Estudio del comportamiento en pruebas de memoria y aprendizaje del ratón modelo de síndrome de down Ts1Cje, y su posible relación con la desregulación de la vía de señalización Akt-mTOR.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA ESTUDIO DE COMPORTAMIENTO EN PRUEBAS DE MEMORIA Y APRENDIZAJE DEL RATÓN MODELO DE SÍNDROME DE DOWN Ts1Cje, Y SU POSIBLE RELACIÓN CON LA DESREGULACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN Akt-mTOR Itziar Benito Latasa de Araníbar Trabajo presentado para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2017 i Lista de abreviaturas Pág. iii Lista de figuras Pág. v Lista de tablas Pág. vii 1. INTRODUCCIÓN Pág. 1 1.1. Origen del síndrome de Down. Cromosoma 21 Pág. 2 1.2. Características fenotípicas del síndrome de Down Pág. 3 1.2.1. Alteraciones morfológicas cerebrales Pág. 5 1.2.2. Alteraciones en la neurogénesis Pág. 6 1.2.3. Alteraciones morfológicas neuronales. Alteraciones en espinas dendríticas Pág. 7 1.2.4. Déficits cognitivos: memoria y aprendizaje Pág. 9 1.3. El hipocampo Pág. 11 1.4. Modelos murinos de síndrome de Down. El ratón Ts1Cje como modelo de estudio Pág. 14 1.4.1. Alteraciones en el cerebro Pág. 17 1.4.2. Alteraciones en la neurogénesis Pág. 17 1.4.3. Alteraciones en la morfología dendrítica Pág. 18 1.4.4. Alteraciones en la plasticidad sináptica Pág. 18 1.4.5. Déficits de memoria y aprendizaje Pág. 19 1.5. Implicaciones de la traducción local en plasticidad sináptica, memoria y aprendizaje Pág. 22 1.6. Regulación de la traducción local por mTOR y ERK Pág. 24 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Pág. 28 3. MATERIALES Y MÉTODOS Pág. 30 3.1. Mantenimiento y genotipado de la colonia Pág. 31 3.2. Pruebas sensoriales y motoras Pág. 32 3.3. Pruebas de memoria Pág. 34 3.4. Tratamiento de los ratones con rapamicina Pág. 37 3.5. Aislamiento de sinaptoneurosomas de hipocampo Pág. 38 3.6. Marcaje y análisis mediante iTRAQ Pág. 38 3.7. Análisis de ontología de genes y de vías de señalización Pág. 39 ii 3.8. Western blot cuantitativo Pág. 41 3.9. Análisis estadístico Pág. 41 4. RESULTADOS Pág. 43 4.1. El comportamiento de exploración en el test de “object recognition” está afectado en los ratones Ts1Cje, y la rapamicina recupera dicho fenotipo Pág. 44 4.2. La persistencia de la memoria espacial a largo plazo está afectada en los ratones Ts1Cje, y este déficit es revertido por la rapamicina Pág. 45 4.3. Caracterización proteómica de sinaptoneurosomas de hipocampo de ratones WT y Ts1Cje, tratados o no con rapamicina Pág. 52 5. DISCUSIÓN Pág. 61 5.1 Efecto terapéutico de la rapamicina sobre el comportamiento exploratorio y la persistencia de la LTM en los ratones Ts1Cje Pág. 62 5.2 Modificación del proteoma sináptico hipocampal por rapamicina en los ratones Ts1Cje Pág. 65 6. CONCLUSIONES Pág. 71 7. BIBLIOGRAFÍA Pág. 74 8. ANEXOS Pág. 86 - The Akt-mTOR pathway in Down's syndrome: the potential use of rapamycin/rapalogs for treating cognitive déficits - Rapamycin restores BDNF-LTP and the persistence of longterm memory in a model of Down’s syndrome iii Lista de abreviaturas 4E-BPs eIF4E-binding proteins AKT Protein Kinase B AMPA -amino 3-hidroxi 5-metil 4-isoxazol propiónico BDNF Brain Derived Neurotrophic Factor CA Cuerno de Amón CREB cAMP response element-binding CV Coeficiente de variación DSCR Región Crítica del Síndrome Down ERK Extracellular signal-Regulated Kinase FDR False Discovery Rate FKBP1 FK506-binding protein 1a, también conocida como FKBP12 GABA Ácido -aminobutírico GD Giro dentado HSA21 Cromosoma humano 21 IDs Proteínas mapeadas IPA Ingenuity Pathway Analysis iTRAQ Isobaric tags for relative and absolute quantitation LTD Depresión a largo plazo LTM Memoria a largo plazo LTP Potenciación a largo plazo MEK MAPK/ERK kinase MMU16 Cromosoma 16 murino (Mus Musculus 16) Mnk1 Mitogen-activated protein kinase integrating kinase 1 mTOR Akt-mammalian Target Of Rapamycin NMDA N-metil-D-aspartato NORT Novel Object Recognition Test p70S6K Ribosomal protein S6 Kinase iv PDK1 Phosphoinositide-dependent kinase 1 PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase PVDF Difluoruro de polivinilideno RSK p90 ribosomal S6 kinase SD Síndrome de Down SGZ Zona subgranular del giro dentado SNC Sistema Nervioso Central SNs Sinaptoneurosomas STM Memoria a corto plazo TCA Ciclo de los ácidos tricarboxílicos v Lista de figuras Figura 1. Cariotipo espectral de una persona (mujer) con síndrome de Down Pág. 2 Figura 2. Representación de segmentos dendríticos de neuronas piramidales de la región CA1 Pág. 8 Figura 3. Clasificación integradora del aprendizaje y la memoria, y las principales áreas cerebrales implicadas en dichos procesos Pág. 11 Figura 4. Principales conexiones en la formación hipocampal Pág. 12 Figura 5. Circuito trisináptico del hipocampo Pág. 14 Figura 6. Localización de genes del HSA21 en los cromosomas MMU16, 17 y 10. Pág. 15 Figura 7. Test de “Morris Water Maze” Pág. 20 Figura 8. Test del laberinto en forma de T Pág. 22 Figura 9. Test “open-field” Pág. 22 Figura 10. Familias funcionales de mRNAs identificados en el compartimento post-sináptico de neuronas de hipocampo Pág. 23 Figura 11. Regulación de la traducción local por BDNF a través de mTOR y ERK Pág. 25 Figura 12. Estructura química de la rapamicina y otros compuestos análogos Pág. 26 Figura 13. Test de coordinación motora “vertical pole” Pág. 33 Figura 14. Test de coordinación motora “hanging wire” Pág. 34 Figura 15. Test “object recognition” Pág. 35 Figura 16. Test “Barnes maze” Pág. 36 Figura 17. Control de la eficacia del tratamiento intraperitoneal con rapamicina Pág. 37 Figura 18. Aislamiento de sinaptoneurosomas Pág. 39 Figura 19. Esquema temporal del protocolo seguido en el test “Barnes maze” Pág. 46 Figura 20. Análisis del aprendizaje espacial de ratones WT y Ts1Cje no tratados, y ratones Ts1Cje tratados con vehículo (Ts1Cje vehicle) o rapamicina (Ts1Cje RAPA) evaluado por día de entrenamiento Pág. 47 vi Figura 21. Análisis del aprendizaje espacial de ratones WT y Ts1Cje no tratados, y ratones Ts1Cje tratados con vehículo (Ts1Cje vehicle) o rapamicina (Ts1Cje RAPA) evaluado por prueba durante la fase de entrenamiento Pág. 48 Figura 22. Análisis de la consolidación y la persistencia de la memoria espacial de ratones WT y Ts1Cje no tratados, y ratones Ts1Cje tratados con vehículo (Ts1Cje vehicle) o rapamicina (Ts1Cje RAPA). Pág. 49 Figura 23. Diferencias en la ocupación del cuadrante target, latencia primaria y número de errores primarios en la prueba de memoria a 8 días versus 24 h para cada ratón individual Pág. 51 Figura 24. Rutas canónicas identificadas mediante IPA entre los conjuntos de proteínas desreguladas en SNs de ratones WT RAPA (A) y Ts1Cje RAPA (B) Pág. 56 Figura 25. Análisis Z score de las rutas canónicas identificadas mediante IPA entre los conjuntos de proteínas desreguladas en SNs de ratones WT RAPA (A) y Ts1Cje RAPA (B) Pág. 57 Figura 26. Análisis de la vía mTOR mediante IPA en SNs de ratones WT RAPA (A) y Ts1Cje RAPA Pág. 58 Figura 27. Detección mediante Western blot de los niveles de FKBP1 en SNs de hipocampo de ratones WT y Ts1Cje tratados o no con rapamicina. Pág. 59 Figura 28. Análisis de las vías de disfunción mitocondrial y fosforilación oxidativa mediante IPA en SNs de ratones WT RAPA (A) y Ts1Cje RAPA (B) Pág. 69 Figura 29. Predicción de la actividad de la vía mTOR en SNs de ratones WT RAPA (A) y Ts1Cje RAPA (B) mediante la función de IPA “Molecule Activity Predictor” Pág. 70 vii Lista de tablas Tabla 1. Alteraciones anatómicas cerebrales más características del SD Pág. 6 Tabla 2. Características fenotípicas comunes entre personas con SD y los ratones Ts1Cje y Ts65Dn Pág. 16 Tabla 3. Test de comportamientos llevados a cabo en el modelo Ts1Cje Pág. 20 Tabla 4. Resultados obtenidos en el test “object recognition” Pág. 45 Tabla 5. Efecto de la rapamicina en la memoria espacial de ratones WT Pág. 52 Tabla 6. Cambios proteómicos en SNs de hipocampo de ratones Ts1Cje, WT RAPA y Ts1Cje RAPA Pág. 54 1 1. INTRODUCCIÓN 8 de una disgenesia de las espinas, lo que puede indicar que se trata de un proceso degenerativo posnatal (Marin-Padilla, 1972, 1976). Como se acaba de mencionar, los cambios en número, tamaño y forma de las espinas dendríticas están relacionados con plasticidad sináptica, existiendo una gran correlación entre el tamaño de la cabeza de la espina y la eficacia de la sinapsis, presumiblemente por el aumento de receptores de ácido -amino 3-hidroxi 5-metil 4- isoxazol propiónico (AMPA) en espinas más grandes (Tada y Sheng, 2006). Además, la longitud y el diámetro del cuello de la espina influyen en el grado y dinámica de la elevación de calcio postsináptico mediada por la activación de receptores N-metil-D- aspartato (NMDA) (Tada y Sheng 2006). Teniendo todo ello en cuenta, cabe pensar que las alteraciones de estos micro-compartimentos neuronales tienen un impacto decisivo en la actividad neuroquímica y funcional de las redes sinápticas en el SD (Contestabile et al., 2010). Figura 2. Representación de segmentos dendríticos de neuronas piramidales de la región CA1: A) persona con 35 años sin trisomía y B) segmentos similares en una persona de la misma edad con SD. Se observa un menor número de espinas dendríticas en el caso de la persona con. Tomado de Ferrer y Gullota et al., 1990. 9 En resumen, la hipocelularidad, así como las anomalías en la ramificación de las dendritas y en el número y morfología de espinas dendríticas, producen un marcado deterioro del número y eficacia de las sinapsis en el cerebro de individuos SD, dando lugar a una pérdida de plasticidad cerebral, proceso esencial que subyace al aprendizaje y la memoria (Koo et al., 1992; Wisniewski y Rabe, 1986). 1.2.4. Déficits cognitivos: memoria y aprendizaje En los seres humanos los mecanismos más importantes a través de los cuales el medio altera la conducta son el aprendizaje y la memoria. El aprendizaje es la adquisición de nueva información o conocimiento, siendo la memoria la retención de la información aprendida. La discapacidad intelectual es el rasgo más sobresaliente del SD. Este término hace referencia a las limitaciones que presentan estas personas, no sólo en el funcionamiento intelectual, sino también en la conducta adaptativa que se manifiesta en las habilidades sociales y cotidianas. El coeficiente intelectual de una persona con SD varía entre 30 y 80, y en la actualidad la media se encuentra en torno a 50. A partir de la adolescencia, el coeficiente intelectual comienza a declinar. Asimismo, la velocidad de aprendizaje en su conjunto es menor que en el resto de la población (Carr y Collins, 2014). Por otra parte, está bien descrito que las personas SD muestran dificultades para retener información, tanto por las limitaciones al recibirla y procesarla (memoria a corto plazo), como al consolidarla y recuperarla (memoria a largo plazo). Memoria a corto plazo En diferentes estudios se ha comprobado que las personas con SD obtienen peores puntuaciones en las tareas de memoria a corto plazo (STM) que otros grupos con retraso mental, en concreto, en memoria verbal, evaluada mediante la repetición de dígitos (Jarrold y Baddeley, 1997; Numminen et al., 2001). En cuanto a la capacidad de memoria visoespacial a corto plazo, se encuentra relativamente conservada para tareas que requieren bajo control, o cuando los componentes visual y espacial son probados de manera separada. En tareas de reconocimiento, donde aumenta la carga de memoria o 10 se combinan las demandas visuales y espaciales, se aprecian más los déficits en las personas SD (Lanfranchi et al., 2004; Visu-Petra et al., 2007). Memoria a largo plazo La memoria a largo plazo (LTM) es un sistema de memoria que almacena todo lo que conocemos acerca de nosotros y del mundo que nos rodea. Dentro de memoria a largo plazo hay que diferenciar entre memoria implícita o de procedimiento y memoria explícita o declarativa (Fig. 3). - La memoria implícita o procedimental es un tipo de memoria en la que las experiencias previas ayudan a la ejecución de una tarea sin que exista la percepción consciente de dichas experiencias. Este tipo de proceso cognitivo requiere poca atención, pues opera de forma automática (Bussy, Charrin, Brun, Curie, & des Portes, 2011). En el SD este tipo de memoria parece estar menos afectado que la memoria explícita, ya que se apoya en estructuras y circuitos cerebrales diferentes (Fig. 3). Una de dichas estructuras es el estriado (Teichmann et al., 2006) que se encuentra bien conservado en el SD. En cambio, otras estructuras importantes son el cerebelo y las áreas motoras del lóbulo frontal, que sí están afectadas en el SD, lo que contribuye al deterioro de este tipo de memoria en esta población (Bussy et al., 2011a). - La memoria explícita o declarativa es la recopilación consciente e intencional de información y experiencias previas. Este tipo de memoria requiere los procesos de codificación, consolidación de la información y la recuperación de los recuerdos, así como un alto grado de atención. Las personas con SD muestran un deterioro acusado en su memoria explícita, con una pobre codificación de la información, una capacidad de recuperación deteriorada y déficits de consolidación (Carlesimo et al., 1997; Vicari et al., 2000). Estos déficits se deben a las alteraciones presentes en ciertas áreas del cerebro como la corteza prefrontal y los lóbulos temporales, sobre todo el hipocampo (Lott y Dierssen, 2010). El hipocampo es un elemento integrador que recibe la información desde las áreas asociativas corticales y la transforma y consolida mientras que la corteza prefrontal se encarga de almacenar la información, relacionarla y dotarla de significado (Fig.3). 11 Figura 3. Clasificación integradora del aprendizaje y la memoria, y las principales áreas cerebrales implicadas en dichos procesos. Modificado de Squire, 2004. Las funciones que aparecen más afectadas en las personas con SD son las que dependen del hipocampo y las relacionadas con la corteza prefrontal. Debido a su interrelación con otras estructuras subcorticales, las alteraciones del hipocampo (cuyo tamaño está disminuido en el SD) contribuyen a explicar la menor capacidad cognitiva y de atención, y podrían explicar las alteraciones en la memoria a largo plazo en el SD. En este trabajo nos centramos en el hipocampo, por lo que a continuación se hará una breve descripción anatómica del mismo. 1.3. El Hipocampo Constituye, junto con el sistema olfatorio, uno de los dos tipos de corteza cerebral, denominada alocórtex por su organización en tres o cuatro capas bien definidas, en oposición al neocórtex, que casi siempre se organiza en seis. Es una de las estructuras más estudiadas del cerebro de los mamíferos, tanto por su importancia en los procesos 12 de aprendizaje y memoria, como por su extraordinariamente bien ordenada organización cito-arquitectónica. Aunque existen varias terminologías usadas indistintamente para nombrar las distintas partes que lo componen, la región del hipocampo incluye dos grupos de estructuras corticales diferenciadas: por un lado, la formación hipocampal y por otra parte, la región parahipocampal. Brevemente, la región parahipocampal está compuesta por cinco áreas diferentes: las cortezas perirrinal, entorrinal y postrrinal, el presubículo y el parasubículo. A nivel de conectividad, la corteza entorrinal se considera el eje principal de la región parahipocampal, ya que recibe y envía multitud de conexiones recíprocas con la formación hipocampal así como con las otras áreas parahipocampales adyacentes (Fig.4). Figura 4. Principales conexiones en la formación hipocampal. Se muestra la vía perforante (Perforant pathway), donde las neuronas de la capa II de la corteza entorrinal proyectan hacia el subículum y terminan en el giro dentado y en la CA3, las fibras musgosas (Mossy fibers) del giro dentado proyectando sobre las células piramidales de la región CA3, y las colaterales de Schaffer que proyectan desde CA3 a CA1, cuyas células conectan a su vez con el subículum y la corteza entorrinal. Tomado de Andersen, 2007. La formación hipocampal ha sido dividida en varias regiones desde antiguo por diversos autores. Las tres principales subregiones comparten una “elegante” organización laminar de los somas y árboles dendríticos de sus neuronas, presentando 13 una disposición en forma de dos herraduras enfrentadas y parcialmente superpuestas, donde los axones aferentes terminan en regiones específicas de la estructura laminar, sea el soma o las distintas partes de los árboles dendríticos. Así Ramón y Cajal distinguió entre el giro dentado y el hipocampo propiamente dicho (hipocampus proper) destacando en este último las regiones superior e inferior. Rose dividió al conjunto en cinco partes (h1-5), pero finalmente fue Lorente de Nó quién estableció una nomenclatura que se sigue utilizando a día de hoy. Así, distinguió entre el giro dentado y la región denominada cuerno de Amón (abreviada como región “CA”, por su estructura retorcida similar al cuerno de un carnero, presente en la cabeza del dios egipcio Amón) dividida a su vez en las regiones CA1 (región superior de Cajal) y CA3 (región inferior), unidas ambas por la pequeña región de transición CA2. Cada una de estas regiones, se distinguen tanto desde el punto de vista cito-arquitectónico (tamaño celular y morfología del árbol dendrítico), como desde el punto de vista genético-bioquímico (expresan diversas proteínas diferencialmente) y, cómo no, por su significación funcional (características electrofisiológicas y patrones de conectividad diferenciales) (Watson et al., 2012). De forma muy simplificada, las conexiones entre la formación hipocampal y la región parahipocampal se presentan clásicamente como un circuito trisináptico. La entrada principal de información está constituida por los axones de la vía perforante, que dirigen información sensitiva polimodal desde neuronas en la capa II de la corteza entorrinal hacia el giro dentado. Estos axones forman sinapsis excitatorias con las dendritas de las células granulares del giro dentado (en particular, las cortezas entorrinal lateral y medial inervan el tercio externo y el tercio medio, respectivamente, del árbol dendrítico de las células granulares). Subsiguientemente, el giro dentado, a través de los axones de sus células granulares (conocidos como fibras musgosas) establece contactos sinápticos sobre la parte proximal de las dendritas apicales de las neuronas piramidales de la región CA3, quienes por su parte envían axones, a través de las conexiones comisurales, a las células piramidales de las regiones CA3 y CA1 del hemisferio cerebral contralateral y adicionalmente desdoblan ramas colaterales a la región CA1 ipsilateral (denominados estos últimos colaterales de Schaffer). 14 Adicionalmente la corteza entorrinal inerva de forma directa, desde las células de su capa II, a las células piramidales de CA3, y desde células de su capa III al tercio distal de las dendritas apicales de CA1 (Neves et al., 2008) (Fig. 5). Figura 5. Circuito trisináptico del hipocampo. Se muestran las principales regiones del mismo (CA1, CA3 y Giro dentado (DG)) y se ejemplifican las sinapsis del circuito trisináptico. Tomado de Neves et al., 2008. Además de estos circuitos, existe una densa red de conexiones asociativas interconectando las células CA3 del mismo hemisferio, una amplia diversidad poblacional de interneuronas inhibitorias por todo el hipocampo, así como una importante entrada de aferencias moduladoras desde otras regiones cerebrales. 1.4. Modelos murinos de síndrome de Down. El ratón Ts1Cje como modelo de estudio Las personas SD muestran discapacidad intelectual y déficits cognitivos que dificultan su calidad de vida y su autonomía. Con el fin de estudiar con mayor profundidad los problemas neurobiológicos relacionados con los déficits de memoria de los individuos SD, se generaron modelos animales. Estos modelos están ayudando a esclarecer los mecanismos moleculares y celulares implicados en las deficiencias de 15 memoria y aprendizaje, y a proponer posibles tratamientos que mejoren la calidad de vida de las personas SD. De los 552 genes que contiene el HSA21, 166 son ortólogos a los genes localizados en regiones sinténicas de los cromosomas de ratón 16 (MMU16), 17 (MMU17) y 10 (MMU10): 110 genes en MMU16, 19 genes en MMU17 y 37 genes en MM10 (Sturgeon y Gardiner, 2011). Por tanto, resulta muy complicado obtener un modelo murino de SD completo, por lo que se han desarrollado diversos modelos portadores de trisomías parciales (Fig. 6). Figura 6. Localización de genes del HSA21 en los cromosomas MMU16, 17 y 10. Se muestran también las regiones del MMU16 que están en trisomía en los modelos murinos de SD Ts65Dn y Ts1Cje. Tomado de Reeves et al., 2001. A pesar de tratarse de modelos de SD parciales, hay evidencias claras que indican que los rasgos más característicos del fenotipo Down se observan también en estos ratones (Tabla 2). Actualmente, el ratón más utilizado y por ello mejor caracterizado es el modelo Ts65Dn. Si bien es cierto que este ratón muestra un fenotipo más severo que otros modelos de SD, recientemente se ha descubierto que presenta 60 genes adicionales en trisomía que 16 no son ortólogos a los localizados en el HSA21 (Duchon et al., 2011), lo que podría cuestionar algunas de las conclusiones obtenidas utilizando este modelo. Tabla 2. Características fenotípicas comunes entre personas con SD y los ratones Ts1Cje y Ts65Dn. Modificado de Rueda et al., 2012. ALTERACIONES SD HUMANO Ts1Cje Ts65Dn Volumen cerebral Reducido Reducido Reducido Densidad neuronal Reducida Reducida Reducida Neurogénesis  Alteraciones en la proliferación de precursores neurales  Retraso del ciclo celular  Alteraciones en neurodiferenciación  Alteraciones en neurogénesis cerebelar  Alteraciones en la proliferación de precursores neurales  Retraso del ciclo celular  Alteraciones en neurodiferenciación  Alteraciones en neurogénesis cerebelar  Alteraciones en la proliferación de precursores neurales  Retraso del ciclo celular  Alteraciones en neurodiferenciación  Alteraciones en neurogénesis cerebelar Dendritas y espinas  Alteraciones en la morfología  Densidad reducida  Alteraciones en la morfología  Densidad reducida  Alteraciones en la morfología  Densidad reducida Electrofisiología  Alteraciones EEG  Alteraciones en los potenciales evocados  Alteraciones en LTP hipocampal  Alteraciones en LTP hipocampal Balance excitacióninhibición  Niveles reducidos de GABA en fetos  Niveles reducidos de glutamato y aspartato en adultos  Redistribución de las sinapsis inhibitorias  Aumento del número de sinapsis inhibitorias  Disminución del número de sinapsis excitatorias  Redistribución de las sinapsis inhibitorias  Aumento del número de interneuronas GABAérgicas  Alteraciones en la estructura del receptor GABA Cognitivosconductuales  Retraso en el desarrollo  Hiperactividad ocasional  Atención reducida  Alteración del aprendizaje  Alteración de la memoria  Adquisición tardía de habilidades motoras  Habilidades lingüísticas alteradas 17 En el ratón Ts1Cje el segmento del MMU16 en trisomía es más pequeño que en el modelo Ts65Dn (Fig. 6), pero suficiente para mostrar un fenotipo similar al humano SD, incluyendo la disfunción hipocampal (Tabla 2). El modelo Ts1Cje se generó de manera fortuita, al intentar generar un ratón mutante para el gen SOD1, que resultó en una translocación parcial del MMU16 (abarcando desde SOD1 hasta MX1) sobre el MMU12 (Sago et al., 1998). A diferencia del ratón Ts65Dn, en el que los machos son estériles, ambos sexos son fértiles en el modelo Ts1Cje, y el porcentaje de animales con la trisomía que resultan en un cruce de un animal silvestre con otro trisómico es del 50%, siendo solo un 25% en el caso Ts65Dn. Los ratones Ts1Cje no muestra ninguna malformación facial ni de extremidades, ni cualquier otra características dismórfica (Sago et al., 1998). A continuación se indican, de forma resumida, las alteraciones neuromorfológicas del ratón Ts1Cje y su correlación con las presentes en personas SD. 1.4.1. Alteraciones en el cerebro Estudios anteriores han demostrado que efectivamente, al igual que en humano SD, el modelo Ts1Cje también muestra un volumen reducido del cerebro desde estadios tempranos de gestación. Sin embargo en ratones adultos no se aprecia dicha disminución (Aldridge et al., 2007; Belichenko, et al., 2007). En el ratón Ts1Cje, el hipocampo no está reducido de tamaño, siendo el cerebelo (estructura implicada en la coordinación motora y en procesos cognitivos como la atención, flexibilidad cognitiva y la memoria) una de las estructuras más afectadas (Belichenko et al., 2007). 1.4.2. Alteraciones en la neurogénesis Al igual que en el SD humano, la neurogénesis está también afectada en los ratones Ts1Cje. Así, se observa una disminución en la proliferación celular de precursores neuronales, estando afectado el ciclo celular y alterada la diferenciación en el neocórtex y la zona subventricular (Hewitt et al., 2010; Ishihara et al., 2010; Moldrich et al., 2009). Además, en ratones adultos de 3 meses se ha observado una disminución severa de la neurogénesis en la zona subgranular del giro dentado (SGZ). La 24 1.6. Regulación de la traducción local por mTOR y ERK mTOR y ERK son dos vías de señalización estrechamente relacionadas entre sí (Fig. 11). Además de otros estímulos, el BDNF es capaz de activar estas vías para regular la tasa de traducción local dendrítica (Takei et al.,T 2004), así como facilitar diversos tipos de plasticidad a largo plazo (revisado Panja y Bramham, 2014). La interacción del BDNF con su receptor TrkB (Tropomyosin receptor Kinase B) produce la activación de PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase), capaz de activar a su vez a AKT1 (Protein Kinase B), ya sea de forma directa o a través de PDK1 (phosphoinositidedependent kinase 1) (Fig. 11). AKT1 fosforila a mTOR, activándola. Además, AKT1 inhibe a TSC, un complejo inhibidor de mTOR. Por su parte, una vez activada, la quinasa mTOR puede fosforilar a las proteínas inhibidoras de la traducción 4E-BPs (eIF4E-binding proteins), lo que resulta en una activación de la síntesis de proteínas dependiente del factor de inicio de la traducción eIF4E. Por otra parte, mTOR puede fosforilar a p70S6K (ribosomal protein S6 Kinase), una quinasa que fosforila a la proteína ribosómica S6. La proteína S6 fosforilada fomenta la traducción de los denominados “TOP mRNAs”, que codifican a su vez otras proteínas ribosómicas, así como factores de traducción, por lo que la activación de S6 favorece la síntesis de la maquinaria molecular necesaria para la síntesis de proteínas. Por otra parte, el BDNF también produce la activación de la vía Ras-ERK (Fig. 11). ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) fosforila a Mnk1 (Mitogen-activated protein kinase integrating kinase 1), que a su vez es capaz de fosforilar a eIF4E, incrementándose así la síntesis de proteínas dependientes de dicho factor. Estas rutas de señalización son complejas, y de hecho no constituyen dos vías completamente paralelas, sino que pueden influirse mutuamente (Fig. 11). Así, por ejemplo, ERK puede fosforilar a PDK1 (Phosphoinositide-dependent Kinase 1 ) a través de RSK (p90 ribosomal S6 kinase) (Frödin et al., 2000), produciendo una activación de la vía Akt-mTOR (Tsokas et al., 2007). La activación de Calpain-2 por ERK (Zadran et al., 2010) también promueve la activación de mTOR, siendo además necesaria para que se lleva a cabo la síntesis de proteínas dendríticas inducida por BDNF en el hipocampo (Briz 25 et al., 2013). A su vez, también PI3K influye sobre la actividad de ERK, a través de MEK (MAPK/ERK kinase) (Tsokas et al., 2007). Figura 11. Regulación de la traducción local por BDNF a través de mTOR y ERK. El BDNF puede activar las vías Akt-mTOR y Ras-ERK a través de su interacción con receptores TrkB, produciendo un incremento de las tasas de traducción local. Modificado de Andrade-Talavera et al., 2015. Diversos trabajos han puesto de manifiesto el papel relevante de mTOR como mediador de la plasticidad sináptica inducida por BDNF (Cammalleri et al., 2003; Hou y Klann, 2004; Tang et al., 2002). Resultados previos de nuestro grupo de investigación han demostrado que la vía de señalización mTOR está hiperactivada en el hipocampo de ratones Ts1Cje (Troca-Marín et al., 2011). Así, los niveles dendríticos de las formas fosforiladas de AKT1, mTOR, p70S6K, S6 y 4E-BP1 están incrementados en neuronas de ratones Ts1Cje. Por otra parte, mientras que los cultivos de neuronas silvestres 26 responden a BDNF aumentando el nivel de fosforilación de las proteínas mencionadas anteriormente, tal y como se describe en la literatura (Takei et al., 2004), las neuronas Ts1Cje son insensibles a la adición de BDNF al cultivo. Por tanto, la hiperactivación de la vía mTOR en el hipocampo Ts1Cje supone una pérdida de capacidad de señalización a través de la misma. Esta pérdida de capacidad de señalización se debe a los niveles anormalmente elevados de BDNF y/o pro-BDNF presentes en el hipocampo de los ratones trisómicos (Troca-Marín et al., 2011), que parecen saturar la vía mTOR (aunque no la vía ERK). Como ya se ha mencionado, nuestro grupo de investigación, en colaboración (Laboratorio Dr. Antonio Rodríguez-Moreno, UPO) también ha demostrado recientemente que la LTP dependiente de BDNF en la región CA1 de hipocampo está ausente en los ratones Ts1Cje (Andrade-Talavera et al., 2015). Figura 12. Estructura química de la rapamicina y otros compuestos análogos. Los recuadros muestran las diferencias entre rapamicina (sirolimus), everolimus, temsirolimus y deforolimus. Tomado de Troca-Marín et al., 2014. La rapamicina (también conocida con el nombre de Sirolimus o Rapamune®) es un antibiótico producido por Streptomyces hygroscopicuses. Se trata de un inhibidor específico de la fosforilación de mTOR, cuyo uso en humanos está aprobado. Actualmente la rapamicina y otros compuestos derivados (Fig. 12) se emplean como 27 agentes inmunodepresores en trasplantes, así como para el tratamiento de ciertos tumores. De manera interesante, la rapamicina restaura los niveles de fosforilación normales de la vía mTOR en neuronas de hipocampo de ratones Ts1Cje, así como la tasa de traducción local (medida mediante marcaje metabólico de sinaptoneurosomas de hipocampo) (José Antonio Troca-Marín et al., 2011). La rapamicina también recupera la BDNF-LTP en rodajas de hipocampo de ratones Ts1Cje (Andrade-Talavera et al., 2015). 28 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 29 En el SD, al igual que en otras enfermedades que cursan con discapacidad intelectual, la morfología dendrítica y la plasticidad sináptica están afectadas. La traducción local de mRNAs dendríticos tiene un papel relevante en ambos aspectos. Como se ha descrito en la Introducción, resultados previos de nuestro laboratorio han demostrado que en el hipocampo del ratón modelo de SD Ts1Cje: 1. la vía de señalización mTOR está hiperactivada, produciendo un incremento de la tasa de traducción local; 2. la vía mTOR no responde a la adición exógena de BDNF, probablemente debido a la saturación de la misma; 3. la LTP dependiente de BDNF está abolida; 4. la rapamicina, un inhibidor específico de la quinasa mTOR, es capaz de revertir todos los déficits mencionados. Dado que los efectos positivos de la rapamicina anteriormente descritos utilizando el modelo Ts1Cje se han observado en sistemas de experimentación in vitro o ex vivo, es de gran interés determinar qué ocurre in vivo en este modelo de SD. Es por ello que el presente estudio tiene como objetivo principal establecer si el tratamiento de ratones Ts1Cje con rapamicina mejora posibles déficits de memoria y aprendizaje, y en caso afirmativo, identificar los cambios sinápticos que produce dicho tratamiento. Los objetivos concretos de este trabajo son, por tanto: 1. Caracterizar los déficits cognitivos del ratón Ts1Cje mediante tests de comportamiento y memoria. Los test utilizados serán los denominados “object recognition” y “Barnes maze”. 2. Determinar si el tratamiento con rapamicina revierte los defectos cognitivos identificados en el objetivo anterior. 3. Caracterizar mediante análisis proteómico muestras de sinaptoneurosomas de hipocampo de ratones silvestres y Ts1Cje, tratados o no tratados con rapamicina, con objeto de esclarecer los mecanismos moleculares desregulados a nivel sináptico en los ratones trisómicos, así como los mecanismos responsables del posible efecto terapéutico de la rapamicina en dichos ratones. 30 3. MATERIALES Y MÉTODOS 31 3.1. Mantenimiento y genotipado de la colonia Ts1Cje Los ratones se mantuvieron en las condiciones óptimas según especie, siguiendo la normativa vigente RD 53/2013 por el que se establecen “las normativas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia”. Todos los procedimientos han sido evaluados y aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. Los ratones Ts1Cje, procedentes de Jackson Laboratories (USA), se mantuvieron en un fondo genético híbrido, llevando a cabo cruces entre hembras C57BL/6JOlaHsd x C3H/HeNHsd F1 (híbridas B6C3F1 suministradas por Harlan o Charles River) y machos Ts1Cje, tal y como recomienda el suministrador. Los ratones fueron genotipados mediante PCR, utilizando DNA aislado a partir de biopsias de cola. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 l, conteniendo: 2 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 0,4 m de cada oligonucleótido (Neofw, Neo-rev, Tcrd-fw, Tcrd-rv), 0,04 unidades de Taq polimerasa (Biotools) y 2,5 l de buffer de reacción comercial (10x, Biotools). Las secuencias de los oligonucleótidos fueron las siguientes: Neo-fw: 5'- CTT GGG TGG AGA GGC TAT TC Neo-rev: 5'- AGG TGA GAT GAC AGA GAT C Tcrd-fw: 5'- CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG Tcrd-rev: 5'- GTC AGT CGA GTG CAC AGT TT Los oligonucleótidos Neo-fw y Neo-rev amplifican una banda de 280 pares de bases (pb) sólo presente en los ratones trisómicos. Los oligonucleótidos Tcrd-fw y Tcrdrv amplifican una banda de 200 pb presente tanto en los ratones silvestres como en los trisómicos (control positivo). El programa de PCR utilizado constó de los siguientes pasos: desnaturalización durante 2 min a 94˚C, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94˚C durante 45 s, 32 annealing a 58˚C durante 45 s y polimerización a 72˚C durante 45 s. Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Esta línea de ratones puede ser portadora de una mutación en el gen Pde6brd1, que, en recesividad, produce degeneración de la retina. Por tanto los ratones homocigotos para dicha mutación son ciegos. Para poder descartar los ratones ciegos en los experimentos realizados, se llevó a cabo el genotipado de los mismos mediante PCR. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µl, conteniendo: 2 mM MgCl2, 200 M de cada dNTP, 0,4 m de cada oligonucleótido (oIMR2093, oIMR2094, oIMR2095), 0,04 unidades de Taq polimerasa (Biotools) y 2,5 l de buffer de reacción comercial (10x, Biotools). Las secuencias de los oligonucleótidos fueron las siguientes: oIMR2093 (alelo mutante): 5´- AAG CTA GCT GCA GTA ACG CCA TTT oIMR2094 (alelo silvestre): 5´- ACC TGC ATG TGA ACC CAG TAT TCT ATC oIMR2095 (común): 5´- CTA CAG CCC CTC TCC AAG GTT TAT AG El oligonucleótido oIMR2093, junto con el oligonucleótido oIMR2095, amplifica una banda de 560 pb presente en los ratones mutantes; el oligonucleótido oIMR2094, junto con el oligonucleótido oIMR2095, amplifica una banda de 240 pb presente en los ratones silvestres; los ratones heterocigotos muestran ambas bandas. El programa utilizado constó de los siguientes pasos: 5 min a 94˚C, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94˚C durante 30 s, annealing a 65˚C durante 30 s y polimerización a 72˚C durante 2 min. Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. 3.2. Pruebas sensoriales y motoras Con objeto de descartar ratones con defectos sensoriales y/o motores que pudieran afectar los resultados de los tests de comportamiento, se llevaron a cabo 33 controles para evaluar el oído, olfato, sensibilidad y coordinación motora de los ratones (Crawley, 2007). Para evaluar la audición se observó la reacción a un estímulo sonoro fuerte (palmada). Para evaluar el olfato, los animales se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se observó su capacidad de encontrar un pellet de comida escondido entre las virutas de la jaula. Por otra parte, la sensibilidad se comprobó aplicando un estímulo doloroso en la cola. La coordinación motora se verificó mediante los tests “vertical pole” y “hanging wire”. La prueba “vertical pole” consiste en situar al ratón en la zona central de una varilla de madera (2 cm de diámetro y 40 cm de largo) en posición horizontal, y a continuación ir girando la varilla hacia la posición vertical (Fig. 13). Antes de alcanzar los 45˚ de inclinación, los ratones con problemas motores se caen de la varilla. La prueba “hanging wire” consiste en colocar al ratón sobre una rejilla que se sacude para estimular la reacción de agarre a la misma por parte del animal y a continuación se da la vuelta a la rejilla. En esta circunstancia, los animales que no presentan problemas motores permanecen al menos 1 min agarrados a la rejilla (Fig. 14). Finalmente se evaluó el estado general de salud mediante curva de peso, ausencia de calvas o lesiones, buena postura al andar, etc. Figura 13. Test de coordinación motora “vertical pole”. El animal se coloca en la parte central de la varilla, que se inclina 45˚. Los animales con problemas motores no son capaces de permanecer agarrados a la varilla en esas circunstancias. 40 de Mus musculus (22.322 proteínas). Se aplicó la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Los datos también fueron analizados utilizando el software comercial Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Summer release June 2016). Se utilizó la opción core analysis (análisis principal) para detectar proteínas reguladas bien al alza, bien a la baja, con un umbral restrictivo a la inclusión de al menos 1,2 veces (cutoff = 1,2). Este cutoff se determinó analizando las variaciones de los niveles de proteínas observadas en el duplicado de la muestra silvestre control (WT), y fijando los límites dentro de los cuales estuvieran incluidos más del 95% de los datos, como se recomienda (Unwin et al., 2010). En nuestro caso, el 98% de las proteínas del duplicado del WT mostraron una expresión relativa dentro del intervalo 0,83-1,2 (cutoff de 1,2 veces). Como referencia para el análisis de los datos proteómicos se utilizó la base de datos “Ingenuity Knowledge Base” marcando la opción “genes only”. Además, sólo se consideraron las moléculas y/o relaciones con base experimental, demostrada en células (astrocitos o neuronas) y/o tejidos del sistema nervioso de ratón, rata o humano. El software IPA genera una lista de rutas canónicas significativamente afectadas, basadas en dos parámetros, denominados p-value y z-score. El p-value, calculado mediante el test exacto de Fisher de una sola cola a la derecha, es una medida de la probabilidad de que una ruta particular esté enriquecida por azar en el conjunto de proteínas desreguladas de la muestra considerada. Con objeto de aumentar la fiabilidad del análisis, sólo se consideraron las rutas con un p-value ≤ 0,005 (o lo que es lo mismo, - log (p-value) ≥ 2,3). Además, las rutas canónicas identificadas en la muestra considerada pueden estar activadas o inhibidas de forma predictiva, según el valor del z-score. El algoritmo z-score de IPA tiene en cuenta los cambios del nivel de expresión observados en el conjunto de proteínas desreguladas. Un z-score positivo indica que una ruta o un regulador están predictivamente activados, y un z-score negativo indica por el contrario una inhibición de la ruta en cuestión. Sólo se consideraron para el análisis las rutas con un z-score ≥ 1,5 ó ≤ -1,5. Las rutas canónicas que no cumplen los requisitos para el análisis z-score de IPA se especifican como N/A. 41 3.8. Western blot cuantitativo Las proteínas de las muestras de sinaptoneurosomas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) usando geles comerciales Mini- PROTEAN® TGX Stain-Free™ (BioRad). Después de la electroforesis los geles fueron expuestos a radiación ultravioleta para inducir la reacción de los compuestos trihalo presentes en el gel con los residuos de triptófano de las proteínas, lo cual produce una señal fluorescente que se puede cuantificar y usar para la normalización. Tras ello las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) usando el sistema comercial recomendado para el aparato de transferencia Trans-Blot® Turbo™ Transfer System (BioRad). Tras el bloqueo de la membrana y la incubación con los anticuerpos primarios adecuados (anti-FKBP1, Abcam; anti- -actin, Sigma) la actividad de los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano fue revelada con el conjunto de sustratos WesternBright Quantum HRP Substrate (Advansta). La quimioluminiscencia resultante en la membrana fue medida usando un aparato ChemiDoc XRS System (BioRad). El comportamiento lineal de la intensidad de las señales luminiscentes obtenidas con cada anticuerpo, respecto a la cantidad de proteína presente en el carril correspondiente, se verificó realizando diluciones seriadas de las muestras de proteína. 3.9. Análisis estadístico Los datos se presentan como la media ± SEM (desviación estándar de la media). En el test “object recognition”, se compararon grupos experimentales independientes de dos en dos, por lo que la significancia estadística se estableció mediante el t-test de Student. Para la comparación de proporciones se empleó el test Z-Score. En el test “Barnes maze”, los datos procedentes de la fase de adquisición se analizaron usando ANOVA bifactorial para medidas repetidas, con un test post-hoc Bonferroni. Para comparar el rendimiento en la prueba de memoria a las 24 h y a los 8 días, los datos se analizaron mediante t-test de Student pareado. Para determinar si los valores medios 42 obtenidos en los experimentos eran significativamente diferentes de un valor especificado (tiempo de ocupación del cuadrante “target” diferente del 25% o scores diferentes de 0) se utilizó un t-test de muestra única. Los niveles de significancia se indican mediante asteriscos en las figuras correspondientes: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p <0,001. 43 4. RESULTADOS 44 4.1. El comportamiento de exploración en el test “object recognition” está afectado en los ratones Ts1Cje, y la rapamicina recupera dicho fenotipo Como ya se ha mencionado, los ratones modelo de SD Ts1Cje presentan deficiencias de plasticidad sináptica (BDNF-LTP) en la región CA1 del hipocampo relacionadas con la hiperactivación de la vía mTOR (Andrade-Talavera et al., 2015). Dichas deficiencias se recuperan totalmente al pre-incubar las rodajas de cerebro con rapamicina 30 min antes de la aplicación del BDNF a las rodajas para promover la LTP. Adicionalmente a su papel en la plasticidad del hipocampo (Korte et al., 1995; Patterson y Abel, 1996), el BDNF es esencial tanto para el aprendizaje y memoria dependientes del hipocampo (Linnarsson et al., 1997; Mizuno et al., 2000) como para el mantenimiento de la LTM de tipo espacial (Bekinschtein et al., 2007). Con objeto de identificar posibles déficits de memoria y aprendizaje en los ratones Ts1Cje y evaluar la capacidad terapéutica de la rapamicina in vivo, se eligieron dos tests de comportamiento clásicos dependientes de hipocampo, el test “object recognition” (memoria no espacial) y el test “Barnes maze” (memoria espacial). Para llevar a cabo el test “object recognition” se establecieron tres grupos experimentales: ratones silvestres no tratados (WT), ratones Ts1Cje no tratados y ratones Ts1Cje tratados con rapamicina (Ts1Cje RAPA) durante los 5 días previos a la realización del test. Los animales se sometieron a un sesión de familiarización, permitiéndoseles que exploraran libremente dos objetos idénticos durante un tiempo total de exploración de 20 s (criterio de inclusión, véase Materiales y Métodos). En esta fase no se observó ninguna preferencia por la exploración de uno de los dos objetos en particular, de modo que, en los tres grupos experimentales, los animales exploraron cada objeto durante aproximadamente 10 s (resultados no mostrados). Sin embargo, los ratones Ts1Cje tardaron significativamente más tiempo en alcanzar el criterio (307 ± 29 s; n=13) que los ratones Ts1Cje RAPA (222 ± 21 s; n=8; p=0,05; t-test), que a su vez mostraron un comportamiento exploratorio similar a los ratones WT (238 ± 9 s; n=10). 45 En la fase de prueba, llevada a cabo 24 h más tarde, uno de los objetos familiares se reemplazó por un nuevo objeto, y se repitió el experimento. Cuando sólo se consideraron en el análisis los animales que alcanzaron el criterio de inclusión (según lo recomendado por Leger et al., 2013), no se observó diferencia alguna en la LTM entre los distintos grupos experimentales (Tabla 4), y todos los ratones mostraron preferencia de exploración del nuevo objeto, sugiriendo que eran capaces de recordar el objeto familiar. Sin embargo, de forma muy llamativa, se observó que el 45% de los ratones Ts1Cje fue incapaz de alcanzar el criterio (Tabla 4), lo que sugería una exacerbación del déficit de comportamiento exploratorio que mostraron en la fase de familiarización. De modo interesante, esa falta de comportamiento exploratorio no se manifestó en los ratones Ts1Cje RAPA (Tabla 4), sugiriendo que la rapamicina contrarresta dicha anomalía. WT Ts1Cje Ts1Cje RAPA Ratones que no alcanzaron el criterio (n) 1 9 1 Ratones que alcanzaron el criterio (n) 18 11 14 Número total de ratones estudiados (n) 19 20 15 Tiempo medio (s) en alcanzar el criterio ± SEM 293,67 ± 29,38 298,09 ± 40,11 266,50 ± 34,29 Índice exploratorio medio (%) ± SEM 60,73 ± 3,87 59,72 ± 2,90 57,68 ± 5,08 Tabla 4. Resultados obtenidos en el test “object recognition”. No se observaron diferencias significativas entre los distintos grupos respecto al tiempo medio empleado para alcanzar el criterio o el índice exploratorio medio (t-test). Sin embargo, la proporción de ratones que no alcanzó el criterio fue significativamente más alta en el caso de los ratones Ts1Cje (WT vs Ts1Cje, Z-Score = -2,8407, p = 0,00452; WT vs Ts1Cje RAPA, Z-Score = -0,1727, p = 0,86502; Ts1Cje vs Ts1Cje RAPA, Z-Score = 2,4843, p = 0,01314). 4.2. La persistencia de la memoria espacial a largo plazo está afectada en los ratones Ts1Cje, y este déficit es revertido por la rapamicina. Trabajos previos de otros laboratorios han demostrado que los ratones Ts1Cje presentan una capacidad disminuida en el test “Morris water maze” (Sago et al., 1998), que se emplea para evaluar la memoria espacial dependiente de hipocampo (véase Introducción). Sin embargo, se ha comprobado que la aplicación de un estímulo aversivo 46 de alta intensidad, como puede ser el agua en el test “Morris water maze”, puede afectar al rendimiento de los animales (Hölscher, 1999). Por este motivo, se decidió emplear el test “Barnes maze”, basado en un aprendizaje espacial similar al de “Morris water maze”, pero que genera menos estrés en los animales (Sunyer et al., 2007). En esta prueba, el ratón se coloca en una plataforma seca circular y se expone a un estímulo aversivo débil, en este caso un chorro de aire generado por tres ventiladores equidistantes entre ellos y colocados radialmente respecto al centro, para inducir la huida del animal hacia el orificio de escape (target box). Se establecieron cuatro grupos experimentales: ratones silvestres (WT) y trisómicos (Ts1Cje) sin tratar, y ratones Ts1Cje tratados con vehículo (Ts1Cje vehicle) o con rapamicina (Ts1Cje RAPA) durante los 5 primeros días previos a la fase de entrenamiento, siguiendo el protocolo descrito en el apartado de Materiales y Métodos. Los ratones fueron entrenados durante 4 días consecutivos, a razón de 4 sesiones por día con un intervalo de 15 minutos entre sesiones. Posteriormente, a las 24 h, se evaluó la LTM, y 8 días más tarde, la persistencia de la LTM (Fig. 19). Figura 19. Esquema temporal del protocolo seguido en el test “Barnes maze”. Ratones WT y Ts1Cje sin tratar (A) o tratados con vehículo o rapamicina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal cada 24 h durante 5 días consecutivos (B) se sometieron a entrenamiento (TRAINING) durante 4 días consecutivos. Transcurridas 24 h se evaluó la LTM, y 8 días más tarde la persistencia de la LTM. 47 Respecto a la fase de entrenamiento, en todos los grupos experimentales se observó una disminución significativa de la latencia primaria (es decir, del tiempo empleado en alcanzar la target box) respecto al tiempo, demostrando que la capacidad de adquisición de la memoria espacial en esta tarea estaba intacta en todos los grupos experimentales (Fig. 20). Figura 20. Análisis del aprendizaje espacial de ratones WT y Ts1Cje no tratados, y ratones Ts1Cje tratados con vehículo (Ts1Cje vehicle) o rapamicina (Ts1Cje RAPA) evaluado por día de entrenamiento. Se representa la latencia primaria (en s) para alcanzar la target box durante los días de entrenamiento 1 a 4. Los datos se muestran como valores medios ± SEM de los valores medios obtenidos para cada bloque de 4 pruebas diarias. El análisis estadístico de los datos mediante ANOVA de dos factores con medidas repetidas, aplicando tests post-hoc de Bonferroni, resultó en valores p > 0,05 para la comparación de todos los grupos experimentales, excepto para la comparación entre ratones WT y Ts1Cje en el día 1 (p < 0,05). Sin embargo, el mismo análisis realizado para comparar las pruebas no agrupadas por día (es decir, pruebas de 1 a 16), no reveló diferencias significativas entre los grupos experimentales. Se observó un descenso significativo de la latencia primaria respecto al tiempo en todos los grupos (p < 0,0001). Por otra parte, aunque los resultados no fueron estadísticamente significativos, en los ratones Ts1Cje tratados con vehículo se observaron valores medios más altos de latencia primaria que en los ratones Ts1Cje sin tratar (Fig. 20). Además al representar gráficamente los valores de latencia primaria de las 16 pruebas llevadas a cabo durante 48 la fase de entrenamiento, se observó una cinética alterada en el proceso de aprendizaje de los ratones Ts1Cje tratados con vehículo (Fig. 21). Estos datos sugieren que el proceso de aprendizaje podría estar ligeramente alterado en estos ratones. Figura 21. Análisis del aprendizaje espacial de ratones WT y Ts1Cje no tratados, y ratones Ts1Cje tratados con vehículo (Ts1Cje vehicle) o rapamicina (Ts1Cje RAPA) evaluado por prueba durante la fase de entrenamiento. Se representa la latencia primaria (en s) para alcanzar la target box en cada una de las 16 pruebas realizadas durante la fase de entrenamiento. Cuando el animal fue incapaz de encontrar la target box durante el tiempo de prueba, se asumió el valor máximo (es decir, 180 s). Nótese la cinética alterada del proceso de aprendizaje en los ratones Ts1Cje tratados con vehículo, en los que se alcanzaron picos de latencia primaria (evidenciando un menor rendimiento) en la última prueba de cada bloque de pruebas diario. Tras el período de entrenamiento (fase de aprendizaje), se evaluó la consolidación de la memoria a largo plazo (24 h más tarde) y la persistencia de la LTM (8 días después) (Sunyer et at., al 2007). A 24 horas, el comportamiento fue similar entre los grupos WT, Ts1Cje y Ts1Cje RAPA, y el tiempo medio de ocupación del cuadrante en el que se localizaba la target box virtual (cuadrante “target”) fue mayor que lo esperado por azar (es decir, superior al 25 %) en los tres grupos, lo que demuestra que la LTM no se encontraba afectada (Fig. 22). Sin embargo, en el grupo de ratones Ts1Cje tratados con 49 vehículo se observó un rendimiento inferior, pues el tiempo medio de ocupación del cuadrante “target” no fue estadísticamente diferente del 25 %. Estos datos sugieren que la composición del vehículo y/o el manejo de los animales anterior a la fase de entrenamiento tuvieron un impacto negativo en la consolidación de la memoria de los ratones trisómicos. Por otra parte, la prueba de persistencia de la LTM a los 8 días mostró que tanto los ratones Ts1Cje sin tratar como los tratados con vehículo permanecían en el cuadrante “target” durante un tiempo no significativamente superior al 25%. Sin embargo, los ratones Ts1Cje tratados con rapamicina mostraron tiempos de ocupación del cuadrante “target” similares al grupo WT y por encima del 25% (Fig. 22). Figura 22. Análisis de la consolidación y la persistencia de la memoria espacial de ratones WT y Ts1Cje no tratados, y ratones Ts1Cje tratados con vehículo (Ts1Cje vehicle) o rapamicina (Ts1Cje RAPA). Se representa el tiempo medio de ocupación (en %) del cuadrante “target” (en el que se localiza la target box virtual) en cada grupo experimental, a las 24 h y a los 8 días de la fase de entrenamiento. Las barras de error indican la SEM. La línea punteada indica el nivel de ocupación esperado por azar (25%). A las 24 h, el análisis estadístico mediante t-test de una muestra para la media diferente al 25% mostró valores de p significativos en todos los casos, excepto para el grupo de ratones Ts1Cje tratados con vehículo (p = 0,030 para WT, n = 9; p = 0,003 para Ts1Cje, n = 10; p = 0,419 para Ts1Cje vehicle, n = 10; p = 0,036 para Ts1Cje RAPA, n = 10). A los 8 días, el análisis estadístico mediante t-test de muestra única para la media diferente al 25% mostró valores de p no significativos sólo en el caso de los ratones Ts1Cje no tratados y tratados con vehículo (p = 0,046 para WT, n = 9; p = 0,318 para Ts1Cje, n = 10; p = 0,698 para Ts1Cje vehicle, n = 10; p = 0,0004 para Ts1Cje RAPA, n = 10). 56 encontraban normalizadas o ligeramente activadas en SNs de ratones Ts1Cje tratados con rapamicina. Al contrario, las vías de señalización eIF4E y p70S6K estaban predictiblemente activadas en las muestras SNs WT RAPA, pero normalizadas en Ts1Cje RAPA SNs (Fig. 25). Figura 24. Rutas canónicas identificadas mediante IPA entre los conjuntos de proteínas desreguladas en SNs de ratones WT RAPA (A) y Ts1Cje RAPA (B). Se muestran las rutas más significativas, indicándose el p-value de Fisher debajo de la ruta correspondiente. También se indica (en las líneas que conectan distintas rutas) el número de proteínas alteradas en común entre dichas rutas, que son parcialmente solapantes. Por razones de claridad, sólo los pares de rutas que comparten al menos 4 proteínas (en el caso SNs WT RAPA) o 7 proteínas (en el caso SNs Ts1Cje RAPA) se han conectado entre sí en la figura. 57 Un análisis en mayor profundidad de la vía mTOR (Fig. 26 y Archivo Suplementario 4), reveló que los niveles de la proteína FKBP1 (FK506-binding protein 1a, también conocida como FKBP12) se encontraban reducidos en Ts1Cje RAPA SNs, pero no en WT RAPA SNs. Las proteínas FKBPs constituyen la diana molecular de la rapamicina, ya que es el complejo FKBP1-rapamicina el que interacciona con la quinasa mTOR, inhibiéndola. Trabajos anteriores han demostrado que las proteínas FKBPs son factores limitantes, y como consecuencia, críticos para la respuesta a rapamicina (Schreiber et al., 2015). Por tanto, este hecho sugiere una base molecular para explicar por qué los ratones Ts1Cje tratados con rapamicina no experimentan los efectos negativos que este fármaco tiene sobre la plasticidad sináptica en los animales WT (Andrade-Talavera et al., 2015). Figura 25. Análisis Z score de las rutas canónicas identificadas mediante IPA entre los conjuntos de proteínas desreguladas en SNs de ratones WT RAPA (A) y Ts1Cje RAPA (B). Se muestran las rutas que presentaron un p-value <0,005 y un Z score > 1,5 ó <-1,5. Las rutas mostradas están ordenadas por su valor p-value (arriba las que tienen un p-value menor). Nótese que un importante número de rutas canónicas identificadas por IPA con un valor bajo pvalue no son elegibles para el análisis de actividad (Z score) (véase Archivo Suplementario 3). 58 Figura 26. Análisis de la vía mTOR mediante IPA en SNs de ratones WT RAPA (A) y Ts1Cje RAPA (B). Se muestran en verde las proteínas o complejos proteicos con niveles de expresión reducidos, y en rojo con valores incrementados (respecto a SNs WT de ratones sin tratar). En gris se indican las proteínas sin cambios, y en blanco las proteínas no detectadas en el análisis proteómico. Algunos complejos proteicos presentan más de un color, según los niveles de expresión de las subunidades que los forman. 59 Con objeto de verificar este importante aspecto se llevó a cabo la cuantificación de los niveles de FKBP1 mediante Western blot cuantitativo. Para ello se prepararon nuevas fracciones de SNs a partir de animales WT y Ts1Cje tratados o no con rapamicina, de manera similar al experimento que se realizó para la obtención de las muestras que fueron analizadas mediante iTRAQ. Figura 27. Detección mediante Western blot de los niveles de FKBP1 en SNs de hipocampo de ratones WT y Ts1Cje tratados o no con rapamicina. Se muestra la imagen obtenida para la inmunodetección de la proteína FKBP1 (A) y -ACTIN (B), utilizada esta última como normalizador tras comprobarse que la señal obtenida era proporcional a la cantidad de proteína total presente en el gel (C). También se muestra la cuantificación de la señal FKBP1 normalizada (D), en unidades arbitrarias. 60 Los resultados preliminares obtenidos con esta técnica (Fig. 27) permitieron confirmar los correspondientes al análisis proteómico, observándose unos niveles más reducidos de FKBP1 en SNs procedentes de ratones tratados con rapamicina Ts1Cje (Ts1Cje RAPA) que WT (WT RAPA). No obstante, al tratarse de un único experimento, estos resultados deben considerarse preliminares y verificarse, además, mediante técnicas complementarias. 61 5. DISCUSIÓN 62 5.1. Efecto terapéutico de la rapamicina sobre el comportamiento exploratorio y la persistencia de la LTM en los ratones Ts1Cje En este trabajo se ha caracterizado el comportamiento del ratón Ts1Cje en dos tests clásicos de aprendizaje y/o memoria dependientes de hipocampo: “object recognition” y “Barnes maze”. Los resultados obtenidos en el test “object recognition” mostraron un comportamiento exploratorio reducido en los ratones Ts1Cje, tanto en la fase de familiarización como en la fase de prueba, lo que estaría en consonancia con las observaciones realizadas por Sago et al. (1998) en su descripción original de este modelo de SD. En dicho trabajo, estos autores reportan una menor actividad locomotora en el centro de la caja en el test “open field”, parámetro que se toma como medida del comportamiento exploratorio. Por otra parte, los déficits de comportamiento exploratorio observados en esta Tesis Doctoral en el test “object recognition” fueron más acentuados en la fase de prueba que en la fase previa, sugiriendo una pérdida progresiva de motivación exploradora al resultar familiar el entorno. En relación con esta observación, un trabajo reciente demuestra que los ratones Ts1Cje son más activos en ambientes novedosos que en ambientes familiares, un fenómeno que los autores correlacionan con los mayores niveles de serotonina que presenta el cerebro de estos ratones (Shimohata et al., 2017). Por otra parte, tal y como discuten Sago et al. (1998), los déficits en el comportamiento exploratorio son compatibles con deficiencias o daños en el hipocampo (Sandin et al., 1997). De manera interesante, el déficit de comportamiento exploratorio no se observó en los ratones Ts1Cje tratados con rapamicina, sugiriendo que este fármaco es capaz de normalizar la función hipocampal en este aspecto concreto. No obstante, y considerando la controversia que existe en torno al papel del hipocampo en el test “object recognition” (Balderas et al., 2008), también es posible que el efecto beneficioso de la rapamicina ocurra a nivel cortical, y no se descarta que pudiera estar relacionado de alguna manera con los niveles de serotonina, dada la 63 relación que existe entre la transmisión serotonérgica y la vía mTOR (McMahon et al., 2015). En un trabajo previo realizado por otro laboratorio (Fernandez y Garner, 2007) no se observaron deficiencias en el test “object recognition”. A pesar de las diferencias en los protocolos experimentales utilizados, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral están en consonancia con los publicados por estos autores. Así, cuando se excluyeron del análisis los animales incapaces de alcanzar el criterio previamente definido (exploración de los objetos durante al menos 20 s en un período de 10 min), no se detectaron diferencias en el índice de memoria entre animales WT, Ts1Cje o Ts1Cje RAPA. El test “Barnes maze” permite la caracterización del aprendizaje y la memoria espacial, y es similar al test “Morris Water Maze”. A pesar de utilizarse con menor frecuencia en la literatura, el test “Barnes maze” ofrece ventajas notables en el caso del ratón, cuyo hábitat natural, a diferencia del de la rata (especie para la que se diseñó originalmente el “Morris Water Maze”) no es acuático. De este modo, como ya se ha mencionado, el “Barnes maze” es una prueba que implica un menor nivel de estrés para el ratón que el “Morris Water Maze”, lo que podría influir notablemente en el rendimiento de los animales (Hölscher, 1999). Quizás por ese motivo, no sea sorprendente que los resultados obtenidos en este trabajo difieran ligeramente de los publicados por Sago et al. (1998) utilizando el test “Morris Water Maze”. Así, mientras que estos autores concluyen que existen deficiencias de aprendizaje en los ratones Ts1Cje, dichas deficiencias no son apreciables en el test “Barnes maze”. De hecho, los animales Ts1Cje inyectados con vehículo mostraron un fenotipo de comportamiento relativamente particular durante la fase de entrenamiento, y un menor rendimiento que los animales Ts1Cje no tratados en la fase de prueba de memoria a 24 h. Estos hechos sugieren que el manejo previo y/o las inyecciones intraperitoneales de vehículo previas a la fase de aprendizaje influyen negativamente en la memoria y aprendizaje de los ratones Ts1Cje, y podría ser indicativo de una mayor susceptibilidad al estrés en estos animales. En cualquier caso, aunque Sago et al. (1998) observaron una reducción estadísticamente significativa del rendimiento de los ratones Ts1Cje (en comparación 64 con el de los ratones WT) en el “Morris Water Maze”, en su estudio los animales trisómicos también mostraron una reducción de la latencia durante la fase de aprendizaje, y además los porcentajes de ocupación del cuadrante “target” durante la fase de prueba fueron superiores al 25%, de manera similar a lo obtenido en esta Tesis Doctoral con el test “Barnes maze”, demostrando que, realmente, los ratones Ts1Cje tienen capacidad de aprender y memorizar dicha tarea. Por otra parte, también cabe destacar el hecho de que el sistema de cruce empleado por Sago et al. (machos Ts1Cje en un fondo genético CD1) era diferente al utilizado en esta Tesis Doctoral (que sigue las directrices de Jackson Laboratories, suministrador original de los ratones Ts1Cje). Es bien sabido que el fondo genético de los ratones tiene un notable impacto en su comportamiento (Holmes et al., 2002), por lo que este factor no puede descartarse como posible fuente de discrepancia en los resultados obtenidos. A pesar de no observarse defectos notables de aprendizaje y memoria a largo plazo en los ratones Ts1Cje, la persistencia de la memoria a largo plazo, evaluada 8 días después del entrenamiento, sí resultó estar afectada, tanto en ratones trisómicos sin tratar como en los inyectados con vehículo. Además, la rapamicina también fue capaz de restaurar este fenotipo. De manera interesante, se ha demostrado que la persistencia de la LTM requiere síntesis de proteínas en el hipocampo, así como una fase dependiente de BDNF (Bekinschtein et al., 2007). Los ratones Ts1Cje tienen una mayor tasa de traducción local en el hipocampo, debida a los niveles incrementados de BDNF y/o pro-BDNF, que producen la hiperactivación de la via mTOR. De hecho, dicha tasa de traducción local se normaliza in vitro en presencia de rapamicina (Troca-Marín et al., 2011). Además, una importante forma de plasticidad sináptica dependiente de BDNF, la BDNF-LTP, está ausente en el hipocampo de los ratones Ts1Cje, y se recupera, ex vivo, en presencia de rapamicina (Andrade-Talavera et al., 2015). Aunque resulta tentador correlacionar los déficits de plasticidad observados en los ratones Ts1Cje con los de persistencia de la memoria, puesto que ambos fenotipos se recuperan por rapamicina, probablemente estos dos aspectos no sean directamente interdependientes. Por ejemplo, la rapamicina elimina la BDNF-LTP en rodajas de hipocampo WT (Tang et al., 2002; Andrade-Talavera 65 et al., 2015), pero solo produce efecto sutiles en la LTM determinada mediante “Barnes maze”, y ningún efecto sobre la persistencia de la LTM. A la inversa, a pesar de carecer completamente de BDNF-LTP, los ratones Ts1Cje no muestran afectación en la LTM, sugiriendo que (al menos en el “Barnes maze”) esta memoria depende de un tipo de plasticidad diferente a la BDNF-LTP. En ese sentido, otras formas de plasticidad están afectadas pero no completamente abolidas en los ratones Ts1Cje (Siarey et al., 2005), y podrían ser suficientes para mantener la memoria espacial durante ese período de tiempo relativamente corto (24 h). En particular, la vía Ras-ERK, que también está bajo el control del BDNF a través de receptores TrkB (Fig. 11), no está afectada en el hipocampo de ratones Ts1Cje (Troca-Marín et al., 2011). Además, los defectos de persistencia de la LTM observados en ratones Ts1Cje no tratados o bien tratados con vehículo podrían deberse a mecanismos corticales, más que a mecanismos hipocampales (Alonso et al., 2005). 5.2. Modificación del proteoma sináptico hipocampal por rapamicina en los ratones Ts1Cje Como ya se ha mencionado, la vía mTOR está hiperactiva en el hipocampo de los ratones Ts1Cje, dando lugar a una mayor tasa de traducción local (determinada mediante el marcaje metabólico de sinaptoneurosomas) que además se normaliza en presencia de rapamicina (Troca-Marín et al., 2011). Por tanto, en esta Tesis Doctoral se caracterizaron las proteínas presentes en estas fracciones subcelulares y sus niveles relativos, tanto en ratones sin tratar, como en ratones tratados con rapamicina, con objeto de esclarecer las vías de señalización desreguladas a nivel sináptico en los ratones trisómicos, así como los posibles mecanismos que podrían mediar los efectos beneficiosos de la rapamicina en dichos ratones. El protocolo de obtención de sinaptoneurosomas utilizado en esta Tesis fue puesto a punto en nuestro laboratorio (Troca-Marín et al., 2010), en colaboración con el Dr. Francisco J. Tejedor (Instituto de Neurociencias de Alicante), pero en la descripción original sólo se utilizaron algunos marcadores pre- y post-sinápticos para su 72 1. Los resultados obtenidos mediante el test de comportamiento “object recognition” muestran que los ratones Ts1Cje presentan una actividad exploratoria reducida, tanto en la fase de familiarización como en la fase de prueba. Dicho déficit es revertido con la administración de rapamicina. 2. A pesar de que los ratones Ts1Cje no muestran defectos evidentes de aprendizaje y de memoria a largo plazo ni en el test “object recognition” ni en el test “Barnes maze”, la persistencia de la memoria a largo plazo en este último caso, evaluada a los 8 días del entrenamiento, sí se vio afectada. El tratamiento de los ratones mediante inyección intraperitoneal de rapamicina también fue capaz de restaurar dicho fenotipo. 3. Los sinaptoneurosomas de hipocampo de ratón están muy enriquecidos en proteínas implicadas en traducción, tales como proteínas del ribosoma, aminoacil-tRNA-sintetasas, chaperonas, y factores de iniciación y de elongación de la traducción, en consonancia con el importante papel que tiene la traducción local en esta región del cerebro. 4. El proteoma sináptico de hipocampo de los ratones Ts1Cje es muy similar al de los ratones silvestres, detectándose diferencias en los niveles de expresión de un bajo número de proteínas, entre las que se incluyen proteínas de la ruta canónica de disfunción mitocondrial. 5. Los diferentes niveles de expresión de proteínas presentes en sinaptoneurosomas de ratones silvestres y Ts1Cje, tratados con rapamicina, sugieren que este fármaco tiene efectos opuestos en ambos casos. Así, en los sinaptoneurosomas de ratones silvestres tratados con rapamicina los niveles de proteínas implicadas en fosforilación oxidativa están, en general, reducidos, y diversas rutas que participan en plasticidad sináptica se encuentran 73 predictiblemente inhibidas, mientras que por el contrario, en sinaptoneurosomas de ratones Ts1Cje tratados con rapamicina los niveles de proteínas que participan en fosforilación oxidativa están incrementados, y las rutas involucradas en plasticidad sináptica están predictiblemente normalizadas o ligeramente activadas. 6. Resultados preliminares confirman que los niveles de la proteína FKBP1, diana molecular de la rapamicina, están más reducidos en los sinaptoneurosomas de ratones Ts1Cje tratados con rapamicina que en los de ratones silvestres tratados con rapamicina. Esta diferencia podría explicar la menor sensibilidad de los ratones trisómicos al efecto inhibidor de la rapamicina. 74 7. BIBLIOGRAFIA 75 Abrous, D. N., & Wojtowicz, J. M. (2015). 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When bound to eIF4E, 4E-BPs repress translation of the socalled “eIF4E-sensitive mRNAs” [13], precluding the formation of the translation initiation complex. These mRNAs contain complex 5’UTRs (untranslated regions), which give them a low rate of translation relative to normal mRNAs. When 4E-BPs are phosphorylated by mTORC1, they are released from the 5’cap mRNA structure, thus allowing the interaction of eIF4G with eIF4E to initiate translation (Fig. 1). Fig. (1). The Akt-mTOR signaling pathway in neurons. Glutamate (Glu) and BDNF can stimulate different postsynaptic receptors to activate PI3 kinase (PI3K), which phosphorylates Akt and induces mTOR signaling. Consequently, the translation of “5’TOP” and “eIF4E sensitive” mRNAs is enhanced by different mechanisms. In contrast to mTORC1, mTORC2 is insensitive to rapamycin, although it has been reported that long-term treatments with this drug inhibit mTORC2 activity in some cell lines [14]. mTORC2 phosphorylates Akt, PKC and other kinases [15] and has been implicated in actin cytoskeleton organization [10]. In addition to the long list of general cellular functions of Akt-mTOR, some specific roles have been reported in neurons, such as the regulation of dendrite morphogenesis [16-19] and synaptic plasticity [20-24]. In terms of dendritic morphogenesis, the transfection of hippocampal neurons with constitutively active forms of PI3K or Akt, which are upstream regulators of mTOR, results in increased dendrite branching [17], higher numbers of immature filopodia-like protrusions in the dendrites, and a decrease in the density of mature dendritic spines [16]. Remarkably, rapamycin abolishes all of these phenotypes [16, 17]. Moreover, knockdown of mTOR or p70S6K results in a decrease in dendritic branching [17]. Additionally, in the mature brain, mTOR has been shown to participate in dendritic growth [19], and Akt-mTOR signaling is involved in different forms of synaptic plasticity. Thus, rapamycin inhibits late longterm potentiation (L-LTP) in the hippocampal CA1 region [20, 21, 24] by blocking mTOR-mediated dendritic synthesis of proteins in response to NMDA receptor (NMDAR) activation [25-27]. Akt-mTOR activation is also involved in BDNF-induced potentiation in the hippocampus [20]. Conversely, mTOR inhibition either with rapamycin or with anti-BDNF antibodies impedes the formation and reconsolidation of inhibitory avoidance memory in rodents [28-30]. Finally, long-term depression (LTD), which is mediated by metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in the CA1 region, also depends on Akt-mTOR signaling [22] and local dendritic translation [31]. Because dendrite morphogenesis and synaptic plasticity are altered in nearly all cognitive syndromes, the functions of Akt-mTOR signaling are important in that context, and recent studies have proposed that the Akt-mTOR cascade is at the “crossroads” of the molecular mechanisms leading to intellectual disability [2]. Thus, the hyperactivation of AktmTOR has been reported in mouse models of fragile X [32, 33] and tuberous sclerosis [34], while a murine model of Rett’s syndrome shows mTOR hypoactivation [35]. POSSIBLE AKT-mTOR PATHWAY DYSFUNCTION IN DS We have recently found that the Akt-mTOR cascade is hyperactivated in the dendrites of hippocampal neurons in Ts1Cje mice [4], a well-known DS model [36]. This mouse is trisomic for a fragment of chromosome 16 that contains numerous human chromosome 21 orthologs, including the Down Syndrome Critical Region (DSCR), which is crucial for the DS cognitive phenotype [37-39]. Accordingly, as is the case in DS [40], Ts1Cje mice show dendritic defaults [41], altered synaptic plasticity and memory deficits [36, 41- 43], reduced cerebellar volume [44], impaired neurogenesis [45-47], and anomalies in the craniofacial skeleton [48]. We found that the levels of phospho-Akt (Ser473), phospho-mTOR (Ser2448), phospho-p70S6K (Thr389), phospho-S6 (Ser235/236), and phospho-4EBP1 (Ser65) are increased approximately 2-fold in dendrites of Ts1Cje- derived hippocampal neurons relative to their wild-type counterparts and, consequently, that local translation rates are also augmented [4]. This increase is physiologically relevant, since it is similar to that produced by BDNF in wild-type neurons [4, 49]. Interestingly, the hippocampal levels of BDNF and pro- BDNF are increased in Ts1Cje mice. Thus, when cultured Ts1Cje hippocampal neurons were treated with scavengers specific for these neurotrophins (TrkB-Fc or p75NTR-Fc), the phosphorylation levels of the Akt-mTOR pathway proteins were restored, strongly suggesting that the hyperactivation of the Akt-mTOR cascade in the Ts1Cje Rapamycin for Down’s Syndrome CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, 2014, Vol. 13, No. 1 3 hippocampus is due to the increased extracellular levels of BDNF and/or pro-BDNF [4]. Dendrites are known to secrete BDNF and pro-BDNF in response to NMDAR activation [50]. Afterwards, pro-BDNF is converted to mature BDNF by extracellular proteases. We found evidence of the increased basal activity of NMDARs in the Ts1Cje hippocampus. Thus, dendritic levels of DSCAM (Down Syndrome Cell Adhesion Molecule) protein, which are regulated by NMDAR-mediated synaptic activity, are abnormally increased in Ts1Cje hippocampal neurons. Remarkably, although APV (2-amino-5- phosphonovaleric acid, a specific NMDAR inhibitor) reduces the dendritic levels of DSCAM in Ts1Cje neurons, incubation with NMDA does not produce further increases [51]. Taking these data together, we have proposed the “glutamatergic positive-feedback loop” hypothesis to explain some of the complex synaptic plasticity defects in Ts1Cje mice [4]. In this model (Fig. 2), increased NMDAR activity could account for the enhanced postsynaptic BDNF and/or pro-BDNF release, thus leading to Akt-mTOR hyperactivation and increased local dendritic translation rates [4]. Because BDNF mRNA is locally translated, the increased local dendritic translation rates could in turn contribute to the augmented BDNF/pro-BDNF levels measured in Ts1Cje dendrites [52]. Furthermore, BDNF could stimulate synaptic glutamatergic activity by enhancing glutamate release [53, 54] and NMDAR signaling [55-58]. Hence, this glutamate-BDNF feedback positive loop could yield a “synaptic saturation state” that could impair synaptic plasticity. A number of observations further support this model: 1) the incubation of hippocampal Ts1Cje neurons with BDNF does not increase the activity of the Akt-mTOR pathway [4]; 2) the incubation of hippocampal Ts1Cje synaptoneurosomes with BDNF does not increase the rates of local translation [4]; 3) inhibitors of NMDAR, such as memantine, APV or MK-801, reduce the dendritic levels of phospho-mTOR (Ser2448) in Ts1Cje hippocampal neurons [4]; 4) remarkably, the BDNF plasma levels in DS patients are higher than in control individuals [59, 60], which likely reflects the increased BDNF levels in brain [61, 62]; and 5) there is a possible dysregulation of mTOR in Ts65Dn mice, which is the most widely used DS model. Hence, increased phospho-Akt (Ser473) levels in Ts65Dn hippocampal extracts have been reported [63, 64]. However, in contrast to what is observed in Ts1Cje mice and possibly in the DS brain, normal or even decreased BDNF levels have been reported in the Ts65Dn hippocampus [65-71]. Nevertheless, it must be stressed that these studies have been conducted using total extracts, which could mask the possible differences in neuronal compartments such as the dendrites, which are crucial for synaptic plasticity. Thus, to establish a consensus on a model, it would be of great interest to determine the possible alterations of dendritic levels of BDNF/pro-BDNF in Ts65Dn and DS neurons, as well as possible differences in the secreted levels of these neurotrophins. Nonetheless, some important questions must be answered to definitively characterize the potential role of mTOR signaling hyperactivation in the alterations of synaptic plasticity that lead to the cognitive deficits observed in DS. For instance, it remains unclear which step of the glutamate- BDNF loop is initially disrupted in trisomic neurons. The overexpression of two human chromosome 21 genes belonging to the DSCR, MNB/DYRK1A and DSCR1 (also known as RCAN1) has been suggested to mediate NMDAR dysregulation in Ts65Dn mice [70, 72]. Specifically, the overexpression of MNB/DYRK1A prolongs calcium uptake after NMDAR stimulation [73]. Moreover, DSCR1, which encodes a calcineurin inhibitor, increases both the probability and the duration of NMDAR opening [74]. Thus, both the MNB/DYRK1A and DSCR1 genes, which are also triplicated in Ts1Cje, could be responsible for the basal increased glutamatergic activity in the trisomic hippocampus. Fig. (2). The glutamatergic positive-feedback loop hypothesis in DS. Increased glutamatergic activity via NMDARs induces the enhanced release of BDNF/proBDNF proteins. Pro-BDNF extracellularly matures into BDNF. The increase in extracellular BDNF in turn induces postsynaptic Akt-mTOR hyperactivation via the TrkB receptors. Consequently, the local translation of dendritic mRNAs is augmented, which most likely includes the translation of BDNF mRNA. The presynaptic release of glutamate is stimulated by BDNF, which contributes to the enhanced glutamatergic activity. 4 CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, 2014, Vol. 13, No. 1 Troca-Marín et al. Another key question that remains unanswered is which aspects of the hippocampal synaptic plasticity are affected by Akt-mTOR hyperactivation. Because mTOR signaling is known to participate in CA1 plasticity (i.e., NMDAR-dependent L-LTP, BDNF-dependent potentiation, and mGluR-dependent LTD [20-22]), in principle, these forms of CA1 plasticity are expected to be altered. Remarkably, rapamycin does not block L-LTP in the dentate gyrus, suggesting that mTOR is not involved in this type of plasticity [75]. In fact, reduced LTP in the dentate gyrus of the Ts1Cje and Ts65Dn mouse models is due to enhanced GABAergic (but not glutamatergic) activity [41, 76]. Therefore, it would be important to assess whether rapamycin restores impaired CA1 plasticity in DS mouse models [42, 77-79]. Sustained hyperactive mTOR signaling has been recently shown to enhance both GABAergic and glutamatergic synaptic transmission by increasing the number of synapses, the number of synaptic vesicles ready to be released, and the amplitude of the miniature postsynaptic currents [80]. It is therefore tempting to speculate that presynaptic mTOR hyperactivation could be responsible for the potentiation of the glutamatergic [51, 72] and GABAergic [41, 76] activity reported in the hippocampus of DS mouse models. In summary, we believe that alterations in Akt-mTOR signaling are crucial to the complex synaptic plasticity phenotype of DS mouse models. This supports our proposal that Akt-mTOR is a novel drug target for DS therapy. RAPAMYCIN AND RAPALOGS Rapamycin and rapalogs interact with FKBP12 (FK506 binding protein 12), a cytoplasmic immunophilin. This complex then binds to the FRB (FKBP12-rapamycin binding) domain of mTOR (Fig. 3A), thus inhibiting the phosphorylation of downstream mTOR targets. Although the underlying mechanism of this inhibition remains largely unknown, it has been proposed that it involves the dissociation of Raptor from mTOR and, consequently, the disruption of mTORC1 binding to its targets [81]. Rapamycin is a macrolide ester (Fig. 3B) that is FDA-approved as an immunosuppressant. It is used to prevent graft rejection, to treat restenosis, and due to its antiproliferative activity, to treat certain types of cancer. Rapamycin is effective in the nanomolar range; however, some of its pharmacological properties are not optimal. Thus, a new generation of analogous compounds (collectively referred as rapalogs) with improved solubility, stability and bioavailability compared to rapamycin have emerged. Such compound include the following: everolimus (RAD001, Novartis), temsirolimus (CCI-779, Wyeth), deforolimus (AP23573, Ariad), and zotarolimus (ABT-578, Abbot Laboratories) (Fig. 3B). In the USA, everolimus and temsirolimus are approved for the treatment of advanced renal cell carcinoma. Everolimus is also FDA-approved for the treatment of subependymal giant cell astrocytoma associated with tuberous sclerosis and for pancreatic neuroendocrine tumors. Deforolimus and zotarolimus are currently being tested in a number of clinical trials for cancer treatment. The chemical characteristics and biological effects of rapamycin and rapalogs have been extensively reviewed elsewhere [82, 83] and are not further discussed here. Fig. (3). mTOR protein and inhibitors. (A) Structure of the mTOR protein showing the HEAT repeats, FAT, FRB, kinase and FATC domains. The HEAT repeats are a protein-protein interaction motif. FAT and FATC domains modulate the kinase activity of mTOR. The inhibitory complex formed by rapamycin and FKBP12 interacts with the FRB domain. (B) Chemical structure of rapamycin and the most common rapalogs. Differences between rapamycin (sirolimus), everolimus (RAD001), temsirolimus (CCI- 779), and deforolimus (AP23573) are highlighted. THE POTENTIAL OF RAPAMYCIN/RAPALOGS TO IMPROVE COGNITIVE FUNCTION IN DOWN’S SYNDROME mTOR hyperactivation has been reported in mouse models of fragile-X [32, 33] and tuberous sclerosis [34], two disorders linked to intellectual disability. At least in the case of tuberous sclerosis, rapamycin has been shown to restore impaired LTP and spatial learning [34]. Moreover, a clinical trial aimed to test the effect of everolimus on neurocognition in tuberous sclerosis patients is underway (http://clinical trials.gov, id. NCT01289912). Inspired by these precedents, the use of rapamycin/ rapalogs for treating Down’s syndrome-associated cognitive dysfunction is intriguing, although a preclinical validation of efficacy is necessary. As a proof of concept, we have demonstrated that rapamycin restores the dendritic level of mTOR phosphorylation and reduces the rate of local dendritic translation in the hippocampus of Ts1Cje mice. Moreover, the increased dendritic level of the AMPA (- amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) receptor subunit GluR1 in the Ts1Cje neurons is also Rapamycin for Down’s Syndrome CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, 2014, Vol. 13, No. 1 5 normalized by rapamycin treatment [4]. It must be emphasized that GluR1 is known to be locally translated in response to BDNF and is regulated by mTOR activity [29, 84]. We are currently testing the effect of rapamycin on memory and learning in Ts1Cje mice using classical behavioral tests. When considering rapamycin/rapalogs for the putative treatment of DS, the most obvious advantages of these compounds are the following: 1) they are highly specific because the FRB domain of mTOR is unique [83], and 2) they are FDA-approved drugs. Nevertheless, other important issues should be considered. First, the mTOR pathway is subject to complex regulation, and the rapamycin effects seem to be highly dependent on the dose and time of treatment, as well as on the cell type. For example, prolonged treatment can interfere with mTORC2 assembly and, consequently, affect Akt signaling. In mice, a daily intraperitoneal injection of rapamycin for a week either hyper- or hypoactivates Akt, depending on the tissue. Nevertheless, this treatment did not affect the levels of phosphorylated Akt in the brain [14], suggesting that neuronal cells are not subjected to this regulatory phenomenon. It has also been shown that, whereas acute rapamycin treatment (1 h) initially induces 4E-BP1 and p70S6K dephosphorylation, prolonged treatment (24-48 h) causes the phosphorylation of 4E-BP1, but not of p70S6K, in a cell type-dependent manner [85]. Finally, in cancer cell lines, it has been shown that a low dose of rapamycin induces the phosphorylation of Akt and ERK by an mTORC1-dependent mechanism, whereas a high dose of rapamycin inhibits Akt and ERK phosphorylation through an mTORC2-dependent mechanism [86]. Considering this complex scenario, the long-term effects of rapamycin on Akt-mTOR signaling in DS neurons are unpredictable and should therefore be tested. Second, mTOR is involved in many functions unrelated to cognition, and the consequence of mTOR inhibition in non-neuronal tissues could have undesirable effects. Third, rapamycin increases the risks of developing infections and lymphoma. This finding is particularly noteworthy in the case of DS because patients with trisomy 21 show a number of mild immune defects, including a reduction in lymphocyte counts, an increased risk of developing autoimmune diseases and a higher susceptibility to suffer infections, especially those affecting the respiratory tract [87]. Other rapamycin-associated adverse reactions, including peripheral edema, hypertriglyceridemia, hypertension, hypercholesterolemia, anemia and thrombocytopenia, should be carefully considered in the specific context of DS. FUTURE DIRECTIONS The identification of the altered molecular pathways common to different intellectual disabilities is an exciting finding that could lead to synergical advances in the search for new therapies to improve cognition in these diseases. When considering the intellectual disabilities that are linked to dysfunctional AkT-mTOR signaling, DS presents the most complex scenario. Fragile X, tuberous sclerosis and Rett’s syndrome are caused by the loss-of-function of a single gene. In contrast, hundreds of genes are triplicated in DS. Interestingly, mTOR hyperactivation interferes with different aspects of synaptic transmission. As mentioned above, hyperactive mTOR signaling enhances GABAergic and glutamatergic transmission at the presynaptic level [80], while at the postsynaptic level, it increases local translation [4, 33] and interferes with some types of synaptic plasticity. In conclusion, mTOR hyperactivation could lead to unbalanced glutamatergic/GABAergic signaling in DS. The resulting synaptic plasticity phenotype would likely be dependent on the brain region. Due to this complex regulation, the potential of rapamycin/rapalogs alone or in combination with other drugs to improve cognition in DS is an open question that should be investigated. Pre-clinical trials to test whether rapamycin restores synaptic plasticity, memory and learning in Ts1Cje mice are underway. ABBREVIATIONS 4E-BP = eIF4E-binding protein AMPA = -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole- propionic acid BDNF = Brain-Derived Neurotrophic Factor DS = Down’s syndrome DSCR = Down Syndrome Critical Region FDA = Food and Drug Administration GABA = -aminobutyric acid L-LTP = Late long-term potentiation LTD = Long-term depression mGlu = Metabotropic glutamate mGluR = Metabotropic glutamate receptor NMDA = N-Methyl-D-Aspartate NMDAR = NMDA receptor p70S6K = S6 kinase CONFLICT OF INTEREST The authors confirm that they do not have any conflicts of interest. ACKNOWLEDGEMENTS We thank Francisco J. Tejedor for critically reading the manuscript. This work was supported by grants from the Ministerio de Economía y Competitividad (Instituto de Salud Carlos III, Spain; grant PI110507), the Junta de Andalucía (grant P09-CTS-4610) and the Fondation Jérôme Lejeune (France) to MLM. REFERENCES [1] Dazert, E.; Hall, M.N. mTOR signaling in disease. Curr. Opin. Cell Biol., 2011, 23(6), 744-755. [2] Troca-Marin, J.A.; Alves-Sampaio, A.; Montesinos, M.L. Deregulated mTOR-mediated translation in intellectual disability. Prog. Neurobiol., 2012, 96(2), 268-282. [3] Menon, S.; Manning, B.D. Common corruption of the mTOR signaling network in human tumors. Oncogene, 2008, 27(Suppl 2), S43-S51. [4] Troca-Marin, J.A.; Alves-Sampaio, A.; Montesinos, M.L. 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Received: October 22, 2012 Revised: March 25, 2013 Accepted: March 27, 2013 Rapamycin restores BDNF-LTP and the persistence of long-term memory in a model of Down's syndrome Yuniesky Andrade-Talavera a,1 , Itziar Benito b,c,d,1 , Juan José Casañas b,c , Antonio Rodríguez-Moreno a , María Luz Montesinos b,c, ⁎ a Laboratorio de Neurociencia Celular y Plasticidad, Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Universidad Pablo de Olavide, E-41013 Sevilla, Spain b Departamento de Fisiología Médica y Biofísica, Universidad de Sevilla, E-41009, Sevilla, Spain c Instituto de Biomedicina de Sevilla, IBIS/Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain d Servicio de Animalario, Hospital Universitario Virgen Macarena (HUVM), E-41009, Sevilla, Spain abstractarticle info Article history: Received 22 May 2015 Revised 22 August 2015 Accepted 16 September 2015 Available online 24 September 2015 Keywords: Barnes maze BDNF-LTP ERK MTOR Pharmacotherapy Rapamycin Synaptic plasticity Trisomy 21 Ts1Cje Down's syndrome (DS) is the most prevalent genetic intellectual disability. Memory deficits significantly contribute to the cognitive dysfunction in DS. Previously, we discovered that mTOR-dependent local translation, a pivotal process for some forms of synaptic plasticity, is deregulated in a DS mouse model. Here, we report that these mice exhibit deficits in both synaptic plasticity (i.e., BDNF-long term potentiation) and the persistence of spatial long-term memory. Interestingly, these deficits were fully reversible using rapamycin, a Food and Drug Administration-approved specific mTOR inhibitor; therefore, rapamycin may be a novel pharmacotherapy to improve cognition in DS. © 2015 Elsevier Inc. All rights reserved. 1. Introduction Trisomy of human chromosome 21 leads to Down's syndrome (DS), the most frequent intellectual disability of genetic origin. Deficits in spatial long-term memory (LTM) and retrieval of explicit memory are well documented in individuals with DS (Carlesimo et al., 1997; Pennington et al., 2003). These data suggest that both hippocampal and prefrontal dysfunction cooperate to produce cognitive disability. Memory consolidation (i.e., conversion of short-term memory into LTM) requires the synthesis of new proteins that modify synapses both structurally and functionally. Some of these proteins are locally translated from pre-existent dendritic mRNAs. Thus, local translation is crucial for synaptic plasticity, learning and memory (reviewed by Buffington et al., 2014). We previously reported a deregulation of hippocampal local translation due to Akt–mammalian target of rapamycin (mTOR) hyperactivation in Ts1Cje mice, a DS model (Troca-Marin et al., 2011). This pathway is coupled to postsynaptic receptors, including the tropomyosin-related kinase B (TrkB) receptor, to regulate local translation rates and synaptic plasticity (Tang et al., 2002; Takei et al., 2004). In Ts1Cje mice, mTOR hyperactivation provokes abnormally augmented synaptic local translation due to increased brain-derived neurotrophic factor (BDNF)/pro-BDNF levels (Troca-Marin et al., 2011), suggesting a saturation of the BDNF–TrkB–Akt–mTOR regulatory axis. Indeed, Ts1Cje synapses do not respond to exogenous BDNF (Troca-Marin et al., 2011), which could be relevant for impaired learning and memory in DS (Troca-Marin et al., 2014). Very recently, mTOR hyperactivation Neurobiology of Disease 82 (2015) 516–525 Abbreviations: 4EBPs, eIF4E-binding proteins; AMPA, α-amino-3-hydroxy-5-methyl- 4-isoxazolepropionic acid; BDNF, brain-derived neurotrophic factor; CHX, cycloheximide; DG, dentate gyrus;DS, Down'ssyndrome; eIF4E, eukaryotictranslation initiation factor 4E; ERK, extracellular signal-regulated kinase; FDA, Food and Drug Administration; fEPSPs, field excitatory postsynaptic potentials; GABA, gamma-aminobutyric acid; HFS, high frequency stimulation; LTD, long-term depression; LTM, long-term memory; LTP, Longterm potentiation; MEK, MAPK/ERK kinase; Mnk1, mitogen-activated protein kinase integrating kinase 1; mTOR, mammalian target of rapamycin; NMDAR, N-methyl D-aspartate receptor; p70S6K, p70 S6 kinase; PDK1, phosphoinositide-dependent kinase 1; PI3K, phosphatidylinositol 3-kinase; PIP2, phosphatidilynositol 4,5-bisphosphate; PIP3, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate; PPF, paired-pulse facilitation; PPR, paired-pulse ratio; PTEN, Phosphatase and tensin homolog on chromosome ten; RSK, p90 ribosomal S6 kinase; TrkB, tropomyosin-related kinase B; TSC, tuberous sclerosis complex; WT, wild-type. ⁎Corresponding author at: Departamento de Fisiología Médica y Biofísica, Instituto de Biomedicina de Sevilla, Universidad de Sevilla, Av. Sánchez-Pizjuán 4, E-41009 Sevilla, Spain. E-mail address: [email protected] (M.L. Montesinos). 1 These authors contributed equally to this work. Available online on ScienceDirect (www.sciencedirect.com). http://dx.doi.org/10.1016/j.nbd.2015.09.005 0969-9961/© 2015 Elsevier Inc. All rights reserved. Contents lists available at ScienceDirect Neurobiology of Disease journal homepage: www.elsevier.com/locate/ynbdi was found in post-mortem DS brains (Iyer et al., 2014; Perluigi et al., 2014). Interestingly, the Food and Drug Administration (FDA)-approved specific mTOR inhibitor rapamycin restores the local translation rates of Ts1Cje (Troca-Marin et al., 2011). This fact raises the possibility that rapamycin could have therapeutic potential for DS intellectual disability. Here, we show that CA3–CA1 BDNF-long term potentiation (BDNF-LTP), an mTOR-dependent form of synaptic plasticity, is lacking in Ts1Cje mice. Moreover, these mice show impaired persistence of spatial LTM. Importantly, rapamycin fully reverses both of these phenotypes. 2. Materials and methods 2.1. Animals Partially trisomic Ts1Cje mice (Sago et al., 1998) were obtained from Jackson Laboratories and maintained on a mixed genetic background as recommended by backcrossing Ts1Cje males to C57BL/6JOlaHsd × C3H/ HeNHsd F1 females. This mating system results in a similar proportion of wild-type (WT) and Ts1Cje animals. Sets of male WT and Ts1Cje litermattes were used in the experiments, that were carried out according to the European Union directive (86/609/EU) for the use of laboratory animals and were approved by the local Ethical Committee. For the electrophysiological recordings, post-natal day 21–30 male mice were used. For the behavioral experiments, male mice between 2 and 4 months of age were used; furthermore, blind animals homozygous for the retinal degeneration mutation Pde6b rd1 , which segregates in the Ts1Cje colony (Sago et al., 1998), were not used. 2.2. Reagents BDNF, cycloheximide, K252a and PD98059 were purchased from Sigma-Aldrich. Rapamycin was acquired from Selleck Chemicals and D-AP5 from Tocris Bioscience. For electrophysiological experiments, BDNF, cycloheximide and D-AP5 were directly dissolved in water; rapamycin, K252a and PD98059 stocks were prepared in DMSO (final concentration of DMSO in the perfussion solution 0.1% v/v). For behavioral experiments, rapamycin was prepared in a vehicle solution (saline buffer containing 4% ethanol, 5% Tween® 80 and 5% polyethylene glycol 400) as previously described (Kwon et al., 2003). 2.3. Electrophysiological recordings Hippocampal slices were prepared as described elsewhere (Rodriguez-Moreno et al., 1998; Andrade-Talavera et al., 2012). The whole brain, including the two hippocampi, was removed in an icecold solution containing the following components (in mM): 124 NaCl, 2.69 KCl, 1.25 KH 2 PO 4 , 2.0 MgSO 4 , 1.8 CaCl 2 , 26 NaHCO 3 , and 10 glucose (pH 7.3, ~300 mOsm). Next, the brain was positioned on the stage of a vibratome slicer (Leica VT 1000S) and cut coronally to obtain 350 μm-thick transverse hippocampal slices. These slices were kept continuously oxygenated for ≥1 h before use. All of the experiments were carried out at room temperature (22–25 °C). The drugs were bath applied, switching between different perfusion lines at a ratio of 3 ml/min. The experiments performed in the presence of rapamycin, cycloheximide or K252a were carried out in slices treated with these compounds 30 min before BDNF application. In PD98059 experiments the slices were pre-incubated at least 1 h prior baseline recording. Field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) were recorded in the CA1 region and were evoked at 0.2 Hz stimulation with a monopolar electrode placed on Schaffer collateral afferents in the stratum radiatum. The distance between the stimulating and recording electrodes was 200 μm. Extracellular recording electrodes were filled with an external solution. In paired-pulse experiments, two consecutive stimuli separated by 40 ms were applied. The basal synaptic transmission in wild-type, Ts1Cje and rapamycin-treated Ts1Cje slices were studied by a stimulus– response curve, ranging from 0 to 240 μAwitha20μA increase per step. The mean of six fEPSPs at each stimulation strength was calculated. The data were filtered at 2 kHz and acquired at 10 kHz. 2.4. Barnes maze test The protocol used for the Barnes maze test was previously described in detail (Sunyer et al., 2007). Briefly, the mouse was first subjected to an adaptation period in which it was exposed to the stimulus (the air jets produced by three fans surrounding the Barnes platform) and guided to the target box by the experimenter. Next, the mouse was allowed to stay in the box for 2 min. After adaptation, the training phase consisted of 4 trials per day (15-min inter-trial interval) for 4 consecutive days. During each trial, the mouse was exposed to the stimulus and allowed to explore for 3 min. The animal was allowed to remain in the box for 1 min after entering the target hole. If the mouse did not find the target box, it was guided to the target hole by the experimenter. The primary latency (time spent to find the target box) was used to evaluate spatial acquisition (learning of the task). Two probe trials were performed, including one at 24 h and one at 8 days after the training (Sunyer et al., 2007). During the probe trials, the target hole was closed, and the mouse was allowed to explore for 90 s. The time spent in the target quadrant, the time elapsed before exploring the virtual target box for the first time (primary latency) and the number of primary errors (exploration of wrong hole events before exploring the virtual target box for the first time) were used to assess LTM (24 h probe) and the persistence of LTM (8 day probe). Visual cues were posted around the Barnes maze platform. To avoid olfactory cues, the maze was systematically cleaned with a surface disinfectant (1% CR36) after each trial and rotated around its axis. An automated tracking system (Smart, Harvard Apparatus) was used to monitor and analyze the animals behavior. For wild-type or Ts1Cje rapamycin-treated mice, rapamycin (10 mg/kg) was administered by intraperitoneal injection during the 5 days prior to the Barnes maze test (one injection per day). The rapamycin was dissolved at 1 mg/ml in a vehicle solution as previously described (Kwon et al., 2003). A group of Ts1Cje mice were treated with vehicle solution following the same injection scheme. Untreated wildtype and Ts1Cje mice did not receive any kind of treatment or manipulation previous to the training phase. 2.5. Statistics Data are presented as the mean ± SEM. For electrophysiological experiments, significance was assessed using Student's paired t-test. For statistical comparisons, an averaged and normalized slope of the last 5 min of the time course was taken over 60 min after BDNF application.Thisslopewasrepresentedasthe mean value of BDNF-potentiation in each experimental condition. For behavioral experiments, data from the Barnes maze acquisition phase were analyzed using a repeatedmeasured two-way ANOVA with the Bonferroni post-hoc test. To comparetheperformanceatthe24hprobeandthe8dayprobe,datawere analyzed using Student's paired t-test. A one-sample t-test was used to assess if the mean values obtained in experiments were significantly different from specified values (target quadrant occupancy different from 25% or scores different from 0). The significance level is indicated using asterisks: *Pb0.05, **Pb0.01 and ***Pb0.001. 3. Results 3.1. CA3–CA1 BDNF-LTP is absent in Ts1Cje mice, and it is restored by rapamycin Synaptic plasticity deficits were previously reported for Ts1Cje mice, including reduced LTP and increased long-term depression (LTD) in the hippocampal CA1 region (Siarey et al., 2005) and decreased dentate- 517Y. Andrade-Talavera et al. / Neurobiology of Disease 82 (2015) 516–525 gyrus (DG) LTP (Belichenko et al., 2007). However, CA3-CA1 BDNF-LTP, a type of synaptic plasticity that requires local dendritic translation (Kang and Schuman, 1996) and depends on mTOR activation (Tang et al., 2002), has not been investigated in a DS mouse model. We previously demonstrated that mTOR-driven local translation is deregulated in the Ts1Cje hippocampus (Troca-Marin et al., 2011); therefore, we first analyzed BDNF-LTP in these mice. We found that exogenous BDNF application (20 ng/ml) induced a robust synaptic potentiation at CA3–CA1 synapses in wild-type hippocampal slices (166 ± 17% of baseline, n= 9), as previously shown by Tang et al. (2002). However, BDNF-potentiation was absent in the Ts1Cje hippocampus (110 ± 8% of baseline, n=15)(Fig. 1A, C). As expected (Tang et al., 2002), rapamycin (200 nM) abolished BDNF-LTP in the wild-type hippocampal slices (109 ± 10% of baseline, n= 11), but it remarkably restored this form of plasticity in the Ts1Cje hippocampus (194 ± 23% of baseline, n= 10) (Fig. 1B, C). This recovery effect was significantly reduced in the presence of 10 μM cycloheximide (CHX) (CHX: 115 ± 15% of baseline, n= 7 versus control: 216 ± 24% of baseline, n=5;Fig. 1E, F) demonstrating that, similarly to BDNF-LTP in the wild-type (Kang and Schuman, 1996) (CHX: 109 ± 8% of baseline, n= 7 versus control: 157 ± 7% of baseline, n=4;Fig. 1D,F), it depends on protein translation. Also similarly to BDNF-LTP in the wild-type (Kang and Schuman, 1995), rapamycin-recovered potentiation in Ts1Cje was prevented in the presence of K252a, an inhibitor of the tyrosine protein kinase activity of TrkB receptors (K252a: 95 ± 3% of baseline, n= 7 versus control: 211 ± 26% of baseline, n=5; Fig. 2). These data show that rapamycin-restored BDNF-LTP in Ts1Cje mice requires the activation of TrkB receptors. It is also known that, in addition to mTOR, BDNF signaling through TrkB receptors activates the Ras–ERK (Extracellular signal-regulated kinase) pathway, which enhances synaptic translational rates and participates in different forms of plasticity (reviewed by Panja and Bramham, 2014). However, it is unknown whether the Ras–ERK pathway plays a role on CA3–CA1 BDNF-LTP. To gain more insight into the mechanisms of the BDNF-LTP observed in wild-type and rapamycin-treated Ts1Cje animals, we checked a possible contribution of ERK signaling in these experimental groups. We performed experiments in the presence of PD98059, a MEK (MAPK/ERK kinase) specific inhibitor. In wild-type mice slices, BDNFLTP was almost completely prevented in the presence of 50 μMof PD98059 (121 ± 12% of baseline, n= 6 versus control: 160 ± 9% of baseline, n=9;Fig. 3A, B). Ts1Cje hippocampal slices treated with 50 μMof PD98059 did not show potentiation in the presence of 200 nM rapamycin after BDNF application (PD98059: 93 ± 13% of baseline, n=6versuscon- trol: 178 ± 18% of baseline, n=9;Fig. 3C, D) demonstrating that, similarly to BDNF-LTP in the wild-type, it involves ERK signaling. Glutamatergic synapses are known to exhibit mechanistically different types of plasticity, and N-methyl D-aspartate receptors (NMDAR) Fig. 1. BDNF-induced LTP at CA3–CA1 hippocampal synapses in WT and Ts1Cje slices treated with or without rapamycin. (A) Time course of BDNF (20 ng/ml) effects on field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) in WT and Ts1Cje mice. Inset: representative traces of a fEPSP before (1) and after (1′) BDNF application in WT mice and before (2) and after (2′)BDNF application in Ts1Cje mice. (B) Time course of BDNF (20ng/ml) effects on fEPSPs inslices from WTand Ts1Cje mice treated with rapamycin (200nM). Inset: representative traces of a fEPSP before (2) and after (2′) BDNF application in WT mice and before (1) and after (1′) BDNF application in Ts1Cje mice. (C) Quantification of the effects depicted in panels A and B. (D) Time course of BDNF (20 ng/ml) effects on fEPSPs in WT slices under control conditions and in slices treated with 10 μM cycloheximide. Inset: representative traces of a fEPSP before (1) and after (1′) BDNF application under control conditions, and before (2) and after (2′) BDNF application in slices treated with 10 μM cycloheximide. (E) Time course of BDNF-induced potentiation in Ts1Cje slices treated with 200 nM rapamycin in control conditions and in the presence of 10 μM cycloheximide. Inset: representative traces of a fEPSP before (1) and after (1′)BDNF application in the absence of 10 μM cycloheximide, and before (2) and after (2′) BDNF application in slices treated with the translation inhibitor. (F) Summary of the results shown in panels D and E. The error bars represent the SEM. The number of slices for each condition is indicated in the corresponding bar. **Pb0.01, Student's t-test. 518 Y. Andrade-Talavera et al. / Neurobiology of Disease 82 (2015) 516–525 References Alonso, M., Bekinschtein, P., Cammarota, M., Vianna, M.R., Izquierdo, I., Medina, J.H., 2005. Endogenous BDNF is required for long-term memory formation in the rat parietal cortex. Learn. Mem. 12, 504–510. Alves-Sampaio, A., Troca-Marin, J.A., Montesinos, M.L., 2010. NMDA-mediated regulation of DSCAM dendritic local translation is lost in a mouse model of Down's syndrome. J. Neurosci. 30, 13537–13548. 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