La relación de heterófilos/linfocitos con las estrategias vitales en la golondrina común (Hirundo rustica)

1 La relación de heterófilos/linfocitos con las estrategias vitales en la golondrina común (Hirundo rustica). Trabajo Fin de Máster. Máster Universitario en Biología Avanzada: Investigación y Aplicación. Línea de Biología Evolutiva. Universidad de Sevilla, departamento de Zoología. Sevilla, 3 de Julio de 2023 Tutores Estudiante Javier Balbontín Arenas Lorena Pinilla Rodríguez Alfonso Marzal Reynolds 2 Índice de contenidos 1. RESUMEN ........................................................................................................................... 3 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 5 3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 9 3.1. Área de estudio y procedimientos de toma de muestras en el campo ........................... 9 3.2. Frotis sanguíneo y microscopía ................................................................................... 10 3.3. Detección molecular de infección por hemosporidios ................................................ 11 3.4. Análisis estadísticos .................................................................................................... 11 4. RESULTADOS .................................................................................................................. 14 4.1. Perfil de leucocitos ...................................................................................................... 14 4.2. Parámetros morfológicos y fisiológicos asociados con el estrés ................................. 20 4.3. Estrés y su relación con el estado de infección ........................................................... 21 4.4. Relación de la eficacia biológica o fitness con el índice de estrés .............................. 23 4.5. El estrés en los distintos periodos de reproducción ..................................................... 23 5. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 24 6. AGRADECIMIENTOS .................................................................................................... 29 7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 30 3 1. RESUMEN La condición de estrés y la función inmune de los vertebrados pueden verse alteradas según la condición fisiológica de los individuos, la etapa del ciclo de vida en la que se encuentran o del parasitismo. Nosotros investigamos a la golondrina común, Hirundo rustica, durante su etapa de reproducción en España utilizando parámetros hematológicos para conocer su estado de estrés, medido mediante el índice heterófilos/linfocitos (i.e., H/L). Estudiamos el perfil de leucocitos en la sangre en relación con distintas variables como el sexo, la colonia de cría, la clase de edad, el año de captura, el estado de infección, el fitness o eficacia biológica (es decir, el número total de huevos, el número total de pollos, el número de puestas y la fecha de la primera puesta) y el periodo de la época de reproducción (prepuesta, incubando, con pollos en el nido y postpuesta). De manera que la ratio H/L alta indicó diferencias entre las dos clases de edad (presentando mayores índices los adultos) y entre el número de puestas (presentando mayores índices las parejas que pusieron tres puestas), pero no mostraron correlación con el parasitismo ni con el periodo de la época de reproducción. Este estudio muestra el valor del uso de parámetros hematológicos para conocer el estado y viabilidad de las poblaciones, y los resultados resaltan la necesidad de seguir trabajando en esta línea de investigación tanto para conocer la prevalencia de infección en especies migratorias como la golondrina, como para entender la ecología evolutiva de las especies mediante el uso del índice H/L. PALABRAS CLAVE: condición de estrés, eficacia biológica, golondrina común, índice H/L, infección, perfil de leucocitos. 4 ABSTRACT: The stress condition and the immune function of vertebrates can be altered depending on the physiological condition, the stage of the life cycle or parasitism. Here, we studied the Barn Swallow, Hirundo rustica, during its reproduction period in Spain using hematological parameters to determine its state of stress, measured by heterophil/lymphocyte ratio (i.e., H/L). We observed how the leukocyte profile varied depending on sex, locality, age class, year, infection status, fitness (total eggs, total fledglings, clutches and laying date) and the period of breeding season (pre-laying, incubation, chicks in the nest and post-laying). Thus, the high ratio of H/L showed differences between age class (adults have higher H/L indices) and between the number of clutches (three clutches have higher H/L indices), but they did not show any correlation with parasitism or the stage of reproductive season. This study shows the value of using hematological parameters to determine the status and viability of populations, and the results highlight the need to investigate in this line of research, both to determine the prevalence of infection in migratory species such as the swallow and to understand the evolutionary ecology of species using the H/L ratio. 5 2. INTRODUCCIÓN La influencia de la condición fisiológica en la supervivencia y el éxito reproductivo ha sido bien establecida en muchos taxones, incluyendo las aves. Por tanto, el estudio y cuantificación de respuestas fisiológicas frente a estresores intrínsecos y extrínsecos sirve para conocer el estado actual y futuro de las poblaciones (Bustillo-de la Rosa et al., 2022; Fitzgerald et al., 2022). Las especies evolucionan ajustando su función inmune al contexto ecológico y medioambiental. En aves, la exposición a patógenos está mediada por factores ecológicos como el hábitat, la sociabilidad y la migración (Hasselquist, 2007). Por ejemplo, en especies altamente sociales se promueve la transmisión horizontal de patógenos y parásitos porque la corta distancia entre individuos en un grupo facilita esa transmisión. Por tanto, los parásitos tienen el potencial de actuar como fuerza de selección del tamaño grupal o de comportamientos solitarios (Côté y Poulin, 1995). Mientras que las especies migradoras de largas distancias están expuestas a mayor diversidad de fauna parásita y por ello desarrollan órganos de defensa inmune más grandes que aves sedentarias (Møller y Erritzøe, 1998). Por tanto, especies coloniales y migratorias desarrollarían mecanismos inmunológicos que contrarresten la elevada presión patogénica (Minias, 2018). La golondrina común, Hirundo rustica, es una pequeña ave paseriforme migratoria y social que se reproduce en colonias que pueden ser desde unas pocas parejas hasta más de 100, por cuyas características se convierte en buen modelo de estudio (Møller, 1987; Costanzo et al., 2017; Romano et al., 2018). La inversión de recursos en la función inmune puede causar un compromiso entre rasgos de la historia de vida. Diversos estudios muestran un compromiso entre la inversión en el sistema inmune y la reproducción, ya que es energéticamente costoso 6 (Saino et al., 2002; Ardia, 2005; Hanssen et al., 2005). La función inmune se puede asociar evolutivamente con el ritmo de vida y la longevidad. De esta forma, especies más longevas invierten más en su propio mantenimiento que en la reproducción, desarrollando respuestas inmunes mayores (Minias, 2018). Los análisis hematológicos se han mostrado como buen método para medir la condición fisiológica. El conteo, identificación del estado y morfología de las células de la sangre proveen de información sobre el estrés, condición inmunológica y reconocimiento de enfermedades e infecciones (Minias et al., 2017; Ribeiro et al., 2020; Ushine et al., 2020; Fitzgerald et al., 2022). La evaluación de los perfiles de leucocitos sirve para medir el estrés, ya que representan los componentes del sistema inmune que proveen de protección frente patógenos y otros agentes estresantes (Ribeiro et al., 2020; Fitzgerald et al., 2022). En aves, los leucocitos se clasifican en granulocitos (basófilos, eosinófilos y heterófilos) y agranulocitos (linfocitos y monocitos). Los linfocitos son responsables de la inmunidad adquirida produciendo anticuerpos y respuestas específicas ante patógenos. Mientras que el resto de las células actúan en la inmunidad innata, que es la primera línea de defensa inmune (Minias et al., 2017; Ribeiro et al., 2020; Ushine et al., 2020; Fitzgerald et al., 2022). Las funciones de los eosinófilos y basófilos no están claras, pero parece que actúan en reacciones hiper sensitivas. Los eosinófilos participan en contra de infecciones parasitarias. Los monocitos fagocitan y degradan microorganismos, células anormales y desechos celulares (Ribeiro et al., 2020). Los heterófilos están involucrados en la respuesta inflamatoria, encargándose de atacar bacterias a través de procesos como quimiotaxis, opsonización, fagocitosis y lisis, y participan en la respuesta inicial ante patógenos mediante la señalización por receptores y eliminación de esos patógenos, y en 7 la inmunidad innata para proteger de la infección viral (Ribeiro et al., 2020; Ushine et al., 2020). Los heterófilos y linfocitos, en conjunto, conforman aproximadamente el 80% de los leucocitos. La relación entre ambos, conocida como índice H/L, se usa como medida de estrés, ya que si aumenta la concentración de corticosteroides provocada por un factor estresante se promoverá mayor reclutamiento de heterófilos con relación a los linfocitos. Consecuentemente, se produce un incremento en el índice H/L. De modo que la inmunidad aviar es medida por la ratio H/L (Grilli et al., 2018; Włodarczyk et al., 2018; Ribeiro et al., 2020; Ushine et al., 2020). La variación de este índice se ha registrado como el reflejo de un amplio espectro de estresores; como el parasitismo, la escasez de alimento, la muda, el miedo o alteraciones medioambientales (Jakubas et al., 2013; Minias et al., 2017; Włodarczyk et al., 2018; Ribeiro et al., 2020). Los parásitos son un agente evolutivo importante, desafiando la aptitud biológica de los individuos. El efecto causado depende de la maquinaria genética del hospedador y del parásito, además de las condiciones en las que se encuentren. De manera que los sistemas de defensa del individuo infectado compiten por los recursos con otras actividades, por lo que se encontrará ante un compromiso energético. Estas problemáticas causadas por los parásitos son líneas importantes de estudio en biología evolutiva porque podemos conocer las fluctuaciones en la eficacia biológica de las poblaciones (Fletcher et al., 2019; Dugas y Border, 2021). La alteración del índice H/L se ha visto relacionada con el estrés inducido por parásitos. Algunos factores influyentes son el grado de virulencia, el grado de parasitemia y su interacción con aspectos del individuo como edad, sexo y condición corporal. Sin embargo, esta interacción no está clarificada, pues no hay respuestas consistentes. Algunos estudios de Plasmodium, Haemoproteus y Leucocytozoon muestran que 8 producen un incremento del índice, mientras que otros han hallado un descenso o incluso no observan dichas variaciones. Por tanto, se interpreta que el alto índice H/L es indicador de infecciones activas o buena habilidad para controlar y evitar infecciones parasitarias (Bustillo-de la Rosa et al., 2022). La detección de hemosporidios en aves ha mejorado gracias a los avances en técnicas moleculares. Con microscopía reconocemos los estadios del ciclo de infección de los parásitos y las morfologías en cada etapa. Mientras que las técnicas moleculares permiten comprobar el estado de infección, aseguran el género y el linaje del parásito (Valkiūnas et al., 2009; Clark et al., 2015). Estos métodos facilitan la descripción de secuencias de ADN parasitarias y el incremento de conocimiento acumulado en las bases de datos. Por tanto, es esencial combinar ambos métodos, la observación al microscopio y las técnicas moleculares como PCR para entender la verdadera diversidad y especificidad (Ciloglu et al., 2016). Durante la época de reproducción las aves sufren un incremento de la demanda física, que viene aparejado con limitaciones del suministro de energía que debe ser invertido en su propia supervivencia o en su descendencia, de modo que los padres entran en un compromiso energético y puede causar la supresión de su sistema inmune (Pap y Markus, 2003). Por tanto, invertir energía en la reproducción es para lograr el éxito reproductivo y, para ello, deben asignar los recursos a las crías y otorgarles protección a costa de su propia condición física (Norris y Evans, 2000). En este trabajo se usó como modelo de estudio a la golondrina común para determinar cómo el estrés afecta a las estrategias vitales de sus individuos, de manera que se compruebe el uso del índice H/L como herramienta. Los objetivos de este trabajo son (1) describir el estado de estrés de los individuos a partir de parámetros hematológicos, (2) establecer la relación entre diferencias morfológicas y fisiológicas de los individuos 9 según el índice H/L, (3) identificar si los individuos infectados por malaria muestran diferencias en el índice H/L con respecto a los no infectados y (4) analizar la eficacia biológica asociando el estrés con el éxito reproductivo de los individuos y el periodo en el que se encontraban durante la época de reproducción. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Área de estudio y procedimientos de toma de muestras en el campo Se estudiaron seis colonias reproductoras de Hirundo rustica en localidades rurales de las provincias de Sevilla y Badajoz (suroeste de España), durante febrero a julio en 2017 y 2018. Se recopilaron datos de 104 individuos (41 hembras y 63 machos). Para ello, se capturaron utilizando redes de niebla en cada sitio de cría y se identificó a cada ejemplar con una anilla metálica y otra anilla con una combinación de dos colores. Para cada individuo se midió la masa corporal con una balanza digital con un error de ± 0.01g, el tarso con un calibre digital con un error de ± 0.01 mm y la longitud de las rectrices más externas con una regla con un error de 1 mm. Además, se realizó un conteo de los malófagos que se observaron. Clasificamos las golondrinas en dos clases de edad diferentes, siendo ambas sexualmente maduras: jóvenes y adultas, donde las primeras se definen como aquellos individuos de un año de edad que fueron anillados como polluelos/volantones en el año anterior. Las adultas son individuos de 2 años o más que estaban en su segundo año de migración o aquellos anillados como polluelos/volantones que fueron recapturados 2 años o más después de su primera captura. De los 104 individuos capturados se recopilaron datos de su reproducción para 78 individuos. Se realizaron observaciones en un “Hide” con telescopios para identificar cada individuo marcado al nido que atendía durante la época de reproducción. Una vez 16 Figura 2. Representación gráfica de la relación entre variables dependientes como linfocitos e índice H/L frente a la clase de edad. Respecto al año en el que se tomaron las muestras se encontraron diferencias significativas en el número de linfocitos (t-test = -2.52, d.f = 20.52, P = 0.02) (Figura 3), pero no para el resto de las variables analizadas (Heterófilos: t-test = -1.97, d.f = 23.02, P = 0.06; H/L: t-test = 1.28, d.f = 30.83, P = 0.21; Eosinófilos: t-test = -1.01, d.f = 21.6, P = 0.32; y Monocitos: t-test = -1.09, d.f = 18.32, P = 0.29). Figura 3. Representación gráfica de la relación entre el número de linfocitos como la variable dependiente frente al año de captura. 17 Dependiendo del estado de infección, se observaron diferencias significativas en el número de linfocitos (t-test = -2.23, d.f = 14.76, P = 0.04) (Figura 4). Pero no encontramos diferencias entre estar infectado o no en el índice H/L (t-test = 0.52, d.f = 15.96, P = 0.61), en el número de heterófilos (t-test = -1.65, d.f = 18.25, P = 0.11), en el número de eosinófilos (t-test = -0.32, d.f = 15.43, P = 0.75), o en el número de monocitos (t-test = 1.62, d.f = 35.20, P = 0.11). Figura 4. Representación gráfica de la relación entre el número de linfocitos frente al estado de infección por parásitos sanguíneos. Para el número de puestas se encontraron diferencias significativas en el índice H/L (F (2, 69) = 5.41, p = 0.006) y en el número de heterófilos (F (2, 70) = 3.31, p = 0.04) (Figura 5), pero no para el resto de las variables (Linfocitos: F (2, 70) = 1.64, p = 0.20; Eosinófilos: F (2, 70) = 0.25, p = 0.78; y Monocitos: F (2, 70) = 0.96, p = 0.39). 18 Figura 5. Representación gráfica de la relación entre el índice H/L y el número de heterófilos frente al número de puestas. Con respecto a la época de reproducción, hallamos diferencias significativas en el número de eosinófilos (F (3, 74) = 2.80, p = 0.04), pero no para el resto de los parámetros analizados (Linfocitos: F (3, 74) = 1.04, p = 0.38; Heterófilos: F (3, 74) = 1.53, p = 0.21; H/L: F (3, 73) = 0.73, p = 0.53; y Monocitos: F (3, 74) = 1.82, p = 0.15). Encontramos que el número de huevos totales puestos por la hembra o en el caso del macho por su pareja durante la estación reproductora explicaba una parte de la varianza en el número de linfocitos (β ± SE = -0.06 ± 0.02, t = -2.52, p = 0.01) y en el índice H/L (β ± SE = 0.03 ± 0.01, t = 2.48, p = 0.01). Conforme aumenta el número total de huevos aumenta el índice H/L (Figura 6). Mientras que encontramos el efecto opuesto con el número de linfocitos (Figura 6). Sin embargo, no hallamos resultados significativos en el número de heterófilos (β ± SE = 0.01 ± 0.02, t = 0.39, p = 0.699), en el de eosinófilos (β ± SE = -0.002 ± 0.02, t = -0.10, p = 0.92), ni en el número de monocitos (β ± SE = -0.02 ± 0.02, t = -0.92, p = 0.36). 19 Figura 6. Representación gráfica de la relación entre el índice H/L y el número de linfocitos frente al número de huevos totales. Encontramos que a medida que aumenta el número de pollos totales disminuye el número de linfocitos (β ± SE = -0.06 ± 0.02, t = -2.298, p = 0.02) (Figura 7). No obstante, para el resto de las variables no encontramos diferencias (Heterófilos: β ± SE = -0.01 ± 0.02, t = -0.41, p = 0.68; H/L: β ± SE = 0.01 ± 0.01, t = 1.004, p = 0.32; Eosinófilos: β ± SE = -0.015 ± 0.02, t = -0.68, p = 0.5; Monocitos: β ± SE = -0.024 ± 0.02, t = -1.09, p = 0.28). Figura 7. Representación gráfica de la relación entre el número de linfocitos frente al número de volantones totales. 20 La fecha de primera puesta no explicaba la varianza de ninguna de las variables analizadas (Linfocitos: β ± SE = 0.005 ± 0.003, t = 1.698, p = 0.09; Heterófilos: β ± SE = 0.002 ± 0.003, t = 0.53, p = 0.6; H/L: β ± SE = -0.002 ± 0.001, t = -1.06, p = 0.29; Eosinófilos: β ± SE = -0.001 ± 0.003, t = -0.38, p = 0.70; Monocitos: β ± SE = 0.003 ± 0.003, t = 0.99, p = 0.33). 4.2. Parámetros morfológicos y fisiológicos asociados con el estrés El análisis GLM para las variables relacionadas con los datos morfológicos para explicar el índice H/L como condición de estrés, indicó que el mejor modelo fue aquel que incluyó la clase de edad como única variable predictora. Concretamente, encontramos que los individuos con clase de edad de 2 años o superior tenían una ratio H/L mayor que los individuos de un año de edad (Tabla 2; Figura 8). Figura 8. Efectos de la clase de edad en el índice H/L en una población de golondrina común estudiada en el suroeste de España. 21 4.3. Estrés y su relación con el estado de infección Se identificaron parásitos hemosporidios de los géneros Plasmodium, Haemoproteus y Leucocytozoon. La prevalencia fue del 19.2% en hembras y de 8.1% en machos (Figura 9). Con respecto a la clase de edad, los individuos jóvenes presentaron una prevalencia de un 16.7% en comparación con un 10.3% en los adultos (Figura 10). Además, también encontramos diferencias en el estado de infección según el año de captura. Concretamente, fue de un 7.7% en 2017 y 36.4% en 2018 (Figura 11). Figura 9. Representación gráfica de la prevalencia de infección según el sexo en una población de golondrina común estudiada en el suroeste de España. 22 Figura 10. Representación gráfica de la prevalencia de infección según la clase de edad en una población de golondrina común estudiada en el suroeste de España. Figura 11. Representación gráfica de la prevalencia de infección según el año de captura en una población de golondrina común estudiada en el suroeste de España. El modelo GLM que incluyó la relación entre la ratio de H/L y el estado de infección no explicó la existencia de una correlación entre ambos (Tabla 2). 23 4.4. Relación de la eficacia biológica o fitness con el índice de estrés El análisis GLM para las variables relacionadas con los datos de la eficacia biológica de los individuos para explicar el índice H/L como condición de estrés, indicó que el mejor modelo fue aquel que incluyó el número de puestas como única variable predictora. Concretamente, encontramos que los individuos que pusieron 3 puestas tenían una ratio H/L mayor que los individuos con menor número de puestas (Tabla 2; Figura 12). Figura 12. Efectos del número de puestas en el índice H/L en una población de golondrina común estudiada en el suroeste de España. 4.5. El estrés en los distintos periodos de reproducción En el modelo GLM con el que evaluamos el efecto del periodo de la época de reproducción en la condición de estrés medida con el índice H/L, no encontramos diferencias significativas que explicaran una correlación. De manera que resultó que durante la época de reproducción los individuos no sufren un estrés significativo (Tabla 2). 24 Tabla 2. Resultados de los GLMs reducidos para identificar los factores asociados con el índice H/L. 5. DISCUSIÓN Nuestro estudio confirma que la cuantificación de parámetros hematológicos puede usarse como medida de la condición de estrés y el estado de las poblaciones. Encontramos que los individuos que invierten más en la reproducción, en relación con el número de puestas producidas durante un periodo reproductor, tuvieron un índice de estrés mayor que los que realizaron menor número de puestas. Aunque no encontramos el mismo resultado para el número de pollos totales o la etapa de la época de reproducción. Se observó variación del índice según el número de huevos totales, pero cuando analizamos la correlación incluyendo todas las variables del fitness esta relación desaparece debido a que quizá no es por el número de huevos que tienen, sino por las veces que tienen que realizar una puesta y poner más huevos. También nuestros resultados establecieron la correlación entre el índice H/L y la clase de edad. En este estudio encontramos que las hembras presentan mayor cantidad de heterófilos y linfocitos que los machos, lo que explica que no haya diferencias en el índice H/L. A pesar de que muchos estudios muestran diferencias entre sexos en este índice, argumentando que la razón se debe a la distinta contribución en el cuidado parental (Hõrak et al., 1998; Schmidt et al., 2007; Palacios et al., 2017), no hallamos tales VARIABLES DEPENDIENTES NAIC VARIABLES EXPLICATIVAS βSE F d.f P-value Índice H/L (datos: morfología) 104 44.35 Clase de edad (joven)  0.15 0.07 4.47 1, 75 0.04 * Estado de infección  0.32 0.15 1.33 1, 75 0.25 Malófagos  0.007 0.004 1.04 1, 74 0.31 Estado de infección:Malófagos 0.015 0.008 3.66 1, 73 0.06 . Índice H/L (datos: fitness) 78 58.5 Número de puestas 0.29 0.15 5.38 2, 69 0.006 ** Índice H/L (datos: periodo cría) 78 39.9 NULL 104 46.7 Índice H/L (estado de infección) 25 diferencias concordando con otros hallazgos que sugieren la ausencia de diferencias sexuales con respecto al estrés que conllevan los compromisos fisiológicos y de la historia de vida de los individuos (Losdat et al., 2016; Chediack et al., 2022). Varias evidencias mostraron que los perfiles de leucocitos difieren entre sexos debido a que las hormonas sexuales actúan como moduladores ante la respuesta del sistema inmune, siendo la testosterona en machos inmunosupresora y el estrógeno en hembras potenciador (Campo y Davila, 2002; Foo et al., 2016; Roved et al., 2017; Grilli et al., 2018; Ribeiro et al., 2020). El número más alto de linfocitos en el caso de las hembras podría explicarse debido a que la prevalencia en la infección por parásitos hemosporidios fue mayor (19.2%) que en los machos (8.1%). La variación en el número de monocitos según la localidad de las poblaciones de estudio puede explicarse debido a la distinta probabilidad de infectarse en cada una, ya que los monocitos participan en infecciones parasitarias degradando microorganismos (Ribeiro et al., 2020). Es conocido que el índice H/L responde a diferentes estresores medioambientales (Johnstone et al., 2012), aunque en este estudio no encontramos tales distinciones posiblemente porque los individuos estaban respondiendo de manera similar a las distintas condiciones que conforman las localidades. Los resultados obtenidos entre las dos clases de edad muestran diferencias en el índice H/L, el número de linfocitos y de monocitos. La edad es un factor biológico importante al medir las variables hematológicas, ya que se han registrado datos de varios trabajos que muestran cómo existe tal influencia, habiendo una distinta inversión de recursos por parte de los más jóvenes a comparación de los adultos de más edad (Campo y Davila, 2002; Schmidt et al., 2007; Montolio et al., 2017). Mayor número de linfocitos y monocitos en jóvenes se puede explicar debido a que la prevalencia de infección en jóvenes fue mayor (16.7%) que en los adultos (10.3%), posiblemente debido a que los 32 -Fletcher, K., Träff, J. y Gustafsson, L. (2019). Importance of infection of haemosporidia blood parasites during different life history stages for long-term reproductive fitness of collared flycatchers. Journal of Avian Biology, 50(8). -Gelman, A. (2008). Scaling regression inputs by dividing by two standard deviations. Statistics in Medicine, 27, 2865-2873. -Grilli, M. G., Pari, M. e Ibáñez, A. (2018). Poor body conditions during the breeding period in a seabird population with low breeding success. Marine Biology, 165(9), 142. -Grzędzicka, E. (2017). Immune challenge of female great tits at nests affects provisioning and body conditions of their offspring. acta ethologica, 20, 223-233. -Hanssen, S. A., Hasselquist, D., Folstad, I. y Erikstad, K. E. (2005). 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