Formulación de insertos de levodopa para su administración intranasal
Abstract
El Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa debilitante que afecta a las células del Sistema Nervioso Central que controlan el movimiento. Se caracteriza por un déficit de dopamina en el organismo, el cual es provocado por una pérdida de las neuronas dopaminérgicas situadas en la sustancia negra del cerebro. El principal tratamiento para esta enfermedad es Levodopa, precursor de la dopamina, de administración oral fundamentalmente. Sin embargo, debido a los problemas que presenta este fármaco en cuanto a su degradación a nivel periférico, el objetivo de este trabajo está enfocado en proponer una formulación en forma de inserto en film, para su posterior administración por vía intranasal. Para ello, se buscó la composición polimérica más adecuada para elaborar un gel que servirá de soporte para obtener el film. Finalmente, se establecieron diferentes mezclas de Hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y Pluronic F127, sobre los cuales se añadieron Propilenglicol y Chitosano. Se realización ensayos de morfología, uniformidad de peso, uniformidad de espesor, hinchamiento y mucoadhesividad. Tras seleccionar la formulación óptima, se incorporó al gel una formulación de liposomas, ya estudiado previamente. Finalmente, se llevaron a cabo estudios de liberación y permeación in vitro con el fin de dilucidar el comportamiento de estos sistemas.
Full text
FORMULACIÓNDEINSERTOS DELEVODOPAPARASU ADMINISTRACIÓNINTRANASAL FacultaddeFarmacia UniversidaddeSevilla ConstanzaAretioMedina Curso2018/2019
‐1‐ UNIVERSIDADDESEVILLA FACULTADDEFARMACIA GradoenFarmacia DepartamentodeFarmaciayTecnologíaFarmacéutica TRABAJODEFINDEGRADO FORMULACIÓNDEINSERTOSDELEVODOPAPARASUADMINISTRACIÓN INTRANASAL ALUMNA:ConstanzaAretioMedina TUTORA:Profa.MaríaLuisaGonzálezRodríguez TIPODEPROYECTO:Experimental PRESENTACIÓN:FacultaddeFarmacia Fecha:juliode2019
‐2‐ RESUMEN El Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa debilitante que afecta a las células del SistemaNerviosoCentralquecontrolan el movimiento. Se caracteriza por un déficit de dopamina en el organismo, el cual es provocado por una pérdida delasneuronas dopaminérgicassituadasenlasustancianegradelcerebro. El principal tratamiento para esta enfermedad es Levodopa, precursor de la dopamina, de administraciónoralfundamentalmente.Sinembargo,debidoalosproblemasquepresentaeste fármacoencuantoasudegradaciónanivelperiférico,elobjetivodeestetrabajoestáenfocado enproponerunaformulaciónenformadeinsertoenfilm,parasuposterioradministraciónpor víaintranasal. Paraello,sebuscólacomposiciónpoliméricamásadecuadaparaelaborarungelqueserviráde soporte para obtener el film. Finalmente, se establecieron diferentes mezclas de Hidroxipropilmetilcelulosa(HPMC)yPluronicF127,sobreloscualesseañadieronPropilenglicol y Chitosano. Se realización ensayos de morfología, uniformidad de peso, uniformidad de espesor,hinchamientoymucoadhesividad.Trasseleccionarlaformulaciónóptima,seincorporó algelunaformulacióndeliposomas,yaestudiadopreviamente.Finalmente,sellevaronacabo estudiosdeliberaciónypermeacióninvitroconelfindedilucidarelcomportamientodeestos sistemas. Losestudiosrevelaronquelamejorproporcióndeloscomponentesenlamezclaparaobtener insertosconcaracterísticasadecuadasparaadministraciónintranasalfuede8gdeHPMCal4% p/p,2gdePluronicF127al17%p/p,2,2gdeChitosanodealtaviscosidadal2%p/vy0,8gde Propilenglicol.EncuantoalaincorporacióndelosliposomasdeLevodopaenlosinsertos,se concluyó,enbasealperfilobtenido,queelsistemaproporcionaunaliberaciónprolongadadel fármaco,porloquepodríaserunaestrategiaaseguirprofundizandoenellacomoalternativa eneltratamientodelParkinson. PALABRASCLAVE: Parkinson,Levodopa,insertos,intranasal.
‐3‐ ÍNDICE 1.INTRODUCCIÓN.................................................................................................... 4 1.1.ENFERMEDADDELPARKINSON..................................................................... 4 1.2.DOPAMINA:FUNCIÓNYSÍNTESIS.................................................................. 5 1.3.TRATAMIENTO............................................................................................... 7 1.3.1.TRATAMIENTONOFARMACOLÓGICO............................................... 8 1.3.2.TRATAMIENTOQUIRÚRGICO............................................................. 8 1.3.3.TRATAMIENTOFARMACOLÓGICO..................................................... 8 1.4.VÍASDEADMINISTRACIÓNDELEVODOPA....................................................12 1.4.1.VÍAORAL............................................................................................12 1.4.2.VÍAINTRAVENOSA.............................................................................13 1.4.3.VÍAINTRANASAL................................................................................13 2.OBJETIVOS............................................................................................................15 3.METODOLOGÍA.....................................................................................................15 3.1.COMPOSICIÓNDELGEL..................................................................................15 3.2.DISEÑOEXPERIMENTALPARALAELABORACIÓNDELGEL............................17 3.2.1.ENSAYOS............................................................................................19 3.3.PREPARACIÓNDEINSERTOSCONLEVODOPA...............................................20 3.3.1.ENCAPSULACIÓNDELEVODOPAENLIPOSOMASE INCORPORACIÓNENELGEL1...........................................................21 3.3.2.INCORPORACIÓNDELEVODOPAENLOSGELES2Y3.......................22 3.4.CUANTIFICACIÓNDELEVODOPAENINSERTOSMEDIANTEHPLC.................22 3.5.ESTUDIODEPERMEACIÓNINVITRO.............................................................23 4.RESULTADOS........................................................................................................23 4.1.SELECCIÓNDELASCARACTERÍSTICASDELGEL..............................................23 4.2.CARACTERIZACIÓNDELOSINSERTOS............................................................27 4.2.1.CARACTERIZACIÓNMORFOLÓGICA...................................................27 4.2.2.ENSAYODEUNIFORMIDADDEPESO.................................................28 4.2.3.ENSAYODEESPESOR.........................................................................28 4.2.4.ENSAYODEHINCHAMIENTO.............................................................29 4.2.5.ENSAYODEMUCOADHESIVIDAD.......................................................32 4.3.INCORPORACIÓNDELEVODOPAENINSERTOS.............................................33 4.4.ENSAYODEPERMEACIÓNINVITRO...............................................................34 5.CONCLUSIONES....................................................................................................36 6.BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................37
‐4‐ 1. INTRODUCCIÓN 1.1. ENFERMEDADDELPARKINSON El Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa debilitante que afecta a las células del SistemaNerviosoCentralquecontrolanelmovimiento.Actualmente,constituyeeltrastorno neurológicodemayorcrecimientoenelmundo.Secaracterizaporundéficitdedopaminaenel organismo,elcualesprovocadoporunapérdidadelasneuronasdopaminérgicassituadasenla sustancianegradelcerebro.Estáestablecidoquelaneurodegeneraciónestáproducidaporla acumulacióndeproteínasllamadaα‐sinucleínasenelcitoplasmadelasneuronas,lascualesse agreganconformadolosconocidoscuerposdeLewy(Kimetal.,2018;Richteretal.,2019) Noseconoceconcertezalaetiologíadeestaenfermedad,aunquesesugierequesucausapuede sermultifactorial,dondesecombinanfactoresgenéticos,medioambientalesyelenvejecimiento delorganismo.Laincidenciadelaenfermedadaumentaapartirdelos60años,llegandoa afectaral1%delapoblacióndemásde65años.Asímismo,setratadeunaenfermedadmás comúnenhombresqueenmujeres. Se caracteriza principalmente por síntomas motores como bradicinesia, temblor, rigidez muscular,inestabilidaddelamarchaoproblemasdeequilibrioycoordinación,entreotros (Richter et al., 2019). Estos síntomas motores aparecen cuando ya se han perdido aproximadamente un 60% de neuronas dopaminérgicas y la cantidad de dopamina se ve reducidaun80%(Morales‐Briceñoetal.,2011).Sinembargo,estaenfermedadtambiénconlleva síntomasnomotorescomosoneldeteriorocognitivo,ladisfunciónautonómica,lostrastornos delsueño,ladepresiónylahiposmia(Kimetal.,2018). Encuantoaldiagnósticodelaenfermedad,ésteesfundamentalmenteclínico,yaquesebasa enunexamenfísicoparaidentificarlossíntomascaracterísticosyenlahistoriadelpaciente (McKenzieetal.,2018).Encuantoalossíntomas,setienequepresentarlacombinaciónde bradicinesiacon,almenos,unsíntomamás(temblorenreposo,rigidezoinestabilidadpostural). ElParkinsonesunaenfermedadprogresiva,variableenfuncióndelapersona.Alolargodel trascursodelaenfermedad,sesucedendiferentesfases,quevandesdelaafectacióndeunsolo ladodelcuerpoounapartedelmismo,dondeelpacienteaúnesindependiente,hastallegara una afectación severa de todo el organismo, convirtiéndose en una persona dependiente. Actualmente,aunnoexistecuraparaestaenfermedad.
‐11‐ dosisdeL‐dopa,yportanto,reducirelperiodo“off”delospacientes(Deaneetal., 2009). Por ello, se trata de terapias coadyuvantes al tratamientoconL‐dopa, previniendo así su metabolismo y mejorar su biodisponibilidad. Aquí se engloban fármacoscomoEntacapona,TolcaponayOpicapona. Agonistasdeladopamina:setratadefármacosquevanaactuarsobrelosreceptores deladopamina,principalmentesobrelosD2,ejerciendounaacciónsimilaraladela dopamina.Estegruposepuededividirendos:losderivadosergóticosylosnoergóticos. Losderivadosergóticosactualmenteyanoseutilizantantodebidoaqueestosproducen unaseriedereaccionesadversastalescomofibrosispleuropulmonaryfibrosisvalvular cardiaca.EntreelloscabedestacaralgunosejemploscomoCabergolinayBromocriptina. Enelgrupodelosnoergóticosseincluyenunaseriedecompuestosloscualeshansido desprovistosdeestasreaccionesadversas,porloquesonfármacos más seguros. AlgunosdeellossonApomorfina,Rotigotina,Pramipexol,RopinirolyPiribedil.Estos fármacossepuedenadministrarsolosoencombinaciónconL‐dopa,reduciendoasísus efectossecundarios.Unagranventajadeestegrupodefármacosesquetienenunavida mediamáslargaqueL‐dopa,loquelesconvierteenungrancandidato como tratamientocomplementarioenpacientesconfluctuacionesmotoras(Kimetal.,2018). Susreaccionesadversasmáscomunessonrespuestaspsicóticas,discinesias,náuseasy vómitos. EnlaFigura5serecogeamododeesquema,elnivelalqueactúanlosdiferentesgrupos farmacológicosempleadoseneltratamientodeestapatología. Figura5.Dianasfarmacológicasdopaminérgicas(Kimetal.,2018)
‐12‐ Anticolinérgicos:estegrupodefármacoseranelprincipaltratamientodela enfermedad del Parkinson hasta la introducción de L‐dopa. Se trata de fármacos antagonistas del receptor muscarínico. La degeneración de sustancia negra en el cerebroprovocaunadisminucióndelacantidaddedopamina,yestoasuvezconlleva un desequilibrio entre las vías colinérgicas y dopaminérgicas (Brocks, 1999). Estos fármacosloquehacenesintentarcontrolarlasvíascolinérgicas. Sus efectos antiparkinsonianossondébiles,ayudansobretodoacontrolareltemblorylarigidez, siendo sus principales efectos secundarios la sequedad de boca,estreñimiento, retenciónurinaria,visiónborrosa,etc. Amantadina: setratadeunfármacoantiviralqueseutilizaeneltratamiento sintomáticodelvirusdelainfluenza(virusdelagripe),especialmenteenpacientesde altoriesgodondelavacunaciónnoestáindicada.Sumecanismoantiparkinsonianoes confuso. Los posibles mecanismos incluyen tanto las vías colinérgicas como las vías dopaminérgicas,aumentandolasíntesisylaliberaciónoinhibiendolarecaptaciónde dopamina(Brocks,1999).Setratadeunprincipioactivocontrovertido,yaquetiene facilidaddeajustededosisysusreaccionesadversassonescasas(manchasenlapiel, visión borrosa, edema). Sin embargo, después de varios meses laeficaciadela amantadina desaparece. Actualmente, es el único tratamiento disponible para la disquinesiaproducidaporlaL‐dopa(Kimetal.,2018). 1.4. VÍASDEADMINISTRACIÓNDELEVODOPA 1.4.1. VÍAORAL TradicionalmentelaL‐dopaseadministraporvíaoral.Sinembargo,estefármacopresentaun metabolismopresistémicoimportantedebidoalaaccióndelaL‐aminoácidodescarboxilasa, consiguiendoquetansóloun30%deladosisadministradaalcancelacirculaciónsistémica.Esto suponeunproblemaimportanteyaquelabiodisponibilidaddelaL‐dopaesdeporsíbaja. Comosolución,lospreparadosoralesdeL‐dopaseadministranjuntoconinhibidoresdelaL‐ aminoácidodescarboxilasaconloqueseconsigueunabiodisponibilidadoraltresvecesmayory además,seconsiguereducirladosisefectivaylagravedaddelosefectossecundarios(Contin andMartinelli,2010). LasfluctuacionesmotorasqueseproducencomoconsecuenciadelusodeL‐dopasedeben principalmenteaqueesadministradaporvíaoralyesadministrada a elevadasdosis. Para conseguirlareversióndelossíntomasdelParkinsonesnecesarioalcanzarunasdeterminadas
‐13‐ concentracionesensangre(Lewitt,2015).Porello,seestáninvestigandonuevasformasde administración. 1.4.2. VÍAINTRAVENOSA AunquelaadministraciónoraldeL‐dopasiguesiendodeelección,lavíaintravenosaposeeuna seriedeventajas.Medianteestetipodeadministración,esposibleconocerconmayorexactitud laconcentraciónquealcanzaL‐dopaensangreyaquelosmedicamentosadministradosporvía oraltienencaracterísticasdeabsorcióndiferentesyvariablesenfuncióndelpaciente.Además, estavíatambiénpermitemantenerconstanteslasconcentracionesenelcerebro,loqueesútil paradeterminadosestudios(Siddiqietal.,2016).Además,almantenerconcentracionesmás constantesqueporvíaoral,tambiénseestádisminuyendoelfenómeno“on‐off”.Sinembargo, setratadeunavíamenoscómodaparaelpacientealahoradeadministrarlamedicación. 1.4.3. VÍAINTRANASAL Lavíaintranasaleslaformamássimpleydirectadeadministrarfármacoscuyopuntofinalesel cerebro. Se trata de una vía de fácil administración, de acción rápida, segura, no invasiva, observándoseconcentracionesyefectoselevadosenelSNCentiempospocosmayoresdeuna hora.Suelevadaefectividadsedebeaqueesunazonaaltamentevascularizadaconunagran superficiedeabsorción,enlacualseproduceuntransportedirectodefármacosalacirculación sanguínea,evitandoasíelmetabolismodeprimerpasohepático,yportanto,mejorandosu biodisponibilidad(Battagliaetal.,2018;MillerandBorgman,1985).Medianteestavíasepueden administrardemaneraefectivadesdemacromoléculashastamoléculasdebajopesomolecular, lascualessoncapacesdeatravesarlabarrerahematoencefálicapordiferentesmecanismos. Encomparaciónconotrasvías,estapresentaunaseriedeventajas.Entreellasseencuentran: elagenteterapéuticonotienequesufrirningunamodificaciónparaseradministradohaciael cerebro;mejoraelcumplimientoporpartedelpacienteyaquepermitelaautomedicaciónalser una vía sencilla; se trata de una alternativa a la vía parentera, especialmente para la administracióndeproteínas,péptidos,oinclusocélulasmadre(PardeshiandBelgamwar,2013). Sinembargo,tambiénpresentainconvenientes.Setratadeunavíaenlaqueexisteunagran variabilidadenlaconcentraciónalcanzableenlasdiferentesregionesdelcerebroysepuede producir aclaramiento mucociliar. Además, un uso continuado de esta vía puede ocasionar dañosenlamucosa,provocandounavariabilidadenlaabsorción.Situacionespatológicascomo lacongestiónnasalpuedeinterferirenlaadministracióndemedicamentos.
‐14‐ Encuantoalasformulacionesempleadasenestavía,existeunagranvariedad.Todasellasdeben compartirlascaracterísticasdelamucosanasal;portanto,debenserisotónicasyligeramente tamponadasparamantenerunpHde5.5a6.5.Tradicionalmente,estavíasehaempleadocon fineslocales,empleándoseparaellosprays,soluciones,suspensiones,emulsiones,geles,gotas, polvos,entreotras.Algunosejemplosdefármacosadministradosporestavíaparaejercerun efectolocalsondescongestivosyopioides(ParedesMogollo,2015). Sinembargo,actualmente,sebuscaelefectosistémicoenlaadministracióndefármacospor esta vía. La principal estrategia para conseguir este efecto son las nanopartículas. Éstas encapsulanalfármaco,protegiéndolodeladegradacióntantobiológica como química que puedasufrirensutransportehaciaelcerebro.Conestoseconsigue una mejora de la biodisponibilidad en el cerebro del fármaco administrado. Además, debido a su pequeño tamaño,eláreasuperficialesmayor,loqueimplicaunaliberaciónyuntransportemásrápido (Mistryetal.,2009).Estossistemaspuedensernanoomicroemulsiones,nanotrasportadores micelares, nanopartículas lipídicas sólidas, chitosano, superficie de lecitina, ciclodextrinas, polietilenglicol,entreotras.EnlaTabla1seexponenalgunosejemplosdefármacosysusistema nanoparticularempleadosenestavía. SISTEMADE ADMINISTRACIÓN FÁRMACO PATOLOGÍA REFERENCIA Nanopartículas lipídicassólidas Risperidona Esquizofrenia/Trastorno bipolar (Pateletal.,2011) Nanoemulsión Olanzapina Esquizofrenia/Trastorno bipolar (Kumaretal.,2008) Ciclodextrinas Estradiol Alzheimer (Wangetal.,2006) Chitosano Ropinirol Parkinson (Khanetal.,2010) Nanotransportadores micelares Zolmitriptán Migraña (Jainetal.,2010) Tabla1.Fármacosysistemasdeadministraciónempleadosenlavíaintranasalconefectos sistémicos.
‐15‐ 2. OBJETIVOS La administración de Levodopa sigue siendo el principal tratamiento de la enfermedad del Parkinson. En base a las limitaciones que presenta este fármaco para su administración sistémica, ya expuestas anteriormente, se plantea direccionar la investigación hacia la vía intranasal.Porestavía,medianteaplicaciónlocal,seconsigueunefectosistémicodelfármaco, actuandodeformarápida,eficazysinsufrirdegradacioneshastallegaralcerebro. Basándoseenlosantecedentesexpuestosenlasecciónanterior,elprimerobjetivoplanteado enelpresentatrabajoestáencaminadoabuscarlaformulaciónmás adecuada para la elaboración de insertos intranasales capaces de liberar el fármaco de manera prolongada, seleccionándoseaquellaconlaqueseconsiganinsertosconpropiedadesadecuadasenaspectos dehinchamientoypotencialadherenciaalamucosanasal.Tambiénsevaloraránaspectoscomo lamorfología,elespesorylauniformidaddepeso. Unavezseleccionadalacomposicióndelinserto,seplanteacomosegundoobjetivovalorarla capacidad de liberación de Levodopa de los insertos mediante tres formas distintas de incorporarelfármacoenlaformulación.Seestudiarálaincorporacióndelfármacoenliposomas, conelfindeprotegerloyproporcionarunaliberaciónprolongada,oincorporarladirectamente a la formulación.Además, también se valora la influencia de la adición alfármaco deHP‐β ciclodextrina,formandocomplejos,conelfindedeterminaresteefectosobrelaestabilidad. 3. METODOLOGÍA 3.1. COMPOSICIÓNDELGEL Basándoseenestudiosprevios,laselecciónquesehizofinalmentedeloscomponentesdelgel fueronHPMC,ChitosanoyPluronicF127.TantoChitosanocomoPluronicposeencapacidad mucoadhesiva,locualesunaventajaparalavíaintranasal.ElHPMCseincluyó,principalmente, comoagentegelificanteparaaumentarlaconsistenciadelosinsertos,aunquetambiéntiene ciertacapacidadmucoadhesiva. LaseleccióndelaproporcióndelosgelesenlamuestraseiniciócondistintasmezclasdeHPMC yPluronicrecogidasenlaTabla2debidoaquesonlosdosgelesmásviscososdelamezcla.Se buscabadeterminarlamejorproporciónalacualestosgelesseinterpusieranperfectamentey noseprodujeraunaseparación.Paraello,seelaboraronHPMC5%p/pyPluronic17%p/p, ambosenaguadestilada.
‐16‐ HPMC(%) PLURONIC(%) 20 80 30 70 40 60 50 50 60 40 70 30 80 20 Tabla2.ProporcionesdeHPMCyPluronicestudiadasparalaelaboracióndelgel. LasmezclasdeHPMC/Pluronictuvieronunpesofinalde10gramos.Unavezelaboradas,se agitarondurantetreshorasyposteriormentesesecaronenlaestufaa38°Cdurante24‐48 horas. Sinembargo,trasobservarquelosfilmsresultanteserandemasiadosrígidos,seprocedióa incluir en la formulación un plastificante con el fin de que aportara al inserto una mayor flexibilidad.Seprobarondosplastificantesdiferentes,GlicerinayPropilenglicol.Basándonosen estudios anteriores, se añadieron en exceso a la formulación previamente preparada en cantidadesde0,8y1g.Finalmente,sedecidióqueelplastificantequeseibaaemplearerala Glicerinaenunacantidadde0,8g. Unavezobtenidoslosresultadosdeestosestudios,lamezclasqueseobtuvieronnoteníanunos resultadosadecuados,porloqueseprocedióabajarlaconcentracióndelHPMC.Enestecaso seprobaronconcentracionesdeHPMCde4y4,5%p/pcondiferentesproporcionesdemezcla reflejadasenlastablas3y4. HPMC (%) PLURONIC (%) GLICERINA (g) HPMC (%) PLURONIC (%) GLICERINA (g) 80 20 0,8 80 20 0,8 70 30 0,8 70 30 0,8 60 40 0,8 60 40 0,8 Tabla3.Proporcionesdelamezclacon HPMCal4,5%p/p Tabla4.Proporcionesdelamezclacon HPMCal4%p/p
‐17‐ Para garantizar la mucoadhesividad de los insertos se añadió Chitosano a diferentes concentraciones,concretamente1y2%p/v.Sinembargo,paraladisolucióndeestecompuesto esnecesarialapresenciaácidoacético,porloquelacantidaddeésteenlacomposicióntotal delinsertodebesermínima.Trasestudiosprevios,sedeterminóquelacantidaddeChitosano queseañadióalgelseriade2,2g(enexceso). Comoresumen,lacantidadtotaldegelseráde8gdeHPMC,2g de Pluronic, 0,8 g de Propilenglicoly2,2gPluronic,siendoeltotalde13gramos(Figura6). Figura6.Composiciónfinaldelgel 3.2. DISEÑOEXPERIMENTALPARALAELABORACIÓNDELGEL Unavezseleccionadalaproporcióndeloscomponentes,seplanteabanunaseriedevariables enlacomposicióndelgellascualesinfluiríanensuscaracterísticasfinales.Paraestudiarestas variables,seaplicóundiseñoexperimentalalestudiodelacomposicióndelgel,estudiandola influenciadelasdistintasvariablesenciertascaracterísticasdelaformulación,conelfinde obteneraquellaconlasmejorescaracterísticasparaunaposterioradministraciónintranasal. Paraello,serealizóunafasedecribado,enlacualsepretendediscriminarentreunnúmero determinado de variables y niveles, aquellos que ejercen una influencia estadísticamente significativasobrelasrespuestasenevaluación.Enconcreto,seestudiaelefectoquetieneel cambioenlosnivelesdecadavariablesobrecadarespuestaconsiderada.Enelpresentetrabajo sehadesarrolladounestudioenelqueseintentaponerdemanifiestolainfluenciaqueejercen variablessobrelascaracterísticasdelaformulación. Paralaetapadecribado,seseleccionóunamatrizortogonalL16deTaguchiquecorrespondíaa undiseñofactorial2(5‐1).Paraesteestudio,losfactoresylosnivelesquedanrecogidosenlaTabla 5.
‐18‐ VARIABLES NIVELINFERIOR NIVELSUPERIOR Variable1:ConcentracióndeHPMC4%p/p 4,5%p/p Variable2:TipodeChitosano Mediaviscosidad Altaviscosidad Variable3:ConcentracióndeChitosano 1%p/v 2%p/v Variable4:AdicióndelChitosano JuntoconelHPMC Alfinal Variable5:Tipodeplastificante Glicerina Propilenglicol Tabla5.Variablesseleccionadasenelestudioysusniveles. Elresultadotrascombinarlasvariablesseleccionadasendosnivelesdiferentesfuerondieciséis experimentos,loscualesquedanrecogidosenlaTabla6.Todoslosexperimentosserealizaron porduplicadoconelfindeestimarlavariabilidaddelosdatosy,porlotanto,losvaloresde error. Run Concentraciónde HPMC(%p/p) Tipode Chitosano Concentraciónde Chitosano(%p/v) Adicióndel Chitosano Tipode Plastificante 1 4 HV 1 B GL 2 4 HV 1 A PG 3 4 HV 2 B PG 4 4 HV 2 A GL 5 4 MV1 BPG 6 4 MV 1 A GL 7 4 MV 2 B GL 8 4 MV 2 A PG 9 4.5 HV 1 B PG 10 4.5 HV 1 A GL 11 4.5 HV 2 B GL 12 4.5 HV 2 A PG 13 4.5 MV 1 B GL 14 4.5 MV 1 A PG 15 4.5 MV2 BPG 16 4.5 MV 2 A GL Tabla6.MatrizortogonaldeTaguchiL16utilizadaenesteestudio.(HV:altaviscosidad.MV: mediaviscosidad.A:alfinal.B:juntoconelHPMC.GL:glicerina.PG:propilenglicol)
‐19‐ Paraevaluarlosresultadosobtenidos,lasmuestrasresultantessesometieronaensayosde uniformidad de espesor, hinchamiento y mucoadhesividad, así como una caracterización morfológica. En la evaluación de estos resultados se emplearon el análisis de la varianza (ANOVA)yelanálisisdelasmedias(ANOM)paradeterminarquéfactoresejercíanunainfluencia estadísticamentesignificativasobrelasrespuestasenevaluación. Parallevaracabolaoptimizacióndelasdistintasrespuestas,seestableciócomocriterioeldeseo demaximizarominimizarcadaunadeellas(Tabla7). Tabla7.Objetivoparacadarespuestaestudiada. Traselestudiodelasvariables,sedeterminaronaquellasqueteníanunamayorinfluenciaenla formulación.Conesteestudio,sedeterminaronlascaracterísticasóptimasquedebíatenerla formulación. 3.2.1. ENSAYOS Traslaobtencióndelosinsertoscondiferentescomposiciones,seprocedióarealizardiversos ensayosconelfindeseleccionarlaformulaciónquepresentarámejorescaracterísticas.Para ello,los16lotessecortaroneninsertosde1cm2.Losensayosqueserealizaronfueronlosque seexplicanacontinuación. Ensayodeuniformidaddepeso:serealizópesandoindividuamente6insertosdecada lote.Secalculóladesviaciónestándar(SD)yladesviaciónestándarrelativa(RSD). Ensayodeespesor:serealizómidiendoelespesorde6insertosdecadalote.Secalculó lamedia,desviaciónestándar(SD)yladesviaciónestándarrelativa(RSD). Ensayodehinchamiento:serealizópesandouninsertoenunpesamuestrasalquese leañade1mLdefluidonasalartificial(SNF),elcualestácompuestopor5mg/mLNaCl, 0,32mg/mLCaCl2∙2H2Oy1,29mg/mLKClajustadoapH6,2(Pauletal.,2018).Cada mediahoraydurante6horasseretiraelexcesodemedioysepesaelinserto.Elensayo serealizóportriplicado.Conlosdatosobtenidossecalculólaratiodehinchamiento (SR).DeacuerdoconGrimaudoetal.,2018(Figura6). RESPUESTA OBJETIVO Espesor Minimizar Hinchamiento Minimizar Mucoadhesividad Maximizar
‐20‐ 𝑆𝑅 𝑃𝑡 𝑃𝑖 𝑃𝑖 𝑥 100 Figura6.Ecuacióndelratiodehinchamiento(Pt:pesofinaldelinserto;Pi:peso inicialdelinserto) Ensayodemucoadhesividad:paralarealizacióndeesteensayoseelaboró,enprimer lugar,unasolucióncalientedeagar/mucinaal1y2%p/prespectivamenteenbuffer fosfatopH6,delacualsedepositaron15,9genplacasdePetridevidriode9cmde diámetro.Sedejaronquegelificarana4‐8°Cdurante3horas.Unavezgelificadas,se dejanequilibrarencondicionesde22°Cy79%dehumedadrelativa.Paraello,seutiliza unasolucióndeclorurodeamoniosaturadaenunacámara(BertramandBodmeier, 2006). EsteensayosellevóacabouniendolaplacadePetrialaparatodedisgregaciónde comprimidos(JPXII),deformavertical,demaneraquelaplaca experimente un movimientoascendenteydescendente,sumergiéndoseenbufferfosfatoajustadoapH 7,4cuandodesciende.Elinsertosecolocóenlapartesuperiordelaplacademanera quecadavezquedesciendelaplacasehumedececonelbufferfosfato(Nakamuraet al.,1996)(Figura7).Así,elinsertoporgravedadsevaairdesplazandoporlaplaca.Se midióeldesplazamientodelinsertoporlaplacaenintervalosde1horadurante4horas. Elpotencialdeadhesiónesinversamenteproporcionalaldesplazamientodelinserto. Figura7.Equipoparalaelaboracióndelensayodemucoadhesividad(modificadode Nakamuraetal.,1996). 3.3. PREPARACIÓNDEINSERTOSCONLEVODOPA Unavezseleccionadoelinserto,segúnsucomposición,paralossiguientesensayosseañadióel fármaco.Comoserefirióanteriormente,seincorporóL‐dopa,lacualseadicionójuntoconácido ascórbicocomoantioxidante,yaqueestudiosanterioreshandemostradoqueL‐dopaaumenta
‐27‐ Figura10.Gelformuladocon80%HPMC 20%Pluronic+0,8gdeGlicerina Figura11.Gelformuladocon80%HPMC 20%Pluronic+0,8gdePropilenglicol Por último, se decidió incluir Chitosano en la formulación debidoasuspropiedades bioadhesivas, su naturaleza viscosa y capacidad de aumentar el tiempo de adherencia del inserto a la mucosa nasal. La elección del Chitosano se debe que numerosos estudios han demostrado que en combinación con el Pluronic proporciona un buensistemaparala administraciónintranasaldefármacosyaquepermitencontrolarlaliberacióndelfármacoy aumentaneltiempoderesidenciadelaformulaciónenlacavidadnasal(Luppietal.,2009). 4.2. CARACTERIZACIÓNDELOSINSERTOS Conlosresultadosobtenidostraselestudiodelos16lotesdeinsertos,cadaunodeelloscon unacomposicióndiferente,sebuscabaencontrarcuáldetodoseraelquemejorrespondíaalos diferentesensayosalosquefueronsometidos,conelfindeencontrarlacomposiciónmás apropiada. 4.2.1. CARACTERIZACIÓNMORFOLÓGICA Traslaelaboracióndelosinsertos,seanalizólamorfologíadecadaunodemaneravisual.Sevio quehabíainsertosdondeloscomponentesnosehabíaninterpuesto,demaneraqueaparecen pequeñosgránulosenlosinsertos(Figura12).
‐28‐ Figura12.Imágenesdelosinsertos. Lano interposición de loscomponentes implica que posteriormente, cuandose leadicione fármaco,estevaaestarrepartidodemaneradesigual.Portanto,lotescomoel2,5,8,14y15 quedarondescartados. 4.2.2. ENSAYODEUNIFORMIDADDEPESO SegúnlaRealFarmacopeaEspañola5ªed.,elensayodeuniformidaddemasadepreparaciones unidosisserealizapesandoindividualmente20unidadestomadasalazarydeterminarlamasa media.Elensayoserácorrectosinomásde2masasindividualessedesvíandelamasamedia enunporcentajemáselevadode10yningunasedesvíamásdeldobledeeseporcentaje. Sinembargo,enlaRealFarmacopeaEspañola,nosereconoceainserto como una forma farmacéutica.Portanto,teniendoencuentaqueesunaformasólidayquesupesoesmenora 80mg,seestablecióquesuporcentajemáximodedesviaciónseríade10. Seaplicóesteprocedimientoalos16insertos,deloscuales,todoslocumplíanexceptoloslotes 6y13,demaneraqueestosserechazaroncomoformulaciónfinal. 4.2.3. ENSAYODEESPESOR Enesteensayosebuscabaencontrarlosfactoresquecontribuyeranaqueelespesordelinserto fueramínimo.Delascincovariablesqueseestudiaron,explicadasanteriormente,sedeterminó
‐29‐ queelúnicoqueafectabaalespesoreraeltipodeplastificante,conunacontribucióndeun 62,2%yunI‐hatde0,06937.Losresultadosconcluyeronqueelplastificantequedebíausarse eraGlicerina. Sinembargo,comosepuedeobservarenlaFigura13,losespesoresmáspequeñosseconsiguen en insertos cuyo plastificante empleado es el Propilenglicol. Estos insertos quedan representadosenlagráficadecolorrojo.Estosedebeaqueelprogramaempleadoparael tratamientodelosdatos,Doepack,analizacómointerfierencadaunadelasvariablesencada unodelosensayosrealizadosdemaneraconjunta.Además,elespesornoesunfactordecisivo enelinserto,yaqueotrosfactorescomolamucoadhesividadoalhinchamiento,influyende maneramásdecisivaenelinsertofinal. Portanto,comosecorroborarámásadelante,sedeterminóqueelPropilenglicoldebíaserel plastificanteutilizado. Figura13.Gráficaquerepresentalosespesores(mm)decadaunodelosinsertos. 4.2.4. ENSAYODEHINCHAMIENTO Conlosinsertosseprocedióamedirsucapacidaddehinchamientoocaptacióndeagua,lacual, esunparámetroqueinfluiráenlacapacidadadhesivadelinserto,demaneraque,amayor hinchamiento,menorcapacidadadhesivadelinserto(Hermansetal.,2014).Portanto,sebuscó queelhinchamientodelinsertofueramínimo. Además,tambiénseapreciaquehayinsertosquealhumedecersevuelvenasuestadodegel. Unejemplodeelloeselinserto14.ComopodemosverenlaFigura14,éstealcanzasumáximo dehinchamientoalahoraymediadeempezarelensayo.Sinembargo,sufreunafuerteerosión queesdebidaaqueencadatomademuestrasepierdepartedelinsertoporsutransformación 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ESPESOR(MM) INSERTOS
‐30‐ denuevoengel.Tambiénsiguenestatendencialosinsertos9y6,porloquefuerondescartados juntoconel14. Figura14.Graficarepresentandoelporcentajedehinchamiento(peso)conrespectoal tiempodelinserto14. Como se dijo anteriormente, se buscaba que el hinchamiento fueramínimoconelfinde aumentarlaadherencialamucosanasal.Sevaloraronlosresultadosobtenidosysedeterminó quehinchamientossuperioresa1300seríandescartados,debidoaqueelinsertonomantiene suforma,esdecir,seexpande,pudiendollegarasermolestoenelcasodeserintroducidoenla mucosanasal.Además,cuantomayoreselhinchamiento,menoreslaconsistenciadelinserto (Hermansetal.,2014).Estohacequelosinsertosseanfrágilesyserompanconmuchafacilidad. Seobservóqueotrosinsertos,conciertasvariables,siguenunamismatendencia.Unavezque alcanzan su máximo de hinchamiento, se van erosionando perdiendo peso de manera prácticamentelineal.Elhechodequelosinsertosvayanperdiendomasaamedidaquepasael tiempoesunfactornodeseado.Portanto,paravercuántoseerosionabanlosinsertosunavez alcanzadossumáximodehinchamiento,secalculólaecuacióndelarectaqueformanlospuntos desdequesealcanzaelmáximodehinchamientohastaelúltimo.Deestamanera,cuantomayor sealapendientedelarecta,mayoreselgradodeerosióndelinserto,y,portanto,másmasa pierdeconeltiempo.Unejemplodeuninsertocuyogradodehinchamientoydeerosiónesalto eselinsertonúmero15(Figura15). 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0 50 100 150 200 250 300 350 400 %HINCHAMIENTO TIEMPO(minutos)
‐31‐ Figura15.Gráficaquerepresentaelporcentajedehinchamiento(peso)conrespectoal tiempodelinserto15. Latendenciadelinsertonúmero15tambiénlasiguenelinserto7yel12.Portanto,estosfueron descartados. Unejemplodeinsertocuyohinchamientocumplelascondicionesanteriormenteexplicadases elinserto4(Figura16).Estatendenciatambiénlasiguenlosinsertos1,10,11,13y16. Figura16.Graficarepresentandoelporcentajedehinchamiento(peso)conrespectoal tiempodelinserto4. Unavezseanalizarontodoslosresultadosobtenidos,sedeterminóquelasdosvariablesque afectabanalhinchamientosonlaconcentracióndeChitosanoyeltipodeplastificante,conuna contribucióndeun19,6%y15,9%,yunI‐hatde224,3y‐202respectivamente,deformaque paraqueelhinchamientoenelinsertoseamínimo,laconcentracióndeChitosanodebeser1% p/vyelplastificantedebeserPropilenglicol. Lacapacidaddehinchamientodelosgelessedebeaquetodosincluyenensuformulación HPMC,elcualsuponelainclusióndegruposhidrófilos,favoreciendolacaptacióndeagua,y haciendoquelosgelesalcancensumáximodehinchamientoantesdelaprimerahoraymedia y=‐3,4724x+1635,5 R²=0,9903 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 0 50 100 150 200 250 300 350 400 %HINCHAMIENTO TIEMPO(minutos) y=‐0,5729x+281,68 R²=0,8806 0 50 100 150 200 250 300 350 0 50 100 150 200 250 300 350 400 %HINCHAMIENTO TIEMPO(minutos)
‐32‐ delensayo(Mughaletal.,2011).Además,elChitosanotambiéncontieneunagrancantidadde grupos hidrófilos, por loque a mayor concentración de Chitosanoenelgel,mayorserásu capacidaddecaptacióndeagua(Biguccietal.,2008). 4.2.5. ENSAYODEMUCOADHESIVIDAD Paradeterminarlacapacidadadhesivadelosinsertosenlamucosanasal,serealizóunestudio delafuerzamucoadhesivadecadaunodelosinsertos. Paraesteensayo,seconsideróqueundesplazamientode5cmsuponequeelinsertonose adhierealmediodeagar/mucinapreparadoasíporsuspropiedadesmucoadhesivas,porloque noposeepropiedadesdemucoadhesividad. Aunquenodeformamuyaparente,enlaFigura17seobservanlosdesplazamientosdelos insertos con respecto al tiempo. De los 16 insertos estudiados,solotressoncapacesde adherirsealagar/mucinasindesplazarse,quefueronlosinsertos3,11y16. Figura17.Gráficadeinsertosrepresentandolosdesplazamientosconrespectoaltiempo. Enestecasosebuscaquelamucoadhesividaddelinsertoseamáxima,portanto,sepretende minimizar el desplazamiento del inserto por la placa de agar/mucina. Según los resultados obtenidosporelDOEpack,eneldesplazamientodelinsertoporelagar/mucinainfluyendos variablesquesonlaconcentracióndeChitosanoyeltipodeplastificante.Laconcentraciónde Chitosano tuvo una contribución de 27,2% y un I‐hat de 46,81, mientras que el tipo de plastificantetuvounacontribuciónde7,6%yunI‐hatde‐24,69.Paraqueeldesplazamientosea 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 12345678910 11 12 13 14 15 16 TIEMPO(horas) DESPLAZAMIENTO(cm) INSERTOS
‐33‐ mínimo la concentración de Chitosano debe ser del 2% p/v y el plastificante debe ser Propilenglicol. SonmuchoslosestudiosquedemuestranlacapacidadmucoadhesivadelChitosano(Bigucciet al.,2008;Luppietal.,2009).Portanto,cuantomayorsealaconcentracióndeChitosanoenel gel,mayorserásucapacidadadhesiva.SeconsideraalChitosanocomounpolímerointeresante paraesteestudioya queposeecargaspositivasquevan ainteracción congrupos decarga negativadelamucosanasal. Comoresumendelosestudiosrealizadosalosinsertos,losresultadosdelosensayosrevelaban quenilaconcentracióndeHPMC,nieltipodeChitosanonienquémomentodelaelaboración se adicione al gel, influyen en las características del inserto. Se determinó, pues, que la concentracióndeHPMCenlamezclaseríadel4%p/pyaquedeestamaneraseahorrarían constesenlamateriaprima.EncuantoalChitosano,seseleccionóeldealtaviscosidad,conel fin darle más consistencia al inserto. Por último, en cuanto almomentodelaadicióndel Chitosano,sedeterminóqueseadicionaríaenelmomentoquealinvestigadorlefueramás sencillo. Comosepuedecomprobar,algunosdelosresultadosobtenidosenlosensayosanterioresse contradicen.Portanto,paraseleccionarcualvanaserlosnivelesdelasvariablesfinales,se establecióqueestablecerunordendeprioridaddelasvariables. Así, se determinó que la variable más prioritaria para la elaboracióndelinsertoerala mucoadhesividad,seguidadelhinchamientoyporúltimoelespesor.Estoquieredecirqueel espesor del inserto no aporta en este estudio una ventaja decisiva, frente a tener buenas propiedadesdemucoadhesividad. Portanto,sellegóalaconclusióndequelacomposicióndelgeldebíadeser8gdeHPMCal4% p/p,2gdePluronical17%p/p,2’2gdeChitosanodealtaviscosidadal2%p/vy0’8gde Propilenglicol.Estaformulacióncoincideconlacomposicióndelinsertonúmero3. 4.3. INCORPORACIÓNDELEVODOPAENINSERTOS LacuantificacióndeL‐dopaenlosinsertossellevóacabodestruyendolosinsertosenfasemóvil delHPLCycuantificarlacantidaddefármaco.Sedeterminóasíquelosinsertosenlosquese incorporabadirectamentelalevodopateníanunacantidadde0,2318mgdeL‐dopaporinserto. Además,secomprobóquelaincorporacióndeciclodextrinasconjuntamenteconlal‐dopala estabilizaba,evitandosuoxidación,asícomolaprotegedelmedioexterno.Elinserto3,elcual
‐34‐ noconteníaciclodextrinas,tomabaunatonalidadoscura,mientrasquelosotrossemantenían ensucolorblanquecino,locualcorroborabaelefectoestabilizadordelasciclodextrinas(Figura 18) Respectoalasformulacionesqueconteníanlosliposomas,seobservó también un efecto positivoenlosinsertos,deformaquesemanteníandecolorblancoyconaspectoflexible. Figura18.InsertosconLevodopa.1)L‐dopa+AA+HPBCDenliposomas2)L‐dopa+AA+ HPBCDsinliposomas3)L‐dopa+AAsinliposomas 4.4. ENSAYODEPERMEACIÓNINVITRO LosestudiosdepermeaciónserealizaronconelfindedeterminarlacantidaddeL‐dopaliberada delinsertoypermeadaatravésdeunamembranaartificial,enfuncióndesucomposición.La composicióndelosgelesseleccionadosparaesteestudiosonlosexplicadosenlaTabla10,de maneraquedecadagelobtuvimoslosinsertos1,2y3respectivamente. Paraobtenerlosperfilesdepermeación,serepresentóelporcentajedepermeacióndeL‐dopa frentealtiempo,incluyendocomocontrolunasoluciónestándardeL‐dopayunadispersiónde liposomas. Comocabríaesperar,seobservandoscomportamientosclaramentediferenciados.Elprimero, elperfilcorrespondientealasoluciónestándardeL‐dopa,queliberaelfármacorápidamente, alcanzándosesumáximodeliberaciónpasadaunahoradeensayo(casiun67%),yelsegundo correspondientealadispersióndeliposomas,quealcanzasumáximo a los 240 minutos, consiguiéndoseunaliberacióndel100%. En cuanto a los insertos, se observa que el inserto que incorpora L‐dopa en liposomas proporcionaunapermeaciónmásprolongadadefármaco,yaquealas3horasdelensayoes cuando se alcanzó su máximo de liberación. Sin embargo, el porcentaje depermeacióndel
‐35‐ fármaco en liposomas con respecto a la cantidad encapsulada tuvo un máximo de aproximadamente27%.EstosepuedeobservarenlaFigura19. Figura19.GráficaquerepresentaelporcentajedeliberadodeL‐dopaconrespectoaltiempo delinserto1. Encontraposición,los insertos 2 y 3, que incorporabandirectamente la L‐dopa,obtuvieron máximos de liberación a los 60 minutos de comenzar el ensayo, con unos porcentajes de aproximadamente30%y35%respectivamente(Figuras20y21). Figura20.GráficaquerepresentaelporcentajedeliberadodeL‐dopaconrespectoaltiempo delinserto2. 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 350 400 LIBERACIÓNLEVODOPA(%) TIEMPO(minutos) ESTANDAR INSERTO1 SOLUCIÓNLIPOSOMAS 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 350 400 LIBERACIÓNLEVODOPA(%) TIEMPO(minutos) ESTANDAR INSERTO2 SOLUCIÓNLIPOSOMAS
‐36‐ Figura21.GráficaquerepresentaelporcentajedeliberadodeL‐dopaconrespectoaltiempo delinserto3. Portanto,aunquelaencapsulacióndefármacoenlosliposomasdebamejorarse,elperfilde liberacióneselmásadecuadoparanuestroinsertoobjetivo,pudiendocompararselosperfiles delostresinsertosenlaFigura22. Figura22.Comparacióndelosperfilesdeliberacióndelostresinsertosestudiados. 5. CONCLUSIONES 1. LaproporcióndeHPMC:Pluronicenlamezcladebeserde80:20,yaqueunaproporción menor de HPMC en la mezcla daba lugar a geles frágiles y poco consistentes para la administraciónintranasal 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 350 400 LIBERACIÓNLEVODOPA(%) TIEMPO(minutos) ESTANDAR INSERTO3 SOLUCIÓNLIPOSOMAS 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 50 100 150 200 250 300 350 400 LIBERACIONLEVODOPA(%) TIEMPO(minutos) INSERTO1 INSERTO2 INSERTO3