Estudio de NAMPT como marcador tumoral y su implicación en tumorigénesis en cáncer de cabeza y cuello

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA UNIVERSIDAD DE SEVILLA ESTUDIO DE NAMPT COMO MARCADOR TUMORAL Y SU IMPLICACIÓN EN TUMORIGÉNESIS EN CÁNCER DE CABEZA Y CUELLO Lola Eufemia Navas Graduada en Farmacia Tesis doctoral Director: Amancio Carnero Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) 2021 Dr. Amancio Carnero Moya y Dra. María José Peral Rubio, CERTIFICAN: Que el trabajo experimental presentado en esta memoria para optar al título de Doctora en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla titulado “ESTUDIO DE NAMPT COMO MARCADOR TUMORAL Y SU IMPLICACIÓN EN TUMORIGÉNESIS EN CÁNCER DE CABEZA Y CUELLO” ha sido realizado por Lola Eufemia Navas Maldonado en el grupo de Biología Molecular del Cáncer del área de Oncohematología y Genética del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) bajo la dirección del Dr. Amancio Carnero Moya y la tutela académica de la Dra. María José Peral Rubio. El trabajo ha sido financiado con una beca de Formación de Personal Universitario (FPU) del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (Ref: FPU16/02920) Sevilla, Diciembre de 2021 La doctoranda, El director, La tutora académica, Lola Eufemia Navas Dr. Amancio Carnero Moya Dra. Mª José Peral Rubio Índice I ÍNDICE ÍNDICE ............................................................................................................................................... I ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................................................... IV ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................................ VI ABREVIATURAS ........................................................................................................................... VII RESUMEN ........................................................................................................................................ IX SUMMARY....................................................................................................................................... XI INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 1 1. Nicotinamida Adenina Dinucleótido (NAD+) ......................................................................................... 3 1.1. Funciones Redox de NAD+ .................................................................................................................. 4 1.2. Funciones no-redox: NAD+ como sustrato ................................................................................... 5 1.3. NAD+ en el metabolismo del cáncer ............................................................................................... 6 1.4. Biosíntesis de NAD+ ............................................................................................................................... 7 1.4.1. Ruta De novo (De novo pathway) .......................................................................................... 8 1.4.2. Ruta Preiss-Handler ( The Preiss-Handler pathway ) ........................................................ 8 1.4.3. Ruta de rescate ( The salvage pathway )................................................................................ 8 1.4.4. Ruta de nucleósido ( The Nucleoside Pathway ) ................................................................ 9 2. Nicotinamida Fosforribosiltransferasa (NAMPT) ................................................................................10 2.1. NAMPT en cáncer ..................................................................................................................................12 2.2. Otras enzimas NAD+-dependientes en cáncer .........................................................................12 2.2.1. SIRTs en cáncer ............................................................................................................................12 2.2.2. PARPs en cáncer ..........................................................................................................................13 2.2.3. cADPRSs en cáncer ....................................................................................................................14 2.2.4. NAPRT en cáncer ........................................................................................................................14 2.3. NAMPT como estrategia terapéutica ............................................................................................15 3. Células Madre del Cáncer (CSCs) ..............................................................................................................18 4. Cáncer de Cabeza y Cuello (CCyC) ...........................................................................................................19 4.1 Tratamiento y CSCs en CCyC............................................................................................................21 OBJETIVOS .................................................................................................................................... 25 MATERIALES Y METODOS ............................................................................................................ 29 1. Técnicas de Biología Molecular .................................................................................................................31 1.1. Reactivos biológicos utilizados .......................................................................................................31 1.1.1. Plásmidos y cebadores .............................................................................................................31 1.1.2. Antibióticos ...................................................................................................................................32 1.1.3. Cepas bacterianas .......................................................................................................................32 1.2. Transformación de células quimiocompetentes ......................................................................32 1.3. Extracción de ADN plasmídico ........................................................................................................32 1.4. Extracción de ADN genómico ..........................................................................................................32 Índice II 1.5. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ..............................................................................33 1.6. Purificación del ADN a partir de un gel de agarosa o producto de PCR .......................33 1.7. Secuenciación .........................................................................................................................................33 1.8. Clonación de plásmidos .....................................................................................................................33 1.8.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del plásmido donador .....................33 1.8.2. Clonación TA ................................................................................................................................34 1.8.3. Digestión de ADN con enzimas de restricción ...............................................................34 1.8.4. Ligación ..........................................................................................................................................35 2. Cultivos Celulares ............................................................................................................................................35 2.1. Líneas celulares ......................................................................................................................................35 2.2. Cultivo y conservación de las líneas celulares ...........................................................................35 2.3. Transfección de células.......................................................................................................................35 2.3.1. Transfección mediante el kit comercial TransIt-X2 (Mirus) ........................................35 2.3.2. Transfección con polietilenimina (PEI) ...............................................................................36 2.3.3. Selección de células transfectadas ......................................................................................36 2.4. Técnica CRISPR-Cas9 ...........................................................................................................................36 2.4.1. Infección lentiviral ......................................................................................................................36 2.4.2. Generación y selección de los clones de CRISPRs.........................................................37 2.4.3. Secuenciación de los clones de CRISPRs ..........................................................................37 3. Ensayos Celulares ............................................................................................................................................38 3.1. Ensayos de metabolismo ...................................................................................................................38 3.1.1. Precursores e inhibidores de NAD+.....................................................................................38 3.1.2. Ensayo de ciclación de NAD+.................................................................................................38 3.1.3. Ensayos en condiciones limitantes de nutrientes ..........................................................39 3.2. Ensayos funcionales de tumorigénesis ........................................................................................39 3.2.1. Ensayo de proliferación ............................................................................................................39 3.2.2. Ensayo de clonabilidad.............................................................................................................39 3.2.3. Análisis y clasificación de los tipos de clones .................................................................39 3.2.4. Ensayo de formación de tumoresferas ..............................................................................40 3.2.5. Ensayo de formación de tumoresferas a partir de una célula aislada ...................40 3.2.6. Ensayo de migración de la Cámara de Boyden ..............................................................40 3.2.7. Ensayo de citotoxicidad ...........................................................................................................41 3.2.8. Ensayo de competición ............................................................................................................41 3.3. Análisis de marcadores por citometría de flujo ........................................................................41 3.3.1. Anticuerpos de citometría .......................................................................................................42 3.3.2. Citometría de flujo (FACS) .......................................................................................................42 3.3.3. Separación celular ( Sorting ) ...................................................................................................42 4. Ensayos in vivo .................................................................................................................................................43 4.1 Generación de xenotransplantes ....................................................................................................43 Índice III 4.1.1 Generación de xenotransplantes a partir de células tumorales ...............................43 4.1.2 Generación de xenotransplantes a partir de tumoresferas .......................................43 4.1.3 Generación de xenotransplantes a partir de células sorteadas por citometría .43 4.2 Tratamientos con inhibidores tumorales ....................................................................................44 4.3 Necropsias ...............................................................................................................................................44 5. Técnicas de análisis de expresión a nivel de ARN .............................................................................44 5.1. Extracción de ARN total .....................................................................................................................44 5.2. Transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) ........................45 5.3. PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) .........................................................................................45 5.4. PCR “array” ..............................................................................................................................................46 6. Técnicas de análisis de expresión a nivel de proteínas ...................................................................47 6.1. Anticuerpos para proteínas ..............................................................................................................47 6.2. Extracción de proteínas total ...........................................................................................................47 6.3. Western-blot ...........................................................................................................................................48 6.4. Cuantificación de bandas de Western-blot ................................................................................48 7. Secuenciación NGS ........................................................................................................................................48 8. Análisis de bases de datos ..........................................................................................................................48 9. Análisis estadístico .........................................................................................................................................49 RESULTADOS ................................................................................................................................. 51 1. Estudio de las propiedades de célula madre de las subpoblaciones CSC en CCyC ............53 1.1. Marcador CD10 ......................................................................................................................................53 1.2. Marcador CD184 ...................................................................................................................................55 1.3. Marcador CD133 ...................................................................................................................................57 1.4. Marcador CD19 ......................................................................................................................................59 1.5. Marcador CD166 ...................................................................................................................................60 1.6. Plasticidad celular entre los distintos marcadores ..................................................................61 1.7. NAMPT, un nuevo marcador ............................................................................................................63 2. Estudio del papel funcional de NAMPT en líneas celulares de CCyC ........................................66 2.1. Efecto de reducción de los niveles de NAMPT en líneas celulares de CCyC.................66 2.2. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en el fenotipo de célula madre en líneas celulares de CCyC ..............................................................................................................................70 2.3. Efecto de los niveles de NAMPT en la migración celular en líneas celulares de CCyC 78 2.4. Efecto de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en CCyC ...................................80 3. NAMPT como diana terapéutica en CCyC .............................................................................................85 4. Estudio del papel de NAMPT en la biosíntesis y metabolismo de NAD+ en CCyC ..............89 DISCUSIÓN .................................................................................................................................... 99 CONCLUSIONES .......................................................................................................................... 115 CONCLUSIONS ............................................................................................................................ 119 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................. 123 Índice IV ANEXO: CONTRIBUCIONES CIENTÍFICAS DURANTE LA ETAPA DE DOCTORADO .............. 137 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) ........................................................... 3 Figura 2. NAD+ en el metabolismo del cáncer ..................................................................................................... 7 Figura 3. Biosíntesis de NAD+...................................................................................................................................... 9 Figura 4. Estructura del gen y la proteína NAMPT ............................................................................................11 Figura 5. Biología molecular del Cáncer de Cabeza y Cuello .......................................................................20 Figura 6. Propiedades de célula madre tumorales de la subpoblación CD10 en CCyC. ...................54 Figura 7. Propiedades de célula madre tumorales de la subpoblación CD184 en CCyC. .................56 Figura 8. Propiedades de célula madre tumorales de la subpoblación CD133 en CCyC. .................58 Figura 9. Propiedades de célula madre tumorales de la subpoblación CD19 en CCyC. ...................59 Figura 10. Propiedades de célula madre tumorales de la subpoblación CD166 en CCyC. ..............61 Figura 11. Plasticidad celular de las subpoblaciones CSC en CCyC. ..........................................................62 Figura 12. Análisis transcriptómico de genes comunes a CD10, CD184 y CD19. .................................63 Figura 13. NAMPT, un marcador común de célula madre tumoral en CCyC. ........................................64 Figura 14. Supervivencia global de pacientes con CCyC de la base de datos TCGA. .........................65 Figura 15. Generación y validación de los CRISPRs de NAMPT en las líneas celulares CCyC..........67 Figura 16. Simulación de la secuenciación de los clones de los CRISPRs de NAMPT en las líneas celulares de CCyC. ..........................................................................................................................................................68 Figura 17. Efecto de los CRISPRs de NAMPT en la capacidad proliferativa y la capacidad de formación de clones en las líneas celulares de CCyC. .....................................................................................69 Figura 18. Efecto de los CRISPRs de NAMPT en la capacidad de competición en las líneas celulares de CCyC. .............................................................................................................................................................................69 Figura 19. Efecto de los CRISPRs de NAMPT en el crecimiento tumoral in vivo en xenotransplantes de las líneas celulares de CCyC. ................................................................................................................................70 Figura 20. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en el fenotipo de los tipos de clones en las líneas celulares de CCyC. .................................................................................................................71 Figura 21. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en la formación de tumoresferas en las líneas celulares de CCyC. ................................................................................................................................72 Figura 22. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en la expresión de genes relacionados con el fenotipo de célula madre tumoral en las líneas celulares de CCyC. .................73 Índice V Figura 23. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en la expresión de los genes marcadores de CSC en las líneas celulares de CCyC. .......................................................................................74 Figura 24. Análisis transcriptómico de genes comunes a CD10, CD184 y CD19 en las líneas celulares de CCyC ...........................................................................................................................................................76 Figura 25. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en el crecimiento tumoral in vivo en xenotransplantes de tumoresferas de las líneas celulares de CCyC. ...................................................77 Figura 26. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en la capacidad de migración en las líneas celulares de CCyC. ......................................................................................................................................78 Figura 27. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en la expresión de genes relacionados con la transición epitelio-mesénquima en las líneas celulares de CCyC. .....................79 Figura 28. Análisis de genes relacionados con la transición epitelio-mesénquima en las líneas celulares de CCyC y la base de datos TCGA. .......................................................................................................80 Figura 29. Validación de los modelos de sobreexpresión de las variantes de NAMPT en las líneas celulares de CCyC. ..........................................................................................................................................................81 Figura 30. Validación de la actividad biológica de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en las líneas celulares de CCyC. ................................................................................................................................82 Figura 31. Efecto de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en la capacidad proliferativa en las líneas celulares de CCyC. ......................................................................................................................................83 Figura 32. Efecto de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en la capacidad de formación de clones y en el fenotipo de los mismos, en las líneas celulares de CCyC. ..........................................84 Figura 33. Efecto de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en la formación de tumoresferas en las líneas celulares de CCyC. ................................................................................................................................84 Figura 34. Comprobación del efecto biológico de los inhibidores de NAMPT y NAPRT en las líneas celulares CCyC. ................................................................................................................................................................85 Figura 35. Efecto de citotoxicidad de los inhibidores de NAMPT en la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en las líneas celulares de CCyC. .........................................................................................................86 Figura 36. Efecto de citotoxicidad de los inhibidores de NAMPT en combinación con cisplatino y docetaxel en las líneas celulares de CCyC. ...........................................................................................................87 Figura 37. Efecto del tratamiento de los inhibidores de NAMPT en monoterapia y en combinación con cisplatino y docetaxel en el crecimiento tumoral in vivo en xenotransplantes en las líneas celulares de CCyC. ..........................................................................................................................................................88 Figura 38. Recuperación de la tasa de proliferación de los CRISPRs de NAMPT durante la curva de crecimiento en las líneas celulares de CCyC. ......................................................................................................90 Summary XII that are currently used as treatment for HNSCC. Adjuvant treatment of NAMPT inhibitors potentiates the antitumor effect of cisplatin and, especially docetaxel, both in vitro and in vivo . Although CRISPRs cells have reduced levels of NAMPT expression and NAD+ pool, they still offer resistance in some tumorigenic properties, for example cell proliferation. The resistance mechanism is different in the two cell lines. NAMPT CRISPRs of RPMI-2650 cell line increase growth rate by activating NAPRT enzyme of the Preiss-Handler pathway, while NAMPT CRISPRs of Detroit-562 cell line increase the proliferation by the promotion of the remaining NAMPT activity. The activation of the Preiss-Handler pathway, through its substrate administration, increases some tumorigenic properties of NAMPT CRISPRs, while the enzymatic inhibition of this pathway reduces these properties. NAMPT CRISPRs can recover the NAD+ pool through the exogenous administration of NAD+ precursors, such as nicotinic acid (NA), nicotinamide riboside (NR) and nicotinamide (NAM). Interestingly, we have observed that NAM is able to bypass the salvage pathway catalyzed by NAMPT and use the alternative Preiss-Handler pathway to generate NAD+. Additionally, we have studied how the nutrient availability in the environment can affect NAMPT CRISPRs cells. INTRODUCCIÓN Introducción 3 1. Nicotinamida Adenina Dinucleótido (NAD+) Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) es un metabolito muy abundante que juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis celular. NAD+ actúa como un cofactor en múltiples reacciones de reducción-oxidación (redox) implicadas en diversos procesos de producción de energía como la glucólisis, el ciclo de Krebs, la fosforilación oxidativa, la oxidación de ácidos grasos y la biosíntesis de serina.1-3 La molécula de NAD+ es un dinucleótido compuesto por adenosín monofosfato (AMP) unida a través de un grupo fosfato a nicotinamida mononucleótida (NMN) que, éste a su vez, está formado por un grupo fosfato, un anillo de ribosa y nicotinamida.1,4 Las propiedades electroquímicas de la fracción de nicotinamida son responsables de las funciones clásicas redox atribuidas a NAD+. De modo que, el grupo nicotinamida es capaz de aceptar un anión hidruro (H+, 2e-) dando lugar a la forma reducida de la molécula, NADH. Por el contrario, NADH puede oxidarse a NAD+ mediante la donación de ese anión hidruro.1,5,6 Alternativamente, el anillo ribosa de la fracción AMP de NAD+ puede ser fosforilado por la enzima NAD quinasa (NADK) dando lugar a nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) que también puede reducirse a NADPH.1,7 Todas las formas de NAD (NAD+, NADH, NADP+, NADPH) actúan como aceptores y donadores de electrones en múltiples reacción redox en la célula. (Figura 1) Figura 1. Estructura de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+). La molécula es un dinucleótido formado por adenosín monofosfato (AMP) unido a nicotinamida mononucleótida (NMN). AMP está compuesto por una base de adenina (en verde), un anillo de ribosa (en azul) cuyo hidroxilo en rojo puede ser fosforilado dando lugar a NADP+, y un grupo fosfato (en amarillo). NMN está formado por un grupo fosfato, un anillo de ribosa y nicotinamida (NAM) (en rosa) cuyo átomo marcado en rojo es capaz de aceptar un anión hidruro (H+, 2e-) dando lugar a la forma reducida NADH. Además, NAD+ es un donador de ADP- ribosa (línea discontinua gris). Introducción 4 Aunque la forma oxidada, NAD+, es la más abundante y ubicua en las células, su disponibilidad puede variar dependiendo de varios factores, tales como el compartimento subcelular, el tipo celular, los niveles de glucosa, la ingesta y restricción calórica, el ejercicio, el envejecimiento y los ciclos circadianos. Por ejemplo, se ha observado que las concentraciones de NAD+ en el citosol y en el núcleo son bastante similares (aproximadamente 100 M) porque ambos compartimentos están interconectados, mientras que el contenido de NAD+ en las mitocondrias es mucho mayor (aproximadamente 250-500 M) ya que la membrana mitocondrial es impermeable a NAD+ y NADH. Esta impermeabilidad asegura una rápida regulación local de los procesos fisiológicos dependientes de NAD+.1,8,9 Además, la concentración de NAD+ puede oscilar a lo largo del día bajo una regulación circadiana. El complejo CLOCK:BMAL1 activa el promotor de la enzima NAMPT, que es clave en la biosíntesis de NAD+, aumentando así la producción de NAD+ cada 24 horas. Por otra parte, SIRT1, una enzima consumidora de NAD+, contrarresta este efecto mediante la desacetilación de BMAL1 y las histonas de promotores de otros genes reguladores.1,10-12 1.1. Funciones Redox de NAD+ Inicialmente, a NAD+ se le atribuyó el papel de transportador universal de electrones en las reacciones redox de los procesos catabólicos para la obtención de energía en las células. La glucólisis, por ejemplo, requiere de la reducción de NAD+ a NADH para permitir la oxidación de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en el citosol. Cada molécula de glucosa dará lugar a 2 moléculas de NADH, 2 moléculas de ATP y 2 moléculas de piruvato. Dependiendo de la disponibilidad del oxígeno, el piruvato puede optar por reducirse a lactato u oxidarse a acetil- CoA. Bajo condiciones anaeróbicas, la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) reduce el piruvato a lactato utilizando NADH como cofactor el cual se oxida regenerando NAD+. En cambio, cuando hay disponibilidad de oxígeno, el piruvato se oxida a acetil-CoA junto con la reducción de NAD+ a NADH.1-3,8 Otra fuente de acetil-CoA es la que se genera mediante la oxidación de ácidos grasos, proceso que requiere también la reducción de NAD+.1,13 En la mitocondria, acetil-CoA entra en el ciclo de Krebs generando 8 moléculas de NADH. Todo el NADH mitocondrial se oxida al donar sus electrones al complejo I, también llamado NADH:ubiquinona oxidorreductasa, de la cadena de transporte de electrones. Estos electrones van pasando secuencialmente desde el complejo I a ubiquinona, complejo II, citocromo C, y complejo IV dando lugar a la reducción del oxígeno al agua. Este flujo de electrones genera un gradiente de protones en el espacio de la membrana interna mitocondrial lo que da lugar finalmente a la producción de 30 moléculas de ATP.1-3,8 Sin embargo, también se genera una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden ocasionar serios daños oxidativos, los cuales se pueden reducir mediante el sistema antioxidante formado por SODs, catalasas, MAPKS, SIRTs, GSH y las vitaminas C y E. Dado que el ciclo de Krebs y la cadena de transporte de electrones requieren de NAD+ y NADH, respectivamente, es necesario un ratio NAD+/NADH óptimo para un metabolismo mitocondrial eficiente.1,14,15 Introducción 5 Al contrario que NAD+, la forma fosforilada, NADP+, es necesaria para los procesos anabólicos, incluyendo la síntesis de los ácidos nucleicos a través de la ruta de la pentosa fosfato.1,16,17 Además, su forma reducida, NADPH, es esencial para disminuir los niveles ROS. De hecho, muchas proteínas antioxidantes dependen de NADPH como cofactor, por ejemplo, la reducción de glutatión disulfuro (GSSG) a glutatión (GSH) requiere NADPH generado durante el primer paso de la ruta de la pentosa fosfato donde la glucosa-6-fosfato se convierte en 6-P-gluconato.1,17 El mantenimiento de la homeostasis redox intracelular es un proceso celular esencial que requiere un equilibrio entre la generación y eliminación de ROS. Esta regulación es especialmente importante en las células tumorales, las cuales, generalmente, tienen una mayor producción de ROS y necesitan un control más estricto de este equilibrio.1,18-20 NADPH también es un cofactor importante en la síntesis de los ácidos grasos, los cuales son necesarios para la formación de la membrana durante la proliferación celular, usando acetil-CoA como precursor.1,3 (Figura 2) 1.2. Funciones no-redox: NAD+ como sustrato NAD+ y NADH se pueden interconvertir entre si de una manera casi ilimitada sin ser apenas consumidas.1,5 Por lo que, en teoría, debería haber la misma cantidad de NAD+ que de NADH en las células, sin embargo, la realidad es bastante distinta. NAD+ es aproximadamente 600-1100 veces más abundante que NADH,1,21 esto es debido a que NAD+ participa en muchos otros procesos moleculares no-redox, como por ejemplo la reparación del ADN, señalización celular, modificaciones post-traduccionales, metabolismo mitocondrial, respuestas inflamatorias, senescencia y apoptosis.1,2,4,6,17,22,23 En estas reacciones no-redox, NAD+ es consumida como sustrato por diferentes tipos de enzimas, incluyendo las familias SIRTs, PARPs y cADPRSs. Estas enzimas utilizan NAD+ como donador de ADP-ribosa y liberan nicotinamida (NAM) como producto catabólico.1,7,24 La familia de las sirtuinas (SIRTs) son unas enzimas deacetilasas dependientes de NAD+ que eliminan los grupos acetilos de los residuos de lisina de las histonas y otras proteínas, generando o-acetil-ADP-ribosa y nicotinamida (NAM).1,24-26 La familia poli-(ADP-ribosa) polimerasas (PARPs) se localiza en el núcleo donde interviene en muchos procesos biológicos, como la reparación del ADN, regulación transcripcional y metabolismo, transfiriendo largas cadenas de polímeros de ADP-ribosa a sus proteínas diana.1,22,23,25 Las ectoenzimas CD38, CD157, CD39 y CD73 pertenecen a la familia ADP-ribosa ciclasas (cADPRSs) que consumen NAD+ y NADP+ generando, respectivamente, ADP-ribosa cíclicas (cADPRs) y fosfato de dinucleótido de adenina de ácido nicotínico (NAADP), los cuales actúan como mensajeros secundarios de la señalización del calcio.1,21,25,27 SIRTs, PARPs y cADPRSs son capaces de corregularse entre ellos compitiendo por el mismo contenido NAD+ intracelular. Por ejemplo, SIRT1 puede desacetilar e inhibir a PARP1, aumentando así los niveles de NAD+, mientras que PARP2 inhibe la transcripción de las SIRTs.1,21,24,25 La importancia del papel de NAD+ en las reacciones no-redox se han establecido recientemente y, por consiguiente, NAD+ ha sido propuesto como la unión entre el metabolismo y la señalización en muchos procesos fisiológicos y en enfermedades.1,9 Introducción 6 1.3. NAD+ en el metabolismo del cáncer Las células cancerosas presentan la habilidad de reprogramar su metabolismo para permitir la alta tasa de crecimiento y producción de biomasa, incluso con recursos limitados de energía y otras condiciones adversas. Esta ventaja darwiniana permite la progresión, desarrollo y supervivencia del tumor.28 En las células tumorales se han encontrado mayores tasas NAD+/NADH y NADP+/NADPH que en las células no-tumorales, lo que sugiere un importante papel de NAD+ en esta conversión metabólica.1,29 Las células tumorales son capaces de cambiar el metabolismo de fosforilación oxidativa (OXPHOS) a glucólisis, incluso en condiciones normales de oxígeno, creando un estado pseudohipóxico conocido como el efecto Warburg.1,30,31 A pesar de que el metabolismo OXPHOS genera energía de una manera más eficiente, 36 moléculas de ATP, las células tumorales prefieren la glucólisis que genera menos energía, 2 moléculas de ATP, pero de una forma más acelerada. Esta producción rápida de energía confiere una ventaja competitiva a la hora de compartir los nutrientes limitados con las células del estroma.1,32,33 Pero, ésta no es la única ventaja de la glucólisis anaeróbica, sino que también permite a las células tumorales sintetizar macromoléculas y contrarrestar la producción de ROS. De hecho, parte del piruvato que se forma se oxida a acetil-CoA para entrar en el ciclo de Krebs, no para obtener ATP sino para producir los compuestos intermediarios del ciclo y usarlos como precursores biosintéticos. Al mismo tiempo que se consumen estos compuestos, se deben reabastecer principalmente a través del metabolismo de la glutamina, que es el aminoácido más abundante en las células y la principal fuente de nitrógeno. Las células tumorales dependen de la glutaminolisis para la síntesis de otros aminoácidos no esenciales, GSH, NAD+, NADPH y ácidos nucleicos.1,31,33-35 Algunos intermediarios de la glucólisis están involucrados en otras rutas que se encuentran altamente activadas en cáncer. Una de esas rutas es la de la pentosa fosfato que es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos, la replicación del ADN, y consecuentemente, el incremento de la producción de la biomasa.1,31,36 Además, es la principal fuente de NADPH que es requerido para contrarrestar el estrés oxidativo producido por el metabolismo acelerado, la inducción de hipoxia y la acumulación del daño en el ADN en las células tumorales. La radio y quimioterapia favorecen este daño oxidativo aumentando los niveles de ROS y, en respuesta a este estrés, los factores oncogénicos ATM, Ras, PI3K/Akt/mTOR y Src inducen la expresión de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), activando la ruta de la pentosa fosfato.1,16,36 Otra ruta dependiente de la glucólisis es la síntesis de la serina, la cual ha sido encontrada incrementada en cáncer y también es dependiente de NAD+. La serina es un precursor de la glicina y cisteína y está involucrada en el metabolismo de la metionina y ácido fólico, transporte de aminoácidos, metilación de ADN e histonas y equilibrio redox en la célula.1,37,38 El metabolismo de las células tumorales depende principalmente de la ruta de la pentosa fosfato, la biosíntesis de la serina y la síntesis de los ácidos grasos. Estas rutas metabólicas, las cuales son dependientes de NAD+ y NADP+, emergen de la glucólisis, convirtiendo el efecto Warburg en el principal impulsor del metabolismo del cáncer.1 (Figura 2) Introducción 7 Figura 2. NAD+ en el metabolismo del cáncer. Las células tumorales dependen más de la glucólisis (en azul) que en OXPHOS de la mitocondria (en negro discontinuo), lo que se conoce como el efecto Warburg. La ruta de la pentosa fosfato (en morado), la biosíntesis de la serina (en verde) y la síntesis de los ácidos grasos (en rojo) están altamente activados en cáncer y dependen de la glucólisis, siendo éste el eje del metabolismo del cáncer. La glutaminolisis (en marrón) también está incrementada como la principal fuente de nitrógeno en la célula. En todas estas rutas participan los cofactores NAD+/NADH y NADP+/NADPH, permitiendo la producción rápida de energía, la eliminación del exceso de ROS y la síntesis de macromoléculas para soportar la proliferación y desarrollo tumoral. Figura adaptada de Navas y Carnero, 2021.1 1.4. Biosíntesis de NAD+ Para satisfacer las exigentes demandas de NAD+ de los procesos redox y no-redox, las células de los mamíferos deben sintetizar NAD+ a partir de precursores de la dieta, como son el triptófano y las diferentes formas de la vitamina B3 (ácido nicotínico, nicotinamida y nicotinamida ribósido). Estos precursores son compuestos esenciales que se deben tomar de la dieta para la síntesis de NAD+. De hecho, una deficiencia crónica de estos precursores puede producir la enfermedad de la pelagra cuyos síntomas son diarrea, dermatitis, demencia, daño neurológico e incluso la muerte. Curiosamente, el papel esencial de NAD+ en las células se descubrió cuando se estaba investigando el tratamiento contra la pelagra en los años 20.1,3,21 A partir de estos precursores, las células sintetizan NAD+ a través de tres vías diferentes: la ruta de novo , la ruta Preiss-Handler y la ruta de nucleósido. Adicionalmente, las células pueden reciclar el producto catabólico liberado por las enzimas consumidoras de NAD+ (SIRTs, PARPs y cADPRs) y reconstituir la molécula a través de la ruta de rescate o the salvage pathway , siendo esta opción la favorita de las células.1,8-11,39 (Figura 3) Introducción 8 1.4.1. Ruta De novo (De novo pathway) NAD+ puede sintetizarse de novo a partir del triptófano (Trp) que es un aminoácido esencial que debe incorporarse diariamente a través de la dieta. En humanos, esta ruta, también llamada ruta de quinurenina, se produce principalmente en el hígado y consta de varios pasos.1,9 El metabolito limitante es el ácido quinolínico (QA). Su precursor, semialdehído del ácido 2-amino- 3-carboximucónico (ACMS), puede elegir entre oxidarse al ácido picolínico (PA) mediante la enzima semialdehído del ácido 2-amino-3-carboximucónico descarboxilasa (ACMSD), o bien entrar en una ciclación espontánea dando lugar a QA. El compuesto QA solamente se forma cuando la enzima ACMSD se satura. Una vez formado, QA entra en la vía Preiss-Handler mediante la enzima quinolinato fosforribosiltransferasa (QPRT) para continuar la síntesis de NAD+.1,3,7 Por otra parte, el Trp también es requerido para la síntesis de otras moléculas esenciales, como serotonina y melatonina. Aproximadamente sólo el 1,66% del Trp de la dieta es usado para la biosíntesis de NAD+. Esta baja eficiencia explica por qué la ruta de novo no es la principal fuente de NAD+ en humanos.1,3 1.4.2. Ruta Preiss-Handler ( The Preiss-Handler pathway ) NAD+ puede sintetizarse a partir del ácido nicotínico (NA), también llamada niacina, de la dieta. Ácido nicotínico fosforribosiltransferasa (NAPRT) es la enzima limitante de esta ruta y cataliza la conversión de NA en el compuesto intermediario ácido nicotínico mononucleotido (NAMN). En consecuencia, NAMN se convierte en ácido nicotínico adenina dinucleótido (NAAD) mediante la enzima nicotinamida mononucleótida adenililtransferasa (NMNAT).1,3 Finalmente, la enzima NAD sintetasa (NADSYN) utiliza la glutamina como donador del grupo amida para amidar NAAD y formar NAD+.1,40 1.4.3. Ruta de rescate ( The salvage pathway ) Teniendo en cuenta que la vida media de NAD+ es de aproximadamente 4-10 horas y que la ingesta media diaria de vitamina B3 es de 15 mg no llegando a cubrir las necesidades fisiológicas (por ejemplo, el hígado necesita aproximadamente 8 g al día), a las células no les queda otra opción que recomponer la molécula NAD+ a través de la ruta de rescate o the salvage pathway .1,3,16 Nicotinamida (NAM), el producto catabólico que liberan las enzimas consumidoras de NAD+, es reciclada en dos etapas. La primera etapa es la reacción limitante de esta ruta y es catalizada por la enzima nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT) que convierte NAM en nicotinamida mononucleótida (NMN) en presencia de magnesio (Mg2+) y fosforribosil pirofosfato (PRPP). En la segunda etapa, la enzima NMNAT reconstituye NAD+ a partir de NMN.1,41-45 Esta ruta de rescate es la principal fuente de NAD+ en las células de los mamíferos debido a la alta eficiencia de producción, menos del 1% de NAD+ se pierde al día al reciclarse. Esto explica por qué las células dependen completamente de esta ruta.1,3,7,44,45 Introducción 9 1.4.4. Ruta de nucleósido ( The Nucleoside Pathway ) Ácido nicotínico ribósido (NAR) y nicotinamida ribósido (NR) son otros precursores de NAD+ que se adquieren de la dieta. Una vez que llegan al organismo, la enzima quinasa nicotinamida ribosa (NRK) se encarga de fosforilar a NAR dando lugar a NAMN (intermediario de la ruta Preiss- Handler ) y a NR convirtiéndolo directamente a NMN, saltándose la reacción limitante catalizada por NAMPT de la ruta de rescate.1,7 Hasta hace poco se pensaba que la membrana celular era impermeable a NMN extracelular generado por NAMPT extracelular y CD38. Por lo que NMN debía primero desfosforilarse a NR por la enzima CD73 y, luego, NR entraba en la célula a través de los transportadores de nucleósidos equilibrativos (ENTs).1,3 Sin embargo, Grozio y colaboradores recientemente identificaron un transportador de NMN en la membrana celular al que llamaron Slc12a8.1,46,47 Figura 3. Biosíntesis de NAD+. Las células pueden sintetizar NAD+ a partir de diferentes precursores que se adquieren de la dieta a través de la ruta de novo (a partir de Trp), la ruta Preiss-Handler (a partir de NA) y la ruta de nucleósido (a partir de NAR o NR). Sin embargo, la mayor fuente de NAD+ de las células es la ruta de rescate o the salvage pathway donde el producto catabólico NAM liberado por las enzimas consumidoras de NAD+ (SIRTs, PARPs y cADPRs), es reciclado para constituir de nuevo la molécula NAD+. Figura adaptada de Navas y Carnero, 2021.1 Introducción 16 contenido NAD+ mitocondrial, por lo que, las células tumorales podrían ser más sensibles que las células no-tumorales.1,63 Además, la citotoxicidad de FK866 parece ser mayor en algunos tipos de tumores que expresan mayores niveles de NAMPT y que son relativamente más dependientes de la glucólisis.1,76,95 Desde 2007, FK866 se encuentra en fase 2 en ensayos clínicos (clinicaltrials.gov; NCT00435084, NCT00431912, NCT00432107). Para paliar los efectos adversos de FK866, se han probado a dosis subóptimas en combinación con otros fármacos, como por ejemplo sirtinol (inhibidor de SIRT1) y olaparib (inhibidor de PARP1).1,42,43,45 Otro inhibidor específico de NAMPT muy estudiado es GMX1778/CHS-828 que se administra por vía oral. El profármaco GMX1777 es un compuesto cianoguanidina que rápidamente se convierte en su forma activa GMX1778, el cual actúa tanto de inhibidor como de sustrato. GMX1778 fosforilado por NAMPT se acumula dentro de las células tumorales potenciando su efecto antitumoral.1,90 GMX1778 estuvo en fase 1 de ensayos clínicos de tumores sólidos (clinicaltrials.gov; NCT00003979), sin embargo, fue retirado debido a sus efectos tóxicos, principalmente trombocitopenia y síntomas gastrointestinales.103 La siguiente generación de inhibidores presentaron mejores propiedades farmacológicas y una mayor especificidad contra su diana NAMPT. Entre ellos se encuentra GNE617 que es una molécula pequeña que se administra por vía oral y que ha resultado ser muy eficaz in vivo , siendo capaz de reducir el crecimiento de xenotransplantes deficientes en NAPRT.1,104,105 STF-31 es otro inhibidor que es capaz de atacar selectivamente a las células de carcinoma renal deficientes del gen supresor de tumores von Hippel-Lindau (VHL). Además de NAMPT, el compuesto STF-31 inhibe al transportador de glucosa GLUT1, este efecto inhibidor adicional puede ser beneficioso para desencadenar la muerte celular en aquellos tumores con una alta tasa de consumo de glucosa.1,106,107 Sin embargo, STF-31, GNE617 y otros inhibidores de la segunda generación no han entrado en ensayos clínicos debido a su toxicidad, que incluye principalmente toxicidad hematopoyética, cardiaca y retiniana en roedores.1,108,109 La depleción total de NAD+ puede ser muy tóxica para las células no-tumorales, por lo que se ha considerado usar precursores de NAD+ (por ejemplo, ácido nicotínico) como coadyuvante.1,64,89 Varios estudios observaron que la coadministración de ácido nicotínico (NA) con algunos inhibidores de NAMPT (GMX1778, GNE617, LSN3154567 y STF-31) ayuda a prevenir los efectos tóxicos, no obstante, el efecto inhibitorio del fármaco se vio suprimido en tumores NAPRT positivos. Por consiguiente, se ha propuesto la coadministración de NA e inhibidores de NAMPT como una nueva estrategia terapéutica, pero sólo en tumores deficientes en NAPRT.1,90,107,110 Recientemente, un nuevo inhibidor de NAMPT, KPT-9274/ATG-019, ha entrado en la fase 1 de ensayos clínicos en pacientes con tumores sólidos avanzados o linfoma de Hodgkin (clinicaltrials.gov; NCT04281420, NCT02702492). Inicialmente, KPT-9274 fue descubierto como un inhibidor de la proteína PAK4, la cual está involucrada en varias rutas de señalización oncogénicas, como por ejemplo Erk, Akt, Ras/MAPK y Wnt/β-catenina. Más tarde, se observó que KPT-9274 también era capaz de inhibir NAMPT, por lo que se ha propuesto como un fármaco candidato en tumores que expresen altos niveles de PAK4 y NAMPT.1,111-114 Introducción 17 Tabla 1. Inhibidores de NAMPT en ensayos clínicos. Tabla traducida de Navas y Carnero, 2021.1 Inhibidor de NAMPT Identificación en CLINICALTRIALS.GOV Fecha inicio del estudio Descripción Resultados KPT-9274/ ATG-019 NCT04281420 2020 (reclutando) Fase 1. Estudio abierto de seguridad y tolerabilidad de ATG- 019/KPT-9274, un inhibidor doble de PAK4 y NAMPT, en pacientes con tumores sólidos avanzados o linfoma de Hodgkin - NCT02702492 2016 (reclutando) Fase 1. Estudio abierto de seguridad y tolerabilidad de ATG- 019/KPT-9274, un inhibidor doble de PAK4 y NAMPT, en pacientes con tumores sólidos avanzados o linfoma de Hodgkin - OT-82 NCT03921879 2019 (reclutando) Fase 1: Seguridad y eficacia de OT-82 en pacientes con linfoma en recaída o refractario - APO866/ FK866 NCT00435084 2007 (completado) Fase 1/2: Estudio para evaluar la seguridad y tolerabilidad de APO866 para el tratamiento de B-CLL refractaria El tratamiento fue seguro y bien tolerado. DLT fue tombocitopenia. Se observó una disminución de los niveles de VEGF en suero 96 horas después del inicio del tratamiento en MTD. Sin respuesta tumoral objetiva. Sin embargo, 4 pacientes de 24 tenían enfermedad estable. Se observó una reducción del tamaño del 80% NCT00431912 2007 (completado) Fase 2. Un estudio de APO866 para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T. NCT00432107 2006 (completado) Fase 2. Un estudio para evaluar APO866 para el tratamiento del melanoma avanzado. CHS-828/ GMX1778 NCT00003979 1999 (retirado) Fase 1. CHS-828 en el tratamiento de pacientes con tumores sólidos Toxicidad crítica. Trombocitopenia y síntomas gastrointestinales GNE617 - - - - STF-31 - - - - STF-118804 - - - - LSN3154567 - - - - CB-300919 - - - - DLT: toxicidad limitante de dosis; DMT: dosis máxima tolerada https://clinicaltrials.gov/ct2/home Introducción 18 OT-82 es otro nuevo inhibidor de NAMPT que ha dado mejores resultados en neoplasias hematológicas que en tumores sólidos. OT-82 favorece la eficacia de otros fármacos como citarabina y dasatinib. Los estudios preclínicos en ratones y primates no-humanos indicaron que OT-82 fue bien tolerado y no mostró toxicidad cardiaca, neurológica ni retiniana. La resistencia a este fármaco se relacionó con una alta expresión de CD38 en células de leucemia linfocítica aguda.1,115,116 Actualmente, OT-82 se encuentra en fase 1 de ensayos clínicos para evaluar la seguridad y eficacia en pacientes con linfoma en recaída o refractario (clinicaltrials.gov; NCT03921879). 3. Células Madre del Cáncer (CSCs) Los tumores son entidades altamente heterogéneas que están organizadas jerárquicamente en diferentes subgrupos de células tumorales. En la cúspide de esta jerarquía se encuentra una pequeña subpoblación de células capaces de autorrenovarse y diferenciarse en los distintos tipos de células que componen el tumor, son las llamadas células madre del cáncer (CSCs, del inglés Cancer Stem Cells ). Al igual que las células madre normales, estas células tienen la capacidad de autorrenovación y diferenciación, pero lo hacen de manera descontrolada. Las CSCs no sólo son responsables de la iniciación y progreso tumoral, sino también de la metástasis y resistencia a las terapias. CSCs pueden originarse a partir de células madre normales o bien de células tumorales diferenciadas que son capaces de adquirir capacidades de célula madre a través de mecanismos de desdiferenciación.1,117-120 El proceso de desdiferenciación es similar al proceso de reprogramación de células somáticas en células pluripotentes inducidas (iPSCs), el cual se produce a través de la activación de algunos factores de transcripción, como los llamados factores de Yamanaka (OSKM) que incluyen OCT3/4, SOX2, KLF4 y c-MYC.1,121 La capacidad de interconversión entre ambos fenotipos, células diferencias y células madre/pluripotente, se conoce como plasticidad celular. El microambiente celular y algunas vías de señalización activan y regulan esta plasticidad celular. Algunas de las principales vías que regulan a las CSCs son: Notch, Hippo, SHH, PI3K, WNT y NF-B.117,120,122 Tanto CsCs como iPSCs activan el efecto Warburg lo que induce el estado hipóxico necesario para el mantenimiento del fenotipo de célula madre. Por lo que el término glucólisis se usa para describir el fenotipo de célula madre o pluripotencia.1,117,123,124 Sin embargo, existe mucha controversia respecto al perfil metabólico típico de CSC. Por lo general, las CSCs se encuentran en fase G0, en quiescencia, estado en el que consumen oxígeno y dependen principalmente del metabolismo OXPHOS por el que obtienen una mayor respuesta antioxidante para compensar los altos niveles de ROS. Este lento metabolismo les permite sobrevivir a las terapias convencionales que principalmente atacan a células con alta tasa de proliferación. Como únicas supervivientes, las CSCs cambian su estado quiescente a un estado más proliferativo y glucolítico, regenerando así de nuevo el tumor.118,123,125 En los últimos años, las investigaciones se han centrado en buscar marcadores de superficie y firmas transcripcionales específicas del fenotipo CSC. Introducción 19 Las CSCs expresan antígenos específicos en su superficie al igual que las células madre normales. Estos marcadores de superficie que caracterizan a las CSCs dependen en gran medida del tipo de cáncer y los más conocidos son: CD44+CD24- y ALDH en cáncer de mama, CD44+ y CD133+ en cáncer de colon y gástrico, CD34+CD38- en leucemia, CD133+ en glioblastoma y sarcoma, CD13/CD45/CD90 en cáncer de hígado, etc.126,127 Sin embargo, la población CSC presenta un alto grado de heterogeneidad, habiendo diferentes subgrupos o categorías incluso en el mismo tumor.117,120,122 Actualmente, la búsqueda de nuevos marcadores y genes que nos ayuden a identificar las poblaciones CSCs resulta vital para encontrar nuevas estrategias terapéuticas más específicas. NAMPT enriquece la población CSC del tumor principalmente a través de la ruta de rescate, permitiendo así un abastecimiento adecuado de NAD+.1,45 NAMPT y NAD+ están involucrados en los procesos de pluripotencia y desdiferenciación a CSC. Se ha observado que la suplementación de NAM puede evitar la senescencia y apoptosis y, en consecuencia, promover la reprogramación durante la generación de iPSC. Además, la reducción de los niveles de NAD+ en células madre humanas puede causar una diferenciación espontánea y apoptosis.1,128 NADH ha sido propuesto como un nuevo marcador de CSC. La autofluorescecia que emite esta molécula puede ser cuantificado por citometría e, interesantemente, la subpoblación NADHalta ha sido relacionado con la subpoblación CD133+ de CSCs en glioblastoma.1,129,130 NAMPT no solo aumenta las propiedades tumorigénicas, sino que permite la adquisición de las propiedades y el fenotipo de CSCs a través de la activación de los factores OSKM, incluyendo SOX2, OCT4, KLF4 y NANOG.1,42,43 Además, NAMPT es capaz de regular la vía canónica de WNT. La inhibición de NAMPT aumenta la expresión de Axin, que induce la degradación de β-catenina, lo que produce una disminución del proceso de tumorigénesis. Se ha comprobado que la adición del producto enzimático de NAMPT, NMN, revierte la degradación de β-catenina.1,131 NAMPT también está involucrado en el proceso de transición epitelio-mesénquima (EMT), proceso por el que las células epiteliales pierden su polaridad y su adherencia para transformarse en células mesenquimales con capacidades migratorias e invasivas. NAMPT activa varios factores transcripcionales implicados en EMT, como son SNAI1, TWIST y FOXC2, favoreciendo la invasión y la metástasis del tumor.1,42,43 4. Cáncer de Cabeza y Cuello (CCyC) El cáncer de cabeza y cuello (CCyC) ocupa el puesto seis de los cánceres más comunes en el mundo. Los últimos datos indican que en 2020 hubo 931.931 nuevos casos de CCyC.132 CCyC es en realidad un conjunto de tumores que afectan a diferentes localizaciones anatómicas; incluyendo cavidad oral, lengua, faringe, nasofaringe, orofaringe, hipofaringe, laringe y glándulas salivales. El 90% de estos tumores se originan en células escamosas, siendo este tipo el 90% de los CCyC totales.133-135 A pesar de esta gran heterogeneidad, CCyC se puede clasificar en dos grandes grupos dependiendo del origen: tumores positivos para el virus del papiloma humano (VPH) y tumores negativos para VPH, éstos últimos están relacionados con un consumo crónico de alcohol y/o tabaco.133,136,137 (Figura 5) Introducción 20 ▪ Tumores CCyC VPH positivos: VPH es un virus de ADN doble cadena que se transmite por contacto directo y por transmisión sexual. La infección del virus se ha correlacionado con un mayor riesgo en cáncer orofaríngeo, cervical y anogenital. De todos los subtipos del virus, el serotipo 16 es el responsable del 90% de los casos de CCyC. Tras el contagio, VPH16 infecta y se replica en los queratinocitos de la capa basal del epitelio escamoso, que son las células hospedadoras del virus.133,134 Las proteínas víricas E6 y E7 actúan como oncoproteínas, ya que son capaces de unirse y degradar a p53 y a pRb (retinoblastoma), respectivamente, por vía ubiquitina-proteosoma, produciendo una alteración del control del ciclo celular y aumentando el riesgo de desarrollar cáncer. Además, la inhibición de pRb conlleva un aumento de la proteína p16, la cual se utiliza como biomarcador en inmunohistología para el diagnóstico del cáncer orofaríngeo.138-140 Los pacientes con tumores VPH positivos responden mejor al tratamiento, presentan una mayor supervivencia y tienen un menor riesgo de recurrencia que los pacientes con tumores VPH negativos.136,141 El desarrollo de vacunas contra el VPH (Gardasil, Cervarix) pueden ayudar a reducir la incidencia de estos tumores.137 ▪ Tumores CCyC VPH negativos: Los principales factores de riesgo de estos tumores son el consumo de tabaco y alcohol. Otros posibles factores son la falta de limpieza bucal, la edad, el sexo (siendo este cáncer más frecuente en hombres que mujeres), dieta poco saludable y la exposición ocupacional a ciertos tóxicos.136,142 La exposición crónica a estos compuestos tóxicos origina mutaciones en el genoma y, consecuentemente, se produce una desregulación de procesos vitales para la célula como son el ciclo celular, proliferación y apoptosis, iniciando así el proceso de tumorigénesis. Figura 5. Biología molecular del Cáncer de Cabeza y Cuello. CCyC es en realidad un conjunto de tumores que afecta a varias localizaciones anatómicas representadas en la silueta. Desde el punto de vista epidemiológico, CCyC se divide en dos grandes grupos: tumores VPH (virus del papiloma humano) positivos y tumores VPH negativos que están correlacionados con el consumo de tabaco y alcohol. Estas sustancias provocan mutaciones en genes supresores de tumores (signo -) y en protooncogenes (signo +) contribuyendo al proceso de tumorigénesis. Introducción 21 En CCyC, son más frecuentes hallar mutaciones en los tumores VPH negativos que a su vez, es más común las mutaciones en genes supresores de tumores que en proto-oncogenes.137,143 El 40- 60% de los pacientes con tumores VPH negativos presentan mutaciones de pérdida de función del gen TP53 , siendo el consumo de tabaco la principal causa. P53 se encarga de frenar el ciclo celular si hay daños en el ADN y de activar la apoptosis cuando estos daños son irreparables. La función de p53 está regulada por p14ARF, que está codificada por el gen INK4a que se encuentra alterado en el 58% de los tumores de CCyC.135,137,144,145 El 40% de los pacientes presentan mutaciones en el gen supresor de tumores PTEN . La proteína PTEN regula negativamente a la vía oncogénica PI3K/Akt/mTOR, la cual se encuentra altamente activada en CCyC.137,143 El 11-19% de los pacientes tienen mutaciones en NOTCH1 . Varios estudios sugieren que NOTCH1 actúa como supresor de tumores en CCyC, no obstante, su papel en este cáncer todavía no está claro.144,145 Por otra parte, el proto-oncogén que se encuentra más frecuentemente mutado en CCyC es el receptor factor de crecimiento epidérmico ( EGFR ), el cual se encuentra sobreexpresado en más del 90% de los tumores. Cuando los ligandos se unen al receptor EGFR, se produce una activación de las rutas de señalización oncogénicas PI3K/Akt/mTOR y Ras que evitan la apoptosis y promueven la proliferación celular. Altos niveles de EGFR se han correlacionado con carcinomas poco diferenciados que se encuentran en estadios más avanzados, por lo que EGFR se ha propuesto como un factor de mal pronóstico en CCyC.135,143,144,146 En menor porcentaje (13%), el receptor del factor de crecimiento insulínico tipo 1 ( IGF-R1 ) se encuentra sobreexpresado. Este receptor también activa la ruta de señalización PI3K/Akt/mTOR en cáncer. Ambas señalizaciones, EGFR y IGF-R1, están interconectadas, por lo que no es de extrañar que los tumores que sobreexpresan IGF-R1 contribuyan a la resistencia al tratamiento de inhibidores de EGFR observada en pacientes.143,147 El 30-50% de los pacientes tienen amplificado el gen que codifica a ciclina D1 ( CCND1 ) que está implicado en la regulación del ciclo celular. La transcripción de CCND1 está estrechamente regulado por NF-B, factor que se ha detectado activado en la mayoría de los pacientes con CCyC. 143,145 4.1 Tratamiento y CSCs en CCyC El tratamiento elegido para tratar a los pacientes con CCyC depende de la localización anatómica, el estadio TNM y la resecabilidad del tumor. En general, los tumores de estadios tempranos (T1, T2) suelen solucionarse con cirugía o radioterapia localizada, mientras que los de estadio más avanzado (T3, T4) requieren combinaciones de cirugía, radiación y quimioterapia.135,137 La quimioterapia clásica para CCyC incluye principalmente los fármacos derivados del platino, (cisplatino, carboplatino, oxaliplatino), los taxanos (docetaxel, paclitaxel) y 5-fluorouracilo.135 La alternativa a esta terapia tradicional es el uso de inhibidores contra EGFR, como por ejemplo Cetuximab. Sin embargo, a pesar de la altísima expresión de EGFR en CCyC, los inhibidores de EGFR como monoterapia no han dado los resultados esperados debido, posiblemente, a los diversos mecanismos oncogénicos que se activan independientemente de EGFR. Actualmente, Cetuximab y otros inhibidores se utilizan en combinación con radioterapia en Introducción 22 aquellos casos en los que los fármacos derivados del platino estén desaconsejados para el paciente.135,143,146 En los últimos años, se está investigando el uso de inhibidores de mTOR, por ejemplo Rapamicina, e inhibidores de IGF1R como coadyuvantes a la terapia clásica.147-149 A pesar de los avances en el tratamiento para CCyC, la tasa de recurrencia del tumor y la tasa de mortalidad de los pacientes siguen siendo elevadas. Por lo que resulta vital la búsqueda de identificadores pronósticos y el desarrollo de nuevos tratamientos dirigidos específicamente contra la subpoblación CSC, la cual, como anteriormente se ha comentado, es responsable de la iniciación, progreso y metástasis del tumor, y de la resistencia a las terapias convencionales. Sin embargo, los tumores de CCyC son altamente heterogéneos ya que dependen en gran medida de la localización anatómica y del tejido original del que surgen. Debido a esta gran heterogeneidad, existe una gran controversia respecto a los marcadores que identifican a la subpoblación CSC en este tipo de cáncer.150 El foco central de la discusión se centra en el uso o no de CD44 como marcador específico de CSC en CCyC. Son varios los estudios que defienden que las células CD44 positivas presentan propiedades tumorigénicas típicas de CSCs.151-154 Además, CD44 puede ser un marcador de pronóstico dependiendo de la localización anatómica del tumor. Así, una alta expresión de CD44 se correlaciona con un peor pronóstico y supervivencia global en pacientes con tumores orofaríngeo, hipofaríngeo y laringe, pero no muestra ninguna correlación en tumores de la cavidad oral.155 Por otro lado, otros estudios muestran que tanto el tejido sano como el tumoral de cabeza y cuello expresan CD44, y éste último lo hace en una proporción mayor del 10%. Por lo que el uso de CD44 como marcador de CSC no está del todo claro.156-158 Otro marcador muy discutido es CD133. Mientras que unos estudios observaron que las células CD133 positivas presentan propiedades de CSC,152,159 otros estudios no encontraron diferencias entre el comportamiento de las células CD133 positivas y negativas.151,160 CD24 es otro marcador de CSC que ha sido propuesto en CCyC. Las células CD24 positivas correlacionan con la sensibilidad a cisplatino y a otros fármacos, y son capaces de inducir angiogénesis en modelo de ratón en CCyC.151,161,162 En combinación con CD44, se ha observado que las células CD44+CD24+ tienen propiedades típicas de CSC en líneas celulares de CCyC.163 Sin embargo, en carcinoma oral de células escamosas, son las células CD44+CD24- las que tienen propiedades de CSC.154,164 Otro marcador propuesto es ALDH, solo o en combinación con CD44 y CD24. Las células de CCyC que expresan ALDH son altamente tumorigénicas y son capaces de restaurar la heterogeneidad del tumor. En preparaciones inmunohistoquímicas de muestras de pacientes, se ha observado que la tinción de ALDH correlaciona con el tamaño y agresividad del tumor.152,165,166 También se ha observado que las células CD44+CD24-ALDH+ son capaces de activar el proceso EMT en CCyC.151,167 CD117 (c-kit), el receptor del factor de célula madre (SCF), ha sido propuesto como un posible marcador que identifica CSC de tipo mesenquimal en CCyC, no obstante, su papel no está muy estudiado en este tipo de cáncer.150,158 Introducción 23 El alto grado de heterogeneidad que existe entre los distintos tipos de tumores de CCyC dificulta a la comunidad científica el poder establecer unos marcadores de CSC comunes para este tipo de cáncer. Más estudios son necesarios, así como la búsqueda de nuevos marcadores específicos de CSC en CCyC que sirvan de biomarcadores para el desarrollo de nuevas terapias dirigidas. OBJETIVOS Materiales y Métodos 32 1.1.2. Antibióticos Los antibióticos utilizados y sus concentraciones han sido: Ampicilina (AppliChem) a 100 µg/ml, Kanamicina (Sigma) a 50 µg/ml, Neomicina o G418 (Santa Cruz Biotecnology) a 0,4-1 mg/ml y Puromicina (Nucliber) a 0,5-1 µg/ml. 1.1.3. Cepas bacterianas Para la amplificación de los plásmido se utilizó la cepa E.coli DH5α (Invitrogen). Para el clonaje de plásmidos se utilizó las cepa JM109 (Promega) y E.coli Stbl3TM (Invitrogen). Como medio de crecimiento se usó LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl pH 7). 1.2. Transformación de células quimiocompetentes Para la transformación de células quimiocompetentes se mezclaron 50 µl de bacterias y la cantidad apropiada de ADN. Dicha mezcla, primero, se incubó en hielo durante 30 minutos, seguido de un choque térmico de 30 segundos a 42ºC y terminando con una incubación de 2 minutos más en hielo. Posteriormente, se añadió 1 ml de medio LB broth y se mantuvo en agitación durante 1 hora a 37ºC. Luego, se centrifugó 2 minutos a 8.000 rpm, se resuspendió en 100 µL de medio LB, se sembró en placas de LB agar con el antibiótico de selección apropiado y se dejó crecer a 37ºC no más de 16 horas. 1.3. Extracción de ADN plasmídico La extracción de ADN plasmídico se puede realizar a partir de pequeños o grandes volúmenes de cultivos de bacterias, según la cantidad que necesitemos. En ambos casos utilizamos el kit PureLink® HiPure Plasmid DNA Maxiprep (Thermo Fisher Scienctific) para medios o grandes volúmenes y el kit Isolate II Plasmid Minikit (BIOLINE) para pequeños volúmenes, siguiendo las instrucciones del fabricante. El protocolo se basa en ambos casos en una lisis alcalina de las bacterias transformadas procedentes de una colonia aislada que previamente se ha cultivado en medio LB con antibiótico de selección. Tras la lisis bacteriana, el ADN plasmídico se precipita y se purifica en una columna de intercambio iónico en condiciones apropiadas de pH y baja concentración de sales. Los contaminantes se eliminan en un lavabo con tampón de fuerza iónica intermedia y el ADN se eluye en un tampón de alta concentración de sales. Por último, el ADN se precipita con isopropanol para concentrarlo y eliminar sales. Todas las centrifugaciones de este protocolo se realizaron en una centrífuga Evolution RC6 plus a una velocidad de 12.000 G. 1.4. Extracción de ADN genómico La extracción de ADN genómico se realizó mediante el kit High Pure PCR Template Preparatio kit (Rocher) siguiendo las instrucciones del fabricante. El protocolo se basa en el lisado de la muestra con un tampón de lisis y proteinasa K en presencia de guanidina-HCl que inactiva todas las nucleasas a 70ºC. Posteriormente, se añade isopropanol y se pasa la muestra a una columna de intercambio iónico. Luego, la columna se lava dos veces con un tampón de lavado para eliminar los contaminales celulares y, finalmente, el ADN se eluye con agua libre de nucleasa. Materiales y Métodos 33 1.5. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La amplificación de fragmentos de ADN por PCR se realizó utilizando el ADN polimerasa MyTaq (BIOLINE). Para ello, se mezcló 10 µl de tampón de reacción 5X MyTaq, 2 µl de cada cebador 10 µM, 1 µl de ADN polimerasa MyTaq, 200 ng de ADN genómico y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 40 µl. La reacción de PCR se realizó en un termociclador bajo las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial de 1 minutos a 95ºC, 35 ciclos de 15 segundos a 95ºC, 15 segundos a la temperatura de annealing de los cebadores usados y 10 segundos a 72ºC y una extensión final de 10 segundos a 72ºC. 1.6. Purificación del ADN a partir de un gel de agarosa o producto de PCR El resultado de la PCR se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa (Biotools) al 1% con solución TAE 1X (Tris-acetato de 0,04 M, EDTA 1mM pH 8) y bromuro de etidio (BioRad). Las bandas obtenidas tras la PCR y separadas se cortaron del gel de agarosa con un bisturí, visualizándolo a través de un transiluminador de luz ultravioleta. La extracción del ADN, tanto a partir de las bandas del gel de agarosa como directamente a partir del producto de PCR, se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante de los kits de Qiagen: QIAquick Gel Extraction (en el caso del gel) y QIAquick PCR Purification kit (en el caso de la PCR). Ambos protocolos se basan en la unión del ADN a una membrana de sílice en presencia de una alta concentración de sales. Posteriormente, se lava la columna con soluciones de lavado y, finalmente, el ADN se eluye en agua destilada libre de nucleasas. 1.7. Secuenciación Las muestras se secuenciaron en el servicio Genómica y Secuenciación del IBiS. Para ello, se utilizaron los cebadores correspondientes al plásmido. La reacción de secuenciación se realizó con el kit BigDye® Terminator v3.1 Ready Reaction Mix en un termociclador Veriti (Applied Biosystems). Para purificar la reacción de secuenciación se utilizaron placas de purificación PERFORMA® V3 96-Well Short Plate (EdgeBio) y la secuenciación se realizó en un secuenciador 3500 automático de 8 capilares (Applied Biosystems). Luego, las muestras se analizaron mediante el software Chromas Lite y SnapGene. 1.8. Clonación de plásmidos 1.8.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del plásmido donador Para amplificar la secuencia de ADN de las variantes 3 y 4 de NAMPT del plásmido donador pCMV-NAMPT, se realizó una PCR utilizando el ADN polimerasa MyTaq (protocolo descrito en el apartado 1.5). Para realizar la clonación de la variante 2, fue necesario hacer una clonación TA con el plásmido pGEM-T como paso intermedio. Al ser un fragmento más largo, la PCR de la variante 2 se realizó utilizando la enzima ADN polimerasa Q5 de alta-fidelidad (BioLabs). Para ello, se mezcló 10 µl de tampón de reacción 10X, 2,5 µl de cada cebador 10 µM, 0,5 µl de ADN polimerasa Q5, 50 ng de Materiales y Métodos 34 ADN genómico y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 50 µl. La reacción de PCR se realizó en un termociclador bajo las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial de 30 segundos a 95ºC, 35 ciclos de 10 segundos a 95ºC, 30 segundos a la temperatura de annealing de los cebadores usados y 1 minuto a 72ºC y una extensión final de 2 minutos a 72ºC. Debido a la actividad exonucleasa de la polimerasa Q5, el producto de la PCR que se generó tenía extremos romos. Por lo tanto, fue necesaria una segunda PCR de 20 minutos a 72ºC, esta vez utilizando polimerasa MyTaq, para sintetizar cola-poli A en los extremos haciéndolos cohesivos. 1.8.2. Clonación TA Una vez que variante 2 de NAMPT fue amplificada con cola-poli A en los extremos, se realizó la ligación de este inserto y el plásmido pGEM-T. Éste plásmido comercial es un vector cuyo sitio de clonación múltiple se encuentra dentro de la secuencia del gen LacZ y que se encuentra abierto con cola-poli T, haciendo posible este tipo de clonación TA. La ligación se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Para ello, se mezcló 5 µl de tampón de reacción 2X, 1 µl de pGEM-T, el volumen necesario de inserto para que la relación molar inserto:vector sea 3:1, 1 µl de la enzima ADN ligasa T4 y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 10 µl.. La mezcla se incubó toda la noche a 16ºC. Al día siguiente, el producto de ligación se transformó en las bacterias JM109 (apartado 1.2) en placas LB/ampicilina/IPTG/X-Gal. Se pudieron distinguir colonias azules, correspondientes a aquellas colonias con el plásmido que llevaba el gen β-galactosidasa funcional y que, por inducción con IPTG, produce dicha enzima que hidroliza al X-Gal generando un producto azul; y colonias blancas, correspondientes a aquellas colonias que contenían plásmidos con el gen de la b-galactosidasa no funcional debido a la inserción de nuestro inserto de ADN. El ADN de colonias blancas aisladas se extrajo y se purificó (apartado 1.3). 1.8.3. Digestión de ADN con enzimas de restricción Los productos de PCR ( NAMPT 3 y 4) y el plásmido pGEM-T-NAMPT2 se digirieron con las enzimas de restricción BamHI y XhoI (BioLabs), y el plásmido destino, pBABE, con las enzimas BamHI y SalI (BioLabs). Las digestiones se realizaron según el protocolo del fabricante, para ello, se mezclaron 5 µl de tampón de restricción 10X, 1 µl de la enzima de restricción, 1 µg de ADN y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 50 µl. La mezcla se incubó 1 hora a 37ºC. Posteriormente, en el caso de la enzima XhoI, fue necesaria una incubación de 20 minutos a 65ºC para inactivarla. El resultado de la digestión se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%. En el caso del plásmido pBABE se obtuvo una banda de 5.000 bp, para los fragmentos NAMPT 3 y 4 se obtuvieron una banda de 302 y 215 bp respectivamente y para el plásmido pGEM-T-NAMPT2 se observaron dos bandas: una de 3.000 bp correspondiente al vector y otra de 1.139 bp del inserto. Las bandas de interés se purificaron a partir del gel (apartado 1.6). Materiales y Métodos 35 1.8.4. Ligación Para realizar la ligación de los insertos ( NAMPT 2, 3 y 4) con el vector destino pBABE se siguió el siguiente protocolo: se mezclaron las dos moléculas de ADN (inserto y vector) en una relación 3:1, 2 µl del tampón de ligación 10X, 1 µl de la enzima ADN ligasa T4 (BioLabs) y agua libre de nucleasa hasta un volumen final de 20 µl. La mezcla se incubó toda la noche a 16ºC. Al día siguiente, el producto de ligación se transformó en las bacterias E.coli DH5 α (apartado 1.2). El ADN de colonias aisladas se extrajo y se purificó (apartado 1.3). Para comprobar si los plásmidos se habían clonado correctamente, se amplificó un fragmento de 200 pb mediante PCR (apartado 1.5) y se comprobó por electroforesis en gel de agarosa (apartados 1.6). Además, los plásmidos se secuenciaron en el servicio Genómica y Secuenciación del IBiS (apartado 1.7) 2. Cultivos Celulares 2.1. Líneas celulares Las líneas celulares utilizadas se describen en la Tabla 4. Tabla 4. Líneas celulares utilizadas Nombre Especie Tipo celular Medio de cultivo Crecimiento Origen CCyC RPMI-2650 Humana Carcinoma de células escamosas nasal DMEM Adherente ATCC Detroit-562 Humana Carcinoma de faringe DMEM Adherente ATCC HEK293T Humana Tejido renal embrionario DMEM Adherente ATCC ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo. 2.2. Cultivo y conservación de las líneas celulares Las líneas celulares comerciales se cultivaron en medio DMEM con glutamina estable (Gibco), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco/Life technologies), 1% de aminoácidos no esenciales (Sigma), 1% de mezcla de penicilina (40 µg/ml, Sigma) y estreptomicina (40 µg/ml, Sigma) y 1% de fungizona (1 µg/ml anfotericina B, Sigma). Las células se crecieron en placas de 10 centímetros (Falcon) y se subcultivaron 1:10 en el caso de RPMI-2650, o 1:8 en el caso de Detroit-562 cada 3-5 días mediante tratamiento con tripsina/EDTA 0,50% (Life technologies). Las células fueron testadas regularmente para detectar contaminaciones por micoplasma. 2.3. Transfección de células 2.3.1. Transfección mediante el kit comercial TransIt-X2 (Mirus) El reactivo de transfección TransIT-X2 es un sistema polimérico no liposomal que recubre el ADN favoreciendo su transporte al interior celular. Siguiendo el protocolo de transfección por el fabricante, se mezclaron 2,5 µg de ADN del plásmido y 250 µl de medio. A continuación, se añadieron 7,5 µl de reactivo TransIT-X2, se resuspendió bien con la pipeta y se incubó 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió la mezcla gota a gota a las células de interés que el día anterior habían sido sembradas en placas de 6 pocillos (Nunc) a una dilución tal que Materiales y Métodos 36 permitiera tener una confluencia del 80% en el momento de la transfección. Una vez transfectadas, las células se incubaron 48 horas a 37ºC antes de empezar el proceso de selección. 2.3.2. Transfección con polietilenimina (PEI) La polietilenimina (PEI) es un polímero estable catiónico que condensa el ADN en partículas cargadas positivamente que se unen a superficies aniónicas, de forma que el complejo PEI-ADN es endocitado por las células y el ADN liberado en el citoplasma. Para realizar la transfección, se mezclaron 10 µg de ADN del plásmido con 80 µl de PEI (1mg/ml y pH 7, Polysciences) en 1 ml de medio. Se resuspendió bien con la pipeta y se incubó 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió la mezcla gota a gota a las células de interés que el día anterior habían sido sembradas en placas de 10 cm a una dilución tal que permitiera tener una confluencia del 60-80% en el momento de la transfección. Una vez transfectadas, las células se incubaron 24-48 horas a 37ºC dependiendo de la línea antes de empezar el proceso de selección. 2.3.3. Selección de células transfectadas Tras 48 horas de incubación se tripsinizaron las células para sembrarlas a baja densidad en placas de 10 cm y se añadió el antibiótico de selección apropiado. La selección se mantuvo el tiempo necesario para que las células sin transfectar murieran y las células transfectadas formasen clones aislados. Posteriormente, se pasaron los clones a monocapa obteniendo poblaciones celulares con la mezcla de todos los clones obtenidos en una placa. Una vez que se finalizó la selección, la concentración del antibiótico se pudo reducir a la mitad para el mantenimiento de las células transfectadas. Para la selección con puromicina, se utilizó una concentración de 1 µg/ml en la línea celular RPMI-2650 y de 0,25-0,5 µg/ml en la línea Detroit-562. En el caso de la droga G418, se utilizó una concentración de 500 µg/µl en RPMI y de 700 µg/µl en Detroit. 2.4. Técnica CRISPR-Cas9 Se utilizó el sistema CRISPR-Cas9 (del inglés, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – associated protein 9 ) para la generación de un modelo knock-down (o reducción de expresión) del gen NAMPT . Para ello, se utilizó un plásmido, previamente diseñado en el laboratorio, que contenía un sgARN (ARN de guía única quimérico) con la secuencia CTTTACATAGGACGCCAGCA dirigida al exón 10, de forma que solo afectara a la variante 1 de NAMPT. 2.4.1. Infección lentiviral El primer paso fue infectar las células de interés con el plásmido sgRNA-NAMPT siguiendo los pasos que se describen a continuación. Primero se realizó una cotransfección del plásmido de interés y plásmidos que permite la producción de los lentivirus. Para ello, se mezclaron 10 µg de ADN del plásmido, 8 µg del plásmido psPAX2 (que contiene los genes virales: GAG y POL ) y 2 µg del plásmido pM2D-G (que contiene el gen viral VSV-G ) y 80 µl del agente de transfección PEI en 1 ml de medio. Se resuspendió bien con la pipeta y se incubó 30 minutos a temperatura ambiente. Como control de eficacia se preparó una mezcla con el plásmido GPF. Luego, se añadió la mezcla Materiales y Métodos 37 gota a gota a las células HEK293T que se sembraron el día anterior de manera que estuvieran a una confluencia del 70-80% en el momento de la transfección. Tras 24 horas de incubación a 37ºC, las células transfectadas con GFP se comprobó la producción de la proteína mirándolas en un microscopio de fluorescencia. Al resto de las células se le cambió el medio y se incubaron otras 24 horas a 37 grados para la producción de lentivirus. Al día siguiente, el sobrenadante que contenía los virus se pasó por un filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm (VWR) y se realizó una dilución 1:4 con medio fresco suplementado con 8 µg/ml de polibreno (Sigma), un policatión que reduce la repulsión electrostática entre el virus y la membrana celular favoreciendo la unión de los mismos. Por último, se infectaron las células receptoras con el sobrenadante lentiviral preparado. Las células infectadas se incubaron durante 4-6 horas a 37ºC. Posteriormente, se les cambiaron el medio a las células eliminándoles los virus y se mantuvieron 24 horas a 37ºC antes de empezar el proceso de selección que se detalla en el apartado 2.3.3. 2.4.2. Generación y selección de los clones de CRISPRs Una vez que las células estuvieron seleccionadas con puromicina, se aislaron para que pudieran formar clones independientes. Para ello, las células se resuspendieron en PBS con 2% FBS y 5 mM EDTA, y se pasaron por el citómetro de flujo FACS Jazz (BD Biosciences) para sembrar una célula por pocillo en placas de 96 que contenía medio con puromicina. Aproximadamente un mes más tarde, algunas células habían crecido y formado clones procedentes de una sola célula. Cada clon se dividió en dos pocillos en una placa de 6 pocillos y se dejaron crecer. Una vez que llenaron ambos pocillos, uno se congeló a -80ºC y el otro sirvió para la extracción de proteínas (descrito en el apartado 6.2). Se analizó y cuantificó la expresión de la proteína NAMPT de cada clon de CRISPR comparándola con la expresión de la línea celular parental mediante la técnica Western-blot (detallado en el apartado 6.3). Basándonos en el resultado de los Western-blot , se eligió los dos clones que tuvieran menor expresión de la proteína respecto al control en cada línea celular para secuenciarlos y estudiar su fenotipo celular. 2.4.3. Secuenciación de los clones de CRISPRs Para secuenciar los clones de CRISPRs elegidos, se extrajo el ADN genómico (aparatado 1.4) y se realizó una PCR usando la enzima ADN polimerasa MyTaq (apartado 1.5) para amplificar un fragmento de 600 bp de ADN que contenía la secuencia diana del sgRNA de NAMPT . El resultado de la PCR se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% (apartado 1.6). Tras la comprobación, el producto de PCR se purificó (apartado 1.6) y se mandó a secuenciar al servicio de Genómica y Secuenciación del IBiS (apartado 1.7). El análisis consistió en comparar las secuencias de los CRISPRs y el control parental. Materiales y Métodos 38 3. Ensayos Celulares 3.1. Ensayos de metabolismo 3.1.1. Precursores e inhibidores de NAD+ Las concentraciones de los distintos precursores e inhibidores de NAD+ que se han utilizado en esta tesis son los siguientes: 500 µM de nicotinamida mononucleótida (NMN, sintetizado por la empresa GeneHarbour Biotechnologies en Hong Kong), 500 µM de ácido nicotínico (NA, Sigma), 5 mM de nicotinamida (NAM, Sigma), 100 µM de triptófano (Trp, Sigma), 10 nM de FK866 (Sapphire Bioscience), 10nM de GNE617 (Selleckchem), 10nM de GMX1778 (Selleckchem), 1mM ácido 2-hidroxinicotínico (2HNA, Sigma). 3.1.2. Ensayo de ciclación de NAD+ El protocolo original del artículo de Zhu et al., 2012168 y readaptado por el grupo del Dr. Lindsay Wu (University of New south Wales, NSW, Australia) está basado en una serie de reacciones enzimáticas acopladas que permiten cuantificar de forma colorimétrica la cantidad de NAD+ y NAD total de las células. De modo que, en presencia de ADH (alcohol deshidrogenasa), una enzima dependiente de NAD+, el etanol se oxida a acetaldehído aumentando la concentración de NADH. Una vez formado, la forma reducida NADH se vuelve a oxidar a NAD+ dona electrones a una reacción acoplada PMS (fenazina metosulfato) / MTT (bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) dando lugar a la forma reducida de MTT cuyo color morado se puede cuantificar mediante su absorbancia a 570 nm, que va a ser proporcional a la cantidad de NAD de la muestra. Para extraer las muestras, se lavaron las células dos veces con PBS frío y se añadió un volumen adecuado de la solución de extracción de NAD+ compuesto por: nicotinamida 10 mM (Sigma), Tris-Hcl 50 mM pH 8,5, Triton X-100 al 0,1% (Sigma). Con ayuda de un rascador, se recogieron las células en tubos de 1,5 ml y se sonicaron 5 segundos al 30% de potencia. Los restos de debris celular se eliminaron por centrifugación durante 5 minutos a 7.000 g a 4ºC. Para evitar el agotamiento de NAD/NADH de las células, el sobrenadante se concentró y se desproteinizó mediante unos filtros (Amicon Ultra 0.5 Centrifugar Filter Unit, Sigma), reservando una pequeña cantidad del sobrenadante para cuantificar las proteínas totales de la muestra (detallado en el apartado 6.2). Centrifugar los filtros con las muestras durante 20 minutos a 14.000 g a 4ºC. A continuación, se dividió el filtrado en dos tubos: uno destinado a cuantificar la cantidad total de NAD y otro destinado a cuantificar sólo NAD+. Mientras que los primeros tubos se mantuvieron en hielo, los segundos tubos se le añadieron 6 µl de HCl 0,1 M y se calentaron durante 30 minutos a 65ºC en el termobloque para degradar y eliminar el NADH de las muestras. Posteriormente, se añadió 25 µl por pocillo de cada tubo en una placa de 96 pocillos. Como curva patrón se preparó unas concentraciones de 0-50 µM de NAD+(Sigma). Una vez preparada la placa, a cada pocillo se añadió 100 µl de una solución compuesta por ADH (Sigma), etanol y tris-HCl, y se dejó incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, se añadió 50 µl de una mezcla de PMS (Sigma) y MTT Materiales y Métodos 39 (Sigma) a cada pocillo. Y se procedió a realizar lecturas de absorbancia a 570 nm cada 5 minutos durante 30 minutos. Los resultados se expresaron en µmol/mg de proteína. 3.1.3. Ensayos en condiciones limitantes de nutrientes Se realizaron ensayos de proliferación y clonabilidad utilizando los siguientes medios: DMEM (Corning) con alta glucosa (4,5g/l) con Glutamax y sin piruvato como control; DMEM con baja glucosa (1g/l) con glutamina y sin piruvato; DMEM sin glucosa, con glutamina y sin piruvato; DMEM sin glucosa, sin glutamina y sin piruvato; DMEM sin niacinamida, con glutamina y sin piruvato; DMEM control suplementado con 500 µM de ácido nicotínico (NA, Sigma) y DMEM normal suplementado con el inhibidor de NA. El ensayo de proliferación (detallado en el apartado 3.2.1) se realizó sembrando 5.000 células de la línea RPMI-2650 o 10.000 células de Detroit-562 en placas de 6 pocillos por duplicado en medio DMEM control. A las 24 horas (día 0) se fijaron las células del primer punto con glutaraldehído 0,5% (Sigma) y se cambió el medio al resto de las placas con las diferentes condiciones metabólicas. Cada 2 o 3 días se cambiaron el medio de las placas. El ensayo de clonabilidad (detallado en el apartado 3.2.2) se realizó sembrando 200 células de RPMI-2650 o 600 células de Detroit-562 en placas de 6 pocillos por duplicado en medio DMEM control. A las 24 horas se cambió el medio a todas las placas con las diferentes condiciones metabólicas. 3.2. Ensayos funcionales de tumorigénesis 3.2.1. Ensayo de proliferación Para estudiar la proliferación, se sembraron 5.000 células de la línea RPMI-2650 o 10.000 células de Detroit-562 en placas de 6 pocillos por triplicado, poniendo una placa por cada punto de la curva de crecimiento. A las 24 horas (día 0) se fijaron las células del primer punto con glutaraldehído 0,5% (Sigma) y, a partir de ahí, cada 24-48 horas se fijaron el resto de placas durante 11 días. El medio de las células en cultivo se cambió a los 7 días. Una vez fijadas todas las placas, se tiñeron con cristal violeta al 0,5% (Sigma). Después de lavar y secar todas las placas, el cristal violeta se disolvió con ácido acético al 20% (AppliChem) y se cuantificó el número relativo de células midiendo la absorbancia del cristal violeta a 595 nm mediante un lector de absorbancias (BioRad). Los valores se representaron refiriéndolos al día 0. 3.2.2. Ensayo de clonabilidad Para estudiar la capacidad de formar clones individuales, se sembraron 1.000 células de la línea RPMI-2650 o 5.000 células de Detroit-562 en placas de 10 cm por triplicado. A los 10-15 días, las células se fijaron con glutaraldehído 0,5% y se tiñeron con cristal violeta al 0,5%. Después de lavar y secar, se cuantificó el número de clones que habían formado. 3.2.3. Análisis y clasificación de los tipos de clones Los clones formados en el ensayo de clonabilidad fueron analizados y clasificados. Para ello, se observó la morfología de cada clon y se tomaron fotos de cada tipo en un microscopio Materiales y Métodos 40 invertido (Olympus IX-71). Los tipos de clones se clasificaron siguiendo el siguiente criterio: holoclón, procedente de células madre del cáncer dando lugar a un clon muy compacto y redondeado; paraclón, formado por células diferenciadas separadas entre sí; y meroclón, compuesto por células con características intermedias entre el holoclón y el paraclón.169-172 Debido a la dificultad de distinguir los tipos de clon en la línea celular Detroit-562, se decidió solamente clasificarlos en holoclones y paraclones. 3.2.4. Ensayo de formación de tumoresferas Para estudiar la capacidad de las células de formar tumoresferas se sembraron 20.000 células de la línea Detroit-562 por triplicado en placas de 24 pocillos de baja adherencia (Corning). Para ello, las células se resuspendieron en 1 ml de medio MammoCult completo (Stem cell tecnologies) compuesto por medio basal MammoCult, 10% de suplemento de proliferación MammoCult, 4 µg/ml de heparina, 0,58 µg/ml de hidrocortisona, 5% de una mezcla de penicilina y estreptomicina que contiene 10.000 unidades de penicilina y 10 mg de estreptomicina/ml (Sigma) y 5% de fungizona a 250 µg/ml (anfotericina B, Sigma). Las células se cultivaron durante 72 horas, se tomaron fotos de las tumoresferas formadas en un microscopio invertido (Olympus IX-71) y se cuantificó el número total y el tamaño de las mismas. En el caso de la línea celular RPMI-2650, no se pudo realizar este ensayo debido a que las células formaban agregados en vez de tumoresferas. Para comprobar la capacidad de formación de tumoresferas en esta línea se realizó el ensayo a partir de células aisladas cuyo protocolo se describe en el siguiente apartado. 3.2.5. Ensayo de formación de tumoresferas a partir de una célula aislada Para estudiar la capacidad de las células RPMI-2650 de formar tumoresferas a partir de una célula asilada, se resuspendieron en medio de citometría (PBS con 2% FBS y 5 mM EDTA). A continuación, la suspensión celular se separó célula a célula mediante el citómetro de flujo FACS Jazz (BD Biosciences). De esta forma, cada célula se sembró individualmente en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de baja adherencia (Corning) que contenía 100 µl de medio MammoCult (explicado en el anterior apartado). Las células se cultivaron durante 30 días, se observaron al microscopio invertido (Olympus IX-71) y se cuantificó el número y el tamaño de las tumoresferas formadas a partir de una sola célula. Este ensayo no se pudo realizar en la línea celular Detroit-562 ya que estas células presentaron dificultades para crecer de formar aislada. 3.2.6. Ensayo de migración de la Cámara de Boyden Para estudiar la capacidad de migración de las células RPMI-2650, se realizó el ensayo de la Cámara de Boyden utilizando el suero fetal bovino (FBS, Gibco/Life technologies) como el agente quimioatrayente del medio celular. Para realizar dicho ensayo, previamente las células se pusieron en medio sin FBS. Al día siguiente, se sembraron 40.000 células en una cámara de 8m (Transwell) Materiales y Métodos 41 suspendidas en 300 l de medio sin FBS. La cámara con las células se colocó en un pocillo de una placa de 24 pocillos con 500 l de medio con FBS. A las 24 horas, las células se fijaron con glutaraldehído 0,5% (Sigma) y se tiñeron con cristal violeta 0,5% (Sigma). Con un bastoncillo se limpió la membrana interna de la cámara para evitar que las células que no migraron se tiñeran. Se realizaron 5 fotos de las células migratorias por el microscopio en objetivo X20, posteriormente se contaron el número de fotos de cada foto y se calculó la media. 3.2.7. Ensayo de citotoxicidad Para realizar el ensayo de citotoxicidad, se sembraron 8.000 células de RPMI-2650 o 16.000 células de Detroit-562 en una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, las células fueron tratadas con diferentes compuestos a 11 diferentes concentracione. Los compuestos que se utilizaron fueron los siguientes: FK866 a una concentración de 10-0M (dilución 1:3), GNE617 a 25-0M (1:3), GMX1778 a 25-0M (dilución 1:3), cisplatino a 33,3-0M (dilución 1:1,5), docetaxel a 33,3- 0M (dilución 1:3), cisplatino a 33,3-0M (dilución 1:1,5), 1mM ácido 2-hidroxinicotínico (2HNA). Luego, tras 96 horas de tratamiento, las células fueron fijadas y teñidas con cristal violeta 0,5% (Sigma). La viabilidad celular fue medida mediante el análisis de la absorbancia a 595 nm al disolver el cristal violeta con el ácido acético al 20% (AppliChem). El IC50 fue calculado como la concentración en la que sobreviven el 50% de las células comparándolo con el día 0 como control. 3.2.8. Ensayo de competición Para estudiar la capacidad de dos tipos celulares de competir entre sí en las mismas condiciones, realizamos un ensayo de competición. Las células con la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT fueron transfectadas con el vector EYFP-Mito que expresa la proteína verde fluorescente (GFP). Una vez seleccionadas por el antibiótico, se separaron mediante el citómetro de flujo FACS Jazz (BD Biosciences) para identificar completamente las células que expresan la proteína fluorescente. A continuación, se sembraron en una misma placa 500.000 células transfectadas con ésta proteína y 500.000 células transfectadas con el vector vacío. También se sembraron 1 millón de células de cada tipo en placas diferentes como controles de que la expresión de la proteína fluorescente no decae con el tiempo. Al día siguiente, se tripsinizaron las células y se resuspendieron en 1 ml de PBS con 2% FBS y 5mM EDTA para analizarlas con el citómetro de flujo analítico Canto II (BD Biosciences) y comprobar que el día 0 se habían sembrado 50% de cada tipo de célula. Se subcultivaron durante 1 mes y se volvieron a analizar para comprobar si algún tipo celular había crecido más que el otro. También se comprobó con las placas controles que la expresión de la proteína fluorescente no decaía con el tiempo. 3.3. Análisis de marcadores por citometría de flujo Para buscar marcadores de superficie relacionados con la población célula madre del cáncer, se empleó la técnica de citometría de flujo en sus dos modalidades: FACS (Fluorescence-activated cell sorting) y Separación celular (cell sorting). Materiales y Métodos 48 6.3. Western-blot La inmunodetección de proteínas se realizó siguiendo un protocolo estándar. Para ello, se disolvieron 30 µg de proteínas en tampón de carga (Tris-HCl 60 mM pH 6,8, glicerol 10%, SDS 2%, 2-mercaptoetanol 5%, azul de bromofenol 0,002% (Sigma)) y se desnaturalizaron 5 minutos a 95ºC. Las proteínas se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida 10-12%, dependiendo del tamaño de la proteína a detectar, utilizando el sistema Mini-Protean Tetra Cell (BioRad). La electroforesis se realizó a una potencia de 100-120 V en un tampón de electroforesis (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1%, pH 8,3). A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Protran 0,2 µm) utilizando el sistema Mini Trans-Blot Cell (BioRad) durante 2 horas a 400 mA en un tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20%, pH 8,3). Tras la transferencia, las membranas se bloquearon en agitación durante 2 horas en un tampón de bloqueo (PBS, Tween 20 0,1%, PBS 3%). Posteriormente, se incubaron toda la noche con la dilución adecuada de anticuerpo primario en tampón de bloqueo y en agitación. Al día siguiente, se hicieron tres lavados con PBS-Tween 0,1% para eliminar el exceso de anticuerpo primario. A continuación, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente diluido en PBS-Tween 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Todos los anticuerpos secundarios utilizados estaban conjugados con la enzima peroxidasa (HRP). Luego, se hicieron 3 lavados con PBS-Tween 0,1% para eliminar el exceso de anticuerpo secundario. Finalmente, la detección se realizó mediante una reacción de quimioluminiscencia utilizado los reactivos ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham) y la visualización con el equipo Chemidoc Touch (BioRad). 6.4. Cuantificación de bandas de Western-blot Para cuantificar las bandas de proteínas se usó el programa Image Lab (BioRad). Se seleccionó cada banda de forma individual, se restó el fondo inespecífico a cada una y se normalizó con respecto al valor de la banda de la proteína α-Tubulina que sirvió de control de carga. 7. Secuenciación NGS La secuenciación NGS, también llamada secuenciación de nueva generación, se realizó en colaboración con el grupo de Medicina Xenómica del Instituto de Investigación de Santiago (IDIS) en Santiago de Compostela. 8. Análisis de bases de datos En esta tesis se han utilizado las siguientes bases de datos: • R2-Genomics (http://hgserver1.amc.nl): bases de datos transcriptómicas públicas desarrollada por el Departamento de Oncogenómica del Centro Médico Académico (AMC) de Ámsterdam. • SurvExpress (http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp): análisis de supervivencia en cáncer. Materiales y Métodos 49 • NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/): utilizada para obtener la secuencia de nucleótidos. • Uniprot (https://www.uniprot.org/): utilizada para obtener información de proteínas. • GeneCards (http://www.genecards.org/): utilizada para obtener información de genes. • PhosphoSitePlus (https://www.phosphosite.org/homeAction): utilizada para obtener información de las modificaciones post-traduccionales de las proteínas. • CBioPortal (https://www.cbioportal.org/): utilizada para el análisis de mutaciones en tumores humanos. • Pfam (http://pfam.xfam.org/search/sequence): utilizada para obtener información sobre los dominios de las proteínas. • Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html): utilizada para obtener información de las variantes. • PBD (http://www.rcsb.org/): utilizada para obtener las estructuras tridimensionales de la proteínas (NAMPT: archivo 3dhf). Las imágenes se retocaron en el programa ViewerLite. 9. Análisis estadístico Utilizamos el programa GraphPad Prism para el análisis estadístico de los experimentos realizados. Dependiendo de si los datos estaban normalizados con respecto al EV/control o no utilizamos el test estadístico T-student para muestras no pareadas o el test T-student con la corrección de Welch. Valores de p inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos y se representaron según la siguiente clasificación: p<0,05 (*), p<0,01 (**) y p<0,001 (***). RESULTADOS Resultados 53 1. Estudio de las propiedades de célula madre de las subpoblaciones CSC en CCyC Dentro del tumor, la subpoblación de células madre tumorales (CSCs) es responsable, no sólo del inicio y progresión tumoral, sino también de la metástasis y resistencia a las terapias convencionales.117-119 Existe una elevada heterogeneidad entre los distintos tipos de cáncer de cabeza y cuello (CCyC), lo que complica en gran medida la identificación de marcadores específicos de esta subpoblación celular.150 Siendo necesario establecer los marcadores de CSC en CCyC, decidimos estudiar las propiedades de célula madre de diferentes marcadores en dos líneas celulares comerciales de CCyC humano: RPMI-2650, procedente de carcinoma de células escamosas de nariz, y Detroit-562, originaria de carcinoma de faringe. En primer lugar, analizamos la expresión de los marcadores de superficie reportados como posibles marcadores de CSC en células de CCyC: CD10, CD184, CD19, CD133, CD166 y CD44, mediante citometría de flujo (FACS) (Tabla 8). Basándonos en los datos obtenidos, descartamos CD44 como marcador de CSC, ya que, en ambas líneas celulares, toda la población celular era positiva para este marcador y no todas las células son capaces de regenerar el cultivo. También descartamos el marcador CD166 en la línea Detroit-562, ya que, al igual que CD44, toda la población era positiva para este marcador. Tabla 8. Expresión de marcadores de célula madre tumorales por citometría de flujo (FACS) en las líneas celulares de CCyC. (%±SD) CD10+ CD184+ CD19+ CD133+ CD166+ CD44+ RPMI-2650 1,018 ±0,27 0,801±0,73 1,721±1,45 0,056±0,12 60,75±1,48 99,68±0,20 Detroit-562 0,609±0,41 0,185±0,10 0,388±0,28 0,049±0,05 99,63±0,23 99,76±0,17 1.1. Marcador CD10 El marcador CD10, también llamado CALLA (antígeno común de la leucemia linfoblástica aguda), es una proteína de superficie de membrana que actúa como una metaloendopeptidasa que se encarga de escindir péptidos de señalización.173,174 Algunos estudios han mostrado que las células CD10 positivas presentan propiedades relacionadas con el fenotipo CSC en líneas celulares de CCyC.173 Altos niveles de este marcador se han correlacionado con una mayor resistencia a la quimio y radioterapia.173 Además, CD10 ha sido propuesto como un posible marcador de peor pronóstico en carcinoma oral de células escamosas.174,175 Evaluamos al marcador CD10 como posible marcador de CSC en nuestras líneas celulares de CCyC. Para ello, generamos tumoresferas, que son agrupaciones celulares capaces de crecer en suspensión en ausencia de suero. Estas poblaciones se caracterizan por su capacidad de autorrenovación tras ser disgregadas y por estar enriquecidas en progenitores epiteliales multipotentes.176-178 Cuantificamos los niveles de expresión de CD10 por RT-qPCR y encontramos una mayor expresión en las tumoresferas generadas de la línea Detroit-562 en comparación con el extracto total celular. Sin embargo, no observamos diferencias en el caso de la línea RPMI-2650 (Figura 6A). Luego, comprobamos el porcentaje de la subpoblación positiva para el marcador Resultados 54 CD10 en las tumoresferas por citometría de flujo (FACS). Las tumoresferas mostraron un menor porcentaje de células CD10 positivas en comparación con el extracto total en ambas líneas celulares (Figura 6B). Figura 6. Propiedades de célula madre tumorales de la subpoblación CD10 en CCyC. A) Niveles de expresión de CD10 en extracto total y tumoresferas de las líneas celulares RPMI-2650 y Detroit-562. B) Porcentaje de células CD10 positivas del extracto total y tumoresferas de las líneas celulares medido por citometría de flujo. C) Ensayo de clonabilidad de las células CD10 negativas y positivas previamente aisladas por el citómetro. D) Ensayo de formación de tumoresferas de las células CD10 negativas y positivas previamente aisladas por el citómetro. E) Niveles de expresión de genes relacionados con el fenotipo de célula madre en las células CD10 negativas y positivas previamente aisladas por el citómetro. F) Crecimiento tumoral in vivo en xenotransplantes (N=6) de las células CD10 negativas y positivas de las líneas celulares RPMI-2650 y Detroit-562. Se muestra imágenes representativas de los tumores y los días que tardaron en aparecer. Los resultados se expresan en niveles normalizados al extracto total o negativo (1% o 100%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 55 Posteriormente, se aislaron mediante citómetro las subpoblaciones CD10 positiva y negativa para realizar un ensayo de clonabilidad, un ensayo de generación de tumoresferas y para extracción de ARN. El ensayo de clonabilidad nos permitió medir la capacidad de las células de formar clones y de regenerar de nuevo el cultivo.169-172 Para ello, se sembraron 500 células CD10 positivas o negativas para RPMI-2650 y 2.000 células para Detroit-562 directamente del citómetro y, tras un periodo de incubación de 7 o 10 días, se cuantificaron el número de clones que habían crecido. Esta diferencia técnica del número de células se debe a que las células Detroit-562 sufrían más que las RPMI-2650 durante el proceso de separación celular mediante citometría, lo que disminuía bastante la supervivencia celular. Observamos que las células CD10 positivas de ambas líneas generaron un menor número de clones en comparación con las células negativas (Figura 6C). Para el ensayo de formación de tumoresferas, se sembraron una única célula CD10 positiva o negativa de la línea RPMI-2650 por pocillo y se incubaron durante aproximadamente un mes para estudiar el porcentaje de células que formaron una tumoresfera siendo capaz de reconstituir la población celular. Y se sembraron 20.000 células CD10 positivas o negativas de la línea Detroit- 562, se cultivaron durante 72 horas y se cuantificó el número de tumoresferas formadas. Observamos una menor eficiencia en la formación de tumoresferas a partir de una célula aislada en las células CD10 positivas en la línea RPMI-2650. En cambio, las células CD10 positivas de Detroit-562 generaron un mayor porcentaje de tumoresferas que las células negativas (Figura 6D). Además, se extrajo ARN de las células CD10 positivas y negativas para medir la expresión de los factores de Yamanaka ( OCT4 , SOX2 , KLF4 y c-MYC ) y NANOG . Estos genes están implicados en rutas de señalización que regulan la pluripotencia de las células madre117-122. Observamos que las células CD10 positivas de la línea RPMI-2650 tenían una mayor expresión de OCT4 , SOX2 y NANOG , pero no encontramos diferencias significativas en la línea Detroit-562 (Figura 6E). Por último, quisimos validar el efecto in vivo de células CD10 positivas en xenotransplantes en ratones inmunodeprimidos. Para ello, se inyectaron 10.000 células positivas o negativas, previamente aisladas por citómetro, en el flanco derecho de 6 ratones. Observamos un crecimiento más rápido y agresivo en los tumores generados a partir de la subpoblación celular CD10 positiva, especialmente en el caso de la línea Detroit-562 (Figura 6F). 1.2. Marcador CD184 La proteína CD184, también llamada CXCR4 (receptor de quimiocina CXC tipo 4), es un receptor de superficie específico del factor 1 derivado de células estromales (SDF-1). La unión del sustrato SDF-1 a su receptor CD184 induce una cascada de señalización que está implicada en la interacción entre las CSCs y las células del estroma que conforman el nicho del tumor. De modo que, CD184 está involucrado en la progresión, angiogénesis, metástasis y supervivencia del tumor.179,180 Se ha propuesto que la interacción SDF-1-CD184 cumple un papel importante en el desarrollo de la población CSC en CCyC.181,182 Cuantificamos los niveles de expresión de CD184 en las tumoresferas generadas mediante RT-qPCR para validar este marcador en nuestras líneas Resultados 56 celulares de CCyC. Observamos altos niveles de expresión de CD184 en las tumoresferas generadas en ambas líneas en comparación con el extracto total celular (Figura 7A). Figura 7. Propiedades de célula madre tumorales de la subpoblación CD184 en CCyC. A) Niveles de expresión de CD184 en extracto total y tumoresferas de las líneas celulares RPMI-2650 y Detroit-562. B) Porcentaje de células CD184 positivas del extracto total y tumoresferas de las líneas celulares medido por citometría de flujo. C) Ensayo de clonabilidad de las células CD184 negativas y positivas previamente aisladas por el citómetro. D) Ensayo de formación de tumoresferas de las células CD184 negativas y positivas previamente aisladas por el citómetro. E) Niveles de expresión de genes relacionados con el fenotipo de célula madre en las células CD184 negativas y positivas previamente aisladas por el citómetro. F) Crecimiento tumoral in vivo en xenotransplantes (N=6) de las células CD184 negativas y positivas de las líneas celulares RPMI-2650 y Detroit-562. Se muestra imágenes representativas de los tumores y los días que tardaron en aparecer. Los resultados se expresan en niveles normalizados al extracto total o negativo (1% o 100%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 57 Luego, comprobamos el porcentaje de la subpoblación positiva para el marcador CD184 en las tumoresferas por citometría de flujo. Las tumoresferas de Detroit-562 mostraron un mayor porcentaje de células CD184 positivas en comparación con el extracto total, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 7B). Como hicimos anteriormente, las subpoblaciones CD184 positivas y negativas fueron aisladas mediante citómetro para realizar un ensayo de clonabilidad, un ensayo de generación de tumoresferas y para extracción de ARN. No observamos diferencias significativas en la formación del número de clones entre las células CD184 positivas y negativas (Figura 7C). Tampoco observamos diferencias significativas en la generación de tumoresferas entre las células CD184 positivas y negativas (Figura 7D). Analizamos la expresión de varios genes relacionados con el fenotipo de célula madre tumoral del ARN extraído de ambas subpoblaciones. Observamos que las células CD184 positivas de la línea RPMI-2650 tenían mayores niveles de expresión de KLF4 , mientras que las células positivas de la línea Detroit-562 tenían ligeramente altos niveles de OCT4 y NANOG en comparación con las células negativas (Figura 7E). Por último, generamos modelos de xenotransplantes en ratones inmunodeprimidos para validar el efecto in vivo del marcador CD184. Para ello, se inyectaron 10.000 células positivas o negativas, previamente aisladas por citómetro, en el flanco derecho de 6 ratones. Observamos un crecimiento más rápido y agresivo en los tumores generados a partir de la subpoblación celular CD184 positiva, especialmente en el caso de Detroit-562 (Figura 7F). 1.3. Marcador CD133 CD133 es un marcador de superficie que ha sido utilizado para identificar la población CSC en muchos tipos de tumores, incluyendo cáncer de colon, gástrico, sarcoma y glioblastoma.126,127 Sin embargo, su uso en CCyC ha sido muy discutido debido a que se han obtenido resultados contradictorios. Mientras que unos estudios observaron que las células CD133 positivas presentan propiedades de CSC,152,159 otros estudios no encontraron diferencias entre el comportamiento de las células positivas y negativas para este marcador.151,160 Cuantificamos los niveles de expresión de CD133 en las tumoresferas generadas mediante RT-qPCR para validar este marcador en nuestras líneas celulares de CCyC. Sin embargo, no observamos diferencias significativas en los niveles de expresión entre las tumoresferas en comparación con el extracto total celular (Figura 8A). No obstante, las tumoresferas de ambas líneas mostraron un mayor porcentaje de células CD133 positivas en comparación con el extracto total por citometría de flujo (Figura 8B). Como anteriormente, las subpoblaciones CD133 positivas y negativas fueron aisladas mediante citómetro. Las células CD133 positivas de la línea RPMI-2650 formaron un mayor porcentaje de clones que las células negativas. No pudimos realizar este ensayo en el caso de la línea Detroit- 562 (Figura 8C). Las células CD133 positivas de ambas líneas generaron un menor porcentaje de tumoresferas que las células negativas (Figura 8D). Además, las células CD133 positivas de RPMI- 2650 tenían significativamente mayores niveles de expresión de KLF4 , mientras que en las células positivas de Detroit-562 observamos un ligero incremento de los niveles de SOX2 en comparación con las células negativas (Figura 8E). Por último, generamos modelos de Resultados 64 Figura 13. NAMPT, un marcador común de célula madre tumoral en CCyC. A) Niveles de expresión de NAMPT en extracto total y tumoresferas de las líneas celulares RPMI-2650 y Detroit-562. B) Ensayo de clonabilidad, C) Ensayo de formación de tumoresferas y D) Niveles de expresión de genes relacionados con el fenotipo de célula madre en las células EV y sobreexpresión de NAMPT. E) Niveles de expresión de NAMPT en las subpoblaciones CD10, CD184, CD19, CD133 y CD166 negativas y positivas previamente aisladas por el citómetro. F) Crecimiento tumoral in vivo en xenotransplantes (N=4) de las células EV y sobreexpresión de NAMPT. Se muestra imágenes representativas de los tumores y los días que tardaron en aparecer. Los resultados se expresan en niveles normalizados al EV (1% o 100%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 65 Posteriormente, comprobamos los niveles de expresión de NAMPT en las distintas subpoblaciones positivas y negativas para los marcadores propuestos anteriormente que habían sido previamente aisladas por citómetro. Observamos que las subpoblaciones CD10 y CD19 positivas de RPMI-2650 y las subpoblaciones CD133 positivas de Detroit-562 expresaban altos niveles de NAMPT en comparación con las subpoblaciones negativas (Figura 13E). Por último, generamos modelos de xenotransplantes en ratones inmunodeprimidos para validar el efecto in vivo de NAMPT. Para ello, se inyectaron 2 millones de células de la línea RPMI-2650 y 1 millón de células de la línea Detroit-562 en el flanco derecho de 4 ratones. Observamos que los tumores generados a partir de las células RPMI-2650 con NAMPT sobreexpresado crecieron más lento que los tumores formados por las células controles. Mientras que los tumores originados a partir de las células Detroit-562 con NAMPT sobreexpresado crecieron de forma más rápida y agresiva. En ambos casos, los tumores de las células con NAMPT sobreexpresado aparecieron antes (Figura 13F). Todos estos datos sugieren que NAMPT podría ser un marcador tumoral de las distintas subpoblaciones de CSC en CCyC. A continuación, estudiamos la posible relevancia clínica de los marcadores propuestos (CD10, CD184, CD19, CD133 y NAMPT) en CCyC. Para ello, analizamos la supervivencia global de pacientes con CCyC de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA), N=520. En los Kaplan- Meier, pudimos observar una reducción de la supervivencia global en el grupo de pacientes con alto nivel de expresión de CD133 , CD166 y NAMPT . La reducción de la supervivencia de los pacientes era bastante importante en el caso de NAMPT (Figura 14), lo que sugiere que NAMPT podría ser un indicador de mal pronóstico en CCyC. Figura 14. Supervivencia global de pacientes con CCyC de la base de datos TCGA. Curvas Kaplan-Meier que representan la supervivencia global de grupos de pacientes con altos y bajos niveles de expresión de los genes CD10 , CD184 , CD19 , CD133 , CD166 y NAMPT en CCyC de la base de datos TCGA ( The Cancer Genome Atlas ), N=520. Resultados 66 2. Estudio del papel funcional de NAMPT en líneas celulares de CCyC 2.1. Efecto de reducción de los niveles de NAMPT en líneas celulares de CCyC Estudiamos el efecto de la reducción de los niveles de NAMPT en nuestros modelos celulares de CCyC. Para ello, generamos modelos knock-down (o reducción de expresión) utilizando el sistema CRISPR-Cas9 (del inglés, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – associated protein 9 ), ya que estos modelos son más estables que los que se generan utilizando un shARN (horquilla corta de ARN). La secuencia diana del sgARN (ARN de guía única quimérico) del plásmido que utilizamos se localiza en el exón 10 del gen NAMPT , específicamente a la secuencia CTTTACATAGGACGCCAGCA, afectando exclusivamente a la expresión de la variante principal. Una vez generados los clones de los CRISPRs (siguiendo el protocolo detallado en el apartado 2.4 de materiales y métodos), analizamos la expresión de la proteína de NAMPT mediante Western-blot para comparar la expresión de cada clon de CRISPR con la expresión de la línea celular parental que nos sirvió de control. No encontramos clones con la eliminación completa de la proteína. No obstante, de cada línea celular, elegimos los dos clones de CRISPRs que presentaban la menor expresión de la proteína: elegimos los clones 46 y 48 de la línea celular RPMI-2650 y los clones 11 y 16 de la línea Detroit-562 (Figura 15A). A continuación, comprobamos la actividad biológica de los CRISPRs mediante la cuantificación de NAD total y NAD+. Observamos una disminución significativa de los niveles de NAD (total y NAD+) en los CRISPRs de ambas líneas, lo que sugiere que la actividad enzimática de NAMPT estaba reducida (Figura 15B). Los clones seleccionados fueron secuenciados y, a partir de la secuencia obtenida, pudimos hacer una simulación de la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante el software SnapGene (Figura 16). Una vez comprobado que los CRISPRs producían menor cantidad de proteína NAMPT y que la actividad de ésta se encuentra comprometida, realizamos una serie de ensayos funcionales para estudiar algunas propiedades tumorigénicas de los CRISPRs en las líneas de CCyC. En primer lugar, realizamos una curva de crecimiento para estudiar la tasa de proliferación celular. Curiosamente, los CRISPRs R46 y R48 de la línea RPMI-2650 crecían significativamente más lentos que las células parentales los primeros días, sin embargo, tras pasar unos días, recuperaban la capacidad proliferativa. El CRISPR D16 de la línea Detroit-562 crecía más lento en los últimos días del ensayo, mientras que el CRISPR D11 mostraba una velocidad de proliferación bastante similar al de las células parentales de esta línea (Figura 17A). Luego, realizamos un ensayo de clonabilidad para medir la capacidad de las células para formar clones en ausencia de contacto celular. Observamos que los CRISPRs de ambas líneas formaban menor número de clones que las células parentales (Figura 17B). Posteriormente, realizamos un ensayo de competición de los CRISPRs de NAMPT. El objetivo de este ensayo fue el de estudiar la capacidad que tienen las células de competir entre sí por las mismas condiciones ambientales. Para ello, transfectamos las células con un plásmido que expresa la proteína verde fluorescente (GFP), luego, seleccionamos las células con la droga Resultados 67 correspondiente y las separamos mediante citometría de flujo para obtener un cultivo más puro. A continuación, sembramos en una placa la misma cantidad de células transfectadas con el vector vacío y células con los CRISPR de NAMPT y la proteína GFP. Mantuvimos este cocultivo durante 30 días. Mediante citometría de flujo, analizamos el porcentaje de células que expresan GFP al inicio (día 0) y al final del mes (día 30). Observamos que en los cocultivos EV+R46-GFP, EV+R48- GFP había un menor porcentaje de células GFP positivas a los 30 días, mientras que no se observaron diferencias en el cocultivo EV+D11-GFP (Figura 18). Este dato podría explicarse si tenemos en cuenta que las células del CRISPR D11 crecen de manera muy similar a las células parentales de la línea Detroit-562. Figura 15. Generación y validación de los CRISPRs de NAMPT en las líneas celulares CCyC. A) Comprobación a nivel proteico de los CRISPRs de NAMPT por Western-blot . Se seleccionaron los clones marcados en rojo: 46 y 48 de la línea RPMI-2650, y 11 y 16 de la línea Detroit-562. B) Comprobación de la actividad biológica de los CRISPRs seleccionados por cuantificación de los niveles de NAD total y NAD+. Los resultados que se expresan en % se debe a que se ha normalizado el control al 1%. Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 68 Figura 16. Simulación de la secuenciación de los clones de los CRISPRs de NAMPT en las líneas celulares de CCyC. A) Esquema de la secuencia diana del sgARN del sistema CRISPR-Cas9. B) Secuenciación de la parte del ADN que contiene la secuencia sgARN (marcada en celeste) de los clones R46 y R48 de la línea RPMI-2650, y de los clones D11 y D16 de la línea Detroit-562. Tras la secuencia sgARN, le sigue la secuencia de nucleótidos modificada por el corte de Cas9 (en rojo) y aminoácidos. Resultados 69 Figura 17. Efecto de los CRISPRs de NAMPT en la capacidad proliferativa y la capacidad de formación de clones en las líneas celulares de CCyC. A) Representación de las curvas de crecimiento de las células que sobreexpresan las diferentes variantes de NAMPT en las líneas RPMI-2650 y Detroit-562. Se representa la media ± SD. B) Ensayo de clonabilidad de los CRISPRs de NAMPT. Los resultados se expresan en niveles normalizados al control (100%). Se representa la media ± SEM. Se muestras imágenes representativas de las placas teñidas con cristal violeta. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Figura 18. Efecto de los CRISPRs de NAMPT en la capacidad de competición en las líneas celulares de CCyC. Se realizó un ensayo de competición en el que se transfectaron las células de los CRISPRs de NAMPT con un plásmido que expresa la proteína verde fluorescente (GFP). Se sembró la misma cantidad de células EV y de células transfectadas con GFP, y se subcultivaron durante 30 días. El % de células de color verde se midió el día 0 y el día 30. Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001) comparando los porcentajes del día 30 frente a los del día 0. Resultados 70 Tras validar el efecto tumorigénico in vitro de los CRISPRs de NAMPT, decidimos realizar un ensayo in vivo en el que generamos modelos de xenotransplantes de cada línea celular en ratones inmunodeprimidos. Para ello, inyectamos 2 millones de células de la línea RPMI-2650 y 1 millón de células de la línea Detroit-562 en el flanco derecho de 4 ratones. Observamos que los tumores formados a partir de las células de los CRISPRs de NAMPT crecieron más lento que los tumores originados a partir de las células parentales (Figura 19). Figura 19. Efecto de los CRISPRs de NAMPT en el crecimiento tumoral in vivo en xenotransplantes de las líneas celulares de CCyC. Se realizaron xenotransplantes en ratones inmunodeprimidos (N=4). Se muestran las gráficas del crecimiento tumoral de los tumores, así como una foto representativa del tumor de cada condición. Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 2.2. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en el fenotipo de célula madre en líneas celulares de CCyC En la literatura, se ha descrito que NAMPT favorece la adquisición de las propiedades típicas de las células CSC, enriqueciendo esta subpoblación tumoral.1,42,43,45 En el primer apartado estudiamos que NAMPT podría ser un marcador de CSC en CCyC. Por consiguiente, decidimos realizar una serie de ensayos para estudiar el efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en el fenotipo de CSC en nuestros modelos celulares de CCyC. En primer lugar, realizamos un ensayo de clonabilidad para analizar el fenotipo de los clones formados en ausencia de contacto celular. Los clones se pueden clasificar en: holoclones, enriquecidos en células con propiedades de células madre y capaces de reconstituir el cultivo; paraclones, formados por células más Resultados 71 diferenciadas e incapaces de reconstituir el cultivo; y meroclones, compuestos por células con características intermedias entre holoclones y paraclones169-172. Observamos que los CRISPRs de NAMPT de la línea RPMI-2650 formaron un menor porcentaje de holoclones y un mayor porcentaje de paraclones en comparación con las células parentales. Sin embargo, no observamos diferencias significativas en los clones generados por las células que sobreexpresaban NAMPT. Los CRISPRs de la línea Detroit-562 también tendieron a formar un menor porcentaje de holoclones y un mayor porcentaje de paraclones, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. Las células Detroit-562 que sobreexpresaban NAMPT formaron un mayor porcentaje de holoclones y un menor porcentaje de paraclones de manera significativa (Figura 20). Figura 20. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en el fenotipo de los tipos de clones en las líneas celulares de CCyC. Se analizaron los diferentes tipos de clones formados en el ensayo de clonabilidad en las líneas RPMI-2650 y Detroit-562. Se muestra el porcentaje de cada fenotipo (holoclon, meroclon y paraclon) de clon, así como imágenes representativas de cada fenotipo. Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). A continuación, estudiamos la capacidad de formación de tumoresferas de las células con NAMPT sobreexpresado y los CRISPRs de NAMPT en nuestras líneas celulares. Para ello, se sembró una única célula por pocillo de la línea RPMI-2650 para analizar el porcentaje de células que formaban una tumoresfera capaz de reconstituir la población celular. Y se sembraron 20.000 células de la línea Detroit-562 para cuantificar el porcentaje de tumoresferas formadas 72 horas después. Observamos una menor eficiencia de la formación de tumoresferas tanto en los CRISPRs como en las células que sobreexpresaban NAMPT en la línea RPMI-2650. Por otra parte, las células Detroit-562 con NAMPT sobreexpresado formaron un mayor porcentaje de tumoresferas, aunque de manera no significativa. Mientras que los CRISPRs de esta línea formaron un menor porcentaje de tumoresferas, especialmente en el caso del CRISPR D16 (Figura 21A). En cuanto al tamaño, las tumoresferas generadas por las células con NAMPT sobreexpresado y los CRISPRs de ambas líneas tenían un área menor en comparación con las tumoresferas de las células parentales Resultados 72 (Figura 21B y C). Posteriormente, medimos la expresión de los factores de Yamanaka ( OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC )121 y otros factores de transcripción ( NANOG, BMI1, SOX9 ) implicados en rutas de señalización que regulan la pluripotencia de las células madre117-122. Observamos que las células RPMI-2650 que sobreexpresaban NAMPT mostraban una mayor expresión de todos los factores de Yamanaka, NANOG y SOX9 , mientras que los CRISPRs R46 y R48 tenían una menor expresión de SOX2 y KLF4 . Sin embargo, no observamos diferencias claras en la línea Detroit-562 (Figura 22). Figura 21. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en la formación de tumoresferas en las líneas celulares de CCyC. A) Ensayo de formación de tumoresferas a partir de una célula aislada en la línea RPMI-2650 y ensayo de formación de tumoresferas en la línea Detroit-562 B) Tamaño de las tumoresferas formadas en ambas líneas celulares C) Imágenes representativas de las tumoresferas generadas en cada condición. Los resultados se expresan en niveles normalizados al control (100%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 73 Figura 22. Efecto de la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en la expresión de genes relacionados con el fenotipo de célula madre tumoral en las líneas celulares de CCyC. Se cuantificaron los niveles de ARNm de los genes OCT4 , SOX2 , KLF4 , MYC , NANOG , BMI1 por RT-qPCR. Los resultados se expresan en niveles normalizados al control (1%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). A continuación, analizamos por citometría de flujo (FACS) el porcentaje de las subpoblaciones positivas para los marcadores que propusimos en el anterior apartado: CD10, CD184, CD19, CD133 y CD166. Observamos que las células RPMI-2650 que sobreexpresaban NAMPT mostraban un mayor porcentaje de células CD10 y CD19 positivas, mientras que los CRISPRs presentaban un menor porcentaje de células CD10, CD184, CD19, CD133 y CD166 positivas en comparación con las células parentales. La reducción observada de la subpoblación CD166 positiva de los CRISPRs fue bastante llamativa. De manera similar, las células Detroit-562 con NAMPT sobreexpresado mostraban un mayor porcentaje de células CD10 y CD184 positivas, mientras que los CRISPRs presentaban un menor porcentaje de células CD10, CD184 y CD19 positivas. Toda la población Resultados 80 Figura 28. Análisis de genes relacionados con la transición epitelio-mesénquima en las líneas celulares de CCyC y la base de datos TCGA. A) Se realizó un PCR array de la expresión de genes relacionados con la transición epitelio-mesénquima en las células que sobreexpresan NAMPT de las líneas celulares RPMI-2650 y Detroit-562. Los genes regulados a la alta y a la baja están representados en el diagrama de venn. B) Se representó en un diagrama de venn los genes resultantes del array de RPMI-2650 o Detroit-562 y los genes correlacionados positivamente (alta) y negativamente (baja) con NAMPT en la base de datos pública TCGA de CCyC. 2.4. Efecto de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en CCyC Se han descrito 14 variantes de empalmes alternativos o splicing dentro del gen NAMPT . De todas estas variantes, solamente 4 producirían proteína: NAMPT1, NAMPT2, NAMPT3 y NAMPT4 (Figura 29A). La variante 1, NAMPT1, es la predominante y es la única a la que se le ha atribuido una actividad biológica.53,54 No obstante, quisimos estudiar el efecto de la sobreexpresión de las otras variantes menos conocidas en CCyC. Para sobreexpresar las variantes 2, 3 y 4 realizamos un subclonaje del plásmido pCMV-NAMPT-10his. Una vez obtenidos los plásmidos, transfectamos nuestras líneas celulares de CCyC con cada variante de NAMPT y un vector vacío (EV) como control. Con el objetivo de comprobar la transfección a nivel de ARNm, diseñamos tres sondas TaqMan diferentes: la sonda NAMPT1 que se une a la secuencia 127-151 del ARNm (exón 10) que detecta exclusivamente la variante 1, la sonda NAMPT1/2 que se une a la secuencia 96-120 (exón Resultados 81 4) que detecta tanto la variante 1 como la 2, y la sonda NAMPT1/2/3/4 que se une a la secuencia 41-68 (exón 1-2) detectando todas las variantes (Figura 29A). Figura 29. Validación de los modelos de sobreexpresión de las variantes de NAMPT en las líneas celulares de CCyC. A) Esquema de las sondas diseñadas para detectar las variantes de NAMPT por RT-qPCR: NAMPT1 (se une al exón 10), NAMPT1/2 (exón 4) y NAMPT1/2/3/4 (exón 1-2). B) Comprobación de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en las líneas RPMI-2650 y Detroit-562 por RT-qPCR, Los resultados se expresan en niveles normalizados al EV (1%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). C) Comprobación de la sobreexpresión de las variantes NAMPT1 (56KDa), NAMPT2 (42KDa), NAMPT3 (10kDa) y NAMPT4 (7kDa) por Western-blot utilizando dos anticuerpos diferentes: Ac NAMPT total (hibrida en el extremo N-terminal de la proteína) y Ac NAMPT1 (hibrida en el extremo C-terminal). Resultados 82 Se cuantificaron los niveles de ARNm de los modelos de sobreexpresión de las variantes mediante RT-qPCR utilizando las sondas diseñadas (Figura 29B). Posteriormente, comprobamos la traducción de las proteínas de las variantes mediante Western-blot utilizando dos anticuerpos diferentes: uno que hibrida en el extremo N-terminal de la proteína (1-100 aa) detectando todas las variantes de NAMPT, a este anticuerpo lo llamamos Ac NAMPT total, y otro que hibrida en el extremo C-terminal de la proteína (450-491 aa) detectando exclusivamente la variante 1, dicho anticuerpo lo llamamos Ac NAMPT1. En nuestro análisis, solamente observamos la proteína NAMPT1 (de tamaño 55kDa) y una banda inespecífica de tamaño 37-25kDa, sin observar las bandas correspondientes a las variantes 2 (42kDa), 3 (10kDa) y 4 (7kDa). Estos datos sugieren que las variantes 2, 3 y 4 de NAMPT se transcriben a nivel de ARNm, pero no codifican para proteína (Figura 29C). No obstantes, estas variantes podrían ejercer alguna función regulando a NAMPT1. Bien sabido es que la variante 1 de NAMPT cataliza la reacción limitante de la ruta de rescate de la biosíntesis de NAD+ en la célula. Se desconoce si las otras variantes de NAMPT interfieren en dicha actividad. Por este motivo, quisimos comprobar el efecto biológico de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en nuestras líneas celulares de CCyC. Para ello, medimos los niveles de NAD total y NAD+. Observamos un incremento significativo de NAD (NAD total y NAD+) en las células que sobreexpresaban NAMPT1 en ambas líneas. Sin embargo, no observamos diferencias en los niveles de NAD generados por las células que sobreexpresaban las otras variantes de NAMPT (Figura 30). Figura 30. Validación de la actividad biológica de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en las líneas celulares de CCyC. Cuantificación de los niveles de NAD total, NAD+ y NADH de las líneas RPMI- 2650 y Detroit-562 mediante un ensayo de ciclación. Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 83 Una vez generados los modelos de sobreexpresión de las variantes de NAMPT y validado la actividad biológica de las mismas, el siguiente paso consistió en estudiar si tenían algún efecto tumoral en las líneas de CCyC. Para ello, se realizaron una serie de ensayos funcionales para medir las propiedades tumorales de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT. En primer lugar, realizamos una curva de crecimiento para estudiar la tasa de proliferación celular. Observamos que las células que sobreexpresaban NAMPT1 crecieron más lento, en cambio, no observamos diferencias significativas en las células que sobreexpresaban las demás variantes en comparación con el EV (Figura 31). Figura 31. Efecto de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en la capacidad proliferativa en las líneas celulares de CCyC. Representación de las curvas de crecimiento de las células que sobreexpresan las diferentes variantes de NAMPT en las líneas RPMI-2650 y Detroit-562. Se representa la media ± SD. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). A continuación, realizamos un ensayo de clonabilidad para medir la capacidad de las células de formar clones en ausencia de contacto celular y analizar el fenotipo de los clones formados. No observamos diferencias significativas en el porcentaje de clones formados, aunque las células RPMI-2650 con NAMPT1 sobreexpresado y las células Detroit-562 con la variante 2 sobreexpresada mostraron una tendencia a formar mayor número de clones (Figura 32A). Respecto al fenotipo de los clones, las células Detroit-562 con NAMPT1 sobreexpresado formaron un mayor porcentaje de holoclones (enriquecidos en células con propiedades de célula madre) y un menor porcentaje de paraclones (formados por células más diferenciadas). Sin embargo, las diferentes variantes de NAMPT no parecen tener un efecto significativo en el porcentaje del tipo de clones observado en ambas líneas celulares (Figura 32B). Posteriormente, medimos la capacidad de formación de tumoresferas de las variantes de NAMPT en nuestras líneas celulares de CCyC. Sin embargo, una vez más, no observamos diferencias significativas en el porcentaje de tumoresferas formadas en los modelos de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT (Figura 33). Resultados 84 Figura 32. Efecto de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en la capacidad de formación de clones y en el fenotipo de los mismos, en las líneas celulares de CCyC. A) Ensayo de clonabilidad de las células que sobreexpresan las variantes de NAMPT. B) Se analizaron los diferentes tipos de clones formados en el ensayo de clonabilidad. Se muestran el porcentaje de cada fenotipo de clon en las líneas RPMI-2650 y Detroit-562. Los resultados se expresan en niveles normalizados al EV (100%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Figura 33. Efecto de la sobreexpresión de las variantes de NAMPT en la formación de tumoresferas en las líneas celulares de CCyC. Ensayo de formación de tumoresferas a partir de una célula aislada en la línea RPMI-2650 y ensayo de formación de tumoresferas en la línea Detroit-562. Los resultados se expresan en niveles normalizados al EV (100%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 85 3. NAMPT como diana terapéutica en CCyC NAMPT cataliza la principal ruta de síntesis de NAD+ en las células (la ruta de rescate), por lo que su inhibición produce una depleción importante del contenido NAD+ y una inhibición de la síntesis de ATP, afectando a la proliferación y viabilidad de las células tumorales. Por tanto, NAMPT ha sido propuesto como una diana terapéutica en cáncer. De hecho, en los últimos años, se han desarrollado varios inhibidores específicos contra NAMPT y algunos de ellos se encuentran actualmente en fase 1/2 en ensayos clínicos.1,32,45,63,76 Nosotros quisimos analizar el efecto citotóxico de algunos de estos inhibidores de NAMPT en nuestras líneas celulares de CCyC. En primer lugar, medimos los niveles de NAD para comprobar la actividad biológica de los inhibidores de NAMPT: FK866 (principal compuesto que inhibe la proteína de manera no competitiva)1,58, GMX1778 (inhibidor competitivo que se administra por vía oral)1,90 y GNE617 (inhibidor de segunda generación que se administra por vía oral)1,104,105. También comprobamos la actividad del ácido 2-hidroxinicotínico (2HNA)99, un inhibidor de la enzima NAPRT que cataliza la ruta alternativa de síntesis de NAD+, la vía Preiss-Handler . Cuando tratamos las células parentales RPMI-2650 y Detroit-562 con los inhibidores de NAMPT, observamos una depleción importante del contenido celular de NAD (NAD total y NAD+). Sin embargo, cuando tratamos las células con 2HNA no observamos ningún efecto reductor en los niveles de NAD. Estos datos sugieren que las células dependen completamente de la actividad de NAMPT para la generación de NAD, mientras que la actividad de NAPRT parece ser prescindible si NAMPT está activo (Figura 34). Figura 34. Comprobación del efecto biológico de los inhibidores de NAMPT y NAPRT en las líneas celulares CCyC. Cuantificación de los niveles de NAD total y NAD+ mediante un ensayo de ciclación tras el tratamiento de 24 horas de los inhibidores de NAMPT: FK866 (10M), GNE617 y GMX1778; Y del inhibidor de NAPRT: 2HNA (1mM) en las líneas RPMI-2650 y Detroit-562. Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 86 Tras comprobar el efecto biológico, quisimos estudiar el efecto citotóxico de los inhibidores según los niveles de expresión de NAMPT. Para ello, realizamos un ensayo de citotoxicidad in vitro de los inhibidores FK866, GNE617 y GMX1778 en los que se medió el valor del IC50, es decir, la concentración en la que se produce la inhibición del 50% de las células. Observamos que las células de ambas líneas que sobreexpresaban NAMPT tenían un IC50 más alto en comparación con las células control, mientras que el IC50 de los CRISPRs de NAMPT era más bajo. (Figura 35). Figura 35. Efecto de citotoxicidad de los inhibidores de NAMPT en la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en las líneas celulares de CCyC. Gráficas representativas del IC50 de los inhibidores FK866, GNE617 y GMX1778 en la sobreexpresión y los CRISPRs de NAMPT en las líneas RPMI-2650 y Detroit-562. Se representa la media ± SD. Posteriormente, estudiamos el uso de los inhibidores de NAMPT como un posible tratamiento coadyuvante a la quimioterapia clásica para CCyC, la cual se basa principalmente en derivados del platino y taxanos.135 Para ello, tratamos las células parentales con cisplatino o docetaxel en monoterapia y en combinación con los inhibidores FK866, GNE617 o GMX1778 a dosis constante (IC50 establecidos anteriormente). En el caso del cisplatino, la respuesta citotóxica fue bastante diferente entre las líneas celulares. Los inhibidores de NAMPT hicieron a las células RPMI-2650 más resistentes y a las células Detroit-562 más sensibles al efecto citotóxico de cisplatino. La Resultados 87 combinación con FK866 hizo a las células de ambas líneas ligeramente más resistentes a docetaxel mientras que la combinación de GNE617 o GMX1778 las hicieron más sensibles (Figura 36). Figura 36. Efecto de citotoxicidad de los inhibidores de NAMPT en combinación con cisplatino y docetaxel en las líneas celulares de CCyC. Se muestran los valores de IC50 de cisplatino y docetaxel en monoterapia y en combinación con los inhibidores FK866, GNE617 y GMX1778 en las células parentales de las líneas RPMI-2650 y Detroit-562. Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Los datos in vitro del tratamiento coadyuvante de los inhibidores de NAMPT sugieren que, dentro de la variabilidad observada, los inhibidores de NAMPT podrían sensibilizar a cisplatino y, especialmente, a docetaxel. Por ello, decidimos estudiar el efecto coadyuvante de estos inhibidores GNE617 y GMX1778 in vivo . En primer lugar, generamos modelos de xenotransplantes de cada línea celular en ratones inmunodeprimidos. Una vez generados los tumores, éstos fueron extraídos y fraccionados para reimplantarlos subcutáneamente en el flanco derecho de nuevos ratones. Dos semanas después, los animales se distribuyeron en 12 grupos (n=6) para tratarlos con los inhibidores GNE617 y GMX1778 en monoterapia y en combinación con cisplatino y docetaxel durante 3 semanas. Decidimos descartar al inhibidor FK866, debido a la toxicidad observada en ratones en otros estudios.101,224-226 El tratamiento de cisplatino, GNE617 y GMX1778 en monoterapia redujo significativamente el crecimiento de los tumores originados de las células de RPMI-2650 y Detroit-562. La combinación de estos inhibidores con cisplatino no produjo cambios observables en el crecimiento tumoral, manteniéndose una reducción del tumor similar al tratamiento de cisplatino en monoterapia (Figura 37A). El tratamiento de docetaxel en monoterapia también redujo significativamente el crecimiento de los tumores de las dos líneas celulares. La combinación de GNE617 y GMX1778 con docetaxel mostró un efecto sinérgico de ambos fármacos, consiguiendo la desaparición de los tumores una vez finalizado el tratamiento (Figura 37B). Estos resultados indican que GNE617 y GMX1778 tiene un potente efecto antitumoral, especialmente en combinación con docetaxel, por lo que podrían ser candidatos coadyuvantes a la quimioterapia clásica para CCyC. En cuanto a la toxicidad observada en los experimentos, el tratamiento con docetaxel causó varios efectos secundarios, tales como piel seca, pérdida de peso y mal aspecto. Esta toxicidad se acentuó en la combinación de docetaxel con GNE617, llegando a tener que detener el tratamiento con docetaxel antes de las tres semanas, observándose, aun así, una alta eficacia. Resultados 88 Figura 37. Efecto del tratamiento de los inhibidores de NAMPT en monoterapia y en combinación con cisplatino y docetaxel en el crecimiento tumoral in vivo en xenotransplantes en las líneas celulares de CCyC. Tratamiento de ratones xenotransplantados con fármacos experimentales (en azul) y con fármacos tradicionales para CCyC (en rojo) en monoterapia y en combinación (en morado). Los fármacos experimentales fueron: GNE-617 (30mg/kg) 5 días consecutivos seguido de 5 días de descanso por vía oral y GMX1778 (200mg/kg) 1 vez a la semana por vía oral. Los fármacos tradicionales fueron: cisplatino (2mg/kg) 4 veces a la semana por vía IP (A) y docetaxel (15mg/kg) 2 veces a la semana por vía IP (B). Se muestran las gráficas del volumen tumoral desde la implantación de las fracciones del tumor hasta el sacrificio de los animales. Los tratamientos duraron 3 semanas (franja en gris) y la medición de los tumores se continuó dos semanas más. Los tumores xenotransplantados se generaron a partir de células de las líneas celulares RPMI- 2650 y Detroit-562. Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico del último punto se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Resultados 89 4. Estudio del papel de NAMPT en la biosíntesis y metabolismo de NAD+ en CCyC Las células de los mamíferos dependen principalmente de la ruta de rescate para regenerar y mantener sus niveles de NAD+ y así satisfacer sus demandas glucolíticas y no-glucolíticas.1,8-11,39 No obstante, existen rutas alternativas que sintetizan NAD+ a partir de precursores procedentes de la dieta: la ruta De novo (a partir del triptófano, Trp), la ruta Preiss-Handler (a partir del ácido nicotínico, NA) y ruta de nucleósido (a partir del ácido nicotínico ribósido, NAR, o de la nicotinamida ribósido, NR).1,3,21 Debido a esta complejidad, quisimos estudiar el papel de NAMPT en las otras rutas alternativas de la biosíntesis de NAD en CCyC. Anteriormente, observamos que las células de los CRISPRs de NAMPT, a pesar de tener bajos niveles de NAD, son capaces de crecer y restaurar el cultivo celular. Cuando realizamos la curva de crecimiento para estudiar la capacidad proliferativa de estas células, observamos que los CRISPRs tenían un crecimiento lento al principio de la curva, pero luego asemejaban su tasa proliferativa al de las células parentales. Este comportamiento fue bastante notable en la línea celular RPMI-2650. Posiblemente, los CRISPRs de NAMPT estarían recuperando de algún modo el contenido NAD celular utilizando alguna vía alternativa. Para comprobarlo, sembramos las células parentales y los CRISPRs para realizar un ensayo de curva de crecimiento (Figura 38A) y recogimos las células en tres puntos distintos: en el día 4, día 7 y día 11. Luego, extrajimos proteínas y analizamos la expresión de las proteínas NAMPT y NAPRT (la principal enzima de la ruta Preiss-Handler ) mediante Western-blot . Observamos que tanto las células parentales como los CRISPRs poseían niveles similares de la proteína NAPRT al inicio de la curva de la línea RPMI- 2650. A partir del día 7, las células parentales aumentaban ligeramente los niveles de NAMPT, pero no modificaban los niveles de NAPRT. En cambio, los CRISPRs aumentaban considerablemente los niveles de NAPRT al final de la curva, en el día 11. En la línea Detroit-562, el CRISPR D11 presentaba niveles altos de NAPRT al inicio de la curva, no obstante, no observamos cambios significativos en la expresión de esta proteína a lo largo de la curva. Respecto a la proteína NAMPT, observamos que los CRISPRs, especialmente D11, aumentaban los niveles de la proteína al final de la curva. Estos datos podrían justificar porqué la capacidad de proliferación de D11 era bastante similar a las células parentales (Figura 38B). Por otra parte, medimos los niveles de NAD total y NAD+ de las células en el día 4, 7 y 11. Pudimos apreciar un aumento de los niveles de NAD (total y NAD+) al final de la curva de crecimiento, en el día 11, en los CRISPRs de ambas líneas celulares (Figura 38C). Todos estos datos sugieren que los CRISPRs de NAMPT aumentan su contenido de NAD para recuperar la tasa de proliferación celular durante la curva de crecimiento. Los CRISPRs de RPMI-2650 podrían hacerlo a través de la ruta Preiss-Handler , potenciando la actividad de NAPRT, mientras que los CRISPRs de Detroit-562 lo harían a través de la ruta de rescate, potenciando la actividad remanente de NAMPT. Resultados 96 Las células tumorales son capaces de reprogramar y modificar su metabolismo en función de los recursos y las condiciones del microambiente.1,28 Revisando la composición del medio de cultivo, identificamos los siguientes compuestos que pueden alterar el metabolismo de las células: D-glucosa (4,5 g/L), L-glutamina (0,584 g/L) y nicotinamida (NAM, 0,004 mg/L). Con el objetivo de evaluar la capacidad de adaptación de los CRISPRs de NAMPT en CCyC, realizamos una serie de ensayos en condiciones de limitación de estos nutrientes. En primer lugar, realizamos una curva de crecimiento en medio normal (que contiene alta glucosa 4,5 g/L, glutamina y NAM), en medio con baja glucosa (glucosa 1g/L, glutamina y NAM), en medio sin glucosa (glutamina y NAM), en medio sin glutamina (glucosa 4,5g/L y NAM) y en medio sin nicotinamida/NAM (glucosa 4,5g/L y glutamina). Observamos que los CRISPRs de NAMPT tendieron a crecer más rápido en medio con baja glucosa, mientras que las células parentales redujeron ligeramente su velocidad de crecimiento en ambas líneas celulares. Un cambio a metabolismo OXPHOS debido a la baja disponibilidad de glucosa para compensar el bajo rendimiento energético de la glucólisis podría explicar este comportamiento de los CRISPRs. Por otra parte, el crecimiento, tanto de los CRISPRs como de las células parentales, se redujo bastante en los medios sin glucosa, sin glutamina y sin NAM. En RPMI-2650, el crecimiento fue completamente inhibido en ausencia de glutamina, lo que sugiere que la capacidad proliferativa de estas células depende del metabolismo de la glutamina. En el caso de Detroit-562, el crecimiento fue inhibido en ausencia de glucosa y en ausencia de NAM, lo que indica que la capacidad proliferativa de estas células depende bastante de estos metabolitos (Figura 43A). Luego, realizamos un ensayo de clonabilidad usando los medios anteriores. En la línea RPM- 2650, las células tendieron a formar menos clones en el medio con baja glucosa y en medio sin NAM, aunque estos cambios no fueron estadísticamente significativos. Las células formaron menos número de clones de manera significativa en ausencia de glucosa. Y las células sin glutamina no formaron ningún clon en ausencia de glutamina, lo que sugiere que la capacidad de formación de clones de estas células depende del metabolismo de la glutamina. En el caso de la línea Detroit-562, no observamos ningún cambio significativo en medio con baja glucosa. No obstante, observamos una reducción muy significativa en la formación de clones en ausencia de glucosa, de glutamina y de NAM. Estos datos indican que la capacidad de formación de clones de estas células depende de la disponibilidad de estos metabolitos (Figura 43B). Por otra parte, comprobamos como la disponibilidad de estos nutrientes afecta a los niveles de NAD total y NAD+. En la línea RPMI-2650, observamos un ligero aumento del contenido de NAD (total y NAD+), tanto en las células parentales como en los CRISPRs de NAMPT, en medio con baja glucosa y en ausencia de glucosa. Y observamos una reducción de los niveles de NAD en ausencia de glutamina. En el caso de la línea Detroit-562, no obtuvimos resultados claros y se necesitarían más estudios (Figura 43C). Todos estos datos sugieren que las líneas celulares RPMI-2650 y Detroit-562 tienen un perfil metabólico diferente. Resultados 97 Figura 43. Efecto de la limitación de nutrientes metabólicos en las propiedades tumorigénicas de los CRISPRs de NAMPT en las líneas celulares de CyCC. A) Ensayo de proliferación celular mediante una curva de crecimiento de los CRISPRs de NAMPT en medio normal (control: que contiene glucosa 4,5g/L, glutamina y NAM), en medio con baja glucosa (que contiene glucosa 1g/L, glutamina y NAM), en medio sin glucosa (que contiene glutamina y NAM), en medio sin glutamina (que contiene glucosa 4,5g/L y NAM) y medio sin NAM (que contiene glucosa 4,5g/L y glutamina) en las líneas RPMI-2650 y Detroit-562. B) Ensayo de clonabilidad en medio normal (control, C), con baja glucosa (BG), sin glucosa (SG), sin glutamina (SGT) y sin NAM (SN). Los resultados se expresan en niveles normalizados a la condición control (100%). C) Cuantificación de los niveles de NAD total y NAD+ en los diferentes medios. Los resultados se expresan en niveles normalizados a las células control en condición control (100%). Se representa la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con el test t-Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). DISCUSIÓN Discusión 101 Cáncer de cabeza y cuello (CCyC) es en realidad un conjunto de tumores que afectan a diferentes localizaciones anatómicas (cavidad oral, lengua, faringe, nasofaringe, etc.)133-135, lo que contribuye a la alta heterogeneidad que caracteriza a este tipo de cáncer.150 La quimioterapia clásica aplicada a los pacientes incluye principalmente los fármacos derivados del platino (ej. cisplatino) y los taxanos (ej. docetaxel).131,133 La terapia alternativa consiste en el uso de inhibidores de EGFR, de mTOR y de IGF1R.135,143,146,147-149 Sin embargo, actualmente la tasa de recurrencia del tumor y la tasa de mortalidad de los pacientes siguen siendo elevadas,150 principalmente en tumores CCyC VPH negativos que no están relacionados con la infección del virus.136,141 Por lo que resulta vital la búsqueda de identificadores pronóstico y el desarrollo de nuevos tratamientos dirigidos específicamente contra la subpoblación CSC o célula madre tumoral, la cual, es responsable de la iniciación, progreso y metástasis del tumor y de la resistencia a las terapias convencionales.1,117-120 Al igual que las células madre normales, las células CSC tienen la capacidad de autorrenovación y diferenciación a los distintos tipos de células cancerosas que componen el tumor.1,113-116 Además, las CSCs expresan antígenos específicos en su superficie que dependen en gran medida del tipo de cáncer y que nos ayudan a identificar a esta subpoblación. 126,127 Sin embargo, existe una gran controversia respecto a los marcadores que identifican a la subpoblación CSC en CCyC debido a la heterogeneidad de estos tumores.150 Por este motivo, decidimos buscar marcadores de CSC y validar sus propiedades tumorigénicas. Para ello, utilizamos la línea RPMI-2650, procedente de carcinoma de nariz, y la línea Detroit-562, procedente de carcinoma de faringe, como modelos celulares de CCyC. Ambas líneas han resultado tener un fenotipo bastante distinto, siendo un ejemplo de la heterogeneidad real de este tipo de tumor. Marcadores CSCs en CCyC Analizamos la expresión de los marcadores de superficie CD10, CD184, CD19, CD133, CD166 y CD44 en nuestras líneas celulares por citometría de flujo (Tabla 8). Rápidamente descartamos CD166 en la línea Detroit-562 y CD44 en ambas líneas celulares, ya que toda la población celular era positiva para estos marcadores y no todas las células tienen la capacidad de regenerar el cultivo. El uso de CD44 y CD166 como marcadores específicos de CSC está muy discutido en la literatura. En el caso de CD44, su especificidad depende en gran medida del tejido original del tumor.146,148 Por ejemplo, varios estudios en tumores de cavidad oral muestran que tanto el tejido sano como el tumoral expresan CD44, por lo que este marcador no es capaz de identificar a las células tumorales.156-158 Además, varias líneas tumorales de boca, hipofaringe y orofaringe muestran elevados porcentajes de CD44,157 lo que coincide con los resultados en nuestras líneas. En el caso de CD166, hay pocos estudios que investiguen su papel como marcador de CSC en CCyC. Algunos estudios indican que CD166 se encuentra altamente expresado en CCyC, poniendo en duda su utilidad como marcador específico de CSC.198,199 El patrón de expresión de CD166 probablemente dependa del tejido original del tumor, al igual que ocurre con CD44. Toda la población celular de Detroit-562 era positiva para CD166, mientras que el porcentaje era entorno Discusión 102 al 60% en la línea RPMI-2650. Aunque dicho porcentaje es demasiado alto para ser células con fenotipo CSC, los resultados de las propiedades tumorigénicas de las células CD166 positivas fueron bastante interesantes en RPMI-2650. En los experimentos in vitro , las células CD166 positivas formaron un mayor número de clones y tumoresferas que son formaciones celulares enriquecidas en progenitores multipotentes capaces de regenerar el cultivo celular.169-172,176-178 En los experimentos in vivo , los tumores originados a partir de las células CD166 positivas mostraron un mayor crecimiento tumoral en xenotransplantes (Figura 10). Además, las células con niveles de expresión reducidos del oncogén NAMPT mostraron una disminución muy significativa del porcentaje de células CD166 positivas, indicando que CD166 y NAMPT podrían estar relacionados. En este trabajo hemos observado que la reducción de NAMPT disminuye la capacidad tumorigénica y las propiedades relacionadas con el fenotipo CSC en las células tumorales. Todo ello sugiere que CD166 podría ser un marcador tumorigénico y estar relacionado con el fenotipo CSC en la línea RPMI-2650. CD133 es un marcador de CSC bien definido en muchos tipos de tumores, sin embargo, su uso en CCyC está muy discutido.151,152,159,160 Algunos estudios incluso no han detectado este marcador en preparaciones de muestras de pacientes.158,227 La subpoblación más pequeña detectada en nuestras líneas celulares fue precisamente la formada por las células positivas para CD133. El porcentaje de células CD133 positivas fue inferior al 0,05%, aunque este porcentaje aumentó en las tumoresferas generadas de las líneas. Sin embargo, no obtuvimos resultados claros al estudiar las propiedades tumorigénicas de la subpoblación CD133 positiva. Parece que CD133 no es un buen marcador específico de CSC en nuestros modelos celulares, lo que coincide con algunos estudios que descartan a este marcador debido a su baja expresión en tumores y a su escasa relación con los parámetros clínicos.152,158,227 Los resultados in vitro del marcador CD19 tampoco fueron muy claros. CD19 ha sido propuesto como un biomarcador pronóstico sólo en tumores de CCyC positivos para el virus VPH.190,191 Se necesitarían más estudios para esclarecer su utilidad como marcador de CSC en tumores VPH negativos. Sin duda, los marcadores más prometedores fueron CD166 en la línea RPMI-2650, y CD10 y CD184 en la línea Detroit-562. En el caso del marcador CD10, las tumoresferas generadas de la línea Detroit-562 mostraron un mayor porcentaje de células CD10 positivas que el extracto total celular. Los tumores formados a partir de esta subpoblación CD10 positiva en los xenotransplantes in vivo crecieron con una mayor velocidad y agresividad (Figura 6). Estos resultados coinciden con los de un estudio en el que observaron un mayor crecimiento tumoral en tumores de lengua CD10 positivos.228 En otros subtipos de CCyC, como en carcinoma oral, CD10 ha sido propuesto como un indicador de mal pronóstico en los pacientes.174 Además, se han encontrado altos niveles de CD10 en células resistentes a cisplatino, fluoracilo y radiación en varias líneas celulares de CCyC, incluida Detroit-562.173 Las citoquinas de inflamación IL-6 e IL-8 parecen estar implicados en el mecanismo de resistencia de CD10 a estos fármacos.175 CD10 también está implicado en varias vías de señalización, como la vía PI3K-Akt,175,229 la cual se Discusión 103 encuentra altamente activada en CCyC.137,143 Todo esto indica que CD10 podría ser un buen marcador CSC en algunos subtipos de CCyC. En el caso del marcador CD184, las tumoresferas de Detroit-562 también mostraban un mayor porcentaje de células CD184 positivas. Las tumoresferas tenían altos niveles transcripcionales de CD184 en comparación con el extracto total celular. Y, al igual que pasaba con CD10, los tumores formados a partir de la subpoblación CD184 positiva en los xenotransplantes in vivo crecieron más rápido y con mayor agresividad que los tumores procedentes de la población negativa (Figura 7). CD184 ha sido descrito como un receptor de membrana que se expresa principalmente en las células con fenotipo CSC. Varios estudios proponen que la interacción de CD184 con su sustrato SDF-1 favorece la interacción de las células CSC con el microambiente tumoral en CCyC.181 182 Pero, no hemos encontrado estudios que evalúen, como hemos hecho nosotros, la capacidad tumorigénica de la subpoblación CD184 positiva. En nuestro estudio, no hemos encontrado una única población CSC en nuestras líneas celulares, sino que hemos obtenido varias subpoblaciones independientes con capacidad tumorigénica relacionada con el fenotipo de célula madre tumoral. Esto es posible porque la población CSC es altamente heterogénea, habiendo diferentes subgrupos dentro del mismo tumor.117,120,122 Las subpoblaciones CD10, CD184, CD19, CD133 y CD166 positivas aisladas fueron capaces de regenerar las distintas poblaciones de los otros marcadores reconstituyendo así la heterogeneidad del cultivo. Sin embargo, las células negativas para un marcador aún eran positivas para el resto de los marcadores (Figura 11). La plasticidad celular observada en nuestras células podría explicar la existencia de varias subpoblaciones distintas de CSC dentro de los cultivos y la dificultad de identificar marcadores de una única subpoblación de CSC. Por otro lado, encontramos varios genes diferenciales entre las subpoblaciones positivas y negativas comunes a los marcadores CD10, CD184 y CD19 mediante secuenciación NGS. Los genes resultantes de la secuenciación fueron IFIT3, MAP4K4, B4GALT4, ZMYND11, ECHDC1, EIF4A1, TP53BP1 y HAUS4. La mayoría de estos genes están implicados en procesos relacionados con el fenotipo CSC, tales como la migración celular, la metástasis, la supervivencia de los pacientes y la resistencia a la quimioterapia. Estos datos refuerzan el papel de estos marcadores como identificadores de las subpoblaciones CSC y sugieren que existe una relación entre ellos. NAMPT, un marcador tumoral y de CSC en CCyC Además de los marcadores anteriores, también proponemos a NAMPT como un posible marcador tumoral y de CSC en CCyC. NAMPT es la enzima limitante que cataliza la primera reacción de la ruta de rescate de la biosíntesis de NAD+ en la célula.1,41-45 Una de las características que definen a las células tumorales es la de su habilidad de reprogramar su metabolismo para permitir la alta tasa de crecimiento y producción de biomasa.28 Las células tumorales deben incrementar la producción de NAD+ para satisfacer las altas demandas glucolíticas y noglucolíticas del tumor. De hecho, se han encontrado mayores tasas de NAD+/NADH en las células Discusión 104 tumorales en comparación con las células no-tumorales.1,29 Por lo que no es de extrañar que, NAMPT, siendo una enzima crucial para la producción de NAD+ en la célula, haya sido descrito como un oncogén en diversos tipos de cáncer, incluyendo neoplasias hematológicas,63,64 cáncer de colon,42 próstata,65 mama,66 tiroides,67 gástrico68 y glioblastoma.43,44 Sin embargo, el papel tumorigénico de NAMPT en CCyC todavía no ha sido evaluado. Encontramos altos niveles de expresión de NAMPT en las tumoresferas generadas de nuestras líneas celulares de CCyC. La sobreexpresión de NAMPT favoreció la formación de clones y aumentó la expresión de algunos genes implicados en la regulación de la pluripotencia de las células madre, como son SOX2 y NANOG , en la línea RPMI-2650. Los tumores procedentes de las células con NAMPT sobreexpresado de la línea Detroit-562 mostraron un crecimiento más rápido y agresivo en xenotransplantes. Sin embargo, no obtuvimos resultados claros en otras propiedades tumorigénicas. Por este motivo, decidimos estudiar el efecto de la reducción de NAMPT. Para ello, generamos modelos knock-down utilizando el sistema CRISPR-Cas9 de la variante 1, NAMPT1, que es la única que tiene una actividad biológica reconocida.53,54 La secuencia diana del sgARN utilizado se localizaba en el exón 10, justo después de la secuencia que codifica los aminoácidos que conforman el sitio catalítico de la proteína (D219 en el exón 6, G384 y R392 en el exón 9).58 La reducción de los niveles de NAMPT en los CRISPRs conllevó una reducción significativa de los niveles celulares de NAD. Esta reducción fue más eficiente en los CRISPRs de la línea RPMI-2650 que en los de Detroit-562, posiblemente esto se deba a que Detroit-562 tenía niveles basales de NAD más altos que la otra línea. (Figura 14). De modo que, los CRISPRs R46 y R48 de RPMI-2650 mostraron tener una menor capacidad tumorigénica que los CRISPRs D11 y D16 de Detroit-562. No obstante, de manera general, la reducción de NAMPT redujo la capacidad de proliferación, la de formación de clones, el crecimiento en condiciones de competición con otras células y el crecimiento in vivo de los tumores generados en modelos de xenotransplantes. (Figura 16-18) Todos estos datos indican que NAMPT podría estar involucrado en el proceso de tumorigénesis en CCyC. En varios tipos de cáncer, se ha descrito que NAMPT es capaz de enriquecer la población CSC del tumor, mediante los procesos de pluripotencia y de desdiferenciación, mecanismo por el que las células adquieren las propiedades y el fenotipo de las células madre tumorales.1,42,43,45 En nuestras líneas celulares, la reducción de NAMPT conllevó a una disminución de las propiedades relacionadas con el fenotipo de célula madre, principalmente en RPMI-2650. Los CRISPRs de NAMPT de esta línea presentaron un menor porcentaje de holoclones y una menor capacidad de formación de tumoresferas. Estas células mostraron bajos niveles de expresión de algunos genes implicados en la regulación de la pluripotencia de las células madre, como son SOX2 y KLF4 . Sin embargo, los resultados in vitro no fueron tan claros en la línea Detroit-562. Por otra parte, cuando inoculamos las tumoresferas generadas a partir de los CRISPRs de NAMPT en ratones inmunodeprimidos, obtuvimos que la eficiencia de la formación tumoral fue de tan solo el 50%, que los tumores formados fueron de menor tamaño y que tardaron más tiempo en aparecer en Discusión 105 comparación con los tumores controles (Figura 20-22, 25). Aunque no observamos un aumento claro de las propiedades CSC con la sobreexpresión de NAMPT, sí observamos una disminución de estas propiedades cuando reducimos la expresión de NAMPT en los CRISPRs. Una propiedad relacionada con las células CSC es la capacidad de migración e invasión. NAMPT está involucrado en el proceso de transición epitelio-mesénquima (EMT), proceso por el que las células epiteliales pierden su polaridad y su adherencia para transformarse en células mesenquimales con capacidades migratorias e invasivas. EMT favorece la invasión y la metástasis del tumor.1,42,43 Por ese motivo, evaluamos el papel de NAMPT en el proceso EMT en CCyC. Observamos que la sobreexpresión de NAMPT favorecía la migración de las células, mientras que la reducción de NAMPT reducía la capacidad de migración celular en la línea RPMI-2650. A nivel transcripcional, el aumento de la expresión de NAMPT incrementó los niveles de expresión de algunos genes implicados en el proceso EMT, tales como TWIST1 , VIM , FOXC2 , CDH2 y GSC en RPMI-2650 y Detroit-562. Además, encontramos varios genes que correlacionaban positivamente con la sobreexpresión de NAMPT de nuestras células en la base de datos pública TCGA de pacientes con CCyC. Los genes resultantes fueron CDH1, DESI1, MAP1B, TMEFF1, OCLN, TCF4, SMAD2, TFRC, AHNAK, PATP4A1, MSN, STEAP1, PGK1 y F11R (Figura 26-28). En los experimentos en modelos de xenotransplantes, aunque no observamos macrometástasis, bien es cierto que podría haber habido micrometástasis a nivel celular tal y como indican los resultados in vitro . Todos estos resultados sugieren que NAMPT podría estar involucrado en el proceso de migración y de EMT en CCyC. NAMPT, además de enriquecer la población CSC del tumor, puede actuar como un marcador específico de estas células en varios tipos de cáncer. La reducción de los niveles de NAMPT conllevó a una reducción del porcentaje de las subpoblaciones CD10, CD184, CD19, CD133 y CD166 positivas en nuestras líneas celulares de CCyC. También produjo una disminución de los niveles de expresión de estos genes a nivel transcripcional (Tabla 9, Figura 23). NAMPT podría ser un marcador específico de CSC en CCyC, al igual que CD10, CD184 y CD166. Además, parece existir una relación entre el marcador NAMPT y los demás marcadores. Basándonos en todos los datos de este trabajo, proponemos un modelo en el que NAMPT actúa como marcador común de las distintas subpoblaciones CSC en CCyC. La Figura 44 muestra la relación entre los distintos marcadores. Las CSCs son responsables de la resistencia a la radio y quimioterapia y a la tasa de recurrencia de los tumores en pacientes.117-119 En la base de datos TCGA, comprobamos que altos niveles de NAMPT correlacionaban con una peor supervivencia en los pacientes con CCyC (Figura 14). Por lo que, NAMPT podría ser también un indicador de mal pronóstico en CCyC, al igual que ocurre en cáncer de estómago, de colon y glioblastoma.1,42,43,68 Discusión 112 562 fue más dependiente al metabolismo de la glucosa y de NAM. La ausencia de glucosa y la ausencia de glutamina en el medio inhibió completamente el crecimiento y la capacidad de formación de clones de las células parentales y de los CRISPRs de NAMPT. En cambio, una baja disponibilidad de glucosa hizo que las células de los CRISPRs de NAMPT de ambas líneas crecieran más rápido y las células parentales crecieran un poco más lento, igualando de este modo la tasa de proliferación de ambas condiciones (Figura 43). Una posible explicación de este comportamiento sería que la baja disponibilidad de glucosa sumado a los niveles reducidos de NAD no sea suficiente para mantener el acelerado metabolismo glucolítico. Especulamos que el estrés celular ocasionado por esta situación fuerce a las células de los CRISPRs a adaptar su metabolismo glucolítico a OXPHOS que, aunque sea más lento, tiene un rendimiento energético más alto.1,32,33 Esta adaptación metabólica podría permitir un aumento de la proliferación de estas células. Al comprobar los niveles celulares de NAD en condiciones de baja glucosa, observamos una ligera acumulación de los niveles de NAD, lo que podría indicar un cambio en el metabolismo celular. No obstante, se requieren más estudios para elucidar si nuestra especulación es cierta. Resumen final En resumen, nuestro trabajo demuestra que existen diferentes subpoblaciones dentro de la población CSC en CCyC. Los marcadores CD10, CD184 y CD166 pueden ser marcadores tumorales que identifican algunas de estas subpoblaciones CSC. Descartamos el uso de CD44 como marcador específico de CSC en este tumor, debido a que la población total expresa esta proteína. También descartamos a CD133 por su baja expresión y especificidad, al igual que CD19. Hemos observado una plasticidad celular entre las distintas subpoblaciones, lo que explicaría la elevada heterogeneidad de la población CSC y la dificultad de identificar marcadores específicos. NAMPT también puede ser un marcador tumoral y específico de las células CSC en CCyC. La reducción de los niveles de NAMPT en los CRISPRs produce una disminución en las propiedades tumorales, en la capacidad de migración y en el fenotipo CSC. Además, estas células presentaban menor porcentaje de las subpoblaciones celulares CD10, CD184, CD19, CD133 y CD166 positivas. Estos datos indican que NAMPT podría ser un marcador común a los otros marcadores en CCyC. NAMPT también podría ser un indicador de mal pronóstico en pacientes con CCyC según la base de datos TCGA. Los inhibidores de NAMPT FK866, GNE617 y GMX1778 producen una importante depleción de los niveles de NAD causando un efecto citotóxico en las células. El tratamiento coadyuvante de GNE617 y GMX1778 mejora la respuesta de las células y de los tumores a los quimioterapéuticos clásicos cisplatino y docetaxel tanto in vitro como in vivo . Por otra parte, hemos observado que los CRISPRs de NAMPT pueden recuperar los niveles basales de NAD a través de las vías alternativas de biosíntesis de NAD+, como son la ruta Preiss-Handler y la ruta de nucleósido. Además, la administración exógena de NA permite a los CRISPRs de NAMPT recuperar la capacidad de proliferación celular y la capacidad de formación de clones. Curiosamente, la acumulación de NAM administrado exógenamente es capaz de evadir la reacción catalizada por NAMPT en la ruta de rescate y entrar en la ruta alternativa Preiss-Handler Discusión 113 aumentando el contenido celular de NAD. En este trabajo, proponemos una reacción de desaminación equivalente a la que se da en bacterias, en donde NAM es convertido en NA para generar NAD+. Por último, una baja disponibilidad de glucosa en el medio parece aumentar la capacidad de proliferación y de formación de clones de las células de los CRISPRs de NAMPT. CONCLUSIONES Conclusiones 117 1. No hemos encontrado una única población CSC, sino varias subpoblaciones independientes identificadas con los marcadores CD10, CD184, CD19, CD133 y CD166, y con plasticidad entre ellas para reconstituir la heterogeneidad del cultivo. 2. NAMPT puede ser un marcador común de las distintas subpoblaciones CSC. Además, NAMPT es un indicador de mal pronóstico en los pacientes de CCyC. 3. La reducción de los niveles de expresión de NAMPT disminuye las propiedades tumorigénicas y las propiedades relacionadas con el fenotipo de célula madre, incluyendo la capacidad de migración de las células. La reducción de NAMPT también disminuye el porcentaje de las subpoblaciones CD10, CD184, CD19, CD133 y CD166 dentro del cultivo. 4. La sobreexpresión de las variantes de NAMPT menos conocidas no ha mostrado ningún efecto significativo en las propiedades tumorigénicas de las células. 5. El tratamiento con los inhibidores de NAMPT GNE617 y GMX1778 es eficaz contra tumores en xenotransplantes in vivo . El tratamiento coadyuvante de GNE617 y GMX1778 potencia el efecto antitumoral de cisplatino y docetaxel, por lo que estos inhibidores podrían ser candidatos para utilizarse como coadyuvantes a la quimioterapia actual en CCyC. 6. Los CRISPRs de NAMPT recuperan su crecimiento tras unos días en el ensayo de proliferación. El mecanismo de esta resistencia es diferente en cada línea celular. Los CRISPRs de la línea RPMI-2650 activan la enzima NAPRT de la ruta Preiss-Handler y los CRISPRs de Detroit-562 potencian la actividad remanente de NAMPT. 7. La activación de NAPRT mediante la administración de su precursor ácido nicotínico (NA) permite a los CRISPRs de NAMPT recuperar las propiedades tumorigénicas basales. Mientras que la inhibición de NAPRT por 2HNA reduce aún más las propiedades tumorigénicas. 8. La administración exógena de los precursores ácido nicotínico (NA), nicotinamida ribósido (NR) y nicotinamida (NAM), pero no de triptófano (Trp), permite a los CRISPRs de NAMPT reabastecer el contenido de NAD+. 9. Nicotinamida (NAM) ha mostrado ser capaz de evadir la ruta de rescate, catalizada por NAMPT, utilizando la vía alternativa Preiss-Handler . La acumulación de NAM aumenta el contenido de NAD+ celular, aunque estén bloqueadas las dos rutas de la biosíntesis de NAD+. CONCLUSIONS Conclusions 121 1. We have not found a single CSC population, but several independent subpopulations identified with the markers CD10, CD184, CD19, CD133 and CD166. These subpopulations have shown plasticity between them to regenerate the culture heterogeneity. 2. NAMPT can be a common marker for the different CSC subpopulations. Furthermore, NAMPT is an indicator of poor prognosis in patients with HNSCC. 3. NAMPT downregulation decreases the tumorigenic and the CSC-like properties, including cell migration capacity. NAMPT downregulation also decreases the percentage of CD10, CD184, CD19, CD133 and CD166 subpopulation within the culture. 4. NAMPT variants overexpression has not shown any significant effect on tumorigenic properties in cells. 5. The treatment with NAMPT inhibitors (GNE617 and GMX1778) is effective against xenograft tumors in vivo . Adjuvant treatment of GNE617 and GMX1778 potentiates the antitumor effect of cisplatin and docetaxel, so these inhibitors could be candidates for use as adjuvants to current chemotherapy in HNSCC. 6. NAMPT CRISPRs cells recover their growth rate after few days in the proliferation assay. The mechanism of this resistance is different in each cell lines. The CRISPRs from RPMI-2650 cell line activate NAPRT enzyme of the Preiss-Handler pathway, while the CRISPRs from Detroit- 562 cell line enhance the NAMPT remaining activity. 7. The NAPRT activation by the administration of its precursor nicotinic acid (NA), allows the NAMPT CRISPRs cell to recover the basal tumorigenic properties. While the NAPRT inhibition by 2HNA further reduces the tumorigenic properties. 8. Exogenous administration of nicotinic acid (NA), nicotinamide riboside (NR) and nicotinamide (NAM) precursors, but not tryptophan (Trp), allows the NAMPT CRISPRs cells to recover NAD+ pool. 9. 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