Identificación y caracterización de elementos regulatorios distales controlados por TGFβ

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ELEMENTOS REGULATORIOS DISTALES CONTROLADOS POR TGFβ Memoria presentada por: Jose Antonio Guerrero Martínez Tesis doctoral realizada en el Departamento de Genética, Universidad de Sevilla, y en el Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla. Director: Jose Carlos Reyes Rosa Tutora: Rosa María Luna Varo Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Dr. Jose Carlos Reyes Rosa, Investigador Científico del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y miembro del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), CERTIFICA: Que el trabajo titulado “Identificación y caracterización de elementos regulatorios distales controlados por TGFβ” presentado por Don Jose Antonio Guerrero Martínez, para optar al Grado de Doctor en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación clínica por la Universidad de Sevilla, ha sido realizado bajo su supervisión en el Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa y reúne, a su juicio, originalidad y contenidos suficientes para que sea defendido ante el tribunal correspondiente. Y, para que conste a los efectos oportunos, expido y firmo el presente certificado en Sevilla, a noviembre de 2020 Fdo. Dr. Jose Carlos Reyes Rosa Fdo. Dra. Rosa María Luna Varo Director Tutora Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 A mi madre Estrella, a mi padre Jose y a mis hermanos Javi y Carlos, por su amor y apoyo incondicional. A mi amigo, mentor, director y padre científico, Jose Carlos. “Los fenómenos derivan su existencia y naturaleza de una dependencia mutua y no son nada en sí mismos” Arya Nagarjuna Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ÍNDICES Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE TABLAS ÍNDICE DE FIGURAS RESUMEN ABREVIATURAS ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL ........................................ 1 1. ANTECEDENTES ................................................................................................. 1 1.1. De genotipo a genoma .................................................................................. 1 1.2. De epigénesis a epigenética ........................................................................ 4 2. MOTIVACIÓN ..................................................................................................... 11 3. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................ 13 INTRODUCCÓN ......................................................................................................... 14 1. CROMATINA Y TRANSCRIPCIÓN. .................................................................... 14 1.1. Cromatina y transcripción: Aspectos generales. ..................................... 14 1.2. Configuración lineal de la cromatina. ........................................................ 15 1.2.1. Histonas ................................................................................................ 15 1.2.1.1. Acetilación ...................................................................................... 16 1.2.1.2. Metilación ....................................................................................... 17 1.2.1.3. Fosforilación .................................................................................. 18 1.2.1.4. Variantes de histonas .................................................................... 18 1.2.2. ADN ....................................................................................................... 19 1.2.2.1. Promotores ..................................................................................... 19 1.2.2.1.1. Propiedades de los promotores ............................................. 19 1.2.2.1.2. Tipos de promotores ............................................................... 20 1.2.2.1.3. Mecanismo de iniciación de la transcripción en los promotores .............................................................................................. 21 1.2.2.2. Enhancers ...................................................................................... 22 1.2.2.2.1. Propiedades de los enhancers ............................................... 23 1.2.2.2.2. Tipos de enhancers ................................................................. 25 1.2.2.2.3. Mecanismos de comunicación entre enhancer y promotor . 26 1.2.2.2.4. Mecanismos de regulación de la transcripción del promotor por los enhancers ................................................................................... 27 1.2.2.2.5. Modelo unificado de los elementos regulatorios .................. 28 1.2.2.3. Insulators ........................................................................................ 29 1.2.2.4. Silencers ......................................................................................... 29 1.2.3. Accesibilidad de la cromatina ............................................................. 30 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ÍNDICE DE FIGURAS Figura R1. Esquema experimental de las condiciones de cultivo y tratamientos empleados en esta tesis doctoral………………………………………………………..92 Figura R2. Correlación entre los datos de ATAC-seq……………………………..…93 Figura R3. Cambio en la señal de ATAC-seq en distintas regiones del genoma………………………………………………………………………………………..94 Figura R4. Comparación de los datos de ATAC-seq y DNAsaI-seq tras 2 horas de tratamiento con TGFβ…………………………………………..………………………….95 Figura R5. Análisis de la apertura de la cromatina utilizando TANGO para el procesamiento de las imágenes tridimensionales de ATAC-see obtenidas por microscopía confocal………………………………………………………………………97 Figura R6. Cinética de la accesibilidad de la cromatina determinada por ATAC- see…………………………………………………………………………………………..…99 Figura R7. Implicación de las rutas de transducción de la señalización por TGFβ en la apertura de la cromatina…………………………………………………….…….100 Figura R8. Análisis de la apertura de la cromatina en otras líneas celular.........101 Figura R9. Análisis de la apertura de la cromatina en distintas condiciones de cultivo………………………………………………………………………………………..102 Figura R10. Clasificación de los enhancers identificados por ATAC-seq en función de su incremento de accesibilidad…………………………………………..104 Figura R11. Enriquecimiento de footprints en las distintas categorías de enhancers clasificados según su incremento de accesibilidad………….……….106 Figura R12. Enriquecimiento diferencial de footprints en las distintas categorías de enhancers clasificados según su incremento de accesibilidad………………107 Figura R13. Relación entre la ocupación de Smad2/3 y AP-1 y el incremento de accesibilidad de enhancers……………………………………………………………...109 Figura R14. Dinámica de las marcas de histonas en los enhancers clasificados según su cambio de actividad por TGFβ………………………………………...……112 Figura R15. Relación entre los niveles de actividad de enhancers y los niveles de expresión de eRNAs………………………………………………………………………115 Figura R16. Relación entre el cambio de activación de los enhancers dependiente de TGFβ y el incremento de accesibilidad……………………...…….116 Figura R17. Estudio de la apertura generalizada de la cromatina provocada por TGFβ a largos tiempos de tratamiento y tras el lavado de TGFβ…………………118 Figura R18. Estudio de la apertura generalizada de los enhancers 72 horas tras un tratamiento durante 2 horas con TGFβ…………………………………………….120 Figura R19. Análisis de los factores de transcripción implicados en la regulación de la actividad de los enhancers por TGFβ………………………………………...…122 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Figura R20. Clasificación de los genes en distintas categorías dependiendo de su expresión diferencial tras el tratamiento con TGFβ……………………………..125 Figura 21. Estudio de la regulación de la expresión génica en el entorno de enhancers regulados por TGFβ……………………………………………...………….127 Figura 22. Estudio de la continuidad del efecto regulatorio de los enhancers regulados por TGFβ……………………………………………………………...………..130 Figura R23. Identificación de clusters de genes corregulados por TGFβ…...….131 Figura R24. Análisis de la corregulación de genes en el entorno de genes regulados de forma robusta por TGFβ………………………………………...………133 Figura R25. Análisis de la corregulación de la expresión intergénica en el entorno de genes regulados por TGFβ…………………………………………..……134 Figura R26. Análisis de la regulación de las marcas de histonas en el entorno de genes regulados por TGFβ………………………………………………………...…….136 Figura R27. Meta-análisis de los TRDs……………………………………………...…137 Figura R28. Caracterización de los genes regulados por TGFβ en TRDs y fuera de TRDs……………………………………………………………………........................139 Figura R29. Caracterización de los promotores de los genes regulados por TGFβ en TRDs y fuera de TRDs…………………………………………………………………140 Figura R30. La inactivación de los enhancers mediada por CRISPRi demuestra la actividad promiscua de los enhancers sobre los genes adyacentes……………142 Figura R31. Controles de la inactivación de los enhancers mediada por CRISPRi……………………………………………………………………………………...143 Figura R32. Validación por ChIP-qPCR de las dianas de los sgRNAs y la actividad represora de dCas9-KRAB…………………………………………………..145 Figura R33. Análisis de interacciones en TRDs y comparación con TADs………………………………………………………………………………………….146 Figura R34. Análisis de corregulación en TADs………………………………..……148 Figura R35. Estudio del papel de los bordes de TADs en la corregulación génica……………………………………………………………………………………......149 Figura R36. Estudio del papel de los bordes de TADs en la regulación enhancergen……………………...…………………………………………………………………….150 Figura R37. Análisis de la ocupación de CTCF en los bordes de TADs y TRDs……………………………………………………..…………………………………..151 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESUMEN Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESUMEN En este trabajo se ha realizado un análisis exhaustivo de los enhancers en células normales de epitelio de glándula mamaria de ratón (NMuMG) para entender, de forma más detallada, cómo los enhancers dependientes de TGFβ controlan la transcripción génica en células epiteliales. El tratamiento con TGFβ desencadena un incremento rápido y generalizado de la accesibilidad de la cromatina en el 80% de los enhancers, independientemente de si van a ser activados, reprimidos o no regulados por TGFβ. Esta apertura de los enhancers depende tanto de la ruta canónica como no canónica de la señalización por TGFβ. Los análisis de footprinting genómico sugieren que los factores de transcripción de la familia AP-1 y SMAD desempeñan un papel principal en este proceso. Por otro lado, la mayoría de los genes regulados por TGFβ se localizan alrededor de los enhancers regulados en el mismo sentido, creando a menudo dominios de varios genes corregulados que denominamos dominios regulatorios de TGFβ o TRDs (por sus siglas en inglés). La inactivación de enhancers dentro de TRDs mediada por CRISPR afectó a la regulación dependiente de TGFβ de todos los genes corregulados, demostrando que la actividad de los enhancers es mucho más promiscua que lo previamente anticipado. En particular, el área de influencia de los TRDs está restringida por los bordes de TADs, causando un sesgo hacia la corregulación dentro de los TADs. To better understand how TGFβ-dependent enhancers control gene transcription in epithelial cells, we performed a comprehensive analysis of enhancers in normal mammary epithelial gland (NMuMG) cells. TGFβ treatment triggers a fast and widespread increase in chromatin accessibility in about 80% of enhancers, irrespective of whether they are activated, repressed or not regulated by TGFβ. This enhancer opening depends on both the canonical and non-canonical TGFβ pathways. Genomic footprinting analyses suggest that the SMAD and AP-1 transcription factors are important players in this process. On the other hand, most TGFβ-regulated genes are located around enhancers regulated in the same way, often creating domains of several coregulated genes that we term TGFβ regulatory domains (TRD). CRISPR-mediated inactivation of enhancers within TRDs impairs TGFβ-dependent regulation of all coregulated genes, demonstrating that enhancer targeting is more promiscuous than previously anticipated. Notably, the area of TRD influence is restricted by TAD borders, causing a bias toward co-regulation within TADs. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ABREVIATURAS Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucléico ARN Ácido ribonucléico ARNm ARN mensajero ATAC Ensayo para cromatina accesible por transposasa (del inglés, Assay for Transposase-Accessible Chromatin) ChIP Inmunoprecipitación de cromatina (del inglés, Chromatin Immunoprecipitation) ChromRNA ARN de la fracción cromatínica (del inglés, Chromatin-RNA) CPM Cuentas por millón (del inglés, Counts Per Million) CRISPRi CRISPR de interferencia (del inglés, CRISPR interference) EMT Transición de epitelio a mesénquima (del inglés, Epithelial to Mesenchymal Transition) eRNA ARN del enhancer (del inglés, enhancer RNA) FBS Suero fetal bovino (del inglés, Fetal Bovine Serum) FC veces de cambio (del inglés, Fold-Change) GTFs Factores de transcripción generales (del inglés, General Transcription Factors) IDR Tasa de descubrimiento irreproducible (del inglés, Irreproducible Discovery Rate) kb kilobase LDTF Factores de transcripción dependientes de linaje (del inglés, Lineage-Driven Transcription Factors) NDR Región deplecionada de nucleosomas (del inglés, Nuclesome- Depleted Region) NGS Secuenciación de próxima generación (del inglés, Next- Generation Sequencing) pb par de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés, Polymerase Chain Reaction) PIC Complejo de preiniciación (del inglés, Preinitiation Complex) Pol II ARN polimerasa II sgRNA ARN guía (del inglés, single-guide RNA) SDTFs Factores de transcripción dependientes de señales (del inglés, Signal-Driven Transcription Factors) SMAD del inglés, Mothers Against Decantaplegic homolog Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 4 lectura u ORFs (por sus siglas en inglés Open Read Frame), anotando finalmente aquellas que fueran auténticas secuencias codificantes o CDS (por sus siglas Coding Sequence). Así, en sólo un siglo se pasó de tener una noción abstracta de genotipo como la base hereditaria que especificaría el conjunto de características de un organismo (o fenotipo) a tener los mapas genómicos de los principales organismos de estudio, conociendo la estructura química de los genes y de sus productos. Con esto, la genómica revirtió la visión que se tenía a principio de siglo, siendo necesario formular la siguiente pregunta: ¿Puede ser deducido el fenotipo de un organismo a partir del conocimiento de la secuencia de su genoma y de los genes que lo componen? 1.2. De epigénesis a epigenética Así comienza esta segunda historia: el nacimiento de la epigenética. Si el nacimiento de la genética molecular y, posteriormente, la genómica estuvo ligado principalmente a bioquímicos cuyo objetivo era identificar las entidades físicas que establecían las bases de la herencia; la epigenética debe su origen a fisiólogos y embriólogos (posteriormente a biólogos evolutivos y del desarrollo) que intentaban responder a una pregunta que se remonta hasta la antigua Grecia: ¿cómo puede un sólo huevo fertilizado (zigoto) dar lugar a un organismo complejo con células de distintas características? En el siglo XVII había dos escuelas enfrentadas: el preformacionismo que establecía que cada célula contenía elementos preformados que se hacían más grandes durante el desarrollo, es decir, las partes de un organismo adulto ya estaban preformadas en el embrión; y la epigénesis que pensaba que existía un proceso que involucraría reacciones químicas entre componentes solubles que llevarían a cabo un plan de desarrollo complejo, es decir, el desarrollo sería un proceso en el que se iría incrementando gradualmente la complejidad a partir de un material homogéneo inicialmente en el huevo o zigoto. El principal defensor de esta segunda escuela sería William Harvey, estableciéndose así el adjetivo epigenético (para referirse a epigénesis) antes que el sustantivo epigenética (Deichmann, 2016; Felsenfeld, 2014). Tras el descubrimiento de la existencia de los cromosomas por Walter Flemming (Flemming, 1879) y varios trabajos posteriores, Thomas Hunt Morgan demostró que la información que dirige el programa del desarrollo se encontraba en los cromosomas, a partir de sus trabajos en el cromosoma X de Drosophila (Morgan, 1911). Más tarde, un discípulo de Morgan desarrollaría mapas cromosómicos lineares que permitía asignar Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 5 genes individuales a sitios concretos en los cromosomas de Drosophila (Sturtevant, 1913). Otro discípulo de Morgan, Hermann Joseph Muller, describió unas mutaciones inducidas por rayos X en Drosophila que denominó everspoting displacements denominadas así ya que eran translocaciones cromosómicas (displacements) que producían un alto grado de cambio fenotípico (everspoting). Estas mutaciones producían moscas con ojos moteados, sin embargo, y en palabras de Muller “incluso cuando todas las partes de la cromatina parecen estar presentes en la dosis adecuada (aunque organizada de manera diferente) el resultado fenotípico no fue siempre el normal”. Más tarde se descubriría que estos fenotipos variegados se originaban al producirse reordenamientos que colocaban al gen que producía el color blanco de los ojos junto a regiones heterocromáticas (Hannah, 1951). Esta observación del fenotipo variegado permitió la identificación de numerosos factores cromatínicos y epigenéticos. Durante estos años se concluyó que los genes no eran entidades completamente independientes y su función podría estar afectada por su localización dentro de los cromosomas, demostrado por los experimentos llevados a cabo en mutantes de Drosophila que daba lugar a fenotipos variegados o no variegados dependiendo de si la translocación ocurría en zonas de heterocromatina o eucromatina, respectivamente, y los trabajos desarrollados con elementos transponibles en plantas (McClintock, 1965). Aunque la morfología de los cromosomas indicaba que todas las células somáticas poseían todos los cromosomas, no era obvio pensar que todas las células somáticas retuvieran toda la información genética presente en el huevo fertilizado. Gracias a los experimentos llevados a cabo por Avery, McLoad y McCarty, y Hershey y Chase (HERSHEY & CHASE, 1952; McCarty & Avery, 1946) se demostró que la molécula de ADN (y no las proteínas que también formaban parte de la cromatina) era la responsable de contener la información genética. Más tarde, experimentos llevados a cabo en ranas demostraron que la introducción de un núcleo de una célula somática en un oocito anucleado podría dar lugar al desarrollo de un embrión (Briggs & King, 1952; Laskey & Gurdon, 1970), demostrando así que el ADN es el mismo en todas las células somáticas de un organismo. Sin embargo, cada vez existía más evidencia de la existencia de una especialización en el repertorio de expresión de las diferentes células somáticas que debía ser mediado por señales, y no por mutaciones o deleciones del ADN germinal. Referido a esto, Conrad Waddington introdujo por primera vez en 1942 el término epigenética, siendo definido como el conjunto de procesos del desarrollo que subyace entre el genotipo y el fenotipo (Waddington, 1942). Más tarde, Naney propuso un modelo en el que existían dos sistemas de control en la célula: una “librería de especificidades” Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 6 que correspondería con un mecanismo de replicación de un molde basado en las secuencias de ADN (el sistema genético) y “mecanismos auxiliares” que estarían implicados en determinar cuál de las especificidades serían expresadas en una célula (sistema epigenético) (Nanney, 1958), actualizándose el término acuñado por Waddington. Así, la epigenética empezaría a emparentarse con los mecanismos de la regulación de la expresión de los genes. Aunque este modelo presentado por Naney se estableció inicialmente para microorganismos, pronto la regulación de la expresión genética empezaría a tener un papel central para explicar los procesos del desarrollo en los organismos superiores. A partir de la década de 1960 se establecería un estrecho vínculo entre la regulación de la expresión y las modificaciones químicas de la cromatina, en particular las modificaciones de las histonas y la metilación del ADN. Estas dos líneas de investigación se desarrollaron paralelamente durante las siguientes décadas hasta originar, a partir de la década de 1990, lo que hoy conocemos como epigenética (Deichmann, 2016). Respecto a la metilación del ADN como marca epigenética, tras la observación de que la inactivación del cromosoma X en ratón debía ser mediada por un mecanismo epigenético que no implicara una reorganización genómica (Lyon, 1961), Riggs (Riggs, 1975) y Holliday y Pugh (Holliday & Pugh, 1975) propusieron que la metilación del ADN podría ser el mecanismo epigenético implicado en este proceso. Ya se había demostrado en los años anteriores que la diana principal de metilación del ADN en eucariotas eran las secuencias CpG (Doskočil & Šorm, 1962), lo cual fue empleado para realizar ensayos con enzimas de restricción sensibles a metilación para detectar el estado de metilación del ADN en estas secuencias y establecer el mecanismo de transmisión de los patrones de metilación (A. P. Bird, 1978). Unos años más tarde se demostraría la relación entre la metilación del ADN y la represión de la expresión génica (Naveh-Many & Cedar, 1981). En este periodo se habían hecho grandes avances con respecto a la identificación de las secuencias de ADN susceptibles a metilación, las maquinarías encargadas del proceso, su papel en la represión, así como la transmisión postmitótica de dichas modificaciones y su función en el desarrollo embrionario de mamíferos. En cuanto a las modificaciones de histonas, desde hacía varios años ya había indicios de que las proteínas de la cromatina (especialmente las histonas) debían tener un papel en la modificación de las propiedades del ADN. En 1950, el matrimonio Stedman propuso que las histonas podrían actuar como represores generales de las expresión génica (Stedman & Stedman, 1950). Según su hipótesis, diferentes tipos celulares en Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 7 un organismo, deberían tener diferentes histonas para generar las diferencias en los fenotipos. Más tarde, Vincent Allfrey y Alfred Mirsky confirmaron esta hipótesis del efecto inhibitorio de las histonas sobre la expresión génica, y mostraron que la acetilación y la metilación de las histonas reducía esta inhibición (Allfrey & Mirsky, 1964). Mirsky sería el principal proponente del efecto inhibitorio de las histonas en la transcripción como forma de regulación génica. Por otro lado, su discípulo Erik Davidson consideraría que las histonas eran responsables de una inhibición inespecífica de la expresión, siendo el principal mecanismo de regulación génica una activación selectiva de los genes (Britten & Davidson, 1969). Si el estado natural de la cromatina es un estado de activación o inhibición inespecífica por histonas y, por tanto, los mecanismos de regulación consisten en una inhibición por histonas o una activación específica es un debate que aún no se ha resuelto. Durante los años siguientes, se observó que la cromatina de las células eucariotas, al contrario que las células procariotas, no tenían grandes extensiones de cromatina abierta, y que sólo una parte del ADN empaquetado en la cromatina era accesible por ensayos enzimáticos (Cedar & Felsenfeld, 1973; Clark & Felsenfeld, 1971), empezando a tomar relevancia los promotores y otros sitios de regulación específicos. En 1974 se produjo uno de los grandes hitos del campo de la cromatina: el ADN es empaquetado en nucleosomas, la subunidad fundamental de la cromatina formado por 150 pares de bases de ADN enrollado en torno a un núcleo proteico formado por 8 histonas (Kornberg & Thomas, 1974). Gracias a la determinación de la estructura cristalina de los nucleosomas se identificó que los extremos amino-terminales de éstas se encontraban en la periferia del octámero, siendo accesibles a modificaciones químicas (Luger et al., 1997; Richmond et al., 1984), demostrándose más tarde la relación entre la modificación de estos extremos amino-terminales y la regulación de la expresión génica (Durrin et al., 1991; Wallis et al., 1980). Gracias a las técnicas de secuenciación y búsqueda de homología por alineamiento de secuencias (comentadas anteriormente), se descubrió la homología entre una acetiltransferasa de histonas de Tetrhymena y un regulador transcripcional de levaduras denominado Gcn5 (Brownell et al., 1996), y entre una deacetilasa de mamíferos y el represor transcripcional de levadura Rdpd3, demostrándose definitivamente la conexión entre la acetilación de histonas y el control de la expresión génica (Taunton et al., 1996). A partir de este momento se descubrirían muchas modificaciones postraduccionales de histonas relacionadas con la regulación de la expresión génica y con otros eventos de la cromatina (como la señalización por daño en el ADN). A estos modificadores de histonas se les denominó escritores (del inglés writers) y borradores (del inglés erasers) Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 8 epigenéticos en función de si añadían o eliminaban grupos químicos de los extremos amino-terminales de las histonas. Más tarde también se descubrirían los lectores epigenéticos (del inglés readers) que consisten en proteínas con dominios de unión a modificaciones específicas de histonas, afectando a la estructura y estado funcional de la cromatina y, en algunos casos, establecerían un mecanismo de propagación de la marca a grandes regiones de la cromatina. Ejemplo de esto es la proteína de la heterocromatina HP1 (Bannister et al., 2001) la cuál es capaz de reconocer la metilación de la lisina 9 de la histona 3, uniéndose a ésta y reclutando a SUV39H1, responsable de la metilación de dicha lisina, propagándose así un estado de cromatina silenciada que abarcaría una gran región. Años más tarde se observaría un fenómeno parecido con otro complejo implicado en la formación de heterocromatina: el complejo Polycomb o PRC2 (por sus siglas en inglés Polycomb Repressive Complex 2) (Margueron & Reinberg, 2011). Al mismo tiempo que empezaban a identificarse los primeros modificadores de histonas, aparecería otro grupo de enzimas: los remodeladores de la cromatina. En este sentido se observó que una proteína quimérica formada por la región de unión a ADN de la proteína GAL4 y el activador transcripcional VP16 (GAL4-VP16) era capaz de unirse a ADN y activar la transcripción in vitro. Este proceso era dependiente de ATP e implicaba el reposicionamiento de nucleosomas (Pazin et al., 1994), sugiriendo que este reposicionamiento dirigido de nucleosomas dependiente de ATP era un evento crítico para establecer la accesibilidad de los promotores y la posterior activación transcripcional. Esto sería demostrado más tarde gracias al descubrimiento y caracterización de los complejos remodeladores de nucleosomas dependientes de ATP tales como SWI/SNF y NURF (Peterson & Herskowitz, 1992; Tsukiyama & Wu, 1995). Tras estos descubrimientos se empezaría a implantar la idea de que tanto las modificaciones de histonas como la remodelación de los nucleosomas estarían implicados en la preparación del molde de cromatina para la transcripción. Así, los determinantes de la actividad específica de un gen durante el desarrollo serían factores regulatorios capaces de reconocer y unirse a secuencias específicas del ADN en promotores y otros sitios de control. Estos factores regulatorios serían proteínas con dominios de unión a una secuencia específica de ADN y con otros dominios que reclutarían a cofactores (como modificadores de histonas y remodeladores de nucleosomas) afectando así, directa o indirectamente, a la transcripción. La primera prueba de la importancia de estos factores se estableció a finales de la década de 1980, con la demostración de que la sobreexpresión del factor de transcripción MyoD en Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 9 fibroblastos (y otros tipos celulares) inducía su conversión a mioblastos (Davis et al., 1987). Ya en el siglo XXI se observó cómo con sólo la introducción en fibroblastos de cuatro factores de transcripción (que serían conocidos como los factores de Yamanaka) podía establecerse un estado pluripotencial inducido estable (Takahashi & Yamanaka, 2006). En los últimos años, además de los promotores, otras regiones reguladoras del ADN han empezado a tener gran relevancia en el estudio de la regulación génica: los enhancers. El primer enhancer fue descubierto en el genoma del virus SV40. Éste consistía en una pequeña secuencia de 72 pares de bases capaz de aumentar la expresión de un gen independientemente de su posición u orientación con respecto al sitio de inicio de la transcripción del gen (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981). Poco después se descubrió el primer enhancer en un genoma eucariota (Banerji et al., 1983; Gillies et al., 1983; Mercola et al., 1983). Estas secuencias de ADN, semejantes a los promotores, actuarían como plataformas de unión de múltiples factores de transcripción adquiriendo un papel central en los campos de la biología evolutiva y en desarrollo. Los primeros estudios de la función de los enhancers vendrían de la mano de la genética de Drosophila. Ha sido en los últimos años y gracias a la secuenciación de los genomas y las técnicas de secuenciación masiva lo que ha permitido el descubrimiento y caracterización de los enhancers, así como su papel en dirigir los patrones de expresión característicos de cada tipo celular (Long et al., 2016). En resumen, ha sido un siglo de grandes descubrimientos que permitieron dejar atrás la idea de que las diferencias entre los distintos tipos celulares de un organismo estaban originadas por alteraciones en el material genético, y permitieron establecer que estas diferencias eran consecuencia de los diferentes programas de expresión genética de cada tipo celular, que a su vez estaban mediados por la unión de factores de transcripción a regiones específicas del ADN (como promotores y enhancers) determinando así la activación o represión de los genes. La relación causa-efecto entre la activación/represión de los genes y las marcas epigenéticas (como la metilación y las modificaciones de histonas) y otras características de la cromatina (como su estructura y topología) es a día de hoy un debate abierto. El concepto de epigenética también ha evolucionado mucho durante estos años, teniendo a día de hoy un significado distinto para distintos investigadores. Así, para algunos autores la “herencia epigenética” implica una transmisión a la descendencia a través de la línea germinal, aunque a día de hoy se ha visto que la mayor parte de las marcas epigenéticas son “borradas” durante el proceso de fecundación. Para otros Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 10 investigadores la epigenética consiste en el estudio de los cambios en la función de los genes que no puede ser explicada por cambios en la secuencias de ADN y que son heredables a través de la mitosis o meiosis (FINCHAM, 1997). Adrian Bird estableció el concepto de epigenética como la adaptación estructural de las regiones cromosómicas con el fin de registrar, señalizar o perpetuar estados alterados de actividad (A. Bird, 2007). Sin embargo para Gary Felsenfeld (Felsenfeld, 2014) algunas de estas definiciones no distinguen entre situaciones en las que las modificaciones son transmitidas a través de la división celular, ayudando a mantener un patrón de expresión determinado, y otros casos en los que las modificaciones son simplemente una parte del aparato transcripcional. La visión general de esta tesis doctoral está acorde con la visión de la inmunóloga molecular Ellen Rothenberg que sostiene que los factores de transcripción específicos de secuencia son los actores principales en dirigir los cambios en el panorama epigenético (como marcas de histonas, compactación de la cromatina, la formación de lazos estructurales entre distintas regiones del genoma, etcétera), cómo parte del mecanismo mediante el cual estos factores controlan la expresión génica. Así, estos factores de transcripción son críticos a la hora de establecer la posición de las marcas de histonas y, conforme avanza el desarrollo, en determinar dónde deben cambiar los patrones de marcas de histonas. En sus propias palabras: “Los posicionamientos de las marcas de histonas son el resultado de los eventos de diferenciación previos y se asientan en el cruce de caminos entre el pasado regulatorio y el futuro regulatorio. Gracias a su capacidad de afectar a la accesibilidad del ADN, estos factores crean una resistencia inercial al cambio. Pero cuándo el ensamblaje de los factores de transcripción pasa un umbral para provocar la diferenciación, éstos pueden modificar la distribución de marcas de histonas reorganizando el panorama epigenético” (Deichmann, 2016). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 11 2. MOTIVACIÓN Gracias a todo este avance en el conocimiento, hoy el estudio de la cromatina y la transcripción ha empezado a desempeñar un papel importante para entender el mecanismo de diferentes procesos fisiopatológicos, como la diferenciación celular o la respuesta celular a señales, desde una nueva perspectiva. Esto, a su vez, se ha visto influenciado gracias al desarrollo de las ómicas. Tras la secuenciación de los genomas de los principales organismos de estudio, el abaratamiento en los costes y tiempos en la secuenciación gracias a las nuevas tecnologías NGS y los rápidos avances en la ciencia de la computación, en general, y de la bioinformática en particular, ha permitido la aparición de numerosas técnicas que podrían agruparse dentro del concepto de genómica funcional. Este nuevo campo permite el estudio de los aspectos dinámicos y funcionales de los genomas desde una perspectiva global. Así se han desarrollado técnicas para estudiar el perfil completo de transcripción (RNA-seq y todas sus variantes), los sitios de unión de factores de transcripción al genoma, así como la localización de modificaciones de histonas (ChIP-seq); y características intrínsecas de los genomas que afectan a su función como la metilación del ADN (methyl-seq), la accesibilidad de la cromatina (DNAsaI-seq y ATAC-seq) y la organización espacial de ésta (4C, 5C y Hi-C). Éste desarrollo tecnológico ha permitido también que las regiones regulatorias del ADN, como los enhancers, empiecen a tener una gran relevancia en el estudio del funcionamiento de los genomas, en especial en procesos de desarrollo y enfermedad, dónde estos elementos tienen un papel muy importante al actuar como regiones reguladoras dinámicas responsables de los patrones espaciotemporales de la expresión génica. Este interés queda claramente reflejado en el desarrollo del proyecto ENCODE (por sus siglas en inglés The Encyclopedia of DNA Elements). Este proyecto titánico, lanzado originalmente en 2003 y que se ha desarrollado hasta ahora en 3 fases, tiene como uno de sus principales objetivos la anotación de los elementos de los genomas (inicialmente humano, expandiéndose más tarde a otros organismos modelo). La fase 3 de este proyecto, recientemente publicada (Snyder et al., 2020), ha permitido la identificación de 0.9 millones de regiones regulatorias en cis (como enhancers) en humano y 0.3 millones en ratón, gracias a la integración de diversas técnicas (como ChIP-seq y ATAC-seq) en numerosas líneas celulares y tejidos. Por otro lado, el equipo liderado por el Dr. Jose Carlos Reyes tiene una amplia trayectoria en el estudio de la cromatina, tanto en plantas (José C. Reyes et al., 2002, 2004), cómo en mamíferos (Ceballos-Chávez et al., 2012; Muchardt et al., 1998; J. C. 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El actual interés en el estudio de la cromatina y la transcripción, en particular de los elementos regulatorios como los enhancers, para entender los procesos celulares tales como la señalización mediada por TGFβ, junto con el desarrollo de las nuevas técnicas que permiten dicho estudio y con la experiencia del grupo dirigido por el Dr. Jose Carlos Reyes en ambos campos (cromatina y señalización) suponen los argumentos que justifican la elaboración de esta tesis doctoral. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 ANTECEDENTES, MOTIVACIÓN Y OBJETIVO GENERAL 13 3. OBJETIVO GENERAL Así, el objetivo de esta tesis doctoral consistirá en la identificación y caracterización de las regiones regulatorias distales implicadas en la respuesta temprana a TGFβ en un modelo de transición de epitelio a mesénquima. Una vez establecido el contexto histórico-científico en el que se desarrolla esta tesis doctoral, la justificación de su elaboración, así como el objetivo general de la misma, se introducirán los distintos elementos que suponen el marco teórico de ésta. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 17 1.2.1.2. Metilación La metilación de histonas se da principalmente en residuos de lisina y arginina, siendo la metilación de las primeras las modificaciones más estudiadas. Al contrario que la acetilación, la metilación de los residuos de las histonas no afectan a la carga eléctrica de ésta, pero si tienen consecuencias funcionales en cuanto a la transcripción. Su efecto en este proceso es muy variable según el residuo que se modifica, el grado y patrón de metilación (un mismo residuo puede estar mono, di y trimetilado en residuos de lisinas) y el contexto genómico dónde ocurra la metilación (Jambhekar et al., 2019). Las marcas de metilación más comunes ocurren en lisinas y se pueden clasificar en aquellas relacionadas con la activación de los genes y las que están relacionadas con su represión. Así, entre las primeras encontramos la H3K4me1 (una marca exclusiva de enhancers) (Heintzman et al., 2007), la H3K4me3 (marca típica de promotores que también puede encontrarse en enhancers con actividad transcripcional) (Barski et al., 2007; Henriques et al., 2018), y H3K36me3 y H3K79me3 que se encuentran principalmente en el cuerpo de genes activos transcripcionalmente. Entre las marcas relacionadas con represión encontramos la H3K27me3 y la H3K9me3 (Z. Wang et al., 2008). El complejo PRC2 (por sus siglas en inglés Polycomb Repressor Complex 2) es el encargado de la dimetilación y trimetilación del residuo H3K27, una marca de represión que puede ser revertida con facilidad, por lo que desempeña un papel importante durante el desarrollo (Margueron & Reinberg, 2011). Por su parte, H3K9me3 es una marca característica de heterocromatina mientras que H3K9me2 suele encontrarse en genes silenciados o con baja tasa de transcripción en regiones de eucromatina (Rice et al., 2003). Al contrario de las HATs, que suelen tener una función más genérica, las metiltransferasas de histonas tienen una actividad más específica. Así, la familia de proteínas SET1/MLL son las encargadas de la metilación de H3K4 asociada a activación transcripcional. SUV39H1/2 están asociadas a la creación de la marca de heterocromatina H3K9me3, G9a y GLP regulan la H3K9me1/2 en eucromatina, mientras que las metiltransferasas EZH1 y EZH2 (que forman parte del complejo PRC2) regulan la H3K27me3. La actividad demetilasa de histonas también es específica, siendo las familias KDM1 (formada por LSD1/2) y JmJC (formada por 19 miembros, que se agrupan en 6 grupos diferentes según el sustrato de demetilación) los principales representantes. En cuanto a los dominios proteicos encargados del reconocimiento específico de metilación de histonas destacan los dominios PHD, chromo, tudor, PWWP, WD40, BAH, ADD, repeticiones de anquirina, MBT y zn-CW. Entre los readers de esta marca podemos destacar a CBX7 (del complejo PRC2), HP1α (proteína de la Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 18 heterocromatina) y DNMT3A que es una metiltransferasa de ADN, estableciendo así una relación entre la metilación de histonas y la metilación del ADN (Hyun et al., 2017). 1.2.1.3. Fosforilación La fosforilación de histonas se da en residuos de serina y treonina y ocurre principalmente, aunque no de forma exclusiva, en los extremos amino-terminales (Rossetto et al., 2012). Al igual que la acetilación, ésta modificación también se ha relacionado con la activación transcripcional, en especial en promotores de genes de proliferación, de respuesta a EGF (por sus siglas en inglés, Epidermal Growth Factor) y de respuesta inmediata como c-FOS, c-JUN y MYC. Las marcas de fosforilación más estudiadas en transcripción son H3S32ph, H3S28ph y H3S10ph (Chadee et al., 1999; Choi et al., 2005; Lau et al., 2011). La fosforilación de estos residuos enlaza directamente la regulación de la transcripción con la señalización celular, ya que pueden actuar como diana de las quinasas que intervienen en estos procesos (Thomson et al., 1999). Además, se ha observado una asociación entre la fosforilación de las histonas y su acetilación (Chadee et al., 1999). Las quinasas de histonas que más se han estudiado son MSK1 y MSK2, mientras que entre las fosfatasas destaca MKP1. La familia de proteínas 14-3-3 son los readers de la fosforilación de histonas más conocidos hasta ahora en relación con la regulación de la transcripción (Sawicka & Seiser, 2014) 1.2.1.4. Variantes de histonas Además de las modificaciones postraduccionales, la sustitución de las denominadas histonas canónicas (H2A, H2B, H3 y H4) por variantes de histonas afecta a la estabilidad del nucleosoma y, por tanto, tiene también un papel en la regulación transcripcional. Entre estas variantes de histonas destaca la H2A.Z, que es reemplazada del promotor antes del reclutamiento de la pol II, favoreciendo la accesibilidad y la activación transcripcional (Hardy et al., 2009); la H2A.B y macroH2A que se han relacionado con la activación y la represión transcripcional, respectivamente (Weber & Henikoff, 2014), y la H3.3 cuya incorporación está relacionada con mayor accesibilidad de la cromatina, estando presente, al igual que la variante de histonas H2A.Z, en promotores y enhancers (L. Shi et al., 2017). Estas variantes de histonas también pueden ser reconocidas por readers específicos, siendo incorporadas o expulsadas de los nucleosomas por remodeladores de la cromatina. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 19 1.2.2. ADN Los principales elementos de la secuencia de ADN implicados en la regulación de la transcripción de los genes son: los promotores, los enhancers, los insulators y los silencers. 1.2.2.1. Promotores Los promotores son secuencias regulatorias que se localizan en el inicio de los genes y que pueden dirigir de forma autónoma altos niveles de transcripción productiva. En general, los promotores se pueden dividir en dos regiones: promotor basal y promotor proximal. El promotor basal consiste en una secuencia corta de unos 50 pares de bases entorno al sitio de inicio de la transcripción (TSS) y que es suficiente para el ensamblaje del PIC y el inicio de la transcripción (Kadonaga, 2012). El promotor proximal (también denominado enhancer proximal debido a que carece de la capacidad de reclutar al PIC) son las secuencias adyacentes al promotor basal que comprenden unos 250 pares de bases desde el TSS y que contienen secuencias activadoras que favorecen la transcripción, actuando como sitio de unión para factores de transcripción específicos (Arnold et al., 2017). 1.2.2.1.1. Propiedades de los promotores Los promotores contienen motivos específicos que permiten el reclutamiento de la Pol II y GTFs y el ensamblaje del PIC. Entre estos motivos destaca la caja TATA que se localiza a unas 30 pb aguas arriba del TSS, el motivo INR (o Initiator) que solapa con el TSS y el motivo DPE (por sus siglas en inglés Downstream Promoter Element) que se localiza aguas abajo del TSS. Estos motivos no son excluyentes, pudiendo encontrarse en el mismo promotor basal y, en general, actúan como sitios de unión para distintas subunidades de TFIID. Otra característica de la secuencia de los promotores es su composición de nucleótidos, ya que muchos promotores contienen islas CpG en su interior, con una alta frecuencia de dinucleótidos CpG (Haberle & Stark, 2018). Los promotores también tienen características cromatínicas particulares. Aunque la mayor parte del ADN genómico tiene una accesibilidad limitada debido a la compactación en torno al octámero de histonas, los promotores activos se encuentran en regiones accesibles que favorecen el ensamblaje del PIC y el inicio de la transcripción. Estas regiones son denominadas regiones deplecionadas de nucleosomas o NDRs (por sus siglas en inglés Nuclesome-Depleted Regions) (C. Jiang Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 20 & Pugh, 2009). A pesar de su nombre, estas regiones por lo general no están deplecionadas de nucleosomas, si no que están constituidas por nucleosomas que contienen variantes de histonas como H2A.Z o H3.3. Estas variantes de histonas confieren un alto dinamismo a los nucleosomas que los contienen, favoreciendo la accesibilidad del ADN (C. Jin et al., 2009). Sin embargo, como veremos más adelante, aún no está claro la relación causal entre la apertura de la cromatina y la transcripción. Por un lado, se sabe que hay factores de transcripción, denominados factores de transcripción pioneros, capaces de unirse a secuencias de ADN en la cromatina cerrada y reclutar a remodeladores de cromatina para facilitar la accesibilidad y el ensamblaje del PIC, activando así al promotor (Fuda et al., 2015). Por otro lado, también se ha visto que es necesario unos niveles bajos de transcripción para mantener un estado accesible de la cromatina y favorecer la unión de factores de transcripción (Gilchrist et al., 2010). Otra característica de la cromatina asociada a regiones promotoras es la presencia de modificaciones postraduccionales de histonas en los nucleosomas que flanquean al promotor activo, como H3K4me3 y H3K27ac (Barski et al., 2007). Se piensa que la marca H3K4me3 es un mecanismo de “memoria” de actividad transcripcional reciente, favoreciendo nuevos ciclos de transcripción (Ng et al., 2003). Por otro lado, la marca H3K27ac podría estar relacionada con la transcripción gracias a que, cómo vimos anteriormente, la acetilación de las histonas disminuye la afinidad de la interacción ADN- histonas, favoreciendo la accesibilidad; o mediante la unión específica de cofactores, que actuarían como readers de estas marcas, como BRD4 (Dey et al., 2003). Además, en muchos promotores ocurre lo que se denomina como transcripción bidireccional o transcripción divergente, dónde la transcripción de los genes está acoplada con la transcripción de ARN cortos no codificantes denominados PROMPTS (por sus siglas en inglés Promoter Upstream Transcripts) o uaRNAs (por sus siglas en inglés Upstream Antisense RNAs) (Andersson, Chen, et al., 2015). Aunque algunos de estos transcritos pueden estabilizarse y dar lugar a ARN largos no codificantes (Sigova et al., 2013), la mayoría son inestables y degradados por el complejo exosoma (Lloret- Llinares et al., 2016). 1.2.2.1.2. Tipos de promotores Podemos distinguir distintos tipos de promotores basales de acuerdo al número y distribución de TSSs, la composición de la secuencia, el tipo de motivos, la configuración de la cromatina y la función de los genes que regulan (Lenhard et al., 2012). Así, encontramos tres tipos: Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 21 Promotores asociados a genes específicos de tejido o de células diferenciadas: contienen un único TSS bien definido en el promotor basal que, además, incluye los motivos de la caja TATA e INR. Presentan una región libre de nucleosomas poco definida con nucleosomas mal posicionados y marcados por H3K4me3 y H3K27ac. Promotores asociados a genes constitutivos: contienen múltiples TSSs distribuidos a lo largo de todo el promotor basal e incluyen islas CpG. Presentan una región libre de nucleosomas bien definida con nucleosomas bien posicionados en la región flanqueante al promotor basal marcados por H3K4me3 y H3K27ac. Promotores asociados a factores de transcripción implicados en desarrollo: Son muy similares a los promotores de los genes constitutivos, pero durante el desarrollo pueden estar marcados con las marcas H3K4me3 y H3K27me3, denominándose promotores bivalentes. Esto permite a estos promotores estar “preparados” para una activación rápida durante el desarrollo, y para un silenciamiento posterior tras la diferenciación. Además, contienen islas CpG mayores que las que se encuentran en los promotores de la categoría anterior, o con múltiples islas CpG, y suelen estar rodeados de otros elementos regulatorios como enhancers. 1.2.2.1.3. Mecanismo de iniciación de la transcripción en los promotores Ensamblaje del PIC: En primer lugar, se produce el reconocimiento del promotor basal y el reclutamiento de los GTFs y la pol II. El factor TFIID reconoce y se une al promotor basal. Este es uno de los pasos más importantes del ensamblaje del PIC, pudiendo ser regulado por factores de transcripción específicos que pueden unirse al promotor proximal y favorecer el reclutamiento de TFIID (Louder et al., 2016). Además, este factor reconoce y se une a la marca H3K4me3, permitiendo una comunicación entre el ensamblaje del PIC y la cromatina (Vermeulen et al., 2007). Tras esto, se produce la unión de TFIIA y TFIIB que favorecen el reclutamiento del complejo pol II-TFIIF y, posteriormente, de TFIIE y TFIIH (Thomas & Chiang, 2006). Iniciación de la transcripción y parada próxima del promotor: Tras el ensamblaje del PIC, comienza la iniciación de la transcripción con la desnaturalización del dúplex de ADN y la formación de un PIC abierto, permitiendo el “escape del promotor”, dónde la pol II es liberada del promotor basal y de los GTFs y Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 22 transcribe a partir del TSS los primeros nucleótidos del transcrito (unos 30-50 bp) antes de pararse. Este fenómeno se denomina parada próxima del promotor (Guenther et al., 2007). Liberación de la parada próxima del promotor y elongación: La liberación de esta parada implica la fosforilación de varios componentes del complejo de elongación como NELF (por sus siglas en inglés Negative Elongation Factor), DSIF (por sus siglas en inglés DRB-sensitive inducing factor) y la subunidad mayor de la propia pol II. El responsable de esta fosforilación es la quinasa dependiente de ciclina 9 o CDK9 (por sus siglas en inglés), la cual es una subunidad del complejo P-TEFb (por sus siglas en inglés Positive Transcription Elongation Factor b) (Henriques et al., 2013). Algunos genes, especialmente los genes de respuesta a estrés y desarrollo, son regulados mayoritariamente a nivel de la liberación de la parada próxima al promotor, lo que permite una rápida activación de la transcripción; mientras que otros son regulados a nivel del ensamblaje del PIC e iniciación de la transcripción, aunque un gran número de genes presentan ambos mecanismos en distinta proporción. Aunque los promotores contienen la información necesaria para que la maquinaria de transcripción seleccione el TSS, el nivel de transcripción puede ser modulado mediante la integración de otras señales. Así, los factores de transcripción específicos de secuencia permiten el reclutamiento de coactivadores (como CBP-P300, SAGA o Mediator) influyendo en el reclutamiento de la maquinaria de transcripción, la iniciación o la elongación. La unión de estos factores de transcripción al ADN puede ocurrir en elementos regulatorios próximos al promotor basal (región conocida como promotor proximal) o distantes a éste. Éstas regiones son conocidas como enhancers. 1.2.2.2. Enhancers Los enhancers son secuencias de ADN de unas 200-500 pb que contienen múltiples sitios de unión para factores de transcripción específicos de secuencia y que son capaces de activar o incrementar el nivel de transcripción de promotores basales distantes independientemente de su distancia y orientación respecto a éstos. Estos elementos son capaces de integrar múltiples señales a través de la unión específica de factores de transcripción dependientes de linaje y dependientes de señales, siendo responsables de un control preciso de los patrones espaciotemporales de la expresión génica (Shlyueva et al., 2014). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 23 Así, tradicionalmente se han considerado enhancers aquellas secuencias genómicas que cumplen con los siguientes criterios (Kim & Shiekhattar, 2015): 1. Incrementan la transcripción de un gen ligado a partir de su TSS. 2. Su actividad es independiente de la orientación relativa con respecto a su gen diana. 3. Pueden funcionar independientemente de su posición relativa con respecto a los genes dianas, encontrándose a veces a grandes distancias (hasta 1 Mb). 4. Pueden funcionar con promotores heterólogos. 5. Presentan hipersensibilidad a DNasaI, lo que refleja una cromatina menos compacta como resultado de la unión de múltiples factores de transcripción. 1.2.2.2.1. Propiedades de los enhancers Con respecto a su secuencia genómica, los enhancers contienen múltiples sitios de unión a factores de transcripción de distinta naturaleza. Además, se ha observado que los enhancers contienen un contenido en CG bajo en comparación con los promotores, estando enriquecidos en dinucleótidos TA. Esto afecta directamente a los factores de transcripción que se unen a ambos elementos regulatorios, existiendo una tendencia de unión de factores de transcripción cuyos sitios de unión presentan un contenido mayor en TA en enhancers (como factores de transcripción de la familia AP1 y NFY1), y con un contenido mayor en CG en promotores (como CREB) (Nguyen et al., 2016). También se ha observado la presencia de secuencias degeneradas de motivos típicos de promotores basales, tales como la caja TATA e INR (Core et al., 2014). Al igual que los promotores, los enhancers también están asociados a NDRs que contienen baja densidad de nucleosomas o nucleosomas con variantes de histonas dinámicas como H2A.Z y H3.3 (C. Jin et al., 2009). Además, los nucleosomas que flanquean la NDR de los enhancers suelen presentar modificaciones postraduccionales específicas. Entre estas modificaciones destaca la marca de activación transcripcional H3K27ac (que comparten con los promotores) y un enriquecimiento de la mono o dimetilación de la H3K4 (H3K4me1/2) frente a la trimetilación. Los promotores, por el contrario, estarían enriquecidos por la marca H3K4me3 frente a la mono o dimetilación, siendo utilizado este ratio H3K4me3/H3K4me1 para distinguir promotores y enhancers (Heintzman et al., 2007). Sin embargo, algunos estudios establecen que esta distinción estaría asociada a una diferente actividad transcripcional más que a una diferencia estructural entre enhancers y promotores, existiendo una correlación entre el ratio H3K4me3/H3K4me1 y el nivel de transcripción, independientemente de la estabilidad Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 24 del transcrito (Core et al., 2014). También se ha observado la marca de represión mediada por Polycomb, H3K27me3, en un subtipo de enhancers denominados enhancers poised (Rada-Iglesias et al., 2011). Se ha descrito también la presencia de H3K79me2/3 en enhancers dónde ocurre transcripción (Djebali et al., 2012). Los enhancers reclutan pol II y a menudo presentan una transcripción bidireccional no productiva que da lugar a los denominados eRNAs (por sus siglas en inglés enhancer- RNAs). Estos eRNAs se caracterizan por ser ARNs pequeños ( < 200 bp), carentes de procesamiento como poliadenilación o splicing y de baja estabilidad, siendo degradados, al igual que los PROMPTs o uaRNAs, por el complejo exosoma (Kim & Shiekhattar, 2015). Sin embargo, también se han encontrado eRNAs que son transcritos unidireccionalmente, estables y que sufren procesamiento como splicing o poliadenilación, aunque no es lo común (de Santa et al., 2010). Los eRNAs suelen ser específicos de tipo celular e inducibles por señalización, siendo la transcripción de estos posterior a la activación del enhancer, es decir, ocurre tras el reclutamiento de activadores transcripcionales (Andersson, Gebhard, et al., 2014; Kim et al., 2010). También se ha observado que, en situaciones de activación transcripcional dependientes de estímulo, la transcripción de los eRNAs ocurre antes que la expresión del ARNm del gen ligado (de Santa et al., 2010). Mientras que el modelo de la iniciación fortuita en enhancers establece que la transcripción de eRNAs es únicamente el producto secundario e inevitable de la acumulación de activadores transcripcionales y maquinaria de transcripción en estos elementos regulatorios, otros autores sostienen que bien la transcripción de los eRNAs o los eRNAs en sí podrían tener un papel funcional (Haberle & Stark, 2018). Por un lado, se ha observado que la transcripción de los eRNAs es importante para mantener un estado de cromatina abierta, haciendo ésta accesible para la unión de factores de transcripción y cofactores, por otro lado, los eRNAs pueden contribuir a la estabilización de los lazos enhancer-promotor e interaccionar con reguladores transcripcionales como CBP o BRD4 (Sartorelli & Lauberth, 2020). Estas propiedades de los enhancers han sido utilizadas durante los últimos años para su identificación dentro del genoma. Así, debido a que los enhancers contienen múltiples sitios de unión a factores de transcripción, se ha utilizado la búsqueda in sílico de dichos motivos para localizar enhancers, así como el mapeo de factores de transcripción, coactivadores (como CBP y P300) que son reclutados por estos factores y la pol II, mediante ChIP-seq o técnicas similares. Gracias a que, al igual que los promotores, los enhancers se encuentran en NDRs también se han utilizado para su detección técnicas de determinación de la accesibilidad de la cromatina, como DNAsaI-seq y ATAC-seq. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 25 Otra técnica muy utilizada, junto con la determinación de la accesibilidad de la cromatina, ha sido el mapeo de modificaciones postraduccionales de histonas mediante ChIP-seq. Ya que muchos enhancers pueden interaccionar físicamente con los promotores, se han desarrollado otras técnicas para la identificación de estos elementos como ChIP-seq de proteínas que intervienen en la interacción enhancer-promotor, como Mediator o Cohesina, técnicas de conformación de cromatina para la determinación de regiones que interactúan con los promotores (como Hi-C, 5C y ChIA-PET utilizando el anticuerpo de pol II) y la búsqueda de ARN nacientes o TSSs intergénicos mediante un amplio abanico de técnicas entre las que destaca GRO-seq, PRO-seq y CAGE (Shlyueva et al., 2014). Para la validación de la actividad de los enhancers se han utilizado las técnicas in vivo basadas en CRISPR (CRISPRi/CRISPRa) y los ensayos denominados MPRA (por sus siglas en inglés Massively Parallel Reporter Assay). En esta tesis doctoral se utilizará principalmente la determinación de la accesibilidad de la cromatina y el mapeo de modificaciones postraduccionales de histonas para la identificación de enhancers. 1.2.2.2.2. Tipos de enhancers Los enhancers pueden clasificarse de acuerdo a su estado de activación y la presencia de modificaciones postraduccionales específicas de histonas (Shlyueva et al., 2014): Enhancers activos: presentan factores de transcripción unidos a una NDR bien definida y están marcados en los nucleosomas adyacentes por las marcas H3K4me1 y H3K27ac. Enhancers primed: son enhancers que no están activos aún pero que están preparados para la activación en un momento posterior del desarrollo o en respuesta a algún estímulo. Presentan la marca H3K4me1. Enhancers poised: identificados principalmente en desarrollo, son enhancers que están marcados por H3K4me1 y la marca de represión por Polycomb H3K27me3. Enhancers latentes o latents: son enhancers que se encuentran en regiones de cromatina cerrada y no están marcados por ninguna modificación de histonas. Sin embargo, pueden ser activados por algún estímulo volviéndose accesibles y adquiriendo las marcas típicas de enhancers activos. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 26 1.2.2.2.3. Mecanismos de comunicación entre enhancer y promotor Los promotores activos suelen encontrarse en la proximidad espacial de los enhancers y el establecimiento de los contactos entre promotores y enhancers está relacionado con la organización tridimensional de la cromatina. La activación del promotor puede ocurrir a través del establecimiento de contactos con un enhancer activo, o mediante el reclutamiento de factores de transcripción a una interacción ya preformada entre un enhancer y el promotor (Haberle & Stark, 2018). Este segundo mecanismo se ha observado en genes del desarrollo dónde ocurre la parada próxima del promotor, indicando que estos genes están preparados para una activación rápida de la transcripción (Ghavi-Helm et al., 2014). Tradicionalmente se han propuesto 4 mecanismos para el establecimiento de los contactos entre el enhancer y el promotor (Furlong & Levine, 2018): -Tracking: según este modelo, la pol II unida a un enhancer aguas arriba de un gen podría desplazarse a lo largo del ADN hasta alcanzar al promotor y empezar a sintetizar el ARNm. Una manifestación de este proceso son los ARN largos no codificantes transcritos a partir de un enhancer en dirección hacia su promotor diana. También se ha propuesto un modelo que combina el modelo de tracking y looping en el cual la pol II reclutada a un enhancer a través de la unión de factores de transcripción, avanzaría hacia el promotor llevando consigo al enhancer, estableciendo así un lazo de cromatina. Este modelo se denomina facilitated tracking (Q. Li et al., 2006). -Linking: la comunicación entre el promotor y el enhancer se establecería, según este modelo, a través de la formación de un oligómero proteína-proteína que actuaría de puente proteico entre ambos. Es decir, proteínas unidas al enhancer reclutarían a otras proteínas hasta, finalmente, contactar con el promotor a través de un puente de proteínas. -Looping: este modelo propone que los factores unidos a dos sitios distintos interaccionarían entre ellos resultando en la extrusión del ADN que los une, formándose así un lazo o “loop”. A diferencia de los dos modelos anteriores, el ADN que une a enhancer y promotor tendría un papel pasivo. Debido a que la unión de los factores de transcripción es muy dinámica, la formación de estos lazos también lo serían. Actualmente este es el mecanismo de comunicación entre enhancer y promotor más aceptado. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 33 dentro del núcleo, sino que, además, existía un número elevado de contactos distales entre las regiones del mismo tipo. Se utilizó el nombre de compartimentos A para designar a las regiones de cromatina activa y compartimentos B para la inactiva, los cuales corresponden con eucromatina y heterocromatina respectivamente (Lieberman- Aiden et al., 2009). Además, estudios posteriores demostraron la existencia de subcompartimentos que presentaban un mayor número de interacciones entre ellos y que correspondían con combinaciones de marcas epigenéticas específicas (Rao et al., 2014). Estos subcompartimentos correlacionan con regiones nucleares concretas identificadas por microscopía como las motas nucleares o nuclear speckles para los compartimentos A, o dominios asociados a laminina (LADs, por sus siglas en inglés) y dominios asociados al nucléolo (NADs, por sus siglas en inglés) para los compartimentos B. Además, en estos compartimentos también puede distinguirse entre los subcompartimentos formados por heterocromatina facultativa marcada con H3K27me3 y unida a Polycomb y heterocromatina constitutiva marcada con H3K9me3 y unida a HP1 (Rao et al., 2014). Esto indica que las regiones de cromatina formada por proteínas del mismo tipo tienden a interaccionar entre sí. El hecho de que las regiones asociadas a marcas epigenéticas y unidas a proteínas específicas presenten una misma localización nuclear e interaccionen más entre sí que con regiones asociadas a otras marcas, ha permitido plantear que la formación de estos compartimentos ocurra mediante separación de fases. Esto consiste en una separación de dos sustancias en una mezcla basada en sus características físicas. Por ejemplo, esto podría ocurrir mediante una separación de fases líquido-líquido o LLPS (por sus siglas en inglés). Se han encontrado múltiples evidencias de que las marcas epigenéticas y las proteínas asociadas a heterocromatina pueden formar gotas in vitro, en el seno de una disolución acuosa. Las proteínas asociadas a eucromatina como el coactivador BRD4, Mediator, el CTD de la pol II y múltiples factores de transcripción, presentan regiones intrínsecamente desordenadas o IDR (por sus siglas en inglés) que también se han asociado a procesos de separación de fases (Hildebrand & Dekker, 2020). Se ha observado que estos compartimentos pueden cambiar de un estado a otro durante la diferenciación (Dixon et al., 2015), indicando que su formación puede estar relacionada con la regulación de la transcripción, más que ser dominios exclusivamente estructurales. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 34 1.3.3. Dominios topológicos Además de los compartimentos A y B que suelen tener de media unas 3-5 Mb, gracias a los experimentos de Hi-C con una mayor resolución se identificaron otras estructuras de unos cientos de kilobases de tamaño, denominadas dominios topológicos o TADs (por sus siglas en inglés Topologically Associating Domains). Estos dominios se definieron a partir de una interacción preferencial entre regiones dentro de estos dominios y una depleción relativa de interacciones (unas dos veces menos) entre regiones situadas en distintos TADs (Dixon et al., 2012). Inicialmente se observó que la partición del genoma en TADs consecutivos correlacionaba con características genómicas como modificaciones de histonas, asociación del ADN a lamina nuclear y sincronización de la replicación. También se observó que los límites de los TADs están enriquecidos en la proteína de unión a insulator CTCF (aproximadamente el 76% de los límites) y en menor grado en marcas de transcripción activa, transcritos nacientes, genes de expresión constitutiva y elementos repetidos (Dixon et al., 2012). Los TADs están conservados entre tipos celulares e incluso entre especies (Rao et al., 2014). Pueden subdividirse en estructuras más pequeñas denominadas subTADs, dominios de contacto, o barrios aislados o insulated neighbourhoods, aunque la forma en que estos dominios son identificados y clasificados depende del método usado para identificarlos o de la resolución de los experimentos de Hi-C (Bonev & Cavalli, 2016). El mecanismo de formación de los TADs también difiere mucho del de los compartimentos. El modelo actual para explicar su formación se conoce como extrusión de lazo e implica la carga del complejo Cohesina que forma un anillo alrededor de la cromatina y que avanza de forma activa recorriendo la fibra de cromatina y formando un lazo hasta alcanzar una barrera que bloquea su actividad. La principal barrera en la formación de los TADs son las proteínas CTCF. En apoyo de este modelo se ha observado que en los límites de los TADs se encuentran motivos convergentes de CTCF, los cuales actuarían como tope en la formación de los TADs (Rowley & Corces, 2018). Así, los límites de los TADs imponen un aislamiento espacial que juega un papel esencial en el control de la expresión génica a través de facilitar los contactos enhancerpromotor dentro de los dominios al mismo tiempo que inhibe la comunicación, a través de dichos límites, con otros elementos regulatorios fuera del TAD. Sin embargo, también se han detectado interacciones entre promotores y elementos regulatorios separados por un borde de TAD (Javierre et al., 2016). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 35 1.3.4. Lazos de cromatina En el genoma ocurren, además, múltiples contactos de largo alcance que no están clasificados en las categorías anteriores como los lazos estructurales, los lazos de genes, los lazos mediados por Polycomb y los lazos enhancer-promotor. Estas estructuras pueden observarse en experimentos de Hi-C de mayor resolución que la utilizada en la identificación de los TADs y, al contrario que éstos, no destacan por contener un mayor número de contactos dentro del dominio con respecto al exterior (Bonev & Cavalli, 2016). Los lazos estructurales son dependientes de Cohesina y CTCF y se ha encontrado que los bordes de estos lazos suelen estar constituidos por promotores de genes expresados diferencialmente (Rao et al., 2014). También se han encontrado los conocidos como lazos génicos que consisten en un lazo formado entre el promotor y el terminador de un gen, lo cual puede estabilizar la transcripción y direccionalidad de la síntesis de ARN (Dowen et al., 2014). Otros contactos de interés son los lazos mediados por Polycomb, los cuales favorecen el contacto entre genes reprimidos o entre genes reprimidos y enhancers poised (Schoenfelder et al., 2015). De todas estas estructuras, la más relevante para esta tesis doctoral son los lazos enhancer-promotor. Cómo se explicó en el apartado de enhancers, para que se produzca la regulación transcripcional mediada por éstos es necesario que se establezca una comunicación entre enhancer y promotor que ocurre, principalmente, mediante la formación de un lazo entre estas regiones, favoreciendo su proximidad espacial. Estos lazos pueden formarse a través del mecanismo de extrusión de lazo, como ocurre en TADs y lazos estructurales. Sin embargo, se ha observado que la mayor parte de genes activos y enhancers no se encuentran en los bordes de dichos lazos y no tienen sitios de unión a CTCF, indicando que los contactos enhancer-promotor son mucho más dinámicos que los lazos mediados por CTCF y deben establecerse por otro tipo de mecanismo (Rao et al., 2014). Para ello se ha propuesto que las proteínas de unión a enhancer y promotores, como Mediator e YY1, podrían tener un papel en el establecimiento de dichos contactos. También se ha observado la participación de algunos ARNs no codificantes en dicho proceso (Schoenfelder & Fraser, 2019). Por otro lado, cómo también se comentó en el apartado de enhancers, los contactos entre enhancer-promotor pueden estar preformados o establecerse de novo durante la diferenciación o en respuesta a algún estímulo (Rubin et al., 2017). En este sentido, puesto que el contacto enhancer-promotor no determina la activación de la transcripción, durante una respuesta rápida a un estímulo externo no es necesario que ocurra una reorganización global de los contactos. Esto implica que la habilidad para responder a Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 36 estímulos externos está, en parte, predeterminada por la arquitectura tridimensional, permitiendo una respuesta celular rápida y precisa (Comoglio et al., 2018). Sin embargo, durante la especificación de linaje sí suele ocurrir una remodelación de las interacciones enhancer-promotor aunque, en algunos casos, esta remodelación también esté sujeta a una topología preformada de la cromatina que sea permisiva. En resumen, la activación de la transcripción mediada por enhancers está sujeta a diversas capas de regulación que están interconectadas entre sí y que permiten una ejecución robusta y fiable de los programas de expresión específicos de tipo celular. La base sobre la cual se colocan las siguientes capas de regulación consiste en la naturaleza intrínseca de la cromatina determinada por la propia secuencia del ADN, que determina los motivos de unión a factores de transcripción y la distribución de éstos en el genoma. Sobre esta base, la primera capa de regulación serían el repertorio de factores de transcripción capaces de unirse a los elementos regulatorios, los modificadores de histonas y los remodeladores de cromatina, cuya acción combinada genera un entorno regulatorio característico, creando regiones de cromatina accesible o permisiva y la presencia de marcas específicas que sirven como sitios de unión para proteínas efectoras. La segunda capa de regulación consiste en la configuración tridimensional de la cromatina que favorece y limita la posibilidad de encuentro entre distintas regiones de ésta. En este sentido, los compartimentos favorecerían el contacto entre regiones de cromatina del mismo tipo principalmente dentro del mismo cromosoma, aunque en algunos casos puede ocurrir entre cromosomas distintos, y los TADs que incrementarían las interacciones entre regiones dentro de ellos, al mismo tiempo que limitan las interacciones con regiones del exterior. Finalmente tenemos una tercera capa que consistiría en las proteínas unidas a enhancers y promotores que favorecen la interacción entre ambos y estabilizan dichas interacciones. Este modelo propuesto por Schoenfelder y Fraser (Schoenfelder & Fraser, 2019) se denomina selección-facilitación-especificación, dónde la selección consistiría en la determinación de la accesibilidad y marcas epigenéticas de los elementos regulatorios, la facilitación en el incremento de contactos entre regiones lejanas que es favorecido por la estructura tridimensional preformada de la cromatina, y la especificación sería la estabilización de interacciones entre enhancer-promotor. Un tipo celular determinado mantendría este entorno regulatorio en un estado estacionario. Sin embargo, este estado puede verse afectado por la señalización por estímulos externos lo cual alteraría varios de los componentes de las distintas capas de regulación, dentro de unas posibilidades predeterminadas. Esta alteración de los componentes podría revertir de nuevo hasta el estado estacionario o estabilizarse en un Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 37 entorno regulatorio distinto, determinado por un repertorio distinto de factores de transcripción, de regiones accesibles, de contactos enhancer-promotor, etcétera. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 38 2. RUTA DE SEÑALIZACIÓN DE TGFβ La familia de citoquinas del Factor de Crecimiento Transformante β o TGFβ (por sus siglas en inglés) está altamente conservada en todo el reino animal y es codificada por 33 genes en mamíferos, incluyendo: las distintas isoformas de TGFβ (TGFβ1-3), proteínas morfogénicas de hueso (BMPs, por sus siglas en inglés Bone Morphogenetic Proteins), factores de crecimiento y diferenciación (GDFs, por sus siglas en inglés Growth and Differentiation Factors), activinas, inhibinas, nodal y la hormona antimulleriana. Todos los miembros de esta familia son sintetizados como precursores largos que son procesados posteriormente para liberar a la molécula activa que se encuentra en el extremo carboxilo-terminal. En su forma activa, estas moléculas están conformadas como dímeros unidos por un puente de disulfuro (Heldin & Moustakas, 2016). Los receptores de la familia TGFβ son receptores de membrana similares tanto a los receptores de serina/treonina quinasas como a los receptores de tirosina quinasas, aunque suelen incluirse dentro del primer grupo (Manning et al., 2002). En mamíferos existen 12 miembros de esta familia de receptores, subdivididos a su vez en dos subgrupos: receptores tipo I y receptores tipo II. La familia de receptores tipo I está formada por 7 miembros (ALK1-7), mientras que la de los receptores tipo II está formada por 5 (TβRII, ActRII, ActRIIB, BMPRII y AMHRII). Los ligandos de la familia TGFβ pueden ser reconocidos por distintos tipos de receptores, existiendo así un amplio número de posibles combinaciones del complejo ligando:receptor tipo I:receptor tipo II (Heldin & Moustakas, 2016). En este trabajo nos centraremos especialmente en las isoformas de TGFβ y sus respectivos receptores. Las tres isoformas de TGFβ (TGFβ1-3) se unen a un único miembro de la familia de receptores tipo II (TβRII). Sin embargo, pueden unirse a dos miembros de la familia de receptores tipo I: TβRI/ALK-5 (que es expresado de forma ubicua); y ALK-1 (que es expresado de forma más selectiva) (Goumans et al., 2003). La unión del ligando promueve la formación de un complejo receptor heterotetramérico (formado por dos receptores tipo I y dos receptores tipo II). TGFβ1 y TGFβ3 se unen con mayor afinidad a TβRII que a TβRI, por lo que la unión del ligando a TβRII favorece el reclutamiento de TβRI a un dominio superficial que se genera a partir de ésta unión (Groppe et al., 2008). TGFβ2 sin embargo se une con menor afinidad a TβRII y necesita la colaboración de un correceptor, como betaglicano, para poder formar el complejo receptor (Stenvers et al., 2003). Tanto el dominio quinasa de TβRI como de TβRII se encuentran activos de manera constitutiva, sin embargo, en TβRI este dominio permanece inhibido debido a la Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 39 unión de la proteína FKBP12 al dominio GS que se encuentra anexo al dominio quinasa. Tras la formación del complejo receptor heterotetramérico TβRII fosforila el domino GS de TβRI lo cual induce un cambio conformacional que permite la liberación de FKBP12 y la activación del dominio quinasa de TβRI (Huse et al., 2001). 2.1. Mecanismos de acción 2.1.1. Transducción de la señalización de TGFβ a través de la ruta SMAD Los efectores de la ruta principal de transducción de la señalización de TGFβ son las proteínas SMAD (por sus siglas en inglés Mothers Against Decantaplegic homolog). Esta familia de proteínas está compuesta por 8 miembros, que se pueden subdividir en 3 subgrupos en cuanto a su función: las proteínas SMAD reguladas por receptor o R- SMAD, formada por las proteínas SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8; las proteínas SMAD inhibitorias o I-SMAD, formada por SMAD6 y SMAD7; y SMAD4 que es el efector común de esta ruta (Feng & Derynck, 2005). En su estado basal, las proteínas R-SMAD y SMAD4 se encuentran desplazándose continuamente entre el núcleo y el citoplasma. Tras la activación dependiente de ligando del complejo receptor, TβRI fosforila a las proteínas R-SMAD en su dominio carboxiloterminal (David & Massague, 2018). Por lo general se ha visto que la activación a través de las isoformas de TGFβ, nodal y activina induce la fosforilación de SMAD2 y SMAD3, mientras que la activación a través de las proteínas BMP induce la fosforilación de SMAD1, SMAD5 y SMAD8 (Feng & Derynck, 2005). Tras su activación, las proteínas R- SMAD fosforiladas forman un complejo heterotrimérico con SMAD4, el cual se transloca al núcleo dónde es capaz de unirse a un amplio número de loci, dependiente o independientemente de colaboración con otros factores cromatínicos, regulando de esta forma multitud de genes diana. Este complejo efector puede estar formado tanto por un homodímero R-SMAD junto con SMAD4 (por ejemplo, SMAD3:SMAD3:SMAD4), como por un heterodímero con SMAD4 (SMAD2:SMAD3:SMAD4). La regulación transcripcional mediada por las SMAD efectoras (R-SMAD y SMAD4) es dependiente de su dominio MH1 con el cual se unen al ADN, y de su dominio MH2 con el que pueden interaccionar con otras SMAD y distintos factores de transcripción (Xi et al., 2011). Por otro lado, las proteínas SMAD inhibitorias (SMAD6-7) son inducidas por los ligandos de la familia TGFβ y participan en la regulación de la señalización mediante un bucle de retroalimentación negativa (Goto et al., 2007). SMAD7 forma un complejo con la proteína ligasa de ubiquitina SMURF2 y con la fosfatasa PP2C. Tras la unión de SMAD7 a TβRI, Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 40 se produce el reclutamiento de SMURF2 y PP2C al complejo receptor de TGFβ promoviendo así su ubiquitinación y posterior degradación a través del proteasoma, y su inactivación mediada por defosforilación (Kamiya et al., 2010). Este efecto inhibitorio se equilibra gracias a la inducción, también por TGFβ, de la proteína TSC-22 que compite con SMAD7 para unirse a TβRI (Yan et al., 2011). Además de los mecanismos de regulación de retroalimentación negativa mediado por las I-SMAD, la ruta de transducción a través de estos efectores presentan distintos niveles de regulación: a nivel de su localización celular la translocación de las R-SMAD y SMAD4 es regulada por la interacción con proteínas del poro nuclear como NUP214, a nivel de su activación las proteínas R-SMAD pueden ser reguladas mediante fosforilación por MAP quinasas (MAPK por sus siglas en inglés Mitogen-activated Protein Kinases), quinasas dependiente de ciclinas (CDK, por sus siglas en inglés Cyclin-Dependent Kinases) y GSK3β. A nivel de su función, la unión de las SMAD efectoras a distintos loci es regulada por su interacción con distintos factores de transcripción y otros factores cromatínicos como readers, writers y erasers epigenéticos (tales como TRIM33, P300 y HDAC1/2 respectivamente); así como coactivadores y correpresores de SMAD (David & Massague, 2018). Aunque se ha visto que la señalización a través de las SMAD puede recapitular todos los efectos asociados a TGFβ, la activación del receptor dependiente de ligando puede, además, desencadenar la activación de otras rutas de señalización como las rutas ERK (por sus siglas en inglés Extracellular Regulated Kinasas), JNK (por sus siglas en inglés c-Jun N-terminal Kinase), p38, IKK (por sus siglas en inglés Ikβ Kinase), PI3K-AKT (por sus siglas en inglés Phosphoinositide-3 Kinase) y GTPasas Rho. En su conjunto todas estas rutas independientes de SMADs se denominan rutas no canónicas de señalización por TGFβ. 2.1.2. Transducción de la señalización de TGFβ a través de la ruta ERK La activación de las quinasas ERK1/2 mediada por TGFβ fue descrita incluso antes del descubrimiento de las SMAD, y su activación puede ocurrir tras 5-10 minutos de tratamiento con TGFβ (Olsson et al., 2001). Tras la activación de TβRI mediada por la unión de ligando, éste recluta y fosforila a SHCA. La fosforilación de SHCA promueve la formación del complejo SHCA-GRB2-SOS permitiendo la activación de Ras en la membrana plasmática, lo cual activa la cascada de señalización a través de RAF, MEK1/2 y ERK1/2 (Lee et al., 2007). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 41 Uno de los principales mecanismos por el cual Erk regula la actividad de TGFβ es mediante la fosforilación de factores de transcripción, los cuales interaccionan y cooperan con las SMADs para regular la expresión génica, como por ejemplo los factores de transcripción de la familia AP-1 (por sus siglas en inglés Activator Protein 1) y p53 (Yoon & Seger, 2006). Por otro lado, también se ha observado que ERK puede regular la ruta SMAD a través de fosforilación directa de las R-SMADs como SMAD2 y SMAD3 (Kretzschmar et al., 1999). Con respecto a su función, se ha descrito que la activación de ERK es esencial para la transición de epitelio a mesénquima inducida por TGFβ, jugando los genes regulados por esta ruta un papel importante en la remodelación de las interacciones de la matriz extracelular y en movilidad (Zavadil et al., 2001). Por otro lado, es importante tener en cuenta que la activación de ERK1/2 dependiente de TGFβ puede verse oscurecida por la presencia de factores de crecimiento en el suero o medio de cultivo, así como las interacciones con la matriz extracelular y la activación oncogénica (Y. E. Zhang, 2009). 2.1.3. Transducción de la señalización de TGFβ a través de las quinasas dependientes de TAK1 A diferencia de las rutas ERK y SMAD que son activadas mediante fosforilación, la activación de la MAPKKK TAK1 es activada mediante mecanismos de poliubiquitinación. Tras la activación dependiente de ligando, la proteína TRAF6 (por sus siglas en inglés TNF Receptor-Associated Factor 6) se asocia con el complejo receptor de TGFβ lo cual induce la activación de su dominio ligasa E3 llevando a cabo su propia poliubiquitinación. Entonces la proteína TRAF6 poliubiquitinada recluta e induce la activación de TAK1 (C. Wang et al., 2001; Yamashita et al., 2008). Aunque la activación de TAK1 es independiente de las R-SMADs, su actividad puede estar regulada por SMAD6 y SMAD7 (Y. E. Zhang, 2009). Una vez activada, TAK1 activa a las quinasas JNK (por sus siglas en inglés c-Jun N- terminal Kinase) y p38 a través de MKK4 y MKK3/6 respectivamente (Weston & Davis, 2007). Tras su activación, JNK y p38 activan a diversos factores de transcripción que cooperan con las SMADs en la regulación de la expresión génica. En concreto, estas dos rutas han sido asociadas con apoptosis y transición de epitelio a mesénquima (Y. E. Zhang, 2009). TAK1 también es capaz de activar a la proteína IKK (por sus siglas en inglés Ikβ Kinase) la cual activa a NF-κβ interfiriendo así también con esta ruta (Takaesu et al., 2003). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 42 2.1.4. Transducción de la señalización de TGFβ a través de la ruta PI3K/AKT Al igual que en la transducción a través de TAK1, la activación de los receptores de TGFβ también activa la ruta PI3K/Akt mediante un proceso dependiente de TRAF6 (Yang et al., 2009). La poliubiquitinación de TRAF6 induce el reclutamiento y activación de PI3K, la cual activa a AKT. La diana principal de AKT es el complejo mTORC1 el cual está implicado, entre otros muchos procesos, en la transición de epitelio a mesénquima. Además, AKT regula a distintos factores de transcripción implicados en la transición de epitelio a mesénquima tales como SNAIL y TWIST (Y. E. Zhang, 2009). 2.1.5. Transducción de la señalización de TGFβ mediada por GTPasas Rho Las GTPasas Rho están implicadas en el control de la organización del citoesqueleto, movilidad celular y la expresión génica (Jaffe & Hall, 2005). De todas ellas, se ha visto que RHOA tiene un papel importante en la transducción de TGFβ, especialmente en el contexto de la transición de epitelio a mesénquima. La inducción por TGFβ promueve, por un lado, la acumulación del complejo receptor en las zonas de uniones estrechas y, por otro, la fosforilación de Par6 por parte de TβRII la cual recluta a SMURF1, provocando la poliubiquitinación y posterior degradación de RHOA, lo cual permite la disolución de las uniones estrechas (Ozdamar et al., 2005). 2.2. Naturaleza contextual de la señalización por TGFβ La familia de citoquinas TGFβ es la que presenta la mayor diversidad de efectos de todas las familias de citoquinas conocidas. Todas las células, tanto en el desarrollo embrionario como en organismos adultos, son susceptibles a la señalización por TGFβ, la cual interviene en multitud de procesos celulares como proliferación, diferenciación, comunicación, adhesión, movilidad y muerte. Así, esta ruta de señalización está implicada en una gran variedad de procesos fisiológicos durante el desarrollo embrionario (mantenimiento de células troncales y diferenciación hacia progenitores) y en el organismo adulto (control del sistema inmune, cicatrización y regulación de la homeostasis celular en tejidos diferenciados). La alteración de la señalización de TGFβ también está asociada a distintas patologías cómo enfermedades del desarrollo, condiciones inflamatorias y fibróticas, y cáncer. Por otro lado, también se ha visto que TGFβ puede intervenir en procesos de reprogramación celular tanto inducida (reprogramación de células iPS, por sus siglas en inglés induced Pluripotent Stem Cells) como fisiológica (transición de epitelio a mesénquima) (Massagué, 2014; Morikawa et Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 49 escala genómica. Por ejemplo, se ha observado que en la EMT inducida por TGFβ en hepatocitos ocurre un incremento global de las marcas de activación y elongación transcripcional, H3K4me3 y H3K36me3, y una bajada de los niveles de H3K9me2 en regiones de heterocromatina mediada por LSD1. Estos cambios se dieron en regiones grandes de heterocromatina ricas en H3K9me2, denominadas LOCKs (por sus siglas en inglés), sugiriendo que la EMT inducida por TGFβ está causada por una reprogramación de dominios de la cromatina específicos (McDonald et al., 2011). También se ha observado que la variante de histona H2A.Z actúa como un regulador maestro de la EMT, siendo su expresión reprimida tras la inducción por TGFβ. H2A.Z se encuentra en el nucleosoma -1 del TSS de los genes epiteliales y su inactivación provoca la represión de la transcripción de éstos. Esta variante de histona también se encuentre en el nucleosoma +2 de los promotores de genes mesenquimales y la eliminación de H2A.Z activa la transcripción de estos genes (Domaschenz et al., 2017). 2.5. TGFβ y enhancers Por último, una de las aproximaciones para entender la naturaleza contextual de la señalización por TGFβ ha sido el estudio de los enhancers, puesto que estos elementos contienen múltiples sitios de unión a factores de transcripción y están directamente implicados en la regulación de los patrones espaciotemporales de expresión. Así, los enhancers son capaces de integrar múltiples señales mediante la unión de factores de transcripción dependientes de linaje (LDTFs, por sus siglas en inglés) y factores de transcripción dependientes de señales (SDTFs, por sus siglas en inglés) (Long et al., 2016; Shlyueva et al., 2014). El modelo actual para explicar el repertorio de enhancers activos propone que los LDTFs presentes en un tipo celular colaborarían entre ellos para establecer el repertorio de enhancers específicos abiertos en un determinado tipo celular (Heinz et al., 2015; Long et al., 2016; Mullen et al., 2011; Trompouki et al., 2011). Estos LDTFs podrían actuar como factores de transcripción pioneros, pudiendo unirse a las secuencias de ADN unidas al octámero de histonas y reclutando a remodeladores activos de la cromatina y modificadores de histonas (Zaret & Carroll, 2011). Esto restringiría el número de enhancers al cual los SDTFs podrían unirse y, por tanto, regular su actividad. Sin embargo, se ha observado la apertura de novo de enhancers mediada únicamente por SDTFs o en cooperación con LDTFs (Ostuni et al., 2013; Vierbuchen et al., 2017). Cómo los SDTFs llevan a cabo la selección de enhancers es todavía una pregunta abierta. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 INTRODUCCIÓN 50 En este sentido, se ha observado que los principales mediadores de la ruta de señalización por TGFβ, las proteínas SMAD, se unen mayoritariamente a enhancers (Mullen et al., 2011; Ramachandran et al., 2018; Trompouki et al., 2011). Experimentos de ChIP-seq realizados en células madre embrionarias, miotubos o células pro-B han demostrado que SMAD3 co-ocupa enhancers con LDTFs tales como Oct4/Sox2/Nanog, Myod1 o PU.1, respectivamente, lo cual sugiere que los efectos específicos de tipo celular por TGFβ están determinados por factores de transcripción específicos (Brown et al., 2011; Mullen et al., 2011). Además, se han observado resultados similares en progenitores eritroides y mieloides y células madre neurales (Fueyo et al., 2018; Trompouki et al., 2011). Sin embargo, estos experimentos fueron realizados en células creciendo en presencia de ligandos de la familia TGFβ (tales como TGFβ, activina, nodal o BMP). Puesto que en el momento del inicio de este trabajo aún no se había estudiado la dinámica de los enhancers en un modelo de inducción por TGFβ, nos propusimos estudiar la dinámica de la cromatina en los enhancers en un modelo de transición de epitelio a mesénquima inducido por TGFβ. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 OBJETIVOS Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 OBJETIVOS 51 OBJETIVOS Los objetivos propuestos para esta tesis doctoral son: 1. Identificar y caracterizar los enhancers en la línea celular NMuMG y estudiar su regulación por TGFβ. 2. Analizar el papel de los enhancers en la regulación transcripcional mediada por TGFβ. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 52 MATERIALES Y MÉTODOS 1. MÉTODOS EXPERIMENTALES 1.1. Métodos de cultivo celular 1.1.1. Líneas celulares y condiciones de cultivo Todas las líneas celulares fueron cultivadas en su medio especificado en la Tabla M.1. suplementado con antibióticos (Estreptomicina 100 µg/ml y Penicilina 100 U/ml, GibcoBRL) y 10% de suero fetal bovino (FBS, GibcoBRL) en atmósfera húmeda a 37oC en 5% CO2. La presencia de micoplasma fue descartada de forma rutinaria mediante el test comercial MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection Kit (Lonza). Tabla M.1. Líneas celulares empleadas en este trabajo. LÍNEA CELULAR ESPECIE ORIGEN MEDIO DE CULTIVO PROCEDENCIA HEK293T Homo sapiens Riñón (embrión) DMEM (Sigma) Dra. Rosa Ríos, CABIMER hTERT- RPE1 Homo sapiens Epitelio pigmentado de la retina RPMI (Sigma), L- glutamina 2mM (GibcoBRL) Dra. Rosa Ríos, CABIMER MCF-7 Homo sapiens Epitelio mamario DMEM-F12 (Sigma), L-glutamina 2mM (GibcoBRL) Dr. Abelardo López Rivas, CABIMER NMuMG Mus musculus Epitelio mamario DMEM (Sigma), Insulina 10 µg/ml (Sigma) Dr. Jose Antonio Pintor Toro, CABIMER Todas las líneas celulares empleadas en este trabajo son adherentes y fueron cultivadas en placas de cultivo de 60, 100 o 150 mm de diámetro con 5, 10 o 15 ml de cultivo respectivamente. Las células se subcultivaron cada 2-3 días. Para ello se realizó un lavado con PBS con el mismo volumen del medio de cultivo, se despegaron añadiendo una décima parte del volumen de éste de una solución estéril de tripsina al 0.05% en PBS-EDTA (Sigma) y se incubaron durante 5 minutos a 37oC. La reacción fue neutralizada utilizando 9 volúmenes de medio de cultivo, y se sembraron a distintas diluciones. Para la congelación de las diferentes líneas celulares, éstas se cultivaron hasta alcanzar 70-80% de confluencia, se lavaron con PBS y se tripsinazaron. Tras esto, se centrifugó en tubos Falcon de 15 ml estériles a 500 g durante 5 minutos, se resuspendieron en medio de congelación (90% medio de cultivo, 10% DMSO), se mantuvieron a -80oC en Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 59 comportamiento similar a la línea parental, y se seleccionó uno de ellos, clon #24, como la línea NMuMG-dCas9. Tampón de sorting: PBS, 25 mM HEPES, 5 mM EDTA, pH 7.0. 1.2.7. Establecimiento del repertorio de células NMuMG-dCas9 que expresan los sgRNAs de interés La línea NMuMG-dCas9 fue infectada con lentivirus (MOI = 2) con las construcciones pU6-sgRNA-PuroR-Cherry que contienen el cassette de expresión de los distintos sgRNAs. Tras 72 de horas infección, se comprobó la intensidad de señal Cherry y BFP mediante citometría de flujo y se subcultivó el repertorio total de células. Después de un día de subcultivo, las células NMuMG-dCas9-sgRNA fueron tratadas con 1 µg/ml de Puromicina para seleccionar las células que hayan incorporado la construcción, y se subcultivaron en medio de cultivo con Puromicina durante 7 días antes de ser almacenadas. Todos los experimentos con estos repertorios celulares se realizaron entre los pases P3-P8 de subcultivo para evitar la deriva del conjunto. 1.3. ATAC-seq Los experimentos de ATAC-seq se realizaron según lo descrito (Buenrostro et al., 2015). En primer lugar, las células se cultivaron en placas de 60 mm de diámetro hasta alcanzar el 70-80% de confluencia. Tras los tratamientos, se lavaron las células con PBS antes de ser tripsinizadas y recogidas. Se contó el número de células para cada condición utilizando una cámara de Fuchs-Rosenthal y se diluyó en DMEM para tener una concentración final de 1.5x105 células/ml. Se eligió este número de células ya que se observó que partiendo de 1.5x105 se obtenían 5x104 núcleos tras la permebealización (datos no mostrados). Se centrifugó 1 ml de la suspensión celular en tubos de 1.5 ml a 1000 g durante 5 minutos, con la centrifuga a 4oC. Se retiró con cuidado el sobrenadante, el pellet fue resuspendido en 50 µl de PBS frío y se volvió a centrifugar en las mismas condiciones que el paso anterior. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 50 µl de Tampón de lisis frío. Tras 5 minutos de incubación en hielo se volvió a centrifugar a 1000 g durante 10 minutos a 4oC. Se retiró el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 50 µl de la mezcla de transposición preparada en el momento y se incubó durante 30 minutos a 37oC. Tras esto, se purificó el ADN utilizando el kit MinElute PCR Purification Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 60 Una vez purificado el ADN se generaron las librerías de secuenciación. Para ello, se amplificó el ADN mediante PCR tradicional utilizando los oligonucleótidos cebadores de Nextera que contienen los códigos de barras para crear las librerías de secuenciación. Se utilizó el mismo cebador directo para todas las muestras (Ad1.Nomx) mientras que el cebador reverso varió de una muestra a otra dentro del mismo experimento (Ad2.1- Ad2.6). Para la reacción de PCR se utilizó: 10 µl de ADN 10 µl de agua MiliQ 2.5 µl de cebador directo (Ad1.Nomx) a 25 µM 2.5 µl de cebador reverso (Ad2.1-Ad2.6) a 25 µM 25 µl de NEBNext Hight Fidelity PCR Master Mix 2x (New Englands Labs) Se amplificó el ADN por PCR como sigue: 1 ciclo: 72oC, 5 minutos; 98oC, 30 segundos. 5 ciclos: 98oC, 10 segundos; 63oC, 30 segundos; 72oC, 1 minuto. Para calcular el número de ciclos adicionales necesarios, se preparó otra reacción de PCR utilizando una parte del ADN amplificado previamente y se amplificó en la máquina de PCR cuantitativa ViiA7 (Life Technologies). Para ello se preparó la siguiente reacción: 5 µl de ADN amplificado previamente 4.41 µl de agua MiliQ 0.25 µl de cebador directo (Ad1.Nomx) a 25 µM 0.25 µl de cebador reverso (Ad2.1-Ad2.6) a 25 µM 0.09 µl de SYBR Green I 100x 5 µl de NEBNext Hight Fidelity PCR Master Mix 2x (New Englands Labs) Y se amplificó: 1 ciclo: 98oC, 30 segundos 20 ciclos: 98oC, 10 segundos; 63oC, 30 segundos; 72oC, 1 minuto Entonces se calculó el número de ciclos necesarios representando la intensidad de fluorescencia (en lineal) frente al número de ciclos, y determinando el número de ciclos que corresponden a la cuarta parte del máximo de intensidad de fluorescencia. En general los ciclos necesarios que hubo que añadir osciló entre 1 y 5 ciclos. Tras la determinación de los ciclos necesarios, se volvió a amplificar el ADN mediante PCR tradicional, utilizando los 45 µl restantes de mezcla de reacción ya preparada: 1 ciclo: 98oC, 30 segundos N ciclos: 98oC, 10 segundos; 63oC, 30 segundos; 72oC, 1 minuto Dónde N es el número de ciclos necesarios calculados previamente. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 61 Por último, se purificó el ADN de las librerías ya generadas utilizando las bolas magnéticas AMPure XP (Beckman Coulter), realizando una doble selección de tamaño y siguiendo las instrucciones del fabricante. Una primera ronda para eliminar los cebadores que utilizó 0.5x volúmenes de bolas magnéticas con respecto al volumen de las librerías, y una segunda ronda donde se seleccionaron los fragmentos amplificados de menos de 1000 pb utilizando 1.3x volúmenes de bolas magnéticas. Finalmente, las librerías se entregaron a la unidad de Genómica de CABIMER para realizar el análisis de calidad mediante Bioanalyzer (Agilent) y Qubit (Thermo Fisher Scientific) y la secuenciación en el instrumento NextSeq 500 (Illumina). El ADN se secuenció por ambos extremos (paired-end) utilizando lecturas de 50 pb. La Tabla M.9. incluye las lecturas utilizadas para cada experimento. Tampón de lisis: 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.1% IGEPAL. Guardar a 4oC Tampón de transposición (Tn5 Buffer) 5x: 50 mM Tris-HCl pH 8, 50% v/v DMF, 25 mM MgCl2. Guardar a -20oC. Mezcla de transposición: 25 µl Tn5 Buffer 2x + 2.5 µl Tn5 A/B* + 22.5 µl agua MiliQ *La transposasa Tn5 A/B fue cedida por el Dr. Felipe Cortés Ledesma de CABIMER. 1.4. ATAC-see Los experimentos de ATAC-see se realizaron según lo descrito (X. Chen et al., 2016). En primer lugar, las células fueron cultivadas de forma que crecieran adheridas sobre cubreobjetos de 12 mm de diámetro en placas de 6 pocillos hasta alcanzar una confluencia del 70-80%. Tras los tratamientos, las células fueron lavadas con PBS y fijadas con 4% de Paraformaldehído en PBS (ChemCruz) durante 10 minutos. Tras la fijación, se lavaron las células con TBS y PBS antes de ser permeabilizadas con Tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente. Entonces, las células fueron lavadas dos veces con PBS e incubadas con la Mezcla de transposición, preparada en el momento, durante 30 minutos a 37oC en cámara húmeda. En todos los experimentos se incluyó un control negativo que contenía 50 mM de EDTA en la Mezcla de transposición. Tras la transposición, se lavaron las células tres veces con Tampón de lavado a 55oC durante 15 minutos cada lavado. Por último, las células fueron teñidas con DAPI durante 5 minutos y lavadas con PBS y agua MiliQ antes de ser montadas en los portaobjetos utilizando Vectashield (Vector). Las imágenes de microscopía de fluorescencia fueron tomadas utilizando el microscopio Leica DM6000B con el objetivo 40x de inmersión en aceite. Las imágenes de microscopía confocal fueron tomadas utilizando el microscopio Leica TCS SP5 (AOBS). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 62 Tampón de lisis: 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.01% IGEPAL. Guardar a 4oC Tampón de transposición (Tn5 Buffer) 5x: 50 mM Tris-HCl pH 8, 50% v/v DMF, 25 mM MgCl2. Guardar a -20oC. Mezcla de transposición: 25 µl Tn5 Buffer 2x 2.5 µl Tn5-ATTO590* 22.5 µl agua MiliQ Tampón de lavado: PBS, 0.01% SDS, 50 mM EDTA. Guardar a temperatura ambiente. *La transposasa Tn5-ATTO590 fue cedida por el Dr. Frank Lyko del German Cancer Research Center (Heidelberg, Alemania). 1.5. DNaseI-seq El experimento se realizó según lo descrito (He et al., 2014). Las células se cultivaron en placas de 100 mm hasta alcanzar una confluencia del 70-80%. Tras los tratamientos, se lavaron las células con PBS antes de ser tripsinizadas y recogidas. Se centrifugaron a 900 rpm durante 3 minutos, y el pellet celular se resuspendió en 6 ml de Tampón A+ y, posteriormente, se añadió 2 ml de Tampón A con 0.2% NP40, se mezcló por inversión y se incubó durante 10 minutos en hielo. Tras la incubación se utilizó la cámara Fuchs- Rosenthal para contar el número de núcleos utilizando la tinción Trypan Blue. La mezcla se centrifugó a 2500 rpm durante 3 minutos y el pellet nuclear se resupendió en Tampón A+ de forma que quedara una concentración de 5X106 núcleos/ml. Se añadió 2 ml de la suspensión de núcleos a tubos de 2 ml y se centrifugó a 2500 rpm, durante 3 minutos. El pellet se resuspendió en 2 ml de Tampón A y se repartió en 4 tubos de 1.5 ml por cada muestra, de forma que cada tubo contuviera 2.5X106 núcleos. Los núcleos se centrifugaron a 2500 rpm durante 5 minutos y el pellet se resuspendió en 500 µl de Tampón de digestión 1x precalentado a 37oC. Cada muestra, dividida en cuatro tubos, se trató con 0, 25, 75 y 100 unidades (U) de DNasaI (Roche) durante 5 minutos a 37oC. Para parar la reacción, se añadió 500 µl de Tampón de parada, se mezcló por inversión, y las muestras se incubaron a 55oC durante 15 minutos. Tras esto, se añadió a cada muestra 4 µl de Proteinasa K a 10 µ mg/ml (Roche), y se incubaron a 55oC durante toda la noche. Todas las centrifugaciones se realizaron a 4oC. Para la purificación del ADN digerido, se añadió a cada muestra 500 µl de Fenol y de Cloroformo. Se cambió a tubos phase-lock de 2 ml para evitar contaminación, se centrifugaron durante 15 minutos a 21000 g y se pasó la fase acuosa a un tubo nuevo. Se precipitó el ADN añadiendo a las muestras fenolizadas 2.5 volúmenes de etanol 100% y 5 µl de glicógeno e incubando a -20oC durante toda la noche. Para comprobar la digestión, las muestras se procesaron en un gel de agarosa del 1% en TBE 0.5x Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 63 durante 40 minutos a 95 V. Para todas las condiciones, se eligió las muestras que habían sido tratadas con 75 U de DNasa I, ya que presentaron el mejor patrón de digestión (datos no mostrados). Para el aislamiento de los fragmentos pequeños, que corresponden a las regiones que presentan sensibilidad a DNasaI, las muestras se procesaron en un gel del 2% de agarosa de bajo punto de fusión en TBE 0.5x a 50 V durante 40 minutos. Se cortó la parte del gel correspondiente a los tamaños 75-300 pb y se realizó una doble purificación secuencial del ADN utilizando los kits QIAQuick Gel Extraction Kit (Qiagen) y MinElute PCR Purification Kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Por último, las muestras se entregaron a la unidad de Genómica de CABIMER para realizar el análisis de calidad mediante Bioanalyzer (Agilent) y Qubit (Thermo Fisher Scientific), la realización de las librerías utilizando el Kit Thruplex-FD (Rubicon Genomics) y la secuenciación en el instrumento NextSeq 500 (Illumina). El ADN se secuenció por ambos extremos (paired-end) utilizando lecturas de 50 pb. La Tabla M.9. incluye el número de lecturas utilizadas para cada experimento. Tampón A: 15 mM Tris-HCl pH 8, 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 mM EGTA pH8. Tampón A+: Tampón A, 0.15 mM Espermina, 0.5 mM Espermidina, cocktail de inhibidores de proteasas 1x (cOmplete EDTA-free, Roche), 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT. Se preparó en fresco el día del experimento. Tampón A-0.2% NP40: Tampón A, 0.2% NP40. Tampón de digestión 10x: 400 mM Tris-HCl pH 8, 60 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2. Tampón de parada: 50 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 0.1% SDS, 100 mM EDTA. El día del experimento se añadió 0.3 mM Espermina y 0.1 mM de Espermidina. Todos los tampones se guardaron a 4oC. 1.6. Extracción de ARN total Para la extracción de ARN total se cultivaron las células en pocillos de placa de 6 pocillos y se utilizó el kit RNAeasy Mini Kit (Qiagen) utilizando las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se estimó por espectrofotometría (ND-100, Nanodrop) utilizando los valores de los ratios 260/280 ≈ 2 y 260/230 ≈ 2.1 como control de calidad del ARN purificado. 1.7. Determinación de ARNm mediante RT-qPCR En primer lugar, las muestras de ARN fueron tratadas con la DNAsa RQ1 (Promega), según las instrucciones del frabricante, para eliminar la contaminación con ADN Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 64 genómico. Para ello se partió 4 µg de ARN total por cada muestra. Tras el tratamiento, se realizó la retrotranscripción a DNA complementario (ADNc) utilizando el sistema Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific), utilizando oligonucleótidos cebadores aleatorios y siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras esto, se cuantificó de manera relativa el ADNc retrotranscrito mediante una PCR cuantiativa (qPCR) utilizando el termociclador de PCR a tiempo real 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystem) y utilizando el protocolo de amplificación por defecto. Para la qPCR se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 2 µl de ADNc 8 µl de agua MiliQ 1.25 µl de cebador directo a 10 µM 1.25 µl de cebador reverso a 10 µM 12.5 µl de Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem) En todos los casos se realizó una recta patrón a partir de diluciones seriadas de 1/10 de una muestra de ADNc para comprobar que la eficiencia de amplificación era la adecuada (valor de la pendiente de la recta en torno -3.1 a -3.5 con un óptimo de -3.3). Además, siempre se relativizó el nivel de expresión relativa de los distintos genes analizados a la de un gen control. Para ello se utilizó el gen de expresión constitutiva Gapdh cuya expresión no cambia con el tratamiento de TGFβ (datos no mostrados). Todos los experimentos incluyeron una curva de disociación para comprobar que existía un único producto de amplificación. Los experimentos incluyeron 3 repeticiones técnicas por cada muestra para cada pareja de cebadores y fueron analizados utilizando el programa 7500 System software v1.4.0. Los oligonucleótidos cebadores se diseñaron utilizando el programa primer3plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Siempre que fue posible los cebadores directo y reverso hibridaron en exones distintos para evitar la amplificación potencial de ADN genómico. La Tabla M.5. incluye las secuencias de todos los oligonucleótidos empleados en esta tesis. Tabla M.5. Secuencia de los oligonucleótidos empleados en los experimentos de RT- qPCR. Gen Cebador directo (5’ -> 3’) Cebador reverso (5’ -> 3’) Arid5a TTCATGAAGGAGCGACACAC GCTACCGCCAAGTTCATCAT Kansl3 CTCAGAGCATGGTGGACAGA AGGAATTTCAAAGGCCAGGT Amigo1 TCCGTGTTCCTGCTTCTCTT GCTCAAGTTGTTGTGGCTGA Cyb561d1 CTTTTCTCCTGGCACCCTGT GGACAGCACAGAGGATGG Atxn7l2 AGGTTCCACCAAAACCTCCT TGACTCCATGTGCATCAGGT Lad1 GCAACCTGAGTTCAACCACA AGACCTCTGCTTCCTCCACA Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 65 Tnnt2 ATCCCCGATGGAGAGAGAGT TCTCGAAGTGAGCCTCGAT Pkp1 CACCTGCTTCCAGGATGAAT AGCCTGCTGGACATTCTGAT Gnai3 ACGGCTATTCAGAGGACGAA CAAATAACTGTCGGGCATCA Neurl3 AAAGCCATTGAGCTTCTGGA CAGGAGCCACAGAAGTGTGA Gapdh AACTTTGGCATTGTGGAAG GGATGCAGGGATGATGTTCT 1.8. RNA-seq Se extrajo el ARN total de las muestras según lo especificado arriba. Tras la extracción, las muestras fueran entregadas al servicio de genómica Genomics Core Facility (EMBL, Heidelberg) para el análisis de calidad por Qubit y Bioanalyzer, la depleción del ARN ribosómico utilizando la tecnología RiboMinus (Thermo Fisher Scientific), la realización de las librerías utilizando el kit TrueSeq Stranded TOTAL RNA kit (Illumina) y la secuenciación en el secuenciador HiSeq 2000 System (Illumina). El ADNc se secuenció por un extremo (single-end) utilizando lecturas de 50 pb. La Tabla M.9. incluye el número de lecturas utilizadas para cada experimento. 1.9. ChromRNA-seq Para el fraccionamiento y obtención del ARN cromatínico se utilizó el protocolo descrito (Conrad & Ørom, 2017). Las células se cultivaron en placas de 100 mm hasta alcanzar una confluencia del 70-80%. Tras el tratamiento, se lavó las células con PBS y se tripsinizaron. Posteriormente se recogieron y se centrifugaron a 200 g durante 5 minutos. Se volvió a lavar las células con PBS, se centrifugaron a 200 g durante 5 minutos, el pellet se resuspendió en 1 ml de PBS-EDTA y se pasó a un tubo de 1.5 ml. Tras esto, se centrifugaron las células a 200g durante 2 minutos, el pellet se resuspendió en 400 µl de Tampón de lisis celular y se incubó en hielo durante 5 minutos. El lisado se vertió en el Tampón de sacarosa (con cuidado de mezclar las dos fases) y se centrifugó a 3500 g durante 10 minutos, obteniéndose el sobrenadante con la fracción citosólica (que fue descartado) y el pellet con los núcleos. El pellet se lavó con 1 ml de PBS-EDTA y se resuspendió en 350 µl de Tampón glicerol y 350 µl de Tampón de lisis nuclear, se mezcló durante 4 segundos con vórtex y se incubó durante 2 minutos en hielo. El lisado se centrifugó a 13000 g durante 2 minutos obteniéndose en el sobrenadante la fracción nucleoplásmica (que fue descartada) y en el pellet la fracción cromatínica. Esta fracción se resuspendió en 50 µl de PBS-EDTA y el ARN asociado a esta fracción se purificó utilizando TRIZOL (Invitrogen) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las centrifugaciones se realizaron a 4oC. Finalmente, el ARN obtenido se trató con TURBO Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 66 DNA-free kit (Thermo Fisher Scientific) para eliminar la contaminación potencial con ADN y se entregó al servicio de genómica Genomics Core Facility (EMBL, Heidelberg) para el análisis de calidad por Qubit y Bioanalyzer, la depleción del ARN ribosómico utilizando la tecnología RiboMinus (Thermo Fisher Scientific), la realización de las librerías utilizando el kit TrueSeq Stranded TOTAL RNA kit (Illumina) y la secuenciación en el secuenciador HiSeq 2000 System (Illumina). El ADNc se secuenció por un extremo (single-end) utilizando lecturas de 50 pb. La Tabla M.9. incluye el número de lecturas utilizadas para cada experimento. Previamente, el ARN asociado a la fracción cromatínica se procesó en un gel de agarosa al 1% en TBE 0.5x durante 25 minutos a 120 V, observándose un patrón de bandas característico del ARN ribosómico sin procesar como control del fraccionamiento. PBS-EDTA: PBS 1x, 0.5 mM EDTA. Tampón de lisis celular: 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.15% NP40. Tampón de sacarosa: 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 24% Sacarosa. Tampón glicerol: 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 75 mM NaCl, 0.5 M EDTA, 50% Glicerol. Tampón de lisis nuclear: 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M Urea, 0.3 M NaCl, 7.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 1% NP40. Todos los reactivos fueron preparados con agua tratada con DEPC y guardados a 4oC. Antes de cada experimento, se añadió a los distintos tampones 1 µl del inhibidor de RNasas RNAseOUT (Thermo Fisher Scientific) por cada ml de tampón, para evitar la degradación del ARN. 1.10. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y ChIP-seq. El experimento se realizó según lo descrito (Ceballos-Chávez et al., 2015). Las células se cultivaron en placas de 100 mm hasta alcanzar una confluencia del 70-80%. Tras los tratamientos, se añadió el Tampón de crosslinking a las placas de cultivo a una concentración final de 0.9% de Formaldehído y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras esto, se añadió Glicina a una concentración final de 0.11 M para parar la reacción de crosslinking y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las células dos veces con PBS y se recogieron en 1 ml de PBS utilizando un rascador. Se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y se guardaron los pellets a -80oC. A continuación, se realizó una lisis en dos pasos, primero las células se resuspendieron en 2.5 ml de Tampón de lisis I que incluía cóctel de inhibidores de proteasas (cOmplete, Roche). Se incubaron las células durante 10 minutos en hielo y se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos. El pellet se resuspendió en 1ml de Tampón de lisis II (con cOmplete, Roche) y la suspensión de Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 67 núcleos se pasó a tubos de 15 ml de poliestireno, especiales para sonicación. Entonces los núcleos se sonicaron en el sonicador de baño Bioruptor (Diagenode) durante 8 ciclos, en potencia alta a 30”/30” (on/off). Para eliminar los restos celulares, se llevaron a cabo dos centrifugaciones consecutivas primero a 4000 rpm durante 5 minutos, se pasó el contenido a un tubo de 1.5 ml y se volvió a centrifugar a 13000g, durante 10 minutos, pasando finalmente el contenido a un tubo limpio. Todas las centrifugaciones se llevaron a cabo a 4oC. La cromatina fragmentada se guardó a 4oC. Antes de continuar con el protocolo de inmunoprecipitación, se utilizó 50 µl de la cromatina fragmentada para comprobar el rendimiento en ADN y el patrón de fragmentación. Para ello, se llevó los 50 µl de la cromatina fragmentada a 400 µl utilizando Tampón de lisis II (sin inhibidores de proteasas), se añadió 2 µl de Proteinasa K (Roche) 10 mg/ml y se incubó durante toda la noche a 65oC para revertir el crosslinking. Posteriormente se purificó el ADN mediante protocolo tradicional de Fenol/Cloroformo y posterior precipitación del ADN con 2 volúmenes de etanol 100% durante 2 horas a -20oC. El ADN purificado se cuantificó por espectrofotometría (ND-100, Nanodrop), y el patrón de fragmentación se comprobó procesando el ADN fragmentado en un gel del 1.2% de agarosa en TBE 0.5x durante 40 minutos a 95 V. Aquellas muestras que mostraban un patrón de fragmentación con un enriquecimiento en la franja de 200-500 pb fueron consideradas válidas para la inmunoprecipitación. La cromatina se diluyó 1/10 en Tampón de inmunoprecipitación (con cOmplete, Roche) de forma que cada tubo contuviese 30 µg de cromatina fragmentada. Antes de la inmunoprecipitación, las muestras se incubaron a 4oC en rotación con 50 µl de bolas magnéticas Dynabeads Protein G (Invitrogen), previamente lavadas con Tampón de lavado I (con cOmplete, Roche), por cada tubo durante 1 hora para eliminar los fragmentos de cromatina que se pudieran unir de manera inespecífica a las bolas magnéticas. Para la inmunoprecipitación, se añadió a cada tubo 3 µg del anticuerpo correspondiente (ver Tabla M.7. de anticuerpos) y se mantuvieron los tubos en rotación a 4oC durante toda la noche. Posteriormente, se añadió 50 µl de bolas magnéticas Dynabeads Protein G (Invitrogen), previamente lavadas con Tampón de lavado I (con cOmplete, Roche), por cada tubo y se incubaron durante 2 horas a 4oC en rotación. Tras esto, se realizaron 5 lavados secuenciales de las bolas magnéticas utilizando 750 µl de Tampón de lavado I, Tampón de lavado II, Tampón de lavado III y 2 lavados con Tris- EDTA. Los lavados se realizaron en rotación durante 5 minutos cada uno de ellos a temperatura ambiente. La elución de la cromatina inmunoprecipitada se llevó a cabo en dos pasos, primero las bolas magnéticas se incubaron a 65oC durante 10 minutos con 50 µl de Tampón de Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 68 elución, se recogieron 30 µl de la elución en un tubo nuevo, y se volvió a repetir este proceso añadiendo 30 µl de tampón de elución y recogiendo todo el volumen restante tras la incubación a 65oC. Así, se obtuvo un volumen final de 80 µl de cromatina fragmentada que se llevó a 150 µl utilizando Tampón de elución. Como input, se cogió 1/10 parte del volumen de cromatina fragmentada utilizada para la inmunoprecipitación y se llevó a 150 µl utilizando Tampón de elución, incubándose junto con las muestras de cromatina inmunoprecipitada a 65oC durante toda la noche para revertir el crosslinking. Posteriormente, las muestras se trataron con Proteinasa K, añadiendo 142.5 µl de Tris-EDTA y 7.5 µl de Proteinasa K (Roche) 10 mg/ml a cada muestra, e incubando a 37oC durante una hora. Posteriormente el ADN fragmentado (input) y el ADN inmunoprecipitado se purificó mediante protocolo tradicional con Fenol/Cloroformo y se precipitó con 2 volúmenes de Etanol 100% durante 4 horas a -80oC. Tras la precipitación, el ADN se lavó con Etanol 70% y se resuspendió en un volumen final de 50 µl. Los experimentos de ChIP-qPCR se cuantificaron de manera relativa utilizando el termociclador de PCR a tiempo real 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystem) y utilizando el protocolo de amplificación por defecto. Para la qPCR se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 2 µl de ADNc 8 µl de agua MiliQ 1.25 µl de cebador directo a 10 µM 1.25 µl de cebador reverso a 10 µM 12.5 µl de Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem) Los oligonucleótidos cebadores utilizados para la amplificación pueden encontrarse en la Tabla M.6. En todos los casos se realizó una recta patrón a partir de diluciones seriadas de 1/5 de una muestra de input para comprobar que la eficiencia de amplificación era la adecuada (valor de la pendiente de la recta en torno -3.1 a -3.5 con un óptimo de -3.3). Los experimentos de ChIP-qPCR también incluyeron la inmunoprecipitación de una Inmunoglobulina G (igG) de la misma procedencia que los anticuerpos utilizados como control negativo. En los experimentos de ChIP-qPCR no se llevó a cabo el pre-clareado de la cromatina fragmentada antes de la inmunoprecipitación y la purificación final del ADN inmunoprecipitado y del ADN fragmentado (input) se realizó utilizando el kit ChIP DNA Clean and Concentrator (Zymo Research) siguiendo las instrucciones del fabricante. Además, en estos experimentos el Tampón de lisis II, Tampón de inmunoprecipitación, Tampón de lavado I y tampón de lavado II no incluyeron deoxicolato de sodio. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 75 ocupada por los núcleos se utilizó un protocolo estándar de segmentación y post-filtros, obteniendo 203 núcleos para la condición vehículo y 192 núcleos para TGFβ2h. Para determinar los dominios de cromatina abierta que se pueden observar en las imágenes crudas de microscopía (de fluorescencia y confocal) se utilizaron los pre-filtros estándar “fast filters 3D” y “LoG 3D (BIG)”. Tras esto, se utilizó la función “3D spot detector” para la segmentación. Por último, se utilizaron las funciones “region adjustment” y “merged regions” como post-filtros. Todos ellos fueron utilizados con las opciones por defecto. Una vez establecidos los núcleos y los dominios de cromatina abierta, se utilizó las funciones “measure geometrical simple” y “signal quantification” para analizar las características y distribución de los dominios de cromatina abierta para todos los núcleos. 2.6. Cuantificación de la señal de ATAC-see Las imágenes de microscopía de fluorescencia obtenidas de los experimentos de ATAC- see fueron analizadas utilizando el programa ImageJ con un macro preestablecido por el grupo para la cuantificación automática de las imágenes. En primer lugar, las imágenes se separaron por color, ya que cada imagen incluía dos colores: azul para los núcleos (DAPI) y rojo para la señal de ATAC-see (ATTO590). Los núcleos fueron segmentados utilizando la imagen con la proyección máxima correspondiente a la tinción DAPI, tras haber sido previamente pre-procesados y filtrados por tamaño, según los criterios estándar. Tras esto, se cuantificó la señal ATTO590, en las imágenes con la proyección máxima para esta tinción, únicamente en las áreas correspondientes con los núcleos segmentados y tras sustraer el fondo. Todos los experimentos fueron normalizados a la mediana. Para cada tipo de análisis de ATAC-see se cuantificaron imágenes correspondientes a tres experimentos independientes. El número de núcleos cuantificados por condición, incluyendo las tres réplicas, fue siempre mayor a 800. 2.7. Análisis de los motivos de unión utilizando CentriMo El análisis de los motivos de unión se llevó a cabo utilizando el programa CentriMo (v.5.0.2), del paquete de programas MEME (Bailey et al., 2009), contra todos los 579 motivos de unión de factores de transcripción incluidos en l base de datos JASPAR vertebrates (Khan et al., 2018) utilizando las opciones por defecto. CentriMo lleva a cabo un análisis de enriquecimiento central de motivos (CMEA, por sus siglas en inglés) el cual permite identificar los motivos de unión implicados en la regulación de las regiones identificadas a partir de los datos de ChIP-seq y ATAC-seq (Bailey & MacHanick, 2012). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 76 Además de los 579 motivos de unión incluidos en el momento del análisis en la base de datos JASPAR vertebrates, se construyeron y se añadieron al análisis las Matrices de Peso de Posición (PWMs, por sus siglas en inglés) de los motivos de unión para los factores de transcripción SNAI1 y SMAD 5GC (Martin-Malpartida et al., 2017), ya que son dos factores implicados en la regulación de la EMT y no estaban incluidos en la base de datos. Para cada categoría, las secuencias de nucleótidos de los enhancers (en formato fasta) fueron barajadas cinco veces para obtener secuencias aleatorias (5 veces mayor en número que las reales para cada categoría) con el mismo contenido %CG utilizando el programa scrambleFasta.pl del paquete de programas HOMER (Heinz et al., 2010) (v.4.10.3). Estas secuencias aleatorizadas fueron utilizadas como fondo (background, en inglés) para el análisis. 2.8. Análisis de footprinting En primer lugar, aclarar que se ha mantenido los términos footprints y footprinting del inglés, en lugar de su traducción al castellano como “huellas” y “hacer huella”, para mantener el contexto del término utilizado en el campo de la genómica. Para identificar footprints de factores de transcripción en la secuencia de los enhancers se utilizó el script Wellington_footprints.py del paquete de programas pyDNAse (Piper et al., 2013) (v.0.2.4) la opción –A, indicando que se trata de datos de ATAC-seq. Este programa no busca footprints en todo el genoma, sino que busca exclusivamente en las regiones que se le específica (preferiblemente regiones correspondientes a picos de ATAC-seq). En este caso esas regiones fueron las coordenadas de los enhancers de las distintas categorías. Se identificaron footprints en los datos de ATAC-seq de las condiciones TGFβ10m, TGFβ2h y TGFβ12h. Para ello, se juntaron los datos de ATAC-seq correspondientes a las dos réplicas biológicas para incrementar la fuerza de detección de footprints. Una vez identificados, para el análisis de enriquecimiento de footprints en las diferentes categorías de enhancers clasificados según el incremento de accesibilidad, primero se utilizó el script scrambleFasta.pl para generar las secuencias background de los footprints de cada categoría. Tras esto, se buscaron motivos de sitios de unión de factores de transcripción en los footprints reales y en las secuencias background obtenidas a partir de éstos utilizando el programa FIMO (v.5.0.5) del paquete de programas MEME. Se utilizaron las opciones por defecto y se seleccionó como umbral un p-valor < 0.0001. El enriquecimiento fue calculado para cada categoría independientemente como: Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 77 𝑒𝑛𝑟= 𝑓𝑜𝑜𝑡𝑝𝑟𝑖𝑛𝑡𝑠[𝑚𝑜𝑡𝑖𝑣𝑜] 𝑓𝑜𝑜𝑡𝑝𝑖𝑛𝑡𝑠[𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙] 𝑓𝑜𝑜𝑡𝑝𝑟𝑖𝑛𝑡𝑠_𝑏𝑔[𝑚𝑜𝑡𝑖𝑣𝑜] 𝑓𝑜𝑜𝑡𝑝𝑟𝑖𝑛𝑡𝑠_𝑏𝑔[𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙] Dónde footprints[motivo] es el número de footprints que contienen un determinado motivo de unión, footprints[total] es el número de footprints totales para dicha categoría, footprints_bg[motivo] es el número de secuencias background que contienen un determinado motivo de unión y footprints_bg[total] es el número de secuencias background totales para dicha categoría. Los p-valores de estos enriquecimientos se calcularon realizando una prueba de Fisher utilizando la función Fisher.test() del paquete stats de R. Los mapas de calor del enriquecimiento se representaron utilizando el programa gitools (v.2.3.1), incluyendo en éstos los motivos más representativos. La medida de las integraciones de la transposasa Tn5 a partir de los datos de ATAC- seq se calculó con Bioconductor utilizando los paquetes GenomicAllignments (v1.20.1), Biostrings (v.2.52.0) y soGGi (v1.16.0). Para ello, primero se extrajeron todos los fragmentos de ATAC-seq menores de 100 pb (ya que corresponden principalmente a las regiones deplecionadas de nucleosomas, NDRs) de los datos que corresponden a las réplicas biológicas de la condición TGFβ2h, una vez juntadas. Tras obtener las coordenadas de los fragmentos, se redimensionaron las lecturas a 1 pb (el comienzo o final del fragmento) y se desplazaron 4 o -5 pb con respecto a las coordenadas genómicas, dependiendo de la hebra, para ajustar los datos al desplazamiento esperado de la inserción que lleva a cabo la transposasa Tn5 al producir los sitios de corte. El análisis de footprinting en las categorías de enhancers regulados se llevó a cabo de forma similar a lo comentado arriba, pero en este caso se utilizó como secuencias background para los footprints de una categoría determinada todas las secuencias de footprints que no estaban incluidas en dicha categoría. Los datos de ATAC-seq de la condición TGFβ2h fueron utilizados para la identificación de footprints en los enhancers de las categorías tempranas, y los datos de la condición TGFβ12h para las categorías tardías. 2.9. Análisis de ChIP-seq de Smad2/3 En primer lugar, se descargaron los datos de ChIP-seq de Smad2/3 en las células NMuMG utilizando su identificador del GEO (por sus siglas en inglés, Gene Expression Omnibus) GSE121254. Estos datos consistieron en dos archivos: la inmunoprecipitación de cromatina utilizando el anticuerpo α-SMAD2/3 en células NMuMG tratadas con Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 78 TGFβ1 durante 1.5 horas, y su input correspondiente. Para alinear las lecturas al genoma de referencia de ratón mm9, se utilizó la función align() del paquete de Bioconductor Rsubread (Liao et al., 2013) (v.1.28.2) con los parámetros type = 1, TH1 = 2 y unique = TRUE, indicando que las muestras corresponden a ADN y que sólo se consideren aquellas lecturas que mapean en un único sitio del genoma. La llamada de picos se llevó a cabo utilizando el comando callpeak de macs2 utilizando el input como archivo de control y con las opciones por defecto. Una vez identificados los picos, se filtraron utilizando como umbral -log10(FDR) ≥ 5. También se eliminaron aquellos picos que coincidían con las regiones incluidas en la “lista negra” de regiones para el genoma de ratón utilizando la función subtract de bedtools con la opción -A. Esta “lista negra” contiene regiones repetidas y otros tipos de regiones problemáticas para los estudios de secuenciación y puede encontrarse en las bases de datos tradicionales. Después de estos filtrados se obtuvieron 8401 picos de Smad2/3. Tras esto, se descartaron los picos que coincidieron con las regiones promotoras, definidas en cuanto al TSS ± 1000 pb, de cualquier transcrito incluido en el archivo de anotación UCSC KnownGene del genoma de ratón mm9 obteniendo 7503 picos, de los cuales 5906 solaparon con los enhancers identificados en nuestras condiciones de estudio. El análisis de solapamiento entre los enhancers unidos a Smad2/3 y los enhancers clasificados en cuánto a su incremento de accesibilidad tras 2 horas de tratamiento con TGFβ1 y/o los que contenían footprints para los factores de transcripción de la familia AP-1, se realizó utilizando el paquete de R vecsets (v.1.2.1). Los p-valores de la probabilidad de la distribución hipergeométrica se calcularon a utilizando la función dhyper() del paquete stats de R. Los gráficos de densidad de la señal de ATAC-seq se representaron para la condición TGFβ2h utilizando el programa compute-matrix con el comando reference-point del paquete de programas deeptools con las opciones -a 2000 -b 2000, indicando que se represente además las regiones 2 kb aguas arriba y abajo de las regiones seleccionadas, en los diferentes grupos de regiones: enhancers con footprints para AP-1, enhancers unidos a Smad2/3 y los que cumplían los dos criterios simultáneamente. 2.10. Procesamiento de los datos de RNA-seq En primer lugar, los datos de RNA-seq de las dos réplicas biológicas de cada condición se filtraron utilizando el programa FASTQ toolkit (v1.0.0). Tras esto, las lecturas de secuenciación fueron alienadas al genoma de referencia de ratón mm9 utilizando la función subjunc() del paquete de Bioconductor RSubread con las opciones TH1 = 2 y unique = TRUE, indicando que sólo se mantuvieran aquellas lecturas que mapearon a Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 79 un sitio único del genoma. El análisis posterior se llevó a cabo con los archivos de alineamiento bam tras haber sido eliminados los duplicados de PCR a través del comando del programa samtools (H. Li et al., 2009) (v.0.1.9) rmdup. La función featureCounts() (Liao et al., 2014) del paquete de Bioconductor RSubread se empleó para asignar las lecturas alineadas a los genes anotados en el archivo de anotación del genoma de referencia de ratón mm9 UCSC KnownGene (previamente se había descartado de este archivo los ARNmi) utilizando las opciones GTF.featureType = “exon”, GTF.attrType = “gene_id” y strandSpecific = 2, indicando que las lecturas se contaron a nivel de exón y que se agruparon por genes, no por transcritos, además de indicar que las librerías de RNA-seq se habían generado utilizando un protocolo específico de cadena. El análisis de expresión diferencial se llevó a cabo utilizando un protocolo estándar que incluía una serie de pasos secuencias utilizando funciones de los paquetes de Bioconductor voom/lima (v.3.34.9) y edgeR (Smyth et al., 2016). Aquellos genes que contenían ≥ 2 CPM en al menos las dos réplicas biológicas consideradas por cada condición fueron analizados, resultando en 11081 genes de los 21240 genes anotados en el archivo UCSC KnownGene. Tras el filtrado, se utilizó la función calcNormFactors() del paquete edgeR para normalizar las muestras, usando el método TMM (por sus siglas en inglés Trimmed Mean of M-values). Para el análisis de expresión diferencial se utilizaron de forma secuencial las funciones voom(), lmFit() y utilizando por último el método de Bayes, eBayes(), para obtener el cambio de expresión log2FC, y dos valores estadísticos: p-valor y el p-valor ajustado, utilizados para la determinación de los genes regulados por TGFβ y los genes regulados de forma robusta por TGFβ, respectivamente. Por último, se clasificaron los genes expresados diferencialmente con un p-valor ajustado ≤ 0.05 de acuerdo a: Represión temprana: ((𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ_𝑣𝑠_𝑣𝑒ℎ)<−1) ⋀ ¬(𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽12ℎ_𝑣𝑠_𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ) >1) Inducción temprana: ((𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ_𝑣𝑠_𝑣𝑒ℎ)>1) ⋀ ¬(𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽12ℎ_𝑣𝑠_𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ) <−1) Represión tardía: ((𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽12ℎ_𝑣𝑠_𝑣𝑒ℎ)<−1) ⋀ ¬(𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ_𝑣𝑠_𝑣𝑒ℎ)<−1) Inducción tardía: ((𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽12ℎ_𝑣𝑠_𝑣𝑒ℎ)>1) ⋀ ¬(𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ_𝑣𝑠_𝑣𝑒ℎ) >1) Represión transitoria: ((𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ_𝑣𝑠_𝑣𝑒ℎ)<−1) ⋀ ¬(𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽12ℎ_𝑣𝑠_𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ)<−1) Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 80 Inducción transitoria: ((𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ_𝑣𝑠_𝑣𝑒ℎ)>1) ⋀ ¬(𝑙𝑜𝑔𝐹𝐶(𝑇𝐺𝐹𝛽12ℎ_𝑣𝑠_𝑇𝐺𝐹𝛽2ℎ) >1) Dónde ⋀ y ¬ son los operadores lógicos que indican conjunción (y) y negación (no) lógica, respectivamente. Debido a que el número de genes incluidos en las categorías que indican un cambio de expresión transitoria, represión e inducción, era muy bajo, estas categorías no fueron consideradas para los análisis posteriores. Para los gráficos MA (MA plots, en inglés) se representó el cambio de expresión (log2FC) contra la media de expresión (log2CPM) para todas las réplicas de todas las condiciones. También se representó la distribución de la media de expresión (log2CPM) mediante diagrama de cajas y bigotes. El mapa de calor de expresión de algunos genes seleccionados se representó utilizando gitools. 2.11. Procesamiento de los datos de ChIP-seq de histonas Los datos de ChIP-seq de dos réplicas biológicas para cada condición y para cada una de las modificaciones de histonas analizadas en este trabajo (H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac) se filtraron utilizando el programa FASTQ toolkit. Tras esto, las lecturas de secuenciación fueron alineadas al genoma de referencia de ratón mm9 utilizando la función align() del paquete de Bioconductor RSubread con las opciones type = 1, TH1 = 2 y unique = TRUE, indicando que eran muestras de ADN y que sólo se mantuvieron aquellos lecturas que mapearon en un sitio único del genoma. El análisis posterior se llevó a cabo con los archivos de alineamiento bam tras haber sido eliminados los duplicados de PCR a través del comando del programa samtools rmdup. 2.12. Clasificación de los enhancers Para crear el repertorio de enhancers de la línea celular NMuMG, primero se llevó a cabo el conteo de lecturas de los datos de ChIP-seq para H3K27ac y H3K4me1 a lo largo de toda la longitud de los picos de ATAC-seq (29071 picos que no solapan con las regiones promotoras) utilizando la función regionCounts() del paquete de Bioconductor csaw con la opción de minq = 40, para eliminar aquellas lecturas que presentaban una calidad baja de alineamiento. Para contar las lecturas de los datos de ChIP-seq para H3K4me1 se incrementaron las coordenadas de las regiones 500 pb, aguas arriba y abajo, debido a que esta marca de histonas presenta una distribución extensa en el genoma. Tras esto, se calculó los valores de CPM y RPKM (por sus siglas en inglés Reads Per Kilobase per Million), utilizando las lecturas contadas en todos los enhancers Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 81 como el tamaño de la librería, y combinando las dos réplicas biológicas para cada condición. Se consideró como picos que contenían las marcas aquellos picos cuyo valor de RPKM fuera mayor que el percentil 25 para H3K27ac o que el percentil 10 para H3K4me1. Así, los enhancers que no contenían las marcas H3K4me1 ni H3K27ac en la condición vehículo pero que adquirían dichas marcas con el tratamiento con TGFβ1 se denominaron enhancers latents o latentes. Los enhancers que en la condición vehículo contenían la marca H3K4me1, pero no la H3K27ac, fueron considerados como enhancers primed. Por último, los enhancers que contenían ambas marcas en la condición vehículo se clasificaron como enhancers activos. Para clasificar los enhancers de acuerdo a su regulación por TGFβ1, se analizó la dinámica de la marca H3K27ac en las condiciones vehículo, TGFβ2h y TGFβ12h, considerando las dos réplicas biológicas independientemente y usando una serie secuencial de funciones de los paquetes de Bioconductor csaw y edgeR. Las lecturas fueron contadas a lo largo de toda la longitud de los picos de ATAC-seq, al igual que lo descrito arriba, y se calcularon los factores de normalización utilizando la función normOffset() del paquete csaw con la opción type = “loess”. Para el análisis de unión diferencial de la marca H3K27ac se emplearon las funciones scaleOffset(), estimateDisp(), glmQLFit() y glmRLT(). Una vez obtenido el cambio en la señal de ChIP- seq y el p-valor a través del análisis de unión diferencial, se clasificaron los enhancers siguiendo los mismos criterios que los establecidos para el análisis de expresión diferencial especificado arriba. Sin embargo, la nomenclatura es diferente, utilizándose los términos represión temprana, activación temprana, represión tardía, activación tardía, represión transitoria y activación transitoria. Para cada comparación también se consideró un p-valor < 0.05 y log2CPM > 0. Aquellos enhancers que no cumplieron ambos criterios no fueron asignados a ninguna categoría. Todos los enhancers que no se asignaron a una de las 6 categorías mencionadas se agruparon en la categoría denominada TGFβ-independientes. Debido al bajo número de enhancers en las categorías transitorias, represión y activación transitoria, no se tuvieron en cuenta para los análisis posteriores. El paquete de Bioconductor EnrichedHeatmap fue utilizado para representar los mapas de calor de las 5 categorías de enhancers, clasificados según la dinámica de la marca H3K27ac, empleadas en este trabajo: represión temprana, activación temprana, represión tardía, activación tardía y TGFβ-independientes. Para la construcción de estos mapas de calor, las filas se ordenaron según el valor de CPM decreciente para la marca H3K27ac para la condición TGFβ2h, y se representó la región constituida por la cumbre del pico de ATAC-seq ± 500 pb, incrementando 1500 pb más por los dos lados. Los Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 82 diagramas de cajas y bigotes para las marcas de las histonas en los enhancers representan el valor medio de CPM de las dos réplicas para cada condición. Los perfiles se representaron utilizando el paquete de Bioconductor Shushi (v.1.16.0) utilizando los archivos bedgraph construidos utilizando el programa bamCoverage del paquete de programas deeptools, previa unión de los archivos de alineamiento bam para las dos réplicas por cada condición utilizando el comando merge del programa samtools. 2.13. Procesamiento de los datos de ChromRNA-seq Los datos de ChromRNA-seq para dos réplicas biológicas por cada condición se filtraron utilizando el programa FASTQ toolkit. Tras esto, las lecturas de secuenciación fueron alienadas al genoma de referencia de ratón mm9 utilizando la función subjunc() del paquete de Bioconductor RSubread con las opciones TH1 = 2 y unique = TRUE, indicando que sólo se mantuvieron aquellos lecturas que mapearon a un sitio único del genoma. El análisis posterior se llevó a cabo con los archivos de alineamiento bam tras haber sido eliminados los duplicados de PCR a través del comando del programa aamtools rmdup. Debido al pequeño tamaño de los eRNAs, las lecturas de ChromRNA- seq se contaron en las regiones correspondientes a la cumbre de los picos de ATAC- seq ± 200 pb y solamente para los enhancers intergénicos, utilizando la función regionCounts() del paquete de Bioconductor csaw la opción de minq = 40, para eliminar aquellas lecturas que presentaban una calidad baja de alineamiento. De los 29071 enhancers considerados en este estudio, aquellos que solaparon con cualquier cuerpo de los transcritos anotados en el archivo UCSC KnownGene para el genoma de referencia de ratón mm9 (extendiendo 5 kb desde el sitio de terminación de la transcripción, TTS, para evitar las lecturas que cayeran en el read-through de la terminación de los transcritos) fueron desechados utilizando el comando subtract del programa bedtools, resultando en 12857 enhancers intergénicos. Tras el conteo de lecturas, se calculó el valor de CPM de los enhancers intergénicos. La correlación entre los niveles de H3K27ac y los niveles de expresión de eRNAs, se estableció utilizando estos 12857 enhancers. Tras esto, se filtraron los enhancers intergénicos manteniendo únicamente aquellos que expresaban eRNAs, los que presentaron una CPM > 17 en al menos 3 las muestras consideradas, obteniendo un repertorio final de 2337 enhancers intergénicos que expresaban eRNAs. Entonces, se realizó un análisis de expresión diferencial de eRNAs en estos enhancers utilizando el mismo proceso que el descrito para ChIP-seq, utilizando los paquetes de Bioconductor csaw y edgeR. Finalmente, de este análisis se obtuvieron los valores del cambio de expresión de eRNAs, log2FC, de Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 83 los 2337 enhancers intergénicos que fueron utilizados para el estudio de correlación con el incremento de los niveles de la marca H3K27ac. 2.14. Análisis de la localización de los genes regulados por TGFβ con respecto a los enhancers regulados por TGFβ Para estudiar la regulación de los genes en el entorno de los enhancers regulados por TGFβ, primero se representó, mediante diagrama de cajas y bigotes, la distribución del cambio de expresión, log2FC, de los genes adyacentes a los enhancers regulados. Para determinar la posición de los genes con respecto a los enhancers primero se calculó la distancia entre el TSS de los genes y la cumbre de los picos de ATAC-seq de los enhancers. Entonces los genes se agruparon de acuerdo a dos criterios. El primer criterio fue la posición relativa de los genes con respecto a los enhancers, distinguiendo si el gen se encontraba aguas arriba (simbolizado por “-“) o aguas abajo (simbolizado por “+”) del enhancer regulado, y utilizando el orden de posición de los genes con respecto al enhancer (del primero al cuarto). Así los genes se agruparon en 4 categorías: Eg (enhancer-gen) ± n, tomando n los valores n = {1,2,3,4}. Así, por ejemplo, en la categoría Eg ± 1 se encontrarían los genes inmediatamente adyacentes (aguas arriba y abajo) a un enhancer regulado. Los genes no expresados no se tuvieron en cuenta para este análisis. La aleatorización de los enhancers se llevó a cabo mediante desplazamiento o mediante barajado. Para la aleatorización mediante desplazamiento, los enhancers de cada cromosoma se ordenaron según sus coordenadas cromosómicas 5’->3’ y se les enumeró. Entonces se recircularizaron los cromosomas y los enhancers aleatorios se obtuvieron al desplazar los enhancers 50 posiciones. Así, si un enhancer regulado estaba enumerado como n, siendo n la posición que ocupa el enhancer en un cromosoma determinado, el enhancer aleatorio asociado a éste sería el enhancer cuya posición fuese n+50. Para la aleatorización mediante barajado, la posición de los enhancers de cada cromosoma fue barajada aleatoriamente utilizando la función sample() de R. Se obtuvieron resultados similares con ambos métodos de aleatorización, sin embargo, en este trabajo se presentan los obtenidos mediante barajado por desplazamiento, ya que se consideró el método más conservador con la estructura genómica. Para estudiar la dependencia de la distancia enhancer-gen se agruparon los genes que se localizaban en el entorno los enhancers regulados por TGFβ en intervalos no solapantes de 50 kb, distinguiendo entre aquellos que se localizaban aguas arriba y Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 84 aguas abajo. Así, por ejemplo, se agruparon aquellos genes que se localizaban en las primeras 50 kb desde la cumbre del pico de ATAC-seq, entre 50 y 100 kb, entre 100 y 150 kb, etcétera, aguas arriba y aguas abajo, hasta 250 kb. Entonces se representó la distribución del log2FC de los genes agrupados así, de forma independiente para cada categoría. Se realizó lo mismo utilizando los enhancers aleatorizados, siguiendo el mismo proceso que el descrito arriba. Para estudiar la correlación entre el cambio de actividad de los enhancers (medido como log2FC(H3K27ac)) y el cambio de expresión de los genes más cercanos (medida como log2FC), primero se establecieron las parejas enhancer-gen más cercano (considerado aquel cuya distancia entre la cumbre del pico de ATAC-seq y el TSS era la menor) y dichas parejas se ordenaron por orden creciente del valor de log2FC(H3K27ac). Una vez ordenados, se agruparon en 20 intervalos no solapabtes y se realizó un análisis utilizando el método de mínimos cuadrados para obtener los valores de r y la pendiente. En este análisis se consideraron los 29071 enhancers y los valores de cambio, tanto de la actividad del enhancer como de la expresión del gen, utilizados fueron los obtenidos en la comparación TGFβ2h versus vehículo. Se realizó el mismo análisis considerando el segundo, el tercer y el cuarto gen más cercano. Para estudiar si los enhancers actúan de manera continua, en primer lugar, se eligieron aquellos enhancers regulados por TGFβ que tenían en su entorno un gen regulado de forma robusta por TGFβ (|log2FC| > 1 ⋀ p-valor ajustado < 0.05), y se representó la distribución del valor de log2FC del resto de genes en el entorno. Así, por ejemplo, se eligieron los enhancers regulados por TGFβ cuyo gen adyacente aguas arriba (Eg-1) estaba regulado de forma robusta por TGFβ, y se representó la distribución del valor de log2FC de los genes Eg-2, Eg+1 y Eg+2. Sólo se estudió este efecto hasta los genes Eg±2, debido a que el número de enhancers cuyo tercer o cuarto gen más cercano, aguas arriba o abajo, estuviera regulado de forma robusta por TGFβ era muy bajo. Se realizó la misma aleatorización que la descrita arriba. 2.15. Identificación de clusters de genes corregulados Para identificar los clusters de genes corregulados, primero se ordenaron todos los genes según el orden cromosómico de 5’->3’ utilizando la coordenada del TSS. Entonces se buscaron pares de genes regulados de forma robusta por TGFβ (|log2FC| > 1 ⋀ p-valor ajustado < 0.05) para cada categoría, que fueran contiguos de forma estricta. Para determinar si el número de pares de genes corregulados era mayor que el esperado por azar, se escogieron de forma aleatoria un número de genes idéntico al Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 MATERIALES Y MÉTODOS 91 Tabla M.9. Número de lecturas utilizadas en los experimentos de NGS. Nombre Lecturas totales Lecturas únicas ATAC_veh_r1 213547366 128768960 ATAC_veh_r2 174689786 100702656 ATAC_TGFβ2h_r1 208937984 106610414 ATAC_TGFβ2h_r2 186034704 103808154 ATAC_TGFβ12h_r1 216396636 90260358 ATAC_TGFβ12h_r2 171429808 67617626 ATAC_veh_exp10m 54893460 34208424 ATAC_TGFβ10m_exp10m 65587840 36325876 ATAC_veh_FBS 78840800 48533492 ATAC_TGFβ2h_FBS 75764908 42429056 ATAC_TGFβ2h_+72h_FBS 64790276 35849744 DNAsaI_veh 90208426 59660580 DNAsaI_TGFβ2h 57727518 37824966 input_veh_r1 74067701 58444326 input_veh_r2 41554381 31069808 input_TGFβ2h_r1 72160972 61225409 input_TGFβ2h_r2 39655845 33008486 input_TGFβ12h_r1 32375614 19469394 input_TGFβ12h_r2 33858162 21319561 K4me1_veh_r1 39878573 36024616 K4me1_veh_r2 50695142 36751888 K4me1_TGFβ2h_r1 41220386 37574065 K4me1_TGFβ2h_r2 56343861 46575076 K4me1_TGFβ12h_r1 50166901 35807165 K4me1_TGFβ12h_r2 34104120 28991314 K4me3_veh_r1 45726114 37276693 K4me3_veh_r2 69608088 57426887 K4me3_TGFβ2h_r1 42046893 34841047 K4me3_TGFβ2h_r2 51295337 43225558 K4me3_TGFβ12h_r1 52810793 39659636 K4me3_TGFβ12h_r2 43741215 33048218 K27ac_veh_r1 102016983 87885852 K27ac_veh_r2 30890168 28260473 K27ac_TGFβ2h_r1 88044547 73109659 K27ac_TGFβ2h_r2 59772824 55365711 K27ac_TGFβ12h_r1 51124775 38443872 K27ac_TGFβ12h_r2 55651664 40652148 RNA_veh_r1 28493413 22571216 RNA_veh_r2 25533245 20579112 RNA_TGFβ2h_r1 34412308 27217313 RNA_TGFβ2h_r2 34628689 27226469 RNA_TGFβ12h_r1 40349411 32174710 RNA_TGFβ12h_r2 33108803 26503527 ChromRNA_veh_r1 51498645 47825194 ChromRNA_veh_r2 46244779 42780783 ChromRNA_TGFβ2h_r1 38182842 35458501 ChromRNA_TGFβ2h_r2 59926259 56015998 ChromRNA_TGFβ12h_r1 44886148 41381421 ChromRNA_TGFβ12h_r2 46509661 43618058 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 92 RESULTADOS 1. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ENHANCERS EN LA LÍNEA CELULAR NMuMG Para investigar cómo la señalización por TGFβ controla la transcripción en la línea celular de epitelio mamario de ratón NMuMG, primero se estudiaron los cambios a corto plazo que provocaba el tratamiento con TGFβ en la cromatina. La señalización por TGFβ ocurre a través de distintas rutas de transducción, las cuáles puedes ser activadas a su vez por diferentes factores de crecimiento presentes en el suero fetal bovino (FBS) utilizado para el cultivo celular. Debido a esto, para poder determinar los cambios producidos por TGFβ de una forma más clara, se decidió mantener a las células NMuMG en ausencia de suero un periodo de tiempo antes de los tratamientos con TGFβ. Para ello las células se cultivaron durante 6 horas en medio de cultivo DMEM con antibióticos y sin FBS ni insulina (adicionada al medio para facilitar el crecimiento de esta línea celular) antes de los tratamientos. Las muestras se tomaron tras 2 horas de tratamiento con TGFβ para analizar los cambios rápidos que ocurrían en la cromatina, y a las 12 horas para estudiar los cambios más tardíos. Además, las células también se trataron con HCl-BSA, utilizado para la preparación de TGFβ, recogiéndose a las 2 horas como control (vehículo) de los experimentos. En la Figura R1 se muestra el esquema experimental básico utilizado en esta tesis doctoral. Además, puede observarse cómo tras 12 horas de tratamiento con TGFβ empiezan a darse los primeros cambios morfológicos relacionados con la transición de epitelio a mesénquima (EMT) inducida por TGFβ. Figura R1. Esquema experimental de las condiciones de cultivo y tratamientos empleados en esta tesis doctoral. Las células se mantuvieron en ausencia de suero durante 6 horas antes de ser tratadas con TGFβ o vehículo. Se recogieron tras 2 horas de tratamiento con vehículo (control), y tras 2 y 12 horas de tratamiento con 5 ng/ml de TGFβ1, y fueron sometidas a distintos protocolos, tales como ATAC-seq, ChIP-seq para modificaciones de histonas, RNA-seq y ChromRNA-seq. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 93 Para la identificación sistemática de enhancers en las condiciones de ensayo, primero se determinó la accesibilidad de la cromatina mediante ATAC-seq (del inglés, Assay for Transposase-Accessible Chromatin) (Buenrostro et al., 2013). Esta técnica permite la identificación de regiones accesibles de la cromatina mediante el tratamiento de los núcleos con la transposasa del elemento Tn5 que corta de forma preferencial el ADN no unido a histonas u otros factores de la cromatina, e incorpora a los fragmentos cebadores de ADN que incluyen un “código de barras”, permitiendo que estos fragmentos pueden ser posteriormente amplificados mediante PCR y secuenciados mediante NGS, determinando así las regiones de la cromatina que presentan una mayor accesibilidad. Analizando estos datos para las condiciones vehículo, TGFβ2h y TGFβ12h se identificaron 52626, 100459 y 105334 picos, respectivamente, con una tasa de descubrimiento irreproducible menor de 0.05 (IDR < 0.05) para dos réplicas biológicas independientes. En la Figura R2 puede observarse la correlación entre los datos de ATAC-seq empleados en la identificación de los picos, siendo esta correlación siempre mayor entre las réplicas biológicas que entre distintas condiciones de tratamiento. Figura R2. Correlación entre los datos de ATAC-seq. Se representa el coeficiente de Pearson para todas las comparaciones entre los datos de ATAC-seq de dos réplicas biológicas independientes de las 3 condiciones de estudio. El coeficiente de Pearson se representa en diagrama de colores, en el intervalo 0.8 ≤ rxy ≤ 1.0. Estos repertorios de picos se refinaron, uniendo todos aquellos picos que se encontraron a una distancia menor de 1000 pb. Además, se creó un repertorio único de picos juntando los identificados para las 3 condiciones de ensayo, obteniendo 39432 regiones de cromatina abierta. En este trabajo denominaremos enhancers a todas aquellas regiones de cromatina abierta, determinadas por ATAC-seq, que no correspondan con la región promotora de ningún transcrito previamente anotado. Se utilizó como región Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 94 promotora la región de 500 pb, aguas arriba y abajo, del sitio de inicio de transcripción (TSS) de cualquier transcrito. Así, se identificaron 10362 regiones de cromatina abierta que coincidieron con la región promotora de transcritos previamente anotados, y 29071 regiones que fueron consideradas enhancers (ANEXO INFORMÁTICO 1). Para más información sobre cómo se llevó a cabo el tratamiento de los datos de ATAC-seq para la identificación de enhancers ver Materiales y Métodos. 1.1. TGFβ provoca una apertura generalizada de la cromatina Cómo se ha mencionado arriba, en las condiciones vehículo, TGFβ2h y TGFβ12h se identificaron por ATAC-seq 52626, 100459 y 105334 picos, respectivamente. Esto sugirió que el tratamiento con TGFβ incrementaba el número de regiones de cromatina abierta, por lo que se profundizó en la caracterización de este evento. En la Figura R3 puede observarse cómo el tratamiento con TGFβ no sólo aumentó el número de regiones de cromatina abierta, sino que, además, la señal de ATAC-seq, cuantificada en cuanto al número de lecturas de secuenciación que alinearon en una región específica, aumentó en las dos condiciones de TGFβ con respecto a la condición vehículo. Dado que el número de lecturas fue similar en las tres condiciones de ensayo Tabla M.9. un aumento en el número de lecturas en picos de ATAC-seq conllevó una disminución de lecturas no asociadas a picos de ATAC-seq (denominadas Resto). Figura R3. Cambio en la señal de ATAC-seq en distintas regiones del genoma. Se representa el cambio de la señal de ATAC-seq (log2FC) para las comparaciones TGFβ2h versus vehículo (izquierda) y TGFβ12h versus vehículo (derecha) para distintos repertorios de regiones: TSS (todas las regiones de cromatina abierta identificadas en las condiciones de ensayo, que coinciden con la región TSS ± 500 pb para todos los transcritos anotados en UCSC KnownGene mm9; 10362 regiones), Enhancers (todas las regiones de cromatina abierta identificadas en las condiciones de ensayo, excluyendo el repertorio de regiones anteriores; 29071 regiones) y Resto (todas las regiones del genoma excluyendo los dos repertorios de regiones anteriores). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 95 Para confirmar este incremento general en la accesibilidad de la cromatina mediante un método diferente al ATAC-seq e independiente de la transposasa de Tn5, se decidió realizar un experimento de DNasaI-seq en las condiciones vehículo y TGFβ2h. Para ello, los núcleos se trataron con DNAsaI, capaz de cortar de forma preferencial el ADN no unido a histonas u otros factores de la cromatina. Tras una digestión parcial se seleccionaron los fragmentos pequeños de cromatina (50-300 pb), que corresponden a regiones abiertas de la cromatina en las que la DNAsaI ha cortado con alta frecuencia y se secuenciaron mediante NGS. En la Figura R4a puede observarse el análisis comparativo entre los picos identificados mediante DNasaI-seq y ATAC-seq. Se identificaron 23672 picos de DNasaI-seq en las condiciones de estudio, vehículo y TGFβ2h, de los cuales el 88.3% coincidieron con los identificados mediante ATAC-seq. Además, el 76.8% de los picos de DNasaI-seq comunes con ATAC-seq incrementaron su señal (log2FC > 0) tras dos horas de tratamiento con TGFβ. Figura R4. Comparación de los datos de ATAC-seq y DNAsaI-seq tras 2 horas de tratamiento con TGFβ. a Diagrama de Venn representando la coincidencia de regiones de cromatina abierta identificadas mediante DNasaI-seq y ATAC-seq. b Diagrama de puntos dónde Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 96 se representa el cambio, log2FC, de las señales de ATAC-seq y DNAsaI-seq para la comparación TGFβ2h versus vehículo de las 20908 regiones comunes de los dos experimentos. Se incluye el coeficiente de Pearson y la recta de ajuste lineal de la correlación. c Diagrama de puntos dónde se representa para todos los picos identificados mediante DNasaI-seq (23672) el cambio de la señal de DNasaI-seq en la comparación TGFβ2h versus vehículo (en log2FC), frente a la media de la señal de DNAsaI-seq para ambas condiciones (en CPM). Se representan en distintos colores los picos identificados exclusivamente mediante DNasaI-seq (2764, verde) y aquellos que coinciden con los picos identificados por ATAC-seq (20908, azul). d Diagrama de cajas y bigotes representando la distribución del cambio de señal, log2FC, para los datos de DNAsaI-seq de la comparación TGFβ2h versus vehículo (izquierda) y la media de la señal de DNAsaI-seq para ambas condiciones (en CPM) en los picos identificados exclusivamente en DNAsaI-seq y aquellos que coincidieron con los picos identificados por ATAC-seq. La significancia estadística indicada entre las muestras fue determinada utilizando la prueba no paramétrica de Mann- Whitney: ***p ≤ 0.001. También se observó, una fuerte correlación entre los incrementos de accesibilidad a las 2 horas de tratamiento con TGFβ en las regiones determinadas por ATAC-seq y DNAsaI-seq (Figura R4b). Por otro lado, se encontró que tanto la señal de DNAsaI-seq como el cambio de señal en los picos identificados exclusivamente por esta técnica fueron más bajos que las de los picos identificados con ambas técnicas (Figura R4 c,d), sugiriendo que pueden existir diferencias en la detección de regiones abiertas a través de distintas técnicas. Por lo tanto, la apertura generalizada de la cromatina observada mediante ATAC-seq fue corroborada mediante DNasaI-seq, demostrando que este fenómeno es detectable a través dos técnicas independientes de determinación de la accesibilidad de la cromatina. Tras esto, se estudió si la apertura generalizada de la cromatina inducida por TGFβ podría ser detectada también mediante técnicas de microscopía utilizando la técnica ATAC-see. Esta técnica es una variante de ATAC-seq, en la cual se emplea una transposasa asociada a cebadores que contienen el fluoróforo ATTO590, que son insertados de forma preferente en regiones de cromatina abierta. Así, ATAC-see permite la visualización de las regiones accesibles de la cromatina a nivel de célula única utilizando microscopía confocal y de fluorescencia (X. Chen et al., 2016). En primer lugar, se confirmó la apertura generalizada de la cromatina promovida por TGFβ tras 2 horas de tratamiento. En la Figura R5a puede observarse que la señal ATAC-see, determinada a través de la intensidad de fluorescencia del fluoróforo ATTO590 mediante microscopía confocal en 3 dimensiones, fue visible como un fondo general en el núcleo y también como puntos concretos de mayor intensidad de señal. La intensidad de esta señal se incrementó de forma general con el tratamiento con TGFβ (Figura R5a). Todos los experimentos de ATAC-see incluyeron un control negativo del experimento, en el cuál la mezcla de reacción de transposición contenía EDTA que inhibe la actividad de la transposasa. Para analizar más en profundidad estas imágenes, se utilizó el programa TANGO (Ollion et al., 2013) que permite el análisis de alto rendimiento de imágenes Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 103 Figura R9. Análisis de la apertura de la cromatina en distintas condiciones de cultivo. a Cuantificación de la señal de ATAC-see en los núcleos de células tratadas con TGFβ o vehículo durante 10 minutos o 2 horas, previamente mantenidas en ausencia de suero (izquierda, 6h privación de suero) o no (derecha, medio completo). b Diagrama de Venn representando la coincidencia de regiones de cromatina abierta identificadas mediante ATAC-seq en células tratadas con TGFβ o vehículo durante 2 horas, previamente mantenidas o no en ausencia de suero durante 6 horas. c Diagrama de puntos dónde se representa el cambio, log2FC, de la señal de ATAC-seq para la comparación TGFβ2h versus vehículo de las 21443 regiones comunes identificadas en los experimentos dónde las células fueron mantenidas o no en ausencia de suero durante 6 horas. Se incluye el coeficiente de Pearson y la recta de ajuste lineal de la correlación. d Diagrama de cajas y bigotes representando la distribución del cambio, log2FC, de la señal de ATAC-seq para la comparación TGFβ2h versus vehículo, en los experimentos dónde las células fueron mantenidas o no en ausencia de suero, en las regiones identificadas exclusivamente en el experimento dónde las células se mantuvieron en ausencia de suero (7777 regiones), las identificadas exclusivamente en el experimento dónde las células no se mantuvieron en ausencia de suero (8145 regiones) y las regiones comunes de los dos experimentos (21443 regiones). Todas las regiones utilizadas en b-d fueron previamente filtradas, utilizándose sólo aquellas que no coincidieron con la región TSS ± 500 pb de cualquier transcrito anotado en UCSC KnownGene mm9. E Cuantificación de la señal de ATAC-see en los núcleos de células tratadas con TGFβ o vehículo durante 10 minutos o 2 horas, previamente mantenidas en ausencia de suero durante 24 horas (izquierda) o 48 horas (derecha). Se incluyó un control negativo sin reacción de transposición (+EDTA). La significancia estadística indicada entre las muestras fue determinada utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney: **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001. Así, se estudió si tiempos mayores de privación de suero podrían hacer que este efecto fuese incluso más drástico. Se analizó la apertura de la cromatina mediante ATAC-see en células NMuMG cultivadas en ausencia de suero durante 24 y 48 horas, antes de ser tratadas con TGFβ durante 10 minutos. Si bien en estas condiciones también se observó una apertura generalizada de la cromatina (Figura R9d), no se puede concluir que este efecto fuese más drástico que utilizando sólo 6 horas de privación de suero, sugiriendo que este tiempo es suficiente para bloquear la activación basal de las rutas de señalización por ligandos presentes en el suero, cómo así sugiere también la activación de ERK (Figura R6c). Todo esto indica que la apertura generalizada de la cromatina inducida por TGFβ puede ocurrir en condiciones normales de cultivo, y en distintas condiciones de ausencia de suero, sugiriendo así que TGFβ es capaz de llevar a cabo este proceso por sí mismo, independientemente de las rutas de señalización con activación basal con las que pueda coexistir en condiciones normales de cultivo. 1.1.6. Identificación de los factores de transcripción implicados en la apertura generalizada de los enhancers inducida por TGFβ Tras caracterizar en más detalle esta apertura de la cromatina, con el estudio de la cinética de apertura y la identificación de las posibles rutas de transducción implicadas en ella, y comprobar que este fenómeno puede ocurrir en diferentes condiciones de cultivo y contextos celulares, se procedió a analizar en más profundidad este fenómeno de apertura centrándose exclusivamente en la apertura de los enhancers. Para ello, se Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 104 realizó también un experimento de ATAC-seq en la línea celular NMuMG tras 10 minutos de tratamiento con TGFβ, previamente mantenidas durante 6 horas en ausencia de suero, ya que se había observado por ATAC-see que la apertura de la cromatina ocurre a partir de este momento (Figura R6a, b). En primer lugar, se clasificaron los enhancers en cuatro categorías según el incremento de accesibilidad tras 2 horas de tratamiento con TGFβ (Figura R10a). El tratamiento con TGFβ incrementó la accesibilidad (FC > 1.5) en el 75% y 79.6% de los enhancers a las 2 y 12 horas de tratamiento, respectivamente. Este efecto fue incluso mayor a los 10 minutos de tratamiento con TGFβ, observándose un incremento de la accesibilidad con un FC > 1.5 en el 88.67% de los enhancers identificados en estas condiciones (Figura R10b), confirmándose así lo observado en la cinética de ATAC-see para la apertura de la cromatina en general. Además, se detectó un incremento proporcional en la accesibilidad de los enhancers al comparar los experimentos de ATAC-seq y de DNasaI- seq realizado previamente (Figura R10c). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 105 Figura R10. Clasificación de los enhancers identificados por ATAC-seq en función de su incremento de accesibilidad. a, b Mapas de calor mostrando los alineamientos de las lecturas de ATAC-seq de las condiciones vehículo, TGFβ2h y TGFβ12h (a) o vehículo y TGFβ10m en los picos de ATAC-seq no coincidentes con los TSS, identificados independientemente para cada experimento (29071 (a) y 17111 (b)) y clasificados según el incremento de accesibilidad (FC < 1.5, 1.5 ≤ FC < 2, 2 ≤ FC < 4, FC ≥ 4) para las comparaciones TGFβ2h versus vehículo (a) o TGFβ10m versus vehículo (b). Las filas fueron ordenadas para cada grupo de regiones en orden decreciente de la señal ATAC-seq en los datos de TGFβ2h (a) o de TGFβ10m (b). Las regiones se representaron de forma: cumbre del pico ATAC-seq ± 500 pb en la parte central, e incrementando 1000 pb por cada lado. También se incluye en la parte superior de los mapas de calor una gráfica de densidad de lecturas de ATAC-seq en los 4 grupos de regiones de forma: FC < 1.5 en negro, 1.5 ≤ FC < 2 en verde, 2 ≤ FC < 4 en azul y FC ≥ 4 en rojo. c Gráfica de densidad de lecturas de DNAsaI-seq para los datos de las células tratadas con vehículo o TGFβ durante 2 horas en los 4 grupos de regiones utilizados en (a). Tras realizar esta clasificación, se estudió qué factores de transcripción (TFs) podrían estar mediando esta apertura generalizada de los enhancers mediante un análisis de footprinting genómico utilizando los datos de ATAC-seq. El análisis de footprinting permite detectar la ocupación de TFs con una alta resolución, gracias a la capacidad de éstos factores de crear un obstáculo estérico a los cortes realizados por la transposasa del elemento Tn5 en la cromatina. En primer lugar, se observó que los footprints de AP- 1 estaban enriquecidos en la mayor parte de los enhancers (Figura 11) a los tres tiempos de tratamiento con TGFβ, 10 minutos, 2 y 12 horas, estando especialmente enriquecidos en los tiempos más tardíos de tratamiento. AP-1 son factores de transcripción compuestos por dímeros pertenecientes a las subfamilias JUN, FOS, ATF, MAF y CREB, los cuales desempeñan funciones importantes en diferenciación, apoptosis y proliferación (Shaulian & Karin, 2002). En este análisis, los footprints de los TFs de AP-1, SMAD4 y SMAD3 estuvieron enriquecidos de forma diferencial en las categorías de enhancers que mostraron un mayor cambio de accesibilidad (FC ≥ 4) en las muestras tratadas con TGFβ durante 2 y 12 horas, pero no en las tratadas durante 10 minutos (Figura R11, Figura R12a, b). En relación a estos resultados, se demostró que los factores de AP-1, Jun y Fos, aumentaron sus niveles tras 2 horas de tratamiento con TGFβ, tanto a nivel de proteína (Figura R12c) como a nivel de ARNm (Figura R12d). A nivel de ARNm, no sólo Jun y Fos, sino que otros factores AP-1, como JunB, JunD, Fosl1, Fosl2, Jdpd2 y ATF3, aumentaron sus niveles de ARNm tras 2 y 12 horas de tratamiento con TGFβ. Además, los footprints para SMAD presentaron un enriquecimiento negativo (subrepresentados) en la categoría de menor incremento de accesibilidad (FC < 1.5) a las 2 y 12 horas de tratamiento con TGFβ (Figura R11a). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 106 Figura R11. Enriquecimiento de footprints en las distintas categorías de enhancers clasificados según su incremento de accesibilidad. a Ocupación de los factores de transcripción dependiendo de los cambios de accesibilidad en los tiempos indicados. Panel izquierdo: distribución de puntos representando los cambios de la señal de ATAC-seq (log2FC) en los tiempos indicados, siempre en comparación con el vehículo, en el eje y, frente a la media de accesibilidad (log2CPM) en el eje x; para todos los enhancers identificados en los distintos experimentos (17111 para TGFβ10m, 29071 para TGFβ2h y TGFβ12h) clasificados en 4 grupos según el incremento de accesibilidad: FC ≥ 4 (rojo intenso), 2 ≤ FC < 4 (rojo claro), 1.5 ≤ FC < 2 (gris claro), FC < 1.5 (gris oscuro). Panel derecho: mapa de calor con los valores de enriquecimiento de los footprints de los factores de transcripción en las distintas categorías de incremento de accesibilidad (orden decreciente hacia abajo) obtenidos al comparar con regiones aleatorias. Los footprints de los factores de transcripción se determinaron calculando la protección de la transposición observada en los datos de ATAC-seq. Se identificaron los motivos de los distintos factores de transcripción (obtenidos de la base de datos JASPAR) en las regiones encontradas en el análisis de footprinting. Se muestran sólo los valores de enriquecimiento para 70/550 factores de transcripción analizados. Los valores de enriquecimiento representados oscilan entre: 0 ≤ enr < 1 (enriquecimiento negativo, en tonos de azul), enr = 1 (en blanco), 1 < enr ≤ 40 (enriquecimiento positivo, en tonos de rojo); dónde enr indica el valor de enriquecimiento. Las barras horizontales de colores indican: footprints de la famila ETS (barra violeta), footprints Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 107 de factores enriquecidos en la categoría FC < 1.5 en la comparación TGFβ2h versus vehículo (barra turquesa) y footprints enriquecidos en la categoría FC ≥ 4 en la comparación TGFβ2h versus vehículo (barra naranja). b P-valores obtenidos mediante la prueba exacta de Fischer (de una cola) del enriquecimiento de la familia de footprints indicados en las categorías de enhancers clasificados según el incremento de accesibilidad a las 2 horas de tratamiento con TGFβ (panel superior) o a los 10 minutos de tratamiento (panel inferior), en comparación con regiones aleatorias. Estos resultados fueron confirmados utilizando datos de ChIP-seq de Smad2/3 en la línea celular NMuMG tras 1.5 horas de tratamiento con TGFβ publicados recientemente (Itoh et al., 2019). Así, se encontró que las categorías de mayor incremento de accesibilidad (2 ≤ FC < 4 y FC ≥ 4) estaban enriquecidas de manera positiva en enhancers que contenían picos de ChIP-seq para Smad2/3, mientras que las categorías de menor incremento de accesibilidad (FC < 1.5, 1.5 ≤ FC < 2) estaban enriquecidas de manera negativa (subrepresentadas) por este tipo de enhancers (Figura 13a, b). También se observó, un mayor porcentaje de enhancers co-ocupados por Smad2/3 y AP-1 en las categorías de mayor incremento de accesibilidad, en comparación con las de menor cambio (Figura 13c). En este sentido, los enhancers que estaban co-ocupados por Smad2/3 y AP-1 mostraron un 25% de mayor accesibilidad promedio que los enhancers que estaban ocupados por sólo uno de estos factores (Figura 13d). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 108 Figura R12. Enriquecimiento diferencial de footprints en las distintas categorías de enhancers clasificados según su incremento de accesibilidad. a Enriquecimiento diferencial de los footprints de distintos factores de transcripción. El enriquecimiento diferencial (log2) se calculó entre las categorías de mayor cambio de accesibilidad (FC ≥ 4) y la de menor cambio (FC < 1.5), para cada uno de los tiempos de tratamiento con TGFβ indicados: 10 minutos (izquierda), 2 horas (centro) y 12 horas (derecha). El eje x muestra el ranking del enriquecimiento diferencial de los factores de transcripción ordenados de menor a mayor enriquecimiento diferencial. Los colores violeta, turquesa y naranja muestran los grupos de factores de transcripción indicados en la Figura R11a. b Ejemplos de footprints de los factores de transcripción identificados en los datos de ATAC-seq tras 2 horas de tratamiento con TGFβ. Se muestra el número de integraciones acumuladas de la transposasa Tn5, obtenidas a partir de los datos de ATAC-seq, a lo largo del sitio de unión del factor de transcripción indicado (centrado en el punto medio del motivo de unión) en los enhancers de la categoría de mayor incremento de accesibilidad (FC ≥ 4, en rojo) y de menor incremento (FC < 1.5, en gris). c Detección mediante western blot de las proteínas Jun, Fos y Tubulina, como control de carga, en las condiciones indicadas: mantenidas en medio completo o tras 6 horas de ausencia de suero, y tratadas con TGFβ o vehículo durante 10 o 120 minutos, tras ser mantenidas en ausencia de suero durante 6 horas. d Mapa de calor indicando los niveles de expresión (log2CPM; calculado utilizando los datos de RNA-seq para las muestras indicadas) para los genes que codifican para los factores de transcripción de la familia AP-1. Por otro lado, se encontró que a los 10 minutos de tratamiento con TGFβ, los footprints de los TFs de la familia ETS (ELK4, ETV, ELF1 y GABPA) estaban enriquecidos de forma diferencial en los enhancers que mostraron un mayor cambio de accesibilidad (Figura R11, Figura R12a). Esto puede sugerir que estos factores podrían estar implicados en la apertura de la cromatina a los 10 minutos de tratamiento con TGFβ, al menos en un subconjunto de enhancers. Además, estos resultados coinciden con la activación de Erk a los 10 minutos de tratamiento (Figura R6c) ya que los TFs de la familia ETS son activados por Erk (Foulds et al., 2004). En este sentido, se observa una activación transitoria de Erk a los 10 minutos que no es mantenida a las 2 horas de tratamiento con TGFβ (figura R6c), al mismo tiempo que los footprints de los TFs de ETS aparecen sólo enriquecidos a los 10 minutos de tratamiento con TGF, y no en tiempos posteriores (Figura R11a). Por último, los enhancers con el menor cambio de accesibilidad (FC < 1.5) a las 2 y 12 horas de tratamiento con TGFβ estuvieron enriquecidos en motivos de unión a CTCF y CTCFL, sugiriendo que estas regiones que apenas cambiaron su accesibilidad podrían tener una función estructural (Figura 11, 12a, b). Sin embargo, este enriquecimiento no se observó tan claramente a los 10 minutos de tratamiento con TGFβ. Así, todos estos datos sugieren que los factores AP-1 y SMAD (especialmente SMAD3/4) podrían estar implicados en la apertura generalizada de los enhancers a las 2 y 12 horas de tratamiento con TGFβ, mientras que los factores ETS podrían tener un papel a los 10 minutos de tratamiento con TGFβ. Todo esto coincide con los apartados anteriores dónde se observó que la apertura generalizada de la cromatina depende de Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 109 las rutas canónica (SMAD) y no canónica (donde se encontrarían factores como ERK, AP-1 y ETS) de TGFβ. A partir de los siguientes apartados nos centraremos únicamente en los cambios que ocurren en la cromatina tras 2 y 12 horas de tratamiento con TGFβ. Figura R13. Relación entre la ocupación de Smad2/3 y AP-1 y el incremento de accesibilidad de enhancers. a Diagrama de Venn representando la coincidencia de los enhancers que presentan unión a Smad2/3 (por ChIP-seq, GSE121254, tras 1.5 horas de tratamiento con TGFβ) y los enhancers clasificados según el incremento de accesibilidad a las 2 horas de tratamiento con TGFβ. Se muestra además los valores de enriquecimiento y el valor de probabilidad calculado utilizando la distribución hipergeométrica. Estos valores aparecen en color azul si el enriquecimiento es negativo, y rojo si es positivo. b Diagrama de barras mostrando el porcentaje de enhancers de cada categoría (según su incremento de accesibilidad a las 2 horas de tratamiento con TGFβ) que contienen al menos un pico de ChIP-seq de Smad2/3. c Diagrama de barras mostrando el porcentaje de enhancers que están unidos a Smad2/3 de cada categoría (según su incremento de accesibilidad a las 2 horas de tratamiento con TGFβ) que contienen al menos un footprint para cualquier factor AP-1. d Gráfica de densidad mostrando la señal de ATAC-seq en el entorno (± 2000 pb) de la cumbre del pico de ATAC-seq de enhancers con al menos un footprint de cualquier factor AP-1 (izquierda), enhancers con al menos un pico de ChIP- seq de Smad2/3 (centro) y enhancers que cumplan los dos criterios anteriores (derecha). Se representan los datos de ATAC-seq de las muestras vehículo (verde), TGFβ2h (naranja) y TGFβ12h (violeta) de dos réplicas biológicas juntas. Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 110 1.2. Identificación y caracterización de los enhancers regulados por TGFβ Tras haber caracterizado la apertura generalizada de la cromatina en general, y la apertura generalizada de los enhancers en particular, se procedió a catalogar y caracterizar el repertorio de enhancers en la línea celular NMuMG, con especial atención en aquellos que son regulados por TGFβ en las condiciones de ensayo. Los enhancers pueden ser clasificados en función de las modificaciones de histonas que presentan (Heinz et al., 2015; Shlyueva et al., 2014). Así, los enhancers activos contienen H3K27ac, H3K4me1 (Heintzman et al., 2007, 2009; Rada-Iglesias et al., 2011) y pol II unida, pudiendo sintetizar ARNs denominados eRNAs (Kim et al., 2010). Los enhancers primed, aquellos que se encuentran en un estado pre-activo de forma estable, se caracterizan por contener únicamente la marca H3K4me1. Por último, los enhancers latent o latentes son regiones del genoma que carecen de marcas de histonas asociadas a enhancers pero que pueden adquirirlas tras inducción por las rutas de señalización celulares (Ostuni et al., 2013). Para clasificar los 29071 enhancers identificados anteriormente, se determinó por ChIP-seq la ocupación a lo largo del genoma de las marcas H3K27ac, H3K4me1 y H3K4me3. Ésta última es una marca típica de promotores activos pero que también puede encontrarse en enhancers, especialmente en aquellos con actividad transcripcional (K. Chen et al., 2015; Russ et al., 2017). También se secuenciaron los ARNs asociados a la cromatina utilizando la técnica ChromRNA-seq para la cuantificación de eRNAs (Bhatt et al., 2012; Kim & Shiekhattar, 2015). Estos eRNAs son ARNs pequeños, que en general se expresan a niveles bajos y son muy inestables, por lo que esta técnica permite la secuenciación de la fracción de ARNs nacientes, la cual se ha descrito que está enriquecida en estos eRNAs. Tanto los experimentos, tanto de ChIP-seq como de ChromRNA-seq se realizaron en las condiciones indicadas en la Figura R1. Así, se cuantificaron las marcas de H3K27ac y H3K4me1, utilizando los datos de ChIP- seq, en el repertorio de 29071 enhancers identificados anteriormente, obtenidos a partir del análisis de los datos de ATAC-seq. Esta cuantificación se llevó a cabo en la condición previa a la estimulación por TGFβ (condición vehículo) la cual podemos considerar como el estado basal de la línea NMuMG. Se identificaron en esta condición 21794 enhancers activos (H3K4me1 + H3K27ac) y 4576 enhancers primed. También se identificaron 2697 enhancers que no contenían ninguna de las marcas mencionadas, probablemente debido que los niveles de las marcas en estas regiones estarían por debajo del umbral utilizado en este análisis (ver Materiales y métodos). A estos enhancers los denominamos indefinidos (ANEXO INFORMÁTICO 1). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 111 Tras clasificar el repertorio de 29071 enhancers en función de su estado de actividad en la condición basal, se realizó un análisis diferencial de la ocupación de la marca H3K27ac para clasificar estos enhancers en función de su cambio de actividad tras el tratamiento con TGFβ, debido a que se ha descrito que el nivel de esta modificación es un marcador excelente para determinar la activación o represión de los enhancers (Malik et al., 2014; Ostuni et al., 2013; B. Zhang et al., 2013). Tras el análisis de la ocupación diferencial de la marca H3K27ac, se clasificaron los enhancers en las siguientes categorías: activación temprana (n = 2166), activación tardía (n = 2242), represión temprana (n = 1059), represión tardía (n = 2654) y TGFβ-independientes (n =20820). También se encontraron enhancers que cambiaron su actividad de manera transitoria, activación transitoria (n = 109) y represión transitoria (n = 21), pero el bajo número de enhancers clasificados en estas categorías no permitían obtener conclusiones significativas estadísticamente, por lo que no se consideraron en los análisis posteriores. También cabe mencionar que los enhancers clasificados como TGFβ-independientes son aquellos en los que no se detectó un cambio de actividad en las condiciones estudiadas (hasta 12 horas tras tratamiento con TGFβ), pudiendo responder también a TGFβ a tiempos posteriores. Así, el tratamiento con TGFβ alteró las marcas epigenéticas del 28% (8251) de los enhancers identificados en las condiciones de estudio. Del total de enhancers activados por TGFβ, el 2.3% de ellos (102) eran latentes en la condición basal (no presentaron las marcas H3K4me1 y H3K27ac, pero las adquirieron con el tratamiento con TGFβ), el 10.5% eran enhancers primed (presentaban la marca H3K4me1 y adquirieron la marca H3K27ac tras el tratamiento con TGFβ) y el 87.2% de los enhancers eran activos (presentaban las dos marcas, pero aumentaron los niveles de H3K27ac con el tratamiento con TGFβ). Como era de esperar, el 100% de los enhancers reprimidos por TGFβ eran activos antes del tratamiento. El ANEXO INFORMÁTICO 1 contiene información del estado de todos los enhancers identificados antes y después del tratamiento con TGFβ. A continuación, se realizó un análisis de la dinámica de la ocupación de las marcas de histonas estudias en este trabajo (H3K27ac, H3K4me1 y H3K4me3) para los enhancers clasificados en las 5 categorías según su cambio de actividad tras el tratamiento con TGFβ en las condiciones de estudio (Figura R14). En general se observó que la dinámica de las marcas H3K4me1 y H3K4me3 siguió un patrón similar a la marca H3K27ac, si bien los cambios fueron más pequeños y retrasados en el tiempo. Por ejemplo, en los enhancers de represión temprana los niveles de H3K4me1 disminuyó (log2FC ≤ -1) solamente en el 1.5% de los enhancers a las 2 horas de tratamiento con TGFβ, mientras que a las 12 horas lo hizo el 70% de los enhancers, indicando que el Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 RESULTADOS 112 “desmantelamiento” de los enhancers sigue a la represión de éstos (medida en cuanto a la bajada de la señal H3K27ac) con una cinética más lenta (Figura R14). También puede observarse cómo la marca H3K4me1 está presente en los enhancers en niveles superiores a la marca H3K4me3 (Figura R14A). Código seguro de Verificación : GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766 24/11/2020 08:22:07 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000060290 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-fef9-9c96-33c7-447d-8bab-e3cf-d5eb-6766