Biotecnología aplicada al ricino (Ricinus communis l.) para su uso como biofactoría.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE BIOLOGÍA Programa de doctorado de Biología integrada Departamento de Biología vegetal y Ecología TESIS DOCTORAL BIOTECNOLOGÍA APLICADA AL RICINO (Ricinus communis L.) PARA SU USO COMO BIOFACTORÍA. Doctorando: Alfonso Jesús Sánchez Álvarez Tutor: Dr. José Antonio Monreal Hermoso Directores: Dr. Joaquín J. Salas Liñán Dra. Noemí Ruiz López Trabajo presentado para optar al grado de Doctor por el Graduado Alfonso Jesús Sánchez Álvarez Fdo. Alfonso Jesús Sánchez Álvarez V˚B˚ El tutor: Dr. José Antonio Monreal Hermoso Profesor Titutarde Universidad de Sevilla Fdo. Dr. José Antonio Monreal Hermoso Los Directores Dr. Joaquín J. Salas Liñán Dra. Noemí Ruíz López Científico titular Investigadora Ramón y Cajal Instituto de la Grasa (CSIC) Universidad de Málaga Fdo. Dr. Joaquín J. Salas Liñán. Fdo. Dra Noemí Ruíz López Sevilla, Marzo de 2019 A mis hermanos, a mis padres y a Inma. Si soy sincero, nunca pensé que llegaría el final de este trabajo. Si finalmente lo he logrado ha sido gracias a todas las personas que nombraré a continuación, a quienes les debo la tesis y muchísimo más. Para empezar, me gustaría agradecer a mis directores de tesis, Joaquín Salas y Noemí Ruiz, todo el empeño, interés, el trabajo y el entusiasmo en el proyecto. A Joaquín le agradezco su forma de ser, el respeto mostrado día a día, el apoyo, las palabras de afecto y ánimo y el enorme interés por el proyecto. A Noemí, le doy las gracias por sentar las bases del proyecto, por seguir apoyándome desde Málaga, por sus sabias palabras en los momentos más críticos y, sobre todo, por los ánimos que nunca se ha cansado de dar. Gracias también a Rafael Garcés por la extraordinaria oportunidad que me brindó y por aportar los medios necesarios en todo momento, gracias a él hoy estoy concluyendo esta etapa de mi vida. Siempre, le estaré agradecido. Por supuesto, gracias a Enrique Martínez, enorme persona y mayor corazón. Gracias por enseñarme y por guiarme cuando estaba perdido, gracias por tu apoyo y tus consejos, gracias también por tus ideas y también gracias por esas excursiones, charlas, conferencias etc… que me has dado la oportunidad de hacer durante mi tesis. Gracias a los doctores Jonathan Napier y Vladimir Nekrasov, quienes permitieron el desarrollo de mi actividad en Inglaterra y, por tanto, son partes esenciales de este trabajo. A Eva Guzmán por aportar los conocimientos y la técnica necesaria para este trabajo y por sean tan amable y gentil. Gracias, también a la empresa Dupont-Pioneer por poner a nuestra disposición lo necesarios. Gracias a José Monreal a quien ya conozco de hace tiempo, quién ha sido mucho más que un tutor. Gracias por implicarte e interesarte, gracias por ayudarme en muchos momentos, gracias por tu tiempo, te debo un millón de tarrinas de menudo. A la Dra. Irene González, sin la cual, el proyecto no sería el mismo. Gracias Irene, por tratarme de la forma en que lo hiciste en Rothamsted, eres una persona extraordinaria, siempre estaré en deuda contigo. Al Dr. Antonio Moreno, Antoñito de Heré, un tío válido donde los haya, una persona noble y legal que no ha dudado en aportar sus conocimientos y sus habilidades a este proyecto. Gracias a Mónica por ser una luchadora nata y hacerme ver cómo, al final, todos conseguimos lo que nos proponemos. A Arantxa y Marisol que son más grandes que la giralda, de ellas he aprendido a manejarme en un laboratorio sin que explote y a intentar mantener el orden, gracias por los consejos y, sobre todo, gracias por la ayuda prestada. i ÍNDICE ÍNDICE GENERAL……………………………………………………..……………………………………………………………….i ÍNDICE DE FIGURAS...................................................................................................... vii ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................ xi ABREVIATURAS........................................................................................................... xiii RESUMEN .................................................................................................................... xix INFORME DE LOS INVESTIGADORES EXTRANJEROS. ...................................................... xxi ÍNDICE GENERAL I.INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1 1. RICINO. .................................................................................................................. 3 1.1. Descripción, botánica e historia. ................................................................................ 3 1.2. Descripción morfológica de la semilla de ricino. ......................................................... 4 1.3. El ricino como cultivo. ................................................................................................ 5 1.4. Componentes tóxicos del ricino. ................................................................................ 6 1.4.1. Proteínas inactivadoras de ribosomas: ricina y aglutinina. .................................. 6 1.4.2. Proteínas alergénicas: albúmina 2S. ................................................................... 7 1.4.3. Otros compuestos: ricinina. ............................................................................... 7 2. Lípidos de plantas: estructura y distribución. .......................................................... 9 2.1. Naturaleza y función de los lípidos. ............................................................................ 9 2.2. Ácidos grasos ........................................................................................................... 10 2.2.1. Definición y clasificación .................................................................................. 10 2.2.2. Nomenclatura .................................................................................................. 10 2.2.3. Estructura tridimensional ................................................................................. 11 2.2.4. Ácidos grasos más frecuentes en la naturaleza. ................................................ 11 2.2.5. Ácidos grasos inusuales con interés industrial. ................................................. 12 2.3. Acilgliceroles............................................................................................................ 15 2.1. Fosfolípidos. ............................................................................................................ 15 2.2. Glucolípidos. ............................................................................................................ 17 2.3. Esfingolípidos. ......................................................................................................... 17 2.4. Ceras. ...................................................................................................................... 17 3. Biosíntesis, modificación y almacenamiento de ácidos grasos y glicerolípidos en plantas. ....................................................................................................................... 18 3.1. Ruta biosintética de ácidos grasos en plantas. ......................................................... 18 3.2. Modificaciones de ácidos grasos. ............................................................................. 20 3.3. Biosíntesis de ácido ricinoleico. ................................................................................ 21 3.4. Biosíntesis de ácido lesquerólico. ............................................................................. 22 3.5. Biosíntesis de ácidos dimorfecólico y coriólico. ........................................................ 23 3.6. Biosíntesis de ácido vernólico. ................................................................................. 24 ii 3.7. Síntesis y almacenaje triacilgliceroles en plantas. ..................................................... 24 3.7.1. Biosíntesis intraplastidial de glicerolípidos. ...................................................... 24 3.7.2. Biosíntesis extraplastidial de glicerolípidos. ...................................................... 25 3.7.3. Formación y acumulación de TAG en ricino. ..................................................... 26 4. Domesticación y mejora genética en plantas. ....................................................... 27 4.1. Domesticación por selección clásica......................................................................... 28 4.2. Obtención de variedades por mutagénesis inducida al azar. .................................... 29 4.3. OLE-1, la variedad de ricino alto oleico. ................................................................... 30 4.4. Ingeniería genética en plantas. ................................................................................ 30 4.4.1. Transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens. .................. 31 4.4.2. Silenciamiento génico en plantas. .................................................................... 35 4.4.3. Herramientas de edición genética. ................................................................... 36 5. Importancia del proyecto. .................................................................................... 41 II. OBJETIVOS ............................................................................................................... 43 III. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................ 47 1. Materiales. ........................................................................................................... 49 1.1. Material biológico y condiciones de cultivo. ............................................................. 49 1.1.1. Ricinus communis L. ......................................................................................... 49 1.1.2. Escherichia coli. ................................................................................................ 49 1.1.3. Agrobacterium tumefaciens. ............................................................................ 49 1.2. Antibióticos. ............................................................................................................ 50 1.3. Tampones y soluciones empleados. ......................................................................... 51 1.3.1. Biología molecular ........................................................................................... 51 1.3.2. Bioquímica ....................................................................................................... 53 2. Métodos. ............................................................................................................. 53 2.1. Biología molecular ................................................................................................... 53 2.1.1. Obtención de ácidos nucleicos. ........................................................................ 53 2.1.2. Estimación de la concentración de ácidos nucleicos. ........................................ 54 2.1.3. Reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). ................................................. 54 2.1.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa. ...................................................... 57 2.1.5. Purificación de fragmentos de ADN en geles de agarosa y productos de PCR.... 57 2.1.6. Tratamientos enzimáticos del ADN................................................................... 58 2.1.7. Diseño y ensamblaje de construcciones genéticas. ........................................... 59 2.2.7. Transformación de bacterias. ........................................................................... 68 2.2.8. Transformación génica de ricino mediante A. tumefaciens. .............................. 71 2.2.9. Ensayo de actividad GUS histoquímico. ............................................................ 75 2.2.10. Ensayo de actividad GUS fluorimétrico. ............................................................ 75 2.3. Técnicas bioquímicas. .............................................................................................. 76 2.3.7. Extracción de lípidos totales. ............................................................................ 76 iii 2.3.8. Metilación de muestras. ................................................................................... 76 2.3.9. Silanización de ésteres metílicos de ácidos grasos hidroxilados. ....................... 76 2.3.10. Análisis de la composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases (GC). 77 2.3.11. Análisis de acil-CoAs. ........................................................................................ 77 2.3.12. Producción de sustratos radioactivos ............................................................... 78 2.3.13. Metilación con diazometano ............................................................................ 83 2.3.14. Preparación de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. ...................... 84 2.3.15. Experimentos de marcaje con ácidos grasos radioactivos ................................. 84 2.3.16. Fraccionamiento de los glicerolípidos en TLC y estudio de la distribución de la radioactividad. ................................................................................................................ 85 IV. RESULTADOS .......................................................................................................... 87 Capítulo 1: Desarrollo de un método de transformación transitoria en ricino. .............. 89 1. Aplicación de un protocolo de transformación transitoria in vitro de la semilla de ricino........................................................................................................................... 89 2. Aplicación de un protocolo de transformación transitoria in vivo de la semilla de ricino........................................................................................................................... 90 2.1. Resultados de las pruebas preliminares. ............................................................... 90 2.2. Puesta a punto del método de agroinfiltración in vivo de la semilla de ricino. .......... 91 2.2.1. Elección del momento de infiltración y tasa de transformación. ....................... 91 2.2.2. Influencia del promotor en el nivel de expresión del marcador GUS en ricino. Ensayo histoquímico. ...................................................................................................... 93 2.1.1. Influencia de distintos promotores en el nivel de expresión de transgenes en ricino. Estudios estudios cuantitativos. ............................................................................ 95 Capítulo 2: Modificación de la composición de ácidos grasos de la semilla de ricino vía expresión transitoria in vivo. ....................................................................................... 97 1. Reducción del contenido en ácido ricinoleico........................................................ 97 1.1. Reducción del contenido de ácido ricinoleico mediante silenciamiento génico: hpFAH12. ............................................................................................................................ 97 1.2. Reducción del contenido en ácido ricinoleico vía CRISPR/Cas9. .............................. 100 2. Producción de ácidos grasos hidroxilados de cadena larga: síntesis de ácido lesquerólico. ............................................................................................................. 103 3. Producción de ácidos grasos epoxidados en semillas de ricino. ........................... 105 Capítulo 3: Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable. Generación de plantas transgénicas. ............................................................ 109 1. Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable. ... 109 1.1. Ensayo de eficiencia de transformación de embriones mediante SAAT. ................. 109 1.2. Puesta a punto de un protocolo de regeneración estable....................................... 110 1.2.1. Imbibición de la semilla de ricino: un aspecto fundamental en la germinación del embrión. 110 1.2.2. Protocolo de transformación-regeneración directa. ....................................... 111 1.2.3. Protocolo de transformación-regeneración adventicia. .................................. 115 iv 1.3. Evaluación del protocolo del protocolo de transformación-regeneración directa. .. 117 2. Análisis de los transformantes. ........................................................................... 118 2.1. Análisis de plantas transformadas con pCambia 1305.1. ........................................ 118 2.1.1. Análisis genético mediante PCR. ..................................................................... 119 2.1.2. Análisis de composición, peso y rendimiento de las semillas. ......................... 120 2.2. Análisis de las plantas estables transformadas con pCambia::hpFAH12. ................. 121 2.2.1. Análisis genético mediante PCR. ..................................................................... 122 2.2.2. Peso y distribución de las semillas. ................................................................. 123 2.2.3. Análisis genético de las semillas. .................................................................... 124 2.2.4. Composición de ácidos grasos y rendimiento. ................................................ 124 2.2.5. Obtención de la primera generación (T1). ...................................................... 127 2.3. Análisis de plantas modificadas con CRISPR/Cas9................................................... 127 2.3.1. Plantas con el gen de la hidroxilasa de ricino como diana para CRISPR/Cas9. . 127 2.4. Plantas con el gen de la ricina como diana para CRISPR/Cas9. ................................ 133 2.4.1. Análisis genético. ........................................................................................... 134 Capítulo 4: Estudios de incorporación de distintos ácidos grasos a glicerolípidos en microsomas de ricino................................................................................................. 137 1. Metabolismo de ácido oleico .............................................................................. 137 2. Metabolismo de ácido ricinoleico ....................................................................... 139 3. Metabolismo del ácido lesquerólico. .................................................................. 140 4. Metabolismo del ácido coriólico. ........................................................................ 142 5. Incorporación en triglicéridos con los distintos precursores. ............................... 143 V. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 145 Capítulo 1: Desarrollo de un método de transformación transitoria en ricino. ............ 147 1. Transformación del fruto de ricino mediante agroinfiltración. ............................ 147 2. Elección de momento de infiltración para la transformación transitoria in vivo de las semillas de ricino y tasa de transformación. ......................................................... 148 4. Estudio cuantitativo de la expresión inducida por distintos promotores en endospermo de ricino. ............................................................................................... 150 Capítulo 2: Modificación de la composición de ácidos grasos de la semilla de ricino vía expresión transitoria in vivo. ..................................................................................... 153 1. Reducción del contenido de ácido ricinoleico...................................................... 153 1.1. Aplicación de la técnica de ADN antisentido mediante la expresión de hpFAH12. .. 153 1.2. Silenciamiento de FAH12 mediante la técnica CRISPR/Cas9. .................................. 154 2. Producción de ácido lesquerólico. ...................................................................... 156 3. Expresión de la epoxigenasa de Stokesia laevis. .................................................. 157 Capítulo 3: Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable. Generación de plantas transgénicas. ............................................................ 159 1. Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable. ... 159 1.1. Transformación del embrión de ricino. .................................................................. 159 v 1.2. Selección de transformantes mediante la selección con higromicina...................... 159 1.3. Presencia de cefotaxima e higromicina en el medio de cultivo. .............................. 160 1.4. Comparación con otros protocolos de transformación estable en ricino. ............... 161 2. Obtención de transformantes. ............................................................................ 163 2.1. Ensayo de control. transformación del ricino con pCambia 1305.1. ........................ 163 2.2. Supresión de la hidroxilasa mediante tecnología antisentido. Transformación con pCambia::hpFAH12 y obtención de la primera generación................................................. 163 2.2.1. Características de la planta............................................................................. 163 2.2.2. Características de las semillas ........................................................................ 164 2.2.3. Obtención de la primera generación (T1) de plantas transgénicas para hpFAH12. 165 2.3. Supresión de la hidroxilasa mediante la técnica CRISPR/Cas9. ................................ 166 2.3.1. Características de la planta obtenida. ............................................................. 166 2.3.2. Características de la semilla. .......................................................................... 166 2.4. Planta modificada vía CRISPR/Cas9 con el gen de la ricina y homólogos como diana. 167 Capítulo 4: Estudios de incorporación de distintos ácidos grasos a glicerolípidos en microsomas de ricino................................................................................................. 169 1. Incorporación de ácido oleico. ............................................................................ 170 2. Incorporación de ácido grasos hidroxilados. ....................................................... 170 2.1. Incorporación de ácido ricinoleico. ........................................................................ 170 2.2. Incorporación de ácido lesquerólico. ..................................................................... 171 2.3. Incorporación de ácido coriólico. ........................................................................... 171 2.4. Incorporación en TAG de los diferentes precursores .............................................. 172 VI. CONCLUSIONES .................................................................................................... 173 VII. ENGLISH VERSION ............................................................................................... 179 Brief Introduction. ..................................................................................................... 181 Chapter 1 summary: Development of a transient transformation method in castor bean. 181 1. Transformation of developing castor endosperm. ............................................... 181 2. Optimization of the agroinfiltration timing. ........................................................ 182 3. Studies of transformation rate. .......................................................................... 182 4. Testing promoters via qPCR and fluorimetric GUS assay. .................................... 183 Chapter 2 summary: Changes in castor bean fatty acid composition vía transient expression in vivo. ..................................................................................................... 184 1. Ricinoleic acid decrease through FAH12 hydroxylase silencing. ........................... 184 2. Ricinoleic acid decrease through CRISPR/Cas9 technology. ................................. 184 3. Transient transformation with the condensing enzyme elongase from Lesquerela fedleri. ...................................................................................................................... 185 4. Transient transformation with Stokesia laevis epoxigenase ................................ 186 vi Chapter 3 summary: Development of a transformation/regeneration method for castor plant. Production of stable transgenic plants. ............................................................ 187 1. Development of a transformation/regeneration method for castor plant. .......... 187 1.1. Castor embryo transformation and use of antibiotics............................................. 187 1.2. Transformation and regeneration of transformed embryos. .................................. 187 1.3. Generated stable transgenic lines. ......................................................................... 189 1.3.1. Transgenic pCambia 1305.1 plant................................................................... 189 1.3.2. Transgenic pCambia 1305.1::hpFAH12 plant. ................................................. 189 1.3.3. Transgenic pCambia 1305.1::Cas9 FAH12 plant. ............................................. 190 1.1.1. Modified CRISPR/Cas9 ricin gen plant............................................................. 191 Chapter 4 summary: Studies of metabolism of hydroxylated fatty acids different to ricinoleic ................................................................................................................... 193 Conclusions. .............................................................................................................. 194 Figures & Tables. ....................................................................................................... 198 VIII. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 229 VIX. ANEXOS.............................................................................................................. 235 Anexo I .............................................................................................................................. 237 Anexo II ............................................................................................................................. 239 vii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Dibujo de las partes de la planta de ricino................................................................... 3 Figura 2. Corte dorsal (A) y lateral (B) de la semilla de ricino ..................................................... 4 Figura 3. Estadios de desarrollo de la semilla de ricino. ............................................................. 4 Figura 4. Distribución mundial de cultivo de ricino. ................................................................... 5 Figura 5. Producción de semilla de ricino. ................................................................................. 6 Figura 6. Estructura química de la ricinina. ................................................................................ 8 Figura 7. Ejemplos de estructura de distintos tipos de ácidos grasos ....................................... 11 Figura 8. Estructura del ácido ricinoleico. ................................................................................ 13 Figura 9. Estructura química del ácido lesquerólico. ................................................................ 13 Figura 10. Estructura química del ácido vernólico ................................................................... 14 Figura 11. Estructura química del ácido dimorfecólico ............................................................ 14 Figura 12. Estructura química del ácido coriólico. .................................................................... 15 Figura 13. Ejemplos de las estructurasde distintos acilgliceroles ............................................. 16 Figura 14. Ejemplo de la estructura química de la parte gliceroacílica de un fosfolípido. ......... 17 Figura 15. Reacciones de la sintasa de ácidos grasos. En el proceso existen tres puntos clave. 19 Figura 16. Síntesis de linoleato (A) y ricinoleato (B). ................................................................ 21 Figura 17. Cambios en la composición de ácidos grasos en la semilla de ricino durante su desarrollo.. ............................................................................................................................. 22 Figura 18. Esquema general de síntesis de ácidos grasos inusuales. ........................................ 23 Figura 19. Esquema de la síntesis y almacenamiento de triacilgliceroles. ............................... 26 Figura 20. Metabolismo de diferentes acil-PC marcados radiactivamente en microsomas de girasol, ricino y Crepis palaestina. ........................................................................................... 27 Figura 21. Fases de la domesticación en maíz.......................................................................... 29 Figura 22. Esquema del sistema d edición genética CRISPR/Cas9............................................. 40 Figura 23. Comparación de las secuencias nucleotídicas que codifican para la Δ12 hidroxilasa y la Δ12 desaturasa de ricino. .................................................................................................... 59 Figura 24. Esquema de la secuencia genética hpFAH12 insertada en el plásmido pMBLT. ....... 60 Figura 25. Estructura final del plásmido pCambia1305.1::hpFAH12 ......................................... 61 Figura 26. Esquema del plásmido final pCambia1305.1::LfKCS3 ............................................... 61 Figura 27. Ensamble del gen SlEPX mediante Loop Assembly. ................................................. 65 Figura 28. Ensamblaje del promotor U6 junto con la guía 1 para Cas9 mediante la técnica de Loop Asembly.. ........................................................................................................................ 67 Figura 29. Ensamblaje del promotor U6 junto con la guía 2 para Cas9 mediante Loop Assembly. ............................................................................................................................................... 68 Figura 30. Ensamblaje final del gen Cas9 junto con el promotor, el terminador y las dos guías bajo el promotor U6 utilizando la técnica de Loop Asembly. ................................................... 69 Figura 31. Fotografía del momento de infiltración en el fruto de ricino. .................................. 72 Figura 32. Ciclo de reacciones aplicado para la elongación en un carbono de un ácido graso. . 80 Figura 33. Preparación de ácido coriólico a partir de ácido linoleico. ....................................... 83 Figura 34. Semillas transformadas in vitro mediante A. tumefaciens asistido por sonicación. .. 90 Figura 35. Resultado preliminar de la infiltración in vivo del fruto de ricino. ............................ 91 Figura 36. Tasa de abortos de la semilla en función del momento de infiltración. ................... 92 Figura 37. Tasa de transformación en semillas no abortadas utilizando el método de agroinfiltración in vivo............................................................................................................. 93 Figura 38. Resultado del ensayo GUS histoquímico para semillas infiltradas mediante agroinfiltración in vivo. ........................................................................................................... 94 Figura 39. Resultados actividad de la β-glucuronidasa (GUS) y expresión de RNA medidos en la semilla. ................................................................................................................................... 96 Figura 40. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia::hpFAH12 ............................... 98 Figura 41. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia 1305.1 .................................... 98 viii Figura 42. Composición del aceite de las semillas transformadas transitoriamente con pCambia 1305.1 y pCambia::hpFAH12 .................................................................................................. 99 Figura 43. Semillas transformadas con la construcción pCambia::CRISPR FAH12 ................... 100 Figura 44. Gel de agarosa que muestra los resultados de la reacción de PCR para la amplificación del gen que codifica para la proteína Cas9. ...................................................... 101 Figura 45. Ensayo GUS histoquímico de las semillas transformadas con pCambia::CRISPR FAH12. .................................................................................................................................. 101 Figura 46. Resultado del análisis de composición de ácidos grasos para las semillas transformadas con pCambia 1305.1, pCambia::hpFAH12 y pCambia::CRISPR FAH12. ............ 102 Figura 47. Expresión de los genes que codifican la enzima LfKCS3 y GUS en semillas de ricino transformadas. ..................................................................................................................... 103 Figura 48. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia::LfKCS3. ................................ 104 Figura 49. Composición de ácidos grasos en semillas transformadas con pCambia::LfKCS3 y pCambia 1305.1.. .................................................................................................................. 104 Figura 50. Composición del conjunto de acil-CoAs durante el desarrollo de la semilla de ricino. ............................................................................................................................................. 105 Figura 51. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia 1305.1::SlEPX::hpFAH12. ...... 106 Figura 52. Análisis de composición de ácidos grasos para semillas transformadas con pCambia::SlEPX::hpFAH12 y pCambia 1305.1. ....................................................................... 107 Figura 53. Resultado del ensayo GUS histoquímico en embriones de ricino transformados empleando el método de transformación con agrobacterium asistida por ultrasonidos (SAAT). ............................................................................................................................................. 110 Figura 54. Esquema del método de transformación-regeneración directa para ricino............ 112 Figura 55. Necrosis producida por exceso de higromicina. .................................................... 114 Figura 56. Explantos supervivientes hasta la etapa de enraizamiento tras la exposición a higromicina durante 2 o 4 semanas en la fase de propagación .............................................. 115 Figura 57. Esquema del método de transformación-regeneración adventicia. ....................... 116 Figura 58. Media de supervivientes en cada etapa. ............................................................... 118 Figura 59. Evolución de las plantas transformadas con pCambia1305.1 obtenidas mediante transformación-regeneración directa. ................................................................................... 119 Figura 60. Producto de PCR de cada planta transformada con pCambia1305.1. .................... 120 Figura 61. Resultados de composición y rendimiento para las plantas transgénicas transformadas con pCambia1305.1. ...................................................................................... 120 Figura 62. Distribución del peso de las semillas de plantas WT y transgénicas transformadas con pCambia 1305.1 ............................................................................................................. 121 Figura 63. Medias del peso de las semillas de plantas WT y transformadas con pCambia 1305.1. ............................................................................................................................................. 121 Figura 64. Evolución de la planta transformada con pCambia::hpFAH12. .............................. 122 Figura 65. Análisis PCR para determinar la presencia de hpFAH12 en la planta estable.. ........ 122 Figura 66. Distribución del peso de las semillas obtenidas de la planta transformada con pCambia::hpFAH12.. ............................................................................................................. 123 Figura 67. Diferencias entre las medias de los grupos de semillas G1 y G2 procedentes de la planta transgénica para pCambia1305.1::hpFAH12. .............................................................. 124 Figura 68. Prueba de PCR para determinar si las semillas obtenidas son transgénicas. .......... 124 Figura 69. Análisis de composición y rendimiento en las semillas obtenidas a partir de la planta transformada con pCambia::hpFAH12. .................................................................................. 125 Figura 70. Correlaciones encontradas en las semillas transgénicascon pCambia::hpFAH12.... 126 Figura 71. Evolución de las plantas transformadas con pCambia::hpFAH12 obtenidas de la planta transgénica madre. .................................................................................................... 127 Figura 72. Test de PCR para confirmar la presencia de pCambia::hpFAH12 en la primera generación de de la progenie del transformante. ................................................................. 127 Figura 73. Planta modifica con CRISPR/Cas9 con la hidroxilasa de ricino como diana. ............ 128 ix Figura 74. Esquema de los sitios de restricción para las dianas Cas9 del gen de la hidroxilasa de ricino. ................................................................................................................................... 129 Figura 75. Productos de PCR obtenidos en la planta modificada con CRIPSR/Cas9 para el gen de la hidroxilasa de ricino. ......................................................................................................... 129 Figura 76. Mutaciones generadas en el gen de la hidroxilasa de la planta de ricino mediante CRISPR/Cas9. ........................................................................................................................ 130 Figura 77. Distribución del peso de las semillas obtenidas de la planta transformada con pCambia::CRISPR FAH12. ...................................................................................................... 131 Figura 78. Medias de los grupos G1 y G2 de la planta transgénica con la estructura génica hpFAH12 y para la planta modificada con CRISPR/Cas9 contra el gen de la hidroxilasa………..132 Figura 79 Datos de composición de las semillas obtenidas de plantas transgénicas para pCambia1305.1, pCambia::hpFAH12, y pCambia::CRISPR FAH12 (A). ..................................... 133 Figura 80. Plantas modificadas mediante CRISPR/Cas9 con el gen de la ricina como diana. ... 134 Figura 81. Esquema del sitio de corte para Cas9 en el gen de la ricina. .................................. 135 Figura 82. Productos de PCR obtenidos en las plantas con el gen de la ricina modificado mediante CRISPR/Cas9.. ........................................................................................................ 135 Figura 83. Mutación generada en la planta 2 modificada con CRISPR/Cas9 en el gen de la ricina. ............................................................................................................................................. 136 Figura 84. Incorporación de ácido oleico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. .................................................................... 138 Figura 85 Incorporación de ácido ricinoleico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. ............................................................... 140 Figura 86. Incorporación de ácido lesquerólico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. ...................................................... 141 Figura 87. Incorporación de ácido coriólico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. ............................................................... 143 Figura 88. Incorporación de diferentes ácidos grasos a la fracción de triacilglicéridos por microsomas de ricino. ........................................................................................................... 144 xvi O. sativa, Oryza sativa P. fendlerei, Physaria fendelerei R. communis Ricinus communis S. laevis, Stokesia laevis S. lycopersicum, Solanum lycopersicum T. aestivum, Triticum aestivum V. galamensis, Vernonia galamensis Z. mays, Zm Zea mays D. AMINOÁCIDOS Código (1 letra) Código (3 letras) Aminoácido A Ala Alanina R Arg Arginina N Asn Asparagina D Asp Aspartato C Cys Cisteína Q Gln Glutamina E Glu Ácido glutámico G Gly Glicina H His Histidina I Ile Isoleucina L Leu Leucina K Lys Lisina M Met Metionina F Phe Fenilalanina P Pro Prolina S Ser Serina T Thr Treonina W Trp Triptófano Y Tyr Tirosina V Val Valina E. MARCADORES GENÉTICOS USADOS EN LAS CEPAS DE A. tumefaciens Abreviatura Descripción RecA Mutación en un gen responsable para la recombinación general de DNA. rifR Marcador de resistencia a rifampicina carbR Marcador de resistencia a carbonicilina pTiBo542DT Tipo de plásmido Ti Mop+ Uso de manopina como señal para la infección de la célula vegetal. F. MARCADORES GENÉTICOS USADOS EN E. coli Abreviatura Descripción mcrA, mcrCB o mrr Mutaciones que permiten la metilación del DNA que no ha sido reconocido como foráneo; xvii hsd Nombre genérico de endonucleasas de E. coli hsdSB (rB-mB-) Permite la clonacion de DNA sin la necesidad de escisión, mediante endonucleasas endógenas. endA Mutación en la endonucleasa no específica I, elimina la actividad endonucleasa no específica. . supE Supresor del RNA transferente de glutamina de ámbar (supE) (UAG) thi-1 Requiere tiamina para crecer en medio mínimo recA Mutación en un gen responsable para la recombinación general de DNA. gyrA96 Mutante de la DNA girasa produce resistencia al ácido nalidíxico relA1 relA (ATP:GTP 3'-pyrophosphotransferase). El locus relA regula el acoplamiento entre la transcripción y la traducción. lacI Codifica el represor lac que controla la expresión de promotores que llevan un operador lac; el IPTG se une al represor lac y quita al represor del promotor. proAB Requiere prolina para crecer en un medio mínimo Tn10 Confiere resistencia a tetraciclina por medio de un trasposón TetR Marcador de resistencia a tetraciclina F’ Plásmido auto trasmisivo y de baja copia usado para generación de ADN monocatenario cuando se infectó con el fago M13; puede contener un marcador de resistencia que permita el mantenimiento y normalmente llevará los genotipos lacI y LacZΔM15 xviii xix RESUMEN El ricino (Ricinus communis L.) es una planta que produce un aceite único, enriquecido en más del 90% en ácido ricinoleico (12-hidroxioleato). Esta composición convierte al aceite de ricino en un aceite apto para diversos usos industriales. Además, el aceite de ricino comprende hasta el 50-60% del peso de la semilla, siendo uno de los cultivos de semilla oleaginosa de mayor rendimiento. El cultivo de ricino puede llegar a tener productividades de hasta 3000 kg/ha. Sin embargo, es necesario reducir al mínimo el contenido de proteínas tóxicas como la ricina. Este proyecto de doctorado pretende demostrar que la semilla de ricino es una excelente plataforma para la síntesis de otros ácidos grasos especiales, como los ácidos grasos epoxi o ácidos grasos hidroxi de cadena larga. Para este propósito, hemos desarrollado métodos para transformar (de forma estable y transitoria) las semillas de ricino. Estos métodos nos han permitido transformar las semillas de ricino para producir ácido lesquerólico, silenciar su gen de hidroxilasa (FAH12) y producir algunas líneas que podrían tener cantidades menores de ricina y otras toxinas. Se ha desarrollado un método de transformación transitoria de la semilla de ricino in vivo a través de agroinfiltración del fruto de ricino. Mediante este método se ha podido evaluar la expresión del marcador GUS regulado por distintos promotores. Además, esta técnica ha permitido probar diferentes construcciones genéticas en las semillas de ricino. Así, mediante agroinfiltración transitoria se comprobó una reducción de la cantidad de ácido ricinoleico en la semilla de ricino mediante el uso de dos técnicas diferentes. La reducción de ácido ricinoleico sirvió como prueba para demostrar la modificación genética en ricino, además, la reducción de este compuesto es necesaria para la síntesis posterior de otros ácidos grasos de interés. Las técnicas usadas para la reducción del ácido ricinoleico fueron el silenciamiento génico de la hidroxilasa mediante el uso de una estrucutra en hairpin, hpFAH12, y mediante el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 de edición genética. El descenso de ácido ricinoleico vino acompañado de un aumento de ácido linoleico, hecho no observado en la variedad de ricino alto oleico, OLE-1. Los niveles de ácido ricinoleico fueron del 50% para hpFAH12 y del 40% para CRISPR/Cas9. Por otra parte, se consiguió un aumento significativo de la cantidad de ácido lesquerólico en la semilla de ricino mediante la sobreexpresión de la enzima elongasa de Lesquerella fendelerei, LfKCS3, de manera transitoria. A pesar de que el aumento fue significativo, la cantidad de ácido lesquerólico no superó el 0.6% de la composición de la semilla. Este hecho se atribuyó a la baja disponibilidad de ricinoleic-CoA, sutrato de LfKCS3, en el conjunto de acil-CoA de la semilla. También se transformó transitoriamente la semilla con la enzima epoxigenasa de Stokesia laevis, aunque en ningún momento se detectó la formación de ácidos grasos epoxidados. Además de la transformación transitoria, se optimizaron métodos de transformación estable mediante los cuales se han llegado a obtener plantas de ricino transgénicas. xx Se han producido plantas transformadas nuclearmente con el plásmido pCambia1305.1 que se usaron como control. La composición del aceite de las semillas de estas plantas no reveleron cambios, algo lógico, ya que pCambia1305.1 no portaba ningún gen que pueda afectar la composición de ácidos grasos de la semilla. También se obtuvieron plantas transgénicas transformadas con hpFAH12, construcción para el silenciamiento del gen de la hidroxilasa (FAH12). Algunas de las semillas obtenidas (T0) mostraron unos niveles de ácidos ricinoleico del 50% aproximadamente, una reducción importante si tenemos en cuenta que una planta salvaje cuenta con un 90% de este compuesto. Además, las semillas se dividieron en dos grupos en función de su peso y se observó una correlación lineal entre el peso de la semilla el contenido en ácido ricinoleico. Esta correlación fue exponencial entre la cantidad de aceite de la semilla y el contenido en ácido ricinoleico. La cantidad de aceite de las semillas fue baja. Los embriones de las semillas analizadas se germinaron in vitro para obtener la siguiente generación de plantas transgénicas (T1). Además de la estructura hpFAH12, se usó la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr una reducción de este ácido graso en plantas modificadas de manera estable. Las plantas modificadas mediante CRISPR/Cas9, mostraron una serie de mutaciones en el gen FAH12 que repercutieron en una caída de la cantidad de ácido ricinoleico. Estas semillas mostaron un 40% de ácido ricinoleico, una reducción aún mayor que con hpFAH12. Al igual que con hpFAH12, la reducción de ácido ricinoleico vino acompañada de un aumento de ácido linoleico. La cantidad de aceite de las semillas también fue baja. Para reducir la cantidad de toxinas en la semilla, se usó la técnica CRISPR/Cas9 para generar mutaciones en la toxina ricinica y en toxinas homólogas. Se obtuvo una planta con el gen de la ricina mutado. En cuanto se obtengan semillas de esta planta, se analizarán para verificar una disminución de la toxicidad de la misma. Finalmente, se llevaron a cabo estudios bioquímicos de asimilación de precursores por parte de la semilla de ricino. Se comprobó la capacidad de incorporación de la semilla de ácidos grasos hidroxilados al cuerpo de triacilgliceroles (TAG). El ácido ricinoleico, como ya se esperaba, tuvo una velocidad mayor de incorporación directa a TAG seguido del ácido lesquerólico. El ácido oleico, no hidroxilado, mostró una cinética menor y una incorporación a lípidos polares precedida de la incorporación a TAG. xxi INFORME DE LOS INVESTIGADORES EXTRANJEROS. Con el fin de obtener la mención de doctorado internacional, se realizó una parte del proyecto durante 3 meses en Rothamsted Research, Reino Unido. Durante la estancia, se diseñaron y ensamblaron las estructuras génicas para la apliación de la herramienta CRISPR/Cas9 para la edición genética. El Dr. Jonathan Napier, llevó a cabo la tutorización del proyecto durante la estancia. El Dr. Vladimir Nekrasov aportó todas las estructuras génicas necesarias. La ayuda de ambos investigadores fue esencial para el desarrollo del proyecto. Los informenes de ambos investigadores se adjuntan a continuación. xxii xxiii xxiv xxv 20th March 2019 To whom it may concern The doctoral thesis entitled “BIOTECHNOLOGY APPLIED TO CASTOR BEAN PLANT (Ricinus communis) TO BE USED AS A BIOFACTORY” by Alfonso J. Sánchez Álvarez is a proof‐of‐ concept study, which is testing the potential of castor bean as a biotechnological platform for producing special fatty acids, such as epoxy or long hydroxy fatty acids. Over the course of the project, the author has successfully developed a novel efficient transient expression method for castor bean that enabled him to quickly express various transgenes in castor bean seeds. As a result, he managed to demonstrate that it was possible to bring down the levels of ricinoleic acid by silencing the FAH12 gene as well as to increase levels of lesquerolic acid via ectopic expression of LfKCS3. Another great novel element in the study is application of the CRISPR/Cas system for the purpose of targeted mutagenesis in castor bean. The author successfully assembled CRISPR/Cas‐expressing constructs using the Golden Gate cloning method. He then expressed the constructs in castor bean using the transient and stable transformation procedures he had developed during the project. The author successfully demonstrated presence of CRISPR/Cas‐induced mutations in FAH12 and the gene encoding the ricin toxin. Importantly, the significantly lower levels of ricinoleic acid in the fah12 CRISPR/Cas mutant line, as compared to the wild type, were consistent with the similar phenotype the author observed in transgenic lines expressing the hpFAH12 construct. Overall, the author presents significantly novel methodological developments, particularly in terms of tools for gene function studies and reverse genetics, in castor bean. These findings will certainly facilitate adoption of this crop as a biosynthesis platform. Sincerely yours, Vladimir Nekrasov, PhD Research Scientist Plant Sciences Dept. Rothamsted Research E‐mail: [email protected] Office tel.: +44 (0) 1582 938 292 Introducción 6 Figura 5. Producción de semilla de ricino. FAOSTAT. El aceite de ricino es de gran interés por sus propiedades físico-químicas, siendo demandado por las industrias farmacéutica y cosmética. Además, ricinopuede emplearse como materia prima para la síntesis de polímeros, la producción de bioplásticos, biodiesel , base para lubricantes industriales y para la fabricación de pinturas y recubrimientos (Patel et al., 2016). 1.4. Componentes tóxicos del ricino. 1.4.1. Proteínas inactivadoras de ribosomas: ricina y aglutinina. Sin duda, una desventaja en el cultivo y el procesado de esta planta es la presencia de proteínas tóxicas en su semilla, las más conocidas son la ricina y la aglutinina, que pertenecen a una familia mayor denominadas proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP). En esta especie existen 28 genes diferentes que codifican a estas proteínas, incluyendo el gen de la ricina, la aglutinina y otros posibles pseudogenes (Chan et al., 2010). De esos 28 genes, 6 codifican proteínas con actividad inactivadora de ribosomas de los cuales el gen de la ricina (XM_002534603) seguido del gen de la aglutinina (XM_002534174) son los que mayor nivel de expresión presentan en la semilla a partir de los 20-30 DAP. La homología entre los 6 genes citados puede variar entre el 51% y el 93%, siendo la más alta la existente entre la ricina y la aglutinina. Estas dos proteínas presentan un tamaño aproximado de 35 kDa y, sin embargo, diferentes actividades a pesar de su alta homología. La actividad inactivadora de ribosomas de la ricina es mucho mayor que la de la aglutinina, la cual posee una mayor actividad aglutinante de eritrocitos (Loss-Morais et al., 2013). Introducción 7 La ricina representa el 5% de la proteína total de la semilla de ricino, está compuesta por 576 aminoácidos de los cuales los 35 primeros componen el péptido señal para su transporte al retículo endoplásmico. La ricina es una RIP de tipo II dado que se divide en dos subunidades: la subunidad A con 267 aminoácidos y la B de 262 aminoácidos, unidas por 12 aminoácidos que actúan como secuencia de enlace o linker. La subunidad A alberga al dominio de unión al ribosoma encargándose de su inactivación mientras la subunidad B presenta el dominio de unión a la membrana de la célula permitiendo la internalización de la subunidad A dentro de la misma. Se han descrito hasta 3 isoformas diferentes de ricina con un peso variable de entre 60-65 KDa. En su forma nativa, la ricina suele ir asociada a la aglutinina (Sehgal et al., 2010; Severino et al., 2012). La dosis letal de la ricina es DL50 es de 3µg/Kg por vía respiratoria y 30 µg/kg por ingestión (Sook-Kyung et al., 2006). Su baja dosis letal ha posibilitado su uso como arma biológica y en bioterrorismo. En los últimos 30 años la ricina se ha usado en un total de 9 atentados, el más famoso fue el asesinato del disidente búlgaro Gueorgui Markov en Londres en 1978, a quien supuestamente el KGB inyectó una dosis letal de ricina con la punta de un paraguas. El caso más reciente ha sido en septiembre de 2018 en el que se envió una carta con ricina al pentágono. La supresión de la familia de genes que codifican las proteínas con actividad inhibidora de ribosomas y sobre todo de la ricina es un aspecto de esencial para la explotación comercial ricinode esta especie. 1.4.2. Proteínas alergénicas: albúmina 2S. La albúmina 2S se sintetiza a partir de un gen de 776pb que codifica un precursor compuesto por 258 aminoácidos. Este precursor produce dos albúminas heterodiméricas distintas conocidas como RicC1 y RicC3 de 12 y 15 kDa respectivamente. La expresión de la albúmina 2S se localiza en la semilla y se produce a partir de los 20 días después de la polinización. Esta proteína es capaz de generar una respuesta alérgica considerable, algo que ha de considerarse durante el cultivo y la manipulación del ricino. (Severino et al.; 2012). 1.4.3. Otros compuestos: ricinina. La ricinina es un alcaloide encontrado en todos los tejidos de la planta y detectado en los estadios más tempranos de la formación de la semilla (Figura 6). Este compuesto puede detectarse en las hojas jóvenes, aunque desaparece con la senescencia. El contenido de ricinina puede variar según el órgano, de 2,3-33g/kg en hojas, 10g/kg en flores, 7g/kg en raíz y 3g/kg en raíces (Severino et al., 2012) . Introducción 8 La ricinina es un compuesto estimulante del sistema nervioso central que mejora la memoria en dosis bajas (Ferraz et al., 2000) aunque puede ser letal en dosis altas, con una DL50 de 3g/kg por ingestión. Una intoxicación por ricinina se caracteriza por perdida de equilibrio, incapacidad para caminar, temblores y salivación. Este compuesto puede resultar tóxico para diversas especies de insectos y nematodos por lo que tiene cierto interés como pesticida natural. Además, la presencia de ricinina en la orina se ha usado como biomarcador para posibles casos de envenenamiento por ricina. Afortunadamente, la baja toxicidad de la ricinina y la posibilidad de ser degrada tras periodos de fermentación hacen que ésta no afecte al cultivo y explotación del ricino. Figura 6. Estructura química de la ricinina. (Hamelin et al., 2012). Introducción 9 2. Lípidos de plantas: estructura y distribución. 2.1. Naturaleza y función de los lípidos. Clásicamente, los lípidos se han definido como la fracción de los seres vivos soluble en disolventes orgánicos. Más recientemente se han buscado definiciones más rigurosas, como la de Christie (Christie, 1987), que los define como un grupo de sustancias conformadas por los ácidos grasos, sus derivados y las sustancias relacionadas biosintéticamente o funcionalmente con ellos. Éstos son constituyentes esenciales de la célula viva y componen un grupo químico variado y heterogéneo. Generalmente presentan un alto grado de insolubilidad en agua siendo, en cambio, fácilmente solubles en disolventes orgánicos, que son empleados para extraerlos de las células y los tejidos. Al igual que en el resto de seres vivos, los lípidos desempeñan importantes funciones biológicas en las plantas (Harwood, 1996): i) Poseen un papel estructural fundamental, ya que son los componentes básicos de las membranas, que actúan como barreras delimitando tanto las células como los compartimentos celulares. Asimismo, en estas membranas tienen lugar importantes funciones para la célula como la captación de luz, las reacciones de transporte de electrones o la generación de ATP. ii) Sirven como material de reserva. Las especies vegetales oleaginosas acumulan lípidos en la semilla o el fruto, generalmente en forma de triacilgliceroles (TAG), que sirven para alimentar al embrión durante la germinación y constituyen una importante materia prima tanto en la industria alimentaria como química. iii) Además están implicados en la regulación de procesos biológicos fundamentales, como la transducción de señal, actuando como precursores en la síntesis de hormonas como el ácido jasmónico y de segundos mensajeros como el inositol fosfato, la fotoprotección, la modificación post-traduccional de proteínas, el reconocimiento celular, la especificidad de especie, la inmunidad de los tejidos y la adaptación al frío; iv) Y en último lugar, cabe destacar su función protectora en la superficie de muchas plantas, formando parte de las ceras, la cutina y la suberina. Introducción 10 2.2. Ácidos grasos 2.2.1. Definición y clasificación Los ácidos grasos son biomoléculas orgánicas formadas por una cadena hidrocarbonada larga y lineal que contiene generalmente un número par de átomos de carbono en plantas, y un grupo carboxilo terminal (Coultate, 1996). Son compuestos insolubles en agua y ricos en energía. Se clasifican según: - La longitud de la cadena: Ácidos grasos de cadena corta: 4-6 carbonos. Ácidos grasos de cadena media: 8-12 carbonos. Ácidos grasos de cadena larga: 14-18 carbonos. Ácidos grasos de cadena muy larga: 20 o más carbonos. - El número y posición de los dobles enlaces: Saturados: no presentan ningún doble enlace, siendo moléculas lineales (Figura 7A). Insaturados: tienen un doble enlace (monoinsaturados) o más de un doble enlace (poliinsaturados). Los dobles enlaces suelen ser de configuración cis, y cuando hay más de uno, suelen estar separados al menos por un grupo metileno, es decir, no presentan conjugación. 2.2.2. Nomenclatura Los ácidos grasos se pueden nombrar de diferentes formas. La mayoría de ellos tienen un nombre común, además, todos ellos se pueden nombrar mediante la nomenclatura sistemática y la abreviada (Tabla 1). La nomenclatura sistemática sigue las reglas adoptadas por la IUPAC, donde se indica la longitud de la cadena y el número, posición y configuración de los dobles enlaces contando el número de átomos de carbono a partir del grupo carboxilo (Δ). En la nomenclatura abreviada, el ácido graso se simboliza por dos números separados por dos puntos, indicando el primero la longitud de la cadena y el segundo el número de dobles enlaces. A continuación, se indica la posición en la que se encuentra el doble enlace, ya sea contando el número de átomos de carbono a partir del grupo carboxilo (Δ) o a partir del grupo metilo terminal (n o ω). Finalmente, se indica la configuración cis (c) o trans (t) del doble enlace. Introducción 11 2.2.3. Estructura tridimensional Como se muestra en la (Figura 7B), los dobles enlaces con isomería cis (B) introducen ángulos en las cadenas hidrocarbonadas, afectando con ello a sus propiedades físicas como, por ejemplo, el punto de fusión. No sucede lo mismo con los dobles enlaces en configuración trans (Figura 7C), que no introducen más que una pequeña irregularidad en la cadena, lo que supone un cambio menor en las propiedades físico-químicas del compuesto y su comportamiento es más parecido al de los ácidos grasos saturados (Figura 7A). Por ejemplo, el ángulo que introduce el doble enlace cis en la molécula del ácido oleico, hace que su punto de fusión baje desde 69°C del ácido esteárico hasta los 16°C. El doble enlace trans, sin embargo, no distorsiona tanto la molécula, por lo que, el punto de fusión del ácido elaídico se mantiene en 44°C. Figura 7. Ejemplos de estructura de distintos tipos de ácidos grasos. A) Ácido esteárico, B) Ácido oleico, C) Ácido elaídico. 2.2.4. Ácidos grasos más frecuentes en la naturaleza. Los ácidos grasos se encuentran principalmente como componentes fundamentales de los lípidos, mientras que en estado libre (no esterificados) sólo aparecen en pequeñas cantidades. En la naturaleza existe una gran diversidad de ácidos grasos, pero no todos tienen la misma importancia. Aunque se han aislado unos 300 tipos distintos de ácidos grasos, los más comunes sólo tienen entre 12 y 22 átomos de carbono (Tabla 1). Los ácidos grasos considerados mayoritarios constituyen, en la mayoría de los casos, más del 95 % de los ácidos grasos totales en una planta y, son el ácido palmítico, esteárico, oleico, linoleico y α-linolénico (Harwood, 1979). Introducción 12 Tabla 1. Ácidos grasos más comunes en los lípidos de reserva de las plantas. NOMBRE COMÚN NOMBRE SISTEMÁTICO NOMBRE ABREVIADO LÁURICO Dodecanoico 12:0 MIRÍSTICO Tetradecanoico 14:0 PALMÍTICO Hexadecanoico 16:0 PALMITOLEICO Cis-9-hexadecanoico 16:1 Δ9 ESTEÁRICO Octadecanoico 18:0 OLEICO Cis-9-octadecanico 18:1 Δ9 LINOLEICO Cis,cis-9,12-octadecenoico 18:2 Δ9,12 ALFA-LINOLÉNICO Cis,cis,cis-9,12,15 octadecatrienoico. 18:3 Δ3,6,9 GAMMA-LINOLÉNICO Cis,cis,cis-6,9,12-octadecatrienoico 18:3 Δ6,9,12 ARAQUÍDICO Eicosanoico 20:0 GONDOICO Cis-11-icosenoico 20:1 Δ9 BEHÉNICO Docosanoico 22:0 ERÚCICO Cis-13-docosenoico 22:1 Δ9 LIGNOCÉRICO Tetracosanoico 24:0 2.2.5. Ácidos grasos inusuales con interés industrial. Además de los ácidos grasos mencionados existen otros con estructuras poco frecuentes, característicos de determinados grupos o especies vegetales. Estos ácidos grasos presentan dobles enlaces en posiciones poco comunes, triples enlaces, ramificaciones, sustituyentes como grupos hidroxilo, epóxido, anillos de ciclopropeno, etc. Algunos de ellos son de interés para el sector industrial por sus propiedades físico-químicas como lubricantes, base para pinturas y recubrimientos, como base para la síntesis de polímeros etc. A continuación, se describen algunos (Napier, 2007): I) Ácido ricinoleico: como ya se ha mencionado, el ácido ricinoleico es el componente mayoritario del aceite de ricino constituyendo el 85-90% del aceite, este ácido también se ha detectado en el hongo Claviceps purpurea. Está formado por 18 carbonos, una insaturación en la posición Δ9 en cis y un grupo hidroxilo (OH) en el carbono Δ12. El nombre sistemático es ácido 12-Hidroxi-9-cis-octadecenoico (Figura 8) (Mensah et al., 2018) Introducción 13 Figura 8. Estructura del ácido ricinoleico. II) Ácido lesquerólico: se encuentra en la semilla de las plantas del género Physaria anteriormente denominado Lesquerella, género que otorgó el nombre al compuesto. Éste ácido forma parte de entre un 40-50% del aceite de la semilla de este género de plantas. El interés industrial de este ácido graso es similar al del ricinoleico, con la diferencia de que los dos carbonos de más le confieren propiedades físicas diferentes y posibilitan la síntesis de derivados químicos de mayor longitud. Su nombre sistemático es ácido 14-Hidroxi-11-cis- icosenoico (Figura 9) (Smith et al., 1961). Figura 9. Estructura química del ácido lesquerólico. III) Ácido vernólico: este ácido graso inusual se encuentra en las semillas plantas de la familia de las Asteraceas, en los géneros Stokesia, Vernonia y Crepis, también en plantas de la familia de las Euforbiáceas en especies como Euphorbia lagascae (Kleinman et al., 1965) y Bernardia pulchellla (Splitzer et al., 1996). En todas estas plantas el ácido vernólico puede representar desde el 50% al 90% del total de ácidos grasos de la semilla. (Cahoon et al., 2002). Es un ácido con un grupo epóxido en la posición Δ12, su nombre sistemático es 12-Epoxy-9-cis- octadecenoico. El ácido vernólico se usa en la industria química como precursor para la fabricación de resinas, pegamentos, barnices, pinturas, recubrimientos y para la síntesis de ciertos plásticos, por lo que el ácido vernólico puede imponerse como una alternativa renovable para la fabricación de estos componentes (Figura 10). Introducción 14 Figura 10. Estructura química del ácido vernólico IV) Ácido dimorfecólico: se encuentra en semillas de plantas del género Dimorfoteca, se trata de un ácido graso hidroxilado en la posición Δ9, que cuenta con 18 carbonos, pero presenta dos dobles enlaces conjugados con conformación trans en las posiciones Δ10 y Δ12 que lo convierten en un ácido graso muy inusual. Su nombre sistemático es ácido 9-Hidroxi- 10,12-trans, trans-octadecanoico (Figura 11) (Cahoon et al., 2004). Figura 11. Estructura química del ácido dimorfecólico V) Ácido coriólico: se encuentra mayoritariamente en semillas de las especies del género Coriaria. Este ácido graso presenta el grupo hidroxilo en la posición Δ13 y presenta dos dobles enlaces conjugados en las posiciones Δ9 y Δ11 en conformación cis/trans. En Coriaria myrtifolia puede alcanzar un 67% de la composición de ácidos grasos de la semilla. Sistemáticamente es llamado ácido 9-cis, 11-trans-13-hidroxioctadecanoico (Figura 12) (Liang et al., 2017). Introducción 15 Figura 12. Estructura química del ácido coriólico. 2.3. Acilgliceroles. Los acilgliceroles, también llamados grasas neutras, son glicerolípidos compuestos por una molécula de glicerol esterificada por uno, dos o tres ácidos grasos (Figura 13). Son solubles en disolventes apolares y su densidad es más baja que la del agua. En los monoacilgliceroles (MAG) hay un solo ácido graso esterificado a la molécula de glicerol en las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3. Existen, por tanto, tres formas isoméricas: los 1(3)- MAG y los 2-MAG. Los diacilgliceroles (DAG) tienen esterificadas dos posiciones con dos ácidos grasos (1,2-DAG, 2,3-DAG y 1,3-DAG; Figura 13). Los 1,2-DAG de configuración L se han descrito como importantes intermediarios del metabolismo, mientras que los 2,3-DAG y los 1,3-DAG sólo se encuentran en trazas (Stobart et al., 1997). Los triacilgliceroles (TAG) tienen esterificadas las tres posiciones del glicerol. Pueden existir TAG simples si los tres ácidos grasos son iguales o compuestos si son diferentes. Los TAG son los componentes principales de los aceites vegetales y determinan las propiedades de estos. 2.1. Fosfolípidos. Los fosfolípidos son glicerolípidos que presentan una molécula de ácido fosfórico en la posición sn-3 en lugar de un ácido graso. Son de gran importancia ya que son los componentes mayoritarios de las bicapas lipídicas que forman las membranas celulares. El ácido fosfórico se encuentra esterificado al esqueleto de glicerol en el grupo hidroxilo sn-3, mediante un enlace fosfoéster. Esto leconfiere una región polar, convirtiendo al fosfolípido en una molécula con un marcado carácter anfipático (Figura 14). Introducción 22 Como ya se ha mencionado, ambas enzimas, tanto la FAD2 como la FAH12, están estrechamente emparentadas y poseen una homología del 67%. La hidroxilasa de ricino es una secuencia de 387 aminoácidos con un tamaño aproximado de 44kDa mientras que la FAD2 posee 383 aminoácidos (Van de Loo et al., 1995). Las secuencias de DNA genómico que codifican éstas proteínas presentan un único intrón que se encuentra en el extremo 5’ de la secuencia, siendo las secuencias codificantes (CDS) de 1149 nucléotidos para la FAD2 y 1161 nucleótidos para la FAH12 (Venegas et al., 2016). 3.4. Biosíntesis de ácido lesquerólico. La síntesis del ácido lesquerólico tiene lugar principalmente en plantas del género Physaria. Se han caracterizado diferentes enzimas implicadas en el proceso de elongación e hidroxilación de ácidos grasos en Physaria fendleri. Esta especie presenta una enzima bifuncional hidroxilasa/desaturasa LfFAH12, que cataliza la formación de 18:1OH-PC a partir de 18:1-PC en la posición sn-2. Además de la enzima LfFAH12, Physaria fendleri presenta otra enzima implicada en este proceso, la cetoacil-CoA elongasa (LfKCS3) que cataliza la formación de 20:1OH-CoA a partir de 18:1OH-CoA. Esta enzima lleva a cabo a la elongación de ácidos grasos ya hidroxilados (Moon et al., 2001) cuando estos se encuentran en el pool de acil-CoAs, al contratrio de lo que ocurre en la hidroxilación, que se lleva a cabo cuando el ácido graso se encuentra esterificado a la PC en la posición sn-2. Por lo tanto, debe existir un retorno de 18:1OH-PC desde el retículo hacia Figura 17. Cambios en la composición de ácidos grasos en la semilla de ricino durante su desarrollo. Ell proceso de síntesis y acumulación de ácido ricinoleico en la semilla de ricino tiene lugar a partir de los 20- 30DAP, momento en el que comienza a acumularse más aceite. Adaptado de Venegas et al., 2016. Introducción 23 el citoplasma en forma de 18:1OH-CoA y así podría elongarse para formar el 20:1OH-CoA gracias a la LfKCS3. La sobreexpresión de esta enzima, junto con la correspondiente hidroxilasa, ha inducido la formación de ácidos grasos hidroxilados de entre 18 y 20 carbonos en semillas de Camelina sativa (Anna R. Snapp et al. 2014) (Figura 18). Figura 18. Esquema general de síntesis de ácidos grasos inusuales. De color anaranjado se muestra la ruta de síntesis de novo de ácidos grasos en el plastidio. De color azul las modificaciones que tienen lugar en el conjunto de acil-CoAs citoplásmicos. De color verde, las modificaciones que tienen lugar en los ácidos grasos esterificados en la posición sn-2 de la PC. PC: fosfatidil colina; ACP: proteína portadora de acilos; SAD: estearato desaturasa; KAS: beta-cetoacil-ACP sintasa; FATA/FATB acil-ACP tioesterasas A ó B; FAD: ácido graso desaturasa; LACS: acil-CoA sintetasas; LPCAT: lisofosfatidilcolina aciltransferasa; LPC: lisofosfatidilcolina; ElaFAEEpo12: E. lagascae 12-ácido graso epoxigenasa; CpFAH12: C. purpurea 12- ácido graso hidroxilasa; HbFAH12 12-ácido graso: H. benghalensis 12-ácido graso hidroxilasa; RcFAH1: R. communis 12- ácido graso hidroxilasa; LfKCS3: P. fendlerei 12-ácido graso hidroxilasa; DsFAD2-1: D. sinuata 12-ácido graso transdesaturasa; DsFAD2-2: D. sinuata conjugasa/hidroxilasa; LfFAH12: P. fendlerei hidroxilasa/desaturasa; VgFAEpo12: V. galamensis 12-ácido graso epoxigenasa; CpaFAEpo12: C. palaestina 12-ácido graso epoxigenasa; SlFAEpo12: S.laevis 12- ácido graso epoxigenasa. 3.5. Biosíntesis de ácidos dimorfecólico y coriólico. La biosíntesis de ácido dimorfecólico se produce a partir del ácido oleico en plantas del género Dimorphoteca, principalmente. En Dimorphoteca sinuata la molécula de oleil-PC formará el trans-linoleil-PC. El ácido trans-linoleico presenta un doble enlace en cis en la posición Δ9 y otro en trans en la posición Δ12, siendo la enzima encargada de este paso la desaturasa de D. sinuata (DsFAD2-1). Posteriormente, la molécula de trans-linoleil-PC formará ácido dimorfecólico esterificado con PC por medio de la conversión del doble enlace cis en la posición Δ9, en uno trans en la posición Δ10 y la adición de un grupo hidroxilo en la posición Introducción 24 Δ9, gracias a la acción de la enzima bifuncional hidroxilasa/conjugasa de Dimorfoteca (DsFAD2- 2) (Figura 18) (Cahoon et al., 2004). Las enzimas encargadas de la síntesis de ácido coriólico aún no están identificadas, no obstante, por su similitud con el ácido dimorfecólico probablemente se trate de una ruta análoga a la descrita para este último ácido graso. 3.6. Biosíntesis de ácido vernólico. El ácido vernólico se ha detectado en diversas plantas, las más relevantes son Crepis palaestina, Vernonia galamensis y Stokesia laevis. La síntesis de ácido vernólico es llevada a cabo por Δ12-epoxigenasas que inducen la formación de un anillo epóxido en la posición Δ12. Podemos diferenciar 2 tipos de epoxigenasas. En primer lugar, encontramos aquellas epoxigenasas que pertenecen a la familia de las enzimas desaturasas, como la epoxigenasa de C. palaestina. Este tipo de enzimas no se ven afectadas por la presencia de monóxido de carbono o por un anticuerpo anti-citocromo P450, requieren NADPH y se inhiben por cianuro. Catalizan la formación de un anillo epóxido en la posición Δ12 del linoleato esterificado en la PC (Lee et al., 1998). Por otra parte, existen epoxigenasas que no pertenecen a la familia de las desaturasas, son las epoxigenasas dependientes de citocromo P450 y cuya actividad precisa de NADPH, se ve afectada por la presencia de monóxido de carbono y por la presencia de anticuerpo anticitocromo P450. Es el caso de la epoxigenasa de E. lagascae. Estas enzimas actúan sobre el oleato-PC a partir del cual forman linoleato-PC para catalizar la formación de un anillo epóxido en la posición Δ12 del mismo (Figura 18) (Bafor et al., 1993 Liu, L. et al. 1998; Cahoon et al. 2002). 3.7. Síntesis y almacenaje triacilgliceroles en plantas. Los ácidos grasos en plantas son almacenados principalmente en forma de glicerolípidos, la mayoría triacilgliceroles. Existen dos rutas diferentes para síntesis de glicerolípidos, la ruta intraplastidial y la extraplastidial. 3.7.1. Biosíntesis intraplastidial de glicerolípidos. Esta ruta biosintética se ha mencionado anteriormente y es también llamada ruta procariota (Somerville, 1991; Dormänn, 2005), genera lípidos de membrana típicos de los tejidos fotosintéticos. En esta ruta dos aciltransferasas transfieren los acil-ACP generados a las posiciones sn-1 y sn-2 del glicerol-3-fosfato (G3P) formando ácido lisofosfatídico (LPA) en un primer paso, y PA Introducción 25 en un segundo paso. La primera enzima se denomina G3P-acil-ACPaciltransferasa, es una enzima soluble con preferencia por el oleil-ACP. La otra enzima es la lisofosfatidil aciltransferasa (LPAAT) situada en la membrana interna de los plastídios y que presenta preferencia por el palmitil-ACP (Bates et al., 2013). 3.7.2. Biosíntesis extraplastidial de glicerolípidos. La ruta extraplastial es la responsable de la síntesis de lípidos de reserva en semillas de oleaginosas, principalmente TAG. Esta ruta transcurre en su totalidad en el retículo endoplasmático y utiliza, como sustratos, el conjunto citoplásmico de acil-CoAs (Stobart et al., 1997). La ruta clásica de síntesis de glicerolípidos implica la acilación sucesiva del G3P por parte de aciltransferasas reticulares. Así, estas enzimas utilizan los acil-CoAs como sustratos donadores de acilo que se esterifican en las distintas posiciones de la molécula de G3P. Esta ruta es conocida como ruta de Kennedy y culmina con la síntesis de TAG. En primer lugar, se forma LPA a partir de la esterificación de un grupo acilo al G3P en la posición sn-1. Esta reacción es catalizada por una acil-CoA glicerol 3-fosfato aciltransferasa (GPAT) (Jayawardhane et al., 2018). En la segunda reacción el LPA es acilado de nuevo en sn-2 para formar PA por la acción de la enzima LPAAT esta enzima tiene alta preferencia por acilos insaturados (Ichihara, 1991). A continuación, el PA es transformado en DAG por la acción de la 3-sn-fosfatidato fosfohidrolasa (fosfatidato fosfatasa, PAP) (Kocsis y Weselake, 1996). Finalmente, la esterificación de un último ácido graso en la posición sn-3 de los DAG formará el producto final, el TAG. Este paso es llevado a cabo por la enzima acil-CoA:1,2-diacilglicerol aciltransfersa (diacilglicerol aciltransferasa, DAGAT) (Lung y Weselake, 2006). Ésta es una enzima específica de esta ruta, con baja especificidad de sustrato y que resulta limitante en la formación de TAG y, por tanto, en la acumulación de aceite en oleaginosas. Durante muchos años ha sido ampliamente mantenido que ésta era la única ruta para la biosíntesis de TAG en plantas, animales y microorganismos. Sin embargo, actualmente se conoce que existen otras rutas alternativas y se describen a continuación. Una enzima de gran interés, identificada en plantas y capaz de acilar los DAG para formar TAG es la fosfolípido:diacilglicerol aciltransferasa (PDAT), la cual transfiere el acilo de una molécula de PC hasta una de DAG, de manera que es capaz de producir TAG de forma no dependiente de la composición y del tamaño del conjunto de acil-CoAs (Karlsson, et al. 1997). Además, publicaciones recientes han demostrado que una gran parte de los glicerolípidos pueden ser sintetizados a través de la acilación de la LPC, por acción de las aciltransferasas de retículo (Bates et al.,2007; 2009). La PC resultante puede dar lugar a DAG a través de la acción de fosfolipasas de tipo D (PLD) más la acción de una PAP, de fosfolipasas de tipo C (PLC) o a Introducción 26 través de una reacción reversible catalizada por la enzima PC:DAG colinafosfotransferasa (PDCT o CPT)(Hu et al.,2012), que intercambia la cabeza polar de una PC con una molécula de DAG. El carácter reversible de esta reacción además produciría nuevas moléculas de DAG generados a partir de PC, lo que permitiría la edición de la composición de ácidos grasos de los DAG que posteriormente podrían destinarse para la síntesis de TAG (Figura 19). Figura 19. Esquema de la síntesis y almacenamiento de triacilgliceroles. Adaptado de Bates et al., 2013.TAG: triacilgliceroles; DAG: diacilgliceroles; PC: fosfatidil colina; LPC: lisofosfatidil colina; G3P: glicerol-3-fosfato; PA: ácido fosfatídico; LPA: ácido lisofosfatídico; GPAT: glicerol-3-fosfato acil-CoA transferasa; LPAAT: lisofosfatidato acil-CoA aciltransferasa; PAP: fosfatidato fosfatasa; CPT: colina fosfato transferasa; PDCT: fosfatidil colina diacilglicerol fosfocolina transferasa; PLD/PLC: fosfolipasas D ó C ; PDAT: fosfolípido diacilglicerol aciltransferasa; DGAT: diacilglicerol acil-CoA aciltransferasa. . 3.7.3. Formación y acumulación de TAG en ricino. La planta de ricino posee mecanismos especializados en la canalización y el almacenamiento del ácido ricinoleico, un ácido graso inusual dado que presenta un grupo hidroxilo en la posición Δ12. Se ha comprobado que el ricino presenta una fosfolipasa A2 específica que reconoce ricinoleil-PC y las hidroliza formando ácido ricinoleico y LPC. Esta enzima, por tanto, liberaría el ricinoleico sintetizado en la PC, y posteriormente éste sería activado por las LACS y pasaría a formar parte del conjunto de acil-CoAs citoplásmico. Posteriormente, la molécula de ricinoleil-CoA entrará en las rutas de formación de TAG (Bafor et al., 1991). La expresión de las enzimas responsables de la acumulación de ricinoleico en plantas distintas al ricino aportan evidencias claras acerca de la presencia de un mecanismo especializado para la acumulación del ácido ricinoleico en las semillas de ricino. Así, la expresión del gen de la hidroxilasa FAH12 en semillas de Arabidopsis da lugar a la acumulación de apenas un 17 % de dicho ácido graso en su aceite. La expresión adicional de una PDAT y una DGAT2 de ricino incrementa dicho porcentaje hasta un 27%. Además, la acción de una PDCT Introducción 27 específica parece también necesaria para proporcionar una canalización del ricinoleico a TAG (Hu et al., 2012). El mecanismo de acumulación de ricinoleico presente en ricino podría servir para acumular otros ácidos grasos oxigenados de interés industrial como ya demostraron in vitro Dahlqvist et al. (2000) para el ácido vernólico. Así, preparaciones de microsomas de ricino fueron capaces de incorporar dicho ácido epoxidado a la fracción de TAG más eficazmente que otras especies, como microsomas de Helianthus annuus (girasol) o Crepis palaestina, a partir de diferentes intermediarios (Figura 20). Figura 20. Metabolismo de diferentes acil-PC marcados radiactivamente en microsomas de girasol, ricino y Crepis palaestina. Adaptado de Dahlqvist et al. (2000). A) Microsomas de semillas en desarrollo. Ricino es la especie con mayor capacidad de asimilación de ácido vernólico en TAG. B) Síntesis in vitro en microsomas de semilla de ricino en desarrollo de TAG compuesto por dos vernoleil y un ricinoleil marcado radiactivamente. La semilla de ricino presenta mecanismos muy eficientes que canalizan ácidos grasos inusuales (ricinoleico y vernólico) desde PC hasta TAG. 4. Domesticación y mejora genética en plantas. La práctica totalidad de las especies vegetales (y animales) que consumimos han sido modificadas genéticamente para obtener de ellas un mayor beneficio, así, podríamos diferenciar tres vías principales que conducen al objetivo final de mejorar las especies que consumimos: domesticación por selección clásica, mutagénesis al azar e ingeniería genética. Introducción 28 4.1. Domesticación por selección clásica. Hace aproximadamente 12000 años, cuando tuvo lugar la revolución neolítica, se produjo un cambio radical a la hora de obtener alimentos con el comienzo de la agricultura. Este cambio fue gracias a la domesticación de diversas especies vegetales (Beltrán, 2018). Las plantas que hoy cosechamos soy muy diferentes a sus ancestros y, en muchos casos, éstas plantas domesticadas son incapaces de sobrevivir en su medio natural de origen. A lo largo de su historia, el ser humano ha ido seleccionando mutaciones genéticas hasta obtener las especies que consumimos hoy en día (Beltrán, 2018). El ejemplo más común en este campo es el desarrollo del maíz (Zea mays) a partir del teosinte, cuya selección y domesticación comenzó hace 8700 años en Centroamérica. Mediante la selección clásica se elegían y propagaban aquellas variedades de teosinte que presentaban mayor rendimiento. En fases posteriores, mediante cruces y selección de la progenie, se fueron seleccionando otras características, como la uniformidad en la respuesta a fotoperiodo, de forma que todas las plantas florezcan a la vez, o la dominancia apical, de forma que se facilita la recolección (Tabla 2). Así, el maíz actual no solo presenta hexaploidía sino también diversas mutaciones en determinados genes que permiten la aparición de las características mencionadas. (Beltrán, 2018; Meyer & Purugganan, 2013). Tabla 2. Ejemplos de genes mutados mediante selección clásica. Gen modificado Función TGA1 Protege los granos dentro de la mazorca e impide su caída. TB1, PBF Modifica la actividad meristemática e incrementa el contenido en proteína de la mazorca. Podríamos dividir la selección clásica en cuatro estadios: I) Comienzo de la domesticación: es la etapa inicial y tiene lugar sobre la variedad salvaje, consistente en el cultivo de la misma. Permite la posibilidad de la selección posterior. II) Proliferación in situ los cambios deseados: consiste en reproducir con la mayor frecuencia posible individuos con las características deseadas. III) Selección de poblaciones adaptadas a regiones determinadas: en esta etapa se seleccionan aquellas variedades adaptadas tanto al clima como a las necesidades de una determinada región. Introducción 29 IV) Cruce de variedades: es la etapa final, consiste en el cruce de las variedades anteriores con el fin de obtener híbridos con características agronómicas óptimas (Figura 21). Figura 21. Fases de la domesticación en maíz. Adaptado de Meyer & Purugganan (2013). 4.2. Obtención de variedades por mutagénesis inducida al azar. Podemos definir mutagénesis como el proceso a través del cual se provocan cambios heredables en la información genética de un organismo. Estos cambios son producidos mediante agentes químicos, físicos o biológicos y no por segregación o recombinación genética. La mutagénesis al azar se basa en mutaciones causadas en el genoma de forma no dirigida, tras la generación de mutaciones se seleccionan los individuos que son viables y que presentan las características deseadas. Posteriormente, mediante cruzamiento, se restauran aquellos genes que hayan sido modificados y alteren características de interés en el organismo. Finalmente, se seleccionan aquellos individuos que presenten viabilidad en el crecimiento y en la reproducción pero que presenten alterada alguna característica de interés. La actividad mutagénica de los rayos-X ya fue demostrada por Lewis John Standler en 1920 en trigo, maíz y cebada. En 1934 se comercializó la primera variedad mutante de tabaco. En 1995 el número de variedades comerciales obtenidas por mutagénesis era de 484, en la actualidad existen más de 1000 variedades de mutantes en las que se incluyes árboles del género Citrus, plantas ornamentales como el crisantemo y plantas destinadas a la alimentación como el arroz o el girasol. (Beltrán, 2018) Tradicionalmente, para llevar a cabo las mutaciones, se han usado agentes químicos y físicos sobre diversos tejidos vegetales como células cultivadas in vitro, embriones, semillas, etc. La característica principal que debe tener el tejido vegetal que se va a usar es que presente totipotencia, esto es, la capacidad de poder generar una planta entera. Los agentes físicos de uso más común en mutagénesis son los rayos-X, rayos gamma, neutrones, partículas beta y partículas alfa. Por otra parte, los agentes químicos más usados son agentes alkilantes, azidas, hidroxilaminas, antibióticos, ácido nitroso o análogos de bases nitrogenadas. Mientras los agentes químicos suelen provocar mutaciones puntuales como transiciones, transversiones, inserciones o deleciones puntuales, los agentes físicos provocan cambios Introducción 30 mayores tales como deleciones grandes o acortamiento de los cromosomas (Oladosu et al., 2015). Como ejemplo de mutantes que se comercializan podemos nombrar la mandarina sin pepitas de la empresa española Mandanova, esta variedad procede de una variedad de naranjo mutante producido por la misma empresa (Mandanova S.L. http://www.ivia.gva.es). También cabe destacar la variedad de colza conocida como Cánola, libre de ácido erúcico y la variedad de girasol Nutrisun, con fenotipo alto oleico alto esteárico, desarrollada en el grupo de genética y bioquímica de lípidos de semillas del Instituto de la Grasa y explotada por la empresa Advanta Seeds. La composición alto oleico alto esteárico otorgan a este aceite potencial para convertirse en una alternativa viable al aceite de palma (Advanta, http://www.advantaseeds.com). 4.3. OLE-1, la variedad de ricino alto oleico. Los componentes mayoritarios del aceite de ricino en la variedad salvaje WT son ácido ricinoleico en un 90% aprox., 5% en ácido linoleico y un 3% en ácido oleico. En cambio, la variedad OLE-1 aislada por Rojas-Barros et al., (2004) contiene un 80% aprox. de ácido oleico, un 17% de ácido ricinoleico y un 4% de ácido linoleico en su aceite (Venegas-Calerón et al., 2016). Un análisis de la secuencia de nucleótidos que codifica laFAH12 mostró 4 diferencias entre OLE-1 y WT, estas diferencias repercutieron en cambios en la secuencia de aminoácidos, concretamente, en los residuos F49S, V242A and H319Q. Las mutaciones en la FAH12 de la variedad OLE-1 fueron las responsables del cambio en la composición en el aceite de las semillas (Venegas-Calerón et al., 2016). En ricino, el ácido oleico es el sustrato común por el que compiten las enzimas FAD2 y FAH12. FAD2 formará ácido linoleico y FAH12 ácido ricinoleico (Figura 18). Una característica llamativa de la variedad OLE-1 fue la acumulación de ácido oleico en lugar de ácido linoleico. 4.4. Ingeniería genética en plantas. En 1978, Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith fueron galardonados con el Nobel de Fisiología o Medicina por el descubrimiento de las enzimas de restricción, enzimas capaces de cortar las secuencias de ADN de una forma precisa y no al azar. Este fue el inicio de lo que conocemos como Ingeniería genética, la capacidad de modificar el genoma de los organismos de forma más precisa y rápida mediante una serie de técnicas que trataremos a continuación (Beltrán, 2018). Introducción 31 Hoy en día, existen varios métodos que permiten transferir genes de un organismo a otro y que éstos se expresen de una manera determinada. Los diferentes métodos de transformación se pueden diferenciar en métodos biológicos o métodos no biológicos. En plantas, el método no biológico más empleado es la biolística, que consiste en bombardear las células con partículas de metal que portan el material genético (circular o lineal) que queremos introducir en el nuevo organismo. Otros métodos no biológicos son la electroporación, que se basa en la introducción del material genético a través de poros creados en la membrana de protoplastos (células vegetales sin pared) mediante impulsos eléctricos, la microinyección, que consiste en introducir el material genético manualmente dentro de la célula, o la lipofección, en la que el material genético se recubre de una membrana lipídica que se fusionará con la membrana del protoplasto (Keshavaredd et al., 2018). Por el contrario, los métodos biológicos utilizan organismos vivos como vectores del ADN que se desea introducir. A este respecto, pueden usarse virus para incorporar el material genético en el núcleo de células vegetales a través de un proceso de infección dirigida. Sin embargo, el método biológico más usado y a la vez el más económico es el que emplea la bacteria Agrobacterium tumefaciens para introducir el material genético dentro de una célula vegetal. Este método ha sido el usado en este proyecto y se detalla en el siguiente apartado (Keshavareddy et al., 2018). 4.4.1. Transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens. En la misma década en la que Arber, Nathans y Hamilton ganaron el premio Nobel de medicina se descubrió que la bacteria A. tumefaciens era capaz de transferir, de manera natural, sus propios genes al genoma de la planta que estaba infectando, usando el plásmido Ti. Más tarde Jeff Schell y Marc Van Montagu, de la universidad de Gante, optaron por modificar los genes del propio Agrobacterium, usando enzimas de restricción, e introducir en su plásmido genes aislados por ellos mismos. En 1983, tres grupos independientes (el grupo de Gante, un grupo de Monsanto encabezado por Rob Fraley, y el grupo de Chiltony) casi simultáneamente demostraron que podían insertar nuevos genes en el genoma de una planta. Los tres grupos utilizaron el promotor de la nopalina sintasa fusionado a un locus de resistencia a los antibióticos que dio lugar a transformantes de tabaco resistentes a dichos antibióticos (Fraley et al. 1983; Herrera-Estrella et al. 1983; Bevan et al. 1983). Estos experimentos abrieron la era de la ingeniería genética de plantas y una posterior revolución industrial en la agricultura. A día de hoy Agrobacterium es el vector más eficiente y económico para la transferencia de genes a plantas. Introducción 38 obedeciendo a pequeñas repeticiones que aparecían en el genoma, a las cuales se les llamó CRISPR (Mojica & Rodríguez-Valera, 2016). No obstante, fueron las doctoras Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier quienes convirtieron el hallazgo del Dr. Mojica en una herramienta útil y programable en biología molecular (Jinek et al., 2012). Doudna y Charpentier demostraron que determinadas secuencias de ARN eran capaces de guiar a la proteína Cas9 hasta esos sitios CRISPR y provocar cortes en la doble hélice del ADN no sólo de virus sino de todo tipo de organismos. Aunque lo más importante es que esas secuencias de ARN pueden ensamblarse a una guía que conduce a la proteína Cas9 hasta la secuencia de ADN que se desee dentro del organismo de interés y generar un corte. La nucleasa Cas9 consta de los dominios RuvC y HNH, encargados de la rotura de la doble hélice (Ma et al., 2016). En definitiva, podemos ensamblar una estructura genética que codifique para una guía de ARN reconocible por la enzima Cas9, que se dirija a los sitios CRISPR y corte la doble hélice del ADN. La posterior reparación, por el método NHEJ (unión de extremos no homólogos), que liga extremos de DNA independientemente de su homología producirá inserciones o deleciones en la secuencia deseada (Figura 22). CRISPR/Cas9 no solo sirve para generar mutaciones sino también para realizar inserciones por recombinación homóloga, vía reparación HDR (reparación dirigida por homología), que repara el corte en el DNA ligando extremos homólogos. Este último proceso tiene una frecuencia baja en plantas, por lo que la inserción de genes vía CRISPR/Cas9 en plantas es un proceso dificultoso (Liu et al., 2017). A pesar de ello recientemente se ha logrado la inserción eficaz de genes, vía HDR, en arroz usando la nucleasa Cpf1, otra nucleasa dependiente de CRISPR (Begemann et al., 2017). El diseño de una construcción genética para el uso de CRISPR/Cas9 debe tener en cuenta los siguientes principios básicos. a) Hay que identificar la secuencia diana a mutar en el genoma. La secuencia diana debe tener una longitud de 20 pb y debe de cumplir una serie de requisitos. En primer lugar, la secuencia debe terminar en lo que conoce como motivo PAM (motivo protoespaciador adjunto, una secuencia NGG al final de la secuencia diana). En segundo lugar, la secuencia diana debe empezar por una guanina o una adenina si se emplea el promotor U6 o U3, respectivamente. Los promotores U6 o U3 son nativamente promotores para la ARN polimerasa III en plantas, el promotor U6 se usará en dicotiledóneas, mientras el U3 en monocotiledóneas. Estos promotores son los que regularán la expresión de nuestra secuencia guía. Se recomienda que la secuencia diana tenga un sitio de restricción en el sitio de mutación, ya que puede Introducción 39 facilitar la posterior comprobación de mutaciones. En tercer lugar, se deben seleccionar aquellas dianas que tengan la menor cantidad de off-targets posibles, esto es, sitios donde la enzima Cas9 pueda cortar por homología con la secuencia diseñada (Belhaj et al., 2015) b) Una secuencia guía. La enzima Cas9 reconoce una secuencia guía fija que es 5’- GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’, esta secuencia precederá a la secuencia diana sin el dominio PAM, todo precedido por el promotor U6 o U3 y clonado en un plásmido binario. (Brooks et al., 2014; Belhaj et al., 2015). c) El gen de la enzima Cas9. Necesitaremos el gen de la enzima Cas9 bajo un promotor fuerte como puede ser el promotor 35S (Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter) que permita una expresión alta en el mismo plásmido. d) Si se desea insertar un gen mediante HDR debemos incluir en nuestro plásmido la secuencia a insertar flanqueada por dos secuencias homólogas al sitio de inserción seleccionado. (Jaganathan et al., 2018). Los pasos a seguir para llevar a cabo la edición génica de una planta mediante la técnica CRISPR/Cas9 son: I) Selección de una diana que cumpla con los requisitos mencionados, diseño y ensamblaje de nuestra construcción genética y clonación en un plásmido binario. II) Transformación de la planta con nuestro plásmido binario. III) Comprobación o screening de las posibles mutaciones generadas. Este paso se puede realizar por secuenciación directa de las bandas obtenidas por PCR del gen de interés o bien realizar un screening usando enzimas de restricción. Como se ha mencionado antes, una de las recomendaciones para la secuencia diana es que tenga un sitio de restricción en el lugar en el que Cas9 genera la mutación. Al generar la mutación en el sitio de restricción, éste se pierde y podremos discriminar las copias mutadas por Cas9, ya que son las que no se han degradado por la enzima de restricción en una digestión previa a una prueba de PCR. IV) Observación del fenotipo de la planta. Una vez comprobadas las mutaciones se comprueba si estas han tenido algún efecto en el metabolismo de la planta (Belhaj et al., 2015; Jaganathan et al., 2018). Introducción 40 Figura 22. Esquema del sistema d edición genética CRISPR/Cas9. La enzima Cas9 guiada por sgRNA reconoce a la secuencia diana y corta la doble hélice en los sitios HNH y RuvC. El dominio PAM es necesario para el corte vía CRISPR. Adaptado de Ma et al., 2016. Las aplicaciones que puede tener la técnica CRISPR/Cas9 son enormes. Desde la cura de enfermedades genéticas humanas hasta la creación de cultivos adaptados y con alta productividad. CRISPR/Cas9 ya se ha aplicado en al menos 20 especies de cultivo (Ricroch et al., 2017) con varios objetivos como la mejora de la productividad o la resistencia a estrés biótico y abiótico. Entre los cultivos en los que se ha aplicado CRISPR/Cas9 destacan el arroz (Shan et al., 2014), el trigo (Shan et al., 2014; Kim et al., 2018), la yuca (Odipio et al., 2017) o el tomate (Brooks et al., 2014). Para la modificación del metabolismo de lípidos de plantas, CRISPR/Cas9 se ha aplicado en Camelina sativa mutando el gen de la enzima desaturasa FAD2, y provocando un incremento del contenido en ácido oleico en esas semillas (Jiang et al., 2017). También se ha utilizado para mutar esa misma enzima en Brassica napus, obteniendose también un incremento significativo de la cantidad de ácido oleico en las semillas (Okuzaki et al., 2018). En ricino, CRISPR/Cas9 podría ser una potente herramienta para llegar a reducir la toxicidad de las semillas, así como para bloquear la síntesis de ciertas proteínas como la hidroxilasa, lo que permitiría por un lado profundizar en el conocimiento del metabolismo de acumulación de TAG en esta especie y de disponer de plantas de ricino que pudieran acumular ácidos grasos inusuales diferentes al ricinoleico. Introducción 41 5. Importancia del proyecto. Por su gran adaptabilidad a distintos climas, su gran productividad, su rápido crecimiento y la resistencia a sequías y a altas temperaturas, el ricino constituye una especie de interés agronómico en amplias áreas de clima templado y subtropical. Además, la presencia de una maquinaria de síntesis de ácidos grasos inusuales única en esta planta, unida a su alta capacidad de producción de aceite, convierte al ricino en una planta de gran interés industrial para la producción renovable de materias primas. La puesta a punto de un protocolo de transformación y regeneración del ricino, puede abrir las puertas para que la explotación de esta planta se extienda mucho más y sea una alternativa verde y eficiente a las fuentes de carbono fósil. 43 II. OBJETIVOS Objetivos 45 El objeto general de este proyecto es desarrollar un método para la transformación genética del ricino, así como profundizar en el conocimiento de la biosíntesis de ácidos grasos y triacilgliceroles en esta planta, con el objeto final de convertirla en una plataforma para la producción de aceites vegetales de interés industrial. Para ello se abordaron los siguientes objetivos: Capítulo 1 1. Desarrollo de un método rápido y eficaz de transformación transitoria en semillas de ricino. 2. Optimización del protocolo de transformación transitoria en ricino mediante la realización de estudios de expresión génica con diferentes promotores en el endospermo de la semilla de ricino en desarrollo. Capítulo 2 1. Investigar la síntesis de ácidos grasos epoxidados e hidroxilados largos durante el desarrollo de la semilla de ricino. ricino 2. Estudiar las consecuencias de una disminución del contenido en ácido ricinoleico en semillas en desarrollo. Capítulo 3 1. Desarrollo de un método de transformación y regeneración adaptado a la planta de ricino para la producción de transformantes estables. 2. Obtención de líneas de ricino que presenten una disminución del contenido en ácido ricinoleico mediante diferentes técnicas moleculares. 3. Obtención de líneas de ricino que presenten una disminución de la toxicidad de la semilla suprimiendo la producción de ricina mediante la técnica CRISPR/Cas9. Capítulo 4 1. Estudio del metabolismo de ácidos grasos hidroxilados distintos al ricinoleico por parte de la semilla de ricino en desarrollo. 47 III. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y métodos 54 continuación, se añadieron 500 µL de tampón de extracción (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) y se aplicó agitación en vortex durante 5 segundos para dejar reposar a temperatura ambiente no más de 1 hora. A continuación, se centrifugó la muestra a 13000 rpm durante 5 minutos, se tomó el sobrenadante y se depositó en un tubo estéril. Se añadió un volumen de 400 µL de isopropanol y se mezcló con cuidado. Tras centrifugar la muestra durante 5 minutos se descartó el sobrenadante y se evaporaron los restos de isopropanol a 40 °C. Finalmente, los ácidos nucleicos se resuspendieron en 100µL de agua MilliQ ultrapura. 2.1.2. Estimación de la concentración de ácidos nucleicos. Tanto la concentración como la pureza del ADN y ARN extraídos se determinó mediante espectrofotometría usando un espectrofotómetro compacto Nanodrop 2000 de Thermo Scientific (Massachusetts, Estados Unidos) el cual determina la concentración a una absorbancia de 260 nm. Para determinar la pureza de la muestra, el aparato detecta también la absorbancia a 230 nm y a 280 nm. Un índice de pureza A260/A280 de ≈1.8 es generalmente aceptado como “puro” en cuanto ADN (≈ 2.0 para ARN). Además, también se midió el índice de pureza a A260/A230, en este caso para el AND y el ARN un índice de pureza entre 1.8 y 2.2 es generalmente aceptado como “puro”. El volumen tomado para el análisis es de 1 µL de muestra. 2.1.3. Reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). 2.1.3.1. Amplificación de ADN mediante PCR. Todas las reacciones se llevaron a cabo en el termociclador MJ Thermal Cycler de Bio-Rad (California, Estados Unidos). Podemos distinguir tres tipos de reacciones de PCR en este trabajo: I) Reacción estándar: para la reacción estándar de PCR se usó el kit MyTaq™ Red Mix de Bioline (Estados Unidos). El cual consiste en una disolución de enzima polimerasa MyTaq, oligonucleótidos y el tampón de carga de ADN. Para un volumen final de 50 µL se aportaron entre 50-1000 ng de ADN molde y una concentración final de oligonucleótidos de 20 µM cada uno. La reacción estándar se desarrolló con una temperatura inicial de desnaturalización de entre 1-3 min a 95 °C dependiendo si el ADN es genómico o es un plásmido. Posteriormente 35 ciclos de 15-30 segundos de desnaturalización a 95 °C, 15 segundos de unión de los cebadores a 2 °C menos de la temperatura media del oligonucleótido y un tiempo variable de extensión de 30 s/kb a 72 °C en función del tamaño de ADN a Materiales y métodos 55 amplificar. Finalmente, la mezcla se somete a 72 °C durante 10 minutos para una extensión final de las cadenas. II) Reacción de alta fidelidad: En aquellos ensayos en los que la fidelidad debía ser mayor se usó la enzima Velocity de Bioline (Estados Unidos). La enzima posee actividad correctora, es decir, actividad 3’-5’ exonucleasa, lo que aumenta 50 veces la fidelidad en la copia, aunque al no poseer actividad transferasa terminal, los fragmentos sintetizados poseen extremos romos. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µL que contenían 1XHi-Fi buffer, 1mM dNTPs, 5-500 ng de ADN molde, 1 µL de enzima y 20 µM de oligonucleótidos. Tras una etapa de desnaturalización inicial de 2-3 min a 98 °C, la reacción se desarrolló durante 35 ciclos de 98 °C durante 30 s, una temperatura 2 °C inferior a la de hibridación de los oligonucleótidos al molde durante 30 s y 72 °C durante un tiempo variable de 20 s/kb. Finalmente se aplicó un tiempo de elongación final de 10 minutos a 72 °C. III) PCR de colonias de E. coli: mediante esta técnica podemos amplificar secuencias directamente a partir de la colonia bacteriana sin necesidad de extracción de material genético. El fin de la técnica es detectar la presencia o ausencia del gen de interés en la colonia. La técnica consiste en tomar una muestra de la colonia con un palillo estéril e introducirlo momentáneamente en un tubo de PCR con la misma mezcla de reacción citada en el apartado I). A continuación, se cerró el tubo y se procedió con la reacción de PCR. IV) PCR para cultivo de A. tumefaciens: A. tumefaciens no genera tantas copias de un mismo plásmido por lo que no tenemos suficiente molde si picamos una muestra de biomasa de la colonia. Para llevar a cabo la PCR directamente sobre material biológico debemos tomar 1 mL de cultivo mantenido toda la noche a 28 °C, centrifugarlo para recuperar las células y resuspenderlo en 50 µL de agua destilada estéril. Posteriormente se toma 1 µL de la solución de células y se añade a la reacción de PCR con las condiciones del apartado I). Materiales y métodos 56 2.1.3.2. Análisis de la expresión génica mediante PCR a tiempo real o cuantitativa. Base teórica La PCR en tiempo real permite conocer el nivel de expresión de un determinado gen en función de su presencia relativa en el ARN total de la célula. En el proceso de la PCR de tiempo real puede observarse una fase exponencial en la que se están generando copias del ADN, cuanta más cantidad tengamos de nuestro molde antes aparecerá la fase exponencial. En una segunda fase la reacción alcanza un estado estacionario debido a que los componentes de la reacción comienzan a ser limitantes y la actividad polimerasa decae. El aumento de la cantidad de copias se detecta por medio de una señal fluorescente. Hablamos de parámetro Ct (ciclo umbral) como el ciclo en el que la fluorescencia supera la línea base y entra en fase exponencial. El análisis de PCR a tiempo real se realiza a partir del ADNc obtenido a partir del ARN. Si la expresión de nuestro gen es mayor, existirán más copias de ARN, por lo que tendremos más representación del mismo en el ADNc total. La presencia relativa de nuestra secuencia será mayor y se verá reflejado en la reacción de PCR a tiempo real. Descripción de la técnica En primer lugar, se extrajo el ARN total de la muestra a analizar (Materiales y métodos, ap. 2.1.1.1), para eliminar restos de ADN genómico se llevó a cabo un tratamiento de degradación del mismo usando el kit DNA-free de Ambion (Estados Unidos). Una vez tratado, se cuantificó el ARN total (Materiales y métodos ap. 2.1.2.) y tomó 1 µg para la síntesis de ADNc (Materiales y métodos ap. 2.1.1.2) el cual sirvió de molde para las reacciones de PCR cuantitativa. El reactivo empleado fue SYBR Green (Quiagen, Alemania). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 25 µl, conteniendo 12 µl de QuantiTect SYBR Green PCR Mix, 2.5 mM de MgCl2, cebadores con una concentración final de 0.3 µM y agua libre de ARNasa y ADNasa y 2 µl de ADNc. Los oligonucleótidos empleados deben tener como producto un amplicón de unas 100pb para que el análisis de la expresión sea lo más fidedigno posible. El tamaño óptimo de los oligonucleótidos es de 20 pb y con un porcentaje de G más C del 50 %. Las reacciones se llevaron a cabo en el sistema MJ Mini Personal Thermal Cycler de Bio- Rad (California) acoplado a un cabezal Mini Opticon Real Time PCR System de Bio-Rad que permite trabajar simultáneamente con 48 pocillos. Los ciclos aplicados constan de una incubación inicial de 50 °C durante 2 min, un tiempo de 15’ a 95 °C para la activación de la Materiales y métodos 57 polimerasa, un periodo de amplificación de 40 ciclos compuestos por una fase de desnaturalización a 94 °C durante 15 s; un periodo de hibridación a 58 °C de 30 s y una última fase de elongación a 72 °C por 15 s. Una vez terminada la reacción se comprueba la ausencia de dímeros de oligonucleótidos y se confirma la especificidad de los mismos observando las curvas de desnaturalización. El nivel de expresión puede variar en gran medida entre tejidos e incluso entre células. Para estandarizar estos valores se toma un gen referente sobre el que se analiza la expresión del gen de interés. En este proyecto el gen referente tomado ha sido el de la Actina de ricino (GenBank AY360221). Una vez obtenidos los datos numéricos de los diferentes Ct, los valores del gen de referencia se tomaron como cero y los datos del gen de interés se relativizaron al gen de referencia siguiendo el método de doble incremente de Ct de Livak (Livak & Schmittgen, 2001). 2.1.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa. Para separar los fragmentos amplificados por PCR se siguió el método descrito por Sambrook et al., (1998). Los geles se prepararon en tampón TAE, tal y como se describe en el apartado 1.3.1. de Materiales y métodos, aplicando mayor concentración de agarosa en los casos en los que se desea separar fragmentos de menor tamaño. En el caso de las PCR de alta fidelidad fue necesario añadir un tampón de carga de ADN, 6X DNA Loading Dye Purple (New Englands Biolabs, Reino Unido) ya que no viene incluido en el tampón de PCR. Para determinar el tamaño exacto de las bandas se usaron dos marcadores distintos: 100 pb gTPbio DNA-ladder y 1 kb gTPbio DNA-ladder (Thermo Fisher, Massachusetts, Estados Unidos). La electroforesis se llevó a cabo en una cubeta horizontal alimentada por la fuente PowerPac (Bio-Rad, California, Estados Unidos). La visualización de los genes se llevó a cabo bajo luz ultravioleta en un detector de quimioluminiscencia ChemiDoc™Imagin System (Bio Rad, California, Estados Unidos) 2.1.5. Purificación de fragmentos de ADN en geles de agarosa y productos de PCR. Los fragmentos aislados del gel de agarosa se extrajeron del mismo usando una cuchilla estéril. La agarosa se eliminó y se recuperó el ADN usando el kit Isolate II PCR & Gel kit (Bioline, Estados Unidos). Se usó el mismo kit para aquellos ensayos en los que fue necesario recuperar el producto de PCR sin cortar la banda en el gel de agarosa. Materiales y métodos 58 2.1.6. Tratamientos enzimáticos del ADN. 2.1.6.1. Digestión del ADN mediante enzimas de restricción. La restricción consiste en un corte en la doble cadena del ADN mediante endonucleasas específicas. En este proyecto se han usado endonucleasas proporcionadas por New Englands Biolabs (Reino Unido). Estas enzimas pueden llevar a cabo el corte en la misma secuencia que reconocen o cerca de la región de reconocimiento (enzimas de tipo II). Las reacciones de restricción se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del suministrador en cuanto a composición de la mezcla de reacción, tiempo y unidades de enzima en volúmenes que variaron entre 20 y 50 µl. Las digestiones dobles, en las que se usan dos enzimas distintas, se realizaron usando un tampón compatible para ambas enzimas. 2.1.6.2. Ligación de fragmentos de ADN. Las ligaciones de fragmentos de ADN se realizaron con la enzima T4 ADN ligasa (Canvax, España). La proporción óptima entre inserto y vector para esta enzima es de 5:1, el volumen de ligación final fue de 10 µl y los volúmenes de inserto y vector se calculan en función de la concentración de los mismos empleando la siguiente fórmula: 50𝑛𝑔 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑥 𝑝𝑏 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜 𝑝𝑏 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑥 𝑛𝑔 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜 = 1 5 En el caso de ligaciones en pMBLT se usó el kit pMBL-T de Canvax (España), ambos llevan una cola de deoxitimina de cadena simple en el extremo 3´ del sitio de inserción facilitando la inserción del fragmento y previniendo la religación del plásmido. Las reacciones de ligación se llevaron a cabo durante 2 h a 22 °C, en casos en los que la ligación es especialmente complicada la ligación se llevó a cabo a 4 °C durante toda la noche. 2.1.6.3. Secuenciación del ADN. Las secuencias de los productos de PCR y de ADN genómico, incluyendo las secuencias resultantes de los análisis de la progenie de plantas transgénicas y mutantes obtenidos por CRISPR/Cas9, fueron secuenciadas. Para la secuenciación se enviaron las muestras a la empresa Secugen, S.A. (Madrid, España) y al servicio LighRun de GATC Biotech (Konstanz, Alemania) que emplean la técnica Illumina para la secuenciación de fragmentos de ADN. Las secuencias obtenidas fueron analizadas empleando el programa programa BLAST 2.0 (Basic Local Alignment Search Tools) del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Para la comprobación del correcto ensamblaje de las construcciones génicas y de su secuencia se usó la herramienta bioinformática Geneious®. Materiales y métodos 59 2.1.7. Diseño y ensamblaje de construcciones genéticas. Las construcciones genéticas empleadas en esta tesis se han diseñado con la herramienta bioinformática Geneious®. Los oligonucleótidos usados para el ensamblaje de las estructuras se encuentran listados en el Anexo I, las secuencias usadas de los genes empleados se muestran en el Anexo II. 2.1.7.1. Construcción de diseños genéticos mediante técnicas clásicas. Hablamos de técnicas clásicas cuando la estructura se ha ensamblado mediante reacciones de restricción y ligación estándar. 2.1.7.1.1. Diseño y ensamblaje de la horquilla de silenciamiento de la hidroxilasa de ricino. Para el silenciamiento de la hidroxilasa de ricino se optó por construir una estructura en horquilla o hairpin (hpARN). La estructura consta de dos brazos, sentido directo y sentido inverso o antisentido, y un loop o lazo. Se seleccionó una secuencia de aproximadamente 100pb que tenía poca semejanza con la secuencia de la desaturasa FAD2 de ricino (para evitar el silenciamento de ésta) (Figura 23). Figura 23. Comparación de las secuencias nucleotídicas que codifican para la Δ12 hidroxilasa y la Δ12 desaturasa de ricino. En amarillo se muestran las regiones no coincidentes. I) Los brazos en sentido directo y antisentido se clonaron desde ADNc de semilla de ricino mediante PCR de alta fidelidad (Materiales y métodos ap. 2.1.3.1.) usando oligonucleótidos específicos (Anexo I). Para que la dirección de ambos brazos fuera la correcta se añadieron dianas de enzimas de restricción a ambos lados de los brazos. En el caso del brazo en sentido directo las enzimas seleccionadas fueron XhoI en el extremo 3´ y SacII en el extremo 5´. Para el brazo antisentido (complementario al de sentido directo) se seleccionaron las enzimas EcoRI en el extremo 5´y NdeI en el extremo 3´. La secuencia final amplificada se muestra en la tabla 5. Materiales y métodos 60 Tabla 5. Sencuencias de los brazos de la secuencia hpFAH12 generada. Nombre Secuencia 5´->3´ Brazo en sentido directo SacII TGCTTACCGCGGATGTCCACTGTCATAACCAGCAACAACAGTGAGAAGAAAGGA GGAAGCAGCCACCTTAAGCGAGCGCCGCACACGAACTCGAGTGCTTA XhoI Brazo antisentido NdeI_ TGCTTACATATGTCCACTGTCATAACCAGCAACAACAGTGAGAAGAAAGGAGGA AGCAGCCACCTTAAGCGAGCGCCGCACACGAATTCTGCTTA EcoRI II) Para el lazo o loop se usó una construcción cedida por el Dr. Edgar Cahoon (Nebraska) que contenía en el plásmido pMBLT una secuencia procedente del intrón de la oleil desaturasa de Camelina sativa (CsFAD2) (Anexo II), que ha sido utilizado anteriormente y satisfactoriamente para el silenciamiento génico (Nguyen et al. 2013). Esta secuencia estaba flanqueada por las dianas de enzimas de restricción SacII y XhoI. Mediante reacciones de restricción y ligación se ensamblaron los dos brazos al intrón FAD2 en el plásmido pBMLT (Figura 24.) Figura 24. Esquema de la secuencia genética hpFAH12 insertada en el plásmido pMBLT. III) Finalmente, la construcción que incluía los dos brazos y el intrón FAD2 se insertó en el sitio de clonación del vector pBinGlyRed cedido por el Dr. Cahoon. El plásmido pBinGlyRed posee un sitio de clonación flanqueado por la secuencia promotora de la glicinina (pGly) promotor de la proteína de soja (Glycine max) glicinina-1 (Sims & Goldberg 1989) (Anexo II) por el extremo 5´y el terminador (3´GlyUTR; Anexo II) por el extremo 3´. Mediante restricción-ligación se insertó la construcción 5-’EcoRI-brazo antisentido::intrónCsFAD2:: brazo en sentido directo- XhoI-3´entre el promotor pGly y el terminador GlyUTR (Anexo II). Este casete final (que va desde el inicio del promotor hasta el final de la secuencia terminadora) quedó flanqueado por los sitios de restricción 5´BamHI y 3´HindIII. Mediante digestión y ligación se extrajo el casete 5´-BamHI-pGLy::brazo Materiales y métodos 61 antisentido::intronCsFAD2::brazo sentido directo::GlyUTR-HindII-3´del plásmido pBinGlyRed y se clonó en el vector pCambia 1305.1 (Figura 25). Figura 25. Estructura final del plásmido pCambia1305.1::hpFAH12 diseñado para silenciar la traducción del gen FAH12 en semillas de ricino. 2.1.7.1.2. Diseño y ensamblaje del gen que codifica para la elongasa de Lesquerella fendleri (LfKCS3). El gen LfKCS3 que codifica para la elongasa de Lesquerella fendleri fue sintetizado por GenScript Corp., los codones de la secuencia de 1492 pb (Anexo II) fueron optimizados para ricino y se le añadieron los sitios de restricción EcoRI y XhoI en los extremos 5’ y 3’, respectivamente. El gen fue cedido en el plásmido pUC57. La secuencia fue cortada con las enzimas EcoRI y XhoI e insertada en uno de los sitios de clonación del plásmido pBinGlyRed3 mediante ligación. En este plásmido, el gen LfKCS3 quedó flanqueado por pGly en el extremo 5´ y por el terminador en el extremo 3´. Finalmente, el casete completo (que incluía el protomor, la secuencia codificante y el terminador) se amplificó mediante una PCR de alta fidelidad y se le añadieron los sitios de restricción 5´SacI y 3´KpnI, que posteriormente se utilizaron para insertar el casete en el sitio de clonación de pCambia 1305.1 (Figura 26). Figura 26. Esquema del plásmido final pCambia1305.1::LfKCS3 diseñado para sobre-expresar la proteína LfKCS3 en semillas de ricino. Materiales y métodos 62 2.1.7.1.3. Ensamblaje del promotor pGly en pCambia 1305.1. En el plásmido pCambia 1305.1, el gen GUS se encuentra bajo el promotor de fuerte expresión constitutiva, 35S. La sustición de dicho promotor por el promotor específico de semillas, pGly, se llevó a cabo mediante digestión con las enzimas EcoRI en el extremo´5´del promotor 35S y NcoI en el extremo 3’ y la posterior ligación con el promotor pGly. El promotor pGly se obtuvo a partir del plásmido pBinGlyRed3 cedido por el Dr. Cahoon y se amplificó mediante PCR de alta fidelidad con oligonucleótidos específicos (Anexo I) que contenían dianas de restricción en 5´EcoRI y 3´NcoI. Este plásmido se denominó pCambia1305.1::pGly. 2.1.7.1.4. Obtención del plásmido pCambia1305.1 sin promotor para GUS. Otro diseño que se generó en este trabajo fue el plásmido pCambia1305.1::nulo sin el promotor 35S regulando al gen GUS. Este plásmidol se usó como control en diferentes ensayos. Para ello, se llevó a cabo una digestión de pCambia1305.1 con las enzimas EcoRI y NcoI para eliminar el promotor 35S. Los extremos fueron tratados con la enzima Klenow (New Englands Biolabs) para poder ser religados con la enzima T4 ligasa. 2.1.7.2. Ensamblaje en lazo o Loop Assembly para la generación de construcciones genéticas. La técnica de clonación en lazo o Loop Assembly (Pollak et al., 2018) consiste en el ensamblaje de genes de forma cíclica usando enzimas de restricción de tipo II y sitios de ligación/recombinación específicos. Las enzimas de restricción de tipo II son capaces de cortar la doble hélice del ADN unos nucleótidos por delante del sitio de reconocimiento. Para este tipo de ensamblaje se usan plásmidos específicos que poseen sitios de reconocimiento para estas enzimas y secuencias de recombinación que permiten el ensamblaje en tándem de las secuencias de una forma ordenada. Así, se establecen determinados niveles dentro de la técnica Loop Assembly. Cuando una secuencia concreta se encuentra clonada en un plásmido específico flanqueada por los sitios de restricción de las enzimas de tipo II y sitios de recombinación la secuencia se dice que se encuentra en el nivel 0 o L0. El ensamblaje de varias secuencias en L0 usando las enzimas de tipo II y mediante recombinación dará lugar al nivel L1. La unión de varias secuencias encadenadas en L1 utilizando el mismo método dará lugar a la unión de varias ORF para formar el nivel 2, L2. El proceso puede repetirse sucesivamente para formar estructuras genéticas complejas de una forma simple y rápida. Materiales y métodos 63 Las reacciones de restricción y ligación no suceden en pasos distintos como sucede en los métodos clásicos, sino que ocurren en una sola reacción. Dichas reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 20 µL, con 200 ng de plásmido aceptor, plásmido donador o inserto en una ratio 2:1 molar, 1.5 µL de tampón de la ligasa T4 de New England Biolabs (Reino Unido), 1.5 µL de una disolución de BSA al 10 % (p/v), 200 unidades de la ligasa T4 de NEB y 5 unidades de la enzima de restricción a usar. La reacción consiste en una serie de ciclos de temperatura para que actúen tanto la ligasa como la enzima de restricción. Esos ciclos son 20 s 37 C, 26 ciclos de 3 min a 37 C y 4 min a 16 C. Una vez terminados los 26 ciclos se aplica 50 °C durante 5 min para desactivar la ligasa y 80 C durante 5 min para desactivar las enzimas de restricción. Una vez terminada la reacción las secuencias se habrán unido siguiendo los sitios de recombinación diseñados. 2.1.7.2.1. Clonación y ensamblaje del gen que codifica para la epoxigenasa de Stokesia laevis (SlEPX) con hpFAH12. La secuencia de la enzima epoxigenasa de Stokesia laevis (SlEPX) se obtuvo por síntesis artificial en Eurofins Genomics y fue cedida en el plásmido pEX-A258. La secuencia usada está adaptada la maquinaria metabólica de ricino y se muestra en el anexo II. Todos los plásmidos usados para generar la construcción fueron cedidos por el Dr. Richard Smith y la Dra. Irene González de Rothamsted Research (Reino Unido). El proceso de clonación y preparación del gen para su expresión en ricino fue el siguiente: 1) Formación de un plásmido L0 con el promotor pGly: se clonó mediante PCR el mencionado promotor, al cual se le añadió tanto en el extremo 5´como en el extremo 3´ un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BpiI y un sitio Pre-BsaI que dará lugar a un corte con dicha enzima en el plásmido aceptor. La secuencia se flanqueó con el sitio de recombinación GGAG en el extremo 5´y AATG en el extremo 3´ usando oligonucleótidos específicos (Anexo I). Mediante digestión con BpiI y ligación en la misma reacción, se insertó el promotor pGly en el plásmido pAGM9121. El resultado fue el promotor pGly inserto en el plásmido pAGM9121 flanqueado por sitios de restricción para BsaI y por las secuencias de recombinación anteriormente citadas. 2) Formación de un plásmido L0 con el gen de la epoxigenasa de Stokesia laevis: El procedimiento fue el mismo que para el promotor pGly, se cambiaron los extremos de recombinación por las secuencias AATG en el extremo 5´y la secuencia GCTT en el extremo 3´. Materiales y métodos 70 durante 20 min en hielo, tras ese periodo se procedió a aplicar un choque térmico a 42°C durante 45 s. Inmediatamente después se añadieron 250 µL de medio LB y se incubó en agitación (220 rpm) a 37°C durante 1 h. Transcurrido ese tiempo se sembraron los 250 µL en una placa LB sólido con los antibióticos específicos para cada plásmido. 2.2.7.3. Preparación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens para su transformación por choque térmico. La cepa usada fue AGL1 (Materiales y métodos ap. 1.1.3.). Las células se incubaron a 28 °C en una placa de LB sólido suplementada con 50 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de carbonicilina. Tras tres días de incubación se tomó biomasa de una colonia aislada para establecer el pre-inóculo de 5 mL de cultivo, el cual se incubó toda la noche a 28 °C. Posteriormente, se tomó un volumen de 300 µL del cultivo anterior para inocular 50 mL de LB líquido con los mismos antibióticos. El cultivo de 50 mL se mantuvo en agitación continua a 230 rpm en un matraz Erlenmeyer de 250 mL hasta que la D.O.600 fue de 0.2 (aproximadamente 16h). Una vez crecido y enfriado en hielo, se centrifugó el cultivo en tubos de 50 mL a 4000 x g durante 10 min a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en un volumen de 50 mL de MgSO4 10 mM. Estas células fueron de nuevo centrifugadas en las mismas condiciones y finalmente se resuspendieron en 1mL de una solución de CaCl2 20 mM. La suspensión se dividió en alícuotas de 100 µL que se congelaron con nitrógeno líquido para conservarse a -80°C. 2.2.7.4. Transformación de A. tumefaciens mediante choque térmico. Para la transformación de A. tumefaciens se tomó una alícuota de células competentes y se les añadió 1 µg de ADN del plásmido apropiado. Tras descongelarse completamente la alícuota en hielo, se aplicaron 37 °C durante 5 minutos. Una vez aplicado el choque térmico se añadió 1 mL de medio LB líquido sin antibióticos para incubarse durante 3 horas a 28 °C en agitación continua de 230 rpm. Transcurrido ese tiempo se centrifugó la muestra para recuperar las células y resuspenderlas en 100 µL de medio LB. Finalmente se tomaron los 100 µL y se sembraron en una placa de LB sólido suplementado con 50 mg/L de rifampicina, 50 mg/L de carbonicilina y el antibiótico de selección del plásmido usado en la transformación. Las colonias aparecieron 3 días después de la transformación. Para la comprobación de las colonias se tomó biomasa de una colonia y se inocularon 5mL de LB líquido a 28 °C durante toda la noche en agitación continua de 230 rpm y con los antibióticos apropiados. Se centrifugó 1 mL de cultivo para recuperar las células las cuales se Materiales y métodos 71 resuspendieron en un volumen de 50 µL de agua destilada autoclavada. Finalmente se tomaron 2 µL como molde para llevar a cabo una PCR estándar. 2.2.7.5. Preparación del cultivo de Agrobacterium tumefaciens para la transformación de ricino. En todos los métodos de transformación de ricino seguidos en este proyecto se preparó el cultivo de Agrobacterium de la forma que se describe a continuación. En primer lugar, se preparó un preinóculo de 5 mL en LB líquido, suplementado con los antibióticos apropiados, con la biomasa de una colonia de Agrobacterium portadora del gen a transferir a Ricinus communis. El cultivo se mantuvo toda la noche a 28°C con agitación continua de 230 rpm. A continuación, se tomaron 300 µL del pre-inóculo y se añadieron a 50 mL de LB líquido con los antibióticos adecuados, el cultivo se mantuvo a 28 °C en agitación continua de 230 rpm hasta alcanzar una O.D.600 de 0.2. Las células resultantes se sedimentaron por centrifugación a 4000 x g durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en un volumen de 50 mL de una solución 10 mM de MgSO4. A continuación las células se volvieron a recuperar por centrifugación y se resuspendieron en 50 mL de solución de infiltración (Materiales y métodos 1.3.1.). El cultivo se mantuvo en oscuridad a 20 °C en agitación continua a 230 rpm durante al menos 3 horas antes de ser utilizado. 2.2.8. Transformación génica de ricino mediante A. tumefaciens. En todos los métodos de transformación de ricino realizados en este trabajo, se usó Agrobacterium tumefaciens cepa AGL1 como vector. Dentro de los métodos de transformación podemos diferenciar el método de transformación transitoria, el cual no necesita protocolo de regeneración y los métodos de transformación estables, los cuales sí necesitan protocolo de regeneración in vitro. 2.2.8.1. Transformación transitoria de la semilla de ricino. Para la transformación transitoria se emplearon dos métodos diferentes: método in vivo y método in vitro. 2.2.8.1.1. Transformación transitoria in vivo. La transformación transitoria in vivo se llevó a cabo a través de la infiltración de una solución de A. tumefaciens AGL1 en el endospermo de la semilla de ricino en desarrollo. Materiales y métodos 72 En la infiltración se usó una suspensión de Agrobacterium incubada en oscuridad en medio de infiltración (Materiales y métodos ap 1.3.1.). La solución se infiltró mediante inyección directamente en el endospermo de la semilla de ricino a través del fruto en la planta. Para ello se usó una jeringa con una aguja hipodérmica de 0.33 mm. El volumen de infiltración fue de 300 µL por fruto (Figura 31). Las semillas infiltradas se recogieron en un periodo de tiempo variable en función del ensayo a llevar a cabo. Dependiendo del análisis a realizar, se alteraron las condiciones de recogida de las muestras, aunque todas las semillas fueron extraídas previamente del fruto. Para el ensayo GUS histoquímico o fluorimétrico la semilla no se congeló, sino que se empleó tejido fresco. Para la extracción de ADN o ARN el tejido se congeló en nitrógeno líquido y se conservó a -80°C. Para análisis en cromatografía de gases las muestras se congelaron a -20°C. Figura 31. Fotografía del momento de infiltración en el fruto de ricino. La aguja hipodérmica atraviesa todas las capas del fruto y la cáscara de la semilla hasta llegar al endospermo. Además, se realizaron pruebas de PCR para diferentes transgenes en la semilla, tomando como molde tanto ADN como ADNc procedente de ARN. Los oligonucleótidos utilizados se detallan en el Anexo I. 2.2.8.1.2. Transformación transitoria in vitro. Método de transformación asistido por sonicación SAAT. El método seguido fue el descrito por Chileh T. et al. (2010). El fruto se extrajo de la planta y se esterilizó durante 20 minutos en una solución al 50% (v/v) de hipoclorito sódico con unas gotas de Tween-20. Una vez estéril, la semilla se diseccionó del fruto en condiciones de esterilidad con pinzas y escalpelo. Ya diseccionada, la semilla se dividió en dos mitades que se Materiales y métodos 73 depositaron en tubos de microcentrífuga conteniendo medio de transformación (Materiales y métodos ap. 1.3.1). Una vez diseccionadas todas las semillas se sustituyó el medio de transformación por la solución de Agrobacterium preparada y descrita en Materiales y métodos ap. 2.1.8.5.) Posteriormente se aplicó el método de transformación asistido por sonicación (SAAT) en el que la semilla de ricino diseccionada y en la solución de Agrobacterium se sometió a un tratamiento de sonicación durante 15 s bajo una frecuencia de 40 kHz en sonicador (Branson 3510 MT) con el fin de provocar heridas que faciliten la infección a Agrobacterium. Una vez transformadas, las semillas se lavaron con agua destilada y se depositaron sobre una placa de medio MS-sacarosa sólido, 2.2 g/L de MS, 30 g/L de sacarosa, 100 µM de acetosiringona, 6 g/L de agar noble. Tras un periodo de co-cultivo de 2 días a 26 °C con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, las semillas se transfirieron a placas de MS- sacarosa suplementado con 500 mg/L de cefotaxima para detener el crecimiento de Agrobacterium durante 3 días más. Una vez transcurridos los 3 días las semillas fueron analizadas con ensayo GUS histoquímico. 2.2.8.2. Métodos de transformación estable y regeneración de ricino. 2.2.8.2.1. Transformación y regeneración directa. El tejido seleccionado para la realización de la transformación estable fue el eje embrionario. Las semillas de ricino fueron peladas y esterilizadas en una solución al 10 % (v/v) de hipoclorito sódico con unas gotas de Tween-20 y se le aplicaron 3 lavados de 5 minutos con agua destilada autoclavada en condiciones de esterilidad. Posteriormente se mantuvieron en imbibición durante un periodo no menor de 2 días a 26 °C en oscuridad. Una vez hidratadas las semillas, se diseccionaron los embriones en condiciones de esterilidad con escalpelo y pinzas. Los embriones se sumergieron en la disolución de Agrobacterium descrita en el apartado 2.1.8.5. de Materiales y métodos para ser transformados aplicando ultrasonidos durante 5 segundos usando la técnica SAAT. Posteriormente los embriones se lavaron con agua destilada autoclavada y se eliminó el exceso de agua con una gasa estéril para depositarlos en placas de medio sólido de transformación, manteniéndose en co-cultivo durante 1 día a 26 °C y en oscuridad. Tras el periodo de co-cultivo de transfirieron a tubos que contenían medio MS-sacarosa (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) suplementado con higromicina a 30 mg/mL para poder seleccionar los embriones transformados. Los embriones permanecieron en este medio durante 9 días a 26 °C con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Materiales y métodos 74 Se eliminó la radícula de los ejes germinados supervivientes y se transfirieron a medio de propagación suplementado con 30 mg/L de higromicina. En este medio se incubaron los ejes a 26 °C con un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad. Tras dos semanas, se eliminó el hipocótilo y los brotes se transfirieron a tubos con medio de propagación (Materiales y métodos ap. 1.3.2.) hasta obtener brotes de más de 2.5 cm de longitud. Los brotes ya crecidos se transfirieron a tubos con medio de enraizamiento (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) donde permanecieron en balancín con agitación continua durante 3 días a 28 °C, fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Pasados los 3 días se transfirieron a tubos con medio MS-sacarosa sólido (Materiales y métodos 1.3.1.), sin reguladores y suplementado con 300 mg/L de cefotaxima donde permanecieron hasta formar raíces, entre 1 y 3 semanas. Una vez enraizados, los brotes se transfirieron a tierra, el sustrato empleado fue turba húmeda y los brotes permanecieron al menos los tres primeros días en alta humedad relativa que fue descendiendo gradualmente. 2.2.8.2.2. Transformación y regeneración adventicia. Para este método, las semillas se esterilizaron y permanecieron en imbibición durante 3 días al igual que el apartado anterior. Los embriones fueron diseccionados en condiciones de esterilidad y se aplicaron cortes en el extremo apical del eje embrionario. Posteriormente se aplicó la técnica SAAT, al igual que en el apartado anterior. Los ejes sometidos a ultrasonidos y transformados se transfirieron a placas con medio de transformación (Materiales y métodos ap. 1.3.1.), donde permanecieron en co-cultivo durante 1 día. Una vez pasado el periodo de co-cultivo, los ejes se lavaron con agua destilada autoclavada y se secaron con una gasa estéril para depositarlos en una placa con medio de elongación del eje embrionario (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) suplementado con 30 mg/L de higromicina donde permanecieron durante 7 días a 26 °C en oscuridad. Los ejes elongados supervivientes se transfirieron a placas con medio de regeneración adventicia (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) suplementado con higromicina a 30 mg/L donde permanecieron durante 2 semanas a la temperatura de 26 °C y con fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Una vez superadas las dos semanas en medio de regeneración adventicia con higromicina, se procedió a retirar la higromicina del medio e incubar los ejes en las mismas condiciones hasta obtener ejes laterales. Los ejes laterales fueron diseccionados e incubados en tubos con medio de propagación hasta obtener ejes de al menos 2.5 cm de longitud. Una vez obtenidos, los ejes siguieron el Materiales y métodos 75 mismo tratamiento que en la regeneración directa descrita en el apartado anterior hasta llevarlos a tierra. 2.2.8.2.3. Selección de plantas transgénicas. Una vez se obtuvieron plantas transformadas se extrajo su ADN (Materiales y métodos ap. 2.1.1.4.) se realizaron pruebas de PCR (Materiales y métodos ap. 2.1.3.1.) para los distintos transgénicos obtenidos. Los oligonucleótidos usados se detallan en el Anexo 1. En el caso de las plantas a las que se aplicó CRISPR/Cas9, su ADN se trató con las enzimas de restricción seleccionadas para cada diana (Materiales y métodos ap. 2.1.7.2.2.) para después realizar una amplificación por PCR. La banda resultante se envió al servicio de secuenciación (Materiales y métodos ap. 2.1.6.3.) para verificar la presencia de mutaciones en el sitio de restricción. También se enviaron bandas de PCR obtenidas a partir de ADN no tratado con enzimas de restricción para aquellos casos en los que la mutación provocada por Cas9 no coincidiese con el sitio de restricción de las enzimas. 2.2.9. Ensayo de actividad GUS histoquímico. La caracterización histoquímica de tejidos transformados se llevó a cabo mediante la incubación del tejido en una solución de ensayo GUS histoquímico (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) (Jefferson et al., 1987). Se aplicó un leve vacío con el fin de que la solución llegase a todas las células para después incubar el tejido toda la noche a 37 °C en oscuridad y con agitación (220 rpm), sumergido en la solución descrita. Posteriormente el tejido se transfirió a una solución al 70 % (v/v) de etanol y agua destilada y se incubó una noche más a 37 °C y 220 rpm. Finalmente la muestra se conservó en una solución de etanol:glicerol al 50 % a 4 °C. 2.2.10. Ensayo de actividad GUS fluorimétrico. La actividad GUS también se midió en semillas transformadas de forma transitoria siguiendo el ensayo de actividad GUS fluorimétrico (Jefferson, 1987). Para llevar a cabo el ensayo se pesaron entre 50-100 mg de endospermo que fueron homogeneizados en tubos de microcentrífuga en un volumen de 0.5 mL de tampón de extracción de ensayo GUS fluorimétrico enfríado sobre hielo (Materiales y métodos ap. 1.3.1.). Los homogenados resultantes fueron centrifugados a 13000 x g durante 20 min a 4 °C. Los sobrenadantes se recuperaron y se ensayó la actividad GUS en ellos. El medio de ensayo consistió en un volumen de 225 µL de de ácido 4-trifluorometillumbeliferril-β-D- glucurónico 0.6 mM en tampón de extracción con 50 µL de cada sobrenadante. La mezcla se Materiales y métodos 76 incubó a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente se tomaron alícuotas de 25 µL que se mezclaron con 225 µL de Na2CO3 0.2M en una placa de lectura de fluorescencia. La fluorescencia emitida fue detectada con el escáner de multifluorescencia Fluoroskan Ascent (Thermo Fisher) usando el par de absorbancia de 355/460 nm. La actividad fue medida en base a la fluorescencia emitida por peso fresco. Las actividades se calcularon empleándose una recta de calibración previamente establecida con diferentes concentraciones de 4-metil umbeliferona. 2.3. Técnicas bioquímicas. 2.3.7. Extracción de lípidos totales. Para la extracción de lípidos totales de la semilla de ricino se usó el método Hara- Radin (Hara & Radin, 1978). Para ello se añadieron 6ml de una mezcla 3:2 (v/v) de hexano/isopropanol a la semilla de ricino sin cáscara y previamente pesada. La semilla de trituró para después calentarse a 80 °C durante 10 minutos. No se sometieron a 80 °C aquellas muestras en las que se quería cuantificar ácidos grasos epoxidados. Una vez frío se añadieron 3 mL de Na2SO4 al 6.7 % (p/v) y se agitó vigorosamente para después centrifugar durante 10 min a 1000 rpm. Se extrajo la fase superior y se depositó en un tubo limpio. El residuo acuoso se volvió a extraer con 4.5 mL de una mezcla 7:2 (v/v) de hexano/isopropanol y se volvió a centrifugar. Se recuperó la fase superior que se combinó con la fase orgánica extraída anteriormente. 2.3.8. Metilación de muestras. La metilación consiste en la formación de ésteres metílicos a partir de ácidos grasos mediante el proceso de transesterificación. Para ello se añadieron 2 mL de mezcla de metilar (Materiales y métodos 1.3.2.) a 2 mg de aceite a los que se añadieron previamente 0.25 mg del patrón interno triheptadecanoína (THD). La reacción tuvo lugar a 90°C durante 1 hora. En aquellos casos en los que no podía someterse la muestra a altas temperaturas, la metilación se llevó a cabo en frío con 2 mL de KOH 2 M en metanol durante 15 minutos. Los ésteres metílicos fueron recogidos en 2 mL de heptano los cuales se evaporaron en atmósfera de nitrógeno. 2.3.9. Silanización de ésteres metílicos de ácidos grasos hidroxilados. Para el análisis en cromatografía de gases de las muestras que contenían ácidos grasos hidroxilados, se llevó a cabo una silanización previa de las mismas. Tras esta reacción los ésteres metílicos de los ácidos grasos hidroxilados se transforman en sus correspondientes Materiales y métodos 77 trimetilsilil derivados. Para ello, la disolución de ésteres metílicos en hexano o heptano obtenida en el apartado anterior se evaporó bajo corriente de nitrógeno. A continuación, el residuo seco se trató con un volumen de 100 µL de mezcla de silanizar consistente en una mezcla de clorotrimetil silano, hexametil disilazano y piridina seca en una proporción de 0.5:2:6 (v/v/v) al residuo de ésteres metílicos. La mezcla se dejó reaccionar durante 30 min a temperatura ambiente, tras lo cual se añadieron 2 mL de heptano y se procedió al análisis mediante cromatografía de gases. 2.3.10. Análisis de la composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases (GC). Los ésteres metílicos se analizaron mediante cromatografía gaseosa en un cromatógrafo Agilent Technologies (California) 6890 Series GC System, con una columna capilar de sílice fundida Quadrex (30m de longitud, 0.25 mm de luz interna y 0.1 µm de grosor) y un detector de ionización de llama. El gas portador fue nitrógeno con un flujo de 40 ml/min. La temperatura del detector fue de 220 °C, la del inyector fue de 200 °C, la temperatura del horno 180 °C y la razón de división de la muestra (“Split”) 1:20, siendo el tiempo para cada análisis de 20 min. Se utilizó una rampa de presión empezando a 80 KPa durante 4 min y se fue aumentando la velocidad de 10 en 10 KPa/min hasta llegar a 100 KPa/min. Por último, se llegó a 220 KPa/min aumentando la velocidad de 30 en 30 KPa/min. La identificación de los picos cromatográficos correspondientes a los ácidos grasos se determinó por comparación de patrones conocidos. 2.3.11. Análisis de acil-CoAs. Los acil-CoAs fueron extraídos de la semilla en desarrollo y derivatizados a sus correspondientes acil-eteno siguiendo el método de Larson y Graham (2001). Se pesaron 150- 250 mg de endospermo y se trituraron en un tubo de microcentrífuga después de añadir 1 nmol de heptadecanoil-CoA como patrón interno y 250 µL de tampón de extracción para acil CoA (Materiales y métodos ap. 1.3.2.). El tejido fue triturado con la ayuda de una micromaza y los lípidos fueron extraídos 3 veces en 200 µL de hexano saturado con isopropanol y agua. Posteriormente se añadieron 5µL de una disolución saturada de sulfato de amonio, las proteínas fueron precipitadas añadiendo 600 µL de una mezcla 2:1 (v,v) de metanol/cloroformo. Los tubos fueron agitados y centrifugados a 13000rpm durante 2 min. Los sobrenadantes fueron transferidos a tubos limpios y evaporados en atmósfera de nitrógeno a 40 °C. Los residuos secos fueron disueltos en 40 µL de cloracetaldehído (0.5 M de Materiales y métodos 78 cloracetaldehído disuelto en 0.15 M de un tampón ácido cítrico/citrato pH 4, 0.5 % (p/v) de SDS) y sometido a análisis por HPLC. Los acil-CoA eteno derivados fueron analizados en un módulo de separación Waters 2695 dotado de una columna XBridge C18 (250 x 0.5 mm, 5µm de luz; Waters) y un detector de fluorescencia Multi λ 2475 (Waters) usando una versión modificada del sistema de gradiente cuaternario descrito por Larson y Graham (2001). Los disolventes consistieron en A: ácido acético al 1 %; B: 90 % acetonitrilo, ácido acético al 1%; C: 0.25 %, trimetilamina, 0.1 % de tetrahidrofurano; D: 90 % acetonitrilo. El flujo fue de 0.75 mL/min y la temperatura de análisis 40 °C. El perfil del gradiente de elución se recoge en la tabla 7: Tabla 7. Perfil del gradiente utilizado para el análisis de acil-CoA. Tiempo Composición inicial Composición final 0 – 7.0 min 90: 10 A – B 20: 80 A– B 7.0 – 7.1 min 20: 80 A – B 20: 80 B – C 7.1 – 9.0 min 20: 80 B – C 90: 10 C – D 9.0 – 34.0 min 90: 10 C - D 25: 75 C - D 34.0 - 35.0 min 25: 75 C – D 100 D 35.0 – 39.0 min 100 D 100 D 39.0 – 40.0 min D 100 90: 10 A– B 40.0 - 45.0 min 90: 10 A – B 90: 10 A – B El detector fue fijado con una longitud de onda de excitación de 230 nm y una detección de 420 nm. Los picos se cuantificaron atendiendo a la señal de un patrón interno. Los datos se procesaron utilizando el software Empower Login. Los acil-CoAs no comerciales como el ricinoleil-CoA fueron preparados por medio de la reacción con éster de N-hidroxisuccinamida y ácidos grasos con coenzima A reducida, tal y como está descrito por Al-Arif y Blecher (1969). 2.3.12. Producción de sustratos radioactivos En el presente trabajo se investigó la capacidad de la maquinaria biosintética del ricino para acumular ácidos grasos inusuales en forma de TAG. Para ello se realizaron incubaciones de microsomas de semilla en desarrollo con distintos precursores radioactivos. Algunos de estos precursores no eran comerciales y tuvieron que ser preparados en el laboratorio. Materiales y métodos 79 2.3.12.1. Preparación de ácido lesquerólico radioactivo ([1- 14C]20:1∆11c∆14hydroxy) El ácido lesquerólico marcado se preparó a partir de ácido ricinoleico comercial (Sigma- Aldrich) empleando una modificación del método de Baumann y Mangold (1968). Este proceso implicó dos ciclos de elongación de la cadena del ácido ricinoleico que consisten en la reducción del precursor con AlLiH4, la producción de un derivado mesilado, la cianuración del mesilo para producir un nitrilo y la hidrólisis del nitrilo para dar lugar a un éster metílico con un carbono más en su cadena. En este caso, el primer ciclo de elongación se llevó a cabo en la escala de 1 g con reactantes fríos. El segundo ciclo se llevó a cabo de igual manera, pero realizando los dos últimos pasos en la escala de microgramos y utilizando cianuro marcado radioactivamente ([14C]KCN). En el primer ciclo de elongaciones las reacciones se llevaron a cabo de la siguiente forma: a) Reducción del ricinoleico. Una cantidad de 1 g de ácido ricinoleico se disolvió en 50 mL de éter etílico anhidro. A continuación, se añadió un exceso de H4AlLi con agitación continua hasta cese de burbujeo de hidrógeno. Entonces se dejó finalizar la reacción en la campana de extracción durante dos horas más. En ese punto se añadió gota a gota y con agitación continua una disolución acuosa de HCl 1M hasta la formación de dos fases. Una vez se comprobó el pH ácido de la fase inferior se procedió a su separación en un embudo de decantación. La fase etérea se secó con sulfato sódico anhidro y se evaporó en rotavapor, resultando un residuo aceitoso correspondiente al derivado dihidroxilado del ácido ricinoleico. b) Mesilación del dialcohol. Una cantidad de 1 g aproximadamente del dialcohol resultante de la etapa anterior se disolvió en 25 mL de diclorometano conteniendo 0.75 mL de trietilamina (TEA) y se hizo reaccionar con 3.2 mL de cloruro de mesilo (cloruro de metansulfonilo) por 2h a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de reacción se extrajo 3 veces con una disolución 0.5 M de HCl para eliminar la TEA y se evaporó a sequedad bajo corriente de nitrógeno en una campana de gases. c) Cianuración del mesilato. El derivado mesilado resultante del paso anterior se sometió a cianuración para la formación del correspondiente nitrilo. La reacción de cianuración consistió en 1 g de mesilato en un volumen de 50 mL de dimetilsulfóxido (DMSO)/agua 25:1 donde previamente se habían disuelto 1.0 g de KCN. La reacción se llevó a cabo durante 16 h a 80 °C. A continuación, el nitrilo se extrajo mediante 3 extracciones con 2 mL de hexano. 87 IV. RESULTADOS Resultados. Capítulo 1 89 Capítulo 1: Desarrollo de un método de transformación transitoria en ricino. 1. Aplicación de un protocolo de transformación transitoria in vitro de la semilla de ricino. Para alcanzar los objetivos planteados en este proyecto se pusieron a punto protocolos de transformación transitoria de endospermo de ricino. Estos protocolos permitirían comprobar la efectividad de diferentes construcciones antes de proceder a la transformación permanente de las plantas, la cual implica procedimientos más largos y dificultosos. El primer método por el que se optó fue el método de transformación transitoria in vitro usando A. tumefaciens asistido por sonicación (SAAT), descrito por Chileh et al. (2010) (Materiales y métodos ap. 2.1.9.1.2.). Se tomaron frutos de entre 40-50 DAP y se diseccionaron en condiciones de esterilidad. Se tomaron 30 semillas para llevar a cabo una prueba preliminar. Las semillas diseccionadas se sometieron al método de transformación descrito en materiales y métodos, se utilizó el plásmido pCambia 1305.1 para evaluar el nivel de transformación de la semilla. Tras 5 días de incubación (2 días de co-cultivo con Agrobacterium y 3 sin Agrobacterium) se realizó un ensayo de actividad GUS histoquímico (Materiales y métodos ap. 2.1.10.). Los resultados se muestran en la figura 34. Los resultados en esta prueba preliminar mostraban una necrosis considerable en la semilla después de los 5 días de incubación. A este aspecto, se une la ardua tarea de la disección de frutos en esterilidad, con la ayuda de escalpelo y pinzas, y el alto riesgo de contaminación que presenta el método. Por todo ello, se decidió abandonar el protocolo de transformación in vitro y se decidió optar por un procedimiento alternativo. Resultados. Capítulo 1 90 Figura 34. Semillas transformadas in vitro mediante A. tumefaciens asistido por sonicación. . 2. Aplicación de un protocolo de transformación transitoria in vivo de la semilla de ricino. 2.1. Resultados de las pruebas preliminares. En vista de los resultados mostrados en el apartado anterior se decidió optar un método en el que las semillas pudiesen seguir desarrollándose y que fuese más rápido y simple. El método elegido fue la agroinfiltración in planta del fruto de ricino en desarrollo. Este es un método que ya se ha puesto a punto en otras especies (Introducción ap. 4.4.1.2.). En primer lugar, se llevó a cabo un ensayo preliminar en el que se infiltró A. tumefaciens suspendido a una D.O.600 de 0.2 en una solución de infiltración con aditivos específicos (Materiales y métodos ap. 2.1.9.1.1.). Para la infiltración se tomaron 300µL de suspensión y se inyectaron con una aguja hipodérmica de 0.33mm de luz directamente en el endospermo de la semilla, atravesando todo el fruto y la envoltura de la semilla. El plásmido usado en la transformación fue pCambia 1305.1. El fruto infiltrado se mantuvo durante 3 días en la planta para después realizar un ensayo histoquímico de GUS. El ensayo de GUS reveló un nivel mayor de transformación en la semilla y era más homogéneo (Figura 35 C y D) que con el método anterior. Además, no afectaba Resultados. Capítulo 1 91 exclusivamente al endospermo, sino que además afecta a órganos adyacentes como son el propio fruto (exocarpio, mesocarpio y epicarpio) (Figura 35 A) y la carúncula (Figura 35 B). Figura 35. Resultado preliminar de la infiltración in vivo del fruto de ricino. Además de la semilla, se transformaron tejidos adyacentes como el fruto (A) y la carúncula (B). El nivel de la actividad GUS de marcaje fue muy alto en el endospermo (C, D). Ante este resultado preliminar se optó por la puesta a punto del protocolo para su adopción como método de transformación transitoria en ricino que permita la evaluación de los diseños genéticos para su posterior transformación estable. 2.2. Puesta a punto del método de agroinfiltración in vivo de la semilla de ricino. 2.2.1. Elección del momento de infiltración y tasa de transformación. Uno de los aspectos cruciales para el éxito de este fue el momento de infiltración. Se observó que algunas infecciones de Agrobacterium terminaban induciendo una alta tasa de abortos en la semilla, por lo que se decidió evaluar el momento correcto de infiltración. Para ello se infiltraron 30 semillas en distintos estadios de desarrollo: 20-30 DAP, 30-40 DAP, 40-50 DAP y 50-60 DAP. Las semillas se recolectaron tras 5 días después de la infiltración (DAI), 10 DAI y 20 DAI. Los resultados revelaron que las semillas infiltradas entre 20-40 DAP sufrían una tasa elevada de abortos, sobre todo las infiltradas entre 20-30 DAP cuya tasa de aborto fue del 100 % si se recolectaban a los 20 DAI. El 50 % de las semillas infiltradas en 30-40 DAP abortaron en 5 DAI, este porcentaje se redujo al 20 % infiltrando a 40-50 DAP. Por otra parte, la tasa de abortos de semillas recogidas a 20 DAI se reducía del 90% al 60 % entre 30-40 DAP y 40-50 DAP. Las semillas infiltradas en 50-60 DAP presentaron la menor tasa de abortos tanto en 5, 10 como en 20 DAI (Figura 36). Resultados. Capítulo 1 92 Figura 36. Tasa de abortos de la semilla en función del momento de infiltración. Cada color representa el momento de recolección de la semilla. Atendiendo a los resultados obtenidos, se optó por infiltrar la semilla a 40-50 DAP en los estudios posteriores. En este punto, se investigó la tasa de transformación de las semillas infiltradas que sobrevivieron en dicho periodo para asegurar la validez del método. Este parámetro se calculó como la relación entre el número de semillas transformadas frente al total de infiltradas no abortadas (Figura 37). Las semillas fueron infiltradas a 40-50 DAP y recuperadas tras 5, 10 y 20 DAI. Las semillas contadas para 5, 10 y 20 DAI fueron 80, 72 y 76, respectivamente. Se comprobó que la tasa de transformación de las mismas fue del aproximadamente 70 % y que este porcentaje no presentó una gran variación entre los 3 estadios de recolección, aunque se observa una tendencia a la disminución a medida que aumenta el tiempo de desarrollo después de la infiltración. Resultados. Capítulo 1 93 Figura 37. Tasa de transformación en semillas no abortadas utilizando el método de agroinfiltración in vivo. Las barras muestran el número de semillas transformadas respecto al número de semillas no abortadas. Todas las semillas fueron transformadas en 40-50 DAP y recolectadas en 5, 10 y 20 DAI 2.2.2. Influencia del promotor en el nivel de expresión del marcador GUS en ricino. Ensayo histoquímico. Como prueba adicional para evaluar la transformación y el nivel de expresión de los diferentes promotores las semillas infiltradas con Agrobacterium fueron sometidas al ensayo histoquímico de GUS a distintos DAI. Los resultados se muestran en la figura 38. En los paneles A, B y C de esta figura se muestran las imágenes de las semillas infiltradas con el plásmido pCambia 1305.1 en el que el marcador GUS se encuentra regulado por el promotor 35S. En los paneles D, E y F se muestran las semillas que fueron transformadas con el plásmido pCambia en el que el marcador GUS se encuentra regulado por el promotor pGly. En el panel G, H e I se muestran las semillas que fueron transformadas por pCambia::nulo sin ningún promotor regulador del marcador GUS. Finalmente, el panel J, K y L muestra las semillas que no fueron infiltradas, pero si sometidas a ensayo GUS histoquímico (Figura 38). En las semillas A-F observamos una fuerte expresión del marcador GUS en el endospermo, que contrasta con la leve tinción que se registró en las semillas sin promotor, G, H y I. Cabe Resultados. Capítulo 1 94 destacar, que de manera acorde a los resultados de fluorimetría, las semillas con el marcador GUS bajo el control de pGly (D, E y F) presentaron una tinción más intensa que las que lo tuvieron bajo el control del promotor 35S (A, B y C). Las semillas no infiltradas, J, K y L, apenas presentaron actividad β-glucuronidasa, solo en algunos casos se observó una leve actividad residual. La transformación también pudo observarse en el eje embrionario y en los cotiledones en muchos casos. Figura 38. Resultado del ensayo GUS histoquímico para semillas infiltradas mediante agroinfiltración in vivo. A, B y C son semillas transformadas con pCambia 1305.1 con promotor 35S regulado al gen GUS. Las semillas D, E y F con pCambia con el promotor pGly regulando al gen GUS. Las semillas G, H e I fueron infiltradas con pCambia::nulo sin promotor que regulase a GUS. Finalmente, las semillas J, K y L no fueron infiltradas. Resultados. Capítulo 1 95 2.1.1. Influencia de distintos promotores en el nivel de expresión de transgenes en ricino. Estudios estudios cuantitativos. En un segundo paso se decidió evaluar cuantitativamente diferentes promotores y con el nuevo protocolo de expresión transitoria en semillas de ricino en desarrollo. Los promotores elegidos para su evaluación fueron el promotor del virus del mosaico de la coliflor, p35S, un promotor constitutivo de fuerte expresión, y el promotor pGly de soja un promotor de expresión fuerte específico de semillas que no se expresa en otros tejidos. El uso de pGly supone la ventaja de no afectar el desarrollo vegetativo de la planta si finalmente se usase para las expresiones estables de ricino. El control para los ensayos fue el plásmido pCambia::nulo que no presenta ningún promotor regulando a GUS (Materiales y métodos ap. 2.1.7.1.4.) La infiltración de Agrobacterium con los plásmidos citados se llevó a cabo en 30 semillas para cada promotor. Las semillas fueron infiltradas entre 40-50 DAP y recogidas a 5, 10 y 20 DAI. Finalmente, la expresión de GUS bajo cada promotor se evaluó mediante PCR cuantitativa (Materiales y métodos ap. 2.1.3.2.). Los resultados mostraron una expresión extremadamente fuerte del promotor 35S a los 5 días después de la infiltración, sin embargo, esta expresión cae de forma rápida a los 10 DAI y 20 DAI. La expresión de GUS con promotor pGly fue significativamente menor, aunque se mantuvo constante entre 5, 10 y 20 DAI. (Figura 39 A) Paralelamente, se analizó la actividad de la GUS expresada bajo cada uno de los promotores mencionados. Esta actividad se analizó mediante el ensayo GUS fluorimétrico (Materiales y métodos ap., 2.1.10). (Figura 39B) El ensayo GUS fluorimétrico mostró, en contra de lo observado en el resultado de la expresión cuantitativa, más actividad de la enzima GUS reportadora cuando su expresión se encuentra regulada por el promotor de pGly que cuando se encuentra regulada con el promotor 35S. Además, la actividad de GUS aumenta de 5 DAI a 10 DAI para después volver a decaer a 20 DAI. En el caso de la actividad GUS bajo el promotor 35S, ésta se mantuvo prácticamente estable entre 5,10 y 20 DAI, aunque se observa una tendencia al aumento de la actividad hasta 20 DAI. Resultados. Capítulo 2 102 CRISPR/Cas9 nunca mostraron un contenido de ácido ricinoleico al mismo nivel que en las semillas transformadas con el vector sin esta construcción. Si bien en 5 DAI y 10 DAI la dispersión estadística de las composiciones es grande, ésta se reduce reduce a 20DAI, donde sí se encontraron diferencias significativas donde se observó una proporción de ácido ricinoleico de entre un 30-40% frente al 80-90% de la semilla transformada con el vector pCambia 1305.1. La disminución de la proporción de ácido ricinoleico tuvo lugar a expensas del crecimiento de la proporción del resto de especies de ácidos grasos, especialmente el ácido linoleico. Figura 46. Resultado del análisis de composición de ácidos grasos para las semillas transformadas con pCambia 1305.1, pCambia::hpFAH12 y pCambia::CRISPR FAH12. Las semillas fueron transformadas mediante agroinfiltración in vivo. Las letras sobre las barras indican diferencias significativas, el test estadístico usado fue t-student p<0.01. DAI: días después de la infiltración. Resultados. Capítulo 2 103 2. Producción de ácidos grasos hidroxilados de cadena larga: síntesis de ácido lesquerólico. Para la síntesis de ácido lesquerólico en la semilla de ricino se utilizó el gen de una enzima elongasa de Lesquerella fendlerei LfKCS3 (Introducción ap. 2.1.7.1.2). Para la sobrexpresión de este gen se usó el promotor pGly descrito previamente. Como control, se usaron semillas agroinfiltradas y transformadas con pCambia 1305.1. Un total de 20 semillas fueron agroinfiltradas y recuperadas a 5, 10 y 20 DAI. Las semillas se diseccionaron de forma longitudinal, la mitad del endospermo se destinó a ensayo GUS histoquímico y la otra mitad a análisis de composición de ácidos grasos. Se seleccionaron 9 semillas, tres para cada momento de recolección. Un trozo de endospermo se destinó a la extracción de ARN del cual se obtuvo el ADNc (Materiales y métodos ap. 2.1.1.2.). Para comprobar la expresión del gen LfKCS3 y de GUS se llevó a cabo una PCR con oligonucleótidos específicos sobre el ADNc obtenido, el cual se trató previamente para eliminar restos de ADN genómico (Materiales y métodos ap. 2.1.1.2.). Todas las semillas seleccionadas expresaron el gen de la elongasa (Figura 47). Como control negativo se utilizaron semillas WT sin transformar. El ensayo GUS histoquímico reveló la transformación irregular del endospermo de las semillas (Figura 48). Figura 47. Expresión de los genes que codifican la enzima LfKCS3 y GUS en semillas de ricino transformadas. . Resultados. Capítulo 2 104 En el análisis de la composición de ácidos grasos se observó un aumento significativo de ácido lesquerólico con respecto al control a 5 y 10 DAI. Sin embargo, este aumento se perdió a 20 DAI. Aunque la diferencia entre la composición de semillas infiltradas con pCambia 1305.1 y pCambia::LfKCS3 fue significativa, el aumento de ácido lesquerólico llegó a representar un porcentaje muy bajo en la composición total de ácidos grasos, 0.5 % a 5 DAI y 0.4% a 10 DAI (Figura 49). Figura 49. Composición de ácidos grasos en semillas transformadas con pCambia::LfKCS3 y pCambia 1305.1. Las semillas fueron transformadas a 40-50 dias después de la polinización. Las letras sobre las barras de error indican diferencias estadísticamente significativas, t-student p>0.01. DAI: días después de la infiltración. . Dado que el sustrato de la enzima LfKCS3 es el ricinoleil-CoA, se decidió cuantificar la disponibilidad del mismo en el conjunto de acil-CoAs. Los resultados se muestran en la figura 50. La cantidad de ricinoleil-CoA en el conjunto de acil-CoAs fue muy baja en comparación con otros acil-CoA. Palmitoil-CoA y estearil-CoA fueron los acil-CoA más abundantes. Figura 48. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia::LfKCS3. Resultados. Capítulo 2 105 Figura 50. Composición del conjunto de acil-CoAs durante el desarrollo de la semilla de ricino. 3. Producción de ácidos grasos epoxidados en semillas de ricino. Para la síntesis de ácidos grasos epoxidados se recurrió a la sobreexpresión del gen de la enzima epoxigenasa de Stokesia laevis, SlEPX (codones optimizados de la secuencia AY462108; Anexo II) usando el promotor pGly como regulador. Acompañando a este gen se clonó en el mismo plásmido la estructura hpFAH12 para el silenciamiento del gen de la hidroxilasa de ricino con la intención de reducir el contenido de 18:1OH en la semilla y que se viesen incrementadas las proporciones de los ácidos grasos 18:1Δ9 y 18:2Δ9,12, ya que éste último es el sustrato de la epoxigenasa. El diseño de estas construcciones y su ensamblaje se describen en materiales y métodos ap. 2.1.7.2.1. La transformación transitoria de las semillas se llevó a cabo mediante agroinfiltración de semillas a 40-50 DAP y su recolección se realizó a 5, 10 y 20 DAI. Se infiltraron un total de 20 semillas de las cuales se seleccionaron 9, tres para cada estadio de recolección, obedeciendo al resultado del ensayo GUS histoquímico. Las semillas seleccionadas aparecen en la figura 51. Resultados. Capítulo 2 106 Figura 51. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia 1305.1::SlEPX::hpFAH12. La otra mitad de la semilla de destinó al análisis de la composición de ácidos grasos. Los resultados de la composición de ácidos grasos no mostraron la presencia de ácidos grasos epoxidados, no obstante, se apreció una disminución del contenido en ácido ricinoleico en comparación con las semillas control (transformadas con el plásmido pCambia 1305.1 (Figura 52)), confirmando los resultados que ya habíamos obtenido en experimentos anteriores. Resultados. Capítulo 2 107 Figura 52. Análisis de composición de ácidos grasos para semillas transformadas con pCambia::SlEPX::hpFAH12 y pCambia 1305.1. No se observó la formación de ácidos grasos epoxidados. Las letras sobre las barras indican diferencias significativas, t-student p<0.01. DAI: días después de la infiltración. La disminución de ácido ricinoleico fue bastante fuerte en 5 DAI. Además, se observó una disminución de ácido ricinoleico significativa en 20 DAI acompañada de una acumulación de ácido linoleico (18:2 Δ9,12) (Figura 52). Resultados. Capítulo 3 109 Capítulo 3: Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable. Generación de plantas transgénicas. 1. Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable. La puesta a punto de un protocolo eficiente y repetitivo que permita la obtención de plantas transgénicas estables de ricino es uno de los objetivos principales del proyecto. Para lograrlo, fue necesario la combinación de un protocolo de transformación y un protocolo de regeneración in vitro. El eje embrionario fue el tejido usado tanto para la transformación como para la regeneración in vitro. 1.1. Ensayo de eficiencia de transformación de embriones mediante SAAT. La transformación de los ejes embrionarios se llevó a cabo mediante la técnica SAAT (Materiales y métodos ap. 2.1.9.1.2.) Con esta técnica, 30 ejes embrionarios fueron diseccionados de la semilla en condiciones de esterilidad. Los embriones fueron sumergidos en una solución de Agrobacterium D.O.600=0.2 para posteriormente ser sonicados. El plásmido usado para la transformación fue pCambia1305.1. Una vez transformados, los embriones permanecieron en periodo de co-cultivo durante dos días en una placa con medio de transformación sólido (Materiales y métodos ap. 1.3.1). Tras el periodo de co-cultivo, los embriones se incubaron en una placa con medio MS-sacarosa (Materiales y métodos ap. 1.3.1) durante un día más, previamente fueron lavados con agua destilada autoclavada y secados en una gasa estéril. Finalmente, los ejes embrionarios se recuperaron y se sometieron a ensayo de actividad GUS histoquímico para evaluar el número de embriones y el área transformada (Figura 53). El ensayo GUS mostró que 9 embriones de los 30 analizados (30%) presentaron actividad GUS en todo el embrión o al menos en la zona apical. Resultados. Capítulo 3 110 Figura 53. Resultado del ensayo GUS histoquímico en embriones de ricino transformados empleando el método de transformación con agrobacterium asistida por ultrasonidos (SAAT). 1.2. Puesta a punto de un protocolo de regeneración estable. La regeneración de los embriones transformados puede llevarse a cabo de dos formas diferentes. Mediante el procedimiento de regeneración directa o por regeneración adventicia. Todos los explantos fueron incubados a 26 °C de temperatura con un fotoperiodo de 16h luz/8h oscuridad a menos que se indique que la incubación se realizara exclusivamente en oscuridad. A continuación, se exponen los resultados de los ensayos de optimización del método desarrollado en esta tesis. 1.2.1. Imbibición de la semilla de ricino: un aspecto fundamental en la germinación del embrión. Para que el embrión de ricino se desarrolle es necesario someter a la semilla a un proceso de imbibición a una temperatura determinada. Así, se llevaron a cabo ensayos de germinación a diferentes temperaturas para periodos de imbibición de 1 y 2 días (tabla 8). Las semillas se sometieron a temperaturas de 15 °C y 26 °C. El número embriones desarrollados fue mayor en aquellas semillas incubadas a 26 °C. El número de embriones germinados disminuyó al disminuir la temperatura de imbibición. Se usaron 100 semillas para cada ensayo. Tabla 8. N° de embriones germinados in vitro, de los 100 ensayados, en función de la temperatura y el tiempo de imbibición. 1 DÍA 2 DÍAS 16°C 70 77 26°C 89 95 Resultados. Capítulo 3 111 1.2.2. Protocolo de transformación-regeneración directa. El método de transformación-regeneración directa puede dividirse en 6 puntos (Figura 54): 1) Disección del embrión, transformación mediante SAAT y co-cultivo en medio MS- sacarosa sólido de transformación durante un día (Materiales y métodos ap. 2.1.9.2.1) en oscuridad. 2) Germinación de los embriones. Durante 9 días los embriones, previamente lavados con agua destilada y secados con gasa estéril, se germinan sobre MS-sacarosa en presencia de higromicina (Materiales y métodos ap. 2.1.9.2.1). 3) Eliminación de la radícula y generación de brotes a partir del hipocótilo. En este estadio, el hipocótilo generará brotes que pueden provenir del meristemo apical (brotes principales) o de meristemos laterales del hipocótilo (brotes adventicios). Los brotes principales surgen en las 3 primeras semanas de incubación. Posteriormente, si la incubación con hormonas se prolonga, aparecen brotes adventicios paralelos al brote principal. Este paso puede durar entre 2 y 8 semanas. El medio de propagación (Materiales y métodos ap. 1.3.1) debe ser refrescado cada dos semanas. 4) Una vez los brotes alcanzaron un tamaño de más de 2.5 cm se transfieren a medio líquido de enraizamiento (Materiales y métodos ap. 1.3.1) donde permanecerán 3 días en agitación. 5) Posteriormente, los brotes se transfieren a medio MS con sacarosa sólido y sin reguladores hormonales. Tras 1-3 semanas de incubación aparecen raíces. 6) Las plántulas se transfieren a sustrato de turba. El proceso de aclimatación comienza con una humedad inicial del 70 % para disminuir posteriormente hasta un 40 %. English version 214 Table 3. Survival shoots in each stage in transformation using the direct regeneration protocol. A high number of contamination appeared between stage 5 and 6, causing a fall in the number of final explants. Figure 25. pCambia 1305.1 transgenic plants obtained by direct transformation-regeneration. First, plant was acclimated to soil with a high initial humidity (A) that gradually was lowered in a culture chamber (B). Lateral axes allowed the propagation of the adult plant (C). Finally, two Stage 1 Stage 2 + Hygromycin Stage 3 2 weeks with hygromycin Stage 3 Without hygromycin Stage 4 Stage 5 Stage 6 Assay 1 100 54 31 21 17 11 0 Assay 2 100 32 20 13 9 9 1 Assay 3 100 50 25 15 10 10 0 Av 100.00 45.33 25.33 16.33 12.00 10.00 0.33 Error 0.00 11.72 5.51 4.16 4.36 1.00 0.58 English version 215 plants, D and E, were obtained. Figure 27. Oil composition (A) and oil content (B) of WT and pCambia 1305.1 transgenic seeds. Lowercase letters indicate statistical differences, t-student p<0,01. Figure 26. PCR product of pCambia 1305.1 transgenic plants targeting the GUS marker (A) and HYGR (B ) gene. English version 216 Figure 28. Transgenic pCambia::hpFAH12 plant. hpFAH12 induces gene silencing in castor hydroxylase. Figure 29. Genomic DNA PCR product in plant expressing pCambia::hpFAH12 construct targeting GUS marker (A) and hpFAH12 genes between intron and antisense arm (B & C). English version 217 Figure 30. pCambia::hpFAH12 seed weight distribution. Seeds collected were separated in two populations well differentiated (A). Each population showed distributions with different average (B and C). Seeds were divided by 50% for each group. . English version 218 Figure 32. PCR product showing the presence of hpFAH12 intron and GUS marker in 6 transgenic seeds Figure 31. Average weight of each group of seeds transformed with pCambia1305.1::hpFAH12. Different letters indicate statistical differences, tstudent p>0.01 English version 219 Figure 33. Oil composition of pCambia::hpFAH12 and pCambia1305.1 transgenic seeds (A) and oil content (B) of WT, pCambia::hpFAH12 and pCambia1305.1 seeds. Lowercase letters indicates statistical differences t-student p<0.01. A B English version 220 Figure 34. Correlation between seed weight and ricinoleic content (A) and correlation between oil content and ricinoleic content (B). Both correlations indicates the preference of castor metabolism to accumulate ricinoleic acid. A English version 221 Figure 35. PCR test for the first generation of transgenic pCambia::hpFAH12 plants. Results were the same for transgenic seeds. Figure 36. Modified CRISPR/Cas9 plant with castor hydroxylase gen as a target. Figure 37. Schematic diagram showing the CRISPR sites and the restriction sites BsrDI, Fnu4HI. Small Arrows indicated PCR primers used for mutations test. English version 222 Figure 38. PCR products after DNA digestion with BsrDI and Fnu4HI 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| *** ** * ** ***** ** *** ** ************************** *** Hidroxilasa WT GACCTCAAGAGAGCCATCCCACCCCATTGCTTTGAACGCTCTTTTGTGCGCTCATTCTCC Hidroxilasa modificada GACATCTGGTGATCCATCACAGCCCGATGGTTTGAACGCTCTTTTGTGCGCTCATTGTCC 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| * *** * * ***** * * ****** **** ************ ****** Hidroxilasa WT TATGTTGCCTATGATGTCTGCTTAAGTTTTCTTTTCTACTCGATCGCCACCAACTTCTTC Hidroxilasa modificada TGTGTGACTTCAGATGTGGGAG-AGCCAGTCTTTTATACTAGATCGCCACCAAATTCTTC 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ***************************************************** ** *** Hidroxilasa WT CCTTACATCTCTTCTCCGCTCTCGTATGTCGCTTGGCTGGTTTACTGGCTCTTCCAAGGC Hidroxilasa modificada CCTTACATCTCTTCTCCGCTCTCGTATGTCGCTTGGCTGGTTTACTGGCTCTTGCAGGGC 190 200 210 220 ....|....|....|....|....|....|....|....|... ****** ********** ************************ Hidroxilasa WT TGCATTCTCACTGGTCTTTGGGTCATCGGCCATGAATGTGGCC Hidroxilasa modificada TGCATTGTCACTGGTCTGAGGGTCATCGGCCATGAATGTGGCC Figure 39. Sequencing results in CRISPR/Cas9 modified plant. Absence of star indicates the sites of mutations in castor hydroxilase gene targets. Yellow mark indicates CRISPR targets. English version 223 Figure 40 Weight distribution in pCambia::CRISPR seeds targeting the hydroxylase FAH12 gene Seeds collected were separated in two populations well differentiated (A). Each population showed normal distribution with different average (B and C). Seeds were divided by 50% for each group. Bibliografía Bibliografía 231 Bates, P. D., Stymne, S., & Ohlrogge, J. (2013). Biochemical pathways in seed oil synthesis. Current Opinion in Plant Biology, 16(3), 358–364. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2013.02.015 Borrelli, G. M., Di Fonzo, N., & Lupotto, E. (1992). Effect of Cefotaxime on Callus Culture and Plant Regeneration in Durum Wheat. Journal of Plant Physiology, 140(3), 372–374. https://doi.org/10.1016/S0176-1617(11)81095-3 Brooks, C., Nekrasov, V., Lippman, Z. B., & Eck, J. Van. (2014). 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ANEXOS Anexo I Anexo I Oligonucleótidos utilizados para el ensamblaje de hpFAH12 Oligonucleótidos utilizados para insertar el promotor Glycinin en pCambia 1305.1 Nombre Oligonucleótido (5´->3´) pRcGLIC-Eco-F CTG GAA TTC GTA CGT ACT CAA AAT GCC AA pRcGLIC-Nco-R ATC CCATGG TTAAGGACCAATGGAGAGAA Oligonucleótidos utilizados para el ensamblaje de SlEPX mediante Loop Assembly Nombre Oligonucleótido (5´->3´) pGLY-Fw loop A KpnI GTGAAGACTGCTCAGGAGGGTACCGATCCGTACGTAAGTACG pGLY-Rv loop C GTGAAGACGTCTCGCATTCGCGGCCGCGGTGATGAC SlEPX Fw LOOPC GTGAAGACTGCTCAAATGTCAGACTCTTATGAT SlEPX Rv LOOPE GTGAAGACGTCTCGAAGCCATCTTGTGATACCAATA GlyT Fw BsaI loopE GAGGTCTCAGCTTTCGAGGCGGCCGCAGCCC GlyT Rv BamHI BsaI loopF GTGGTCTCGAGCGGGATCCTAAGTCATGAAGAACCTG Oligonucleótidos utilizados para el ensamblaje de las estructuras para CRISPR/Cas9 Nombre Oligonucleótido (5´->3´) Hydrox t1 sgRNA Fw TGTGGTCTCAATTGAGCGTTCAAAGCAATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG Hydrox t2 sgRNA Fw TGTGGTCTCAATTGACCAGTGAGAATGCAGCCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAG RicinA t1 sgRNA Fw TGTGGTCTCAATTGTTCAACTAAAATAAACCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAG RicinA t2 sgRNA Fw TGTGGTCTCAATTGCTTTCTGTTACATTAGCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA AG gRNA_AGCG_BsaI Rv TGTGGTCTCAAGCGTAATGCCAACTTTGTAC pCamb-Cas9 Fw KpnI GGTACCTGCCGAATTCGGATCCGGAG pCamb-Cas9 Fw KpnI GGTACCATGTGCATCCTCGTAAAGCG pCamb-Cas9 Rv KpnI GGTACCATGTGCATCCTCGTAAAGCG Nombre Oligonucleótido (5´->3´) ARM1_HPHIDRO_nde_afw TGCTTACATATGTCCACTGTCATAACCAGCAAC ARM1_HPHIDRO_eco_arv TAAGCAGAATTCGTGTGCGGCGCTCGCTTAAGG Arm1_SacII_sFw TGCTTACCGCGGATGTCCACTGTCATAACCAGC ARM1_HPHIDRO_XHOI_SRV TAAGCACTCGAGTTCGTGTGCGGCGCTCGCTTAAGG iFAD2_Nde_Fw GGGCATATGCGTCAGCTCCATCTCCAGGTCC iFAD2_SacII_Rv GGGCCGCGGTTTCTGCAGAAAACCAAAAGC Anexo I Oligonucleótidos utilizados para comprobar la presencia de transgenes. Nombre Oligonucleótido (5´->3´) Gus_Plus_Fw CCGCACACTATCCGTACTC Gus_Plus_Rv GTACCTGGGAGAAGATTCGG HigroR_Fw GACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCG HigroR_Rv TTCTTTGCCCTCGGACGAGTGC Cs_Fad2i_Fw ACCACAAGCAAGAGATGTGACC Ricin_Fw_CRISPR_TEST CGGTCGTTTAACAACTGGAGCTGATG Ricin_Rv_CRISPR_TEST GCATCTTCCTGATTGTCAGGATGAAA Hydrox_Fw_CRISPR_TEST CGCACACGAAGCCTCCTTTC Hydrox_Rv_CRISPR_TEST GATACTCACTAAAAGCATGATGG Cas9_Fw6 ATTCATCAGTCAATTACGGGGC Anexo II Anexo II Secuencia del intrón usado para la estructura hpFAH12. 10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TATGCGTCAGCTCCATCTCCAGGTCCGTCGCTTCTCTTCCATTTCTTCTC 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) ATTTTCGATTTTGATTCTTATTTCTTTCCAGTAGCTCCTGCTCTGTGAAT 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TTCTCCGCTCACGATAGATCTGCTTATACTCCTTACATTCAACCTTAGAT 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) CTGGTCTCGATTCTCTGTTTCTCTGTTTTTTTCTTTTGGTCGAGAATCTG 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) ATGTTTGTTTATGTTCTGTCACCATTAATAATAATGAACTCTCTCATTCA 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TACAATGATTAGTTTCTCTCGTCTACAAAACGATATGTTGCATTTTCACT 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TTTCTTCTTTTTTTCTAAGATGATTTGCTTTGACCAATTTGTTTAGATCT 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TTATTTTATTTTATTTTCTGGTGGGTTGGTGGAAATTGAAAAAAAAAAAA 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) ACAGCATAAATTGTTATTTGTTAATGTATTCATTTTTTGGCTATTTGTTC 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TGGGTAAAAATCTGCTTCTACTATTGAATCTTTCCTGGATTTTTTACTCC 510 520 530 540 550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TATTGGGTTTTTATAGTAAAAATACATAATAAAAGGAAAACAAAAGTTTT 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) ATAGATTCTCTTAAACCCCTTACGATAAAAGTTGGAATCAAAATAATTCA 610 620 630 640 650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) GGATCAGATGCTCTTTGATTGATTCAGATGCGATTACAGTTGCATGGCAA 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) ATTTTCTAGATCCGTCGTCACATTTTATTTTCTGTTTAAATATCTAAATC 710 720 730 740 750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TGATATATGATGTCGACAAATTCTGGTGGCTTATACATCACTTCAACTGT 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CsFAD2 intron (secuencia loop) TTTCTTTTGGCTTTGTTTGTCAACTTGGTTTTCAATACGATTTGTGATTT 810 820 830 840 850 Anexo II 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly promoter GAAAGAATCCAGGAAGAAAAGAAATGAAACCATGCATGGTCCCCTCGTCATCACGAGTTT 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly promoter CTGCCATTTGCAATAGAAACACTGAAACACCTTTCTCTTTGTCACTTAATTGAGATGCCG 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly promoter AAGCCACCTCACACCATGAACTTCATGAGGTGTAGCACCCAAGGCTTCCATAGCCATGCA 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly promoter TACTGAAGAATGTCTCAAGCTCAGCACCCTACTTCTGTG>ACGTGTCCCTCATTCACCTT 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly promoter CCTCTCTTCCCTATAAATAACCACGCCTCAGGTTCTCCGCTTCACAACTCAAACATTCTC 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|... Gly promoter TCCATTGGTCCTTAAACACTCATCAGTCATCACCGCGGCCGCG Secuencia Gly 3´-UTR. 10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T AGCCCTTTTTGTATGTGCTACCCCACTTTTGTCTTTTTGGCAATAGTGCT 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T AGCAACCAATAAATAATAATAATAATAATGAATAAGAAAACAAAGGCTTT 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T AGCTTGCCTTTTGTTCACTGTAAAATAATAATGTAAGTACTCTCTATAAT 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T GAGTCACGAAACTTTTGCGGGAATAAAAGGAGAAATTCCAATGAGTTTTC 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T TGTCAAATCTTCTTTTGTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTTTCTTTC 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T TTCTGAGCTTCTTGCAAAACAAAAGGCAAACAATAACGATTGGTCCAATG 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T ATAGTTAGCTTGATCGATGATATCTTTAGGAAGTGTTGGCAGGACAGGAC 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T ATGATGTAGAAGACTAAAATTGAAAGTATTGCAGACCCAATAGTTGAAGA 410 420 430 440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....| Gly-T TTAACTTTAAGAATGAAGACGTCTTATCAGGTTCTTCATGACTTA Anexo II Secuencia sgRNA. 10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| sgRNA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|... sgRNA TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT Secuencia Cas9 10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGG 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAG 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCC 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAAC 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGG 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGG 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCC 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAA 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGAC 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACA 510 520 530 540 550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAAC 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCG Anexo II 610 620 630 640 650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTC 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGA 710 720 730 740 750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCC 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAG 810 820 830 840 850 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCG 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATT 910 920 930 940 950 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCT 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada GAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTT 1010 1020 1030 1040 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATT 1060 1070 1080 1090 1100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGC 1110 1120 1130 1140 1150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGG 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGC 1210 1220 1230 1240 1250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGG 1260 1270 1280 1290 1300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGA 1310 1320 1330 1340 1350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTAC 1360 1370 1380 1390 1400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCG Anexo II 1410 1420 1430 1440 1450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CAAATCAGAAGAGACTATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATA 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAA 1510 1520 1530 1540 1550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTA 1560 1570 1580 1590 1600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGA 1610 1620 1630 1640 1650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGAC 1660 1670 1680 1690 1700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGA 1710 1720 1730 1740 1750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGG 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATC 1810 1820 1830 1840 1850 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGA 1860 1870 1880 1890 1900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada GGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAG 1910 1920 1930 1940 1950 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAG 1960 1970 1980 1990 2000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGAT 2010 2020 2030 2040 2050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTA 2060 2070 2080 2090 2100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGAC 2110 2120 2130 2140 2150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGG 2160 2170 2180 2190 2200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Anexo II Cas9 optimizada GGACAGTCTCCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCA 2210 2220 2230 2240 2250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTA 2260 2270 2280 2290 2300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAA 2310 2320 2330 2340 2350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGA 2360 2370 2380 2390 2400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCA 2410 2420 2430 2440 2450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada GTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCA 2460 2470 2480 2490 2500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada GAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCT 2510 2520 2530 2540 2550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGAT 2560 2570 2580 2590 2600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAG 2610 2620 2630 2640 2650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGC 2660 2670 2680 2690 2700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada GGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTG 2710 2720 2730 2740 2750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCAT 2760 2770 2780 2790 2800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAA 2810 2820 2830 2840 2850 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATT 2860 2870 2880 2890 2900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTTTCAGATTTCAG 2910 2920 2930 2940 2950 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATG 2960 2970 2980 2990 3000 Anexo II ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAA 3010 3020 3030 3040 3050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGA 3060 3070 3080 3090 3100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCG 3110 3120 3130 3140 3150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATT 3160 3170 3180 3190 3200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGG 3210 3220 3230 3240 3250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCC 3260 3270 3280 3290 3300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada GGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTA 3310 3320 3330 3340 3350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGA 3360 3370 3380 3390 3400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGAT 3410 3420 3430 3440 3450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAG 3460 3470 3480 3490 3500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCAC 3510 3520 3530 3540 3550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGG 3560 3570 3580 3590 3600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAG 3610 3620 3630 3640 3650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGC 3660 3670 3680 3690 3700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada GGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTA 3710 3720 3730 3740 3750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGATCTCCCGAA Anexo II 3760 3770 3780 3790 3800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada GATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGA 3810 3820 3830 3840 3850 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCG 3860 3870 3880 3890 3900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada ACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAG 3910 3920 3930 3940 3950 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAA 3960 3970 3980 3990 4000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada CTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAA 4010 4020 4030 4040 4050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAG 4060 4070 4080 4090 4100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada TCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGG 4110 4120 4130 4140 ....|....|....|....|....|....|....|....| Cas9 optimizada AGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGA