Estudio ecológico de saccharomyces en la serranía de Ronda (Málaga). Comportamiento enológico de cepas de saccharomyces autóctonas

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Química Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola ESTUDIO ECOLÓGICO DE SACCHAROMYCES EN LA SERRANÍA DE RONDA (MÁLAGA). COMPORTAMIENTO ENOLÓGICO DE CEPAS DE SACCHAROMYCES AUTÓCTONAS. Memoria que presenta la Licenciada ALMUDENA CLAVIJO RODRÍGUEZ para optar al título de Doctor en Biología por la Universidad de Sevilla Sevilla 2010 Doña MATILDE FORTEZA GONZÁLEZ, Profesora Titular de Universidad y Directora del Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola de la Facultad de Química de la Universidad de Sevilla, CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral titulada “ESTUDIO ECOLÓGICO DE SACCHAROMYCES EN LA SERRANÍA DE RONDA (MÁLAGA). COMPORTAMIENTO ENOLÓGICO DE CEPAS DE SACCHAROMYCES AUTÓCTONAS.”, que presenta la Lda. Almudena Clavijo Rodríguez para optar al grado de Doctor en Biología, ha sido realizado en el Área de Edafología y Química Agrícola de este Departamento bajo la dirección de las Dras. Patricia I. Paneque Macías y Mª Lourdes Morales Gómez, durante el tiempo requerido y reuniendo los requisitos exigidos en este tipo de trabajo. Y para que así conste, firmo el presente certificado en Sevilla, Julio de 2010. Fdo. Matilde Forteza González PATRICIA I. PANEQUE MACÍAS, Profesora Colaboradora del Área de Edafología y Química Agrícola de la Universidad de Sevilla y Mª LOURDES MORALES GÓMEZ, Profesora Titular del Área de Nutrición y Bromatología de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: Que la Tesis Doctoral titulada “ESTUDIO ECOLÓGICO DE SACCHAROMYCES EN LA SERRANÍA DE RONDA (MÁLAGA). COMPORTAMIENTO ENOLÓGICO DE CEPAS DE SACCHAROMYCES AUTÓCTONAS.”, ha sido realizada por la Lda. Dña. Almudena Clavijo Rodríguez, en el Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola de la Universidad de Sevilla, bajo su dirección y que reune, a su juicio, las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor en Biología por la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, firmamos en Sevilla, Julio de 2010. Directora Directora Fdo. Patricia I. Paneque Macías Fdo. Mª Lourdes Morales Gómez Agradecimientos Son muchos los sentimientos que expresar de corazón y pocas las palabras que me vienen a la mente. Comenzaré por mis directoras que confiaron en mí al verme, que me dieron la oportunidad de empezar, de aprender, de realizarme en mi profesión en la que me iniciaba con tanta ilusión, y de llegar hasta donde estoy ahora mismo, escribiendo agradecimientos como colofón a una etapa que acaba y que si Dios quiere, me abrirá puertas para empezar otras. A la Dra. Patricia Paneque, del Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola, directora, jefa y tantas veces amiga, compañera de alegrías, disgustos, agobios e ilusiones que nos han ido acompañando en estos años de Tesis. Gracias por estar ahí de principio a fin, apoyándome en todo a pesar de las dificultades. Gracias por enseñarme y poner los medios necesarios a mi alcance, en definitiva, por haber hecho este sueño posible. Y a la Dra. Lourdes Morales, del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal, que siempre me ha ayudado, entendido y me ha dado ánimos. Por facilitarme el camino de la Tesis, a veces complicado, y siempre de buen grado. Muchas gracias. El desarrollo de esta Tesis ha sido posible gracias a la ayuda económica prestada por la Junta de Andalucía (contrato P-2005/1258 entre la Empresa Pública de Desarrollo Agrario y Pesquero-Junta de Andalucía y la Universidad de Sevilla) y el Ministerio de Educación y Ciencia-INIA (proyecto FEDER RM2007-00008-C02-00) que, además, me han permitido disfrutar de una beca y, posteriormente, contrato. Asimismo, he de agradecer a D. Joaquín Fernández, propietario de la bodega del mismo nombre, y a su enológo (D. Pablo Ortigueira) las muestras, material y facilidades prestadas para la ejecución de la Tesis. También tengo que agradecer su ayuda y compañía a todos mis compañeros del área de Química Agrícola donde he realizado mi Tesis doctoral, a los que están: Isidoro, Elena, Antonio, Lorena y Eva, y a los que estaban cuando llegué pero que continúan en otros sitios: Dres. Guillermo Paneque y Nicolás Bellinfante, Félix, Pili y Auxi. Todos me han demostrado siempre su cariño y apoyo y me han tendido siempre la mano cuando los he necesitado. Aunque quisiera detenerme muy especialmente en Isi, que tanto me ha escuchado y ayudado en todo, compañero de risas y alegrías y que ante los problemas siempre era la cara positiva que me proporcionaba la estabilidad necesaria para seguir. No quisiera olvidarme de los secretarios del Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola, Pepe y Marisa, siempre serviciales y atentos. Y de los que nunca podría olvidarme, de mis compis de laboratorio, por lo tanto que han amenizado mis jornadas y por la gran ayuda de todo tipo que me han brindado, especialmente a Luís Carlos, Cristina, Rocío, Raúl y Teresa. ¡Muchas gracias amigos! A la Dra. Isabel López Calderón y a Machupi del Departamento de Genética, por sus enseñanzas, sus atenciones y dedicaciones, y los ánimos y el apoyo que siempre me han dado. Por creer en mí desde el principio. ¡Gracias! Y a mis amigos que realizan allí su tesis y que siempre me han ayudado en todo, especialmente a Víctor. A “mi segundo grupo”, el del área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Farmacia, a la Dra. Ana Troncoso, y a Raquel y Ana Belén, compañeras de congresos, de ánimos y desánimos, siempre ahí desde el principio. ¡Gracias a todas! A “mi otro departamento”, el de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular de la Facultad de Química, a todos: al Dr. Antonio Márquez y a Mª José, Marco, Margarita, Guillermo y Alfredo. Por su amistad y cariño, por brindarme su ayuda y apoyo en todo momento y acogerme como una más en tantas ocasiones. ¡Muchas gracias a todos! A mis compañeros y amigos de la carrera de Biología, especialmente a mi grupo “piña” de Genética Molecular. A Joaquín por toda su ayuda y apoyo durante la Tesis, también a Juan Diego y Antonio por su ayuda y cariño, y a mi Sandra Muñoz por su amistad incondicional y cercana, por creer en mí desde siempre y apoyarme en todo. ¡A todos os agradezco enormemente vuestra amistad y cercanía! A mis amigos de siempre de Bollullos, a Carina, a mi Mercedes y a mis amigos de Mairena que lo serán siempre, José y Teresa, por su apoyo, cariño y oración. Y a mis nuevos amigos, especialmente a Rosa, compañera de alegrías, agobios y confidencias. ¡Muchas gracias! A mi José, por ser mi alegría y mi apoyo incondicional, por su cariño y oración. Por creer en mí aún sin conocerme. Por tanto y todo, muchas gracias de corazón. Y por último, y no por ello menos importante, sino por ser de lo más elemental de mi ser, mi familia. A todos, pero especialmente a mi hermano y a mis padres, que me dieron la vida, la educación, la oportunidad y los medios para realizarme como persona y profesionalmente, por quererme y cuidarme tanto y a los que quiero de corazón. Gracias por apoyarme siempre, por enseñarme y aconsejarme, y siempre todo desde el más profundo cariño. No podría nada sin vosotros. ¡Muchas gracias! A los Corazones de Jesús y de María por quererme, guiarme y cuidarme. ¡Siempre con Ellos! Introducción 4 Desde Pasteur, la microbiología de las vinificaciones ha sido ampliamente estudiada revelando la gran complejidad de su ecología (Fleet, 1993). Aunque las levaduras juegan un papel central, las uvas, mostos y vinos pueden contener otros microorganismos, como hongos (otros diferentes a las levaduras), bacterias lácticas y acéticas y virus (Fleet, 1993; Pretorius, 2000; Hidalgo Togores, 2003). La intervención de estos microorganismos es limitada debido a la cantidad de interacciones que se producen entre ellos y a los efectos acumulados del etanol y el pH combinados con la escasez de nutrientes y a las medidas tomadas durante el proceso que evitan su desarrollo (Fugelsang, 1997). De esta manera, según Pardo et al. (1989), los hongos desaparecen rápidamente al inicio de la fermentación, la población de bacterias lácticas disminuye durante la fermentación alcohólica para luego incrementar y llevar a cabo la fermentación maloláctica y las levaduras, por el contrario, crecen rápidamente en el mosto y alcanzan su población máxima para el desarrollo de la fermentación alcohólica. Las bacterias lácticas de interés enológico están representadas por los géneros Lactobacillus, Pediococcus, Oenococcus y Leuconostoc (Fugelsang, 1997). Su actividad influye positiva y negativamente en la producción del vino. Por un lado, su acción positiva está relacionada con la fermentación maloláctica (de la que es responsable principalmente Oenococcus oeni) a traves de la cual degradan el ácido málico a ácido láctico disminuyendo así la acidez de los vinos (esencial en los tintos) y además contribuye a la estabilidad microbiológica del producto final pues, por una parte, eliminan nutrientes residuales impidiendo que el vino pueda fermentar tras su embotellado comercial y, por otra producen bacteriocinas (Fleet, 2003; Muñoz et al., 2005). Por otro lado, pueden producir alteraciones que disminuyen la calidad del vino. Algunas son ya bien conocidas, como la degradación del glicerol o el denominado “picado láctico”; y otras se han descrito en la última década y todavía no se conocen con suficiente detalle; estas alteraciones afectan al plano sensorial ya que producen olores indeseables debidos a la producción de fenoles volátiles o a la formación de bases heterocíclicas aromáticas. También se ha estudiado en los últimos años, la implicación de las bacterias lácticas en la calidad higiénica de los vinos que derivan del metabolismo de los aminoácidos, como es la formación de carbamato de etilo y de aminas biógenas (Muñoz et al., 2005). Otro factor de gran importancia económica en la industria, relacionado con las bacterias lácticas es la infección por bacteriófagos ya que provocan paradas en la Introducción 5 degradación de ácido málico durante la fermentación maloláctica, por pérdida de la viabilidad de las bacterias lácticas aunque aún no esta clara esta relación (Muñoz et al., 2005). Las bacterias acéticas están representadas por 6 géneros: Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter, Acidomonas, Asaia y Kozakia. Su crecimiento es indeseable ya que están asociadas a procesos de alteración del vino, fundamentalmente mediante la producción de ácido acético, acetaldehído y acetato de etilo (Fugelsang, 1997). Son responsables del picado acético en los vinos, pero también de la pudrición ácida en uvas y mostos, de la producción de polisacáridos extracelulares que dificultan el filtrado de los vinos, de la degradación del glicerol y de la producción de ácido glucónico y exofructosa como productos del metabolismo de los azúcares, los cuales poseen una elevada capacidad para unirse al SO2, disminuyendo su capacidad antimicrobiana y antioxidante, entre otros efectos (Guillamón & Mas, 2005). Los hongos filamentosos intervienen en diferentes etapas de la producción del vino aunque principalmente influyen durante el cultivo de la uva causando su deterioro (Fugelsang, 1997; Fleet, 2003). Los más importantes o habituales en la vid son Oidium tuckeri causante del oidio, Plasmopara vitícola causante del Mildiu, Botrystis cinerea que ocasiona la podredumbre gris o “botritis”, Phyllosticta ampelicida responsable de la podredumbre negra, Phomopsis vitícola que provoca la excoriosis y Eutipa lata, causante de la eutipiosis (Cantoral & Collado, 2005). Por otro lado, el crecimiento de hongos como Botrytis cinerea, Aspergillus spp. y Penicillium spp. puede dar lugar a la producción de diversos metabolitos y condiciones influyendo sobre la ecología y crecimiento de las levaduras durante la fermentación (Fleet, 2003). Sin embargo, se han encontrado algunas levaduras que poseen una fuerte actividad fungicida, como Metschnikowia pulcherrima, varias especies de Candida, Pichia, Cryptococcus, y algunas especies de Saccharomyces y Zygosaccharomyces; que ha propiciado la iniciativa de usarlas como agentes naturales en biocontrol (Fleet, 2003). 2. Laslevadurasvínicas:suorigen Las levaduras son hongos unicelulares microscópicos, que se reproducen por gemación o escisión, constituyendo un grupo taxonómico complejo y heterogéneo, que incluyen Ascomicetos, Basidiomicetos y Hongos Imperfectos según su desarrollo Introducción 6 sexual (modo de formación de esporas), si bien la mayoría de levaduras vínicas pertenecen a los Ascomicetes (Saccharomyces, Debaryomyces, Dekkera, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Zygosaccharomyces, Torulospora, Hanseniaspora, y Schizosaccharomyces) y a los Hongos Imperfectos (Brettanomyces, Candida, Kloeckera, Cryptococcus, Rhodotorula y Metschnikowia). Mientras que en los Ascomicetos las esporas o ascosporas haploides están contenidas en ascas (especie de sacos formados a partir de la célula vegetativa), en las levaduras asporógenas no se pudo evidenciar un modo de reproducción sexuada y están clasificadas entre los Hongos Imperfectos o Deuteromicetos (Ribéreau-Gayon et al., 2003 a; Hidalgo Togores, 2003). El origen de las levaduras que participan en la fermentación ha sido tema muy discutido en estos últimos años. Según algunos estudios, se encuentra en los nidos o colmenas de los insectos, o incluso en el propio insecto formando parte de su microbiota intestinal (Mortimer, 2000). Las levaduras alcanzan el viñedo por los insectos o por efecto de diseminación del viento, que las transportan desde sus nidos o colmenas de forma que están presentes en las uvas desde el inicio de maduración (Lafon-Lafourcade, 1983; Mortimer & Porsinelli, 1999). La población de levaduras en el mosto fresco de uva sana y madura oscila entre 103-105 ufc/ml. Sin embargo, la población total de levaduras en el grano de uva, así como la proporción relativa de cada especie, depende de diversos factores como la temperatura, la pluviometría y otros factores climáticos, grado de madurez de la uva, uso de fungicidas o pesticidas, daño físico por hongos, insectos o pájaros, la altitud, la variedad de uva y la campaña de estudio (Fleet & Heard, 1993; Boulton et al., 1996; Sabate et al., 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2003 a; Fleet, 2003). Los géneros Kloeckera/Hanseniaspora representan entre el 50-75% de la población total de levaduras en el grano de uva, aunque en menor proporción es posible encontrar otras especies de levaduras estrictamente oxidativas o débilmente fermentativas y poco tolerantes al etanol, pertenecientes a los géneros Metschnikowia, Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Pichia, Kluyveromyces y Hansenula (Fleet & Heard, 1993; Ribéreau-Gayon et al., 2003 a; Barata et al., 2008). Estas especies también son conocidas como no-Saccharomyces. Sin embargo, la presencia de Saccharomyces en las uvas es muy reducida o incluso nula (Fleet & Heard, 1993; Sabate et al., 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2003 a; Ciani et al., 2004), siendo más abundantes en uvas rotas, dañadas y sobremaduras (De la Torre et al., 1999; Mortimer & Polsinelli, 1999; Sabate et al., 2002; Schuller et al., 2005; Barata et al., 2008). Por otro lado, Valero et al. (2007) Introducción 7 en su estudio en el viñedo encuentran una gran diversidad de S. cerevisiae y exponen que la biodiversidad de esta especie en el viñedo depende de la edad o el tamaño del mismo y de las condiciones climáticas. Resultados similares obtienen Schuller et al. (2005) que todas las colonias que aíslan en el viñedo pertenecen a S. cerevisiae. Sin embargo, aunque hay autores que defienden que las levaduras que participan en la fermentación provienen en parte del viñedo y en parte de la bodega (Le Jeune et al., 2006), Ciani et al. (2004) y Mercado et al. (2007) demuestran que la contribución en el proceso de fermentación de las levaduras Saccharomyces cerevisiae presentes en las uvas es poco significativa o nula. Por otra parte, en las superficies y equipos de bodega, con la que el mosto puede entrar en contacto durante el proceso de vinificación, se desarrolla una microflora de levaduras característica conocida como residencial, constituida principalmente por S. cerevisiae aunque también han sido aisladas en este ambiente especies de los géneros Kloeckera, Torulospora, Brettanomyces, Candida, Hansenula y Pichia (Fleet & Heard, 1993). Según Martín & Martín (1990) ésta constituye la principal fuente de cepas indígenas de S. cerevisiae para el desarrollo de la fermentación. Por tanto, la población de levaduras que se desarrolle en la bodega dependerá de la naturaleza de la superficie y del grado de limpieza y estado sanitario en el que se encuentre (Fleet & Heard, 1993). Sin embargo, las condiciones en las que se realicen las fermentaciones determinan la naturaleza de las cepas S. cerevisiae que se encuentran en estas superficies. Así, el empleo de levaduras comerciales, la frecuencia de su uso y la edad de la bodega influyen en la población de levaduras autóctonas encontradas en las superficies y equipos de bodega y en las fermentaciones (Beltrán et al., 2002; Santamaría et al., 2005; Mercado et al., 2007). 3. BiologíadelaslevadurasSaccharomycescerevisiae La levadura es el más simple de los organismos eucariotas. Son hongos unicelulares formados por dos envueltas celulares (pared y membrana plasmática), un citoplasma con orgánulos y un núcleo verdadero recubierto por una membrana encerrando los cromosomas. Pared y membrana plasmática son muy importantes para el desarrollo de la fermentación alcohólica y para la composición del vino ya que ceden algunos de sus componentes al medio (Ribéreau-Gayon et al., 2003 a). Introducción 8 Por su destacado papel en la vinificación, se describen a continuación algunos aspectos sobre la pared celular, las mitocondrias, la constitución genética, la reproducción y ciclos de vida, el metabolismo, el crecimiento y cinética de fermentación de S. cerevisiae. 3.1. Laparedcelular La pared celular representa entre el 15 y el 25% del peso seco de la célula. Es de naturaleza esencialmente polisacarídica, formada por glucanos (60% del peso seco), manoproteínas (25-50%) y quitina (1-2%). Aunque es una envoltura rígida, está dotada de cierta flexibilidad. Es una estructura dinámica, multifuncional, cuya composición y funciones evolucionan en el curso de la vida de la célula y según los factores de su medio ambiente. La pared celular le confiere a la levadura protección, su propia forma (por su organización macromolecular) y lugar de anclaje de moléculas que determinan ciertas interacciones celulares (como la unión sexual, la floculación y el factor killer) y de numerosas enzimas, generalmente hidrolasas, asociadas a la pared algunas y otras alojadas en el espacio periplasmático (entre la pared y la membrana plasmática) cuyos sustratos son sustancias nutritivas del medio en el que se desarrollan e incluso las macromoléculas de la pared, constantemente modificadas en el transcurso de la morfogénesis celular (Ribéreau-Gayon et al., 2003 a). La liberación “artificial” de la pared mediante la acción hidrolítica de enzimas en una solución estabilizada osmóticamente origina un protoplasto o esferoplasto, lo que ha facilitado el estudio de la propia pared celular, el aislamiento de orgánulos y otros componentes celulares (como el ADN) y también estudios genéticos en los que se precisa la fusión y transformación de levaduras con material genético exógeno. 3.2. Lasmitocondrias Es fundamental el papel metabólico de las mitocondrias, los verdaderos orgánulos respiratorios de las levaduras. En aerobiosis la célula de S. cerevisiae contiene cerca de cincuenta. En anaerobiosis, estos orgánulos degeneran pero de forma reversible, de forma que si las células formadas en anaerobiosis son reubicadas en aerobiosis, las mitocondrias recuperan su forma normal (Ribéreau-Gayon et al., 2003 a). Introducción 9 Debido a su naturaleza fermentativa, pueden existir cepas de Saccharomyces sin mitocondrias (los denominados mutantes deficientes en respiración o “petite”). Durante la fermentación, debido a la elevada concentración de glucosa en el medio de cultivo, se produce una inhibición de la síntesis de enzimas implicados en el ciclo del ácido cítrico y de los citocromos de la cadena respiratoria, y la actividad oxidativa mitocondrial es baja. Este fenómeno se conoce como “represión catabólica de la glucosa”. Sin embargo, durante algunas etapas de la vinificación, las levaduras realizan un metabolismo respiratorio, con una implicación muy importante de las mitocondrias (Hidalgo Togores, 2003; Aranda et al., 2005). Las mitocondrias poseen un genoma cuyos genes codifican proteínas de este orgánulo implicadas en la cadena respiratoria (Barre et al., 1993; Ribéreau-Gayon et al., 2003 a). 3.3. Elgenoma El genoma de S. cerevisiae y en general, el de las levaduras vínicas, es el más pequeño de los genoma eucariotas conocidos. Este material genético está formado por el ADN cromosómico, el mitocondrial y el plasmídico y según la cepa, dos moléculas de ARN ubicadas en el citoplasma que confieren el llamado factor killer (Barre et al., 1993). 3.3.1. ADNnuclear El ADN nuclear está formado por el ADN cromosómico y el plasmídico. El ADN cromosómico representa el 80-85% del ADN total en una cepa haploide y contiene alrededor de 14.000 kb, escaso comparado al de los eucariotas superiores. Está organizado en 16 cromosomas de tamaño comprendido entre 2.000 y 200 kpb que no pueden ser observados al microscopio óptico por su pequeño tamaño y su débil condensación. Sin embargo, las cepas vínicas son principalmente diploides, aneuploides y ocasionalmente poliploides, y altamente heterocigóticas mostrando un gran polimorfismo en la longitud cromosómica, de forma que el análisis de los cariotipos es uno de los principales criterios de identificación de las cepas (Barre et al., 1993; Pretorius, 2000; Pérez-Ortín et al., 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2003 a). Los cromosomas de las levaduras contienen pocos intrones y relativamente pocas secuencias repetidas; la mayoría de los genes sólo están presentes en un solo ejemplar Introducción 10 en un genoma haploide. Sin embargo, los genes de los ARN ribosómicos (5,8S, 18S y 26S) son abundantemente repetitivos, se agrupan en tándem formando unidades de transcripción que se repiten en el genoma entre 100 y 200 veces (Fernández-Espinar et al., 2005; Ribéreau-Gayon et al., 2003 a). Además de los cromosomas, en el núcleo existe un plásmido de 2 µm. Se trata de una molécula circular de ADN que contiene 6 kpb, presentes en cantidades de 50 a 100 copias por célula, cuya función biológica es desconocida (Ribéreau-Gayon, 2003 a). 3.3.2. ADNmitocondrial El ADN mitocondrial (ADNmt) consiste en ADN circular de 75 kpb cuyos genes confieren resistencia a ciertos antisépticos, sistemas de enzimas respiratorios y sistemas de componentes estructurales de la membrana mitocondrial (Suárez Lepe, 1997). La molécula posee dos propiedades notables: su alto grado de polimorfismo según la cepa y su estabilidad (baja tasa de mutación) durante la multiplicación vegetativa (Ribéreau- Gayon, 2003 a). Los distintos tamaños del ADNmt entre las distintas cepas de S. cerevisiae resultan de la presencia variable de algunos intrones y de variaciones de tamaño en las regiones intergénicas (Clark-Walter et al., 1981). Esta variabilidad ha sido utilizada para la caracterización de cepas unida a otra característica de esta molécula: su rica composición en regiones AT (75% de la molécula) además de unas 200 regiones ricas en GC (Barre et al., 1993; Fernández-Espinar et al., 2005). 3.3.3. ARNkiller La propiedad killer, que confiere a las cepas que la poseen la capacidad de matar a otras cepas de fenotipo sensible, consiste en genes nucleares y dos ARN citoplasmáticos de doble cadena: L y M. El ARN L está normalmente en las células, sólo el ARN M es específico de cepas de fenotipo killer o neutras ya que es el que codifica para la toxina killer y para el factor de inmunidad a toxinas. Se han descrito 5 tipos de toxinas killer en S. cerevisiae: K1, K2, K3 (Young & Yagiu, 1978), KT28 (Pfeiffer et al., 1982) y K3GR1 (Extremera et al., 1982) según la agresividad de éstas, siendo K1 la de mayor agresividad (Suárez Lepe, 1997). El tamaño del ARN M difiere según el tipo killer (2- 1,5 kb) mientras que el del ARN L es prácticamente constante (4,7 kb). Las toxinas más ampliamente distribuidas entre las cepas vínicas son la K1 y la K2 aunque es la K2 la más importante en vinificación ya que es estable al pH del mosto. Los ARN L y M están en el citoplasma en el interior de una cápsida proteica similar a partículas de tipo Introducción 11 viral. El ARN L codifica para las proteínas de la cápsida y para una ARN polimerasa (Barre et al., 1993; Shimizu, 1993; Hidalgo Togores, 2003). 3.4. Reproducciónyciclodevida S. cerevisiae, como otras levaduras esporógenas que pertenecen a la clase de los Ascomicetos, puede reproducirse asexualmente por vía vegetativa o de forma sexual formando ascosporas. 3.4.1. Reproducciónasexual La reproducción vegetativa o asexual en S. cerevisiae se produce por gemación. El proceso se realiza en cuatro fases: la primera, en G1, es el periodo precedente a la síntesis de ADN; la segunda, S, donde se empieza a formar un brote o gema y el huso polar del núcleo se extiende fuera de éste hacia la citada protuberancia; la tercera, G2, en la que el núcleo empieza a estirarse para meterse en la gema, en la que también entran mitocondrias y pequeñas vacuolas; y por último, la cuarta fase corresponde a la mitosis (M) propiamente dicha, que está marcada por el estiramiento máximo del núcleo y la separación de la célula madre y de la célula hija, luego por la construcción de la pared de separación y finalmente, por el depósito de un anillo de quitina sobre la cicatriz de brotación en la célula madre (Hidalgo Togores, 2003; Ribéreau-Gayon et al., 2003 a). En el mosto de uva, la duración de la gemación es de una a dos horas, de modo que, en la fase de crecimiento activo de las levaduras durante la fermentación, el número de células se duplica en dos horas (Ribéreau-Gayon et al., 2003 a). 3.4.2. Reproducciónsexual Cuando las células diploides de las levaduras esporógenas se encuentran en un medio que les es hostil, como por ejemplo carente de azúcares asimilables o pobre en nitrógeno o muy aireado, cesan de multiplicarse por gemación, transformándose las células en ascas con una gruesa pared y conteniendo cuatro ascosporas o esporas haploides procedentes de la división meiótica del núcleo (Hidalgo Togores, 2003). En S. cerevisiae, las ascosporas son de dos tipos de signo sexual: a y α. En el asca existen dos de cada tipo. En condiciones favorables de esporulación, como la presencia de azúcares, la pared del asca se rompe liberando las ascosporas que se multiplican vegetativamente en el medio. Dos células de signo opuesto pueden entonces aparearse, Introducción 12 uniéndose sus núcleos y citoplasmas en un zigoto, formando una nueva levadura diploide (a/α), que entonces puede multiplicarse por gemación. En ciertas especies de levaduras, mientras que las células haploides se multiplican, algunas de ellas tienen la capacidad de invertir su signo sexual gracias a un gen llamado HO, pudiendo entonces unirse entre sí para formar una nueva levadura diploide (a/a o α/α). Estas son conocidas como especies homotálicas y corresponden a la mayoría de las levaduras vínicas, a diferencia de las especies heterotálicas, que no presentan esta propiedad y pueden pasar varias generaciones manteniéndose en estado haploide y con signo sexual constante. Las levaduras del género Saccharomyces son diploides y homotálicas y tienen un ciclo de reproducción diplofásico en el que la reducción o meiosis se produce antes de la formación de esporas de forma que siempre son diploides cuando se reproducen vegetativamente. El jugo de uva y el vino no parecen ser un campo propicio para la esporulación de las levaduras, por lo que mayoritariamente se reproducirán asexualmente. 3.5. Metabolismo Las levaduras en condiciones anaeróbicas realizan la fermentación alcohólica, en la que los azúcares presentes en el mosto de uva (glucosa y fructosa, principalmente), son transformados en alcohol etílico y anhídrido carbónico, además de otras sustancias, transformándose, entonces, en vino. Esta compleja reacción bioquímica se produce con desprendimiento de calor, pues en el catabolismo de los azúcares se produce un exceso de energía que no se utilizan en los procesos de anabolismo de construcción de las células o de su multiplicación. Durante la fermentación alcohólica también se producen una serie de fenómenos bioquímicos colaterales de gran importancia en el desarrollo de la misma y en la composición del vino, como la fermentación gliceropirúvica, fermentación homoláctica, fermentación maloalcohólica, catabolismo y anabolismo de los aminoácidos y metabolismo de los compuestos azufrados. Es necesario disponer de pequeñas cantidades de oxígeno durante la fermentación alcohólica con el objeto de que las levaduras se multipliquen y su desarrollo sea el adecuado. En este momento cobra gran importancia el metabolismo aerobio de las Introducción 13 levaduras, donde los azúcares u otros sustratos son transformados finalmente en agua y anhídrido carbónico mediante la respiración, produciéndose una energía veinte veces superior a la de la fermentación alcohólica que explica el mayor crecimiento de la población celular en estas condiciones (Hidalgo Togores, 2003). Las levaduras deben sintetizar durante su crecimiento todas las proteínas que necesita. Para ello asimila del medio fermentativo los compuestos nitrogenados que contiene en forma de ion amonio o de aminoácidos, a partir de los cuales podrá sintetizar otros aminoácidos que formarán parte de las proteínas. Sin embargo, Saccharomyces es incapaz de asimilar las fuentes de nitrógeno inorgánico del medio (como nitratos y nitritos) así como las proteínas y polipéptidos, ya que carece de los sistemas de digestión extracelular para este tipo de compuestos, por lo que el contenido en nitrógeno de los mostos suele ser limitante para el crecimiento de S. cerevisiae desde el punto de vista nutricional y el principal causante de paradas de fermentación. En cuanto al catabolismo de los aminoácidos es importante destacar la formación de metabolitos como los alcoholes superiores y los ésteres derivados de éstos, ambos con una participación decisiva en la fracción aromática de los vinos (Aranda et al., 2005; Hidalgo Togores, 2003). Respecto a los compuestos azufrados, las levaduras son capaces de incorporar y metabolizar sulfitos, sulfatos, aminoácidos azufrados, glutatión, tiamina, biotina, etc., pero también producir y segregar al medio otras sustancias azufradas, como sulfitos, sulfuro de hidrógeno, dimetilsulfuro, mercaptanos, tioésteres, sulfuros, etc. La mayor parte de ellos influyen en las cualidades organolépticas de los vinos (Hidalgo Togores, 2003). 3.6. Ciclodecrecimientoycinéticadefermentación El desarrollo de la fermentación alcohólica está íntimamente ligado al ciclo de crecimiento de las levaduras, de forma que depende el uno del otro. En el ciclo de crecimiento se pueden apreciar seis fases de desarrollo (Aranda et al., 2005; Hidalgo Togores, 2003): 1. Fase de latencia: La población de levaduras no aumenta, ya que no se producen multiplicaciones celulares al estar adaptándose al medio. Introducción 20 fermentación natural o espontánea (sin inóculo) dichas especies no actúan de forma simultánea, sino que crecen de forma secuencial a lo largo de la fermentación alcohólica (Fleet & Heard, 1993; Schütz & Gafner, 1993; Querol et al., 1994; Schütz & Gafner, 1994; Sabate et al., 1998; Torija et al., 2001; Santamaría et al., 2005; Maro et al., 2007; Mercado et al., 2007). La fermentación alcohólica es iniciada principalmente por especies de Kloeckera, Hanseniaspora y Candida, y en menor medida de Hansenula y Pichia, pero a medida que ésta avanza estos microorganismos van desapareciendo dando paso a otras especies de Saccharomyces, fuertemente fermentativas y tolerantes al etanol, capaces de finalizar la fermentación. La desaparición de las especies no- Saccharomyces parece estar relacionada con su baja tolerancia al etanol y a su incapacidad para sobrevivir en un medio con concentraciones crecientes de etanol producido por las especies de Saccharomyces. Sin embargo, Pérez-Nevado et al. (2006) apuntan que algunas no-Saccharomyces como H. guilliermondii y H. uvarum toleran grandes cantidades de etanol en cultivos puros pero mueren rápidamente cuando crecen en cultivos mixtos con S. cerevisiae por lo que postulan que la causa de muerte (y por tanto de la sucesión durante la fermentación alcohólica) podría ser distinta a la toxicidad por el etanol. Según Ribéreau-Gayon et al. (2003 a), además del etanol, la selección natural de S. cerevisiae se produce por otros tres factores: la anaerobiosis, el sulfitado de los mostos y la riqueza en azúcar, a los cuales las especies no-Saccharomyces son más sensibles que S. cerevisiae. El empleo de técnicas de caracterización molecular ha puesto de manifiesto que durante la fermentación participan diversas cepas de S. cerevisiae encontrándose dos situaciones, fermentaciones en las que sólo un pequeño número de ellas son mayoritarias (1 a 3) representando el 70-80% de las colonias aisladas (Ribéreau-Gayón et al., 2003), o bien fermentaciones en las que ninguna cepa domina sobre las demás (Torija et al., 2001; Sabate et al., 1998). La aplicación de estas técnicas ha permitido además estudiar la distribución geográfica de cepas de S. cerevisiae salvajes o indígenas, demostrando la adaptación de algunas de ellas a microambientes específicos (Nadal et al., 1996; Schütz & Gafner, 1994). Uno de los principales inconvenientes de las fermentaciones espontáneas, sin embargo, es la variabilidad en la población total de levaduras y en su composición de una campaña a otra, que por una parte puede no ser suficiente para asegurar el inicio de la fermentación alcohólica o que ésta sea muy lenta favoreciendo la proliferación de Introducción 21 levaduras contaminantes y, por otra, hace que las características del producto final de la fermentación varíe cada vendimia y que, por tanto, la fermentación espontánea resulte altamente impredecible (Pretorius, 2000). 4.2. Fermentacionesinoculadas Frente al desarrollo de las fermentaciones espontáneas, a cargo de la microflora presente en los racimos de uva y la residencial en la bodega, las fermentaciones pueden ser dirigidas mediante la inoculación de levaduras seleccionadas, bien en forma de levaduras secas activas o bien mediante su adición a partir de una cepa conservada en laboratorio y debidamente propagada en escalonamientos sucesivos. Sin embargo, antes de que se iniciaran los procesos de selección de cepas vínicas, para paliar los problemas expuestos anteriormente en relación a las fermentaciones espontáneas, se recurría al empleo de un pie de cuba, que no era más que un mosto en plena fermentación, conducida en las mejores condiciones para procurar el predominio de las mejores levaduras para el proceso enológico (Suárez Lepe, 1997). Se trata de una técnica antigua pero que hoy día se sigue utilizando en muchas bodegas para aquellas elaboraciones donde se desea que la población de levaduras proceda del propio ecosistema, sobre todo en vinos que presentan una fuerte expresión de su origen o “terroir”. El pie de cuba se prepara unos días antes de la vendimia a partir de racimos de uva sanos y maduros de los que se extrae el mosto que se deja fermentar de forma espontánea. Cuando está en fermentación tumultuosa y alcanzado una graduación alcohólica de entre 6-8 % vol, se añade a los depósitos de fermentación en proporción variable de 3-5%, que asegura la siembra de una población de 2 ó 3 x 106 levaduras/ml y la presencia de levaduras más favorables para el proceso de fermentación. Se ha de mezclar bien con el mosto a fermentar por remontado o mejor situándolo en el fondo del depósito antes de ser llenado, acto que le da nombre a la técnica pie de cuba (Suárez Lepe, 1997; Hidalgo Togores, 2003). Por otra parte, el concepto de empleo de levaduras seleccionadas para conducir la fermentación tampoco es reciente. A principios del siglo pasado el instituto La Claire en Francia comenzó a aislar, mantener y producir a pequeña escala cepas puras de levadura en forma de cultivos líquidos que se utilizaban como pies de cubas en mostos, en un proceso que se iba escalonando hasta permitir el inóculo de los tanques industriales de Introducción 22 fermentación (Degre, 1993; Ramón., 2005). A nuestro país dicho concepto llegó de la mano de Tommaso Castelli en 1955, discípulo de Gino de Rossi. El objetivo era la obtención de una colección de microorganismos de distintas regiones vitivinícolas, entendiendo que las más abundantes en las distintas fases de fermentación (inicio, tumultuosa y final) serían potencialmente interesantes como futuras levaduras seleccionadas. Según Castelli, aunque la fermentación en pureza no era implacable, podría permitir una mayor regularidad, mayor producción de alcohol, mejor relación rendimiento alcohólico y menor acidez volátil. Tomasso Castelli y Baldomero Iñigo fueron los responsables de los primeros análisis microbiológicos de fermentaciones realizados en España a final de la década de los 50 del siglo XX (González et al., 2005). No obstante, no fue hasta la década de los 60 cuando comienza la producción industrial de cepas enológicas de levaduras en forma de levaduras secas activas (LSA) en respuesta a las necesidades de una creciente producción de vinos en California, y aunque en principio el número de cepas disponibles era muy reducido (Montrachet y Pasteur champagne), en la actualidad rondan el centenar las cepas comerciales ofrecidas por diferentes empresas (Degre, 1993; González et al, 2005). El empleo de LSA, además de aumentar el grado de reproducibilidad del vino año tras año, asegura una rápida y completa fermentación del mosto y disminuye la fase de latencia de las levaduras (Fleet & Heard, 1993) reduciendo así el riesgo de contaminación y permitiendo un mayor control de la fermentación y calidad en los vinos (Henick-Kling et al., 1998). Otra de las ventajas de la LSA es su fácil manipulación en bodega, que no requiere personal especializado. Para su inoculación tan sólo es precisa una fase previa de rehidratación durante 15-20 minutos en agua caliente (30-40 ºC) a la que se le debe añadir mosto o sacarosa con objeto de evitar el choque osmótico. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el empleo de levaduras comerciales no asegura su total implantación durante la fermentación, que puede ser incluso baja o nula (Barrajón et al., 2009). El grado de implantación de las LSA depende principalmente de la dosis usada, de las condiciones de rehidratación y de la temperatura de inoculación, aunque también otros factores pueden afectar directamente a su viabilidad, vitalidad y actividad fisiológica y, por tanto, a su capacidad de competir con la microflora salvaje presente en el mosto, por ejemplo, el contenido intracelular en carbohidratos, contenidos de nitrógeno en el mosto, la presencia de factores de supervivencia y la temperatura de fermentación (revisado por Barrajón et al., 2009). En este sentido, las técnicas de Introducción 23 biología molecular son una herramienta importante que permite la monitorización de las fermentaciones y el control del grado de implantación de la levadura inoculada y, de este modo, tomar a tiempo las medidas pertinentes en caso de no observarse una adecuada implantación de la cepa inoculada. A pesar de las ventajas del uso de levaduras comerciales, muchos autores defienden el empleo de levaduras autóctonas seleccionadas (Martini & Vaughan- Martini, 1990; Suárez Lepe & Iñigo Leal, 2004; Querol et al., 1992a; Regodón et al., 1997; Romano et al., 1998). Por un lado, estas últimas están mejor adaptadas a su microambiente y pueden imponerse más fácilmente garantizando la homogeneidad de la flora (Martini & Vaughan-Martini, 1990, Lema et al., 1996; Regodón et al., 1997; Pretorius, 2000; Esteve-Zarzoso et al., 2001; Romano et al., 2003; Lopes et al., 2007; Barrajón et al., 2009; Rodríguez et al., 2009). Por otro lado, esta práctica facilita el mantenimiento de la tipicidad del producto según la región de origen (Regodón et al., 1997; Nikolaou et al., 2006; Rementaria et al., 2006; Rodríguez et al., 2009). Por ello, el mantenimiento del patrimonio biológico es esencial para obtener inóculos capaces de desarrollar por completo los sabores y aromas típicos de los vinos originados en los diferentes viñedos (Pretorius, 2000). 5. Seleccióndelevadurasautóctonas Los beneficios de controlar el proceso fermentativo mediante la inoculación de levaduras frente al desarrollo de la fermentación de forma espontánea o natural han sido ya expuestos en el apartado anterior, así como las ventajas que supone el empleo de levaduras autóctonas seleccionadas frente al de levaduras comerciales en relación a la más fácil implantación de las primeras en el proceso fermentativo y en el mantenimiento de las características particulares de los vinos producidos en una región determinada. El proceso de selección clonal de levaduras lleva consigo determinar las propiedades enológicas de cada cepa que la haga más adecuada para el proceso fermentativo, bien por su comportamiento tecnológico durante la fermentación, bien por las características que aporte al producto final. Si además la selección se lleva a cabo entre las levaduras autóctonas (o locales) de la propia región donde se vayan a emplear Introducción 24 en la vinificación se llegaría al concepto de levadura local seleccionada ya apuntado en 1964 por Iñigo Leal (Suárez Lepe & Iñigo Leal, 2004). El primer paso, por tanto, en el proceso de selección de una levadura local o autóctona es el aislamiento e identificación de la microflora levaduriforme que participa en la fermentación espontánea de los mostos en una región determinada (Briones et al., 1995). Lo más habitual es realizar los aislamientos en el mosto en fermentación, normalmente en la última fase de la misma, aunque también pueden usarse otros sustratos como la propia uva, mosto fresco e incluso lías (González et al., 2005), para después proceder a la identificación y caracterización de las especies y cepas presentes. A continuación las cepas identificadas son ensayadas de acuerdo a unos criterios de selección. Según Suárez Lepe & Iñigo Leal (2004) debe diferenciarse entre criterios primarios de selección, básicos o fundamentales, útiles para la selección de levaduras destinadas a fermentar cualquier mosto, y otros que una vez superados los primeros, se deben estudiar con carácter específico según el tipo de vino a elaborar. Consideran básicos un poder fermentativo elevado, baja producción de acidez volátil y una correcta cinética fermentativa. Otros criterios a tener en cuenta son la resistencia al SO2, fenotipo killer y la ausencia de defectos olfativos (producción de SH2). Posteriormente, la selección debe proseguir en función de su aplicación tecnológica, considerando la producción de vinos comunes, vinos tintos o blancos de calidad, o bien de vinos especiales como los de crianza biológica o los espumosos. Degré (1993) resume algunas de las propiedades tecnológicas de las levaduras, clasificándolas en función de sus efectos en el proceso de vinificación y/o calidad del producto final como: - Favorables: poder fermentativo, fermentación completa de azúcares, cinética fermentativa adecuada, alta tolerancia al etanol, capacidad de fermentar a diferentes temperaturas, resistencia al SO2, factor killer o resistencia a toxinas killer, degradación del ácido málico, producción de β-glucosidasa y producción de glicerol. - Desfavorables: producción acidez volátil, de SH2, de acetaldehído, formación de precursores del carbamato de etilo, y formación de espuma. Introducción 25 5.1. Propiedadesfavorables El poder fermentativo o poder alcoholígeno corresponde al máximo porcentaje de etanol que es capaz de producir una levadura al fermentar un mosto estéril con cantidad suficiente de azúcares; indica, por tanto, su capacidad para producir vinos de elevado grado alcohólico (Suárez Lepe & Iñigo Leal, 2004). Esta propiedad está asociada a alta velocidad de fermentación, fases de latencia cortas y consumo casi total de los azúcares presentes en el mosto (González et al., 2005), y constituye uno de los primeros criterios empleados en la selección de levaduras. Es muy variable entre las distintas especies de levaduras vínicas y, a menudo, entre diferentes cepas de una misma especie. Normalmente las cepas con mayor poder fermentativo son también las más resistentes al etanol. S. cerevisiae y otras levaduras vínicas pertenecientes a este género, son los microorganismos más tolerantes al etanol de entre los eucariotas, son capaces de crecer a concentraciones comprendidas entre 8-12% vol etanol y de producir una graduación alcohólica superior a 12% vol (Suárez Lepe, 1997). Otra propiedad de interés en relación a la selección de una cepa de levadura es su cinética fermentativa, que se establece mediante la determinación de otros parámetros como la duración de la fase de latencia (relacionada con el tiempo que tarda en producirse el arranque de la fermentación), la regularidad fermentativa de la cepa, la duración total del proceso y la curva termodinámica de cada cepa, que deben definirse en las mismas condiciones experimentales (Suárez Lepe & Iñigo Leal, 2004). En relación a la temperatura de fermentación, cada cepa tiene su óptimo de temperatura (Torija et al., 2003). Puede ser de gran utilidad contar con cepas seleccionadas capaces de fermentar a temperaturas elevadas en zonas vinícolas con altas temperaturas durante la vendimia y el período de fermentación y con bodegas que carecen de sistemas de refrigeración, situaciones que pudieran conducir a paradas de fermentación (Regodón et al., 1997, Nikolaou et al., 2006). Sin embargo, en otras ocasiones interesa fermentar a temperaturas bajas para favorecer la conservación de los aromas varietales y fermentativos en el vino, aunque disminuye la tasa de crecimiento de las levaduras y por tanto de la fermentación. La resistencia al sulfuroso sigue siendo un carácter a tener en cuenta en la selección de cepas vínicas, especialmente cuando no se limita a especies de S. cerevisiae. El empleo de sulfito es una práctica habitual durante la vinificación, Introducción 26 justificada por su actividad antiséptica, entre otras, que ayuda a controlar el crecimiento de microorganismos indeseables en el mosto y en el vino. La resistencia a este compuesto es característica común de las cepas vínicas de S. cerevisiae, que poseen una copia del alelo SSU1-R del gen SSU1 que les confiere mayor resistencia a este compuesto que las cepas que poseen el alelo normal (González et al., 2005). También parece interesante contar con cepas killer de S. cerevisiae como inóculos, capaces de liberar toxinas y de este modo matar cepas que no posean factor killer o cuyo factor killer es diferente (González et al., 2005) favoreciéndose la implantación de la cepa inoculada y evitando el desarrollo de levaduras sensibles que puedan contaminar y dañar el vino (Kunkee, 1984). El ácido málico no sólo contribuye a la acidez en el vino provocando un desequilibrio organoléptico (Suárez Lepe, 1997), sino que también sirve de sustrato para contaminaciones por bacterias lácticas que pueden dañar el vino tras su embotellamiento. Por ello es esencial eliminar el exceso de ácido málico del vino para asegurar la estabilidad física, bioquímica y microbiológica y por tanto, la calidad del vino (Pretorious, 2000). La capacidad de degradar ácido málico del vino difiere con la especie y la cepa de levadura (Redzepovic et al., 2003). El aroma varietal, o primario del vino puede verse afectado por la cepa de levadura que se emplee en la vinificación. La producción de enzimas β-glucosidasa por algunas cepas vínicas permite la hidrólisis de los precursores aromáticos procedentes de la uva, que suelen ser terpenos unidos por enlace β-glucosídico a un resto azucarado, liberando así el verdadero compuesto aromático, que es el terpeno libre (Fernández- González et al., 2003; Hernández et al., 2003). Por otra parte, la acción de otras enzimas hidrolíticas ayudan también a la extracción de componentes del aroma y color a partir de las paredes celulares de la uva, por lo que la producción de estas enzimas con estas actividades también se han propuesto como criterio de selección (Gonzaléz et al., 2005). La producción de glicerol también se asocia con una mejora de las propiedades sensoriales del vino al proporcionarle dulzor, cuerpo y suavidad (Nikolaou et al., 2006). En algunos vinos puede ser, después del alcohol y el agua, el constituyente presente en mayor cantidad (Ribéreau-Gayon et al., 2003 b; Suárez Lepe & Iñigo Leal, 2004). Su formación transcurre en los primeros estadios de la fermentación alcohólica, como consecuencia de la reducción de la fosfohidroxiacetona, cuando todavía hay poco Introducción 27 acetaldehído formado. Teniendo en cuenta que cada vez existe una mayor demanda de vinos con baja graduación alcohólica, y que un aumento en la producción de glicerol implica un descenso en la de etanol, la selección de cepas productoras de glicerol tiene interés desde ambos puntos de vista. 5.2. Propiedadesdesfavorables Desde un punto de vista negativo, un exceso de ácido acético y por tanto, una producción de acidez volátil elevada, es uno de los defectos más fácilmente detectables en el vino. A menudo un exceso de acético se asocia al desarrollo incontrolado de bacterias –normalmente acéticas aunque también lácticaspero también puede haber una contribución apreciable de este compuesto como consecuencia del propio metabolismo de S. cerevisiae que dependerá de cada cepa (Suárez Lepe, 1997). También un exceso en sulfuro de hidrógeno disminuye la calidad de los vinos acabados ya que produce un desagradable olor a huevos podridos (Pisarnitskii, 2001). Aunque todas las cepas de Saccharomyces pueden producir una pequeña cantidad de este compuesto (Gutiérrez et al., 1997), su producción depende de la cepa de levadura y de sus características fisiológicas (Rementaria et al., 2006). Existen cepas cuyas características genéticas les permite bloquear la síntesis de SH2 cuando existe una traza de éste en el medio; estas cepas poseen lo que se conoce como “carácter SH2 negativo” que consiste en un sistema de control específico para la reducción de sulfatos (Suárez Lepe & Iñigo Leal, 2004). El acetaldehído es un compuesto muy reactivo que se une fácilmente al SO2, impidiendo que ejerza sus funciones, y a otros constituyentes del vino, como los compuestos fenólicos provocando insolubilizaciones (Mareca Cortés, 1983). En exceso provoca la denominada maderización o gusto oxidado (Mesas & Alegre, 1999). Además, su oxidación produce ácido acético, aumentando así la acidez volátil de los vinos (Mareca Cortés, 1983). El carbamato de etilo está relacionado con la calidad higiénica. Parece ser un agente cancerígeno cuyo principal precursor es probablemente la urea por reacción química entre ésta con el etanol. Durante la fermentación alcohólica, la urea es liberada bajo la acción de la arginasa en el transcurso de la metabolización de la arginina (Flanzy, 2003). Introducción 28 La formación de espuma durante la fermentación hace necesario dejar una cámara de aire en los depósitos de fermentación para evitar que rebosen y dificulta el transporte del mosto por las bombas (Kunkee, 1984), por ello es importante seleccionar las cepas que menos espuma produzcan. 5.3. Ensayosdeselección La determinación del comportamiento de las cepas de levaduras a ensayar en relación con los criterios seleccionados implica el empleo de medios sintéticos o bien de microfermentaciones en mosto natural en condiciones de laboratorio, así como la determinación de compuestos volátiles y análisis sensorial en los productos finales obtenidos en vinificaciones de laboratorio (Briones et al., 1995). Finalmente, el comportamiento de las cepas seleccionadas debe ensayarse también en vinificaciones en bodega (Regodón et al., 2000; Rementaria et al., 2006; Rodríguez et al., 2009). En nuestro país se han llevado a cabo diversos trabajos de selección enfocados a la selección de alguna cepa de S. cerevisiae para su aplicación en una región vinícola dada: en la DO de Alicante (Querol et al., 1992a), en la DO de Valdepeñas (Briones et al., 1999), en Extremadura (Regodón et al., 1997), en La Mancha (Pérez-Coello et al., 1999), en El Penedés (Esteve-Zarzoso et al., 2000), en la DO Terra Alta (Torija, 2002) y, más recientemente, en la provincia de Cádiz (Rodríguez et al., 2009), entre otros. Trabajos similares han sido realizados recientemente en Grecia (Nikolaou et al., 2006) y en la Patagonia argentina (Lopes et al., 2007). En términos generales, los criterios de selección más frecuentemente empleados fueron la cinética fermentativa, tasa de consumo de azúcares, producción de acidez volátil, de SH2 y de espuma, fenotipos killer y resistencia a diferentes concentraciones de SO2, estudiados en la mayoría de ellos. Otras propiedades estudiadas, aunque en menor medida, fueron la tolerancia al etanol (Briones et al., 1995; Pérez-Coello et al., 1999), a diferentes temperaturas (Querol, 1992, Regodón et al., 1997, Nikolaou et al., 2006), la adaptación a concentraciones de azúcares elevadas (Querol, 1992), producción de fenoles volátiles (Briones et al., 1995; Pérez-Coello et al., 1999), de glicerol y aminas biógenas (Nikolaou et al., 2006). Por tanto, no existe un protocolo estándar para la selección de levaduras, hallándose diferencias en la totalidad de propiedades enológicas estudiadas así como en la prioridad que se le da a cada una de ellas en el proceso de selección. Sin embargo, todos los trabajos de selección coincidieron en la realización de microvinificaciones, con un Introducción 29 número reducido de cepas preseleccionadas, en las que se evalúan las propiedades sensoriales y, en algunos casos, se determinan el contenido en compuestos volátiles de los vinos obtenidos. Finalmente, en algunos de ellos se hacen vinificaciones en bodega para comprobar la implantación de la cepa seleccionada, su adaptación a las condiciones locales y las propiedades de los vinos elaborados (Briones et al., 1995, Esteve-Zarzoso et al., 2000, Rementeria et al., 2006). 6. Papeldelaslevadurasenelaromadelvino El aroma de los vinos es de una gran complejidad que se debe en parte a su origen, pues es el resultado final de una larga secuencia biológica, bioquímica y tecnológica, y en parte al número elevado de constituyentes volátiles que contiene, cuyas concentraciones van desde algunos nanogramos por litro a algunas centenas de microgramos, o algunos miligramos. En el potencial aromático de los vinos hay que tener en cuenta otros compuestos ligados llamados también precursores del aroma (Bayonove et al., 2000). Los constituyentes aromáticos del vino se clasifican según su origen (Bayonove et al., 2000; Romano et al., 2003), en: - Aromas varietales que provienen de la uva y que dependen esencialmente de la variedad pero también de otros factores. En el caso de variedades poco aromáticas, estos constituyentes son esencialmente precursores: ácidos grasos, glucósidos, carotenoides y compuestos fenólicos. - Aroma prefermentativo que se forma en las operaciones de extracción, maceración y acondicionamiento del mosto como consecuencia de la acción de enzimas sobre ciertos lípidos; son esencialmente compuestos de 6 átomos de carbono. - Aromas fermentativos, formados por las levaduras durante la fermentación alcohólica y por las bacterias lácticas en aquellos vinos en los que tenga lugar la fermentación maloláctica. Cuantitativamente son los más abunadantes y son considerados como los responsables de la nota vinosa común a todos los vinos. - Aromas postfermentativos, incluyen todos los compuestos volátiles que se forman durante el envejecimiento y la conservación del vino. Introducción 36 pueden ser glucosa, ramnosa, arabinosa, y apiosa, así como disacáridos. Las levaduras de fermentación poseen una cierta actividad glucosídica, siendo un importante factor de liberación de aromas varietales (Rosi et al., 1994; Fernández-González et al., 2003; Hernández et al., 2003). Cuando estos glucósidos son liberados por la acción de las enzimas glucosidasas, el contenido en terpenos en el mosto aumenta de dos a cinco veces. La actividad glucosídica depende de la cepa de S. cerevisiae utilizada pero no es inhibida por la presencia de glucosa como es el caso de las glucosidasas de la uva y presenta un máximo de actividad al finalizar la fase de crecimiento de las levaduras, aunque luego decrece rápidamente (Hidalgo Togores, 2003). La actividad de esta enzima en la elaboración del vino son limitadas ya que las condiciones óptimas de actividad son pH 4 y a 40º C de temperatura (Rosi et al., 1994; Hernández et al., 2003). La diana de acción de estas enzimas son las uniones entre un compuesto no glucídico (o aglicona) con otro glucídico formando heterósidos. Muchos precursores de aromas varietales se encuentran en forma de heterósidos, especialmente los que la aglicona es un terpenol, norisoprenoide o un fenol volátil. Las enzimas β-D- glucosidasas son capaces de hidrolizar estos compuestos, liberando así los aromas varietales. 6.6.2. Proteasas Aunque las proteasas tienen un papel importante en el proceso de clarificación y estabilidad del vino al hidrolizar las proteínas (Canal-Llauberes, 1993) y en evitar la formación de espuma (Kunkee, 1984), también como consecuencia de esta actividad influyen indirectamente en el aroma del vino. Las proteasas intervienen en la producción de compuestos aromáticos mediante la “fermentación alcohólica de los aminoácidos”. La actividad de estas enzimas extracelulares producidas por algunas cepas de S. cerevisiae, hidrolizan las proteínas del mosto en los aminoácidos correspondientes (Bilinski et al., 1987; Úbeda Iranzo et al., 1998), estimulando su metabolismo y, al tomar los aminoácidos como fuente de nitrógeno para atender sus funciones vitales, excretan al medio los alcoholes superiores correspondientes como sustancias de desecho (Hidalgo Togores, 2003). Introducción 37 7. Técnicasdeidentificaciónycaracterizaciónmoleculardelevaduras El conocimiento de las levaduras presentes en la fermentación es fundamental, dada la influencia de éstas en la producción de compuestos que determinan el sabor y el perfil aromático de los vinos. Por ello, es preciso contar con técnicas de identificación y caracterización que permitan distinguir y determinar las especies de levaduras a nivel de cepa para llevar a cabo el estudio ecológico de levaduras responsables de la fermentación, los controles de producción, de comercialización, y de implantación de las levaduras seleccionadas utilizadas como inóculo, así como la constitución y el mantenimiento de las colecciones de levaduras autóctonas o seleccionadas. Los primeros métodos de identificación y, por tanto, de clasificación de las levaduras, se basaron en el estudio de caracteres morfológicos, tales como la forma, dimensiones celulares, y formación de esporas. También se aplicaron criterios fisiológicos de asimilación de compuestos carbonados y nitrogenados, así como la necesidad de factores de crecimiento. Estos métodos eran muy laboriosos, su realización era lenta y costosa y su interpretación requería de un especialista. Además, estos factores fenotípicos no permitían la precisión suficiente para establecer una correcta clasificación y delimitación de las especies de levaduras (Hidalgo Togores, 2003, Fleet, 1993) ya que por otro lado, podían variar los resultados en función de las condiciones de cultivo y en ocasiones, las especies están delimitadas por una sola característica fisiológica en algunos casos determinada por un solo gen. Sin embargo, a partir de la década de los ochenta del siglo pasado, como consecuencia del avance de la genética y de la tecnología molecular se han podido aplicar diversas técnicas de análisis del ADN que han permitido diferenciar entre especies e incluso entre cepas distintas. Entre ellas, se comentan a continuación aquellas que han sido utilizadas en el desarrollo de esta Tesis. 7.1. Métodosdeidentificacióndeespecies Los genes ribosomales 5,8S, 18S y 26S así como los espaciadores internos (ITS, del inglés Internal Transcribed Spacer) y los espaciadores intergénicos (NTS, del inglés Non-Transcribed Spacer) constituyen poderosas herramientas para el establecimiento de las relaciones filogenéticas y la identificación de especies (Kurztman & Robnett, 1998), debido a la existencia de secuencias conservadas en las mismas, así como por su evolución concertada, es decir, la similitud entre las unidades de transcripción repetidas Introducción 38 es mayor dentro de especies que entre unidades de distintas especies (Fernández Espinar et al., 2005). Esta técnica ha sido ampliamente usada en la identificación de levaduras vínicas (Guillamón et al., 1998; Esteve-Zarzoso et al., 1999; Granchi et al., 1999; Fernández-Espinar et al., 2000; Esteve-Zarzoso et al., 2001; Torija et al., 2001; Beltrán et al., 2002; Sabate et al., 2002; Clemente-Jiménez et al., 2004; Lopes et al., 2007; Maro et al., 2007; Valero et al., 2007; Barata et al., 2008; Jeyaram et al., 2008; Barrajón et al., 2009; Tofalo et al., 2009). El análisis de estas regiones ribosomales se basa en la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se trata de la amplificación de la región génica o secuencia diana deseada a la que se unen en cada cadena del ADN de la levadura, dos oligonucleótidos de secuencia conocida utilizados como cebadores para la enzima que lleva a cabo la reacción: la ADN polimerasa. Esta enzima, conocida como Taq polimerasa al haber sido aislada de la bacteria termófila Thermophilus aquaticus, es estable a las elevadas temperaturas a las que se desarrolla la PCR. Esta técnica consiste en un número de ciclos (habitualmente entre 25 y 45) y cada uno de ellos consta de los siguientes pasos: - desnaturalización del ADN, en la que se separan las dos cadenas de la molécula, - hibridación o unión de los cebadores a cada cadena, y - extensión, en la que la Taq polimerasa se une a los cebadores y a partir de ellos copia o replica la cadena de ADN molde. El resultado es la amplificación del ADN, duplicando la cantidad de ADN diana en cada ciclo. 7.1.1. Análisisderestricciónderegionesribosomales Se basa en la amplificación por PCR de la región 5,8S-ITS del ADN ribosómico (ADNr) a partir de los cebadores ITS1 e ITS4 descritos por White et al. (1999) y la posterior restricción de los amplificados. Es una técnica de fácil manipulación y gran reproducibilidad. Aunque lo habitual es usar ADN directamente como molde en la reacción de amplificación (Guillamón et al., 1998; Fernández-Espinar et al., 2000; Torija et al., 2001; Beltrán et al., 2002; Sabate et al., 2002; Clemente-Jiménez et al., 2004), diversos Introducción 39 autores han utilizado como molde una pequeña cantidad de biomasa de una colonia aislada (Esteve-Zarzoso et al., 1999; Granchi et al., 1999; Esteve-Zarzoso et al., 2001; Barata et al., 2008; Jeyaram et al., 2008; Tofalo et al., 2009). Esto supone un gran ahorro de tiempo y sólo precisa de un paso previo de 15 minutos a 95ºC en el protocolo de amplificación con objeto de liberar el ADN a la mezcla de reacción, para que pueda ser utilizado como molde. Los perfiles de amplificación se visualizan en geles de agarosa al 1.4%. Los productos de amplificado de distinto tamaño corresponden a especies diferentes, sin embargo, cuando los amplificados son del mismo tamaño, no siempre corresponden a la misma especie. Siempre es necesario recurrir a la digestión de estos fragmentos para llegar a la definitiva identificación. La digestión de los productos de PCR se lleva a cabo directamente sin necesidad de un paso previo de purificación. Para ello se emplean enzimas de restricción de ADN: son endonucleasas que reconocen una secuencia diana interna del ADN y generan un corte específico en dicha secuencia. Para la identificación de las especies de levaduras vínica las endonucleasas más empleadas son CfoI (con la misma diana y corte en el ADN que la enzima HhaI), HaeIII e HinfI y en ocasiones DdeI (Guillamón et al., 1998; Esteve-Zarzoso et al., 1999; Granchi et al., 1999; Esteve-Zarzoso et al., 2001; Torija et al., 2001; Beltrán et al., 2002; Sabate et al., 2002; Barrajón et al., 2009). Los fragmentos generados son separados por electroforesis en geles de agarosa al 3% y, una vez teñidos, revelan un perfil de bandas característico de especie. 7.1.2. Secuenciaciónderegionesribosomales La secuenciación es una técnica muy precisa y de aplicación relativamente rápida basada en la determinación y comparación de secuencias nucleotídicas de las regiones ribosomales. Las dos regiones más utilizadas son las correspondientes a los dominios D1 y D2 situados en el extremo 5’ del gen 26S (Kurtzman & Robnett, 1998; Baleiras Couto et al., 2005; Maro et al., 2007; Tofalo et al., 2009) y el gen 18S (James et al., 1997), aunque la región 5,8S-ITS también ha sido empleada en algunos trabajos (Nisiotou & Gibson, 2005). La disponibilidad de las secuencias en bases de datos, sobre todo en el caso de la región D1/D2 del gen 26S, hacen que esta técnica sea muy útil para asignar una levadura desconocida a una especie concreta cuando el porcentaje de identidad de sus secuencias sea superior o igual a 99% (Kurtzman & Robnett, 1998). Introducción 40 La amplificación del dominio considerado se lleva a cabo por PCR a partir del ADN total. En este caso, los productos de PCR han de ser purificados mediante kits comerciales para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucleótidos que interferirían en la reacción de secuenciación. 7.2. MétodosdecaracterizacióndecepasdelaespecieS.cerevisiae Existe una gran diversidad de técnicas para la diferenciación entre cepas. Se han utilizado técnicas de hibridación (Querol et al., 1992b; Xufre et al., 2006), análisis del cariotipo electroforético (Schütz & Gafner, 1993; Schütz & Gafner, 1994; Briones et al., 1996; Izquierdo Canas et al., 1997; Pérez-Coello et al., 1999; Fernández-Espinar et al., 2001; Valero et al., 2007; Jeyaram et al., 2008), análisis de restricción de mtADN (Querol et al., 1992c; Querol et al., 1994; Constantí et al., 1997; Sabate et al., 1998; Esteve-Zarzoso et al., 2001; Torija et al., 2001; Beltrán et al., 2002; Sabate et al., 2002; Schuller et al., 2004; Santamaría et al., 2005; Lopes et al., 2007; Mercado et al., 2007; Garijo et al., 2008; Barrajón et al., 2009), métodos de amplificación por PCR ya sea RAPD (Ramdon Amplified Polymorphic DNA) (Baleiras Couto et al. 1996; Maro et al., 2007; Tofalo et al., 2009), PCR de zonas repetitivas del genoma (Masneuf-Pomarède et al., 2007) , amplificación de secuencias δ (Egli et al., 1998; Fernández-Espinar et al., 2001; Ciani et al., 2004; Le Jeune et al., 2006; Mercado et al., 2007; Domizio et al., 2009), y AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Flores Berrios et al., 2005). 7.2.1. AnálisisderestriccióndelADNmt El alto grado de polimorfismo que revela el ADNmt entre cepas vínicas de S. cerevisiae hace que el análisis de esta variabilidad sea uno de los más aplicados para la caracterización de este tipo de aislados (Querol et al., 1992c; Querol et al., 1994; Constantí et al., 1997; Sabate et al., 1998; Esteve-Zarzoso et al., 2001; Torija et al., 2001; Beltrán et al., 2002; Sabate et al., 2002; Schuller et al., 2004; Santamaría et al., 2005; Lopes et al., 2007; Mercado et al., 2007; Garijo et al., 2008; Barrajón et al., 2009). Además, no requiere equipos sofisticados ni una gran habilidad personal (Querol et al., 1992c). Querol et al. (1992c) desarrollaron un método de análisis de ADNmt que evita la utilización de gradientes de cloruro magnésico y el uso de una ultracentrífuga, factor limitante para su uso en la industria. La simplificación de la técnica se basa en el hecho Introducción 41 de que el ADNmt de levaduras tiene un alto contenido en AT (75%) aunque contiene unas 200 regiones ricas en GC. Por tanto, digestiones del ADN total con enzimas del tipo GCAT no reconocen las secuencias ricas en GC ni las ricas en AT. Dado el bajo número de sitios de restricción en el ADNmt y el alto número de puntos de corte en el ADN nuclear, éste último se rompe en fragmentos de pequeño tamaño, lo que permite visualizar claramente las bandas correspondientes al ADNmt como bandas definidas, superpuestas a la sombra de degradación del ADN nuclear mediante una electroforesis convencional en gel de agarosa al 1%. No todos los enzimas revelan el mismo grado de polimorfismo y es muy dependiente de la especie. En el caso concreto de S. cerevisiae, el enzima más apropiado para la diferenciación a nivel de cepa es HinfI (Querol et al., 1994). 8. BrevehistoriadelvinoenMálaga,susDenominacionesdeOrigen(D.O.)y situaciónactualdelaviticulturaenRonda 8.1. BrevehistoriadelvinoyD.O.enMálaga Las primeras referencias del vino en Málaga se remontan a la llegada de los fenicios a sus costas en el s. VIII a.C., quienes no sólo introdujeron vinos procedentes del mediterráneo oriental sino que además cultivaron la vid en asociación con los grupos autóctonos elaborando vinos (http://www.vinomalaga.com). Coincidiendo con la fundación de la mítica Mainake, hacia el año 600 a.C., los griegos se establecieron en Málaga y enseñaron a los indígenas a podar las viñas según Guillén Robles (1987). En las ruinas romanas de Acinipo, en Ronda, se han encontrado numerosas monedas con la representación de un racimo de uvas, lo que da ha entender la importancia de la producción vitícola en ese territorio. En las tierras malagueñas de Al andalus se siguió cultivando la viña para producir vino y pasas. El vino llamado xarab al malaquí se siguió consumiendo, fue muy famoso y cantado por los más destacados poetas. El cultivo de la pasa sigue realizándose en nuestros días siguiendo la más genuina tradición, protegida bajo la D.O. Pasas de Málaga. Introducción 42 Con el descubrimiento de América se produce un gran auge de la viticultura en toda Andalucía, enviándose las primeras partidas al Nuevo Mundo. Se empieza a exportar a Europa en el siglo XV, siendo en el siglo XVI cuando se establece oficialmente el mercado con Inglaterra y Dinamarca (http://www.serraniaderonda.cc). En este siglo, se constituye en Málaga la Hermandad de Viñeros, que subsiste en su faceta gremial en lo que hoy es el Consejo Regulador y en su faceta religiosa en la Muy Ilustre Antigua y Venerable Hermandad Sacramental de Ntro. Padre Jesús Nazareno de Viñeros, Ntra. Sra. del Traspaso y Soledad de Viñeros y S. Lorenzo Mártir (http://www.vinomalaga.com). A finales del siglo XIX se produce de forma involuntaria, la renovación total del viñedo como consecuencia de la invasión por Phylloxera vastatrix (año 1876), insecto que ataca a la raíz de las cepas sensibles a esta plaga, responsable de la destrucción de prácticamente todos los viñedos establecidos en ese momento (http://www.serraniaderonda.cc). En el año 1900 aparece el Reglamento de la Asociación Gremial de Criadores Exportadores de Vino de Málaga, para velar por los intereses generales del comercio de vinos expidiendo certificados, nombrando árbitros y peritos y sobre todo, garantizando por medio de su sello de origen, la legitimidad de los vinos que exportaban. En 1924 consiguen la inscripción de la marca “Málaga” (http://www.vinomalaga.com). La Denominación de Origen Málaga es una de las más antiguas del país (1933). Ampara vinos cuyas uvas se recogen en cinco zonas de la provincia, alrededor de 1.030 hectáreas, repartidas por 66 municipios. Las zonas de producción son: Norte, Axarquía, Montes, Costa Occidental y Serranía de Ronda. Introducción 43 Figura 2. Zonas de producción de las DDO Málaga y Sierras de Málaga En 2001 se crea la Denominación de Origen “Sierras de Málaga”, subdenominación “Serranía de Ronda”, compartiendo Consejo regulador con la D.O. “Vinos de Málaga”. Los vinos “Sierras de Málaga” se clasifican en blancos, tintos y rosados y se pueden elaborar con las variedades blancas: Pero Ximen (Pedro Ximénez), Moscatel de Alejandría, Moscatel Morisco (Moscatel de grano menudo), Chardonnay, Macabeo, Sauvignon Blanc, Lairén y Doradilla; y las tintas: Romé, Cabernet Sauvignon, Merlot, Syrah, Tempranillo, Garnacha, Cabernet Franc, Pinot Noir, Colombard y Petit Verdot. Ampara los vinos “tranquilos”, aquellos que se obtienen mediante la fermentación natural de los mostos, con un contenido alcohólico de entre 10 y 15 %. 8.2. SituaciónactualdelaviticulturaenRonda La década de los sesenta trajo consigo una fuerte emigración que supuso el abandono del cultivo de la vid en muchas parcelas de la comarca de Ronda, aunque nunca se ha dejado totalmente de producir (http://www.serraniaderonda.cc). Actualmente el cultivo de la vid está resurgiendo. Se están estableciendo plantaciones modernas, con densidades de plantación que van de 4.300 a 5.000 plantas por hectárea, formadas en espaldera, cultivo en la mayoría de los casos ecológico, utilizando variedades ya injertadas sobre pies seleccionados en función de un análisis realizado sobre el suelo donde se van a plantar. Estas variedades son mayoritariamente tintas, como Tempranillo, Merlot, Syrah, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir, Garnacha Introducción 44 Tinta, Petit Verdot, y en menor medida con variedades blancas como la Chardonnay. La superficie existente en la actualidad ronda las 200 ha, comprendiendo éstas las antiguas (40 ha) y las de nueva plantación. La corriente vitivinícola que se está desarrollando en la comarca es heredera de los cambios que se han producido en el sector a nivel español en la década de los ochenta y noventa, pasando de la producción en gran cantidad (destinada mayoritariamente a la destilación) a la producción de vinos de alta calidad y sobre todo vinos con identidad propia. También se ha optado por la fusión entre el viticultor y el elaborador de vinos en una misma persona, dejando de ser así el trabajo en bodega un proceso industrial y pasa a ser un proceso artesanal, donde cada vitivinicultor da al vino unas características propias que reflejan todo lo que el suelo donde se cultivan esas viñas tiene de particular y característico. Se compite así con un producto de altísima calidad y con una identidad diferente a lo que existe en el mercado. 9. Viticulturayvinosecológicos Se entiende por agricultura ecológica, biológica, orgánica, biodinámica o biológico-dinámica al sistema agrario cuyo objetivo fundamental es la obtención de alimentos de máxima calidad respetando el medio ambiente y conservando la fertilidad de la tierra, mediante la utilización óptima de los recursos y sin el empleo de los productos de síntesis. La viticultura ecológica es una consecuencia de la anterior, donde la uva como fruto de la vid puede ser objeto de una producción ecológica. Sin embargo, la elaboración de vino ecológico como tal es un término no amparado por la legislación comunitaria actual, ya que este tipo de vino no se encuentra recogido en la Organización Común del Mercado Vitivinícola de la Unión Europea, y por lo tanto, no se puede hablar de vino ecológico, si no más bien de “vino procedente de uvas de agricultura ecológica” (Hidalgo Togores, 2003). Las parcelas destinadas a la agricultura ecológica deberán pasar por un periodo de conversión de al menos dos años antes de la siembra, o en el caso de cultivos vivaces distintos de las praderas de al menos tres años antes de la primera cosecha, aplicándose esta normativa en el caso del establecimiento de un viñedo ecológico. Introducción 45 La fertilidad y la actividad biológica del suelo deberán ser mantenidas o incrementadas mediante: - El cultivo de leguminosas, abono verde o plantas de enraizamiento profundo, con arreglo a un programa de rotación plurianual adecuado. - La incorporación de estiércol procedente de la producción ganadera ecológica, con un máximo de animales por hectárea equivalente a 170 kg de nitrógeno por hectárea y año. - La incorporación de cualquier otro material orgánico procedente de explotaciones de producción ecológica. - Podrán añadirse excepcionalmente y como complemento, fertilizantes establecidos, orgánicos o minerales, tales como estiércol, mantillo de excrementos sólidos o excrementos líquidos de animales, arcillas, serrín, sulfato de potasio, carbonato cálcico de origen natural, entre otras. - Para la activación de compost podrán utilizarse preparados apropiados a base de vegetales o preparados a base de microorganismos, que no estén modificados genéticamente, pudiendo utilizarse los llamados preparados biodinámicos a base de polvo de roca, estiércol de granja o vegetales. - Para mejorar el estado general del suelo o su disponibilidad de nutrientes, podrán utilizarse preparados apropiados a base de microorganismos, que no estén modificados genéticamente, cuando la necesidad de su empleo se reconozca expresamente por las autoridades. La lucha contra parásitos, enfermedades y malas hierbas también está establecida mediante una serie de medidas determinadas a adoptar según el caso. A pesar de no estar reglamentados los vinos ecológicos en la Unión Europea, en España, desde octubre de 2006, existen unas directrices para la elaboración vinos procedentes de uvas de agricultura ecológica (CAECV, 2010), donde destacan una serie de prácticas permitidas, entre otras: - Transporte de la uva a la bodega en el mismo día y de forma que se evite su compactación y alteración. Introducción 52 Guillamón, J.M., Sabaté, J., Barrio, E., Cano, J., Querol A. 1998. Rapid identification of wine yeast species based on RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region. Arch. Microbiol. 169: 387-392. Guillén Robles, F. 1987. Historia de Málaga y su provincia. Editorial Arguval, Málaga, España. Gutiérrez, A.R., Lopez, R., Santamaría, M.P., Sevilla, M.J. 1994. 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Este proyecto tiene su origen en la convocatoria de concurso para la realización de proyectos de investigación y transferencia de tecnología en el ámbito de la agricultura y ganadería ecológica (Expdte.: 92162/1) de la Junta de Andalucía, siendo los procesos industriales agroalimentarios ecológicos una de las líneas de investigación y, en concreto, la mejora de los métodos de vinificación ecológica. Dentro de este contexto, el proyecto se presentó coordinado con una bodega recientemente establecida en la Serranía de Ronda con vocación de producir vinos, tintos particularmente, a partir de uva de cultivo ecológico. A pesar de no existir una regulación europea sobre la elaboración de vinos ecológicos, a nivel nacional existen unas recomendaciones para la elaboración de dichos vinos; entre ellas la fermentación a partir de las levaduras presentes de forma natural en el mosto (fermentaciones espontáneas) o el empleo de levaduras seleccionadas. Por tanto, el objetivo principal de nuestro trabajo era la mejora de la elaboración ecológica de los vinos en la bodega de estudio mediante el empleo de levaduras autóctonas de la Serranía de Ronda que proporcionen características únicas y propias de la zona de producción, y que contribuya a la conservación de la biodiversidad. Por otra parte, dada las características de la bodega y de su viñedo, ambos de reciente creación, ha sido práctica común el empleo de levaduras comerciales desde el inicio de la actividad de la bodega para asegurar el desarrollo de la fermentación. El primer paso, por tanto, y antes de realizar los trabajos de selección, era conocer la microbiota levaduriforme propia (autóctona) de Ronda, nunca antes estudiada y crear una colección de cultivos puros de Saccharomyces cerevisiae autóctonas. El empleo de Capítulo1 69 Abstract An ecological study of a spontaneous and an inoculated fermentation in red wine was carried out in the 2005 vintage in a winery located in the Denomination of Origin “Sierras de Málaga” (Malaga, southern of Spain). The winery operated by the first time with the 2003 vintage and since then has used commercial yeast inoculums to start alcoholic fermentation. Yeast isolates were identified by ribosomal DNA and mitochondrial DNA RFLP analysis. All the isolates were found to be strains of Saccharomyces cerevisiae whose mitochondrial restriction patterns matched to some of those of the commercial yeasts employed by the winery during the successive vintages. The same four restriction patterns were found in non inoculated and inoculated vats, although with different frequencies. No non-Saccharomyces yeasts or indigenous Saccharomyces yeasts were isolated during fermentation, and the former were only found in the fresh must before fermentation. The use of commercial yeast starter in a new established winery seems to have prevented the development of a resident indigenous Saccharomyces flora, and suppressed the growth of non-Saccharomyces yeasts during the early stages of the fermentation. Keywords: Saccharomyces cerevisiae, alcoholic fermentation, inoculation, new winery Capítulo1 70 1.Introduction The conversion of grape must to wine is a complex microbiological reaction involving the sequential development of various yeast and lactic acid bacteria species. Traditionally, wine has been produced by natural fermentation of grape juice by yeasts that originate from the grapes and winery equipment. As summarized by Beltran et al. (2002), the diversity, composition and evolution of yeast flora in grape musts depend on a variety of factors: geographic location, climatic conditions, age of the vineyard and grape variety. Yeast of the genera Kloeckera, Hanseniaspora, Candida, Pichia and, sometimes, Hansenula grow during the early stages of fermentation but eventually die off, leaving Saccharomyces cerevisiae as the dominant species to complete the fermentation (Heard and Fleet 1985). On the other hand, using active dry yeast in fermentation is becoming one of the most common practices in winemaking because it ensures a reproducible product and reduces the lag phase and the risk of wine spoilage (Beltrán et al. 2002; Heard and Fleet 1985; Santamaría et al. 2005). The inoculation of a large population of S. cerevisiae strains could inhibit the growth of other Saccharomyces and also non-Saccharomyces species. Hence, inoculation limits the growth of wild yeasts (Santamaría et al. 2005). Thus, the winemaking community is still widely divided about this practice because of a widespread belief that native yeast strain gives a distinctive style and quality to wine (Beltrán et al. 2002). This study shows the influence of the winery characteristics, in special, the age and the use of commercial yeasts, on the yeast ecology of the winery: the behaviour of the commercial strains used in different vintages in order to become a component of the winery yeast flora and participate in inoculated and non-inoculated fermentations. 2. MaterialsandMethods 2.1.Thevineyardandthewinery The vineyard and the winery are located in the “Serranía de Ronda” (Malaga, South of Spain), both belonging to the Denomination of Origin “Sierras de Málaga”. The vineyard, established in 2002, has an extension of approximately four ha of cultivated grapevines (Merlot, Syrah, Cabernet Sauvignon and Garnacha) and it is managed under the routine practices of Integrated Production and Organic Farming. Capítulo1 71 The winery was built just prior to the 2003 vintage, and it is adjacent to the vineyard. Its first vinification took place during the 2003 and 2004 vintages but with grapes harvested in other vineyards from the same municipality. All the equipment in the winery was totally new and neither the winery, nor the equipment had been previously exposed to must, fruit juices, wines, or any beverage or food before the 2003 vintage. For this reason, the use of commercial starter has become a usual practice in this winery to ensure the alcoholic fermentation. 2.2.Winefermentations The conditions of fermentations were established by the management of the winery according to their common practises and commercial interests Wines were produced from Cabernet Sauvignon grapes harvested during the 2005 vintage. The must was supplemented with sulfur dioxide (35 mg/liter) and was separated in two different vats of 700 liters each and kept at 10 ºC during 48 h. Next, Vat 1 was inoculated with the active dry yeast Excellence XR (Lamothe-Abiet, France), that was rehydrated prior to inoculation according to the instructions of the supplier (25 g/Hl); and Vat 2 was inoculated with a spontaneous fermenting must of the same variety prepared separately from the winery. This addition of natural preconditioned yeast cells is called the “pie de cuba” method of inoculation (pied de cup). The fermentations in both vats took place under the same conditions of temperature (25-30ºC) and kinetics of the fermentation was monitored by measuring the Baume degree. 2.3.Yeastisolation Samples were taken periodically during the fermentation for the isolation and enumeration of yeasts. Density was monitored in each vat and three sampling points were considered: the beginning (14 Baume degree), the middle (6-7 Baume degree) and the end (less than 2 Baume degree) of the alcoholic fermentation. Additionally, a sample of the fresh must before filling the vats was also taken for microbiological analysis perfomance. Aliquots (0.1 ml each) of serial dilutions were spread onto plates of YEPD agar (yeast extract 1% w/v, peptone 1 % w/v, glucose 2 % w/v, agar 2 % w/v). Plates were incubated at 28 ºC for 72 hours and, for each sample, 30 colonies were randomly chosen and submitted to further studies. Capítulo1 72 2.4.Yeastidentification To rapidly discriminate between Saccharomyces and non-Saccharomyces yeast, every isolate was evaluated according to its ability to grow on L-lysine plates (Barnett et al. 1990). Isolates that were not able to grow using L-lysine as the sole nitrogen source were classified as Saccharomyces. This classification was confirmed by PCR of the ribosomal region encompassing the 5,8S ribosomal DNA (rDNA) gene and the two internal transcribed spacers. rDNA was amplified by PCR in a TC-312 Techne termocycler using primers ITS1 and ITS4, described by White et al. (1990). The species of the isolates were identified by PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) digesting with the restriction endonucleases HinfI, HhaI (same enzymatic activity than CfoI) and HaeIII (Amersham Biosciences) as previously described by Guillamón et al. (1998). PCR products and restriction fragments were separated on a horizontal 1.4% and 3 % (w/v) agarose gel, respectively, in TAE buffer and compared with standards (100-bp DNA ladder, Amersham Biosciences). 2.5.Straindifferentiation Mitochondrial DNA (mtDNA) restriction analysis was used to differentiate strains of S. cerevisiae. DNA extraction and restriction of mtDNA was performed according to Querol et al. (1992b). Electrophoresis was carried out as described before except that restriction products were separated on a 1 % (w/v) agarose gel and lambda DNA digested with PstI was used as standard. Results of restriction with HinfI (Amersham Biosciences) were found to be the most informative (Querol et al. 1994). 2.6.Commercialyeasts Samples of the active dry yeasts used in the winery since the first vinification (2003 vintage) were also analysed in order to distinguish between indigenous Saccharomyces strains and commercial ones. Table 1 shows the commercial yeasts used in the winery during the 2003 to 2005 vintages. 3.Results Two vats from the winery specified in Materials and Methods were selected to study the evolution of Saccharomyces strains populations during the fermentation of Cabernet Sauvignon musts. One of the vats was inoculated with the commercial dry yeast strain coded as LSA7, and the other one was inoculated with a pied de cup Capítulo1 73 prepared with the same grape variety. Four sampling points were defined and a total of 206 yeast colonies were isolated. 3.1.Yeastidentification Wine yeasts isolated from the fresh must and during the fermentation of Cabernet Sauvignon must in both vats were initially tested for their capability to grow in L-lysine medium. According to this test, non-Saccharomyces yeasts were only found in the fresh must sample, but in a low proportion (five out of the 26 isolates), and the rest of the yeast strains were assigned to the genus Saccharomyces. The PCR-amplified products from Saccharomyces ITS1-5,8S rDNA-ITS2 regions showed the same size (850 pb), indicating that those isolates belonged to the Saccharomyces sensu-stricto group (Fernández Espinar et al. 2000). The PCR products digested with HhaI, HaeIII and HinfI endonucleases were analysed comparing the sizes of the restriction products with those described previously (Esteve-Zarzoso et al. 1999). These results showed that all the Saccharomyces isolates correspond to the species S. cerevisiae (Figure 1). 3.2.Straindifferentiation The mtDNA restriction patterns of the S. cerevisiae isolates revealed scarce diversity at strain level, with only four different patterns characterized (A, B, C and D). The number and frequencies of the patterns of the isolates are presented in Table 2 and represented in Figure 2. In addition, when comparing these patterns with those obtained from the commercial yeasts used in the winery (Figure 3), we found that the patterns A, B, C and D were coincident with those of the commercial yeast coded as starter LSA2, LSA4, LSA3 and LSA7, respectively (Figure 4). More interestingly, no indigenous (wild) Saccharomyces strains were isolated during the fermentation and not even in the fresh must where, curiously enough, most of the isolates in the fresh must corresponded to commercial Saccharomyces cerevisiae strains but four non-Saccharomyces isolates (Table 2). Yeast strains with each of the four patterns were found in both vats during the fermentation, but pattern C was scarcely represented. This mtDNA restriction pattern corresponds to commercial starter LSA3 that was used only during the 2004 vintage, prior to this study. Strains showing restriction patterns A, B and D were found in both Capítulo1 74 vats with some differences in their frequencies, particularly in Vat 1 (Figure 2). In Vat 2 the three main patterns (A, B and D) were found at slightly different frequencies, especially at the beginning and middle fermentation stages, thus, none of these yeast strains prevailed during the alcoholic fermentation. Active dry yeast coded as starter LSA4 (pattern B) has been used every vintage since the start of the vinification activity in the winery (2003, 2004 and 2005 vintages). In both vats the number of isolates increased in the middle stage of the fermentation but decreased in the last stage. Active dry yeast LSA2 (profile A) used in the winery in the 2005 vintage for the first time to inoculate other fermentation vats, was found in both vats at frequencies close to 30% (33.3 and 26.6 % in Vat 1 and 2, respectively). Commercial starter LSA7 (profile D) has been used in the 2004 and 2005 vintage campaigns and for inoculating Vat 1 during this study. This fact explains its dominance in this vat and its prevalence until the end of the fermentation, representing 52.2 % of isolates. Finally, no strain with a profile similar to commercial strain LSA1 (firstly used during the vintage campaign of this study) was isolated in any of the sampled vats. 4.Discussion Different authors have studied the fermentation of grape juice into wine pointing out the role of yeasts, mainly S. cerevisiae but also other non-Saccharomyces species, as primarily responsible for the alcoholic fermentation (Heard and Fleet 1985; Querol et al. 1994; Torija et al. 2001). These studies demonstrate that S. cerevisiae, extremely rare on grape and vineyard (Le Jeune et al. 2006, Martini 1993, Pretorius 2000; Sabate et al. 2002) but mainly colonising the surface of winery equipment (Beltran et al. 2002; Ciani et al. 2004; Le Jeune et al. 2006; Rosini 1984; Sabate et al. 2002; Sangorrin et al. 2002; Vaughan-Martini and Martini 1995), dominates the fermentation process due to its efficient fermentative metabolism. The use of S. cerevisiae starters in the form of active dry yeast has become a usual practice to ensure the reproducibility of fermentations and the final product quality (Beltran et al. 2002; Henick-Kling et al. 1998; Querol et al. 1990, 1992b; Santamaria et al. 2005). Diverse molecular methods to clearly differentiate between the inoculated S. cerevisiae strain and the wild S. cerevisiae strains present in Capítulo1 75 musts are available (Le Jeune et al. 2006; Mercado et al. 2007; Querol et al. 1992a; Schuller et al. 2005; Schütz and Gafner 1993). Among these techniques, mitochondrial DNA restriction analysis has proven useful for monitoring inoculated wine fermentations due to the high mtDNA polymorphism among wine Saccharomyces strains (Constantí et al. 1997, Querol et al. 1992a). In this work, we have stated how the use of commercial yeast in a modern winery since the first vintage influenced the composition of the winery yeast flora as to participate in inoculated (Vat 1) and non-inoculated (Vat 2) fermentations. According to our results, commercial Saccharomyces strains have been the most isolated both from the fresh must and during the alcoholic fermentation in the two vats sampled, we have not isolated any indigenous Saccharomyces strain from these sources and only a low population of non-Saccharomyces has been detected in the fresh must. The absence of indigenous S. cerevisiae strains results especially curious in the vat 2 inoculated with a natural pied de cup prepared separately of the winery. In this kind of inoculums cellular densities may achieve values of 106-107 cells/ml, thus it seems quite unlikely that indigenous or wild S. cerevisiae strains that occur in such a high concentration are completely suppressed by the winery’s resident commercial S. cerevisiae strains, unless the natural flora is mainly composed of commercial S. cerevisiae strains. Therefore, it is important to bear in mind some considerations about the characteristics of our work. Both the vineyard and the winery were recently established, the winery equipment was also brand new and, thus, a resident Saccharomyces microbiota was not available to initiate and lead the fermentation, for this reason, the use of commercial yeasts has been a usual practice since the beginning of the winery activity in the 2003 campaign to ensure the alcoholic fermentation. In such circumstances, after several vintages and fermentations, the equipment, walls and the rest of the winery has become suitable for the development of a microbiota adapted to the winery environment (Martini et al. 1996), and it is likely that this winery resident microbiota is composed of commercial strains that have been selected for their good adaptation to the winemaking process (Boulton et al. 1996). On the other hand, it is of interest to note that during the two first vintages (2003 and 2004 vintages) the lees obtained from the fermentation vats, containing the commercial yeasts used in the winery, were spread along the closest vineyard with fertilizing purposes. Since the vineyards were recently established it seems that not only the winery but also the vineyard became “contaminated” with Capítulo1 76 commercial yeast strains. Valero et al. (2005) reported how commercial strains were isolated in the vineyard at very close proximity to the winery, especially after the harvest and once the winery activity have started, reflecting immediate dissemination. Thus, further studies about the evolution of these yeasts in the vineyard would be of great interest. Furthermore, our experiment took place when other grape varieties had already been harvested and fermented, thus the winery was already enriched with fermenting commercial Saccharomyces strains. It is well known than “crosscontamination” between adjacent vats by means of insects or winery equipment is frequent (Constantí et al. 1997, Ribereau.Gayon et al. 2000), even the air in itself could behave as a means for the dispersal of microorganisms within the winery and for the inoculation of tanks (Garijo et al. 2008), which may explain that commercial strains used during the vintage and contaminating the winery become dominant during fermentation. All these reasons may explain the sole presence of commercial yeasts in both fermentation vats. However, the isolation of the different commercial yeasts used in the cellar does not occur to the same extent. The presence of starters LSA2, LSA4 and LSA7 was quite remarkable in both vats, while starter LSA3 (used in the 2004 vintage) and starter LSA1 (used in the 2005 vintage) were scarce or null, respectively. Santamaría et al. (2005) reported that as more vintages are studied in a winery, more previously detected strains appear, indicating that different S. cerevisiae strains remain in the winery ecosystem. According to these authors, the different conditions of each harvest could determine which specific strains develop during the fermentation. Finally, a significant dominance of the inoculated yeast (starter LSA7) in Vat 1 could not been observed contrary to results described in other works when monitoring wine fermentations conducted by active dry yeast (Querol et al. 1992a). In our study, at the end of the fermentation, the frequency of isolation of the strain inoculated in Vat 1 was only 52.2 %, higher than in the non inoculated Vat 2 (33.3 %), but lower than that suggested by Delteil et al. (2001) to consider that the implantation is effective (80 %). So, it seems that in Vat 1, the inoculated starter strain LSA7 competed with strains LSA2, LSA3 already present in the fresh must and with LSA4 detected during fermentation, but did not completely suppress their growth (see Figure 2). This result agrees with that of Querol et al. (1992a), demonstrating the competence among Saccharomyces strains resident in the must before the inoculation, and the inoculated Capítulo1 77 one. Depending on the proportion of each yeast strain and their own nature, one or more strains will persist during the fermentation process (López et al. 2003, Schütz and Gafner 1993). Our results confirm the influence of some winery characteristics, in special, the conjunction of the age of the winery (a newly built one) together with the practice of the use of commercial yeasts, on the yeast ecology of the winery. The use of active dry yeast can not only induce a decrease in the presence of non-Saccharomyces yeasts and indigenous Saccharomyces, as reported by other authors (Beltrán et al. 2002; Constanti et al. 1997; Henick-Kling et al. 1998; Santamaría et al. 2005), but hindering their development in the winery environment during the first vintages. Therefore, the practice of using wine lees as fertilizer facilitates the dissemination of commercial strains in the vineyard near to the winery, probably explaining their presence in the fresh must and in the fermentation vats when pied de cup starters are prepared, as it seems likely to have happened in our study. We also conclude that further studies on the yeast population on the vineyard, winery equipment and pied de cup would be of great interest in order to a better understanding of yeasts dynamics during the fermentation process. We consider these results to be taken into account in the case of newly established wineries and of particular relevance for winemakers that intend to implement Organic Farming and that consider avoiding the use of commercial strains and instead rely on indigenous (native) flora. Acknowledgements This work was supported by grant from “Junta de Andalucía” (Spain) to P.P. (Exp. 92162/11). The authors wish to thank J. Fernández and P. Ortigueira who provided the wine winery facilities for the realization of this work. Capítulo1 84 Tables Table 1. Commercial yeasts strains used in the winery during 2003-2005. Vintage Commercial yeast Assigned code 2003 2004 2005 BDX, Lallemand LSA4 X X X Rhône 2056, Lallemand LSA3 -- X -- Excellence XR, Lamothe-Abiet LSA7 -- X X Excellence SP, Lamothe-Abiet LSA2 -- -- X LA-BJL, Lamothe-Abiet LSA1 -- -- X X: used. --: Not used Table 2. Number and frequencies (%) of S. cerevisiae strains presenting patterns A, B, C, D of mtDNA, isolated from each fermentation vat and yeast population in must and each stage of fermentation (BF: beginning; MF: middle; EF: end). Vat 1 inoculated with commercial yeast LSA7 (pattern D); Vat 2 prepared with a “pied de cup”. Vat 1 Vat 2 Strain/Pattern Must BF MF EF BF MF EF LSA2 / A 8 (31%) 9 (30%) 5 (16.7%) 10 (33.3%) 12 (40%) 8 (26.7%) 10 (33.3%) LSA4 / B 0 6 (20%) 8 (26.7%) 3 (10%) 7 (23.4%) 13 (43.3%) 9 (30%) LSA3 / C 6 (23%) 1 (3.3%) 0 1 (3.3%) 1 (3.3%) 0 0 LSA7 / D 7 (27%) 14 (46.7) 17 (56.6%) 16 (53.4%) 10 (33.3%) 9 (30%) 11 (36.7%) S. cerevisiae isolates 21 30 30 30 30 30 30 Capítulo 2 Influence of the winery environment in the yeast populations present in alcoholic fermentations inoculated with a natural “pied de cup” or a commercial yeast strain Almudena Clavijo, Isabel L. Calderón, Patricia Paneque Enviado a Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Capítulo2 87 Abstract The present study has been carried out in an organic winery established in 2003 in the Denomination of Origin “Sierras de Málaga” (Southern Spain) region, during the 2007 vintage. The aim of this work was to ascertain the yeast microflora present in the winery and the vinifications and to obtain by the first time a collection of autochthonous S. cerevisiae strains from this area. Yeast population from three vats containing fermenting musts from different grape varieties were analysed. Two of them were inoculated with a natural “pied de cup” while the third was sown with a rehydrated commercial yeast strain. A total of 382 yeasts were isolated and identified, initially by restriction analysis of ribosomal DNA and further by sequencing of this region. Non- Saccharomyces yeasts were found in all three musts but they practically disappeared as the fermentations progressed. Analysis of mitochondrial DNA RFLP revealed 13 different restriction patterns of Saccharomyces cerevisiae strains, five of them similar to those of commercial strains used in the winery. Commercial strains were found even in vats inoculated with “pied de cups” generated by spontaneous fermentation of a must sample. The analysis of samples recovered from different winery surfaces and equipments demonstrated that non-Saccharomyces, and both commercial and autochthonous Saccharomyces strains were part of the resident microflora in the winery. Biodiversity of autochthonous S. cerevisiae in fermentation vats was low but two of them were able to compete with the commercial ones and they were isolated even at the end of fermentations. Keywords: Saccharomyces cerevisiae, commercial strains, alcoholic fermentation, inoculation, winery surfaces Capítulo2 88 1.Introduction Wine is the result of the alcoholic fermentation of must by different yeast strains. S. cerevisiae is the main yeast species which carries out the fermentation (Fleet & Heart, 1993). Traditionally, wine has been produced by natural fermentation of grape juice by yeasts that originate from the grapes and winery equipment (Fleet & Heart, 1993; Le Jeune et al., 2006). However, Martini (1993) concluded that few, if any, cells of S. cerevisiae resident on the grapes provide an extremely limited contribution to spontaneous must fementation. These results have been confirmed by Ciani et al. (2004) that demonstrated that S. cerevisiae strains colonising the winery surfaces are responsible of the natural must fermentation. On the other hand, the use of active dry yeast in fermentation is becoming one of the most common practices in winemaking because it ensures a reproducible product and reduces the lag phase and the risk of wine spoilage (Beltrán et al., 2002; Heard & Fleet, 1985; Santamaría et al., 2005). The inoculation of a large population of S. cerevisiae strains could inhibit the growth of other Saccharomyces and also non-Saccharomyces species, thus limiting the growth of wild yeasts (Santamaría et al., 2005). Commercial yeast strains used in the wineries could become winery-resident strains and take over the spontaneous fermentation (Mercado et al., 2007; Santamaría et al., 2005). However, the use of starter cultures can also produce loss of complexity in the final wine (Mas et al., 2002) displacing or even eliminating from fermentation native yeast strains that confer a distinctive style and quality to the wine. The “Serranía de Ronda” is a wine-producing area of Malaga (Southern Spain) characterized by recently new established small cellars, where the use of commercial strain in vinification is a common practice by winemakers, even in wineries producing organic wines as that in which this study was carried out. However, one of the recommendations is the use of autochthonous or native yeasts to carry out the fermentations (Hidalgo Togores, 2003). In this context, it is very important to isolate and identify yeast strains present in the media and to study their oenological characteristics in order to evaluate their potential in wine-making (Briones et al. 1995; Pérez-Coello et al., 1999). In a previous work, we isolated and identified the yeast microflora present in fermenting Cabernet Sauvignon musts, both in a vat that was inoculated with commercial yeast and in vat in which fermentation took place spontaneously. In that campaign (2005 vintage) only commercial Saccharomyces strains Capítulo2 89 used in that vintage and in previous ones were isolated, thus suggesting that they had become natural residents of the winery participating even in inoculated and noninoculated fermentations. In the present study we have sampled fermenting vats during the 2007 campaign in order to follow up the evolution of the yeast microflora after several campaigns and to evaluate the implantation of the commercial strains in the vinification process. In addition, yeast population associated to the winery surfaces has also been investigated in order to asses their role in vinification. Finally, the obtainance of a collection of autochthonous S. cerevisiae strains of the “Serranía de Ronda”, never accomplished before, will make it possible to evaluate their oenological properties in future studies. 2.MaterialsandMethods 2.1.Thevineyardandthewinery The vineyard and the winery are located in the Serranía de Ronda (Malaga, South of Spain), both belonging to the Denomination of Origin “Sierras de Málaga”. The vineyard, established in 2002, has an extension of approximately four ha of different cultivated grapevines (Merlot, Syrah, Cabernet Sauvignon and Garnacha) and is managed under the routine practices of Integrated Production and Organic Farming. The winery that was built just prior to the 2003 vintage, is adjacent to the vineyard. Its first vinifications took place during the 2003 and 2004 vintages but with grapes harvested in other vineyards from the same area. All the equipment in the winery was totally new and neither the winery, nor the equipment had been previously exposed to must, fruit juices, wines, or any beverage or food before 2003 vintage. For this reason, the use of commercial starter became a usual practice in this winery in order to ensure the alcoholic fermentation. Table 1 shows the commercial strains used by the winery in the 2003 to 2007 vintages. 2.2.Winefermentations The conditions of fermentations were established by the management of the winery according to their common practises and commercial interests. Wines were produced from Merlot, Syrah and Cabernet Sauvignon grapes harvested during the 2007 vintage. Musts were supplemented with 35 mg/liter of Capítulo2 90 sulphur dioxide. A “pied de cup” was prepared by allowing a sample of Merlot must to ferment spontaneously for approximately 9 days. In the Merlot fermentation, must was inoculated 9 days after cold maceration, with 20 L of the prepared “pied de cup”. In the Syrah fermentation, the “pied de cup” was added to the vat only 24 hours after the extraction of the must because a strong spontaneous fermentation was detected. In the latter case, 10 L of fresh Syrah must was added to 10 L of the “pied de cup” prior to inoculation. Cabernet Sauvignon vat was inoculated five days after cold maceration, with the active dry yeast LSA7 (Excelence XR, Lamothe-Abiet, Bordeaux, France) that was rehydrated prior to inoculation according to the instructions of the supplier (25 g/Hl). All fermentation took place in vats containing 700 L of must kept at 25-30ºC. 2.3.Yeastisolation Fermentation kinetics was monitored by density measurement. Five samples were considered for the isolation and enumeration of yeast: (1) grape juice before SO2 addition; (2) must before inoculation; (3) inoculum; (4) at the middle (6.5º Baume) and (5) at the end (< 2º Baume) of alcoholic fermentation. However, in the case of Cabernet Sauvignon vat, since it was inoculated with a rehydrated commercial strain, the inoculum was not analysed; the sample corresponding to the middle of the fermentation was not taken due to accidental circumstances. An additional study of the yeast microflora that was present in the winery surface previous to the 2007 campaign was also carried out. Once the 2006 campaign was over and all the winery equipment had been cleaned with a solution of NaOH, microbial analyses were conducted on winery surfaces and winery equipment. The isolation was performed as follows: sterile cotton plugs were streaked on surfaces of approximately 400 cm2 each on the winery floor (two samples), on the winery wall (two samples), of the pneumatic press (two samples), of the destemmer (one sample), of the empty fermentation vats (internal and external, four samples), of the storage vat (two samples), of the barrels with wine (four samples) and of winery sink (one sample). Then, the cotton plugs were introduced in sterile tubes filled with 5 ml sterile Ringer solution and upon arrival to the laboratory where they were vigorously shaken for 1 hour at room temperature before plating. Aliquots (0.1 ml each) of serial dilutions were spread onto plates of YEPD agar (yeast extract 1% w/v, peptone 1 % w/v, glucose 2 % w/v, agar 2 % w/v) and the plates Capítulo2 91 were incubated at 28 ºC for 72 hours. When possible, 30 colonies of each sample were randomly chosen and submitted to further studies. 2.4.Yeastidentification To rapidly discriminate between Saccharomyces and non-Saccharomyces yeasts in samples from winery surfaces and equipment, every isolate was evaluated according to its ability to grow on L-lysine plates (Barnett et al., 1990). Isolates that were not able to grow using L-lysine as the sole nitrogen source were classified as Saccharomyces. PCR of the ribosomal region encompassing the 5,8S rRNA gene and the two internal transcribed spacers was used to identify species of yeast isolates. rDNA was amplified by PCR in a TC-312 Techne termocycler using primers ITS1 and ITS4, described by White et al. (1990). The species of the isolates were identified by PCRRFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), digesting the PCR products with the restriction endonucleases HhaI (same enzymatic activity as CfoI), HaeIII and HinfI (Takara BIO INC, Otsu, Shiga, Japan) as previously described by Guillamón et al. (1998). PCR products and restriction fragments were separated on a horizontal 1.4% and 3% agarose gel, respectively, in TAE buffer and compared with standards (100-bp DNA ladder, Amersham Biosciences). Species were confirmed by sequencing the D1/D2 variable domains of 26S rRNA gene, of at least two isolates of each species. Amplification of the fragments to be sequenced was carried out using the external primers NL-1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) and NL-4 (5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’). PCR reactions were performed in a 100 µl volume containing 0.25 µM of each primer, 80 µM of dNTP, 1 x buffer (MBL, Dominion), 1.5 mM MgCl2, 5 U Taq polymerase (MBL Dominion, Cordoba, Spain), and DNA isolated according to Querol et al. (1992) and diluted to 1-50 µg/µl. PCR was performed in a TC-312 cycler (Techne) as follows: a first denaturation step at 95 ºC for 5 min, followed by 36 cycles with a temperature profile of 94 ºC for 1 min, 58 ºC for 1 min and 72 ºC for 1.5 min. An extension period of 5 min at 72 ºC was carried out after 36 cycles. The PCR products were purified using a Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up system (Promega, Madrid, Spain) according to the manufacturer’s instructions and then sequenced by the company Stab Vida (Portugal). A BLAST analysis Capítulo2 92 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) was performed for the sequences obtained. Identification was considered to be valid when the identity was at least 98 %. 2.5.S.cerevisiaestraindifferentiation Mitochondrial DNA (mtDNA) restriction analysis was used to differentiate strains of S. cerevisiae. DNA extraction and restriction of mtDNA was performed according to Querol et al. (1992). Electrophoresis was carried out as described before except that restriction products were separated on a 1 % agarose gel and lambda DNA digested with PstI was used as standard. Results of restriction with HinfI (Takara BIO INC., Otsu, Shiga, Japan) were found to be the most informative (González et al., 2007; Querol et al., 1994). Samples of the active dry yeasts used in the winery since the first vinification (2003 vintage) were also analysed in order to distinguish between indigenous Saccharomyces and commercial ones. 3.Results 3.1.Vinifications A total of 390 colonies (30 colonies from 13 different samples) were isolated from the three tanks sampled. However, since a few isolates (eight) died off before being identified, only 146 colonies from Merlot, 146 from Syrah and 90 from Cabernet Sauvignon vats were analysed. 3.1.1.Yeastidentification Table 2 indicates the number of isolates of each species found during the fermentation of the musts. Analysis of RFLP of PCR 5.8-ITS rRNA region products revealed that 287 of 382 isolates were S. cerevisiae strains. The other species identified were Hanseniaspora guilliermondii (68 isolates), H. uvarum (18 isolates), Issatchenkia orientalis (2 isolates), Pichia anomala (6 isolates) and Kluyveromyces thermotolerans (only 1 isolate). Sequencing of the D1/D2 variable domains of 26S rDNA confirmed these results. Non-Saccharomyces yeasts were isolated only in the grape juice (before SO2 addition) in all the fermentations and, in the Cabernet Sauvignon vat, also in the must Capítulo2 93 before inoculation. Afterwards, Saccharomyces strains took over the fermentation in all cases (Table 2). 3.1.2.Saccharomycesstraindifferentiation Mitochondrial DNA restriction analysis of the 287 Saccharomyces isolates revealed 13 different patterns (Figure 1). Five of them were coincident with those of the commercial yeast used in the winery, namely LSA2 (A), LSA3 (C), LSA7 (D), LSA8 (F) and LSA1/LSA9 (E) (LSA1 and LSA9 presented the same pattern) (Figure 2). The eight remaining patterns were different from those described of the 45 commercial strains described in Fernández-Espinar et al. (2006) and, thus, they were considered autochthonous or indigenous, although the possibility of them being commercial ones used in nearby wineries can not be discarded although we consider it to be unlikely. Patterns M and N had been also found during the 2006 campaign on the surface of the grapes from the surrounding vineyard, but the other 6 patterns coded V, W, X, Z, AG and AM were isolated by the first time in this zone. However, as shown in Tables 3 to 5 not all the patterns were found in the three vats. S. cerevisiae strains corresponding to profiles A, C, D and F (commercial strains) and AG (autochthonous strain) were isolated in the three vats, although with different frequencies, but other patterns were only found in some of the vats. Merlot vat presented a higher S. cerevisiae diversity than Syrah and Cabernet Sauvignon vats. Six restriction profiles corresponding to one commercial (pattern E) and five autochthonous strains (M, N, V, W and Z) were only found in Merlot vat, while pattern X is exclusive from Syrah vat and pattern AM was common to Syrah and Cabernet Sauvignon vats. Merlot grapes were vinificated in first place. In the grape juice, although non- Saccharomyces species were predominant, some S. cerevisiae yeasts were also present (4 colonies out of 27) (Table 3). Two of them corresponded to one of the commercial strains (LSA1/9, pattern E), and the other 2 isolates, to wild S. cerevisiae strains. After 9 days of cold maceration, in the must before inoculation, non-Saccharomyces yeasts had died off and only S. cerevisiae strains were found, mainly commercial ones; most of them corresponded to commercial strain LSA8. Autochthonous strains were also found but were different to those previously isolated in the grape juice: pattern AG (4 isolates) and V and W (one isolate each). Capítulo2 100 Heard, G.M., Fleet, G. 1985. Growth of natural yeast flora during the fermentation of inoculated wines. Appl. Environ. Microbiol. 50: 727-728. Hidalgo Togores, J. 2003. Tratado de Enología. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid, Spain, pp1027-1037. Le Jeune, C., Erny, C., Demuyter, C., Lollier, M. 2006. 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Pérez-Coello, M.S., Briones Pérez, A.I., Ubeda Iranzo, J.F., Martín Álvarez, P.J. 1999. Characteristics of wines fermented with different Saccharomyces cerevisiae strains isolated from the La Mancha region. Food Microbiol. 16: 563-573. Pretorius, I.S. 2000. Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of winemaking. Yeast 16: 1-55. Querol, A., Barrio, E., Huerta, T., Ramón, D. 1992. Molecular monitoring of wine fermentations conducted by active dry yeast strains. Appl. Environ. Microbiol. 58: 2948-2953. Querol, A., Barrio, E., Ramón, D. 1994. Population dynamics of natural Saccharomyces strains during wine fermentation. Int. J. Food Microbiol. 21: 315-323. Capítulo2 101 Santamaría, P., Garijo, P., López, R., Tenorio, C., Gutiérrez, A.R. 2005. Analysis of yeast population during spontaneous alcoholic fermentation: effect of the age of the cellar and the practice of inoculation. Int. J. Food Microbiol. 103: 49-56. Torija, M.J., Rozès, N., Poblet, M., Guillamón, J.M., Mas, A, 2001. Yeast population dynamics in spontaneosus fermentations: comparison between two different wineproducing areas over a period of three years. Antonie van Leeuwenhoek 79: 345- 352. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungi ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds) PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, California, USA, pp 315-322. Capítulo2 102 Figure 2. Electrophoretic patterns of mitochondrial DNA cut with HinfI from of the commercial yeasts used in the winery during 2003 to 2007 vintages. Lanes: 1, LSA4; 2, LSA3; 3, LSA7; 4, LSA2; 5, LSA1; 6, LSA8; 7, LSA9; 8; LSA6; 9, LSA10; 10, LSA11 and m is the size marker digested with PstI (λ-PstI). Figure 1. Electrophoretic patterns of mitochondrial DNA cut with HinfI from S. cerevisiae isolated in the three vats under study. Lanes: 1, pattern A (LSA2); 2, pattern C (LSA3); 3, pattern D (LSA7); 4, pattern E (LSA1/9); 5, pattern F (LSA8); 6, pattern M; 7, pattern N; 8; pattern V; 9, pattern W; 10, pattern X; 11, pattern Z; 12, pattern AG; 13, pattern AM. m: size marker digested with PstI (λ-PstI). Figures Capítulo2 A 0% 20% 40% 60% 80% 100% Must Before Inoculation Middle AF Final AF B 0% 20% 40% 60% 80% 100% Must Before Inoculation Middle AF Final AF C 0% 20% 40% 60% 80% 100% Must Before Inoculation Final AF Non-Sac AUT LSA Figure 3. Relative proportion (%) of commercial and autochthonous Saccharomyces and non-Saccharomyces yeasts in samples from different stages of fermentations of the three grape varieties studied: A) Merlot vat; B) Syrah vat; C) Cabernet Sauvignon vat. 103 Capítulo2 104 Cells / ml 100 102 104 106 108 1010 MBF BF + I FF M BF BF+I MF FFMBF BF+I MF FF ACB Figure 4. Yeast population (cells/mL) in samples from the three grape varieties studied: (A) Merlot vat; (B) Syrah vat; (C) Cabernet Sauvignon vat in different stages of fermentation: M, must; BF, before fermentation; BF+I, must before fermentation plus inoculum; MF, middle of fermentation; FF, end of fermentation. Autochthonous (AUT); Commercial (LSA); non-Saccharomyces (Non-Sac) strains. Capítulo2 105 Tables Table 1. Commercial yeasts strains used in the winery during 2003 to 2007 vintages. Commercial yeast Code Vintage 2003 2004 2005 2006 2007 BDX, Lallemand LSA 4 X X X X X Rhône 2056, Lallemand LSA 3 -- X -- -- -- Excellence XR, Lamothe-Abiet LSA 7 -- X X X X Excellence SP, Lamothe-Abiet LSA 2 -- -- X -- -- LA-BJL, Lamothe-Abiet LSA 1 -- -- X -- X Fermol Premier Cru LSA 8 -- -- -- X -- Fermol Mediterranée LSA 9 -- -- -- X -- 43, Lallemand LSA 6 -- -- -- X -- Chalenge Selection ES U42, Sepsa-Enartis LSA 10 -- -- -- -- X Star, Agrovin LSA 11 -- -- -- -- X X: used; --: not used Capítulo2 Table 2. Number of isolates of each species found in the samples from the three fermentations studied. Date Sampling point Total Isolates S. cerevisiae H. guilliermondii H. uvarum I. orientalis P. anomala K. thermotolerans 11/09/2007 Grape juice 27 4 4 11 2 6 -- 20/09/2007 Must before inoculation 29 29 -- -- -- -- -- 20/09/2007 Inoculum (“pied de cup”) 30 30 -- -- -- -- -- 26/09/2007 Middle of fermentation 30 30 -- -- -- -- -- 04/10/2007 Final of fermentation 30 30 -- -- -- -- -- Total 146 123 4 11 2 6 0 19/09/2007 Grape juice 29 -- 22 7 -- -- -- 20/09/2007 Must before inoculation 27 27 -- -- -- -- -- 20/09/2007 Inoculum (“pied de cup”) 30 30 -- -- -- -- -- 27/09/2007 Middle of fermentation 30 30 -- -- -- -- -- 04/10/2007 Final of fermentation 30 30 -- -- -- -- -- Total 146 117 22 7 0 0 0 19/10/2007 Grape juice 30 -- 29 -- -- -- 1 24/10/2007 Must before inoculation 30 17 13 -- -- -- -- 24/10/2007 Inoculum (LSA7) n/sa-- -- -- -- -- -- Middle of fermentation n/sa-- -- -- -- -- -- 08/11/2007 Final of fermentation 30 30 -- -- -- -- -- Total 90 47 42 0 0 0 1 Total 382 287 68 18 2 6 1 an/s: not samples 106 Capítulo2 Table 3. Number of yeast strains showing different mtDNA restriction pattern isolated from different samples studied in the Merlot must containing vat. Merlot Must Before Inoculation Inoculum Middle FeFinal Ff Species CodeaPattern S. cerevisiae LSA2 A -- -- 4 2 -- “ LSA3 C -- 2 6 3 1 “ LSA7 D -- 4 10 7 4 “ LSA1/9 E 2 1 1 -- -- “ LSA8 F -- 16 8 7 10 “ M 1 -- -- -- -- “ AG -- 4 1 10 15 “ N -- -- -- 1 -- “ V -- 1 -- -- -- “ W -- 1 -- -- -- “ Z 1 -- -- -- -- H. guilliermondii 4 -- -- -- -- H. uvarum 11 -- -- -- -- I. orientalis 2 -- -- -- -- P. anomala 6 -- -- -- -- Total isolates 27 29 30 30 30 Population 2.9 x1029.7 x1068.9 x1082.1 x1087.3 x105 Total LSAb 2 23 29 19 15 Total AUT c 2 6 1 11 15 Total non-Sacd 23 0 0 0 0 a Commercial yeast code; bLSA: Commercial yeasts; cAUT: Autochthonous yeasts; d non-Sac: Non-Saccharomyces; Middle F: e Middle of fermentation; fFinal F: End of fermentation 107 Capítulo2 Table 4. Number of yeast strains showing different mtDNA restriction pattern isolated from different samples studied in the Syrah must containing vat. Syrah Must Before Inoculation Inoculum Middle F e Final F f Species CodeaPattern S. cerevisiae LSA2 A -- -- 2 2 1 “ LSA3 C -- 1 10 10 6 “ LSA7 D -- -- 13 5 15 “ LSA8 F -- 3 4 11 6 “ AG -- -- 1 -- -- “ AM -- 22 -- 2 2 “ X -- 1 -- -- -- H. guilliermondii 22 -- -- -- -- H. uvarum 7 -- -- -- -- Total 29 27 30 30 30 Population 2.4 x1074.6 x1052.0 x1093.1 x1079.6 x106 Total LSAb 0 4 29 28 28 Total AUT c 0 23 1 2 2 Total non-Sacd 29 0 0 0 0 a Commercial yeast code; bLSA: Commercial yeasts; cAUT: Autochthonous yeasts; d non-Sac: Non-Saccharomyces; Middle F: e Middle of fermentation; fFinal F: End of fermentation 108 Capítulo2 109 Table 5. Number of yeast strains showing different mtDNA restriction pattern isolated from different samples studied in the Cabernet Sauvignon must containing vat. Cabernet Sauvignon Must Before Inoculation Final Ff Species CodeaPattern S. cerevisiae LSA2 A -- 3 3 “ LSA3 C -- 1 2 “ LSA7 D -- 8 19 “ LSA8 F -- 5 4 “ AG -- -- 1 “ AM -- -- 1 H. uvarum 29 13 -- K. thermotolerans 1 -- -- Total 30 30 30 Population 5.4 x1052.8 x1072.4 x107 Total LSAb 0 17 28 Total AUT c 0 0 2 Total non-Sacd 30 13 0 a Commercial yeast code; bLSA: Commercial yeasts; cAUT: Autochthonous yeasts; d non-Sac: Non-Saccharomyces; fFinal F: End of fermentation Capítulo3 116 2.2.Samplecollection,microvinificationsandyeastisolation From each sampling point, approximately 1.5 to 2 kg of grapes were collected aseptically and directly placed into sterile plastic bags that were transported to the laboratory. Grapes were carefully crushed in the plastic bags, and 80 ml of juice was poured into 100 ml erlenmeyer flasks. Duplicates of microvinifications were carried out for all samples except for samples 15BH and 20AH from the 2006 campaign. The fermentors were placed at 25 ºC. Daily weight determination allowed the monitoring of the fermentation progress. When a consumption of about 2/3 of the sugar content was observed, diluted must samples were spread on YEPD plates (yeast extract 1% w/v, peptone 1% w/v, glucose 2% w/v, agar 2% w/v) and incubated for 48-72 hours at 28 ºC. Thirty colonies were selected at random from each spontaneous fermentation. 2.3.Yeastidentification To rapidly discriminate between Saccharomyces and non-Saccharomyces yeasts, every isolate was evaluated according to its ability to grow on L-lysine plates (Barnett et al., 1990). Isolates that were not able to grow using L-lysine as the sole nitrogen source were classified as Saccharomyces. The species of the yeast isolates was determined according to their rDNA polymorphism of the 5,8S-ITS gene region. This region was amplified by PCR using primers ITS1 and ITS4, described by White et al. (1990). The PCR products were digested with restriction endonucleases HinfI, HaeIII and HhaI (same activity than CfoI) (Takara, Japan). PCR amplification products and restriction fragments were separated on a horizontal 1.4 and 3 % agarose gel, respectively, in TAE buffer and their size determined comparing with a standard (100-bp DNA ladder, Amersham Biosciences). An additional restriction endonuclease (DdeI) was used to differentiate Hanseniaspora species (Esteve-Zarzoso et al., 1999). Strains of the Lachancea clade (Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomyces cidri, Kluyveromyces thermotolerans and Kluyveromyces waltii) with similar restriction profiles and yeast isolates with misidentified restriction profiles were identified by sequencing the D1/D2 variable domains of the large subunit rRNA gene. They were amplified using the external primers NL-1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) and NL-4 (5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’). PCR reactions were performed in a 100 µl volume Capítulo3 117 containing 0.25 µM of each primer, 80 µM of dNTP, 1 x buffer (MBL, Dominion), 1.5 mM MgCl2, 5 U Taq polymerase (MBL, Dominion) and DNA isolated according to Querol et al. (1992) and diluted to 1-50 µg/µl. PCR was performed in a TC-312 cycler (Techne) as follows: a first denaturation step at 95 ºC for 5 min, followed by 36 cycles with a temperature profile of 94 ºC for 1 min, 58 ºC for 1 min and 72 ºC for 1.5 min. An extension period of 5 min at 72 ºC was carried out at the end of the 36 cycles. The PCR products were purified using a Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up system (Promega) according to the manufacturer’s instructions and then sequenced directly (StabVida, Portugal). A BLAST analysis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) was performed for the sequences obtained. We considered identification to be valid when the identity was at least 98 %. 2.4.CharacterizationofS.cerevisiaeisolates The colonies identified as S. cerevisiae were also characterized at strain level by mtDNA restriction analysis as described by Querol et al (1992). Yeast DNA was digested with HinfI, the fragments were separated in 1 % agarose gels and their size determined comparing with a standard (Lambda DNA digested with PstI). 2.5.Commercialyeast Samples of the active dry yeasts used in the winery since the first vinification (2003 vintage) were also characterized in order to distinguish between indigenous Saccharomyces and commercial ones. Table 2 shows the commercial yeasts used in the winery during the 2003 to 2007 vintages. 3.Results 3.1.Yeastisolationandidentificationfrommicrovinifications Microfermentations of a total of 75 samples were attempted (54 and 21 during 2006 and 2007 harvest seasons, respectively), but only 58 of them were able to start fermentation, after more as 30 days of incubation. None of the samples of date 15BH (2 weeks before harvest) in the 2006 vintage fermented and few of the samples of date 7BH (one week before harvest) did. In general terms, fermentation took place for most of the samples only at harvest and post-harvest dates. For this reason, sampling dates 15BH and 7BH were discarded for the 2007 vintage campaign. Capítulo3 118 Yeast population ranged from 3 x 104 to 2.2 x 107 cfu/mL and, in general terms, it increased with the sampling date and campaign, with higher values from harvest sampling onwards, and in the 2007 campaign. In order to ascertain the natural yeast flora present in the vineyard, 1586 isolates from microvinifications carried out during the 2006 and 2007 vintages were selected for analysis, 1334 of them corresponded to non-Saccharomyces yeasts and the rest (252) to Saccharomyces species as determined by their ability to grow on plates containing L-lysine as the sole nitrogen source (Barnett et al., 1990). However, 305 isolates of non-Saccharomyces yeasts (mainly belonging to sampling dates 7B and H from the 2006 vintage) died off before further analysis. The rest of the isolates were identified according to the ITS polymorphisms and the results confirmed by sequencing of the D1/D2 region of 26S rDNA of each PCR-RFLP pattern obtained and this technique was also applied to those yeast isolates with misidentified restriction profiles (Table 3). The PCR products sizes ranging from 400 to 850 bp were digested with HhaI, HaeIII and HinfI, whereby 12 different profiles were obtained. Nine of the 12 patterns were identified after comparing the molecular mass of the restriction products with those previously described (Esteve-Zarzoso et al., 1999, 2001, Granchi et al., 1999). These 9 groups were Candida stellata, Candida parapsilosis, Issatchenkia orientalis, Metschnikowia pulcherrima, Pichia anomala, Pichia guilliermondii, Torulospora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii and Saccharomyces cerevisiae. An additional restriction analysis with endonuclease DdeI was necessary to differentiate between H. guilliermondii, H. uvarum and H. vineae (Esteve Zarzoso et al., 2001). Another group of similar restriction profiles (profile n. 11) included the species Kluyveromyces thermotolerans, K. waltii, Zygosaccharomyces cidri and Z. fermentati. Their 26S rRNA gene sequence results yielded 100 % similarity to Kluyveromyces thermotolerans. The last profile (n.12) was also identified by this technique as Aureobasidium pullulans. As stated in Table 3, S. cerevisiae, K. thermotolerans, H. uvarum and H. guilliermondii were the yeast species most frequently isolated. Although non- Saccharomyces yeasts were mostly isolated, it is remarkable that the percentage of S. cerevisiae isolates (19.7 and 9.8 % in 2006 and 2007 vintages, respectively is higher than reported elsewhere (Fleet & Heard, 1993, Mortimer & Polsinelli, 1999). In most of the fermentations (45 out of 58) isolates corresponded only to non-Saccharomyces species. In 6 of the fermentations, only S. cerevisiae strains were isolated and both S. Capítulo3 119 cerevisiae and non-Saccharomyces were isolated in the rest of them (7 fermentations). Spontaneous fermentations were performed by one or more predominating species accompanied by a very heterogeneous yeast community with no prevalent species. 3.2.Yeastpopulationdiversityinspontaneousfermentation Table 4 indicates the distribution of yeasts during spontaneous must fermentation according to sampling dates, grape variety and vintage. Although data of the 2006 vintage are incomplete, results seem to indicate that greater yeast diversity existed in sample 20AH (20 days after harvest) for Merlot and Syrah fermentations from BM and BS plots. Before harvest (sampling date 7BH), Pichia anomala was the predominant yeast in Merlot and Syrah musts (49.2 and 100 %, respectively) but it was hardly isolated after this date. In harvest and post-harvest samples (H, 10AH and 20AH sampling dates), C. parapsilosis, H. guilliermondii, I. orientalis and S. cerevisiae were frequently isolated but with some differences among Merlot and Syrah fermentations. .Whereas in Merlot samples S. cerevisiae yeasts were only found 10 days after harvest (date 10AH) and accounted for almost 100 % of the isolates, in Syrah samples they were isolated from harvest onwards (dates H, 10AH, 20AH), although in much lower frequencies (Table 4). During the 2006 campaign, another Syrah plot was sampled (PS), in this case there was no winery in the proximity of the vineyard. Only sampling date H experiments fermented. Again, I. orientalis and H. guilliermondii were mostly identified (20.0 and 18.9 %, respectively), together with S. cerevisiae (12.2 %),but in this case Zygosaccharomyces bailii, not isolated in BS or in BM plots, was also found (15.6 %). When focusing in the 2007 results, we observed some differences in the species found in both the 2006 and 2007 campaigns (Table 3). K. thermotolerans and H. uvarum were the major species isolated in the 2007 (33.6 and 25.5 %, respectively), but they were hardly found in the 2006 campaign, at least considering the limitations of our work for that vintage. H. guilliemondii and S. cerevisiae yeast strains were also isolated, but in lower percentages than in 2006 (14.4 and 9.8 %, respectively). As in the 2006 harvest, differences were observed among the grape varieties studied, with Cabernet Sauvignon fermentations showing greater yeasts diversity than Merlot and Syrah assays (Table 4). Finally, S. cerevisiae strains were only isolated from after harvest samples (10AH) in Cabernet Sauvignon fermentations. Capítulo3 120 3.3.CharacterizationofS.cerevisiaestrains From the 1598 yeasts isolated, only 252 of them corresponded to S. cerevisiae (192 and 60 isolates during the 2006 and 2007 campaigns, respectively). They were characterized at strain level by RFLP of the mtDNA. Eleven different restriction profiles were identified (Figure 1), two of which corresponded to two of the commercial yeasts employed by the winery (Figure 2), namely profile C (LSA3) and D (LSA7). Differences in the restriction profiles distribution were found according to grape varieties, sampling dates and sampling campaigns as reflected in Table 5. During the 2006 campaign, six restriction profiles were detected, four of them corresponded to local strains (patterns M, N, O and Q) and the rest (patterns C and D) to two commercial ones. In the Merlot fermentations, S. cerevisiae species were only isolated in postharvest assays (sampling date 10AH) and autochthonous strains (restriction profiles N and O) and commercial strains (profiles C and D) were isolated with similar frequency. In Syrah assays, different S. cerevisiae strains were characterized depending on the sampling date. Autochthonous strains all from the same profile (M) were isolated exclusively at harvest date (H) in both BS and PS vineyards. However, only commercial strains were isolated in post-harvest sampling dates (profiles D and C in dates 10AH and 20AH, respectively) in BS plots. Thus, a succession of S. cerevisiae strains was observed during this vintage. Autochthonous S. cerevisiae strains isolated in 2006 were different from those isolated in the 2007 campaign, with a higher diversity in the latter (Table 5). Five new different restriction profiles were characterized, but most of the isolates (85 %) corresponded to the pattern coded as AF. S. cerevisiae strains were only isolated from Cabernet Sauvignon fermentations in date 10AH. No commercial strains were found in this campaign. S. cerevisiae strains were found in 13 microfermentations (Table 5). Interestingly, yeast with profile M were found only in Syrah grapes in both vineyards but in that located close to the winery (BS), it was substituted by the commercial strains LSA3 and LSA7 in samples taken after harvest (10AH and 20 AH). The cited commercial strains were found also in grapes from two sites of the BM vineyard, also located near the winery, but not in the BCS one. In this latter location, autochthonous strains with profile AF were predominant but other local strains were also found. Capítulo3 121 4.Discussion One of the goals of this work was the isolation for yeast selection purposes of indigenous S. cerevisiae in the “Serranía de Ronda”, a viticultural region where no ecological study on wine yeasts had been performed before. This task was not possible to fulfil in the 2005 vintage since only commercial strains were isolated from fermenting vats (publication submitted). Thus, microfermentations from grapes aseptically taken from the vineyard were carried out in the laboratory during the 2006 and 2007 campaigns. It is well known that the presence of S. cerevisiae in grapes is rather rare, according to Mortimer and Polsinelli (1999) only about one in a thousand berries is S. cerevisiae positive. However, in our case, during the 2006 and 2007 vintages, 15.6 % of the isolates corresponded to this species. As described by Valero et al. (2007) fermentations could perform as an enrichment media enhancing S. cerevisiae growth. Only six and five different profiles were characterized in each vintage, indicating a low biodiversity in contrast to the results found by other authors (Schuller et al., 2005, Torija et al., 2001, Valero et al., 2007). Moreover, two of the profiles matched commercial strains. As described by Martini et al. (1996), the youth of the vineyard (in this case, established between 2002 and 2003) influences the quantity and biodiversity of yeasts. Several authors have reported studies about the biodiversity of yeasts associated with the vineyard in order to evaluate the dynamics of autochthonous populations of Saccharomyces and the impact of the use of commercial yeasts in wine regions of France and Portugal (Schuller et al., 2005, Valero et al., 2005, Valero et al., 2007). In our case, the presence of commercial strains has been detected in vineyards adjacent to the winery. This result indicates that dissemination of commercial yeasts from the winery to the nearby vineyard could be frequent, probably facilitated by vectors such as insects and wasps, but also by other common operations in the cellar (Mortimer & Polsinelli, 1999, Ribereau-Gayon et al., 2003). Valero et al. (2005) also indicate that the topography of the vineyard, for instance the fact that it is sloped could constitute a factor that facilitates the dissemination because of water run-off. This is the case of vineyards BS, BM and BCS. In our study, commercial yeasts were isolated at places located at distances less than to 200 m from the cellar, which, according to Valero et al. (2005), is, in general, the maximum radius of dissemination of yeasts. The practice of throwing out the fermentation lees from the winery to the neighbouring vineyard during Capítulo3 122 2003 to 2005 vintages could have facilitated the dissemination of commercial yeasts in the adjacent vineyards. Different commercial strains have been used by the winery since 2003 (Table 2), but only Rhône 2056 (LSA3) and Excellence XR (LSA7) have been isolated in the present study. The latter has been used in the winery since 2004 in all vintages, while Rhône 2056 was only used in 2004. In contrast, the other widely used commercial strain (BDX, coded as LSA4) has not been isolated. Thus, there is no strict correlation between the utilisation level and the frequency of dissemination (Valero et al., 2005) and a permanent implantation of commercial strains in the vineyard did not occur, but instead these strains are subject to natural fluctuations of periodical appearance/disappearance like autochthonous strains do (Valero et al., 2005). On the other hand, it should be borne in mind that some aspects of our methodology involving fermentations, plating on nutrient plates and isolation of a restricted number of colonies may limit our view about the microflora diversity. Killer phenotype may also play an important role in fermentation aptitude and competitive traits making possible that only certain strains participate or dominate in fermentation although their population was scarce at the beginning (Mercado et al., 2007, Van Vuuren & Jacobs, 1992). It is to be noted that the commercial strains Excellence XR (LSA7) and Rhône 2056 (LSA3) presented a killer-resistant phenotype, while strain BDX (LSA4) was sensitive to the killer toxin (data not shown). Finally, 13 different non-Saccharomyces species have been identified. H. guilliermondii, I. orientalis and, to a lesser extent, P. anomala were the most frequent species isolated in the 2006 vintage, and K. thermotolerans, H. uvarum and H. guilliermondii in the 2007 campaign. According to the literature, the yeasts of Kloeckera and Hanseniaspora genera are the predominant species on the surface of the grapes, accounting for 50-75 % of the total yeast population (Fleet & Heard, 1993) and, to a lesser extent, it is also possible to detect the species of Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Pichia, Metschnikowia and Kluyveromyces (De la Torre et al., 1999, Fleet, 1993, Longo et al., 1991, Martini et al., 1996). Although non-Saccharomyces wine yeasts have traditionally been associated with high volatile acidity, ethyl acetate production, off-flavours and wine spoilage, the role of non-Saccharomyces yeasts in winemaking has been re-evaluated (Ciani et al., 2006, Capítulo3 123 Viana et al., 2008, Zott et al., 2008). Several studies have shown their capacities to contribute positively to wine flavour (Ciani and Maccarelli, 1998, Esteve-Zarzoso et al., 1998, Fleet, 2003, Romano et al., 2003), or considered the biotechnical interest of their enzymatic activities (Arévalo Villena et al., 2007, Fernández et al., 2000, Manzanares et al., 2000, Strauss et al., 2005, Úbeda Iranzo et al., 1998). For this reason, some authors have evaluated the possibility of using mixed starters to improve the quality of wines (Ciani et al., 2006, Clemente-Jiménez et al., 2005, Garde-Cerdán and Ancín- Azpilicueta, 2006, Moreira et al., 2008, Rojas et al., 2003, Viana et al., 2008, 2009). One of the species more frequently isolated in our study, I. orientalis, has been also isolated in Spanish fermentations by Clemente-Jimenez et al. (2004), who also experimented their capability to ferment Macabeo musts obtaining a very good profile of higher alcohols even if their did not consum all the initial glucose. This species has been proven to reduce the malic acid content in wines when co-fermenting with S. cerevisiae obtaining a higher score in sensory evaluations when compared to wines fermented with S. cerevisiae alone (Kim et al., 2008). On the other hand, Kapsopoulos et al (2007) used K. thermotolerans and S. cerevisiae in mixed culture fermentations of grape must and found that it provided an effective biological acidification during alcoholic fermentation by the production of L-lactic acid. The fermentation behaviour of K. thermotolerans has also been studied by Ciani et al (2006). Moreira et al. (2008) found that the growth of H. guilliermondii and H. uvarum during the first days of fermentation enhanced the production of desirable compounds, such as esters, and may not have a negative influence on the production of higher alcohols and heavy sulphur compounds. Studies on acetate ester formation in wine by mixed cultures of S. cerevisiae and P anomala and H. guilliermondii in laboratory fermentations have been carried out by Rojas et al. (2003), Viana et al. (2008) also accomplished a rational selection of non-Saccharomyces wine yeasts for mixed starters based on ester formation and oenological traits that involved different strains of the genera Candida, Pichia, Hanseniaspora, Torulospora and Zygosaccharomyces. Accordingly, the current trend in the wine industry is to develop new technologies and promote the use of mixed and sequential cultures of non-Saccharomyces together with S. cerevisiae strains in order to increase the aromatic properties of wine while obtaining a desirable ethanol production. In this work, we have isolated and identified a Capítulo3 124 number of cultivable yeasts and also built a collection of yeast present in grapes which could participate in winemaking in the studied area. Acknowledgements This study was supported by funds from the Andalusia Government (EXP 92162/11) and with financial support of FEDER funds (project RM2007-00008-C02-00 from INIA-Ministerio de Educación y Ciencia de España). We also appreciate the assistance of the enologist P. Ortigueira and the owner (J. Fernández) of the winery facilitating sampling campaigns in the vineyards, and to M.J.R. Palero for her kind help during this work. Capítulo3 125 References Arévalo Villena, M., Úbeda Iranzo, J.F., Briones Pérez, A. I. 2007. β-Glucosidase activity in wine yeasts: Application in Enology. Enz. Microbial Technol. 40: 420- 425. Barnett, J.A., Payne, R.W., Yarrow, D. 1990. Yeasts: Characteristics and identification, second ed. Cambridge University Press, Cambridge, UK. Ciani, M., Maccarelli, F. 1998. Oenological properties of non-Saccharomyces yeasts associated with wine-making. World J. Microbiol. Biotechnol 14: 199-203. Ciani, M., Beco, L., Comitini, F. 2006. Fermentation behaviour and metabolic interaction of multistarter wine yeasts fermentations. Int. J. Food Microbiol. 108: 239-245. Clemente-Jiménez, J., Mingorance-Cazorla M. L., Martínez-Rodríguez, S., Las Heras- Vázquez, F.J., Rodríguez-Vico, F. 2004. Molecular characterization and oenological properties of wine yeast isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiol. 21: 149-155. Clemente-Jiménez, J., Mingorance-Cazorla M. L., Martínez-Rodríguez, S., Las Heras- Vázquez, F.J., Rodríguez-Vico, F. 2005. Influence of sequential yeast mixtures on wine fermentation. Int. J. Food Microbiol. 98: 301-308. De la Torre, M.J., Millan, M.C., Perez-Juan, P., Morales, J., Ortega, O. 1999. Indigenous yeast associated with two Vitis vinifera grape varieties cultured in southern Spain. Microbios 100: 27-40. Degré, R. 1993. Selection and commercial cultivation of wine yeast and bacteria. In: Fleet, G.H. (Ed.) Wine microbiology and biotechnology. Harwood Academic Publishers, Chur, pp 421-447. Esteve-Zarzoso, B., Belloch, C., Uruburu, F., Querol, A. 1999. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5,8S rRNA gene and the two internal transcribed spacers. Int J. Syst. Bacteriol. 49: 329-337. Esteve-Zarzoso, B., Manzanares, P., Ramón, D., Querol, A. 1998. The role of non- Saccharomyces yeast in industrial winemaking. Int. Microbiol. 1: 143-148. Capítulo3 132 Table 2. Commercial yeasts strains used in the winery during 2003-2007. Commercial yeast Code Vintage 2003 2004 2005 2006 2007 BDX, Lallemand LSA 4 X X X X X Rhône 2056, Lallemand LSA 3 -- X -- -- -- Excellence XR, Lamothe-Abiet LSA 7 -- X X X X Excellence SP, Lamothe-Abiet LSA 2 -- -- X -- -- LA-BJL, Lamothe-Abiet LSA 1 -- -- X -- X Fermol Premier Cru LSA 8 -- -- -- X -- Fermol Mediterranée LSA 9 -- -- -- X -- 43, Lallemand LSA 6 -- -- -- X -- Chalenge Selection ES U42, Sepsa-Enartis LSA 10 -- -- -- -- X Star, Agrovin LSA 11 -- -- -- -- X Capítulo3 133 Table 3. Results of the comparison of the isolates with those present in GenBank from NCBI database and relative frequency of each species during the 2006 and 2007 campaigns. Yeast species Isolate designation Sequencing product Strain type Gen Bank Data Base % Identity 2006 2007 Saccharomyces cerevisiae 35/61 550 NRRL Y- 12632 AY048154 100 19,7 9,8 Aureobasidium pullulans BCSII/2 530* T4B1c.7P FJ490622 100 0,0 6,7 Candida parapsilosis 44/31 561 26.4 EU660860 100 3,7 0,0 Candida stellata 59/31 401* A17-1-2 EF648014 98 2,9 0,3 Hanseniaspora guilliermondii 35/31 553 TY20 FJ972220 100 18,9 14,4 Hanseniaspora uvarum BCSI2/25 557 SYAKW EU326135 99 3,2 25,5 Hanseniaspora vineae BCSI/2 553 NRRL Y- 27936 DQ655684 100 0,0 4,3 Issatchenkia orientalis BCSII/2 551 NRRL Y- 5396 EF550222 100 11,0 2,6 Kluyveromyces thermotolerans BCSII/9 567 NRRL Y- 8284 U69581 100 1,5 33,6 Metschnikowia pulcherrima BCSI/15 483 MB510 DQ872871 100 0,0 0,8 Pichia anomala 25/31 566 Lv196 EU795420 100 7,0 0,0 Pichia guilliermondii BCSI2/32 573 NRRL Y- 27949 DQ655689 100 0,1 0,7 Torulospora delbrueckii 46/66 565 CO4 EU879961 100 0,8 0,0 Zygosaccharomyces bailii 32/62 575 N2314 EU268642 100 2,9 0,0 Non identified Non-Saccharomyces -- -- -- -- -- 28,4 1,3 * Sequencing product from PCR 5,8S ITS Capítulo3 134 Table 4. Distribution of yeast (%) during spontaneous must fermentation according to sampling dates, grape variety (Merlot, Syrah, Cabernet Sauvignon) and sampling campaign (2006 and 2007) BM BS PS BCS 2006 2007 2006 2007 2006 2007 Yeast species 7BH H 10AH 20AH H 10AH 7BH H 10AH 20AH H 10AH H H 10AH S. cerevisiae -- -- 99,2 -- -- -- -- 19,6 7,8 15,6 -- -- 12,2 -- 25,0 A. pullulans -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 100 -- -- -- -- C. parapsilosis -- -- -- -- -- -- -- -- 33,3 6,7 -- -- -- -- -- C. stellata -- -- -- 31,1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 0,8 H. guilliermondii -- 19,2 -- 30,0 -- 27,5 -- 35,3 25,6 17,8 -- 57,8 18,9 2,5 -- H. uvarum -- -- -- 34,4 -- 22,5 -- -- -- -- -- 42,2 -- 44,2 15,8 H. vineae -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 21,7 -- I. orientalis -- 23,1 -- 1,1 -- -- -- -- -- 37,8 -- -- 20,0 13,3 -- K. thermotolerans 3,1 -- 0,8 3,3 -- 50,0 -- -- -- 10,0 -- -- -- 7,5 56,7 M. pulcherrima -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 4,2 -- P. anomala 49,2 0,6 -- -- -- -- 100 -- -- 4,4 -- -- -- -- -- P. guilliermondii -- -- -- -- -- -- -- -- -- 1,1 -- -- -- 0,8 1,3 T. delbrueckii -- -- -- -- -- -- -- -- 8,9 -- -- -- -- -- -- Z. bailii -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 15,6 -- -- Non identified 47,7 57,1 -- -- -- -- -- 45,1 24,4 6,7 -- -- 33,3 5,8 0,4 BM: Merlot vineyard; BS: Syrah vineyard; PS: Syrah vineyard far from winery; BCS: Cabernet Sauvignon vineyard. 7BH: one week before harvest; H: harvest; 10AH: ten days after harvest; 20AH: twenty days after harvest. Capítulo3 135 Table 5. Mitochondrial DNA RFLP patterns of S. cerevisiae yeast isolates from microvinifications of grapes samples collected in vineyard BM, BS, PS and BCS in harvest (sampling date H) and post harvest (sampling dates 10AH and 20AH) during the 2006 and 2007 campaigns. Campaign Vineyard Sampling date Isolates Number of S. cerevisiae Pattern 30 30 N 30 30 O 30 30 C 28 D BM 10AH 30 1 Q H 30 30 M 10AH 30 7 D BS 20AH 30 14 C 30 9 M 30 10 M 30 2 M 2006 PS H 30 1 M 29 AF 30 1 AQ 22 AF 2 AN 4 AP 1 AQ 2007 BCS 10AH 30 1 AU Capítulo 4 Selection of autocthonous Saccharomyces strains from Ronda (Malaga, Southern Spain) based on their oenological characteristics, for organic wine production Almudena Clavijo, Raquel Callejón, Isabel L. Calderón, M. Lourdes Morales, Ana M. Troncoso y Patricia Paneque Enviado a European Food Research and Technology Capítulo4 139 Abstract Eight autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains isolated in a winery and its vineyard from “Serranía de Ronda” (Malaga, southern Spain) and five commercial yeasts commonly used by the same winery were evaluated according to their oenological properties. Most of them were found to present β-glucosidase activity and two of them protease activity as well. Some statistically significant differences were found among the strains when fermenting different glucose concentration media (225 and 275 g L-1) at 30 ºC. However, none of the strains tested satisfied all the established criteria. For further studies, two commercial and one local strain were discarded because they were sensitive to killer yeast toxins; the rest, were used for micro-scale fermentations (330 ml of sterile Merlot must) carried out under controlled conditions. The results showed no differences among them in most of the analytical parameters of the fermented products. However, sensory analysis results and volatile composition of the produced wines showed that some autochthonous strains seem to produce wines with better quality. Finally, one commercial and four autochthonous strains were preselected for pilot scale fermentation in the winery. Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Yeast selection; Oenological characteristics; Volatile compounds; Sensory evaluation Capítulo4 140 1.Introduction Wine fermentation is a complex microbial process involving the transformation of must into wine by the action of different species of yeasts and lactic acid bacteria originally present on the grapes and the winery equipment (Fleet & Heard, 1993). The main agents responsible of the alcoholic fermentation are strains of the species Saccharomyces cerevisiae. Commercially available dried yeast strains of S. cerevisiae can be inoculated into the grape juice in order to establish a high population and accomplish well-controlled must fermentations (Nikolau et al., 2006, Lopes et al., 2007). However, the use of local, autochthonous strains of S. cerevisiae is preferable since they are better acclimatised to the environmental conditions (Martini & Vaughan- Martini, 1990; Degré, 1993; Regodón et al., 1997) thus assuring the maintenance of the typical sensory properties of the wines of a given region (Hernández et al., 2003). In consequence, for local strains selection purposes, it is necessary the isolation and identification of yeast species present in the fermenting must, together with their evaluation in accordance with established oenological criteria (Briones et al., 1995; Pérez-Coello et al., 1999; Rodríguez et al., 2009). Among the most important oenological properties that wine strains should present are: tolerance to and high ethanol production, exhaustion of sugar potential and high fermentation activity, growth at low and high temperatures, growth at high sugar concentration, good glycerol production, resistance to and low sulphur dioxide production, low volatile acidity and hydrogen sulfide production, resistance to killer toxins but killer phenotype, good enzymatic profile (high β-glucosidase and proteolytic activities) and low acetaldehyde production (Ubeda Iranzo et al., 1998; Pérez-Coello et al., 1999; Esteve-Zarzoso et al., 2000, Rementeria et al., 2006). The “Serranía de Ronda” (Malaga, southern Spain) is located at 5º 10' and 36º 44' northern latitude, and less than 750 m above sea level. The Denomination of Origin (DO) “Sierras de Málaga” accomplished red and white wines produced in the province of Malaga, but gives a special mention to those wines elaborated in the “Serranía de Ronda” thus recognizing the climatic and geographic peculiarities of this region. The use of commercial yeasts is rather common in the region since most of the wineries and vineyards are newly established and no study of the indigenous yeast population has been as far reported. Capítulo4 141 In a previous work, we isolated and identified the yeast population present in a newly built winery and in its neighbouring vineyard located in the “Serranía de Ronda” (DO Sierras de Málaga) during 2005 to 2007 campaigns (submitted publication). This population comprised non-Saccharomyces and Saccharomyces strains, both autochthonous and of commercial origin. This winery, as many other in the area, elaborates organic wines (wines produced with grapes from organic farming). Nowadays there is no an EU normative regulating the production of these wines. However, some recommendations for their elaboration and composition do exist in Spain (CAECV, 2010; Hidalgo Togores, 2003) and, among them, the use of selected autochthonous yeasts for the fermentation process. In this work we have studied some relevant oenological characteristics of eight autochthonous S. cerevisiae strains isolated from the “Serranía de Ronda” area, and compared with that of five commercial strains commonly used by the winery. Some of the tested strains were finally used for microvinification assays carried out under controlled laboratory-scale conditions, and the produced wines were evaluated by sensory and instrumental analysis. 2.MaterialsandMethods 2.1Yeaststrains For this study, eight autochthonous strains were selected on the basis of their frequency of isolation during 2005 to 2007 campaigns. They were coded MY, NY, OY, RY, SY, TY, AGY and AMY, defined for their particular molecular pattern of mtDNA- RFLP polymorphism analysis. Additionally, five of the most frequently employed commercial strains were also chosen for the same purpose, namely (in order to facilitate yeast designation, a code was assigned to each strain): Excellence SP (LSA2), Rhône 2056 (LSA3), BDX (LSA4), Excellence XR (LSA7) and Fermol Premier cru (LSA8). To determine the killer production/sensitivity phenotype, the following S. cerevisiae strains were used: 1101 (K1 killer yeast) and 1384 (K2 killer yeast), provided by Dr. R. Esteban (University of Salamanca, Spain), and 47G (sensitive non-killer yeast) provided by Dr. T. Villa (University of Santiago de Compostela, Spain). As a positive control for β-glucosidase activity, a strain of S. cerevisiae T73 (provided by Dr. A. Querol, IATA, Valencia, Spain) was used.