Nuevas metodologías genéticas para la evaluación del nivel de endogamia y su repercusión sobre caracteres de interés económico en la población equina "Pura Raza Española"

Nuevas Metodologías Genéticas para la Evaluación del Nivel de Endogamia y su Repercusión sobre Caracteres de Interés Económico en la Población Equina "Pura Raza Española" Tesis Doctoral 2023 Davinia Isabel Perdomo González Grupo de Investigación MERAGEM PAI AGR-273 Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica Departamento de Agronomía Universidad de Sevilla 1 Nuevas Metodologías Genéticas para la Evaluación del Nivel de Endogamia y su Repercusión sobre Caracteres de Interés Económico en la Población Equina "Pura Raza Española" TESIS DOCTORAL 2023 Davinia Isabel Perdomo González 1 3 Esta Tesis Doctoral ha sido parcialmente subvencionada a través del Proyecto Nacional AGL-2017-84217-P del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad del Gobierno de España 4 Universidad de Sevilla Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica 5 Programa de Doctorado Interuniversitario en Ingeniería Agraria, Alimentaria, Forestal y del Desarrollo Rural Línea de investigación: Producción Animal TESIS DOCTORAL “NUEVAS METODOLOGÍAS GENÉTICAS PARA LA EVALUACIÓN DEL NIVEL DE ENDOGAMIA Y SU REPERCUSIÓN SOBRE CARACTERES DE INTERÉS ECONÓMICO EN LA POBLACIÓN EQUINA "PURA RAZA ESPAÑOLA"” Autora: Davinia Isabel Perdomo González Directoras: Dra. María Mercedes Valera Córdoba Dra. María José Sánchez Guerrero Dra. Ester Bartolomé Medina Tutora: Dra. María Mercedes Valera Córdoba Sevilla, 2023 6 Universidad de Sevilla Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica 7 Programa de Doctorado Interuniversitario en Ingeniería Agraria, Alimentaria, Forestal y del Desarrollo Rural Línea de investigación: Producción Animal TÍTULO DE LA TESIS DOCTORAL: “NUEVAS METODOLOGÍAS GENÉTICAS PARA LA EVALUACIÓN DEL NIVEL DE ENDOGAMIA Y SU REPERCUSIÓN SOBRE CARACTERES DE INTERÉS ECONÓMICO EN LA POBLACIÓN EQUINA "PURA RAZA ESPAÑOLA"” Autora: DAVINIA ISABEL PERDOMO GONZÁLEZ La presente Tesis Doctoral cumple con los requisitos establecidos por la Universidad de Sevilla para su presentación por compendio de publicaciones (de conformidad con lo establecido en los arts. 62 al 64, 74 y 75 del Acuerdo 6.1/CG 23-7-19), al estar integrada por 4 artículos publicados y 2 en revisión en revistas científicas incluidas en el primer cuartil de la lista de revistas del ámbito de la especialidad y referencias en los últimos datos publicados por el Journal Citations Report (JCR): • Perdomo-González, D.I.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Molina, A.; Valera, M. (2020). Genetic Structure Analysis of the Pura Raza Español Horse Population through Partial Inbreeding Coefficient Estimation. Animals, 10, 1360. https://doi.org/10.3390/ani10081360 ▪ Índice de impacto: 2,752 (JCR, 2020) (1º cuartil). ▪ Área y posición: Veterinary Sciences 19/146 Agriculture, Dairy & Animal Science 13/63 • Perdomo-González, D.I.; Molina, A.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Bartolomé, E.; Varona, L.; Valera, M. (2021). Genetic inbreeding depression load for fertility traits in Pura Raza Española mares. Journal of Animal Science, 99(12), skab316. https://doi.org/10.1093/jas/skab316 ▪ Índice de impacto: 3,338 (JCR, 2021) (1º cuartil) ▪ Área y posición: Agricultura, Dairy & Animal Science 10/62 14 15 AGRADECIMIENTOS Quiero expresar mi más sincera gratitud a todas las personas e instituciones que han sido fundamentales en el desarrollo y conclusión de esta Tesis Doctoral. Sus contribuciones y apoyo han sido invaluables, y estoy sinceramente agradecida por su ayuda y aliento a lo largo de este arduo proceso. Mi más profundo agradecimiento va hacia mi tutora y directora, Mercedes Valera, por su guía experta, conocimientos excepcionales y paciencia infinita. Sus valiosos comentarios, orientación y disponibilidad han sido fundamentales para dar forma a esta Tesis Doctoral. Estoy sinceramente agradecida por su compromiso y entrega en cada etapa de este proceso de investigación. Gracias, Mercedes, por brindarme esta oportunidad y por guiarme en cada paso del camino. Tu apoyo ha sido inestimable y ha contribuido en gran medida a mi crecimiento académico y profesional. Agradecer a mis directoras de Tesis, María José Sánchez Guerrero y Ester Bartolomé Medina, por mostrarme el camino y apoyarme en cada momento con valiosas aportaciones y sugerencias. Siempre he tenido la certeza de que podía contar con ustedes y esa confianza nunca ha sido en vano. Mi más sincero agradecimiento a Antonio Molina por su inestimable apoyo y orientación a lo largo de mi trayectoria como investigadora, desde mis estudios de Máster hasta la culminación de esta Tesis Doctoral. Su generosidad al compartir sus conocimientos y su compromiso con mi desarrollo académico han sido invaluables. Estoy sinceramente agradecida por su guía experta y por estar siempre dispuesto a responder mis preguntas y brindarme su apoyo. También quiero expresar mi enorme agradecimiento a Nora Laseca, cuya participación, conocimiento y compañerismo han sido fundamentales en esta Tesis. Su dedicación y contribución han enriquecido enormemente mi investigación. Agradezco de corazón su valioso tiempo y esfuerzo dedicados a este proyecto. De manera especial, quiero dar las gracias a Ángela Cánovas y a Rute Guedes por todo el tiempo que han invertido en enseñarme con paciencia, por haberme acogido y tratado tan bien durante mis estancias en Guelph y Elvas y por estar siempre disponibles cuando me ha surgido alguna duda. Del mismo modo, quiero agradecer a Luis Varona por brindarme metodologías y enfoques para llevar a cabo parte de mi investigación. Su experiencia y generosidad al compartir su saber han sido de gran ayuda en el desarrollo de mi trabajo. Gracias también a Cristóbal Medina y Sebastián Demyda, por compartir valiosos conocimientos para el desarrollo de esta Tesis. Para mí ha sido un placer trabajar con todos ustedes y sería un honor seguir haciéndolo en un futuro. Mi reconocimiento se extiende al Grupo de Investigación MERAGEM (PAI AGR-273) y a la Real Asociación Nacional de Criadores de Caballos de Pura Raza Española, en especial, al Libro Genealógico, por brindarme los recursos necesarios para llevar a cabo esta Tesis. Sin su colaboración, este proyecto no habría sido posible. Su dedicación y compromiso con la preservación y promoción del caballo de Pura Raza Española han sido fundamentales. 16 No puedo dejar de mencionar a mis queridos colaboradores y colegas de la Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica (ETSIA). Su colaboración, intercambio de ideas y debates enriquecedores han sido una parte integral de mi experiencia doctoral. Agradezco a María Ripollés, Julia Poyato, Ana Encina, Laura Romero y Manolo Ligero, por su apoyo constante y por desafiar mis suposiciones, lo cual me ha llevado a un mayor desarrollo de mis ideas. Junto a los ya mencionados, no puedo olvidar a aquellas fuentes de inspiración y apoyo diario durante mi vida en Sevilla en estos últimos 5 años. En especial quiero agradecer a Carlos Sousa, por ser mi compañero y escucharme día tras día, y a Enrique Apolo, Aurora Moreno, David Muñoz, Javier Ordóñez, Paloma Hernández, Ana Márquez, María Pérez y Gina Suarez, por ser una fuente de motivación constante. Gracias por darme ánimos, brindarme ayuda y hacer que cada día sea más agradable. Los buenos momentos que hemos compartido juntos quedarán para siempre en mi recuerdo. El apoyo que he recibido de ustedes ha sido fundamental en mi camino, y no puedo expresar con palabras lo agradecida que estoy por tenerlos en mi vida. Gracias por ser parte de mi historia y por enriquecerla con vuestra amistad y compañía. Agradecer a mi familia por su inquebrantable apoyo y amor incondicional a lo largo de mi trayectoria académica. A mis padres, Josefa y Adolfo, y a mis hermanos, Adolfo e Irene, les agradezco de corazón por su constante estímulo, orientación y apoyo. Ustedes han sido un pilar fundamental en cada paso que he dado, y no puedo expresar con palabras lo agradecida que estoy por tener el refuerzo emocional y la confianza que han depositado en mí, la cual han sido un impulso poderoso en mi camino hacia el logro de este título. Gracias por creer en mí y por ser mi fuente inagotable de apoyo y amor. Por último, quiero expresar mi más profundo agradecimiento a mis amigos, Laura Perera, Miguel Ortega, Rita Robaina, Ana Patricia Naranjo y Ana Laura Armas. Su apoyo emocional, palabras de aliento y comprensión durante los momentos difíciles han sido un gran estímulo para seguir adelante. Gracias por estar a mi lado, por ser mi red de apoyo y por compartir conmigo risas, desafíos y triunfos. En resumen, mi más sincero agradecimiento a todos por estar ahí, tanto en los buenos como en los malos momentos, y por brindarme la energía y el apoyo incondicional para seguir adelante. Su presencia y aliento han sido una fuente constante de fortaleza y motivación a lo largo de esta travesía. Sin ustedes, este camino habría sido mucho más difícil. Gracias por creer en mí, por acompañarme en este viaje y por ser parte fundamental de mi éxito. 17 ÍNDICE ÍNDICE DE CONTENIDO Listado de abreviaturas utilizadas en esta Tesis Doctoral ........................................................... 19 RESUMEN .................................................................................................................................. 23 SUMMARY ................................................................................................................................ 27 INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 33 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 43 CAPÍTULOS ............................................................................................................................... 47 1. CAPÍTULO I: Estructura genética de la población equina “Pura Raza Española” y evaluación de la endogamia. ................................................................................................. 47 1.1. Artículo 1 (Capítulo I). Genetic structure analysis of the Pura Raza Español horse population through partial inbreeding coefficient estimation ............................................. 51 1.2 Artículo 2 (Capítulo I). Fine‑tuning genomic and pedigree inbreeding rates in equine population with a deep and reliable stud book: the case of the Pura Raza Española horse. 67 2. CAPÍTULO II: Análisis de las alteraciones a la herencia mendeliana y su repercusión en caracteres de interés económico en el caballo de Pura Raza Española. 83 2.1 Artículo 3 (Capítulo II). Genetic inbreeding depression load for fertility traits in Pura Raza Española mares ................................................................................................. 87 2.2 Artículo 4 (Capítulo II). Quantitative analysis of parent-of-origin effect in reproductive and morphological selection criteria in the pura Raza Española horse. ....... 99 2.3 Artículo 5 (Capítulo II). Transmission ratio distortion detection by neutral genetic markers in the Pura Raza Española horse breed. ............................................................. 113 3. CAPÍTULO III: Índice de selección precoz de parámetros reproductivos en yeguas de Pura Raza Española, mediante caracteres morfológicos ............................................ 153 3.1. Artículo 6 (Capítulo III). Designing an early selection morphological traits index for mare reproductive efficiency in Pura Raza Española horse........................................ 155 DISCUSIÓN GENERAL .......................................................................................................... 191 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 211 CONCLUSIONS ....................................................................................................................... 215 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 221 Anexo 1: Ficha de valoración de aptitud básica en el caballo de Pura Raza Española. ............ 249 Anexo 2: Publicaciones derivadas de la tesis ............................................................................ 251 18 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE 19 ÍNDICE Listado de abreviaturas utilizadas en esta Tesis Doctoral AC Ángulo de la grupa (Angle of croup) AFF Edad al primer parto (Age at First Foaling) AIF Intervalo medio entre partos (Average Interval between foaling) ALF Edad al último parto (Age at last foaling) AHC Coeficiente de historia ancestral (Ancestral history coefficient) ANCCE Real Asociación Nacional de Criadores de Caballos Pura Raza Española AR Parentesco promedio (Average relatedness) CML Calificación morfológica Lineal DSD Diámetro dorso esternal (Dorsal-Sternal diameter) F Coeficiente de consanguinidad clásica de Wright F3 Consanguinidad clásica considerando 3 generaciones F6 Consanguinidad clásica considerando 6 generaciones F9 Consanguinidad clásica considerando 9 generaciones Fa_Bal Consanguinidad ancestral de Ballou Fa_Kal Consanguinidad ancestral de Kalinowski FG Consanguinidad genómica por los elementos diagonales de la matriz genómica FH Consanguinidad genómica por los elementos diagonales de la matriz híbrida FHOM Consanguinidad genómica aplicando la metodología del método de los momentos Fij Coeficiente de consanguinidad parcial Fnew_Kal Consanguinidad reciente de Kalinowski FN Número de partos (Foaling number) FRZ Consanguinidad genómica aplicando el paquete R RZooROH FRZ3 FRZ con 3 generaciones FRZ6 FRZ con 6 generaciones FRZ9 FRZ con 9 generaciones GE Eficacia reproductiva general (General Efficiency) HatW Alzada a la cruz (Height at withers) HSD Distancia cadera-tibia (Hip-stifle distance) 20 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE I12 Intervalo entre el primer y segundo parto (Interval between first and second foaling) IBD Idéntico por descendencia (Identical By Descent) IBS Idéntico por estado (Identical By State) PCB Perímetro de la caña anterior (Perimeter of anterior cannon bone) PDC Potencial de depresión consanguíneo PE Eficacia reproductiva parcial (Partial Efficiency) PL Vida productiva (Productive life) PLS Mínimos cuadrados parciales (Partial Least Squares) PRE Pura Raza Española TC Circunferencia torácica (Thoracic circumference) TRD Distorsión de los ratios de transmisión (Transmission Ratio Distortion) RD Registro Definitivo ROH Segmentos de homocigosis (Runs of Homozygosity) RN Registro de Nacimientos SIL Longitud escapulo-isquial (Scapular‑ischial length) STR Marcador microsatélite (Short Tandem Repeates) RESUMEN 22 23 RESUMEN RESUMEN El caballo de Pura Raza Española (PRE) es la raza equina autóctona española más importante con respecto a su censo, con 275.018 individuos activos. Su actual Programa de Cría, en la que se incluye el Programa de Mejora, fue aprobado en 2020 y tiene como objetivos la mejora de la morfología, la conformación y la funcionalidad, minimizando el nivel de endogamia y garantizando la conservación de la Raza. Durante las 4 últimas generaciones (aproximadamente 40 años) se hace de forma sistemática controles de paternidad mediante el uso de diferentes herramientas moleculares (grupos sanguíneos, polimorfismos bioquímicos y marcadores microsatélites), lo que hace que la población del caballo de PRE sea ideal para la evaluación de diferentes metodologías para la estimación de la consanguinidad y el estudio de diferentes modelos que estiman las desviaciones en el ratio de transmisión de genes de padres a hijos en caracteres de especial interés económico en esta Raza. La presente Tesis se ha estructurado en tres capítulos. Capítulo I. “Estructura genética de la población equina “Pura Raza Española” y evaluación de la endogamia.” Desde 1912, con la creación del primer Libro de Registro, el caballo de PRE se estableció como una población cerrada, en la que solo pueden inscribirse como reproductores animales procedentes de padres inscritos en el Libro Genealógico. Desde ese momento, el apareamiento de animales emparentados se volvió inevitable y la consanguinidad, relacionada con el incremento de la homocigocidad en el genoma, fue progresivamente incrementándose. Hoy en día, la estimación de la consanguinidad, omnipresente e ineludible en los sistemas productivos de razas puras, es el principal objetivo en la gestión ganadera, sobre todo para aquellos criadores que están interesados en mitigar sus consecuencias negativas. El primer objetivo de este capítulo fue analizar, a partir de información genealógica, el coeficiente de consanguinidad clásica (F), el coeficiente de parentesco (AR) y el coeficiente de consanguinidad parcial (Fij) de la población total de PRE y determinar los ancestros que proporcionan el 50% de la variabilidad genética total de la población actual. Este estudio nos permitió comprobar que la F media del conjunto de la población (328.706 caballos) ha disminuido en casi un 1% en los últimos 20 años. Además, se determinó que un total de 10.244 ancestros comunes (aquellos que generan consanguinidad) contribuyeron aportando consanguinidad parcial a una media de 5.370 descendientes, donde cada descendiente tiene un promedio de 170 ancestros comunes en su pedigrí. También se determinó que, a 30 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE Chapter III. "Early Selection Index for Reproductive Parameters in Purebred Spanish Horse Mares Using Morphological Traits". In this chapter, a series of indices were developed for the preselection and early selection of reproductive efficiency and fertility parameters in PRE mares, based on morphological variables. A partial least squares analysis was conducted to determine the morphological variables that have the greatest impact on reproductive efficiency parameters. These variables included height at withers, lateral hock angle, dorsal-sternal diameter, perimeter of anterior cannon bone, angle of shoulder, thoracic perimeter, hip-stifle distance, and croup angle. Subsequently, morphological and fertility records from 16,620 to 19,758 mares, depending on the analyzed variable, were used to estimate genetic parameters using a multivariate animal model. The model included age, geographic region, coat color, and average stud size at the mare's first foaling decade as fixed effects. Heritabilities ranged from 0.1 (interval between first and second foaling) to 0.9 (height at withers), and genetic correlations between morphological and reproductive variables ranged from -0.47 (hip-stifle distance with age at last foaling) to 0.16 (angle of shoulder with interval between first and second foaling). It was determined that, for all studied fertility variables, the response to selection increased when comparing indices that included morphological information to those that did not. The fertility variable that showed the highest response was the interval between first and second foaling, with a response increase of 46%, followed by age at last foaling with a 28% increase. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 32 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE 33 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS INTRODUCCIÓN La importancia del sector ecuestre en España reside en su gran interés turístico y deportivo además de por la riqueza que genera al país. Según el último estudio económico del sector equino en España (Green Oak Group & Deloitte S.L., 2022), el número total de explotaciones equinas asciende a 188.289 y las diferentes actividades relacionadas con este sector suponen un movimiento económico total de 7.392.559.213 €, contribuyendo al 0,59% del Producto Interior Bruto (PIB) de España y al mantenimiento de 149.863 puestos de trabajo al año. El caballo es también un elemento clave tanto en el ámbito cultural como en el territorial, ya que a ese papel económico se le une el elemento de tradición y dinamización de las zonas rurales. La constitución de la actual raza equina Pura Raza Española (PRE) tuvo sus inicios durante el siglo XV (Edwards & Geddes, 1978) y actualmente es la única raza equina considerada como “Raza Autóctona de Fomento” según el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA , Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación (2020). Catálogo Oficial de Razas. Pura Raza Español) (anexo I del Real Decreto 45/2019, de 1 de marzo de 2019, y anexo 1 del Real Decreto 2129/2008, de 26 de diciembre, donde se recogen las definiciones de razas en peligro de extinción o de fomento). En el Catálogo Oficial de Razas de Ganado de España, el cual mantiene a disposición del público toda aquella información relacionada con las razas ganaderas y su reglamentación, se encuentran incluidas otras 20 razas equinas, de las cuales 4 son clasificadas como razas integradas, 1 es clasificada como “otras razas reconocidas en España” y el resto son razas autóctonas. Desde el punto de vista deportivo, el caballo de PRE se puede relacionar con otras razas equinas españolas como el caballo Menorquín y el Caballo de Deporte Español. El PRE, además de ser la raza equina con mayor censo activo (275.018 individuos; MAPA, 2023) es la raza más extendida en el país, ya que se distribuye por todas sus comunidades autónomas y, además, está presente en otros 65 países (26% del censo), tanto de la Unión Europea como en Terceros Países entre los que destacan EE.UU (8.397 machos y 8.775 hembras) y México (7.200 machos y 8.066 hembras). En España destaca, desde el punto de vista censal, la Comunidad Autónoma Andaluza en la que se concentra el 31% del censo del PRE y el 30,31% de las 46.345 ganaderías de PRE existentes en todo el mundo. 34 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE Uno de los momentos de mayor apogeo de esta Raza se produjo durante el reinado de Felipe II en el siglo XVI, donde se establecieron las bases de su cría (Altamirano, 2006). En aquel entonces, se construyeron las Caballerizas Reales en la ciudad de Córdoba, convirtiéndose en uno de los primeros centros organizados de cría de caballos, que reunía los mejores reproductores de la zona del Valle del Guadalquivir. En 1912, se creó en España el Registro-Matrícula o Libro de Registro Racial, el cual era gestionado por el Fondo de Explotación de los Servicios de Cría Caballar y Remonta (FESCCR). Aunque tradicionalmente las competencias en materia de cría equina estuvieron vinculadas al Ministerio de Defensa, a través del FESCCR, desde la publicación del Real Decreto 1133/2002 de 31 de octubre1, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, asumió estas funciones poniendo en marcha numerosas actividades de promoción del sector. En el año 2007, este registro, actualmente conocido como Libro Genealógico, pasó a ser gestionado por La Real Asociación de Criadores del Caballo de Pura Raza Española (ANCCE). La ANCCE, creada en 1972, es la asociación matriz del caballo de PRE a nivel mundial y la única reconocida oficialmente por el Ministerio de Agricultura Español, para garantizar la pureza de la Raza mediante la gestión de su Libro Genealógico y de su Programa de Cría. Esta asociación está conformada por ganaderos, socios y asociaciones de todo el mundo. Al no existir otras entidades ni otros libros de características similares, se considera el libro original o de origen de la raza PRE y el que define los principios sobre la Raza en España y en cualquier otro país. El Programa de Cría de esta Raza, aprobado por Resolución de la Dirección General de Producciones y Mercados Agrarios, de 15 de junio de 20202, se establece a partir de los requisitos básicos recogidos en la Orden APA/1018/2003, del 23 de abril3, 1 Real Decreto 1133/2002, de 31 de octubre, por el que se regula en el ámbito de las razas equinas, el régimen jurídico de los libros genealógicos, las asociaciones de criadores y las características zootécnicas de las distintas razas. Boletín Oficial del Estado, 265, de 5 de noviembre de 2002, 38929-38938. URL: https://www.boe.es/buscar/doc.php?id=BOE-A-2002-21338 2 Resolución de la Dirección General de Producciones y Mercados Agrarios, de 15 de junio de 2020, por la que se aprueba el Programa de Cría y el Programa de Difusión de la mejora de la raza equina Pura Raza Española. URL: https://www.mapa.gob.es/es/ganaderia/temas/zootecnia/report_1592238387802- resoluciondeladgporlaqueseapruebaelprogramadecriadelcaballopre_tcm30-539933.pdf 3 Orden APA/1018/2003, de 23 de abril, por la que se establecen los requisitos básicos para los esquemas de selección y los controles de rendimientos para la evaluación genética de los équidos de raza pura. Boletín Oficial del Estado, 103, de 30 de abril de 2003, 16586-16590. URL: https://www.boe.es/eli/es/o/2003/04/23/apa1018 35 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS en el que se regulan los esquemas de selección y de los controles de rendimientos para la evaluación genética de los équidos de raza pura. En esta Orden se determinaron las bases para el desarrollo de las normativas que afectaban a las razas puras equinas con vistas a su conservación, ordenación, mejora y fomento. Una vez establecidas las condiciones para la inscripción de los animales en los libros genealógicos fue necesario avanzar en la consecución de los Esquemas de Selección y Planes de Mejora, así como en la definición de los controles de rendimientos que permitirían alcanzar un progreso genético. Es decir, las razas debían tener un Esquema de Selección bien estructurado, que integrara la información genealógica, la valoración de reproductores y el control de rendimientos de las diversas pruebas y disciplinas hípicas en las que participaba cada raza caballar. El objetivo último era el de la determinación del valor genético de los caballos para diversas aptitudes y diseñar los apareamientos entre reproductores, con el fin de optimizar el progreso genético y aumentar su competitividad sin que hubiera un detrimento de la variabilidad genética de la raza. En 2004 se aprobó el primer Esquema de Selección del caballo de PRE, donde se reconoce a la ANCCE como la encargada de su gestión, bajo la dirección técnica del Grupo de Investigación MERAGEM. Desde el primer Esquema de Selección, y actualmente en el Programa de Cría, se determinó como objetivo principal la mejora de la morfología, la conformación y la funcionalidad manteniendo en todo momento la variabilidad genética y minimizando el nivel de parentesco de la población, garantizando así la conservación de la Raza y de su estirpe (Estirpe Cartujana). Por tanto, se busca la obtención de animales sanos, sin defectos hereditarios, y la mejora de las características morfológicas de la Raza y la selección y mejora de las características de comportamiento de acuerdo con el prototipo racial, además de la mejora de la conformación y el potencial funcional, entendiendo estas últimas como la mejora de la morfología orientada a una determinada funcionalidad para cada una de las distintas disciplinas deportivas. El Programa de Mejora, encuadrado dentro del Programa de Cría del Caballo de Pura Raza Española se encuentra estructurado en 5 etapas, que en la actualidad se desarrollan simultáneamente a lo largo del año. Las etapas primera y segunda consisten en la identificación e inscripción en el Registro de Nacimientos (RN) y la inscripción en el Registro Definitivo (RD), respectivamente, siguiendo el procedimiento y los requisitos establecidos en el apartado correspondiente del Libro Genealógico de la Raza. La tercera etapa consiste en el control de rendimientos, donde todos los animales inscritos de la Raza 36 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE pueden participar en controles de rendimientos para la conformación y funcionalidad y/o en concursos de Doma Clásica. Los primeros se realizan a los animales a partir de los tres años de edad, obteniendo 27 medidas zoométricas clásicas y 30 variables de conformación mediante la aplicación de una metodología denominada Calificación Morfológica Lineal (ver ANEXO 1), entre las que se incluye la evaluación de los defectos morfológicos que pueden presentar los caballos de esta Raza. Esta evaluación morfológica, realizada por un total de 13 veterinarios cualificados (ANCCE, 2023), se realiza en las propias explotaciones, durante las valoraciones de la Aptitud Básica para la reproducción. Por su parte, los controles de rendimientos para la Doma Clásica, los cuales son encuentros tanto nacionales como internacionales, se realizan en las Pruebas de Selección de Caballos Jóvenes organizadas por la ANCCE y las pruebas de Doma Clásica organizadas por la Real Federación de Hípica Española (RFHE). La información fenotípica recogida en estos encuentros se recopila utilizando los formularios establecidos para cada categoría y/o grupo de edad. La cuarta etapa del Programa de Mejora consiste en la valoración genética de los reproductores a partir de los controles de rendimientos (morfológicos y funcionales) y los datos genealógicos. Estas valoraciones genéticas se basan en el diseño de modelos de estimación en los que se tienen en cuenta factores de corrección de los distintos efectos ambientales que hayan salido significativos, a través de los correspondientes análisis estadísticos. Tras la valoración genética, los animales podrán obtener una categoría genética (Joven Reproductor Recomendado o Reproductor Mejorante, tanto en Aptitud Morfológica para la Doma Clásica como para la Doma Clásica, o Reproductor Élite). La quinta, y última etapa, implica la publicación del Catálogo de Reproductores tras la valoración genética anual con el fin de dar difusión y promoción a los ejemplares con categoría genética y fomentar su utilización reproductiva de cara a alcanzar un mayor progreso genético y contribuir a la reducción del intervalo generacional de la Raza. Desde que se comenzó con el primer programa de selección de la Raza se han publicado 23 catálogos de reproductores (Escribano et al., 2006, 2007, 2009; Valera et al., 2008, 2010a, 2010b, 2011, 2012; Sánchez-Guerrero et al., 2011, 2012, 2013a, 2013b, 2014a, 2014b, 2015a, 2015b, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020; Perdomo- González et al., 2021, 2022). Los 4 primeros catálogos (años 2006, 2007, 2008, y 2009), fueron publicados por el MAPA, aglutinando en función de las disciplinas deportivas, a los animales de las distintas razas equinas que consiguieron la categoría de Jóvenes Reproductores Recomendados. Sin embargo, a partir del año 2010 la ANCCE empiezó a publicar 2 catálogos al año, únicamente con animales PRE, uno de funcionalidad (Doma 37 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Clásica y/o Concurso Completo de Equitación) y otro de Aptitud Morfológica para la Doma Clásica. Es a partir del año 2016 cuando se unifican en un único Catálogo de Reproductores de PRE a los animales con categoría genética para cualquiera de las aptitudes. Concretamente, en el último catálogo de PRE (Perdomo-González et al., 2022) 103 caballos obtuvieron categorías genéticas: 62 Jóvenes Reproductores Recomendados (34 en Doma Clásica, 17 en Aptitud Morfológica para la Doma Clásica y 11 para ambas), 22 Reproductores Mejorantes (8 en Doma Clásica y 14 en Aptitud Morfológica para la Doma Clásica) y 19 Élites. Hasta ahora, como controles de rendimientos en el Programa de Mejora del PRE, solo se han incluido variables relacionadas con la conformación, los defectos morfológicos y la funcionalidad. Sin embargo, a pesar de que en el propio programa se destaca como posibles criterios de selección parámetros reproductivos, atendiendo principalmente a caracteres relacionados con la aptitud reproductiva, no se habían abordado estos estudios hasta el momento de la realización de la presente Tesis Doctoral. La rentabilidad de las explotaciones equinas depende en gran medida de su eficiencia reproductiva. En la especie equina este rendimiento reproductivo es bajo en comparación a otras especies domésticas (Sairanen et al., 2009; Alvarenga et al., 2016). Hasta ahora, en lo que se ha trabajado es en encontrar animales con alteraciones cromosómicas que no son aptos para la reproducción o que su fertilidad se ve disminuida (Anaya et al., 2017, 2018; Demyda-Peyrás et al., 2023), habiendo sido preciso abordar estudios genéticos de variables relacionadas con la eficiencia reproductiva, sobre todo en ciertas ganaderías grandes dedicadas a la cría. En otras razas equinas ya se han abordado estudios sobre los parámetros genéticos en variables de fertilidad y eficiencia reproductiva en yeguas (Sairanen et al., 2009; Gómez et al., 2020; Mantovani et al., 2020;Laseca et al., 2021) y en sementales (Van Eldik et al., 2006; Loomis & Graham, 2008; Sieme & Distl, 2012; Labitzke et al., 2014; Gottschalk et al., 2016; Greiser et al., 2019, 2020; Pirosanto et al., 2021). Para abordar estudios genéticos con variables de fertilidad, y su relación con otras variables de conformación, es importante también aplicar metodologías genéticas que hasta ahora no se habían aplicado en razas equinas o incluso en otras especies ganaderas. En este sentido, en la presente Tesis Doctoral se analizan tres nuevas metodologías para el estudio, desde el punto de vista de la genética cuantitativa, de las alteraciones en la herencia mendeliana que se ven en la población de caballos de Pura Raza Española, en 38 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE caracteres morfológicos, pero, sobre todo, en caracteres relacionados con la fertilidad. La primera ley de Mendel, también conocida como ley de la segregación (Mendel, 1866), es un principio fundamental de la Biología. Establece que cada progenitor tiene dos alelos para un rasgo determinado y que estos alelos se separan durante la formación de los gametos, recibiendo cada gameto un solo alelo. Como resultado, cada descendiente tiene las mismas posibilidades de heredar cualquiera de los alelos de su progenitor. No obstante, se han descrito excepciones a este principio mendeliano (Ostberg et al., 2013), como puede ser en el caso de recombinaciones de los cromosomas, mutaciones o genes que se encuentran en desequilibrio de ligamiento, y la existencia de otros mecanismos a través de los cuales, aunque los genes se transmiten de forma mendeliana, la expresión de esos genes no se ve reflejada en la población en las proporciones esperadas como lo son los fenómenos genéticos de la impronta genómica o la depresión consanguínea. No obstante, antes de analizar los mecanismos genéticos que actúan en una población, es importante conocer la estructura de dicha población. En concreto, es de especial relevancia el análisis de los niveles de endogamia. La endogamia, también denominada consanguinidad, es el porcentaje de parentesco entre individuos de una población (Wright, 1922). En una población cerrada o en una donde la entrada de nuevos animales reproductores es baja, el apareamiento de animales emparentados es inevitable. Como consecuencia de esto, el nivel de relación entre los individuos se va incrementando y, con ello, el nivel de consanguinidad, cuya principal consecuencia es el aumento de la homocigocidad de la población. Esto se puede traducir en una reducción del valor fenotípico del individuo (depresión consanguínea), o lo que es lo mismo, pérdida de la capacidad reproductiva, pérdida de la eficiencia biológica y una reducción de los valores de cualquier carácter bajo selección (Hedrick & Kalinowski, 2000). En la presente Tesis Doctoral se realizó un análisis exhaustivo de los niveles de consanguinidad en la población de caballos de PRE, no solo evaluando la consanguinidad total, comparando parámetros basados en el pedigrí (Meuwissen & Luo, 1992; Wright, 1922) con parámetros basados en el genoma (Fisher, 1954) y diferenciando entre consanguinidad reciente (Kalinowski et al., 2000) y consanguinidad ancestral (Ballou, 1997; Kalinowski et al., 2000; Baumung et al., 2015), sino además, se analizó la evolución de las consanguinidades parciales (Lacy et al., 1996, 1997), que son generadas por los ancestros comunes de un determinado individuo, a lo largo de la historia. 39 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Una vez conocida la estructura de la población es preciso poner a punto, en esta Raza, una serie de metodologías para el análisis cuantitativo de la expresión de los genes. Una de estas nuevas metodologías es la estimación del potencial de depresión consanguíneo (PDC) (Varona et al., 2019). En los últimos años se ha descubierto que la depresión consanguínea posee un efecto heterogéneo dependiendo del fundador o ancestro común que genera la consanguinidad, esto quiere decir que la consanguinidad tiene un amplio rango de efectos, generalmente negativos, pero también neutros o positivos (Miglior et al., 1994; Carolino & Gama, 2008; Casellas et al., 2009; Todd et al., 2018; Varona et al., 2019; Poyato-Bonilla et al., 2020). A través de la evaluación de las cargas endogámicas ocultas asociadas a los fundadores y el muestreo mendeliano de los no fundadores, Varona et al., (2019) desarrolló un modelo para la estimación del PDC de los individuos de una población. Determinar la proporción y dirección del cambio que se produce en un descendiente cuando recibe la suficiente consanguinidad parcial de un determinado ancestro común permitiría seleccionar caballos con un valor genético capaz de resistir los efectos deletéreos de la consanguinidad. Otra nueva metodología desarrollada en la presente Tesis Doctoral es la del efecto del padre de origen, o imprinting, que ha demostrado tener una gran importancia en caracteres morfológicos, pero, sobre todo, en caracteres de fertilidad. Estos modelos se han desarrollado a partir de estudios que han sugerido que la contribución genética de ambos padres a su descendencia no siempre es igualitaria, es decir, el grado de expresión de un gen en la descendencia depende del sexo del padre del cual haya heredado dicho gen. Este fenómeno se describió por primera vez en 1974 (Graham & Deussen, 1974), cuando experimentos en ratones con trasplante pronuclear no consiguieron crear progenie de padres del mismo sexo. Posteriormente se describió uno de los casos de imprinting mejor conocidos, el del gen IGF2 en cerdos, que se identificó como loci de rasgo cuantitativo (QTL) que afecta al crecimiento del músculo, a la deposición de la grasa y al tamaño del corazón. Estos experimentos se llevaron a cabo en familias F2 derivadas del cruce de diferentes líneas porcinas, cuyo tipo de familia permite separar los genotipos Qq y qQ en el QTL, donde el primer alelo es paterno, y luego probar estadísticamente las diferencias fenotípicas entre ellos. De esta forma, se determinó que este gen es expresado en la línea paterna y reprimido en la línea materna (De Koning et al., 2000, 2001). Desde el punto de vista de la genética cuantitativa, los primeros resultados sobre el grado en que los genes impresos contribuyen a la variación genética en el ganado fueron presentados Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE 46 47 CAPÍTULOS CAPÍTULOS 1. CAPÍTULO I: Estructura genética de la población equina “Pura Raza Española” y evaluación de la endogamia. Este primer capítulo comprende dos publicaciones científicas: • Perdomo-González, D.I.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Molina, A.; Valera, M. (2020). Genetic Structure Analysis of the Pura Raza Español Horse Population through Partial Inbreeding Coefficient Estimation. Animals, 10, 1360. https://doi.org/10.3390/ani10081360 • Perdomo-González, D.I.; Laseca, N.; Demyda-Peyrás, S.; Valera, M.; Cervantes, I.; Molina, A. (2022). Fine‑tuning genomic and pedigree inbreeding rates in equine population with a deep and reliable stud book: the case of the Pura Raza Española horse. Journal of Animal Science and Biotechnology, 13, 127, https://doi.org/10.1186/s40104-022-00781-5 RESUMEN: El primer capítulo de esta Tesis Doctoral se ha centrado en el análisis de la estructura genética de la población de caballos Pura Raza Española, la identificación de los ancestros que más han aportado a la variabilidad genética de la población actual y la comparación de diferentes metodologías para la estimación de la endogamia, tanto genealógica como genómica. Este capítulo está compuesto por dos artículos científicos. En el primer artículo (Genetic Structure Analysis of the Pura Raza Español Horse Population through Partial Inbreeding Coefficient Estimation), publicado en 2020 en la revista Animals, se analizó la información genealógica completa del caballo de Pura Raza Española para determinar la consanguinidad clásica (F), el coeficiente de parentesco (AR) y los coeficientes de consanguinidades parciales (Fij) que cada individuo ha recibido de cada uno de sus ancestros comunes. La consanguinidad es la proporción del genoma de un individuo que es una copia exacta del genoma de un ancestro común. Estos ancestros comunes son los que se encuentran en la genealogía del individuo tanto por línea familiar paterna como por línea familiar materna. 48 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE Para este estudio se analizó la información genealógica de 328.706 animales nacidos entre 1900 y 2018, de los cuales el 30,2% han sido utilizados como reproductores. Los parámetros analizados para establecer la calidad de la información genealógica incluyeron los niveles de integridad (completeness index), el número de generaciones completas, de generaciones máximas y de generaciones equivalentes. Por otro lado, los parámetros de la variabilidad genética analizados fueron la consanguinidad, el coeficiente de parentesco, el número de fundadores, el número de ancestros, el número efectivo de fundadores y el número efectivo de ancestros. Además, se estimaron los coeficientes de consanguinidad parcial (Fij) transmitidos por cada ancestro común a cada descendiente consanguíneo mediante un nuevo enfoque que permitió descomponer la consanguinidad en cada una de las fuentes de parentesco entre los progenitores de cada individuo, a partir de los fundadores de la población y el muestreo mendeliano de los no fundadores. Agrupando los individuos en función de la década de su nacimiento se ha analizado la evolución de los principales parámetros genéticos. Los resultados indicaron que el nivel de integridad del pedigrí de los caballos de PRE, nacidos en el último intervalo generacional (de 2009 a 2018), es del 99,6%, permaneciendo por encima del 90% en los últimos siete intervalos generacionales. El número de generaciones completas promedio del total del pedigrí es de 5,6, siendo 17,1 el promedio de generaciones máximas y 9,4 el promedio de generaciones equivalentes. Además, se estimó que el 98,7% de los animales inscritos en el pedigrí son consanguíneos y que el coeficiente de consanguinidad promedio de los animales nacidos en el último intervalo generacional es de 7,3%. Por otro lado, la estimación de los Fij generó una base de datos con más de 58 millones de registros (un registro para cada Fij que cada animal ha recibido de cada uno de sus ancestros comunes). Un total de 10.244 ancestros comunes (3.676 sementales y 6.568 yeguas) proporcionaron Fij a un promedio de 5.370 descendientes (que osciló entre 1 y 323.807) y el Fij promedio fue de 0,1%, oscilando entre 0% y 25%. El análisis a través de las generaciones ha demostrado que a pesar de que los animales consanguíneos reciben consanguinidad de cada vez más ancestros, la proporción de la consanguinidad que transmiten dichos ancestros se ha ido reduciendo en las últimas generaciones. El segundo artículo que comprende este capítulo profundiza en el análisis de la endogamia de esta Raza y realiza una comparativa entre las distintas metodologías para la estimación de la consanguinidad, tanto genealógicas como genómicas. Los resultados 49 CAPÍTULOS obtenidos en el Artículo 1 de la presente Tesis Doctoral ya demostraron que la población actual del caballo de PRE posee información genealógica de muchas generaciones con un alto nivel de integridad y que, además, en esta Raza se lleva realizando durante más de 40 años controles de paternidad sistemáticos para la inscripción de los animales en el Libro Genealógico. Por lo que es una población perfecta para un análisis comparativo de diferentes metodologías de estimación de la endogamia. Los resultados de este estudio se recogen en el artículo Fine‑tuning genomic and pedigree inbreeding rates in equine population with a deep and reliable stud book: the case of the Pura Raza Española horse, publicado en 2022 en la revista Journal of Animal Science and Biotechnology. Para la realización de este trabajo se usó la información genealógica de la población total del caballo de PRE (344.718 caballos). Utilizando diferentes programas informáticos se obtuvieron los siguientes coeficientes de consanguinidad: clásica de Wright (F), ancestral de Balou (Fa_Bal), ancestral de Kalinowski (Fa_Kal), reciente de Kalinowski (Fnew_Kal) y el coeficiente de historia ancestral (AHC). Adicionalmente, se genotipó una población seleccionada de 805 caballos de PRE para determinar diferentes coeficientes de consanguinidad basados en el genoma. Las técnicas utilizadas estuvieron basadas en SNP-by-SNP (método de los momentos -FHOM-, los elementos diagonales de matrices genómicas -FG-, y los elementos diagonales de matrices híbridas -FH-) y en las medidas de ROH (FRZ). Posteriormente se realizó el análisis de la evolución a lo largo de la historia del PRE de los diferentes coeficientes y se determinaron las correlaciones entre ellas para establecer su fiabilidad. Los resultados mostraron que los coeficientes de consanguinidad fundamentados en datos genealógicos tienen unos valores promedios que oscilaron entre 0,01 (F3) y 0,08 (F), excepto para Fa_Bal (0,31) y AHC (0,44). El nivel de consanguinidad en la población se ha ido incrementando de forma paulatina desde el año 1940 hasta el año 1998, para luego ir disminuyendo hasta la actualidad. Sin embargo, la Fa_Bal y la AHC nunca han mostrado una disminución de sus valores. Estos dos parámetros, son a su vez, los más parecidos entre sí y los que menor correlación mostraron tener con la F. Los valores promedio de los coeficientes de consanguinidad basados en el genoma mostraron diferencias según la metodología empleada. Los métodos matriciales y los basados en el método de los momentos mostraron valores bajos y muy similares (0,05, 0,06 y 0,05 en FH, FG y FHOM, respectivamente). Dentro de la metodología basada en ROH (FRZ), los valores medios fueron de 0,17, 0,05, 0,09 y 0,11 para FRZ, FRZ3, FRZ6, FRZ9, es decir, 50 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE cuando se utiliza el total de generaciones para su estima y para 3, 6 y 9 generaciones, respectivamente. En general, las correlaciones entre los coeficientes de consanguinidad basados en la genealogía y los basados en el genoma fueron significativas, positivas y de magnitud alta, oscilando entre 0,6 (F3-FHOM) y 0,8 (F-FRZ). Los resultados de este capítulo han puesto de manifiesto que, a pesar del alto porcentaje de individuos consanguíneos en la población actual del caballo de PRE, la consanguinidad promedio de la población, aunque sigue siendo relativamente alta, ha ido disminuyendo en las últimas generaciones. Esto ha sido posible gracias al mayor conocimiento sobre el parentesco de los animales y a la eficacia del Programa de Cría, que proporciona a los ganaderos una herramienta en la web de la asociación para determinar la consanguinidad de cada posible descendiente. Además, aunque la obtención de valores de consanguinidad reales sea preferible (valores genómicos), las estimaciones del nivel de consanguinidad basados en la genealogía, que como la del PRE es muy profunda y robusta, permite trabajar de forma más eficiente y económica que con el genotipado masivo. 51 CAPÍTULOS 1.1. Artículo 1 (Capítulo I). Genetic structure analysis of the Pura Raza Español horse population through partial inbreeding coefficient estimation. Título (en Español): Análisis de la estructura genética del caballo de Pura Raza Española a través de la estimación de los coeficientes de consanguinidad parciales. Autores: Davinia Isabel Perdomo-González1; María José Sánchez-Guerrero1; Antonio Molina2; Mercedes Valera1. Afiliaciones: 1Departamento de Ciencias Agro-forestales, ETSIA, Universidad de Sevilla, Carretera de Utrera Km 1, 41013 Sevilla, Spain. 2Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Gregor J. Mendel, Planta baja, Carretera Madrid-Cádiz km 396ª, 14071 Córdoba, Spain. Revista: Animals. Año de Publicación: 2020 Número y páginas: 10, 1360 DOI: 10.3390/ani10081360 Índice de impacto: 2,752 (JCR, 2020) (1º cuartil). Área y posición: Veterinary Sciences, 19/146 Agriculture, Dairy & Animal Science 13/63 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE 52 animals Article Genetic Structure Analysis of the Pura Raza Español Horse Population through Partial Inbreeding Coefficient Estimation Davinia I. Perdomo-González 1,* , María J. Sánchez-Guerrero 1, Antonio Molina 2 and Mercedes Valera 1 1 Departamento de Ciencias Agro-forestales, ETSIA, Universidad de Sevilla, Carretera de Utrera Km 1, 41013 Sevilla, Spain; [email protected] (M.J.S.-G.); [email protected] (M.V.) 2 Departamento de Gen é tica, Universidad de C ó rdoba, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Gregor J. Mendel, Planta baja, Carretera Madrid-Cádiz km 396ª, 14071 Córdoba, Spain; [email protected] * Correspondence: [email protected]; Tel.: +34-954-486-461 Received: 14 July 2020; Accepted: 4 August 2020; Published: 6 August 2020 check ror updates Simple Summary: The Pura Raza Español horse (PRE) is an autochthonous Spanish horse recognized as an official breed since the 15th century. In 1912, with the creation of its studbook, it became a closed population (only animals belonging to the breed acts as breeders: 23,530 stallions and 75,870 mares), in which relatedness between individuals and inbreeding has tended to increase. Inbreeding estimation measures the probability in an individual of possessing, in one gene, two identical alleles derived from a common ancestor. Each common ancestor provides part of the descendant’s total inbreeding (partial inbreeding coefficient, Fij). This work analyzes the Fij, calculated using a recently developed approach (based on founders and Mendelian sampling of the non-founders) in the whole PRE population. The identification of 10,244 common ancestors and their relationship with the seven most influential individuals of the breed allowed us to determine that a genetic bottleneck due to an unequal contribution over the generations occurred. Computing Fij has being an important tool to determine which are the breeding animals, with more or less massive use, whose are determining a loss of genetic variability in the population at each moment and has enabled us to expand our knowledge about PRE genetic demographic evolution. Abstract: The aim of this work was to analyze genetic parameters such as the inbreeding coefficient (F), relatedness coe ffi cient (AR) and partial inbreeding coe ffi cient (F ij ) of the whole PRE population, and the ancestors which account for 50% of the total genetic variability of the current population, from genealogical information. The average F of the whole PRE population (328,706 animals) has decreased from 8.45% to 7.51% in the least 20 years. The F ij was estimated for the whole PRE population, resulting in a database of 58,772,533 records containing one record for each Fij that each animal receives from a certain common ancestor (CA). A total of 10,244 CAs contributed to the F ij with an average of 5370 descendants, with each descendant having an average of 170 CAs. Over the generations, the number of CAs has increased, while the proportion of F ij by each one has decreased. In addition, the contributions of the more influential ancestors have changed. The increased census, the limited use of artificial insemination and our increased knowledge about inbreeding depression and the animals’ breeding values allow breeders to select horses more for their functionality and conformation than for their pedigree reputation, which is the cause of all these changes. Keywords: common ancestors; genetic variability; studbook; genealogical analysis Animals 2020 , 10 , 1360; doi:10.3390 / ani10081360 www.mdpi.com/journal/animals Animals 2020, 10, 1360 2 of 13 1. Introduction The Pura Raza Español horse (PRE) is an autochthonous Spanish horse population and the most important horse breed in Spain in terms of both history and census, with 252,852 active horses [1]. A single association, the National Association of Pure Spanish Horse Breeders (ANCCE), manages all of them, despite the fact that 23.3% of PRE horses are distributed abroad, in over sixty countries [1]. PRE is a breed with ancestors dating back thousands of years in the Iberian Peninsula, and was recognized as an o ffi cial breed in the 15th century [2]. This breed has exceptional temperamental and functional qualities, making it highly suitable for di ff erent equine competitions, above all, classic dressage [3]. The foundation of the studbook was o ffi cially approved on January 1, 1912, and it was being managed by the Spanish Armed Forces first and since 2007 by the ANCCE. Following the creation of the studbook, the number of horses born each year increased (around 100 animals per year) until the 1970s, after which the growth surged to a maximum figure of 19,560 new horses in 2009. From that year, growth has fallen and has now stabilized at about 10,000 births per year. Since the establishment of the studbook, the inscription of new PRE horses has been restricted to those animals born from horses registered in the official studbook, which has therefore created a completely closed studbook, in which the mating of related individuals is inevitable in the long term. In closed populations with a non-reduced census, the intensive use of selection also leads to an increase in the level of inbreeding [4]. Pedigree-based relationship coefficients are often used to manage the inbreeding in a population when effects of the inbreeding depression begin to be manifested. Although, in recent decades, attempts have been made to maintain genetic variability in the PRE population, in general, unbalanced contributions of founders reflect the great loss of genetic diversity over the generations [2]. The inbreeding coe ffi cient of an individual (F) is defined as the probability of an individual to possesses two identical alleles by descent from a common ancestor at the same randomly chosen locus [5]. Historically, F has been studied only as the sum of the founder’s partial coefficients [6], but this does not provide detailed information about the contribution of each ancestor to the identity-by-descent (IBD) probability. Alternatively, F can be broken down into the sources of the coancestry between the parents of each individual [7,8] as the sum of the partial coefficient from founders and the Mendelian sampling of the non-founders. These partial coefficients into which F can be partitioned are known as partial inbreeding coefficients, Fij, which is the combined probability that an individual i is autozygous for an allele and that this allele was derived from the allele in ancestor j [6,9,10]. The possibility of computing, for the first time in equines with a high census population, the partial inbreeding coefficients (Fij) attributed not only to founders but also to non-founders, presents a way of analyzing the PRE population structure and evolution from a new point of view and gives us greater insight into the genetic variability of PRE over the generations. Moreover, this approach provides us with a methodology to identify the unequal common ancestor’s contribution and determine the reasons why a certain ancestor becomes important. 2. Materials and Methods Pedigree data were obtained from the ANCCE studbook, with a total of 328,706 animals (160,640 males and 168,066 females) born from 1900 to 2018, of which 99,400 horses (30.24%) have been used for breeding (23,530 stallions and 75,870 mares). The parameters related to the quality of genealogical information were estimated, including pedigree completeness level (the proportion of ancestors known in each ascending generation [11]), complete generations (the number of generations separating the offspring of the furthest generation where the 2g ancestors of the individual are known, where g is the number of generations since the last known ancestor), maximum generations (the number of generations separating the individual from its furthest ancestor) and equivalent generations (the sum of (1/2)n, where n is the number of generations separating the individual to each known ancestor [12]). The parameters of genetic variability estimated were inbreeding coefficient (F, defined as the probability that an individual has two genes identical by descent [13]) and average relatedness coefficient (AR, defined as the probability that an allele randomly Animals 2020, 10, 1360 3 of 13 chosen from the whole population in the pedigree belongs to a given animal [14], i.e., the representation of the animal in the whole pedigree; also, the AR of a founder indicates its genetic contribution to the population). Finally, the number of founders (ancestors with unknown parents), the number of ancestors (the ancestors, not necessarily founders, accounting for 100% of the genetic diversity in the actual population), the effective number of founders (fe, the number of equally contributing founders that would be expected to produce the same genetic diversity as in the population under study [15]) and the effective number of ancestors (fa, the minimum number of ancestors, not necessarily founders, which account for the complete genetic diversity of a population [15]) were also calculated to evaluate whether bottlenecks have affected the population. The approach developed by Casellas [16] was used to estimate the Fij transmitted by each common ancestor to each inbred descendant of the PRE pedigree file. This new approach allowed the inbreeding to be broken down into the sources of the co-ancestry between the parents of each individual, which include the founders of the population (the traditional approach) and the Mendelian sampling of the nonfounders [7,8]. Thus, the inbreeding load (ii) for the i th individual can be decomposed as follows: i i = i s + i d + ε i (1) where i s and i d are the inbreeding loads for its sire and dam, respectively, and ε i is its Mendelian sampling [16,17]. This approach provides a subset of partial inbreeding coe ffi cients accounting for the identity-by-descent contribution from each relevant ancestor. In addition, to evaluate whether the most influential ancestors (those which provide the F ij for a greater number of descendants) also explain most of the genetic variability of the total PRE population, ancestors accounting for 50% of the genetic contribution in the total population (based on Boichard methodology [15]) were analyzed. Demographic and genetic variability parameters were calculated using the ENDOG v4.8 software [18]. Finally, with the objective of identifying which factors have contributed to a certain animal having a higher or lower inbreeding level, several factors historically related to F were analyzed using a general linear model followed by a Tukey post hoc test of least square means. Reproductive status (4 levels; male without offspring, female without offspring, stallion with offspring and mare with offspring) was included to determine if linage implies a higher or lower use of an animal for reproduction. Coat color (5 levels; grey, bay, black, chestnut and other minority coat colors) was included to analyze its pleiotropic role. And factors as birth generational interval (10 levels; 1919–1928, 1929–1938, 1939–1948, 1949–1958, 1959–1968, 1969–1978, 1979–1988, 1989–1998, 1999–2008 and 2009–2018), birth stud size (7 levels; 1 animal, 2–4 animals, 5–9 animals, 10–14 animals, 15–19 animals, 20–24 animals and ≥ 25 animals) and geographic zone (6 levels; Spain, Rest of Europe, South America, North America, Australia and Africa) were included due to its relation to differences in horse management. Statistical analyses were performed using SPSS software for windows [19]. 3. Results The pedigree completeness level of the PRE horses born in last generational interval (the last 10 years [20], 115,005 individuals) was 99.6%, remaining above 99% until the third generational interval and above 90% until the seventh generational interval. The mean complete generations of the total pedigree (328,706 horses) were 5.6, the mean maximum generations were 17.1 and the mean equivalent generations were 9.4. The total PRE population showed an average F of 7.51% and a mean AR of 11.31%. Up to 98.7% of the registered individuals are inbred, and those born in the last four generations are 99.9% inbred. Animals belonging to the last generational interval showed a mean F of 7.25% and a mean AR of 11.20%, with the mean of complete generations 6.2, a maximum pedigree depth of 18.8 generations and the mean of equivalent generations of 10.4. The effective number of founders (fe = 33) was only 3.13% of the total number of founders (1053) and the effective number of ancestors (fa = 19) was 1.86% of the total number of ancestors (1023). Animals 2020 , 10 , 1360 10 of 13 an intermediate census (328,706 animals) and complete generations (5.6). This means that the fact that the PRE average F value is considerably higher than that of Pirenaica (3%) and Rubia Gallega (2%) is due to the large number of ancestors that transmit a low F ij rather than to a low number of ancestors transmitting a high Fij. This fact can be observed in Figure 1, too, where animals with the same F levels have a greater number of common ancestors with a lower average F ij when the current generation is compared with five generations ago. As stated above, the last two generational intervals represent over 77% of the individuals registered in the PRE studbook. From the studbook’s creation, in 1912, there has not been any change in horse or foal registration policies, just the intensive efforts made by breeders to improve the breed and make it more international have allowed this great increase, which shows that this breed is experiencing a period of rapid growth. In addition, the efforts made in the breeding program to decrease inbreeding (with selection and mating processes) have resulted in an increased number of animals becoming common ancestors, which has already grown exponentially each generation. Inbreeding and average relatedness values have shown similar behavior over generational intervals in both the total PRE population and its common ancestors. It seems that, in the last generation, the increase in the average AR values was less marked, which demonstrates that breeders are looking for less closely related individuals and avoiding inbreeding, due to the fact that using animals with low AR values as breeders maintains the genetic variability. On the other hand, over the generations, while the number of common ancestors has increased, the average Fij that a common ancestor transmits to its descendants has decreased, the opposite of which would be expected since the PRE breeding program started to be implemented in 2003. The PRE breeding program is managed by ANCCE, and includes functional conformation, dressage and riding abilities, in addition to morphology, as the main selection criteria [41,42]. The fact the average Fij that a common ancestor transmits to its descendants has decreased is mainly due to the increasing awareness among horse breeders about the inbreeding depression [2] and the better information available about the animals’ breeding values, which enables them to choose the best stallions and mares (also with the lowest AR) to obtain foals with the desired characteristics and less F, thus reducing the average founder’s contribution to the population [34]. Nowadays, despite the large Pura Raza Español horse census, just 1023 ancestors account for 100% of the genetic variability, only seven of which are responsible for 50% of the population gene pool, which is one more than reported by Valera et al. [21]. Americano and Destinada remain the two ancestors with the highest contribution percentages, despite making a lower contribution to the total gene pool than two generational intervals ago (Americano contribution has decreased from 15.7% to 13.9% and that of Destinada from 12.6% to 11.8%). This coincides with the fact that both ancestors had a lower percentage of descendants in the last generation than one generation before, which means that their influence increased exponentially until the 1999–2008 interval but has decreased in the last generation. On the other hand, Maluso now accounts for a bigger contribution percentage (from 5.37% to 6.7%) and Celoso III (from 6.27% to 6.0%) and Zurrona (from 3.62% to 3.1%) for smaller percentages. As regards the Fij they transmit, Americano and Destinada transmit to their descendants the highest average Fij values, 0.54% and 0.74%, respectively while Maluso, with an average transmitted Fij of 0.24%, transmits a large proportion of partial inbreeding (≥6.25%) to the highest number of descendants, followed by Americano and Celoso III . This fact could explain why Maluso has the lowest number of descendants in the last generation (only 5% of his total descendants), while the other ancestors have around 40%, probably because of the visible e ff ects of inbreeding depression as reduction in reproductive parameters or morphology measurements. 5. Conclusions Breeders design horse’s matings in function of their breeding objectives, looking to fix certain characteristics and the maximum influence of animals with great value, genetic or phenotypic. The general idea in the past that mating related individuals establishes certain long-term traits is Animals 2020 , 10 , 1360 11 of 13 demonstrated here with the use of certain animals from both the maternal and paternal lineages, making them common ancestors. To achieve this, apart from controlling inbreeding, the assessment of genetic contributions from founders and ancestors of the current population has provided us with a better understanding of the changes that take place in the genetic pool of this breed. The e ff orts made to reduce the average F over the last generations have been mainly possible thanks to our increased knowledge about the animals’ relatedness (o ff spring’s inbreeding) and to the e ff ectiveness of the breeding program to provide breeders with breeding values, which increases their options of successfully choosing new animals regardless of their pedigree or the breeder’s prestige. Therefore, in addition to carrying out a systematic control of the inbreeding level both in the total population and within studs, it is important to determine the reasons that a certain ancestor is being used so intensely that it determines an increase in the kinship between the breeding animals and therefore a loss of variability, both in the total population and within certain studs. Author Contributions: Conceptualization, M.V. and A.M.; Methodology, D.I.P.-G., M.J.S.-G. and A.M.; Formal Analysis, D.I.P.-G. and M.V.; Data Curation, A.M. and M.J.S.-G.; writing—original draft preparation, D.I.P.-G.; Investigation, Writing—Review and Editing, Visualization and Supervision, all authors. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. Funding: This research was funded by the AGL-2017-84217-P Research project from Ministerio de Econom í a, Industria y Competitividad of the Spanish Government. Acknowledgments: The authors wish to thank the Pura Raza Español Horse Breeders Association for the data and Joaquim Casellas and Luis Varona for the approach used and their expert knowledge. Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest. References 1. MAPA, Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación. Catálogo Oficial de Razas. Pura Raza Español. 2020. Available online: https: // www.mapa.gob.es / es / ganaderia / temas / zootecnia / razas-ganaderas / razas / catalogo / autoctona-fomento / equino-caballar / espanola / iframe-ejemplo-arca.aspx (accessed on 3 April 2020). 2. Sol é , M.; Valera, M.; Fern á ndez, J. Genetic structure and connectivity analysis in a large domestic livestock meta-population: The case of the Pura Raza Español horses. J. Anim. Breed. Genet. 2018 , 135 , 460–471. [CrossRef] 3. Sánchez-Guerrero, M.J.; Cervantes, I.; Valera, M.; Gutiérrez, J.P. 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This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 10 . CAPÍTULOS 1.2 Artículo 2 (Capítulo I). Fine‑tuning genomic and pedigree inbreeding rates in equine population with a deep and reliable stud book: the case of the Pura Raza Española horse. Título (en Español): Ajuste de las tasas de consanguinidad genómica y por pedigrí en poblaciones equinas con un libro genealógico profundo y fiable: El caso del caballo de Pura Raza Española. Autores: Davinia Isabel Perdomo-González1; Nora Laseca2; Sebastián Demyda- Peyrás3,4; Mercedes Valera1; Isabel Cervantes5; Antonio Molina2 Afiliaciones: 1Departamento de Agronomía, ETSIA, Universidad de Sevilla, Carretera de Utrera Km 1, 41013 Sevilla, Spain. 2Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Gregor J. Mendel, Planta baja, Carretera Madrid-Cádiz km 396ª, 14071 Córdoba, Spain. 3Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina. 4Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONI‑ CET), La Plata, Argentina. 5Departamento de Producción Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Spain. Revista: Journal of Animal Science and Biotechnology. Año de Publicación: 2022 Número y páginas: 5, 1-14 DOI: 10.1186/s40104-022-00781-5 Índice de impacto: 7,000 (JCR, 2022) (1º cuartil). Área y posición: Agriculture, Dairy & Animal Science 2/62 67 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE 68 83 CAPÍTULOS 2. CAPÍTULO II: Análisis de las alteraciones a la herencia mendeliana y su repercusión en caracteres de interés económico en el caballo de Pura Raza Española. Este segundo capítulo está constituido por tres publicaciones científicas: • Perdomo-González, D.I.; Molina, A.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Bartolomé, E.; Varona, L.; Valera, M. (2021). Genetic inbreeding depression load for fertility traits in Pura Raza Española mares. Journal of Animal Science, 99(12), skab316. https://doi.org/10.1093/jas/skab316 • Perdomo-González, D.I.; Varona, L.; Molina, A.; Laseca, N.; Valera, M. (2023). Quantitative analysis of parent-of-origin effect in reproductive and morphological selection criteria in the Pura Raza Española horse. Journal of Animal Breeding and Genetics, 00, 1-11. https://doi.org/10.1111/jbg.12811 • Perdomo-González, D.I.; Id-Lahoucine, S.; Molina, A; Cánovas, A.; Laseca, N.; Azor, P.J.; Valera, M. (2023). Transmission ratio distortion detection by neutral genetic markers in the Pura Raza Española horse breed. Animal (en revisión). RESUMEN: El Segundo capítulo de esta Tesis Doctoral versa sobre diversas metodologías que tratan de identificar y cuantificar desviaciones en la expresión y la transmisión de los genes de padres a hijos con respecto a los valores esperados en la población de caballos de PRE, principalmente en caracteres reproductivos, pero también en ciertos caracteres morfológicos de interés económico para la Raza. Para ello, se diseñaron y se ejecutaron diferentes modelos que incluyeron la estimación de las varianzas debidas, por un lado, al potencial de depresión consanguíneo y, por otro lado, al efecto del padre de origen. Además, se evaluó la presencia de alelos o genotipos relacionados con efectos deletéreos en la población y, por tanto, relacionados con la distorsión en el ratio de transmisión. En el primer artículo de este capítulo, Genetic inbreeding depression load for fertility traits in Pura Raza Española mares, publicado en 2021 en la revista Journal of Animal Science, se analizaron seis caracteres reproductivos y tres parámetros de eficiencia reproductiva, en un grupo de yeguas que oscilaron según la variable analizada entre 9.241 y 22.799 yeguas de PRE. Los caracteres reproductivos fueron la edad al primer parto (AFF), el intervalo entre el primer y el segundo parto (I12), el intervalo 84 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE promedio entre partos (AIF), el número de partos (FN), la edad al último parto (ALF) y la vida productiva (PL, definida como los años que la yegua ha estado criando activamente). Además, se describió la eficiencia reproductiva general (GE) de las yeguas como la relación entre el número real de partos que ha tenido durante su vida productiva y el número total de partos que podría haber tenido. Así mismo, se pudo establecer un parámetro de eficiencia reproductiva parcial (PE) que relacionó el número de partos que ha tenido la yegua en un determinado momento con respecto al número óptimo de partos que podría haber tenido en ese momento. En concreto estos momentos han sido el 3º y el 6º parto, estimándose la PE3 y PE6, respectivamente. En primer lugar, se determinó si la consanguinidad afectaba de manera negativa (depresión consanguínea) a las variables analizadas. Posteriormente se ejecutaron modelos univariados que incluían un vector con la consanguinidad total (F) de las yeguas, una covariable con la depresión consanguínea, los efectos sistemáticos, la contribución genética aditiva, el efecto del potencial de depresión consanguíneo individual y el termino residual en un software propio desarrollado en FORTRAN. Los resultados determinaron que existe depresión consanguínea en todas las variables analizadas, siendo la Fa_Kal más sensible para su detección que la F, y que, por tanto, se podía estimar, para cada una de las variables, su correspondiente potencial de depresión consanguíneo (PDC) y su ratio (de forma análoga al cálculo de la heredabilidad). Los valores de heredabilidad más altos fueron para AFF (0,16) y AIF (0,14), mientras que el resto de las estimaciones oscilaron entre 0,05 (I12) y 0,10 (GE). Los ratios del PDC, calculados para un valor de consanguinidad del 10%, oscilaron entre 0,06 (PE3) y 0,17 (AFF). Por último, se calcularos correlaciones fenotípicas entre los valores genéticos aditivos y los valores genéticos de PDC, los cuales fueron significativos y oscilaron entre valores negativos, -0,17 (FN) y -0,11 (PE1), y valores muy positivos, 0,54 (ALF) y 0,27 (PE3). Por tanto, estos resultados indican que los PDC tienen una gran influencia en el rendimiento reproductivo de las yeguas consanguíneas y que la utilización de ancestros comunes, que proporcionen una Fij determinada, podría no solo neutralizar los efectos deletéreos de la consanguinidad, sino favorecer también a su descendencia consanguínea. Otro de los fenómenos genéticos que distorsionan la proporción esperada de la expresión de determinados genes en la descendencia es el efecto del padre de origen, que ha sido analizado en el segundo artículo de este capítulo, Quantitative analysis of parent- 85 CAPÍTULOS of-origin effect in reproductive and morphological selection criteria in the Pura Raza Española horse, publicado en 2023 en la revista Journal of Animal Breeding and Genetics. En este estudio se analizó el efecto de este fenómeno, en el cual la expresión de un gen puede variar en la descendencia dependiendo de si el gen ha sido transmitido por el padre o por la madre (también conocido como “imprinting”), en tres caracteres de fertilidad (GE, AFF y FN) y tres caracteres morfológicos (alzada a la cruz -HatW-, circunferencia torácica -TC- y longitud escapulo-isquial -SIL-). El número de animales analizado osciló entre 44.038 y 144.191, todos ellos con datos fenotípicos y ambos padres conocidos. Se desarrollaron 4 modelos diferentes, sin imprinting, solo con imprinting paterno, solo con impirnting materno y un último modelo con imprinting paterno y materno juntos, mediante un software de la familia del BLUPF90. Para ello, primero se estimó la matriz inversa de relaciones gaméticas utilizando un software propio desarrollado en FORTRAN90. La comparación de modelos reveló que ambos efectos gaméticos, paterno y materno, influyen en los caracteres analizados y que el efecto gamético materno tuvo una mayor influencia que el efecto gamético paterno en la mayoría de las variables analizadas. En concreto, el efecto gamético materno supuso entre un 3% y un 11% del total de la varianza fenotípica para todas las variables analizadas excepto para la AFF, en la cual fue el efecto gamético paterno el que tuvo mayor peso, con un 4% de la varianza fenotípica total. Cuando se comparan los valores genéticos aditivos del modelo sin imprinting y del modelo más completo (el que mejor se ajustó a los datos), se encontraron correlaciones significativas y muy altas, siempre por encima de 0,95. Hay que destacar que el porcentaje de animales coincidentes para el percentil 5 superior de los valores genéticos estimados entre el modelo más complejo y el que no incluyó imprinting también fue muy alto, por encima del 74,7% en todos los casos. En el tercer artículo de este capítulo, Transmission ratio distortion detection by neutral genetic markers in the Pura Raza Española horse breed, que se encuentra ahora en el proceso de revisión por pares de la revista Animal, se profundizó en diversos mecanismos que afectan al ratio de transmisión de alelos y/o genotipos de padres a hijos que se dan lugar en las células germinales, como pueden ser la letalidad embrionaria o la competición gamética. 86 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE En este trabajo se analizaron un total de 126.394 tríos, constituidos por el semental, la yegua y su descendiente, que fueron genotipados usando un panel de 17 marcadores microsatélites (recomendados por la Sociedad Internacional de Genética Animal -ISAG- ) para los controles de paternidad y la identificación animal. El número de alelos totales analizados fue de 268. Los datos genómicos fueron analizados mediante el software TRDscan v2.0 para la identificación de regiones relacionadas con la distorsión del ratio de transmisión (TRD) mediante dos patrones, patrón alélico y patrón genotípico. Dentro de este último patrón, además se podían identificar regiones de TRD específicas de la descendencia según su sexo. Los resultados revelaron que, en un total de 12 alelos, de 11 microsatélites, se identificaron claras evidencias de TRD con patrón genotípico, 3 de ellos con patrón aditivo y 9 con patrón de heterosis. Por otro lado, se detectaron 19 alelos, pertenecientes a 10 microsatélites, que mostraron patrón alélico de TRD, de los cuales 5 mostraron un patrón específico de la descendencia según su sexo. A partir de todas las regiones identificadas con TRD, se identificaron 24 genes anotados, los cuales se han asociado con el metabolismo y la homeostasis del colesterol, y suelen estar relacionados con síntomas no específicos de infertilidad, problemas de crecimiento y el deterioro de la salud en general. En vista de los resultados obtenidos en este capítulo, la evidencia de desviaciones en la herencia mendeliana ha quedado patente en la población de caballos de PRE, tanto desde el punto de vista de la genética cuantitativa como molecular, en caracteres morfológicos y en caracteres relacionados con la fertilidad y la eficiencia reproductiva de las yeguas de esta Raza. Además, aunque hacen falta más estudios al respecto, la implantación de estos modelos en las evaluaciones genéticas periódicas de la Raza podría ser de gran interés, tanto para la conservación de la variabilidad genética, como para la estimación de los valores de cría de los animales. 87 CAPÍTULOS 2.1 Artículo 3 (Capítulo II). Genetic inbreeding depression load for fertility traits in Pura Raza Española mares. Título (en Español): Potencial de depresión consanguíneo en caracteres de fertilidad en yeguas de Pura Raza Española. Autores: Davinia Isabel Perdomo-González1; Antonio Molina2; María José Sánchez- Guerrero3; Ester Bartolomé1; Luis Varona4; Mercedes Valera1. Afiliaciones: 1Departamento de Agronomía, ETSIA, Universidad de Sevilla, Carretera de Utrera Km 1, 41013 Sevilla, Spain. 2Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Gregor J. Mendel, Planta baja, Carretera Madrid-Cádiz km 396ª, 14071 Córdoba, Spain. 3Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica, Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, Spain, 4Departamento de Anatomía Embriología y Genética Animal, Instituto Agroalimentario de Aragón (IA2), Universidad de Zaragoza, Zaragoza, Spain Revista: Journal of Animal Science. Año de Publicación: 2021 Número y páginas: 12, 1-10 DOI: 10.1093/jas/skab316 Índice de impacto: 3, 338 (JCR, 2021) (1º cuartil) Área y posición: Agriculture, Dairy & Animal Science 10/62 CAPÍTULOS 2.2 Artículo 4 (Capítulo II). Quantitative analysis of parent-of-origin effect in reproductive and morphological selection criteria in the pura Raza Española horse. Título (en Español): Análisis cuantitativo del efecto del padre de origen en criterios de selección reproductivos y morfológicos en el caballo de Pura Raza Española Autores: Davinia Isabel Perdomo-González1; Luis Varona2; Antonio Molina3; Nora Laseca3; Mercedes Valera1. Afiliaciones: 1Departamento de Agronomía, ETSIA, Universidad de Sevilla, Carretera de Utrera Km 1, 41013 Sevilla, Spain. 2Departamento de Anatomía Embriología y Genética Animal, Instituto Agroalimentario de Aragón (IA2), Universidad de Zaragoza, Zaragoza, Spain 3Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Gregor J. Mendel, Planta baja, Carretera Madrid-Cádiz km 396ª, 14071 Córdoba, Spain. Revista: Journal of Animal Breeding and Genetics. Año de Publicación: 2023 Número y páginas: 00, 1-11 DOI: 10.1111/jbg.12811 Índice de impacto: 2,600 (JCR, 2022) (1º cuartil). Área y posición: Agriculture, Dairy & Animal Science 15/62 99 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE 100 10 . CAPÍTULOS 2.3 Artículo 5 (Capítulo II). Transmission ratio distortion detection by neutral genetic markers in the Pura Raza Española horse breed. Título (en Español): Detección de la Distorsión en el ratio de transmisión mediante marcadores genéticos neutros en la raza equina Pura Raza Española. Autores: Davinia Isabel Perdomo-González1; Samir Id-Lahoucine2; Antonio Molina3; Angela Cánovas4; Nora Laseca3; Pedro Javier Azor5; Mercedes Valera1. Afiliaciones: 1Departamento de Agronomía, ETSIA, Universidad de Sevilla, Carretera de Utrera Km 1, 41013 Sevilla, Spain. 2Department of Animal and Veterinary Science, Scotland’s Rural College, Easter Bush, Edinburgh, EH25 9RG, United Kingdom. 3Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Gregor J. Mendel, Planta baja, Carretera Madrid-Cádiz km 396ª, 14071 Córdoba, Spain. 4Center of Genetic Improvement of Livestock, Department of Animal Biosciences, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada. 5Real Asociación Nacional de Criadores de Caballos de Pura Raza Española (ANCCE), Sevilla, 41014, Spain. Revista: Animal (en revisión). Año de Publicación: 2023 Índice de impacto: 3,600 (JCR, 2022) (1º cuartil). Área y posición: Agriculture, Dairy & Animal Science 7/62 Veterinary Science 9/143 113 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE 114 Powered by Editorial Manager® and ProduXion Manager® from Aries Systems Corporation Powered by Editorial Manager® and ProduXion Manager® from Aries Systems Corporation 1 1 Transmission ratio distortion detection by neutral genetic markers in the 2 Pura Raza Española horse breed 3 D.I. Perdomo-Gonzáleza, S. Id-Lahoucineb, A. Molinac, A. Cánovasd, N. 4 Lasecac, P.J. Azore, M. Valeraa 5 6 aDepartamento de Agronomía, ETSIA, Universidad de Sevilla, Sevilla, 41005, 7 Spain. 8 bDepartment of Animal and Veterinary Science, Scotland’s Rural College, Easter 9 Bush, Edinburgh, EH25 9RG, United Kingdom. 10 cDepartamento de Genética, Universidad de Córdoba, Córdoba, 14014, Spain. 11 dCenter of Genetic Improvement of Livestock, Department of Animal Biosciences, 12 University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada. 13 eReal Asociación Nacional de Criadores de Caballos de Pura Raza Española 14 (ANCCE), Sevilla, 41014, Spain. 15 Corresponding author: Davinia Isabel Perdomo-González. E-mail: 16 [email protected] 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 26 27 Abstract 28 Transmission ratio distortion (TRD) is a genetic phenomenon widely 29 demonstrated in several livestock species, but barely in equine species. The TRD 30 occurs when certain genotypes are over- or under-represented in the offspring of 31 a particular mating and can be caused by a variety of factors during gamete 32 formation or during embryonic development. For this study, 126394 trios 33 consisting of a stallion, mare, and offspring were genotyped using a panel of 17 34 neutral microsatellite markers recommended by the International Society for 35 Animal Genetics (ISAG) for paternity tests and individual identification. The 36 number of alleles available for each marker ranges from 13 to 18, been 268 the 37 total number of alleles investigated. The TRDscan v.2.0 software was used with 38 the biallelic procedure to identify regions with distorted segregation ratios. After 39 completing the analysis, a total of 12 alleles (out of 11 microsatellites) were 40 identified with decisive evidence for genotypic TRD; 3 and 9 with additive and 41 heterosis patterns, respectively. In addition, 19 alleles (out of 10 microsatellites) 42 were identified displaying allelic TRD. Among them 14 and 5 were parent- 43 unspecific and stallionmare- specific TRD. Out of the TRD regions, 24 genes 44 were identified and annotated, predominantly associated with cholesterol 45 metabolism and homeostasis. These genes are often linked to non-specific 46 symptoms like impaired fertility, stunted growth, and compromised overall health. 47 The results suggest a significant impact on the inheritance of certain genetic traits 48 in horses. Further analysis and validation are needed to better understand the 49 TRD impact before the potential implementation in the horse breeding program 50 strategies. 51 52 Keywords 53 Mendelian inheritance, microsatellite marker, equine, fertility, genotypic 54 expression 55 56 3 57 Implications 58 The event where certain genotypes are over- or under-represented in the next 59 generation in known as Transmission ratio distortion (TRD). The Pura Raza 60 Española (PRE) horse is known for its distinct characteristics, such as the psychic 61 balance and the harmony of its forms, highly desired by breeders. This study 62 elucidates genetic and allelic TRD patterns that underly in the PRE population 63 which are related to 24 annotated genes, that can lead to potential health issues. 64 Therefore, it is crucial further TRD analysis and validation to carefully manage 65 breeding programs to maintain the health of the PRE horse population. 66 67 Introduction 68 Mendel's first law, also known as the law of segregation, is a fundamental 69 principle in biology. It states that each parent has two alleles for a given trait, and 70 these alleles separate during gamete formation, with each gamete receiving only 71 one allele. As a result, each offspring has an equal chance of inheriting either 72 allele from its parent. Nevertheless, exceptions to this Mendelian principle have 73 been described (Ostberg et al., 2013). This event remains still not completely 74 clear in practically all livestock species, especially in the case of the horse, where 75 it has been barely studied up to now. Biologically speaking, TRD can arise from 76 various mechanisms that impact germ cells, such as meiotic drive, germline 77 selection, gametic competition (Huang et al., 2013), embryonic lethality (Zöllner 78 et al., 2004), or postnatal survival (Moore, 2006). Various genetic phenomena 79 such as linkage disequilibrium (which can contribute to the lack of Mendelian 80 inheritance rules by affecting the expected frequencies of particular genotype 81 combinations in a population), genomic imprinting or inbreeding depression, 82 contribute also to this lack of mendelian inheritance rules, among others. 83 Therefore, the TRD can be regarded as the end result of multiple genetic factors 84 that occur during various phases of the reproductive process and early neonatal 85 development (Fishman and McIntosh, 2019). 86 The Pura Raza Española (PRE) horse is an indigenous Spanish horse breed and 87 one of the oldest in Europe, which has influenced the creation of numerous horse 88 breeds worldwide, including the Lipizzan, Lusitano, and several American strains. 10 270 270 271 [Table 4] 272 272 273 Significant molecular functions (Table 5) were related in most cases with 274 transmembrane transport as oxalate transmembrane transporter activity 275 (GO:0019531) and secondary active sulfate transmembrane transporter activity 276 (GO:0008271). These molecular functions included only two genes, SLC26A4 277 and SLC26A3. 278 [Table 5] 279 [Table 6] 280 The significant terms for the cellular components were mainly related to the 281 membrane components and transport as the ATP-binding cassette (ABC) 282 transporter complex (GO:0043190), nuclear speck (GO:0016607), apical plasma 283 (GO:0016324) and integral components of the plasma membrane (GO:0005887). 284 The genes involved in these processes are ABCG8, ABCG5, CCDC188, PPM1B, 285 RASL11B, COG5, NIPAL3, PNPLA3, MBOAT2, COMT, PIK3CG, SNW1, HBP1, 286 SRSF10, CBLL1, and SRRM1. 287 As shown in Fig. 1, genes related to TRD regions in the Pura Raza Española 288 horse are linked to a large list of biological processes, molecular function, and 289 cellular components processes. According to the percent of gene hit against total 290 number of genes, the most representative processes for biological process 291 category are cellular process (GO:0009987, 46.6%), metabolic process 292 (GO:0008152, 27.2%) and biological regulation (GO:00665007, 26.0%), while for 293 molecular function category the most representative processes are binding 294 (GO:0005488, 28.2%) and catalytic activity (GO:0003824, 18.3%). 295 [Insert Fig.1 here] 296 297 Metabolic Pathway analysis. Two metabolic pathways significantly related to TRD 298 regions in the PRE horse were identified using DAVID software (Table 7). These 299 pathways are fat digestion and absorption (ecb04975) and cholesterol 11 300 metabolism (ebc04979), both of them represented for the same three genes: 301 ABCG8, ABCG5, and APOB. Interestingly, the gene network analysis also 302 revealed how these three genes, ABCG8, ABCG5, and APOB, show interactions 303 between them (Fig. 2). Using the AmiGO and PANTHER GO-Slim databases, the 304 significative genes related to TRD in the PRE horse are linked to a total of 160 305 different pathways, where the most important, according to the percent of genes 306 affected against the total number of genes, are inflammation mediated by the 307 chemokine and cytokine signaling pathways (P0031, 1.3%), Wnt signaling 308 pathway (P00057, 1.3%) and gonadotropin-releasing hormone receptor 309 pathways (P06664, 1.1%) 310 311 [Table 7] 312 [Insert Fig 2. Here] 313 313 314 Discussion 315 The TRD occurs in the genome when certain alleles/genotypes are over- or 316 under-represented in the offspring generation. This can occur due to a variety of 317 factors, including the presence of germline selection, gametic competition, 318 meiotic drive, embryo lethality (Seidel et al., 2011), inbreeding depression, imprint 319 resetting error, diseases, and even differential postnatal viability. Depending on 320 the penetrance of TRD in a population, it can have a significant impact on the 321 efficiency of animal breeding programs, as it can result in a decreased genetic 322 gain on reproductive traits, a reduction in selection response or a reduced genetic 323 diversity within a population. Therefore, the overall impact of TRD on animal 324 breeding programs is generally negative, and it is important for animal breeders 325 to be aware of the potential for TRD and to take steps to mitigate its effects, such 326 as using molecular markers to detect and track the spread of TRD-causing 327 alleles. This can allow breeders to make informed decisions about matings and 328 avoid producing offspring with unwanted alleles/genotypes. In addition, it allows 329 them to select and propagate desirable genotypes that can lead to better animal 330 performance and increase the overall efficiency of breeding programs. 12 331 Timid evidence of TRD has been present in livestock since 1985, as revealed by 332 a segregation study of eleven swine leukocyte antigen (SLA) haplotypes in two 333 breeds of pigs (Philipsen and Kristensen, 1985). While there are some studies 334 related to mendelian inheritance alteration in horses, the extent and prevalence 335 of TRD in this specie have not been analyzed so far. In an extended family of 336 American Standardbreed horses, Bailey (1986) observed a clear excess male 337 transmission for haplotype of the equine lymphocyte antigen (ELA) system, which 338 is a segregation distortion analogous to the T/t complex in mice. Years later, the 339 first sire-specific gene TRD, affecting all typed alleles at 12 protein marker loci in 340 a cohort of over 5000 phenotyped horses, was reported by Weitkamp et al. (1988) 341 in American Standardbred stallions. When this type of study is carried out, the 342 first precaution to take into account is to rule out that the Mendelian inconsistency 343 is not due to genotyping errors. 344 Microsatellite markers are a useful and powerful genetic tool due to their 345 extensive length polymorphism, which results in allelic variation in the number of 346 tandemly arranged perfect repeats. Compared to the SNPs markers, STRs have 347 the advantage of the high number of markers present in current commercial 348 arrays and the disadvantage of presenting only two variants, compared to 6 to 18 349 for STR markers (Tautz, 1989). Although the use of microsatellites has clearly 350 declined in recent years (due to their relative higher cost and poorer 351 standardization than other types of markers), they are gaining renewed interest 352 in certain aspects. Thus studies of the human genome have revealed several 353 examples of functional STRs, whose length variations can alter susceptibility to 354 disease (Contente et al., 2002). There is additional evidence supporting the 355 functional role of STRs in human disease, as seen in numerous disorders 356 resulting from the expansion of large repeat sequences in coding or non-coding 357 regions (Gemayel et al., 2010). While the pathogenic effect of STRs has been 358 primarily studied in humans, there are also instances of their impact in other 359 vertebrates. Furthermore, variable STRs in both coding and noncoding regions 360 have been shown to modulate quantitative phenotypes in dogs (Körberg et al., 361 2014). Finally, there are authors (Cánovas et al., 2012) who consider that STRs 362 can operate as loci of quantitative expression traits (eQTL) and methylation 363 (mQTL) in pigs and humans, respectively, demonstrating the association with 13 364 variation in local gene expression of neighboring gene promoters, thus playing a 365 role in genome functionality. 366 In this study, different TRD models were identified among STRs suggesting 367 strong evidence of the corresponding inheritance pattern of the observed TRD 368 when the log10 BF value was higher than 1 (BF>10), and statistical decisive 369 evidence of the model when log10BF >2 (BF >100). Both, allelic and genotypic 370 patterns have been observed in the Pura Raza Española horse genome. In this 371 context, among the 31 identified alleles, 19 fit better to the allelic model (Table 2) 372 and 12 fit better with the genotypic model (Table 3). 373 From the distorted regions with allelic transmission ration distortion pattern (table 374 2), 14 alleles have shown evidence of overall TRD, (log10 BF >2) which can be 375 seen as a merge between specific sire- and dam-TRD (Casellas et al., 2014, 376 2017). For regions with parent-specific TRD, 3 regions showed dam- and 2 377 regions exhibited sire-TRD. For these alleles, we also observed an overall TRD 378 but with lower TRD magnitudes, it means that the parent's origin of TRD can be 379 confirmed, even if it is identified as overall TRD, by having sufficient informative 380 offspring from the parent who did not exhibit TRD. This is in concordance with Id- 381 Lahoucine (2020), highlighting the importance of modeling the probability of 382 inheritance considering the paternal- and maternal-origin in search of parent- 383 specific TRD. One should keep in mind that certain biological mechanisms that 384 lead to TRD may be restricted to only one of the parental genders. In fact, sex- 385 dependent TRD has been previously reported in other studies on beef cattle 386 (Casellas et al., 2017). 387 The TRD magnitude is a measure of the degree to which one allele/genotype is 388 over- or under-transmitted to the next generation. A value of -0.5) 389 indicates complete skewing of transmission for a single allele, while null TRD 390 . Within 391 allelic TRD pattern, it can be observed that most regions with significant overall 392 TRD, TRD value ranged from -0.16 to -0.49, which means moderate to high under 393 transmission. When parent-specific TRD regions are analyzed, both sire and 394 dam-TRD values were close to the null distribution. Only dam-specific TRD in the 395 ASB23 STR marker and sire-specific TRD in the ASB2 STR marker showed 14 396 significant log10 BF and TRD value closest to the complete skewing under- 397 transmission. 398 The genotypic model highlighted 3 regions with additive pattern and 9 with either 399 excess or deficiency of heterozygous offspring (Table 3). The results indicate 400 varying levels of statistical significance for TRD estimates, indicating different 401 levels of model fit. Within this context, the three distorted regions with genotypic 402 ration distortion pattern and additive pattern showed TRD values with moderate 403 transmission. The heterosis effect may be responsible for the other patterns 404 observed in the genotypic model. An excess or deficiency of heterozygous 405 offspring was observed in these regions. It is worth mentioning that there were 3 406 female- and 1 male-specific offspring regions with clear evidence of TRD, which 407 were similar pattern that described across the cattle genome (Id-Lahoucine et al., 408 2022). 409 For all this, it is worth to mention that both models presented supportive analytical 410 methods which permit recording different types of TRD and spotlight the 411 importance of accomplish both models. After the TRD detection, TRD analyses 412 and characterization can aid in the discovery of new candidate lethal alleles and 413 genes related to TRD, which directly affect reproduction. For this, potential 414 regions subjected to TRD were analyzed and genes related to BP, CC, MF, and 415 metabolic pathways were studied. 416 A total of 24 annotated genes [see Supplementary Table S1] have been located 417 within the TRD regions using STRs in the PRE population, and most of them have 418 a function related with fertility and/or play an important role of reproductive 419 problems. The ATP binding cassette subfamily G member 5 (ABCG5) and 420 member 8 (ABCG8) are located at the sitosterolemia locus, where each gene 421 encodes a membrane-bound ABC half-transporter and forms a functional unit. 422 The activity of this unit is responsible for biliary and intestinal excretion. However, 423 knockout mice for these genes exhibit infertility and a loss of abdominal fat. (Solca 424 et al., 2013). Furthermore, complementation factors for APOB mRNA editing 425 have been shown to be essential for embryogenesis and fertility in 426 Caenorhabditis elegans (Kinnaird et al., 2004) and APOB deficiency produce 427 malabsorption of dietary lipids but also deleterious effects on liver lipid 428 metabolism, steroid biosynthesis, and cell membrane function that can result in 15 429 unspecific symptoms of reduced fertility, growth, and health in caws (Gross et al., 430 2016). Mice that express a human APOB gene are unable to deliver their 431 offspring if the transgene is present in a homozygous state, but not when present 432 in a heterozygous form. (Word et al., 2005). The SLIRP gene encodes a steroid 433 receptor RNA activator (SRA) RNA-binding protein that acts as a potent repressor 434 of nuclear receptor activity. Its coregulators have essential functions in initiating 435 and directing gene expression that affects mammalian reproduction, 436 development, and metabolism (Colley et al., 2013). Studies with SLIRP knockout 437 mouse showed subfertile response, specifically when homozygous knockout 438 males were crossed with wild-type females and the resultant average litter size 439 is reduced by approximately one third compared with those produced by wild 440 males and females (Colley et al., 2013). On the other hand, a human study 441 revealed a reduced level of SLIRP mRNA and protein expression in men with 442 asthenospermia compared to normospermia (Shan et al., 2020). They concluded 443 that in men with asthenospermia, SLIRP expression is reduced, oxidative 444 damage is increased, and energy metabolism is decreased in spermatozoa. The 445 LRPPRC gene is related to gene expression, mitochondrial DNA replication, and 446 protein synthesis and degradation, but until date they are not totally related to 447 primary ovarian insufficiency (POI). However, the implication of mitochondrial 448 dysfunction in POI suggests that manipulating mitochondrial function is a crucial 449 therapeutic target for preventing or treating POI in humans (Tiosano et al., 2019). 450 Furthermore, alterations in the THADA gene seems to be related with obesity, 451 hirsutism, and amenorrea, which are directly implicated in enlarged polycystic 452 ovaries in humas (Cariati et al., 2019). Engrossing, the gene network analysis 453 also revealed how these two genes, SLIRP, and LRPPRC show interactions 454 between them (Fig. 2), and both are associated to PPM1B. 455 The PPM1B gene, a metal-dependent serine/theonine protein phosphatase, is 456 related to foliculogenesis and ovulation; its depletion induces premature 457 senescence in human fibroblasts (Park et al., 2014). In addition, Ishii et al. (Ishii 458 et al., 2019) suggests that the development of the follicles is excessive in 459 PPM1B+/- mice, and that this leads to a partial depletion of mature follicles and a 460 corresponding decrease in the number of ovulated oocytes. The NIPAL3 gene 461 has been identified as a germline cancer predisposition gene in humans (Park et 16 462 al., 2018). Uncommon germline variants in these genes contribute significantly to 463 cancer risk, accounting for approximately 14% of ovarian carcinomas, 7% of 464 breast tumors, and 4% of endometrial carcinomas of the uterine corpus. The 465 PIK3CG gene is specifically expressed in mononuclear cells and was significantly 466 associated with age-at-menopause in humans and daughter stillbirth in cattle (Liu 467 et al., 2020). 468 The ALKBH1 gene belongs to the family of mammalian dioxygenases. 469 Nordstrand et al. (2010) demonstrated that the allele ALKBH1 shows non- 470 mendelian inheritance in mice. Offspring with ALKBH1 -/- or heterozygous 471 ALKBH1 +/- genotypes are born at significantly reduced frequencies. Moreover, 472 the sex ratio is heavily skewed against female offspring, with only one female 473 born for every three to four males. Genetic and phenotypic assessments indicate 474 that ALKBH1 plays a role in regulating gene expression during spermatogenesis 475 and is critical for normal embryonic development and sex ratio distribution in 476 mice. 477 The SLC26A3 gene encodes a chloride/bicarbonate exchanger that is 478 predominantly expressed in gastrointestinal, pancreatic, and renal tissues. In 479 humans, mutations in the SLC26A3 gene have been shown to cause congenital 480 chloride-losing diarrhea (CLD), an infrequent autosomal recessive disorder 481 characterized by chronic secretory diarrhea. El Khouri et al. (2018) showed that 482 the absence of SLC26A3 is linked to significant abnormalities in the epididymis' 483 cytoarchitecture, causing severe lesions, and in the quantity, quality, and 484 morphology of sperm. These findings compromised male fertility, which is 485 supported by reports indicating subfertility in some male CLD patients, as well as 486 the expression of SLC26A6 and SLC26A3 in sperm cells and the male genital 487 tract. At the same time, a study in mice (Hihnala et al., 2006) showed that the 488 pathophysiological mechanisms that can disturb reproductive functions and 489 cause male subfertility in CLD patients are similar to those induced by cystic 490 fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) deficiency in the male 491 reproductive system. That also suggests a primary role for SLC26A3 in male 492 reproduction. Ultimately, the splicing factor SRSF10 plays a crucial role in 493 spermatogenesis and male fertility. Without SRSF10, the formation of 494 spermatogonial stem cells may occur, but the expansion of Promyelocytic Zinc 17 495 Finger (PLZF)-positive undifferentiated progenitors could be hindered, leading to 496 a failure in spermatogonia differentiation and the initiation of meiosis. (Liu et al., 497 2022). The SRSF10 gene also appears to be a downregulated gene at high 498 temperature on the ovine sperm transcriptome (Ureña et al., 2022). 499 Although more research is needed to understand how common the TRD 500 phenomenon is and how it affects the inheritance of different traits in horses, 19 501 alleles of TRD with allelic pattern and 12 alleles with genotypic pattern of TRD 502 have been identified in this work from 268 alleles investigated across the 17 503 markers in the Pura Raza Española horse. From those regions, 24 genes were 504 annotated, most of which play an important role in functions and biological 505 processes resulting in symptoms of reduced fertility. Overall, TRD is a complex 506 event that is not fully understood in horses, but that clearly is an important aspect 507 for animal breeding programs, which has a significant impact on the inheritance 508 of reproductive and fertility traits. For these reasons, it must be considered to 509 optimize the genetic conformation and performance of a population. 510 510 511 511 512 Ethics approval 513 Not applicable. 514 Data and model availability statement 515 The dataset supporting the results of this study was supplied by the National 516 Association of Pura Raza Española Horse Breeders (ANCCE). The datasets 517 generated and/or analyzed during the current study are available from the 518 corresponding author upon reasonable request. 519 519 520 Author ORCIDs 521 D.I. Perdomo-González: https://orcid.org/0000-0003-2618-105X 522 S. Id-Lahoucine: https://orcid.org/0000-0001-5289-4788 523 A. Molina: https://orcid.org/0000-0002-9566-6600 18 524 A. Cánovas: https://orcid.org/0000-0002-0036-0757 525 N. Laseca: https://orcid.org/0000-0003-3753-6725 526 M. Valera: https://orcid.org/0000-0003-1742-550X 527 528 Authors' contributions 529 D.I. Perdomo-González: Investigation, Formal analysis, Writing - Original Draft, 530 Writing - Review & Editing. S. Id-Lahoucine: Conceptualization, Methodology, 531 Formal analysis. A. Molina: Conceptualization, Methodology, Formal analysis, 532 Project administration. A. Cánovas: Writing - Review & Editing, Supervision. N. 533 Laseca: Investigation, Writing - Original Draft. P.J. Azor: Resources. M. Valera: 534 Writing - Review & Editing, Supervision, Project administration. All authors 535 contributed to the interpretations of the results, the discussion and prepared the 536 final manuscript. All authors read and approved the final manuscript. 537 537 538 Declaration of interest 539 None. 540 Acknowledgements 541 We wish to thank the Pura Raza Española Horse Breeders Association for the 542 data. Also, we wish to thank Dr. Samir Id-Lahoucine for the dedication and 543 support he has given to this work, and for the direction and rigor he has provided 544 in models implementation resulted from his thesis. 545 Financial support statement 546 This research received no specific grant from any funding agency, commercial or 547 not-for-profit section. 548 548 549 549 550 550 551 551 19 552 References 553 Asselstine, V., Miglior, F., Suárez-Vega, A., Fonseca, P.A.S., Mallard, B., Karrow, N., 554 Islas-Trejo, A., Medrano, J.F., Cánovas, A., 2019. Genetic mechanisms regulating the 555 host response during mastitis. Journal of Dairy Science 102, 9043–9059. 556 Bailey, E., 1986. Segregation distortion within the equine MHC; analogy to a mouse 557 T/t-complex trait. Immunogenetics 24, 225–9. 558 Binns, M.M., Holmes, N.G., Holliman, A., Scott, A.M., 1995. Identification of 559 polymorphic microsatellite loci in the horse and their use in Thoroughbred parentage 560 testing. 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Distorted regions with allelic transmission ration distortion (TRD) pattern. 26 STR ns nd ABxAA1 ABxBB AAxAB BBxAB ABxAB Pat TRD effect (log AA2 AB AB BB AA AB AB BB AA AB BB 10(BF)) HTG4 5 12 0 0 0 27 0 0 0 27 0 0 0 O -0.48 (14.51) HTG6 0 7 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 O -0.43 (3.31) HTG6 1 6 0 0 0 14 0 0 0 9 0 0 0 O -0.45 (5.54) HTG6 5 29 0 0 0 22 0 0 0 72 0 0 0 O -0.49 (26.30) AHT5 4 28 0 0 3 33 0 0 21 51 0 0 0 O -0.27 (6.66) HMS6 2 4 0 0 0 4 0 0 0 11 0 0 0 O -0.43 (3.31) ASB23 10 13 0 0 84 96 0 0 7 34 0 0 0 D s= -0.03 (- d = -0.31 (3.37) ASB2 2 3 0 0 3 20 0 0 2 2 0 0 0 S s= - d= -0.01 (-0.27) ASB2 25 82 0 0 82 145 0 0 63 157 5 1 3 O -0.16 (9.88) HTG7 0 8 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 O -0.43 (3.31) HTG7 197 911 2 0 829 886 2 1 1133 1337 19 39 24 D s= -0.02 (- d= -0.04 (2.09) HTG7 2137 9016 8119 7840 525 533 7961 7606 524 499 1871 3616 1756 O HTG7 3 23 0 0 0 7 0 0 0 54 0 0 0 O -0.48 (16.56) HTG7 8 30 0 0 23 93 0 0 23 63 0 3 0 O -0.26 (12.17) HMS1 11 48 0 0 37 39 0 0 47 84 0 1 1 D s= -0.02 (- d= -0.14 (1.42) HMS1 4 11 0 0 0 7 0 0 1 26 0 0 2 O -0.45 (8.27) CA425 1 8 0 0 0 1 0 0 2 17 0 0 0 O -0.36 (2.42) CA425 14 54 0 0 30 56 0 0 38 42 0 0 2 S s= - d= -0.04 (-0.77) LEX33 2 2 0 0 0 9 0 0 0 2 0 0 0 O -0.42 (2.23) 735 Distribution of offspring from all matings and corresponding TRD estimates. STR = Microsatellite marker; ns = Hetero sires; nd = Hetero dams; 736 Pat = Pattern; O = Overall pattern; D = Dam pattern; S = Sire pattern; = Overall TRD; s = Sire-TRD; d = Dam-TRD; 1Sire x dam mating 737 genotypes; 2Offspring genotype from the corresponding mating. 738 739 Table 3. Distorted regions with genotypic transmission ration distortion (TRD) pattern. 27 STR ns nd ABxAA1 ABxBB ABxAB Pat TRD effect (log10 BF) 740 Distribution of offspring from all matings and corresponding TRD estimates. STR = Microsatellite marker; ns = Heterozygous sires; nd = 741 Heterozygous dams; Pat = Pattern; A = Additive pattern; H- = Heterosis deficiency; H+ = Heterosis excesses; g = Additive TRD; g = Dominance 742 TRD; 1Sire x dam mating genotypes; 2Offspring genotype from the corresponding mating, 3The distribution of offspring only correspond to female 743 (Fo) or male (Mo) offspring; g-Fo and g-Fo); g-Mo 744 and g-Mo). AA2 AB AB BB AA AB BB HTG10 1210 5372 116 109 11502 11738 430 992 481 A g g= 0.02 (-0.19) ASB17 376 1246 21 14 3830 4032 36 96 48 A g g= 0.02 (-1.41) CA425 348 1196 12 13 3440 3335 89 144 64 A g= - g= -0.04 (1.56) HTG4 1468 5924 176 171 14097 14231 735 1336 693 H- g= - g= -0.02 (1.79) HTG6 66 294 0 0 668 693 12 11 9 H- g= - g= -0.18 (13.38) HMS6 1310 5178 97 102 12570 12288 495 1091 540 H+ g= 0.03 (- g= 0.03 (2.24) ASB23 983 3614 36 51 9977 9560 297 657 291 H+ g= 0.03 (- g= 0.04 (3.93) ASB17 112 462 0 0 1335 1243 5 24 10 H+ g g= 0.17 (11.09) VHL20 723 2698 21 19 4472 4753 149 252 142 H- Fo3 g-Fo = -0.05 (- g-Fo = -0.06 (4.94) HMS3 407 1229 19 18 2413 2509 66 101 69 H- Fo g-Fo = -0.07 (- g-Fo = -0.06 (2.17) HMS2 112 443 1 1 716 760 14 20 7 H- Fo g-Fo = - g-Fo = -0.14 (6.32) AHT4 118 408 0 0 702 775 10 10 9 H- Mo g-Mo = - g-Mo = -0.18 (13.40) 745 Table 4. Significant biological process related to microsatellite markers in the 746 Pura Raza Española horse. 28 GO TERM Count List total % Genes1 P- value Fold Enrichment GO:0033344~cholesterol efflux 3 78 3.2 ABCG8, ABCG5, APOB 0.004 29.8 GO:0000961~negative regulation of mitochondrial RNA catabolic process GO:0045796~negative regulation of intestinal cholesterol absorption GO:0010949~negative regulation of intestinal phytosterol absorption 2 78 2.1 SLIRP, LRPPRC 0.010 198.7 2 78 2.1 ABCG8, ABCG5 0.010 198.7 2 78 2.1 ABCG8, ABCG5 0.010 198.7 GO:0055088~lipid homeostasis 3 78 3.2 ADCK1, PNPLA3, THADA 0.011 18.6 GO:0007588~excretion 2 78 2.1 ABCG8, ABCG5 0.020 99.3 GO:0070129~regulation of 2 78 2.1 ALKBH1, LRPPRC 0.034 56.7 mitochondrial translation GO:0042632~cholesterol homeostasis 3 78 3.2 ABCG8, ABCG5, 0.041 9.1 APOB 747 Analysis was made using the DAVID database. 1Genes name list at Supplementary 748 Table S1. 749 750 751 Table 5. Significant molecular functions related to microsatellite markers in the 752 Pura Raza Española horse. 29 GO TERM Count List total GO:0019531~oxalate % Genes1 P- Value SLC26A4, Fold Enrichment transmembrane transporter activity GO:0008271~secondary 2 69 2.1 SLC26A3 0.042 45.8 active sulfate transmembrane transporter activity 2 69 2.1 SLC26A4, SLC26A3 0.046 41.6 753 Analysis was made using the DAVID database. 1Genes name list at Supplementary 754 Table S1. 755 756 757 Table 6. Significant cellular components related to microsatellite markers in the 758 Pura Raza Española horse. 30 GO TERM Count List total % Genes1 P- Value Fold Enrichment GO:0043190~ATP- binding cassette (ABC) 2 82 2.1 ABCG8, ABCG5 0.009 216.3 transporter complex CCDC188, PPM1B, RASL11B, GO:0016020~membrane 9 82 9.7 COG5, NIPAL3, 0.019 2.6 PNPLA3, MBOAT2, COMT, PIK3CG GO:0016607~nuclear SNW1, HBP1, speck 5 82 5.4 SRSF10, CBLL1, 0.050 3.5 SRRM1 759 Analysis was made using the DAVID database. 1Genes name list at Supplementary 760 Table S1. 761 762 763 764 Table 7. Significant metabolic pathways related to STRs in the Pura Raza 765 Española horse. 31 KEGG PATHWAY Count List total % Genes1 P - Value Fold Enrichment ecb04975: Fat digestion and absorption ecb04979: Cholesterol metabolism 3 39 3.261 ABCG8, ABCG5, APOB 3 39 3.261 ABCG8, ABCG5, APOB 0.016 14.915 0.018 14.020 766 Analysis was made using the DAVID database. 1Genes name list at Supplementary 767 Table S1. 768 769 List of figure captions 32 770 Figure 1. Functional analysis of gene ontology terms using the list of positional 771 genes with TRD. 772 Positional genes with TRD in the Pura Raza Española horse using AmiGO and 773 PANTHER GO-Slim. Biological process (a), Molecular functions (b), Cellular 774 components (c) GO categories. 775 776 777 Figure 2: Gene network of genes annotated within the TRD regions identified in 33 778 the Pura Raza Española horse 254 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE Autores Ripollés-Lobo, M; Perdomo-González, D.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Bartolomé, E.; Valera, M. Título: Genetic relationship between free movement and under rider gaits in young Pura Raza Española horses Referencia: Livestock Science, 263 (2022). https://doi.org/10.1016/j.livsci.2022.105031 Editorial: Elsevier País de publicación: Holanda ISSN: 1871-1413 EISSN: 1878-0490 Índice de impacto: 1,80 (JCR, 2022) Área y posición: Agriculture, Dairy & Animal Science 29/62 Autores Ripollés-Lobo, M; Perdomo-González, D.; Azor, P.J., Valera, M. Título: Evaluation of potential effects and genetic parameters in conformational limb defects in Pura Raza Española horses. Referencia: Italian Journal of Animal Science, 22:1, 407-417 (2023). https://doi.org/10.1080/1828051X.2023.2206419 Editorial: Taylor & Francis LTD País de publicación: Italia ISSN: 1594-4077 EISSN: 1828-051X Índice de impacto: 2,50 (JCR, 202) Área y posición: Veterinary Sciences 25/143 Agriculture, Dairy & Animal Science 16/62 Libros completos y capítulos de libro Autores: Sánchez, M.J.; Azor, P.J.; Perdomo-González, D.I.; Encina, A.; Molina, A.; Demyda, S.; Valera, M. Título: Catálogo de reproductores de Pura Raza Española - 2020 Editorial: Asociación Nacional de Criadores de Pura Raza Española (ANCCE) ISBN: 978-84-09-29691-0 Páginas: 154 Año: 2020 Ciudad: Sevilla País de publicación: España 255 ANEXO 2 Autores: Perdomo-González, D.I.; Azor, P.J.; Encina, A.; Molina, A.; Demyda, S.; Valera, M. Título: Catálogo de reproductores de Pura Raza Española - 2021 Editorial: Asociación Nacional de Criadores de Pura Raza Española (ANCCE) ISBN: 978-84-09-36523-4 Páginas: 194 Año: 2021 Ciudad: Sevilla País de publicación: España Autores: Perdomo-González, D.I.; Azor, P.J.; Encina, A.; Molina, A.; Demyda, S.; Valera, M. Título: Catálogo de reproductores de Pura Raza Española - 2022 Editorial: Asociación Nacional de Criadores de Pura Raza Española (ANCCE) ISBN: 978-84-09-47594-0 Páginas: 232 Año: 2022 Ciudad: Sevilla País de publicación: España Congresos internacionales Autores: Perdomo-González, D.I.; Bartolomé, E; Sánchez-Guerrero, MJ; Valera M. Título: Influence of intrinsic effects on effort and recovery stress assessed with infrared thermography. Congreso: 70th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of abstracts of the 70th Annual Meeting of the EuropeanF for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-339-6) Volumen/páginas: 279 Tipo de participación: oral Lugar de celebración: Ghent, Belgium Fecha: 26-30 de agosto de 2019. 256 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE Autores: Perdomo-González, D.I.; Poyato-Bonilla, J.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Casellas, J.; Molina, A.; Valera M. Título: Potential of inbreeding depression in morphological traits of the Pura Raza Español horse Congreso: 70th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of Abstracts of the 70th Annual Meeting of the European Federation for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-339-6) Volumen/páginas: 583 Tipo de participación: oral Lugar de celebración: Ghent, Belgium Fecha: 26-30 de agosto de 2019. Autores: Perdomo-González, D.I.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Molina, A.; Valera M. Título: Estimation of genetic parameters for fertility in Pura Raza Española mares. Congreso: 71th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of Abstracts of the 71th Annual Meeting of the European Federation for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-349-5) Volumen/páginas: 345 Tipo de participación: póster Lugar de celebración: Porto (Portugal) Fecha:1-4 diciembre 2020 Autores: Perdomo-González, D.I.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Molina, A.; Valera M. Título: Partial inbreeding coefficient analysis in Pura Raza Español horse population Congreso: 71th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of Abstracts of the 71th Annual Meeting of the European Federation for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-349-5) Volumen/páginas: 347 Tipo de participación: póster Lugar de celebración: Porto (Portugal) Fecha:1-4 diciembre 2020 257 ANEXO 2 Autores: Gómez, M.D.; Perdomo-González, D.I.; Molina, A.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Valera M. Título: Are conformation characteristics of Pura Raza Espanola adult horses predictable? Congreso: 72th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of Abstracts of the 72th Annual Meeting of the European Federation for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-366-2) Volumen/páginas: 177 Tipo de participación: póster Lugar de celebración: Davos (Switzerland) Fecha: 30 Agosto – 3 Septiembre 2021 Autores: Perdomo-González, D.I.; Molina, A.; Cervantes, I.; Laseca N.; Demyda- Peyrás, S; Valera M. Título: Inbreeding coefficient estimation methodologies comparison in Pura Raza Espanola horse population Congreso: 72th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of Abstracts of the 72th Annual Meeting of the European Federation for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-366-2) Volumen/páginas: 178 Tipo de participación: póster Lugar de celebración: Davos (Switzerland) Fecha: 30 Agosto – 3 Septiembre 2021 Autores: Perdomo-González, D.I.; Molina, A.; Valera M.; Varona, L. Título: Quantitative analysis of imprinting effects of reproductive traits in Pura Raza Española mares. Congreso: 73th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of Abstracts of the 73th Annual Meeting of the European Federation for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-385-3) Volumen/páginas: 179 Tipo de participación: oral Lugar de celebración: Porto (Portugal) Fecha: 5 Septiembre – 9 Septiembre 2022 258 Nuevas metodologías genéticas para la evaluación de la endogamia en el PRE Autores: Perdomo-González, D.I.; Gómez, M.D.; Bartolomé, E.; García De Paredes, R.; Valera M. Título: Genetic parameters of morphofunctional traits in Purebred Menorca Horses based on their coat colour. Congreso: 73th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of Abstracts of the 73th Annual Meeting of the European Federation for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-385-3) Volumen/páginas: 179 Tipo de participación: póster Lugar de celebración: Porto (Portugal) Fecha: 5 Septiembre – 9 Septiembre 2022 Congresos nacionales Autores: Perdomo-González, D.I.; Gómez, M.D.; Bartolomé, E.; García De Paredes, R.; Valera M. Título: Dominancia e imprinting en la especie equina: análisis cuantitativo en el Caballo Pura Raza Española. Congreso: XX Reunión Nacional de Mejora Genética Animal Entidad organizadora: INIA Tipo de participación: Oral Lugar de celebración: Madrid (España) Fecha: 1 Junio – 3 junio 2022 Conferencias y seminarios Autores: Perdomo-González, D.I. Título: Potencial de depresión consanguíneo: una herramienta para controlar los efectos de la consanguinidad. Entidad organizadora: Real Asociación Nacional de Criadores de Caballos de Pura Raza Española (ANCCE) Denominación de la conferencia o seminario: Conferencia impartida durante la Jornada Formativa Técnica “Nuevas aplicaciones de la biotecnología genética en la ganadería equina” durante el Salón Internacional del Caballo (SICAB) Tipo de participación: Conferencia invitada Lugar de celebración: Sevilla (España) Fecha: 21 de noviembre de 2019 259 ANEXO 2 Dirección de proyectos final de carrera (ETSIA) Directores: Valera, M., Perdomo-González, D.I., Sánchez-Guerrero, M.J. Autora: López Fernández, A. Título: Estudio de la variabilidad genética del caballo de Pura Raza Español en función del nivel de consanguinidad. Centro/universidad: ETSIA. Universidad de Sevilla Año de defensa: septiembre 2021 Calificación: Sobresaliente 10 Directores: Valera, M., Sánchez-Guerrero, M.J., Perdomo-González, D.I. Autor: Jiménez Maraver, J.A. Título: Mejora genética de la aptitud funcional del caballo de Pura Raza Española (PRE) Centro/universidad: ETSIA. Universidad de Sevilla Año de defensa: septiembre 2021 Calificación: Matrícula de Honor 10 Premios especiales Mención especial al mejor póster Autores: Gómez, M.D.; Perdomo-González, D.I.; Molina, A.; Sánchez-Guerrero, M.J.; Valera M.; Título: Are conformation characteristics of Pura Raza Española adult horses predictable? Congreso: 72th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science Entidad organizadora: EAAP Publicación (ISSN/ISBN): Book of Abstracts of the 72th Annual Meeting of the European Federation for Animal Production (ISBN: 978-90-8686-366-2) Volumen/páginas: 177 Tipo de participación: póster Lugar de celebración: Davos (Switzerland) Fecha: 30 Agosto – 3 Septiembre 2021 10 . honestidad, valores indispensables para progresar en la vida Gabriel Oliverio Los caballos inspiran felicidad, libertad, fuerza y