Supresion de la respuesta SOS como estrategia para la sensibilización de bacterias Gram-negativas resistentes a quinolonas.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Microbiología TESIS DOCTORAL Supresión de la respuesta SOS como estrategia para la sensibilización de bacterias Gram-negativas resistentes a quinolonas Trabajo realizado para alcanzar el grado de Doctor por la Licenciada en Biología y Bioquímica Dña. Esther Recacha Villamor Sevilla, Noviembre de 2018 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Microbiología El Dr. D. Álvaro Pascual Hernández, Catedrático del Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla y el Dr. D. José Manuel Rodríguez Martínez, Profesor Titular del Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: Que la Tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla que lleva por título “SUPRESIÓN DE LA RESPUESTA SOS COMO ESTRATEGIA PARA LA SENSIBILIZACIÓN DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS RESISTENTES A QUINOLONAS” ha sido realizada por Dña. Esther Recacha Villamor bajo nuestra supervisión, considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación. Y para que conste donde proceda, firmamos el presente certificado en Sevilla, a 14 de Noviembre de 2018. Dr. D. Álvaro Pascual Hernández Dr. D. José Manuel Rodríguez Martínez AGRADECIMIENTOS …¿Quieres realizar la Tesis Doctoral, aunque eso implique quedarte todas las tardes realizando experimentos, sin horario fijo y combinando tus obligaciones de residente con las de doctorando? “Sí, quiero”, un compromiso personal más allá de lo laboral. Así empezó todo, recién aterrizada en el servicio de Microbiología del H. U. V. Macarena, cuando Álvaro, me brindó esta gran oportunidad. En primer lugar, quisiera agradecer a mis directores, Álvaro y José Manuel, por confiar en mí para llevar a cabo este proyecto. Gracias Álvaro por hacer accesible la investigación a los residentes e inculcarnos la importancia de una formación de calidad, en la que clínica e investigación deben ir de la mano. Gracias por tus consejos e ideas, siempre necesarias. A José Manuel, pilar básico de este proyecto, gracias por muchas cosas…por tu generosidad al incluirme en tu equipo, la investigación requiere muchas horas…; por servirme de referente; pero sobre todo por estar ahí siempre que te he necesitado y apostar por mí. Por supuesto, también quisiera agradecer a todo el personal investigador y técnico de la “Cátedra”, su gran amabilidad e inmejorable predisposición a ayudarte. En especial, a Paula y María, un placer haber trabajado con vosotras en este proyecto y gracias por todo lo que me enseñásteis. Imposible no mencionar a Fernando, de esa clase de personas necesarias en cualquier parte. Y porque el equipo une, muchas gracias Jesús, por explicarme cada cosa que no entendía, resolver mis dudas y aconsejarme cuando te lo pedía, ya fuera en el laboratorio o tomando una cerveza. Tantas horas trabajando juntas, trae consigo además de una Tesis, la amistad. Gracias a todas las residentes por vuestro apoyo, las amigas que mejor te entienden. Gracias a todos los adjuntos del servicio, por comprender la importante carga de trabajo que con lleva la realización de una Tesis a la vez que la residencia y su capacidad para facilitarme el trabajo, sin dejar de transmitir el compromiso fundamental del residente. Sin su ayuda, hubiera sido imposible. Por último, agradecer a mi familia su eterno apoyo, por aconsejarme en todos los momentos importantes y confiar en mí siempre. TESIS POR COMPENDIO DE ARTÍCULOS PREVIAMENTE PUBLICADOS Esta tesis, de acuerdo con el informe correspondiente y la autorización de los directores de la misma y del órgano responsable del Programa de Doctorado, se presenta como un compendio de dos artículos. Las referencias completas a los artículos que componen el cuerpo de la tesis son las siguientes: Quinolone Resistance Reversion by Targeting the SOS Response. Recacha E, Machuca J, Díaz de Alba P, Ramos-Guelfo M, Docobo-Pérez F, Rodriguez-Beltrán J, Blázquez J, Pascual A, Rodríguez-Martínez JM. mBio. 2017 Oct 10;8(5). pii: e00971-17. doi: 10.1128/mBio.00971-17. Factor de impacto: 6,689 (1er decil, JCR 2017). Suppression of the SOS response modifies spatiotemporal evolution, post-antibiotic effect, bacterial fitness and biofilm formation in quinolone-resistant Escherichia coli. Recacha E, Machuca J, Díaz-Díaz S, García-Duque A, Ramos-Guelfo M, Docobo-Pérez F, Blázquez J, Pascual A, Rodríguez-Martínez JM. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2018 Oct 16. doi: 10.1093/jac/dky407. Factor de impacto: 5,217 (1er decil, JCR 2017). 2 ABREVIATURAS 3 ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control) EARS-Net (European Antimicrobial Resistance Surveillance Network) BLEE (Betalactamasas de Espectro Extendido) QRDR (Quinolone Resistance Determining Region, región determinante de resistencia a quinolonas) PRP (Proteínas con Repeticiones Pentapeptídicas) ADNcs (ADN de cadena sencilla) ADNcd (ADN de cadena doble) DSB (Double Strand Breaks, roturas de doble hebra) DSE (Double Strand Ends, extremos libres) ROS (Reactive Oxygen Species, especies reactivas del oxígeno) NER (Nucleotide Excision Repair, reparación por escisión de nucleótidos) TLS (Translesion Synthesis, síntesis por translesión) Pol (Polimerasas) CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) VSM (Ventana de Selección de Mutantes) EPA (Efecto Post-Antibiótico) EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) CLSI (Clinical of Laboratory Standards Institute) LLQR (Low-Level Quinolone Resistance, fenotipo de resistencia a quinolonas de bajo nivel) AUC (Area Under the Curve, área bajo la curva) UFC (Unidades Formadoras de Colonias) 4 INTRODUCCIÓN 5 II. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 6 INTRODUCCIÓN 7 1. Resistencia bacteriana Desde el descubrimiento de la penicilina por Alexander Fleming en 1928, los antibióticos han sido los fármacos más efectivos, su éxito se ha reflejado por su uso continuado y el descenso en la morbi-mortalidad causada por las infecciones bacterianas en los últimos 50 años. Tras la comercialización de la penicilina en los años 40, se han ido desarrollando un gran número de compuestos con actividad antimicrobiana de origen natural (derivados del metabolismo de los microorganismos), sintéticos o por modificación de versiones anteriores. Sin embargo, los microorganismos poseen las herramientas moleculares necesarias para desarrollar resistencia y poder adaptarse a las nuevas condiciones de su entorno, haciendo ineficaces agentes antimicrobianos al poco de ser comercializados (Figura 1).1 Figura 1. Desarrollo de los agentes antimicrobianos y aparición de cepas resistentes a lo largo del tiempo.1 INTRODUCCIÓN 8 A pesar de que el desarrollo de resistencia precede a la era antibiótica moderna, con la presencia de un resistoma antibiótico (conjunto de todos los genes microbianos involucrados en la resistencia antimicrobiana) muy diverso genéticamente como han demostrado varios estudios,2–4 el uso de enormes cantidades de antimicrobianos para controlar la infección en las enfermedades desarrolladas en el hombre y en los animales y su uso en la agricultura han propiciado e incrementado la movilización de elementos de resistencia en poblaciones bacterianas y su captura por patógenos previamente sensibles.5 A lo largo del tiempo, estas condiciones han permitido cada vez más la selección de bacterias resistentes a antibióticos a través de tres mecanismos principales: (i) la captura secuencial de genes de resistencia, principalmente a través de la movilización de transposones, integrones y plásmidos y transferencia génica horizontal de fuentes ambientales; (ii) adquisición de mutaciones de resistencia antibiótica junto con mutaciones compensatorias que neutralicen el coste del fitness 6 y (iii) la sobreexpresión de los mecanismos intrínsecos de resistencia como son las bombas7,8 o las enzimas que inactivan antibióticos.9 En estas circunstancias, se desarrollan microorganismos con diferentes patrones de resistencia a antimicrobianos por adquisición de determinantes de resistencia y se acuñan y definen tres términos para clasificarlas en categorías: bacterias multirresistentes (no son sensibles a al menos un antimicrobiano de tres o más familias), bacterias extremadamente resistentes (no son sensibles a al menos un antimicrobiano en todas las familias excepto en una o dos), bacterias panrresistentes (no son sensibles a ningún antimicrobiano de ninguna familia).10 Estos microorganismos son difíciles de tratar con el arsenal antibiótico actual poniendo en riesgo los avances en la medicina moderna como los trasplantes, cirugías complicadas, tratamiento de recién nacidos pretérmino, quimioterapia en pacientes con cáncer que no serían posibles sin el acceso a la antibioterapia.11 INTRODUCCIÓN 9 2. La resistencia bacteriana como un problema de salud pública El rápido incremento de patógenos resistentes a la mayoría de antimicrobianos de uso habitual en clínica se ha proclamado como un problema de salud pública mundial. Esto ha hecho que diversas instituciones como la Organización Mundial de la Salud (OMS) hayan elaborado documentos para proponer soluciones. En 2014, el informe denominado “Antimicrobial Resistance: Global Report on Surveillance” sobre la situación de la multirresistencia en respuesta a la sospecha sobre su expansión a nivel mundial,12 alertó a la OMS y dio pie a la elaboración de otros documentos. En 2015, mediante “Global Action Plan on Antimicrobial Resistance” se marcan una serie de objetivos para abordar el problema de forma conjunta, incluyendo a todos los sectores implicados como la medicina, veterinaria, agricultura, medio ambiente, mundo financiero, y los consumidores.13 Mediante el documento titulado “Global Antimicrobial Resistance Surveillance System” (GLASS)14 se trata de abordar uno de los cinco objetivos del plan de acción global referente a la consolidación del conocimiento sobre las bases de la resistencia antimicrobiana a través de la investigación, haciendo especial hincapié en una serie de “patógenos prioritarios”.15 También se encargará de tareas como la coordinación global de los estudios y análisis de las tendencias que ya se vienen haciendo a nivel regional. De hecho, el ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control), a través de la EARS-Net (European Antimicrobial Resistance Surveillance Network) se encarga de monitorizar la resistencia en esta localización geográfica y elaborar mapas de resistencia por países.16 Una red similar se crea a iniciativa de la región europea de la OMS incluyendo aquellos países que no forman parte de la EARS- Net formando CAESAR (Central Asian and Eastern European Surveillance of Antimicrobial Resistance).17 Organizaciones como el CDC (Centers for Disease Control and Prevention), en Estados Unidos, también llevan a cabo la monitorización de la resistencia por regiones y han establecido una lista de “patógenos prioritarios” por categorías.18 En 2014 se aprueba en nuestro país el PRAN (Plan Nacional frente a la Resistencia a los Antibióticos) a iniciativa de la unión europea, cuyo objetivo es reducir el riesgo de selección y diseminación de resistencia a los antimicrobianos y, consecuentemente, reducir el impacto de este problema sobre la salud de las personas INTRODUCCIÓN 10 y los animales, preservando de manera sostenible la eficacia de los antibióticos existentes; propone seis líneas estratégicas que abarcan la salud humana y la sanidad animal.19 Es patente que el consumo antibiótico es el principal factor desencadenante de la resistencia a agentes antimicrobianos. La asociación entre consumo de antibióticos y resistencia está bien documentada a nivel espacial y temporal en hospitales,20 residencias de ancianos,21 instalaciones de atención primaria22 y en el ámbito comunitario,23 así como en los distintos países.24 Estudios epidemiológicos ya han demostrado la relación directa entre el consumo antibiótico y la emergencia y diseminación de cepas bacterianas resistentes.25 Éste aumentó un 65% en el período comprendido entre 2000 y 2015 y se estima que se eleve por encima de un 200% en 2030, si no se adoptan políticas correctoras.26 Además, se ha registrado un importante incremento global en el consumo de antimicrobianos de último recurso como son los carbapenémicos y la colistina, consistente con el aumento en el número de infecciones resistentes a estos agentes antimicrobianos.26 Este rápido incremento de bacterias resistentes se explica de la siguiente manera, los genes que codifican para estos mecanismos de resistencia pueden ser heredados de una cepa parental o pueden ser adquiridos desde cepas no relacionadas mediante elementos genéticos móviles como integrones, transposones o plásmidos. Esta transferencia horizontal hace posible que la resistencia se transmita entre bacterias de diferentes especies.27 Los plásmidos son elementos extracromosómicos de ADN circular presentes en la bacteria, capaces de replicarse independientemente del genoma del hospedador. La transferencia horizontal de plásmidos que contienen genes de resistencia es un mecanismo esencial para la dispersión de resistencia antimicrobiana.28 Este libre movimiento de genes de resistencia transmitidos por plásmidos ha sido clave en la reciente y rápida expansión global de la resistencia antimicrobiana.29 En este contexto, los clones bacterianos “exitosos” son una fuente poderosa para la propagación de componentes genéticos resistentes a antimicrobianos, proporcionando plataformas estables para el mantenimiento y propagación de genes INTRODUCCIÓN 11 responsables de la resistencia antimicrobiana desempeñando un papel esencial en la reciente emergencia global de microorganismos Gram-negativos multirresistentes, especialmente en el caso de las Enterobacteriaceae.29 Esta expansión ha sido facilitada por otros factores como bajas condiciones higiénico-sanitarias tanto en el ambiente hospitalario como en el comunitario y el creciente aumento de los viajes, el comercio y la transmisión de enfermedades a nivel mundial.11 Las Enterobacteriaceae, especialmente Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae son agentes etiológicos comunes de infecciones nosocomiales y comunitarias entre humanos. La expansión de clones exitosos de E. coli ST131, con frecuencia resistente a fluoroquinolonas y asociado con la producción de betalactamasas de tipo CTX-M-15 y de K. pneumoniae ST258, asociado con la producción de carbapenemasas de tipo KPC-2 y KPC-3 con mayor frecuencia,29 ha provocado un rápido incremento en la resistencia a antimicrobianos frecuentemente usados como las fluoroquinolonas y betalactámicos, como son las cefalosporinas y carbapenémicos, reduciendo las opciones de tratamiento. La terapia antibiótica con betalactámicos es considerada uno de los tratamientos de primera elección para infecciones graves por Klebsiella spp y E. coli y la presencia de betalactamasas es la causa más común de resistencia a estos agentes.29 Concretamente, las betalactamasas con mayor relevancia clínica son las de “espectro expandido”, enzimas con actividad frente a cefalosporinas con cadena lateral oximinio y/o carbapenémicos. Estas enzimas se clasifican en: betalactamasas de tipo AmpC plasmídico (por ejemplo los tipos CMY), betalactamasas de espectro extendido de tipo A (BLEE) (por ejemplo los tipos CTX-M, SHV y TEM), y carbapenemasas, de clase A (por ejemplo los tipos KPC); metalobetalactamasas de clase B (por ejemplo los tipos VIM, IMP y NDM) y las oxacilinasas de clase D como las enzimas tipo OXA-48.29 El tipo de BLEE más extendido a nivel mundial es la betalactamasa CTX-M,30 siendo las betalactamasas NDM, OXA-48 y KPC, las carbapenemasas más frecuentes entre los aislados de Enterobacteriaceae nosocomiales y comunitarios.31 Dentro de los “patógenos prioritarios” de importancia crítica descritos por la OMS destacan otros bacilos Gram-negativos como Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos y Enterobacteriaceae resistente INTRODUCCIÓN 18 capacidad para reducir, eliminar o incluso revertir la presión selectiva causada por los antimicrobianos; la existencia de una enorme cantidad de posibles dianas virulentas, ayudaría a combatir el problema de la escasez de antimicrobianos en desarrollo y el poco impacto sobre la flora comensal, la convierten en una estrategia de interés. La lista de factores de virulencia es enorme y diversa e incluye adhesinas, toxinas, sistemas de secreción, sideróforos, factores de evasión y modulación inmune, factores que promueven la producción de biofilm, además de factores reguladores como el quorum sensing. Esté último es de gran relevancia, inhibidores del quorum sensing pueden prevenir la producción de múltiples factores de virulencia.69 Por lo tanto, la utilización combinada de antimicrobianos tradicionales con compuestos capaces de inhibir estos procesos que favorecen el desarrollo de bacterias resistentes y con mayor grado de patogenicidad, podría ser una eficiente estrategia terapéutica para combatir infecciones bacterianas de difícil tratamiento. Entre estos mecanismos destaca la respuesta SOS bacteriana,66,70,71 debido a su implicación en los procesos anteriormente mencionados, como una posible diana terapéutica en combinación con antimicrobianos bactericidas ampliamente utilizados como las fluoroquinolonas.72 4. Respuesta SOS y multirresistencia En respuesta al daño en el ADN, como el causado por algunos antimicrobianos, se van a inducir variaciones genéticas en la bacteria, con el objetivo de reparar su genoma y sobrevivir. En este proceso están involucrados sistemas bacterianos de respuesta al estrés, entre los que destaca la respuesta SOS. La inducción de la respuesta SOS bacteriana, además de reparar el ADN, conduce a un estado de alta mutabilidad (hipermutación transitoria) debido a las polimerasas de la síntesis por translesión que permite a las bacterias incrementar su oportunidad de sobrevivir en condiciones de estrés, por ejemplo tras contacto con antimicrobianos. Muchos trabajos apoyan la idea de que concentraciones subinhibitorias de antimicrobianos inducen mutagénesis mediada por la respuesta SOS.73–77 De hecho, para antimicrobianos como las INTRODUCCIÓN 19 fluoroquinolonas las mutaciones puntuales suponen el principal mecanismo de resistencia adquirida.78 La facilidad con que esta clase de antimicrobianos desarrollan resistencia asociada a la inducción de la respuesta SOS, unido a su amplio uso en clínica, hacen que la combinación de fluoroquinolonas y la inhibición de la respuesta SOS, pueda ser una buena estrategia terapéutica para combatir la multirresistencia antibiótica, tanto en términos de restricción de su desarrollo como de reversión de la misma. 5. Quinolonas 5.1. Origen e historia Las quinolonas son agentes antimicrobianos de amplio espectro que se descubrieron en los años 40 de forma accidental en el contexto de la síntesis de agentes antimaláricos. En 1962, Lesher y colaboradores desarrollaron la primera quinolona de uso clínico: el ácido nalidíxico, con actividad frente a ciertos bacilos Gram-negativos,79 derivada del compuesto 1,8-naftiridona (Figura 2) y formada por dos anillos, con dos nitrógenos en la posición 1 y 8, un grupo carboxilo en la posición 3 y un grupo carbonilo en la posición 4;80 a diferencia del núcleo básico de las quinolonas, constituido por una molécula de 4-quinolona con un grupo carboxilo en posición 3 (Figura 3). Sobre este compuesto, se han llevado a cabo diversas modificaciones para obtener moléculas con mayor espectro de acción y mejores características farmacocinéticas que el ácido nalidíxico.81 A pesar de que su uso fue limitado a causa de su estrecho espectro INTRODUCCIÓN 20 de acción y toxicidad, en la década de los 80, se recuperó para el tratamiento de infecciones urinarias y gastrointestinales debido al desarrollo de resistencia en aislados de Shigella y E. coli a otras clases de antimicrobianos usados.82 Las modificaciones más relevantes fueron la adición de un átomo de flúor en la posición 6 y la adición de un grupo piperacínico o metil-piperacínico en posición 7. Estas modificaciones condujeron a una mayor actividad biológica y mejores propiedades farmacocinéticas (buena absorción oral y amplia distribución tisular). Este grupo de quinolonas se conoce como fluoroquinolonas, antimicrobianos de primera línea utilizados para el tratamiento de múltiples procesos infecciosos.83,84 5.2. Estructura y clasificación La estructura de las quinolonas de uso clínico está formada por dos anillos, con 1 átomo de nitrógeno en la posición 1, un grupo carboxilo en la posición 3 y un grupo carbonilo en la posición 4. Las quinolonas, pueden clasificarse al igual que otras familias de antibióticos, en generaciones, en función de su espectro de acción y perfil farmacocinético (Figura 4 y Tabla 1). En esta clasificación las quinolonas quedan agrupadas en cuatro generaciones, quedando fuera las quinolonas híbridas.85 Sin embargo, existen ligeras variaciones según autores.81,82,84,86,87 INTRODUCCIÓN 21 Figura 4. Estructura química de diferentes quinolonas correspondientes a distintas generaciones. La primera generación de quinolonas (ácido nalidíxico y ácido pipemídico), es activa frente a algunas bacterias Gram-negativas, se utilizan para el tratamiento de infecciones urinarias no complicadas ya que debido a sus parámetros farmacocinéticos solo alcanzan una concentración adecuada en las vías urinarias. Las quinolonas de segunda generación (norfloxacino y ciprofloxacino) presentan un átomo de flúor en posición 6 y un grupo piperacínico o metil-piperacínico en posición 7, mejorando las propiedades farmacocinéticas de las anteriores, pudiendo llegar a actuar también frente a microorganismos Gram-positivos e incluso Pseudomonas spp. Las quinolonas de tercera generación (levofloxacino), además de presentar un átomo de flúor en posición 6, presentan una gran variedad de sustituciones en las posiciones 1, 7 y 8 permitiendo ampliar el espectro de acción sobre bacterias Grampositivas, siendo activas frente a Streptococcus pneumoniae y S. aureus.81,85 INTRODUCCIÓN 22 Generación Quinolona Actividad Indicaciones Primera generación Ácido nalidíxico Cinoxacina Ácido pipemídico Gram-negativos (salvo Pseudomonas) Infecciones del tracto urinario no complicadas Segunda generación Clase I Norfloxacino Lomefloxacino Gram-negativos (salvo Pseudomonas) Infecciones del tracto urinario no complicadas Segunda generación Clase II Ciprofloxacino Ofloxacino Gram-negativos, algunos Gram-positivos y patógenos atípicos Infecciones del tracto urinario e infecciones sistémicas Tercera generación Levofloxacino Esparfloxacino Gatifloxacino Gram-negativos, algunos Grampositivos (alternativa frente a S. pneumoniae y estafilococos sensibles a meticilina) y patógenos atípicos Infecciones del tracto urinario, infecciones sistémicas e infecciones respiratorias Cuarta generación Moxifloxacino Trovafloxacino Clinafloxacino Sitafloxacino Gram-negativos, Gram-positivos, anaerobios y patógenos atípicos Infecciones del tracto urinario, infecciones sistémicas, infecciones respiratorias e infecciones intrabdominales. Tabla 1. Características generales de las quinolonas clasificadas por generaciones Las quinolonas de cuarta generación (moxifloxacino) presentan una elevada potencia y un espectro de acción más amplio, pudiendo actuar frente a algunas especies de micobacterias y anaerobios. 5.3. Mecanismo de acción de las quinolonas Esta familia de antimicrobianos tiene como diana las enzimas topoisomerasas del ADN tipo II, ADN girasa y topoisomerasa IV. Se trata de enzimas esenciales para el enrollamiento adecuado de la molécula de ADN garantizando procesos celulares como la replicación o la transcripción. El corte en las hebras de ADN llevado a acabo por las topoisomerasas, será aprovechado por estos antimicrobianos que van a impedir la INTRODUCCIÓN 23 ligación de las hebras ocasionando la fragmentación del cromosoma y la muerte celular si los mecanismos de reparación del ADN bacteriano no son suficientes. 5.3.1. Estructura y función de las topoisomerasas Las topoisomerasas son enzimas que controlan la topología del ADN. Se clasifican en dos tipos, I y II en función de si provocan la rotura de una o de ambas hebras del ADN, respectivamente. De forma general, ambas actúan de manera similar: provocan rotura en el ADN, promueven el paso de la hebra a través de la rotura y finalmente llevan a cabo el sellado de la rotura. Su condición de enzimas esenciales en la bacteria y el hecho de que sus reacciones lleven consigo roturas en el ADN, han ocasionado que las topoisomerasas sean importantes dianas terapéuticas.88 Las topoisomerasas de tipo I, actúan eliminando superenrollamientos negativos y relajando el ADN. Por su parte, las topoisomerasas de tipo II constituyen la diana de las quinolonas, concretamente la ADN girasa y la topoisomerasa IV. Estas enzimas son imprescindibles para procesos celulares como el empaquetamiento del ADN, la replicación, la transcripción o la recombinación.89 La ADN girasa y la topoisomerasa IV son heterotetrámeros formados por dos subunidades A y dos subunidades B (Figura 5). Las subunidades de la ADN girasa están codificadas por los genes gyrA y gyrB, siendo para la topoisomerasa IV, parC y parE en bacterias Gram-negativas y grlA y grlB en bacterias Gram-positivas.90 INTRODUCCIÓN 24 Figura 5. Estructura de la ADN girasa de Thermus thermophilus. Adaptado de Papillon y cols.91 En bacterias Gram-negativas, la topoisomerasa inhibida principalmente por las quinolonas es la ADN girasa, mientras que en bacterias Gram-positivas, la principal diana inhibida por estos antimicrobianos es la topoisomerasa IV, aunque esto no es siempre así y para una especie bacteriana determinada la principal diana puede ser dependiente del tipo de quinolona utilizada.81,88,90 A pesar de que ambas enzimas pertenezcan a las topoisomerasas de tipo II, poseen distintas funciones en la célula. La topoisomerasa IV tiene un papel clave en la separación de las hebras de ADN tras cada replicación y en la relajación de la molécula de ADN por eliminación de superenrollamientos. Por otra parte, la ADN girasa se encarga de mantener un nivel de enrollamiento adecuado en la molécula que facilite el movimiento hacia los complejos que se forman en la replicación y en la transcripción y es la única enzima capaz de introducir superenrollamientos negativos en el ADN. Estas diferencias funcionales se derivan de su estructura.81 INTRODUCCIÓN 25 En ambas enzimas, la subunidad B (GyrB/ ParE) consta de un dominio aminoterminal responsable de la unión al ATP y de su hidrólisis, permitiendo los cambios conformacionales necesarios en las proteínas para la reacción, y un dominio carboxiterminal que interacciona con la subunidad A (GyrA/ParC) formando la enzima funcional, y con la molécula de ADN; alberga el dominio TOPRIM, que une iones metálicos necesarios para la escisión y rotura de la molécula (Figura 6). Por otro lado, la subunidad A (GyrA/ ParC), contiene el residuo de tirosina (en posición 122 para GyrA y 120 para ParC) en el dominio amino-terminal,92 constituyendo el sitio activo del enzima; se trata de una región muy conservada, donde se localiza la región QRDR (Quinolone Resistance Determining Region) donde se concentran las mutaciones responsables de la resistencia a quinolonas. Finalmente, su extremo carboxi-terminal permite la envoltura del ADN.88,90,93–95 Resumiendo, la subunidad A de la enzima se encarga de la rotura y ligación de las hebras de ADN, mientras que la subunidad B presenta función ATPasa. Figura 6. Mecanismo de acción de la ADN girasa, adaptado de Costenaro y cols.96 A pesar de que ambas enzimas, tienen dominios funcionales similiares, hay una región en el extremo carboxi-terminal de GyrA, cuya estructura difiere con la de ParC. Se trata de una secuencia de 7 aminoácidos conservados en todas las ADN girasas (“GyrA box”), responsable de la actividad específica de la enzima que consiste en introducir superenrollamientos negativos.93,97 INTRODUCCIÓN 26 5.3.2. Mecanismo de acción de las quinolonas Estudios cristalográficos de las topoisomerasas tipo II, ADN girasa y topoisomerasa IV, han permitido analizar las interacciones que se producen entre estas enzimas y las quinolonas. Estructuras iniciales situaron al fármaco en un lugar próximo a los residuos de serina y residuos acídicos (ubicados cuatro residuos más abajo), pero pronto se observó que los aminoácidos no se encontraban lo suficientemente próximos en el espacio para que esta interacción tuviera lugar de forma directa.98–100 Finalmente, una estructura más tardía permitió distinguir un complejo de quinolona que contenía un ion Mg2+ quelado por los grupos carboxi en C-3 y ceto en C- 4101 (Figura 7). Este ion metálico se coordinaba a 4 moléculas de agua, y dos de estas moléculas se localizaban próximas a la serina y a los residuos acídicos formando puentes de hidrógeno. En base a estos hallazgos estructurales, y a un estudio anterior que vislumbraba que los iones metálicos tenían un papel relevante en la acción de las quinolonas,102 se sugirió que el puente de hidrógeno mediado por el ion metálico “anclaba” el fármaco a la enzima con participación de los residuos de Ser83 y Asp/Glu87 en E. coli.101 Posteriormente, estudios funcionales han caracterizado el papel que desempeña en las uniones quinolona-enzima103,104 y se ha demostrado que supone la interacción primaria entre las quinolonas y las topoisomerasas tipo II.90 Esto explica que las principales interacciones entre las quinolonas clínicamente relevantes y sus enzimas dianas estén mediadas por las posiciones C-3 y C-4 del fármaco, y podría explicar la tolerancia para la diversidad estructural de sustituciones en las posiciones N-1, C-7 y C- 8 de esta clase de antimicrobianos.105 INTRODUCCIÓN 27 Figura 7. La unión quinolona-topoisomerasa está mediada por enlaces establecidos entre el ion magnesio y moléculas de agua que afectan a los grupos carboxilo y ceto en posciones 3 y 4, respectivamente y a los aminoácidos señalados.90 Según este modelo de unión a la quinolona mediado por un ion magnesio no catálitico, dos moléculas de antimicrobiano se intercalan separadas una distancia de 4 pares de bases en los dos sitios de escisión del ADN y la interacción de la enzima-ADN favorece la unión de moléculas de quinolona incrementando la formación de complejos escindidos y la fragmentación cromosómica.90,106 El efecto potenciador de la fragmentación cromosómica llevado a cabo por las quinolonas va más alla de la simple inhibición del resellado del ADN roto atribuido a inhibidores catalíticos. Sin embargo, parece que existen distintas formas de unión de la quinolona a la enzima en función de si el sustituyente en C-7 interacciona con GyrB/ ParC o con GyrA/ ParE, esto condicionará los residuos implicados en la formación del puente de hidrógeno mediado por el ion metálico. En el primer caso, el extremo del radical en C-7 se extiende hacia una región próxima al residuo en 466 de GyrB y el puente iónico afecta a los residuos 83 y 87 de GyrA y al extremo carboxilo en C-3 de la quinolona (Figura 8). INTRODUCCIÓN 34 contrario, una deficiencia de la enzima catalasa elevó la actividad letal de norfloxacino, debido a que un incremento de H2O2 conduce a la acumulación de OH·.106 La producción de ROS mediada por antimicrobianos está asociada además de con las reacciones redox que se derivan del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, con otras rutas metabólicas como la glucólisis. Se ha observado que la utilización como fuente de carbono de moléculas con mayor número de átomos (hexosas) se asocia a una mayor letalidad que aquellas de menor tamaño (pentosas, gliceraldehido). El tratamiento de E. coli con antimicrobianos bactericidas también supuso un incremento en el consumo de oxígeno, confirmando de nuevo la hipótesis de que estos fármacos inducen alteraciones en la fisiología celular asociado a reacciones redox.117 Otro hallazgo interesante es la función protectora frente al daño oxidativo que desempeña el sulfuro de hidrógeno (H2S) a bajas concentraciones, en contraposición con su efecto tóxico a altas concentraciones al desencadenar la reacción de Fenton con formación de OH· tóxicos. Se ha propuesto que el compuesto 3-mercaptopiruvato sulfurtransferasa (3MST), codificado por el gen mstA y principal fuente endógena de H2S, suprima el estrés oxidativo en E. coli al secuestrar el hierro libre que desencadena la reacción de Fenton genotóxica.121 5.6. Mecanismos de resistencia a quinolonas Las modificaciones estructurales del ácido nalidíxico condujeron a la mejora de las propiedades farmacocinéticas y de la actividad biológica convirtiendo a las quinolonas de segunda generación en el tratamiento de elección frente a numerosas infecciones. Sin embargo, el uso masivo de las fluoroquinolonas trajo consigo el rápido desarrollo de resistencia a las mismas. La emergencia de resistencia a quinolonas se registró inicialmente en S. aureus, particularmente en aislados de MRSA (methicillinresistant S. aureus) y en Pseudomonas aeruginosa,122 pero pronto apareció en casi todas las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.123,124 En los últimos años, se ha confirmado un incremento de las tasas de resistencia a quinolonas en enterobacterias. En nuestro país, según datos de la EARS-Net,125 la tasa INTRODUCCIÓN 35 de resistencia a quinolonas ha aumentado desde que comenzaron a registrarse los primeros datos. Para K. pneumoniae se notificó una tasa de resistencia de 10,7%, 15,8% y 22,7% en los años 2005, 2009 y 2016, respectivamente. En el caso de E. coli, disponemos de datos anteriores de resistencia, siendo de un 17,3%, 28,2%, 31,5% y 32,5% para los años 2001, 2005, 2009 y 2016, respectivamente. Este incremento de resistencia no solo afecta a nuestro país, sino que se trata de una tendencia generalizada en la mayoría de los países europeos. La Figura 11 muestra la comparativa del estado de la resistencia a fluoroquinolonas en Europa en los años 2009 y 2016 de E. coli y K. pneumoniae. En los mapas se muestran los porcentajes de cepas no sensibles, incluyendo cepas con fenotipo resistente (R) y de sensibilidad intermedia (I). Figura 11. Mapa europeo de resistencia a fluoroquinolonas en E. coli (A) y K. pneumoniae (B) (fenotipos I y R) en los años 2009 y 2016. Fuente: EARS-Net. INTRODUCCIÓN 36 Inicialmente se pensó que la resistencia a quinolonas tardaría en aparecer al tratarse de fármacos de origen sintético con un nuevo mecanismo de acción, sin embargo, la resistencia apareció rápidamente como muestran los datos anteriores. La adquisición de resistencia a quinolonas es un proceso secuencial, provocado por la acumulación de mutaciones cromosómicas en los genes que codifican las topoisomerasas tipo II. Aunque las mutaciones en la ADN girasa y la topoisomerasa IV, constituyen el principal mecanismo de resistencia, existen otros tanto cromosómicos como plasmídicos que se detallan a continuación (Figura 12). Figura 12. Mecanismos cromosómicos y plasmídicos de resistencia a quinolonas. Adaptado de Correia y cols.126 5.6.1. Mecanismos cromosómicos Los mecanismos cromosómicos de resistencia a quinolonas son tres: modificaciones en los genes de las dianas (ADN girasa y topoisomerasa IV), alteraciones en las bombas de expulsión activa y cambios en la permeabilidad de la membrana debidos a mutaciones en los genes codificantes de porinas. INTRODUCCIÓN 37 Modificación de las dianas La resistencia a quinolonas se debe fundamentalmente a mutaciones en los genes codificantes de las topoisomerasas tipo II, lo que sugiere que las interacciones enzima-antimicrobiano juegan un importante papel en la estabilización de los complejos de escisión. Las mutaciones asociadas a resistencia, se localizan en su mayoría en la región amino terminal de la subunidad GyrA (entre los residuos 67 y 106 para E. coli) o ParC (entre los residuos 63 y 102), ambas regiones situadas cerca de los residuos de tirosina (Tyr122 para GyrA, Tyr120 para ParC) del sitio activo, las cuales están unidas transitoriamente de modo covalente a la molécula de ADN.90 Este dominio es el QRDR de GyrA y de ParC.127 En bacterias Gram-negativas, la resistencia a quinolonas suele estar asociada a mutaciones en el QRDR de gyrA, siendo las más frecuentes aquellas que afectan a las posiciones Ser83 (sustitución de Ser por Leu, aunque también por Trp, Ala o Val) y Asp87 (sustitución de Asp por Asn, aunque también por Gly, Tyr, His o Val) en E. coli, o a posiciones equivalentes en otros microorganismos.90,110,128 En microorganismos Gram-positivos, la resistencia a quinolonas se debe inicialmente a mutaciones en parC, y posteriormente a mutaciones en gyrA.129 Como ya se ha mencionado, existe un alto grado de conservación entre los genes de las topoisomerasas, lo que se ve reflejado en que las mutaciones asociadas a resistencia se localizan en puntos homólogos del QRDR de gyrA y parC; las posiciones 83 y 87 de GyrA equivalen a las posiciones 80 y 84 de ParC.130 Estos aminoácidos participan en la unión de la quinolona a la enzima a través del ion Mg2+ y sustituciones por otros podría restringir el tipo de ion metálico unido afectando a la interacción quinolona-enzima.90 Esto explicaría la razón por la cual las sustituciones en estas posiciones confieren mayor resistencia que otras del QRDR.128,131 También se han descrito mutaciones en los genes codificantes de la subunidad B de la ADN girasa (gyrB) y la topoisomerasa IV (parE), aunque su relevancia parece ser mucho menor. En el caso de gyrB, las sustituciones se producen principalmente en la región comprendida entre los aminoácidos 426 y 447.128 INTRODUCCIÓN 38 Tanto en bacterias Gram-negativas como en Gram-positivas el nivel de resistencia a quinolonas es proporcional al número de mutaciones. La alteración de la diana es un fenómeno secuencial, facilitando la presencia de una mutación la aparición de una segunda, y así sucesivamente hasta presentar 3 ó 4 mutaciones, lo que conduce a niveles de resistencia clínica. Este proceso secuencial tiene importantes consecuencias epidemiológicas, ya que existe un elevado riesgo de seleccionar microorganismos con alto nivel de resistencia durante el tratamiento con fluoroquinolonas en cepas con alguna mutación preexistente en los genes de las topoisomerasas tipo II.132 Sistemas de expulsión activa A pesar de que el mecanismo de resistencia anterior es el más relevante, un microorganismo también puede hacerse resistente al antimicrobiano por sobreexpresión de bombas de expulsión activa, transportadores localizados en la membrana que disminuyen la concentración de antibiótico en el interior de la célula, impidiendo su unión a las topoisomerasas tipo II. Estos sistemas pueden ser de codificación plasmídica o cromosómica y constituyen el principal mecanismo de disminución de la concentración del antimicrobiano en bacterias Gram-positivas. Estas bombas de expulsión activa se clasifican en cinco familias: MFS (Major Facilitator Superfamily), ABC (ATP-Binding Cassette), RND (Resistance/ Nodulation/ Division), SMR (Small Multidrug Resistance), MATE (Multidrug and Toxic-compound Extrusion).133 En bacterias Gram-positivas, concretamente en S. aureus, la sobreexpresión de las bombas NorA, NorB y NorC, que pertenecen a la familia MFS, ha demostrado aumentar de 4-8 veces la resistencia a quinolonas.127 En bacterias Gram-negativas, el complejo mejor estudiado ha sido la bomba AcrAB-TolC en E. coli, que pertenece a la superfamilia RND, cuya sobreexpresión también es capaz de conferir resistencia a quinolonas.127,134 Este sistema está regulado por genes como marR, marA y soxS. Mutaciones en el gen acrR, represor local de acrAB, incrementa la actividad de la bomba. Algo similar sucede con la inactivación de marR. La expresión de los genes acrA, acrB y tolC es activada por el producto del gen marA. INTRODUCCIÓN 39 Este gen en condiciones normales se encuentra reprimido por MarR. Sin embargo, mutaciones en el gen marR ocasionan la desrepresión de marA, induciéndose la expresión del sistema AcrAB-TolC y disminuyendo la expresión de la porina OmpF. Esto ocasiona un aumento de la expulsión de quinolonas del interior celular, disminuyendo la concentración interna de estos antimicrobianos.135 Alteraciones de la permeabilidad de la membrana En bacterias Gram-negativas, el acceso de las quinolonas al interior celular sucede por difusión pasiva (quinolonas hidrofóbicas, como esparfloxacino y moxifloxacino) o a través de porinas (quinolonas hidrofílicas, como ciprofloxacino y norfloxacino). La pérdida de porinas o la expresión de porinas alteradas estructuralmente contribuyen a una disminución de la sensibilidad a quinolonas. Este mecanismo no suele tener relevancia clínica a menos que vaya asociado a otros mecanismos de resistencia, ya que no inhiben completamente la entrada de quinolonas en la célula.136 En E. coli, las principales porinas están codificadas por el gen ompF y ompC y suponen la principal vía de entrada de las quinolonas hidrofílicas al interior celular. La disminución de la expresión de las porinas puede deberse a modificaciones o inactivaciones de los genes codificantes de éstas, así como en los genes reguladores, como es el caso del operón mar que afecta a la expresión de ompF, de esta forma, mutantes con una disminución en la expresión de ompF van a presentar un incremento en la concentración mínima inhibitoria (CMI) de quinolonas de entre 2 y 4 veces.137 5.6.2. Mecanismos plasmídicos En 1998, se descubre en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla, el primer mecanismo de resistencia a quinolonas mediado por plásmido en un aislado clínico de K. pneumoniae deficiente en porinas, procedente de EEUU.138 Se observó que transconjugantes que albergaban este plásmido (pMG252) presentaban un INTRODUCCIÓN 40 incremento de la CMI de quinolonas como ciprofloxacion de 4 a 32 µg/mL. Siendo este incremento en la resistencia mucho menos marcado en E. coli o K. pneumoniae con porinas intactas.138 Estudios adicionales permitieron la identificación del gen responsable de la resistencia a quinolonas, llamado inicialmente qnrA (quinolone resistance) y renombrado posteriormente como qnrA1.139 Tras este hallazgo inicial, se han descrito tres mecanismos de resistencia a quinolonas mediado por plásmidos: i) protección de la diana, ii) modificación enzimática de las quinolonas y iii) sistemas de expulsión activa. Protección de la diana: genes qnr Desde el descubrimiento de los genes qnr, se han descrito siete familias, así como diversas variantes alélicas implicadas en la resistencia a quinolonas de origen plasmídico, existiendo actualmente: 8 qnrA, 92 qnrB, 9 qnrS, 1 qnrC, 3 qnrD, 9 qnrVC y 1 qnrE (revisado en Agosto de 2018 http://www.lahey.org/qnrStudies). Aunque se han encontrado diversos genes tipo qnr tanto en bacterias Grampositivas como Gram-negativas, se desconoce el origen de la mayoría de proteínas Qnr. Parece que se generaron a partir de microorganismos acuáticos y/o ambientales. Se ha demostrado que los determinantes QnrA-like proceden de Shewanella algae.140 Los genes qnrS-like, tuvieron su origen en Vibrio splendidus.141 En cuanto a los QnrB-like, se ha visto que proceden del cromosoma de especies del complejo de Citrobacter freundii de origen tanto clínico,142 como ambiental;143 aunque también se ha registrado en Stenotrophomonas maltophilia una proteína, SmQnr, con un 88% de identidad aminoacídica con QnrB5 y QnrB19;144,145 así mismo se ha encontrado un 80% de identidad entre otros QnrB-like y la proteína SmaQnr cromosómica de Serratia marcescens. El gen qnrVC, ha sido frecuentemente asociado con el cromosoma de V. cholerae como parte de un superintegrón.146 Varios estudios han demostrado que los plásmidos no conjugativos que portan el gen qnrD se han localizado en otras Enterobacteriaceae, aunque fundamentalmente en especies de Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Providencia rettgeri, pudiendo ser su origen.147,148 Más recientemente, se ha descrito otra familia Qnr, tras el hallazgo de qnrE en aislados de INTRODUCCIÓN 41 K.pneumoniae. Aunque no está claro su origen, este gen ha podio ser movilizado por ISEcp1 del cromosoma de Enterobacter spp.149 Los genes qnr codifican proteínas pertenecientes a la familia de proteínas con repeticiones pentapeptídicas (PRP). Estas proteínas se caracterizan por presentar repeticiones de una secuencia de 5 aminoácidos semiconservada: [Ser, Thr, Ala o Val] [Asp o Asn] [Leu o Phe] [Ser, Thr o Arg] [Gly].150 Actualmente, existe consenso a nivel mundial para la nomenclatura y definición de los genes qnr.151 Un gen qnr se define como un gen de origen natural que codifica una proteína de repeticiones pentapeptídicas y confiere bajo nivel de resistencia a ácido nalidíxico o a fluoroquinolonas. La expresión de los genes qnrA, qnrB, qnrC, qnrD y qnrS causan incrementos de la CMI de ciprofloxacino de 8 a 32 veces en E. coli ATCC25922152 y de 10 veces para qnrVC.153 Las familias de genes qnr difieren en al menos un 30% de su secuencia nucleotídica o aminoacídica. A excepción del recientemente descubierto gen qnrE, que es algo inferior.149 La proteína de resistencia a fluoroquinolona de Mycobacterium tuberculosis (MfpA), fue la primera proteína perteneciente a la familia PRP en la que se determinó la estructura tridimensional. Reveló que se disponía formando una β-hélice cuadrangular y dextrógira. Esta estructura es similar en tamaño, curvatura y características electrostáticas a la forma B del ADN. De manera que MfpA se une a la ADN girasa inhibiendo su actividad.154,155 Al estudiar y comparar proteínas de la familia PRP presentes en bacterias Grampositivas y Gram-negativas, se observó que estaban formadas por 36 repeticiones pentapeptídicas interrumpidas por dos asas que se proyectan hacia el exterior de la proteína. Estos dos bucles están ausentes en las proteínas pentapeptídicas de E.faecalis (EfsQnr), y M.tuberculosis (MfpA).156 Además, la secuencia de estos lazos se encuentra altamente conservada, sobre todo la del lazo más largo o bucle B (Figura 13). Mutaciones en el bucle B de la proteína pentapeptídica de Aeromonas hydrophila (AhQnr) afectan a la protección de la ADN girasa frente a quinolonas, lo que indica el posible papel de este asa para el desarrollo de la actividad de la proteína. INTRODUCCIÓN 42 Figura 13. Estructura terciaria de QnrB1. Adaptado de Rodríguez-Martínez y cols.152 La función fisiológica de las proteínas Qnr no se conoce actualmente. Se ha postulado que estas proteínas podrían formar parte de un sistema toxina-antitoxina; actuarían como antitoxinas protegiendo a la ADN girasa y topoisomerasa IV de alguna toxina natural aún desconocida.157 Otra posible función que se le atribuye, es la de actuar como GyrI, un regulador de la ADN girasa con efecto antiquinolona.158 Por último, la presencia de secuencias de unión a LexA en las regiones promotoras de los genes qnrB y qnrD, podría indicar que estas proteínas están implicadas en la protección de las células ante daño en el ADN, causado también por antimicrobianos como las quinolonas, tras activación de la respuesta SOS.159–161 Las proteínas Qnr van a interaccionar directamente con la ADN girasa y la topoisomerasa IV y la unión Qnr-enzima se produce antes de que la topoisomerasa se una al ADN, de forma que se reduce el efecto de las quinolonas.162,163 Modificación enzimática de las quinolonas: gen aac(6’)-Ib-cr y CrpP En 2006, se describió un nuevo gen responsable del aumento de la CMI de ciprofloxacino en aislados clínicos de E. coli en Shangai. Se trataba de una variante de INTRODUCCIÓN 43 una acetiltransferasa (AAC(6’)-Ib) capaz de acetilar aminoglucósidos, confiriendo resistencia a tobramicina, amikacina y kanamicina. Esta nueva variante, denominada AAC(6´)-Ib-cr es capaz de acetilar aquellas fluoroquinolonas con un nitrógeno amino localizado en el sustituyente piperacinil en posición C-7 (ciprofloxacino y norfloxacino).164 La enzima AAC(6´)-Ib-cr presenta dos cambios aminoacídicos con respecto a la forma clásica: Trp120Arg y Asp179Tyr, los cuales son suficientes para reducir la actividad de ciprofloxacino 4 veces.165,166 Este gen se ha identificado como cassette de resistencia en integrones de clase 1.164 Recientemente, se ha descrito una enzima modificadora de ciprofloxacino, denominada CrpP, encontrada en plásmidos pUM505 de aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa. Se trata de una proteína de 65 aminoácidos, codificada por el gen orf131 que posee un 40% de identidad aminoacídica con la enzima aminoglucósido fosfotranferasa de Mycobacterium smegmatis, capaz de fosforilar aminoglucósidos e inactivarlos. La actividad de CrpP es dependiente de ATP y la fosforilación de ciprofloxacino sería previa a su degradación. Transformantes de E. coli que albergaban CrpP mostraron un descenso de la sensibilidad de ciprofloxacino de 7,5 veces.167 Sistemas de expulsión activa: genes qepA y oqxAB Como ya se mencionó anteriormente, las bombas de expulsión activa pueden estar codificadas por el cromosoma bacteriano o por plásmidos. En 2007, se describió por primera vez la bomba QepA en aislados clínicos de E. coli de Japón y Bélgica. Esta proteína es miembro de la familia de transportadores con 14 segmentos transmembrana presentes en los microorganismos ambientales que pertenecen a la superfamilia de bombas de expulsión tipo MFS, capaz de eliminar de la célula fluoroquinolonas hidrofílicas como norfloxacino y ciprofloxacino.168–171 Otro sistema de expulsión activa que confiere un descenso de la sensibilidad de las quinolonas es OqxAB. Esta bomba fue descrita por primera vez en 2004, en un aislado de E. coli de origen porcino.172 OqxAB pertenece a la familia RND y posee una amplia INTRODUCCIÓN 50 6.3.1. RecA Es una proteína altamente conservada de ≈38 kDa que desempeña un papel crítico en la recombinación homóloga y en la degradación de LexA.205 Estructuralmente, RecA monomérica, contiene tres dominios: un core central para el plegamiento de RecA, que es flanqueado por dos subdominios reguladores en los extremos amino y carboxi206 (Figura 15A). Estos monómeros, pueden formar enormes nucleofilamentos de proteína por oligomerización cooperativa, mediada por el core de plegamiento de RecA, formando una estructura helicoidal dextrógira que se extiende sobre el ADNcs.207 El core de RecA, une ATP entre monómeros,206 necesario para la polimerización de las subunidades y para las reacciones de intercambio de ADNcs e hidroliza ATP para la despolimerización del filamento.205 El filamento de RecA también actúa como una co-proteasa para estimular la escisión autocatálitica de LexA y de UmuD en E. coli208 y del represor del fago lambda, estimulando la entrada del profago en el ciclo lítico.209 6.3.2. LexA Molécula de ≈22 kDa que contiene dos dominios separados por un conector flexible. Es un homodímero en solución, se une al ADN mediante un motivo hélicevuelta-hélice en el extremo amino-terminal. El extremo carboxi-terminal es responsable de la dimerización de LexA y también alberga la actividad serín-proteasa (diada catalítica: Ser119-Lys156) que cataliza la escisión del péptido entre Ala84 y Gly85 localizados en un loop en la región flexible del conector, determinando el estado escindible o no escindible de LexA, en función de si el loop está adyacente a la diada catalítica o no204,210,211 (Figura 15B). La actividad escindible es estimulada por RecA* y su unión a LexA constituye un paso clave. Se ha propuesto que el represor se une por su región carboxi-terminal en la hendidura formada por el filamento nucleoproteico (RecA*), por interacción con los residuos aminoacídicos, Gly22 y Gly108, mientras que su región amino-terminal interacciona con la región del core de RecA*.212 INTRODUCCIÓN 51 La actividad autocatalítica de LexA comienza tras la disociación del operador y lleva a la degradación total de LexA, así como RecA* también necesita que LexA no se encuentre unido al operador para interaccionar con él.213 Se han caracterizado variantes de LexA no proteolizables in vivo, incapaces de activar la respuesta SOS. Estas mutaciones fueron localizadas en la región flexible del conector y en el extremo-carboxi, ambas implicadas en las reacciones de escisión. Además, estas mutaciones fueron agrupadas en tres regiones: i) alrededor del sitio de escisión (Ala84-Gly85), incluye residuos en las posiciones 80-85; ii) alrededor del residuo de Ser-119, incluye aminoácidos en posiciones 114-120; iii) en torno al residuo de Lys156, incluye Thr154 y Lys156. A pesar de la diversidad de posiciones afectadas, existen tres variantes clásicas descritas: LexA1 (G80D), LexA2 (T154I) y LexA3 (G85D) que aumentan notablemente la sensibilidad de la célula al ADN dañado. LexA1 fue la variante elegida para la construcción de cepas isogénicas con el sistema SOS hipoactivado.214 Figura 15. Dianas de la respuesta SOS. (A) Estructura de RecA, mostrado como un filamento, con monómeros alternados en color azul oscuro y claro. El ADNcs es mostrado como esferas de color rojo. El recuadro de debajo muestra el sitio de unión del ATP. (B) Estructura de LexA dimérico, unido al ADN de la caja SOS, con monómeros individuales coloreados en verde y amarillo. El INTRODUCCIÓN 52 dominio C-terminal está unido al dominio N-terminal por un conector. En el mecanismo de escisión autocatalítica, LexA experimenta un enorme cambio conformacional en su dominio C- terminal entre los estados inactivo (barras rojas) y activo (barras moradas). El recuadro de debajo muestra el solapamiento de las conformaciones activas e inactivas. Adaptado de Culyba y cols.71 6.4. Regulación de la respuesta SOS 6.4.1. Regulación transcripcional En presencia de daño en el ADN, RecA*, inducirá la escisión autocatalítica de LexA que se encuentra unido a la secuencia denominada caja SOS de la región operadora de los genes del regulón. La caja SOS, está formada por la secuencia consenso 5´- TACTGT(AT)4ACAGTA-3´ en E. coli.184,215 El grado de expresión y el tipo de genes que se expresan van a depender de factores como: la cantidad de ADN dañado;216 la composición de la caja SOS, variaciones en su secuencia van a determinar la afinidad de unión de LexA y una desrepresión génica diferencial. A modo de ejemplo, la unión débil de LexA al operador de recA, hace que la proteína RecA sea inducida “inmediatamente”, en menos de un minuto217 y por el contrario, genes con una proteína LexA fuertemente unida a su operador, tengan una expresión más tardía en la respuesta, como es el caso de umuC y umuD, que actúan en la mutagénesis de SOS, y se activan al cabo de unos 30 minutos.218 Por último, otro factor implicado en la transcripción va a ser el número de cajas SOS presente en los promotores de los genes, así el gen recN tiene tres regiones de unión a LexA.219 La proteína RecN pertenece a la familia SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) y es reclutada por RecA hacia DSB tras el tratamiento con mitomicina.220 Recientemente, se ha demostrado que DnaA, proteína iniciadora de la replicación del cromosoma, desempeña además, junto con LexA un papel clave en la represión de la transcripción del gen uvrB, implicado en la reparación por escisión de nucleótidos, y otros genes del regulón SOS como recN y dinJ; actuando como modulador para el INTRODUCCIÓN 53 mantenimiendo de la integridad del genoma durante la respuesta SOS y limitando la expresión de los genes del regulón.221 6.4.2. Regulación post-transcripcional Los principales factores reguladores a este nivel son los componentes iniciadores de la respuesta: RecA y LexA. Aunque existen otros. Una vez que las lesiones han sido reparadas, RecA deja de ser activado por ADNcs. Sin embargo, la expresión de los genes recA y lexA continúa como consecuencia de la activación de la respuesta SOS,200 lo que lleva a la producción de altos niveles de LexA no escindido y de RecA no activado, cuya acumulación conduce a la represión del sistema.181 Al cese de la respuesta contribuye también que lexA, es un gen de expresión tardía y puede parar la inducción de la respuesta SOS cuando la señal genotóxica desaparece y la escisión de LexA no es favorecida.180 También, existen otras proteínas que intervienen en la regulación de la respuesta SOS por interacción con el nucleofilamento de RecA. Se trata de las proteínas RecX y DinI, ambas están bajo el control de la respuesta SOS y regulan la estabilidad del filamento de RecA de forma opuesta. RecX se une a RecA, promoviendo la desestabilización del nucleofilamento de RecA-ADNcs y es capaz de inhibir sus actividades recombinasa y co-proteasa.222,223 Por otro lado, está DinI, que se une a RecA estabilizando el nucleofilamento, manteniendo oculto el ADNcs,224 fuerte inductor de la respuesta SOS. DinI también inhibe la actividad co-proteasa de RecA.225 Esta actividad inhibida por ambas proteínas es importante, como ya hemos comentado permite la desrepresión por parte de LexA de los genes SOS permitiendo la reparación del ADN. Además, esta actividad co-proteasa también juega un papel esencial en la activación de la polimerasa V de la síntesis por translesión, cuya inhibición daría tiempo a la bacteria para reparar el ADN dañado de manera no mutagénica.226 Otra proteína con efecto inhibitorio de la respuesta SOS es PsiB (Protein for SOS inhibition). El gen psiB es portado por algunos plásmidos con un rango de hospedador estrecho, de manera que una forma de impedir que la célula altere su genoma, INTRODUCCIÓN 54 impidiendo la replicación del plásmido, es inhibiendo la respuesta SOS.227,228 Por otro lado, RdgC (Recombination-dependent growth), es una proteína de unión al ADNcs y ADN de cadena doble (ADNcd), previene la función de RecA compitiendo por los sitios de unión al ADN y se ha demostrado que in vitro inhibe la escisión de LexA.229 6.5. Funciones del regulón SOS En muchas especies bacterianas, como hemos visto anteriormente, el ADN dañado estimula la respuesta SOS; un mecanismo que regula la expresión de los genes implicados en los procesos de reparación del ADN y de tolerancia al daño y favorece el intercambio genético. Los primeros genes en ser expresados son los relacionados con los mecanismos de reparación del ADN de forma no mutagénica, como son la recombinación homóloga y el mecanismo de reparación por escisión de nucleótidos (NER, Nucleotide Excision Repair); no obstante, si el daño persistiera comenzarán a expresarse aquellos genes implicados en mecanismos mutagénicos, como son las polimerasas de baja fidelidad de la síntesis por translesión (TLS, Translesion Synthesis). Así mismo, la respuesta SOS está relacionada con la expresión de genes con funciones diversas encaminadas a la adaptación al estrés y supervivencia que vamos a analizar a continuación. 6.5.1. Recombinación homóloga La recombinación homóloga tiene un papel clave tanto en la generación de diversidad genética230,231 como en la reparación de ADN dañado, ayudando a mantener la integridad cromosómica. Se han descrito al menos 25 proteínas diferentes en E. coli involucradas en este proceso232 y muchas de estas proteínas presentan homólogos funcionales en todas las formas de vida,233 confirmando la importancia del proceso. El paso clave en la recombinación es el intercambio de hebras entre dos secuencias de ADN homólogas llevado a cabo por la familia de ATPasas de RecA, proteína altamente conservada de bacterias a humanos.234 INTRODUCCIÓN 55 El proceso de recombinación comienza cuando se elevan las cantidades de ADN dañado. RecA polimeriza sobre ADNcs formando el nucleofilamento proteico RecA- ADNcs que constituye la forma activa de RecA (Figura 16A, paso 1). A continuación, este nucleofilamento invade ADNcd formando un heterodúplex y se produce la migración a lo largo de éste hasta encontrar una secuencia con una homología lo suficientemente grande para que se pueda dar el intercambio entre ambas hebras (Figura 16A, paso 2- 3). Finalmente y con ayuda de proteínas accesorias, como las enzimas RuvABC, se resuelve el intermediario de Holliday formado y por acción de ligasas se unen los fragmentos de la nueva molécula de ADN (Figura 16A, paso 4). Sin embargo, para que se dé el proceso de recombinación es necesario el procesamiento del ADN dañado para formar ADNcs sobre el que actuará RecA, en función de si se trata de DSB o gaps (ADNcs) será necesario la actuación de complejos enzimáticos adicionales RecBCD o RecFOR, respectivamente.180 Ruta RecBCD Este complejo enzimático es esencial para el 99% de los eventos de recombinación que se originan para reparar DSBs en una cepa de E. coli con fenotipo salvaje232 (Figura 16B). RecBCD para ejercer su acción se une con alta afinidad a un extremo romo en el ADNcd, gracias a su actividad helicasa bipolar, localizada en los componentes RecB y RecD con direcciones de acción opuestas 3´5´ y 5´3´, respectivamente,235,236 el complejo enzimático va a ir separando ambas hebras a la vez que se desplaza por la molécula hasta encontrar una secuencia específica, 5´- GCTGGTGG-3´ denominada χ (chi, crossover hotspot instigator),237,238 reconocida por el componente RecC.239,240 En el proceso de separación de hebras, el dominio nucleasa de RecB se va a encargar de degradar preferentemente el extremo 3´ de ADNcs hasta alcanzar la secuencia χ, momento en el que la nucleasa cambia su actividad para actuar exclusivamente en el extremo 5´, protegiendo de esta manera el extremo 3´ para la unión de RecA pero manteniendo su actividad helicasa.241,242 Tras la interacción con χ, se produce otro acontecimento importante, RecBCD excluye las proteínas de unión a INTRODUCCIÓN 56 cadena sencilla (SSB, ssDNA-binding protein) lo que posibilita la “carga” de RecA sobre ADNcs243,244 y que se inicie el proceso de recombinación. Ruta RecFOR Esta ruta no está tan bien caracterizada como la anterior. Sin embargo, resulta esencial para reparar roturas de cadena sencilla o gaps (Figura 16C). Los primeros componentes en actuar son RecQ, que inicia la separación de las hebras en dirección 3´5´ gracias a su actividad helicasa y RecJ, que degrada la hebra separada mediante su actividad exonucleasa 5´3´, dejando un extremo protuberante 3´ de ADNcs.245. A continuación, las proteínas SSB se unirán a ese ADNcs impidiendo la formación del filamento de RecA.246,247 Este problema es superado por la acción de las proteínas mediadoras de la recombinación que en E. coli son RecF, RecO y RecR246 y forman dos subcomplejos funcionales: RecOR y RecFOR. RecOR une SSB, desestabilizando la unión SSB-ADNcs y RecFOR reconoce el extremo 5´ de unión entre ADNcs-ADNcd y recluta RecA para inducir la nucleación y formación del filamento.248 A continuación se produce el intercambio entre hebras homólogas como se ha comentado anteriormente. Figura 16. (A) Proceso de recombinación homóloga. (B) Procesamiento de roturas de doble hebra llevado a cabo por el complejo RecBCD. (C) Procesamiento de roturas de cadena sencilla dirigido por el complejo RecFOR. INTRODUCCIÓN 57 6.5.2. Reparación por escisión de nucleótidos Se trata de un proceso altamente conservado en procariotas y eucariotas que sucede en varios pasos: detección y verificación del daño, incisión, escisión y ligación del ADN formado (Figura 17). El grupo de enzimas que lleva a cabo la mayoría de los pasos es UvrABCD. El primer componente en actuar en el mecanismo de reparación por escisión de nucleótidos (NER) es UvrA. Se trata de una enzima que ejerce su acción en forma dimérica y pertenece a la superfamilia de ATPasas ABC (ATP-binding cassette). Necesita varios iones Zn2+, cuya función es la de mantener la estructura de la enzima y garantizar la especificidad del reconocimiento del ADN dañado. A pesar de que no está claro la zona de unión de UvrA al ADN, estudios realizados en Thermotoga maritima demuestran que se une por la hendidura formada tras la dimerización de UvrA, concretamente a una región de 4 nucleótidos consecutivos en los extremos del fragmento de ADNcd.249 La acción de UvrA es esencial para el reconocimiento del daño, pero al no interaccionar directamente con él, es necesario la aparición de UvrB que se encarga de la verificación del mismo. UvrB es un componente esencial en el mecanismo NER, porque no solo va a interaccionar con UvrA, sino que también lo va a hacer con UvrC, UvrD y ADN pol I.250 Se trata de una enzima con actividad helicasa y ATPasa,251 con varios dominios, y varios estudios han atribuido su implicación como verificadora del daño a residuos ubicados en una estructura, una horquilla-β, localizada en uno de los dominios252–255 la cual va a ser insertada en la doble hélice. A continuación, UvrA y el ADN dañado van a estimular la actividad ATPasa de UvrB, que se encarga de acoplar el movimiento de su dominio helicasa hacia la unión eficiente del ADN dañado y va a permitir la unión de UvrC.256 La unión de UvrB en la zona de la lesión facilita la disociación del componente UvrA. Por su parte, UvrC es una nucleasa dual que va a realizar un corte a ambos lados de la lesión. Con su dominio amino-terminal corta la hebra dañada en 3´ y con su dominio carboxiterminal lo hace en 5´.257,258 Finalmente, se une UvrD, su actividad helicasa en dirección 3´5´ dependiente de ATP,259 va a permitir la separación del fragmento que contiene la lesión. El reemplazamiento y sellado de la hebra eliminada es llevado a cabo por la acción secuencial de la ADN polimerasa I y una enzima ligasa, respectivamente.260 INTRODUCCIÓN 58 Figura 17. Mecanismo de reparación por escisión de nuleótidos 6.5.3. Síntesis por translesión Este mecanismo de reparación se inicia cuando los anteriores, libre de errores, fracasan en la reparación del ADN dañado. Las polimerasas que participan en la síntesis por translesión (TLS) son de inducción tardía y suponen el último recurso de la célula por preservar la integridad de su genoma y sobrevivir.261,262 Las polimerasas (Pol) implicadas en esta vía son PolII, codificada por el gen polB, Pol IV (dinB) y Pol V (umuC y umuD), se trata de enzimas altamente especializadas en esquivar la lesión, debido a la presencia de una estructura menos restrictiva en el sitio de unión a la hebra de ADN que la que posee la polimerasa primaria (Pol III).263 Por contra, esto hace que tengan una menor capacidad para diferenciar entre nucleótidos correctos e incorrectos pudiendo llevar a la incorporación de nucleótidos inadecuados, tras la adición de bases al azar. Además, este hecho unido a la ausencia de una actividad INTRODUCCIÓN 59 correctora de errores 3´5´ en todas ellas, a excepción de la Pol II, en la que se registra cierta actividad exonucleasa, las convierten en polimerasas altamente mutagénicas.263 Similar a lo que sucede con LexA, la síntesis de la PolV activa, también requiere la actividad co-proteasa de RecA. La proteína UmuD, tras ser inducida de forma tardía, es inactiva para llevar a cabo sus funciones mutagénicas. Esta proteína es activada tras la escisión autocatalítica mediada por RecA de una región de 24 aminoácidos en su región amino-terminal.264 Sin embargo, la escisión de UmuD es mucho menos eficiente que la escisión de LexA265 y como consecuencia, UmuD´ no se acumula en la célula hasta pasados 45 minutos de la exposición a la radiación UV.218 Presumiblemente, la escisión de la cola en la región amino-terminal en UmuD, inducirá un cambio conformacional en la estructura de la proteína que posibilitará a UmuD´ dimérica formar un complejo con UmuC.266,267 No obstante, RecA* necesita activar directamente la polimerasa UmuD´2C transfiriendo una molécula de RecA y ATP para formar la PolV mutasoma (UmuD´2C- RecA-ATP), la forma activa de PolV.208 El monómero de RecA-ATP debe ser transferido desde el extremo 3´ de RecA* hacia UmuD´2C para formar una PolV mut con actividad polimerasa, aunque una vez formada, no es necesaria la presencia del nucleofilamento de RecA para continuar su actividad268 (Figura 18). Los niveles intracelulares de esta enzima están estrictamente regulados para mantener al mínimo su actividad mutagénica y sea utilizada bajo circunstancias concretas. Se estima que en una célula con ADN dañado, en el momento de máxima actividad haya unas 60 moléculas de UmuD´2C (PolV) mutagénicamente activas frente a unas 70.000 moléculas de RecA.218 A pesar de las lagunas que existen en relación a la síntesis por TLS, se ha visto que no participan de la misma forma ante una determinada lesión. En E. coli, por ejemplo, el daño en el ADN causado por la exposición a la radiación UV es esquivado por la PolV,217,269 se considera responsable de la mayoría de los eventos de mutagénesis inducidos por radiación UV.266,270 Por su parte, PolII, desempeña un papel clave en el comienzo de nuevo de la replicación en células sometidas al mismo daño.261,271,272 INTRODUCCIÓN 66 67 III. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 68 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 69 1. Justificación del estudio e hipótesis de trabajo El incremento de infecciones causadas por enterobacterias multirresistentes, y su expansión a nivel mundial, ha evidenciado la necesidad de buscar nuevas estrategias terapéuticas que permitan prolongar la vida de los antimicrobianos actuales. Se ha demostrado que concentraciones tanto subinhibitorias como suprainhibitorias de antimicrobianos bactericidas como las fluoroquinolonas inducen la respuesta SOS, la cual está implicada en procesos de transferencia génica horizontal y fenómenos de mutagénesis que promueven la adaptación de la bacteria al daño y conduce finalmente al desarrollo de resistencia a los antimicrobianos. En esta Tesis Doctoral se propone evaluar la supresión de la respuesta SOS en combinación con fluoroquinolonas con una doble finalidad: (i) resensibilización de bacterias resistentes y (ii) bloqueo del desarrollo de resistencias de relevancia clínica. Las hipótesis de este estudio son las siguientes: 1. La supresión de la respuesta SOS (mediada por deleción de recA o presencia de LexA1) origina un incremento de sensibilidad a fluoroquinolonas en cepas con fenotipo sensible, sensibilidad intermedia y resistente. 2. La supresión de la respuesta SOS (mediada por deleción de recA o presencia de LexA1) bloquea el desarrollo de resistencias a fluoroquinolonas en cepas con fenotipo sensible, sensibilidad intermedia y resistente. 3. La supresión de la respuesta SOS es capaz de modificar parámetros biológicos relevantes como el fitness bacteriano y la producción de biofilm en cepas con fenotipo sensible, sensibilidad intermedia y resistente a fluoroquinolonas. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 70 4. La alteración de la respuesta SOS mejora la eficacia bactericida de las fluoroquinolonas en un modelo in vivo. 2. Objetivos del estudio 1. Analizar si la supresión de la respuesta SOS origina un incremento de sensibilidad a fluoroquinolonas en cepas con distintos fenotipos de sensibilidad/resistencia. 2. Evaluar si la supresión de la respuesta SOS restringe la aparición de mutantes resistentes en cepas con distintos fenotipos de sensibilidad/resistencia. 3. Determinar la implicación de la respuesta SOS en parámetros biológicos relevantes como el fitness bacteriano y la producción de biofilm en cepas con distintos fenotipos. 4. Evaluar el papel que desempeña la respuesta SOS en la eficacia bactericida de las fluoroquinolonas en un modelo in vivo. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 71 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 72 PUBLICACIONES 73 IV. PUBLICACIONES PUBLICACIONES 74 PUBLICACIONES 75 A continuación, se presentan los dos trabajos fruto de esta Tesis. Se trata de dos enfoques diferentes de la utilidad de la supresión de la respuesta SOS bacteriana como potencial estrategia terapéutica. En el primer artículo, se aborda el impacto que la supresión de la respuesta SOS tiene sobre la sensibilidad a quinolonas en cepas resistentes a estos antimicrobianos. Las aproximaciones experimentales de laboratorio son confirmadas por un modelo in vivo (artículo 1). En el segundo artículo, se analiza la repercusión que la supresión de la respuesta SOS tiene sobre la mutagénesis y la utilidad que la diana terapéutica propuesta puede tener en la restricción del desarrollo de mutantes resistentes a fluoroquinolonas. Además, se analizan otros parámetros relacionados con la implicación del regulón SOS en fenómenos de virulencia, como el fitness y la producción de biofilm (artículo 2). Efforts to overcome the problem of resistance have focused mainly on modifying existing antibiotics by circumventing the molecular mechanisms conferring resistance (1). While such efforts are efficacious against resistant strains, new resistance mechanisms often arise in the process of adaptation to new antimicrobial agents (2, 3). Members of the Enterobacteriaceae family, like Escherichia coli, are among the most common causes of community and nosocomial infections. Fluoroquinolones are used for empirical and directed therapy in infections caused by E. coli (4). Quinolone resistance has increased notably in Enterobacteriaceae from both human and veterinary isolates (5, 6). Mechanisms of fluoroquinolone resistance occur principally through chromosomal mutations in genes encoding the quinolone targets (DNA gyrase and topoisomerase IV), and to a lesser extent through decreased permeability (6). Plasmidmediated quinolone resistance mechanisms have also been described (7). These determinants on their own (whether chromosomally or plasmid mediated) confer lowlevel quinolone resistance (LLQR), so that multiple mechanisms must be combined to achieve clinical resistance. New strategies are needed to block the development of resistance and to extend the life of antibiotics such as quinolones. Multiple studies suggest that adaptive resistance mutations and the acquisition of resistance genes by bacteria are induced or facilitated by antibiotic therapy due to the activation of RecA (leading to the SOS response, the DNA repair and mutagenesis pathway) (8–10). Antibiotics can trigger bacterial stress at both lethal and sublethal concentrations (8). In this respect, fluoroquinolones are potent inducers of the SOS response, causing DNA damage or arresting replication forks by blocking DNA gyrase (10, 11). The SOS pathway is initiated through the activation of RecA, which in turn induces autocatalytic cleavage of the LexA repressor and induces the SOS response genes (8, 10). RecA is involved in DNA repair, recombination, induction of the SOS response, horizontal gene transfer, and biofilm formation (10, 12–14). Systematically altering bacterial SOS activity, both constitutive SOS activation and inactivation, has been revealed as a therapeutic strategy for potentiating bactericidal antibiotics like quinolones against highly susceptible wildtype E. coli (15, 16). Several compounds have also been shown to inhibit the ATPase activity of RecA in vitro (17–19). Phthalocyanine tetrasulfonate were recently characterized as an in vivo RecA inhibitor (20). In short, the SOS response is a promising target for developing therapeutics to enhance the bactericidal activity of antimicrobial agents such as quinolones. Despite genetic data implicating the SOS response as critical to the survival and adaptation of highly susceptible wild-type bacteria, significant questions remain regarding its impact as a strategy for the reversion or resensitization of antibiotic-resistant bacteria under therapeutic concentrations (21–23). To address this question, we generated E. coli mutants that exhibited a spectrum of SOS activity, ranging from a natural SOS response to a hypoinducible (LexA1; very low cleavage rate) (24) or constitutively suppressed response (∆recA)(Fig. 1). We tested the effects of these mutations on a set of isogenic strains carrying different combinations of chromosome- and plasmidmediated quinolone resistance mechanisms with susceptible, LLQR, resistant, and highly resistant phenotypes. Our comprehensive analysis opens up a new strategy for reversing drug resistance by targeting the SOS response. (This study was presented in part at ASM Microbe, Boston, MA, in 2016 [oral presentation, session 374].) RESULTS Suppression of the SOS response sensitizes fluoroquinolone resistance. Six isogenic E. coli strains harboring frequent chromosomal mutations, associated with fluoroquinolone resistance, in the gyrA and/or parC genes and/or a deletion in the marR gene and combined with plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) mechanism (qnrS) (ranging from wild-type high level of susceptibility to a high level of resistance) were used for recA deletion or lexA replacement by lexA1 and evaluated for susceptibility to quinolones (Table 1; also see Table S1A in the supplemental material). Recacha et al. ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 2 PUBLICACIONES 82 We first confirmed that the ∆recA and lexA1 mutations produce the expected perturbations in the SOS response (significant differences were observed confirming suppression and hypoinduction of the SOS response, respectively) (Fig. S1). The reductions in the MICs of ciprofloxacin ranged from 1-fold to 8-fold against both the ∆recA and LexA1 strains (Table 1). Sensitization was greater in ∆recA strains (with constitutive SOS inactivation), ranging from 4-fold to 8-fold (Table 1; Fig. S2). Of note, the EC04lexA1 strain did not reduce the MIC values of most the quinolones, which lends support to the hypoinducible SOS response as a less effective strategy of sensitization to quinolones. The process of sensitization was equally efficient across susceptible, LLQR, and resistant phenotypes and independent of the type of molecular mechanism involved in quinolone resistance or whether it was chromosomally or plasmid mediated. Interestingly, recA inactivation in the EC02 strain (carrying a GyrA protein with S83L substitution) modified the ciprofloxacin MIC value below the epidemiological cutoff (0.032 mg/liter) (http://www.eucast.org)(25). Here we show that, in terms of MICs, SOS inactivation suppresses the effects of first-step mutations toward resistance associated with topoisomerase type II modifications. Similar results were observed for all quinolones tested. The MICs were reduced up to 8-, 8-, 15-, 4-, 4-, and 2-fold for ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, norfloxacin, ofloxacin, and nalidixic acid, respectively (Table S1A). In addition, the changes in the ciprofloxacin MICs observed for EC08 (MIC of 2 mg/liter down to 0.5 mg/liter) and EC09 (MIC of 8 mg/liter down to 1 mg/liter) recA deficient strains involved changes to the susceptible category. Here, strain EC08, which is intermediate or resistant according to the CLSI and EUCAST breakpoints, respectively, was sensitized to susceptible according to both committees. Similarly, the resistant strain, EC09, was sensitized to susceptible and intermediate-susceptible according to the CLSI and EUCAST breakpoints, respectively (Table 1). The clinical category was also changed to susceptible against levofloxacin and moxifloxacin (Table S1A). These data all lend support to suppression of the SOS response as capable of resensitizing mutant strains with genes encoding three, or even four, different mech- WT LexA1 (G80D) ∆recA Natural SOS response Hypo-inducible SOS response Constuve SOS inacvaon ATCC EC02 EC04 EC08 EC09 EC59 ATCC - EC04 - EC09 EC59 ATCC EC02 EC04 EC08 EC09 EC59 Wild-type LLQR Resistant High level resistant SOS genes SOS genes SOS genes off inducible hypo-inducible FIG 1 Engineered recA and lexA variants in E. coli displaying a range of SOS activities. The LexA protein is represented by green ovals, and lexA1 (G80D) cleavage mutations are labeled in orange. RecA is shown as red filaments, and recA deleted mutants are labeled in red. Strains with a natural SOS response are labeled in green. Four lexA1 mutants and six mutants with recA deleted were derived from low-level quinolone-resistant (LLQR), resistant, and high-level resistant wild-type (WT) phenotypes of quinolone resistance, allowing the bacterial response to quinolones to be examined across a spectrum of SOS activity. Activated RecA filaments led to cleavage of LexA and inducible expression of SOS genes in the WT strain. Deletion of recA (∆recA) inactivated the SOS response. Mutations in the LexA protein (G80D) reduce the rate of self-cleavage relative to the WT strain and so affect the level of SOS induction. Resistance Reversion by Targeting the SOS Response ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 3 PUBLICACIONES 83 anisms of acquired quinolone resistance. The degree of sensitization could be considered moderate (up to 15-fold). SOS suppression enhances bactericidal activity against resistant strains. To show the impact of SOS response suppression in terms of bacterial viability, time-kill curves were obtained for each isogenic group according to the SOS system induction status. At fixed concentrations, a marked reduction of viable bacteria was observed with the inactivated SOS response over 24 h of incubation (Fig. 2). At 1 mg/liter, a bactericidal effect (drop of 3 log 10 CFU/ml) was observed against strain EC08recA after 4 h (and no viable bacteria were recovered after 6 h). At 2.5 mg/liter, a bactericidal effect was observed against both EC08 (after 4 h) and EC08recA (after 2 h), although regrowth was observed after 24 h in strain EC08 (6.8 log 10 CFU/ml) but not strain EC08recA (Fig. 2). At 1 mg/liter, a bacteriostatic effect only (drop of 3 log 10 CFU/ml) was observed in strain EC09recA (although a marked difference was observed in the first 8 h compared to EC09, up to ∆4.2 log 10 CFU/ml at 6 h). At 2.5 mg/liter, however, a bactericidal effect was observed in EC09recA (after 2 h) and a bacteriostatic effect in EC09 in the first 8 h, with regrowth after 24 h (Fig. 2). Under these conditions, SOS induction suppression leads to a high bactericidal effect under relevant therapeutic concentrations in E. coli harboring multiple mechanisms of quinolone resistance. At 1MIC of ciprofloxacin (of the tested strains harboring a nonmodified SOS system), major differences in the numbers of viable bacteria were observed after 24 h (∆6.1, ∆4.2, ∆9.5, and ∆6.9 log 10 CFU/ml in the ATCC, EC04, EC08, and EC09 isogenic pairs, respectively). Minor differences were observed at 4MIC of ciprofloxacin (Fig. S3). Additional kinetic assays (growth curves and ATP production) confirmed these results (Fig. S8). Suppression of SOS response reduces survival in resistant strains after a short time. The LIVE/DEAD staining method was tested using three different approaches to show the impact of SOS inactivation on bacterial survival during a short period of TABLE 1 Genotypes and ciprofloxacin susceptibility (by Etest) of isogenic strains Strain Genotype a MIC b CC (CLSI/ EUCAST) c Fold change d Source or referencegyrA1 gyrA2 parC marR qnr SOS system ATCC e WT f 0.008 S/S Lab collection ATCCrecA ∆recA 0.002 S/S 4 This study ATCClexA1 lexA1 0.004 S/S 2 This study EC02 S83L WT 0.25 S/S 31 EC02recA S83L ∆recA 0.03 S/S 8 This study EC04 S83L S80R WT 0.5 S/S 31 EC04recA S83L S80R ∆recA 0.125 S/S 4 This study EC04lexA1 S83L S80R lexA1 0.5 S/S 1 This study EC08 S83L D87N S80R WT 2 I/R 31 EC08recA S83L D87N S80R ∆recA 0.5 S/S 4 This study EC09 S83L D87N S80R ∆marR WT 8 R/R 31 EC09recA S83L D87N S80R ∆marR ∆recA 1 S/I 8 This study EC09lexA1 S83L D87N S80R ∆marR lexA1 2I/R 4 This study EC59 S83L D87N S80R ∆marR qnrS WT 32 R/R 31 EC59recA S83L D87N S80R ∆marR qnrS ∆recA 4 R/R 8 This study EC59lexA1 S83L D87N S80R ∆marR qnrS lexA1 32 R/R 1 This study a Strains are isogenic to E. coli ATCC 25922 and carry only the chromosomal modifications, qnrS gene, and/or SOS dysfunction (recA deletion or nonproteolizable LexA variant [LexA1]). Resistance-associated mutations located in the GyrA and ParC proteins have been defined as resistance mechanisms that alter the target site. b MIC (in milligrams per liter) of ciprofloxacin by Etest. c CC, clinical category according to the CLSI and EUCAST breakpoints (25, 38). The clinical category according to the CLSI breakpoint is shown before the slash, and the clinical category according to the EUCAST breakpoint is shown after the slash. The clinical categories are shown as follows: S, susceptible; I, intermediate susceptibility; R, resistant. Subgroups with clinical category changes are indicated in boldface type. d Fold reduction of MIC compared to the MIC of wild-type strain for the SOS system in each isogenic subgroup. e E. coli ATCC 25922. f WT, wild-type. Recacha et al. ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 4 PUBLICACIONES 84 exposure to quinolones. First, using the Infinite 200PRO multireader, it was clear that the live/dead ratio depended significantly on the SOS response functionality. Figure S4A shows the quantitative results obtained at 1MIC of ciprofloxacin (according to the MICs of strains with a functional SOS response) after4hofexposure. Under these conditions, the ratio of live to dead cells for E.coli ATCCrecA, EC04recA, EC08recA, and EC09recA deficient SOS variants decreased by 88%, 94%, 98%, and 98%, respectively, compared to their parental variants with the wild-type SOS response (P0.001). This reduction was also proportional to the level of quinolone resistance (P0.001). Second, these results were supported by fluorescence microscopy assay. Figure S4A shows representative images of strains EC08 and EC08recA exposed to 2.5 mg/liter (maximum concentration of drug in serum [C max ]) of ciprofloxacin for 4 h, supporting the differential response. Third, in order to determine whether the SOS response was a key factor for survival after a very short period of exposure to bactericidal drugs like quinolones in strains with mechanisms of acquired resistance (strains EC02, EC04, EC08, and EC09), flow cytometry was used to examine bacterial viability after 60 min of exposure at multiple concentrations of ciprofloxacin (see Materials and Methods). A significant reduction in cell viability was observed following treatment with ciprofloxacin at 4MIC and 2.5 mg/liter (Fig. 3 and S4B) (also at 1MIC and 1 mg/liter [data not shown]), which correlates directly with the inability to activate the SOS response. These results imply that the SOS response is a key short-term responder to DNA damage in both LLQR and resistant E. coli at clinically relevant quinolone concentrations. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the in vivo model. The fit of the mathematical model to the mouse serum data (i.e., correlation between the observed Time (hours) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 EC08 EC08recA EC08 1 mg/L CIP EC08recA 1 mg/L CIP Group EC08 - 1mg/L CIP Log 10 CFU/mL Time (hours) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 EC09 EC09recA EC09 1 mg/L CIP EC09recA 1 mg/L CIP Group EC09 - 1mg/L CIP Log10 CFU/mL Time (hours) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 EC08 EC08recA EC08 2,5 mg/L CIP EC08recA 2,5 mg/L CIP Group EC08 - 2.5mg/L CIP Log10 CFU/mL Time (hours) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 EC09 EC09recA EC09 2.5 mg/L CIP EC09recA 2.5 mg/L CIP Group EC09 - 2.5mg/L CIP Log 10 CFU/mL FIG 2 SOS inactivation enhances bactericidal activity against resistant strains. Viable bacterial counts of the EC08/EC08recA and EC09/EC09recA isogenic pairs in time-kill assays at ciprofloxacin (CIP) concentrations of 1 mg/liter (breakpoint for resistance according to EUCAST) and 2.5 mg/liter (human serum C max ), respectively. Data are represented as the means from at least three independent measurements. Standard deviations are indicated by the error bars (standard deviations not shown are smaller than the symbols). Resistance Reversion by Targeting the SOS Response ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 5 PUBLICACIONES 85 versus predicted data of the mathematical model) was acceptable (R 2 0.968). The estimated parameter values were as follows: clearance (CL), 0.38 10 1 liters/h; volume of distribution of the drug in the peripheral compartment (V p ) of 0.95  10 2 liters; transfer rate constant from central to peripheral compartment (k cp ) of 4.03; transfer rate constant from peripheral to central compartment (k pc )0.44 10 7 (Fig. S5). AUC/MIC values of 12.2/24.4 for strain EC08 and 48.8/97.6 for strain EC08recA were predicted in our model for 50 and 100 mg/kg of body weight, respectively. SOS suppression enhances bactericidal activity against resistant strains in vivo. Selected isogenic mutants, ciprofloxacin-nonsusceptible strain EC08 and susceptible strain EC08∆recA, were included in a murine model of intraperitoneal sepsis. No differences of bacterial load were observed in the spleens of control groups infected with strains EC08 and EC08∆recA (7.73 0.62 versus 7.45 0.61 log 10 CFU/g). All the controls died in the first 48 h according to the minimum lethal dose (MLD), with no differences between the strains (P0.05). Note that 33% mortality was observed within the first 24 h in the EC08 group treated with 50 mg/kg every 12 h (q12h), while no mortality was observed in the remaining treated groups during the experiments. With respect to bacterial burden, in mice infected with strain EC08∆recA (with the inactivated SOS response), treatment with ciprofloxacin at 50 mg/kg q12h and at 100 mg/kg q12h significantly reduced bacterial concentrations (∆log 10 CFU/g units of 1.75 and 1.76 in the spleen; P0.001, respectively) with respect to groups infected with strain EC08 (with the active SOS response) (Fig. 4). DISCUSSION The SOS response plays an important role in adaptation and acquired bacterial resistance to antibiotics. The key regulators (LexA and RecA) have been proposed as an attractive strategy for increasing bacterial sensitivity to antibiotics and combating the 10 1 10 2 10 3 10 4 0 200 400 600 800 Group EC02 Fluorescence Intensity(SYTO9) Cell count EC02 2.5mg/L EC02recA 2.5mg/L EC02 4xMIC CIP EC02recA 4xMIC CIP 10 1 10 2 10 3 10 4 0 200 400 600 800 Group EC04 Fluorescence Intensity(SYTO9) Cell count EC04 2.5mg/L EC04recA 2.5mg/L EC04 4xMIC CIP EC04recA 4xMIC CIP 10 1 10 2 10 3 10 4 0 200 400 600 800 Group EC08 Fluorescence Intensity(SYTO9) Cell count EC08 2.5mg/L EC08recA 2.5mg/L EC08 4xMIC CIP EC08recA 4xMIC CIP 10 1 10 2 10 3 10 4 0 200 400 600 800 Group EC09 Fluorescence Intensity(SYTO9) Cell count EC09 2.5mg/L EC09recA 2.5mg/L EC09 4xMIC CIP EC09recA 4xMIC CIP AB CD FIG 3 Flow cytometry of four groups of isogenic LLQR cells (harboring a natural [wild-type] or inactive SOS system [∆recA]) treated for 60 min at 2.5 mg/liter or at 4MIC (relative to the MIC of the wild-type SOS) of ciprofloxacin. Survival was measured as staining with green fluorescent SYTO9.Strains EC02 (A), EC04 (B), EC08 (C), and EC09 (D) were studied. Recacha et al. ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 6 PUBLICACIONES 86 emergence of resistance. This strategy has been tested essentially against highly susceptible wild-type bacteria without molecular mechanisms of acquired resistance (16, 26–28). Low-level resistance phenotypes, such as LLQR (which can be exposed to sublethal levels of antibiotics during antimicrobial treatment), pose a significant threat to the development of clinical resistance (29–31). Previous data validating the SOS response as a target of interest motivated our efforts to explore the consequences of a broader spectrum of SOS activity, ranging from natural through hypoinducible to constitutively repressed SOS response (Fig. 1) in a set of isogenic strains carrying combinations of chromosome- and plasmid-mediated quinolone resistance, and phenotypes ranging from susceptible to LLQR, resistant, and highly resistant. Our detailed analysis opens up a new strategy for reversing drug resistance by targeting the SOS response. The bactericidal activity of quinolones in bacteria has been related to a combination of DNA fragmentation, reactive oxygen species (ROS) production, and programmed cell death systems, such as mazEF (32–35). The SOS response has also been postulated as a formidable strategy against aggressions such as antimicrobial exposure (10). The link between quinolones, activation of the SOS response, and induction of antibiotic resistance (26,28) demonstrates the potential for reducing resistance by targeting the RecA and LexA proteins that are essential for an SOS response. Our study provides evidence that suppression of the SOS pathway can synergize with specific antimicrobial agents, such as quinolones, to reduce MICs in a process of resistance reversion. In the case of constitutive SOS inactivation, the MIC data of ∆recA mutants were in agreement with earlier studies of highly susceptible wild-type phenotypes (36,37), and resensitization was observed in LLQR, resistant, and highly resistant phenotypes (Table 1 and Fig. 2 and 4; also see Fig. S6 in the supplemental material). However, the increased sensitivity was less when the level of SOS induction was attenuated by a slow-cleaving LexA variant, the LexA1 (G80D) strain, which showed minor changes in MIC in both susceptible Ec08 No treatment Ec08recA No treatment Ec08 CIP 100 mg/kg Ec08recA CIP 100 mg/kg Ec08 CIP 50 mg/kg Ec08recA CIP 50 mg/kg 0 2 4 6 8 10 Strains Log10 cfu/ g spleen Ec08 No treatment 7.735 0.6205 Ec08recA No treatment 7.450 0.6238 Ec08 CIP 100 mg/kg 5.802 0.7655 Ec08recA CIP 100 mg/kg 4.050 0.4041 Ec08 CIP 50 mg/kg 6.575 0.3051 Ec08recA CIP 50 mg/kg 4.813 0.5176 ns ** FIG 4 SOS inactivation reduces the in vivo survival of mice infected with bacteria receiving quinolone treatment. Efficacies of ciprofloxacin (CIP) in a murine model of sepsis caused by strains EC08 (intact SOS system) and EC08recA (inactivated SOS system). Group 1 was given ciprofloxacin 50 mg/kg q12h intraperitoneally. Group 2 was given ciprofloxacin 100 mg/kg q12h intraperitoneally. The control group was not treated with ciprofloxacin. Standard deviations are indicated by the error bars. Values that were significantly different (P0.001) are indicated by a bar and asterisk. Values that were not significantly different (ns) are indicated. Resistance Reversion by Targeting the SOS Response ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 7 PUBLICACIONES 87 and resistant phenotypes. This discrepancy could be due, in part, because recA deletion can have an impact beyond leading to loss of LexA cleavage and SOS response suppression, with additional implications in important processes like homologous recombination. An overactive SOS response can also increase quinolone susceptibility, although to a lesser extent than constitutive inhibition (15). Moreover, several compounds that inhibit RecA in vitro or in vivo have been discovered (17–20). In short, potent inhibition of the SOS response in concert with DNA-damaging agents like quinolones offers the best option for potential synergy, and we focused our study on recA mutants in order to show their impact on the reversion of quinolone resistance. According to the CLSI guidelines (38), complete inactivation of the SOS response led to a change in clinical category for ciprofloxacin from intermediate or resistant to susceptible in EC08 (S83L, D87N, and S80R substitutions) and EC09 (S83L, D87N, and S80R substitutions and ∆marR) strains, respectively. Using EUCAST guidelines (25), inactivation changed the clinical category from resistant to susceptible in strain EC08 and to intermediate-susceptible in strain EC09, respectively. These results support the relevance of a strategy of SOS inactivation for bringing about reversion of antimicrobial resistance at a level that could be clinically significant. Interestingly, the inactivation of recA in the EC02 strain (encoding an S83L substitution) modified the ciprofloxacin MIC below the epidemiological cutoff (0.032 mg/liter; http://www.eucast.org)(39, 40). Here we show that inactivation of the SOS system suppresses the effect, in terms of MIC, of the first step toward resistance associated with topoisomerase type II modifications. A qualitative model illustrating the efficacy of SOS suppression in the resensitization of quinolone resistance is shown in Fig. 5, showing that this phenomenon is observed in bacteria with genes encoding multiple (up to four) different resistance mechanisms. In terms of kinetic assays, multiple approaches were developed to evaluate the Susceptibility Number of mechanisms of quinolone resistance ECOFF 0123 4 5 S I R SOSSOS- SOSSOS- SOSSOS- FIG 5 A general qualitative model illustrating the efficacy of SOS response suppression for reversion of fluoroquinolone resistance. Reversion of resistance was even observed in bacteria carrying genes encoding four different resistance mechanisms. Red bars correspond to E. coli with an intact SOS system; green bars correspond to E. coli with a suppressed SOS response. The epidemiological cutoff (ECOFF) (0.032 mg/liter [http://www.eucast.org]) is indicated by the red dotted line. S, I, and R mean susceptibility, intermediate susceptibility, and clinical resistance, respectively. SOS- means SOS response suppression. Recacha et al. ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 8 PUBLICACIONES 88 reversion of quinolone resistance mediated by an inactivated SOS response at both long and short periods of exposure to drugs. In all cases, we observed a clear selective disadvantage for survival in strains with a suppressed SOS response when exposed to ciprofloxacin at relevant concentrations (breakpoint concentrations, serum C max , and MIC values) (Fig. 2 and 3 and S6). For time-kill curves, an inactivated SOS response in E. coli harboring multiple mechanisms of resistance had a high bactericidal effect in the presence of clinically relevant ciprofloxacin concentrations after 2 to4hofexposure (depending on the strain and conditions), which was maintained for 24 h (Fig. 2 and S3). Flow cytometry assays also showed significant reductions in cell viability following a short period of exposure to the drug (60 min), which was directly related to the inability to activate the SOS response (Fig. 3). Our data show that changes in the MICs of specific quinolone-resistant strains (EC08 and EC09) as a result of an inactivated SOS response correlated with ROS formation at clinically relevant concentrations of ciprofloxacin (Fig. S7). In terms of bacterial viability, these data support the potential utility of this strategy for resensitizing or reversing quinolone resistance after both short and long periods of exposure to quinolones at relevant concentrations. Interestingly, whether SOS response suppression could restrict the evolution to clinical resistance in LLQR phenotypes should be tested (16). Although SOS response inactivation led to moderate reductions in the MICs of ciprofloxacin (up to 8-fold) and other fluoroquinolones (up to 15-fold), these differences could play a significant role in therapeutic failure, bearing in mind the concentrationdependent character of these antimicrobials, whose predictors of efficacy in vivo are C max /MIC and AUC/MIC. AUC/MIC values of 30 are associated with low mortality and are required for clinical efficacy (41–44). Our murine sepsis model, using isogenic strains that were resistant (EC08) and susceptible (EC08recA; lacking SOS response) to ciprofloxacin according to EUCAST, showed the impact of the pathway on the in vivo efficacy of this fluoroquinolone (with a reduction in bacterial count of around 99%). Our murine model shows that inactivation of the SOS pathway in an initially quinolone-resistant E. coli strain (EC08) significantly increases the in vivo efficacy of ciprofloxacin. According to our data, engineered bacteriophage targeting SOS response (by overexpression of an inactivated LexA variant) was shown to be a promising resistance reversion strategy (45). In overall terms, this study shows that suppression of the SOS response enhances the bactericidal activity of antimicrobials like quinolones across a range of E. coli phenotypes from highly susceptible to highly resistant and plays a significant role in increasing the in vivo efficacy of these bactericidal drugs against bacteria with multiple mechanisms of acquired resistance. The development of RecA inhibitors could function as an adjuvant therapy, potentiating antimicrobial activity and contributing to the resensitization or reversion of drug resistance. MATERIALS AND METHODS Strains, growth conditions, and antimicrobial agents. Wild-type E. coli ATCC 25922 was used as the starting strain for all constructions (Table 1). E. coli ATCC 25922 (wild-type) and isogenic EC02, EC04, EC08, EC09, and EC59 strains represent progressive degrees of fluoroquinolone resistance, ranging from susceptible to resistant (see Text S1 in the supplemental material for details). Liquid or solid Luria-Bertani medium (LB), Mueller-Hinton broth (MHB), and M9 minimal medium were used. Strains were grown at 37°C. The following quinolones were used for the different assays: nalidixic acid, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, norfloxacin, and ofloxacin (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain). Isogenic strain construction. lexA1 mutants (coding for a LexA G80D substitution) (46) were obtained by gene replacement, as previously described (Table 1 and see Table S1B in the supplemental material) (31, 47). Disruption of the recA gene was carried out with a modified version of the method described by Datsenko and Wanner (48). The qnrS gene was cloned into the pBK-CMV vector as described previously (31) (see Text S1 for details). MICs. MICs were determined in triplicate for each bacterial strain, using two different techniques, broth microdilution and the Etest technique, and following CLSI reference methods (38). Clinical categories were established according to CLSI and EUCAST breakpoints (25, 38). Time-kill curve assays. To show the effect of suppression of the SOS response on bacterial viability, time-kill assays were performed with each isogenic group based on the SOS system induction status. Mueller-Hinton broth was used with 1MIC and 4MIC concentrations of ciprofloxacin. Ciprofloxacin Resistance Reversion by Targeting the SOS Response ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 9 PUBLICACIONES 89 concentrations were relative to MICs for strains harboring the unmodified SOS system (i.e., with intact recA and lexA genes). Selected isogenic groups of strains, the EC08 and EC09 groups (bordering on clinical resistance) were also exposed to fixed concentrations of antimicrobial (1 mg/liter, the breakpoint for resistance according to EUCAST, or 2.5 mg/liter, human serum C max for ciprofloxacin) in MHB (25, 49). Growth in drug-free broth was evaluated in parallel as a control. Cultures were incubated at 37°C with shaking at 250 rpm. An initial inoculum of 10 6 CFU/ml was used in all experiments, and bacterial concentrations were determined at 0, 2, 4, 6, 8, and 24 h by colony counting. Quantification of live/dead bacteria by flow cytometry. The Molecular Probes LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit (Invitrogen) was used to show the impact of SOS inactivation after a short period of antimicrobial exposure by flow cytometry (Cytomics FC500-MPL; Beckman Coulter) according to the kit instructions. Cells were exposed at 1MIC and 4MIC ciprofloxacin concentration of the tested strains harboring a nonmodified SOS system (i.e., intact recA and lexA genes) or to a fixed concentration (1 mg/liter, the breakpoint for resistance according to EUCAST, or 2.5 mg/liter, the serum C max for ciprofloxacin) (25, 49). Cells were cultured in the same way and exposed to ciprofloxacin for 60 min. To prepare the cells for measurement, 1 ml of cell culture was washed once in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS), resuspended in 1 ml of saline solution, stained according to the kit instructions, and then incubated for 15 min before counting. The following photomultiplier tube (PMT) voltages were used: 420 V for FL1 and 560 V for FL3. At least 10,000 cells per sample were collected. Flow cytometry acquisition was performed at a low flow rate (~30 events/s) (35). Mice. Male immunocompetent C57BL/6 mice were obtained from the University of Seville. The project was approved by the Ethics and Clinical Research Committee of the Virgen Macarena and Virgen del Rocio University Hospitals (reference number 1086-N-15) (see Text S1 for details). Pharmacokinetics and pharmacodynamics. Pharmacokinetic serum data from our previous work were fitted to a two-compartment model (intraperitoneal space and blood) using ADAPT 5 (50, 51). A range of dosages were simulated in order to obtain a favorable pharmacokinetic parameter of area under the concentration-time curve from 0 to 24 h (AUC 024 )/MIC ~50 or ~100, adjusted to the SOS-deficient strain in the isogenic pair EC08/EC08recA (strain EC08recA has a ciprofloxacin MIC of 0.5 mg/liter). Experimental model. Mice weighing 16 to 18 g were used. Using a murine model of peritoneal sepsis, the minimum lethal dose (MLD) for EC08 and EC08recA strains was determined (see Text S1 for details). The murine model was used to evaluate the efficacy of ciprofloxacin between strains EC08 and EC08recA. Mice were infected intraperitoneally using the MLD. Two hours postinfection, antimicrobial therapy started. Animals were randomly assigned to different therapeutic groups as follows: group 1,ciprofloxacin administered intraperitoneally at 50 mg/kg of body weight every 12 h (q12h); group 2, ciprofloxacin administered intraperitoneally at 100 mg/kg q12h;control group, no ciprofloxacin treatment. At 24 h, the bacterial loads in the spleens of 15 mice per strain and ciprofloxacin dosage were determined (see Text S1 for details). Statistical analysis. For statistical evaluation, the Student’s ttest was used when two groups were compared. The analysis of variance (ANOVA) test and Tukey’s posthoc tests were used for group comparisons. Differences were considered significant when Pvalues were 0.05. SUPPLEMENTAL MATERIAL Supplemental material for this article may be found at https://doi.org/10.1128/mBio .00971-17. TEXT S1, DOCX file, 0.04 MB. FIG S1, PDF file, 0.5 MB. FIG S2, PDF file, 2 MB. FIG S3, PDF file, 0.4 MB. FIG S4, PDF file, 0.6 MB. FIG S5, PDF file, 0.1 MB. FIG S6, PDF file, 0.4 MB. FIG S7, PDF file, 0.3 MB. FIG S8, PDF file, 1.1 MB. TABLE S1, DOCX file, 0.02 MB. ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by the Ministerio de Sanidad y Consumo, Instituto de Salud Carlos III (projects PI14/00940 and PI13/00063) and by the Plan Nacional de IDi 2008-2011 and the Instituto de Salud Carlos III, Subdirección General de Redes y Centros de Investigación Cooperativa, Ministerio de Economía y Competitividad, and the Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI RD12/0015), cofinanced by the European Development Regional Fund “A way to achieve Europe” ERDF. 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Tamae C, Liu A, Kim K, Sitz D, Hong J, Becket E, Bui A, Solaimani P, Tran Resistance Reversion by Targeting the SOS Response ® September/October 2017 Volume 8 Issue 5 e00971-17 mbio.asm.org 11 PUBLICACIONES 91 PUBLICACIONES 98 Enterobacteriaceae such as Escherichia coli are among the most common causes of community-acquired and nosocomial infections. Fluoroquinolones are used for empirical and directed therapy in infections caused by E. coli. 9 Quinolone resistance in both human and veterinary isolates of Enterobacteriaceae has increased notably. 10,11 The mechanisms of fluoroquinolone resistance mainly involve chromosomal mutations in genes encoding quinolone targets (type II topoisomerases), but also involve reduced permeability. 11 Plasmid-mediated quinolone resistance mechanisms are also epidemiologically relevant. 12 These determinants on their own confer low-level quinolone resistance (LLQR), and therefore multiple mechanisms must be combined to achieve clinical resistance. 12 Suppression of the SOS response was recently revealed as a therapeutic strategy for potentiating bactericidal antibiotics such as quinolones against both susceptible and resistant E. coli, leading to their resensitization to drugs such as quinolones. 13,14 Several compounds have been validated for the inhibition of RecA activity in vitro and in vivo, leading to increased antimicrobial activity. 15,16 Although targeting the SOS response seems a promising strategy for developing therapeutics to enhance the bactericidal activity of antimicrobial agents, significant questions remain unanswered regarding the possible impact of this approach as an evolutionary strategy for reversing and tackling the evolution of antibiotic resistance. 17,18 To address this question, we used a collection of isogenic E. coli mutants (Table S1, 14 available as Supplementary data at JAC Online) exhibiting a spectrum of SOS activity, from a natural SOS response to hypoinducible (LexA1, with very low cleavage rate) 19 and constitutively suppressed responses (DrecA), also carrying combinations of chromosomally and plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) mechanisms (including susceptible, LLQR and resistant phenotypes). The impact of suppression of the SOS response on the spatiotemporal evolution of resistance and other relevant biological parameters, such as bacterial fitness, biofilm formation and post-antibiotic effects (PAEs), under therapeutic concentrations was investigated. Materials and methods Strains, growth conditions and antimicrobial agents Sixteen isogenic E. coli strains were used (based on WT E. coli ATCC 25922) harbouring chromosomally mediated and/or plasmid-mediated quinolone resistance mechanisms combined with recA deletion and/or lexA replacement by lexA1 14 (see Table S1). Liquid or solid LB medium and Mueller–Hinton broth (MHB) were used. Strains were grown at 37C. Ciprofloxacin was used for the different assays (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain). Kanamycin (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain) at 30mg/L was used for plasmid maintenance. The qnrS gene was cloned into the pBK-CMV vector as described previously. 20 Expression of ciprofloxacin-induced GFP in the kanamycin-resistant pMSrecA-gfp vector was used to detect recA promoter activity (SOS induction). 21 Determination of mutation rate Overnight cultures of E. coli were diluted 1:10000 and incubated for 16h in the absence of ciprofloxacin. The mutation rate was determined by spreading an overnight culture of viable microorganisms (100 lL) from 5 mL cultures on LB agar plates, with and without ciprofloxacin (with 4%MIC as the selective concentration). Ciprofloxacin concentrations were relative to MICs for strains harbouring the unmodified SOS response (i.e. with intact recA and lexA genes). Selected isogenic groups were also exposed to fixed selective concentrations of ciprofloxacin: 1mg/L for the ATCC, EC02 and EC04 groups (CLSI breakpoint for resistance) 22 and 2.5mg/L for the EC04, EC08 and EC09 groups [peak serum ciprofloxacin concentrations (C max )]. 23 These concentrations allow selection of different types of mutants. The colony count was determined after 48h at 37C in three independent assays. The colony counts from the three replicates were then used in the MSS maximum-likelihood method using the FALCOR web site (http://www.mito chondria.org/protocols/FALCOR.html) 24 to estimate the number of mutational events per culture. Mutant prevention concentration (MPC) determination MPCs were determined as previously described by Marcusson et al. 25 The MPC was recorded as the lowest quinolone concentration at which no colonies grew on an agar plate. The MPC for each strain was determined in at least two independent experiments. Agar gradient plate experiments A key aspect of bacterial survival is the ability to evolve while migrating across spatially varying environmental challenges. 26 Gradient plate assays (120.5mm) were used to evaluate microbial evolution as a function of the SOS response available. Several maximum concentrations of ciprofloxacin were used: 1 and 2.5mg/L, and 1%or 4%MIC (relative to the WT SOS response). BM2 swarming medium was used 27 (see Supplementary Methods). The plates were incubated for a maximumof 240h. 28 Whole genome sequencing Genomic DNA from 29 evolved mutants (obtained from the zone separating growth and non-growth) and their respective parental strains was extracted and sequenced using MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA). Raw reads were quality filtered and assembled into contigs using the CLC genomics workbench 9.5.2. (CLC bio, QIAGEN) and analysed (see Supplementary Methods). Growth competition assays E. coli ATCC 25922, EC02,EC04, EC08 and EC09 were used as standard reference strains against derived DrecA (kanamycin-resistant) mutants. EC59 DlacZ was tested against EC59 DrecA (DlacZ mutation is neutral). 20 Fitness cost was determined as previously described by Marcusson et al. 25 (see Supplementary Methods). A relative fitness (RF) score .1 indicated that the mutant strain had a selective advantage over the control strain, whereas a score ,1 represented a fitness cost. Competition assays were also carried out at 0.5%MIC of ciprofloxacin. Ciprofloxacin concentrations were relative to MICs for strains harbouring the modified SOS response (recA deleted). The ATCC, EC02 and EC04 groups were also exposed to environmental concentrations of ciprofloxacin (0.002mg/L). 29 Each competition assay was tested in at least six independent experiments. Determination of the PAE of ciprofloxacin ATCC, EC02, EC04 and EC08 groups were selected to show the impact of suppression of the SOS response on the PAE in vitro by exposing the bacteria (10 7 cfu/mL) to fixed concentrations of 1 and 2.5 mg/L of ciprofloxacin for 2 h. The antibiotic was removed from the culture by three centrifugations, and the bacteria were resuspendedin fresh MHB. The antibiotic-free bacterial suspension was then incubated at 37C and shaken. After removal of the drug, viable counts were performed hourly for the next 6h and at 24h. A growth control, prepared and treated in a similar way to the test solution but without being exposed to antibiotics, was included in each experiment. The PAE was calculated as previously described. 30 Recacha et al. 2 of 8 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/advance-article-abstract/doi/10.1093/jac/dky407/5133291 by guest on 17 October 2018 PUBLICACIONES 99 Biofilm production Biofilm production was assessed by a previously described spectrophotometric method 31 (see Supplementary Methods). Sub-MIC concentrations of ciprofloxacin (1/16%MIC for each of the respective SOS WT strains) were evaluated. Statistical analysis For statistical evaluation, Student’s t-test was used when two groups were compared. Differences were considered significant when Pvalues were 0.05. Results Suppression of the SOS response reduces emergence of mutants in LLQR E. coli Five isogenic E. coli strains were used that harbour the most frequent chromosomal mutations associated with fluoroquinolone resistance in the gyrA and/or parC genes and/or a deletion in the marR gene combined with the PMQR mechanism (qnrS) (ranging from WT high susceptibility to a high level of resistance). In order to evaluate the impact of the SOS response on the emergence of mutants in LLQR E. coli, the SOS response was suppressed in all strains by means of recA deletion or replacement of lexA by lexA1 (Table S1). MICs were in the range 0.004–4 mg/L. (Table 1) To evaluate the role of the SOS response in the emergence of resistant mutants, selected strains were exposed to different selective concentrations of ciprofloxacin above the MIC (see Table 1). At a fixed concentration of 1 mg/L ciprofloxacin, no mutants were obtained for the ATCC and EC02 groups. The EC04 WT strain displayed a mutation rate of 2%10 #5 , and strains with modified SOS response (LexA1/DrecA) showed a decrease in mutation rate of 10-fold and no mutants, respectively. At 2.5mg/L ciprofloxacin, the EC04 group produced no mutants. The WT strain EC08 showed a mutation rate of 5%10 #5 , which compared with undetectable levels of mutants in its isogenic RecA-deficient counterpart. Mutation rates for strains belonging to the EC09 group with modified SOS response (DrecA/LexA1) were 3%10 #6 and 4%10 #4 , respectively. At 4%MIC, inactivation of the SOS response (mediated by LexA1) produced a 10- to 100-fold decrease in mutation rate for ATCC, EC04 and EC09, although interestingly no mutants grew from RecA-deficient strains under these conditions in any group (Table 1). EC59 data are not included due to its high level of resistance. These results indicate that suppression of the SOS response hampers acquired ciprofloxacin resistance in LLQR E. coli and has a major effect on DrecA mutants (SOS inactivation) compared with LexA1 mutants (SOS hypoactivation). Suppression of SOS response reduces MPCs of quinolone for LLQR E. coli The ATCC, EC02, EC04 and EC08 groups carrying modifications in the SOS response (recA deletion or LexA1) were used to study MPC parameters. Ciprofloxacin MICs ranged between 0.004 and 2 mg/L, from WT highly susceptible to intermediately susceptible (according to CLSI guidelines 22 ). The ciprofloxacin MPC values for all isogenic strains with recA deletion or LexA1 were 8- and 2-fold lower, respectively, than for the WT strain (Table 1). An 8-fold decrease for EC02 and EC04 (recA deletion strains) relative to WT reduced MPC values of ciprofloxacin to 0.5 and 1 mg/L, respectively. These concentrations are below the maximum serum concentrations (2.5 mg/L). Although the mutant selection window (MSW) was wider for WT E. coli ATCC 25922 (256) than for the strains with modifications in the gyrA and parC genes (16–64), absolute MPC values in these Table 1. Susceptibility (MICs and clinical category), mutation rates, mutant prevention concentration (MPC), time to emergence of mutants and mutant selection window (MSW) values of ciprofloxacin Mutation rates (mutations/generation) Strain CIP MIC (mg/L) CC (CLSI/EUCAST) a CIP 1 mg/L CIP 2.5 mg/L CIP 4%MIC MPC (mg/L) Time to emergence of mutants (h) MSW (MPC/MIC) ATCC 25922 0.004 S/S ,3%10 –8 ND 2 %10 –7 1 48 256 ATCC DrecA 0.001 S/S ,2%10 –7 ND ,3%10 –9 0.125 48 128 ATCC lexA1 0.002 S/S ,2%10 –7 ND 2 %10 –9 0.5 24 256 EC02 0.06 S/S ,2%10 –8 ND 3 %10 –6 4 24 64 EC02 DrecA 0.008 S/S ,5%10 –7 ND ,3%10 –9 0.5 48 64 EC04 0.5 S/S 2 %10 –5 ,2%10 –8 3%10 –6 8 24 16 EC04 DrecA 0.125 S/S ,5%10 –8 ,10 –8 ,2%10 –9 1 24 8 EC04 lexA1 0.5 S/S 3 %10 –6 ,2%10 –8 8%10 –8 4 24 8 EC08 2 I/R ND 5 %10 –5 4%10 –8 64 48 32 EC08 DrecA 0.5 S/S ND ,2%10 –8 ,2%10 –9 8 24 16 EC09 4 R/R ND ND 6 %10 –7 ND ND ND EC09 DrecA 1 S/I ND 3 %10 –6 ,2%10 –9 ND ND ND EC09 lexA1 2 I/R ND 4 %10 –4 2%10 –8 ND ND ND Mutation rate data correspond to the analysis of at least three independent cultures. Ciprofloxacin concentrations indicated for mutation rate assays were used as selective concentrations. Subgroups with clinical category changes are indicated in bold. CIP, ciprofloxacin; ND, not determined. a CC (CLSI/EUCAST) refers to clinical categories according to CLSI or EUCAST breakpoints. 22,44 Blocking quinolone resistance by suppressing the SOS response JAC 3 of 8 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/advance-article-abstract/doi/10.1093/jac/dky407/5133291 by guest on 17 October 2018 PUBLICACIONES 100 strains were clearly higher than those of the WT strains. Suppression of the SOS response mediated by recA deletion affected the MSW, which was narrower for ATCC (256 versus 128), EC04 (16 versus 8) and EC08 (32 versus 16) and equal for EC02 (64), compared with the parental strain. Modification of the SOS response with LexA1 also produced changes in the MSW. It was narrower for EC04 (16 versus 8) and equal for ATCC (256). Although the plates were incubated for up to 96h, 24–48 h was sufficient to show colony growth (Table 1). Suppression of SOS response delays spatiotemporal microbial evolution Using the agar gradient plate experiments, we demonstrated a notable delay in the spatiotemporal evolution of quinolone resistance in accordance with the SOS response (recA deletion) in isogenic LLQR (EC02, EC04, EC08) E. coli strains harbouring several molecular resistance mechanisms (Figure S1). Although multiple lineages evolved towards resistance in both WT strains and those with a deficient SOS response, the number of lineages and the progression towards higher levels of resistance was much more evident in the presence of a functional SOS response. This isespecially relevant in LLQR phenotypes at clinically relevant concentrations of quinolones (Figure S1C and D). Regardless of SOS response functionality, adjacent mutant lineages exclude each other and compete for limited space, resulting in some lineages completely blocking the growth of others (Figure S1). The twenty-nine evolved mutants obtained in these assays were subjected to whole-genome sequencing. No differences (associated with type of quinolone resistance mutation) were found depending on the functionality of the SOS response. No new modifications of the topoisomerase genes were identified. Some of these mutants showed modifications in the redox-sensitive transcription activator, SoxR (G121D), DNA repair proteins such as RecQ (V536L!A539S) or UvrD (R421P), the cell division protein, FtsA (E203G), and the regulator of outer membrane proteins, EnvZ (P248Q). Suppression of SOS response modifies bacterial fitness in LLQR E. coli The six mutants harbouring recA deletions were tested against their respective WTs in growth competition assays to measure the fitness costs associated with the resistance mutations carried and suppression of the SOS response. For every pair of strains tested, recA deletion produced alterations in fitness, which varied in magnitude depending on the presence/absence of the antibiotic, and there was no correlation between fitness and the level of quinolone resistance (Figure 1a). In the absence of ciprofloxacin, there was a decreased fitness of 19%–28% relative to the WT, with the greatest decrease in the EC59 strain. In the presence of DNA- damaging antibiotics, two concentrations of ciprofloxacin were studied. At 0.5%MIC of ciprofloxacin (the MIC value refers to the RecA-deficient strain), there was a bigger drop in fitness (by 33%– 50%) than in the non-induced group, with the greatest loss of fitness being for EC09 (Figure 1b). The ATCC, EC02 and EC04 groups were selected for treatment with a fixed concentration of ciprofloxacin of 0.002 mg/L (equivalent to the concentration of ciprofloxacin found in environmental wastewater 29 ) and showed decreasedfitness of 81%, 30% and 28%, respectively (Figure 1c). Suppression of SOS response increases in vitro PAE in both WT and LLQR E. coli In vitro PAE was determined to evaluate the impact of suppression of the SOS response after exposure to fixed ciprofloxacin concentrations (1mg/L, i.e. the CLSI breakpoint for resistance, 22 and 2.5mg/L, i.e. the C max of ciprofloxacin 23 ), as well as the time needed for recovery after antimicrobial stress. After 2h exposure, the in vitro PAE of ciprofloxacin at 1 and 2.5mg/L was .6 h against recA-deficient E. coli ATCC 25922 compared with 2 h against WT E. coli ATCC 25922 (Figure 2). Likewise, for the LLQR phenotypes EC02, EC04 and EC08, at these clinically significant concentrations of ciprofloxacin, the PAE was observed to be 3 h longer in the isogenic strains with the deficient SOS response (Figure 2). Effect of suppression of SOS response on biofilm formation under subinhibitory concentrations Figure 3shows the relative biofilm production in M9 minimal medium at sub-MIC concentrations of ciprofloxacin (1/16%MIC relative to the MIC of SOS WT). A reduction of 22%–80% was observed when recA was deleted. Absorbance values were 0.546–0.438 for the WT strains, whereas those for their isogenic recA-deficient counterparts were 0.410–0.105 (threshold value indicative of biofilm production: 0.08). LexA1 mutants had a minor effect on biofilm formation compared with recA deletion under the same conditions. Discussion The SOS response plays an important role in adaptation and acquired bacterial resistance to antibiotics, and has been proposed as an attractive target for increasing bacterial susceptibility to antibiotics and combating the emergence of resistance. 17–19,32 Lowlevel resistance phenotypes, such as LLQR (which can be exposed to sub-lethal levels of antibiotics during antimicrobial treatment), pose a significant threat of the development of clinical resistance. 18,19,32 Apart from the effect that the suppression of the SOS response has in enhancing the bactericidal activity of antimicrobial agents such as quinolones, significant questions remain unanswered about the possible impact of SOS response suppression as an evolutionary strategy for reversing and tackling the evolution of antibiotic resistance. 17,18 In this study, we determined the efficacy of SOS response suppression as a strategy for disrupting the spatiotemporal evolution of resistance and other important clinical parameters such as bacterial fitness, biofilm formation and PAE under therapeutic concentrations using an isogenic collection with an altered SOS response (Table S1 14 ) in combination with chromosomal and PMQR mechanisms (including susceptible, LLQR and resistant phenotypes). Our study showed that targeting the SOS pathways in LLQR phenotypes at clinically significant concentrations slowed down mutagenesis and blocked the acquisition of resistance (Table 1 and Figure S1). For RecA-deficient strains, a huge drop in the mutation rate was observed in those harbouring mechanisms of quinolone resistance (ranging from susceptible, intermediate Recacha et al. 4 of 8 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/advance-article-abstract/doi/10.1093/jac/dky407/5133291 by guest on 17 October 2018 susceptible to low-level resistant) at 4%MIC of ciprofloxacin, from which it was concluded that suppression of the SOS response mediated by recA deletion interferes with the ability of bacteria to evolve to higher resistance levels independently of the quinolone resistance phenotype. This behaviour was similar at clinically relevant concentrations of ciprofloxacin for LLQR phenotypes, supporting the ability of this strategy to tackle the emergence of resistance. For the EC08 group, at ciprofloxacin C max (2.5 mg/L), suppression of the SOS response reduced the mutation rate .10 3 - fold, preventing the emergence of mutations. These results correlated well with a recently published in vivo murine model, in which the EC08 group was used to show that suppression of the SOS response increased the in vivo efficacy of ciprofloxacin. 14 On the other hand, a hypoactive SOS response based on LexA1 resulted in a minor reduction of the mutation rate relative to recA-deleted strains. Furthermore, we showed that suppression of the SOS response based on recA deletion reduced quinolone MPC values in LLQR E. coli (groups EC02 and EC04, Table 1) below the maximum serum concentration of ciprofloxacin (2.5mg/L 23 ). Hence, suppression of the SOS response reverses the effects of low-level quinolone resistance mechanisms, such as S83L and S80R on GyrA and ParC, on the MPC value and the emergence of mutants. 20,33 RecA and LexA have been proposed as therapeutic targets that interfere with SOS induction. 15,16,34–37 Our results suggest that the effects of SOS response suppression (DrecA and LexA1) largely mimic each other in terms of synergy and acquired resistance, even in low-level resistance phenotypes, although a greater degree of susceptibility and control of emergence of resistance can be observed with the DrecA strain. 13,14 Our data suggest that targeting either RecA or LexA could be of interest, although it is worth noting that each probably presents its own challenges. RecA, unlike LexA, has important human homologues (i.e. the Rad51 family), which makes specificity a particularly important requirement for targeting RecA; indeed, some high-throughput screening efforts have yielded compounds that selectively target RecA or Rad51. 13,33 Furthermore, recA deletion has an impact other than leading to suppression of the SOS response, since it has additional implications for important processes such as homologous 0.6 ATCC 25922 ∆recA ATCC 25922 ∆recA ATCC 25922 ∆recA EC02 ∆recA EC04 ∆recA EC02 ∆recA EC04 ∆recA EC08 ∆recA EC09 ∆recA EC02 ∆recA EC04 ∆recA EC08 ∆recA EC09 ∆recA EC59 ∆recA 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 (a) (b) (c) Competition index (CI) (log) Competition index (CI) (log) Competition index (CI) (log) ***** * 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 * * * * * 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 * ** Figure 1. Bacterial fitness in in vitro competition assays for ATCC, EC02, EC04, EC08, EC09 and EC59 recA mutants compared with WT strains studied in the absence of ciprofloxacin (a), at 0.5%MIC for the recA mutant (b), and with 0.002 mg/L of ciprofloxacin (c). 29 Competition index values from each independent experiment are plotted. The broken horizontal line indicates a competition index value of 1, and means are indicated by short continuous horizontal lines. Significant Pvalues compared with the respective WT for SOS response are noted: *P,0.001. Blocking quinolone resistance by suppressing the SOS response JAC 5 of 8 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/advance-article-abstract/doi/10.1093/jac/dky407/5133291 by guest on 17 October 2018 PUBLICACIONES 101 –2 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10 12 10 24 Time (h) Log10cfu/mL Log10cfu/mL Log10cfu/mL Log10cfu/mL ATCC ATCCrecA ATCC 2.5 mg/L CIP ATCCrecA 2.5 mg/L CIP ATCC 1 mg/L CIP ATCCrecA 1 mg/L CIP ATCC –2 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10 12 10 24 Time (h) EC02 EC02recA EC02 2.5 mg/L CIP EC02recA 2.5 mg/L CIP EC02 1 mg/L CIP EC02recA 1 mg/L CIP EC02 –202468 0 2 4 6 8 10 12 10 24 Time (h) EC04 EC04recA EC04 2.5 mg/L CIP EC04recA 2.5 mg/L CIP EC04 1 mg/L CIP EC04recA 1 mg/L CIP EC04 –2 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10 12 10 24 Time (h) EC08 EC08recA EC08 2.5 mg/L CIP EC08recA 2.5 mg/L CIP EC08 1 mg/L CIP EC08recA 1 mg/L CIP EC08 Figure 2. PAE of ciprofloxacin against ATCC, EC02, EC04 and EC08 recA mutants and their respective WT strains after 2 h of exposure to 1 or 2.5 mg/L of drug. A vertical line indicates the beginning of the time after exposure to the antibiotic. 0 50 ATCC ATCC ∆recA EC02 ∆recA EC08 ∆recA EC04 ∆recA EC59 ∆recA Ec04 lexA1 Ec09 lexA1 EC59 lexA1 ATCC lexA1 EC02 EC04 EC08 EC09 EC59 EC09 ∆recA 100 Relative biofilm formation (%) 1/16 ×MIC CIP (relative to MIC of SOS WT) ** ** *** ** * *** ** ** ** * Figure 3. Biofilm production by ATCC, EC02, EC04, EC08, EC09 and EC59 and their respective mutants with defective SOS response (DrecA or LexA1) at 1/16%MIC of ciprofloxacin (relative to the MIC of SOS WT). In each group, data are expressed as percentages relative to the SOS WT. Significant P values compared with the respective WT for SOS response are noted: *P,0.05; **P,0.01; ***P,0.001. Recacha et al. 6 of 8 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/advance-article-abstract/doi/10.1093/jac/dky407/5133291 by guest on 17 October 2018 PUBLICACIONES 102 recombination. 38 It is unknown if the SOS response suppression could interfere positively or negatively with the impact of other relevant processes involved in genetic variability such as the DNA mismatch repair system. 39 A key aspect of bacterial survival is the ability to evolve while migrating across spatially varying environmental challenges. The gradient plate assays enabled us to study microbial adaptation and to visualize directly the evolutionary dynamics of each group of strains (WT versus DrecA strains). Suppression of the SOS response showed a reduction in the number of lineages observed relative to each WT strainafter the same period of time, which supports our previous results in terms of mutation rate and MPC data (Table 1and Figure S1) and provides new evidence of the effectiveness of this strategy in tackling the evolution of resistance. 3,17,26 WGS was performed for selected mutants. Unexpectedly, only a few modifications were found: in the redox-sensitive transcription activator SoxR, in DNA repair proteins (RecQ or UvrD), in the cell division protein FtsA, and in the regulator of outer membrane proteins EnvZ. Using competition assays, we noted a remarkable fitness cost associated with recA deletion in the absence of external DNA- damaging agents such as antimicrobials in LLQR phenotypes. This effect was even higher when competition assays were performed in the presence of sub-MIC concentrations of ciprofloxacin (simulating sub-therapeutic or environmental concentrations of fluoroquinolones) 29 (Figure 1). In this connection, it is well known that the SOS response also induces increases in three DNA polymerases (pol II, pol IV, pol V), conferring a competitive fitness advantage during the stationary phase of the bacterial lifecycle. 40 Hence, the absence of RecA could explain the fitness cost observed in both WT and LLQR E. coli phenotypes. Other important parameters reported in this study, such as in vitro PAE (prolonged by 3h in RecA-deficient strains, including LLQR and resistant strains) and biofilm formation (reduced in RecA-deficient strains at sub-MIC concentrations) showed additional beneficial properties of this possible therapeutic strategy (Figures 2and 3). Suppression of the SOS response would help prolong the PAE after withdrawing the antimicrobial, which is potentially advantageous in therapy. Bacterial adherence is a key step in bacterial physiology and pathogenesis. The SOS response has been shown to be involved in the adherence of E. coli to surfaces. 41–43 Studies have shown that biofilm formation depends on the abilityof the bacteriato induce the SOS response. 7 In conclusion, this study shows that suppression of the SOS response is an interesting strategy for reversing andtackling the evolution of antibiotic resistance in a set of E. coli phenotypes ranging from highly susceptible to highly quinolone resistant, and plays a significant role in other important clinical parameters such as bacterial fitness, biofilm formation and PAEs under therapeutic concentrations. The development of RecA inhibitors could function as an adjuvant therapy, leading to reversion of drug resistance. Acknowledgements This study was presented in part atECCMID 2017, Vienna, Austria (Poster Presentation P0226) and ECCMID 2018, Madrid, Spain (Poster Presentation P1170). Funding This work was supported by the Plan Nacional de I!D!i 2013–2016 and the Instituto de Salud Carlos III (projects PI14/00940 and PI17/01501), Subdireccio´n General de Redes y Centros de Investigacio´n Cooperativa, Ministerio de Economı´a, Industria y Competitividad, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI; RD16/0016/0001 and REIPI RD16/ 0016/0009), co-financed by the European Development Regional Fund ‘A way to achieve Europe’, operative program Intelligent Growth 2014– 2020. F. D.-P. is supported by a VPPI-US fellowship from the University of Sevilla. Transparency declarations None to declare. Supplementary data Additional Methods, Table S1 and Figure S1 appear as Supplementary data at JAC Online. References 1Fischbach MA, Walsh CT. Antibiotics for emerging pathogens. 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DISCUSIÓN DISCUSIÓN 114 a quinolonas incrementaba significativamente la eficacia in vivo de ciprofloxacino (con reducción del recuento bacteriano en torno al 99%) (Figura 4, artículo 1). Otros parámetros relacionados con la supervivencia celular y la virulencia de la bacteria fueron evaluados en las cepas de la colección isogénica de E. coli. A través de ensayos de competición, se notificó un considerable coste del fitness asociado a la deleción de recA en ausencia de agentes externos que dañan el ADN, como los antimicrobianos, en los fenotipos LLQR. Este efecto se intensificó cuando los ensayos de competición se realizaron en presencia de concentraciones subinhibitorias de ciprofloxacino (simulando concentraciones subterapéuticas o ambientales de fluoroquinolonas)313 (Figura 1, artículo 2). Estos datos correlacionan con el hecho de que la respuesta SOS induce un incremento en la expresión de las ADN polimerasas (II, IV y V), confiriendo un fitness competitivo ventajoso durante la fase estacionaria del ciclo celular, permitiendo la supervivencia de la bacteria a largo plazo.314 Por lo tanto, la ausencia de RecA podría explicar el coste del fitness observado en ambos fenotipos de E. coli, salvaje y LLQR. En este trabajo también se evaluaron el EPA in vitro y la producción de biofilm. En las cepas delecionadas en recA, incluyendo los fenotipos LLQR y resistente, la duración del EPA se alargó en torno a 3 h respecto a las cepas con el sistema SOS intacto (Figura 2, artículo 2). En consecuencia, la supresión de la respuesta SOS también ayudaría a prolongar el efecto post-antibiótico tras la retirada del antimicrobiano, lo cual es potencialmente ventajoso en terapia. Por otro lado, la adherencia bacteriana es un paso clave en la fisiología bacteriana y en la patogénesis. Se ha evidenciado que la respuesta SOS se encuentra estrechamente relacionada con la adherencia a superficies en E. coli283,315,316 y que la producción de biofilm depende de la capacidad de la bacteria de inducir la respuesta SOS.281 Nuestros resultados fueron concordantes con datos previos, la producción de biofilm disminuyó en cepas deficientes en RecA a concentraciones subinhibitorias, incluyendo fenotipos LLQR y resistente (Figura 3, artículo 2). En este estudio también se abordó la implicación de la respuesta SOS en los eventos de mutagénesis que suceden en su mayoría durante la síntesis por translesión, cuando el ADN no ha podido ser reparado por los mecanismos convencionales. Se trata DISCUSIÓN 115 de un proceso en el que participan las Pol IV y V, responsables en gran medida de la resistencia adquirida a los antimicrobianos.268 La inactivación de la respuesta SOS mostró un enlentecimiento de la mutagénesis y bloqueo de la adquisición de resistencia en cepas con fenotipos LLQR a concentraciones clínicamente significativas (Tabla 1 y Figura S1, artículo 2). De hecho, para las cepas deficientes en RecA que hospedaban mecanismos de resistencia a quinolonas (variando de sensible, sensibilidad intermedia a bajo nivel de resistencia) se observó una caída significativa de la tasa de mutación a 4xCMI de ciprofloxacino. En consecuencia, podemos afirmar que la supresión de la respuesta SOS mediada por la deleción de recA altera la capacidad de la bacteria para evolucionar hacia altos niveles de resistencia independientemente del fenotipo de resistencia a quinolonas. Este comportamiento fue similar a concentraciones de ciprofloxacino clínicamente relevantes para los fenotipos LLQR, apoyando la capacidad de esta estrategia para atajar la emergencia de resistencia. En el caso del par isogénico EC08, a Cmáx de ciprofloxacino (2,5 mg/L), la supresión de la respuesta SOS redujo la tasa de mutación más de 103 veces, contribuyendo a la prevención de la emergencia de mutaciones. Estos resultados correlacionaron bien con los datos de eficacia in vivo de ciprofloxacino arrojados por el modelo murino comentados anteriormente. Sin embargo, una hipoactivación de la respuesta SOS, basada en LexA1 dio lugar a una menor reducción de la tasa de mutación referida a las cepas delecionadas en recA. Además, nuestros resultados mostraron que la supresión de la respuesta SOS basada en la deleción de recA redujo los valores de CPM de las quinolonas en E. coli LLQR (grupos EC02 y EC04; Tabla 1, artículo 2) hasta niveles por debajo de la concentración máxima de ciprofloxacino alcanzada en suero (2,5 mg/L).301 Por lo tanto, la supresión de la respuesta SOS revierte los efectos de los mecanismos de bajo nivel de resistencia a quinolonas como las sustituciones S83L y S80R en GyrA y ParC, respectivamente, afectando también al valor de CPM y a la emergencia de mutantes.304,317 Un aspecto clave de la supervivencia bacteriana es la capacidad para evolucionar durante el proceso de migración espacial en función de las condiciones ambientales cambiantes.318 Mediante ensayos de gradiente en placa se pudo estudiar la adaptación microbiana y visualizar directamente la dinámica de desarrollo de cada grupo de cepas (cepas con fenotipo salvaje frente a cepas ΔrecA). La supresión de la respuesta SOS DISCUSIÓN 116 mostró una reducción en el número de linajes observados en relación a cada cepa con fenotipo salvaje tras el mismo periodo de incubación, lo cual apoya nuestros resultados previos en términos de tasa de mutación y datos de CPM (Tabla 1 y Figura S1, artículo 2) y supone otra evidencia de la efectividad de esta estrategia para bloquear la evolución hacia la resistencia.71,318,319 Con el objetivo de analizar genéticamente los mutantes resistentes, se hizo una selección de los mismos y se sometieron a evaluación por secuenciación genómica masiva. Inesperadamente, las modificaciones observadas no afectaban a las dianas clásicas responsables de la resistencia a quinolonas, solo se encontraron modificaciones en: SoxR, el activador de la transcripción de SoxS, relacionado con los procesos redox; proteínas de reparación del ADN (RecQ o UvrD); la proteína de división celular FtsA y el regulador de las proteínas de membrana externa EnvZ. La utilización de la respuesta SOS como diana terapéutica para incrementar la sensibilidad y disminuir la resistencia adquirida a los antimicrobianos adquiere su máximo potencial con la inactivación constitutiva del regulón, en la que ambos componentes, LexA o RecA, han demostrado ser dianas igualmente viables. En contraposición con la sobreactivación de la respuesta SOS, cuyos resultados la convirtieron en una estrategia menos eficaz en estos términos.287 En nuestro trabajo, la inactivación constitutiva de la respuesta SOS fue conseguida mediante deleción en recA, y la presencia de LexA1, supuso una hipoactivación del regulón, por tanto, las diferencias observadas en la efectividad de ambas estrategias responden a la diferente capacidad de la bacteria de activar la respuesta SOS. Aunque exista evidencia sobre la potencialidad de ambas dianas, LexA y RecA, cada una de ellas presenta sus propios desafíos. Por su parte, la deleción de recA ejerce un impacto que va más allá de la supresión de la respuesta SOS, ya que presenta implicaciones adicionales en procesos bacterianos importantes como la recombinación homóloga.73 Sin embargo, desde un punto de vista terapéutico, RecA, a diferencia de LexA, presenta homología con la familia de proteínas equivalente en eucariotas (familia Rad51); de hecho, cribados de alto rendimiento han mostrado que los compuestos obtenidos interaccionaban con facilidad frente a ambos, RecA y Rad51.296 En consecuencia, se hace necesaria la búsqueda de inhibidores de RecA incidiendo particularmente en su especificidad, requisito DISCUSIÓN 117 indispensable para su utilización. Por su parte, LexA se considera un componente exclusivo de procariotas pudiendo ser una diana óptima para actuar sobre la respuesta SOS, sin embargo, existe poca evidencia experimental sobre estrategias que utilicen este regulador y hasta hace poco no se han desarrollado compuestos potenciales que inhiban su autoproteólisis.295 La utilización de bacteriófagos que hiperproduzcan LexA3, una variante de LexA no proteolizable, se ha propuesto como posible estrategia para la supresión de la respuesta SOS a nivel de este componente.294 La inactivación de la respuesta SOS a nivel de RecA, supone la estrategia más factible por dos motivos fundamentales. Por un lado, se trata del primer sensor del daño capaz de inducir la respuesta SOS, promoviendo la reparación del ADN y la mutagénesis, la síntesis de factores de virulencia, y los mecanismos de transferencia génica horizontal responsables de la variabilidad genómica y resistencia a antimicrobianos. Por otro, la existencia de una amplia bibliografía describiendo potenciales compuestos inhibidores de RecA. Además, el tratamiento con antimicrobianos bactericidas, como las quinolonas, supone un poderoso inductor de la actividad de RecA (Figura S1, artículo 1); las cepas de E. coli que carecen de RecA son mucho más sensibles a los antibióticos bactericidas, confirmando la importancia del papel protector de RecA frente a los antimicrobianos (Tabla 1, artículo 1). RecA se considera esencial para el incremento de la tolerancia tras tratamiento con antimicrobianos, potenciando la reparación del ADN dañado que se origina directamente por daño en el ADN mediado por antibióticos o indirectamente debido al estrés metabólico y oxidativo. Estos hallazgos subrayan el papel de RecA como diana terapéutica, potenciando la actividad de antibióticos y combatiendo la emergencia de la resistencia a antimicrobianos.299 Se han descrito compuestos inhibidores del dominio ATPasa de RecA como la suramina,320 compuestos metálicos,321 derivados de moléculas aromáticas aniónicas, como las ftalocianinas tetrasulfonadas,299 metabolitos secundarios de líquenes,322 péptidos α-helicoidales,323 la curcumina.324 Estos compuestos compiten con el ADN por su unión al dominio ATPasa de RecA. La formación de nucleofilamentos de RecA requiere la presencia de ADNcs en torno al cual los monómeros polimerizan. Además, esta filamentación es necesaria para que se produzca la unión del ATP en la interfase entre monómeros. En consecuencia, la no unión de ADNcs, imposibilita la formación de nucleofilamentos y el bloqueo de la DISCUSIÓN 118 unión de ATP, con importantes consecuencias en las actividades recombinantes de RecA y activación de la respuesta SOS.322 Existen algunas limitaciones en nuestro estudio relativas a la colección de cepas utilizadas. Se han evaluado construcciones artificiales que confieren distintos niveles de resistencia a quinolonas, sin embargo, en la naturaleza existen aislados que portan una combinación de determinantes de resistencia con gran éxito evolutivo, como es el caso de los clones exitosos de enterobacterias tales como E. coli ST131 y K. pneumoniae ST258.29 En estas cepas, desconocemos si, la inactivación de la respuesta SOS afectaría en diferente grado a la sensibilidad y desarrollo de resistencia del microorganismo a los antimicrobianos. Por otro lado, al tratarse de una respuesta bacteriana ampliamente conservada sería interesante evaluar el impacto que esta estrategia tendría sobre el microbioma. La microbiota intestinal constituye uno de los “puntos calientes” para los procesos de transferencia génica horizontal por varios motivos: i) la elevada carga bacteriana crea un ambiente óptimo para la interacción microbiana, ii) el tracto gastrointestinal es un ambiente hostil y las bacterias están sometidas a distintos tipos de estrés derivado tanto de los microorganismos como del hospedador, iii) el tracto gastrointestinal supone un inmenso reservorio de determinantes de resistencia que pueden ser transferidos entre bacterias por diseminación horizontal, inducido por la respuesta SOS bacteriana.325 Además, se ha demostrado que la microbiota intestinal determina algunos aspectos de la salud en los humanos.326 Por tanto, sería pertinente la evaluación del efecto de esta estrategia sobre el microbioma intestinal. A la vista de los resultados obtenidos en este trabajo podemos afirmar que la supresión completa de la respuesta SOS constituye una estrategia de gran valor en la lucha contra la multirresistencia antimicrobiana, garantizando la recuperación de antimicrobianos bactericidas como las quinolonas. Por tanto, la búsqueda de inhibidores efectivos que puedan ser utilizados como adyuvantes debe ser una prioridad. DISCUSIÓN 119 DISCUSIÓN 120 121 VI. CONCLUSIONES [Escriba aquí] 122 CONCLUSIONES 123 De los resultados obtenidos en los trabajos expuestos en este proyecto de Tesis Doctoral se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. La supresión de la respuesta SOS mediada por deleción de recA induce un incremento de la sensibilidad a fluoroquinolonas en cepas de E. coli resistentes a quinolonas. Este incremento de sensibilidad puede suponer cambio de categoría clínica. 2. La supresión de la respuesta SOS mediada por deleción de recA en cepas de E. coli resistentes a quinolonas incrementa la actividad bactericida de fluoroquinolonas in vitro. 3. La supresión de la respuesta SOS mediada por deleción de recA en cepas de E. coli resistentes a quinolonas incrementa la eficacia de las fluoroquinolonas en un modelo murino de sepsis peritoneal. 4. La supresión de la respuesta SOS en cepas de E. coli disminuye la aparición de mutantes resistentes a fluoroquinolonas y los valores de las concentraciones preventivas de mutantes (CPM). 5. La supresión de la respuesta SOS en cepas de E. coli resistentes a fluoroquinolonas disminuye la producción de biofilm y el fitness bacteriano. 6. La supresión de la respuesta SOS puede ser una estrategia de interés para la reversión de la resistencia a antimicrobianos bactericidas BIBLIOGRAFÍA 130 the War on Antimicrobial Resistance. FEMS Microbiol Ecol 2018. 38. World Health Organization. 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