Evaluación de la eficacia de tratamientos de desinfesción de suelo en el control de hongos patógenos en el cultivo de la fresa, en las condiciones de cultivo de la provincia de Huelva

DEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGÍA TESIS DOCTORAL “Evaluación de la eficacia de tratamientos de desinfesción de suelo en el control de hongos patógenos en el cultivo de la fresa, en las condiciones de cultivo de la provincia de Huelva” D. Manuel Chamorro Rodríguez Directora: Dra. Berta de los Santos García de Paredes Tutora: Dra. Carolina Sousa Martín Sevilla, 2014 INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN Y FORMACIÓN AGRARIA Y PESQUERA DEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGÍA TESIS DOCTORAL “Evaluación de la eficacia de tratamientos de desinfesción de suelo en el control de hongos patógenos en el cultivo de la fresa, en las condiciones de cultivo de la provincia de Huelva” Tesis presentada por Manuel Chamorro Rodríguez en satisfacción de los requisitos necesarios para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Dirigida por: Dña. Berta de los Santos García de Paredes, Investigadora del IFAPA Centro de Las Torres-Tomejil (Sevilla) y como Tutora; Dña. Carolina Sousa Martín, Investigadora de la Universidad de Sevilla en la facultad de farmacia (departamento de parasitología y microbiología). Doctorando D. Manuel Chamorro Rodríguez VºBº - diretora: Tutora: Dra. Berta de los Santos García de Paredes Dra. Carolina Sousa Martín INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN Y FORMACIÓN AGRARIA Y PESQUERA Dña. Berta de los Santos García de Paredes, Investigadora del IFAPA Centro de Las Torres-Tomejil (Sevilla) Investigadora del Área de Producción Ecológica y Recursos Naturales del IFAPA en el departamento de fitopatología en el Centro “Las Torres- Tomejil”, en calidad de directores de esta Tesis Doctoral; y Dña. Carolina Sousa Martín, Investigadora de la Universidad de Sevilla en la facultad de farmacia (departamento de parasitología y microbiología), en calidad de Tutor; AUTORIZAN a Manuel Chamorro Rodríguez, Ldo. en Biología, para la presentación del trabajo con el título “Evaluación de la eficacia de tratamientos de desinfesción de suelo en el control de hongos patógenos en el cultivo de la fresa, en las condiciones de cultivo de la provincia de Huelva”, ha realizado bajo su dirección y tutorización para optar al grado de Doctor en Biología. Para que así conste y surta los efectos oportunos, en cumplimiento de la legislación vigente, dan su conformidad para la presentación de la referida Tesis en la Universidad de Sevilla. Sevilla, a de 2014. Fdo.: Dr. Berta de los Santos García de Paredes Fdo.: Dr. Carolina Sousa Martín A las tres mujeres de mi vida, padre y abuelo… AGRADECIMIENTOS Llegó el momento por el que tanto he luchado y por el que tanto nos hemos esforzado, en plural porque esta tesis no es solo mía, sino de todos los que han estado a mi lado. Recuerdo con una sonrisa en la cara, una primavera de 2010, el día que tuve que decidir entre, seguir en una empresa que había empezado recientemente o una beca de 4 años que no sé muy bien cómo acabaría, eligiendo finalmente lo que mi abuela me decía que era lo más importante … los estudios, es decir, mi doctorado. En esta tesitura entre elegir una empresa internacional o hacer la tesis sin saber lo que me iba a deparar el futuro, es donde entra mi primer agradecimiento a D. Enrique Figueroa, que me recomendó que si quería aprender, este era mi momento. Uno de los agradecimientos más especiales tiene que ser a la persona que me eligió, me ha asesorado y ayudado en todo lo que ha estado en su mano a la hora de hacer la tesis, mi directora, jefa y amiga Berta de los Santos. Todo el departamento de fitopatología de las Torres, del grupo de D. Fernando Romero, que me ha ayudado a la hora de tomar decisiones y aconsejado mucho y bien, sobre todo lo relacionado con mi tesis y el mundo agrícola. María del Carmen Gómez (mi Mari, si hubieras esperado cuatro años más …), Olga Gómez (mi morena, como nos lo hemos pasado juntos estos 4 años, si no fuera por tí…), Esther Rodríguez (Esthercita, pedazo de trabajadora … me has ayudado muchísimo con esta tesis). Agradecer a todo el personal de las torres en las que más que trabajadores hemos sido amigos, Maria del Carmen (telefóno), Jorge (como me he reído contigo), Miguel Ángel (mira el tonto, leyendo una tesis), Ana Aguado (gran amiga y mejor consejera), Mari Carmen Sánchez, Irene, Maria José Basallote, Nieves Capote, Ana María (cuatro años juntos que hemos sido buenos amigos, espero seguir siéndolo contigo como doctores), Clemente (mi cari y nuestras estancias IFAPA) y todos los becarios IFAPA y el grupo koala. A mis compañeros de El cebollar, en mi primer viaje hacia la finca, mi jefa me dijo: “este camino te lo sabrás de memoria”, pues … creo que si cierro los ojos sería capaz de llega. Cuando llegue a mi segunda casa, me encontré a un grupo de trabajadores INCREIBLES, viven el trabajo, luchan por él y lo más importante, creen en él. D. Juan Jesús Medina, creo que habrá poca gente en el mundo que sepa más del cultivo de la fresa, muchas gracias por todo lo que he aprendido a tu lado y espero seguir aprendiendo. Los siguientes son dos personas muy especiales para mí en mi tesis, v INDICE DE TABLAS Pág. TABLA 1.1. - ALTERNATIVAS QUÍMICAS Y NO QUÍMICAS AL BROMURO DE METILO EN LOS CULTIVOS DE ESPAÑA. .......................................................... 8 TABLA 2.1. - TRATAMIENTOS APLICADOS AL SUELO EN CAMPO DE PRODUCCIÓN DE FRUTO DE FRESA (MOGUER, HUELVA). .............................. 44 TABLA 2.2.- POBLACIÓN DE M. PHASEOLINA (UFC/G DE SUELO SECO) ANTES Y DESPUÉS DE LOS TRATAMIENTOS DE BIOSOLARIZACIÓN, Y AL FINAL DE CADA CAMPAÑA EN SUELOS DONDE SE CULTIVA FRESA, EN TRES CAMPAÑAS CONSECUTIVAS. ....................................................................... 52 TABLA 2.3.- EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS DE DESINFESCIÓN DE SUELO EN EL PORCENTAJE DE MORTALIDAD, OCASIONADA POR M. PHASEOLINA, DURANTE LAS CAMPAÑAS AGRÍCOLAS 2009-10, 2010-11 Y 2011-12. MORTALIDAD ACUMULADA HASTA EL FINAL DE CADA CAMPAÑA (MAYO). .................................................................................................... 54 TABLA 2.4.- PRODUCCIÓN TOTAL (KG/HA Y G/PL) EN SUELOS TRATADOS MEDIANTE BIOSOLARIZACIÓN EN PRE-PLANTACIÓN (CV. ‘CAMAROSA’) (MOGUER, HUELVA). ................................................................................................. 56 TABLA 2.5.- COEFICIENTES DE CORRELACIÓN ENTRE EL NÚMERO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS DE M. PHASEOLINA EN SUELO, EL PORCENTAJE ACUMULADO DE PLANTAS MUERTAS Y LOS RENDIMIENTOS DE CULTIVO (CV. ‘CAMAROSA’) (MOGUER, HUELVA). ..... 57 TABLA 3.1. – COMPOSICIÓN DEL SUELO EN LAS FINCAS OCCIFRESA S.L. (MOGUER), Y FRES-GÓMEZ S.C:A. (PALOS DE LA FRONTERA)....................... 72 TABLA 3.2. – CARACTERÍSTICAS DEL AGUA DE REGADÍO EN LAS FINCAS OCCIFRESA S.L. (MOGUER), Y FRES-GÓMEZ S.C.A. (PALOS DE LA FRONTERA). ................................................................................................................. 73 TABLA 3.3. - DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS DE DESINFESCIÓN DE SUELO (OCCIFRESA S.C.A., MOGUER, Y FRES-GÓMEZ S.L., PALOS DE LA FRONTERA, EN LA PROVINCIA DE HUELVA). ..................................................... 76 TABLE 3.4. - POBLACIÓN DE M. PHASEOLINA (UFC/G DE SUELO SECO) ANTES, DESPUÉS Y AL FINAL DE CADA CAMPAÑA EN OCCIFRESA S.C.A, EN TRES CAMPAÑAS CONSECUTIVAS. ................................................................. 80 TABLE 3.5. - EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS DE DESINFESCIÓN DE SUELO EN EL PORCENTAJE ACUMULADO DE PLANTAS MUERTAS (PM) Y EN LA INCIDENCIA DE PODREDUMBRE CARBONOSA (PMRC), CAUSADA POR M. PHASEOLINA, DESDE LA CAMPAÑA 2009-10 HASTA 2011-12 EN LAS FINCAS OCCIFRESA S.C.A. (MOGUER) Y FRES-GÓMEZ S.L. (PALOS DE LA FRONTERA). MORTALIDAD DE PLANTAS ACUMULADA HASTA EL FINAL DE CADA CAMPAÑA (MEDIADOS DE MAYO)...................................................... 81 vi TABLA 4.1.- ESCALA DE SEVERIDAD EN PLANTAS. ........................................... 92 TABLA 5.1. – FUMIGANTES QUÍMICOS ALTERNATIVOS AL BROMURO DE METILO EN EL CONTROL DE PATÓGENOS Y MALAS HIERBAS, EN FLORIDA. .................................................................................................................... 107 TABLA 5.2.- APLICACIONES DE DIFERENTES FUMIGANTES DURANTE DOS CAMPAÑAS AGRÍCOLAS, EN UNA FINCA EN BRANDON, (FLORIDA). ........ 109 TABLE 5.3. – COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO RB EN 1 L DE AGUA DESTILADA ESTÉRIL. .............................................................................................. 112 TABLA 5.4. – EFECTO DE LOS FUMIGANTES, EN LA VIABILIDAD DE ESCLEROCIOS EN MAZORCA DE MAÍZ Y CORONAS SECAS DE FRESA, INFECTADAS CON M. PHASEOLINA, EN UNA FINCA EN BRANDON (FLORIDA), DURANTE 2012-13 Y 2013-14. ............................................................ 115 TABLA 5.5. – EFECTO DE LOS FUMIGANTES EN EL PORCENTAJE DE PLANTAS MUERTAS (PM%) Y EL PORCENTAJE DE INCIDENCIA DE PODREDUMBRE CARBONOSA CAUSADA POR M. PHASEOLINA (PMCR%), EN UNA FINCA EN BRANDON (FLORIDA), DURANTE 2013-14. ...................... 120 vii INDICE DE FIGURAS Pág. FIGURA 1.1. - FORZADO DEL CULTIVO DE FRESA MEDIANTE SISTEMA DE MACROTÚNELES. ....................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. FIGURA 1.2. - FORZADO DEL CULTIVO MEDIANTE SISTEMA DE MICROTÚNELES O TUNELILLOS. ........... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. FIGURA 1.3. - PRODUCCIÓN MUNDIAL DE FRESA 2012 (FAO DIRECCIÓN DE ESTADÍSTICA). .............................................................................................................. 4 FIGURA 1.4. - REDUCCIÓN DEL USO DE BROMURO DE METILO SEGÚN PROTOCOLO DE MONTREAL A NIVEL MUNDIAL. HTTP://OZONE.UNEP.ORG. .......................................................................................... 7 FIGURA 1.5. - EMPLEO DE SOLARIZACIÓN EN UN CAMPO DE FRESA EN HUELVA ........................................................................................................................ 11 FIGURA. 1.6. - PLANTAS DE FRESAS AFECTADAS POR PODREDUMBRE CARBONOSA. ............................................................................................................... 17 FIGURA. 1.7. - A) CORTE LONGITUDINAL DE CORONA DE FRESA, QUE MUESTRA NECROSIS EN VASOS OCASIONADAS POR M. PHASEOLINA. B) MICROESCLEROCIOS DE M. PHASEOLINA EN TEJIDO DE CORONA DE FRESA. ........................................................................................................................... 17 FIGURA. 1.8. - A) ROTURA DE UN PICNIDIO DE M. PHASEOLINA Y DISPERSIÓN DE CONIDIAS 10X. B) CONIDIAS DE M. PHASEOLINA A 40X. .... 18 FIGURA. 1.9. - MICROESCLEROCIO DE M. PHASEOLINA EN MEDIO DE CULTIVO DE PDA. ....................................................................................................... 21 FIGURA 2.1. - EN CORTE LONGITUDINAL, NECROSIS EN CORONA DE FRESA OCASIONADA POR M. PHASEOLINA. ......................................................... 37 FIGURA 2.2. - VISTA AÉREA DE LA FINCA EXPERIMENTAL “EL CEBOLLAR” (MOGUER, HUELVA). ......................................................................... 43 FIGURA 2.3. - A). APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO DE VINAZA DE REMOLACHA. B). BIOFENCE®. C). TUSAL®. .......................................................... 45 FIGURA 2.4. – A). APLICACIÓN DE MATERIA ORGÁNICA AL SUELO. B). RIEGO POR ASPERSIÓN. C). COLOCACIÓN DE LÁMINAS DE POLIETILENO (SOLARIZACIÓN). D). ELABORACIÓN DE LOS LOMOS DE CULTIVO E INSTALACIÓN DE CINTA DE RIEGO. ...................................................................... 46 FIGURA 2.5. - PLANTACIÓN DEL CULTIVAR 'CAMAROSA' EN LOMOS DE FRESA DE LA PROVINCIA DE HUELVA. ................................................................ 46 viii FIGURA 2.6. - TOMA DE MUESTRA DE SUELO A 20CM DE PROFUNDIDAD, EN EL LOMO CENTRAL DE LA PARCELA, CON UNA SONDA VERTICAL GRADUADA. ................................................................................................................. 47 FIGURA 2.7. - SONDA VERTICAL GRADUADA. .................................................... 48 FIGURA 2.8. - EN MEDIO PDA-DOPCNB, COLONIAS DE M. PHASEOLINA PROCEDENTE DE SUELO EN LOS QUE SE CULTIVA FRESA. ............................ 48 FIGURA 2.9. - EN MEDIO DE CULTIVO PDA, COLONIAS DE M. PHASEOLINA PROCEDENTE DE AISLAMIENTOS DE TEJIDOS DE RAÍZ Y CORONA DE FRESA. ........................................................................................................................... 49 FIGURA 2.10. - PLANTAS DEL CULTIVAR ‘CAMAROSA’ CON SÍNTOMAS DE PODREDUMBRE CARBONOSA. ................................................................................ 53 FIGURA 2.11.- PORCENTAJE DE MORTALIDAD OCASIONADA POR M. PHASEOLINA EN DISTINTOS TRATAMIENTOS DE DESINFESCIÓN DE SUELO, EN TRES CAMPAÑAS AGRÍCOLAS. ......................................................... 55 FIGURA 3.1. – LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA DE LAS FINCAS OCCIFRESA S.L. (MOGUER), Y FRES-GÓMEZ S.C:A (PALOS DE LA FRONTERA). ............... 72 FIGURA 3.2. - A). APLICACIÓN DE 1,3 DICLOROPROPENO:CLOROPICRINA EN INYECCIÓN A LOMO, EN EL CULTIVO DE FRESA. B). APLICACIÓN DE DAZOMET A TODO TERRENO. ................................................................................. 75 FIGURA 3.3. - PRODUCCIÓN TOTAL (KG/HA) EN SUELOS FUMIGADOS Y BIOSOLARIZADOS EN PRE-PLANTACIÓN EN LAS FINCAS DE OCCIFRESA (MOGUER) Y FRES-GÓMEZ (PALOS DE LA FRONTERA) (CV. ‘CAMAROSA’)83 FIGURA 4.1. - ENSAYO EN CÁMARA DE CULTIVO, EN CONDICIONES CONTROLADAS. .......................................................................................................... 91 FIGURA 4.2. - SUSPENSIÓN DE ESCLEROCIOS DE LOS AISLADOS TOR-102 Y TOR-99. .......................................................................................................................... 92 FIGURA 4.3. - INCIDENCIA DE PODREDUMBRE CARBONOSA (PORCENTAJE DE PLANTAS MUERTAS), TRAS LA INOCULACIÓN CON DOS AISLADOS DE M. PHASEOLINA, EN CONDICIONES CONTROLADAS. ........................................ 95 FIGURA 4.4. - RESPUESTA DE CINCO CULTIVARES DE FRESA A LA INOCULACIÓN CON DOS AISLADOS DE M. PHASEOLINA, EN CONDICIONES CONTROLADAS. .......................................................................................................... 95 FIGURA 4.5. - NÚMERO MEDIO DE ESCLEROCIOS DE M. PHASEOLINA POR GRAMO DE SUELO SECO (UFC/G), MEDIA DE DOS CAMPAÑAS AGRÍCOLAS96 FIGURA 4.6.- PORCENTAJE DE MORTALIDAD E INCIDENCIA DE PODREDUMBRE CARBONOSA (PORCENTAJE DE PLANTAS MUERTAS), MEDIA DE DOS CAMPAÑAS AGRÍCOLAS ............................................................. 97 FIGURA 5.1. - PRODUCCIÓN DE FRESA EN EE.UU, DESDE 2000-2012. (HTTP://WWW.NASS.USDA.GOV). ......................................................................... 105 ix FIGURA 5.2. – A). PLANTAS DE FRESA CON VASOS NECROSADOS POR PODREDUMBRE CARBONOSA. B). PLANTA DE FRESA COLAPSADA. ......... 106 FIGURA 5.3. – BOLSAS DE NYLON CON MAZORCA DE MAÍZ Y CORONAS SECAS DE FRESAS INFECTADAS CON M. PHASEOLINA. .................................. 110 FIGURA 5.4.- LOMO DE FRESA CON 4 AGUJEROS PARA LA COLOCACIÓN DE LAS BOLSAS DE PIENSO CON MAZORCAS DE MAÍZ Y CORONAS INFECTADAS CON M. PHASEOLINA, A DISTINTAS PROFUNDIDADES DURANTE LA CAMPAÑA 2013-14. ......................................................................... 111 FIGURA 5.5. – EFECTO DE DOS FUMIGANTES, EN LA VIABILIDAD DE ESCLEROCIOS EN MAZORCA DE MAÍZ, INFESTADAS CON M. PHASEOLINA, EN DIFERENTES PROFUNDIDADES Y DILUCIONES. ........................................ 117 FIGURA 5.6. – EFECTO DE UN FUMIGANTE Y UN CONTROL, EN LA VIABILIDAD DE ESCLEROCIOS EN MAZORCA DE MAÍZ, INFESTADAS CON M. PHASEOLINA, EN DIFERENTES PROFUNDIDADES Y DILUCIONES .......... 118 x xi RESUMEN El cultivo de la fresa está muy extendido en los cinco continentes, siendo China y Estados Unidos los mayores productores del mundo. A nivel mundial, el cultivo de fresa se ha visto incrementado significativamente en los últimos años, llegando a 241.109 hectáreas, en 2012. En ese año, la superficie cultivada en la provincia de Huelva (costa suroeste de España) alcanzó las 7.600 ha con una producción de 289.900 toneladas. Para esta provincia, el cultivo de la fresa ha supuesto una gran revolución desde que, a mediados de los años sesenta del pasado siglo, se iniciara en la zona. En la actualidad, supone uno de sus principales motores de desarrollo económico junto con la producción de cítricos y el turismo. Huelva es la principal área de cultivo en Europa y la cuarta después de Estados Unidos, México y Turquía, por lo que se considera a España un referente a nivel mundial en prácticas de este cultivo. Los principales países importadores de la fresa española son Francia, Alemania y Portugal con más del 80% de la exportación total. El cultivo de la fresa ha sido altamente dependiente de la utilización del bromuro de metilo para la desinfesción del suelo. Como resultado del Protocolo de Montreal y la Regulación de la Comunidad Europea (CE) nº 2037/2000 del 29 de Junio sobre sustancias que deterioran la capa de ozono, la prohibición del bromuro de metilo (BM) para la producción de fresas fue irreversible en los países de la Unión Europea desde 2007 (Decisión de la comisión de EC, 2006). Actualmente, en la UE, los únicos fumigantes autorizados con restricciones son los generadores de metil isocianato: dazomet, metam sodio y metam potasio. Aunque, 1,3- dicloropropeno y cloropicrina han sido utilizados como las principales alternativas al BM, están excluidas del Anexo I (Directiva Europea CE 91/414) desde 2010 y 2013, respectivamente, manteniéndose en la actualidad para usos de emergencia nacional mediante permisos temporales renovables de 120 días por año para la industria agrícola. En los países donde se cultiva la fresa, se ha observado, durante los últimos años, la aparición de nuevas enfermedades fúngicas y el resurgir de otras que estaban prácticamente erradicadas. Un gran número de autores relacionan este hecho con los cambios realizados en los productos utilizados para la desinfesción de suelos y en su forma de aplicación. Entre las enfermedades emergentes que afectan al cultivo de la fresa se encuentra la podredumbre carbonosa (charcoal rot, en la literatura anglosajona) ocasionada por Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidanich. En la provincia de Huelva se detectó por primera vez en el año 2006. Las condiciones climáticas de esta zona, así como el tipo de suelo, favorecen el desarrollo de esta enfermedad, que ya se considera una seria amenaza en todas las zonas donde se cultiva la fresa. xii Aún no está lo suficientemente claro si la reciente aparición de información sobre la podredumbre carbonosa es debida al incremento de dispersión del patógeno, la prohibición del BM o el creciente conocimiento de la misma como nueva enfermedad en fresa. Se han estudiado numerosas técnicas de producción de fresa sin BM u otros químicos: cultivos hidropónicos, desinfesción anaerobia del suelo, por vapor, solarización, biosolarización y utilización de variedades resistentes, entre otros. A pesar de ello, solo en el caso de que estas técnicas permitan unos rendimientos adecuados, podrían ser consideradas como alternativas viables al uso de fumigantes para el cultivo de la fresa. La finalidad de este trabajo es determinar la eficacia de métodos de desinfesción de suelo en el control de las poblaciones de Macrophomina phaseolina en suelo, la incidencia de podredumbre carbonosa y la influencia de los mismos en la producción, así como analizar la respuesta de resistencia o susceptibilidad de variedades de fresa a dicho patógeno y determinar las posibles diferencias entre aislados del patógeno, concretándose en los siguientes objetivos parciales: 1. Determinar la eficacia de los tratamientos de desinfesción en el control de las poblaciones de M. phaseolina en suelo. 2. Evaluar la incidencia de podredumbre de corona (podredumbre carbonosa, “charcoal rot”) en plantas de fresa en suelos fumigados. 3. Analizar el efecto de los tratamientos de desinfesción de suelo en los rendimientos del cultivo. 4. Determinar la relación entre la población de M. phaseolina en suelo con la incidencia de podredumbres de corona, así como con los rendimientos del cultivo. 5. Determinar la respuesta de resistencia/susceptibilidad de variedades de fresa de uso común a M. phaseolina. Para la consecución de estos objetivos se han llevado a cabo distintos ensayos en campo y en condiciones controladas. Los ensayos de campo se realizaron en tres fincas ubicadas en el suroeste de la provincia de Huelva (España) y en una finca colaboradora de la Universidad de Florida, situada en Dover (Florida, EEUU). El resto de los trabajos se realizaron en el Centro IFAPA Las Torres (Alcalá del Río, Sevilla, España), dependiente de la Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural (Junta de Andalucía). En la finca experimental El Cebollar (Moguer, Huelva), se ha analizado la eficacia de diversos tratamientos de biosolarización, técnica que combina la biofumigación y la solarización, durante tres campañas agrícolas. Estos tratamientos redujeron las poblaciones de M. xiii phaseolina en el suelo, siendo los tratamientos de biosolarización con gallinaza a 25.000kg/ha o vinaza de azúcar de remolacha a 15.000kg/ha muy eficaces en el control de la podredumbre carbonosa. En ensayos realizados en dos fincas comerciales, con distinto historial de desinfesción, se compararon distintos tratamientos químicos y el tratamiento de biosolarización con gallinaza a 25.000kg/ha. La mayoría de los tratamientos químicos redujeron las poblaciones de M. phaseolina y disminuyeron la incidencia de podredumbre carbonosa. La aplicación repetida del tratamiento de biosolarización resultó en una incidencia de podredumbre carbonosa del 1% y en rendimientos del cultivo similares a los obtenidos con la aplicación del tratamiento estándar 1,3-dicloropropeno:cloropicrina. Las aplicaciones con dazomet, fumigante autorizado, fueron tan eficaces como el tratamiento estándar. En una finca colaboradora del Gulf Coast Research and Education Center (Wimauma, Florida, EEUU), se llevó a cabo durante dos campañas agrícolas, un trabajo de campo cuyo objetivo era determinar la eficacia de distintos tratamientos químico de desinfesción de suelo con diferentes formas de aplicación, en la erradicación de varios tipos de inóculo de M. phaseolina, enterrados en suelo. Los compuestos generadores de isotiocianatos (metam sodio y potasio) fueron tan eficaces como aplicaciones de BM:cloropicrina. Se determinó la respuesta de resistencia/susceptibilidad de variedades de fresa comerciales a M. phaseolina, mediante inoculación artificial, en condiciones controladas, y en condiciones de campo, en suelos naturalmente infestados. Los resultados obtenidos en ambas condiciones fueron similares, siendo el cultivar ‘Splendor’ el más resistente a la enfermedad. Estos trabajos han sido financiados por el Convenio INIA CC09-074-C5, Proyecto TRANSFORMA PP.TRA.TRA201300.6, fondos FEDER y la beca postdoctoral número 11 de IFAPA y Fondo Social Europeo 2007-2013. xiv Capítulo 1 3 2008). Otro sistema de cultivo que se inició en la fresa en Huelva hace 10 años, es el cultivo sin suelo. Existen en la actualidad unas 200 has de cultivo de fresa sin suelo en Huelva bajo diversas modalidades: sistemas abiertos o cerrados, suspendidos o apoyados, con o sin sustrato (hidropónico). Los sustratos usados principalmente son: fibra de coco, lana de roca, perlita y turba. Uno de los problemas actuales del sistema de cultivo sin suelo es la falta de variedades realmente adaptadas a tal sistema. (López-Aranda et al., 2009). Según datos de la Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural-Junta de Andalucía, en 2012, el 70% (4.510 has) de la superficie dedicada al cultivo de la fresa se maneja según la normativa de Producción Integrada de la Fresa (Anónimo, 2008). Figura 1.1. - Forzado del cultivo de fresa mediante sistema de macrotúneles. Figura 1.2. - Forzado del cultivo mediante sistema de microtúneles o tunelillos. Capítulo 1 4 1.1.2.- Importancia del cultivo. La fresa es uno de los cultivos con mayor consumo de fruta en el mundo. Su producción mundial se ha multiplicado por seis en los últimos 60 años, desde 754.516 toneladas en 1961 hasta 4.516.810 toneladas en 2012 (Anónimo, 2014c). Este gran desarrollo se debe en parte al incremento de la demanda, al ser considerada por los consumidores una fruta de alto contenido en vitamina C, casi análogo al de los cítricos, y al haberse potenciado sus posibilidades de utilización industrial. Según datos de la FAO (2012), la producción de fresa a nivel mundial se sitúa alrededor de 4,5 millones de toneladas y una superficie aproximada de 250.000 hectáreas (Anónimo, 2014a). Por continentes, América y Europa son los que concentran los mayores porcentajes de producción de fresa, entorno al 65%. California es responsable de que Estados Unidos sea primer productor mundial. Huelva es la principal área de cultivo en Europa, aportando alrededor del 6,3% de la producción mundial y el 27% a nivel europeo, situando a España como cuarto país productor tras Estados Unidos, México y Turquía, lo que hace de nuestro país un referente a nivel mundial en prácticas de cultivo (Figura 1.3). Figura 1.3. - Producción mundial de fresa 2012 (FAO Dirección de Estadística). En 2012, se dedicaron al cultivo de la fresa en la provincia de Huelva 7.600 has, con una producción de 289.900 toneladas, con una fluctuación desde 2008 a 2011 de 249.410, 225.800, 245.000 y 302.600 toneladas, respectivamente. En la actualidad, este cultivo supone uno de sus principales motores de desarrollo económico junto con la producción de cítricos y el turismo Capítulo 1 5 (De Vicente, 2008). La superficie cultivada ocupa el 3% de las tierras labradas de la provincia, aportando más del 50% de la producción total agrícola, por tanto este sector tiene una elevada repercusión económica y un bajo consumo de recursos naturales, tanto de suelo como de agua (Anónimo, 2003). Es uno de los productos con mayor cuota en la exportación de frutas y hortalizas en España. Los principales países importadores de la fresa española son Francia, Alemania y Portugal con más del 80% de la importación total. Sin embargo, en Holanda, Bélgica, Polonia, Austria y Dinamarca la importación de fruta ha sido inferior al 10% del total de la producción española (Domínguez et al., 2014). En la provincia de Huelva podemos distinguir 3 zonas productoras de fruto de fresa: la Comarca Litoral, que comprende los municipios de Moguer, Palos de la Frontera, Lucena del Puerto y Almonte, y que representa la zona pionera del cultivo en la provincia; la Comarca de la Costa, al oeste de la primera, que abarca los municipios de Lepe, Cartaya, Isla Cristina y Villablanca, y que ha registrado una progresión muy importante en los últimos años; y la Comarca de la Campiña, compuesta por los términos municipales de Rociana, Bollullos del Condado, Palma del Condado, Villalba, Bonares y Niebla (Márquez-Domínguez, 2008). El cultivo de fresa moderno, tal y como se conoce actualmente, tiene un origen relativamente reciente (Medina-Mínguez, 2008). 1.2. - Desinfesción de suelo. El suelo es un reservorio para muchos patógenos de plantas. La salud e integridad del suelo es, por sí mismo, el factor principal que afecta a los niveles de patógenos. Un suelo sano es una combinación de minerales, aire, agua y materia orgánica. Los minerales en forma de arena, limo y arcilla componen cerca de 50% de un suelo adecuado. La materia orgánica constituye sólo una pequeña porción de los suelos, pero es fundamental para la transferencia de los iones químicos necesarios para el crecimiento de las plantas y la producción de frutas y hortalizas. Los suelos bien estructurados y estables son un ecosistema con su propio equilibrio e interacción de los organismos. Es este ambiente sano alrededor de la zona de la raíz de una planta, el que permite la supresión biológica de patógenos de plantas y previene el parasitismo y el daño a las plantas. El suelo es un ambiente extremadamente complejo, siendo difícil entender los aspectos que influyen en el desarrollo de los patógenos en el suelo y en el de las enfermedades que ocasionan (Koike et al., 2003). Las microorganismos habitantes de suelo causan grandes pérdidas en la mayoría de los cultivos, afectando tanto a los rendimientos como a la calidad (Katan, 1996). En agricultura intensiva, como es el caso de la fresa, con frecuencia se utiliza la misma parcela durante años consecutivos, lo que ocasiona un rápido aumento de las poblaciones de microorganismos en el suelo, especialmente aquellos que causan Capítulo 1 6 enfermedades en las raíces. Es necesario, por tanto, desarrollar métodos de control efectivos para asegurar la productividad de los cultivos y estabilizar el rendimiento. Además de ser efectivos, esos métodos tienen que ser económica, ambiental y tecnológicamente viables (Katan, 1999). Los niveles poblacionales de los patógenos de suelo (soilborne pathogens, en la literatura anglosajona), entre los que se incluyen bacterias, hongos, nematodos y algunos virus, pueden ser reducidos en el suelo por tratamientos de desinfesción apropiados. La desinfesción del suelo es una práctica fundamental en el cultivo de determinadas especies de interés agronómico, como es el caso de la fresa. Básicamente consiste en la aplicación al suelo, antes de la instalación del cultivo, de algún agente biocida de naturaleza física o química. Así, según la naturaleza del agente biocida, las técnicas de desinfesción de suelos se pueden clasificar como químicas o no químicas, existiendo la posibilidad de combinarlas, con la finalidad de aprovechar y mejorar al máximo los efectos beneficiosos que estas ofrecen y, en algunas ocasiones, la combinación de técnicas químicas con otros métodos de control garantiza un buen resultado (Rodríguez-Kábana, 1998). Entre las técnicas empleadas, las prácticas de control más difundidas tanto en los cultivos hortícolas como ornamentales son: la desinfesción con fumigantes químicos y el uso de calor tanto seco como húmedo, incluyendo el aprovechamiento de la radiación solar o las desinfesciones con vapor de agua (Diánez, 2005). Lo más frecuente es recurrir al uso de productos químicos debido, principalmente, a la facilidad de aplicación (Barres, 2006). El bromuro de metilo (BM) o metilbromuro (CH3Br) se ha utilizado de forma mayoritaria en los sistemas de cultivo intensivos, ya que se trata de cultivos de alto valor y con una frecuencia de producción casi continua, que se interrumpe sólo durante el tiempo suficiente para esterilizar el suelo (Calatrava, 2002). 1.2.1. - Situación actual de los desinfestantes químicos. Una de las principales ventajas de la desinfesción química de los suelos es su sencillez a la hora de la aplicación, además de su elevada eficacia insecticida, nematicida, fungicida y herbicida. La toxicidad de los productos para tratamientos de suelos es un factor que aconseja limitar su utilización (Cenis, 1991). A la hora de seleccionar este tipo de desinfesción conviene conocer el alcance medioambiental de los efectos de su aplicación así como de la evaporación y degradación de los productos químicos, de la formación de metabolitos, de su capacidad de percolación y de su posible translocación en las plantas (Barres, 2006). El cultivo de la fresa ha sido altamente dependiente del uso de BM como fumigante de suelo para el control de malas hierbas, nematodos y hongos patógenos, tanto en campos de Capítulo 1 7 producción de fruto como en viveros de altura (Medina et al., 2009). El Protocolo de Montreal y el reglamento CE nº 2037/2000 de 29 Junio de 2000 subrayaron la necesidad de eliminar gradualmente el uso de BM, dada su importante contribución al agotamiento de la capa de ozono estratosférica y las posteriores consecuencias que pudiera tener para el medio ambiente (Yates y Gan, 1997) (Figura 1.4). El Protocolo de Montreal establecía enero de 2005, como fecha tope para la prohibición de la utilización del BM, marcándose, para algunos países, un periodo transitorio de uso, llamado de “Usos Críticos”. En el caso de España, el consumo de BM se restringió a 230 toneladas entre 2005-2006, 217 toneladas en 2007, 200 toneladas en 2008 y llamado a desaparecer en 2009 (Reglamento CE nº 2037/2000 del Parlamento Europeo). Figura 1.4. - Reducción del uso de Bromuro de Metilo según Protocolo de Montreal a nivel mundial. http://ozone.unep.org. El BM es considerado uno de los fumigantes de suelo más efectivos. Algunas de las ventajas de su uso residen en su facilidad de aplicación en un amplio rango de tipos de suelo, con distintos niveles de humedad, temperatura y a diferentes profundidades, manteniendo una alta eficacia en el control de patógenos de suelo. Otras alternativas químicas son menos flexibles en cuanto a forma de aplicación y a las condiciones necesarias para mantener su eficacia (Santos, 2007). Muchos de los productos químicos registrados y disponibles son efectivos contra hongos, nematodos o malas hierbas, es decir son mucho más específicos, pero carecen del amplio espectro de acción del BM (Barres, 2006; Matthiessen y Kirkegaard, 2006; Noling, 2002; Rodríguez-Kábana, 1998). Además, al contrario de lo que sucede con el BM, su eficacia Países no desarrollados Países desarrollados Capítulo 1 8 y la respuesta del cultivo, depende de las condiciones climáticas y edáficas durante los momentos anteriores y posteriores a su aplicación (Noling, 2002). El Methyl Bromide Technical Option Committee (MBOTC) define una “alternativa” como aquellos tratamientos o procedimientos químicos y no químicos que son técnicamente viables para el control de organismos patógenos permitiendo la eliminación del BM y establece diferencias entre las consideradas “alternativas existentes” y “alternativas potenciales”. Las primeras se corresponden con las que se están aplicando o se han aplicado en alguna región concreta mientras que las últimas están en proceso de investigación o desarrollo (Bello y Díez- Rojo, 2004). Estas alternativas, a su vez, se clasifican en tres grupos: alternativas no químicas, alternativas químicas y alternativas de control integrado (Tabla 1.1) (Rodríguez-Kábana, 1998; Tello y Bello, 2002). Tabla 1.1.- Alternativas químicas y no químicas al bromuro de metilo en los cultivos de España. No químicas Químicas Rotación de cultivo 1,3 Dicloropropeno Solarización Metam-sodio Biofumigación Metam-potasio Biosolarización Dazomet Cultivos sin suelo y sustratos Cloropicrina Variedades resistentes Combinaciones Vapor de agua Uso de semillas o plantas libres de patógenos Otros Debido al elevado consumo de BM, que le llevó a ocupar el cuarto puesto tras países como EEUU, Italia y Japón, España ha sido uno de los países de referencia en la búsqueda de alternativas a este fumigante (Bello y Díez-Rojo, 2004). La Directiva 91/414/CEE del Consejo Europeo, de 15 de Julio de 1991, relativa a la comercialización de productos fitosanitarios y posteriormente bajo la Regulación Europea Nº1107/2009 y 540/2011 (UE) relativa a la comercialización de Productos de Protección de Plantas, establece normas uniformes en materia de evaluación, autorización, comercialización Capítulo 1 9 y control de productos fitosanitarios y de las sustancias activas que contienen, reduciendo dramáticamente el número de fumigantes disponibles dentro de la Unión Europea. La aplicación de la modificación de esta directiva sobre fumigantes químicos de suelos agrícolas implica que los compuestos que en la actualidad son utilizados como alternativas al BM como 1,3 dicloropropeno (1,3 D) o cloropicrina tienen los días contados en el territorio de la Unión Europea, y luego seguirían, indefectiblemente, otros como dazomet, metam sodio y metam potasio, entre otros (López-Aranda, 2008). Entre las alternativas químicas al BM utilizadas de forma mayoritaria por los productores de fruto de fresa se encuentran 1,3 D:cloropicrina, metam sodio, dazomet y yodo metamo (Pinzon, 2011). Las formas más comunes de los productos formulados con 1,3 D son los isómeros cis- o transde 1,3 D contenidos en mezclas con el agente fungicida cloropicrina, en proporción de 65% 1,3 D y 35% de cloropicrina (Nelson et al., 2001). Aunque estas sustancias están excluidas del Anexo I de la Directiva 91/414/CEE (399) desde 2010 y 2013, respectivamente, aún se siguen utilizando, debido a la posibilidad legal de los estados miembros de la UE de solicitar permisos temporales (120 días/año) para la industria agrícola (usos de emergencia nacional) (De Cal et al., 2004). En la actualidad, los únicos fumigantes autorizados en la UE son: dazomet, metam sodio y metam potasio, compuestos generadores de metil isotiocianato (MITC), con restricciones de uso. Según el Anexo I de la Directiva 91/414/CEE (399), trasladadas al anexo I del REGLAMENTO CE) Nº 1107/2009, el uso de estos productos está permitido como nematicida, fungicida, herbicida e insecticida para su aplicación como agente fumigante del suelo antes de la plantación, limitados a 1 aplicación cada 3 años en un mismo campo, pudiendo autorizarse la aplicación en campo abierto por inyección en el suelo o riego por goteo, y en invernadero mediante riego por goteo únicamente, prescribiéndose el uso de una película de plástico estanca a los 15 gases para el riego por goteo. La tasa de aplicación máxima es de 153kg/ha (correspondiente a 86,3kg/ha de MITC) en el caso de las aplicaciones en campo, estando su aplicación limitada a usuarios profesionales. Otros compuestos químicos estudiados para reemplazar al BM como yoduro de metilo, azida sódica, entre otros, no han alcanzado el mercado, mientras que dimetil disulfuro (DMDS) está aún en desarrollo en varios países (Gullino et al., 2007), aunque se ha registrado como Paladin en Israel y Florida (USA) (López-Aranda, 2012, Qin et al., 2011;), estando pendiente de registro en la Unión Europea (UE). Los fumigantes químicos suelen ser aplicados dos semanas antes de la plantación, aunque, ocasionalmente este periodo puede incrementarse hasta un mes. El fundamento de la desinfesción de suelos o sustratos empleando productos químicos se basa en la capacidad de Capítulo 1 10 dichos productos de pasar a estado gaseoso en el momento de ser liberados, haciéndose necesario impedir el escape de dichos gases al medio ambiente, reteniéndolos durante el tiempo necesario para que su acción resulte efectiva. La desinfesción de suelo se ha realizado mediante aplicaciones a toda superficie, cubriendo el suelo con lámina de polietileno virtual o totalmente impermeable (VIF o TIF), para reducir las emisiones de los gases a la atmósfera (Yates et al., 2002). Hoy en día, los fumigantes se aplican durante el proceso de formación de los lomos, que son inmediatamente cubiertos con polietileno negro o VIF. De esta forma los pasillos entre lomos no se tratan, lo que permite reducir las tasas de aplicación, promoviendo así la reducción de dosis (Nelson et al., 2001). Otro método de aplicación, desarrollado recientemente, es la aplicación de fumigantes emulsionados en agua mediante el riego por goteo y directamente en el lomo (Duniway, 2002). El uso de plásticos con alta capacidad de retención es un componente muy importante para incrementar la actividad fumigante contra los patógenos de suelo. El uso de plástico VIF incrementa la duración de concentraciones relativamente altas del fumigante en el suelo, lo que permite más tiempo de exposición de los patógenos a dosis letales y, también, una mejor distribución lateral en el suelo (Santos et al., 2007). En general, el uso de agroquímicos en agricultura intensiva ha disminuido en más de un 30% debido a la política agro-ambiental europea y la presión de la opinión pública. Las regulaciones de la UE están incrementando las restricciones de usos de pesticidas (y fumigantes químicos), estimulando a las industrias al propósito de nuevos retos debido a que actualmente la disponibilidad de nuevos químicos como alternativas al BM es incierta. En la campaña agrícola 2012-13, y para el cultivo de la fresa en Huelva, los tratamientos de desinfesción de suelo utilizados fueron: 1,3 D:cloropicrina (73% de la superficie), cloropicrina (12%), dazomet solo o mezclado con 1,3 D (10%), metam sodio o metam potasio (2,5%) y cultivos sin suelo (2,5%) (López-Aranda, 2013). Portavoces del sector fresero de Huelva han señalado importantes reducciones de la producción, cifradas entre un 15 y un 25% de la cosecha, en los últimos años, como consecuencia de la rápida desaparición del BM, por lo que se hace urgente un cambio en el manejo del cultivo. Según López-Aranda (2008), este brusco cambio tecnológico en el cultivo de la fresa en zonas de clima mediterráneo podría suponer el incremento de la incidencia de enfermedades fúngicas, ocasionadas por patógenos de suelo. Capítulo 1 11 1.2.2. - Desinfesciones de tipo no químicas como alternativas al BM. La presión legislativa y social para restringir el uso de fumigantes químicos ha creado un interés en evaluar el aprovechamiento de alternativas no químicas para el manejo de enfermedades del suelo (Chellemi et al., 1994). Entre estas alternativas se encuentran: la solarización, la biofumigación y la combinación de ambas: biosolarización (Tabla 1.1). La técnica de la solarización fue descrita por Katan y colaboradores en 1976. Fue ensayada en Israel, donde el método más utilizado para la desinfección de suelos era la fumigación, cuyo alto coste era su principal inconveniente. Esta práctica se lleva a cabo durante los meses más cálidos del año y consiste en cubrir el suelo con láminas de polietileno transparente, selladas en los márgenes y mantenidas sobre el mismo durante varias semanas (Figura 1.5). Esta cubierta plástica permite el paso de las radiaciones solares de onda corta. Una vez que la luz solar atraviesa la cubierta, se produce el calentamiento del suelo hasta temperaturas de entre 35-60ºC, que son letales para la mayoría de los patógenos de plantas (incluyendo hongos, bacterias, malas hierbas, nematodos e insectos) (Stapleton y DeVay, 1995). De esta forma se consigue reducir las poblaciones de determinados patógenos, así como la incidencia de las enfermedades asociadas a los mismos. Este método es similar al calentamiento artificial del suelo por vapor u otros medios, con la ventaja de que no es necesario conducir el calor desde su fuente al campo (Katan, 1981). Figura 1.5. - Empleo de solarización en un campo de fresa en Huelva. Para la aplicación de esta técnica es necesaria la ocupación del suelo de forma no productiva durante un largo periodo de tiempo, existiendo además una dependencia de las condiciones Capítulo 1 12 climáticas, por lo que su uso se encuentra restringido a zonas con alta intensidad lumínica y temperaturas (Berg, 2007; Ros et al., 2008). Además, en el caso de la fresa, la solarización proporciona el control de malas hierbas pero se observa una reducción de los rendimientos debido a que no controla las poblaciones de algunos hongos patógenos y nematodos (Locascio et al., 1999). Otra de las desventajas de esta técnica, es que afecta de forma negativa a microorganismos beneficiosos, aunque los cambios en la microflora y la descomposición de la materia orgánica que se producen tras la solarización pueden incrementar el crecimiento de las plantas e inducir la supresividad hacia los organismos patógenos. Algunos microorganismos beneficiosos, como Trichoderma spp. son capaces de sobrevivir a las altas temperaturas (Pinkerton et al., 2002) Stapleton (2000), aconseja combinar la solarización con otras técnicas que resulten compatibles para la mejora de su eficacia en caso de situaciones adversas como: condiciones medioambientales marginales; presencia de organismos patógenos termotolerantes, o que se distribuyen en el suelo a gran profundidad; y con el objetivo añadido de minimizar la duración del tratamiento. La solarización se puede combinar con otros métodos de control físico, químico o biológico. La biofumigación es una técnica que utiliza como fumigantes para el control de patógenos de suelo, las sustancias volátiles y otros productos que se originan en el suelo como consecuencia de la biodegradación de enmiendas orgánicas y otros residuos agroindustriales (Bello et al., 2004). Los compuestos de nitrógeno (como amonios y nitratos), sulfuro de hidrógeno, los ácidos orgánicos y un gran número de sustancias volátiles así como enzimas (peroxidasas, quitinas) y fenoles son responsables de esta actividad biocida (Barres, 2006; Bello et al., 1997; Gamliel y Stapleton, 1993a, b; Mian et al., 1982; Rodríguez-Kábana, 1998). Los patógenos son susceptibles a los compuestos volátiles que se desprenden durante la descomposición de la materia orgánica así como al incremento de la temperatura del suelo que se produce al incorporarse la materia orgánica (Bello et al., 2000, 2001). La emisión de compuestos volátiles durante la biofumigación no es constante; se produce un marcado descenso después de tres semanas (Gamliel y Stapleton, 1993a). Además, el oxígeno en el suelo disminuye mientras que el dióxido de carbono (CO2) aumenta, el pico máximo de CO2 ocurre en los primeros días de tratamiento. La biofumigación es una aproximación del uso de plantas que contienen sustancias biológicamente activas y específicas para el control contra hongos, nematodos y plagas de los cultivos agrícolas. El principio de la biofumigación se basa en el uso de plantas con altos niveles de glucosinolatos, compuestos de azufre que se producen de forma natural en las plantas y que mejoran la protección de la planta. Cuando las plantas se incorporan al suelo, Capítulo 1 19 rápidamente en suelos mantenidos a 25°C ó a temperaturas fluctuantes de 18 a 32°C, comparado con la viabilidad en suelos mantenidos a 30°C. Después de 30 a 40 semanas de exposición en el suelo, el inóculo mantenido a 25°C, 30°C, ó a temperaturas fluctuantes en invernadero disminuyó hasta niveles muy bajos. Además, se observó un aumento significativo en la mortalidad de las plantas en suelos infestados mantenidos a 30ºC frente a los mantenidos a 25°C, mientras que el estrés hídrico a 25ºC ó 30°C no afectó a la mortalidad de las plantas en los suelos infestados con M. phaseolina (Zveibil et al., 2012). En ensayos in vitro, Khan (2007) demostró que el crecimiento de M. phaseolina fue insignificante a bajas temperaturas y comenzó su crecimiento a 15°C, encontrando que la temperatura óptima de crecimiento fue de 30°C, siendo fuertemente inhibida por temperaturas de 40°C ó superiores. El contenido de humedad del suelo ha sido considerado como uno de los principales factores que afecta a la supervivencia de M. phaseolina (Pratt, 2006). La humedad del suelo y el nivel del agua tienen efectos significativos sobre la supervivencia de los microesclerocios de M. phaseolina. Así, en suelos húmedos, tanto a altas temperaturas (> 50°C) como a bajas (-5 ó 5°C) afectan de forma negativa a la supervivencia y al crecimiento de M. phaseolina (Papavizas y Klag, 1975). Zveibil y colaboradores (2012) observaron que una combinación de una alta humedad e inundaciones causaban una disminución de la viabilidad de los microesclerocios en comparación con los suelos secos. Aunque, los resultados del estudio realizado por Pratt (2006) no mostraron de manera clara que los suelos secos favorecieran la supervivencia de microesclerocios de M. phaseolina, como sugieren algunos autores, debido a que la supervivencia óptima ocurre en suelos relativamente húmedos y con una capacidad de retención de agua en torno a 50-100%. En este estudio, los resultados y las observaciones de los experimentos a diferentes niveles de humedad del suelo, sugirieron que la viabilidad de los microesclerocios pueden verse influenciadas por las interacciones entre los microorganismos y la humedad del suelo. Olaya y colaboradores (1996 a, b) demostraron que las altas temperaturas y los bajos potenciales hídricos del suelo son factores importantes en la ocurrencia de esta enfermedad. En medios de cultivo no específicos, este hongo es capaz de crecer a temperaturas de 35°C y potencial osmótico bajo, especialmente si los nutrientes están disponibles. Los microesclerocios proliferan en el medio en un amplio rango de potenciales osmóticos (Odvody y Dunkle, 1979). Además Shokes y colaboradores (1977), demostraron que el potencial hídrico tiene una gran importancia en la ecología de M. phaseolina. Posteriormente, Goudarzi y colaboradores (2008) estudiaron el efecto del potencial osmótico y el potencial mátrico del suelo en la germinación de microesclerocios y el crecimiento miceliar de M. phaseolina y llegaron a la conclusión de que el potencial mátrico era un factor más importante que el potencial osmótico para el crecimiento miceliar M. phaseolina. Los factores que influyen de manera negativa en la supervivencia de los propágulos del hongo son, además Capítulo 1 20 de ciclos de congelación y descongelación del suelo, una baja relación de carbono:nitrógeno y una alta humedad del suelo (Short et al., 1980). La densidad de plantación juega un papel importante en la incidencia de podredumbre carbonosa, que fue inversamente proporcional, de manera que a mayor densidad de población menor incidencia, en algunos estudios realizados en cultivos como: girasol, cacahuete y guayule (Parthenium argentatum, A. Gray) (Mihail, 1989). M. phaseolina sobrevive en el suelo y en restos de plantas de fresa infectadas mediante estructuras de resistencias denominadas microesclerocios. Al final de la campaña (mediados de Mayo), las plantas de fresas se extraen del lomo mediante la siega de la parte aérea, arado de los lomos o la aplicación de herbicidas. Finalmente, los restos de las plantas infectadas por patógenos del suelo pueden permanecer en el suelo hasta la siguiente campaña y por lo tanto, servir como una fuente potencial de inóculo primario para los posteriores cultivos (Zveibil et al., 2012). Algunos estudios sugieren que la población de microesclerocios de M. phaseolina aumenta a medida que los desechos del huésped se van descomponiendo en el suelo (Mihail, 1989). Esta puede ser una de las principales causas del incremento observado en la incidencia de la enfermedad en suelos sin ningún tipo de fumigación, cuando la fresa es cultivada año tras año sin rotación (De los Santos et al., 2012). En España, M. phaseolina no ha sido aislada de plantas procedentes de los viveros de altura, a diferencia del caso de Fusarium oxysporum (Redondo et al., 2012), por lo que la planta de la fresa podría no ser considerada como una fuente de inóculo para M. phaseolina. Los microesclerocios sirven como fuente primaria de inóculo y se ha demostrado que pueden persistir en suelo hasta más de tres años (Dhingra y Sinclair, 1975). Aunque, algunos autores describen una disminución significativa en el número de microesclerocios en residuos de suelo y de la planta en campo, pasados varios meses (Pratt, 2006). La supervivencia de los microesclerocios puede verse reducida considerablemente en suelos húmedos, no sobreviviendo durante más de 7 a 8 semanas, mientras que el micelio no es capaz de sobrevivir más de 7 días (Anónimo, 2014b). Aunque la longevidad de los microesclerocios no se conoce de manera fehaciente, en las condiciones del suroeste de España, la población de M. phaseolina aumentó año tras año, en suelos no fumigados, donde se cultiva fresa desde el año 2009 (datos no publicados). Short y colaboradores (1980), observaron en cultivos de la soja y del maíz, que las poblaciones de microesclerocios en suelo con capacidad germinativa estaban directamente relacionadas con el número de años que se mantuvo el cultivo, doblándose el número de microesclerocios tras dos años consecutivos con el mismo cultivo. Por otra parte, la severidad y la incidencia de la podredumbre carbonosa en soja y fresa están directamente relacionadas con la población de M. phaseolina en suelo, e inversamente relacionada con los Capítulo 1 21 rendimientos del cultivo (Miranda et al., 2012). Wyllie (1988) observó en el cultivo de la soja que 15 microesclerocios por gramo de suelo de M. phaseolina podría ser es un nivel aceptable y no afectar a la producción del cultivo. Los microesclerocios se producen en el tejido del huésped y se liberan al suelo cuando se produce la descomposición de la planta. Estas estructuras multicelulares permiten que persistencia del hongo en condiciones adversas: bajos niveles de nutrientes en suelo, temperatura por encima de 30ºC, entre otras. La germinación de los microesclerocios se da en un rango de temperaturas entre 25 y 35ºC, esto se produce en la superficie de la raíz cuando los tubos germinales forman los apresorios que son capaces de penetrar en la epidermis del huésped mediante presión mecánica, digestión enzimática o por las aberturas naturales del huésped (Bowers y Russin, 1999). El crecimiento de las hifas se produce intercelularmente en la corteza y luego intracelularmente a través del xilema que coloniza el tejido vascular. Una vez en el tejido vascular M. phaseolina se propaga a través de la raíz y el tallo inferior produciendo microesclerocios que conectan los vasos vasculares de la planta (Wyllie, 1988). La severidad de la enfermedad se ve afectada con las altas temperaturas y baja humedad del suelo, además de la obstrucción mecánica de los microesclerocios en los vasos del xilema, la producción de toxinas, la acción enzimática y la presión mecánica ejercida durante el desarrollo de la enfermedad (Anónimo, 2014 b). Figura. 1.9. - Microesclerocio de M. phaseolina en medio de cultivo de PDA. M. phaseolina es la especie tipo del género Macrophomina Petr., y es también el nombre asignado al coelomicete sinamorfo Rhizoctonia bataticola (Taubenh.) E.J. Butler (Crous et al., 2006). M. phaseolina produce un gran número de esclerocios, pero no da lugar a la producción de esporas (Rossman y Palm-Hernández, 2008). Por este motivo, se le relacionó con otros Capítulo 1 22 hongos formadores de esclerocios como Rhizoctonia solani J.G. Kühn, de la familia de los basidiomicetos (Rossman y Palm-Hernández, 2008). Según Wheeler (1975), M. phaseolina pertenecía a la división Eumicota, subdivisión Deuteromicotina, clase Coelomicetos, orden Sphaeropsidales (teniendo un conidioma picnidial), familia Sphaerioidacease, y género Macrophomina. Rossman y Palm-Hernández (2008) señalaron que en la integración de las especies asexuales, en una filogenia de ascomicetos, se hicieron evidentes algunas relaciones sorprendentes. Un ejemplo de una relación relevada usando datos de secuencia molecular (28S ADNr) es la inclusión de M. phaseolina, que causa la podredumbre carbonosa y la necrosis del tallo, en la familia ascomycete Botryosphaeriaceae, aunque, el teleomorfo es aún desconocido (Crous et al., 2006). De acuerdo con el Index Fungorum, la nueva posición de M. phaseolina en la clasificación taxonómica es: familia Botryosphaeriaceae, orden Botryosphaeriales, Incertae sedis, clase Dothideomicetos, subdivisión Pezizomicotina y división Ascomicota (Disponible online: http://www.indexfungorum.org). Según citan Crous y colaboradores (2006), von Arx (1981) introdujo el nombre Tiarosporella phaseolina (Tassi) van der Aa, para M. phaseolina, e incluyó el género Macrophomina como Tiarosporella Höhn. Este tratamiento ha sido en gran parte ignorado por la comunidad de patólogos de plantas y la comunidad micóloga, aunque von Arx (1987) lo siguió manteniendo. El género Tiarosporella se caracteriza por tener conidias formadas de conidióforos hialinos, de textura suave, con células que carecen de engrosamientos periclinales y proliferaciones, una forma de subcilíndrica a fusiforme y conidias con apéndices irregulares, mucoides y apicales (Nag Raj, 1993). Crous y colaboradores (2006) fueron capaces de inducir la esporulación de numerosas cepas de M. phaseolina sobre agujas de pino estériles, y descubrieron que las conidias formaban apéndices apicales mucoidales. Así que, M. phaseolina (Tassi) Goid. (= Tiarosporella phaseolina (Tassi) Van der Aa) pertenece a la forma anamorfa de los ascomicetos y se caracteriza por la producción tanto de picnidios como de eslerocios en tejidos huésped y en medios de cultivo (Ndiaye, 2007). El conidioma picnidial es de color marrón oscuro a negro, solitario o agregado, de hasta 200 μm de diámetro, además de poseer una apertura central u ostiolo, que tiene una pared multicelular gruesa. Las picnidiosporas tienen forma desde elipsoidal a ovoidal, y miden (16-)20-24(-32) × (6-)7-9(-11) μm; las conidias inmaduras son hialinas. Durante la formación esclerocial, 50–200 células individuales hifales se agregan creando cuerpos multicelulares llamados microesclerocios. Las microesclerocios, se producen en los tejidos huésped o en el suelo, son de color negro, rugosos, duros y su tamaño varía en función de los nutrientes disponibles en el sustrato donde se producen los propágulos. (Crous et al., 2006; Ndiaye, 2007). De acuerdo con la primera descripción de Maas (1998), M. phaseolina, aislada de plantas de fresa con síntomas de marchitamiento de las hojas y necrosis de la corona, produce sobre Capítulo 1 23 medio de cultivo patata-dextrosa agar (PDA) un micelio esponjoso y blanquecino. Al cabo de 3 días se forman esclerocios pequeños, negros, rugosos, con forma irregular. M. phaseolina aislado de plantas de fresas que mostraban síntomas de podredumbre carbonosa produjo numerosos esclerocios oscuros con formas alargadas e irregulares que median 55-67 a 170-190 μm de longitud y de 44-50 a 133-135 μm de anchura (Figura 1.9). Cuando los aislados fueron cultivados en un medio agar agua 1,5%, con paja de trigo deshidratada y esterilizada, se produjeron picnidios oscuros que formaban conidias cilíndricas, ostioladas e hialinas y unicelulares (Baino et al., 2011; Koike, 2008; Mertely et al., 2005). Mertely y colaboradores (2005) y Baino y colaboradores (2011) observaron picnidios visiblemente ostiolados, con una forma generalmente elipsoidal, hialinos y que ocasionalmente o raramente se desarrollan en los tejidos huésped afectados después de 8 a 10 días de incubación. Las colonias en medio de cultivos tienen una coloración desde blanco a marrón o gris y oscurecen con el paso del tiempo. Las hifas se ramifican y forman generalmente ángulos rectos, aunque puede también observarse en ángulos agudos. Crous y colaboradores (2006), señalaron las diferencias entre Tiarosporella y Macrophomina, que produce normalmente picnidios con proliferación de células conidiógenas y conidios que se vuelven de color marrón oscuro y pierde sus apéndices apicales en la madurez. Principalmente debido a estas diferencias el género Macrophomina y el nombre M. phaseolina se ha mantenido. Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid., Annali Sper. agr. N.S. 1:457. 1947. Basionym: Macrophoma phaseolina Tassi, Bull. Lab. Ort bot. Siena IV:9. 1901. = Tiarosporella phaseoli (Maubl.) Aa, Verh. Kon. Ned. Akad. Wetensch., Sectie 2, 68:4. 1977. Sinónimos adicionales fueron indicados por Holliday y Punithalingam (1988). Aunque sólo una especie (phaseolina) está reconocida dentro del género Macrophomina (Sutton, 1980), se observa una gran variabilidad en la morfología y la patogenicidad entre aislados procedentes de diferentes huéspedes (Fernández et al., 2006). Utilizando patrones restringidos con fragmentos amplificados de ADN por PCR cubriendo el espacio transcrito de la región interna, 5.8S ARNr y parte de 25S ARNr, no se observaron variaciones entre aislados de M. phaseolina procedentes de soja, maíz, sorgo, tejidos de raíz de algodón, ni suelo de campos infestados, sugiriendo que M. phaseolina constituye una sola especie (Su et al., 2001). Según Rayatpanah y colaboradores (2012), la diversidad genética del hongo M. phaseolina podría favorecer su supervivencia y adaptación a diferentes entornos, debido a las diferencias morfológicas, fisiológicas, patogénicas, y a su diversidad genética. Sin embargo, no hay evidencias claras que sugieran la existencia de formas especiales, subespecies o razas Capítulo 1 24 fisiológicas. Muñoz-Cabañas y colaboradores (2005) concluyeron que, M. phaseolina mostró una cierta especialización patogénica, pero no diferentes razas genéticas. 1.4. – Objetivos. La finalidad de este trabajo es determinar la eficacia de métodos de desinfesción de suelo en el control de las poblaciones de M. phaseolina en suelo, la incidencia de podredumbre carbonosa y la influencia de los mismos en la producción, así como analizar la respuesta de resistencia o susceptibilidad de variedades de fresa a dicho patógeno y determinar las posibles diferencias entre aislados del patógeno, concretándose en los siguientes objetivos parciales: 1. Determinar la eficacia de los tratamientos de desinfesción en el control de las poblaciones de M. phaseolina en suelo. 2. Evaluar la incidencia de podredumbre de corona (podredumbre carbonosa, “charcoal rot”) en plantas de fresa en suelos fumigados. 3. Analizar el efecto de los tratamientos de desinfesción de suelo en los rendimientos del cultivo. 4. Determinar la relación entre la población de M. phaseolina en suelo con la incidencia de podredumbres de corona, así como con los rendimientos del cultivo. 5. Determinar la respuesta de resistencia/susceptibilidad de variedades de fresa de uso común a M. phaseolina. 1.5. – Estructura de la tesis. Atendiendo a los objetivos descritos, la presente Tesis Doctoral recoge un compendio de capítulos que corresponden a diferentes artículos científicos que se encuentran en proceso de revisión en revistas internacionales de reconocido prestigio. En este primer capítulo se pretende ofrecer una visión general de la situación actual del cultivo de la fresa, y de la desinfesción de suelo y sus posibles alternativas, así como revisar los conocimientos sobre M. phaseolina y la podredumbre carbonosa. En el capítulo 2, titulado “Evaluación de tratamientos de biosolarización para el control de podredumbre carbonosa (agente causal: M. phaseolina) en fresas”, se recogen los trabajos realizados, durante tres campañas agrícolas, en la finca de El Cebollar, situada en Moguer (Huelva), donde se ha estudiado la eficacia de diferentes tratamientos de biosolarización en el control de M. phaseolina. Capítulo 1 25 En el capítulo 3, “Evaluación de tratamientos químicos y de biosolarización para el control de M. phaseolina en el cultivo de la fresa”, se muestran los resultados de tres años de ensayos, durante los que se ha estudiado la eficacia de tratamientos de tipo químico y biológico. Estos trabajos se realizaron en dos fincas, Occifresa situada en Moguer y Fres-Gómez en Palos de la Frontera, con diferentes historiales previo de desinfesción de suelo. En el capítulo 4, “Evaluación de la resistencia de cultivares de fresa a M. phaseolina, agente causal de podredumbre carbonosa”, se ha analizado la respuesta de cultivares comerciales de fresa a M. phaseolina, en condiciones controladas y en campo, en suelos naturalmente infestados. De dos estancias en Gulf Coast Research and Education Center - University of Florida, ha nacido el capítulo 5, “Eficacia de fumigantes alternativos al bromuro de metilo, en el control de Macrophomina phaseolina, en cultivos de fresa en florida”, que recoge los resultados de los ensayos realizados durante dos campañas. Se ha testado la eficacia de diferentes fumigantes químicos y distintas formas de aplicación en la erradicación de varios tipos de inóculo de M. phaseolina, enterrado en los lomos antes de la aplicación de los tratamientos. Por último, en el capítulo 6, se recogen las conclusiones que se derivan de estos trabajos. 1.6. – Bibliografía. Agostini, A. 2011. 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Después del abandono del BM, como principal fumigante de suelo, algunos autores han asociado los cambios en las formas y en la dosis de aplicación de los productos utilizados para la fumigación en la desinfesción de suelos con la aparición y el establecimiento de M. phaseolina. Además, en los países desarrollados, la mayoría de los fumigantes químicos considerados como alternativas viables, no podrán ser utilizados en un futuro, debido principalmente a las restricciones impuestas por la UE. Entre las alternativas no químicas, para la producción de fresa, se encuentra la biosolarización del suelo, una nueva técnica que combina otras dos: la biofumigación y la solarización. En este estudio, se compara la eficacia de diversos tratamientos de biosolarización en el control de M. phaseolina durante tres campañas sucesivas en una finca experimental, cuyos suelos no han sido tratados con productos de síntesis, ubicada en Moguer, en la provincia de Huelva. La influencia de estos tratamientos en la población de M. phaseolina en suelo, el desarrollo de la podredumbre carbonosa en corona y la producción de fruta en fresa, se determinó en las campañas agrícolas 2009, 2010 y 2011. El suelo fue biofumigado mediante enmiendas con estiércol freso de pollo (gallinaza) a 12.500kg/ha, con o sin Trichoderma spp (TUSAL®) a 3,5kg/ha; gallinaza a 25.000kg/ha; “pellets” de Brassica spp. (BIOFENCE®) a 2.000kg/ha ó 15.000kg/ha; orujillo de olivo a 12.500kg/ha o vinaza de azúcar de remolacha a 15.000kg/ha. El suelo fue posteriormente solarizado durante 30 días, mediante una cubierta con plástico transparente. El control no tratado, recibió estiércol fermentado pero no fue solarizado. Los tratamientos redujeron o estabilizaron la población de M. phaseolina en suelo comparándolas con el control. Los tratamientos de biosolarización con gallinaza a 25.000kg/ha o vinaza de azúcar de remolacha a 15.000kg/ha redujeron significativamente la incidencia de podredumbre carbonosa con respecto al control no tratado. Los rendimientos obtenidos en la enmienda de gallinaza (entre 59.319 to 89.421kg/ha) fueron similares a los previamente citados para la fumigación química estándar con 1,3-dicloropropeno:cloropicrina. Por lo tanto, la Capítulo 2 36 biosolarización con gallinaza podría ser una opción prometedora y apropiada para el cultivo de la fresa en zonas de clima templado-cálido. Abstract Macrophomina phaseolina, the causal agent of charcoal rot, is a primarily soil-borne pathogen. Charcoal rot has become increasingly troublesome in strawberry in Spain, where it was reported for the first time in 2006, and worldwide. After the phase out of methyl bromide, some authors have associated the changes in the fumigation products used and methods of applying them prior to planting strawberries with the establishment of M. phaseolina. Moreover, in developed countries, the majority of useful chemical alternatives are futureless, because of the regulatory restrictions. Among the non-chemical alternatives for strawberry fruit production is soil biosolarization, a new technique combined soil biofumigation and soil solarization. In this study, we compared the efficacy of several biosolarization treatments to control M. phaseolina for three successive seasons in a non-chemical treated field near Moguer, Huelva (southwestern Spain). The influence of these treatments on M. phaseolina soil population, charcoal rot development, and strawberry yield was assessed each year. Soil was biofumigated by amendment of fresh chicken manure at 12,500kg/ha with or without Trichoderma spp (TUSAL®) at 3,5kg/ha; fresh chicken manure at 25,000kg/ha; Brassica spp. pellets (BIOFENCE®) at 2,000kg/ha and 15,000kg/ha; dried olive pomace at 12,500kg/ha or sugar beet vinasse at 15,000kg/ha. Soil was then solarized for 30 days by covering with a clear plastic mulch. A control that received fermented manure remained uncovered. The treatments reduced or stabilized M. phaseolina sclerotia populations in soil compared to untreated control. Treatments which combined biosolarization with chicken manure at 25,000kg/ha or sugar beet vinasse at 15,000kg/ha reduced significantly the incidence of charcoal rot compared to untreated control. Furthermore, yields obtained by amendment with fresh chicken manure (59,319 to 89,421kg/ha) were also similar to the yields previously reported for the standard chemical fumigation with 1,3-dichloropropene:chloropicrin. Therefore, biosolarization with fresh chicken manure could be a promising and sustainable option for strawberry crops grown in warm temperate climate areas. Capítulo 2 37 2.2. - Introducción La fresa (Fragaria x ananassa Duch.) es uno de los cultivos más importantes en la provincia de Huelva (suroeste de España), con 7.000 ha cultivadas en 2011 y una producción de 231.732 TM (Anónimo, 2011). La producción de fresa, en ese año se valoró en 300 millones de euros (Uclés et al., 2011) La podredumbre carbonosa ocasionada por M. phaseolina comienza a ser considerada un problema para el cultivo de la fresa, en todas las zonas donde se cultiva. M. phaseolina es un patógeno de suelo, ubicuo y con un amplio rango de huéspedes, que afecta a más de 500 especies cultivadas y silvestres, es de gran longevidad en suelo y con capacidad saprofítica altamente competitiva (Su et al., 2001). Los síntomas en fresa consisten en marchitamiento foliar, secado y muerte de las hojas más viejas, seguido de un eventual colapso y muerte de la planta (Koike, 2008). En corte longitudinal de la corona, se observa una coloración negra o marrón que indica necrosis en los tejidos corticales y vasculares (Mertely et al., 2005) (Figura 2.1). Esta enfermedad también puede ocasionar necrosis en las raíces de la planta (Avilés et al., 2008). Figura 2.1. - En corte longitudinal, necrosis en corona de fresa ocasionada por M. phaseolina. M. phaseolina está considerado como un patógeno de climas cálidos y algunas de las primeras informaciones sobre este hongo en fresa provenían de India y Egipto, donde las altas Capítulo 2 38 temperaturas del suelo y las condiciones de baja humedad son características. Posteriormente, se ha citado en países con climas más fríos, como Francia y España (Zveibil et al., 2012). Las condiciones medioambientales como temperatura, humedad atmosférica y la humedad disponible en el suelo, juegan un papel importante en la dispersión y multiplicación de M. phaseolina (Khan, 2007). El desarrollo de la enfermedad se puede ver favorecido por algunas combinaciones de estrés térmico, déficit de agua en el suelo, suelos de textura ligera o estrés asociado con la reproducción del huésped (Mihail, 1989). Así, se relaciona la dominancia de este patógeno con los meses más cálidos del año, a finales de primavera o a principios de verano cuando la temperatura, a menudo, excede de los 30ºC, coincidiendo con la mayor mortalidad de plantas en el cultivo de la fresa (Fang et al., 2011). Concretamente, en el suroeste de España, los síntomas de podredumbre carbonosa aparecen en los campos de producción de fruto de fresa en los meses de Abril y Mayo, cuando las temperaturas exceden de 25ºC (Miranda et al., 2012). M. phaseolina sobrevive en el suelo y en restos de plantas infectadas como microesclerocios. Estos microesclerocios son estructuras de resistencias que permiten al hongo vivir durante largos periodos de tiempo en el suelo (Dhingra y Sinclair, 1975; Zveibil et al., 2012). Una baja densidad de inóculo en el suelo, puede ser suficiente para ocasionar síntomas de podredumbre carbonosa en la planta, especialmente cuando el huésped es altamente susceptible, como es el caso de Euphorbia lathyris. En este cultivo, se ha demostrado que densidades de esclerocios inferiores a 1 microesclerocio por gramo de suelo pueden ocasionar más de un 90% de muerte de plantas (Young y Alcorn, 1984). Sin embargo, Wyllie (1988), determinó que 15 microesclerocios por gramo de suelo pueden ser un nivel aceptable y no afectar a la producción en el cultivo de soja. Los microesclerocios son producidos en el tejido huésped y liberados al suelo cuando la planta infectada muere. Cuando el material vegetal se descompone, estas estructuras de resistencia se mantienen en el suelo durante largos periodos de tiempo, siendo el inóculo primario en las siguientes campañas agrícolas (Zveibil et al., 2012). Se ha demostrado que los cultivos susceptibles a este patógeno influyen en la densidad y la dinámica del inóculo de M. phaseolina en el suelo, así en el caso de la soja, se detectan incrementos de la población del patógeno en el suelo en monocultivo (Mihail, 1989). Según Mihail y Alcorn (1987), los microesclerocios muestran un patrón espacial en el suelo en forma de agregados, exhibiendo un gradiente muy variable en las parcelas experimentales. En los campos de fresas infestados, generalmente se observan pequeños parches, en áreas concretas, con plantas sintomáticas. Sin embargo, en zonas donde la enfermedad se ha desarrollado durante más de una campaña, la distribución puede ser más amplia, extendiéndose el inóculo desde el área inicialmente infestada (Koike, 2008). Probablemente, las labores de labranza realizadas al inicio de cada nueva campaña contribuyen a la redistribución vertical y horizontal Capítulo 2 39 de los patógenos en el suelo (Koike, 2008). En la mayoría de las zonas donde se cultiva la fresa, el sistema de cultivo es anual, sin rotación. Este cultivo intensivo combinado con las altas temperaturas alcanzadas durante la campaña, crea unas condiciones óptimas para el desarrollo y la multiplicación de patógenos de suelo como M. phaseolina (Zveibil et al., 2012). El resultado es un daño extensivo y la reducción de la producción en las mayores áreas de producción de fruto de fresa en Europa y la zona mediterránea (Santos et al., 2006) La podredumbre carbonosa en la fresa ha sido detectada en los últimos años en: Argentina (Baino et al., 2011), Australia (Golzar et al., 2007), California (Koike, 2008), Florida (Mertely et al., 2005), Grecia (Tjamos et al., 2006), Italia (Angelini y Faedi, 2010), Irán (Sharifi y Mahdavi, 2011), Israel (Zveibil y Freeman, 2005), España (Avilés et al., 2008), Turquía (Benlioğlu et al., 2004). En EEUU, M. phaseolina fue aislado, por primera vez en 2001, de plantas marchitas y muertas procedentes de un campo de producción de fruto de fresa, en Florida (Mertely et al., 2005). Posteriormente, Koike (2008) observó plantas de fresa decaídas y enfermas en campos comerciales del suroeste de California. Aún no está suficientemente claro si esta reciente aparición de información sobre la podredumbre carbonosa es debida al incremento de la dispersión del patógeno, la prohibición del BM o el creciente conocimiento de la misma como nueva enfermedad en la fresa. Tras la prohibición y retirada del bromuro de metilo (BM) en 2005 en los países desarrollados, el manejo de algunas enfermedades relacionadas con patógenos de suelo, incluida la podredumbre carbonosa ha empezado a convertirse en un serio problema. Algunos autores han asociado los cambios en los productos usados para la fumigación de suelo y en los métodos de aplicación, con la emergencia de la podredumbre carbonosa ocasionada por M. phaseolina en fresa (Avilés et al., 2008; Koike, 2008; Mertely et al., 2005; Zveibil y Freeman, 2005). El cultivo de la fresa ha sido altamente dependiente de la utilización de BM en la desinfesción de suelo. Como resultado del Protocolo de Montreal y la Regulación de la Comunidad Europea (CE) nº 2037/2000 del 29 de Junio sobre sustancias que deterioran la capa de ozono, la prohibición del uso de BM para la producción de fresas fue irreversible en países de la Unión Europea (UE) desde 2007 (Decisión de la Comisión (Comunidad Europea), 2006). Desde entonces, se han utilizado con éxito otros tratamientos químicos en España, principalmente la mezcla de 1,3-dicloropropeno (1,3 D) más cloropicrina, cloropicrina, Dazomet más 1,3 D, y metan sodio (datos no publicados). La re-evaluación de los pesticidas en la UE ha reducido drásticamente la disponibilidad de fumigantes en Europa. Actualmente, los únicos fumigantes autorizados y con restricciones son los generadores de metil isocianato: dazomet, metam sodio y metam potasio. Dazomet fue el primero autorizado como fumigante de suelo en 2011, seguido de las sales de metam potasio y sodio en 2012. Los dos últimos están autorizados para aplicaciones previas a plantación, pero solo podrán ser utilizados una vez cada tres años en el Capítulo 2 40 mismo terreno y bajo plástico. Aunque, 1,3 D y cloropicrina han sido utilizados como las principales alternativas al BM, están excluidas del Anexo I desde 2010 y 2013, respectivamente, manteniéndose los “usos de emergencia nacional”, mediante permisos temporales renovables de 120 días por año para la industria agrícola, en algunos países (Italia, España y Grecia) (Colla et al., 2012). En ensayos llevados a cabo en el suroeste de España, los tratamientos de suelo preplantación con cloropicrina, 1,3 D:cloropicrina, dimetil disulfuro:cloropicrina, ioduro de metilo + cloropicrina o Dazomet (incorporado al suelo con Mix-Tiller), no solo redujeron la población de M. phaseolina en el suelo, sino que mantuvieron estos bajos niveles del patógeno hasta finales de campaña (final de Mayo). Así, mientras que la mortalidad de plantas del cultivar ‘Camarosa’ fue el 20% en suelos no tratados, en los suelos fumigados no alcanzó al 10%, y en los suelos fumigados con dazomet no se detectaron plantas muertas (Miranda et al., 2012). Zveibil et al. (2012), estudiaron el efecto de varios fumigantes químicos en el control de M. phaseolina. Metam sodio y BM fueron los más efectivos, consistentemente, en la erradicación de varios tipos del inóculo de M. phaseolina (microesclerocios, coronas y estolones naturalmente infectados). Sin embargo, la fumigación con cloropicrina o la combinación de 1,3 D:cloropicrina no fueron tan efectivos como los tratamientos con metam sodio o BM, a las distintas profundidades en este estudio. Se han estudiado diversas aproximaciones a la producción de fresa sin BM u otros químicos, como por ejemplo: cultivo sin suelo, desinfesción anaeróbica, desinfesción por vapor, solarización, biofumigación y uso de herbicidas. Las investigaciones en la búsqueda de alternativas en la desinfesción de suelos han sido muy intensas en países como EEUU (Ajwa et al., 2003; Duniway, 2002) y España (López-Aranda et al., 2009; Medina et al., 2012a; Medina et al., 2012b). A pesar de todos los esfuerzos realizados, la mayoría de las alternativas no han alcanzado, de forma consistente, la misma capacidad como fumigante de amplio espectro (patógenos de suelo, plagas y malas hierbas) que presentaba el BM. La solarización del suelo es una aproximación no química para la desinfesción del suelo. Esta técnica es una práctica de manejo del suelo que se lleva a cabo en los meses de verano para facilitar el crecimiento de los cultivos en el otoño. Se lleva a cabo cubriendo el suelo con un plástico transparente, con la finalidad de captar la radiación solar y acumular calor, así la temperatura del suelo se ve incrementada hasta niveles letales para muchas de las plagas y patógenos que afectan a las plantas (Katan, 1981). Se recomienda mantener esta cubierta plástica durante 30-45 días, en los meses donde la temperatura del suelo excede los 50ºC (Medina, 2002). Los suelos solarizados son, a menudo, más supresivos frente a numerosos patógenos de plantas que los no solarizados. Los cambios en la microflora del suelo, que se Capítulo 2 41 producen tras la solarización podrían incrementar el crecimiento de las plantas e inducir la supresividad frente a patógenos. Según estudios previos, realizados en campos de fresa, cuando la solarización se repite durante dos o más años consecutivos en una misma parcela, ejerce un control efectivo sobre hongos patógenos como Phytophthora spp., Pythium spp., Rhizoctonia spp. y Cylindrocarpon spp. (Ben-Yephet et al., 1987; Gamliel y Stapleton, 1993 b; Pinkerton et al., 2002; Su et al., 2001). La solarización puede no ser totalmente efectiva en el control de M. phaseolina, especialmente en las capas más profundas del suelo (Lodha et al., 1997; Yildiz et al., 2010). En campos de fresa, la solarización no redujo la viabilidad de M. phaseolina en suelo a profundidades de 10 a 20cm, sin embargo, se determinó una reducción significativa (66%) en la supervivencia a 5cm de profundidad (Young y Alcorn, 1984). De otra parte, el efecto combinado de la solarización y la irrigación del suelo resulta, en la mayoría de los casos, en una completa erradicación de la población de M. phaseolina a profundidades de suelo entre 0-30cm (Lodha et al., 1997). La biofumigación es una técnica que utiliza como fumigantes para el control de patógenos de suelo, las sustancias volátiles y otros productos que se originan en el suelo como consecuencia de la biodegradación de enmiendas orgánicas y otros residuos (Bello et al., 2004). Los compuestos de nitrógeno (como amonios y nitratos), los ácidos orgánicos y un gran número de sustancias son responsables de esta actividad biocida (Mian et al., 1982). La biofumigación es una aproximación del uso de plantas que contienen sustancias biológicamente activas y específicas para el control contra hongos, nematodos y plagas de los cultivos agrícolas. El principio de la biofumigación se basa en el uso de plantas con altos niveles de glucosinolatos, compuestos de azufre que se producen de forma natural en las plantas naturalmente y que mejoran la protección de la planta. Cuando las plantas se incorporan al suelo, estos glucosinolatos son hidrolizados por la enzima de la planta “mirosinasa”, a pH neutro, que produce sustancias químicas activas y volátiles, como los isocianatos. Las especies de plantas más efectivas son las del genero Brassica, entre ellas B. napus y B. oleracea (Bianco et al., 2000; Mazzola, 2011 a). Las enmiendas con harina de semillas del genero Brassicaceae suprimieron la proliferación de M. phaseolina en el suelo (Mazzola, 2011 b). Además de los residuos de Brassicaceae, se han ensayo otros materiales orgánico como productores de compuestos biofumigantes para la desinfesción del suelo, entre estos compuestos orgánicos se incluyen los compost o enmiendas verdes, enmiendas animales (como la gallinaza) y residuos agroindustriales como cáscara de arroz, piel de cítricos, etc. Pratt (2006), demostró que el uso de los residuos de las aves domésticas de corral, produjo un control eficaz de los microesclerocios de M. phaseolina en suelo. Estas enmiendas orgánicas animales, redujeron la supervivencia de los microesclerocios en el suelo, trece días después de su aplicación. Capítulo 2 42 Para el control de patógenos de suelo se estudia la aplicación del tratamiento de solarización integrado con el uso previo de distintas enmiendas orgánicas como las citadas anteriormente (Medina et al., 2009; Ndiaye et al., 2007). La combinación de solarización con aplicaciones de materia orgánica es lo que se conoce como solarización biológica o biosolarización (Ros et al., 2008). Lodha et al. (1997), demostraron la eficacia de la aplicación de riego en verano y la posterior solarización del suelo, combinada con el aporte de residuos de especies de crucíferas en el control de M. phaseolina. En suelos biosolarizados con esta técnica, las poblaciones de M. phaseolina fueron casi totalmente erradicadas (93-99%) a profundidades de entre 0-15 y 16-30cm. En campos experimentales de fresas, la desinfesción anaeróbica del suelo con desechos de aves de corral aplicados en los lomos obtuvieron rendimientos muy similares comparados al tratamiento estándar con 1,3 D:cloropicrina. La supervivencia del inóculo de F. oxysporum y M. phaseolina se redujo significativamente con ambos tratamientos al compararlos con el control no tratado. La desinfesción anaeróbica fue uno de los tratamientos más eficaces en la eliminación de M. phaseolina (Rosskopf et al., 2011). Recientemente, Zveibil et al. (2012) han sugieren que períodos prolongados de biosolarización pueden ser un método alternativo en el control de M. phaseolina. Sin embargo, esta técnica no debería afectar a la producción del cultivo para que sea considerada como una alternativa viable a los productos químicos en el cultivo de la fresa. Algunas cepas del agente de biocontrol Trichoderma spp. han sido probadas contra M. phaseolina aislada de diferentes cultivos (Elad et al., 1986; Sandoval y López, 2000). La aplicación al suelo de la formulación en forma de granulado o compost seco de T. harzianum, T. polysporum y T. viride controlaba la necrosis de raíz, ocasionada por M. phaseolina, en el cultivo de berenjena (Solanum melongena L.) en condiciones de campo (Ramezani, 2008). Desde la campaña 2006-07, y en un campo experimental ubicado en Moguer (Huelva), se ha analizado la eficacia de diferentes tratamientos de biosolarización en el control de hongos patógenos de suelo. La podredumbre carbonosa se detectó por primera vez en este campo durante la campaña 2009-10. El objetivo del presente estudio, fue evaluar los efectos de la aplicación repetida de distintos tratamientos de biosolarización sobre: las poblaciones de M. phaseolina en suelo, la incidencia de podredumbre carbonosa y la producción de fruto en el cultivo de la fresa en un clima templado. 2.3. - Materiales y métodos 2.3.1. - Parcela experimental. Los ensayos de campo se llevaron a cabo en la finca experimental “El Cebollar”, perteneciente al Instituto Andaluz de Formación Agraria y Pesquera (IFAPA), que se ubica en Moguer, Capítulo 2 43 Huelva (longitud 6º 48'1'' O, latitud 37º 14'25'' N) (Figura 2.2). Los trabajos se realizaron durante tres campañas agrícolas desde 2009 hasta 2011. En los tres años, los tratamientos se aplicaron en las mismas parcelas. El suelo estaba compuesto por: 90,1% de arena, 7,2% de arcilla, y 2,8% de limo; pH de 6,5; con un contenido de materia orgánica de 0,26%; nitrógeno total 0,02%; fósforo 68mg/kg y una conductividad eléctrica de 0,19mmhos/cm. Figura 2.2. - Vista aérea de la Finca Experimental “El Cebollar” (Moguer, Huelva). Los suelos de esta finca experimental nunca han sido fumigados con productos de síntesis. En Julio de 2005, el suelo fue biosolarizado con una enmienda de gallinaza a 30.000kg/ha. Desde 2006-07, se han llevado a cabo en esta parcela ensayos con diferentes tipos de biosolarización. El control no tratado y el tratamiento de biosolarización con enmienda de gallinaza a dosis alta, se han superpuesto en las mismas parcelas y repeticiones desde 2006-07, mientras que la biosolarización con pellets de Brassica spp. (BIOFENCE ®) a 2.000kg/ha, se aplicó por primera vez en 2008-09 (López-Aranda, 2012). M. phaseolina se detectó por primera vez en este campo experimental en la campaña 2009-10. 2.3.2. - Diseño experimental y descripción de los tratamientos. Se aplicó un diseño experimental en bloques al azar, con cuatro repeticiones, incluyendo un testigo (control) al que se aplicó estiércol fermentado y que no fue solarizado. Las dimensiones de parcelas elementales eran 6m de largo y 3,3m de ancho, con tres lomos y, en cada uno, dos filas de plantas (marco de plantación de 25  25 cm) y 140 plantas cada parcela. En cada campaña se ensayaron un total de seis tratamientos. Durante las tres campañas se repitieron cuatro tratamientos: biosolarización con estiércol fresco de pollo (gallinaza) a 25.000kg/ha (GALL-DA); biosolarización con gallinaza a 12.500kg/ha (GA-DB); biosolarización con vinaza de remolacha a 15.000kg/ha (VIN); y biosolarización con pellets de Brassica spp. (BIOFENCE®) a 2.000kg/ha (BP-DB). Durante la campaña 2009-10, se Capítulo 2 44 aplicaron otros dos tratamientos: uno mediante biosolarización con pellets de Brassica spp. (BIOFENCE®) a 15.000kg/ha (BP-DB), y otro mediante biofumigación en lomo, bajo plástico negro, con BIOFENCE® a 2.000kg/ha, sin solarización del suelo (BP-DBLM). Estos dos tratamientos fueron reemplazados en las campañas 2010-11 y 2011-12 por tratamientos de biosolarización con gallinaza a 12.500kg/ha más Trichoderma spp. (TUSAL®, Certis, España: 1 • 1011 ufc de la cepa T11 + 1 • 1011 ufc de la cepa T25/ha) a 3,5kg/ha (GALL-DB+TR), y biosolarización con alperujo de olivo a 12.500kg/ha (AL-O), respectivamente. Todos los tratamientos se superponen en las mismas parcelas y repeticiones cada año (Tabla 2.1) (Figura 2.3). Tabla 2.1. - Tratamientos aplicados al suelo en campo de producción de fruto de fresa (Moguer, Huelva). Tratamientos Descripción Dosis (kg/ha de superficie tratada) Método de aplicación 2009 2010 2011 C Control no tratado --- GALL-DA Biosolarización con gallinaza 25.000 25.000 25.000 Pre-plantación Toda superficie GALL-DB Biosolarización con gallinaza 12.500 12.500 12.500 Pre-plantación Toda superficie GALL-DB+TR Biosolarización con gallinaza +Trichoderma (TUSAL®) --- 12.500 + 3,5 12,500 + 3,5 Pre-plantación Toda superficie + Riego por goteo VIN Biosolarización con vinaza de remolacha 15.000 15.000 15.000 Pre-plantación Toda superficie AL-O Biosolarización con alperujo de olivo --- 12.500 12.500 Pre-plantación Toda superficie BP-DA Biosolarización con pellets de Brassica spp. (BIOFENCE®) 15.000 --- --- Pre-plantación Toda superficie BP-DB Biosolarización con pellets de Brassica spp. (BIOFENCE®) 2.000 2.000 2.000 Pre-plantación Toda superficie BP-DBLM Biofumigación con pellets de Brassica spp. (BIOFENCE®) 2.000 --- --- Bajo lomo, con plástico negro, sin solarización Capítulo 2 51 2.3.7. - Análisis estadístico. La incidencia de la podredumbre carbonosa, se expresó como porcentaje acumulado de las plantas muertas. Los datos de porcentaje, se transformaron mediante la transformación arcoseno antes del análisis de la varianza (ANOVA). El ANOVA se realizó para las UFC/g de M. phaseolina y el rendimiento total de fruta comercializable. Los datos de población del suelo fueron transformados mediante la transformación raíz cuadrada. Cuando el estadístico F de un ANOVA fue significativo a P < 0,05, las medias se compararon mediante la prueba de la mínima diferencia significativa (MDS) de Fischer, a un nivel de significación del 5%. Las correlaciones entre la población de M. phaseolina en suelo y el porcentaje de plantas muertas o la producción de fruta se determinaron utilizando el coeficiente de correlación de Kendall y Spearman (De los Santos et al., 2003). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa “Statistix” vs 8.0 (Analytical Software, Ltd., La Jolla, CA, EE.UU.). 2.4. - Resultados 2.4.1. - Determinación de las poblaciones de M. phaseolina en suelo. En las muestras de suelo tomadas antes de la aplicación de los tratamientos, el rango del número medio de propágulos de M. phaseolina por gramo de suelo se encontró entre 0-12, 0- 58 y 0-26 UFC/g, en 2009-10, 2010-11 y 2011-12, respectivamente. Sólo en la primera campaña se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos, en las poblaciones de M. phaseolina en el suelo (Tabla 2.2). En 2009-10, antes de la aplicación de los tratamientos de biosolarización, las poblaciones de M. phaseolina fueron más altas en los suelos correspondientes al tratamiento con BP-DBLM y al control, con 7,5 y 3,0 UFC/g, respectivamente. Después de la aplicación de los tratamientos, estos valores se incrementaron hasta 10,0 y 18,7 UFC/g, respectivamente. El resto de los tratamientos disminuyeron la población de suelo de M. phaseolina hasta valores iguales o inferiores a 1,0 UFC/g. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre control y el resto de los tratamientos. En las muestras tomadas en Mayo 2010, se obtuvieron resultados similares, aunque se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos y el control, con la excepción de BP-DBLM (Tabla 2.2). En 2010-11, antes de que los tratamientos de biosolarización fueran aplicados, las poblaciones de M. phaseolina fueron más altas en el control (19,5 UFC/g) y en las parcelas correspondientes al tratamiento AL-O (12,5 UFC/g). Después de la biosolarización con AL-O, el número de propágulos se redujo a 1,0 CFU/g, manteniendo esta eficacia hasta el final de la campaña. Capítulo 2 52 En 2011-12, la densidad de M. phaseolina en suelo antes de la aplicación de los tratamientos, fue de 11,0 y 6,5 UFC/g, en el control no tratado y AL-O, respectivamente (Tabla 2.2). Durante las dos últimas campañas agrícolas, la mayoría de los tratamientos de biosolarización redujeron significativamente los niveles de M. phaseolina en suelo respecto al control no tratado, con la excepción de GALL-DB. Al final de ambas campañas (muestreos de mayo), los valores en todos los tratamientos fueron significativamente distintos a los del control. Las poblaciones de M. phaseolina en suelo fueron inferiores a 2,0 UFC/g en todos los tratamientos, manteniéndose altas en las parcelas control (18,5 y 20,5 UFC/g en 2010-11 y 2011-12, respectivamente) (Tabla 2.2). Tabla 2.2.- Población de Macrophomina phaseolina (UFC/g de suelo seco) antes y después de los tratamientos de biosolarización, y al final de cada campaña en suelos donde se cultiva fresa, en tres campañas consecutivas y. Tratamientos z 2009/10 2010/11 2011/12 Antes Después Final Antes Después Final Antes Después Final Control 3,0ab 18,1 11,5a 19,5 21,5a 18,5a 11,0 22,4a 20,5a GALL-DA 0,0b 0,5 1,0b 0,0 0,0b 0,0b 0,5 0,0b 0,5b GALL-DB 2,5ab 0,0 0,0b 0,5 7,0ab 0,0b 1,0 2,5b 0,5b GALL-DB+TR --- --- --- 0,0 1,0b 0,0b 0,0 0,5b 0,0b VIN 0,0b 0,0 0,0b 0,0 0,0b 0,0b 1,5 0,0b 0,5b AL-O --- --- --- 12,5 1,0b 1,0b 6,5 3,0b 0,0b BP-DA 0,5b 1,0 0,0b --- --- --- --- --- --- BP-DB 0,5b 0,0 0,5b 0,5 0,5b 2,0b 0,5 0,0b 0,0b BP-DBLM 7,5a 10,0 15,0a --- --- --- --- --- --- y Unidades formadoras de colonias de M. phaseolina por gramo de suelo seco. Cada valor es la media de cuatro parcelas y cinco repeticiones. Los valores seguidos por la misma letra en una columna no difieren significativamente según la prueba MDS (P < 0,05) (datos transformados mediante raíz cuadrada). Se presentan los datos no transformados. “---” = no determinado z Los detalles de los tratamientos se describen en la Tabla 2.1. 2.4.2.- Incidencia de podredumbre carbonosa. No se detectó M. phaseolina en los aislamientos realizados a plantas procedentes de vivero y muestreadas antes de la plantación, en cada campaña. En 2009-10, las primeras plantas con síntomas de marchitamientos o decaimiento, se detectaron el 24 de Marzo, con un máximo de 2,9% de plantas muerta en las parcelas control (Figura 2.10). En los días anteriores, la Capítulo 2 53 temperatura máxima media (Tª max) fue de 25ºC y la humedad relativa media (HRmn) del 78,0%. Desde mediados de marzo hasta final de campaña, las temperaturas máximas variaron entre 25 y 34ºC y el promedio HRmn fue de 58,0%. Durante este período, la mortalidad tuvo un gran incremento y alcanzó el 28,2% en las parcelas control. La mortalidad en las parcelas biofumigadas con BP-DBLM alcanzó el 29,5%. La incidencia de la enfermedad en los tratamientos aplicados a toda superficie fue significativamente inferior (Figura 2.11, Tabla 2.3). Se encontró una correlación positiva y significativa entre el porcentaje de plantas muertas acumulado (al final de la campaña) y el número de microesclerocios de M. phaseolina en suelo (muestreos de octubre y mayo) (coeficiente de correlación de Spearman de 0,5885 (P < 0,0023) y 0,7133 (P < 0,0001), respectivamente). Figura 2.10.- Plantas del cultivar ‘Camarosa’ con síntomas de podredumbre carbonosa. En 2010-11, las primeras plantas sintomáticas se detectaron el 29 de marzo, con un porcentaje de mortalidad del 10% en las parcelas control (Figura 2.11). Durante los días previos, el promedio de Tªmax fue de 24ºC y la HRmn del 75,0%. Durante los primeros días del mes de abril, se produjo un pico de Tªmax de 32,8ºC, (media 30ºC) y una HRmn de 66,0%. El 12 de Abril, la mortalidad en las parcelas control alcanzó el 28%. Desde el 21 de mayo hasta el final de la campaña, los valores de Tªmax fueron superiores a 40ºC y el promedio de HRmn inferior a 55,0%, con porcentajes de mortalidad de plantas de hasta el 43% en las parcelas control (Figura 2.11). Los tratamientos de biosolarización con gallinaza y VIN redujeron de manera significativa el porcentaje de mortalidad de plantas acumulado respecto al control no tratado (Tabla 2.3). Se detectó una correlación positiva y significativa entre el porcentaje de mortalidad acumulado y la población de M. phaseolina en suelo, en los muestreos llevados a Capítulo 2 54 cabo en los meses de Octubre y Mayo (coeficiente de correlación de Spearman 0,7103, (P < 0,0000) y 0,6942, (P < 0,0001), respectivamente). Tabla 2.3. - Efecto de los tratamientos de desinfesción de suelo en el porcentaje de mortalidad, ocasionada por Macrophomina phaseolina, durante las campañas agrícolas 2009-10, 2010-11 y 2011- 12. Mortalidad acumulada hasta el final de cada campaña (Mayo). Mortalidad (%) Tratamientos z 2009-10 2010-11 2011-12 Control 28,2a y 42,8a 25,2a GALL-DA 3,0bc 2,0c 1,1b GALL-DB 6,1b 15,1bc 2,7b GALL-DB+TR ---- 13,2bc 1,1b VIN 3,7bc 3,6bc 0,0b AL-O ---- 21,6ab 7,6ab BP-DA 0,0c ---- ---- BP-DB 3,3b 17,8ab 0,5b BP-DBLM 29,5a ---- ---- y Valores seguidos por la misma letra en una columna no fueron significativamente diferentes según test MDS (P < 0,05). Los datos fueron transformados mediante la transformación del arcoseno. Se presentan los datos no transformados. “----” = no determinado z Los detalles de los tratamientos se describen en la Tabla 2.1. En 2011-12, las primeras plantas muertas se detectaron en la tercera semana de enero, con la frecuencia más alta en las parcelas control (1,4%) (Figura 2.11). Al inicio de la campaña (finales de octubre 2011), la Tªmax alcanzó los 20ºC y la HRmn fue inferior al 50%. Desde mediados del mes de marzo, la Tªmax aumentó (22 - 30ºC) y la HRmn fue del 80%, alcanzándose el 27 de marzo un porcentaje de mortalidad del 4,2% en las parcelas control. Posteriormente, desde mediados del mes de abril hasta finales de la campaña, la Tªmax alcanzó valores superiores a 25ºC durante el 93% de esos días, con un máximo de 45ºC durante la tercera semana del mes de mayo. En mayo, el porcentaje de mortalidad en las parcelas control alcanzó el 25,2%, siendo la incidencia significativamente inferior en suelos tratados, excepto en el caso de AL-O, donde el porcentaje de mortalidad fue del (Tabla 2.3). Se observó una correlación positiva y significativa entre el porcentaje de mortalidad acumulado y las poblaciones de M. phaseolina en suelo, correspondientes a los muestreos realizados en los meses de octubre y mayo (coeficientes de correlación de Spearman: 0,6812, (P < 0,0001) y 0,6073, (P < 0,0009), respectivamente). Capítulo 2 55 Figura 2.11.- Porcentaje de mortalidad ocasionada por Macrophomina phaseolina en distintos tratamientos de desinfesción de suelo, en tres campañas agrícolas. zLos detalles de los tratamientos se describen en la tabla 2.1. Las barras verticales indican el error estándar de cada media. Mortalidad de plantas (%) Z z Capítulo 2 56 2.4.3.- Influencia de los tratamientos en los rendimientos del cultivo. Los tratamientos de biosolarización a todo terreno, aumentaron los rendimientos del cultivo (kg/ha o g/planta) de forma significativa con respecto al control. En general, las producciones más altas se obtuvieron después la aplicación de los tratamientos de biosolarización con GALL-DA o GALL-DB+TR, con diferencias significativas respecto al control. Los rendimientos del cultivo tuvieron su máximo valor con tres o dos aplicaciones de GALL-DA y GALL-DB+TR, respectivamente. En los tratamientos con GALL, no se encontraron diferencias significativas al comprar la dosis alta y baja. Sin embargo, la adicción de TUSAL® al tratamiento de dosis baja de gallinaza, da lugar a un aumento significativo de la producción, respecto al mismo tratamiento sin aporte de Trichoderma spp., en el último año. Por el contrario, los rendimientos fueron significativamente inferiores en las parcelas tratadas con AL-O y BP-DB (Tabla 2.4). Tabla 2.4.- Producción total (en kg/ha y g/plant) en suelos tratados mediante biosolarización en pre-plantación (cv. ‘Camarosa’) (Moguer, Huelva). Rendimientos comerciales acumulados Tratamientos x 2009-10 2010-11 2011-12 kg/ha g/pl kg/ha g/pl kg/ha g/pl Control 42.156c y 660,1c 36.492b 489,3c 55.915d 759,2d GALL-DA 66.919a 954,6a 62.884a 765,8a 85.472ab 1.119,2ab GALL-DB 62.654ab 905,7ab 59.319a 714,0ab 79.430bc 1.037,2bc GALL-DB+TR ---- ---- 64.256a 761,8a 89.421a 1.152,2a VIN 56.853b 828,7b 56.765a 655,5b 78.796bc 1.039,8bc AL-O ---- ---- 61.591a 744,0ab 77.767c 1.027,4c BP-DA 66.804a 971,1a ---- ---- ---- ---- BP-DB 60.955ab 903,2ab 56.726a 670,8ab 76.591c 1.010,7c BP-DBLM 45.197c 719,5c ---- ---- ---- ---- x Los detalles de los tratamientos se describen en la Tabla 2.1. y Valores seguidos por la misma letra en una columna no fueron significativamente diferentes según test MDS (P < 0,05). “----”= no determinado Los coeficientes de correlación de Spearman entre las poblaciones de M. phaseolina en suelo, el porcentaje de plantas muertas y la producción de fruta (kg/ha y g/pl) se muestran en la Tabla 2.5. Se encontraron correlaciones negativas y significativas entre el porcentaje de plantas muertas y la producción total. Por otra parte, existen correlaciones negativas y significativas entre la producción total y las poblaciones de M. phaseolina en suelo, en los muestreos Capítulo 2 57 correspondientes a los meses de octubre y mayo. Sin embargo, en 2011-12, las correlaciones entre la producción y las poblaciones de M. phaseolina en suelo, en el mes de mayo, no fueron significativas. Tabla 2.5.- Coeficientes de correlación entre el número de unidades formadoras de colonias de M. phaseolina en suelo, el porcentaje acumulado de plantas muertas y los rendimientos de cultivo (cv. ‘Camarosa’) (Moguer, Huelva). 2009-10 2010-11 2011-12 M.phaseolina x (UFC/g suelo) % PM M.phaseolina (UFC/g suelo) % PM M.phaseolina (UFC/g suelo) % PM Oct. Mayo Oct. Mayo Oct. Mayo gr/plant -0,4051 -0,4808 -0,7390 -0,5344 -0,4462 -0,4203 -0,4177 -0,2913 -0,4026 P-value 0,0454* 0,0160* 0,0000*** 0,0038* 0,0182* 0,0268* 0,0312* 0,1404NS 0,0381* kg/ha -0,4737 -0,5519 -0,7413 -0,5961 -0,5179 -0,5571 -0,4630 -0,3334 -0,4432 P-value 0,0177* 0,0048* 0,0000*** 0,0010*** 0,0053* 0,0024* 0,0158* 0,0897NS 0,0215* NS, *, ***: No significativo a P = 0,05 significativo a P = 0,05 y 0,001, respectivamente x Población de M. phaseolina en suelo (UFC/g de suelo seco) en los muestreos realizados después de los tratamientos (Oct.) y al final de cada campaña (Mayo) 2.5.- Discusión En la mayoría de las zonas donde se cultiva fresa como sistema anual, el cultivo se repite año tras año sin ningún tipo de rotación. Este sistema de cultivo intensivo, combinado con las altas temperaturas alcanzadas durante la campaña agrícola, crea unas condiciones óptimas para el desarrollo y la multiplicación de patógenos de suelo, como es el caso de M. phaseolina (Zveibil et al., 2012). M. phaseolina sobrevive en el suelo y en restos de plantas de fresa infectadas formando estructuras de resistencia denominados microesclerocios (Zveibil et al., 2012). La distribución espacial de los microesclerocios en el suelo, observada en la parcela experimental, corresponde a un patrón en forma de agregados, presentando un gradiente desde niveles bajos (0 UFC/g) hasta altos (58 UFC/g). Estos resultados son similares a los obtenidos por Mihail y Alcorn (1987). Los microesclerocios de M. phaseolina fueron aislados por primera vez en tres zonas limitadas. Estas áreas correspondían, principalmente, con las parcelas del control no tratado, y las de los tratamientos: GALL-DB, BP-DA, BP-DB y BPDBLM. En campañas sucesivas, estas zonas infestadas presentaron una mayor extensión, indicando la dispersión del patógeno desde los puntos iniciales (Koike, 2008). Observamos una correlación positiva y significativa entre las poblaciones M. phaseolina en suelo y la incidencia en plantas muertas con podredumbre carbonosa. Aunque, Wyllie (1988) observó, que densidades de población de 15 microesclerocios por gramo de suelo, pueden considerarse Capítulo 2 58 aceptables o tolerables para la producción de soja, nuestros resultados muestran que densidades de población en suelo inferiores (10 UFC/g de suelo) pueden ocasionar más del 20% de muerte en plantas de fresa. Young y Alcorn (1984), determinaron que en el caso de huéspedes altamente susceptibles, densidades de microesclerocios inferiores a un microesclerocio por gramo de suelo, pueden llegar a causar más del 90% de muerte de plantas. En nuestro estudio, esta densidad de microesclerocios ocasionó el 10% de mortalidad de plantas de fresa. Los tratamientos repetidos de biosolarización a toda superficie, consiguieron reducir la población de M. phaseolina en suelo. Además, los tratamientos fueron efectivos contra este patógeno hasta el final de cada campaña agrícola (Mayo). Por lo tanto, podríamos considerar la técnica de biosolarización tan eficaz como algunos tratamientos químicos (dazomet o cloropicrina, entre otros) para el control de M. phaseolina en suelo (Miranda et al., 2012; Zveibil et al., 2012). La descomposición de las enmiendas orgánicas producen sustancias volátiles que pueden resultar tóxicas para los patógenos de suelo (Bonamoni et al., 2007). La solarización combinada con la biofumigación proporciona un mejor control de M. phaseolina, que la técnica de solarización sola. En campos de fresa, la solarización no consiguió reducir la viabilidad de M. phaseolina, en profundidades de suelo entre 10–20cm (Yildiz et al., 2010). Sin embargo, la aplicación repetida de tratamientos de biosolarización con gallinaza y vinaza de remolacha redujo la población de M. phaseolina, a 20cm de profundidad, y la incidencia de la podredumbre carbonosa. Algunos autores han demostrado la eficacia de los tratamientos de biofumigación con estiércol de pollo fresco o residuos de especies de Brassicaceae, como medida de control de hongos patógenos de suelo, en el cultivo de la fresa (Lodha et al., 1997; Mazzola, 2011 b; Pratt, 2006). Bello y colaboradores (2004) aplicaron la biofumigación con vinaza de remolacha, demostrando un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de algunos hongos patógenos de suelo, como Fusarium spp y Phytophthora parasitica, entre otros. La diferencia entre los tratamientos con BP-DB y BP-DBLM, durante 2009-10, pudo deberse al efecto de la temperatura, ya que BP-DBLM se aplicó justo después del alomado en septiembre (cuando las temperaturas son más bajas) y bajo plástico negro, en lugar del transparente utilizado para la solarización en los meses de verano (Julio – Agosto), cuando se alcanzan las temperaturas más altas (Chen y Katan, 1980). En 2009-10, en parcelas tratadas con BP-DBLM se observó una alta mortalidad de plantas y una baja producción de fruto, por lo que se reemplazó (sobre las mismas parcelas) por el tratamiento de biosolarización con alperujo de olivo, durante las siguientes campañas. En estas parcelas se encontraron unas densidades altas de población de M. phaseolina en suelo, lo que puede deberse a un efecto residual del tratamiento de BP-DBLM aplicado en 2009-2010. Sin embargo, la aplicación del Capítulo 2 59 tratamiento AL-O disminuyó la población de M. phaseolina en suelo, desde el inicio hasta la finalización de la campaña agrícola 2010-11. M. phaseolina está considerado como un hongo patógeno de climas cálidos. Se considera que el desarrollo de la podredumbre carbonosa puede estar favorecido por la combinación de estrés térmico, déficit de agua y suelos de textura ligera (Khan, 2007; Papavizas y Klag, 1975), coincidiendo con las condiciones medioambientales de la provincia de Huelva. Aunque, estudios previos indican que los síntomas de la podredumbre carbonosa aparecen en campos donde se cultiva la fresa al final de la campaña agrícola (Miranda et al., 2012), en este trabajo hemos detectado plantas con síntomas, en el mes de enero, cuando la temperatura alcanzó los 20ºC y la humedad fue inferior al 50%. En 2010-11, desde abril hasta mayo se registraron las temperaturas más altas, coincidiendo la mayor incidencia de podredumbre carbonosa (Fang et al., 2011). Los tratamientos de biosolarización con gallinaza y vinaza de remolacha fueron los más eficaces en el control de la población de M. phaseolina en suelo y de la incidencia de podredumbre carbonosa. Además, la biosolarización con gallinaza produjo los rendimientos de producción más elevados. A pesar de que no se detectaron diferencias significativas entre la biosolarización con gallinaza a dosis alta y baja, la producción fue ligeramente superior a la dosis más alta, resultados muy similares a los obtenidos por Gamliel y colaboradores (1993) y posteriormente por Klein y colaboradores (2007). Cuando al tratamiento con gallinaza a dosis baja se le añadió TUSAL®, se observó un incremento de la producción acumulada a final de campaña. Cuando se aplica Trichoderma spp, en combinación con biofumigantes, se han detectado efectos positivos como: el control de los patógenos que afectan a las raíces o a las hojas, inducción de resistencia, control biológico de enfermedades por antagonismo directo o antibiosis frente a hongos patógenos, entre otros (Harman, 2006; Washington et al., 1999). Se encontraron resultados similares cuando las aplicaciones de Trichoderma spp. se combinaron con la técnica de solarización, observándose incrementos en los rendimientos del cultivo y una mejora de las condiciones de la rizosfera (Porras, 2005; Porras et al., 2007 b), debido a la actividad antagonista de Trichoderma spp. frente a algunos patógenos de suelo (Zveibil y Freeman, 2005). Porras y colaboradores (2007 a), demostraron que algunas especies de Trichoderma resistían altas temperaturas, aunque otros estudios señalan que los niveles de Trichoderma spp. en suelo pueden verse reducidos por la solarización (Ben-Yephet et al., 1987). Aunque, Zveibil y colaboradores (2012) indican que el incremento de la podredumbre de corona o la necrosis de raíces en plantas de fresa, ocasionada por M. phaseolina, puede ser debido a la retirada del BM como principal fumigante para este cultivo, en nuestro campo de Capítulo 2 60 ensayo nunca se habían aplicado BM u otros compuesto químicos para la desinfesción de suelo. Esta situación, junto al hecho de que no se ha detectado M. phaseolina en plantas procedentes de viveros, hace que nos planteemos la hipótesis de que M. phaseolina podría haberse detectado en los cultivos de fresa de la provincia de Huelva, debido a dos razones principales: (i) Compartir un hábitat común con otras especies de plantas previamente infectadas con el patógeno. (ii) Un aumento progresivo de la temperatura durante la última década, consecuencia del cambio climático, que podría favorecer el desarrollo o aparición de nuevos patógenos y enfermedades emergentes. Además, las condiciones climáticas de Huelva, podrían incrementar la incidencia de la enfermedad con el paso del tiempo. El objetivo de este estudio fue el desarrollo de técnicas de biofumigación para reemplazar a los tratamientos químicos en el control de patógenos de suelo en el cultivo de la fresa. A pesar de que M. phaseolina permanece en el suelo entre campañas agrícolas, nuestro estudio reveló que algunos de los tratamientos de biosolarización aplicados controlaron la podredumbre carbonosa. Podemos concluir que la aplicación repetida de tratamientos de biosolarización (principalmente en los que se usó gallinaza), fueron eficaces en la reducción y control de las poblaciones de M. phaseolina en el suelo. Este efecto tiene una relación directa con el aumento de los rendimientos en el cultivo de la fresa. Por otra parte, las producciones obtenidas con las enmiendas de gallinaza, fueron similares o incluso superiores a las producciones previamente descritas para el tratamiento químico estándar con 1,3 D:cloropicrina (alrededor de 54.000 – 60.000kg/ha) (López-Aranda, 2008). Dosis reducidas de gallinaza, en combinación o no con aplicaciones de Trichoderma spp., pueden ser utilizadas para evitar posibles riesgos de contaminación por nitrato en el suelo. En la zona mediterránea, el cultivo de la fresa, podría tener como principal alternativa a los fumigantes químicos, la técnica de biosolarización como herramienta fundamental en la desinfesción de suelo. Esta estrategia puede aprovechar la actividad industrial local para la obtención de los biofumigantes, que están disponibles y que resultan económicamente viables para su uso por los productores de fresa. Según López- Aranda y colaboradores (2012), a pesar de que la mayoría de los productores conocen este tipo de técnicas de aplicación de enmiendas orgánicas, es necesario trabajar en el proceso de transferencia de la tecnología, ya que en gran medida su éxito, será directamente proporcional al correcto conocimiento y aplicación de las dosis, el momento y el método de aplicación. Capítulo 3 67 CAPITULO 3 EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS QUÍMICOS Y DE BIOSOLARIZACION PARA EL CONTROL DE MACROPHOMINA PHASEOLINA EN EL CULTIVO DE LA FRESA 3.1. – Resumen. La retirada gradual del bromuro de metilo (BM) en el cultivo de la fresa, ha provocado problemas en el control de algunos hongos de suelo como es el caso de Macrophomina phaseolina, agente causal de la podredumbre carbonosa. En este trabajo, se comparó la eficacia de varios tratamientos de tipo químico y un tratamiento de biosolarización, en el control de M. phaseolina. Los ensayos se llevaron a cabo, durante tres campañas consecutivas (2009, 2010 y 2011), en dos parcelas experimentales situadas en la costa suroeste de España (Huelva), con diferente historial de fumigación del suelo. En la finca “Fres-Gómez S.L.” (Palos de la Frontera) el suelo fue fumigado con BM hasta 2005 y con 1,3- dicloropropeno:cloropicrina hasta 2008, mientras que, en “Occifresa S.C.A.” (Moguer) las últimas fumigaciones de suelo con BM se realizaron en la campaña 2000-01. En los ensayos se determinaron los efectos de los tratamientos sobre: la mortalidad de plantas, la población de M. phaseolina en suelo y el rendimiento en la producción de fruta acumulada hasta el final de cada campaña. En la campaña 2009-10, se aplicaron cinco tratamientos, y siete tratamientos durante las campañas 2010-11 y 2011-12. Los tratamientos de fumigación fueron: biosolarización con gallinaza, dazomet:1,3-dicloropropeno, 1,3-dicloropropeno:cloropicrina, cloropicrina, dimetil disulfuro:cloropicrina por inyección en rejao a través de riego por goteo, y dazomet. Durante las tres campañas se usaron plantas del cultivar ‘Camarosa’ y el manejo del cultivo se realizó siguiendo la directiva de producción integrada en fresa y bajo macrotúnel. La mayoría de los tratamientos consiguieron reducir significativamente la población de M. phaseolina en suelo (20–100%), con la excepción del tratamiento con dimetil disulfuro:cloropicrina aplicado en riego por goteo. En ambas fincas, todos los tratamientos redujeron la mortalidad de plantas causadas por podredumbre carbonosa (35–100%), observándose una mayor producción de fruto acumulada en comparación con el testigo (5– 56%). Los análisis de costos para la aplicación de cada uno de los fumigantes, demuestran que son su viables y rentables para su utilización en el cultivo de la fresa, en ausencia de BM. Capítulo 3 68 Abstract The phase-out of methyl bromide (MB) in strawberry has increased the difficulty of controlling Macrophomina phaseolina, a soil-borne pathogen and causal agent of charcoal rot disease. In this study, several chemicals and one biosolarization treatment were compared for the control M. phaseolina in three successive seasons between 2009 and 2011. Trials were conducted in two fields with different history of chemical soil treatments in south-western coast of Spain (Huelva). At the first field at Fres-Gómez S.L. farm in Palos de la Frontera, the soil was fumigated with 1,3-dichloropropene:chloropicrin from 2005 to 2008, whereas the soil of the second field at Occifresa S.C.A. farm in Moguer, was fumigated with MB until 2000- 2001. We determined treatments effect on plant mortality, M. phaseolina population in soil over time, and yield. Five and seven treatments plus an untreated control were applied the 2009-10 and 2010-12 seasons, respectively. The treatments were: biosolarization with chicken manure, dazomet:1,3-dichloropropene, 1,3-dichloropropene:chloropicrin, chloropicrin, dimethyl disulfide:chloropicrin by shank, dimethyl disulfide:chloropicrin through drip irrigation, and dazomet. Strawberry cv. 'Camarosa' was grown following standard production practices under large plastic tunnels. The majority of treatments reduced M. phaseolina populations in soil (20–100%), except dimethyl disulfide:chloropicrin applied through drip irrigation that was not significantly different from the untreated control. In both experimental fields all treatments reduced plant mortality caused by charcoal rot (35–100%) and provided greater yields than the untreated control (5–56%). Additionally, cost analyses showed positive economic impacts of the treatments on strawberry production in the absence of MB. 3.2. – Introducción. El cultivo de la fresa (Fragaria x ananassa Duch.) está muy extendido en los cinco continentes, siendo China y Estados Unidos los mayores productores del mundo. A nivel mundial, el cultivo de fresa se ha visto incrementado significativamente en los últimos años, llegando a 241.109 hectáreas, en 2012 (Anónimo, 2014 a). En ese año, la superficie cultivada en la provincia de Huelva (costa suroeste de España) alcanzó las 7.600 has con una producción de 289.900 toneladas (Anónimo, 2012). Para esta provincia, el cultivo de la fresa ha supuesto una gran revolución desde que, a mediados de los años sesenta del pasado siglo, se iniciara en la zona. Debido no solo a la importancia económica que tiene la fresa en España, sino también al impacto social del cultivo, se están realizando grandes esfuerzos en la investigación para la mejora de la producción y de la calidad del fruto de fresa, para hacer frente a las necesidades de este sector (Martínez-Ferri et al., en prensa). Capítulo 3 69 3.2.1. - Situación actual de los fumigantes químicos. En los países de la Unión Europa (UE), y particularmente, en los de la cuenca mediterránea, como Francia, Italia y España, la fumigación del suelo representa un factor fundamental en los cultivos hortícolas, como la fresa y frambuesa, entre otros. La aplicación del Protocolo de Montreal, y del Reglamento nº 2037/2000 de 29 de junio de la Comunidad Europea, que regula las sustancias que agotan y deterioran la capa de ozono, resultó en la eliminación del bromuro de metilo (BM) de forma irreversible en los países desarrollados, a partir de 2007. En el caso del cultivo de la fresa en Huelva, esta prohibición, tuvo un impacto negativo en el control de patógenos de suelo y otras plagas (López-Aranda, 2013). Debido a las políticas agroambientales seguidas por la UE y a la percepción negativa del consumidor, el uso de agroquímicos en la agricultura intensiva se ha visto reducido en más de un 30% en los últimos 8 años. Los reglamentos de la UE, son muy restrictivos en el uso de pesticidas y fumigantes químicos, y tienen como objetivo principal, estimular a las industrias en la búsqueda de alternativas de tipo no químico, para el manejo y/o control de patógenos y plagas (Colla et al., 2012). Actualmente, los únicos fumigantes de suelos autorizados en la UE son: las sales de metam potasio y metam sodio, y dazomet. En Europa, estos fumigantes podrán aplicarse tan sólo una vez cada tres campañas, con una dosis máxima de 153kg/ha y su aplicación deberá ser bajo cubierta plástica. El 1,3-dicloropropeno (1,3 D) y cloropicrina (PIC), se han considerado las principales alternativas químicas al BM, sin embargo, estos fumigantes están excluidos del anexo I (Directiva Europea CE 91/414), que regula el uso de fumigantes y su aplicación, desde el año 2010 y 2013, respectivamente, y por tanto, muy probablemente no estarán a disposición para su aplicación en la industria fresera. Sin embargo, los estados miembros de la UE, pueden emitir ciertas autorizaciones excepcionales (emergencia nacional), para el uso y/o aplicación de PIC y 1,3 D de forma temporal (120 días/año), en determinados sectores agrícolas (De Cal et al., 2004). 1,3 D tuvo autorización excepcional en Bélgica, Chipre, Francia, Grecia, Italia, Portugal y España desde 2009 hasta 2013, mientras que, las autorizaciones en el caso de aplicaciones de PIC, han sido aprobada en España, hasta el 29 de Octubre 2014 y están en marcha en Italia y Reino Unido (Anónimo, 2014 b). Entre los productos químicos, de nueva inclusión en la UE, se encuentra el dimetil disulfuro (DMDS), que en la actualidad está registrado como fumigante de suelo en EEUU. Durante la campaña de fresa de 2012-13, los fumigantes aplicados en la provincia de Huelva, fueron: la mezcla de 1,3 D:PIC (73% de la superficie), PIC (10%), dazomet solo o mezclado con 1,3 D (12%), sales de metam sodio y potasio (López-Aranda, 2013). La reevaluación de los plaguicidas marcada por la Directiva Europea CE 91/414 sobre productos fitosanitarios, y posteriormente, por el Reglamento Europeo nº 1107/2009 y 540/2011 (UE), relativo a la comercialización de productos Capítulo 3 70 fitosanitarios en el mercado, reduce drásticamente el número de fumigantes disponibles en el territorio europeo. En ensayos llevados a cabo en el suroeste de España, los tratamientos de suelo preplantación con cloropicrina, 1,3 D:cloropicrina, dimetil disulfuro:cloropicrina, ioduro de metilo + cloropicrina o Dazomet (incorporado al suelo con Mix-Tiller), no solo redujeron la población de M. phaseolina en el suelo, sino que mantuvieron estos bajos niveles del patógeno hasta finales de campaña (final de Mayo). Así, mientras que la mortalidad de plantas del cultivar ‘Camarosa’ fue del 20% en suelos no tratados, en los suelos fumigados no alcanzó al 10%, y en los suelos fumigados con dazomet no se detectaron plantas muertas (Miranda et al., 2012). Zveibil y colaboradores (2012), estudiaron el efecto de varios fumigantes químicos en el control de M. phaseolina. Metam sodio y BM fueron los más efectivos, en la erradicación de varios tipos del inóculo de M. phaseolina (microesclerocios, coronas y estolones naturalmente infectados). Sin embargo, las fumigaciones con cloropicrina o con la combinación 1,3 D:cloropicrina no fueron tan eficaces como los tratamientos con metam sodio o BM, a las distintas profundidades analizadas en este estudio. 3.2.2.- Macrophomina phaseolina, agente causal de podredumbre carbonosa en el cultivo de la fresa. La producción en el cultivo de la fresa ha sido dependiente del BM, como principal fumigante de suelo, en el control de enfermedades, malas hierbas y nematodos. Después de la prohibición de su uso, el cultivo de la fresa se ha visto amenazado a nivel mundial por varias enfermedades emergentes, como es el caso de la podredumbre carbonosa, causada por M. phaseolina. Este hongo de suelo es un patógeno con una amplia variedad de huéspedes (más de 500 especies de plantas cultivadas y silvestres), además posee una gran longevidad en suelo y una alta capacidad saprófita, que lo convierten en un patógeno altamente competitivo, frente a otros microorganismos (Su et al., 2001). En fresa ocasiona el marchitamiento y/o muerte de las hojas más viejas, con el eventual colapso y posterior muerte de la planta (Koike, 2008). En los tejidos internos de plantas sintomáticas se puede apreciar una coloración marrón oscuro a anaranjado en la zona vascular de la corona y en los tejidos corticales (Mertely et al., 2005), además, puede provocar necrosis en las raíces (Avilés et al., 2008). La podredumbre carbonosa, puede verse favorecida por condiciones de alta temperatura y baja humedad en suelo, así como por la combinación de estrés climático, déficit de agua en suelo, textura de suelo ligera (arenosa), y/o el estrés asociado a la reproducción del hospedador, condiciones que provocan un rápido desarrollo de esta enfermedad en la planta (Mihail, 1989). Por tanto, las condiciones climáticas y edáficas de la provincia de Huelva, son óptimas para el desarrollo y Capítulo 3 71 dispersión de M. phaseolina, en meses donde las temperaturas a menudo alcanzan los 30ºC , provocando pérdidas en la producción debido, principalmente, a la muerte de plantas (Fang et al., 2011; Miranda et al., 2012). M. phaseolina sobrevive en el suelo y en tejido de plantas infectadas, como microesclerocios, estructuras de resistencias que permiten al hongo vivir durante largos periodos de tiempo en el suelo. Cuando las condiciones climáticas son óptimas para su dispersión, puede ser capaz de infectar nuevas plantas de fresa en sucesivas campañas (Dhingra y Sinclair, 1975; Zveibil et al., 2012). Una baja densidad de inóculo puede ser suficiente para causar podredumbre carbonosa, especialmente cuando el huésped es altamente susceptible (Young y Alcorn, 1984). Los microesclerocios se producen en el tejido del huésped y, tras la descomposición de los tejidos infectados, se liberan en el suelo. Por otra parte, el monocultivo sin rotación, usado en el cultivo de la fresa en Huelva, puede favorecer un aumento en la población de microesclerocios de M. phaseolina (Mihail, 1989; Zveibil et al., 2012). Los microesclerocios de M. phaseolina se distribuyen en el suelo en forma de parches. En los campos de cultivo, donde la enfermedad se ha desarrollado durante más de una campaña agrícola, se produce la dispersión del patógeno en el suelo desde el foco inicial, debido a los movimientos de tierra realizados durante las tareas de laboreo y preparación del terreno (Koike, 2008). La podredumbre carbonosa, se ha detectado en las distintas zonas donde se cultiva la fresa, como: Argentina, (Baino et al., 2011), Australia (Golzar et al., 2007), California (Koike, 2008), Florida (Mertely et al., 2005), Grecia (Tjamos et al., 2006), Italia (Angelini y Faedi, 2010), Irán (Sharifi y Mahdavi, 2011), Israel (Zveibil y Freeman, 2005), España (Avilés et al., 2008), y Turquía (Benlioğlu et al., 2004). El incremento en el número de casos de detección de M. phaseolina, en el cultivo de la fresa, puede ser debido a un aumento de la dispersión del patógeno, a la prohibición de uso del BM o a un mayor conocimiento de la enfermedad. El objetivo de este trabajo es determinar el efecto de distintos tratamientos de desinfesción de suelo en la población de M. phaseolina, en la incidencia de podredumbre carbonosa, así como su influencia en la producción de fruto de fresa, en las condiciones de cultivo de la provincia de Huelva. 3.3. - Materiales y métodos. 3.3.1. - Historial y características de los campos de ensayo. Los ensayos se han llevado a cabo, durante las campañas agrícolas 2009-10, 2010-11 y 2011- 12, en las fincas comerciales: Fres-Gómez S.L. (Palos de la Frontera) y Occifresa S.C.A. (Moguer), ambas en la zona costera de Huelva (Figura 3.1). En la primera de ellas se Capítulo 3 72 realizaron desinfesciones con BM desde 2000-01 hasta 2005-06, continuándose con aplicaciones de 1,3 D:PIC hasta 2008-09. En Occifresa S.C.A., la última fumigación del suelo con BM fue en la campaña 2000-01, desde entonces nuestro equipo de investigación, ha llevado a cabo ensayos con distintos fumigantes en la búsqueda de alternativas al BM para el cultivo de la fresa (2002 hasta 2008). Los suelos, en ambas fincas, son de textura arenosa y de composición similar (Tabla 3.1). Las características del agua de riego se muestran en la Tabla 3.2. Figura 3.1. – Localización geográfica de las fincas Occifresa S.L. (Moguer), y Fres-Gómez S.C:A (Palos de la Frontera). Tabla 3.1. – Composición del suelo en las fincas Occifresa S.L. (Moguer), y Fres-Gómez S.C:A. (Palos de la Frontera). Occifresa S.C.A. Fres-Gómez S.L. Textura (%) Arenosa Arenosa pH 6,09 6,05 Materia orgánica (%) 0,78 0,47 Contenido de Nitrógeno (%) 0,06 0,05 Contenido de Fósforo (mg/kg) 25,68 27,78 Conductividad eléctrica (mS/cm) 0,11 0,08 1 2 1 = Occifresa S.C.A. 2 = Fres-Gómez S.L. Capítulo 3 73 Tabla 3.2. – Características del agua de regadío en las fincas Occifresa S.L. (Moguer), y Fres- Gómez S.C.A. (Palos de la Frontera). Occifresa S.L. y Fres-Gómez S.C.A. Conductividad eléctrica (mS/cm) 0,16 Cl- (mg/L) 21,0 K+ (mg/L) 2,6 NO3- (mg/L) <2,50 Na+ (mg/L) 11,3 NO2- (mg/L) <0,05 Ca2+ (mg/L) 18,0 Cu (mg/L) <0,05 Mg2+ (mg/L) 10,0 Mn (mg/L) <0,05 NH4+ (mg/L) <0,06 Fe (mg/L) <0,10 CO32- (mg/L) <25,0 Zn (mg/L) <0,05 CO3H- (mg/L) 55,0 B (mg/L) <0,50 SO42- (mg/L) 16,8 Relación de adsorción de sodio (meq) <0,50 3.3.2. Diseño experimental y descripción de los tratamientos. El diseño experimental fue de bloques al azar con tres repeticiones. En 2009-10, se aplicaron cinco tratamientos, y siete en 2010-11 y 2011-12, además de un testigo no tratado (UC). Los tratamientos fueron superimpuestos, en las mismas parcelas y repeticiones, año tras año. Las medidas de cada parcela elemental fueron: 25m de largo por 3,3m de ancho, con tres lomos de 50cm y dos hileras de plantas cada uno. Los tratamientos aplicados durante las tres años de estudio fueron: biosolarización con gallinaza (2.500g/m2) (BIO); dazomet (8g/m2 en 2009-10, y 20g/m2 en 2010-11 y 2011-2012) + 1,3-dicloropropeno (40g/m2 en 2009-10, y 30g/m2 en 2010-11 y 2011-2012) (DAZ:1,3 D); 1,3-dicloropropeno:cloropicrina (40g/m2) (1,3 D:PIC); cloropicrina (40g/m2) (PIC), y dimetil disulfuro (40g/m2) + cloropicrina (13g/m2) aplicado mediante inyección en reja (DMDS:PIC S). En las dos últimas campañas, se añadieron dos nuevos tratamientos: dimetil disulfuro (40g/m2 en 2010-11, y 30g/m2 en 2011-12) + cloropicrina (13g/m2 en 2010-11, y 10g/m2 en 2011-12) aplicados en riego por goteo, bajo lomo con cubierta de plástico de polietileno negro (PE) en 2010-11 y bajo lomos con cubierta de plástico virtualmente impermeable (VIF) en 2011-12 (DMDS:PIC D), y dazomet (50g/m2) (DAZ) (Tabla 3.3). A mediados de Julio, se realizó el abonado con enmienda orgánica en todos los tratamientos, incorporándose en el suelo a una profundidad de 20cm con la ayuda de un rotovator (16 de Capítulo 3 74 Julio de 2009, 16 de Julio 2010, 20 de Julio de 2011 en Fres-Gómez S.L., y 13 Julio 2009, 20 de Julio de 2010 y 21 Julio 2011 en Occifresa S.C.A.). El tratamiento de biosolarización (BIO), se llevó a cabo desde mediados del mes de julio hasta mediados de agosto (18 Julio - 14 Agosto 2009, 21 de Julio - 17 Agosto 2010 y 22 Julio – 18 Agosto 2011 en Fres-Gómez S.L., y 17 Julio - 19 Agosto 2009, 23 Julio-19 Agosto, 2010 y 22 Julio - 18 Agosto, 2011, en Occifresa S.C.A.), cubriendo el suelo con plástico de polietileno transparente de baja densidad de 0,05 mm de espesor (Katan, 1981; Medina et al., 2009) (ver Capítulo 2, apartado 2.3.2). A mediados de Agosto, se llevó a cabo el alomado del terreno con plástico de PE negro, en lomos con una anchura de 50cm, colocando una cinta de riego por goteo en la parte central de cada uno. Los tratamientos químicos, fueron aplicados mediante riego por goteo o mediante inyección en reja en diferentes fechas (Figura 3.2. A) (Tabla 3.3). El tratamiento con dazomet se aplicó a todo terreno, mediante una Mix Tiller Dry® (Forigo), antes de la formación de los lomos (Figura 3.2. B). La plantación, se llevó a cabo a mediados del mes de Octubre (23 Octubre 2009, 24 de Octubre de 2010 y 24 Octubre 2011 en Fres-Gómez S.L., y 16 de Octubre de 2009, 18 de Octubre 2010 y 25 de Octubre de 2011, en Occifresa S.C.A.), con plantas de fresa del cultivar ‘Camarosa’. En Fres-Gómez S.L. la densidad de plantación fue de 72.000 plantas/ha, con un marco de plantación de 25 x 25cm, mientras que en Occifresa se dispusieron 87.000 plantas/ha, con un marco de 20 x 22cm. En el primer caso las plantas procedían de "Viveros Niharra" (Segovia), y en el segundo de "Viveros Cuna de Platero" (Ávila). En estos ensayos se utilizó el cultivar 'Camarosa', debido a que se ha considerado la variedad más importante en la zona de Huelva desde 1997 hasta 2010 y por ser susceptible a podredumbre carbonosa causada por M. phaseolina (Koike et al., 2009). Las plantas fueron cultivadas en un sistema intensivo anual bajo macrotúnel (Medina et al., 2009). Un mes después de la plantación, se llevó a cabo el forzado del cultivo mediante macrotúneles, bajo plástico transparente de 0,15 mm de espesor. Para el manejo del cultivo se siguieron las recomendaciones del reglamento de producción integradas para el cultivo de la fresa (López-Aranda, 2008). Durante cada campaña agrícola (Octubre – Mayo), el abonado se realizó mediante fertirrigación: 175 kg N/ha, 77 kg P+/ha, 185 kg K+/ha, 85 kg Ca2+/ha, 14 kg Mg2+/ha. Capítulo 3 75 Figura 3.2. - A). Aplicación de 1,3 Dicloropropeno:Cloropicrina en inyección a lomo, en el cultivo de fresa. B). Aplicación de Dazomet a todo terreno. A B Capítulo 3 76 Tabla 3.3. – Descripción de los tratamientos de desinfesción de suelo (Occifresa S.C.A., Moguer, y Fres-Gómez S.L., Palos de la Frontera, en la provincia de Huelva). Tratamientos Descripción Dosis (g/m2) Métodos de aplicación Fecha de aplicación y 2009 2010 2011 2009 2010 2011 UC Control n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. BIO Biosolarización con gallinaza 2.500 2.500 2.500 Toda superficie 13, 16 Jul 13, 16 Jul 21, 20 Jul DAZ:1,3D Dazomet:1,3-dicloropropeno 8:40 20:30 20:30 Toda superficie + Cinta por riego x 10, 11 Sep 10, 7 Sep z 6, 14 Sep 1,3D:PIC 1,3-dicloropropeno:cloropicrina 40 40 40 Inyección en reja bajo PE 3, 4 Sep 1, 4 Sep 6, 1 Sep PIC Cloropicrina 40 40 40 Inyección en reja bajo PE 3, 4 Sep 1, 4 Sep 6, 1 Sep DMDS:PIC S dimetil disulfuro:cloropicrina 40:13 40:13 40:13 Inyección en reja bajo PE 3, 4 Sep 1, 4 Sep 6, 1 Sep DMDS:PIC D dimetil disulfuro:cloropicrina ---- 40:13 30:10 Cinta de riego bajo PE (2010) y bajo VIF (2011) ---- 14, 13 Sep 15, 15 Sep DAZ Dazomet ---- 50 50 Toda superficie ---- 1, 4 Sep 6, 1 Sep x Dazomet fue aplicado por cinta de riego en 2009 y a toda superficie en 2010 y 2011, 1,3-dicloropropeno se aplicó por cinta de riego durante las tres campañas. y La primera fecha corresponde a Occifresa S.C.A. y la segunda a Fres-Gómez S.L. z La fecha corresponde a la aplicación de 1,3D, ya que el tratamiento DAZ fue aplicado a la misma vez que se hicieron los lomos del cultivo. “n.a.” = no aplicado. “----” = no determinado. “PE” = Film de plastic de polietileno. “VIF” = plástico virtualmente impermeable. Capítulo 3 83 Figura 3.3. - Producción total (kg/ha) en suelos fumigados y biosolarizados en pre-plantación en las fincas de Occifresa (Moguer) y Fres-Gómez (Palos de la Frontera) (cv. ‘Camarosa’). zValores seguidos por la misma letra en una columna no fueron significativamente diferentes según test MDS (P < 0,05). “n.a.” = no aplicado. Los tratamientos se describen en la tabla 3.3. Las barras verticales indican el error estándar de cada media. z n.a . n.a. 2009-10 2010-11 2011-12 Tratamientos DAZ:1,3 D DMSA:PIC D DAZ BIO UC 1,3 D:PIC DMDS:PIC S Kg/ha DAZ:1,3 D DMSA:PIC D DAZ BIO UC 1,3 D:PIC DMDS:PIC S PIC DAZ:1,3 D DMSA:PIC D DAZ BIO UC 1,3 D:PIC DMDS:PIC S PIC PIC Occifresa Fres-Gómez Capítulo 3 84 M. phaseolina como 1,3 D:PIC, considerado tratamiento estándar, y que fue utilizado por el 73% de los productores en Huelva durante la campaña agrícola 2012-13. La elección de 1,3 D:PIC se debe, no sólo a que proporciona un control satisfactorio de hongos y nematodos en el suelo (Noling y Becker, 1994), sino también a la facilidad de su aplicación y/o uso, ya que no requiere ningún equipo adicional o calibración. Varios autores han observado que mediante aplicaciones repetidas de tratamientos de biosolarización durante dos o más años consecutivos puede ejercerse el control de hongos como Fusarium spp., Rhizoctonia spp., y Cylindrocarpon spp. (Ben-Yephet et al., 1987; Su et al., 2001). En Occifresa S.C.A., el tratamiento BIO redujo la población M. phaseolina, e incremento de forma significativa la producción final acumulada, en comparación a las parcelas controles, durante las tres campañas agrícolas. Además, las aplicaciones con biosolarización, podrían haber tenido un efecto beneficioso acumulado en el tiempo, que da como resultado un bajo porcentaje de plantas muertas en el último año (Pinkerton et al., 2002). La repetición de este tratamiento a toda superficie hace que sea tan eficaz y presente rendimientos similares al tratamiento estándar 1,3 D:PIC. La mayoría de los tratamientos, con la excepción de DMDS:PIC D, fueron eficaces en el control de la población de M. phaseolina, desde su aplicación hasta el final de la campaña. Aunque la densidad de esclerocios tras la aplicación de DMDS:PIC D se mantuvo alta, cuando se utilizó plástico VIF en lugar de PE no se observó muerte de plantas. Según Santos y colaboradores (2007), el uso de plástico VIF incrementa la duración de concentraciones relativamente altas del fumigante en el suelo, permitiendo más tiempo de exposición de los patógenos a dosis letales y, también, una mejor distribución lateral en el suelo. Gerik (2005) observó que las aplicaciones con DMDS, reducían las poblaciones de Pythium ultimum y Fusarium oxysporum, aunque, investigaciones llevadas a cabo en viveros de fresas españoles, han mostrado resultados inconsistentes en el control de patógenos de suelo con este compuesto (De Cal et al., 2004). DMDS no está aún autorizado para su uso en Europa, aunque ya se comercializa en EEUU e Israel como Paladin. En los suelos tratados los rendimientos del cultivo son similares a los obtenidos con las fumigaciones con BM, en concordancia con los resultados obtenidos en campos de producción de fresa, en Florida (EEUU) (Albregts et al., 1996; Overman et al., 1987). En ambas fincas experimentales, se observó una tendencia muy similar en todos los tratamientos, obteniendo de mayor a menor producción acumulada final los tratamientos de: DAZ, DMDS:PIC D, DMDS:PIC S, PIC, 1,3 D:PIC, DAZ:1,3 D y BIO. Capítulo 3 85 Según Domínguez y colaboradores (2014) los costos en fumigantes y de la aplicación fueron: DAZ = 2.800 €/ha, DAZ:1,3 D = 1.214 €/ha para 2009-10 que se aplicó DAZ a todo terreno y 1.863 €/ha para 2010-11 y 2011-12, donde DAZ se aplicó en cinta por riego, PIC = 1.140 €/ha, 1,3 D:PIC = 1.110 €/ha y BIO = 850 €/ha. El costo máximo fue el de la aplicación con DAZ (0,037 €/kg) y el mínimo el del tratamiento de biosolarización (0,012 €/kg). A pesar de que el tratamiento DAZ fue más caro que el tratamiento BIO, el aumento en la producción podría justificar la aplicación de este fumigante, en precios actuales para la fruta de fresa en el mercado europeo. 3.6. – Bibliografía. Albregts, E.E., Gilreath, J.P., y Chandler, C.K. 1996. Soil solarization and fumigant alternatives to methyl bromide for strawberry fruit production. Soil Crop Sci. Soc. Fla. Proc. 55:16-20. Angelini, R., y Faedi, W. 2010. Malattie e fisiopatie. In: ART (Ed) La Fragola, Bologna, Italy, pp 228-246. 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Tal es el caso de Macrophomina phaseolina, hongo patógeno de suelo que ocasiona la podredumbre carbonosa (charcoal rot). Dadas las restricciones vigentes en la utilización de desinfestantes químicos, el uso de cultivares resistentes se considera una de las alternativas para reducir la incidencia de podredumbre carbonosa en el cultivo de la fresa. El objetivo de este trabajo, fue determinar la respuesta de variedades de fresa a M. phaseolina en condiciones controladas y de campo. La respuesta al patógeno de algunos de los cultivares de uso común en la provincia de Huelva se caracterizó mediante inoculación artificial bajo condiciones controladas. Se utilizaron dos aislados del patógeno y la inoculación se realizó mediante riego con una suspensión de esclerocios. Se realizaron observaciones semanales, para comprobar el estado y las necesidades hídricas de las plantas, y se determinó la susceptibilidad al patógeno mediante una escala de severidad de 0 (planta sana) a 5 (planta muerta), además de la incidencia, como porcentaje de plantas muertas a la finalización del ensayo. Las diferencias observadas se debieron al cultivar, no siendo significativa la interacción entre cultivar y aislado. Sólo ‘Splendor’ resultó resistente al patógeno, mientras que ‘Camarosa’, ‘Florida Fortuna’, ‘Candonga’ y ‘Benicia’, fueron susceptibles. Los ensayos de campo se llevaron a cabo, durante dos campañas agrícolas, en una parcela experimental que nunca había sido desinfestada y que presentaba una población homogénea en suelo del patógeno objeto de estudio. El diseño experimental fue de bloques al azar con 3 repeticiones y 12 plantas por cultivar y repetición. Los resultados fueron similares a los obtenidos en condiciones controladas. El cultivar ‘Splendor’ fue el más resistente, mientras que ‘Camarosa’ y ‘Florida Fortuna’ resultaron los más susceptibles. Capítulo 4 90 4.2. – Introducción. Aunque la podredumbre carbonosa de la fresa, ocasionada por el patógeno de suelo M. phaseolina, fue detectada a mediados de los años 50 del siglo XX en Illinois (EEUU) (Maas, 1998), su expansión a la mayoría de las zonas donde se cultiva la fresa ha sido reciente (Mertely et al., 2005; Zveibil y Freeman, 2005), siendo descrita por primera vez en Huelva en 2007 (Avilés et al., 2008). Los síntomas en fresa consisten en marchitamiento foliar, secado y muerte de las hojas más viejas, seguido de un eventual colapso y muerte de la planta (Koike, 2008). En corte longitudinal de la corona, se observa una coloración negra o marrón que indica necrosis en los tejidos corticales y vasculares (Mertely et al., 2005). Esta enfermedad también puede ocasionar necrosis en las raíces de la planta (Avilés et al., 2008). Las condiciones que facilitan el desarrollo de la enfermedad son elevadas temperaturas y estrés hídrico. El hongo produce estructuras de resistencia que le permiten sobrevivir en el suelo o sobre restos de plantas durante largos periodos de tiempo. Ocasionalmente se pueden desarrollar picnidios ostiolados en tejidos del huésped, y estos a su vez producir conidios, los cuáles, juegan un importante papel en la dispersión del patógeno (Holliday y Punithaligam, 1970; Mihail y Taylor, 1995; Smith y Wyllie, 1999). Las enfermedades ocasionadas por patógenos de suelo son de difícil control. Tras el abandono del uso del bromuro de metilo se estudia la eficacia de otros fumigantes químicos, sometidos a importantes restricciones de uso por las diversas normativas y legislaciones. El uso de alternativas químicas implica alteraciones en el medioambiente, afectando, entre otros factores, a la fertilidad del suelo y a la calidad del agua. El uso de plantas resistentes o tolerantes frente a M. phaseolina y otros patógenos de suelo, como parte de las estrategias de control integrado es una alternativa que debe ser tomada en cuenta (Avilés et al., 2009; Khan, 2007). Los programas de mejora encaminados al desarrollo de cultivares resistentes a patógenos de suelo están en progreso en diferentes países (Faedi et al., 2002), entre ellos España. En nuestro caso, los convenios de mejora que mantiene el Instituto de Formación Agraria, Pesquera y del Medio Rural (IFAPA) con otros organismos y empresas del sector fresero, incluyen el estudio de la resistencia de las líneas en desarrollo a M. phaseolina. Los estudios llevados a cabo por diferentes autores indican que los cultivares de fresa varían en su susceptibilidad a este patógeno, observándose distinto comportamiento en plantas inoculadas artificialmente o mantenidas en campo (Koike, 2008; Koike et al., 2009). Avilés y colaboradores (2009), indicaron que la respuesta de los cultivares a la enfermedad depende del aislado de M. phaseolina. Aunque en un trabajo posterior determinaron tres grupos de susceptibilidad al patógeno (Avilés et al., 2012). Capítulo 4 91 El objetivo de este trabajo es caracterizar la respuesta de variedades de fresa, de uso común en la provincia de Huelva, a M. phaseolina, mediante inoculación artificial y ensayos de campo. 4.3. - Materiales y métodos 4.3.1. - Inoculación de M. phaseolina en condiciones controladas. Se llevaron a cabo dos ensayos, desde Octubre 2011 - Marzo 2012 y Octubre 2012 - Marzo 2013. En estos ensayos, se analizó la respuesta de cinco cultivares comerciales de fresa de uso común en la provincia de Huelva: ‘Benicia’, ‘Camarosa’, ‘Candonga’, ‘Florida Fortuna’ y ‘Splendor’. Para la inoculación se utilizaron dos aislados de M. phaseolina: TOR-99, aislado procedente de tejidos de planta sintomática de fresa (‘Camarosa’), y TOR-102, aislado de suelo donde se cultiva fresa (Moguer, Huelva). Las plantas de fresa se trasplantaron a macetas de 16cm de diámetro, que contenían turba estéril, manteniéndose en cámara de cultivo a 27ºC, en condiciones de fotoperiodo con 16h de luz (SYLVANIA LUXLINE PLUS F58W/840 Cool White DE LUXE, GERMANY, 100.5 E m-2·s-1) (Figura 4.1). El diseño experimental fue de bloques al azar con 3 repeticiones (2 plantas por repetición) por aislado y cultivar. Cuatro semanas después de la plantación, se realizó la inoculación mediante riego con 50ml de una suspensión de esclerocios (6 × 103 esclerocios/ml) de cada uno de los aislados de M. phaseolina (Figura 4.2). Las plantas usadas como control se regaron con agua (Avilés et al., 2009). Se realizaron riegos periódicos (dos semanales) con 100ml de agua/maceta. Figura 4.1. - Ensayo en cámara de cultivo, en condiciones controladas. Capítulo 4 92 Figura 4.2. - Suspensión de esclerocios de los aislados TOR-102 y TOR-99. El seguimiento del desarrollo de la enfermedad se llevó a cabo mediante observaciones semanales. La susceptibilidad al patógeno, se determinó mediante una escala de 0 (planta sana) hasta 5 (planta muerta) (Tabla 4.1) (Fang et al., 2011), la incidencia de podredumbre carbonosa se expresó como porcentaje de plantas muertas sobre el total. A la finalización del ensayo, todas las plantas fueron extraídas de las macetas y lavadas bajo agua corriente para eliminar el suelo adherido a las raíces. Para confirmar la infección por el patógeno, se realizaron aislamientos de tejidos sintomáticos sobre medio de cultivo patata dextrosa agar (ver apartado 2.3.4, capítulo 2), manteniéndose las placas a 30ºC y en oscuridad durante 7 días, para la posterior identificación del patógeno. Tabla 4.1. - Escala de severidad en plantas (Fang et al., 2011). 0 Planta asintomática 1 Planta con ligero retraso del crecimiento 2 Planta enana y ligero marchitamiento 3 Planta decaída 4 Planta con mayoría de hojas marchitas o muertas 5 Planta muerta Capítulo 4 99 ‘Florida Festival’ resultó susceptible (Whidden, 2013). En nuestro caso, ‘Florida Fortuna’ fue una de las variedades más susceptibles a M. phaseolina. El éxito de una buena campaña agrícola: alta producción, baja mortalidad, alta calidad del fruto, se basa principalmente en una buena elección del cultivar, que depende directamente del grado de infestación, del tipo de hongo que predomine en el terreno, las condiciones climáticas, etc. así por ejemplo, ‘Florida Sensation’ y ‘Florida Fortuna’, se muestran resistentes a la enfermedad de antracnosis, causada por Colletotrichum acutatum, ‘Florida Festival’, es resistente a la necrosis de raíz causada por Phytophthora cactorum, y a Botrytis cinérea (Whidden, 2013). Por lo tanto, para llevar a cabo un buen control de la podredumbre carbonosa u otras enfermedades en fresa, la desinfesción del suelo, deberá basarse en una adecuada elección del fumigante, dosis y forma de aplicación, además de la elección de cultivares que sean menos susceptibles al patógeno de suelo, M. phaseolina. 4.6.- Bibliografía. Avilés, M., Castillo, S., Bascon, J., Zea-Bonilla, T., Martín-Sánchez, P.M., y Pérez-Jiménez, R.M. 2008. First report of Macrophomina phaseolina causing crown and root rot of strawberry in Spain. Plant Pathology 57:382. Avilés, M., Castillo, S., Borrero, C., Castillo, M.L., Zea-Bonilla, T., y Pérez-Jiménez, R.M. 2009. Response of strawberry cultivars: ‘Camarosa’, ‘Candonga’ and ‘Ventana’ to inoculation with isolates of Macrophomina phaseolina. Acta Horticulturae ISHS 842:291-294. Avilés, M., Castillo, S., Borrero, C., y Refoyo, A. 2012. Strawberry cultivar susceptibility to charcoal rot caused by Macrophomina phaseolina. 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El principal problema para este cultivo a nivel mundial, es la aparición de nuevas enfermedades emergentes debido a la prohibición del uso del BM, como principal fumigante de suelo. En el caso de Florida, las dosis de fumigantes alternativos al BM (metam sodio y potasio, dimetil disulfuro, y dicloropropeno), está siendo incrementada año tras año, para una óptima desinfesción del suelo. No solo la dosis empleada, sino también diferentes combinaciones o mezclas de fumigantes son usados por agricultores y técnicos, para el control de patógenos de suelo y con ello un aumento en la producción y la calidad de fruto. El objetivo de este trabajo es la búsqueda de alternativas al BM, comparando la efectividad de quince tratamientos a diferentes dosis y métodos de aplicación además de un testigo sin tratamiento, en el control sobre un suelo artificialmente inoculado con el patógeno M. phaseolina, en condiciones de cultivo de una finca comercial situada en Dover (Florida, EEUU), durante dos campañas agrícolas (2012-13 y 2013-14). Todos los fumigantes consiguieron reducir el porcentaje de mortalidad de plantas y el porcentaje de plantas con podredumbre carbonosa, causada por M. phaseolina, excepto Dazitol™ en combinación con Integrate 20™ (21,4 y 11,3%, respectivamente), con valores significativamente no diferentes al testigo sin tratar (25,1 y 15,4%, respectivamente). En el control de bolsas de pienso de mazorca de maíz inoculadas y coronas secas infectadas con M. phaseolina, los tratamientos que tuvieron menos eficacia y no consiguieron reducir significativamente respecto a el control, fueron las distintas dosis de la combinación 1,3 Dicloropropeno:Cloropicrina, además del producto Dazitol™ en combinación con Integrate 20™. Además en este trabajo, se comprobó Capítulo 5 104 como el tratamiento con metam potasio (Kpam®) y la combinación de dimetil disulfuro y cloropicrina (DMDS RG:PIC RG), no fueron efectivo en los laterales del lomo de cultivo, debido a una mala difusión del fumigante, ya que aunque tuvo una buena desinfesción en las bolsas con pienso de mazorca de maíz inoculadas con M. phaseolina enterradas en el centro del lomo, para ambas profundidades, tuvo valores similares al control, en bolsas enterradas alejadas de la cinta de riego donde se aplicó los fumigantes. En los ensayos llevados a cabo, en diferentes tipos de cubierta plástica del lomo, se determinó que el plástico virtualmente impermeable (VIF) resultó más efectivo en el control de esclerocios de M. phaseolina, que el plástico de baja densidad (LDPE), incluso usando dosis de la combinación 1,3-dicloropropeno:cloropicrina más elevada en LDPE que para VIF. 5.2. - Introducción 5.2.1. – Producción de fresa en Florida (EEUU.). La producción de Fresa en EEUU fue aproximadamente 1.246.500 toneladas en 2012, un 3% menos que en 2011 (Anónimo, 2012) (Figura 5.1). La producción de fruta, alcanzó su máximo valor económico en 2011, con un total de 2,4 billones de dólares. Los tres principales estados productores de fresa en EEUU son; California, Florida y Oregón. La producción en California en 2012 fue de 1.147.500 toneladas, lo que supone el 85% del volumen total. Mientras que en Florida, la producción de la cosecha supone entre un 10-12% del total del cultivo en EEUU, con aproximadamente 107.100 toneladas de fresa en 2012, lo que supuso unos 313 millones de dólares, y una superficie de 3.561 hectáreas en 2009 (Anónimo, 2007 y 2009b). Oregón produjo 7.650 toneladas de fresa en 2012, un 21% menos que 2011, debido a la reducción de superficie cultivada. Según la Asociación de Productores de Fresas de Florida (FSGA), la superficie cultivada de fresa en 2013 se espera que sea inferior, respecto a los 4.088 ha en 2012 (The Ledger, 2012). Está pequeña reducción se debe principalmente a México, como principal competidor de Florida y al exceso de oferta de fresa, en el mercado. EEUU se sitúa como el segundo mayor productor, por detrás de China y exportador de fresas, por detrás de España. En 2010, el precio final de las exportaciones alcanzo su nivel máximo con 359,8 millones de dólares (Anónimo, 2014). Aunque, el aumento de la producción y la caída en el precio de la fruta, está causando un pesimismo en la industria, especialmente en Florida, donde la Capítulo 5 105 competencia con México ha demostrado ser devastadora para los productores (Anónimo, 2009 a; Bouffard, 2012) Figura 5.1. - Producción de fresa en EE.UU, desde 2000-2012. (http://www.nass.usda.gov) 5.2.2. – Problemas patológicos en campos de fresa de Florida. Al inicio de cada campaña agrícola se lleva a cabo la aplicación de los fumigantes para la desinfesción de suelo, entre dos y cuatro semanas antes de la plantación. El periodo de plantación en Florida empieza a principios de Septiembre hasta finales de Noviembre, utilizando el riego por aspersión y el goteo para ayudar al establecimiento de las plantas, en lomos de cultivo (Price et al., 2007; VanSickle et al., 2009). La recolección de la fruta se realiza cada tres días aproximadamente, desde que la planta empieza a producir a finales de Diciembre (Whidden, 2010). La universidad de Florida (Gulf coast resear Gulf Coast Research and Education Center) es uno de los principales obtentores de nuevos cultivares de fresa, a nivel mundial. Cultivares como ‘Florida Festival’, ‘Florida Elyana’, ‘Florida Fortuna’, ‘Winterstar’, etc, adaptadas a obtener un óptimo rendimiento en producción y calidad de fruto. Estos nuevos cultivares adaptados a condiciones adversas climáticas, resistentes a ciertos patógenos, etc. no ha solventado el problema debido a la retirada del BM. Entre las principales plagas en Florida, se encuentran, diferentes familias de ácaros; Tetranychus urticae, T. turkestani y T. tumidus, insectos; Frankliniella occidentalis, Spodoptera frugiperda, S. eridania, Helicoverpa zea, Familia nitidulidae (Capinera, 2001), Capítulo 5 106 patógenos de suelos como los nematodos; Meloidogyne hapla, Aphelenchoides fragariae, bacterias; Xanthomonas fragariae y hongos fitopatógenos: Botrytis. cinerea, Colletotrichum spp, Sphaerotheca macularis, Mycosphaerella fragariae, Phomopsis obscurans, Marssonina fragariae, Phytophthora spp y Macrophomina phaseolina, entre otros (Peres, 2006). Actualmente, no se conocen cultivares resistentes en el caso de la podredumbre carbonosa, causada por M. phaseolina, observada por primera vez en cultivo de lomos de fresa no fumigados, en el año 2001 en Florida, (Mertely et al., 2005). Desde la prohibición del BM, la incidencia de esta enfermedad ha extendiéndose en zonas de cultivo de fresa como España, Australia, California y Israel (Avilés et al., 2008; Golzar et al., 2007; Koike, 2008; Zveibil y Freeman, 2005, respectivamente). M. phaseolina, es un patógeno de suelo que causa el decaimiento y la necrosis del tejido vascular de la corona, provocando un colapso y posterior muerte de la planta (Fig. 5.2 A y B). Figura 5.2. – A). Plantas de fresa con vasos necrosados por podredumbre carbonosa. B). Planta de fresa colapsada. Algunos agricultores han observado pérdidas por muerte de plantas debido a esta enfermedad de entre un 45 a 75% del total de la producción (Peres et al., 2010). Cortes en coronas enfermas, se puede apreciar un color de marrón oscuro a anaranjado en los vasos vasculares de la corona y tejidos corticales (Mehan y McDonald, 1997; Mertely et al., 2005), además, puede provocar necrosis en las raíces (Ashraf y Javaid, 2007). Noling y colaboradores (2013), determinaron una tabla con la dosis máxima de los actuales fumigantes alternativos al BM, en los que se muestra el A B Capítulo 5 107 control que ejercen sobre las enfermedades, nematodos y malas hierbas, más comunes en el cultivo de la fresa (Tabla 5.1.). Tabla 5.1. – Fumigantes químicos alternativos al Bromuro de metilo en el control de patógenos y malas hierbas, en Florida. Fumigante Dosis máxima Control Nematodos Hongos Malas hierbas Bromuro de Metilo 50/50 350 lb Bueno a Excelente Excelente Medio a Excelente Cloropicrina 300 lb Ninguno a Pobre Excelente Pobre Ioduro de metilo 350 lb Bueno a Excelente Bueno a Excelente Bueno a Excelente Metam sodio 75 gal Inconsistente Inconsistente Inconsistente Telone II 18 gal Bueno a Excelente Ninguno a Pobre Pobre Telone C17 26 gal Bueno a Excelente Bueno Pobre Telone C35 35 gal Bueno a Excelente Bueno a Excelente Medio a Pobre Cloropicrina y 1,3 Dicloropropeno 40/60 300 lb Bueno a Excelente Bueno a Excelente Medio a Pobre Metam potasio 60 gal Inconsistente Inconsistente Inconsistente Dimetil disulfuro 60 gal Bueno a Excelente Bueno a Excelente Pobre a Excelente “gal” = galones. “lb” = libras. Capítulo 5 108 5.3. – Materiales y métodos. 5.3.1. - Diseño experimental y descripción de los tratamientos. En las campañas agrícolas de 2012-13 y 2013-14, se llevaron a cabo ensayos para determinar la eficacia de distintos tratamientos, en la búsqueda de alternativas al BM. Los experimentos se realizaron en una finca colaboradora de la Universidad de Florida situada en Dover. El diseño experimental de las parcelas fue de bloques al azar con tres repeticiones con dos lomos para cada tratamiento. Se aplicaron doce tratamientos durante la campaña agrícola 2012-13 y once tratamientos en 2013-14, además de un testigo para ambas campañas. En cada lomo se plantaron, 392 plantas del cultivar ‘Florida Festival’, lo que supone un total de 784 plantas por tratamiento y repetición. El manejo de cultivo fue común, al realizado en fincas comerciales de cultivo de fresa al aire libre, durante las dos campañas agrícolas del ensayo (Strand, 2008). Los tratamientos aplicados durante las dos campañas agrícolas se muestran en la Tabla 5.2. 5.3.2. – Efecto de los fumigantes en bolsas con mazorca de maíz y coronas infectadas con M. phaseolina. Para llevar a cabo la determinación sobre la efectividad de los tratamientos sobre M. phaseolina, se realizó una infestación de M. phaseolina, en pienso de mazorca de maíz (Kay-kob®) y coronas de fresa secas infestadas con M. phaseolina de campañas anteriores. El pienso de mazorca de maíz fue previamente esterilizado y posteriormente inoculado con trozos de M. phaseolina, crecida en condiciones óptimas y medio de cultivo de PDA (Campbell y van der Gaag, 1993; Dhingra y Sinclair, 1977). El pienso de mazorca de maíz permaneció con las condiciones de humedad propias de la esterilización en cámara de cultivo a 30ºC y oscuridad, durante aproximadamente una semana, con agitación diaria de los botes (para asegurar que todo el pienso de mazorca de maíz fuese infestado con el patógeno). A continuación, con una probeta se midieron 3mL de pienso de mazorca de maíz infestada con M. phaseolina, y se colocaron en pequeñas bolsas de nylon (Figura 5.3). En los lomos de cultivo del ensayo, se realizaron varios agujeros a distintas profundidades 3 y 7 pulgadas (7,6 y 20,3cm) con una sonda calibrada, donde posteriormente se colocaron las coronas secas de fresa y las bolsas de pienso de mazorca de maíz infestadas con M. phaseolina, procediendo al enterrado y tapado de los agujeros con plástico negro de cubierta, hasta la posterior aplicación de los tratamientos en riego por goteo y/o inyección a lomo. . Capítulo 5 115 Tabla 5.4. – Efecto de los fumigantes, en la viabilidad de esclerocios en mazorca de maíz y coronas secas de fresa, infectadas con M. phaseolina, en una finca en Brandon (Florida), durante 2012-13 y 2013-14. Tratamientos y 2012-13 2013-14 Esclerocios viables/bolsa 7,6cm Esclerocios viables/bolsa 20,3cm Esclerocios viables/g de corona 7,6cm Esclerocios viables/bolsa 7,6cm centro Esclerocios viables/bolsa 20,cm centro Esclerocios viables/bolsa 7,6cm lateral Esclerocios viables/g de corona 7,6cm BM:PIC DA 5 d x 4 b 2 e n.a. n.a. n.a. n.a. BM:PIC DB n.a. n.a. n.a. 6 d 4 c 6 c 2 b BM:PIC MD 1 d 9 b n.a. 1 d 1 c 15 c 1 b TEL DA 262 cd 11 b 558 ab 7 d 1 c 2 c 332 b TEL DB 8 d 1 b 120 de n.a. n.a. n.a. n.a. DMDS:PIC DB 4 d 3 b 6 e n.a. n.a. n.a. n.a. DMDS:PIC DA 4 d 5 b 1 e 295 d 1.250 b 927 c 165 b DMDS RG:VAPAM n.a. n.a. n.a. 11 d 2 c 2 c 11 b TRIFECTA IN 31 d 10 b 90 de 18 d 7 c 4 c 6 b 1,3 D DA:PIC 1.037 ab 1.883 a 734 a 1.657 c 160 c 1.165 bc 897 a 1,3 D DB: PIC 696 bc 2.635 a 481 bc n.a. n.a. n.a. n.a. Capítulo 5 116 Continuación Tabla 5.4. Tratamientos y 2012-13 2013-14 Esclerocios viables/bolsa 7,6cm Esclerocios viables/bolsa 20,3cm Esclerocios viables/g de corona 7,6cm Esclerocios viables/bolsa 7,6cm centro Esclerocios viables/bolsa 20,3cm centro Esclerocios viables/bolsa 7,6cm lateral Esclerocios viables/g de corona 7,6cm KPAM 2 d 1 b 1 e 11 d 1 c 1.334 bc 2 b VAPAM 2 d 2 b 4 e 3 d 4 c 4 c 1 b DAZ:INT n.a. n.a. n.a. 3.705 a 2.996 a 4.879 a 336 b DMDS RG:PIC RG 2 d 1 b 11 e 31 d 2 c 6.077 a 23 b UC 1.310 a 2.637 a 268 cd 2.753 b 2.996 a 2.941 b 1.052 a x Esclerocios viables aisladas en medio de cultivo RB, de M. phaseolina. Cada valor es la media de tres repeticiones/tratamiento y tres repicas por muestra. Los valores seguidos por la misma letra en una columna no difieren significativamente, según la prueba MDS (P < 0,005) (datos transformados mediante raíz cuadrada). Se presentan los datos no transformados. “n.a”.= no aplicado. y Los detalles de los tratamientos se describen en la Tabla 5.2. . Capítulo 5 117 Figura 5.5. – Efecto de dos fumigantes, en la viabilidad de esclerocios en mazorca de maíz, infestadas con M. phaseolina, en diferentes profundidades y diluciones. Diluciones Original 1:10 1:100 3”s 7’’c 3’’c 3”s 7’’c 3’’c BM:PIC (50/50) TRIFECTA Capítulo 5 118 Figura 5.6. – Efecto de un fumigante y un control, en la viabilidad de esclerocios en mazorca de maíz, infestadas con M. phaseolina, en diferentes profundidades y diluciones. Diluciones Original 1:10 1:100 3”s 7’’c 3’’c 3”s 7’’c 3’’c CONTROL KAPAM Capítulo 5 119 5.4.2. - Efecto de los fumigantes en la incidencia de podredumbre carbonosa, en la campaña 2013-14. La efectividad de los tratamientos aplicados para el control en la mortalidad de plantas (PM%) y las coronas con podredumbre carbonosa, durante la campaña 2013-14, tuvo valores máximos las parcelas control (UC), con 25,1% de plantas muertas al finalizar la campaña, de las cuales se aisló M. phaseolina (PMCR%), en el 15,4% del total. El tratamiento con Dazitol™en combinación con Integrate 20™ (DAZ:INT), tuvo valores similares tanto en PM%, como en PMCR% (21,4 y 11,3%, respectivamente), no obteniendo diferencias significativas con UC. Los 10 tratamientos aplicados restantes, fueron eficaces en el control de PM% y PMCR%, aunque en todos los tratamientos aplicados se produjo mortalidad, todos tuvieron valores significativamente menores en comparación con las parcelas control, observándose en la aplicación 1,3-dicloropropeno y cloropicrina en inyección a lomo (1,3 D DA:PIC), los valores máximos de mortalidad (3,2%). La menor mortalidad e incidencia de podredumbre carbonosa, se detectó en parcelas tratadas con la combinación de dimetil disulfuro y metam sodio aplicados en riego por goteo (DMDS RG:VAPAM) (1,0% y 0,1%, respectivamente) (Tabla 5.5.). . Capítulo 5 120 Tabla 5.5. – Efecto de los fumigantes en el porcentaje de plantas muertas (PM%) y el porcentaje de incidencia de podredumbre carbonosa causada por M. phaseolina (PMCR%), en una finca en Brandon (Florida), durante 2013-14. Tratamientos Descripción 2013-14 Tipos de plástico Dosis Métodos de aplicación PM%x PMCR%x BM:PIC DB bromuro de metilo:cloropicrina 2,1 bc 0,9 b VIF 218 lb/ta (67/33) Inyección en lomo BM:PIC DM bromuro de metilo:cloropicrina 1,3 c 0,2 b VIF 320 lb/ta (50/50) Inyección en lomo TEL DA 1,3-dicloropropeno:cloropicrina 2,3 bc 1,0 b LDPE 320 lb/ta (50/50) Inyección en lomo DMDS:PIC DA dimetil disulfuro:cloropicrina 1,9 bc 0,4 b VIF 60 gpta Inyección en lomo DMDS RG:VAPAM dimetil disulfuro:metam sodio 1,0 c 0,1 b VIF 50:75 gpta Riego por goteo TRIFECTA IN dimetil disulfuro:1,3- dicloropropeno:cloropicrina: 1,7 bc 0,3 b VIF 400 lb/ta Inyección en lomo 1,3 D DA:PIC 1,3-dicloropropeno:cloropicrina 3,2 b 1,0 b LDPE 300 lb/ta Inyección en lomo KPAM Metam potasio 2,6 b 1,0 b LDPE 60 gpta Riego por goteo VAPAM Metam sodio 2,1 bc 0,9 b LDPE 75 gpta Riego por goteo DAZ:INT Alil isocianato:surfactante 21,4 a 11,3 a LDPE 6,25 gpta Riego por goteo DMDS RG:PIC RG dimetil disulfuro:cloropicrina 2,0 bc 0,9 b VIF 60 gpta Riego por goteo UC Control no tratado 25,1 a 15,4 a LDPE n.a. n.a. x Cada valor es la media de cuatro repeticiones/tratamiento. Los valores seguidos por la misma letra en una columna no difieren significativamente según la prueba MDS (P < 0,05) (datos transformados mediante raíz cuadrada). Se presentan los datos no transformados. “n.a.” = no aplicado Capítulo 5 121 5.5. – Discusión. Durante las campañas agrícolas 2012-13 y 2013-14, se llevaron a cabo un total de 15 tratamientos a diferentes dosis, métodos de aplicación y cubiertas plásticas en lomo, además de un testigo no tratado. De los tratamientos aplicados en inyección a lomo, la combinación de bromuro de metilo con cloropicrina a las tres dosis, fueron siempre efectivas, en el control de M. phaseolina, en ambas profundidades (BM:PIC DA, DM y DB). El tratamiento con el producto TRIFECTA® IN fue efectivo en ambas campañas agrícolas, tanto en bolsas de pienso con mazorca de maíz como en corona seca de fresa, infectada con M. phaseolina. Entre los tratamientos más efectivos durante la campaña 2012-13, fueron las aplicaciones de dimetil disulfuro en combinación con cloropicrina en ambas dosis (DMDS:PIC DA y DB). Sin embargo, el tratamiento TEL DB fue efectivo en la erradicación de esclerocios en bolsas con pienso de mazorca de maíz inoculada, no obtuvo buenos resultados en las coronas infectadas de fresa. De los tratamientos aplicados en riego por goteo, VAPAM fue el más efectivo durante las dos campañas agrícolas, que junto con el tratamiento DMDS RG:VAPAM (2013-14), consiguieron reducir de manera significativa las poblaciones de esclerocios en las bolsas de nylon con pienso de mazorca de maíz y coronas secas de fresa, a diferentes profundidades tanto en la parte central del lomo como en el lateral. Por el contrario, los tratamientos de KAPAM, y DMDS RG:PIC RG, fueron efectivos a distintas profundidades en los tres agujeros de la parte central del lomo, mientras que, no fueron eficaces en las bolsas de pienso de mazorca de maíz inoculadas, enterradas a 7,6cm en el lateral del lomo y más alejadas de la cinta de riego. Por lo que este estudio reveló que la difusión de los tratamientos de KAPAM, y DMDS RG:PIC RG, en aplicaciones de riego por goteo no resultó efectiva en la erradicación de esclerocios de M. phaseolina. Durante las dos campañas agrícolas de estudio, el tratamiento estándar de dicloropropeno más cloropicrina no tuvo una buena eficacia, en el control de M. phaseolina, para ninguna de las dosis aplicadas (1,3 D DA:PIC 2012-13 y 2013-14 y 1,3 D DB:PIC 2012-13). La combinación de Dazitol™ con Integrate 20™ (DAZ:INT 2013-14), obtuvo malos resultados en todas las profundidades y métodos de inoculación en el control de M .phaseolina. De acuerdo con estos estudios, Zveibil y colaboradores (2012), realizaron ensayos con coronas de fresa infectada por M. phaseolina a 30cm de profundidad, con aplicaciones de Cloropicrina a diferentes dosis (180 y 360 lb/a), obteniendo resultados ineficaces en la reducción del porcentaje de esclerocios y no encontrando diferencias significativas al control. Sin embargo, en aplicaciones de metam sodio a distintas dosis (40 y 70lb/a), obtuvieron los mejores resultados en erradicación de esclerocios de M. phaseolina, ya que encontraron diferencias Capítulo 5 122 significativas al control. En nuestros ensayos, el metam sodio (VAPAM) también obtuvo buenos resultados en el control de la enfermedad de podredumbre carbonosa y en la erradicación de esclerocios de M. phaseolina. Los diferentes plásticos para la cubierta de lomos usadas para estos ensayos, se realizó debido a la pérdida por difusión del fumigante después se su aplicación, ya que el plástico estándar (LDPE), tiene una alta permeabilidad. En este ámbito la industria provee al sector fresero de nuevos plásticos más impermeables, entre ellos: SIF (Semi-impermeable), VIF (Virtualmente impermeable), TIF (Totalmente impermeable), EVOH (etileno vinilo alcohol) (Noling et al., 2013). Nuestros trabajos realizados con distintos plásticos de cobertura del lomo, fueron encaminados a comprobar la eficacia contra la viabilidad de los esclerocios de M. phaseolina, después de la aplicación del fumigante, en la finca de Dover. En la campaña 2012-13, se aplicó el tratamiento estándar (1,3 D:PIC), y Telone C35®, ambos con aplicación en inyección a lomo, a diferentes dosis, en las aplicaciones de dosis alta el lomo fue cubierto con plástico LPDE y las aplicaciones a dosis bajas con plástico VIF (300 y 250lbs/ta para 1,3 D:PIC, y 35 y 30gpta para el Telone C35®). Estos ensayos determinaron, que el plástico VIF resultó más efectivo que el LDPE, en la erradicación de esclerocios de M. phaseolina, incluso cuándo en lomos con LDPE se aplicaron dosis del fumigante más elevada que para VIF. Benlioğlu y colaboradores (2014), determinó que aplicaciones de metam sodio (100ml/m2) mejoró significativamente las producciones de fresa entre 18,5 – 21,6% y 14,5 – 18,5%, para LDPE y VIF, respectivamente. Sin embargo, estos mismos autores determinaron que la fruta de fresa comercial, no mejoró con ningún otro fumigante aplicado, incluyendo la práctica de la solarización. Zveibil y colaboradores (2012), observó que la erradicación de poblaciones remanentes de M. phaseolina en suelo, puede depender de la proveniencia del inóculo, así, los microesclerocios de suelo, podrían ser más susceptibles a los efectos de fungicidas y la solarización, que los que han infectado tejidos de plantas como estolones o coronas de fresa. Los resultados obtenidos en nuestro trabajo, indican que en el caso de Telone C35® aplicado a diferentes dosis (TEL DA y TEL DB), funciona bien contra bolas de pienso de mazorca de maíz infestada con M. phaseolina, pero no contra los esclerocios de las corona seca de fresa, algo parecido ocurrió con la fumigación de Trifecta®, aunque los resultados no fueron tan evidente como con la aplicación del fumigante Telone C35®. Estos resultados están en concordancia con los obtenidos por Hutton y colaboradores (2013), que mostró en algunos fumigantes de suelo, diferente rango en la capacidad para erradicar los microesclerocios de M. phaseolina, en suelos de cultivo de fresa intensivo. Sin embargo, otros estudios previos en suelo fumigados con BM, Capítulo 5 123 demostró que las coronas enterradas infectadas con M. phaseolina, fue el único capaz de erradicar en su totalidad los microesclerocios (Hutton, 2010). Todo esto señala, la importancia que tiene para los agricultores y técnicos, la eliminación de los residuos y restos de fresas infectados de los campos de fresa campaña tras campaña (Hutton et al. 2013). Por último, en la última campaña agrícola 2013-14, se registró la mortalidad de plantas de fresa y se determinó el porcentaje de corona con podredumbre carbonosa de un total de 11 tratamientos fumigantes aplicados y un control. Todos los tratamientos y formas de aplicación resultaron efectivos contra la mortalidad y el control de podredumbre carbonosa causada por M. phaseolina, excepto el tratamiento con alil isocianato (Dazitol™) en combinación con un surfactante (Integrate 20™), que tuvo valores de PM y PMCR, no diferentes significativamente y por tanto similares a los obtenidos en las parcelas control. 5.6. – Bibliografía. Anónimo. 2007. U.S. Dept. of Agriculture/National Agricultural Statistics Service. 2009. 2007 Census of Agriculture: National, State and County Tables. U.S. Dept. of Agriculture/National Agricultural Statistics Service. Anónimo. 2009a. IBIS World Industry Report, Fruit & Tree Farming in the US, January, 2009 International Group, Ltd., Fruit - U.S., February 2009. Anónimo. 2009b. U.S. Dept. of Agriculture/National Agricultural Statistics Service. 2009. Vegetable Summary 2009. National Agricultural Statistics Service. U.S. Dept. of Agriculture/National Agricultural Statistics Service. 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