Cuantificación y evaluación del efecto radiobiológico inducido por radiación ionizante sobre nanopartículas de oro en cultivo celular

ANTONIO - Departamento de Fisiología Médica y Biofísica Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla Enero – junio 2024 Cuantificación y evaluación del efecto radiobiológico inducido por radiación ionizante sobre nanopartículas de oro en cultivo celular Autor: Natalia Garrido Díaz Tutor: Antonio Leal Plaza Co-tutor: José Antonio López Valverde Máster en Investigación Biomédica LEAL PLAZA Firmado digitalmente por LEAL PLAZA LOPEZ VALVERDE Firmado digitalmente por LOPEZ VALVERDE JOSE ANTONIO - Firmado por Natalia Garrido Díaz ANTONIO - ***810*** JOSE ANTONIO ***652*** Fecha: 2024.06.03 con un certificado **810*** Fecha: 2024.06.03 22:01:59 +02'00' - ***652*** 21:56:29 +02'00' Abreviaturas AuNP Nanopartículas de oro. AVAD Años de vida ajustados por discapacidad. BSA Seroalbúmina bovina. CBMN Micronúcleos bloqueados por citocinesis. cGy centiGray. DBS Double strand break. DCA Ensayo de cromosomas dicéntricos. DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium. EECC Ensayos clínicos. EPR Efecto de permeabilidad y retención. FBS Suero fetal bovino. GdNP Nanopartículas de gadolinio. Gy Gray. KeV Kilo electrón voltio. L-15 Leibovitz’s 15 LSPR Resonancia Superficial de Plasmón Localizada. MeV Mega electrón voltio. MN Micronúcleos. MRI Resonancia magnética de imagen. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). NBF Formalina tamponada neutra. NIR Infrarrojo cercano. nm nanometros. NP Nanopartículas. NPB Puentes nucleoplásmicos. PBS Phosphate Buffered Saline. PDT Population Doubling Time. PEG Polietilenglicol. PSA Penicilina-Estreptomicina-Aureomicina. RES Sistema Reticuloendotelial. RPMI Roswell Park Memorial Institute. RT Radioterapia. SERS Dispersión Raman mejorada en superficie. SPION Nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro. TAC Tomografía axial computarizada. UM Unidades Monitor. Z Número atómico. Índice 1. Antecedentes .......................................................................................................................... 1 1.1. Cáncer y radioterapia ..................................................................................................... 1 1.2. Radioterapia personalizada y de precisión ..................................................................... 2 1.3. Aplicaciones de nanopartículas en radioterapia ............................................................. 3 1.4. Nanopartículas de oro..................................................................................................... 4 1.4.1. Nanopartículas de oro como agentes teragnósticos................................................ 5 1.4.2. Ensayos clínicos (EECC) actuales con nanopartículas de oro en radioterapia ...... 7 1.5. Dosimetría biológica ...................................................................................................... 8 1.5.1. Amplificación y sensibilización ............................................................................. 8 1.6. Citogenética .................................................................................................................... 9 1.6.1. Ensayo de cromosomas dicéntricos (DCA) ......................................................... 10 1.6.2. Ensayo de micronúcleos bloqueados por citocinesis (CBMN) ............................ 10 2. Objetivos .............................................................................................................................. 13 3. Materiales y métodos .......................................................................................................... 14 3.1. Cultivos celulares ......................................................................................................... 14 3.1.1. Línea celular MDA-MB-231 y línea celular MP46 ............................................. 14 3.2. Ensayo Population Doubling Time .............................................................................. 15 3.2.1. Population Doubling Time MDA-MB-231 medio DMEM complete. ................. 16 3.2.2. Population Doubling Time MDA-MB-231 medio L-15 ...................................... 16 3.2.3. Population Doubling Time MP46 RPMI 1640. ................................................... 17 3.3. Ensayo de viabilidad celular (MTT) ............................................................................ 17 3.3.1. Diseño y siembra de las placas ............................................................................. 18 3.3.2. Preparación y adición de nanopartículas .............................................................. 19 3.3.3. Preparación de disoluciones ................................................................................. 20 3.3.4. Realización del ensayo de MTT ........................................................................... 20 3.4. Técnicas de citogenética............................................................................................... 20 3.4.1. Ensayo de dicéntricos ........................................................................................... 20 3.4.2. Ensayo de micronúcleos bloqueados en citocinesis (CBMN) ............................. 23 3.5. Dosimetría biológica .................................................................................................... 26 3.5.1. Foci gamma H2AX .............................................................................................. 26 4. Resultados y discusión ........................................................................................................ 30 4.1. Population Doubling Time ........................................................................................... 30 4.1.1. PDT línea celular MDA-MB-231 ........................................................................ 30 4.1.2. PDT línea celular MP-46...................................................................................... 32 4.2. Ensayo de viabilidad celular (MTT) ............................................................................ 32 4.3. Ensayo de micronúcleos bloqueados por citocinesis ................................................... 33 4.4. Ensayo de cromosomas dicéntricos.............................................................................. 35 4.5. Foci gamma H2AX ...................................................................................................... 36 5. Conclusiones ........................................................................................................................... 37 6. Bibliografía ............................................................................................................................. 38 Resumen En la actualidad el cáncer supone uno de los mayores problemas de salud pública debido a la gran carga clínica, económica y social asociada, dando lugar a una creciente búsqueda de nuevas alternativas a su tratamiento. La radioterapia de precisión surge como una novedosa opción, gracias a las nuevas tecnologías de imagen y al avance en el cálculo de la dosis. En el marco de este propósito, como en otras especialidades médicas, la nanomedicina aparece como una herramienta plausible. El uso de nanopartículas de oro como radiosensibilizadores es, sin duda, la línea de investigación más recurrente en este contexto científico. Mediante el uso de estas nanopartículas, que destacan por sus características fisicoquímicas únicas, se persigue un mayor daño del tejido tumoral con menor afectación del tejido sano. Más aún, este daño a la lesión pretende ser más preciso en la medida en que se apunta a la célula que ha metabolizado selectivamente la nanopartícula, a diferencia del empeño de la radioterapia convencional en entregar una dosis terapéutica a un volumen tumoral. Este nuevo enfoque hace de la dosimetría biológica un tópico de interés común para muchos investigadores que pretenden evaluar el daño bajo nuevas técnicas terapéuticas. En este trabajo, trato de cuantificarse el daño producido por el uso de radiación en combinación con nanopartículas de oro en concentraciones determinadas sobre cultivos celulares. Se realizaron ensayos de citogenética como son el ensayo de dicéntricos y el ensayo de micronúcleos con bloqueo de la citocinesis en células tumorales de las líneas MDA-MB-231 y MP46. Estos ensayos se realizaron tanto en presencia como en ausencia de nanopartículas bajo radiación. La comparación de los resultados de dichos métodos en distintas condiciones permitió cuantificar las aberraciones producidas, cuyos resultados pueden extrapolarse para cuantificar el daño producido por la presencia o ausencia de nanopartículas de oro, y demostrar así la capacidad como radisosensibilizador de estas nanopartículas. Este trabajo fue realizado en el contexto de un proyecto de investigación que pretende, como siguiente etapa metodológica, la traslación a experimentación in vitro, por lo que, entre otros objetivos, los resultados aquí expuestos serán considerados para un desenvolvimiento ético adecuado y respetuoso con los criterios de las 3 Rs. 1 1. Antecedentes 1.1. Cáncer y radioterapia Actualmente, el cáncer, tan solo superado por las enfermedades cardiovasculares, ocupa el segundo puesto como causa de muerte debida a enfermedad a nivel mundial (1). Esto supone un total de aproximadamente 19 millones de nuevos casos de cáncer en el mundo en 2022 y casi 10 millones de muertes debido a esta enfermedad en ese mismo año. Destacan por su mayor incidencia los tumores de pulmón, mama y colorrectales en ese orden, tanto en hombres como en mujeres (2,3) . Estas estadísticas, hacen del cáncer la enfermedad con mayor carga económica, clínica y social en términos de años de vida ajustados por discapacidad (AVAD), es decir, el número de años perdidos por causa de una enfermedad (4). En los últimos años todas las investigaciones se han centrado en encontrar el origen y formación de los tejidos cancerosos, así como sus mecanismos de propagación y de recaída tras el tratamiento (1). Un campo importante en la investigación engloba la búsqueda de nuevos tratamientos, para mejorar los utilizados o encontrar nuevas opciones para paliar la enfermedad. En la actualidad, son utilizadas múltiples técnicas terapéuticas, dependiendo del tipo de tumor y el estadio en el que se encuentre, entre las que destacan: quimioterapia, cirugía, radioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia o terapia dirigida, entre otras, pudiéndose utilizar uno o varios métodos combinados a la vez. El objetivo principal, dentro del uso de uno o varios métodos de tratamiento es siempre lograr la máxima efectividad produciendo el mínimo daño (5). Entre los tipos de tratamiento anteriormente mencionados, destacan las técnicas basadas en la radiación orientadas al tratamiento del tumor sólido. Las tecnologías basadas en la radiación son utilizadas tanto para la exploración física como para el diagnóstico por imagen multimodal basado en detalles anatómicos tridimensionales. Las técnicas utilizadas más habitualmente son la resonancia magnética (RM), la tomografía computarizada (TC) y la tomografía por emisión de positrones (PET-TC), pudiéndose combinar entre ellas, con el fin de obtener una sinergia entre información morfológica y funcional o fisiológica. Estas técnicas han permitido evaluar el volumen de tratamiento, así como el contorno del tumor y de los tejidos sanos (6). La utilización de estas técnicas permite, en la clínica, la determinación del volumen tumoral macroscópico (GTV, del inglés Gross Tumor Volume), el cual se extiende hasta la afectación microscópica del cáncer lo cual se denomina volumen tumoral clínico (CTV, del inglés Clinical Target Volume) y finalmente este se amplía hasta un margen, dependiendo de la evaluación de las muestras quirúrgicas, obteniéndose así el volumen diana de planificación (PTV, del inglés Planning Target Volume). Dependiendo de esto, se administrará la dosis de radiación típica que suele ser de 81,6 Gy en fracciones de 1,2 Gy o de 66 a 74 Gy en fracciones de 2 Gy (7). Este punto es uno de los que mayor reconsideración está teniendo en la radioterapia avanzada, ya que 2 las nuevas tecnologías de colimación para la administración de la dosis al tumor evitando tejido sano ha impulsado nuevos esquemas de tratamiento, especialmente, en regímenes de hipofraccionamiento, es decir, en menos sesiones para la entrega de la dosis de prescripción. Solo con esto, sin que tenga por qué mediar una nueva técnica radioterápica como la que aquí se evalúa, ha despertado en la comunidad científica la inquietud por cuantificar el efecto radiobiológico de manera más efectiva y rutinaria, conduciendo a un interés especial por la dosimetría biológica, como debatiremos más adelante. Teniendo delimitado el tumor, la radioterapia se lleva a cabo dirigiendo diferentes haces de radiación hacia la diana, variando los ángulos e intensidades asociadas. Cada uno de los haces de radiación tiene como objetivo común seguir el contorno diana delimitado y converger en la lesión, administrándose así la dosis planificada para el tumor, administrando la mínima dosis en los tejidos sanos (6). Más allá de esta convergencia de haces y conformación tridimensional, que solo puede lograrse con precisión a través del dispositivo MLC (del inglés, Multileaf Collimator), este mismo dispositivo revoluciona la radioterapia al permitir con acierto la modulación de la intensidad, considerando las heterogeneidades que cada haz tiene que recorrer hasta la diana, así como dar lugar a una distribución relativa de la dosis más ajustada. La técnica radioterápica que permite este avance es la denominada IMRT (del inglés, Intensity Modulated Radiation Therapy) y es el estándar actual en teleterapia. 1.2. Radioterapia personalizada y de precisión La radioterapia se postula de esta manera como el método más eficaz en tratar el tumor sólido y controlar la enfermedad localizada, utilizando radiación ionizante con el fin de destruir las células cancerígenas y/o detener la alta capacidad mitótica de las mismas. Las energías asociadas a los haces terapéuticos tienen capacidad ionizante, es decir, provocan la formación de iones que, bien directa o indirectamente a través de la formación de especies reactivas de oxígeno o ROS (del inglés, Reactive Oxygen Species) que potencien reacciones químicas no reguladas, induzcan cambios genéticos irreversibles que desemboquen en muerte celular (8,9). En la medida en que el tejido canceroso se caracteriza por una división celular descontrolada, este resulta más radiosensible que el tejido sano frente a una misma dosis de radiación. No obstante, no es posible irradiar exclusivamente las células cancerígenas, sino que también las células sanas reciben una cantidad indeseada de dosis. Se espera que estas células sanas normalmente reciban niveles de dosis mucho más bajos con idea de que se reparen con mayor facilidad que las cancerígenas. Es por esto por lo que los tratamientos se fraccionan en sesiones, con objeto de permitir la reparación a niveles de baja radiación, y es por esto mismo que, técnicas más precisas permiten un número de sesiones más pequeño, como se ha comentado con anterioridad (7). 3 El refinamiento de este objetivo dual es el que impulsa un nuevo enfoque que ha surgido en la última década y que se denomina radioterapia personalizada y de precisión. Esto implica el tratamiento de cada paciente de manera precisa mediante su estratificación y la utilización de nuevas tecnologías y/o biomarcadores (11). Dentro del campo de la radioterapia personalizada y de precisión, cabe destacar el uso de la nanomedicina, que pretende utilizar nanopartículas no solo para el tratamiento del cáncer, sino incluso para su diagnóstico (12,13). El uso de nanopartículas en radioterapia ha demostrado que ofrece un mayor control del tratamiento que la radioterapia por si sola además de una mayor selectividad. Una importante ventaja que ofrece es que en combinación con otros tratamientos permite superar los fenómenos de farmacorresistencia y radiorresistencia (14,15). Los mecanismos por los cuales las nanopartículas combinadas con Figura 1. Respuesta biológica de las células a la combinación de nanopartículas y radioterapia (16). radioterapia pueden resultar más eficaces son variados: Producción de ROS, inhibición de los sistemas de reparación del ADN, perturbación del ciclo celular o control del microambiente tumoral. En la Figura 1 se representan esquemáticamente algunos de estos mecanismos. Esta propuesta ha demostrado destruir las células madre cancerosas y dar buenos resultados en algunos ensayos clínicos (16). 1.3. Aplicaciones de nanopartículas en radioterapia Las nanopartículas se definen como partículas microscópicas que presentan un tamaño dentro de la escala nanométrica comprendido entre 1 y 100 nanómetros en todas sus dimensiones, ya que pueden diferenciarse de estas los nanotubos y placas, por ejemplo, de grafeno. No obstante, también pueden incluirse partículas mayores, llegando hasta un tamaño de 1 micrómetro (17). Las nanopartículas utilizadas en radioterapia van a estar, principalmente, basadas en un núcleo metálico con alto número atómico, las cuales, una vez establecida la química de su síntesis, dependerá de su aplicación posterior, el elemento del núcleo. El material seleccionado para la síntesis del núcleo va a permitir que haya una mayor biocompatibilidad, además del ajuste de atributos como forma, carga o tamaño de la nanopartícula, y la conjugación de grupos adicionales a la superficie, que permitirán la funcionalización de estas (18). Principalmente, entre los diferentes tipos de nanopartículas, van a destacar tres grupos: nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro o SPION (del inglés, Superparamagnetic 10 tan solo se muestra la respuesta de reparación; sin embargo, no permite dar una idea del daño real causado, es decir, de las consecuencias finales de este (34). En el caso de los ensayos citogenéticos, se evalúan las mutaciones de tipo complejo y estructurales denominadas aberraciones, como son los dicéntricos o los micronúcleos (MN), entre otros. Estas aberraciones cromosómicas nos permiten, mediante el conocimiento de su frecuencia, estimar el grado de exposición y determinar una dosis biológica de radiación (33). 1.6.1. Ensayo de cromosomas dicéntricos (DCA) Este ensayo se basa en que las células, expuestas a radiación, sufren roturas en la doble cadena de ADN. Esta rotura es reparada, pero puede ocurrir una reparación incorrecta de dos cromosomas y posterior replicación, formándose así un cromosoma de dicéntricos, es decir, con 2 centrómeros que lo hace inestable, como se observa en la Figura 2 (40). El fundamento de este ensayo se basa en la utilización de Figura 2. Proceso de formación de un cromosoma dicéntrico. Colcemida, una sustancia que impide la formación del huso mitótico durante la mitosis, provocando la inmovilización de la metafase. Esto permite la observación de los cromosomas condensados en la metafase permitiendo así el estudio de las diferentes aberraciones en las técnicas de citogenética. Las radiaciones ionizantes producen diferentes cambios en el ADN celular, sabiéndose que un aumento de la dosis de radiación produce un aumento del número de dicéntricos que, a pesar de no ser la única aberración producida, se ha establecido como la más sensible y específica para evaluar el efecto biológico de la dosis de radiación (41). La formación de cromosomas dicéntricos se considera un fenómeno especifico de la exposición a radiación ionizante y algunos fármacos radiomiméticos. Los niveles de cromosomas dicéntricos son muy bajos en individuos no expuestos a radiación, por lo que este ensayo permite evaluar dosis de irradiación tan bajas como 0,1 Gy. Esto convierte al ensayo de cromosomas dicéntricos en el gold standard de la dosimetría biológica (40,42). 1.6.2. Ensayo de micronúcleos bloqueados por citocinesis (CBMN) Al igual que en el ensayo anterior, esta técnica CBMN (del inglés, Cytokinesis-Block Micronucleus), se basa en las reparaciones incorrectas del ADN tras el daño sufrido debido a la exposición de radiaciones ionizantes (43). En el momento de la mitosis, determinados cromosomas o fragmentos de estos no segregan a los polos de la célula, formándose así los micronúcleos, que consisten en fragmentos excluidos de los núcleos hijos y rodeados de su membrana (38). 11 En este ensayo se considera la formación de micronúcleos, que pueden observarse como pequeños cuerpos redondos formados por cromatina en el citoplasma de las células. Los micronúcleos pueden producirse de manera natural en el organismo o darse por causas externas, como puede ser la radiación (43). Los factores más frecuentes que dan lugar al origen de micronúcleos se encuentran bien descritos y son los siguientes: Fragmentos de cromosomas acéntricos, rotura de cromosomas dicéntricos, mala segregación de cromosomas, inestabilidad cromosómica, agregación de cromosomas doble minuto. Los micronúcleos tan solo son visibles tras la división de la célula, de manera que este ensayo consiste en el uso de Cytocalasina B, la cual va a inhibir la citocinesis sin que se inhiba la cariocinesis. El uso de este reactivo no va a interferir en la mayor o menor formación de micronúcleos, de manera que se observan células binucleadas en las cuales se han podido llegar a formar uno o varios micronúcleos tras la división del núcleo como se observa en la Figura 3 (31). Figura 3. Esquema del procedimiento del ensayo de micronúcleos por bloqueo de citocinesis. Este ensayo se ha convertido así, durante sus casi 40 años de uso, en uno de los métodos para evaluar la genotoxicidad de las radiaciones ionizantes más populares. En la versión básica del ensayo solo se puntúan los micronúcleos, aunque también pueden puntuarse otros marcadores como pueden ser los puentes nucleoplásmicos o NPB (del inglés, Nucleoplasmic Bridges), yemas nucleares, células necróticas y/o apoptóticas y manchas nucleares. Este ensayo que puntúa otros marcadores, se denomina ensayo CBMN (del inglés, Cytokinesis-Block MicroNucleus) de citoma y proporciona información adicional sobre los daños al ADN, su reparación, la citostasis y la citotoxicidad (44). Los criterios detallados para la puntuación de estos marcadores han sido publicados, siendo la puntuación de micronúcleos y puentes nucleoplásmicos los biomarcadores mejor validados para la dosimetría biológica de la exposición a radiaciones ionizantes (40). Los micronúcleos son reconocidos por ser morfológicamente iguales a los núcleos principales, pero de un tamaño más pequeño. Para su puntuación deben además cumplir las siguientes características: Tener un diámetro medio que varíe entre 1/16 y 1/3 del diámetro de los núcleos principales; no ser retráctiles y distinguirse de los artefactos, no estar unidos ni conectados a los núcleos principales; poder tocar los núcleos principales, pero no superponerse con ellos, debiendo poder distinguirse el núcleo micronuclear del límite nuclear; tener la misma intensidad de tinción que los núcleos principales, aunque puntualmente esta puede ser más intensa (40). 12 Los puentes nucleoplásmicos se definen como estructuras continuas de ADN que se encuentran uniendo los núcleos principales de una célula binucleada. Estas estructuras se van a originar en los cromosomas dicéntricos en los cuales los centrómeros son arrastrados hacia polos opuestos durante el anafase (40). De las características de estos criterios de puntuación, puede inferirse la dificultad de su cuantificación, lo expuesto que el proceso puede estar al sesgo debido a su naturaleza usuario dependiente, así como el reto que supone realizar un procedimiento automático y reproducible por procesamiento de imagen, aunque, al mismo tiempo, sea muy deseable. 13 2. Objetivos El objetivo principal de este trabajo es la demostración del efecto radiosensibilizador de las AuNP en combinación con radioterapia en cultivo celular, bajo unas condiciones específicas encontradas previamente como óptimas para la aplicación clínica en una etapa in silico. Para ello, ha sido necesario acometer los siguientes objetivos intermedios: 1. Caracterización de las líneas celulares bajo estudio. 2. Realización de procedimientos de viabilidad celular como el ensayo de MTT. 3. Optimización de procedimientos experimentales en ensayos de citogenética tales como el ensayo de micronúcleos bloqueados en citocinesis y el ensayo de dicéntricos. 4. Observación de daño en muestras mediante equipos de microscopia y adquisición de imágenes con software específico. 5. Cuantificación de los resultados y desarrollo de técnicas de cuantificación automática bajo análisis por comparación directa con el proceso manual. 14 3. Materiales y métodos 3.1. Cultivos celulares Para la realización del presente trabajo que se encuadra dentro del proyecto de investigación ‘Viabilidad clínica de las nanopartículas de oro como agente teragnóstico en una radioterapia de precisión’ financiado por la Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer (AECC), fue necesaria la selección de líneas celulares adecuadas. Para ello fue preciso antes realizar una búsqueda bibliográfica en bases de datos científicas como PubMed. De acuerdo con nuestros criterios para el tratamiento de tumor sólido, se seleccionaron dos líneas celulares, una de cáncer de mama como es la línea celular MDA-MB-231, y otra de melanoma uveal como es la línea celular MP46, cuyas características son descritas a continuación. 3.1.1. Línea celular MDA-MB-231 y línea celular MP46 Figura 4. Células MP46 observadas al microscopio óptico invertido con el objetivo 10x. Figura 5. Células MDA-MB-231 observadas al microscopio óptico invertido con el objetivo 10x La línea celular MDA-MB-231 (Figura 4) procede de un adenocarcinoma basal de mama. Estas células fueron aisladas de un derrame pleural de una paciente de 51 años. Presentan un crecimiento rápido y en monocapa adherente, siendo el medio idóneo de cultivo, el medio Leibovitz’s 15 [ThermoFisher, Grand Island, NY, USA, ref. 21083-027] (L-15) adicionado con un 10% Suero fetal bovino (FBS) [Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany, ref. F7524-100ML] y penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 µg/ml) y anfotericina B Gibco (0,25 µg/ml) [ThermoFisher, Grand Island, NY, USA, ref. 15240062] (PSA), siendo las condiciones de incubación una temperatura de 37ºC y 0% de CO2 (45). Estas células también han sido cultivadas en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) con elevada glucosa y piruvato [ThermoFisher, Paisley, UK, ref. 21969035] adicionado con un 10% FBS, 4 mM L- glutamina [ThermoFisher, Paisley, UK, ref. 25030081] y PSA, con la diferencia de que las 15 condiciones de incubación son una temperatura de 37ºC y 5% de CO2 con lo cual se encuentran en un incubador diferente. La línea celular MP46 (Figura 5) es de tipo epitelial y procede de un tumor primario uveal. Estas células fueron extraídas de un varón de 69 años con melanoma. Su crecimiento tiende a ser rápido y en monocapa adherente, siendo el medio idóneo para su cultivo, el medio RPMI-1640 con modificación de la ATCC [ThermoFisher, Grand Island, NY, USA, ref. A1049101] adicionado con 20% FBS, a una temperatura de 37ºC y 5% de CO2 (46). 3.2. Ensayo Population Doubling Time Un procedimiento relevante previo a la realización del resto de experimentos consiste en realizar un ensayo Population Doubling Time (PDT), el cual nos determinará el tiempo que tardan las líneas celulares en duplicar su población. La realización de este ensayo nos va a permitir obtener una curva de crecimiento de la población celular, en la cual se pueden distinguir diferentes fases: Fase lag, en la cual las células no se dividen, sino que están adaptándose a las condiciones de cultivo; Fase log o exponencial, en la cual las células proliferan activamente y hay un Figura 6. Representación de la curva de crecimiento celular (47) incremento exponencial en la densidad celular ; Fase plateau o estacionaria, donde la proliferación celular cae debido a que la población celular comienza a ser confluente en el cultivo; Fase de muerte, en la cual predomina la muerte celular y hay una notable reducción de células viables. En la Figura 6 se representa en el eje de coordenadas el número de células por centímetro cuadrado, y en el eje de abscisas se representa el tiempo transcurrido, diferenciándose las fases comentadas. El cálculo del PDT, o tiempo requerido para que un cultivo duplique su población se calcula partir de la Ecuación 1: 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 = 𝑃𝑃 𝑙𝑙𝑙𝑙2 ln ( 𝑋𝑋𝑋𝑋) 𝑋𝑋𝑋𝑋 (47) Ecuación 1. Cálculo de Population Doubling Time. Tiempo de incubación en cualquier unidad (T). Número de células al final del tiempo de incubación (Xe). Número de células al inicio del tiempo de incubación (Xb) (47). 16 3.2.1. Population Doubling Time MDA-MB-231 medio DMEM complete. Para la realización de este ensayo se utilizó la línea celular MDA-MB-231, la cual tras su segundo pase había sido incubada en un Flask T75 durante 72 horas en medio DMEM complete, a 37ºC y 5% de CO2. Tras la realización del subcultivo se hicieron cuatro recuentos de las células con el fin de hallar el número total de células por mililitro en nuestra suspensión. Una vez realizado el cálculo, se sembraron un total de 20 Flask T25 con un total de aproximadamente 75.000 células, es decir, 3.000 células por cm3. El experimento se realizó por un total de 10 días realizando el recuento de dos Flask T25 seleccionados de manera completamente aleatoria cada 24 horas. Para ello, se tripsinizaron las células de los Flask T25 a fin de despegarlas del soporte, y se centrifugaron en tubos Falcon a 800 rpm, 23ºC y 6 minutos, obteniéndose así un Pellet, el cual se fue resuspendiendo en diferentes volúmenes cada día dependiendo de la densidad celular esperada. Se aislaron 2 eppendorf con un volumen de 20 µl de la suspensión de células de cada uno de los Flask T25. Para el recuento se utilizó la cámara de Neubahuer, utilizando mezclas igualitarias de la suspensión de células con la Solución azul de tripano al 0,4% [ThermoFisher, Grand Island, NY, USA, ref. 15250061] con el fin de teñir las células muertas y separarlas de las vivas. Se realizaron dos recuentos de cada uno de los eppendorf, obteniéndose un total de ocho recuentos por día. Además, tras la realización de estos, se midió el volumen exacto total de cada Falcon. Las células se contaron cada 24 horas, aproximadamente a la misma hora, quedando indicado cuando hubo un desfase horario. Puesto que las células van consumiendo los recursos del medio, se decidió realizar un cambio de medio cada 48 horas, de manera indistinta de si habían consumido el medio o no, para que las características del ensayo fueran homogéneas. 3.2.2. Population Doubling Time MDA-MB-231 medio L-15 Para la realización de este ensayo se utilizó la línea celular MDA-MB-231, incubada en un Flask T75 durante 72 horas en medio L-15 adicionado con un 10% de FBS y PSA, a 37ºC y 0% de CO2. El ensayo se realizó de manera idéntica a como se describe en el apartado 3.2.1. Previo a este ensayo, se realizó un ensayo con la misma línea celular y medio, el cual se realizó de manera menos heterogénea. Este ensayo se realizó durante un total de 11 días, realizándose el recuento de las células cada 24 horas, a excepción del último día que se realizó a las 48 horas. Los cambios de medio fueron realizados los días 3, 5 y 8 del ensayo y no fueron medidos los volúmenes en los tubos Falcon al finalizar el recuento. Estos motivos fueron los que llevaron a la repetición del ensayo, con objeto de homogeneizarlo. 17 3.2.3. Population Doubling Time MP46 RPMI 1640. Para la realización de este ensayo se utilizó la línea celular MP46, la cual, había sido incubada en un Flask T75 durante 96 horas en medio RPMI 1640 adicionado con un 20% de FBS y PSA, a 37ºC y 5% de CO2. Tras la realización del subcultivo se hicieron cuatro recuentos de las células con el fin de hallar el número total de células por mililitro en nuestra suspensión. Una vez realizado el cálculo, se sembraron un total de 22 Flask T25 con un total de aproximadamente 60.000 células, es decir 2.400 células por cm3. Este cambio en la densidad de siembra con respecto a los ensayos anteriores se debió al crecimiento más lento de esta línea celular, de manera que al realizar la siembra no se obtuvo el número de células deseado y se decidió este cambio, el cual no afecta al ensayo. El experimento se realizó por un total de 17 días realizando el recuento de dos Flask T25 seleccionados de manera completamente aleatoria cada 48 horas, a excepción del primer recuento que se realizó a las 24 horas con la finalidad de ver de manera más precisa la fase lag, ya que el crecimiento de esta línea celular es más lento. El resto de los pasos se realizó de manera idéntica a como se describe en el apartado 3.2.1. Igualmente, las células se contaron cada 48 horas, a excepción del primer día, aproximadamente a la misma hora, quedando indicado cuando hubo un desfase horario. Se realizó un cambio de medio cada 48 horas para compensar el consumo de los recursos en el medio, y con independencia de si se había consumido o no el medio para homogeneizar el proceso. 3.3. Ensayo de viabilidad celular (MTT). Los ensayos de viabilidad celular son frecuentemente utilizados para determinar el número total de células eucariotas viables que hay en una población celular, previamente a la realización de experimentos en los que se va a producir un daño a la población celular, pudiendo llegar a provocar su muerte. Figura 7. Reducción del MTT al compuesto coloreado del formazán. Existen múltiples métodos para determinar la viabilidad celular. Este ensayo colorimétrico consiste en la reducción de MTT por parte del metabolismo de las células en un compuesto llamado formazán cuyo color es morado. Cuando las células mueren pierden la capacidad de reducir este compuesto. El mecanismo por el que se produce esta reducción no está perfectamente comprendido, pero se cree que la acción sobre el MTT se debe a las 18 deshidrogenasas mitocondriales. La coenzima reducida resultante NADH convertirá el MTT en su formazán (Figura 7). Las sales de formazán se acumulan en el interior de las células como un precipitado, de manera que deben ser solubilizadas previamente a la medida en el lector de placas, cuyo máximo de absorbancia está en 570 nm (48). Cuando una determinada longitud de onda con una intensidad (I0) incide de manera perpendicular sobre la disolución, el compuesto químico que esta contenga absorberá una parte de la radiación incidente (Ia), dejando pasar a través de la disolución el resto de la radiación (It). La absorbancia se va a definir de esta manera como la cantidad de luz incidente absorbida por el compuesto químico presente en la disolución, la cual es representada por la siguiente ecuación: 𝐴𝐴 = − log 𝐼𝐼𝑡𝑡 𝐼𝐼0 (49) Ecuación 2. Ecuación que permite el cálculo de la absorbancia. Luz transmitida (It). Luz incidente (I0) (49). Esta relación nos va a indicar en qué medida el compuesto químico absorbe determinadas cantidades de luz. Por ello, cuando la luz incidente (I0) es igual a la luz transmitida (It), la absorbancia tiene un valor de 0, y el logaritmo vale 1, indicando que la muestra no absorbe. Cuanto mayor sea la cantidad de formazán reducido, mayor cantidad de luz será absorbida por la muestra y por tanto mayor será el valor sobre 1 en la Ecuación 2 (49). Los parámetros como la concentración de MTT, la duración del periodo de incubación o tanto el número como la actividad metabólica de las células, son dependientes de la cantidad de señal que se va a generar. Esto hace que sea de gran importancia optimizar el ensayo, para así obtener una señal suficiente que pueda ser detectada por encima del fondo (48). 3.3.1. Diseño y siembra de las placas El diseño de las placas se realizó como se indica en la Figura 8, en las cuales se incluyeron 3 tipos de columnas de pocillos, cada una con un contenido: Medio fresco (Blanco).; células que no van a ser tratadas con AuNP o Control Positivo (Morado); células que van a ser tratadas con AuNP a diferentes concentraciones (Tonalidades verdes). Figura 8. Diseño de placa para el ensayo de MTT. Control positivo (C+). Blanco (B). La línea celular seleccionada fue la línea MDA-MB-231 la cual fue incubada en medio DMEM complete a 37ºC y 5% de CO2. Esta línea se sembró en los pocillos indicados en la Figura 8 en 19 una densidad celular de aproximadamente 20.000 células en 200 µl por pocillo. En los pocillos pertenecientes al blanco se pusieron 200 µl de medio fresco DMEM complete sin rojo fenol, evitando así cualquier interferencia posterior a la hora de la medida. Las placas de incubaron durante 24 horas para asegurar la adherencia celular. 3.3.2. Preparación y adición de nanopartículas Las AuNP que vamos a utilizar en estos ensayos son AuroVist™ 15 nm del proveedor Nanoprobes [Nanoprobes, Yaphank, NY, USA, ref. 1115A-5 × 40MGAu]. Estas nanopartículas son un novedoso agente de contraste que permite obtener imágenes mejoradas con rayos X de vasos sanguíneos, tumores y otros sistemas y órganos biológicos. Tienen un núcleo central de oro de un diámetro de 15 nm y una cubierta orgánica que las estabiliza la cual es altamente soluble en agua. Esto las hace bien toleradas por los animales y utilizables en altas concentraciones. Poseen numerosas características que las hacen ventajosas y únicas: Tiempo de residencia en sangre superior a los agentes yodados (aproximadamente 15 horas de vida media en sangre); alto contraste; no se elimina a través de los riñones; baja toxicidad (LD50> 5 g Au/kg); mayor contraste que los agentes yodados; baja osmolaridad, incluso a altas concentraciones; baja viscosidad, similar a la del agua, siendo fácil de inyectar incluso en vasos sanguíneos pequeños; permite la obtención de imágenes mediante MicroCT estándar, CT clínico, radiografía planar o mamografía, amplifica la dosis de radioterapia. Estas AuNP se encuentran presentadas en viales de 200 µl los cuales contienen 40 mg Au, de manera que su concentración es de 200 mg Au/ml (50). Para la preparación de AuNP, previamente se calculó el volumen necesario para coger del vial y ser diluidas en el medio DMEM complete sin rojo fenol. Las concentraciones deseadas fueron 0.05, 0.2, 1, 5 y 22.3 mg Au/ml. Para ello se hizo la suspensión de mayor concentración y posteriores diluciones seriadas, para evitar errores en las concentraciones más pequeñas. Una vez realizados los cálculos, en la campana de extracción, se pusieron las respectivas cantidades tanto de medio DMEM complete como de la suspensión de AuNP en un tubo Falcon de 50ml. La suspensión resultante fue filtrada 2 veces con un filtro 0,2 µl. De esta suspensión se realizaron las diluciones seriadas de menor concentración y se adicionaron a medio DMEM complete que también fue filtrado previamente 2 veces. Estas suspensiones se conservan en la nevera a 4 ºC. Previamente a la utilización de las nanopartículas, se pasaron por el vórtex los tubos Falcon durante 1 minuto. Una vez estuvieron las nanopartículas listas, se retiró el medio y se adicionaron 100 µl de medio fresco en los pocillos correspondiente al blanco y el control 26 ciertos parámetros, ajustándose a las características actuales de las líneas celulares utilizadas en nuestro estudio. Este software muestra un procedimiento adecuado para el contaje de células, cosa que el grupo de investigación ya había resuelto, pero no es preciso para el resto de la tarea que se pretende. 3.5. Dosimetría biológica 3.5.1. Foci gamma H2AX 3.5.1.1. Preparación de disoluciones Previo a la realización del ensayo se tuvieron que preparar y almacenar en el frigorífico una serie de disoluciones: • PBS: se prepararon 600 ml midiendo su pH previamente a su almacenamiento. Esta disolución se utilizó para el lavado y como solvente del resto de reactivos. • Disolución de formalina tamponada neutra (NBF) [Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU., ref. HT501128] al 10%. Se trata de una disolución que ya está preparada comercialmente y se utiliza como fijador histológico. • Tritón X-100 [ThermoFisher, Fair Lane, NJ, USA., ref. A16046.AP] al 0,1%. Para su preparación se adicionaron 100 ml del PBS anteriormente preparado a una botella con una mosca, donde se añadieron 100 µl de Tritón X-100, facilitando su disolución. • Tritón X-100 al 0,05% con seroalbúmina bovina (BSA) [Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany, ref. A9647-50G]. Preparamos una disolución igual que la anterior, pero en este caso, tan solo añadimos 50 µl de Tritón X-100. Una vez disuelto se le añadieron 3 gramos de BSA que se disolvieron lentamente por sí solos. 3.5.1.2. Siembra de placas e irradiación Se sembraron las células en 5 placas de 24 pocillos, poniendo en el fondo de estas cubre objetos redondos previamente tratados con poli lisina A, para asegurar la adhesión de las células, como se aprecia en la Figura 10. La línea celular seleccionada para la realización del ensayo fue la línea celular MDA-MB-231 en medio DMEM complete. Se sembraron los pocillos con una densidad celular de 100.000 células por pocillo en un volumen de 200 µl de medio DMEM complete y se dejaron incubar durante 24 horas a 37ºC y al 5% CO2. Las células fueron irradiadas con el mismo acelerador linear a igual dosis tal como se describió en el apartado 3.4.2.3 del ensayo de micronúcleos bloqueados por citocinesis. Figura 10. Diseño de la placa Ensayo de foci gamma H2AX. Células tratadas con AuNP (color rojo). Células sin tratar C (color morado). Estos pocillos presentaban 27 3.5.1.3. Fijación y permeabilización Inmediatamente, tras realizar la irradiación, se retiró el medio de los pocillos y se les adicionó 1 ml de la solución comercial de NBF con el fin de fijar las células. Se dejaron incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y se retiró el reactivo. Se realizaron 3 lavados con 1ml de PBS, dejando la placa en agitación durante 5 minutos en shaker entre cada lavado. Tras finalizar el ultimo lavado, adicionamos 1 ml de Tritón X-100 al 0,1% en cada uno de los pocillos a fin de permeabilizar las células y lo dejamos incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retiramos el reactivo y acto seguido, adicionamos 1 ml de la disolución de Tritón X-100 al 0,05% con BSA y lo dejamos incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 3.5.1.4. Adición del Anticuerpo primario En primer lugar, preparamos el anticuerpo primario dirigido a las Ser-139 fosforilada de la H2AX [Novus, Madrid, España, ref. NB100-74435], teniendo en cuenta que la concentración del vual comercial, y que la deseada era de 2 µg/ml. Para ello se puso en un eppendorf la cantidad necesaria de solvente de Tritón X-100 al 0,05% con BSA y añadimos la cantidad necesaria de anticuerpo, para preparar tan solo la cantidad necesaria, teniendo en cuenta que se necesitaban 30 µl por cada uno de los cubre objetos. Una vez preparado el anticuerpo, con una pinza quitamos los cubreobjetos de cada uno de los pocillos y los pusimos en la cámara de incubación. Estos se colocaron con la cara en la que están adheridas las células hacia arriba y acto seguido con una micropipeta se adicionaron los 30 µl de anticuerpo primario creándose una película que recubría toda la superficie del cubreobjetos. Se cerraron cuidadosamente las cámaras de incubación con Parafilm y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 2 horas. Finalizado este tiempo, sacamos los cubreobjetos de las cámaras de incubación y se devolvieron a sus respectivos pocillos. Se realizaron 3 sucesivos lavados con 1ml de Tritón X-100 al 0,05% con BSA, con 5 minutos de agitación en shaker entre ellos. Durante este tiempo se limpiaron cuidadosamente las cámaras de incubación con alcohol para eliminar los restos del anticuerpo primario. 3.5.1.5. Adición del Anticuerpo secundario Durante el tiempo de incubación del anticuerpo primario, preparamos de la misma manera que en el caso anterior, el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 [Invitrogen, Eugene, OR, EE. UU., ref. A-21121]. pero, en este caso, debe hacerse en condiciones de oscuridad. 28 Una vez finalizados los lavados del anticuerpo anterior, sacamos los cubreobjetos, volviéndolos a colocar en las cámaras de incubación y adicionando el anticuerpo secundario de igual manera. Se cerraron las cámaras con Parafilm y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante una hora. Transcurrido este tiempo, se sacaron los cubreobjetos de las cámaras, pero en este caso, se pusieron en pocillos diferentes de las placas que estuvieran limpios del anticuerpo primario. Se volvieron a realizar 3 lavados con 1ml de Tritón X-100 al 0,05% con BSA, con 5 minutos de agitación en shaker entre ellos. 3.5.1.6. Montaje de las muestras Para el montaje de las muestras fue importante mantener las condiciones de oscuridad en todo momento. Se rotularon los portaobjetos y se puso sobre ellos una gota de aproximadamente 15 µl de Fluoromont G + DAPI [Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU., ref. 00-4959-52]. A continuación, con precisión se cogieron con la pinza los cubreobjetos y se pusieron sobre la gota, poniendo el lado en el que están adheridas las células hacia el fluorocromo. Una vez colocados todos los cubreobjetos, se dejaron secar las muestras overnight en el frigorífico y protegidos de la luz. Una vez se hubieron secado, se sellaron los cubres con laca de uñas, para lo cual se utilizó una micropipeta y se fueron añadiendo pequeñas cantidades de laca de uñas, hasta rodear todos los cubreobjetos. 3.5.1.7. Adquisición de imágenes Las preparaciones fueron escaneadas con el microscopio Leica Stellaris 8 utilizado en el CITIUS. Todas las imágenes fueron adquiridas con el objetivo HC PL APO CS2 63x/1,40 OIL. Para la adquisición de las imágenes, se guardó la información en dos canales, realizándose un barrido secuencial. Por una parte, el canal azul se asignó a la señal DAPI, correspondiendo al núcleo celular, se situó el diafragma de detección confocal a 1UA, la excitación a 405nm con una intensidad ~ 22% y un detector HyD S 1 (430-499 nm) con la ganancia ajustada a ~73%. Por otra parte, en el canal verde, se registró la información de los foci γH2AX situando del diafragma de detección confocal a 3UA, la excitación a 499 nm, con una intensidad ~ 5,6% y un detector HyD S 3 (504-581nm) con la ganancia ajustada a ~3,7%. Se adquirieron imágenes de un total de 6 muestras correspondientes a 500, 125 y 0 UM tanto en ausencia como presencia de AuNP. Se adquirió para cada una de ellas un mosaico compuesto por 9 campos de imagen individuales. 29 La resolución de píxeles de los campos de imágenes individuales se optimizó según la ley de Nyquist. La resolución de cada una de las imágenes que constituían el mosaico era de 3014 x 3104 px, y la a profundidad de píxel se fijó en 8 bits para cada canal. 3.5.1.8. Cuantificación automática en Sofoco Para este estudio se utilizó un software de cuantificación automática robusto desarrollado por López-Valverde et al. (23) a partir de una adaptación del algoritmo FoCo desarrollado previamente por Lapytsko et al. (52). Este software cuantifica la densidad de foci por objeto, es decir, puede cuantificar tanto células individuales como grupos de ellas, que no se han podido separar por umbralización. 30 4. Resultados y discusión 4.1. Population Doubling Time 4.1.1. PDT línea celular MDA-MB-231 Los ensayos se realizaron tal y como se describen en el apartado 3.2 de la sección Materiales y Métodos. En primer lugar, se realizaron 2 ensayos con las células MDA-MB-231, en medio L- 15. Se obtuvo el número de células con respecto al tiempo, de manera, que se representó el tiempo de incubación en horas en el eje de abscisas frente al número de células en escala logarítmica en el eje de ordenadas. Se dividió la curva en las fases lag, log y plateau que describen el proceso (Figura 11). Figura 11. Representación de la curva de crecimiento de la población celular MDA-MB-231 en medio de cultivo L-15. Para calcular el valor del PDT, definido por la Ecuación 1, se utilizó la ecuación de la recta que describe la fase log, puesto que es la fase en la que las células se están multiplicando activamente. Se seleccionaron dos puntos en las rectas, los cuales estaban separados entre ellos 24 horas. El tratamiento de los datos se realizó de manera idéntica en el caso de la línea celular sembrada en medio DMEM complete (Figura 12). 31 Figura 12. Representación de la curva de crecimiento de la población celular MDA-MB-231 en medio de cultivo DMEM complete. A partir de las ecuaciones de cada una de las curvas y de los puntos seleccionados, se obtuvo así un valor de PDT para esta línea celular con diferentes medios de cultivo. Tabla 1. Representación del cálculo de los valores del PDT para la línea celular MDA-MB-231 en medio L-15 y DMEM complete con sus respectivos coeficientes de determinación. Línea celular/medio de cultivo R2 PDT (horas) MDA-MB-231/L-15 0,9506 35,02 MDA-MB-231/DMEM complete 0,9678 36,71 En cuanto a los resultados obtenidos en los diferentes ensayos ( Tabla 1), se observa que en las 3 rectas tenemos un coeficiente de determinación muy cercano a 1 por lo que tenemos un ajuste lineal aceptable. En cuanto a los valores en horas del PDT, el resultado proporcionó confianza, ya que alrededor de 36 horas es el valor más recurrente en la literatura (53), mientras que confiere robustez el hecho de que el resultado sea muy próximo en 2 medios de cultivo diferentes. Se puede afirmar, que la misma línea celular, presentó tiempos de duplicación similares en distintas condiciones de cultivo, tanto en presencia como en ausencia de CO2, habiéndose adaptado a ambos medios de manera eficiente. Esto las hizo adecuadas para su utilización en el resto de los ensayos. 32 4.1.2. PDT línea celular MP-46 El procedimiento seguido con la línea celular MP46 en medio de cultivo RPMI 1640 (Figura 13) fue igual al descrito en el apartado 4.1.1 de la sección de Resultados y Discusión. Figura 13. Representación de la curva de crecimiento de la población celular MP-46 en medio de cultivo RPMI 1640. En este caso, al tener esta línea celular un crecimiento más lento, nunca llegó a alcanzar la fase Plateau, a pesar de que se realizó un ensayo de mayor duración. Esto no fue un inconveniente, puesto que, para realizar el cálculo de PDT, tan solo necesitábamos tener la ecuación que describe la fase log y, aunque observar la fase de Plateau permite ajustar con mayor precisión la pendiente, el número de puntos parecía ser suficiente. Se obtuvo un valor del coeficiente de determinación de 0,9849, y el valor en horas del PDT fue de 107,48 horas, un valor también muy cercano al descrito en la literatura, que es de 110 horas (54). Se puede afirmar de esta manera, que la línea celular se había adaptado correctamente al medio de cultivo y tenía un crecimiento celular adecuado. 4.2. Ensayo de viabilidad celular (MTT). Este ensayo se realizó tal como se describe en el apartado 3.3 de la sección Materiales y Métodos. Su finalidad era el estudio de la viabilidad celular en presencia de AuNP con el fin de seleccionar el tiempo de exposición y concentración adecuados para el resto de los ensayos. 33 Figura 14. Representación de los ensayos de viabilidad celular MTT con AuNP a 2,4,8 y 24 horas, en ese orden de arriba abajo y de izquierda a derecha En la Figura 14 se representan los valores de viabilidad en tanto por ciento respecto al control frente a las concentraciones ensayadas de AuNP para diferentes tiempos de incubación del cultivo celular MDA-MB-231 en medio DMEM complete. No parece sencillo explicar el comportamiento de la viabilidad para los tiempos de incubación evaluados en comparación con el correspondiente control. Se diría que, contrariamente a lo esperado la viabilidad es peor en tiempos más cortos y que, pasadas 24 horas, tiempo destacable para la propuesta clínica, las células sobreviven y parecen haberse adaptado después de una fase de crisis, especialmente para las concentraciones más altas, como puede verse a las 12 horas. No obstante, la tendencia para cada tiempo de incubación de las diferentes concentraciones no parece seguir ningún patrón, por lo que sería aventurado concluir algo con fundamento. En cualquier caso, y dejando pendiente la observación de la internalización de las AuNP en la célula y su tiempo de permanencia dentro de ella, los cultivos de esta línea celular han sobrevivido a concentraciones altas en el orden de la propuesta clínica. En la medida en que no se busca una concentración de AuNP como agente terapéutico en solitario de las células tumorales, sino en combinación con la radiación prevista, este resultado era valioso para nuestra metodología ya que, la observación de daño inferido en las células con AuNP tras la irradiación, podrá considerarse consecuencia del efecto combinado y no por citotoxicidad debida a una concentración de AuNP demasiado elevada en los cultivos bajo ensayo. 4.3. Ensayo de micronúcleos bloqueados por citocinesis 34 El ensayo de CBMN se realizó tal como se explicó en el apartado 3.4.2 de la sección de Materiales y Métodos. Para su análisis se tomaron una batería de imágenes (Figura 15) en las que se contabilizaron las células y las aberraciones cromosómicas, teniendo en cuenta las pautas dadas por la IAEA (40), tal como se describió en el apartado 1.6 de la sección de Introducción. En la pueden observarse algunos ejemplos representativos de las células observadas en la batería de imágenes. En el caso del primer ensayo realizado con el haz de fotones Mega Voltage Cone Beam CT (MV-CBCT), se contabilizaron un total de 20 muestras, siendo 2 por cada una de las condiciones. Para cada condición se calculó la proporción media de las distintas imágenes y se filtraron los valores atípicos mediante un filtro Figura 15. Imágenes de células MDA-MB-231 en el ensayo CBMN. Célula mononucleada (A). Célula binucleada (B). Células polinucleadas (C, D). Células apoptóticas (E, F, G, H). Célula con puente nucleoplásmico y micronúcleo (I). Célula con puente nucleoplásmico (J). Célula binucleada con micronúcleo (K). Célula mononucleada con micronúcleo (L). polinucleadas). estadístico definido como μ ± 1,25 - σ. Para todas las imágenes adquiridas, se puntúo la proporción en número de micronúcleos por número de células multinucleadas (binucleadas y Por último, se calculó una media global ponderada de la tasa de micronúcleos para cada condición utilizando todos los datos de las imágenes que quedaron tras la filtración, junto con el error estándar de la media. Las tasas medias ponderadas de micronúcleos se trazaron frente a las dosis para cada conjunto de datos, con y sin nanopartículas, y se calculó una tendencia lineal (). Se obtuvo el valor de correlación y se comprobó estadísticamente con la prueba R de Pearson, habiendo realizado previamente la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk en los datos El segundo ensayo realizado con el acelerador lineal Elekta Versa HD™ Flattening Filter Free (FFF) con 6 MeV de tratamiento, quedó pendiente del análisis de las imágenes de las muestras adquiridas. 35 Figura 16. Daño cuantificado del ADN tras irradiación con haz MV-CBCT en términos de número de micronúcleos por célula multinucleada, para células control (izquierda) y células tratadas con AuNP (derecha). Se representan la línea de regresión lineal y las ecuaciones. Los valores de la p de regresión lineal de cada conjunto de datos fueron de 0,001313 y 0,05963, respectivamente. Estos valores no son comparables puesto que las condiciones de incubación con o sin AuNP son distintas. Sin embargo, puede observarse que la densidad de micronúcleos aumenta de forma más significativa en presencia de AuNP con una pendiente de 0,077, que, sin ellas, con una pendiente de 0,052 (Figura 16). Tras calcular la relación entre las pendientes obtuvimos un valor de radiosensibilización ~1,48 cuando las AuNP estaban presentes en el medio a una concentración de ~22,3 mg Au/mL. Este factor es superior a la amplificación de dosis que el grupo de investigación había calculado previamente en la etapa in silico por el método Monte Carlo. Este hallazgo vino a sugerir el esperado aumento de radiosensibilización debido a la puesta en juego de electrones Auger en el aumento de ROS. Más allá de esto, resultó de gran interés y relevancia la coincidencia del factor de radiosensibilización extra con la medida, en condiciones idénticas, del daño al ADN con inmunofluorescencia indirecta basada en foci γH2AX, donde el grupo observó un factor de radiosensibilización de ~1,46 (23). En cualquier caso, este esperanzador resultado ha de ser tomado con cautela ya que, como se observa en la Figura 16, la cuantificación manual no alcanzó, aunque por muy poco, significancia estadística. 4.4. Ensayo de cromosomas dicéntricos El ensayo fue realizado tal y como se describe previamente en el apartado 3.4.1. A pesar de obtenerse un importante número de imágenes con el microscopio OLYMPUS BX61, el proceso de cuantificación fue imposible. Las imágenes de las metafases obtenidas presentaban ciertas características (Figura 17), que dificultaban o impedían su cuantificación: Diferente grado de empaquetamiento de los cromosomas; solapamientos y aglomeración de cromosomas, metafases con menor o mayor número de cromosomas. A pesar de ello, también se pudieron observar metafases completas con 46 cromosomas (Figura 18 arriba) y también cromosomas dicéntricos (Figura 18 abajo), los cuales eran las aberraciones cromosómicas objetivo.