Comportamiento enantioselectivo de los plaguicidas metalaxil e imazaquín en suelos agrícolas

Comportamiento enantioselectivo de los plaguicidas Metalaxil e Imazaquín en suelos agrícolas Memoria que presenta M.ª del Rocío López Cabeza para optar al título de Doctora por la Universidad de Sevilla Sevilla, abril 2017 Comportamiento enantioselectivo de los plaguicidas Metalaxil e Imazaquín en suelos agrícolas Visado en Sevilla, a 5 de abril de 2017 LOS DIRECTORES EL TUTOR Dr. Rafael Celis García Investigador Científico del CSIC Dr. Juan Cornejo Suero Profesor de Investigación del CSIC Dra. María Elena Fernández Boy Profesora Titular de la Universidad de Sevilla FACULTAD DE QUÍMICA Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola DRA. ROSARIO VAZ PARDAL, DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE CRISTALOGRAFÍA, MINERALOGÍA Y QUÍMICA AGRÍCOLA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Comportamiento enantioselectivo de los plaguicidas Metalaxil e Imazaquín en suelos agrícolas”, presentada por Dña. M.ª del Rocío López Cabeza para optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el marco del Programa de Doctorado en Recursos Naturales y Medio Ambiente del Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola. En Sevilla, a 5 de abril de 2017 DOCTOR D. JOSÉ ENRIQUE FERNÁNDEZ LUQUE, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Comportamiento enantioselectivo de los plaguicidas Metalaxil e Imazaquín en suelos agrícolas”, presentada por Dña. M.ª del Rocío López Cabeza para optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el Departamento de Agroquímica, Microbiología Ambiental y Conservación de Suelos del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS), bajo la dirección de los Drs. D. Rafael Celis García y D. Juan Cornejo Suero, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, a 5 de abril de 2017 ÍNDICE II 1.3.5.2.1. Barreras inmovilizadoras de plaguicidas en suelos………………… 57 1.3.5.2.2. Soportes para la liberación controlada de plaguicidas…………… 58 1.3.5.2.3. Filtros para la depuración de aguas……………………………………… 60 2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………… 63 3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………………….. 67 3.1. Materiales………………………………………………………………………………………………. 69 3.1.1. Plaguicidas……………………………………………………………………………………….. 69 3.1.1.1. Metalaxil……………………………………………………………………………………. 69 3.1.1.2. Imazaquín………………………………………………………………………………..... 70 3.1.2. Suelos………………………………………………………………………………………………. 72 3.1.3. Adsorbentes…………………………………………………………………………………….. 73 3.1.3.1. Residuos de almazara………………………………………………………………… 74 3.1.3.2. Arcillas……………………………………………………………………………………….. 74 3.1.3.3. Complejos arcilla-imazaquín…………………………………………………….. 76 3.2. Métodos…………………………………………………………………………………………………. 77 3.2.1. Método analítico para la determinación de los plaguicidas……………… 77 3.2.1.1. Análisis quiral…………………………………………………………………………….. 77 3.2.1.2. Análisis aquiral…………………………………………………………………………… 79 3.2.2. Caracterización de los suelos……………………………………………………………. 80 3.2.3. Caracterización de los adsorbentes………………………………………………….. 81 3.2.3.1. Caracterización de las enmiendas orgánicas………………………………. 81 3.2.3.2. Caracterización de las arcillas…………………………………………………….. 82 3.2.3.3. Caracterización de los complejos arcilla-imazaquín……………………. 83 3.2.4. Estudio del comportamiento enantioselectivo de los plaguicidas quirales en los suelos: Experimentos de laboratorio………………………… 86 3.2.4.1. Estudios de adsorción y desorción……………………………………………… 86 3.2.4.1.1. Adsorción de los plaguicidas a los adsorbentes…………………….. 86 3.2.4.1.2. Adsorción de los plaguicidas a los suelos sin enmendar y enmendados………………………………………………………………………….. 88 3.2.4.2. Estudios de persistencia…………………………………………………………….. 89 ÍNDICE III 3.2.4.2.1. Estudios de persistencia en suelos sin enmendar y enmendados con los adsorbentes…………………………………………. 89 3.2.4.2.2. Estudios de persistencia con aplicaciones sucesivas……………… 91 3.2.4.2.3. Estudio de persistencia a elevada dosis de metalaxil…………….. 91 3.2.4.3. Estudios de lixiviación………………………………………………………………… 92 3.2.4.3.1. Estudios de lixiviación en los suelos sin enmendar y enmendados con los adsorbentes…………………………………………. 92 3.2.4.3.2. Estudio de lixiviación con adición del complejo de SA-HDTMA y R-imazaquín………………………………………………………………………… 93 3.2.4.4. Bioensayos con imazaquín…………………………………………………………. 94 3.2.4.4.1. Bioensayo general…………………………………………………………………. 94 3.2.4.4.2. Bioensayo con simulación de alto riesgo de lixiviación…………… 95 3.2.5. Estudio del comportamiento enantioselectivo del metalaxil en un suelo agrícola bajo condiciones reales de campo: efecto de la adición de arcilla modificada……………………………………………………………. 95 3.2.6. Tratamiento de los datos………………………………………………………………… 97 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………………………… 99 4.1. Caracterización de suelos y adsorbentes…………………………………………………. 101 4.1.1. Caracterización de los suelos……………………………………………………………. 101 4.1.2. Caracterización de los adsorbentes………………………………………………….. 103 4.1.2.1. Caracterización de las enmiendas orgánicas………………………………. 103 4.1.2.2. Caracterización de las arcillas…………………………………………………….. 106 4.1.2.2.1. Hidrotalcitas………………………………………………………………………….. 106 4.1.2.2.2. Montmorillonita modificada con HDTMA………………………………. 119 4.2. Estudio enantioselectivo del comportamiento del fungicida metalaxil……. 123 4.2.1. Estudios de adsorción-desorción en condiciones de laboratorio………. 123 4.2.1.1. Estudios de adsorción–desorción a los adsorbentes…………………… 123 4.2.1.2. Estudios de adsorción-desorción a suelos sin enmendar y enmendados……………………………………………………………………………… 129 4.2.2. Estudios de persistencia en condiciones de laboratorio…………………… 137 4.2.2.1. Persistencia en los suelos sin enmendar……………………………………. 139 4.2.2.2. Persistencia en los suelos enmendados con los residuos de ÍNDICE IV almazara…………………………………………………………………………………… 145 4.2.2.3. Persistencia en los suelos enmendados con organo-hidrotalcita… 147 4.2.2.4. Estudio de la persistencia bajo aplicaciones sucesivas…………………………………………………………………………………… 150 4.2.2.5. Estudio de persistencia a elevadas dosis……………………………………. 152 4.2.3. Estudios de lixiviación en condiciones de laboratorio………………………. 154 4.2.3.1. Lixiviación en los suelos sin enmendar………………………………………. 155 4.2.3.2. Lixiviación en los suelos enmendados con los residuos de almazara…………………………………………………………………………………….. 158 4.2.3.3. Lixiviación en los suelos enmendados con organo-hidrotalcita…… 162 4.2.4. Estudio del comportamiento enantioselectivo del metalaxil en un suelo agrícola bajo condiciones reales de campo: efecto de la adición de hidrotalcita modificada…………………………………………………… 165 4.2.4.1. Condiciones meteorológicas………………………………………………………. 165 4.2.4.2. Lixiviación y persistencia en condiciones de campo……………………. 166 4.2.4.3. Composición enantiomérica de los residuos de metalaxil…………… 169 4.2.5. Resumen de los resultados obtenidos en el estudio enantioselectivo del comportamiento del fungicida metalaxil……………………………………. 171 4.3. Estudio enantioselectivo del comportamiento del herbicida imazaquín….. 173 4.3.1. Estudios de adsorción-desorción……………………………………………………… 173 4.3.1.1. Estudios de adsorción-desorción a los adsorbentes………………….. 173 4.3.1.2. Estudios de adsorción-desorción a suelos sin enmendar y enmendados con SA-HDTMA……………………………………………………… 176 4.3.2. Estudios de persistencia……………………………………………..…………………… 180 4.3.2.1. Persistencia en los suelos sin enmendar…………………………………….. 181 4.3.2.2. Persistencia en los suelos enmendados con los residuos de almazara…………………………………………………………………………………….. 187 4.3.2.3. Persistencia en los suelos enmendados con organo-arcilla………… 190 4.3.2.4. Estudio de la persistencia bajo aplicaciones sucesivas………………………………………………………………....................... 193 4.3.3. Estudios de lixiviación……………………………………………..…………………....... 194 4.3.3.1. Lixiviación en los suelos sin enmendar……………………………………….. 194 4.3.3.2. Lixiviación en los suelos enmendados con los residuos de ÍNDICE V almazara…………………………………………………………………………………….. 199 4.3.3.3. Lixiviación en los suelos enmendados con organo-arcilla…………… 203 4.3.3.4. Lixiviación en suelo tras la adición del herbicida en forma de complejo de SA-HDTMA y R-imazaquín………………………………………. 205 4.3.4. Bioensayos: eficacia biológica………………………………………………………….. 212 4.3.4.1. Bioensayo general……………………………………………………………………… 212 4.3.4.2. Bioensayo con simulación de alto riesgo de lixiviación: aplicación del herbicida libre y soportado en SA-HDTMA……………………………. 215 4.3.5. Resumen de los resultados obtenidos en el estudio enantioselectivo del comportamiento del herbicida imazaquín………………………………….. 218 5. CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………. 219 6. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………. 225 7. PUBLICACIONES…………………………………………………………………………………… 253 PREÁMBULO VII Los plaguicidas quirales constituyen un grupo emergente de productos fitosanitarios cuyo uso se ha extendido por todo el mundo en las últimas décadas. Estos plaguicidas pueden existir como una o varias parejas de enantiómeros, los cuales suelen presentar un comportamiento en suelos y una actividad biológica diferente. A pesar de ello, estos agroquímicos a menudo se usan, regulan y analizan como si fueran aquirales debido, en parte, al insuficiente conocimiento de los factores que determinan su posible comportamiento enantioselectivo, así como a las dificultades técnicas asociadas a la separación y análisis de los enantiómeros. El uso de plaguicidas quirales como mezcla racémica de dos enantiómeros, sin tener en cuenta que sólo uno de ellos suele ser activo contra la plaga a combatir, supone un problema medioambiental añadido, puesto que, en muchos casos, el destino final del enantiómero considerado como inactivo es desconocido, pudiendo afectar a otros organismos presentes en el suelo. Por este motivo, los gobiernos de diversos países han puesto el foco de atención en regular el uso de los plaguicidas quirales considerando los enantiómeros por separado y, en ciertos casos, han recomendado o impuesto el uso del enantiómero activo exclusivamente. Con los resultados presentados en esta memoria se pretende profundizar en la enantioselectividad de los procesos de transporte y transformación que dos plaguicidas quirales, metalaxil e imazaquín, pueden sufrir en suelos agrícolas, así como establecer la influencia de ciertas prácticas agronómicas en dichos procesos. Entre las prácticas evaluadas destacan la adición de enmiendas orgánicas y el uso de arcillas como adsorbentes de los plaguicidas seleccionados. A pesar de que la bibliografía sobre la utilización de enmiendas orgánicas y arcillas como adsorbentes de plaguicidas es extensa, la enantioselectividad del proceso de adsorción de plaguicidas quirales en estos materiales y su efecto en la enantioselectividad de otros procesos de transporte y transformación ha sido escasamente estudiada. Una propuesta innovadora de este trabajo es la síntesis de complejos de liberación lenta del enantiómero activo soportado sobre arcilla, lo cual permitiría reducir la dosis de aplicación del plaguicida quiral a la vez que disminuir las pérdidas de agroquímico por procesos de transporte, mejorando su eficacia sobre la plaga objetivo. De este modo, los conocimientos adquiridos en esta tesis podrían contribuir a la optimización del uso de plaguicidas quirales, con el fin de aumentar su eficacia y prevenir o paliar los posibles efectos adversos ocasionados por el uso intensivo de los mismos. PREFACE IX Chiral pesticides have become a very important group of emerging agrochemicals widely used all over the world. These pesticides consist of one (or more) pair of enantiomers whose biological activity and behavior in soil are usually different. Even so, most of these agrochemicals are used, regulated, and analyzed as if they were achiral due to i) the scarce understanding about the factors influencing their possible enantioselective environmental behavior once applied to agricultural soils and ii) the greater complexity in separating and analyzing individual enantiomers as compared to achiral compounds. The use of chiral pesticides as a racemic mixture of their enantiomers, without considering that only one of the enantiomers may be active against the target pest, could represent serious environmental problems, since the final fate of inactive enantiomers is usually unknown and they could affect nontarget organisms. For this reason, governments in several countries have realized the need to conduct exhaustive studies of the environmental behavior of enantiomers separately. On the basis of the results obtained, the use of the biologically-active enantiomer has been recommended or imposed for some chiral pesticides. The outcomes achieved from this work are expected to improve the current knowledge about the enantioselectivity of the processes that determine the fate of two chiral pesticides, metalaxyl and imazaquin, in agricultural soils, including assessment of the influence of certain agronomic practices on such enantioselective behavior. Particular attention is paid to the effect of the addition of organic amendments to the soils and to the use of clays as sorbents of the selected pesticides. Although previous studies have addressed the use of organic amendments and clays as pesticide sorbents, research on the enantioselective sorption of chiral pesticides by these materials is scarce and their effects on the enantioselectivity of other soil transport and transformation processes have been poorly studied. An innovative proposal of this work is the design of active-enantiomer slow release formulations using clay as a support. These formulations would permit to reduce the pesticide application rate and minimize the agrochemical losses by transport processes, improving its efficacy against the target pest. The knowledge acquired in this work may be helpful to optimize the use of chiral pesticides by increasing their efficacy and reducing their environmental impact. 1. INTRODUCCIÓN 8 al., 2012). Normalmente, dicho átomo asimétrico o centro estereogénico es un átomo de carbono unido a cuatro sustituyentes distintos, aunque también puede darse quiralidad por la existencia de átomos de fósforo o azufre asimétricos (Hegeman & Laane, 2002) (Figura 1.4). Por otra parte, la presencia de varios átomos asimétricos en una misma molécula de plaguicida aumenta el número de estereoisómeros posibles a 2n (2n-1 parejas de enantiómeros), siendo n el número de centros estereogénicos o asimétricos. En este caso aparecen también los diastereoisómeros, es decir, estereoisómeros que no son superponibles pero que no son imágenes especulares uno del otro. El sistema más aceptado para nombrar la configuración de un centro estereogénico es la denominada convención de Cahn, Ingold y Prelog, que asigna una letra R o S a cada centro en función de la distribución espacial de sus sustituyentes. Figura 1.4. Ejemplos de plaguicidas quirales cuyos centros estereogénicos son un átomo de C (a), de S (b) y de P (c). A diferencia de otros tipos de estereoisómeros, los enantiómeros de un determinado compuesto quiral presentan propiedades fisico-químicas prácticamente idénticas, diferenciándose, principalmente, en la dirección en la que desvían el plano de la luz polarizada (a derecha o izquierda) y en su comportamiento frente a especies que también son quirales (Chen & Liu, 2008). Así, en la mayoría de los casos, la S CF3 O N N CN H2N Cl Cl F3C S F3C O N N NC NH2 Cl CF3 Cl S-fipronil R-fipronil Cl OC CH3 CH3 H COOH OCl H3C C CH3 H HOOC S-mecoprop R-mecoprop O P OCH3 OCH(CH3)2 O O NH2 P O (H3C)2HCO O H3CO H2N O R-isocarbofos S-isocarbofos a) b) c) 1. INTRODUCCIÓN 9 actividad biológica de un plaguicida quiral contra la plaga diana recae principalmente sobre uno de los enantiómeros (enantiómero activo), ya que el objetivo molecular final de los plaguicidas suele ser una enzima o un receptor biológico cuyo centro activo es también quiral y por lo tanto enantioselectivo (Figura 1.5) (Chen & Liu, 2008; Garrison, 2011). Cuando se da la situación en la que un enantiómero es 10 veces más activo que el otro, solo debe considerarse a dicho enantiómero como sustancia activa, ya que esto supone que más del 90% del efecto contra la plaga se debe a este enantiómero (Magrans et al., 2002). El comportamiento y destino final del enantiómero inactivo es, en muchos casos, desconocido pudiendo, en la peor de las situaciones, afectar a otras especies no-objetivo del suelo. Por consiguiente, la aplicación de mezclas de enantiómeros o mezclas racémicas de plaguicidas supone que, a los problemas medioambientales propios de la utilización de estos productos fitosanitarios, se sume el hecho de la adición de sustancias sin funcionalidad real que podrían sobrecargar la capacidad de auto-recuperación de los suelos, así como afectar a otras especies presentes en los mismos. Figura 1.5. Representación esquemática de la interacción entre los dos enantiómeros de una molécula quiral y un receptor quiral de una enzima. En el caso (a), la molécula encaja en el sitio del receptor, lo cual dará lugar a una respuesta. En el caso (b), el otro enantiómero no se acomoda adecuadamente en el receptor enzimático y por consiguiente no se espera una respuesta enzimática. Receptores en proteínas a) b) 1. INTRODUCCIÓN 10 Los primeros trabajos sobre el comportamiento enantioselectivo de plaguicidas quirales se remontan a la década de los 90, si bien el interés por este tipo de compuestos ha aumentado considerablemente en los últimos años debido a las particulares implicaciones medioambientales que conlleva su uso (Figura 1.6). Figura 1.6. Artículos publicados y número de citas a los mismos sobre pesticidas quirales. Fuente: ISI Web of Knowledge, Web of Science-Citation Report, enero, 2017. Criterio de búsqueda: “chiral” and “pesticide”. La aplicación de plaguicidas quirales está muy extendida por todo el mundo. Se estima que aproximadamente el 30% de los ingredientes activos de plaguicidas registrados actualmente son mezclas racémicas (1:1) de los enantiómeros de dichos plaguicidas (Sekhon, 2009) y que más del 40% de los insecticidas y herbicidas comúnmente utilizados en China son quirales (Ye et al., 2015). En los últimos años, los países han sido más conscientes de la necesidad de realizar estudios exhaustivos sobre la posible enantioselectividad en el comportamiento y destino final de los plaguicidas quirales en el medio ambiente, llegando incluso en ocasiones a recomendarse el uso del enantiómero activo puro (Magrans et al., 2002). De este modo, sobre la base de la diferente bioactividad de los enantiómeros, varios países han tomado medidas. Las autoridades de Holanda y Suiza han revocado la licencia para el uso de mezclas racémicas de ácidos fenoxialcanoicos quirales, mientras que aprueban el registro del producto con el isómero activo puro. Otro ejemplo es Suecia, que ha implementado un impuesto en función del peso del Artículos publicados cada año Año Citas en cada año Año 1. INTRODUCCIÓN 11 ingrediente activo quiral (Ye et al., 2010). En el caso de EEUU, la EPA ha emitido una política provisional sobre la reevaluación del plaguicidas quirales para su reemplazo por enantiómeros puros (EPA, 2000). Entre las ventajas de usar el enantiómero activo frente a la mezcla racémica, además de que probablemente cause menos daño ambiental y un menor riesgo ecológico (Hegeman & Laane, 2002), está el hecho de reducir la dosis de aplicación, lo que supondría un aumento de la rentabilidad para los agricultores y una disminución en los riesgos de contaminación por contacto. No obstante, aun así, se estima que las formulaciones de plaguicidas consistentes en enantiómeros puros suponen solo el 7% del mercado de fitosanitarios actual (Liu et al., 2009). Este predominio del uso de mezclas racémicas de plaguicidas quirales se debe, en parte, a motivos económicos. Debido a la gran similitud de las propiedades fisico-químicas de los enantiómeros, las técnicas para su separación son muy complejas y costosas, lo cual hace que no resulte rentable su comercialización. Sin embargo, las exigencias a nivel europeo, con el reglamento 1107/2009 (DOUE, 2009) que obliga a especificar la identidad y contenido de isómeros/diastereoisómeros de los nuevos productos fitosanitarios registrados y clasifica como sustancias candidatas a la sustitución a aquellas que contienen una proporción significativa de isómeros inactivos, las recientes mejoras en el desarrollo de catálisis estereoselectiva por compuestos organometálicos y la aplicación de la biotecnología en la síntesis estereoselectiva, hacen cada vez más factible la producción a gran escala de enantiómeros activos puros (Magrans et al., 2002). 1. INTRODUCCIÓN 12 Escorrentía Volatilización Transpiración Lixiviación Fotodegradación 1.2. DINÁMICA DE LOS PLAGUICIDAS EN LOS SUELOS: ENANTIOSELECTIVIDAD EN LOS PROCESOS DE TRANSFERENCIA Y TRANSFORMACIÓN Los plaguicidas llegan al suelo a través de distintas vías: por aplicación directa al suelo, a través de las partes aéreas de las plantas, o bien pueden ser arrastrados por el viento o por el agua de precipitaciones o de riego. Una vez en el suelo, los plaguicidas se ven sometidos a una serie de procesos (Figura 1.7) que pueden dar lugar a su desplazamiento del lugar óptimo de acción o a su trasformación en otros compuestos que resulten inefectivos para la plaga o que puedan afectar negativamente a otros organismos. Por todo ello, es esencial el conocimiento de todos los procesos de transporte y transformación a los que están sometidos los plaguicidas para evaluar su futura eficacia y posible impacto ambiental. Figura 1.7. Procesos que determinan la dinámica de los plaguicidas en el suelo. 1. INTRODUCCIÓN 13 La dinámica de los plaguicidas en los suelos ha sido ampliamente estudiada desde hace décadas. Sin embargo, la información sobre el comportamiento enantioselectivo de los plaguicidas quirales en el medio ambiente es muy limitada. Los escasos estudios que existen indican la importancia de la evaluación de los procesos de dinámica para cada enantiómero por separado, ya que estos pueden ser diferentes y estas diferencias no quedan reflejadas en los casos en los que los plaguicidas quirales se estudian considerándolos como compuestos aquirales. 1.2.1. Procesos de transferencia o transporte Los procesos de transferencia o transporte son aquellos en los que el plaguicida se mueve de un medio a otro sin que exista ningún tipo de modificación en su estructura química. Principalmente son: adsorción-desorción, lixiviación, escorrentía, volatilización, absorción y difusión. Puesto que los enantiómeros de un plaguicida quiral presentan idénticas propiedades fisico-químicas, se prevé que los procesos de transporte no sean enantioselectivos. Sin embargo, existen ciertas situaciones particulares de estos procesos en las que intervienen especies quirales y, por tanto, en las que podría observarse enantioselectividad. 1.2.1.1. Adsorción-desorción La adsorción es un proceso dinámico en el que un compuesto (adsorbato) pasa desde la fase acuosa del suelo (disolución) a la superficie de las partículas sólidas (adsorbente) sin que se produzcan cambios en la naturaleza química de dicho compuesto. En el caso de los plaguicidas, su adsorción en el suelo va a depender de las interacciones que tengan lugar entre las moléculas del plaguicida y los componentes del suelo, entre las moléculas del plaguicida entre sí, así como de las interacciones entre las partículas de suelo y otros compuestos presentes en la disolución del mismo. Las fuerzas de atracción que se dan en estos casos son muy variadas, pudiendo tener diferente naturaleza en función de las propiedades del soluto y de la superficie adsorbente. Así, pueden darse interacciones de tipo fuerzas de van der Waals, interacciones de tipo iónico, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, enlaces covalentes, transferencia de carga, cambio de ligando, etc. 1. INTRODUCCIÓN 14 La desorción es el proceso contrario de la adsorción, es decir, el paso del compuesto desde las partículas de suelo a la disolución acuosa del mismo. La desorción puede ser total, dándose un proceso de adsorción reversible (Wauchope & Mylers, 1985; Monkiedje & Spiteller, 2002), o puede ocurrir que se desorba sólo una parte de las moléculas, dándose una desorción parcial, o una adsorción totalmente irreversible (Cox et al., 1995; Celis & Koskinen, 1999; Fogg et al., 2003). Cabe destacar que los procesos de adsorción-desorción son esenciales para definir el resto de los procesos que determinan la dinámica del plaguicida, ya que el grado de disponibilidad de los plaguicidas en el suelo para ser sometidos a otros procesos de transporte y/o degradación va a depender de su mayor o menor adsorción en el suelo. a) Medida de la adsorción-desorción Las moléculas orgánicas se adsorben y desorben de la superficie del adsorbente alcanzando un equilibrio, el cual puede expresarse como: donde Ce es la concentración de soluto en disolución en equilibrio con el adsorbente y Cs es la cantidad adsorbida por unidad de masa del sólido. Frecuentemente, se asume que Cs depende linealmente de Ce y se define un coeficiente de distribución, Kd, como: 𝐾𝑑=𝐶𝑠 𝐶𝑒 Ec. 1.1 La ecuación Ec. 1.1 supone que existe una relación directamente proporcional entre la concentración de adsorbato en el disolvente o fase líquida y la concentración en el sólido o fase sólida. En los casos en los que la concentración de adsorbato en la fase líquida es baja, la ecuación Ec. 1.1 suele describir de forma correcta el equilibrio. Sin embargo, en las situaciones en las que la relación entre la cantidad adsorbida y la cantidad en disolución no es lineal, el valor de Kd depende de la concentración a la cual se trabaje. De este modo, en estos casos se requiere de la obtención de las isotermas de adsorción, que se definen como la relación que describe el equilibrio ⥮ Cs Ce 1. INTRODUCCIÓN 15 entre Cs y Ce a una determinada temperatura. Giles et al. (1960) propusieron cuatro tipos generales de isotermas de adsorción (Figura 1.8) dependiendo de la forma de la pendiente del tramo inicial, a partir de las cuales se obtiene información sobre el mecanismo de adsorción y sobre la naturaleza tanto del adsorbato como de la superficie del adsorbente. Figura 1.8. Tipos de isotermas de adsorción según la clasificación de Giles et al. (1960). - Isotermas tipo S: la pendiente inicial de la curva indica que la adsorción está facilitada a elevadas concentraciones de soluto. Esto suele revelar cierta afinidad entre las moléculas de soluto adsorbidas y aquellas en disolución dándose una “adsorción cooperativa”. Este tipo de curvas son típicas de sistemas en los que se da una interacción específica entre el soluto y el adsorbente, tiene lugar una moderada atracción entre las moléculas de soluto adsorbidas y las moléculas de disolvente tienen una gran afinidad por el adsorbente, compitiendo con las moléculas de soluto por los sitios de adsorción. - Isotermas tipo L: la pendiente inicial muestra que a medida que progresa la adsorción la dificultad para que las moléculas de adsorbato encuentren sitios vacantes irá en aumento. Suelen darse en los casos en los que existe una alta afinidad entre el soluto y el adsorbente, dándose una escasa competencia soluto-disolvente por los sitios de adsorción. - Isotermas tipo H: se consideran un caso particular de las isotermas tipo L. En ellas, la pendiente inicial es prácticamente vertical debido a que la afinidad entre el soluto y el adsorbente es tan alta que a concentraciones bajas prácticamente todo el soluto queda adsorbido a la superficie. Son isotermas poco habituales, propias de Cs Ce Ce Ce Ce Tipo S Tipo L Tipo H Tipo C 1. INTRODUCCIÓN 16 sistemas con adsorbatos de elevado peso molecular como miscelas iónicas o especies poliméricas. - Isotermas tipo C o de reparto constante: se caracterizan por presentar una relación lineal entre la cantidad de soluto adsorbida y la concentración del mismo en la disolución de equilibrio. Las isotermas de adsorción obtenidas experimentalmente pueden modelizarse usando diferentes ecuaciones que relacionan Cs en función de Ce. Para suelos y coloides de los suelos, las ecuaciones más utilizadas son la ecuación de Langmuir, que se ajusta bien a todas las isotermas excepto a las que presentan forma de tipo S, y la ecuación de Freundlich, que se adapta adecuadamente a todas las isotermas a excepción de las de tipo H. Puesto que en nuestro trabajo no se han obtenido isotermas del tipo H, se ha empleado el modelo de Freundlich, ya que presenta una gran versatilidad para comparar parámetros cuantificadores de la adsorción. La ecuación de Freundlich se expresa como: CS = Kf·Ce Nf Ec. 1.2 o como su expresión logarítmica: log CS = log Kf + Nf log Ce Ec. 1.3 donde Cs es la cantidad de soluto adsorbida a la concentración de equilibrio Ce mientras que Kf y Nf son constantes características que pueden obtenerse del ajuste lineal de los datos de log Cs vs log Ce. El valor de Nf corresponde a la pendiente de la representación lineal del log Cs vs log Ce y se considera una medida de la intensidad de la adsorción. Además, puesto que los diferentes tipos de isotermas de adsorción quedan definidas por su pendiente inicial, en función del parámetro Nf se puede asignar: - Tipo C cuando Nf = 1 - Tipo L cuando Nf < 1 - Tipo S cuando Nf > 1 1. INTRODUCCIÓN 17 A partir de la ecuación Ec. 1.3, se deduce que cuando Ce = 1 el valor absoluto de Kf = Cs y, por tanto, este parámetro puede utilizarse para evaluar la capacidad de adsorción de diferentes tipos de sistemas adsorbentes-adsorbatos siempre que las condiciones experimentales hayan sido las mismas y los valores de Nf sean similares (Hance, 1967), siendo esencial que el valor de Ce = 1 esté dentro o cerca del intervalo de concentraciones experimentales (Hermosín & Cornejo, 1987). El estudio del proceso de desorción suele realizarse mediante diluciones sucesivas, sustituyendo parte de la disolución en equilibrio por una disolución libre de plaguicida, permitiendo que se restablezca el equilibrio. Cuando la isoterma de desorción del plaguicida no coincide con la de su desorción, se dice que existe histéresis. El grado de reversibilidad del proceso de adsorción puede expresarse por diferentes índices. Uno de los más utilizados es el coeficiente de histéresis, H, que se define como: 𝐻 = 𝑁𝑓−𝑑𝑒𝑠 𝑁𝑓−𝑎𝑑𝑠 Ec. 1.4 donde Nf-des y Nf-ads son los coeficientes de Freundlich para la desorción y la adsorción, respectivamente. El coeficiente H puede adoptar valores entre 0, para procesos completamente irreversibles, y 1, cuando el proceso es reversible, es decir, cuando las isotermas de adsorción y desorción siguen el mismo camino (O’Connor et al., 1980; Barriuso et al., 1994). Otro coeficiente que permite describir la histéresis del proceso de adsorcióndesorción es el índice termodinámico de irreversibilidad propuesto por Sander et al. (2005), el cual se expresa como: 𝑇𝐼𝐼 = 1 − 𝑁𝑓−𝑑𝑒𝑠 𝑁𝑓−𝑎𝑑𝑠 Ec. 1.5 En este caso, el valor de TII puede oscilar entre 0 y 1, siendo una adsorción completamente reversible cuando TII =0 y completamente irreversible en los casos en los que TII = 1. El proceso de histéresis puede deberse a la deformación de los poros en el adsorbente sólido, lo cual conduce a que el camino de la desorción sea diferente al de 1. INTRODUCCIÓN 24 - Condiciones climáticas: Intensidad y duración de las precipitaciones, así como la temperatura. - Características del suelo: Textura, contenido de materia orgánica y humedad. - Propiedades de los plaguicidas: Solubilidad, propiedades de adsorción, polaridad, persistencia y forma y dosis de su aplicación. - Prácticas culturales: Cubiertas vegetales, franjas de protección y técnicas de mínimo laboreo entre otras. Al igual que ocurría en la lixiviación, la posible enantioselectividad del proceso de escorrentía, entendida como la diferente composición enantiomérica de los residuos de plaguicida encontrados en aguas de escorrentía, dependerá del carácter enantioselectivo de la adsorción y de la persistencia de los plaguicidas quirales que se transportan en las aguas superficiales, ya que el proceso de arrastre en sí mismo no es intrínsecamente enantioselectivo. b) Volatilización La volatilización se define como el paso del plaguicida a la fase gaseosa desde una fase acuosa o sólida. Este proceso es muy importante ya que puede transportar al plaguicida lejos de su punto de aplicación y ser causa de contaminación difusa. Los principales factores que intervienen en la volatilización son climáticos: las precipitaciones, puesto que un aumento del agua infiltrada puede desplazar a las moléculas de plaguicidas que se encuentran adsorbidas dándose un incremento temporal de la volatilización del agroquímico; la temperatura, ya que su aumento provoca un incremento en la volatilización de los plaguicidas; y la presión atmosférica. Puesto que las propiedades de los plaguicidas que afectan a la volatilización (presión de vapor, constante de Henry, coeficiente de partición aire-octanol) son idénticas para los enantiómeros, es esperable que la volatilización de los plaguicidas quirales no sea enantioselectiva. De este modo, la detección de proporciones no racémicas de un determinado plaguicida en la atmósfera será consecuencia de la presencia, en el suelo o agua a partir de la cual se ha evaporado, de uno de los enantiómeros en mayor abundancia (Bidleman et al., 1998). 1. INTRODUCCIÓN 25 c) Difusión La difusión se define como el transporte del plaguicida de un punto a otro de la misma fase (suelo o agua) como consecuencia de diferencias de concentraciones. Los principales factores que afectan a la difusión son la solubilidad y la presión de vapor del contaminante, así como la temperatura, el contenido de humedad y la porosidad del suelo. Al igual que en el caso de la volatilización, las propiedades de los plaguicidas quirales de las cuales depende la difusión son análogos para sus enantiómeros, por lo que se vaticina que el transporte por difusión no será enantioselectivo. d) Absorción La absorción consiste en la incorporación del plaguicida presente en el suelo a las plantas a través del sistema radicular o a otros organismos como microorganismos, insectos y nematodos. La relevancia de este proceso de transporte reside en que es la vía para que los fitosanitarios se incorporen a los organismos, entrando en contacto con la plaga diana que se desea eliminar (parásitos, hongos, insectos, malas hierbas, etc.). Por otra parte, por medio de la absorción, plantas y organismos resistentes a ciertos plaguicidas pueden acumularlos y/o metabolizarlos a compuestos no tóxicos, lo que supone una fórmula natural de descontaminación de suelos (Schmidt & Fedtke, 1977). El proceso de absorción de plaguicidas quirales puede ser enantioselectivo en plantas (Zhang et al., 2013, 2016) y en otros organismos como nematodos y microorganismos (Zipper et al., 1998). Esto se atribuye al transporte activo a través de las biomembranas, donde los isómeros de los plaguicidas quirales interaccionarían enantioselectivamente con macromoléculas quirales como las proteínas transportadoras u otros receptores quirales presentes en dicha membranas celulares, dando lugar a una absorción enantioselectiva (Zipper et al., 1998; Zhang et al., 2013). En el caso de la absorción en plantas, los plaguicidas pasan desde la disolución del suelo hasta el xilema a través del sistema radicular cruzando varias láminas de tejidos (epidermis, córtex, endodermis y periciclo), lo que supone atravesar al menos una biomembrana (Collins et al., 2006). 1. INTRODUCCIÓN 26 1.2.2. Procesos de transformación Los procesos de transformación implican la alteración de la estructura química del plaguicida generando nuevos compuestos que puede ser menos tóxicos (inactivación o destoxificación) o más tóxicos (activación) que el compuesto original. En el caso de los plaguicidas quirales, estos procesos pueden dividirse en tres grupos según su naturaleza: procesos de degradación abiótica (degradación química y fotodegradación), procesos de degradación biológica (biodegradación) y procesos de interconversión entre enantiómeros (enantiomerización). 1.2.2.1. Procesos de degradación abiótica a) Degradación química La degradación química es el proceso de transformación producida por reacciones químicas hidrolíticas, de sustitución o reacciones de oxidación-reducción. Los factores más importantes que pueden influir en la degradación química en el suelo son el pH, el potencial redox, la temperatura, la composición de la disolución y los componentes de la fracción coloidal del suelo (Khan, 1980), así como la naturaleza química del plaguicida y su susceptibilidad frente a dichas reacciones. De forma general, la adsorción del plaguicida a los coloides del suelo y a la materia orgánica soluble (MOS) lo protege de la degradación química. Sin embargo, en los casos en los que las reacciones estén catalizadas por la superficie de los componentes coloidales o de la MOS, la degradación puede verse favorecida por la adsorción. Hay que señalar que este tipo de degradación tiene menos importancia desde el punto de vista cuantitativo, ya que la cinética de reacción es más lenta debido a la competencia que presentan los oxidantes por la materia orgánica. Generalmente, se ha observado que las reacciones abióticas que afectan a los plaguicidas en el suelo no son enantioselectivas, es decir, no se detectan diferencias significativas en la velocidad de degradación de los enantiómeros de un determinado plaguicida quiral (Buser & Müller, 1995; Bidleman et al., 1998). Este comportamiento queda ratificado con los resultados obtenidos para la degradación, en condiciones abióticas, de los plaguicidas quirales α-hexaclorociclohexano, mecoprop, cis- y transclordano, heptacloro, exo-epóxido y oxiclordano, para los que, en todos los casos, la 1. INTRODUCCIÓN 27 fracción enantiomérica (EF) se mantuvo cercana a 0.5 (racémica) tras los procesos degradativos (Hegeman & Laane, 2002). b) Fotodegradación La fotodegradación de define como la transformación química del plaguicida promovida por la acción de la luz solar (Horspool, 1970) a través reacciones de oxidación, reducción, hidrólisis, sustitución e isomerización. Los principales factores que van a afectar a este tipo de degradación son: - Disponibilidad de la radiación solar: Dependerá del tiempo e intensidad de la radiación solar. Además, se requiere la presencia del plaguicida en los primeros milímetros del suelo, en la superficie de las plantas y/o en ecosistemas acuáticos, que son las zonas más susceptibles de recibir dicha radiación solar. - Características del suelo: Las más significativas son el pH, el grado de aireación y la presencia de catalizadores fotoquímicos. También es muy importante el contenido de ácidos húmicos, ya que pueden absorber radiación ultravioleta disminuyendo la fotodegradación de los plaguicidas o catalizándola (Ramezani et al., 2008). - Propiedades del plaguicida: Las más relevantes son la estructura química, el estado físico (sólido, disuelto o en estado gaseoso) y el grado de adsorción del plaguicida. La degradación fotoquímica puede ser directa o indirecta. Será directa cuando la luz actúe directamente sobre el plaguicida degradándolo e indirecta cuando la energía de la radiación solar sea absorbida por otras moléculas presentes en el suelo, las cuales transmiten la energía a los plaguicidas o se transforman en productos intermedios que reaccionan con el plaguicida (Mansour et al., 1989; Cox et al., 1996; Aguer et al., 2000). Se han llevado a cabo varios estudios para determinar la posible enantioselectividad de la fotodegradación de plaguicidas quirales en agua y suelos y en todos los casos el resultado fue que los enantiómeros se degradaban a la misma velocidad (Ali et al., 2004; Ramezani et al., 2008). 1. INTRODUCCIÓN 28 1.2.2.2. Biodegradación La biodegradación consiste en la transformación del plaguicida por la asimilación-metabolización de microorganismos del suelo, dando como resultado compuestos minerales como NH3, CO2, H2O o metabolitos intermedios. En general, tiene lugar mediante reacciones enzimáticas de reducción (típicas de bacterias anaeróbicas en ambientes húmedos), de oxidación o hidrolíticas (producidas por hongos y bacterias tipo aeróbicas). Los principales factores que van a condicionar la degradación biológica son: - Factores climáticos: Principalmente la temperatura y la humedad, cuyo incremento (hasta cierto límite) aumenta la degradación por favorecer el crecimiento bacteriano. - Grado de adsorción en el suelo: Por lo general, para que las moléculas orgánicas puedan ser biodegradadas deben estar en disolución o biodisponibles, de modo que cuanto mayor sea la adsorción del plaguicida en el suelo, menor será la biodegradación. - Contenido de materia orgánica en los suelos: El efecto de la materia orgánica puede ser variable. Por un lado, puede adsorber al plaguicida protegiéndolo de la biodegradación. Por otro lado, la materia orgánica puede ser utilizada como sustrato nutritivo por los microorganismos, favoreciendo el crecimiento de su población y, con ello, los procesos biodegradativos. La biodegradación de los plaguicidas en el suelo es consecuencia de la acción de las enzimas (y receptores biológicos) de diferentes microorganismos. Los centros activos de estas macromoléculas suelen ser quirales, de modo que, a pesar de la similitud química de los enantiómeros de un plaguicida quiral, la fuerza de asociación centro activo-enantiómero suele ser diferente para cada uno de ellos (Magrans et al., 2002). Por consiguiente, las enzimas encargadas de la degradación se unirán preferentemente a uno de los enantiómeros degradándolo a mayor velocidad que al otro. Se debe destacar que, además de la acción de las enzimas intracelulares de los microorganismos, Kalathoor et al. (2015) encontraron cierta contribución a la biodegradación del metalaxil de enzimas extracelulares presentes en el suelo, a través de estudios de persistencia realizados con suelos sometidos a diferentes procesos de esterilización. 1. INTRODUCCIÓN 29 Los estudios realizados sobre los factores que pueden afectar a la enantioselectividad de la degradación biológica de plaguicidas quirales en suelos y aguas han señalado que dicha degradación dependerá fundamentalmente de las propiedades del suelo que den lugar a cambios en las poblaciones microbianas. Una de las propiedades del suelo más importantes de cuya variación puede depender la enantioselectividad de la degradación de un determinado plaguicida es el pH. Esto se debe a que cambios en el pH pueden afectar a nivel de los microorganismos degradadores (por ejemplo con un predominio de población microbiana que degrade preferentemente al enantiómero S o R) o a nivel molecular (por ejemplo por activación/inactivación de enzimas enantioespecíficas) (Buerge et al., 2003). Otras propiedades igualmente importantes son la textura, las condiciones redox y la disponibilidad/ausencia de oxígeno. Hay que destacar que el predominio de microorganismos que degraden preferentemente un enantiómero sobre el otro, normalmente, no depende de una sola de las propiedades anteriormente mencionadas, sino del efecto de la combinación de varias. A continuación, se presentan algunos ejemplos que ilustran las diferencias en la enantioselectividad de la biodegradación de plaguicidas quirales en diferentes condiciones. Buerge et al. (2003) encontraron que en suelos aeróbicos con valores de pH > 5 el enantiómero R del fungicida metalaxil se degradaba más rápidamente que el enantiómero S, mientras que en suelos aeróbicos con valores de pH < 4 y en suelos anaeróbicos la enantioselectividad del proceso de degradación del metalaxil era inversa. Müller & Buser (1995) encontraron preferencia de la degradación del S- metalaxil frente al R-metalaxil en lodos de depuradoras anóxicos a pH neutro. Estos resultados indican que el efecto del pH sobre la población microbiana será diferente en función de la disponibilidad de oxígeno. Otro caso es la degradación del benalaxil, en la que el enantiómero R se degrada a mayor velocidad que el enantiómero S en suelos aeróbicos y dicha enantioselectividad está más acentuada cuanto más alcalino son los valores de pH de los suelos. En suelos con pH ácido, la biodegradación no es enantioselectiva (Wang et al. 2007a; Qin et al., 2014). Otro ejemplo interesante es la degradación del insecticida fipronil, que en condiciones aeróbicas no es enantioselectiva, mientras que en condiciones de inundación (anaeróbicas) es altamente enantioselectiva, con una degradación más rápida del enantiómero S frente al R (Tan et al., 2008). Sin embargo, en otro estudio 1. INTRODUCCIÓN 30 de degradación en lodos de sedimentos de agua dulce anóxicos, se encontró que a pH≈ 7 y potencial redox metanogénico el S-fipronil se degradaba más rápidamente, mientras que en lodos con pH= 7.8 y potencial sulfidogénico el enantiómero que se degradaba a mayor velocidad era el R-fipronil (Jones et al., 2007). Otra propiedad del suelo que puede afectar a la enantioselectividad de la degradación de ciertos plaguicidas quirales es la textura, probablemente por tener influencia en las poblaciones microbianas. Romero et al. (2001) observaron que en el caso de los herbicidas mecoprop y dicloroprop, el enantiómero R se degradaba a mayor velocidad en suelos franco-limosos y franco-arenosos, mientras que en suelos franco arcillosos, el enantiómero que se degradaba preferentemente era el S. 1.2.2.3. Enantiomerización La enantiomerización se define como la transformación de un enantiómero en el otro. Es un proceso que requiere gran cantidad de energía, de modo que, normalmente, tiene lugar a través de un carbono quiral metino, excepto en ciertos casos en los que por procesos de absorción de luz UV se obtiene suficiente energía para la rotura homolítica de enlaces (C-C) (Katagi, 2012). Se diferencian dos tipos de enantiomerización: abiótica y biótica. La enantiomerización abiótica es debida principalmente a reacciones de hidrólisis o de fotolísis. La enantiomerización vía hidrólisis es un proceso que requiere catálisis ácida o básica, por lo que el pH es una propiedad esencial de los suelos y aguas de la cual depende este proceso de transformación (Figura 1.10). El tipo de catálisis dependerá del compuesto y de la estabilidad del intermedio de reacción que se forme. Así, se ha observado la racemización abiótica del αS,2S- y αS,2R-fenvalerato en αR,2S- y αR,2R-fenvalerato respectivamente y del S-fenpropatrín en R-fenpropatrín en suelos alcalinos (pH = 8.2), mientras que en suelos ácidos (pH = 5.4) los enantiómero puros de estos insecticidas fueron configuracionalmente estables (Li et al., 2009). La enantiomerización de plaguicidas quirales mediante fotolísis no requiere de un catalizador ya que estos compuestos obtienen la energía necesaria para que se dé la reacción a partir de la absorción UV de la luz solar natural del medio (Katagi, 1. INTRODUCCIÓN 31 2012). Este tipo de inversión quiral es típica de los insecticidas quirales del grupo de los piretroides, como permetrina y cipermetrina (Qui & Gan, 2007). Figura 1.10. Ejemplos de mecanismos de enantiomerización/racemización abiótica de un plaguicida quiral a través de catálisis básica (a) y ácida (b) (Katagi, 2012). La enantiomerización biótica es aquella en la que la transformación quiral está mediada por enzimas de microorganismos presentes en el suelo. Estas enzimas pertenecen principalmente al grupo de las racemasas, las cuales son las encargadas de catalizar la inversión estereoquímica en el carbono asimétrico de un enantiómero (Tanner, 2002). Algunos estudios han remarcado la importancia de la enantiomerización debido a que la transformación enantioselectiva de ciertos plaguicidas quirales no sólo es consecuencia de la degradación preferencial de uno de los enantiómeros sino también de su interconversión en el otro enantiómero (Müller & Buser, 1997; Romero et al., 2001). En otros casos, la degradación del enantiómero es mucho más rápida que la conversión quiral en cualquier dirección, de modo que a pesar de que pueda darse, no se tiene en consideración (Buser & Müller, 1995). Desde el punto de vista práctico, la enantiomerización es un proceso muy relevante ya que la aplicación del enantiómero activo purificado de un plaguicida quiral en lugar de la mezcla racémica correspondiente puede llegar a carecer de sentido si el proceso de enantiomerización o racemización vuelve a formar rápidamente el enantiómero inactivo durante el almacenaje o tras la aplicación del producto. a) Catálisis básica b) Catálisis ácida 1. INTRODUCCIÓN 32 1.3. EFECTO DE DIVERSAS PRÁCTICAS AGRONÓMICAS EN EL COMPORTAMIENTO DE LOS PLAGUICIDAS QUIRALES 1.3.1. Adición del plaguicida en forma de enantiómero activo puro Como se ha mencionado en apartados anteriores, los enantiómeros de un plaguicida quiral presentan propiedades fisico-químicas análogas, pero su comportamiento ante procesos biológicos suele ser diferente. Esto se debe a que los procesos biológicos normalmente implican reacciones enzimáticas, en las cuales la enzima y el sustrato establecen interacciones enantioespecíficas. De este modo, en la mayoría de los casos, la actividad contra la plaga objetivo recae principalmente sobre uno de los dos enantiómeros del plaguicida quiral. Esto supone que al usar estos plaguicidas en su forma racémica, solo la mitad de la dosis aplicada (la que corresponde al enantiómero activo) resultará efectiva contra la plaga, mientras que el destino final del otro enantiómero es incierto, pudiendo afectar a otras especies (Magrans et al., 2002; Garrison, 2006; Ye et al., 2015). Por ello, en los últimos 5-10 años se ha promovido en Europa y Estados Unidos el uso de formulados fitosanitarios basados en enantiómeros puros o disoluciones enriquecidas en el enantiómero activo de ciertos plaguicidas quirales en lugar de en las mezclas racémicas de los mismos (Garrison, 2006). La adición del enantiómero activo puro presenta la ventaja de reducir la dosis de aplicación del plaguicida a la mitad, lo cual conlleva una reducción de la carga contaminante sin que la eficacia biológica contra la plaga a combatir se vea comprometida (Sekhon, 2009). Un ejemplo concreto de los beneficios medioambientales de la aplicación del enantiómero puro es la aplicación del enantiómero activo R-metalaxil en lugar del compuesto racémico. Se ha demostrado que el efecto de la mezcla racémica y del metalaxil-M (R-metalaxil) sobre la infección causada por Plasmopara helianthi en plantas de girasol fue idéntico, con la diferencia de que al aplicar la mezcla racémica se adicionó una cantidad de S-metalaxil que no tuvo ningún efecto sobre la enfermedad (Zadra et al., 2002), siendo además este enantiómero mucho más persistente en el suelo que el enantiómero activo (Marucchini & Zadra, 2002). Por otra parte, en estos estudios se observó una ausencia de enantiomerización del R- metalaxil en S-metalaxil tanto en suelos como en las plantas de girasol (Marucchini & Zadra, 2002; Zadra et al., 2002). 1. INTRODUCCIÓN 33 A pesar de las ventajas del uso de enantiómeros puros en lugar de mezclas racémicas que varios estudios han presentado (Hegeman & Laane, 2002; Sekhon, 2009), la producción a gran escala del isómero activo puro no está generalizada debido, en parte, a que su fabricación es mucho más costosa que la elaboración de la correspondiente mezcla racémica. Esto podría justificar, en algunos casos, la comercialización de la mezcla racémica en lugar del enantiómero activo puro (Magrans et al., 2002). Sin embargo, actualmente se han desarrollado nuevas técnicas de separación basadas en el uso de catalizadores enantioselectivos, la aplicación de la biotecnología en la síntesis enantioselectiva y el uso de columnas cromatográficas quirales dirigidas a optimizar los procesos de obtención de enantiómeros puros (Magrans et al., 2002). Todas estas mejoras en la síntesis de compuestos quirales pueden favorecer la sustitución de las mezclas racémicas por los enantiómeros activos puros antes, incluso, de que la legislación lo imponga, como ya ha ocurrido en el caso del metalaxil-M, benalaxil-M y mecoprop-P en algunos países (EU Pesticide Database, 2017). Por otro lado, existen plaguicidas quirales cuya licencia de la formulación racémica ya ha sido revocada en la UE y sólo se permite el uso de sus enantiómeros activos como son: diclorprop-P, dimetenamida-P, fenoxaprop-P-etil, fluazifop-P-butil, haloxifop-P, quizalofop-P y S-metolacloro (Sekhon, 2009; EU Pesticide Database, 2017). En el caso de este último plaguicida quiral, con dos centros estereogénicos, el 95% de la actividad herbicida recae en los enantiómeros 1´S, lo cual dio lugar a que el uso exclusivo del S-metolacloro se generalizara en la década de los 90 en varios países del mundo (Estado Unidos en 1997, Suiza en 1997, Canadá en 1998, Sudáfrica en 1998 y Australia en 1999) (Buser et al., 2000). La formulación comercial de S-metalocloro contiene un 86% de enantiómeros 1´S, permitiendo una reducción del 40% en la cantidad de plaguicida que necesita ser aplicado para alcanzar el mismo efecto que se obtiene usando la mezcla racémica correspondiente (Garrison, 2006). Un factor muy importante a considerar antes de implantar el uso de enantiómeros puros en lugar de las mezclas racémicas son los posibles procesos de transformación que puede sufrir el enantiómero puro en el suelo. Por ello, se requiere un exhaustivo estudio del comportamiento de los enantiómeros por separado para evaluar si al aplicar el compuesto puro, este puede verse sometido a degradación y/o enantiomerización a una velocidad que no haga factible ni rentable su utilización. Un ejemplo es el herbicida mecoprop, en el que su enantiómero R (mecoprop-P) es comúnmente comercializado, llegando a ser la única forma del plaguicida registrado 1. INTRODUCCIÓN 40 Sánchez et al., 2003; González et al., 2008) y residuos de la industria agroalimentaria (Businelli, 1997; Marín-Benito et al., 2009), entre otros. Dentro de este último grupo, los residuos tanto líquidos (alpechín) como sólidos (orujo y alperujo) generados durante la producción del aceite de oliva han sido ampliamente estudiados en los últimos años. 1.3.4.1. Uso de residuos de almazaras como enmiendas en la agricultura A partir de los años 90 se implantó un nuevo modelo de extracción del aceite de oliva en dos fases que sustituiría al anterior modelo de tres fases, el cual presentaba problemas medioambientales por generar un elevado volumen de agua residual. Este modelo se instauró rápidamente en España, llegando a implementarse en casi el 100% de las almazaras del país (Roig et al., 2006). En otros países europeos, la entrada de este nuevo modelo fue más lenta y en países como Italia y Grecia todavía se utilizaba mayoritariamente el modelo de tres fases a comienzo del siglo XXI (según datos del IMPEL, 2003). El nuevo modelo de dos fases, genera, además del aceite de oliva, un subproducto sólido constituido por una mezcla de aguas de vegetación, partes sólidas de las aceitunas y restos grasos, denominado alperujo (Figura 1.13). Este residuo tiene un contenido de humedad elevado en el que las especies químicas mayoritarias son solubles. Además, presenta una relación C/N alta y valores de pH comprendidos entre 4 y 6. Respecto a su composición orgánica cabe destacar que es un residuo rico en lignina (32-56%), hemicelulosa (27-42%) y celulosa (14-25%). Asimismo, contiene proteínas (4-11%), lípidos (8-20%) e hidratos de carbono solubles (1-16%) (Alburquerque et al., 2004). También contiene una serie de componentes fitotóxicos, principalmente fenólicos (1-2%), que inhiben el crecimiento microbiano, la germinación y el crecimiento vegetativo en plantas (Capasso et al., 1995; Ramos-Cormenzana et al., 1996; Linares et al., 2003). Para mejorar las propiedades fisico-químicas del alperujo y reducir la cantidad de compuestos fitotóxicos que contiene, este residuo se somete a un proceso de compostaje (Figura 1.13). Dicho proceso consiste en una descomposición aeróbica de la materia orgánica heterogénea por la acción de una mezcla de microorganismos en un ambiente húmedo, templado y aeróbico (Gray et al., 1971) dando lugar a un material llamado compost. Los residuos orgánicos se apilan en cúmulos y, debido a la intensa actividad biológica de las bacterias en la primera fase de la degradación, se 1. INTRODUCCIÓN 41 producen reacciones exotérmicas que conducen a temperaturas que alcanzan los 70- 80 °C en el interior del montículo y cuyo calor emitido causa la pasteurización de los residuos. La degradación de sustancias orgánicas y la mineralización en CO2, agua y sales orgánicas suponen una reducción de masa de un 40-50%. Un residuo orgánico muy novedoso utilizado como enmienda de suelos y que está en alza en los últimos años es el carbón biológico o biochar (BC). Este residuo se forma a partir de la transformación termoquímica de biomasa de diferentes orígenes mediante procesos de pirólisis, gasificación o carbonización hidrotermal, principalmente (Figura 1.13) (Cha et al., 2016). Se obtiene un material con una alta estabilidad al compararlo con otros residuos orgánicos, el cual, al adicionarlo al suelo, aumenta la fertilidad, la retención de agua, el potencial de secuestro de C y reduce las emisiones de gases de efecto invernadero. Además de estas mejoras en las propiedades del suelo asociadas a la optimización de la producción de cultivos, otra finalidad de la adición de este residuo al suelo es la de ayudar a su remediación por contaminación tanto de metales pesados como de contaminantes orgánicos como los plaguicidas, debido a sus propiedades como adsorbente. Para mejorar la capacidad adsorbente del biochar, el producto obtenido de los procesos termales anteriormente descritos puede someterse a técnicas de activación que aumenten su superficie específica y porosidad o para enriquecerlo en determinados grupos funcionales. Los métodos de activación pueden ser de naturaleza física, en la que se utilizan gases como el vapor de agua, el CO2 o el ozono, o química, basados principalmente en reacciones de oxidación con diferentes oxidantes como permanganato potásico, agua oxigenada, aire u ozono (Tang et al., 2013). Los principales factores que van a condicionar las propiedades del biochar son la temperatura de preparación y el origen del material de partida. Tang et al. (2013) estudiaron algunos ejemplos de la influencia del origen de la biomasa y de la temperatura sobre la superficie específica y porosidad del BC generado y la relacionó con su capacidad de adsorción. Una de las materias primas que pueden ser utilizadas para la obtención de biochar son los residuos de almazaras. Varios trabajos han evaluado la capacidad de adsorción de este tipo de biochar, demostrando su alta capacidad para la adsorción de compuestos orgánicos como los plaguicidas (García-Jaramillo et al., 2014; Gámiz et al., 2016a) y de metales pesados (Ahmad et al., 2014). 1. INTRODUCCIÓN 42 Figura 1.13. Representación esquemática de los procesos de preparación de enmiendas basadas en residuos de almazaras. 1.3.4.2. Efecto de los residuos orgánicos en la dinámica de los plaguicidas El efecto de los residuos orgánicos sobre la dinámica de los plaguicidas en el suelo dependerá de las propiedades del suelo y del residuo, así como de la naturaleza del plaguicida. Respecto a la adsorción, la materia orgánica insoluble proporcionada por el residuo suele aumentar la adsorción de los plaguicidas al suelo. Sin embargo, las enmiendas orgánicas también aportan al suelo materia orgánica soluble (MOS) cuyo efecto es más variable (Cox et al., 2004; Fernandes et al., 2006). Así, la MOS puede aumentar la adsorción del plaguicida al adsorberse sobre las partículas del suelo y proporcionar nuevos sitios de adsorción o, por el contrario, puede reducir la adsorción por la formación de complejos solubles MOS-plaguicida o por competir con el plaguicida por los sitios de adsorción del suelo (Celis et al., 1998a). Respecto a la persistencia de los plaguicidas, la adición de residuos orgánicos podría acelerar la degradación de los agroquímicos al proporcionar materia orgánica que favorezca la proliferación microbiana (Barriuso et al., 1997), así como incorporar ACEITUNAS Centrifugación horizontal ACEITE DE OLIVA ALPERUJO (ALP) ALPERUJO COMPOSTADO (ALPc) Trituración/molienda Lavado BIOCHAR (BC) SINTEGAS: CO Y H2 BIOACEITE - Pirólisis - Gasificación - Carbonización hidrotermal Compostaje CO2+ H2O 1. INTRODUCCIÓN 43 nuevos microorganismos exógenos que pudieran contribuir en la degradación de los plaguicidas (Wang et al., 2007b). No obstante, otros autores han observado que el uso de residuos orgánicos como enmiendas también puede ralentizar la degradación de los plaguicidas debido al uso, por parte de los microorganismos degradadores, de la materia orgánica aportada por las enmiendas como alimento más fácilmente degradable que el plaguicida (Albarrán et al., 2003), por el efecto tóxico de ciertos compuestos de la enmienda sobre las especies degradadoras o bien por una disminución de la biodisponibilidad por un aumento de la adsorción. Hay que resaltar que el efecto será distinto en función del tipo de enmienda orgánica adicionada. Por ejemplo, los tratamientos de compostaje y pirólisis mejoran las propiedades de los residuos haciéndolos más estables y útiles. De este modo, el proceso de compostaje hace que el alperujo reduzca su cantidad de compuestos fitotóxicos y transforma la materia orgánica en compuestos más humificados. Por otro lado, el proceso de transformación térmica para generar biochar da lugar a un residuo muy poroso con gran superficie específica que presenta una alta capacidad de adsorción frente a compuestos orgánicos (Figura 1.14). Figura 1.14. Mecanismos de interacción de biochar (BC) con contaminantes orgánicos. Los círculos en las partículas de biochar muestran partición o adsorción (adaptado de Ahmad et al., 2014). Interacción electrostática entre el BC y contaminantes orgánicos Interacción entre el BC y contaminantes orgánicos polares Interacción entre el BC y contaminantes orgánicos nopolares Zonas carbonizadas (Fase de adsorción) Zonas no carbonizadas (Fase de partición) 1. INTRODUCCIÓN 44 El aumento de la adsorción de los compuestos agroquímicos en suelos enmendados con biochar da lugar a una reducción de su biodisponibilidad en el suelo, lo cual conlleva una menor degradación y una disminución en la absorción por las plantas, que ayuda a reducir la presencia de plaguicida residual en los cultivos. Sin embargo, puesto que se requiere que el plaguicida esté biodisponible para actuar contra la plaga objetivo, la disminución de la efectividad del plaguicida por el efecto del BC no es completamente deseable (Tang et al., 2013). Por consiguiente, el uso de biochar en la agricultura requiere realizar un balance entre el potencial efecto del residuo en la remediación de plaguicidas y su efecto negativo en la eficacia del mismo. Cabe destacar que estudios recientes han encontrado que el envejecimiento del biochar puede reducir su capacidad de adsorción con el tiempo, lo cual mejoraría la eficiencia del uso de biochar en suelos agrícolas (Martin et al., 2012). El estudio del efecto de los residuos orgánicos en la enantioselectividad de la adsorción y degradación de plaguicidas quirales ha sido escasamente estudiado. En un principio, el efecto sobre los procesos abióticos afectaría de igual modo a ambos enantiómeros. Sin embargo, los procesos biológicos, es decir, aquellos que son realizados por microorganismos o enzimas extracelulares, sí que podrían verse afectados de forma diferente para cada uno de los enantiómeros. Esto se debe a que los residuos orgánicos podrían suministrar al suelo microorganismos exógenos que degradarían exclusivamente a uno de los enantiómeros o bien suministrar algún tipo de compuesto tóxico que afectara a los microorganismos degradadores de un enantiómero específico, disminuyendo su velocidad de degradación (Gámiz et al., 2013, 2016a; Romero et al., 2001). De este modo, Gámiz et al. (2013) observaron que la aplicación de un residuo de almazara fresco a un suelo franco-arcilloso daba lugar a un aumento de la velocidad de degradación del enantiómero S del fungicida metalaxil y a una disminución en la velocidad de degradación del enantiómero R, en comparación con el suelo sin enmendar. En otro estudio, Gámiz et al. (2016a) observaron este mismo comportamiento al aplicar alperujo compostado, mientras que al aplicar biochar obtenido a partir del mismo la persistencia de ambos enantiómeros aumentó debido a la alta capacidad de adsorción del BC para el fungicida. La enmienda de suelos con residuos orgánicos no sólo modifica la velocidad de degradación de los enantiómeros, sino que además puede cambiar la 1. INTRODUCCIÓN 45 enantioselectividad del proceso. Así, Romero et al. (2001) encontraron que la degradación del enantiómero S de los herbicidas mecoprop y diclorprop en un suelo franco-arcilloso era más rápida que la del enantiómero R. Al adicionar a dicho suelo residuos procedentes de turba, la enantioselectividad de la disipación cambió, pasando el enantiómero S a ser más persistente que el R. 1.3.5. Aplicación de materiales arcillosos Las arcillas, por su elevado poder adsorbente, constituyen un grupo de materiales de origen natural que han sido propuestos en diversas aplicaciones dirigidas a prevenir o remediar la contaminación por los plaguicidas que se usan en la agricultura. Dichas aplicaciones incluyen desde su uso como soportes para una liberación controlada del producto fitosanitario hasta su aplicación directa al suelo para la inmovilización del plaguicida o su uso como componentes de filtros para la descontaminación de aguas afectadas por la presencia de plaguicidas. A continuación se describen brevemente, las características estructurales y propiedades adsorbentes de este tipo de materiales, así como sus principales aplicaciones en la prevención y remediación de la contaminación por plaguicidas. 1.3.5.1. Propiedades estructurales y adsorbentes de las arcillas Los materiales arcillosos pueden definirse como un variado grupo de compuestos de diferente naturaleza y propiedades que tienen en común una estructura constituida por láminas formadas por la unión de tetraedros y/u octaedros de óxidos o hidróxidos metálicos. En función de los metales presentes en la estructura y de la constitución de las láminas, se obtiene una extensa variedad de compuestos que pueden dividirse, considerando la carga permanente de estas láminas, como arcillas catiónicas (filosilicatos o arcillas naturales) o arcillas aniónicas (hidrotalcitas o hidróxidos dobles laminares) (Figura 1.15). La estructura laminar de estos materiales es la responsable de su alta superficie específica y de la existencia de un espacio interlaminar, generalmente expansible, capaz de albergar compuesto orgánicos. Además, presentan la posibilidad de modificar su naturaleza superficial (hidrofílica, hidrofóbica…) para aumentar su 1. INTRODUCCIÓN 46 afinidad por un adsorbato específico. Por todo ello, las arcillas han sido propuestas como adsorbentes de plaguicidas. Figura 1.15. Representación esquemáticas de la estructura de las arcillas catiónicas y aniónicas. 1.3.5.1.1. Arcillas catiónicas a) Estructura El término arcillas catiónicas se usa para designar a aquellos minerales de la arcilla presentes en suelos y sedimentos los cuales son productos finales de la meteorización de los silicatos o se encuentran en yacimientos enriquecidos en algunos de ellos. Estos constituyentes de los suelos tienen una gran importancia en la agricultura, ya que influyen en propiedades clave de los suelos como la estructura, textura, retención de agua y fertilidad, entre otras. La mayoría de estos minerales pertenecen al grupo de los filosilicatos, aunque pueden coexistir con algunas otras fases minerales cristalinas o amorfas (óxidos e hidróxidos: gibbsita, hematites, etc...) que también se incluyen en la definición de minerales de la arcilla (Guggenheim & Martin, 1995). En este apartado nos centraremos en el grupo de los filosilicatos y más específicamente en el grupo de las esmectitas, al ser las arcillas catiónicas que se utilizarán y modificarán en el desarrollo de esta tesis. Los filosilicatos están formados a partir del apilamiento de láminas tridimensionales, constituidas a su vez por capas bidimensionales de unidades tetraédricas de Si-O y unidades octaédricas de Al-(O-OH) o Mg-(O-OH). En función del apilamiento se diferencian tres tipos de minerales: + + + - - - - - - Arcillas catiónicas + + + + + + Arcillas aniónicas 1. INTRODUCCIÓN 47 Minerales tipo 1:1 En ellos, cada lámina tridimensional se forma por la condensación de una capa tetraédrica y otra octaédrica. Dichas láminas se unen entre sí a través de puentes de hidrógeno OH-O de capas adyacentes. Minerales tipo 2:1 Las lámina tridimensionales están constituida por una capa octaédrica situada entre dos capas tetraédricas, de modo que la unión entre láminas tiene lugar mediante fuerzas de van der Waals entre átomos de O de capas contiguas. En la mayoría de los casos, las láminas de los filosilicatos 2:1 presentan una carga negativa permanente debido a sustituciones isomórficas de cationes Si4+ de las capas tetraédricas por otros cationes de tamaño parecido pero de carga menor como el Al3+. También son posibles sustituciones isomórficas en las capas octaédricas de, por ejemplo, Al3+ por Mg2+. La carga negativa generada está compensada por cationes inorgánicos, hidratados en mayor o menor grado, que se sitúan tanto entre las láminas del material como en los bordes. Estos cationes inorgánicos pueden ser intercambiables por otros, lo cual dependerá de que la carga permanente se dé en la capa tetraédrica u octaédrica, de la carga por superficie laminar o de celda, así como de la naturaleza del catión. Minerales tipo 2:1:1 Este tipo de minerales presentan una estructura similar a la de los minerales del tipo 2:1, en los que el balance de carga se mantiene por la presencia, en el espacio interlaminar, de grupos hidroxilos coordinados octaédricamente similares a las capas octaédricas. Esto supone que tanto su capacidad de intercambio catiónico como de hinchamiento son prácticamente nulas (Karathanasis et al., 1983; Ezzaim et al., 1999). A este tipo de minerales pertenecen las cloritas. En este trabajo, nos referiremos específicamente a los filosilicatos del tipo 2:1, del grupo esmectitas y subgrupo montmorillonita, los cuales son minerales dioctaédricos (las posiciones octaédricas están ocupadas por Al) de fórmula genérica (Na,Ca)0.3(Al, Mg)2Si4O10(OH)2. 1. INTRODUCCIÓN 48 b) Interacciones de plaguicidas con esmectitas Los centros activos de las esmectitas para la adsorción de compuestos orgánicos e inorgánicos se muestran en la Figura 1.16. Dichos centros son, principalmente, los cationes de cambio hidratados de la interlámina y los bordes del mineral, los grupos silanoles y aluminoles de los bordes de ruptura de los enlaces Si- O-Si y Al-O-Si, los cuales son sitios de carga variable dependiente del pH, y los grupos siloxanos laminares de los planos basales externos o interlaminares comprendidos entre los sitios cargados, que presentan carácter hidrofóbico (Jaynes & Boyd, 1991a). Figura 1.16. Centros activos de un mineral esmectítico en relación con la adsorción de plaguicidas. Los mecanismos de interacción de estas arcillas con los plaguicidas dependen, en gran medida, de la carga de dichos plaguicidas. De este modo, los plaguicidas catiónicos y protonables se adsorben rápidamente por su afinidad por la carga negativa de las láminas (Hermosín & Pérez-Rodríguez, 1981; Cox et al., 1997b) por procesos de intercambio catiónico y a través de enlaces polares y de hidrógeno. Por otro lado, los plaguicidas aniónicos y los ácidos débiles presentan una adsorción muy baja o nula debido a que son repelidos por las superficies basales cargadas negativamente (Celis et al., 1999a). Cabe señalar que en las esmectitas existen sitios Grupos silanoles y aluminoles (carga variable) Cationes interlaminares Grupos siloxanos (Superficie hidrofóbica) Sustituciones isomórficas O Si+4 Al+3 Mg+2 H OH 1. INTRODUCCIÓN 49 de adsorción para especies aniónicas, como son los bordes cargados positivamente (si el pH es inferior a 5), los metales polivalentes en los sitios de intercambio o, con las condiciones apropiadas, mediante la dominancia de la atracción por fuerzas de van der Waals (Lagaly, 2001); sin embargo, no son muy numerosos y globalmente predominan los sitios con cargas negativas. Finalmente, los plaguicidas neutros hidrófobos no presentan, en general, una alta afinidad por las esmectitas debido al ambiente hidrofílico de la superficie del mineral generado por los cationes interlaminares hidratados (Jaynes & Vance, 1996), mientras que los plaguicidas neutros que presentan grupos funcionales polares (-OH, =O, -NH2, -NO2) son retenidos mediante fuerzas electrostáticas (ion-dipolo o dipolo-dipolo) o enlaces de coordinación. c) Interacciones de plaguicidas con esmectitas modificadas con cationes orgánicos Con el fin de mejorar las propiedades de adsorción de las arcillas tipo esmectitas frente a compuestos aniónicos y ácidos débiles, así como frente a compuestos neutros hidrofóbicos o polares, es posible la modificación de las propiedades superficiales de estas arcillas mediante la sustitución de los cationes inorgánicos presentes en el espacio interlaminar por cationes orgánicos (Jaynes & Boyd, 1991a; Hermosín & Cornejo, 1992; Lagaly, 2001). Estas transformaciones son posibles gracias a que las esmectitas son filosilicatos de tipo expansibles y permiten la incorporación en la interlámina de compuestos orgánicos voluminosos para formar organo-arcillas. Los mecanismos por los que los cationes orgánicos se introducen en el espacio interlaminar pueden ser de diferente naturaleza, siendo los principales a través de reacciones de intercambio catiónico y por adsorción física. Los cationes orgánicos más comunes que se utilizan para la preparación de las organo-arcillas son los cationes aquilamonio cuaternarios de fórmula general [(CH3)nNR4-n], donde R es un hidrocarburo aromático o alifático (Figura 1.17) (Carrizosa et al., 2001), aunque también se emplean otros compuestos como polímeros (Darder et al., 2003; Gámiz et al., 2010; Celis et al., 2012). 1. INTRODUCCIÓN 56 Figura 1.21. Algunos surfactantes y aniones carboxilatos usados para modificar el carácter hidrofílico a hidrofóbico en las hidrotalcitas. Los principales factores de los que va a depender el grado de adsorción de los plaguicidas en las organo-hidrotalcitas serán la naturaleza, la cantidad y la configuración estructural que adopte el anión orgánico intercalado. Celis et al. (2014) evaluó la capacidad de adsorción de muestras de hidrotalcitas y organo-hidrotalcitas obtenidas a partir de la incorporación de aniones de ácidos grasos de igual tamaño (18 átomos de carbono) pero diferente número de insaturaciones. Para el caso de los plaguicidas no-iónicos el resultado fue una baja adsorción en la hidrotalcita inalterada debido a su carácter hidrofílico y una gran afinidad por las organo-hidrotalcitas, al cambiar la naturaleza de la arcilla a hidrofóbica por la incorporación de los aniones orgánicos. La capacidad de adsorción de las organo-hidrotalcitas dependió del grado y tipo de insaturaciones. Así, la muestra de hidrotalcita modificada con el anión elaidato, que presenta una insaturación en trans, mostró mayor adsorción de los plaguicidas no-iónicos al compararlo con aquellas modificadas con aniones con insaturaciones en cis. Por otro lado, cuanto mayor era el número de insaturaciones en cis de los aniones orgánicos, menor fue la capacidad de adsorción para los plaguicidas no-iónicos. Esto se debió a que la curvatura impuesta por la geometría cis de los dobles enlaces da lugar a estructuras de menor densidad de empaquetamiento -O O S -O O O -O O b) Dodecilbencenosulfato (DBS) O S -O OO a) Dodecilsulfato (DDS) d) Oleato (OLE) f) Linolenato (OLE) -O O e) Linoleato (OLE) c) Elaidato (ELA) -O O 1. INTRODUCCIÓN 57 reduciéndose el espaciado interlaminar donde albergar los compuestos orgánicos adsorbidos. Un caso similar se observó en la adsorción del insecticida clorpirifos sobre muestras de hidrotalcitas modificadas con dodecilsulfato (HT-DDS) y dodecilbencenosulfato (HT-DBS). Se demostró que la presencia del anillo bencénico en el anión de DBS daba lugar a una densidad de empaquetamiento menor a la que se daba en el caso del DDS, donde la cadena alifática es lineal. La mayor densidad del empaquetamiento de los aniones orgánicos DDS explicaba la mayor adsorción del insecticida en la muestra de HT-DDS en comparación con la muestra de HT-DBS. (Wang et al., 2005). 1.3.5.2. Aplicaciones de las arcillas como adsorbentes de plaguicidas 1.3.5.2.1. Barreras inmovilizadoras de plaguicidas en suelos Este uso propuesto para las arcillas consiste en la formación de barreras que inmovilizan a los contaminantes en la zona más superficial de los suelos, impidiendo que se produzcan pérdidas por escorrentía o lixiviación. Está disminución de las pérdidas por escorrentía y lixiviación reducen el riesgo de contaminación de aguas superficiales y subterráneas y, por otra parte, puede incrementar la eficacia del plaguicida al prolongar su tiempo de residencia en la rizosfera. En general, los contaminantes pueden unirse a este tipo de barreras modificando su fase (barreras de precipitación) o bien adherirse a la superficie de los materiales que forman la barrera (barrera de adsorción) (Morrison & Spangler, 1993). La efectividad del uso de organo-arcillas procedentes de arcillas catiónicas como barreras para adsorber los plaguicidas ha sido expuesta en multitud de estudios (Jaynes & Boyd, 1991b; Brixie & Boyd, 1994; Rodríguez-Cruz et al., 2007). Voudrias (2002) demostró, mediante modelos predictivos, que el tratamiento de un suelo con bentonita modificada con HDTMA disminuyó la lixiviación del herbicida diurón y de benceno. Por otro lado, Rodríguez-Cruz et al. (2007) emplearon barreras constituidas por diferentes minerales de la arcilla (montmorillonita, caolinita paligorskita) modificados con octadeciltrimetilamonio (ODTMA) en estudios de lixiviación en columnas de suelo, observándose una reducción de la lixiviación de varios plaguicidas e incluso, la inmovilización de algunos de ellos. 1. INTRODUCCIÓN 58 El empleo de organo-hidrotalcitas para la formación de barreras inmovilizadoras no se ha estudiado tan extensamente como en el caso de las organoarcillas catiónicas. No obstante, recientemente se ha propuesto su uso como adsorbentes para la retención de contaminantes en sistemas suelo-agua. Un ejemplo es el estudio realizado por Bruna et al. (2012) en el que se evaluó el uso de HT-DDS para la inmovilización de hidrocarburos aromáticos policíclicos. 1.3.5.2.2. Soportes para la liberación controlada de plaguicidas En la mayoría de las formulaciones de plaguicidas que se comercializan actualmente, el principio activo se presenta en una forma inmediatamente disponible para actuar sobre la plaga objetivo. Esto conlleva que, en los casos de plaguicidas muy solubles, estos se pierdan rápidamente por procesos de lixiviación y/o escorrentía tras su aplicación, ya que las moléculas no permanecen en el suelo el tiempo suficiente para que se difundan a través de los agregados y alcancen los sitios de adsorción presentes en los mismos (Gish et al., 1991; Cox et al., 2000a). Para reducir las pérdidas de plaguicidas por transporte, se ha propuesto la síntesis de complejos o formulaciones de liberación controlada en las cuales solo una pequeña parte del plaguicida se encuentra en una forma inmediatamente disponible, mientras que la mayor parte se encuentra adsorbida en un soporte inerte, en este caso arcillas u organo-arcillas, que lo libera gradualmente con el tiempo (Fernandez-Pérez et al., 1998; Celis et al., 2000, 2002a; Undabeytia et al., 2003). El uso de este tipo de formulaciones de plaguicidas presenta muchas ventajas. Por un lado, la reducción de las pérdidas por escorrentía y lixiviación permite una disminución en la dosis de aplicación y en el número de aplicaciones del plaguicida requeridas si se compara con las formulaciones convencionales, lo cual supone, a su vez, un abaratamiento de los costes. Además, se da un aumento en la seguridad de la manipulación del agroquímico por parte de los agricultores y, en general, un descenso en los efectos perjudiciales sobre el medio ambiente al reducirse la posible contaminación difusa (Gerst et al., 1998a). No obstante, el uso de estas formulaciones presenta el inconveniente de que ciertos complejos arcilla-plaguicida mantienen altas cantidades del agroquímico no liberado, lo que puede dar lugar a problemas de contaminación a largo plazo y la necesidad de mayores dosis de aplicación (Celis et al., 2002b; Cornejo 1. INTRODUCCIÓN 59 et al., 2004). Otra desventaja de su uso es el elevado precio actual en el mercado de estas formulaciones. En el caso de las arcillas catiónicas, se han ensayado diferentes tipos de formulaciones, principalmente basadas en arcillas modificadas con cationes alquilamonio (Carrizosa et al., 2000, 2001; Undabeytia et al., 2000; Lagaly., 2001; Celis et al., 2002a). Sin embargo, los estudios más recientes se han centrado en la síntesis de complejos de plaguicidas soportados sobre arcillas modificadas con cationes orgánicos naturales, los cuales causarían menos daños medioambientales una vez introducidos en ecosistemas naturales. Algunos ejemplos serían las formulaciones de diurón soportado en una montmorillonita modificada con espermina (Trigo et al., 2009), así como este mismo herbicida sobre una montmorillonita modificada con fosfatidilcolina (Undabeytia et al., 2012). Por otro lado, los estudios acerca del empleo de hidrotalcitas y organohidrotalcitas como soportes para plaguicidas son mucho menos comunes que en el caso de las organo-arcillas de arcillas catiónicas, si bien en las últimas décadas el interés por este tipo de formulaciones y los estudios sobre ellos han ido en aumento (Meng et al., 2005; Cardoso et al., 2006; Bruna et al., 2008; Qiu et al., 2009; Chaara et al., 2011). Un ejemplo es el estudio realizado por Cardoso et al. (2006), en el cual se sintetizaron complejos hidrotalcita-plaguicidas con tres herbicidas ácidos diferentes: 2,4 D, MCPA y picloram y se aplicaron a columnas de suelo para simular el proceso de lixiviación. Para los tres plaguicidas, se observó un retraso en la lixiviación al ser aplicados en forma de complejos en lugar de libres. En otros trabajos se han utilizado organo-hidrotalcitas para formar complejos de plaguicidas no-iónicos. Así, Bruna et al. (2008) sintetizaron complejos de terbutilazina soportada sobre hidrotalcitas modificadas con los aniones orgánicos dodecilsulfato (DDS) y sebacato (SEB) y se detectó de nuevo un retardo en la lixiviación del herbicida cuando se aplicaba en forma de complejo al compararlo con la formulación comercial. Resultados similares fueron obtenidos por Celis et al. (2015b) al aplicar formulaciones de metalaxil soportado en organo-hidrotalcitas que habían sido modificadas con aniones de ácidos grasos. 1. INTRODUCCIÓN 60 1.3.5.2.3. Filtros para la depuración de aguas Una aplicación muy importante de las arcillas y organo-arcillas tanto catiónicas como aniónicas, es su posible uso como filtros para la depuración de aguas y para la remediación de medios acuáticos contaminados. El empleo de esmectitas tanto inalteradas como modificadas con cationes orgánicos en la remediación de sistemas acuáticos contaminados por plaguicidas ha sido ampliamente estudiado. Se ha evaluado el uso de estos materiales como filtros de compuestos orgánicos tanto iónicos como polares (Hermosín & Cornejo, 1992; Sánchez-Camazano et al., 1995; Cox et al., 1997b; Celis et al., 1999 a,b; Ganigar et al., 2010), así como de compuestos neutros no polares (Lee et al., 1990; Sheng & Boyd, 2000; Chun et al., 2003; Shen, 2004). A pesar de la alta afinidad de las hidrotalcitas por plaguicidas aniónicos, el uso de estas arcillas como filtros en aguas naturales no resulta efectivo debido a que la abundancia de iones carbonatos en este medio dificulta su desplazamiento por el plaguicida que se quiere retirar. Por ello, es necesario modificar la estructura de la interlámina para mejorar la afinidad por dichos plaguicidas. Una posible estrategia para mejorar la adsorción consistiría en intercalar en la hidrotalcita aniones monovalentes fácilmente intercambiables como el Cl- o el NO3- o bien utilizar hidrotalcitas calcinadas a 500 °C. Un ejemplo sería la retirada del herbicida ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) de una disolución acuosa. Hermosín & Cornejo (1992) encontraron que aunque una hidrotalcita de Ni/Al carbonatada era más eficiente para retirar 2,4-D de aguas que varias arcillas naturales y organo-arcillas, la adsorción se limitaba principalmente a la superficie externa del hidróxido doble laminar, ya que el anión monovalente 2,4-D no era capaz de desplazar a los aniones divalentes carbonatos de la interlámina. Para mejorar la adsorción de este herbicida sobre una muestra de hidrotalcita Zn/Al, Lakramimii et al. (2000) introdujeron aniones inorgánicos monovalentes de Cl-, los cuales son más fácilmente intercambiables por el 2,4-D. Otra solución para aumentar la afinidad de las hidrotalcitas por este herbicida aniónico es la utilización de su variante calcinada a 500 °C, haciendo uso del “efecto memoria” (Pavlovic et al., 2005). Otros plaguicidas aniónicos que han sido retirados satisfactoriamente de aguas naturales mediante hidrotalcitas son los fenolatos, los cuales suelen encontrarse en aguas subterráneas. Se pueden citar como ejemplo el 2,4,6-triclorofenol (TCP) o el 2,4,6-trinitrofenol (TNP) (Hermosín et al., 1993, 1996; 1. INTRODUCCIÓN 61 Ulibarri et al., 1995), 2,4-dinitrofenol (DNP) y 2-metil-4,6-dinitrofenol (Chaara et al., 2010). Otros contaminantes orgánicos presentes en aguas y que son aptos para ser retenidos por hidrotalcitas son los surfactantes como el dodecildibenzosulfato, octilsulfato o el 4-octilbenzenosulfanato (Pavlovic et al., 1997; You et al., 2002), moléculas derivadas de ácidos orgánicos (Crepaldi et al., 2002; Cardoso et al., 2003) y tintes sintéticos (Orthman et al., 2003). Además de para contaminantes aniónicos orgánicos, las hidrotalcitas y sus productos de calcinación han sido evaluados como adsorbentes de contaminantes inorgánicos aniónicos de diferente naturaleza, como nitratos y fosfatos responsables de la eutrofización en aguas naturales (Shin et al., 1996; Legrouri et al., 1999; Gillman, 2010), iones con actividad radioactiva de aguas residuales (Kang et al., 1996; Toraishi et al., 2002), oxoaniones como arseniato, cromato y vanadato (Kovanda et al., 1999), aniones monoatómicos como Clprocedentes de aguas ácidas (Kameda et al., 2000), etc. Cabe destacar que la práctica totalidad de los estudios realizados sobre la aplicación de arcillas catiónicas y aniónicas como enmiendas, filtros y soportes de plaguicidas no han abordado el posible efecto enantioselectivo que pudiera darse por la presencia de átomos quirales en la estructura del plaguicida, habiéndose analizado y tratado estos compuestos como una suma de enantiómeros y no como enantiómeros individuales. 2. OBJETIVOS 65 El hecho de que más de un cuarto de los plaguicidas comercializados en la actualidad a nivel mundial sean quirales ha suscitado un gran interés por la particular actividad de este grupo de compuestos agroquímicos y por las consecuencias de su presencia en compartimentos ambientales como suelos, aguas y sedimentos. Los plaguicidas quirales se caracterizan por presentar al menos dos formas enantioméricas (imágenes especulares no superponibles) asociadas a la presencia de un centro estereogénico en su estructura, las cuales, tradicionalmente, se han venido utilizando, regulando y analizando de forma conjunta considerándolas como si fueran indistinguibles. Sin embargo, el avance en el desarrollo de métodos de separación y análisis enantioselectivos de los últimos años ha permitido demostrar que la eficacia biológica, la toxicidad hacia organismos no objetivos y el comportamiento en el medio ambiente de un gran número de plaguicidas quirales muestran una marcada enantioselectividad. En consecuencia, considerar a los enantiómeros de un plaguicida quiral como si se trataran de un único compuesto puede conducir a importantes errores en la predicción de la eficacia y del impacto ambiental del plaguicida. Por otra parte, cuando la eficacia biológica recae mayoritariamente sobre uno de los enantiómeros, a los habituales efectos adversos asociados al uso del plaguicida se añade el hecho de incorporar en el medio ambiente una fracción inactiva, sin utilidad real, que puede sobrecargar el suelo reduciendo su capacidad de auto-recuperación. Ante esto, las autoridades de distintos países han asumido la necesidad de regular el uso de los plaguicidas quirales, considerando el comportamiento de los enantiómeros por separado y, en ciertos casos, recomendando o imponiendo el uso del enantiómero activo puro en lugar de la mezcla racémica o mezcla de enantiómeros. Esta práctica supondría una reducción de las dosis de aplicación y, por tanto, una disminución de la contaminación del medio ambiente. La hipótesis de partida para la presente Tesis Doctoral ha sido considerar que, dado que el comportamiento de los plaguicidas quirales en el suelo suele ser enantioselectivo, los posibles cambios en dicho comportamiento causados por prácticas agrícolas comunes también podrían afectar de forma diferente a cada uno de los enantiómeros. Por lo tanto, un conocimiento profundo de la actividad quiral de estos plaguicidas bajo diferentes condiciones de aplicación, facilitaría diseñar estrategias que permitan reducir el impacto contaminante de estos agroquímicos en el suelo y, en particular, establecer la idoneidad de aplicar exclusivamente el enantiómero activo para el tratamiento de la plaga a combatir. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 72 Purificación de los enantiómeros del imazaquín Algunos experimentos de laboratorio se llevaron a cabo utilizando los enantiómeros puros del imazaquín. Para ello, los enantiómeros se purificaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) usando el equipo y la columna que se especifican en el apartado 3.2.1.1. Las condiciones cromatográficas utilizadas en la separación fueron: fase móvil isocrática de HCl 0.001 M/acetonitrilo con un porcentaje 60:40 (v/v), flujo de 1 ml/min y detección a 250 nm. En cada inyección, se introdujo en el sistema un volumen de 50 µl de una disolución de 500 mg/l de imazaquín racémico preparado en fase móvil. La fracción del primer pico (S- imazaquín) fue recolectada a un tiempo de retención aproximado de 6.4-7.0 min y la fracción del pico 2 (R-imazaquín) a 7.4-8.1 min. Se recogieron alrededor de unos 100 ml de cada enantiómero, que se neutralizaron con 0.6 ml de NaOH (0.1 M) hasta alcanzar un valor de pH aproximado de 6. Finalmente, se evaporó el acetonitrilo de la disolución aplicando un flujo de N2. La concentración de cada enantiómero en cada disolución (30 mg/l aprox.) se determinó por HPLC enantioselectiva (bajo las condiciones descritas en el apartado 3.2.1.1), obteniéndose una pureza > 99% para cada uno de ellos. 3.1.2. Suelos En los experimentos de laboratorio descritos en esta memoria se utilizaron dos suelos agrícolas representativos de suelos mediterráneos con similares valores de pH y bajos contenidos de carbono orgánico, pero con diferentes texturas y composición mineralógica. Los suelos, procedentes de la provincia de Sevilla, fueron un suelo arcilloso originario de la localidad de las Cabezas de San Juan dedicado al cultivo de algodón (S1) y un suelo franco-arenoso procedente de la finca experimental “La Hampa” que el IRNAS (CSIC) posee en la localidad de Coria del Río dedicado al cultivo del olivar (S2). El experimento de campo se realizó en una de las parcelas de esta misma finca, presentando el suelo utilizado (S3) una textura también francoarenosa. Los suelos S1 y S2 fueron muestreados a una profundidad de 0-20 cm, secados al aire y, posteriormente, tamizados con una luz de malla de 2 mm. A continuación, se almacenaron en cámara fría a 4 °C hasta su caracterización y 3. MATERIALES Y MÉTODOS 73 posterior uso en los experimentos. Este mismo procedimiento se utilizó en el caso del suelo S3 para su caracterización. En la Tabla 3.1 se resumen la nomenclatura, procedencia, clasificación textural, uso y el tipo de experimento en el que se utilizó cada uno de los suelos. Tabla 3.1. Procedencia, uso, textura y experimentos en los que fueron usados cada uno de los suelos. Suelo Procedencia Textura Uso Experimento S1 Las Cabezas de San Juan (Sevilla) Arcillosa Algodón Laboratorio S2 Coria del Río (Sevilla) Franco-arenosa Olivar Laboratorio S3 Coria del Río (Sevilla) Franco-arenosa Olivar Campo 3.1.3. Adsorbentes Los adsorbentes utilizados en este trabajo se resumen en la Tabla 3.2. En ella se detallan los diferentes plaguicidas y el tipo de experimento para los que se usó cada uno de ellos. Tabla 3.2. Procedencia, plaguicidas y experimentos en los que se usó cada adsorbente. Procedencia Adsorbente Plaguicida Experimento Residuos de almazara ALP Metalaxil/Imazaquín Laboratorio ALPc Metalaxil/Imazaquín Laboratorio BC Imazaquín Laboratorio Arcillas HT-CO3 Metalaxil/Imazaquín Laboratorio HT500 Metalaxil/Imazaquín Laboratorio HT-ELA Metalaxil/Imazaquín Laboratorio HT-OLE Metalaxil Campo SA-HDTMA Metalaxil/Imazaquín Laboratorio 3. MATERIALES Y MÉTODOS 74 3.1.3.1. Residuos de almazara Se utilizaron tres residuos orgánicos procedentes de dos almazaras distintas. a) Alperujo fresco (ALP) El alperujo fresco se obtuvo inmediatamente después de la etapa de centrifugación del proceso de extracción del aceite de oliva en dos fases en una almazara de Marchena (Sevilla). Para reducir el contenido de agua del residuo, se dejó secar al aire mediante volteo con máquinas de pala. Tras el secado, el ALP se trituró, tamizó a una luz de malla de 2 mm y almacenó a 4 °C hasta su posterior caracterización y uso en los experimentos. b) Alperujo compostado (ALPc) El alperujo compostado se obtuvo a partir de la descomposición aeróbica de un alperujo fresco procedente de una almazara de Jaén. Para ello, se dejó el alperujo fresco en un tanque para su secado al aire, favoreciendo el proceso de fermentación y consiguiendo disminuir el contenido de polifenoles, los cuales son fitotóxicos. Al alperujo fresco se le añadió restos de poda y hojas de olivo para favorecer la aireación. El proceso duró entre 4 y 6 meses. A continuación, el residuo fue molido y se hizo pasar por un tamiz de luz de malla de 2 mm. Finalmente, el ALPc se almacenó a 4 °C hasta su posterior caracterización y uso en los experimentos. c) Biochar (BC) El biochar se obtuvo sometiendo a un proceso de pirólisis una muestra del ALPc procedente de la almazara de Jaén. Para ello, una porción de 150 g de dicho residuo compostado se calentó a 400 °C durante 4 horas en un horno tubular bajo un flujo de N2 a 1.5 l/min. El rendimiento de la preparación del BC fue de un 60% aproximadamente. 3.1.3.2. Arcillas a) Síntesis de la hidrotalcita (HT-CO3): Mg3Al(OH)8(CO3)0.5·mH2O La hidrotalcita utilizada en los experimentos de laboratorio fue sintetizada con una relación Mg:Al 3:1 y con carbonato como anión interlaminar por el método de coprecipitación (Reichle, 1986). Para ello, se añadió gota a gota 100 ml de una 3. MATERIALES Y MÉTODOS 75 disolución acuosa de Mg(NO3)2·6H2O (0.3 moles) y Al(NO3)3·9H2O (0.1 moles) sobre 500 ml de una disolución acuosa alcalina de Na2CO3 (1.6 moles de NaOH y 0.37 moles de Na2CO3). Bajo estas condiciones, coprecipita el hidróxido doble laminar de Mg:Al en una relación 3:1. A continuación, la suspensión resultante de la coprecipitación se sometió a un tratamiento hidrotermal en un reactor de teflón a una temperatura comprendida entre 80-90 °C durante 24 horas. Tras centrifugar la suspensión y lavar el sólido cinco veces con agua destilada, el precipitado obtenido se liofilizó y guardó en un medio anhidro. b) Obtención de la hidrotalcita calcinada (HT500): Mg6Al2O9 Para la obtención de la hidrotalcita calcinada, HT500, se tomó una porción de la HT-CO3 sintetizada y se calentó a 500 °C en una mufla durante 3 horas, obteniéndose el óxido mixto metálico amorfo correspondiente (Miyata, 1980). c) Síntesis de hidrotalcita modificada con anión elaidato (HT-ELA) La organo-hidrotalcita HT-ELA se sintetizó siguiendo el procedimiento de reconstrucción basado en la reversibilidad del proceso de calcinación (Chibwe & Jones, 1989; Cavani et al., 1991; Pavlovic et al., 1997). Para ello, se realizó la hidratación de una porción de HT500 (0.5 g) con una disolución alcalina de ácido elaídico (3 mmoles de ácido elaídico disuelto en 110 ml de una disolución de NaOH 30 mM) en una estufa a 60 °C con agitación constante, tal y como describen Celis et al. (2014). Pasadas 24 horas, la suspensión se centrifugó y se retiró el sobrenadante. El sólido se lavó dos veces con agua Milli-Q (100 ml) y se secó en estufa a 60 °C. Finalmente, la organo-hidrotalcita se homogeneizó en un mortero de ágata y guardó en botes opacos cerrados herméticamente. d) Síntesis de hidrotalcita modificada con anión oleato (HT-OLE) La hidrotalcita con oleato intercalado utilizada en los experimentos de campo se sintetizó mediante un proceso similar al método de reconstrucción descrito en el apartado anterior. Se tomó 50 g de una hidrotalcita comercial con una pureza del 99% suministrada por Sigma-Aldrich y se calcinó a 500 °C durante 2 h. A continuación, se adicionó la hidrotalcita calcinada a una disolución de oleato sódico (80%, Sigma- Aldrich) de una concentración de 50 g/l (75 g de oleato sódico disuelto en 1.5 l de agua destilada a 60 °C). La suspensión se agitó durante 24 horas a una temperatura de 3. MATERIALES Y MÉTODOS 76 60 °C en estufa. Transcurrido este tiempo, la suspensión se filtró (tamaño de poro= 0.45 µm) y el sólido resultante se secó a 60 °C, obteniéndose, finalmente, la hidrotalcita modificada con oleato (HT-OLE). e) Síntesis de montmorillonita modificada con hexadeciltrimetilamonio (SAHDTMA) La síntesis de la muestra SA-HDTMA se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito por Celis et al. (2007). Se tomó una porción de montmorillonita SAz-1, rica en Ca2+, suministrada por “The Clay Minerals Society” (100 g) y se trató con una disolución de etanol:agua (50:50) con un contenido del cloruro de alquilamonio equivalente al 100% de la capacidad de intercambio catiónico de la arcilla (1200 mmol/kg). La suspensión se agitó durante 24 horas, se centrifugó y el sólido resultante se lavó tres veces con una mezcla al 50% de etanol:agua. Posteriormente, se lavó con agua destilada, se liofilizó y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso. 3.1.3.3. Complejos arcilla-imazaquín a) Síntesis del complejo de HT con R-imazaquín Para la síntesis de este complejo, se pesó 15 mg de HT500 obtenida del modo descrito en el apartado 3.1.3.2 y se añadió 10 ml de una disolución acuosa de 30 mg/l de enantiómero R-imazaquín. Se agitó la suspensión 24 horas y, transcurrido este tiempo, se filtró a vacío y el papel de filtro que contenía el complejo se secó en estufa a 60 °C. El líquido obtenido tras el filtrado se analizó por HPLC para determinar la concentración de herbicida no adsorbido y, a partir de ella, el porcentaje de imazaquín en el complejo. Con fines comparativos y en algunos experimentos de caracterización se preparó un complejo similar con imazaquín racémico. b) Síntesis del complejo de SA-HDTMA con R-imazaquín Para la síntesis de este complejo, se puso en contacto 25 mg de la arcilla SAHDTMA con 10 ml de una disolución acuosa de R-imazaquín de 30 mg/l y se agitó durante 24 horas. Pasado este tiempo, la suspensión de filtró a vacío y el sólido obtenido se secó en estufa a 60 °C. El sobrenadante se midió por HPLC para determinar, de forma indirecta, el porcentaje de herbicida en el complejo formado. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 77 3.2. MÉTODOS 3.2.1. Método analítico para la determinación de los plaguicidas 3.2.1.1. Análisis quiral El método analítico para obtener las concentraciones de los enantiómeros individuales de los plaguicidas fue la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en su modalidad quiral. Esta técnica se basa en el uso de una fase estacionaria quiral cuya diferente afinidad por los enantiómeros del plaguicida lleva a la separación de los mismos en el análisis cromatográfico. Se utilizó un cromatógrafo de la casa comercial Waters Millipore, formado por un controlador de sistema Waters 600E System Controller, un detector de radiación ultravioleta emitida por lámpara de deuterio Waters 998 Photodiode Array Detector y un inyector automático de muestras Waters 717 Autosampler. Para ambos plaguicidas, el flujo de la fase móvil fue de 1 ml/min y se utilizaron patrones externos para su calibración. La columna utilizada para el análisis de metalaxil fue una columna Chiralpak IB (150 mm de longitud x 4.6 mm de diámetro interno, 5 m de tamaño de partícula). En el caso del herbicida imazaquín se empleó una columna Chiralcel OD-3R (150 mm de longitud x 4.6 mm de diámetro interno, 3 m de tamaño de partícula). Ambas columnas presentan una fase estacionaria compuesta por un selector quiral de celulosa derivatizada con tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) soportado sobre partículas de sílice macroporosa (Figura 3.4). En el caso de la columna Chiralcel OD-3R, la fase estacionaria se fabrica por recubrimiento físico del polímero sobre la silica gel (coated chiral stationary phase), mientras que en la columna Chiralpak IB el selector quiral está inmovilizado en el soporte mediante una técnica novedosa (immobilized chiral stationary phase) que proporciona mejoras en las características de las columnas, como una mayor robustez y mejor reproducibilidad. Figura 3.4. Estructura del polímero (a) y del monómero (b) del selector quiral. O OR RO OR O O OR RO OR O O OR RO OR O O OR RO OR O O O OCONH HNOCO OCONH CH3 CH3 CH3 CH3 O H3C H3C n a) b) 3. MATERIALES Y MÉTODOS 78 En la Tabla 3.3 se describen el resto de las condiciones utilizadas para el análisis de cada plaguicida. Los límites de detección (LD) y de cuantificación (LC) se calcularon como la concentración correspondiente a una relación señal:ruido 3:1 y 10:1, respectivamente (Camacho-Muñoz et al., 2009). La Figura 3.5 muestra ejemplos de cromatogramas representativos de disoluciones acuosas racémicas de metalaxil e imazaquín de 6 mg/l junto con los respectivos espectros de absorción de cada enantiómero. La asignación de los picos del metalaxil se llevó a cabo por comparación del tiempo de retención de un patrón de metalaxil-M (R-metalaxil) con un cromatograma de un patrón de rac-metalaxil, obteniéndose que el segundo pico eluído correspondía al enantiómero R. En el caso de los picos de imazaquín, éstos fueron nombrados de acuerdo con los resultados de un bioensayo con Brassica oleracea botryits en el que el enantiómero con mayor actividad herbicida, que se asignó como enantiómero R (Lao & Gan, 2005; Ramezani et al., 2010), fue el obtenido a un mayor tiempo de retención (ver apartado 4.3.4.1). Figura 3.5. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC quiral para los plaguicidas metalaxil (a) e imazaquín (b) con una disolución racémica patrón de 6 mg/l. a) b) 3. MATERIALES Y MÉTODOS 79 3.2.1.2. Análisis aquiral Para ciertos experimentos preliminares y complementarios, se utilizó HPLC con columnas aquirales. Asimismo, se realizaron análisis aquirales para comprobar su correspondencia con el análisis quiral de los enantiómeros individuales. Los análisis se realizaron en el mismo cromatógrafo de la casa comercial Waters Millipore descrito en el apartado 3.2.1.1. La columna empleada fue una columna Kinetex C18, 5 µm 100 A (150 mm de longitud x 4.6 mm de diámetro interno). Las condiciones cromatográficas utilizadas fueron las mismas descritas para el análisis quiral de cada plaguicida (apartado 3.2.1.1). El tiempo de retención del pico del metalaxil fue de 4.9 min, mientras que para el pico de imazaquín fue de 3.3 min. En la Figura 3.6 están representados ejemplos de cromatogramas de disoluciones acuosas racémicas de ambos plaguicidas de concentración de 6 mg/l y sus respectivos espectros de absorción. En ellos, los dos enantiómeros aparecen como un único pico cromatográfico. Figura 3.6. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC aquiral para los plaguicidas metalaxil (a) e imazaquín (b) con una disolución racémica patrón de 6 mg/l. a) b) 3. MATERIALES Y MÉTODOS 80 Tabla 3.3. Condiciones de análisis de los plaguicidas por HPLC enantioselectiva. Plaguicida Fase móvila Vinyección (µl) λdetección (nm) Tiempo de retención (min) LD (mg/l) LC (mg/l) Metalaxil H2O:AcN (60:40) 50 213 t S-metalaxil= 5.2 t R-metalaxil= 6.5 0.006 0.02 Imazaquín H3PO4 /AcN (60:40) pH=2 25 250 t S-imazaquín= 6.4 t R-imazaquín= 7.3 0.006 0.02 a AcN: acetonitrilo 3.2.2. Caracterización de los suelos La caracterización de los suelos se realizó en los laboratorios del servicio de análisis del IRNAS siguiendo los procedimientos convencionales descritos en la bibliografía (Tabla 3.4). La clase textural de los suelos se determinó por sedimentación siguiendo el método descrito por Gee & Bauder (1986). El contenido de carbono orgánico se obtuvo por oxidación con dicromato (Nelson & Sommer, 1982) y el contenido en carbonatos a través de la descomposición por la acción de HCl (Nelson, 1982). El pH y la conductividad fueron analizados en suspensiones suelo:agua mediante potenciometría y conductimetría respectivamente. Adicionalmente a los experimentos de caracterización convencionales, se realizaron análisis de las distribuciones de tamaño de poro y de la mineralogía de las fracciones arcilla de los suelos. Las distribuciones de tamaño de poro se obtuvieron por porosimetría de intrusión de mercurio a agregados de suelo usando un porosímetro modelo AuroPore IV 9500 de Micromeritics. La fracción arcilla de los suelos (fracción de tamaño de partícula < 2 µm) se obtuvo por sedimentación tras eliminar los carbonatos con acetato/acético (pH=5) (Jackson, 1975). La mineralogía de las fracciones arcilla se determinó por difracción de rayos X sobre agregados orientados saturados en Mg2+ y K+, tratados con etilenglicol y calcinados a 500 °C, respectivamente (Brown, 1961). 3. MATERIALES Y MÉTODOS 81 Tabla 3.4. Parámetros determinados para los suelos y técnica utilizada. Parámetro Técnica analítica Textura Sedimentación (Gee & Bauder, 1986) Contenido de C orgánico Oxidación por dicromato (Nelson & Sommer, 1982) Contenido en carbonatos Descomposición con HCl (Nelson, 1982) pH Potenciometría sobre una suspensión 1:2.5 de suelo:H2O Conductividad Conductimetría sobre una suspensión 1:5 de suelo:H2O Distribución de tamaños de poro (40-0.004 m) Porosimetría de intrusión de mercurio a agregados de suelo (porosímetro modelo AutoPore IV 9500 de Micromeritics). Mineralogía de la fracción arcilla Difracción de rayos X (Brown, 1961) 3.2.3. Caracterización de los adsorbentes 3.2.3.1. Caracterización de las enmiendas orgánicas La caracterización de las enmiendas orgánicas, ALP, ALPc y BC, fue realizada por el servicio de análisis del IRNAS. Los parámetros analizados se resumen en la Tabla 3.5. Tabla 3.5. Parámetros determinados para los alperujos y técnica empleada. Parámetro Técnica analítica Humedad Gravimetría (secado a 105 °C) pH Potenciometría sobre una suspensión 1:5 enmienda:H2O Conductividad Conductimetría sobre una suspensión 1:5 enmienda:H2O Carbono total Analizador de carbono con módulo de nitrógeno Materia Orgánica Calcinación (a 550 °C) Cenizas Calcinación (a 550 °C) N total (Kjedahl) Destilación-valoración automática Se realizó un análisis adicional de la materia orgánica soluble (MOS) de las enmiendas orgánicas por espectroscopía de fluorescencia. Para ello, se puso en 3. MATERIALES Y MÉTODOS 88 3.2.4.1.2. Adsorción de los plaguicidas a los suelos sin enmendar y enmendados Para cada plaguicida, se obtuvieron las isotermas de adsorción a los suelos S1 y S2 sin enmendar y enmendados con aquellos residuos orgánicos y arcillas que presentaron mejores propiedades adsorbentes. Por triplicado, 1 g de suelo sin enmendar o enmendado con ALP (2%), ALPc (2%) y HT-ELA (0.5 y 1%) para el caso del metalaxil y de suelo enmendado con SA-HDTMA (5%) para el caso del imazaquín, se agitaron 24 horas a 20 ± 2 °C con 8 ml de disoluciones del plaguicida a diferentes concentraciones iniciales, Cini (2, 5, 10, 20, y 30 mg/l de rac-metalaxil y 0.5, 1, 2 y 5 mg/l de rac-imazaquín). Al igual que se describe en el apartado 3.2.4.1.1, tras centrifugar las suspensiones, se retiraron 4 ml del sobrenadante que fueron filtrados y medidos por HPLC enantioselectiva para determinar la concentración de cada enantiómero en disolución. Tras el experimento de adsorción, se realizó la desorción para las muestras equilibradas con las disoluciones de concentraciones iniciales de plaguicidas más altas. La desorción se realizó del mismo modo descrito en el apartado 3.2.4.1.1. Figura 3.8. Esquema del experimento de adsorción-desorción. ADSORCIÓN DESORCIÓN Suelo (+ enmienda) o adsorbente puro Agitación 24 h Centrifugación 8000 r.p.m. 10 min 8 ml de agua destilada 4 ml de la disolución sobrenadante HPLC 8 ml de disolución acuosa del plaguicida 3. MATERIALES Y MÉTODOS 89 3.2.4.2. Estudios de persistencia 3.2.4.2.1. Estudios de persistencia en suelos sin enmendar y enmendados con los adsorbentes Los estudios de persistencia o disipación se llevaron a cabo mediante incubaciones de suelo sin enmendar y enmendado con los adsorbentes en condiciones aeróbicas y de oscuridad a 20 ± 2 °C. Se pesaron 100 g de suelo en un recipiente de vidrio con cierre hermético (Figura 3.9a) y se adicionó agua destilada para conseguir un porcentaje de humedad próximo a la capacidad de campo de los suelos (40% para el suelo 1 y 30% para el suelo 2). Se prepararon incubaciones de ambos suelos sin enmendar, enmendados con ALP y ALPc (2%) para los dos plaguicidas, HT-ELA (0.5 y 1%) exclusivamente para el metalaxil y BC (2%) y SA-HDTMA (1 y 5%) para el imazaquín. Se añadió el plaguicida en su forma racémica a una dosis de 2 mg/kg (1 mg/kg de cada enantiómero) y se homogeneizó la mezcla con espátula esterilizada. En el caso del herbicida imazaquín, para ambos suelos no enmendados, también se realizaron incubaciones de los enantiómeros puros, S- y R-imazaquín por separado, añadiendo una dosis de 1 mg/kg de cada uno de ellos. Periódicamente, se tomaron muestras de los suelos (3 g) por triplicado y se congelaron inmediatamente a -20 °C hasta su análisis. Durante todo el periodo de incubación (50 y 75 días para las incubaciones de metalaxil y de imazaquín respectivamente) se mantuvo el contenido de humedad constante adicionando agua destilada cuando fue necesario. Posteriormente, para su análisis, se extrajeron las muestras congeladas con 8 ml de metanol en el caso del metalaxil, y con 8 ml de una mezcla H3PO4 diluido (pH=2):acetonitrilo (60:40) en el caso del imazaquín. Tras 24 horas de agitación, las suspensiones de suelo se centrifugaron y el sobrenadante se filtró y se midió por HPLC enantioselectiva para determinar la concentración de cada enantiómero presente en las muestras. A determinados tiempos de incubación, también se tomaron, por duplicado, muestras de 5 g de suelo que se colocaron en tubos de centrífuga tipo PALL, los cuales contienen una membrana de 0.45 µm con la finalidad de proporcionar una alícuota de la disolución del suelo tras su centrifugación (Figura 3.9b). De esta forma, se centrifugó a 8000 rpm, obteniéndose la alícuota de disolución del suelo que se analizó por HPLC enantioselectiva. A partir de los datos obtenidos del análisis de la disolución del suelo y de la cantidad total de plaguicida obtenida a partir de las extracciones de 3. MATERIALES Y MÉTODOS 90 las muestras de incubación a esos días, se calculó el valor de la Kd para cada enantiómero según la Ec 1.1, donde Cs es la cantidad adsorbida y se calculó por diferencia entre la concentración de plaguicida obtenida de la extracción del suelo y la concentración de equilibrio obtenida de los tubos PALL (Ce). Las curvas de disipación se ajustaron a cinéticas de primer orden en las que la velocidad de degradación es proporcional a la concentración de compuesto existente en el suelo. Para las cinéticas de primer orden, el descenso de la concentración del plaguicida con el tiempo puede describirse como: 𝑑𝐶 𝑑𝑡 = −𝑘𝐶 Ec. 3.4 donde C es la concentración (mg/kg), t es el tiempo (días) y k es la constante de velocidad de degradación (días-1). La forma integrada de la ecuación es: 𝐶 = 𝐶0. 𝑒−𝑘𝑡 Ec. 3.5 donde C es la concentración del plaguicida en el tiempo t (mg/kg) y C0 es la concentración en el tiempo 0 (mg/kg). La forma logarítmica de la Ec. 3.5 da lugar a una relación lineal entre el ln C y el tiempo t. ln 𝐶 = ln 𝐶0−𝑘𝑡 Ec. 3.6 A partir del valor de k puede calcularse el tiempo de vida media (t1/2), que se define como el tiempo necesario para que se degrade el 50% de la cantidad de plaguicida inicialmente presente: 𝑡1/2 = 𝑙𝑛2 𝑘 Ec. 3.7 Los valores C0 y k se estimaron ajustando los valores experimentales de C y t a la ecuación exponencial (Ec. 3.5). También es posible ajustar dichos valores a la ecuación logarítmica (Ec. 3.6); sin embargo, es recomendable el uso de la ecuación exponencial, a menos que existan evidencias experimentales que sugieran lo contrario (Beulke et al., 2001). 3. MATERIALES Y MÉTODOS 91 Figura 3.9. Fotografía de los botes utilizados en los experimentos de incubación (a) y tubos Pall (b). 3.2.4.2.2. Estudios de persistencia con aplicaciones sucesivas Se estudió el efecto en la disipación de una segunda aplicación del plaguicida tanto para el metalaxil como para el imazaquín. Para ello, se tomaron 200 g de suelo S2 y se procedió del mismo modo que se describió anteriormente en el apartado 3.2.4.2.1. Tras finalizar el periodo de incubación (50 días para las incubaciones de metalaxil y 75 días para el imazaquín), se volvió a aplicar una dosis del plaguicida en su forma racémica de 2 mg/kg. Al igual que en la primera incubación, se tomaron muestras periódicamente y se congelaron. El periodo de incubación, tras la segunda aplicación, fue de 41 días para el experimento de persistencia con metalaxil y de 75 días para el caso del imazaquín. El día del análisis, se extrajeron las muestras con el extractante adecuado y se analizó por HPLC enantioselectiva. 3.2.4.2.3. Estudio de persistencia a elevada dosis de metalaxil Puesto que en algunos cultivos está autorizado el uso del metalaxil a dosis elevadas cercanas a 10-20 kg/ha, se realizó un experimento de persistencia incrementando la dosis de fungicida a 20 mg/kg. Se pretendió así comprobar el posible efecto tóxico de una mayor cantidad de fungicida en el suelo en la flora microbiana autóctona y su repercusión en la persistencia del fungicida en el suelo. Para ello, se pesó 100 g de suelo S2 y se procedió de idéntica forma a la descrita en el apartado 3.2.4.2.1 con la salvedad de que la dosis de metalaxil racémico añadida fue de 20 mg/kg. a) b) 3. MATERIALES Y MÉTODOS 92 3.2.4.3. Estudios de lixiviación 3.2.4.3.1. Estudios de lixiviación en los suelos sin enmendar y enmendados con los adsorbentes Los estudios de lixiviación se llevaron cabo en columnas de vidrio de 30 cm de longitud y 3.1 cm de diámetro interno. En la parte inferior de la columna se colocó lana de vidrio y 10 g de arena de mar de grano grueso. A continuación, las columnas se rellenaron en cuatro tramos de 5 cm con aproximadamente 40 g de suelo en cada uno de ellos (160 g en total). Se prepararon, por triplicado, columnas con ambos suelos sin enmendar, enmendados con residuos orgánicos en toda la columna (2% ALP, 2% ALPc para ambos plaguicidas y 2% BC para el imazaquín exclusivamente) y con arcilla en los 2.5 primeros centímetros del suelo (0.5 y 1% de HT-ELA para metalaxil y 1% y 5% SA-HDTMA para imazaquín). En la parte superior de la columna, se adicionaron 10 g de arena de mar para evitar la formación de canales de flujo preferencial y mejorar la distribución del plaguicida y del agua durante su aplicación (Figura 3.10). Las columnas se saturaron con 100 ml de agua destilada y se dejó lixiviar durante 24 horas. Se midió el volumen del agua recogida para determinar el volumen de poro de la columna, siendo éste la diferencia entre el volumen de agua adicionado y el recogido por percolación: 65 ± 1 ml para las columnas con suelo S1 y 61 ± 1 ml para las columnas con suelo S2. Tras la saturación, se añadió el plaguicida en su forma racémica en cantidad representativa de dosis de campo: 2 kg/ha de rac-metalaxil y 0.2 kg/ha de rac-imazaquín. Asimismo, para el caso del imazaquín, se prepararon columnas de ambos suelos sin enmendar, a las que se les aplicó una dosis de 0.1 kg/ha de cada enantiómero puro por separado. Las columnas se regaron diariamente con 15 ml de agua destilada, se dejaron drenar 24 horas y se recogieron los lixiviados que, posteriormente, fueron filtrados y medidos por HPLC enantioselectiva para determinar la concentración de cada enantiómero del plaguicida en los mismos. Adicionalmente, se analizó la cantidad total de carbono orgánico (TOC) en los lixiviados recogidos en los primeros 10 días para comprobar la posible lixiviación de materia orgánica soluble junto a los plaguicidas. Una vez finalizado el experimento de lixiviación, en los tratamientos en los que se observó una lixiviación total de los plaguicidas menor a un 80%, se extrajo el 3. MATERIALES Y MÉTODOS 93 suelo de las columnas obteniéndose cilindros de aproximadamente 20 cm de longitud. Se cortaron en 4 porciones iguales de unos 5 cm y se extrajeron con 100 ml de metanol las columnas tratadas con metalaxil y de mezcla H3PO4 diluida (pH=2):acetonitrilo (60:40) aquellas en las que se adicionó imazaquín. Se agitó durante 24 horas y el sobrenadante se filtró y midió por HPLC enantioselectiva (Figura 3.10b). 3.2.4.3.2. Estudio de lixiviación con adición del complejo de SA-HDTMA y R- imazaquín Para este estudio se prepararon columnas de suelo S2 de forma análoga al procedimiento descrito en el apartado 3.2.4.3.1. A dichas columnas se les adicionó, por triplicado, una dosis de 0.2 kg/ha de rac-imazaquín en disolución acuosa, 0.1 kg/ha de R-imazaquín también en disolución acuosa y esta misma dosis de R- imazaquín en forma de complejo con la arcilla SA-HDTMA. A continuación se desarrolló el experimento de lixiviación del mismo modo que en el apartado 3.2.4.3.1. Figura 3.10. Esquema de las columnas de suelo utilizadas para los experimentos de lixiviación (a), y de la separación del contenido de la columna para realizar la extracción (b). Fotografía de las columnas de suelo durante el estudio de lixiviación (c). c) Arena de mar Arena de mar Suelo (+ Enmienda) HPLC 15 ml agua destilada (diariamente) Recoger lixiviados (a diario) 20 cm a) 20 cm 5 cm Extracción b) 3. MATERIALES Y MÉTODOS 94 3.2.4.4. Bioensayos con imazaquín Se realizaron dos tipos de bioensayos con imazaquín. El primero de ellos fue un bioensayo general para evaluar la eficacia biológica de los enantiómeros del herbicida por separado, a tres dosis de aplicación diferentes. Por otro lado, se realizó un segundo bioensayo con simulación de un periodo de intensa lluvia poco después de la aplicación del herbicida. Con ello, se comprobó la posible reducción de las pérdidas de imazaquín en esta situación de alto riesgo de lixiviación cuando el herbicida se aplicó en forma de complejo con la arcilla SA-HDTMA. Figura 3.11. Foto de las macetas empleadas en los bioensayos. 3.2.4.4.1. Bioensayo general Los bioensayos se realizaron por triplicado en macetas de 30 cm2 de superficie y 5 cm de altura (Figura 3.11). Se dispuso en el fondo de la maceta lana de vidrio y se cubrió con 30 g de arena de mar de grano grueso. A continuación se añadió 100 g del suelo S2 y las macetas se saturaron con 100 ml de agua destilada. Tras 24 horas, se plantaron en cada maceta 12 semillas de Brócoli Romanesco Natalino (Brassica oleracea botrytis) y, seguidamente, se aplicó el plaguicida a tres dosis diferentes (1, 2 y 5 g/ha) de cada enantiómero por separado. Asimismo, se prepararon 3 macetas control a las cuales, tras plantar las semillas, no se aplicó el herbicida. Las macetas se regaron diariamente con agua destilada durante 2 semanas, tras las cuales, para determinar la eficacia biológica de cada enantiómero del herbicida, se extrajeron las plantas de la maceta y se midió la longitud de tallo y de la raíz de cada planta. Finalmente, se pesó la parte aérea de todas las plantas germinadas de cada maceta para calcular la biomasa. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 95 3.2.4.4.2. Bioensayo con simulación de alto riesgo de lixiviación En este bioensayo, se utilizaron macetas de 36 cm2 de área y 5 cm de altura. Se colocó lana de vidrio en el fondo de la maceta, se cubrió con 60 g de arena de mar de grano grueso y se añadió 100 g de suelo S2 a cada una de ellas. Se aplicó el herbicida como rac-imazaquín a una dosis de 80 g/ha y como R-imazaquín en forma libre y de complejo con SA-HDTMA a una dosis de 40 g/ha. Todas las aplicaciones se realizaron por triplicado. Tras aplicar el plaguicida en sus diferentes formas, se adicionó 150 ml de agua destilada a cada maceta (equivalente a una lluvia de 40 l/m2), se dejó lixiviar 24 horas y se recogió el lixiviado para un posterior análisis por HPLC enantioselectiva. A continuación, se plantaron 12 semillas de Brócoli Romanesco Natalino (Brassica oleracea botrytis) en las macetas, se colocaron a la luz solar y se regaron diariamente con agua destilada. Pasadas 2 semanas, se extrajeron las plantas de las macetas y se midió la longitud de los tallos y de la raíz. Finalmente se pesó la parte aérea de las plantas germinadas para calcular la biomasa. 3.2.5. Estudio del comportamiento enantioselectivo del metalaxil en un suelo agrícola bajo condiciones reales de campo: efecto de la adición de arcilla modificada Se diseñó un experimento en condiciones de campo con el fin de comparar el comportamiento del metalaxil en suelo sin enmendar y enmendado con arcilla bajo condiciones ambientales reales. Dicho experimento de campo se realizó en parcelas de la finca experimental “La Hampa” que el IRNAS (CSIC) posee en la localidad de Coria del Río en Sevilla (37° 17´ 02´´N, 6° 03´ 58´´ W). Se prepararon seis parcelas de 1 m2 confinadas en marcos de madera con una altura de 10 cm y con una separación entre parcelas de 0.5 m. Tres de las parcelas se enmendaron manualmente con la arcilla HT-OLE a una dosis de 2 t/ha en la parte más superficial del suelo (0-2 cm) y las otras tres parcelas se dejaron sin enmendar. En la Figura 3.12a se muestra una fotografía de una de las parcelas durante el tratamiento con la arcilla. A continuación, se aplicó el metalaxil a una dosis de 6 kg/ha disuelto en 4 l de agua a todas las parcelas. Dicha aplicación tuvo lugar el 8 de octubre de 2014. Las condiciones atmosféricas (lluvias y temperatura del aire) fueron monitorizadas durante la duración del experimento en una estación meteorológica localizada a unos 4 km del lugar de estudio. Se tomaron muestras por triplicado y a diferentes profundidades (0-5, 5-10 y 10-20 cm) con barrena en los días 0, 35, 64 y 98 tras la aplicación del fungicida (Figura 3. MATERIALES Y MÉTODOS 96 3.12b). Las muestras tomadas se guardaron en bolsas de plástico y se congelaron inmediatamente a -20 °C. Para la extracción, se tomaron por duplicado 5 g del suelo almacenado en cada bolsa, se le añadió 10 ml de metanol y se agitó durante 24 h. Transcurrido este tiempo, la suspensión se centrifugó y los sobrenadantes se filtraron y midieron por HPLC enantioselectivo. Experimentos previos demostraron que este procedimiento de extracción recuperaba más del 95% del metalaxil añadido al suelo. Además, 35 días después de la aplicación, se tomaron alícuotas de suelo enriquecido con arcilla que se extrajeron para determinar su contenido en metalaxil y compararlo con el contenido medio del suelo en su conjunto (Figura 3.12c). Figura 3.12. Fotografías de una de las parcelas utilizadas en los experimentos de campo (a) y del muestreo de los suelos de dichas parcelas con barrena a diferentes profundidades (b). Imagen de la acumulación de organo-arcilla en los 5 primeros cm del suelo en las parcelas enmendadas (c). a) b) c) 3. MATERIALES Y MÉTODOS 97 3.2.6. Tratamiento de los datos Los datos de adsorción, persistencia, lixiviación y bioeficacia se obtuvieron, al menos, por duplicado y los resultados se expresaron como la media acompañada del error estándar para indicar la variabilidad entre las repeticiones. Para la identificación de diferencias significativas entre tratamientos se aplicó ANOVA de un factor, seguido del test Tukey (p = 0.05) utilizando el programa Sigma Plot versión 12.5. El ajuste de las isotermas a la ecuación de Freundlich y de los datos de disipación a una cinética de primer orden también se llevó a cabo utilizando el programa Sigma Plot versión 12.5. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 104 Debido al importante papel de la materia orgánica soluble (MOS) en el movimiento de los plaguicidas en el suelo, sobre todo en su lixiviación, se realizó un estudio más profundo del tipo de compuestos orgánicos que constituían la MOS de las enmiendas orgánicas seleccionadas. En la Figura 4.2 se muestran los espectros de fluorescencia de la MOS de las tres enmiendas. El ALP presentó un máximo de emisión en la región de los 300 – 320 nm. En este rango de longitudes de onda emiten las moléculas de menor peso molecular, polares y no humificadas. En el caso del BC emitió a longitudes de onda entre 380 - 400 nm aproximadamente, y el ALPc a longitudes de onda superiores a 420 nm. En esta zona del espectro fluorecen moléculas mayores y más complejas, probablemente aromáticas, típicas del material humificado. Los resultados obtenidos en los espectros de fluorescencia son análogos a los obtenidos por García-Jaramillo et al. (2014) para unos residuos orgánicos similares a los utilizados en este trabajo. Figura 4.2. Espectros de fluorescencia normalizados al máximo de emisión para la MOS extraída de ALP, ALPc y BC. A partir de los espectros de fluorescencia se determinó el índice de humificación (IH) aplicando la Ec. 3.1. Los resultados obtenidos, junto con los valores de algunas características determinadas para los extractos de las enmiendas orgánicas, se resumen en la Tabla 4.4. Longitud de onda (nm) 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 Intensidad de fluorescencia 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 ALP ALPc BC 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 105 Tabla 4.4. Características de los extractos de MOS de los residuos orgánicos utilizados como adsorbentes: pH, carbono orgánico soluble de los residuos (C.O.) e índice de humificación (IH). pH C.O. (mg/l) IH ALP 5.3 3800 0.1 ALPc 8.3 420 9.5 BC 9.4 190 2.6 Los valores de pH de los extractos (medidos en CaCl2 0.01 M) fueron similares a los obtenidos para las suspensiones acuosas de los residuos. El porcentaje de carbono orgánico fue muy superior en el caso del ALP, y fue disminuyendo tras los proceso de compostaje y pirólisis a 400 °C. Finalmente, los valores de índice de humificación confirmaron el orden creciente de humificación observado en los espectros (Figura 4.2): ALP < < BC < ALPc. El incremento del índice de humificación está relacionado con una mayor complejidad de las moléculas presentes en el residuo orgánico, por ejemplo, por un aumento en el número de anillos aromáticos, en el grado de condensación y/o conjugación, así como en la relación C/H (Zsolnay, 2003). De este modo, el bajo valor de IH del ALP se puede justificar por la presencia de compuestos lábiles, sencillos y poco humificados. El aumento del índice de humificación tras el proceso de compostaje del ALP se puede atribuir a la transformación microbiológica de dicha materia orgánica lábil en compuestos orgánicos más complejos, así como a la presencia de compuestos recalcitrantes que han resistido la biodegradación. La disminución del IH en el extracto de BC pudo ser consecuencia de la eliminación de moléculas complejas del ALPc al ser sometido a la pirólisis. Así, se obtiene un residuo constituido, principalmente, por compuestos condensados no solubles en agua y en el que la cantidad de compuestos recalcitrantes que no se degradaron en el compostaje se ha reducido parcialmente. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 106 4.1.2.2. Caracterización de las arcillas 4.1.2.2.1. Hidrotalcitas a) Análisis elemental Los resultados obtenidos del análisis elemental de las organo-hidrotalcitas utilizadas en los diferentes experimentos, junto con los de sus arcillas de partida HTCO3 y HT500, se recogen en la Tabla 4.5. Teniendo en cuenta la fórmula general de los compuestos tipo hidrotalcita: [MII1-x MIIIx(OH)2]x+ [An-]x/n·mH2O, la relación atómica de los elementos metálicos vendrá dada por la siguiente expresión: 𝑀𝐼𝐼 𝑀𝐼𝐼𝐼 =(1−𝑥) 𝑥 Ec. 4.1 Tabla 4.5. Resultados del análisis elemental de los adsorbentes tipo hidrotalcita. Masa (%) Relaciones atómicas Mg Al C N x Mg/Al C/Al Anión/Al HT-CO3 24.0 8.5 2.2 < 0.05 0.24 3.1 0.6 0.58 HT500 38.6 13.7 0.9 < 0.05 0.24 3.1 0.1 0.14 HT-ELA 12.2 4.3 39.1 < 0.05 0.24 3.1 20.5 1.14 HT-CO3 (Sigma) 22.2 11.3 5.1 < 0.05 0.31 2.2 1.0 1.01 HT500 (Sigma) 38.9 19.6 0.8 < 0.05 0.31 2.2 0.1 0.09 HT-OLE 16.7 7.1 30.2 < 0.05 0.28 2.6 9.6 0.53 El valor de x representa la carga generada por la sustitución isomórfica del catión divalente (Mg+2) por el catión trivalente (Al+3), la cual debe ser compensada por el anión interlaminar. Para la hidrotalcita no modificada (HT-CO3 y HT-CO3 Sigma), si toda la carga positiva originada por la incorporación de Al estuviera compensada por el anión interlaminar (CO32-), la relación teórica Anión/Al sería 0.5. Sin embargo, el 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 107 valor obtenido para dicha relación a partir de los datos experimentales de HT-CO3 es de 0.6 (Tabla 4.5). Esto supone un exceso del 20% de anión carbonato que estará, probablemente, adsorbido en la superficie externa de la hidrotalcita debido a la alta afinidad de este anión por la lámina (Miyata, 1983). La relación Anión/Al para la hidrotalcita calcinada (HT500) disminuyó a un valor de 0.1 debido a que, durante el proceso de calcinación a 500° C, el carbonato interlaminar se pierde en forma de CO2. No obstante, una cantidad residual de C continúa presente en la HT500, probablemente debido a incorporación de CO2 atmosférico. En el caso de la hidrotalcita de partida comercial (HT-CO3 Sigma) se observan ciertas diferencias respecto a la hidrotalcita sintética. En primer lugar, la relación Mg/Al tiene un valor cercano a 2 en lugar del esperado de 3 para una hidrotalcita del tipo 3:1. Además, la relación Anión/Al es 1.0 en lugar del valor teórico de 0.5. Esto puede ser indicativo de que la hidrotalcita comercial podría contener impurezas en las que parte del aluminio está en forma de carbonato, sin formar parte de la lámina de hidróxido doble. Las organo-hidrotalcitas presentaron un valor experimental de C/Al considerablemente más alto que el de sus correspondientes hidrotalcitas no modificadas, debido a la incorporación de los ácidos grasos (ELA y OLE) en el espacio interlaminar. Asumiendo que el C analizado corresponde casi en su totalidad a los ácidos grasos (en el apartado 4.1.2.2.1c se demostrará por IR la ausencia de cantidades importantes de carbonatos en las muestras de organo-hidrotalcita) es posible calcular la cantidad de anión orgánico intercalado por unidad de carga de la arcilla. De este modo, para la muestra HT-ELA se obtuvo una relación Anión/Al ligeramente superior a 1. Esto nos indica que se ha producido una completa incorporación del anión elaidato durante el proceso de reconstrucción. El exceso de anión orgánico detectado en esta organo-hidrotalcita puede deberse a que en el proceso de reconstrucción se añadió una cantidad levemente superior a la capacidad de intercambio aniónico de la hidrotalcita de partida, que pudo quedar adsorbido a través de interacciones hidrofóbicas. Por otro lado, la relación Anión/Al para la muestra HT-OLE fue de 0.52, menor a lo esperado teóricamente. Esto puede ser consecuencia de dos efectos: (i) la presencia de impurezas de ácido grasos de menor peso molecular que el oleato (palmítico, mirístico…) que neutralizan la carga del aluminio pero cuyo contenido en carbono es menor; o bien a que, como se ha comentado anteriormente, (ii) parte del aluminio puede estar en forma de carbonato en una fase que no adsorbe oleato. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 108 A partir de los datos experimentales obtenidos del análisis elemental y considerando una estructura tipo hidrotalcita, Mg1-xAlx(OH)2, u óxido mixto, Mg1- xAlxO1+x/2, se propusieron las fórmulas moleculares que se resumen en la Tabla 4.6 para cada uno de los compuestos. Tabla 4.6. Fórmulas moleculares propuestas para las muestras de hidrotalcita y organo-hidrotalcitas. Muestras Fórmula molecular HT-CO3 Mg0.76Al0.24(OH)2(CO3)0.14 HT500 Mg0.76Al0.24O0.12 HT-ELA Mg0.76Al0.24(OH)2(ELA)0.27 HT-CO3 Sigma Mg0.69Al0.31(OH)2(CO3)0.31 HT500 Sigma Mg0.69Al0.31O1.15 HT-OLE Mg0.72Al0.28(OH)2(OLE)0.15 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 109 b) Difracción de rayos X En la Figura 4.3 se muestran los difractogramas de las dos organohidrotalcitas sintetizadas junto con los de sus correspondientes hidrotalcitas no modificadas (HT-CO3) e hidrotalcitas calcinadas (HT500) utilizadas como materiales de partida para su síntesis. - Hidrotalcitas no modificadas (HT-CO3 y HT-CO3 Sigma): En el diagrama de la muestra HT-CO3 se observan difracciones intensas, estrechas y simétricas a valores bajos de 2θ y difracciones de menor intensidad, más anchas y asimétricas a valores de 2θ elevados, lo cual es un patrón característico de los hidróxidos dobles laminares bien cristalizados (Donato et al., 2012). En este difractograma aparecen las difracciones correspondientes a los planos (003), (006) y (009) con valores de espaciado de 7.73, 3.87 y 2.60 Å, respectivamente. Estos valores concuerdan con la presencia de carbonato en la interlámina como principal anión interlaminar (Barriga et al., 2002; Costa et al., 2008; Donato et al., 2012). A partir del espaciado d003, es posible determinar el parámetro c como c= 3d003, resultando un valor de c= 23.19 Å. Asimismo, es posible calcular la distancia entre láminas (h) como la diferencia entre el espaciado del plano 003 y el espesor de la capa de brucita (4.8 Å), obteniéndose h= 2.93 Å. La distancia media metal-metal (parámetro a) puede determinarse a partir del pico de difracción (110) como a= 2d110, obteniéndose un valor de 3.06 Å. Esta distancia concuerda con los valores esperados para hidrotalcitas de Mg:Al con una relación (3:1) (Miyata, 1980; Cavani et al., 1991). El diagrama de difracción para la hidrotalcita comercial (HT-CO3 Sigma) es prácticamente idéntico al de la muestra sintética, presentando las mismas difracciones con una intensidad similar. No obstante, cabe destacar pequeñas diferencias debido a la presencia ciertas impurezas de Al. Así, se observan dos pequeños picos a ángulos 2θ= 53° y 2θ= 56° que podrían asignarse a impurezas de Al (carbonatos o hidróxidos). - Hidrotalcitas calcinadas (HT500 y HT500 Sigma): Los espectros de difracción de ambas muestras calcinadas son prácticamente iguales. Se observa la desaparición de los picos de difracción de mayor intensidad y mayor espaciado, correspondientes a los planos (003) y (006). Esto se atribuye a la pérdida de los aniones CO32- durante la calcinación y a la destrucción de la estructura laminar. Por otro lado, el diagrama 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 110 presenta dos difracciones anchas correspondientes a los planos (200) y (220) típicas de la estructura cúbica tipo MgO de las hidrotalcitas calcinadas (Barriga et al., 2002). - Organo-hidrotalcitas (HT-ELA y HT-OLE): Los difractogramas de las organohidrotalcitas muestran una menor cristalinidad a la observada en las hidrotalcitas no modificadas. Esto es consecuencia de que la incorporación de los aniones orgánicos durante el proceso de reconstrucción ha dificultado el proceso de reordenamiento de las láminas. Al rehidratarse la hidrotalcita calcinada con las disoluciones de elaidato u oleato, los picos correspondientes a d003 y d006 de la hidrotalcita vuelven a aparecer, pero con menor intensidad. La presencia de estos picos puede deberse a la existencia de una pequeña fracción de hidrotalcita no modificada o a reflexiones de alto orden (00l) (Costa et al., 2008). El valor del espaciado del plano (110) es el mismo que en la HT-CO3, lo cual nos indica que el valor del parámetro a es la mismo. Esto supone que las organo-hidrotalcitas mantienen la estructura doble laminar propia de los compuestos tipo hidrotalcita con una misma distancia media catión-catión. La principal variación entre los difractogramas de las organo-hidrotalcitas con los de sus correspondientes arcillas sin modificar y entre sí es el valor del espaciado basal. En el caso de HT-ELA, se midió el difractograma a bajo ángulo y se observó la aparición de dos picos: uno a 35.3 Å y otro a 50.4 Å. Estudios anteriores (Xu et al., 2004; Celis et al., 2014) han relacionado el valor de ≈36.0 Å al espaciado basal de un ordenamiento de la organo-hidrotalcita en el que los aniones orgánicos se disponen con un ángulo de inclinación de aproximadamente 60° sobre las láminas de HT dando lugar a una monocapa. Por otro lado, el pico de difracción de 50.4 Å puede asignarse a una interlámina en la que el anión elaidato y el ácido elaídico se colocan sucesivamente sobre la lámina de HT con un ángulo de ≈ 60° formando una bicapa (Xu et al., 2004; Donato et al., 2012). En el caso del difractograma correspondiente a la muestra HTOLE, se observa un espaciado de 34 Å, un valor próximo al obtenido en estudios previos de hidrotalcita con oleato intercalado en su estructura (Xu et al., 2004; Celis et al., 2014). 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 111 2 (grados) 20 40 60 34.0 Å 16.1 Å 7.6 Å 3.8 Å 2.56 Å 2.28 Å 1.52 Å HT-OLE 2.09 Å 1.48 Å HT500 Sigma 7.66 Å 3.81 Å 2.57 Å 2.28 Å 1.93 Å 1.52 Å 1.49 Å HT-CO3 Sigma 2 (grados) 2.09 Å 1.48 Å HT500 7.73 Å 3.87 Å 2.60 Å 2.33 Å 1.99 Å 1.53 Å 1.50 Å HT-CO3 2 (grados) 020 40 60 17.6 Å 7.9 Å 4.05 Å 2.59 Å 1.53 Å 1.50 Å HT-ELA Intensidad (unidades arbitrarias) 2 (grados) 2 (grados) 2 4 6 8 10 Intensidad (unidades arbitrarias) 50.4 Å 35.3 Å 17.0 Å Figura 4.3. Difractogramas de rayos X de las muestras de hidrotalcita (HT-CO3 y HT-CO3 sigma), de hidrotalcita calcinada (HT500 y HT500 Sigma) y de las organohidrotalcitas (HT-ELA y HT-OLE). 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 112 c) Espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier En la Figura 4.4 se han representado los espectros de infrarrojos de las hidrotalcitas no modificadas, las hidrotalcitas calcinadas y las organo-hidrotalcitas. Figura 4.4. Espectros de infrarrojos de las hidrotalcitas carbonatadas (HT-CO3 y HT-CO3 Sigma), calcinadas (HT500 y HT500 Sigma) y modificadas con aniones orgánicos (HT-ELA y HT-OLE). - Hidrotalcitas carbonatadas (HT-CO3 y HT-CO3 Sigma): El espectro de la hidrotalcita HT-CO3 presenta las bandas de absorción propias de un hidróxido doble laminar Mg:Al con iones carbonato en su estructura. Así, en el espectro se observa una banda ancha a 3500 cm-1 correspondiente a la vibración de tensión de los grupos hidroxilos estructurales y del agua adsorbida, y una banda a 1650 cm-1 de la vibración de deformación de dichas moléculas de agua. Se aprecia un hombro pequeño cercano a 3000 cm-1 que se puede asignar a moléculas de agua que están fuertemente unidas a los aniones carbonato presentes en la interlámina. A números de onda inferiores, se obtiene una banda muy intensa correspondiente al modo de vibración de tensión Ʋ3 Número de onda (cm-1) 1000150020002500300035004000 Transmitancia (unidades arbitrarias) 3500 3000 1650 1365 1400 3470 2960 29202850 1630 964 1370 1410 1470 HT500 HT-CO3 HT-ELA 1540 Número de onda (cm-1) 1000150020002500300035004000 Transmitancia (unidades arbitrarias) 3420 773 935 1370 1575 3059 1450 3430 2920 2850 1370 1410 1540 1460 1650 HT-CO3 (Sigma) HT500 (Sigma) HT-OLE (Sigma) 2920 2850 3010 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 113 del ion carbonato a 1365 cm-1. Este valor difiere ligeramente del valor de absorción del grupo carbonato libre (1415 cm-1) debido, probablemente, a la interacción de los grupos carbonatos con el espacio interlaminar. Por debajo de los 1000 cm-1 se observarían los modos de tensión Ʋ2 y Ʋ4 de los carbonatos, así como las vibraciones Mg-O y Al-O. La muestra de HT-CO3 Sigma presenta un espectro muy similar al obtenido para la HT-CO3, excepto por dos pequeñas bandas a 2920 cm-1 y 2850 cm-1 correspondientes a ciertas impurezas presentes en la hidrotalcita comercial, probablemente algún tipo de compuesto orgánico. Otra diferencia es el desplazamiento de la banda de vibración de hidroxilos a menor número de onda. Esto puede deberse a la presencia de mayor cantidad de aluminio en la muestra, que debilita los enlaces O-H. - Hidrotalcitas calcinadas (HT500 y HT500 Sigma): Los espectros de infrarrojos de las hidrotalcitas calcinadas muestran cómo el proceso de calcinación eliminó casi en su totalidad el agua adsorbida y los carbonatos de la interlámina. También se observa la desaparición de la banda correspondiente a la vibración de los grupos hidroxilos fuertemente unidos a aniones carbonato (3000 cm-1), todo ello al transformarse las hidrotalcitas en óxidos mixtos y perder su estructura laminar. Los pequeños hombros observados a número de onda 3400 cm-1, 1650 cm-1 y 1400 cm-1 pueden atribuirse a pequeñas cantidades de agua y carbonato adsorbidas por las muestras calcinadas al entrar en contacto con el aire. - Organo-hidrotalcitas (HT-ELA y HT-OLE): Tras la hidratación de la hidrotalcita calcinada con la disolución de elaidato, se produjo la recuperación de la estructura laminar, lo cual se confirma por la presencia de bandas propia de los grupos hidroxilos estructurales y moléculas de agua adsorbidas ƲOH y δH-OH (3470 cm-1 y 1630 cm-1). Excepto un pequeño hombro a 1370 cm-1 que puede atribuirse a una pequeña cantidad residual de carbonatos que ocupan sitios de adsorción de la hidrotalcita, se observa la desaparición de las bandas asociadas a los carbonatos, lo cual nos indica que la incorporación del anión orgánico en la interlámina ha sido efectiva. En el espectro de HT-ELA, se observan las bandas de la cadena carbonada del elaidato: vibraciones de tensión de los grupos -CH2- y -CH3 a 2960 cm-1, 2920 cm-1 (ƲCH asimétrica) y 2920 cm-1 (ƲCH simétrica), una banda correspondiente a las vibraciones de flexión a 1470 cm-1 (δCH) y un hombro pequeño a 1370 cm-1 que, además de a carbonato residual, también puede corresponder a flexiones de grupos CH2 y CH3. A 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 120 Figura 4.8. Difractogramas de rayos X de las muestras de SAz-1 y SA-HDTMA. c) Espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier Los espectros de infrarrojos tanto de la arcilla sin modificar como de la arcilla modificada se han representado en la Figura 4.9. - SAz-1: El espectro de IR presenta un par de bandas a 3610 y 3390 cm-1 correspondientes a la vibración de tensión de los grupos hidroxilo, ƲOH, bien de los grupos OH estructurales de la montmorillonita o de los enlaces OH de las moléculas de agua. También se observa una banda a 1630 cm-1 que se puede asignar a vibraciones de modo de flexión (δOH) de las moléculas de agua y una banda a 980 cm-1 atribuido a vibraciones de tensión de Si-O-Si en el mineral de arcilla. - SA-HDTMA: La banda a 3610 cm-1 no varía tras la incorporación del catión orgánico, lo cual es indicativo de que la modificación de la interlámina no supuso cambios en la estructura de la arcilla. Sin embargo, las bandas correspondientes a las moléculas de agua (ƲOH y δOH) aparecen ligeramente desplazadas a números de onda mayores debido a una mayor libertad de las moléculas de agua en la organo-arcilla que en la arcilla de partida. Esto se atribuye a que las interacciones entre las moléculas de agua con los cationes orgánicos son más débiles que las que se daban en 2 (grados) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Intensidad (unidades arbitrarias) SAz-1 SA-HDTMA 22.5 Å 15.2 Å 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 121 la arcilla SAz-1 entre dichas moléculas de agua y los cationes Ca2+. Además, la baja intensidad observada en estas bandas es consecuencia del menor grado de hidratación que se da en la muestra SA-HDTMA comparado con SAz-1. En el espectro de SA-HDTMA aparece un conjunto de bandas, ausentes en el espectro de la arcilla, que corresponden a las vibraciones del catión orgánico: a 2923 y 2851 cm-1 vibraciones de tensión simétrica y asimétrica de C-H y una serie de bandas entre 1487 y 1416 cm-1 propias de vibraciones de flexión de los grupos C-H (Gámiz et al., 2015). Figura 4.9. Espectros de infrarrojos de la muestra de montmorillonita SAz-1 sin modificar y modificada con HDTMA. Número de onda (cm-1) 1000150020002500300035004000 Transmitancia (unidades arbitrarias) SAz-1 SA-HDTMA 3610 2923 2851 1640 1487 1474, 1468 1416 985 3390 1630 980 3430 3610 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 122 d) Modelización de la estructura de la organo-arcilla La estructura esperada para la organo-arcilla es aquella en la que el catión orgánico HDTMA se dispone en una posición parafínica en el espacio interlaminar de la arcilla SAz-1 (Celis et al., 2000; Lagaly, 1982). La arcilla SAz-1 es de alta carga, de modo que la proximidad de dos cargas adyacentes promueve una disposición vertical de las cadenas alquílicas del catión orgánico. No obstante, una disposición perpendicular del catión respecto a la superficie supondría un espaciado basal de aproximadamente 35 Å, valor superior al observado en la difracción de rayos X de nuestra muestra (22.5 Å). Esto indica que el catión orgánico adopta cierto ángulo de inclinación en la interlámina. Así, considerando que el espaciado de la lámina deshidratada de montmorillonita es de 10 Å y que la cadena del catión orgánico presenta una longitud de 25 Å (Lee et al., 2005), la molécula de HDTMA debe disponerse en el espacio interlaminar con un ángulo de inclinación de unos 30° (Figura 4.10) Figura 4.10. Posible estructura de la organo-arcilla SA-HDTMA en la que el catión orgánico adopta una disposición parafínica en la interlámina. - - - - - - - - - - - - - - d001 = 22.5 Å 10 Å h = 12.5 Å α = 30° 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 123 4.2. ESTUDIO ENANTIOSELECTIVO DEL COMPORTAMIENTO DEL FUNGICIDA METALAXIL En este apartado, se discutirán los resultados obtenidos en los estudios del comportamiento enantioselectivo del fungicida metalaxil en suelos sin enmendar y enmendados con residuos orgánicos y con organo-hidrotalcitas. Para ello, se realizaron experimentos de adsorción, persistencia y lixiviación bajo condiciones controladas de laboratorio, así como de persistencia y lixiviación en condiciones reales de campo. 4.2.1. Estudios de adsorción-desorción en condiciones de laboratorio En primer lugar, se llevó a cabo el estudio de la adsorción de los enantiómeros del metalaxil en los adsorbentes (ALP, ALPc, HT-CO3, HT500, HT-ELA y SA-HDTMA) a una única concentración de metalaxil racémico (rac-metalaxil) de 2 mg/l (1 mg/l de cada enantiómero), para seleccionar aquellos adsorbentes con mayor capacidad de adsorción. A continuación, se obtuvieron las isotermas de adsorcióndesorción en un rango de concentraciones 2-30 mg/l de rac-metalaxil para aquellas muestras con mejores propiedades adsorbentes. Finalmente, se determinaron las isotermas de adsorción-desorción a los suelos S1 y S2 sin enmendar y enmendados con los adsorbentes seleccionados. 4.2.1.1. Estudios de adsorción-desorción a los adsorbentes a) Adsorción a concentración única En la Figura 4.11 se observa que las muestras de ALP y ALPc presentaron una adsorción similar, con una leve mayor adsorción en el alperujo compostado (ALPc) que en el fresco (ALP). Por otro lado, la adsorción de los enantiómeros a las muestras de organo-arcilla fue considerablemente superior a la de las enmiendas orgánicas, siendo la adsorción en la muestra de HT-ELA prácticamente el doble que en la muestra de SA-HDTMA. Cabe destacar que la hidrotalcita de partida, HT-CO3, no mostró adsorción de los enantiómeros del metalaxil, como tampoco lo hizo su producto de calcinación, HT500, que, al proporcionar un ambiente muy alcalino (pH > 10), indujo la hidrólisis del fungicida. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 124 Figura 4.11. Porcentaje de S- y R-metalaxil adsorbido por los adsorbentes ALP, ALPc, HT-ELA y SA-HDTMA a una concentración inicial de 2 mg/l de rac-metalaxil. Los valores de Kd y % de adsorción para cada enantiómero, así como para la mezcla racémica, se resumen en la Tabla 4.8. En esta tabla también se ha incluido el valor del factor enantiomérico (EF) calculado para cada muestra según la ecuación (Harner et al., 2000): 𝐸𝐹 =𝐶𝑒 (𝑆) 𝐶𝑒(𝑆)+𝐶𝑒(𝑅) Ec. 4.4 donde Ce(S) y Ce(R) son las concentraciones de equilibrio de los enantiómeros S y R del metalaxil, respectivamente. Los valores de EF obtenidos, cercanos a 0.5, indican que para los cuatro adsorbentes la disolución de equilibrio se mantuvo racémica tras la adsorción y que, por tanto, la adsorción del metalaxil no fue enantioselectiva (Tabla 4.8). Esta ausencia de enantioselectividad observada en los residuos de almazara y en las arcillas modificadas refleja que no existen sitios de adsorción enantioselectivos en los adsorbentes o que, si existen, están compensados para uno y otro enantiómero (Gámiz et al., 2016a). Los coeficientes de distribución, Kd, para la muestra de HT-ELA y SA-HDTMA fueron muy superiores a los calculados para el ALP y el ALPc. Esta mayor adsorción del fungicida en las organo-arcillas refleja la gran afinidad de las cadenas carbonadas de los aniones y cationes orgánicos de HT-ELA y SA-HDTMA, respectivamente, por los enantiómeros del fungicida, que probablemente se unen a ellas a través de interacciones hidrofóbicas no enantioselectivas. La mayor adsorción detectada en la muestra de HT-ELA al compararla con la muestra de SA-HDTMA Metalaxil adsorbido (%) 0 20 40 60 80 100 S-metalaxil R-metalaxil ALP ALPc HT-ELA SA-HDTMA 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 125 (Figura 4.11, Tabla 4.8), se atribuye al mayor espaciado interlaminar que presenta la hidrotalcita modificada (Figuras 4.7 y 4.10) y a su mayor contenido en C (39.1 % frente a 22.1% de la SA-HDTMA). Esto se traduce en un ambiente interlaminar de la muestra de HT-ELA con una mayor capacidad de adsorción que el de la muestra de SA-HDTMA. Tabla 4.8. Valores de Kd para la adsorción del metalaxil en ALP, ALPc, HT-ELA y SA-HDTMA a partir de una disolución de rac-metalaxil de 2 mg/l. % Adsorbido Kd (l/kg) EF ALP S-metalaxil R-metalaxil (S+R)-metalaxil 12.3 ± 1.0 11.2 ± 0.5 11.8 ± 0.7 11.3 ± 1.0 10.1 ± 0.5 10.7 ± 0.7 0.50 ± 0.00 ALPc S-metalaxil R-metalaxil (S+R)-metalaxil 19.5 ± 0.2 17.6 ± 0.1 18.6 ± 0.1 19.4 ± 0.2 17.1 ± 0.1 18.2 ± 0.1 0.50 ± 0.01 HT-ELA S-metalaxil R-metalaxil (S+R)-metalaxil 70.6 ± 0.3 71.4 ± 0.4 71.0 ± 0.3 1927 ± 30 2000 ± 42 1963 ± 32 0.51 ± 0.01 SA-HDTMA S-metalaxil R-metalaxil (S+R)-metalaxil 32.5 ± 0.1 32.2 ± 0.1 32.4 ± 0.0 386 ± 2 380 ± 2 383 ± 1 0.50 ± 0.00 A la vista de los resultados obtenidos, se seleccionaron como adsorbentes a estudiar los dos residuos de almazara (ALP y ALPc) y la hidrotalcita modificada con el anión elaidato (HT-ELA), ésta por mostrar un porcentaje de adsorción significativamente mayor al de la montmorillonita modificada con el catión HDTMA (SA-HDTMA). 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 126 b) Isotermas de adsorción-desorción Las isotermas de adsorción-desorción de S- y R-metalaxil en los adsorbentes se presentan en la Figura 4.12. Lo primero que se observa es que las isotermas de los dos enantiómeros solapan, confirmando la ausencia de enantioselectividad observada en el estudio a una única concentración (Figura 4.11, Tabla 4.8). Figura 4.12. Isotermas de adsorción-desorción de los enantiómeros del metalaxil a los adsorbentes seleccionados a partir de disoluciones racémicas del fungicida. Las isotermas se ajustaron a la ecuación de Freundlich (Ec. 1.3) y se determinaron los coeficientes empíricos de la ecuación, los cuales se resumen en la Tabla 4.9. Los valores de R2 cercanos a 1 para los tres adsorbentes indican un buen ajuste de los datos experimentales a la ecuación. A partir del coeficiente Nf calculado es posible clasificar las isotermas según su pendiente inicial, de acuerdo con la clasificación de Giles et al. (1960). Así, aquellas isotermas que presentan un valor de Nf <1, como es el caso de las isotermas de todos nuestros adsorbentes, se definen Ce (mg/l) 0246810 12 14 16 Cs (mg/kg) 0 20 40 60 80 100 120 S-metalaxil adsorción S-metalaxil desorción R-metalaxil adsorción R-metalaxil desorción ALP ALPc Ce (mg/l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Cs (mg/kg) 0 20 40 60 80 100 120 S-metalaxil adsorción S-metalaxil desorción R-metalaxil adsorción R-metalaxil desorción HT-ELA Ce (mg/l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Cs (mg/kg) 0 2000 4000 6000 8000 S-metalaxil adsorción S-metalaxil desorción R-metalaxil adsorción R-metalaxil desorción 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 127 como de tipo L. El mecanismo de adsorción de los sistemas que presentan este tipo de isotermas se caracteriza por ser la adsorción de las moléculas de plaguicida más difícil a medida que los sitios de adsorción son ocupados. Una posible explicación de este mecanismo es la existencia de un número limitado de sitios de adsorción y baja competencia con las moléculas del disolvente por dichos sitios (Giles et al., 1960). Puesto que las isotermas de adsorción a los tres adsorbentes fueron del mismo tipo, es posible analizar el valor de Kf como indicativo de la afinidad de los adsorbentes por el fungicida. Los valores del coeficiente Kf para ALP y ALPc fueron similares, algo superiores en el caso del ALPc, siendo los valores para HT-ELA mucho más elevados. Esto refleja de nuevo una mayor capacidad de adsorción de la hidrotalcita modificada comparado con los residuos orgánicos, lo cual coincide con los resultados obtenidos en el análisis de la adsorción a una única concentración (Tabla 4.8). Es interesante destacar el hecho de que los valores de Kf para la mezcla racémica (S+R) del fungicida resultan ser superiores a los obtenidos para los enantiómeros individuales. Este resultado es consecuencia de haber medido las isotermas de adsorción de un enantiómero en presencia del otro, el cual, dada la forma L de las isotermas, reduce la adsorción del primero por competencia respecto a si no hubiera estado presente. Tabla 4.9. Coeficientes de Freundlich para la adsorción de metalaxil en ALP, ALPc y HT-ELA Kf Nf R2 ALP S-metalaxil 10 (9-11)a 0.71 ± 0.04 0.981 R-metalaxil 9 (8-10) 0.74 ± 0.05 0.978 (S+R)-metalaxil 12 (10-14) 0.73 ± 0.06 0.981 ALPc S-metalaxil 16 (11-22) 0.66 ± 0.20 0.914 R-metalaxil 14 (11-20) 0.70 ± 0.17 0.943 (S+R)-metalaxil 21 (20-22) 0.70 ± 0.02 0.999 HT-ELA S-metalaxil 1585 (1442-1742) 0.76 ± 0.04 0.991 R-metalaxil 1597 (1524-1673) 0.75 ± 0.04 0.993 (S+R)-metalaxil 1885 (1768-2011) 0.75 ± 0.04 0.992 arango de error estándar. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 128 Los datos experimentales de las isotermas de desorción también se ajustaron a la ecuación de Freundlich (Ec. 1.3), presentándose los resultados en la Tabla 4.10. Tabla 4.10. Coeficientes de Freundlich para la desorción de los enantiómeros del metalaxil de ALP, ALPc y HT-ELA. Kf-des Nf-des R2 TII ALP S-metalaxil 52 (47-56)a 0.15 ± 0.04 0.880 0.79 R-metalaxil 55 (48-55) 0.16 ± 0.03 0.912 0.78 (S+R)-metalaxil 87 (80-95) 0.18 ± 0.03 0.931 0.76 ALPc S-metalaxil 84 (79-89) 0.11 ± 0.04 0.830 0.83 R-metalaxil 82 (77-86) 0.11 ± 0.03 0.880 0.84 (S+R)-metalaxil 156 (146-166) 0.10 ± 0.03 0.881 0.85 HT-ELA S-metalaxil 2580 (2432-2738) 0.47 ± 0.04 0.985 0.38 R-metalaxil 2570 (2431-2716) 0.47 ± 0.04 0.987 0.37 (S+R)-metalaxil 3746 (3436-4085) 0.47 ± 0.04 0.985 0.38 arango de error estándar. Para determinar el grado de reversibilidad del proceso de adsorción de los enantiómeros del metalaxil en los diferentes adsorbentes, se calculó el índice termodinámico de irreversibilidad (TII) a partir de la ecuación Ec. 1.5. TII puede tomar valores de 0 a 1 donde TII = 0 supone una adsorción completamente reversible y TII = 1 una adsorción irreversible. De este modo, se observó una baja reversibilidad del proceso de adsorción para el caso del ALP y ALPc, así como una mayor reversibilidad para la organo-hidrotalcita (Tabla 4.10). 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 129 4.2.1.2. Estudios de adsorción-desorción a suelos sin enmendar y enmendados En la Figura 4.13 se representan las isotermas de adsorción para el S- y R- metalaxil en los suelos S1 y S2 sin enmendar y enmendados con ALP (2%), ALPc (2%) y HT-ELA (0.5% y 1%). En el caso de los residuos de almazara, se seleccionó un porcentaje de enmienda del 2% por ser un valor realista teniendo en cuenta las dosis de aplicación del alperujo en el campo. Para la organo-hidrotalcita, debido a su elevada capacidad de adsorción, se decidió aplicarla en menor cantidad, en un porcentaje del 0.5 y 1%. Figura 4.13. Isotermas de adsorción de S-metalaxil y R-metalaxil en los suelos S1 y S2 sin enmendar y enmendados con ALP, ALPc y HT-ELA medidas a partir de disoluciones racémicas del fungicida. De nuevo, no se observó enantioselectividad en la adsorción del metalaxil en los suelos sin enmendar ni enmendados con los residuos de almazara o la organo- S-metalaxil Ce (mg/l) 0246810 12 14 Cs (mg/kg) 0 20 40 60 80 S2 S2 + 2% ALP S2 + 2% ALPc S2 + 0.5% HT-ELA S2 + 1% HT-ELA R-metalaxil Ce (mg/l) 0246810 12 14 Cs (mg/kg) 0 20 40 60 80 S2 S2 + 2% ALP S2 + 2% ALPc S2 + 0.5% HT-ELA S2 + 1% HT-ELA S2 S-metalaxil Ce (mg/l) 0246810 12 14 Cs (mg/kg) 0 20 40 60 80 S1 S1 + 2% ALP S1 + 2% ALPc S1 + 0.5% HT-ELA S1 + 1% HT-ELA R-metalaxil Ce (mg/l) 0246810 12 14 Cs (mg/kg) 0 20 40 60 80 S1 S1 + 2% ALP S1 + 2% ALPc S1 + 0.5% HT-ELA S1 + 0.5% HT-ELA S1 6. BIBLIOGRAFÍA 232 Celis R., Trigo C., Facenda G., Hermosín M.C. & Cornejo, J. (2007). Selective modification of clay minerals for the adsorption of herbicides widely used in olive groves. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 6650-6658. Celis R., Adelino M.A., Hermosín M.C .& Cornejo J. (2012). 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