Biodisponibilidad de los componentes del insaponificable del aceite de oliva en humanos

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Ingeniería Química Biodisponibilidad de los componentes del insaponificable del aceite de oliva en humanos TESIS DOCTORAL IMAN KASEM 2009 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Ingeniería Química Biodisponibilidad de los componentes del insaponificable del aceite de oliva en humanos Memoria que presenta Dña Iman Kasem para optar al Grado de Doctor Fdo. Iman Kasem Sevilla, Enero de 2009 Dña. Valentina Ruiz Gutiérrez Y Dña. María del Carmen Pérez Camino, Directoras de la tesis y Dña. Mª Montaña Durán Barrantes, Tutora, autorizamos la presentación de la Tesis Doctoral “Biodisponibilidad de los componentes del insaponificable del aceite de oliva en humanos” Realizada por Dña. Iman Kasem. Vº Bº Las Directoras Fdo. Dra. Valentina Ruiz Gutiérrez Fdo. Dra. Mª Carmen Pérez Camino Vº Bº La Tutora Fdo. Dra. Mª Montaña Durán Barrantes La presente Tesis Doctoral ha sido realizada en el grupo de Nutrición y Metabolismo lipídico del Departamento de Caracterización y Calidad de los Alimentos del Instituto de la Grasa de Sevilla, perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (C.S.I.C), dentro del Programa Interdepartamental “Estudios Avanzados en Alimentos”, del que es responsable académico el Departamento de Ingeniería Química, el cual, de conformidad con el procedimiento establecido por su Consejo, ha autorizado su presentación en el día de la fecha. Vº Bº El Coordinador del Programa Vº Bº El Director del Departamento Fdo. Dr. Fernando Romero Guzmán Fdo. Dr.Francisco Carrillo de la Fuente Sevilla, a de Octubre de 2008 AGRADECIMIENTO Esta Tesis no se habría podido realizar sin la generosa colaboración de muchas personas a quienes deseo expresar mi agradecimiento: A la prof. Dra. Dña Valentina Ruiz Gutiérrez responsable del grupo “Nutrición y Metabolismo Lipídico” y directora de este Trabajo. Quiero destacar la oportunidad de aprender y trabajar en su grupo, sus consejos científicos, sus conocimientos y todos los medios de que he dispuesto para la realización y elaboración de esta Tésis. Un especial reconocimiento a la co-directora de esta Tesis Dra. Dña Maria del Carmen Pérez Camino, Jefa del Departamento de Caracterización y Calidad de Alimentos; un profundo agradecimiento a quien con su tiempo, ayuda, apoyo, paciencia y comprensión me alentaron a lograr esta hermosa realidad. Por esto y más …..Muchas gracias. A la Dra. Dña Mª Montaña Durán Barrantes tutora del trabajo y al Dr. D. Fernando Romero Guzmán coordinador del programa de “Estudios Avanzados en Alimentos” por sus consejos, interés y ayuda en facilitar todo para terminar este trabajo. A D. José Luís Ríos Martín, quien al frente del espectro de masas me ayudó en la realización e interpretación de los espectros, por su constancia y empeño en el desarrollo de este trabajo, gracias por dedicarme su tiempo. Igualmente esta Tesis no se hubiera realizado sin la ayuda y colaboración de los Doctores: D. José Luís Prada Paradal y D. Alfonso del Arco Jiménez del Hospital Costa del sol de Marbella. A mi esposo Manuel, como un testimonio de gratitud ilimitada por su gran ayuda, comprensión y tolerancia. Con Mucho Cariño. Agradezco a mis padres todo el apoyo recibido durante mi formación profesional. Con cariño y respeto. A mi hijo Ahmad, porque su presencia ha sido y será siempre el motivo más grande que me ha impulsado a lograr esta meta. A todas mis hermanas y hermanos por el apoyo que siempre me han brindado y con el cual he logrado terminar mi carrera profesional, siendo para mí, la mejor de las herencias. Y por fin, a todos mis compañeros del grupo “Nutrición y Metabolismo Lipídico” Antonio, Rosana, Paco, Ana, Rosalía y Javier que de algún modo han puesto su interés en que este trabajo pudiera salir adelante. Gracias. Iman ImanIman Iman I. INTRODUCCIÓN 1. ACEITE DE OLIVA………………………………………………………………………………………1 1.1. Aceites de oliva. Clasificación……………………………………………………………1 1.2. Composición del aceite de oliva…………………………………………………………2 1.3. Aceite de orujo de centrifugación. Obtención…………………………….……3 1.3.1. Componentes menores insaponificables………………………………….5 1.3.1.1. Hidrocarburos……….…………………………………………………….6 1.3.1.1.1 Hidrocarburos alifáticos…………………………….…6 1.3.1.1.2. Hidrocarburos terpénicos…………………………….6 1.3.1.2. Compuestos alcohólicos……………………………………………….7 1.3.1.2.1. Alcoholes alifáticos……………………….…………….7 1.3.1.2.2. Alcoholes esteroideos………………………………….8 Esteroles. Fitosteroles. Colesterol………….10 El colesterol………………………………………………11 Dialcoholes Triterpénicos…………………………13 1.3.1.2.3. Tocoferoles…………………………………………………14 1.4. Componentes menores insaponificables. Métodos de preparación…15 2. ACEITE DE OLIVA. EFECTOS BIOLÓGICOS……………………………………….…..18 2.1. Aceite de oliva y patología cardiovascular……………….…………………….18 2.2. Aceite de oliva y otras patologías…………………………………………………….21 3. METABOLISMO LIPIDICO…………………………………………………………………………25 3.1. Los lípidos. Importancia biológica……………………………….………………….25 3.1.1. Ácidos grasos…………………………………………………….…………………….25 3.1.2. Lípidos complejos…………………….…………………………………………….26 3.2. Absorción y metabolismo de los lípidos de la dieta…………………………27 3.3 Transporte de los lípidos de la dieta. Las lipoproteínas……………………27 3.3.1. Estructura y composición de las lipoproteínas………………………28 3.4. Lipoproteínas Ricas en Triglicéridos……………………………….……………….31 4. METABOLISMO POSTPRANDIAL……………………………………………………….……32 5. INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA………37 5.1. Malnutrición en la infección por el virus del VIH/SIDA…………………37 5.1.1. Factores nutricionales y desarrollo de la infección……………38 5.1.1.1. Efectos de la propia malnutrición……………………….39 6. ANORMALIDADES METABÓLICAS LIPIDICAS EN VIH………………………….….40 6.1. Alteraciones en el metabolismo lipídico en enfermos de VIH………41 6.1.1. Citoquinas y cambios metabólicos………………………………………42 A) Aumento de la producción de VLDL………………………………44 B) Descenso del aclaramiento plasmático de TRL…………….44 6.1.2. Fisiopatología de las alteraciones del metabolismo de las lipoproteínas en el VIH…………………………………………………………44 A) Producción de subclases de LDL de pequeño tamaño….47 B) Elevada actividad de la enzima factor de activación plaquetaria-acetilhidrolasa…………………………..……………47 6.1.3. Dislipidemia………………………………………………………………………….48 II. OBJETIVOS……………………………………………………….……………………….49 III. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………51 7. REACTIVOS, PATRONES Y MATERIALES EN GENERAL………………….………51 8. MATERIA PRIMA……………………………………………………………….…………………….51 8.1. Aceites…..…………………………………………………………………………………………51 8.1.1. Composición en ácidos grasos…………………………………………………52 8.1.2. Fracción insaponificable…………………………………………………………53 8.1.3. Ceras……………………………………………………………………………………….58 9. EXPERIENCIA CLÍNICA…………………………………………………………………………….60 9.1. Selección y características de los voluntarios…………………………………60 1. Grupo de voluntarios sanos……………………………………………………….60 2.Grupo de voluntarios infectados por VIH……………………………………61 9.2. Ingesta Experimental……………………………………………………………………….62 9.3. Diseño Experimental…………………………………………………………………………63 9.4. Extracciones………………………………………………………………………………………64 9.4.1. Extracción Basal………………………………………………………………………64 9.4.2. Ingesta de las comidas experimentales y extracciones durante el periodo postprandial……………………………………………………………64 10. SISTEMÁTICA ANALÍTICA DESARROLLADA PARA LA EVALUACIÓN DE COMPONENTES MENORES EN TRL…………………………………………………….…65 10.1. Aislamiento de TRL………………………………………………………………………65 10.2. Extracciones de los lípidos de TRL. Método Folch………………………65 10.3. Obtención de la fracción de insaponificable de los lípidos procedentes de TRL………………………………………………………………….……66 10.4. Procedimiento Cromatográfico……………………………………………………67 11. IDENTIFICACIÓN DE COMPONENTES MENORES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES-ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GCMS)…………………………………………………………………………………………………………68 12 LÍMITES DE DETECCIÓN…………….………………………………………………………….69 13. FACTORES DE RESPUESTA………………………………….………………………………69 14. RECUPERACIÓN Y REPETIBILIDAD………………………………………………………71 15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO……………………………………………………………………….71 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………73 15. COMPOSICIÓN DE LA INGESTA EXPERIMENTAL……………………………………73 16. COMPOSICIÓN DE LOS ACEITES UTILIZADOS….…………………………………..73 16.1. Composición en ácidos grasos…………………………………………………….73 16.2. Componentes menores…………………………………………………………………75 17. METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA EL AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE COMPONENTES INSAPONIFICABLES EN LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS………………………………………….78 17.1. Aislamiento del insaponificable en TRL………………………………………78 17.2. Análisis mediante GC de las fracciones insaponificables……………80 17.3. Identificación de componentes. Análisis de los espectros GCMS..........................................................................82 17.4. Límites de detección..…………………………………………………………………91 17.5. Factores de respuesta…………………………………………………………………91 17.6. Recuperación y Repetibilidad de las diferentes familias de componentes del insaponificable……………………………………………….92 17.6.1. Resultados en TRL………………………………………………………….92 17.6.2. Resultados en aceites…………………………………………………….95 18. BIODISPONIBILIDAD DE LOS COMPONENTES DEL INSAPONIFICABLE DEL ACEITE DE OLIVA DURANTE EL PERIODO POSTPANDRIAL EN VOLUNTARIOS SANOS Y ENFERMOS…………………………………………………….97 18.1. Estudio de los componentes menores del insaponificable de TRL de sujetos sanos…………………………………………………………………98 18.1.1. Escualeno……………………………………………………………………….98 18.1.2. Alcoholes alifáticos………………………………………………………100 18.1.3. Esteroles……………………………………………………………………….107 18.1.3.1. Colesterol…………………………………………………….107 Introducción 5 La composición de este aceite es similar a la del aceite de oliva virgen y está formado por una fracción saponificable, que constituye el 97- 99% del total, y una fracción insaponificable, formada por los mismos constituyentes aunque difieren en sus cantidades. Es precisamente esta fracción, por su amplia distribución en el mundo vegetal y la gran variedad de efectos biológicos que se atribuyen a estos compuestos naturales y a sus derivados (Moreau et al., 2002), la que será objeto de nuestro trabajo. 1.3.1. Componentes menores insaponificables Los componentes menores insaponificables de los aceites forman un conjunto de lípidos que no sufren hidrólisis alcalina y que por tanto se pueden aislar tras un proceso de saponificación del aceite con un hidróxido alcalino y posterior extracción con un disolvente orgánico (hexano o éter etílico). Este grupo de compuestos además de participar en el mantenimiento de la estabilidad de la propia grasa donde se encuentran, evitando su enranciamiento y otras alteraciones así como contribuir a determinadas propiedades sensoriales, tienen otras funciones en mayor o menor medida conocidas en el organismo como por ejemplo la actividad vitamínica de los tocoferoles, o como la presentada por los fitosteroles al competir con el colesterol en la absorción intestinal (Valsta at al., 2004; Andersson et al., 2004). Esta fracción insaponificable está constituida por: hidrocarburos (escualeno), alcoholes lineales, terpénicos y esteroideos entre los que se incluyen los fitosteroles en general y entre estos el β-sitosterol en particular. 1.3.1.1. Hidrocarburos Los hidrocarburos en los aceites de oliva constituyen el 32-50% del material insaponificable. Se podrían clasificar de muy diversas maneras, Introducción 6 una de ellas es, como se recoge en el Cuadro 3, de acuerdo a su estructura, en alifáticos y ramificados. Cuadro 3. Principales hidrocarburos presentes en los aceites de oliva GRUPO COMPUESTO FUNCIÓN Hidrocarburos Alifáticos: Alcanos (C11-C35) y alquenos monoinsaturados Ramificados o Terpénicos: Esqualeno y Caroteno Impermeabilizantes Intermediarios en la síntesis de esteroles 1.3.1.1.1 Hidrocarburos alifáticos Están formados generalmente por 11 a 35 átomos de carbono organizados linealmente. Se encuentran en mayores concentraciones junto a los lípidos extracelulares epicuticulares en plantas superiores y tienen una función impermeabilizante, protegiendo de diferentes formas de estrés. En menores concentraciones también forman parte de los lípidos intracelulares en plantas e incluso en los mamíferos. Los encontramos en aceites vegetales en una concentración entre 7 y 170 mg/kg (Lanzón et al., 1994). 1.3.1.1.2. Hidrocarburos terpénicos. Escualeno Denominados también isoprenoides, debido a que el isopreno (unidad de 5 átomos de carbono) es su precursor biológico; todos derivan de la fusión repetida de unidades ramificadas de estos cinco carbonos. Podemos encontrar compuestos que contienen desde una hasta ocho unidades. Las unidades pueden disponerse linealmente, como en el caso del escualeno, o cíclicamente como en el caso de los carotenoides que son tetraterpenos muy importantes en los mamíferos, especialmente el βcaroteno que es precursor de la vitamina A. Introducción 7 En los aceites de oliva el hidrocarburo más abundante es el escualeno, hidrocarburo triterpénico con seis dobles enlaces conjugados. Constituye un intermediario en la biosíntesis de esteroles, tanto de fitosteroles en plantas como de colesterol en animales. Es también un componente mayoritario de los lípidos de la piel en humanos donde ejerce un efecto quimioprotector (Waterman y Lockwood, 2007; Newmark, 1997). Diferentes autores han hablado del efecto potencial del escualeno como antioxidante (Malecka, 1991) y como protector de regeneración nerviosa (Aguilera et al., 2005). Por otra parte, este hidrocarburo es un potente inhibidor de la enzima que cataliza la síntesis de colesterol 3-hidroxi-3- metilglutaril coenzima, por lo que podría desempeñar un papel importante en procesos aterogénicos (Bellosta et al., 2000). Figura 2. Representación de la molécula del escualeno 1.3.1.2. Compuestos alcohólicos En los aceites los componentes menores de naturaleza alcohólica se presentan tanto en forma libre como esterificados con ácidos grasos formando lo que se denominan ceras (Hargrove et al., 2004). 1.3.1.2.1. Alcoholes alifáticos Los alcoholes primarios de cadena lineal se encuentran formando parte de la fracción lipídica de numerosas materias biológicas. (Moreda et al., 2004). En la mayoría de las plantas, esta fracción está constituida por una serie saturada de 20 a 28 átomos de carbono, siendo los miembros más abundantes los de cadena par y concretamente los de 24 y 26 átomos de Introducción 8 carbono. Dado que los ácidos mayoritarios tienen 18 átomos de Carbono (esteárico, oleico, linoleico y linolénico), al esterificarse con un alcohol resultan ceras que tienen 42 y 44 átomos de Carbono (Kunst et al, 2002). También están presentes en los aceites, aunque en mucha menor proporción, su serie homóloga monoinsaturada (C23, C25, C27 y C29). Hay diferentes estudios donde se ha demostrado que los policosanoles son capaces de disminuir el colesterol y por tanto reducir los factores de riesgo de enfermedad cardiovascular (Menéndez et al., 2005; Gámez et al., 2005; Chen et al., 2005; Castano et al., 2004; Hargrove et al., 2004; Janikula et al., 2002; McCarty, 2002). En los aceites de oliva virgen los alcoholes alifáticos se encuentran entre 100-200 mg/kg, mientras que en los orujos esta cantidad es la mínima presente. OH Figura 3. Estructura general de unAlcohol lineal o alcanoles de C26H54O(Hexacosanol) 1.3.1.2.2. Alcoholes esteroideos Alcoholes esteroideos es el nombre genérico dado a un amplio grupo de compuestos triterpénicos tetra y penta-cíclicos que contienen un grupo hidroxilo en el C-3(Figura 5). Podemos dividirlos a su vez en tres grupos 1. 4,4´-Dimetilesteroles, o alcoholes triterpénicos propiamente. 2. 4-Monometilesteroles, también conocidos por metilesteroles 3. 4-Desmetilesteroles, también denominados esteroles normales, los más comunes de este grupo son: Colesterol en animales y β-Sitosterol en vegetales. Introducción 9 Los alcoholes esteroideos son sintetizados a partir del acetil-CoA vía acido mevalónico siendo el escualeno un intermediario clave, y fundamental que al ciclar produce cicloartenol en plantas y lanosterol en animales. Al igual que los alcoholes lineales los esteroideos se presentan libres y esterificados en forma de ceras (esterólicas y triterpénicas). En la figura 4, se recoge un esquema de la biosíntesis de alcoholes esteroideos, con la formación en primer lugar de alcoholes triterpénicos, metil esteroles y por último, esteroles. Figura 4. Esquema General de la Biosíntesis de alcoholes esteroideos 4,4’ - DIMETILESTEROLES (Alcoholes triterpénicos) Cicloartenol 24,Metilencicloartanol 4-METILESTEROLES (Metilesteroles) Cicloeucalenol 31-Norlanosterol Obtusifoliol Citrostadienol Gramisterol 4-DESMETILESTEROLES (Esteroles normales) ∆7-Avenasterol ∆7-Estigmastenol ∆5-Avenasterol Sitosterol Estigmasterol Colesterol Introducción 10 Esteroles. Fitosteroles. Colesterol Todos se pueden denominar genéricamente alcoholes esteroideos. Zooesteroles se denominan cuando el origen es animal, siendo el colesterol el más abundante de este grupo, y fitosteroles cuando el origen es vegetal, siendo en este último caso el β- Sitosterol el más abundante seguido del campesterol y estigmasterol. En esencia, los esteroles se diferencian de los alcoholes triterpénicos propiamente dicho en no poseer ningún grupo metileno en las posiciones 4 y 4´. A pesar de su similar estructura química, esteroles vegetales y animales difieren enormemente en relación a sus propiedades farmacológicas. El colesterol se asocia a enfermedades coronarias y los esteroles de plantas a la de inhibidores de la absorción de colesterol, antiinflamatorio, anti-microbiano, anti-bacteriano, anti-fúngico y antioxidantes (Awad, 2000; Muti et al., 2003; Tapiero et al., 2003; Ovesna et al., 2004; Varady et al., 2004; Moreno, 2003). Los posibles mecanismos por los que los esteroles vegetales reducen la concentración plasmática de colesterol incluyen: 1) Inhibición de la absorción de colesterol en el intestino delgado a través del desplazamiento del colesterol de las micelas. 2) Limitando la solubilidad intestinal del colesterol. 3) Disminución la hidrólisis de los ésteres de colesterol en el intestino delgado (Ling y Jones, 1995). En la figura 5, se recogen las principales estructuras esterólicas encontradas. Se ha dividido en dos grupos denominados “Estructuras ∆5” y “Estructuras ∆7” que difieren en la posición del doble enlace en el anillo B, entre C5-C6 en los ∆5, y entre C7-C8 para los ∆7. Introducción 11 Figura 5. Estructura de los principales Esteroles (1) Colesterol (colesta-5-en-3β-ol). (2) Brasicasterol (24[S]-24-metilcolesta-5,22-dien-3β-ol). (3) 24-Metilencolesterol (24-metilcolesta-5,24-dien-3β-ol). (4) Campesterol (24[R]-24- metilcolesta-5-en-3β-ol). (5) Estigmasterol (24[S]-24-etilcolesta-5,22-dien-3β-ol). (6) β- Sitosterol (24[R]-24-etilcolesta-5-en-3β-ol). (7) ∆5-Avenasterol (24[Z]-24-etilidencolesta-5-en- 3β-ol). (8) ∆5,23-Estigmastadienol (24-etilcolesta-5,23-dien-3β-ol). (9) ∆5,24-Estigmastadienol (24-etilcolesta-5,24-dien-3β-ol). (10) Clerosterol. (24[S]-24-etilcolesta-5,25-dien-3β-ol). (11) ∆7-Estigmastenol (24[R]-24-etil-5α-colesta-7-en-3β-ol). (12) ∆7-Avenasterol (24[Z]-24- etiliden-5α-colesta-7-en-3β-ol). (13) ∆-Espinasterol (24[R]-24-etil-5α-colesta-7,22-dien- 3β−ol). El colesterol es un alcohol esteroideo que consta de cuatro anillos fusionados, una cadena lateral unida al C17 del anillo D, un grupo hidroxilo unido al C3 del anillo A, y un doble enlace entre C5 y C6 del anillo B, se trata por tanto, de una estructura ∆5. Es el esteroide más abundante en los animales, pertenece a este grupo por tener el mismo esqueleto caracterizado por la presencia de un hidroxilo (OH) en el C3 y su cadena lateral alifática de 8 átomos de carbono. Es un componente mayoritario de las membranas plasmáticas animales. El grupo OH en la molécula, le da un HO CH3 CH3 H3C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 CH3 CH3 Estructuras ∆5(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) HO CH3 CH3 H3C CH3 CH3 CH3 (11) CH3 CH3 CH3 (12) CH3 CH3 CH3 (13) Estructuras ∆7 AB C D C D B A Introducción 12 débil carácter anfífílo y el núcleo esteroide, es una estructura no polar, rígida y plana, por lo tanto, esto es un determinante importante de las propiedades de la membrana. Forma parte estructural de ellas a las que confiere estabilidad. El colesterol es un componente graso esencial para la vida. En la dieta se halla exclusivamente en los alimentos de origen animal como por ejemplo yema de huevo, carnes, productos lácteos, mantequilla, órganos (como el hígado). Este esteroide, es abundante también en lipoproteínas del plasma sanguíneo, en donde aproximadamente el 70% está esterificado por ácidos grasos de cadena larga formando ésteres de colesterol. Es el precursor metabólico de las hormonas esteroideas, que son substancias que regulan una gran variedad de funciones fisiológicas, que incluyen el desarrollo sexual y el metabolismo de los carbohidratos. Es por tanto, molécula base que sirve para la síntesis de casi todos los esteroides, así como de ácidos biliares, precursores de sales biliares necesarias para la solubilización y posterior absorción grasas. Circula permanentemente en el cuerpo humano entre el hígado, donde se secreta y se almacena, y los demás tejidos del organismo; sin embargo, como no se disuelve en soluciones acuosas, como el suero, para ser transportado necesita integrarse a otras sustancias solubles, las lipoproteínas. En contraste con el colesterol, los fitosteroles se absorben en muy pequeña proporción entre 0 y 10%, dependiendo del esterol vegetal concreto (Ling, 1995). Por otra parte, su presencia interfiere con la incorporación del colesterol en las micelas intestinales, lo que contribuye a disminuir su absorción (Jones et al., 2001; Lichtenstein et al., 2001). HO CH 3 CH 3 H 3 CCH 3 CH 3 Figura 6. Molécula del colesterol Introducción 13 Dialcoholes Triterpénicos Eritrodiol (3β-olean-12-en-28-diol) es un dialcohol triterpénico muy característico del aceite de orujo. Va acompañado de otro diol triterpénico pentacíclico, el uvaol (∆-12-ursen-3β, 28-diol) (Akasbi et al., 1993). Ambos compuestos se encuentran en mayor proporción en la piel del fruto y, de ahí su importante presencia en los aceites de orujo. Su concentración varía de 10 a 12 mg/kg de aceite de oliva virgen (Paganuzzi, 1979; Mariani et al., 1987). CH 2 OH HO Figura 7. Estructura del Eritrodiol, principal dialcohol triterpénicos en los aceites de oliva y orujo Los dialcoholes pentacíclicos han demostrado tener gran importancia en terapias antiinflamatorias, debido a que su estructura es similar a los corticoides (De la Puerta et al, 2000). También han sido descritos como citoestáticos, citotóxicos y antimicrobianos (Esuoso et al., 2000); se ha demostrado que poseen un efecto vaso-relajante en la aorta de las ratas de experimentación y una función estimuladora de NO a nivel de la capa endotelial arterial, a la vez que un descenso de las células secretoras de calcio en la musculatura lisa de dichos vasos con la consecuente relajación arterial, también contribuyen a la homeostasis vascular al inducir la liberación de PGI2, y ser de esta forma una molécula bioactiva que puede contribuir a los efectos beneficiosos de la dieta mediterránea (Rodríguez- Introducción 14 Rodríguez et al., 2004; Rodríguez-Rodríguez et al., 2008; Martínez- González et al., 2008). 1.3.1.2.3. Tocoferoles. Entre la fracción insaponificable del aceite de oliva se encuentra la familia de compuestos antioxidante los tocoferoles. La molécula de tocoferol presenta dos partes diferentes: una cíclica denominada anillo cromano, y una cadena isoprenoide, cadena fitilo, en el carbono 2 que le permite su incorporación y retención en las membranas celulares, hasta 1 molécula por cada 2000 moléculas de fosfolípidos. Se presentan como cuatro formas activas diferentes: α (Alfa), β (Beta), γ (Gamma) y δ (Delta), que se diferencian entre si en los grupos metilo en la molécula fenólica del anillo cromano. Destacan por ser potentes antioxidantes como la vitamina E (αtocoferol). La presencia de suplementos de vitamina E en la dieta generalmente en combinación con otras vitaminas antioxidantes, se ha relacionado con una menor mortalidad por enfermedad cardiovascular (Duthie y Bellizzi, 1999). Dichos efectos beneficiosos han sido asociados tanto al potencial antioxidante del α-tocoferol sobre la peroxidación lipídica (Azzi et al., 2003), como a la modulación del metabolismo de eicosanoides (Jialal et al., 2001) o de la activación endotelial (Zapolska- Downar et al., 2000). Sin embargo, debido a los controvertidos resultados de ensayos clínicos, enfocados sobre los efectos de las vitaminas antioxidantes en la enfermedad coronaria, actualmente se considera que no existe evidencia científica suficiente para recomendar la suplementación con vitamina E (Rimm y Stampfer, 2000; Kris-Etherton et al., 2004). Los decepcionantes resultados de dichos estudios clínicos podrían ser explicados, en parte, por las diferencias, respecto a la ingesta habitual, de esta vitamina en la vida cotidiana. Introducción 21 basal (Aviram y Eias, 1993), una dieta rica en AGPI (Reaven et al., 1993, Kratz et al., 2002), o incluso rica en hidratos de carbono (Berry et al., 1992). Estos resultados indican el papel protector de la presencia de AGMI en la dieta frente a uno de los principales eventos desencadenantes de la aterosclerosis. Además de los efectos benéficos atribuidos al ácido oleico, hasta ahora vistos, es de señalar que los fenoles contenidos en el aceite de oliva han demostrado ser beneficiosos para el corazón, beneficios que se pierden en el proceso de refinación. Los fenoles configuran un grupo importante de compuestos bioquímicos que abarca a flavonoides, ácidos fenólicos, lignanos y vitaminas; la mayoría de ellos ostentan un gran papel antiinflamatorio similar al del ibuprofeno (Ruano et al., 2005). 2.2. Aceite de oliva y otras patologías Gracias a los estudios epidemiológicos se pudo poner de manifiesto la diferente incidencia de determinados tipos de cáncer en diferentes regiones, resultados que fueron achacados a la diferencia de dietas y, en general, se ha podido también demostrar una correlación entre cáncer y grasas, como han demostrado diferentes estudios científicos publicados desde 1997 (Kushi y Giovannucci, 2002; Owen et al., 2004; Trichopoulou et al., 2000; Sieri et al., 2004; Rose, 1997; Holmes et al., 1999; Bartsch et al., 1999). Según el oncólogo Ramón Colomer, “el 80% de los cáncer se debe a motivos no genéticos y a hábitos de salud como la dieta, cuyo papel preventivo en la evolución de la enfermedad puede ser tanto o más importante que los propios fármacos antitumorales, como el tamoxifeno, en el caso de los tumores mamarios”. Las poblaciones con una dieta rica en aceite de oliva muestran una menor incidencia de cánceres gastrointestinales, de mama o próstata, existiendo indicios de que una alimentación con aceite de oliva puede Introducción 22 reducir un 8-10% el cáncer de colon. Dicha relación entre alimentación y cáncer está determinada por el tipo de ácido graso de la dieta. Así, recientemente, las propiedades anticancerígenas del aceite de oliva han sido asociadas a un efecto regulador inducido por el ácido oleico sobre varios oncogenes implicados en el desarrollo del cáncer de mama, en concreto reduciendo los niveles del gen denominado Her-2/neu. El ácido oleico no sólo parece reprimir la actividad del gen, sino que también mejoró la efectividad de un fármaco contra el cáncer de mama llamado herceptina (Menéndez et al., 2005; Colomer y Menéndez, 2006). Además del ácido oleico en la prevención y mejora de los procesos tumorales, en los últimos años se está poniendo de relieve el papel fundamental que juegan otros componentes menores del aceite de oliva como el escualeno y los compuestos fenólicos. (Hashim et al., 2008; Escrich et al., 2007; Owen et al., 2000a, 2000b; Gill et al., 2005; Newmark, 1999). Estudios muy recientes muestran que la actividad anticancerígena observada en los extractos frutales del olivo parece provenir del ácido maslínico y no del ácido oleanólico; por tanto, el ácido maslínico promete ser un interesante componente en el tratamiento preventivo del cáncer de colon (Juan et al., 2008). Por otra parte, también se está dirigiendo la atención al papel que tiene la nutrición en el desarrollo y mantenimiento del sistema inmunológico. Recientemente se ha comprobado que los ácidos grasos intervienen en varias funciones inmunológicas, participando en la regulación de los procesos inflamatorios asociados a las enfermedades autoinmunes. En este sentido, la ausencia en la dieta de aceite de oliva se traduce en un descenso de la actividad fagocítica de los polimorfonucleares, así como en una reducción de la agregación plaquetaria. Las investigaciones actuales que estudian el papel de los aceites en la función del sistema inmune se dirigen en mayor medida y una Introducción 23 vez más la acción de los ácidos grasos monoinsaturados, más que a los efectos de las moléculas antioxidantes contenidas en ellos, de ahí la importancia del aceite de oliva gracias al alto contenido en ácido oleico. Entre las enfermedades de carácter autoinmune podemos citar la artritis reumatoide donde los estudios sobre la incidencia del consumo de aceite de oliva ha mostrado ejercer una disminución en el desarrollo de la misma (Linos et al., 1999). En estos estudios los efectos han sido atribuidos tanto a su contenido en ácido oleico, el cual inhibe la formación de metabolitos altamente proinflamatorios, como a las propiedades antioxidantes de los compuestos fenólicos (Yaqoob, 1998; Yaqoob et al., 1998; Wahle et al., 2004). En cuanto a la patología digestiva hay diferentes hechos significativos destacables. Serrano y col., (1997), compararon los efectos de dietas con diferente contenido en ácidos grasos sobre la secreción gástrica, demostrando que la ingesta de una dieta rica en aceite de oliva es capaz de atenuar la secreción de ácidos gástricos frente a una dieta rica en aceite de girasol, dado el predominio del ácido monoinsaturado del aceite de oliva frente a los poliinsaturados del girasol lo cual le da al aceite de oliva un valor potencialmente beneficioso en el tratamiento del ulcus duodenal. Por otro lado, se ha demostrado que el ácido oleico mejora el vaciamiento gástrico de la vesícula biliar, con la consiguiente disminución del riesgo de cálculos biliares gracias a los terpenos presentes en la fracción insaponificable, así como estimulando la producción de colecistoquinina que favorece el vaciado vesicular a diferencia de otros aceites vegetales que parecen incrementar el riesgo de cálculos biliares. (Pandey et al., 2003). Asimismo, un alto contenido de AGMI y AGPI en la dieta ha sido asociado a un aumento en la síntesis de ácidos biliares, provocando una excreción más rápida del colesterol de la dieta (Bravo et Introducción 24 al., 1998) e igualmente se ha demostrado que la presencia del ß-sitosterol del aceite de oliva dificulta la absorción del colesterol. Íntimamente relacionado con la protección del aparato cardiovascular se halla la regulación de la presión sistólica. De acuerdo con la OMS, la hipertensión arterial es la causa subyacente de más de 7.000 muertes al año en todo el mundo. En este sentido, diferentes estudios resaltan el papel hipotensor de las dietas conteniendo una mayor proporción de los AGPI n-3, (Appel et al., 2005, Engler et al., 1999; Engler y Engler, 2000). Este efecto hipotensor es atribuido, al menos en parte, al incremento en la síntesis de eicosanoides derivados de la serie n-3, los cuales se caracterizan por una mayor ateroprotección frente a sus homólogos de la serie n-6, derivados del ácido araquidónico (Pérez- Jimenez et al., 2002). Del mismo modo, se ha visto que la sustitución de AGS por AGMI en la dieta es capaz de disminuir la presión sistólica y diastólica en un 5-9 % en pacientes sanos (Salas et al., 1999) o predispuestos a desarrollar una hipertensión (Appel et al., 2005). En España la actividad hipotensora inducida por la ingesta de aceite de oliva ha sido mostrada en diversos estudios clínicos (Lahoz et al., 1997; Ferrara et al., 2000; Perona et al., 2004a). Dicha actividad ha sido asociada a cambios estructurales y funcionales en la membrana celular atribuida a la composición de ácidos grasos. Por ultimo, en un estudio muy reciente se ha demostrado que una dieta pobre en productos grasos está inversamente relacionada con padecer hipertensión arterial, el estudio fue realizado con un grupo de ancianos con un alto riesgo vascular, lo cual sugiere que este tipo de dietas pueden tener un efecto protector contra la hipertensión arterial (Toledo et al., 2008). Un estudio reciente demuestra de forma concluyente una relación inversa entre dieta mediterránea y prevalencia de hipertensión, diabetes e hipercolesterolemia en pacientes de alto riesgo (Sánchez-Taínta et al., 2008). Introducción 25 3. METABOLISMO LIPIDICO 3.1. Los lípidos. Importancia biológica Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos orgánicos. Su estructura química varía, y con ella, también lo hacen sus propiedades y su función. Dentro de ellos se encuentran las grasas, que se dividen en saturadas e insaturadas. Están constituidos por carbono, hidrógeno y oxígeno fundamentalmente. En los alimentos existen fundamentalmente tres tipos de lípidos. - Triglicéridos o triacilglicéridos - Fosfolípidos - Ésteres de colesterol Juegan los lípidos varios papeles en la dieta humana, un papel sensorial provocando el placer y deleite de los alimentos ingeridos; provocan la sensación de plenitud o saciedad dado el mayor tiempo de digestibilidad que requieren frente a carbohidratos o proteínas; igualmente son una fuente de energía que cuando no es necesaria se almacena en el cuerpo en células específicas denominadas células adiposas o adipocitos; y por último, y no menos importante, es el papel que juegan en el aislamiento térmico corporal o de sostén de estructuras anatómicas, así como determinando la formación estructural de las membranas celulares. Una característica básica de los lípidos es su hidrofobicidad siendo ello responsable de la baja solubilidad de los mismos frente al agua. Esta característica les viene determinada por su propia estructura química. 3.1.1. Ácidos grasos Los ácidos grasos son moléculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada lineal, y con un número par de átomos de carbono. Tienen en un extremo de la cadena un grupo carboxilo (-COOH). Tienen Introducción 26 esencialmente carácter apolar y por tanto, son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos (Lehninger et al., 1993). Se pueden clasificar los ácidos grasos en saturados e insaturados y desempeñan un importante papel dentro de las grasas, dado que forman parte de los triglicéridos y también de los fosfolípidos (junto con glicerol, grupo fosfato y otros grupos hidrofílicos). Además, se esterifican con los esteroles en general y con el colesterol en particular para dar lugar a ésteres de esteroles y colesterol respectivamente. (Larsson, 1994) 3.1.2 Lípidos complejos Dentro del grupo denominado lípidos complejos están los fosfolípidos que son lípidos saponificables en cuya estructura molecular además de carbono, hidrógeno y oxígeno, hay también nitrógeno, fósforo, azufre o un glúcido. Son las principales moléculas constitutivas de la doble capa lipídica de la membrana celular, por lo que también se llaman lípidos de membrana y hacen que tengan que darse unas condiciones extremas para que las membranas sufran alguna modificación (Lehninger et al., 1993). Existen dos grandes grupos de fosfolípidos, los glicerofosfolípidos (o fosfoglicéridos) y los esfingolípidos. Los fosfoglicéridos están compuestos por dos ácidos grasos asociados a una molécula de glicerol, y de un grupo fosfórico en la posición sn-3, unido por enlace fosfodiéster, este grupo proporciona carga negativa a la molécula. Los esfingolípidos son similares a los fosfoglicéridos, con la diferencia de que la estructura base no es una molécula de glicerol, sino que están compuestos por una molécula de esfingosina, un amino alcohol con una cadena alifática, y un ácido graso, además de un grupo fosfatídico sustituido por un grupo alcohol o amino (Glew., 1997). Introducción 27 3.2. Absorción y metabolismo de los lípidos de la dieta Debido al carácter hidrófobo de los lípidos su digestión, en la luz intestinal por parte de las hidrolasas, de carácter hidrófilo, no está exenta de cierta dificultad. Hay que señalar que la digestión de los lípidos tiene comienzo en el estómago gracias al proceso de emulsión, es decir, el fraccionamiento de las grandes moléculas de grasa en unidades más pequeñas, gracias a la acción de emulsionantes ingeridos en la dieta entre los que podemos citar los denominados fosfolípidos dietéticos (Bermúdez et al., 2004) En este proceso de emulsión juega un papel determinante la acción de una lipasa lingual y otra gástrica, llamadas ambas esterasas preduodenales. En este proceso de emulsión, y de fraccionamiento, los ácidos grasos son liberados a la luz gástrica para pasar a la corriente sanguínea unidos a la albúmina plasmática. Una segunda emulsión tiene lugar en la luz intestinal por medio de las sales biliares y fosfolípidos liberados por la vesícula biliar. Igualmente, la presencia de ácidos grasos en el duodeno estimula la liberación de colecistoquinina, responsable de la contracción vesicular, esto a su vez favorece la llegada de bilis facilitando así la emulsión de las gotas de grasa. 3.3. Transporte de los lípidos de la dieta. Las lipoproteínas Las lipoproteínas, son complejos macromoleculares esféricos, formadas por un núcleo que contiene lípidos apolares (colesterol esterificado y triglicéridos) y una capa externa polar formada por fosfolípidos, colesterol libre y proteínas (apolipoproteínas), cuya principal función es el transporte de lípidos tanto endógenos, sintetizados en el hígado, como exógenos, sintetizados en el intestino a partir de los lípidos de la dieta. Dicho transporte se realiza desde los órganos de producción o absorción hasta los tejidos periféricos de utilización y de almacenamiento, Introducción 28 como el tejido muscular y el adiposo, respectivamente. La formación de lipoproteínas es esencial, pues permiten el desplazamiento de moléculas hidrofóbicas a través del medio acuoso que supone el plasma, y a su vez contiene las apolipoproteínas (apos) necesarias para su metabolismo. 3.3.1. Estructura y composición de las lipoproteínas Las lipoproteínas se componen de un núcleo hidrofóbico, formado por TG y EC, rodeado de una cubierta de carácter anfifilico formada por FL, colesterol libre y apos. Los FL se disponen formando una monocapa y se orientan de forma que las cadenas de AG contactan con el núcleo hidrofóbico, mientras que los grupos polares se orientan al exterior. El colesterol no esterificado se dispone también en esta monocapa lipídica con el grupo hidroxilo hacia el exterior y el núcleo esteroide hacia el interior. Los apos se sitúan preferentemente hacia el exterior de las lipoproteínas aunque pueden incluir parte de su estructura en el núcleo hidrofóbico. Cuando esto ocurre, los aminoácidos también se disponen según su polaridad dentro de la estructura lipoproteica. Así, los aminoácidos más polares se orientan hacia el exterior de la partícula, a deferencia de aquellos más apolares que lo harán hacia el interior (Mataix, 2002). Las apos, además de proporcionar integridad estructural en las partículas de lipoproteínas, desempeñan un papel vital en el control del metabolismo lipoproteico, pues actúan como ligandos de los receptores de la membrana celular y como cofactores de algunos enzimas clave que participan en su catabolismo. En la Figura 9 se muestra el esquema de la estructura molecular de un quilomicrón (QM), que responde al esquema general de las lipoproteínas. Introducción 29 Figura 9. Estructura molecular de un quilomicrón. Modificado de Lehninger et al., 1993. Las moléculas que integran las partículas lipoproteicas están unidas por fuerzas fisicoquímicas débiles. Esta característica permite el intercambio de material lipídico y proteico entre distintas lipoproteínas, un proceso que tiene lugar durante el desarrollo de los procesos metabólicos a los que están sometidas dichas partículas. Por lo tanto, las lipoproteínas no presentan una estructura estática, ya que ésta depende del estado metabólico en el que se encuentren. Las lipoproteínas se clasifican en diferentes grupos según su densidad, que es proporcional a su contenido lipídico, así a mayor densidad menor contenido en lípidos. Los QM (Quilomicrones), son grandes partículas esféricas que transportan los lípidos en sangre hacia los tejidos. Su formación tiene lugar en la luz intestinal. Las VLDL (Very Low Density Lipoproteins), o lipoproteínas de muy baja densidad, son sintetizadas en el hígado y a nivel de los capilares de los tejidos extra hepáticos (adiposo, mama, cerebro, glándulas Colesterol Triglicéridos y ésteres de colesterol Fosfolípidos Apolipoproteínas Introducción 30 suprarrenales) son atacadas por una enzima Lipoproteina lipasa la cual libera a los triacilgliceroles, convirtiéndolos en ácidos grasos libres. IDL (Intermediate Density Lipoproteins) o lipoproteínas de intensidad intermedia. LDL (Low Density Lipoproteins), o lipoproteína de baja densidad, son lipoproteínas que transporta el colesterol desde el hígado al resto del cuerpo, para ser utilizado por las distintas células. Un alto nivel de LDL está asociado al riesgo de padecer aterosclerosis, infarto de miocardio y apoplejía. HDL (High Density Lipoproteins), o lipoproteínas de alta densidad son un tipo de lipoproteínas que transportan el colesterol desde los tejidos del cuerpo al hígado. Estudios epidemiológicos muestran que altas concentraciones de HDL (superiores a 60 mg/dL) tienen un carácter protector contra las enfermedades cardiovasculares como la cardiopatía isquémica e infarto de miocardio. Bajas concentraciones de HDL (por debajo de 35 mg/dL) suponen un aumento del riesgo de estas enfermedades, especialmente para las mujeres. Estas lipoproteínas se subdividen en dos subtipos con distinta densidad, HDL2 y HDL3 (Tabla 1). Tabla 1. Características fisicoquímicas y composición de las lipoproteínas humanas (Mataix, 2002) QM VLDL IDL LDL HDL2 HDL3 Diámetro (Å) 800-5000 250-800 250-300 200-250 70-120 50-100 Densidad (g/mL) <0,960 0,960-1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,125 1,125-1,210 %Fracción Proteica 1-2 10 18 25 40 55 TG 85 55-50 30 7 5 3 EC 4 13 22 35 15 12 CL 2 8 8 15 5 4 %Fracción Lipídica FL 8 15-18 22 20 35 25 Introducción 37 5. INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es una enfermedad transmisible producida por un retrovirus, que afecta directa y fundamentalmente al sistema inmunológico, produciendo un cuadro de deterioro profundo, progresivo e irreversible de la función inmune. Presenta un amplio espectro de manifestaciones clínicas que van desde la infección aguda inicial con sintomatología inespecífica, pasando por un período variable asintomático, hasta desembocar en una serie de infecciones oportunistas que definen el estadío más avanzado de la enfermedad, denominado SIDA. Representa una pandemia global y altamente letal de la que se conocen casos en todos los continentes y cuya cifra de mortalidad se acerca al 50% de los individuos afectados. Se conocen datos de su existencia al examinar bancos de suero almacenados en 1959 en África Central, así como por el reconocimiento retrospectivo de casos en Europa y EE.UU en la década de los 70, si bien, fué en 1979 cuando se detectaron las primeras manifestaciones clínicas relacionadas con la enfermedad. Sin embargo, es en 1981, con la descripción del primer caso en EE.UU, cuando el SIDA emerge como entidad clínico-patológica claramente definida, alcanzando el número y distribución de casos rápidamente y propiedades de pandemia. 5.1. Malnutrición en la infección por el virus del VIH/SIDA Entre las consecuencias derivadas de la enfermedad del VIH, el déficit nutricional y la pérdida severa de peso, constituyen dos graves complicaciones que en muchos casos determinan la morbimortalidad de los sujetos afectados. Dicha malnutrición posee un doble componente proteico-energético, en el sentido que no solo se produce una pérdida de Introducción 38 masa corporal, sino que además conlleva un grave desequilibrio en diferentes marcadores bioquímicos. Uno de los criterios diagnósticos de VIH es el denominado síndrome de consunción o caquéctico (wasting síndrome), ya definido en el año 1987 como una pérdida de peso involuntaria superior al 10% con respecto al peso basal, más diarrea crónica (más de 2 deposiciones diarias durante más de 30 días) o debilidad crónica y fiebre intermitente o constante durante más de 30 días, en ausencia de enfermedad concurrente y otra condición que pueda explicar estos hallazgos. Un elevado porcentaje de enfermos desarrolla malnutrición en los primeros estadios de la enfermedad, la incidencia y gravedad de la misma aumenta en las fases finales. No obstante, en los últimos años, y gracias a la introducción de los tratamientos antirretrovirales de gran actividad, la incidencia de la malnutrición ha disminuido, aún así sigue siendo una seria complicación a tener en cuenta a pesar de dichos tratamientos. En España, la incidencia de malnutrición en enfermos de VIH viene descendiendo desde el año 1994. 5.1.1 Factores nutricionales y desarrollo de la infección Los datos epidemiológicos no avalan de forma clara y taxativa una relación directa entre la ingesta de nutrientes y el progresivo desarrollo de la enfermedad, si bien es cierto que el cuidado nutricional de estos pacientes constituye un factor determinante en la supervivencia y progresión de la misma. Los individuos afectados por esta enfermedad pueden fallecer con una pérdida de masa corporal en torno al 50%, constituyendo esta pérdida de peso (Tang et al., 2005) un buen factor predictivo de la mortalidad de estos sujetos, y porcentajes de pérdida de hasta un 5% pueden ser determinantes de una mayor o menor supervivencia de los sujetos infectados. Hay estudios que señalan que una elevada ingesta de determinados micronutrientes tales como vitamina A, Introducción 39 C, niacina y vitamina B1, se asociaría a un descenso en el índice de progresión de la enfermedad (Tang, 2003). Si la pérdida de peso y el desequilibrio en el balance de micronutrientes constituye ya de por sí un severo problema, estas alteraciones nutricionales además son causa de la manifestación de complicaciones secundarias en el transcurso de la enfermedad, como puede ser infección sistémica por microbacterias. Existen diversos factores que influirían sobre el desarrollo de la enfermedad entre los que podemos destacar los siguientes: 5.1.1.1. Efectos de la propia malnutrición La malnutrición lleva aparejada una serie de cambios estructurales y funcionales en el organismo que a su vez determinan un incremento en la propia malnutrición creándose así un círculo vicioso difícil de romper. Entre estos cambios podemos citar la pérdida de altura e incluso la desaparición de la microvellosidad intestinal responsable de la absorción nutricional a este nivel, reducción de las disacaridasas y aminopeptidasas de la mucosa epitelial, descenso de las secreciones gástricas y pancreáticas, sobrecrecimiento bacteriano y en definitiva malabsorción de carbohidratos y grasas (Grinspoon y Bilezikian 1992). Igualmente la malnutrición proteico-energética lleva aparejada una mala respuesta inmunitaria, afectando tanto al sistema inmunitario humoral como al celular, alterándose los procesos fagocitarios, disminución en la actividad complemento, descenso en el número y función de linfocitos T, incluyendo los CD4, linfocitos B, macrófagos y células killer (Khovidhunkit et al., 2004) No menos importante son las repercusiones hormonales derivadas de la malnutrición entre las que cabe destacar, el ascenso del cortisol, reducción de los niveles plasmáticos de hormonas tiroideas T3 y T4, así como un descenso de los niveles de testosterona y estrógenos circulantes. Introducción 40 6. ANORMALIDADES METABÓLICAS LIPÍDICAS EN VIH. Las alteraciones del metabolismo glucídico y lipídico, y su rol como factores de riesgo cardiovascular en el paciente VIH, así como las dificultades en el manejo terapéutico, constituyen un nuevo y apasionante campo de trabajo en el área de la medicina interna. Las anomalías metabólicas observadas en los pacientes tratados con terapia combinada producen un serio impacto ya sea en su imagen corporal o en el incremento del riesgo de enfermedades cardiovasculares. Se han mencionado casos de infarto agudo de miocardio en pacientes infectados VIH en tratamiento con inhibidores de proteasa (IP) que presentaban una hipercolesterolemia con hipertrigliceridemia. No hay hallazgos epidemiológicos concluyentes respecto a la relación entre el nivel de triglicéridos plasmáticos y la incidencia de enfermedad coronaria realizados en población general. Los estudios de control de casos muestran una asociación firme y uniforme, y la mayoría de los estudios prospectivos indican una relación positiva significativa. Según el estudio cardiológico de McKee et al., (1971), el nivel de triglicéridos plasmáticos puede tener mayor valor predictivo en las mujeres. Cuando coexisten niveles altos de triglicéridos y bajos de HDL- colesterol, incluso con aumento mínimo o nulo de LDL-colesterol se incrementa el riesgo de enfermedad coronaria. El estudio cardiológico de Jaross et al., (1994) vincula esta alteración con un muy alto riesgo de enfermedad coronaria. El tratamiento de estos desórdenes metabólicos todavía sigue siendo tema de discusión. En los últimos años se han descubierto nuevos aspectos de la funcionalidad lipídica, su participación en procesos defensivos contra las infecciones, y se ha puesto de manifiesto su papel en la inmunidad natural. En consecuencia, debe considerarse el metabolismo lipídico como enclavado entre dos sistemas, el metabólico y el defensivo. Introducción 41 Los lípidos y las lipoproteínas forman parte de la inmunidad natural y sufren variaciones durante una reacción inflamatoria inespecífica. Como mediadores defensivos, los lípidos parecen desempeñar varios papeles en la lucha antiinfecciosa: destrucción o lisis, de neutralización, de bloqueo de receptores y de quimiotaxis. 6.1. Alteraciones en el metabolismo lipídico en enfermos de VIH En humanos, las infecciones y procesos inflamatorios conllevan un descenso del colesterol plasmático, como consecuencia de un descenso conjunto de las LDL y HDL (Sammalkorpi, 1988; Grunfeld, 1992; Auerbach, 1989; Ettinger, 1989). Como en otras infecciones, la causada por VIH está acompañada por disturbios en el metabolismo lipídico y glucídico. Esas anormalidades están presentes aun sin terapia antirretroviral. En el curso de la infección por VIH, en la etapa precoz asintomática desde el punto de vista clínico, aparecen niveles bajos de HDL, seguidos de niveles bajos de LDL. Posteriormente, de manera tardía en el curso de la infección, los niveles de triglicéridos van ascendiendo. El aumento de la síntesis hepática de triglicéridos y la disminución de la catabolización periférica de los mismos, al reducirse la actividad de la lipoproteínalipasa, provoca una hipertrigliceridemia, más o menos intensa, que en algunas ocasiones ha sido utilizada como marcador pronóstico en el curso de enfermedades infecciosas, entre las que destaca el VIH. La ocurrencia simultánea de niveles bajos de colesterol con niveles altos de triglicéridos podría afectar la imunocompetencia de los sistemas humoral y celular. Los cambios en la membrana celular podrían producirse también por la hipocolesterolemia la que a su vez podría afectar la replicación viral. La disminución de niveles de colesterol-HDL observada en la infección por VIH podría contribuir a la presencia del sincitio (fusión celular) induciendo a su vez, la expresión de fenotipos del VIH. Todos estos mecanismos pueden contribuir a las Introducción 42 relaciones entre los niveles plasmáticos de lípidos con la activación inmunológica y progresión de la enfermedad. El aumento de los niveles de triglicéridos, y la disminución de HDL, conlleva la aparición de LDL-c, LDL pequeñas y densas, las cuales son fácilmente oxidadas y estimulan la producción de endotelinas y la proliferación de macrófagos en la pared arterial, con un papel importante en la génesis de la aterosclerosis (Grunfeld, 1992). Se han propuesto diferentes mecanismos responsables del desarrollo de la hipertrigliceridemia del individuo infectado por el VIH: (a) descenso en la actividad de la LPL, que provocaría una disminución en el aclaramiento plasmático de los triglicéridos (Rodríguez y Muñoz, 2000). (b) incremento en la síntesis hepática de ácidos grasos (Wilcox et al., 1996). (c) aumento de la lipolisis, que origina un aumento de los niveles circulantes de ácidos grasos y de la producción de VLDL (Feingold et al., 1993). (d) aumento en la producción de citoquinas. (e) existencia de ciclos fútiles de grasa. 6.1.1. Citoquinas y cambios metabólicos A las citoquinas se le achaca la responsabilidad en las alteraciones metabólicas tanto en modelos animales como en individuos con cáncer o sepsis, por lo que se ha sugerido su participación en las alteraciones del metabolismo lipídico observadas en la infección por el VIH/SIDA, si bien los resultados no son concluyentes. Algunas citoquinas (interferónα, interleuquinas, factor de necrosis tumoral (TNF) juegan un rol importante en la patogenia de las dislipemias en los pacientes infectados por VIH. Las citoquinas median también en la producción de LDL oxidadas, de Introducción 43 endotelinas y de óxido nítrico, responsables de la disfunción endotelial y de la proliferación de macrófagos. Una de las principales citoquinas implicadas es el TNF-α, que en modelos animales ha demostrado, además de un efecto inmunomodulador y citotóxico, efectos sobre el metabolismo intermediario y balance calórico (Ling, 1997). Además, el TNF-α inhibe la actividad de la LPL, aumenta los niveles de VLDL y aumenta la lipolisis de adipocitos, efectos que contribuyen a la hipertrigliceridemia (Grunfeld, 1992). Sin embargo, la implicación del TNF-α en la hipertrigliceridemia y pérdida de peso asociada a la infección por el VIH/SIDA, no está claramente establecida. Si bien en estudios iniciales se mostraron concentraciones elevadas de TNF-α en ciertos individuos con VIH (Lähdevirta, 1988), resultados posteriores no han observado diferencias en las concentraciones plasmáticas de TNF-α entre individuos VIH y sujetos control (Grunfeld, 1992; Aukrust et al., 1994), así como tampoco correlación entre dichas concentraciones y el grado de pérdida de peso en individuos VIH-positivos (Grunfeld, 1992). Parte de estos resultados contradictorios podrían relacionarse con la observación de incrementos episódicos de las concentraciones de TNF-α sólo coincidiendo con la existencia de infecciones secundarias (Aukrust et al., 1994), así como con las dificultades para su determinación debido a su escasa vida media. Otra citoquina implicada en las alteraciones del metabolismo lipídico en la infección por el VIH/SIDA es el INF-α. En individuos VIH se han observado concentraciones plasmáticas de INF-α anormalmente elevadas, que además se correlacionan positivamente con la hipertrigliceridemia (Grunfeld et al., 1991), descenso en el aclaramiento plasmático de triglicéridos (Grunfeld, 1992) e incremento de la síntesis hepática de ácidos grasos durante el ayuno, así como alteraciones de VLDL-C y Apo B. Se desconoce, no obstante, si el INF-α directamente induce hipertrigliceridemia o bien es un marcador de actividad del sistema inmune y de la producción de otras citoquinas. Introducción 44 Igualmente las citoquinas como la TNF-α, INF-α, IL-1 e IL-6, parecen desempeñar un papel significativo en la producción de ciclos fútiles de grasas responsables de parte de la hipertrigliceridemia. Estas citoquinas incrementan los triglicéridos plasmáticos por dos mecanismos: A) Aumento de la producción de VLDL: Esto puede producirse por, a) un aumento de la lipolisis del tejido adiposo, fenómeno en el cual los ácidos grasos liberados son transportados al hígado los cuales son reesterificados en triglicéridos y secretados al torrente sanguíneo como VLDL. (Memon et al., 1993; Feingold et al., 1992; Feingold et al., 1993). b) incremento de la síntesis hepática de ácidos grasos con el incremento de la producción de VLDL (Feingold et al., 1992; Nonogaki et al., 1995; Feingold et al., 1990; Grunfeld et al., 1990). B) Descenso del aclaramiento plasmático de TRL: Algunas citoquinas, como el TFN-α, IL-1 y IL-6 inhiben la síntesis de la Lipoproteína Lipasa (LPL) en el tejido adiposo y células endoteliales, lo que provoca un descenso en el aclaramiento de las VLDL (Kawakami et al., 1987; Grunfeld et al., 1992; Hardardóttir, 1994; Rodríguez et al., 2000). 6.1.2. Fisiopatología de las alteraciones del metabolismo de las lipoproteínas en el VIH En los procesos infecciosos e inflamatorios se producen una serie de alteraciones metabólicas conocidas como la fase de respuesta aguda (FRA). Ésta se caracteriza por inducir cambios en la concentración específica de proteínas plasmáticas, que actúan como mecanismos de reparación de las lesiones causadas por el agente infeccioso; la FRA lleva asociada cambios en las concentraciones plasmáticas de lípidos y lipoproteínas (Hardardóttir, 1994). Entre los cambios podemos destacar un incremento de los niveles de Introducción 45 triglicéridos y VLDL, descenso de HDL y del colesterol total (Sammalkorpi et al., 1988, Grunfeld et al., 1992). En la infección por VIH se considera a la apoproteína A1 (apo A1), que es el mayor componente proteico de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), como un factor antivírico en la lucha orgánica contra el referido retrovirus. La membrana glicoproteica del VIH es esencial para el anclaje y penetración del virus en la célula huésped. Esta membrana vírica parece participar también en la fusión intercelular posterior a la infección con producción de células gigantes, uno de los efectos citopáticos más importantes de la acción patogénica del virus. La membrana viral contiene regiones que pueden plegarse formando hélices alfa anfipáticas. La apo A1 contiene también péptidos anfipáticos, análogos a los que se ha comprobado que inhiben la fusión celular, tanto en células infectadas por VIH como en células infectadas por recombinaciones víricas. Estos péptidos anfipáticos poseen la capacidad de disminuir la infectividad del VIH. El modo en el que la apo A1 ejerce una acción inhibitoria de la infección celular por VIH puede resumirse en los siguientes mecanismos: • Alterando la capa lipídica bilaminar de la membrana vírica o celular, o ambas, al modificar sus propiedades fusogénicas. • Interactuando con el dominio fusogénico de la gp41. • Interfiriendo con el receptor celular de la fusión. • Dificultando la unión de gp120 con el receptor celular CD4. La infección por VIH asintomática se asocia con una disminución temprana en las concentraciones plasmáticas de colesterol de alta densidad (HDL). La progresión hacia enfermedad sintomática y a síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) causa mayor disminución del colesterol HDL, disminución del colesterol total, elevación de triglicéridos y acumulación de las subclases pequeñas y densas de las LDL. Los niveles de colesterol HDL son menores en pacientes con cuentas bajas de linfocitos CD4. Las anormalidades son una respuesta inespecífica a una infección con Introducción 46 repercusión sistémica existiendo relación entre las concentraciones plasmáticas de triglicéridos con las concentraciones de β2-microglobulina y de factor de necrosis tumoral-α, o de interferón-γ. La hipertrigliceridemia se debe, entre otros factores, a disminución de la actividad de la lipasa lipoproteica, debido al acumulo sanguíneo de sus inhibidores (ej. ácidos grasos), por otro lado, la producción hepática de lipoproteínas es anormalmente baja, hecho que limita la severidad de la hipertrigliceridemia. Por otra parte, los niveles bajos de colesterol HDL se explican por la menor actividad de la lipasa lipoproteica, enzima responsable de un porcentaje importante de la síntesis de las HDL. Además, si existen niveles altos de triglicéridos, la hipertrigliceridemia por sí misma es causa de colesterol HDL bajo (por aumento de depuración de la HDL enriquecidas en triglicéridos). Independientemente de las funciones citadas anteriormente, las HDL protegen de la oxidación de las LDL debido a algunas de las proteínas asociadas a las HDL, tales como la ceruloplasmina, transferrina, Apo A-I que presentan una acción antioxidante (Kunitake et al., 1992; Ehrenwald et al., 1994) por ello un descenso provocado en enfermedades infecciosas y/o inflamatorias podría contribuir a descender la oxidación de las LDL. Asimismo, se ha observado efectos directos de las infecciones sobre los macrófagos, que podrían incrementar el riesgo de aterosclerosis, ya que toxinas y citoquinas (TNF y IL-1) provocan una acumulación de lípidos (Khovidhunkit et al., 2004; Rodríguez et al., 2000). Por otra parte se han puesto de manifiesto cambios en el metabolismo de las LDL, ya que durante los procesos infecciosos se producen algunos cambios estructurales y funcionales en las LDL que las hacen más proaterogénicas y el SIDA al ser un proceso inflamatorio crónico comparte estos cambios. A continuación se detallan algunos de ellos. Materiales y Métodos 53 Condiciones cromatográficas Se utiliza un cromatógrafo Hewlett Packard 5890 Serie II, equipado con columna capilar de sílice fundida Omegawax Tm 320, de 30 m de longitud, 0,32 µm de diámetro interno y película de 0,25 µm de espesor, y detector de ionización de llama (FID). Los análisis se llevaron acabo con una rampa de temperatura que comenzó con 165ºC durante 4 minutos, un incremento de 2ºC por minuto hasta alcanzar los 200ºC, y un mantenimiento de esta temperatura durante 15 minutos. La temperatura del inyector fue de 200ºC, y la del detector de 250ºC, con un flujo de gas auxiliar (N2) de 30 mL/min, flujo de split de 70 mL/min y una relación de split de 1/40. Portador: H2. Expresión de los resultados El porcentaje de cada ácido graso se determina según: %ácido graso x= (Ax × 100) / ∑A Donde: Ax. Área del pico del ácido graso x. ∑A. Suma de las áreas de todos los ácidos grasos. 8.1.2. Fracción insaponificable La determinación de los componentes del insaponificable requiere el tratamiento previo de la muestra que consiste en una saponificación de los ácidos grasos para eliminar las interferencias producidas por los triglicéridos, seguida de un aislamiento de esta fracción insaponificable mediante extracción líquido-líquido Procedimiento Antes de pesar el aceite, en un matraz de 250 mL se añade 1 mL de solución de patrones Eneicosanol (C21OH) y α-colestanol de concentraciones 0,05 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente, en cloroformo). Se evapora el disolvente en el que van los patrones. Seguidamente se Materiales y Métodos 54 pesan 5 g de aceite con exactitud de mg, se le añaden 50 mL de solución alcohólica 2N de KOH (13 g + 20 mL de agua + 80 mL de etanol) y se tiene a ebullición 1 hora. A continuación se le añade agua destilada. Se transfiere todo a un embudo de decantación de 500 mL. Las extracciones se realizan 3 veces con éter etílico añadiendo cada vez 80 mL, los extractos se combinan en otro embudo de decantación. Se lava varias veces con agua hasta pH neutro. La solución de éter se pasa por un filtro que contiene sulfato sódico anhidro. A continuación se elimina el disolvente en una rotavapor y se pesa. Expresión de los resultados % Insaponificable= (gramos obtenidos/ gramos de aceite pesado) × 100 Para la determinación cuantitativa de los componentes del insaponificable del aceite es necesario, una vez obtenido éste, proceder a eliminar las interferencias, mediante aislamiento de las fracciones correspondiente por cromatografía en placa fina. Fraccionamiento del insaponificable: Desarrollo en placa fina (CCF) La CCF se realizó sobre placas de vidrio recubiertas de sílica gel 60, de 2,25 mm de espesor (Merck) desarrollando dos veces con la mezcla hexano-éter (65/35). Para la determinación de esteroles y de eritrodiol+uvaol se siguieron los procedimientos indicados en los anexos V y VI del reglamento CEE/2568/91 de la Comisión de la Comunidades Europeas respectivamente 1. Preparación de placas para el aislamiento del insaponificable Las placas de sílice deben recubrirse previamente con una solución de potasa en etanol para que retenga en su origen aquella parte de los ácidos libres y también jabones que no han sido eliminados y de esta manera no interferir en la separación. Materiales y Métodos 55 Procedimiento Se pesan 2,8 g de potasa a los que se les añaden 250 mL de alcohol etílico, Esta solución se pone en una bandeja en la que se sumerge la placa cromatográfica (20×20) durante 1 minuto. A continuación se seca al aire durante, al menos 1 hora y seguidamente se activa en una estufa durante 1 hora a 105ºC. 1. Desarrollo cromatográfico de la fracción insaponificable. El insaponificable obtenido una vez pesado se redisuelve en 1,5 mL de cloroformo y se siembra en la placa fina. Esta placa se desarrolla en una cubeta cromatográfica con hexano:éter (65:35); con dos desarrollos, el primero hasta la mitad de la placa y el segundo completo. Una vez terminado el segundo se seca al aire y se revela pulverizando con dicloroflueresceína (figura 10). Una vez realizado el desarrollo de la placa se aíslan las bandas correspondientes a los compuestos o grupos de compuestos a determinar, se derivatizan (silanizando) y se inyecta en el cromatógrafo de gases con el método correspondiente a cada uno de ellos. Aislamiento y derivatización de: 1. Alcoholes + metilesteroles. 2. Esteroles + eritrodiol y Uvaol. Las bandas correspondientes a estas dos fracciones se raspan y se ponen en un filtro que va sobre un embudito, y éste sobre una pera. Se lava 1º con 10 mL de cloroformo caliente, 2º Dos veces con 10 mL de éter etílico. Se lleva a sequedad mediante rotavapor. A continuación se añade 200 µL de reactivo silanizante (Trimetilcloroxilano/hexametildisilazano en piridina) y se inyectan en el cromatógrafo de gases con las condiciones de alcoholes o esteroles (ver página 57). Se utiliza cromatografía en capa fina por las ventajas que tiene para el aislamiento de los componentes del insaponificable de un aceite Rapidez Sencillez Materiales y Métodos 56 Económica Poder separador Figura 10. Desarrollo de una placa conteniendo el insaponificable con Hexano:Eter (65:35) Hidrocarburos Tocoferoles Alcoholes Esteroles Dialcoholes triterpénicos Figura 11. Cromatografía en Placa fina de la fracción insaponificable de un aceite Todas las ventajas citadas se dan cuando trabajamos con una sola muestra y cuando disponemos de cantidad suficiente como ocurre cuando se trabaja con un aceite. En nuestro caso para el estudio de insaponificable de TRL sería inviable porque: 1. Tenemos un gran número de muestras a analizar y además, una pequeña cantidad de éstas. Materiales y Métodos 57 2. No se dispone de cantidad suficiente de algunos de los compuestos y el reactivo para revelar (diclorofluoresceína) no es lo suficientemente sensible. 3. Los patrones utilizados como referencia se desarrollan a velocidad diferente (distinto Rf): 1º porque van solos y 2º porque en algún caso se ha escogido un estándar con una estructura ligeramente diferente a los compuestos a aislar. Condiciones cromatográficas para la determinación de alcoholes: Columna: SPB5 Temperatura de horno: 215-290ºC a 2ºC/min Tiempo a la Tra inicial: 5 min Tiempo a la Tra final: 8 min Inyector: 300 ºC Detector: 300ºC Tiempo de análisis: 50 min Condiciones cromatográficas para determinación de esteroles: Columna: SPB5 Temperatura horno: 265ºC Inyector: 300 ºC Detector: 300 ºC Tiempo de análisis: 30 min Materiales y Métodos 58 8.1.3. Ceras Esta determinación se describe en el Reglamentación europeo (UE, 2568/91. Anexo IVb). Indicándose que se usa para detectar presencia de aceites de orujo en aceite de oliva. Para su análisis se realiza un fraccionamiento del aceite, en columna de cromatografía con gel de sílice hidratado para, una vez mas, evitar interferencias de los triglicéridos. Se pesa en un matraz en forma de pera de 25 mL de capacidad 0,5 g de aceite y a continuación se añade 1 mL de solución de laurilaraquidato al 0,1% m/v en hexano. Se agita para disolver y se vierte cuantitativamente el contenido en la columna; la elución se realiza con la mezcla hexano:éter (98.5:1.5) a un ritmo de aproximadamente 2mL por minuto. Se utiliza el indicador Sudán I al 1% en hexano para impedir la incorporación de triglicéridos (León y Cert, 1994), ya que al ser coloreado y eluir junto con los triglicéridos podemos parar la elución cuando el color alcance la parte baja de la columna sin que llegue a salir de esta manera los triglicéridos. A continuación se evapora el eluído en rotavapor; por último redisuelve en 5mL de heptano del que se inyecta 1 µL en el cromatógrafo de gases. Condiciones cromatográficas Se ha utilizado un cromatógrafo Hewlett Packard 5890 Serie II, equipado con columna capilar con fase SPB TM-5 de 15 m de longitud, 0,32 mm de diámetro interno y película de 0,1 µm de espesor, y detector de ionización de llama (FID). Los análisis se llevaron a cabo mediante inyección “on column” con una rampa de temperatura que comenzó a 70ºC, un incremento de 45ºC por minuto hasta alcanzar los 180ºC, e incremento de 5ºC por minuto hasta alcanzar los 310ºC, temperatura que se mantiene durante 15 minutos. La Materiales y Métodos 59 temperatura del inyector fue de 63 ºC, y la del detector de 350ºC, con un flujo de gas auxiliar (N2) de 30 mL/min. Expresión de los Resultados Se determinan las áreas correspondientes a los picos del patrón interno y los ésteres alifáticos de 40-46 átomos de carbono y el contenido total de ceras en mg/kg, se calcula según: Ceras (mg/kg) = (Ax × ms × 1000) / (As × m) Donde: Ax. ∑ Áreas de los picos C40 - C46 As. Área del pico del laurilaraquidato. ms. Peso en miligramos del laurilaraquidato. m. Peso en gramos de la muestra Materiales y Métodos 60 9. EXPERIENCIA CLÍNICA 9.1. Selección y características de los voluntarios 1- Grupo de voluntarios sanos Se llevó a cabo en el Hospital Universitario Virgen del Rocío de la ciudad de Sevilla, realizándose la selección entre el personal voluntario del Instituto de la Grasa Se comenzó la selección incluyendo en este grupo personas sanas de edades comprendidas entre los 20 y 31 años, que no cumplían los criterios de exclusión que a continuación se detallan: 1. Antecedentes de hipertrigliceridemia familiar 2. Hipertensión secundaria 3. Enfermedad cardiovascular, renal o hepática 4. Obesidad 5. Diabetes 6. Alcoholismo 7. Tabaquismo 8. Estar sometido a tratamiento farmacológico que afecte a los parámetros de estudio. Teniendo en cuenta estos criterios, se concluyó la selección con la participación de 9 voluntarios cuyas características se recogen en la Tabla 2. Tabla 2. Características de los voluntarios sanos Sexo Varones Media Edad (años) 20–31 26,2±4,3 Índice de Masa Corporal (Kg/m2 ) 20,1-26,2 23,7±2,0 A cada uno de ellos se le realizó un análisis bioquímico y hematológico completo, y se consultó su historial clínico para verificar que no cumplían ninguno de los criterios de exclusión. Todos los ensayos se realizaron de Materiales y Métodos 61 acuerdo con los principios fundamentales de la Declaración de Helsinki, del Convenio del Consejo de Europa y de la Declaración Universal de la UNESCO. Para ello, se ha elaborado un protocolo de análisis para el estudio con humanos aprobado por el Comité Institucional para Investigación en Humanos del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla. Los sujetos voluntarios dieron consentimiento escrito a este protocolo después de ser convenientemente informados tanto oralmente como por escrito y fueron exhortados a evitar el consumo tanto de bebidas alcohólicas como de tabaco durante el día precedente al comienzo del experimento. 2- Grupo de voluntarios infectados por VIH Se reclutaron voluntarios varones infectados por VIH procedentes de la Unidad de Infecciosos del Hospital Costa del Sol de Marbella (Málaga, España), de edades comprendidas entre 31 y 49 años con índice de masa corporal (IMC) 17,1–26,19. Los voluntarios fueron seleccionados en base a los siguientes criterios de inclusión y exclusión: Criterios de inclusión • Edad comprendida entre 31 y 49 años. • Padecer infección por el VIH demostrada mediante técnicas de enzimoinmunoanálisis realizados en el Hospital Costa del Sol. • Estar bajo HAART. • Informados y carta de aceptación por parte de los mismos a participar en el estudio. • No cumplimiento de los criterios de inclusión. • Personas con hipertrigliceridemia secundaria, enfermedad de tipo cardiovascular, renal o hepática, obesidad, alcoholismo, diabetes, fumadores. • Tratamientos farmacológicos que afecten al metabolismo lipídico, distinto de la terapia antirretroviral. Materiales y Métodos 62 Todos los ensayos se realizaron de acuerdo con los principios fundamentales de la Declaración de Helsinki, del Convenio del Consejo de Europa y de la Declaración Universal de la UNESCO. Para ello se elaboró un protocolo de análisis para el estudio con humanos que fue aprobado por el Comité Institucional para Investigación en Humanos del Hospital Universitario Costa del Sol (Marbella, España). Los voluntarios dieron su consentimiento por escrito a este protocolo después de ser convenientemente informados verbalmente y por escrito. Asimismo, fueron exhortados a evitar el consumo tanto de bebidas alcohólicas como de tabaco durante el día precedente al comienzo del estudio postprandial, dada la influencia de estos factores sobre el metabolismo lipídico. Teniendo en cuenta estos criterios, se concluyó la selección con la participación de 11 voluntarios cuyas características se recogen en la tabla 3. Tabla 3. Características de los voluntarios infectados con el VIH. Sexo Varones Media Edad (años) 31–49 40,8±5,4 Índice de Masa Corporal (Kg/m2) 17,1-26,2 22,4±3,1 9.2. Ingesta Experimental La comida experimental consistió en 100 g (peso seco) de pasta cocida, 130 g de salsa de tomate que se acompañó con una rebanada de pan de molde integral de 28 g y un yogurt desnatado de 125 g. Esto se enriquece con 70 g del aceite a estudiar; alternando el de orujo con el de oliva con un periodo de lavado de una semana. Esta comida proporcionó 4523 kj de energía, de los cuales el aceite aportó 2587 kj. La comida se ingirió a primera hora de la mañana, en condiciones de ayuno previo de 12 horas. De cada sujeto se tomó una muestra de 9 mL de sangre en condiciones basales inmediatamente antes de la comida Materiales y Métodos 69 12. LÍMITES DE DETECCIÓN El límite de detección (LDD) es la concentración mínima de sustancia que puede ser detectada por un método analítico determinado. Intuitivamente, sería la concentración mínima obtenida a partir de la medida de una muestra, que contiene el analito, que seríamos capaces de discriminar de otra obtenida a partir de una muestra sin analito presente. Cuando en esta definición se introduce la palabra fiabilidad, esto implica necesariamente la introducción de estadística y hablamos en ese caso de límite de cuantificación (LDQ) en la propia definición y en su cálculo posterior (Vial y Jardy, 1999). En métodos cromatográficos de análisis en los que el pico correspondiente al analito debe ser distinguido de la línea de base cromatográfica, el LDD puede calcularse midiendo el ruido del cromatograma de diversos (normalmente tres) blancos de muestra que han sido sometidos a todo el proceso analítico. Por otra parte, dado que el método que proponemos no se utiliza para análisis de trazas en alimentos o como el caso de antidopaje, donde la legislación requiere la ausencia de ciertos analitos, el límite de detección debe estimarse de forma rigurosa, como se describe en el documento de la IUPAC (IUPAC 1995). Hemos procedido, por tanto, a su determinación preparando diluciones sucesivas de los patrones interno, e inyectado en las mismas condiciones que las muestras experimentales, llevándolas primero a sequedad y silanizando. 13. FACTOR DE RESPUESTA Para el cálculo de los factores de respuestas se preparan las siguientes disoluciones A. Disolución de patrones: α-colestanol (0.5 mg/mL) C21:0-OH (0.4 mg/mL) Materiales y Métodos 70 Epicoprostanol (0.2 mg/mL) B. Disoluciones de : Colesterol (1,0 mg/mL) Escualeno (1,0 mg/mL) C28:0-OH (1,0 mg/mL) ß-Sitosterol (1,0 mg/mL) A partir de cada una de las disoluciones que vamos a utilizar como disolución de patrón interno y de las de los compuestos a determinar el factor de respuesta se preparan 5 nuevas disoluciones mediante diluciones, tomando los volúmenes que a continuación se detallan Tabla 4. Preparación de diluciones para el cálculo de factores de respuesta Volúmenes (mL) Disolución Patrón (A) Disolución muestra (B) Disolvente (C) 1 0,25 3,75 Solución 1 1 0,5 3,5 Solución 2 1 1 3 Solución 3 1 2 2 Solución 4 1 3 1 Solución 5 De cada una de las disoluciones anteriormente preparadas (C) se toman 200 µL que se llevan a sequedad, se silanizan y se inyectan en las mismas condiciones de nuestro método de análisis. Obtenemos así 5 valores de áreas para cada uno de los patrones y 5 para cada compuesto, obteniéndose para cada inyección un valor de RF para cada compuesto. El valor final de cada uno es la media de los 5 obtenidos. RF = [Componente] x Q [Patrón] Materiales y Métodos 71 Donde: RF = factor de respuesta [Componente] = concentración de un componente [Patrón] = concentración de patrón Q = Área Componente/Área Patrón 14. RECUPERACIÓN Y REPETIBILIDAD Para la determinación de la recuperación y repetibilidad del método se formó un “stock” de suero a partir de varias muestras al que se le realizó todo el proceso: Extracción de quilomicrones Obtención de los lípidos Obtención del insaponificable La metodología fue realizada añadiendo todos los patrones desde el principio del proceso y también, a otra parte de la muestra stock, se le realizó el proceso añadiendo los patrones al final justo antes de silanizar. La diferencia entre ambos es una medida de la recuperación. Se hicieron seis replicados para cada método y cada muestra a su vez fue inyectada en el cromatógrafo 3 veces (Total = 18 inyecciones). 15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados de los análisis de la composición de los aceite se han expresado como valores medios ± desviaciones estándar. El efecto del método analítico fue analizado mediante análisis de la varianza de una sola vía con un nivel de significación del 5%. Los resultados obtenidos en los análisis de la composición de TRL se representaron en gráficamente en función del tiempo. Los resultados fueron expresados como media ± error estándar de la media (SEM) del número de experimentos (n) indicado en cada caso. Materiales y Métodos 72 El análisis estadístico se realizó con el programa Graphpad Prism, seguido del t-student. La diferencia entre los valores obtenidos se consideró significativa a partir de P<0.05. Resultados y Discusión 73 15. Composición de la Ingesta Experimental La composición nutricional de la comida empleada fué recogida de la declarada en los envases de cada uno de los alimentos y se muestra en la tabla 5. Tabla 5. Composición Nutricional de la Comida Empleada en el Estudio (g). PESO CARBOHIDRATOS PROTEÍNAS GRASA1 ENERGÍA (KJ) Pasta (trigo) 100 72,0 11,0 1,0 1450 Salsa de tomate 130 7,2 1,6 >0,1 153 Rebanada de Pan2 28 2,5 2,3 0,8 283 Yogurt desnatado 125 6,0 5,5 0,1 50 Aceite3 70 - - 70,0 2587 Total 453 87,7 20,4 71,9 4523 1Fraccionamiento de la grasa excluyendo el aceite (g): Saturada (0,6), Monoinsaturada (0,5), poliinsaturada (0,8). 2Fibra (1,7). 3Aceite de orujo (OR), aceite de oliva refinado (OL). Consistió en 100 g (peso seco) de pasta cocida, 130 g de salsa de tomate enriquecida con 70 g de aceite, OL u OR objetos de este estudio, que se acompañó de una rebanada de pan de molde integral de 28 g, y un yogurt desnatado de 125 g. Esta comida proporcionó 4523 kj de energía, de los cuales el aceite aportó 2587 kj. 16. COMPOSICIÓN DE LOS ACEITES UTILIZADOS 16.1. Composición en ácidos grasos El análisis de la composición en ácidos grasos de los aceites de OL y OR empleados en el estudio fué realizado mediante cromatografía de gases previa transesterificación de las muestras. En la tabla 6 se detallan los resultados de dicho análisis. Las principales diferencias entre los aceites utilizados en este trabajo en relación a la composición en ácidos grasos se observa en la proporción de oleico (18:1, n-9), siendo ligeramente inferior Resultados y Discusión 74 en el aceite de orujo, y en la concentración de linoleico (18:2, n-6), cuyo contenido fué notablemente inferior en al aceite de OL que en el de OR (Tabla 6). El oleico es un ácido graso monoinsaturado al que se han atribuido tradicionalmente los efectos cardiosaludables del aceite de oliva (Pérez-Jiménez et al., 1995; Ginsberg et al., 1990; Mattson y Grundy, 1985). No obstante, estudios demuestran que otros ácidos grasos, así como su distribución posicional en los triglicéridos, y otros componentes como los polifenoles y la fracción insaponificable del aceite de oliva virgen pueden tener igual o mayor importancia que el propio ácido oleico para reducir o prevenir la incidencia cardiovascular (Perona et al., 2003; Escriba et al., 2003; Abia et al, 2001; Martinez-Dominguez et al, 2001). La concentración de ácido linoleico (18:2, n-6), fué aproximadamente dos veces superior en el OR (8.07 %) que en el de OL (4.52 %) (Tabla 6), cuyos valores suele estar comprendido en el amplio rango de 3,5 – 21,0 %. Este dato es muy variable ya que depende de la variedad de la aceituna y de las condiciones agronómicas. Normalmente los valores obtenidos están más cercanos a bajas cantidades de linoleico; sin embargo, los aceites de orujo tienen una parte importante del aceite procedente de la semilla (hueso) de la aceituna y, que como cualquier otra semilla en general, se caracteriza por ser rica en ácidos mas insaturados como es el caso del linoleico. Este ácido es esencial para los humanos, pues son incapaces de sintetizarlo e interviene en diversos procesos biológicos (Aparicio y Harwood, 2003), debiendo ser proporcionado cada día en la dieta. Por otra parte, los aceites utilizados en estos estudios contienen cantidades moderadas de los ácidos saturados mirístico, palmítico, esteárico, aráquico, behénico y lignocérico (total = 14,12%). Por último, las composiciones de los dos aceites utilizados en estos ensayos están dentro de la normativa establecida para los aceites de orujo y oliva (EEC, 1991). Resultados y Discusión 75 Tabla 6. Composición en ácidos grasos de los aceites empleados en el estudio (% s/total de EM). ACIDOS GRASOS Aceite de OL1 Aceite de OR1 Mirístico (14:0) 0,02 0,02 Palmítico (16:0) 11,06 10,47 Palmitoleico (16:1, n-7) 0,83 0,77 Esteárico (18:0) 3,56 3,00 Oleico (18:1, n-9) 78,39 75,59 Trans-oleico (18:1, n-9) 0,12 0,18 Linoleico (18:2, n-6) 4,55 8,21 α-Linolénico (18:3, n-3) 0,62 0,71 Aráquico (20:0) 0,42 0,46 Gadoleico (20:1, n-9) 0,25 0,34 Behénico (22:0) 0,12 0,17 Lignocérico (24:0) 0,05 0,07 1Valores expresados como porcentaje del total de ácidos grasos Media de 2 determinaciones 16.2. Componentes menores Entre los componentes menores de los aceites se encuentran los compuestos insaponificable, éstos se determinan gravimétricamente tras un proceso de saponificación, siguiendo el protocolo descrito en el apartado 8.1.2, y supuso un 1,6 % en el aceite OR de segunda centrifugación y 1.3 % en el caso del OL. El contenido de los componentes de la fracción insaponificable, entre los que se encuentran los esteroles, fué analizado por cromatografía de gases siguiendo los métodos oficiales recomendados. En la Tabla 7 se recogen los resultados obtenidos, para los componentes menores de los aceites, donde se pueden apreciar notables diferencias tanto en los constituyentes de la materia insaponificable entre ambos aceites como en otros componentes menores saponificables como los ácidos terpénicos oleanólico y maslínico, y las ceras. Resultados y Discusión 76 Tabla 7. Componentes menores de los aceites OL y OR empleados en estos estudios. COMPONENTES MENORES Aceite de OL Aceite de OR FRACCIÓN INSAPONIFICABLE Escualeno (mg/kg) 2642 2543 Esteroles Totales (mg/kg) 1120 2245 β-Sitosterol (%) 95.2 95.2 Campesterol (%) 3.2 2.4 ∆7-Estigmasterol (%) 0.2 0.3 Brasicasterol (%) 0.1 0.1 Colesterol (%) 0.3 0.3 Otros (%) 1.2 1.7 Tocoferoles Totales (mg/kg) 145 345 α-Tocoferol (%) 94.3 80.7 β-Tocoferol (%) 4.2 8.9 γ-Tocoferol (%) 1.5 10.4 Triterpenos Eritrodiol+Uvaol (mg/kg) 17 337 Oleanólico (mg/kg) Nd 416,0 ÁCIDOS TERPÉNICOS Maslínico (mg/kg) Nd 110,0 CERAS (mg/kg) 123 3484 El análisis de los resultados revela una diferencia notable en la cantidad de esteroles totales, el doble en el aceite de orujo de segunda centrifugación (OR) que en el aceite de oliva (OL), aunque el porcentaje de los distintos esteroles se mantiene con respecto a estos. Esta diferencia podría proporcionar un efecto beneficioso al consumo de aceite OR, pues existen diversos estudios que atribuyen interesantes propiedades a los esteroles de las plantas, capaces de reducir los niveles de LDL como consecuencia del descenso de absorción de colesterol, así como de disminuir el desarrollo de la lesión arteriosclerótica (De Jong et al., 2003). Además, se ha descrito que el β-sitosterol tiene efecto antiinflamatorio (de la Puerta et al. 2000) así como actividad protectora frente a la oxidación de las LDL in vitro (Andrikopoulos et al., 2002) del mismo modo que el campesterol, otro de los esteroles más abundantes. Resultados y Discusión 77 Los tocoferoles, especialmente el α- y γ-tocoferol, son importantes antioxidantes, también tienen una gran actividad biológica, pues ejercen una acción inhibitoria de la oxidación de las LDL con efecto creciente, en este caso, en el siguiente orden (Andrikopoulos et al., 2002): α-tocoferol < β-tocoferol < γ-tocoferol El α-tocoferol es la especie mayoritaria, aunque se encuentra en un porcentaje inferior al que se encuentra en los oliva de otras categorías. Por tanto, aunque β- y γ-Tocoferol, son las especies minoritarias, se encuentran en mayor proporción respecto al total de tocoferoles en el aceite de orujo. No se observa, como con el resto de otras categorías o variedades de aceites de oliva presencia de δ-Tocoferol. En relación al contenido de hidrocarburos el mayoritario en los aceites de oliva es el escualeno, precursor bioquímico de los esteroles. Los análisis mostraron concentraciones de 2642 y 2543 mg/kg para OL y OR respectivamente. En relación a este dato no hay valores establecidos en la bibliografía consultada, ya sea sobre cantidades mínimas o máximas. Sin embargo, los aceites de oliva tanto vírgenes como refinados y de orujo son los que contienen la mayor cantidad de escualeno en comparación con otros aceites comestibles (Gutfinger y Letan, 1974). Algunas publicaciones atribuyen al escualeno un importante efecto antioxidante, destacando su papel protector frente a la alteración térmica (Malecka, 1991). En relación a los dos principales dialcoholes triterpénicos presentes en estos aceites, eritrodiol y uvaol, son compuestos que se aíslan conjuntamente con los esteroles y se cuantifican en esta fracción. Son mucho más abundantes en el aceite de orujo de segunda centrifugación que en los aceites de oliva y por esta razón se ha establecido como norma oficial para diferenciar estas categorías de oliva. Así, el límite establecido en la legislación para un aceite de oliva es del 4,5% de los esteroles totales. No existe límite superior para los orujos. El aceite OR empleado en Resultados y Discusión 78 estos estudios presenta un valor de 13,05%, mientras que el valor encontrado para OL es 1,49%. Varios autores atribuyen a los dialcoholes triterpénicos actividad antiinflamatoria en modelos de inflamación aguda y crónica (De la Puerta et al., 2000; Máñez et al. 1997; Recio et al. 1995). Además de la acción anti-inflamatoria, en el caso del uvaol, se ha visto que desempeña un papel antioxidante en la oxidación in vitro de lipoproteinas LDL (Andrikopoulos et al., 2002). Por último, y en relación al contenido en ceras existen notables diferencias entre OR (3484 mg/kg) y OL (123 mg/kg) asi como entre OR y los valores tabulados para los aceites de oliva de otras categorías cuyo límite está establecido en ≤250 mg/kg. 17. METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA EL AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE COMPONENTES INSAPONIFICABLES EN LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS. 17.1. Aislamiento del insaponificable en TRL El mismo procedimiento de obtención y aislamiento o purificación llevado a cabo con los aceites ha sido llevado a cabo con las TRL. Una vez obtenido el insaponificable a partir de TRL lo depositamos en forma de banda en una placa cromatográfica de sílice y se introduce en una cubeta conteniendo hexano:éter 65:35, se realiza un doble desarrollo para posteriormente proceder a su revelado con diclorofluoresceina y al aislamiento de las bandas obtenidas. En la Figura 13 se muestra una cromatografía en placa fina de una muestra de insaponificable obtenido a partir de las TRL, donde además se han puesto, en la parte derecha de la placa tres patrones, para localizarlos en la muestra. Como puede observarse es muy difícil la identificación de los diversos grupos de compuestos en las TRL, fundamentalmente por la baja concentración en Resultados y Discusión 85 Figura 19. Espectro de masas correpondiente al Estigmasterol En relación al pico 16 que eluye a Rt = 26,4 min, presenta un M+ a m/z = 207 y un B+ a m/z = 486. Estos datos junto con las restantes fragmentaciones recogidas en el espectro de la Fig. 20 nos indican que el pico 16 es el β-Sitosterol. Figura 20. Espectro de masas correspondiente al β-Sitosterol 64iman_jcrp #4339 RT: 33,90 AV: 1NL: 1,10E5 T: + c Full ms [ 60,00-700,00] 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 207 396 209 281 213 357 397 255 486 133 253 265225 147 121 73 109 356 381 163 83 487 173 227 282 228 327 429 358 313 369 471 407 528503 432 470 541 518 Pico 16. Rt = 26,4 81iman_JC RP_6H_AOO_ESTEROL #3771 RT: 31,98 AV: 1NL: 5,22E4 T: + c Full ms [ 60,00-700,00] 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 73 394 91 129 255 79 159 105 145 484 395 253 119 199 173 213 379 485 282 239 185 226 469 281 354 351 486 291 343 267 342 295 396 442 397 503 533 458 Pico 15. Rt = 24 ,2 Resultados y Discusión 86 Picos 12, 13, 21, 22, 23 y 26. Oxiesteroles y oxifitosteroles El espectro correspondiente al pico 12 muestra un abundante pico base B+ a m/z= 456. El resto de las fragmentaciones del espectro obtenido coincide con el encontrado en la librería de datos para el Colest-7-en-3ol (Figura 21) Figura 21. Espectro de masas del pico 12 (Rt = 22.6 min), correspondiente al Colest-7-en-3ol. En relación al compuesto señalado como pico 13, que eluye a Rt = 23,0 el espectro muestra un ión molecular a m/z= 382 y un pico base B+ a m/z= 472. Este espectro coincide con el encontrado en la librería de datos para el Colest-5-en-24one. Figura 22. Espectro de masas del pico 13 (Rt = 23.0 min) Colest-5-en- 24one 76iman_JSP_I_0h #3394 RT: 27,72 AV: 1NL: 3,07E4 T: + c Full ms [ 60,00-700,00] 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 456 209 207 281 73 225 341 79 149 283 355 105 147 267 429 359 457 227 299 401135 151 368 91 415191 253 325 430 159 121 369 323 161 459 247 399 431 175 302 452 463 470 81iman_JCRP_6H_AOO_ESTEROL #3593 RT: 30,74 AV: 1NL: 1,12E4 T: + c Full ms [ 60,00-700,00] 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 382 73 91 79 105 343 129 145 255 117 367 472 159 383 213 161 261 173 203 457 217 473 344 174 241 356 342 394 475 339 281 301 444 311 401 430 485 491 Resultados y Discusión 87 El compuesto que eluye a Rt = 30,0, pico 21, muestra un ión molecular M+ a m/z = 174 y un pico base B+ a m/z= 410. El espectro obtenido coincide con el encontrado en la librería de datos para el estigmasta-3,5-dien-7-one Figura 23. Espectro de masas del pico 21 (Rt = 30.0 min), correspondiente al Estigmasta-3,5-dien-7-one El pico 22 muestra un ión molecular M+ = 73 y un pico base B+ = 472. El espectro de masas obtenido coincide con el encontrado en la librería de datos para el 7-Cetocolesterol Figura 24. Espectro de masas del pico 22 (RT= 31.5 min), correspondiente al 7-Cetocolesterol 81iman_JCRP_6H_AOO_ESTEROL #4683 RT: 38,31 AV: 1NL: 1,61E4 T: + c Full ms [ 60,00-700,00] 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 174 159 91 410 79 187 67 105 147 119 411 95 269 213 395227 241 281 201 368 377 412297 354 325 445 Resultados y Discusión 88 El pico 26 a Rt = 38,5 presenta un ión molecular a m/z 484 y B+ = 574; coincide con a el sitostanetriol Figura 25. Espectro de masas del pico 26 (Rt= 38.5 min), correspondiente al Sitostanetriol Las estructuras de los principales esteroles oxidados identificados en nuestras muestras se encuentran recogidas en la Figura 26. En la Tabla 8 se recogen los tiempos de retención de todos los compuestos identificados presentes, tanto en los aceites como en las TRL. Hay dos zonas en los cromatogramas, la primera desde el inicio de la inyección hasta el minuto 9.0 y la segunda entre los tiempos de retención 16,1 y 18,0 y que corresponden por una parte a hidrocarburos lineales saturados e insaturados, y por otra parte a los alcoholes triterpénicos y metilesteroles que no han sido objeto de estudio. Hay que mencionar igualmente el hallazgo de picos, en los cromatogramas de algunas muestras, dentro del área perteneciente a los oxifitosteroles, que no hemos podido identificar, como también por otra parte hemos podido detectar cantidades insignificantes de otros componentes que debido a su pequeña concentración no nos ha sido posible llevar a cabo su cuantificación. 61imanCC F_alcoh #6535 RT: 48,34 AV: 1NL: 3,43E5 T: + c Full ms [ 60,00-700,00] 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 484 431 207 209 485 281 574 253 225 432 575 559 545 191 73 394 227 119 81 327 283 133 177 349 395 135 95 285 267 469 430 249 107 355 315 486 379 299 444 578 412 595 503 Resultados y Discusión 89 A Colest-7-en-3ol B Colest-5-en-24ona C Estigmasta-3,5-dien-7-ona D 7-Cetocolesterol E Epoxicolesterol F Sitostanotriol Figura 26. Estructuras de los principales oxi-esteroles y -fitosteroles encontrados. HO CH 3 CH 3 H 3 CCH 3 CH 3 O CH 3 CH 3 HO CH 3 CH 3 H 3 C HO CH3 CH3 H3CCH3 CH3 CH3 O HO CH3 CH3 H3CCH3 CH3 O HO CH 3 CH 3 H 3 CCH 3 CH 3 O HO CH 3 CH 3 H 3 CCH 3 CH 3 CH 3 OH OH Resultados y Discusión 90 Tabla 8. Tiempos de retención de todos los compuestos identificados 1Nº COMPONENTES Rt/min 1 C200H Eicosanol 9,0 C21OH (patrón interno) 9,9 2 C220H Docosanol 10,9 3 C230H Tricosanol 11,8 4 C240H Tetracosanol 13,0 6 C250H Pentacosanol 14,4 7 C260H Hexacosanol 16,1 8 C270H Heptacosanol 18,0 ALCOHOLES ALIFÁTICOS 9 C280H Octacosanol 20,0 HIDROCARBUROS 5 Escualeno 13,9 TOCOFEROLES 11 α–Tocoferol 20,8 Epicoprostanol (patrón interno) 18,7 10 Colesterol 20,2 α-Colestanol (patrón interno) 20,3 14 Campesterol 23,5 15 Estigmasterol 24,2 16 β-Sitosterol 26,4 17 ∆5-Avenasterol 26,9 18 ∆5,24-Estigmastadienol 27,7 19 ∆7-Estigmastenol 28,5 20 ∆7-Avenasterol 29,4 24 Eritrodiol 33,9 ESTEROLES Y DIALCOHOLES TRITERPÉNICOS 25 Uvaol 38.0 12 Colest-7 en-3-ol 22,6 13 Colest-5-en-24one-oxy 23,0 21 Estigmasta-3,5-dien-7-one 30,0 25-Hidroxicolesterol (patrón interno) 30,1 22 7-Cetocolesterol 31,5 23 Epoxicolesterol 33,7 OXIESTEROLES 26 Sitostanetriol 38,5 1. Numero asignado al compuesto en el cromatograma Resultados y Discusión 91 17.4. Límites de detección A partir de las disoluciones de los patrones usados como estándares internos para cuantificación de las muestras en estudio, se prepararon diluciones sucesivas, hasta 15*103 veces la empleada para la cuantificación de las muestras. Se llega al valor de LDD experimental para cada compuesto cuando la altura del pico cromatográfico del compuesto en cuestión es 3 veces la señal del ruido de la línea base y así, se establecen las cantidades mínimas detectables indicadas en la Tabla 9. Tabla 9. Límites de detección del método propuesto a partir de los patrones internos Patrones LDD (µg/mL) Áreas C21OH 0.026 >1433.25 Epicoprostanol 0.108 >2380.99 25-Hidroxicolesterol 0.010 >2319.12 17.5. Factores de respuesta. Para la determinación cuantitativa de los componentes del insaponificable de los aceites siguiendo la metodología analítica propuesta, hemos decidido utilizar dos patrones internos: Eneicosanol (C21OH) con el que se determina la familia de alcoholes y α-colestanol para la familia de esteroles. Se hace asi en los métodos normalizados, y al pertenecer ambos a las mismas familias a cuantificar se asume que tienen el mismo factor de respuesta. Para el caso de la determinación de escualeno, se ha decidido estudiar el factor de respuesta de este frente a ambos patrones. Para la cuantificación de los componentes del insaponificable de TRL se utiliza C21OH para la familia de alcoholes y se ha sustituido el α-colestanol, patrón utilizado para los aceites, por epicoprostanol (5β-colestan-3α-ol) ya que al Resultados y Discusión 92 haber una cantidad importante de colesterol, este solaparía en parte con el patrón de α–colestanol. Tabla 10. Factores de respuesta con respecto al alcohol C21OH y al αcolestanol. Respuesta (n = 4 ) Escualeno/C21OH 0,998 ± 0.003 Escualeno/α-colestanol 1,011 ± 0.002 C28OH/C21OH 1,004 ± 0.001 Colesterol/Epicoprostanol 1,021 ± 0.002 Los datos obtenidos muestran que el escualeno tiene una respuesta cromatográfica muy similar, tanto a la del eicosanol como a la del αcolestanol, las diferencias pueden ser perfectamente debidas al error de la determinación. Por tanto, y ante estos valores para la determinación de escualeno, hemos decidido hacerlo a partir del C21OH. 17.6. Recuperación y Repetibilidad de las diferentes familias de componentes del insaponificable 17.6.1. Resultados en TRL Para poder hacer el cálculo de la recuperación del método aplicado a los componentes menores insaponificables de TRL, con muestra suficiente para realizar los diferentes replicados, se preparó una muestra “stock” de suero a partir de varias muestras, a la que se le realizó todo el proceso: 1. Extracción de TRL 2. Obtención de los lípidos Resultados y Discusión 93 3. Obtención del insaponificable 4. Derivatización 5. Inyección y cuantificación El método desarrollado se le ha aplicado a la muestra stock 6 veces y cada uno de los insaponificables obtenidos tras derivatización mediante silanización (TMS-derivados) son inyectados 3 veces. Justo antes de la silanización e inyección se le añaden los patrones previamente descritos. Se obtienen, por tanto un total de 18 inyecciones. El mismo procedimiento se realiza a otra alícuota del stock de muestra, pero en este caso los patrones son añadidos desde el principio del ensayo, de la misma manera cada insaponificable obtenido y sililado es inyectado 3 veces. La concentración de alcoholes se ha calculado a partir de las relaciones de área C21OH-Componentes alcohólicos (C20-C28). El grupo de esteroles ha sido cuantificado mediante las relaciones de área epicoprostanol-esteroles. De la misma manera se hace con los oxiesteroles y el eritrodiol con el área del 25-hidroxicolesterol. Por último, hemos cuantificado el escualeno y el α-tocoferol a partir de las relaciones de área de C21OH. Con los datos obtenidos se han elaborado las tablas 11 y 12, que corresponden a la muestra cuantificada con patrones añadidos desde el principio del procedimiento y justo antes de la silanización, respectivamente. Teniendo en cuenta los valores recogidos en ambas tablas se puede determinar, por diferencia, la recuperación de cada uno de los grupos de compuestos. Si no se utilizan patrones desde el principio las recuperaciones están entre el 38 y 65% dependiendo de la familia de compuesto. Estos resultados nos indican la necesidad de añadir los estándares desde el principio del procedimiento; de esta manera se evitan las pérdidas que la manipulación del propio método conlleva y así la reproducibilidad es Resultados y Discusión 94 mayor. No sería por tanto factible, en este caso, la determinación cuantitativa mediante una recta de calibrado muy usual en el caso de una escasa manipulación de las muestras, como ocurre en la determinación de tocoferoles, mediante HPLC. Tabla 11. Resultados del estudio del método propuesto de TRL obtenidos añadiendo todos los patrones desde el principio (Resultados expresados en µg/mL de TRL) Alcoholes Totales Esteroles Totales Oxiesteroles Totales Hidrocarburos (Escualeno) Valor Medio 5,88 48,44 0,29 0,53 Número determinaciones 18 18 18 18 Desv Standard 0,99 2,15 0,06 0,03 Tabla 12. Resultados en µg/mL de TRL obtenidos añadiendo los patrones al final (Resultados expresados en µg/mL de TRL) Alcoholes Totales Esteroles Totales Oxiesteroles Totales Hidrocarburos (Escualeno) Valor Medio 2,74 21,96 0,19 0,20 Número determinaciones 18 18 18 18 Desv Standard 1,00 1,17 0,15 0,11 Resultados y Discusión 101 Encontramos diferencias significativas entre ambas curvas a las 2 horas y muy significativa a las 4 horas para un valor de P<0.05. La curva concentración-tiempo para el OR muestra un pico máximo a las 4 horas postprandiales (4,6 µg/mL), mientras que para el OL, sufre un pico de inflexión mínima a las 4 horas para después ascender hasta un pico máximo a las 6 horas (3,3 µg/mL). 0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 Tiempo (h) Alcoholes totales (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 28. Evolución concentración-tiempo de alcoholes totales de TRL de individuos sanos. Los valores representados son la media ± SEM (n=7-9). *P<0.05. El interés en alcoholes alifáticos de cadena larga ha sido escaso en comparación con los ácidos grasos, esteroles y fosfolípidos. Los alcoholes grasos han sido habitualmente relegados a un papel de precursores en la biosíntesis de los ésteres grasos y de éteres lipídicos. De hecho, se sabe muy poco acerca de la función biológica de los alcoholes grasos o sus derivados lipídicos, y rara vez se trata en los textos de bioquímica el metabolismo de los alcoholes grasos. No obstante, la reciente identificación de enfermedades humanas derivadas de defectos genéticos del metabolismo de alcoholes grasos ha comenzado a despertar el interés por la importancia de esta oscura clase de lípidos en la biología humana. * * Resultados y Discusión 102 Presencia de los alcoholes grasos y su papel biológico Los alcoholes grasos constituyen una clase ubicua de lípidos (Mahadevan, 1978). Existen como alcoholes libres o como ésteres grasos y éteres lipídicos al unirse a ácidos grasos y formar así las ceras. En mamíferos los alcoholes grasos libres más abundantes encontrados son tanto saturados como insaturados y con longitud de cadenas de 16 a 20 átomos de carbonos. Los ésteres grasos están formados por alcoholes grasos esterificados con ácidos grasos y habitualmente muestran una longitud de cadena similar de ácido y alcohol. Dentro de la cadena biológica alimenticia, los alcoholes grasos como un componente de ésteres grasos pueden encerrar la mayor reserva energética en los animales marinos. Tienen importancia en microorganismos marinos que son fuentes a su vez de energía en la dieta de pescados que se alimentan de ellos. En los tiburones y en ciertos peces, los éteres lípidos neutros y los ésteres grasos sintetizados a partir de alcoholes grasos constituyen la mayoría de lípidos del hígado y de otros tejidos (Malins et al., 1969). En el caso de las plantas, los alcoholes grasos son sintetizados por éstas e incorporados a las cadenas grasas de las células de las hojas donde actúan como una barrera frente al agua (Eglinton et al., 1967; Kottukudy, 1970). Sin lugar a dudas, los herbívoros dependen en cierta medida para su nutrición de los alcoholes grasos. En los mamíferos, los alcoholes grasos libres constituyen una pequeña parte de la composición lipídica de la mayoría de los tejidos, normalmente cantidades inferiores a 0,01% del total de la masa lipídica. En comparación con los alcoholes libres, estos lípidos son mucho más abundantes cuando se encuentran esterificados con ácidos grasos. Los lípidos derivados de los alcoholes grasos son particularmente importantes en ciertos tejidos, tales como la piel, cerebro, nervios periféricos, médula Resultados y Discusión 103 ósea, eritrocitos y corazón. En la piel, los ésteres grasos y el alquildiacilglicerol constituyen el 24% (Nicolaides, 1967) y el 15% (Oku et al., 1995) de la superficie lipídica de la piel, respectivamente. En la mielina del cerebro humano casi todo el fosfatidil etanolamín (PE) está en la forma del éter plasmalógeno, siendo entre 11-14% del total lipídico (O´Brien et al., 1965). El papel biológico de los alcoholes grasos y de los lípidos derivados de los alcoholes en mamíferos, con pocas excepciones, se desconoce. Un éter lipídico (1-alkil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolin), comúnmente conocido como factor activador plaquetario, es un potente mediador químico y tiene un papel crucial en la coagulación sanguínea (Hanahan, 1986). Estudios in vitro de células deficientes en plasmalógeno incubadas con ácidos grasos pyrene, sugieren que los éteres lipídicos pueden proteger las membranas biológicas del daño inducido por irradiación ultravioleta (Zoeller et al., 1988). Estos éteres fosfolipídicos pueden también jugar un papel en los procesos de fusión de membrana durante la exocitosis y endocitosis (Lohner, 1996). Los alcoholes grasos con una cadena de carbonos inferior a 14 carbonos tienen propiedades anestésicas bien conocidas que desaparecen cuando la cadena es más larga (Pringle et al., 1981). Los alcoholes grasos, los ésteres grasos y alguilgliceroles de la epidermis, junto con otros lípidos neutros, pueden contribuir a la función barrera frente al agua en la piel y su presencia en el sebo puede procurar una protección a la piel frente a microorganismos y frente a virus con cápsulas lipídicas (Snipes et al., 1977; Kubo et al., 1995). El Hexadecanol (C16:0-OH) in vitro ha demostrado ser un inhibidor de la actividad de la lipasa (Ferreira, 1990), no obstante, efectos parecidos in vivo no se han demostrado. Origen y metabolismo de los alcoholes grasos en mamíferos En mamíferos, los alcoholes grasos están presentes por la ingesta de la dieta y endógenamente son sintetizados a partir de ácidos grasos Resultados y Discusión 104 (Stetten et al., 1940; Zinder et al., 1970). Sin lugar a dudas, los humanos consumen los alcoholes grasos procedentes de origen vegetal, pero la digestibilidad de los alcoholes grasos libres o de los ésteres grasos (ceras) por el hombre aun no ha sido definida. El consumo proveniente de la dieta de alcoholes de cadena larga y su contribución al pool total de alcoholes grasos en el hombre se desconoce. Una excepción es el fitol (3, 7, 11,15- tetramethyl-2-hexadecen-1-ol) un alcohol graso de origen vegetal de 20 átomos de carbono que no es sintetizado por los mamíferos. El fitol tiene su origen, en parte, en fuentes vegetales y en parte por la descomposición de la clorofila en el intestino, un proceso que tiene escasa relevancia en el hombre pero de fácil formación en rumiantes (Baxter, 1986; Steinberg, 1995). Se ha demostrado que los humanos absorben el fitol de la dieta y que es oxidado a ácido fitánico (Steinberg, 1995). Las vías que conducen a la síntesis y la oxidación de los alcoholes grasos parecen tener lugar en forma de ciclo (Rizzo et al., 1987). El concepto de un ciclo de alcohol graso deriva del hallazgo de que dentro de una célula intacta, el alcohol graso es simultáneamente sintetizado a partir de ácido graso y oxidado de nuevo a ácido graso, y que las enzimas que catalizan estas reacciones son distintas. Las evidencias que sostienen este ciclo de alcohol graso derivan de la existencia de errores genéticos en humanos del metabolismo de los alcoholes grasos asociados con bloqueos en reacciones específicas. El ciclo del alcohol graso no está cerrado a la entrada de metabolitos intermediarios, tales como lípidos de la dieta o productos resultantes del catabolismo de otros lípidos. En gran medida los alcoholes grasos son sintetizados a partir de ácidos grasos vía reducción de los ésteres de la acil-CoA (Riendeau et al., 1985). La activación inicial de un ácido graso libre es catalizada por la acil- CoA sintetasa y requiere ATP. La siguiente reducción de acil-CoA es catalizada por acil-CoA reductasa, una enzima NADPH-dependiente, que parece provenir de un aldehído intermediario (Bishop et al., 1981). Esta enzima tiene una longitud de cadena relativamente corta, especificidad Resultados y Discusión 105 que determina el perfil de las estructuras de los alcoholes (Bishop et al., 1978). El alcohol graso es utilizado también como sustrato para la síntesis de ésteres grasos y éter lipídicos y es de nuevo oxidado a ácido graso por el alcohol graso: NAD+ oxidoreductasa (FAO), un complejo enzimático consistente al menos de dos proteínas separadas que catalizan la oxidación del alcohol graso a aldehído graso y ácido graso (Rizzo et al., 1987; Lee, 1979; Ichihara et al., 1986). El flujo relativo de alcohol graso a través de las vías de biosíntesis son opuestas a las de oxidación a ácido graso, dependen sin lugar a dudas de los índices de síntesis de ésteres grasos y éteres lipídico, los cuales pueden variar de unos tejidos a otros. Las enzimas involucradas en el metabolismo del alcohol graso parecen estar reguladas de forma coordinada para modular la disponibilidad del alcohol graso para las necesidades de biosíntesis. Varios pasos enzimáticos en el metabolismo del alcohol graso están localizados en compartimentos subcelulares específicos, aunque los lugares subcelulares para todas las enzimas en un tejido o especies no han sido identificados. No se sabe si el ciclo del alcohol graso tiene una función auxiliar además de proveer de precursores para la biosíntesis de lípidos o el reciclaje de lípidos. Cada vuelta del ciclo consume una molécula de ATP e intercambia dos moléculas de NADPH por NADH. En células que poseen un nivel bajo de síntesis de éteres lipídicos y ésteres grasos, el ciclo puede tener una utilidad escasa en la síntesis del alcohol graso y la oxidación (Hue, 1982). El intercambio de equivalentes reductores, sin embargo, puede ser importante para otras reacciones oxidativas-reductivas dentro de la célula. Diversos estudios sugieren que los alcoholes grasos de cadena muy larga disminuyen los niveles de colesterol plasmáticos en humanos, de forma que la ingesta de 5-20 mg por día de una mezcla de alcoholes, incluyendo Resultados y Discusión 106 octacosanol (C28OH)y triacontanol (C30OH), disminuyen el LDL en torno a un 21-29% y elevan el HDL en torno un 8-15% promoviendo además una mejora en la resistencia general del organismo, una mejora en la resistencia al stress y una más rápida recuperación después del ejercicio. El policosanol (C24-C34), ha demostrado reducir las tasas de colesterol en ensayos clínicos así como la fracción LDL (Fernández et al., 2004; Wang et al., 2003) también han demostrado inhibir la agregación plaquetaria y la perioxidación lipídica, tanto en modelos experimentales como en humanos. En recientes experimentos llevados a cabo in vitro se ha puesto en evidencia la actividad antiinflamatoria que juegan los alcoholes grasos al inhibir y disminuir ciertos mediadores químicos necesarios en la cadena inflamatoria. Y así, se ha podido constatar que estos alcoholes grasos disminuyen la producción de NO, del factor α-de necrosis tumoral, de prostaglandina E2 y de tromboxano A2 (Fernández-Arche A et al., 2008), todos ellos factores mediadores en los procesos inflamatorios. La mayoría de los científicos suponen que la biodisponibilidad de los alcoholes de cadena larga en mamíferos está en torno a un 10-40% de las ceras consumidas (Place, 1992). Si las ceras contienen aproximadamente un 25% de alcoholes de cadena larga, podemos suponer que al menos se necesitaría el consumo de 0.1g de cera natural para alcanzar una dosis efectiva de policosanol en la dieta, aunque los procesos culinarios podrían llevar aparejados una degradación de los constituyentes de las ceras y esto podría explicar por qué las dietas refinadas tienden a producir una elevación del colesterol. Resultados y Discusión 107 18.1.3. Esteroles 18.1.3.1. Colesterol Según los resultados obtenidos en nuestro estudio, en el caso del colesterol excepto a las 0 horas, entre las que sí encontramos una diferencia estadísticamente significativa (P<0.005) no aparecen diferencias en las cantidades obtenidas para los valores de colesterol en la TRL tanto para ingestas conteniendo, OR como para las que contienen OL. Las gráficas de los resultados cuantitativos obtenidos tras ambas ingestas se mantienen prácticamente plana a lo largo de todo el periodo postprandial sin picos máximos aunque sí con un progresivo ascenso en la cantidad total de colesterol hasta las 6 horas postprandiales. 0 2 4 6 8 0 2 4 6 Tiempo (h) Colesterol (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 29. Evolución concentración-tiempo de colesterol de TRL de individuos sanos. Los valores representados son la media ± SEM (n=7-9). *P<0.005. Atendiendo a los resultados obtenidos en las experiencias realizadas en el grupo de voluntarios sanos, podemos decir que la presencia de colesterol en la fracción TRL es ligeramente superior cuando la dieta experimental utilizada se ha elaborado con OL que cuando se ha elaborado con OR. La explicación a este hecho podría venir determinada por los niveles más altos de fitosteroles totales presentes en el OR frente al OL tal * Resultados y Discusión 108 y como se verá en las figuras 30 y 32 respectivamente, ya que los fitosteroles juegan un papel importante en el descenso de los niveles de colesterol tal y como se recoge en la bibliografía que posteriormente se cita. Desde hace tiempo es conocido el papel que desempeña el colesterol dentro de los procesos aterogénicos vasculares y su relación con toda la patología cardiovascular. Hay que recordar que la muerte por patología cardiovascular constituye la causa más frecuente de mortalidad en el mundo desarrollado, de ahí el esfuerzo que se viene haciendo en los últimos años para la comprensión del mecanismo fisiopatológico que desempeña el colesterol en dicha patología. El colesterol, a pesar de su similitud química con los fitosteroles, presenta una funcionalidad completamente diferente. Los estudios de los últimos años han demostrado cómo los fitosteroles a pesar de que presentan una absorción muy pequeña en relación al colesterol, juegan un papel inhibidor importante en la absorción de éste último. A medida que aumenta la ingesta de fitosteroles desciende más el LDL. El efecto hipolipemiante óptimo se obtendría con ingestas diarias de fitosteroles esterificados entre 1 y 3 g, siendo la reducción de la absorción del colesterol de un 50 %. Sin embargo, si se eleva la ingesta de fitosteroles hasta 9 g, no aumenta la reducción del colesterol, con lo que no tendría sentido introducir mayores cantidades de fitosteroles en la dieta. El mecanismo mediante el cual los fitosteroles disminuyen el colesterol sanguíneo parece ser multifactorial; entre los factores cabe destacar la inhibición de la absorción del colesterol a nivel de intestino delgado limitando la solubilidad en las micelas y disminuyendo la hidrólisis de los ésteres de colesterol en el mismo. La disminución de la absorción intestinal del colesterol inducida por los fitosteroles promueve dos efectos reguladores hepáticos. El primero es el aumento de la síntesis endógena de colesterol, y el segundo la estimulación de la expresión de receptores LDL, con el consiguiente aumento de captación del LDL circulante. El resultado Resultados y Discusión 109 final es un descenso entre el 10-15% del LDL plasmático. Este descenso del colesterol por los fitosteroles lleva aparejado un efecto antiaterogénico significativo (Moghadasian et al., 1997). El colesterol es una molécula insoluble, por lo que su absorción intestinal supone una cierta complejidad, siendo el yeyuno proximal la región donde se realiza su absorción pasando a la linfa transportado por las TRL. Son muchas las enzimas y proteínas que participan en la absorción intestinal del colesterol, entre ellas la lipasa pancreática y la carboxyl ester lipasa y aunque no todos los mecanismos han sido elucidados, hasta el momento se han caracterizado la mayoría de pasos en la absorción intestinal del colesterol. Además de la genética, (actualmente se acepta que aproximadamente un 80% del colesterol circulante en el plasma está determinado por el genotipo del individuo) diversos factores fisiológicos (edad, obesidad, velocidad del tránsito intestinal, capacidad detergente de los ácidos biliares en la circulación enterohepática) y dietéticos (tipo y cantidad de grasa, carga de fitosteroles y cantidad de fibra) ejercen una influencia variable sobre la eficiencia de la absorción intestinal del colesterol, en general por interacciones físicas que favorecen o interfieren la formación de micelas mixtas en la fase intraluminal del proceso absortivo. Los suplementos dietéticos que inhiben la absorción de colesterol son la fibra alimentaria, la lecitina de soja y los fitosteroles. A la luz de los conocimientos actuales, la disminución de la concentración plasmática de colesterol LDL sería responsable de una disminución de los lípidos contenidos en la placa de ateroma. Hay que mencionar que los lípidos más aterogénicos son las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las de muy baja densidad (VLDL). Gracias a la eficacia hipolipemiante de los inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa, se han podido conseguir reducciones del cLDL de hasta un 50%. La formación de la placa ateromatosa conlleva unos cambios estructurales a nivel del endotelio vascular en los que intervienen la agregación plaquetaria, y activación de los macrófagos plasmáticos. Resultados y Discusión 110 También hay que mencionar que las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son las lipoproteínas eficaces en el denominado transporte reverso de colesterol. Esta función consiste en complejos mecanismos que tratan de retirar el colesterol de la pared arterial y de otras células y llevarlo hacia el hígado donde son captadas y catabolizadas para eliminar el exceso de colesterol. Bajos niveles de colesterol HDL, aun en presencia de colesterol total normal, son fuertes indicadores de enfermedad coronaria prematura. El riesgo de enfermedad coronaria a cualquier concentración de colesterol LDL es sustancialmente modificado por las concentraciones de colesterol HDL existentes, no obstante, actualmente se está investigando el beneficio de elevar los niveles de colesterol HDL. Niveles elevados de colesterol plasmático no solo son el responsable de los fenómenos aterogénicos, sino que además promueven el desarrollo de otras enfermedades, incluyendo ciertas formas de cáncer, diabetes y obesidad. 18.1.3.2. Fitosteroles totales. La Figura 30 nos muestra los resultados experimentales en la fracción TRL dentro del grupo de individuos sanos, de la biodisponibilidad de fitosteroles totales, calculados como suma de los esteroles mayoritarios encontrados: β-Sitosterol, Campesterol y Estigmasterol. Las cantidades iniciales oscilan entre 0,88 y 0,69 µg/mL de TRL. A lo largo del periodo postprandial podemos apreciar cómo la evolución de esta familia de compuestos en la fracción de las TRL es desigual si comparamos un aceite con otro, ya que entre las 0 y 6 horas la mayor concentración se encuentra cuando la dieta experimental ha sido elaborada con OR, existiendo un pico claramente diferenciado de presencia máxima a las 2 horas. Sobre las 4 horas postprandiales la biodisponibilidad de fitosteroles totales es muy similar tanto si la dieta ha sido elaborada con OL como si ha sido elaborada con OR. En el caso del aceite OL la evolución es levemente ascendiente Resultados y Discusión 117 postprandiales, los valores encontrados oscilan entre (0,60 y 1,37) µg/mL. Las diferencias, estadísticamente significativa, que hay entre las dos curvas concentración-tiempo, en dietas conteniendo OR y OL, a las 2 h postprandiales (P<0.05), no hallándose diferencias significativas para el resto de horas entre ambas curvas. 0 0,5 1 1,5 2 0 2 4 6 Tiempo (h) Sitostanetriol (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 32. Evolución concentración-tiempo del sitostanetriol de TRL de individuos sanos. Los valores representados son la media ± SEM (n=7-9). *P<0.05. Como ya se ha comentado anteriormente, en relación al sitostanetriol, los productos derivados de la oxidación tanto del colesterol como de los fitosteroles, han sido foco de atención debido a su presencia en las placas de ateromas del ser humano, jugando un papel muy importante dentro de los procesos aterogénios in vitro y en cierta medida también in vivo. Los compuestos oxidados que se encuentran en mayor cantidad en lesiones ateromatosas avanzadas son el 27-hidroxicolesterol, seguido del 7-cetocolesterol. El papel que juega éste último dentro del desarrollo aterosclerótico aún está por determinarse con exactitud (Lyons et al., 1999); su origen puede ser al parecer tanto endógeno, a través de procesos oxidativos del colesterol endógeno, o bien derivado de la absorción procedente de la ingesta (Nielsen et al., 1995). * Resultados y Discusión 118 18.1.3.3.2. 7-Cetocolesterol El 7-Cetocolesterol parece formarse fundamentalmente mediante procesos oxidativos no enzimáticos a partir del colesterol y concentrase en las células espumosas tanto en las placas de ateromas como en las plasmáticas. En nuestro estudio encontramos a las 4 horas postprandiales la máxima concentración de este compuesto (0,4 µg/mL), en los dos grupos. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 2 4 6 Tiempo (h) 7-Cetocolesterol (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 33. Evolución concentración-tiempo del 7-Cetocolesterol de TRL de individuos sanos. Los valores representados son la media ± SEM (n=7-9). Los efectos in vitro causados por este compuesto son una inhibición de la liberación del colesterol por las células, un descenso en la permeabilidad de la membrana celular a la glucosa, alteraciones en el flujo de membrana del ión Ca+, alteraciones de la barrera endotelial, disminución de la expresión de los receptores de LDL, inhibición de la liberación del NO, citoxicidad, e inducción de apoptosis celular (Lyons & Brown, 1999). En estudios con radioisótopos en ratas ha podido comprobarse cómo el 7-cetocolesterol es rápidamente captado por el hígado, hidrolizado y liberado en forma no esterificada, que Resultados y Discusión 119 presumiblemente sería excretado vía biliar hacia la luz intestinal (Lyons et al., 1999). 18.1.3.3.3. Epoxicolesterol Es uno más de los derivados oxidados del colesterol atribuyéndosele las mismas características y efectos aterogénicos que al resto de compuestos oxidativos derivados del colesterol. Tras analizar los datos obtenidos para el epoxicolesterol correspondientes al grupo de sanos podemos decir que la presencia de dicha sustancia en la fracción de las TRL es superior cuando lo empleado en la dieta ha sido el OR. La única diferencia estadísticamente significativa es a las 4 horas postprandiales con un valor de P<0,05. 0 0,05 0,1 0,15 0 2 4 6 Tiempo (h) Epoxicolesterol (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 34. Evolución concentración-tiempo del epoxicolesterol de TRL de individuos sanos. Los valores representados son la media ± SEM (n=7-9). *P<0.05. * Resultados y Discusión 120 En resumen, en el grupo de sanos estudiados hemos detectado y cuantificado los principales componentes menores del insaponificable presentes en TRL, durante un periodo postprandial de 6 h, tanto tras ingestas conteniendo OR como en las que contienen OL. Entre los compuestos cuantificados el escualeno presenta una biodisponibilidad mayor cuando el aceite ingerido es OL. Por tanto desde un posible punto de vista en relación a la salud, cabría obtener más ventajas con OL que con OR si buscamos los efectos terapéuticos de este compuesto. En relación al grupo de los fitosteroles totales parece haber una mejor y mayor biodisponibilidad cuando se ha utilizado aceite OR en las 4 primeras horas, posteriormente las diferencias son mínimas. Así pues, parece deducirse que el empleo de OR sería más ventajoso que el empleo del OL si lo que pretendemos es una mayor biodisponibilidad de fitosteroles totales. En cuanto al colesterol no se pueden deducir grandes diferencias tanto con uno u otro aceite, por lo que creemos que el uso de OR u OL es indiferente de cara a una reducción significativa del colesterol en TRL. En el grupo de los alcoholes totales resulta evidente la mayor biodisponibilidad de los mismos tras el uso de OR, por lo cual habría que explorar en futuros estudios este hecho para ser utilizado en la regulación de los niveles de colesterol. En último lugar podemos decir que los tres compuestos oxidados estudiados, sitostanetriol, 7-cetocolestrol y epoxicolestrol, muestran mayores valores en la fracción de las TRL cuando hemos utilizado en la dieta experimental OR; sin duda esto constituye un inconveniente desde el punto de vista sanitario, dado que como ya hemos apuntado en el trabajo, los compuestos oxidados del colesterol y de los fitosteroles juegan un papel aterogénico al parecer importante. Resultados y Discusión 121 En definitiva, si bien parece que el OR posee mayores ventajas frente al OL en el grupo de los alcoholes totales y fitosteroles totales en cuanto a la biodisponibilidad de los mimos y de cara a posibles efectos terapéuticos, se halla en desventaja frente al OL en cuanto a la mayor presencia de compuestos oxidados. Resultados y Discusión 122 18.2. Estudio de la evolución concentración-tiempo de los componentes menores del insaponificable de TRL de sujetos enfermos Alteraciones metabólico-lipídicas en enfermos El grupo de enfermos participantes en estos ensayos se caracterizan por presentar un cuadro clínico multisistémico, con varios órganos y funciones afectados entre ellas las que afectan al metabolismo lipídico. Ya vimos con detalle en la introducción las alteraciones y mecanismos fisiopatológicos implicados en los desórdenes metabólicolipídicos, que a modo de resumen podríamos estructurar en tres fases, una primera fase asintomática, una segunda fase de síntomas clínicos y una tercera fase de severos trastornos multiorgánicos y metabólicos. Según un estudio de Rivera et al., 2001, en una primera fase, y antes del comienzo de tratamiento alguno, es común encontrar una hipertrigliceridemia con concentraciones bajas de colesterol y colesterol HDL (hay que recordar que esta disminución del colesterol en las primeras fases es común a cualquier proceso infeccioso inflamatorio en los primeros estadios). La progresión hacia enfermedad sintomática en una segunda fase, lleva aparejada una mayor disminución del colesterol HDL, disminución del colesterol total, elevación de triglicéridos y acumulación de las subclases pequeñas y densas de las LDL. Los niveles de colesterol HDL son menores en pacientes con cuentas bajas de linfocitos CD4 (Zangerle et al., 1994). Todas estas anormalidades son una respuesta inespecífica a una infección con repercusión sistémica. La hipertrigliceridemia es atribuible a la disminución de la actividad de la lipasa lipoproteica, debido al acúmulo sanguíneo de sus inhibidores, sin embargo al estar la producción hepática de lipoproteínas muy baja, este hecho limita la gravedad de la hipertrigliceridemia. Los niveles bajos de colesterol HDL se explican por la menor actividad de la lipasa lipoproteica, enzima responsable de un porcentaje Resultados y Discusión 123 importante de la síntesis de las HDL. Además, si existen niveles altos de triglicéridos, la hipertrigliceridemia por sí misma es causa de colesterol HDL bajo. La introducción de las nuevas terapias antirretrovirales ha supuesto una significativa disminución en la morbimortalidad del padecimiento, sin embargo, sus efectos sobre el metabolismo de lipoproteínas, carbohidratos y tejido adiposo son causa frecuente de complicaciones cardiovasculares. La dislipemia de estos pacientes es multifactorial. El efecto final es una hipertrigliceridemia (moderada a severa, dependiendo del fármaco utilizado) con hipercolesterolemia moderada (<300 g/dL) que es reversible al suspenderse la administración de estos fármacos. A todo esto se suma una lipodistrofia o redistribución anómala de la grasa corporal; la grasa subcutánea en cara y extremidades inferiores disminuye y se deposita en sitios anormales (cuello, en la columna dorso cervical, grasa intrabdominal). Además de estas alteraciones los antirretrovirales son responsables de otras disfunciones como intolerancia a la glucosa con desarrollo de diabetes (la resistencia a la insulina causa alteraciones que favorecen la progresión de la aterosclerosis), acidosis láctica, hiperfibrinogemia, altas concentraciones de proteína C reactiva, apolipoproteína B, disminución de la vasodilatación arterial y aumento del grosor de la íntima de la arteria carótida. La consecuencia esperable de todo ello es la aceleración de los procesos aterogénicos. No obstante, los efectos de los inhibidores de la proteasa (IP) son distintos entre ellos dependiendo del fármaco utilizado; si bien los estudios realizados parecen demostrar la influencia de los IP sobre el metabolismo lípidico, la asociación entre los ITRN (inhibidores de la transcriptasa reversa de tipo nucleósido; habitualmente el tratamiento de los enfermos de VIH suele ser una mezcla de IP con ITRN) y la dislipemia es menos clara y en ausencia de lipodistrofia, ninguno de los ITRN parecen implicados en el desarrollo de dislipemia. Resultados y Discusión 124 Los factores identificados como predictores de dislipemia varían notablemente entre los estudios. Los más comunes son carga viral baja, CD4 altos, sujetos con recuperación nutricional, preexistencia de dislipemia, diabetes y lipodistrofia, esta última asociada positivamente con la duración de la infección por VIH, siendo otros factores asociados a la misma, la mayor edad, la raza blanca, la duración y severidad de la enfermedad, tiempo desde la reversión de la progresión clínica de la infección y cambios extremos de peso. Los mecanismos por los cuales los IP y los ITRN causan lipodistrofia se desconocen. El tratamiento de las alteraciones metabólicas incluye terapia nutricional, (los efectos inhibidores de los IP sobre la secreción de las lipoproteínas que contienen apolipoproteína B, Apo B, son revertidos por la acción del ácido oleico) ejercicio y la eliminación de otros factores de riesgo como tabaquismo o alcoholismo; si no se consigue la normalización del perfil de lípidos, se puede utilizar el tratamiento farmacológico. En cuanto al tratamiento de la lipodistrofia no existe ningún tratamiento eficaz. Resultados y Discusión 125 18.2.1. Escualeno Los resultados obtenidos para el escualeno en el grupo de enfermos indican que este compuesto también se encuentra en la fracción TRL de este grupo en estudio, con los dos aceites empleados, destacando la presencia ligeramente superior de dicho hidrocarburo cuando la dieta ha sido elaborada con OR (Figura 35). En este caso, como puede apreciarse en gráfico, la concentración del escualeno se dispara a partir de las 4 horas hasta alcanzar un pico máximo a las 6 horas postprandiales (2,86 µg/mL). Cuando el grupo de enfermos ingiere OL el pico máximo se alcanza a las 4h (1,27 µg/mL) postprandiales para ir descendiendo progresivamente hasta las 6 horas (0,64 µg/mL). 0 1 2 3 4 0 2 4 6 Tiempo (h) Escualeno (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 35. Evolución de la concentración-tiempo de escualeno. Los valores representados son la media ± SEM (n=9-11). 18.2.2. Alcoholes totales La presencia de los alcoholes totales en la fracción TRL en el grupo de enfermos viene representada en la Figura 36. Puede observarse que la mayor presencia de alcoholes totales en la fracción TRL se encuentra cuando la dieta ha sido elaborada con OR. En este caso la máxima concentración se produce a las 2 h postprandiales (6,06 µg/mL). El análisis Resultados y Discusión 126 estadístico de los resultados obtenidos muestra, en el caso de los enfermos, una diferencia muy significativa a las 0 horas (1,29-3,46 µg/mL) con un valor de P<0,05, significativa a las 2 y 4 horas para valores de P<0,05 en ambos casos, y una ausencia de diferencia significativa a las 6 horas postprandiales. 0 2 4 6 8 0 2 4 6 Tiempo (h) Alcoholes totales (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 36. Evolución de la concentración de alcoholes totales durante el periodo postprandial estudiado. Los valores representados son la media ± SEM (n=9-11). *P<0.05, **P<0.005. En ambas curvas se muestra un ascenso en la concentración de alcoholes totales hasta llegar a un máximo, en el caso de una ingesta conteniendo OR, a las 2 horas postprandiales, para ir disminuyendo hasta llegar a sus valores más bajo a las 6 horas. La curva de los que ingirieron OL es una curva que se inicia con valores más bajos que van aumentando hasta las 4 horas donde comienza un descenso paulatino hasta las 6 horas donde los valores se igualan. En ambos casos las curvas muestran a las 6 horas una concentración de alcoholes totales alta (2,3-2,5 µg/mL). Diversos estudios sugieren, como ya se ha mencionado, la utilidad de los alcoholes de cadena larga en la reducción de los niveles de colesterol, más en concreto la reducción de los niveles de LDL y aumento de los niveles de HDL. Por tanto, el enriquecimiento dietético con alcoholes de cadena larga podría ser también de utilidad a la hora de reducir el riesgo aterogénico en estos enfermos tratados con IP e * * ** Resultados y Discusión 133 18.2.3.3.3. Colest-5-en-24one Para este oxiesterol los resultados encontrados están comprendidos entre 0,27-0,20 µg/mL para ingestas conteniendo OL y entre 0,09 y 0,17 µg/mL cuando la ingesta contiene OR. Las diferencias encontradas son muy significativas a las 2 horas con P<0.0001. Ambas evoluciones discurren de forma paralela, siendo mayores para el OL, para al final de las 6 horas de estudio estos coinciden (0,20-0,17 µg/mL) como se observa en la Figura 42. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0246 Tiempo (h) Colest5en-24one (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 42. Evolución de la concentración de colest5-en-24 one durante el periodo postprandial estudiado. Los valores representados son la media ± SEM (n=9-11). *P<0.05, **P<0.0001. ** * Resultados y Discusión 134 18.2.3.3.4. Colest-7en-3ol Para esta compuesto de oxidación las dos curvas solo muestran una diferencia significativa para las 2 horas postprandiales. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 2 4 6 Tiempo (h) Colest-7en-3ol (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 43. Evolución de la concentración del coles-7en-3ol durante el periodo postprandial estudiado. Los valores representados son la media ± SEM (n=9-11). *P<0.05. En este caso, los datos recogidos (no está es inicial de los que ingirieron oliva) presentan valores muy similares entre las 4 y 6 horas postprandiales; en el caso del OR comienza con valores elevados para ir disminuyendo su concentración hasta las 6 horas. 18.2.3.3.5. Epoxicolesterol Los datos recogidos en la gráfica 44, muestran diferencias muy significativas para todos los valores obtenidos durante el periodo postprandial. * Resultados y Discusión 135 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 2 4 6 Tiempo (h) Epoxicolesterol (µg/mL) TRL Oliva Orujo Figura 44. Evolución de la concentración del epoxicolesterol durante el periodo postprandial estudiado. Los valores representados son la media ± SEM (n=9-11). *P<0.05, **P<0.0001, ***P=0.001, ****P=0.005. La curva que representa la cuantificación del compuesto cuando la dieta se ha elaborado con OR sube en pendiente suave desde las 0 horas hasta las 6 horas donde alcanza sus valores máximos (0,13 µg/mL). Cuando se analiza la representación gráfica de la cuantificación utilizando en la dieta experimental OL, vemos que se produce un ascenso importante en los valores entre las 2 y 4 horas, con un pico de máxima concentración (0,38 µg/mL) para ir luego disminuyendo lentamente hasta las 6 horas. Por tanto, los datos obtenidos para el grupo de enfermos nos permiten constatar que la presencia del epoxicolesterol es superior en la fracción de las TRL cuando la dieta ha sido elaborada a partir de OL. De esta sustancia puede decirse que al igual que todos los compuestos oxidativos aumenta el riesgo aterogénico en estos pacientes. ** * *** **** Resultados y Discusión 136 En resumen, en el grupo de enfermos estudiado, al igual que en el grupo de sanos visto con anterioridad, hemos detectado y cuantificado los principales componentes menores del insaponificable presentes en TRL, durante el periodo postprandial, tanto tras ingestas conteniendo OR como en las que contienen OL. Hemos observado que existe una manifiesta mayor biodisponibilidad del escualeno cuando la dieta ha sido elaborada a partir de OR. Sin duda alguna este hecho es relevante de cara a fines terapéuticos, no olvidemos los efectos benéficos del escualeno como reductor de factores proinflamatorios vasoconstrictores y cardioprotector. Debemos recordar que se ha informado sobre muerte súbita por infartos agudos en pacientes con VIH, debido a las complicaciones del metabolismo lipídico de estos enfermos tal y como ya hemos dicho a lo largo del trabajo. Los alcoholes totales muestran una mayor biodisponibilidad en la fracción TRL cuando se ha empleado OR. Como ya apuntamos más arriba cuando hacíamos referencia al grupo de sanos, los estudios experimentales parecen apuntar al efecto hipocolesterolémico de estas sustancias, por lo que también en este caso, parece más ventajoso de cara a estos enfermos el uso de OR. En cuanto al colesterol, los resultados son los que cabría esperar en estos enfermos, es decir, un incremento notable del mismo, siendo ligeramente superior cuando la dieta ha sido elaborada con OR, aunque la diferencia con los niveles cuando la dieta ha sido elaborada con OL no es importante, pero dada la problemática de alto riesgo de trastornos lipídicos en estos pacientes, cabe pensar que el uso de OL sería más aconsejable a la vista de los resultados expuestos. En el grupo de fitosteroles totales, podemos decir que existe una clara y mayor biodisponibilidad de estos compuestos cuando la dieta experimental ha sido elaborada con OL. Este hecho es relevante si pensamos que desde un punto de vista terapéutico es importante conseguir Resultados y Discusión 137 la reducción de los valores de colesterol que como ya hemos dicho a lo largo del trabajo se hallan elevados en estos enfermos. Por tanto, el empleo del OL con fines hipocolesterolémicos en estos pacientes parece que estaría más justificado que el empelo de OR. En cuanto al grupo de compuestos oxidados, 7-cetocolesterol, sitostanetriol y epoxicolesterol, puede decirse que la mayor biodisponibilidad y cuantificación para los dos primeros, aparece tras el uso de OR, mientras que para el epoxicolesterol la mayor concentración se encuentra tras el empleo de OL. También en el caso de los compuestos oxidativos parece que el empleo de OR es menos ventajoso que el de OL si tenemos en cuenta el efecto aterogénico de dichos compuestos, si además, como ya sabemos, la oxidación de los derivados de los fitosteroles es más fácil que la oxidación de los derivados del colesterol, y el sitostanetriol es un derivado oxidado de los fitosteroles, se confirmaría aún más las ventajas del OL. Si en el grupo de sanos, el uso de OR parecía reportar más beneficios que el OL, en el grupo de enfermos con VIH los datos obtenidos parecen indicar que las ventajas terapéuticas están más de parte del OL que del OR. Resultados y Discusión 138 18.3. Estudio comparativo de los componentes menores del insaponificables entre sujetos sanos y enfermos de TRL Se analizan a continuación las respuestas comparativas sanosenfermos ante la ingesta de dietas conteniendo OL y OR, cuantificando los diferentes componentes del insaponificable de las TRL y evaluando si se producen diferencias estadísticamente significativas en el periodo postprandial comprendido entre las 0 horas y 6 horas en ambas poblaciones. 18.3.1. Escualeno A. Escualeno-oliva La biodisponibilidad del escualeno en TRL se muestra en la Figura 45 donde puede verse que cuando la ingesta contiene OL los valores obtenidos son superiores en el grupo de enfermos en comparación con los sanos. En ambos casos, el pico de máxima cuantificación se produce a las 4 horas postprandiales (1,01-1,37 µg/mL para sanos y enfermos respectivamente). Las diferencias encontradas entre cada uno de los puntos de dicha gráfica no son significativas estadísticamente. Resultados y Discusión 139 0 0,5 1 1,5 2 0 2 4 6 Tiempo (h) Escualeno (µg/mL) TRL Oliva/Sanos Oliva/Enfermos Figura 45. Evolución de la concentración del escualeno durante el periodo postprandial estudiado comparando los grupos de sanos y enfermos cuando la dieta contiene aceite OL. Los valores representados son la media ± SEM. B. Escualeno-orujo En el caso de ingestas conteniendo aceite de orujo (Figura 46) la biodisponibilidad del escualeno la encontramos superior en el grupo de los enfermos en comparación con el grupo de sanos y las diferencias muestran ser significativas entre ambas curvas para 4 y 6 horas postprandiales P<0.05 y muy significativa para P<0.0001. Si comparamos ambas gráficas del escualeno, Figuras (45 y 46), la biodisponibilidad del escualeno, cuando se trata de sujetos sanos es superior utilizando OL, sin embargo, en el grupo de enfermos, la biodisponibilidad es mayor cuando lo empleado es el OR. Resultados y Discusión 140 0 1 2 3 4 0 2 4 6 Tiempo (h) Escualeno (µg/mL) TRL Orujo/Sanos Orujo/Enfermos Figura 46. Evolución de la concentración del escualeno durante el periodo postprandial estudiado comparando los grupos de sanos y enfermos cuando la dieta contiene aceite OR. Los valores representados son la media ± SEM. *P<0.05, **P<0.0001. De los resultados anteriores cabría suponer, y dadas las propiedades antioxidantes, cardioprotectoras e hipocolesterolémicas que posee el escualeno, que sería interesante desde un punto de vista terapéutico obtener unos niveles de presencia del escualeno que pudiera tener una acción terapéutica eficaz frente a las complicaciones aterogénicas de estos enfermos; según los resultados arriba expresados, y a manera de hipótesis de trabajo, una dieta elaborada con aceite de orujo o enriquecida con dicho aceite conllevaría una mayor biodisponibilidad de esta sustancia en los paciente de VIH. 18.3.2. Alcoholes totales A). Alcoholes totales-oliva La Figura 47 recoge la evolución de los alcoholes totales en ambos grupos de voluntarios, sanos y enfermos, cuando sus dietas son suplementadas con OL. Se puede observar cómo la presencia de alcoholes es superior en el grupo de enfermos 1,29-3,55 (µg/mL) TRL aun cuando al final del periodo postprandial estudiado obtenemos los mismos resultados. * ** Resultados y Discusión 141 0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 Tiempo (h) Alcoholes totales (µg/mL)TRL Oliva/Sanos Oliva/Enfermos Figura 47. Evolución de la concentración de alcoholes totales durante el periodo postprandial estudiado comparando los grupos de sanos y enfermos cuando la dieta contiene aceite OL. Los valores representados son la media ± SEM. B. Alcoholes totales-orujo Cuando la dieta experimental se ha realizado con OR la presencia de alcoholes en la fracción TRL es superior en el grupo de enfermos al de sanos, como se ve en la Figura 48. Los picos de máxima concentración durante el periodo postprandial están desplazados en ambas poblaciones. Así en el grupo de enfermos lo presenta después de 2 h mientras que es después de 4 h cuando la concentración es máxima en la población de sanos. Resultados y Discusión 142 0 2 4 6 8 0 2 4 6 Tiempo (h) Alcoholes totales (µg/mL) TRL Orujo/Sanos Orujo/Enfermos Figura 48. Evolución de la concentración de alcoholes totales durante el periodo postprandial estudiado comparando los grupos de sanos y enfermos cuando la dieta contiene aceite OR. Los valores representados son la media ± SEM. En la literatura consultada no hay nada que haga referencia a la influencia de los alcoholes sobre las alteraciones metabólicas de los enfermos de VIH. Tan solo se pone de relieve el papel que juega este tipo de compuestos inhibiendo ciertos mediadores en la cadena inflamatoria, y su papel como agentes hipocolesterolémicos. 18.3.3. Esteroles 18.3.3.1. Colesterol A. Colesterol-oliva Se muestran diferencias muy significativas para las curvas del colesterol-oliva entre sanos y enfermos (figura 49).