Estudio del papel de CSPa/DNAJC5 en la función y mantenimiento de las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo en ratones adultos
Abstract
La cochaperona sináptica Cysteine String Protein CSP /DNAJC5) se ha implicado en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas como la lipofuscinosis neuronal ceroidea autosómica dominante del adulto (enfermedad de Kufs/CLN4) y las enfermedades de Parkinson y Alzheimer. Se ha demostrado que la proteína CSP /DNAJC5 actúa como cochaperona para mantener la estabilidad de la proteína SNARE SNAP25. Esta cochaperona es esencial para el mantenimiento de sinapsis que operan en un régimen de alta actividad, pero los mecanismos moleculares de su acción protectora no están aún bien establecidos. Por otro lado, el funcionamiento de las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo que operan a baja actividad es crucial en los fenómenos de aprendizaje y memoria y en las alteraciones cognitivas asociadas a la neurodegeneración, no obstante, el papel que la CSP /DNAJC5 juega en estas sinapsis es desconocido. En esta tesis doctoral se han empleado ratones knockout (KO) convencionales carentes de CSP /DNAJC5 (ratones Dnajc5 KO) y se han generado y validado nuevos ratones KO condicionales inducibles por tamoxifeno (TMX) carentes de CSP /DNAJC5 (ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ ) y carentes de la proteína SNARE SNAP25 (CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox) específicamente en neuronas glutamatérgicas del prosencéfalo para el estudio de las sinapsis glutamatérgicas que forman las neuronas hipocampales. En los ratones Dnajc5 KO, la liberación de glutamato evocada por potenciales de acción, la plasticidad a corto plazo, así como la frecuencia de liberación espontánea no presentaron mayores alteraciones en las sinapsis entre las colaterales de Schaffer y las neuronas piramidales de la región CA1 (sinapsis SC CA1). No obstante, la amplitud de las corrientes miniaturas (mEPSCs) resultó estar disminuida, lo que podría deberse a plasticidad homeostática secundaria a un déficit en la transmisión GABAérgica. Curiosamente, en estos ratones, se observó una disminución de los niveles de la proteína SNARE SNAP25 solamente en las sinapsis SC CA1 pero no en las sinapsis formadas entre fibras musgosas de las células granulares y las MF CA3. La investigación de mecanismos autónomo celulares de la cochaperona CSP /DNAJC5 en las sinapsis glutamatérgicas se llevó a cabo en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ que resultaron ser viables, sin presentar fenotipos neurológicos ni conductuales evidentes a edades tempranas, pero que experimentaron un mayor deterioro y mortalidad que los ratones controles a partir de los 12 meses de edad (10 meses post TMX). La liberación de glutamato evocada por potenciales de acción y la plasticidad a corto plazo resultó ser prácticamente normal en las sinapsis SC A1 en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ pero la frecuencia de liberación espontánea y la carga de las corrientes miniaturas (mEPSCs) aparecieron aumentadas. Este fenotipo no se pudo explicar por un cambio estructural en la morfología o en el número de las espinas dendríticas que resultaron ser normales. Curiosamente, se ha descrito un fenotipo similar inducido por la mutación L50S en SNAP25 que causa encefalopatía epiléptica infantil en humanos. Por otro lado, la liberación espontánea de glutamato en las sinapsis MF CA3 resultó ser normal en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ . Análogamente a lo observado en los ratones Dnajc5 KO, en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ los niveles de la proteína SNARE SNAP25 aparecieron disminuidos en las sinapsis SC CA1 siendo normales en las sinapsis MF CA3. Esto indica que la cochaperona CSP /DNAJC5 es esencial para mantener, mediante un mecanismo postraduccional y autónomo celular, los niveles de SNAP25 en la sinapsis SC CA1 pero no en la sinapsis MF CA3. Las diferencias en la proteostasis de SNAP25 entre las sinapsis SC CA1 y MF CA3 podrían explicar las diferencias en el patrón de liberación espontánea de glutamato entre ambas sinapsis en ausencia de CSP /DNAJC5. Con objeto de investigar el papel de SNAP25 en los fenotipos observados, se estudiaron los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox que presentaron un fenotipo de letalidad temprana a las dos semanas de administrar dieta con tamoxifeno. En las sinapsis SC CA1 de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox, la frecuencia de liberación espontánea de glutamato resultó estar disminuida y el tiempo de subida y el decaimiento de las corrientes miniaturas mEPSCs aparecieron enlentecidos. Estos fenotipos podrían deberse a defectos en la formación del complejo SNARE y en la cinética de apertura del poro de fusión. Sorprendentemente, en estas mismas sinapsis la liberación de glutamato evocada por potenciales de acción aumentó. Este fenotipo inesperado podría deberse a la participación compensatoria de otra proteína de la familia de SNAP25 y a una mayor apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje, ya que se ha descrito previamente que SNAP25 bloquea este tipo de canales. En cualquier caso, el fenotipo en la liberación de glutamato observado en las sinapsis SC CA1 de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ no puede explicarse por una mera disminución en los niveles de SNAP25 en esas sinapsis, pero podría deberse a la existencia de especies de SNAP25 con una conformación mal plegada y aberrante por la falta de la actividad de la cochaperona CSP /DNAJC5, ejerciendo un efecto patológico análogo al observado en la mutación L50S en SNAP25 que causa encefalopatía epiléptica infantil en humanos. Las observaciones realizadas en esta tesis indican que las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo son más resilientes a la falta de CSP /DNAJC5 que otras sinapsis centrales como el cáliz de Held o las sinapsis GABAérgicas que expresan parvalbúmina y que operan bajo un régimen de mayor actividad. No obstante, el aumento de la mortalidad a edades avanzadas de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ pone de manifiesto un posible papel protector de CSP /DNAJC5 durante el envejecimiento necesario también para el mantenimiento de sinapsis que operan en régimen de baja actividad. Nuestras observaciones abren nuevas perspectivas en los mecanismos por los que las sinapsis mantienen su integridad funcional a lo largo de toda la vida. Por otro lado, hemos observado que las neuronas piramidales de la región CA3 de ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ a los 8, 16 y 22 meses después de finalizar la administración de dieta con tamoxifeno, no presentan la lipofuscinosis característica de la lipofuscinosis neuronal ceroidea autosómica dominante del adulto. Esto indica que la falta de función de CSP /DNAJC5 no causa la lipofuscinosis patológica propia de esta enfermedad humana, respondiendo a una pregunta hasta ahora abierta en el campo de la fisiopatología molecular de las lipofuscinosis.
Full text
InstitutodeBiomedicinadeSevilla, (IBiS,HospitalUniversitarioVirgendelRocío/CSIC/UniversidaddeSevilla), DepartamentodeFisiologíaMédicayBiofísicadelaFacultaddeMedicina delaUniversidaddeSevillayCIBERNED,ISCIII EstudiodelpapeldeCSPα/DNAJC5 enlafunciónymantenimientodelassinapsis glutamatérgicasdelhipocampo enratonesadultos CristinaMesaCruz Directores: Dr.RafaelFernándezChacón Dr.JoséLuisNietoGonzález TesisDoctoral Sevilla,2023
Agradecimientos Larealizacióndeestatesisdoctoralhasidoposiblegraciasala financiacióndelaAgenciaEstataldeInvestigación(AEI)(BES‐2017‐082324, BFU2016‐76050‐P,PID2019‐105530GB‐I00/AEI/10.13039/501100011033), elInstitutodeSaludCarlosIII(CIBERNED),laConsejeríadeSaludyConsumo delaJuntadeAndalucía(RH‐0064‐2021),laConsejeríadeUniversidad, InvestigacióneInnovacióndelaJuntadeAndalucía(P18‐FR‐2144,US‐ 1381657)yelFondoEuropeodeDesarrolloRegional(FEDER).
I ÍNDICE ÍNDICE.............................................................................................................................................I ÍNDICEDETABLAS.........................................................................................................................II ÍNDICEDEFIGURAS......................................................................................................................III ABREVIATURAS.............................................................................................................................IV RESUMEN......................................................................................................................................1 INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................7 1.Sinapsisytransmisiónsináptica.............................................................................................8 1.1.Principaleshallazgosenelestudiodelasinapsis...........................................................8 1.2.Sinapsisyvesículasináptica...........................................................................................9 1.2.1.Elciclodelavesículasináptica.............................................................................11 1.2.1.1.CiclodeproteínasSNARE/SMimplicadoenlafusióndemembranas durantelaexocitosissináptica................................................................................12 1.3.Sinaptopatías:trastornosneurológicospordisfunciónsináptica................................15 2.CSP(cysteinestringprotein).................................................................................................15 2.1.Funciónchaperona:complejotriméricoCSPα/Hsc70/SGT..........................................16 2.2.CSPα/DNAJC5yenfermedadesneurodegenerativasenhumanos..............................17 2.3.CSPα/DNAJC5yneurodegeneraciónenmodelosanimales.........................................18 2.4.RelacióndeCSPα/DNAJC5conlaproteínaSNAP25delcomplejoSNARE...................19 2.5.PapeldeCSPα/DNAJC5ensinapsiscondiferentestasasdedisparo...........................20 3.Hipocampo............................................................................................................................21 3.1.Anatomíadelhipocampoderatón...............................................................................22 3.1.1.Hipocampopropio................................................................................................22 3.1.2.Girodentado........................................................................................................24 3.2.Conexionesdelhipocampo..........................................................................................25 3.2.1.Circuitotrisinápticohipocampal..........................................................................25 3.2.2.Aferenciasyeferenciasdelasprincipalesáreasdelhipocampo.........................25 3.3.Transmisiónglutamatérgicaenelhipocampo.............................................................27 3.3.1.Sinapsisexcitadorasenelhipocampo..................................................................28 3.3.1.1.SinapsisSC‐CA1..........................................................................................29 3.3.1.2.SinapsisMF‐CA3.........................................................................................30 OBJETIVOS...................................................................................................................................31 MATERIALESYMÉTODOS............................................................................................................33 1.Ratones.................................................................................................................................34
I 1.1.GeneraciónygenotipadodelalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox...........34 1.2.GeneraciónygenotipadodelalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox..........38 1.3.Tratamientocontamoxifeno........................................................................................40 2.ValidacióngenómicadelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox...........................................40 2.1.ExtraccióndeADN........................................................................................................40 2.2.Reacciónencadenadelapolimerasa..........................................................................42 3.Análisisdesupervivencia......................................................................................................42 4.Curvadepeso.......................................................................................................................43 5.Experimentosdecomportamiento.......................................................................................43 5.1.AnálisisSHIRPA.............................................................................................................43 5.2.Evaluacióndelaactividadlocomotoraymotora.........................................................44 5.2.1.Pruebadecampoabierto.....................................................................................44 5.2.2.Rotarod.................................................................................................................45 5.3.Evaluacióndelamemoria............................................................................................46 5.3.1.Reconocimientodeobjetonuevo........................................................................46 5.3.2.Condicionamientodelmiedocontextual.............................................................47 6.Análisisdeproteínas.............................................................................................................48 6.1.Extraccióndelasmuestras...........................................................................................48 6.2.Diseccióndelhipocampo..............................................................................................49 6.3.Procesadodelasmuestras...........................................................................................49 6.4.Westernblot.................................................................................................................50 6.5.Determinacióndelrangolinealparaladeteccióncuantitativadelwesternblot........52 6.6.Cuantificacióndelosnivelesdeproteína.....................................................................52 7.Inmunohistoquímica.............................................................................................................54 7.1.Perfusiónyobtencióndelasrodajasdecerebro.........................................................54 7.2.Inmunohistoquímicadecampoclaro...........................................................................54 7.3.Inmunofluorescencia....................................................................................................55 7.4.Cuantificacióndelasimágenesdeinmunofluorescencia............................................55 8.HibridacióninsitudeARN....................................................................................................56 8.1.Criopreservaciónyobtencióndeloscortesdecerebro...............................................56 8.2.ProtocolohibridacióninsitumediantelatécnicadeRNAscope®................................57 8.3.CuantificacióndelasimágenesdelahibridacióninsitudeARN.................................58 9.Electrofisiología....................................................................................................................58 9.1.Preparacióndelasrodajasdecerebroenratonesjóvenes.........................................59
I 9.2.Preparacióndelasrodajasdecerebroenratonesadultos..........................................59 9.3.RegistroselectrofisiológicosdelasneuronaspiramidalesdelaCA1yCA3.................60 9.3.1.Corrientespostsinápticasexcitadorasminiatura.................................................61 9.3.2.Estimulacióndepulsopareado............................................................................61 10.Análisisdelasespinasdendríticas......................................................................................62 10.1.Inyecciónintracelulardebiocitinamediantelatécnicadepatch‐clamp...................62 10.2.Reveladodelmarcajeintracelularconbiocitina........................................................62 10.3.Cuantificaciónyclasificacióndelasespinasdendríticas............................................63 11.Microscopíaelectrónicadetransmisión.............................................................................63 12.Análisisestadístico..............................................................................................................64 RESULTADOS...............................................................................................................................65 1.EstudiodelhipocampoenratonesDnajc5knockout...........................................................66 1.1.EstudiodelaexpresiónydistribucióndeCSPα/DNAJC5enelhipocampo.................66 1.2.Análisiselectrofisiológicodelatransmisiónsinápticaglutamatérgicaenelhipocampo deratonesDnajc5KOycontroles..................................................................................71 1.2.1.Estudiodelaliberaciónespontáneadeglutamatomedianteelregistrode corrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs)enlasinapsisSC‐CA1...71 1.2.2.Estudiodelaliberaciónevocadaporpotencialesdeacciónydelaplasticidada cortoplazoenlasinapsisSC‐CA1..............................................................................74 2.GeneraciónycaracterizacióndeunalíneaderatónKOcondicionalparaladelecióngénica temporalmentecontroladadeCSPα/DNAJC5enneuronasglutamatérgicasdelhipocampo .............................................................................................................................................77 2.1.GeneracióndelalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox.................................77 2.2.ValidacióndelalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox...................................77 2.2.1.ActividadCreERT2‐recombinasainducidaportamoxifenoespecíficaenellocus Dnajc5enlalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox......................................77 2.2.2.AnálisisdelosnivelesdeCSPα/DNAJC5enelhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐................................................................................80 2.2.3.DistribuciónyexpresióndeCSPα/DNAJC5endiferentestiposneuronalesdel hipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐...........................................83 2.3.Estudiodelaviabilidad,longevidadyfenotiponeurológicoyconductualdelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.....................................................................................85 2.3.1.Supervivenciaycurvadepesocorporal...............................................................85 2.3.2.Análisisdelfenotiponeurológicoyconductual...................................................88 2.3.2.1.Evaluacióngeneraldelestadodelratón....................................................89 2.3.2.2.Evaluacióndelaactividadlocomotora......................................................89
I 2.3.2.3.Evaluacióndelaactividadmotora.............................................................93 2.3.2.4.Evaluacióndelamemoria..........................................................................95 2.3.2.4.1.Memoriadereconocimientodeunobjetonuevo..............................95 2.3.2.4.2.Memoriadecondicionamientodelmiedocontextual........................98 2.4.Estudiodelassinapsisglutamatérgicasenelhipocampodelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐...................................................................................101 2.4.1.EstudiodelaexpresióndeCSPα/DNAJC5..........................................................101 2.4.2.Análisiselectrofisiológicodelatransmisiónsinápticaglutamatérgicaenel hipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.........................................102 2.4.2.1.AnálisiselectrofisiológicodelasinapsisSC‐CA1delhipocampo.............103 2.4.2.1.1.Estudiodelaliberaciónespontáneadeglutamatomedianteelregistro decorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs).........................103 2.4.2.1.2.Estudiodelaliberaciónevocadaporpotencialesdeacciónydela plasticidadacortoplazo ....................................................................................106 2.4.2.2.AnálisiselectrofisiológicodelasinapsisMF‐CA3delhipocampo............108 2.4.2.2.1.Estudiodelaliberaciónespontáneadeglutamatomedianteelregistro decorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs).........................108 2.4.3.Análisismorfológicodeespinasdendríticasenneuronaspiramidalesdelaregión CA1delhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐...........................113 2.4.4.EstudiodelaexpresiónydistribucióndeSNAP25ensinapsisglutamatérgicasen elhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.....................................118 2.4.4.1.TranscripcióndeSnap25enelhipocampo..............................................125 2.4.4.2.MantenimientoalargoplazodelaproteínaSNAP25..............................128 3.GeneraciónycaracterizacióndeunalíneaderatónKOcondicionalparaladelecióngénica deSNAP25enneuronasglutamatérgicasdelhipocampo................................................133 3.1.GeneracióndelalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox...............................133 3.2.Estudiodelaviabilidad,longevidadyfenotiponeurológicodelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox...............................................................................133 3.3.AnálisisycursotemporaldelosnivelesdeSNAP25enhipocampo,cortezaycerebelo deratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox.............................................................135 3.4.AnálisiselectrofisiológicodelatransmisiónsinápticaglutamatérgicaenlasinapsisSCCA1delhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox.............................141 3.4.1.Estudiodelaliberaciónespontáneadeglutamatomedianteelregistrode corrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs)....................................141 3.4.2.Estudiodelaliberaciónevocadaporpotencialesdeacciónydelaplasticidada cortoplazo...............................................................................................................147 4.EstudiodelpapeldeCSPα/DNAJC5enlainduccióndelipofuscinosisenratonesadultos CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐........................................................................................149
I DISCUSIÓN.................................................................................................................................153 1.ReduccióndelaamplituddelasmEPSCsyescaladosinápticoenlasinapsisSC‐CA1delratón Dnajc5KOsinalteracióndelaliberaciónevocada...........................................................154 2.LaactividadCreERT2‐recombinasaenelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5floxelimina CSPα/DNAJC5específicamenteenlasneuronasglutamatérgicasdelhipocampo...........156 2.1.LosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐adultosjóvenessonviablesy neurológicamentenormales........................................................................................158 2.2.IncrementodelacargayfrecuenciadelasmEPSCsenlasinapsisSC‐CA1delratón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐...................................................................................159 2.2.1.Laliberacióndeglutamatoevocadaporpotencialesdeacciónesnormalenel ratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐....................................................................162 2.2.2.ElratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐nopresentaunmayornúmerodeespinas dendríticasenlasneuronaspiramidalesdelaCA1.................................................163 2.3.LasmEPSCspermaneceninalteradasenlasinapsisMF‐CA3enelratón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐...................................................................................163 2.4.LaausenciadeCSPα/DNAJC5enlosterminalesglutamatérgicosafecta diferencialmentealatransmisiónsinápticaenlassinapsisSC‐CA1yMF‐CA3............164 2.5.DisminucióndeSNAP25enelhipocampoderatonescarentesdeCSPα/DNAJC5(Dnajc5 KOyCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐)..........................................................................165 2.5.1.DiferenteestabilidaddeSNAP25enlosterminalesdelassinapsisSC‐CA1yMFCA3carentesdeCSPα/DNAJC5...............................................................................166 2.5.1.1.LacaídadeSNAP25enlascolateralesdeSchafferenelratón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐sedebeaunaalteraciónpostraduccional.........169 2.6.LaproteínaSNAP25malplegadapodríaalterarlaliberaciónespontánea................170 3.LetalidadyliberaciónsinápticadeglutamatoenratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox ...........................................................................................................................................172 3.1.MortalidadtempranaenratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox.......................172 3.2.Alteracionesenlaliberaciónespontáneadeglutamatoasociadasalaeliminación progresivadeSNAP25..................................................................................................174 3.3.Aumentodelaliberacióndeglutamatoevocadaporpotencialesdeacciónenausencia deSNAP25....................................................................................................................176 4.Ausenciadelipofuscinosispatológicaenlasneuronaspiramidalesderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐envejecidos....................................................................177 CONCLUSIONES.........................................................................................................................179 BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................182
II ÍNDICEDETABLAS Tabla1.Cebadoresutilizadosparaelgenotipadodelosratones..............................................35 Tabla2.CebadoresutilizadosparalavalidacióndelarecombinacióndelaleloDnajc5floxeado. .....................................................................................................................................................42 Tabla3.ProtocoloSHIRPAmodificado.......................................................................................44 Tabla4.Parámetrosanalizadosenlapruebadecampoabierto................................................45 Tabla5.Distribucióndelosobjetosencadafasedelreconocimientodeobjetonuevo...........47 Tabla6.Anticuerposprimarios...................................................................................................51 Tabla7.Anticuerpossecundarios...............................................................................................53 Tabla8.ResumendelosnivelesdeCSPα/DNAJC5ySNAP25enhipocampoderatonesDnajc5 controles,HETyKO.....................................................................................................................66 Tabla9.RatiosdeintensidaddefluorescenciadeCSPα/sinapsinaySNAP25/sinapsinaenel stratumradiatumyelstratumlucidumdelhipocampoderatonesDnajc5controles,HETyKO. .....................................................................................................................................................69 Tabla10.ResumendelaspropiedadesdelasmEPSCsregistradasenlascélulaspiramidalesde laCA1enratonesDnajc5controlesyKO....................................................................................72 Tabla11.Valoresdelasamplitudesindividualesdelacurvadeentrada/salidaylaspendientes queseobtienenenlasinapsisSC‐CA1enlosratonesDnajc5controlesyKO............................74 Tabla12.RatiosdepulsopareadoadiferentesfrecuenciasregistradosenlasinapsisSC‐CA1en ratonesDnajc5controlesyKOaP26‐33.....................................................................................75 Tabla13.Resumendelosnivelesdeproteínaspresinápticasenhipocampodelosratones experimentales............................................................................................................................81 Tabla14.Resumendelosvaloresdepesocorporalenlosratonesmachoexperimentales.....86 Tabla15.Resumendelosvaloresdepesocorporalenlosratoneshembraexperimentales....86 Tabla16.AnálisisneurológicoSHIRPAenratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐a1mespost‐TMX....................................................................89 Tabla17.Resumendelosparámetrosanalizadosenlapruebadecampoabiertorealizadaalos ratonesexperimentales(machosyhembras).............................................................................90 Tabla18.Resumendelosparámetrosanalizadosenlapruebadecampoabiertorealizadaalos ratonesexperimentales(ambossexosjuntos)...........................................................................90 Tabla19.Resumendelosparámetrosanalizadosenlapruebaderotarodrealizadaalosratones experimentales(machosyhembras)..........................................................................................93 Tabla20.Resumendelosparámetrosanalizadosenlapruebaderotarodrealizadaalosratones experimentales(ambossexosjuntos).........................................................................................94 Tabla21.Resumendelosparámetrosanalizadosenlapruebadereconocimientodeobjeto nuevorealizadaalosratonesexperimentales(machosyhembras)..........................................96
II Tabla22.Resumendelosparámetrosanalizadosenlapruebadereconocimientodeobjeto nuevorealizadaalosratonesexperimentales(ambossexos)....................................................96 Tabla23.Porcentajedefreezingqueexperimentanlosratonesexperimentales(machosy hembras)enlapruebadecondicionamientodelmiedocontextual..........................................99 Tabla24.Porcentajedefreezingqueexperimentanlosratonesexperimentales(ambossexos) enlapruebadecondicionamientodelmiedocontextual..........................................................99 Tabla25.ResumendelaspropiedadesdelasmEPSCsregistradasenlascélulaspiramidalesde laCA1enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐35 díaspost‐TMX............................................................................................................................103 Tabla26.Valoresdelasamplitudesydelaspendientesdelascurvasdeentrada/salidaquese obtienentrasestimularlasinapsisSC‐CA1enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos28‐37díaspost‐TMX......................................................106 Tabla27.RatiosdepulsopareadoadiferentesfrecuenciasregistradosenlasinapsisSC‐CA1en ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos28‐37díaspost‐ TMX...........................................................................................................................................107 Tabla28.ResumendelaspropiedadesdelasmEPSCsregistradasenlascélulaspiramidalesde laCA3enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐33 díaspost‐TMX............................................................................................................................109 Tabla29.ResumendelafrecuenciayamplitudpromediodelasmEPSCsde<45pAy>45pA registradasenlascélulaspiramidalesdelaCA3.......................................................................112 Tabla30.NúmerodedendritasapicalesdeneuronasdelaCA1enhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐..........................................114 Tabla31.Valoresdelosparámetrosanalizadosenlasespinasdendríticasdedendritasapicales proximalesdeneuronasdelaCA1enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐................................................................................................116 Tabla32.ResumendelosnivelesdeCSPα/DNAJC5ySNAP25detectadosmediantewesternblot endiferentesregionesdelhipocampodelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐................................................................................................119 Tabla33.RatiosdeintensidaddefluorescenciadeCSPα/tdTomatoySNAP25/tdTomatoenel stratumradiatumyelstratumlucidumdelhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐..........................................123 Tabla34.IntensidaddefluorescenciadelARNmdeSnap25enlascélulaspiramidalesdelaCA3 ylascélulasgranularesdelgirodentadoenelhipocampodelosratonesexperimentales.....126 Tabla35.RatiosdeintensidaddefluorescenciadeCSPα/tdTomatoySNAP25/tdTomatoenel stratumradiatumyelstratumlucidumdelhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesespost‐TMX.131 Tabla36.Resumendelosnivelesdeproteínaspresinápticasenhipocampo,cortezaycerebelo delosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox.............136
IV mmlCapamolecularintermedia;middlemolecularlayer NMDAN‐metil‐D‐aspartato NMDGN‐metil‐D‐glucamina NPY NeuropéptidoY ns Nosignificativo NSFN‐ethylmaleimidesensitivefactor NTNeurotransmisor O‐LM Oriens‐lacunosummoleculare omlCapamolecularexterna;outermolecularlayer pb Paresdebases PB Tampónfosfato;phosphatebuffer PBS Tampónfosfatosalino;phosphatebuffersaline PCR Reacciónencadenadelapolimerasa;polymerasechainreaction PFA Paraformaldehído post‐TMXDespuésderecibirladietacontamoxifeno PP Víaperforante;perforantpathway PTT1 Palmitoiltioesterasa‐1 PV Parvalbúmina RIPARadioimmunoprecipitationassaybuffer rpm Revolucionesporminuto RRP Contingentedevesículaslistasparaliberarse;readyreleaseablepool SC ColateralesdeSchaffer;Schaffercollaterals SCAMPSecretorycarriermembraneprotein SC‐CA1SinapsisentrelascolateralesdeSchafferylascélulaspiramidalesdelaCA1 SDSDodecilsulfatosódico;sodiumdodecylsulfate
IV SDS‐PAGEGeldepoliacrilamidacondodecilsulfatosódico;sodiumdodecylsulfate polyacrylamidegel SEM Errorestándardelamedia;standarderrorofthemean SGT Smallglutamine‐richtetratricopeptiderepeat‐containingprotein sl Stratumlucidum slm Stratumlacunosummoleculare SNAP25Synaptosomal‐associatedprotein25KDa SNAPsSolubleNSF‐attachmentproteins SNARESolubleNSFattachmentproteinreceptors so Stratumoriens sp Stratumpyramidale sr Stratumradiatum SUB Subiculum Syb2 Sinaptobrevina2 Syph2 Sinaptofisina2 Syt1 Sinaptotagmina1 Syt2 Sinaptotagmina2 TA Temporo‐ammonic TBS‐T TampónTrissalinoyTween20 TMX Tamoxifeno TPRRepeticionesdetetratricopéptido TTXTetrodotoxina VAMP Vesicleassociatedmembraneprotein VGCC Voltage‐gatedcalciumchannel
1 RESUMEN LacochaperonasinápticaCysteineStringProteinCSP/DNAJC5)sehaimplicadoenla patogénesisdeenfermedadesneurodegenerativascomolalipofuscinosisneuronalceroidea autosómica‐dominantedeladulto(enfermedaddeKufs/CLN4)ylasenfermedadesdeParkinson yAlzheimer.SehademostradoquelaproteínaCSP/DNAJC5actúacomocochaperonapara mantenerlaestabilidaddelaproteínaSNARESNAP25.Estacochaperonaesesencialparael mantenimientodesinapsisqueoperanenunrégimendealtaactividad,perolosmecanismos molecularesdesuacciónprotectoranoestánaúnbienestablecidos.Porotrolado,el funcionamientodelassinapsisglutamatérgicasdelhipocampoqueoperanabajaactividades crucialenlosfenómenosdeaprendizajeymemoriayenlasalteracionescognitivasasociadasa laneurodegeneración,noobstante,elpapelquelaCSP/DNAJC5juegaenestassinapsises desconocido.Enestatesisdoctoralsehanempleadoratonesknockout(KO)convencionales carentesdeCSP/DNAJC5(ratonesDnajc5KO)ysehangeneradoyvalidadonuevosratonesKO condicionalesinduciblesportamoxifeno(TMX)carentesdeCSP/DNAJC5(ratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐)ycarentesdelaproteínaSNARESNAP25 (CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox)específicamenteenneuronasglutamatérgicasdel prosencéfaloparaelestudiodelassinapsisglutamatérgicasqueformanlasneuronas hipocampales.EnlosratonesDnajc5KO,laliberacióndeglutamatoevocadaporpotencialesde acción,laplasticidadacortoplazo,asícomolafrecuenciadeliberaciónespontáneano presentaronmayoresalteracionesenlassinapsisentrelascolateralesdeSchafferylasneuronas piramidalesdelaregiónCA1(sinapsisSC‐CA1).Noobstante,laamplituddelascorrientes miniaturas(mEPSCs)resultóestardisminuida,loquepodríadeberseaplasticidadhomeostática secundariaaundéficitenlatransmisiónGABAérgica.Curiosamente,enestosratones,se observóunadisminucióndelosnivelesdelaproteínaSNARESNAP25solamenteenlassinapsis SC‐CA1peronoenlassinapsisformadasentrefibrasmusgosasdelascélulasgranularesylas MF‐CA3.Lainvestigacióndemecanismosautónomo‐celularesdelacochaperonaCSP/DNAJC5 enlassinapsisglutamatérgicassellevóacaboenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐que resultaronserviables,sinpresentarfenotiposneurológicosniconductualesevidentesaedades tempranas,peroqueexperimentaronunmayordeterioroymortalidadquelosratones controlesapartirdelos12mesesdeedad(10mesespost‐TMX).Laliberacióndeglutamato evocadaporpotencialesdeacciónylaplasticidadacortoplazoresultóserprácticamente normalenlassinapsisSC‐A1enlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐perolafrecuenciade liberaciónespontáneaylacargadelascorrientesminiaturas(mEPSCs)aparecieronaumentadas. Estefenotiponosepudoexplicarporuncambioestructuralenlamorfologíaoenelnúmerode
2 lasespinasdendríticasqueresultaronsernormales.Curiosamente,sehadescritounfenotipo similarinducidoporlamutaciónL50SenSNAP25quecausaencefalopatíaepilépticainfantilen humanos.Porotrolado,laliberaciónespontáneadeglutamatoenlassinapsisMF‐CA3resultó sernormalenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.Análogamentealoobservadoenlos ratonesDnajc5KO,enlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ losnivelesdelaproteína SNARESNAP25aparecierondisminuidosenlassinapsisSC‐CA1siendonormalesenlassinapsis MF‐CA3.EstoindicaquelacochaperonaCSPα/DNAJC5esesencialparamantener,medianteun mecanismopostraduccionalyautónomo‐celular,losnivelesdeSNAP25enlasinapsisSC‐CA1 peronoenlasinapsisMF‐CA3.LasdiferenciasenlaproteostasisdeSNAP25entrelassinapsis SC‐CA1yMF‐CA3podríanexplicarlasdiferenciasenelpatróndeliberaciónespontáneade glutamatoentreambassinapsisenausenciadeCSP/DNAJC5.Conobjetodeinvestigarelpapel deSNAP25enlosfenotiposobservados,seestudiaronlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxquepresentaronunfenotipodeletalidadtempranaalasdos semanasdeadministrardietacontamoxifeno.EnlassinapsisSC‐CA1delosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox,lafrecuenciadeliberaciónespontáneadeglutamatoresultó estardisminuidayeltiempodesubidayeldecaimientodelascorrientesminiaturasmEPSCs aparecieronenlentecidos.Estosfenotipospodríandeberseadefectosenlaformacióndel complejoSNAREyenlacinéticadeaperturadelporodefusión.Sorprendentemente,enestas mismassinapsislaliberacióndeglutamatoevocadaporpotencialesdeacciónaumentó.Este fenotipoinesperadopodríadebersealaparticipacióncompensatoriadeotraproteínadela familiadeSNAP25yaunamayoraperturadecanalesdeCa2+dependientesdevoltaje,yaque sehadescritopreviamentequeSNAP25bloqueaestetipodecanales.Encualquiercaso,el fenotipoenlaliberacióndeglutamatoobservadoenlassinapsisSC‐CA1delosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐nopuedeexplicarseporunameradisminuciónenlosnivelesde SNAP25enesassinapsis,peropodríadebersealaexistenciadeespeciesdeSNAP25conuna conformaciónmalplegadayaberranteporlafaltadelaactividaddelacochaperona CSPα/DNAJC5,ejerciendounefectopatológicoanálogoalobservadoenlamutaciónL50Sen SNAP25quecausaencefalopatíaepilépticainfantilenhumanos. Lasobservacionesrealizadasenestatesisindicanquelassinapsisglutamatérgicasdel hipocamposonmásresilientesalafaltadeCSP/DNAJC5queotrassinapsiscentralescomoel cálizdeHeldolassinapsisGABAérgicasqueexpresanparvalbúminayqueoperanbajoun régimendemayoractividad.Noobstante,elaumentodelamortalidadaedadesavanzadasde losratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ponedemanifiestounposiblepapelprotectorde CSP/DNAJC5duranteelenvejecimientonecesariotambiénparaelmantenimientodesinapsis
3 queoperanenrégimendebajaactividad.Nuestrasobservacionesabrennuevasperspectivasen losmecanismosporlosquelassinapsismantienensuintegridadfuncionalalolargodetodala vida.Porotrolado,hemosobservadoquelasneuronaspiramidalesdelaregiónCA3deratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8,16y22mesesdespuésdefinalizarlaadministraciónde dietacontamoxifeno,nopresentanlalipofuscinosiscaracterísticadelalipofuscinosisneuronal ceroideaautosómica‐dominantedeladulto.EstoindicaquelafaltadefuncióndeCSP/DNAJC5 nocausalalipofuscinosispatológicapropiadeestaenfermedadhumana,respondiendoauna preguntahastaahoraabiertaenelcampodelafisiopatologíamoleculardelaslipofuscinosis.
4 ABSTRACT ThesynapticcochaperoneCysteineStringProteinα(CSPα/DNAJC5)hasbeenimplicatedin thepathogenesisofneurodegenerativediseasessuchasautosomaldominantadult‐onset neuronalceroidlipofuscinosis(Kufsdisease/CLN4),Parkinson'sdisease,andAlzheimer's disease.IthasbeendemonstratedthatCSPα/DNAJC5actsasacochaperonetomaintainthe stabilityoftheSNAREproteinSNAP25.Thiscochaperoneisessentialforthemaintenanceof synapsesoperatingunderhighactivityconditions,butthemolecularmechanismsofits protectiveactionarenotyetwellestablished.Ontheotherhand,thehippocampal glutamatergicsynapsesoperatingunderlowactivityconditionsplayacrucialroleinlearningand memoryaswellasincognitiveimpairmentsassociatedwithneurodegeneration.However,the roleofCSPα/DNAJC5inthesesynapsesisunknown.Inthisdoctoralthesis,conventional knockout(KO)micelackingCSPα/DNAJC5(Dnja5KOmice)wereused,andnewtamoxifen (TMX)‐inducibleconditionalKOmicelackingCSPα/DNAJC5(CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐)and lackingtheSNAREproteinSNAP25(CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox)specificallyinforebrain glutamatergicneuronsweregeneratedandvalidatedforthestudyofglutamatergicsynapses formedbyhippocampalneurons.InDnajc5KOmice,glutamatereleaseevokedbyaction potentials,short‐termplasticity,andthefrequencyofspontaneousrelease,monitoredatthe synapsesbetweentheSchaffercollateralsandCA1pyramidalneurons(SC‐CA1synapses),did notshowsignificantalterations.However,theamplitudeofminiatureexcitatorypostsynaptic currents(mEPSCs)wasfoundtobereduced,whichcouldbeduetohomeostaticplasticity secondarytoadeficitinGABAergictransmission.Interestingly,adecreaseinSNAP25protein levelswasobservedonlyintheSC‐CA1synapsesbutnotinthesynapsesformedbetweenmossy fibersofgranulecellsandpyramidalneuronsfromtheCA3region(MF‐CA3).Theinvestigation ofautonomouscellularmechanismsofthecochaperoneCSPα/DNAJC5inglutamatergic synapseswascarriedoutinCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐mice,whichwereviableanddidnot showanyevidentneurologicalorbehavioralphenotypesatearlyagesbutexperienced increaseddeteriorationandmortalitycomparedtocontrolmicestartingat12monthsofage (10monthspost‐TMX).Glutamatereleaseevokedbyactionpotentialsandshort‐termplasticity wasfoundtobenearlynormalinSC‐A1synapsesinCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐mice,but spontaneousreleasefrequencyandthechargeofmEPSCsappearedtobeincreased.This phenotypecouldnotbeexplainedbystructuralchangesinthemorphologyornumberof dendriticspines,whichwerefoundtobenormal.Interestingly,asimilarphenotypeinducedby theL50SmutationinSNAP25,whichcausesinfantileepilepticencephalopathyinhumans,has beendescribedinthesemice.Ontheotherhand,spontaneousglutamatereleaseinMF‐CA3
5 synapseswasfoundtobenormalinCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐mice.Similarlytowhatwas observedinDnajc5KOmice,thelevelsoftheSNAREproteinSNAP25werefoundtobe decreasedinSC‐CA1synapsesinCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐mice,whiletheyremained normalinMF‐CA3synapses.ThisindicatesthatthecochaperoneCSPα/DNAJC5isessentialfor maintainingSNAP25levelsinSC‐CA1synapses,butnotinMF‐CA3synapses,througha posttranslationalandcell‐autonomousmechanism.DifferencesinSNAP25proteostasis betweenSC‐CA1andMF‐CA3synapsescouldexplainthedifferencesinspontaneousglutamate releasepatternsbetweenthesesynapsesintheabsenceofCSPα/DNAJC5.Toinvestigatethe roleofSNAP25intheobservedphenotypes,micewithCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxwere studied,andtheyexhibitedearlylethalityphenotypetwoweeksafteradministrationofa tamoxifen‐enricheddiet.InSC‐CA1synapsesofCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxmice,the frequencyofspontaneousglutamatereleasewasdecreased,andtheriseanddecaytimesof miniatureexcitatorypostsynapticcurrents(mEPSCs)weresloweddown.Thesephenotypes couldbeattributedtodefectsintheformationoftheSNAREcomplexandthekineticsoffusion poreopening.Surprisingly,inthesesamesynapses,glutamatereleaseevokedbyaction potentialsincreased.Thisunexpectedphenotypecouldbeduetocompensatoryinvolvementof anotherproteinfromtheSNAP25familyandincreasedopeningofvoltage‐dependentCa2+ channels,sinceithasbeenpreviouslydescribedthatSNAP25blocksthistypeofchannels.Inany case,thephenotypeobservedinglutamatereleaseinSC‐CA1synapsesof CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐micecannotbeexplainedsolelybyadecreaseinSNAP25levels inthosesynapses,butitcouldbeattributedtothepresenceofSNAP25specieswithmisfolded andaberrantconformationduetothelackofCSPα/DNAJC5activity,exertingapathological effectsimilartothatobservedintheL50SmutationinSNAP25,whichcausesinfantileepileptic encephalopathyinhumans. Theobservationsmadeinthisdoctoralthesisindicatethathippocampalglutamatergic synapsesaremoreresilienttothelackofCSPα/DNAJC5comparedtoothercentralsynapses suchasthecalyxofHeldorparvalbumin‐expressingGABAergicsynapses,whichoperateunder ahigheractivityregime.However,theincreasedmortalityatadvancedagesin CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ micehighlightsapossibleprotectiveroleofCSPα/DNAJC5 duringaging,whichwouldbealsonecessaryforthemaintenanceofsynapsesoperatingunder low‐activityconditions.Ourobservationsopennewperspectivesonthemechanismsbywhich synapsesmaintaintheirfunctionalintegritythroughoutlife.Ontheotherhand,wehave observedthatpyramidalneuronsintheCA3regionofCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐miceat8, 16,and22monthsafterthecessationoftamoxifendietadministrationdonotexhibitthe
6 characteristiclipofuscinosisofautosomal‐dominantadultneuronalceroidlipofuscinosis.This indicatesthatthelackofCSPα/DNAJC5functiondoesnotcausethepathologicallipofuscinosis associatedwiththishumandisease,answeringapreviouslyopenquestioninthefieldofthe molecularpathophysiologyoflipofuscinosis.
INTRODUCCIÓN
Introducción 8 1.Sinapsisytransmisiónsináptica 1.1.Principaleshallazgosenelestudiodelasinapsis Elfuncionamientodelsistemanerviosohacautivadointerésenelserhumanodurante siglos.TantoesasíquelaNeurocienciaemergiócomoelconjuntodedisciplinascientíficas enfocadasalesclarecimientodelaestructurayfuncióndelsistemanervioso.Alolargodelos años,numerosasinvestigacioneshanaportadorelevantesavancescientíficosgraciasaloscuales actualmentedisponemosdeunamplioconocimientosobreelsistemanervioso.Noobstante, cabedestacarquemuchasdelasaportacionesquecondujeronalentendimientodeloquehoy conocemoscomosinapsisytransmisiónsináptica,ocurrieronentrefinalesdelsigloXIXy mediadosdelsigloXX. LaintroduccióndelatincióndeGolgidescubiertaporCamilloGolgien1873representóun granavanceparalaNeurociencia.Utilizandoestemétodo,SantiagoRamónyCajalestudióla morfologíadelasneuronasyformulóla“doctrinaneuronal”defendiendoqueelsistema nerviosoestabaformadoporcélulasindependientes,encontrasteconlaanterior“teoría reticular”quedefiníaelsistemanerviosocomounaredcontinuadefibrassinespacioentre ellas.Comoreconocimientoaestosestudios,compartióPremioNobelconGolgien1906. AunqueRamónyCajalyahablódelascélulasindependientesdelsistemanerviosoydelcontacto entreellas,fuevonWaldeyer‐Hartzen1891quienacuñóeltérmino“neurona“alaunidad celulardelsistemanerviosoyCharlesScottSheringtonquiennombró,enlaséptimaediciónde TextbookofPhysiologydeMichaelFosteren1897,coneltérmino“sinapsis”alaconexiónde unacélulanerviosaconotra(Bennett,1999;Cowanetal.,2001;Tansey,1997). Aunqueeltérmino“sinapsis”noseintrodujohasta1897,lahistoriadeloqueahoranos referimoscomotransmisiónsinápticacomenzóafinalesdelsigloXVIIIcuandoLuigiGalvani descubrióquelascélulasmuscularesproducenelectricidadylollamó“electricidadanimal”.Un siglomástarde,en1860WillyKühneyWilhelmKrausedescribieronlaestructuradelaunión neuromuscularysugirieronquelatransmisióndelnervioalmúsculoeraunprocesoeléctrico. Sinembargo,en1877EmilduBois‐Reymond,consideradoelpadredelaelectrofisiologíapor susdescubrimientosdelpotencialdeacciónydelpotencialdeequilibrio,proporcionólaprimera propuestadequelatransmisiónneuromuscularpodríaestarmediadaporlaliberacióndeuna sustanciaquímica.100añosdespués,GeorgePaladeidentificóporprimeravezlas“vesículas sinápticas”mediantemicroscopíaelectrónica(PalayyPalade,1955).Basándoseeneste hallazgo,BernardKatz,trabajandoenlauniónneuromuscular,caracterizóendetalleelproceso detransmisiónsináptica.SegúnKatz,lallegadadeunpotencialdeacciónaunterminalnervioso
Introducción 15 CSPα/DNAJC5(cysteinestringprotein),Hsc70(70kDaheat‐shockcognate)ySGT(small glutamine‐richtetratricopeptiderepeat‐containingprotein)(Tobabenetal.,2001)(Figura3). 1.3.Sinaptopatías:trastornosneurológicospordisfunciónsináptica Variosestudioshandemostradoqueligerasperturbacionesdelafunciónsinápticapueden contribuiratrastornosdelneurodesarrollo(autismo,discapacidadintelectual,epilepsia),así comoaenfermedadesneurodegenerativas(AlzheimeryParkinson)(Luoetal.,2018).Dehecho, seintrodujoelconceptode“sinaptopatías”paraclasificaraquellostrastornosneurológicos causadospormodificacionesengenesquecodificanparaproteínassinápticas(Grant,2012). Posteriormente,sepropusoelconceptode“SNAREopatías”paradefinirlostrastornosque surgendemutacionesquealteranlamaquinariaSNARE/SMfundamentalparalaexocitosisde lasvesículassinápticas(VerhageySørensen,2020).Sehandescritomutacionesheterocigóticas ensinaptobrevina2/VAMP2,SNAP25yMUNC18‐1(codificadoporSTXP1enhumanos)en pacientescontrastornosdelneurodesarrollo,quetienenhipotonía,discapacidadintelectual, epilepsiaycaracterísticasautistascomosíntomascentrales(Michettietal.,2022). Además,enfermedadesneurodegenerativasenhumanossehanrelacionadocondefectos enlaproteínapresinápticaCSPα/DNAJC5(Valenzuela‐Villatoroetal.,2018),comosedescribe endetallemásadelante.Dadasurelevanciaparaelmantenimientodelafunciónsináptica,la cochaperonaCSPα/DNAJC5constituyeeltemaprincipaldeestatesis. 2.CSP(cysteinestringprotein) LasproteínasCSPs(cysteinestringproteins)sedescubrieronporprimeravezenDrosophila melanogasterbasándoseenelusodeunanticuerpomonoclonalespecíficoneuronalquemarcó losterminalesnerviosos.Lasproteínasquereconocíanelanticuerposedistinguieronporla presenciadeunacadenade11residuosdecisteínacontiguosquellevaronaladenominación deestasproteínascomoproteínasdecadenadecisteína(cysteinestringproteins)(Zinsmaieret al.,1990).Pocodespués,seidentificóunhomólogodeCSPsenvertebrados,concretamenteen Torpedocalifornica,enunestudioparaidentificarposiblessubunidadesdeloscanalesdeCa2+ inyectandoARNmantisentidodellóbuloeléctricodeTorpedoenovocitosdeXenopus (GundersenyUmbach,1992).EnestosestudiosademássedemostróqueCSPsestaban localizadasenvesículassinápticas(Mastrogiacomoetal.,1994).Seguidamente,seidentificaron CSPsenmamíferos(CoppolayGundersen,1996;MastrogiacomoyGundersen,1995).Además deexpresarseenmúltiplesespecies,CSPstambiénestánpresentesenunaampliagamadetipos devesículassecretorasentejidosneuronalesynoneuronales,incluyendogránulossecretores
Introducción 16 exocrinos,endocrinosyneuroendocrinos,yenvesículaspequeñasencélulasdemamíferos (BraunyScheller,1995;Chamberlainetal.,1996;ChamberlainyBurgoyne,1996;Coppolay Gundersen,1996;Gleaveetal.,2001). InvertebradoscomoDrosophilayCaenorhabditiseleganstienenunúnicogenquecodifica paraCSP(Cspydnj‐14,respectivamente),mientrasquelosmamíferosexpresantresproteínas CSP(α,β,γ).CSPα/DNAJC5eslaprincipalisoformaexpresadaenelcerebro.Inicialmente,se pensóquelaexpresióndeCSPβyCSPγestabarestringidaalostestículos(Fernández‐Chacónet al.,2004),sinembargo,estudiosposterioresdemostraronsuexpresiónenmuchosotrostejidos (Gundersen,2020). LasecuenciadeCSPα/DNAJC5contienevariosdominios(Figura4):(1)undominioDna‐Jen elextremoN‐terminal,característicodelafamiliadecochaperonasDnaJ/Hsp40,que comprendeuntramodeaproximadamente70aminoácidosqueestámuyconservadodesdelas bacteriasaloshumanos;(2)unacadenacentraldemúltiplesresiduosdecisteína(enlaproteína CSPα/DNAJC5deratón,lacadenacentralcontiene25aminoácidosdeloscuales13‐15residuos sondecisteína);(3)laregiónenlazadora(regiónL)entreeldominioDna‐Jylacadenade cisteínas;y,(4)unextremoC‐terminalmenosconservado,delcualnoseconocebiensufunción (SchmitzyFernández‐Chacón,2009). VariosestudioshandemostradoquelafosforilacióndelaSer10deCSPα/DNAJC5alterasu interacciónconsintaxinaysinaptotagminayportanto,CSPα/DNAJC5podríatenerunpapel reguladorenlaexocitosis(EvansyMorgan,2005).Lamayoríadelascisteínasdelacadena centraldeCSPα/DNAJC5seencuentranpalmitoiladas.Lapalmitoilacióndeestosresiduoses esencialparadirigirCSPα/DNAJC5alasvesículassinápticasypromoverlaliberaciónde neurotransmisores(Arnoldetal.,2004). 2.1.Funciónchaperona:complejotriméricoCSPα/Hsc70/SGT LaprincipalfuncióndeCSPα/DNAJC5queseconoceesladecochaperonamolecular.No obstante,CSPα/DNAJC5noesactivaconstitutivamente.Enprimerlugar,en1996sedemostró queCSPα/DNAJC5interaccionaconlaproteínaHsc70(70kDaheat‐shockcognateprotein). Hsc70contieneundominioATPasacuyaactividadintrínsecaesbaja,peroseactivaporlaunión aldominioDna‐JdeCSPα/DNAJC5(Braunetal.,1996;ChamberlainyBurgoyne,1997).Launión entreCSPα/DNAJC5yHsc70seproduceentrelasecuenciatri‐péptidoHPDdeldominioDna‐J deCSPα/DNAJC5yeldominioATPasadeHsc70(BurgoyneyMorgan,2015)(Figura4). Posteriormente,Tobabenycolaboradoresen2001descubrieronlaunióndeotraproteína,SGT
Introducción 17 (smallglutamine‐richtetratricopeptiderepeat‐containingprotein),alcomplejoCSPα/Hsc70 (Tobabenetal.,2001).SGTseunealacadenacentralconmúltiplescisteínasdeCSPα/DNAJC5, encooperaciónconelextremoC‐terminaldeCSPα/DNAJC5.TambiénsedemostróqueSGTse unealextremoC‐terminaldeHsc70,porloquerepresentaunamoléculapuenteentre CSPα/DNAJC5yHsc70(Figura4).Estoshallazgosidentificaronelcomplejotrimérico CSPα/Hsc70/SGTcomounachaperonadependientedeATPquerepliegaproteínasmalplegadas enlasinmediacionesdelasuperficiedelavesículasináptica(Tobabenetal.,2003). Figura4.DominiosdelasproteínasqueconformanelcomplejotriméricoCSPα/Hsc70/SGT. CSPα/DNAJC5seuneatravésdesudominioDna‐JaldominioATPasadeHsc70.Lasrepeticionesde tetratricopéptido(TPR)deSGTseunenalextremoC‐terminaldeHsc70,asícomoalaregióndelacadena decisteínasyalextremoC‐terminaldeCSPα/DNAJC5.Lacadenadecisteínaspalmitoiladasaseguranla interaccióndeCSPα/DNAJC5conlasvesículassinápticas.SBD:dominiodeuniónasustrato(Schmitzy Fernández‐Chacón,2009). 2.2.CSPα/DNAJC5yenfermedadesneurodegenerativasenhumanos Entre2011y2013variosestudiosindependientesencontraronunaasociaciónentre mutacionesenelgenDNAJC5(tambiénreferidocomoCLN4)quecodificaparaCSPα/DNAJC5en humanosylalipofuscinosisneuronalceroidedeinicioenadulto(ANCL,adultonsetneuronal ceroidlipofusinosis)(Benitezetal.,2011;Cadieux‐Dionetal.,2013;Noskováetal.,2011;Velinov etal.,2012).ANCL,tambiénconocidacomoenfermedaddeKufsoenfermedaddeParry,esun desordenneurodegenerativoautosómicodominantequecomienzaadesarrollarseentrelos20 y30años.LospacientesconANCLgeneralmentedesarrollandificultadesdelhabla,ataxia, movimientosinvoluntarios,convulsionesydemenciaprogresivaconunaesperanzadevidamás corta(Gundersen,2020;Valenzuela‐Villatoroetal.,2018).Curiosamente,entodoslospacientes conANCLestudiadoshastalafechasehanidentificadounadelassiguientesdosmutacionesen
Introducción 18 lasecuenciaquecodificaparalacadenadecisteínasdeCSPα/DNAJC5:ladelecióndelaleucina 116olasustitucióndelaleucina115porunaarginina(L115R)(Benitezetal.,2011;Cadieux‐ Dionetal.,2013;Noskováetal.,2011;Velinovetal.,2012).Además,lasmuestrasdecerebro postmortemdepacientesconANCLmostraronunagranreducciónenlosnivelesde CSPα/DNAJC5sinápticaencomparaciónconloscontroles(Noskováetal.,2011).Greavesy colaboradoresdemostraronquelasmutacionesdeANCLinducenlaagregacióngenerando agregadospalmitoiladosresistentesaSDSyquelaCSPα/DNAJC5silvestrepuedecoagregarcon laCSPα/DNAJC5mutante,explicandoelefectodominantedelasmutaciones(Greavesetal., 2012).Posterioremnte,ZhangyChandraverificaronqueestosagregadossuprimíanlafunción cochaperonadeCSPα/DNAJC5(ZhangyChandra,2014).Además,Hedersonycolaboradores informarondequelamutacióndeCSPα/DNAJC5alterabalaexpresiónylocalizacióndesu enzimadespalmitoilante,proteínapalmitoiltioesterasa‐1(PTT1),proponiendounefectosobre elpatróndepalmitoilacióndeproteínaslisosomalesysinápticascomounmecanismoparael desarrollodeANCL(Hendersonetal.,2016). AunqueANCLeslaúnicaenfermedadquesesabequeescausadapormutacionesde CSPα/DNAJC5,sehanidentificadoalteracionesenlosnivelesoactividaddeCSPα/DNAJC5en otrasenfermedadesneurodegenerativas(HuangyZhang,2021).Enmuestraspostmortemde pacientesconAlzheimerseinformóquelaexpresióndeCSPα/DNAJC5sereduceenáreas degeneradasdelcerebroanterior(Tiwarietal.,2015),yrecientemente,sehanidentificado acumulacionesextracelularesdeCSPα/DNAJC5enlasproximidadesdelosdepósitosdebetaamiloide(Rupawalaetal.,2022).Además,seobservóquelosnivelesdelcomplejoSNARE disminuyenenmuestrasdecerebropostmortemdeambospacientesconAlzheimeryParkinson (Sharma,Burré,ySüdhof,2012). 2.3.CSPα/DNAJC5yneurodegeneraciónenmodelosanimales LafunciónneuroprotectoradeCSPα/DNAJC5fueevidenteenlosprimerosestudiosen DrosophilamelanogastercarentedeCSPα/DNAJC5.Lasmoscasmutantesquesobrevivierona laedadadultademostraronparálisissensiblealatemperatura,movimientodescoordinado, tembloresymuertetemprana(Zinsmaieretal.,1994). Posteriormente,segeneraronlosratonescarentesdeCSPα/DNAJC5mediantela recombinaciónhomólogadeunaregiónqueincluíaelexón2,elcualfuereemplazadoporla secuenciadelgenderesistenciaalaneomicina(Fernández‐Chacónetal.,2004;Tobabenetal., 2001).LosratonescarentesdeCSPα/DNAJC5parecíannormaleslosprimerosdíastrasnacer, peroapartirdeldía20devida,desarrollabandéficitsmotoresprogresivos,neurodegeneración
Introducción 19 enlasunionesneuromuscularesylassinapsisdelcálizdeHeldymoríanentrelosdías40‐80de edad(Fernández‐Chacónetal.,2004)(Figura5).Estosratonestambiénmostraronuna degeneraciónextensayrápidaenlosfotorreceptoresdelaretina(Schmitzetal.,2006),una reducciónenlasensibilidadnormalalcalciodelmecanismodeliberacióndeneurotransmisores (Ruizetal.,2008)yundeteriorodelreciclajedevesículassinápticasenlauniónneuromuscular (Rozasetal.,2012).Unhallazgosorprendentefuequelaneurodegeneraciónylareducida esperanzadevidaenlosratonescarentesdeCSPα/DNAJC5serevirtiósignificativamenteal sobreexpresarlachaperonasinápticaα‐sinucleína(Chandraetal.,2005). ElpapelneuroprotectordeCSPα/DNAJC5enlasinapsishaquedadodemostradoenvarios estudiosdesdeDrosophilamelanogasterhastahumanos.Porlotanto,eldesarrollodefármacos, queaumentenlaactividaddeCSPα/DNAJC5oqueevitenlanecesidaddelafunción cochaperonadeCSPα/DNAJC5,sepresentacomounapotencialterapiaparaANCLytambién, engeneral,paralasenfermedadesneurodegenerativas(BurgoyneyMorgan,2015).Dehecho, Sharmaycolaboradoresdemostraronqueeltratamientodelosratonescarentesde CSPα/DNAJC5coninhibidoresdelproteasomaaumentabalaesperanzadevidadelosratonesy retrasabalaneurodegeneración(Sharma,Burré,ySüdhof,2012). Figura5.FenotipodelosratonescarentesdeCSPα/DNAJC5. A,Alas4semanasdeedadlosratonesDnajc5knockout(Dnajc5‐/‐o)sonmáspequeñosymuestran defectosseverosenelsistemamotorencomparaciónconlosratonescontroles(Dnajc5+/+)(Modificada deSchmitzyFernández‐Chacón,2009).B,PérdidadepesocorporaldelosratonesDnajc5knockout (Dnajc5‐/‐)encomparaciónconlosratonescontrol(Dnajc5+/+)yDnajc5heterocigotos(Dnajc5+/‐).C, DisminucióndelasupervivenciadelosratonescarentesdeCSPα/DNAJC5apartirdelos30díasdespués denacimiento(ModificadadeFernández‐Chacónetal.,2004). 2.4.RelacióndeCSPα/DNAJC5conlaproteínaSNAP25delcomplejoSNARE Unaobservaciónimportanteenelestudiodetalladodelosratonescarentesde CSPα/DNAJC5fuelareduccióndelosnivelesdeSNAP25ydelosnivelesdecomplejosSNARE ensamblados.LadisminucióndeSNAP25nosevioafectadaporlasobreexpresióndeαsinucleína,loquesugirióaSNAP25comoelprincipalclientedeCSPα/DNAJC5(Chandraetal.,
Introducción 20 2005).Estudiosposterioresdemostraronque,enausenciadeCSPα/DNAJC5,disminuyeSNAP25 debidoasuubiquitinaciónysuproteólisisdeunamaneradependientedelaactividadsináptica (Sharmaetal.,2011).Además,lasobreexpresióndeSNAP25,utilizandolaexpresiónlentiviral encultivosdeneuronasderatonescarentesdeCSPα/DNAJC5,rescatóelfenotipo neurodegenerativo(pérdidaneuronal)(Sharma,Burré,Bronk,etal.,2012).Experimentosde unióninvitrosugirieronqueCSPα/DNAJC5noseunedirectamenteaSNAP25,sino indirectamenteatravésdeHsc70.Portanto,estoshallazgospropusieronelcomplejo CSPα/Hsc70/SGTcomochaperonamolecularparaSNAP25ysugirieronqueelmantenimiento delaconformacióndeSNAP25esfundamentalenlaprevencióndelaneurodegeneración. 2.5.PapeldeCSPα/DNAJC5ensinapsiscondiferentestasasdedisparo EnlosprimerosestudiosconlosratonescarentesdeCSPα/DNAJC5seobservóque terminalesnerviososnormalescoexistíanconotrosqueestabandegenerandoypropusieron queprobablementesedebiesealasdiferenciasdependientesdelaactividadentrelos terminalessinápticos(Fernández‐Chacónetal.,2004).Posteriormente,García‐Junco‐Clemente ycolaboradoresestudiaronlafuncióndeCSPα/DNAJC5ensinapsisGABAérgicasinhibitorias (interneuronasdeparvalbúmina(PV)),queoperanenunrégimendealtaactividaddisparando potencialesdeacciónenunasfrecuenciasmuyelevadas(aproximadamente200Hz)(Csicsvari etal.,1999;Pelkeyetal.,2017),yensinapsisglutamatérgicasexcitadoras,quedisparan potencialesdeacciónenunafrecuenciamásbaja(aproximadamente1Hz)(Frerkingetal.,2005; Mizusekietal.,2011).EnesteestudiodemostraronqueenlasinterneuronasPVdegeneraban progresivamentelosterminalespresinápticostraslaeliminacióndeCSPα/DNAJC5.Además,los registroselectrofisiológicosenneuronascultivadasdehipocampoderatonescarentesde CSPα/DNAJC5mostraronunadisminuciónprogresivadelafrecuenciadelascorrientes postsinápticasinhibitoriasminiatura(mIPSCs,miniatureinhibitorypostsynapticcurrent), indicandounareducciónenelnúmerodeterminalessinápticosGABAérgicos.Curiosamente,no encontraroncambiosenlafrecuenciadelascorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura (mEPSCs,miniatureexcitatorypostsynapticcurrent)porloquelassinapsisglutamatérgicasno sevieronafectadas.Esimportanteremarcarqueencontraronqueladisminucióndelainhibición sinápticafuecompensadaporunmecanismohomeostáticoqueconsistíaenunareducciónde losreceptoresdeAMPApostsinápticos(García‐Junco‐Clementeetal.,2010)(Figura6).Estos descubrimientos,demostraronqueCSPα/DNAJC5esesencialparamantenerlafunción presinápticabajounrégimendeelevadaactividadsináptica.Noobstante,dadalatemprana mortalidaddelosratonesDnajc5KOaP30‐40,esteestudionopermitecomprobarsilaausencia deCSPα/DNAJC5enlosterminalesexcitadorespodríadesarrollarunfenotipoalargoplazo.
Introducción 21 Además,elanálisiselectrofisiológicoestárealizadoencultivosdeneuronasdehipocampoy resultanecesariocontinuarelestudioenrodajasdehipocampoparacompletarla caracterizacióndelasalteracionesqueseproducenenlassinapsisexcitadorasantelaausencia deCSPα/DNAJC5.Elusoderodajasdehipocampopermiteelestudiodesinapsisbien caracterizadasqueoperanenunrégimendebajaactividad. Figura6.Modelorepresentativodeloscambiossinápticosinhibitoriosyexcitadoresencultivode neuronascarentesdeCSPα/DNAJC5. Enloscultivosdehipocampoderatonescontrolexisteunequilibrioentrelosestímulosexcitadorese inhibitorios.Sinembargo,enloscultivosdehipocampoderatonesDnajc5KOlosterminalesdelas interneuronasquefuncionanbajounrégimendealtaactividad(célulasencanastaqueexpresan sinaptotagmina2(Syt2+)necesitanCSPα/DNAJC5paravencerelestrésmolecularderivadodelacontinua actividadypodríaniniciarunprocesodedegeneraciónpormuerteregresivadeunamaneradependiente delaedad.Lasinterneuronasmenosactivas(positivasparacalretinina(CR+))ylasneuronaspiramidales glutamatérgicassonmenosdependientesdeCSPα/DNAJC5porquefuncionanenunrégimendebaja actividad.Laredsináptica,anteestareduccióndelaactividadsinápticainhibitoria,desencadena mecanismosdeplasticidadhomeostática:lassinapsisexcitadorassedebilitanporlareducciónfuncional postsinápticadelosreceptorestipoAMPA(Modificadade(García‐Junco‐Clementeetal.,2010). 3.Hipocampo Elhipocampoesunadelasestructurascerebralesmásinvestigadasdebidoasudistintiva anatomíaysuimportantepapelenlamemoriayelaprendizaje.Desdequeen1957seinformó delcasodelpacienteH.M.,quienperdiólacapacidaddeformarnuevosrecuerdosdeclarativos despuésdelaextirpaciónquirúrgicadelhipocampoydeltejido(ScovilleyMilner,1957),el hipocampohaestadoalavanguardiadelainvestigaciónsobrelasbasesneurobiológicasdela
Introducción 22 memoria.Estainvestigacióncondujoaldescubrimientoenelhipocampodelapotenciacióna largoplazo,elprincipalmodelodelabasecelulardelamemoria.Además,eldescubrimientode las“placecells”(O’Keefe,1976),“headdirectioncells”(Mulleretal.,1996;Taubeetal.,1990)y “gridcells”(Haftingetal.,2005)enlaformacióndelhipocampoderoedoresestableciólabase paralanocióndequeelhipocampojuegaunpapelcríticoenlaformacióndelamemoriaal proporcionarunmarcoespaciotemporaldentrodelcualseunendiversoscomponentes sensoriales,emocionalesycognitivosdeunaexperiencia.Estemarcopermitequelaexperiencia sealmaceneyposteriormentesepuedarecuperarcomounrecuerdo. 3.1.Anatomíadelhipocampoderatón Elhipocampoformapartedelsistemalímbicoyesunaestructuracurvaqueseextiende ventrocaudalmentedesdelosnúcleosseptalesdelprosencéfalohastalacortezatemporal.La formacióndelhipocampocomprendetresdivisionesdistintas:(1)elcuernodeAmón(Ammon´s horn)ohipocampopropio,quesesubdivideentresáreas(CA3,CA2yCA1,siendoCAla abreviaturadecornusammoni);(2)elgirodentado(DG,dentategyrus),y(3)elsubiculum (Figura7).Sinembargo,eltérminohipocampoescomúnmenteutilizadoparareferirseal hipocampopropioyalgirodentado.Laregiónparahipocampaladyacenteincluyelacorteza entorrinal,perirrinalypostrinalyproporcionalamayorpartedelaentradacorticalal hipocampo. Figura7.Organizaciónanatómicadelhipocampoderatón. LocalizacióndelhipocampoenelcerebroderatónytincióndeNissldeunaseccióndehipocampoenla queseidentificaelgirodentado(DG),lasáreasCA3yCA1delcuernodeAmónyelsubiculum(SUB) (ModificadadeHainmuelleryBartos,2020).3.2.Citoarquitecturaytiposcelulares 3.1.1.Hipocampopropio SegúnlaterminologíaqueasignóLorentedeNó,elhipocampopropiosedivideentresáreas (CA3,CA2yCA1)(LorentedeNó,1934)(Figura8).Laprincipalcapacelulareselstratum pyramidale(sp)enelquesealineanlossomasdelasprincipalescélulasdelhipocampopropio,
Introducción 23 denominadascélulaspiramidales.Lascélulaspiramidalesutilizanglutamatocomo neurotransmisor(neuronasglutamatérgicasexcitadoras)ydebensunombrealaclaraforma triangulardesuscuerposcelulares.Elsomadeestascélulastieneundiámetrode20µmydeél emergentrestroncosdendríticosprincipales,unoapicalydosbasales.Lasdendritasapicalesse extiendenenelstratumradiatum(sr)yarborizanenelstratumlacunosummoleculare(slm).Las dendritasbasalesseramificanenelstratumoriens(so).Laparteproximaldelasdendritas apicalesdelascélulaspiramidalesdelaCA3selocalizanenelstratumlucidum(sl)enelque tambiénseencuentranlasfibrasmusgosasqueseproyectandesdelascélulasgranularesdel girodentado.Losaxonesdelascélulaspiramidalesproyectanhaciaelstratumalveus(alv)desde dondesalendelhipocampo(Hammond,2015;Noguchietal.,2020). Laactividaddelasneuronaspiramidalessemodulaporlasaferenciasglutamatérgicasy tambiénporinervacioneslocalesdeinterneuronasinhibitorias.Enelhipocampopropiosehan descritocuatrotiposprincipalesdeinterneuronasinhibitorias,ytodasutilizanGABAcomo neurotransmisor(neuronasGABAérgicas). Lascélulasencesta(basketcells)inervanelsomaylasdendritasproximalesdelascélulas piramidaleslocalizadasenelstratumpyramidaleyradiatum,respectivamente.Loscuerpos celularesdelascélulasencestaselocalizanprincipalmenteenelstratumpyramidale.Hay almenostressubgruposdecélulasencesta:unsubtipoqueesinmunopositivopara parvalbúmina(PV)+peronegativoparacolecistoquinina(CCK)‐,yotrosdossubtiposqueson inmunohistoquímicamentealainversa,esdecir,PV‐yCCK+. Lascélulasbiestratificadasinervanlaparteproximaltantodelasdendritasapicalescomo basalesenelstratumradiatumyoriens,ysuscuerposcelularesselocalizanenelstratum oriens,radiatumopyramidale.Inmunohistoquímicamentelascélulasbiestratificadasson PV+,somastotatina+,neuropéptidoY(NPY)+yCCK‐. Lascélulasaxo‐axónicas,tambiénllamadascélulascandelabro,inervanexclusivamenteel segmentoinicialdelaxóndelascélulaspiramidales.Loscuerposcelularesdeestascélulas selocalizanenelstratumpyramidaleocercadeél.Inmunohistoquímicamente,lascélulas axo‐axónicassonPV+. Lascélulasoriens‐lacunosummoleculare(O‐LM)tienensussomasenelstratumoriense inervanlasdendritasdistalesdelascélulaspiramidalesenelstratumlacunosum moleculare.LascélulasO‐LMexpresanPVysomatostatina(Hammond,2015;Szilágyietal., 2011).
Introducción 24 3.1.2.Girodentado Elgirodentado(DG)seorganizaentrescapas,siendolaprincipalcapacelularladenominada capagranular(gl,granularlayer)(Figura8).Enlacapagranularseencuentrandensamente empaquetadoslossomasdelascélulasgranulares,queconstituyenlascélulasprincipalesdel girodentado.Lascélulasgranularessonglutamatérgicasysussomassonovoidesconun pequeñodiámetrode14‐18µm.Losárbolesdendríticosemergendelpoloapicaldelossomasy formanlacapamolecular(ml,molecularlayer).Losaxonesdelascélulasgranulares, denominadosfibrasmusgosas(MF,mossyfibers),emergendelpolobasaldelossomasyse extiendenenelhilus(H)enelquecontactanconinterneuronaslocalesylleganhastaelstratum lucidumparahacersinapsisconlascélulaspiramidalesdelaCA3(Hammond,2015).Aunquelas célulasprincipalesymayoritariasdelgirodentadosonlascélulasgranulares,existeotrogrupo principaldecélulasqueselocalizaenelhilusysonlasdenominadascélulasmusgosas.Lascélulas musgosastambiénsonglutamatérgicasexcitadorasytienenunimportantepapelregulandola actividaddelascélulasgranularesquesonquiescentes(neuronashiperpolarizadas)(Scharfman yMyers,2012). Además,elgirodentadotambiéncontieneinterneuronasGABAérgicasinhibitorias, concretamente,sehandescritolosmismoscuatrotiposdeinterneuronasqueseencuentranen elhipocampopropio.Lamayordensidaddeestasneuronasseencuentraenlacapagranulary elhilus,mientrasquelacapamolecularpresentamenornúmerodeneuronas(Hammond, 2015). Figura8.Citoarquitecturaytiposcelularesdelhipocampoderatón. A,RepresentacióndelhipocampodibujadoporRamónyCajal(1911)enelquesemuestralamorfología delasprincipalescélulas:lascélulaspiramidalesenelhipocampopropioylascélulasgranularesenelgiro dentado(DG)(ModificadadeAndersen,1975).B,Esquemadelaestructuradelhipocampomostrandola organizacióndelascapasquelocomponen:stratumoriens(so),stratumpyramidale(sp),stratum radiatum(sr),stratumlacunosummoleculare(slm),capamolecular(ml,molecularlayer),capagranular (gl,granularlayer),hilus(H),stratumlucidum(sl),fimbria(F)(ModificadadeNoguchietal.,2020).
OBJETIVOS
Objetivos 32 Losmecanismosquemantienenlatransmisiónsinápticaalolargodelavidasedesconocen. ComosedescribeenlaIntroducción,nuestrogrupohaidentificadoaCSPα/DNAJC5comouna proteínadelavesículasinápticaquepromueveelmantenimientodelassinapsisdeneuronas altamenteactivas,comolasinterneuronasGABAérgicasdedisparorápido.Unapregunta fundamentalessiCSPα/DNAJC5estambiénclaveparaelmantenimientodelafunciónyla estructuradelassinapsisqueoperanabajaactividad,comoeselcasodelassinapsis glutamatérgicasdelhipocampo.Estatesispersiguelainvestigacióndelosmecanismos neuronalesymolecularesquesubyacentrasladelecióngenéticadeCSPα/DNAJC5, específicamenteenneuronasglutamatérgicas. Enconsecuencia,losprincipalesobjetivosdeestatesisson: 1. Análisisbioquímicoyelectrofisiológicoexvivodesinapsisglutamatérgicasenelratón convencionalDnajc5knockoutcarentedeCSPα/DNAJC5. 2. Generaciónyvalidacióndeunalíneaderatóncondicionalparainducirladelecióngénica deCSPα/DNAJC5enneuronasglutamatérgicasenratonesadultosconcontroltemporaly expresando,enlasmismasneuronas,unmarcadorfluorescente. 3. Caracterizaciónfenotípicadelosratonescondicionales,incluidoelanálisisneurológico, bioquímico,inmunohistoquímicoyelectrofisiológicodelassinapsisglutamatérgicasdel hipocampo. 4. Estudiodelmecanismomolecularimplicadoeneldesarrollodefenotipo,encasodequelo hubiera,enlosratonescarentesdeCSPα/DNAJC5enlasneuronasglutamatérgicas.
MATERIALESYMÉTODOS
MaterialesyMétodos 34 1.Ratones Paracumplirconlosobjetivospropuestosenestatesissehanusadovariaslíneasderatón. Paralosexperimentosiniciales,seutilizóelratónconvencionalDnajc5knockout(KO)carentede CSPα/DNAJC5(TheJacksonlaboratory,nºstock.006392,ThomasC.Südhof)(Fernández‐Chacón etal.,2004),aunquelasprincipaleslíneasutilizadasenesteestudiohansidolaslíneasderatón condicionalquehemosllamadoCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5floxyCaMKIIcreERT2:Ai27D:Snap25flox. ParalageneracióndeestaslíneashemoscruzadoelratónDnajc5flox/flox(Nieto‐Gonzálezetal., 2019)yelratónSnap25flox/flox(B6‐Snap25tm3mcw)(Marques‐Smithetal.,2016), independientemente,conelratónCaMKIIαCreERT2(Tg(Camk2a-cre/ERT2)2Gsc) (Erdmannetal., 2007)paraeliminarelgendianafloxeadoenlasneuronasglutamatérgicas.Además,estos ratonessehancruzadoconlalíneaderatónAi27D(TheJacksonLaboratory,stockno:012567, HongkuiZeng)(Madisenetal.,2012)paraintroducirlaproteínadefusióncanalrodopsina‐ 2/tdTomato(ChR2/tdTomato)yutilizareltdTomatocomoreporterodelascélulasqueexpresan CaMKIIα.Laestrategiaparalageneracióndeestaslíneasderatónsedescribeabajoconmás detalle. Todoslosprocedimientosrelacionadosconlainvestigaciónconanimalesserealizaronde acuerdoconlaDirectivadelaUniónEuropea2010/63/EUsobrelaproteccióndeanimales utilizadosconfinescientíficosyaprobadoporlaConserjeríadeAgriculturayPescadelaJunta deAndalucía(Nºdelproyectoautorizado18/11/2016/174).Losanimalessemantuvieronenel animalariodelInstitutodeBiomedicinadeSevilla(IBiS)conunciclodeluz/oscuridadde12/12 hyaccesosinrestriccionesacomidayagua. 1.1.GeneraciónygenotipadodelalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox LalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5floxsegenerómedianteunaestrategiade crucesqueincluíalaslíneasderatónmencionadasanteriormente.Recibeestenombreporque contienelacrerecombinasa,inducicleportamoxifeno,bajoelcontroldelprotomordela CaMKIIα(ratonesCaMKIIαcreERT2knock‐in),laconstrucciónChR2/tdTomatoinsertadaenellocus ROSA26(ratonesAi27D)yelalelofloxeadodeDnajc5(ratonescondicionalesDnajc5flox/flox).En primerlugar,secruzaronanimalesCaMKIIαcreERT2hemicigotos(hemi)(losratonesCaMKIIαcreERT2 homocigotosnosonviables)conratonesDnajc5flox/flox.Ensegundolugar,losratones CaMKIIαcreERT2hemi:Dnajc5flox/floxsecruzaronconanimalesAi27Dhomocigotos(homo)para introducirlaproteínadefusiónChR2/tdTomato.Unavezqueseconsiguióobtenerratones CaMKIIαcreERT2hemi:Ai27Dhomo:Dnajc5flox/flox(primerparental),estossecruzaronconratones Dnajc5convencionalesheterocigotos(Dnajc5+/‐)(segundoparental)paraintroducirelalelo
MaterialesyMétodos 35 knockoutdeDnajc5yfinalmente,obtenerlosratonesexperimentales:CaMKIIαcreERT2 hemi:Ai27Dhemi:Dnajc5flox/+comocontrolesyCaMKIIαcreERT2hemi:Ai27Dhemi:Dnajc5flox/‐ como knockoutcondicionales(Dnajc5cKO).TantoenlosanimalescontrolescomoenlosDnajc5cKO losalelosCaMKIIαcreERT2yAi27Dpermanecenenhemicigosis,porello,lanomenclatura simplificadaqueutilizamosenestatesisdoctoralesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+ocontroles, yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐oDnajc5cKO(Figura11).Además,enalgunasocasionespara abreviarnosreferimosalosratonescontrolescomoDnajc5flox/+,Flox/+oF/+yalosratones Dnajc5cKOcomoDnajc5flox/‐,Flox/‐oF/‐,dadoelespacioreducidodelasfiguras. Locus Nombre del cebador Secuencia5´3´Tipode cebador Tamañodela bandadel productodePCR CaMKIIαcreERT2 ERT2‐1GGTTCTCCGTTTGCACTCAGGAComún directoHomocigoto=375 pb Hemicigoto=375y 290pb Silvestre=290pb ERT2‐2CTGCATGCACGGGACAGCTCTSilvestre reverso ERT2‐3GCTTGCAGGTACAGGAGGTAGTTransgén reverso Ai27D oIMR9020AAGGGAGCTGCAGTGGAGTASilvestre directo Homocigoto=315 pb Hemicigoto=315y 297pb Silvestre=297pb oIMR9021CCGAAAATCTGTGGGAAGTCSilvestre reverso oIMR9103GGCATTAAAGCAGCGTATCCTransgén directo oIMR9105CTGTTCCTGTACGGCATGGTransgén reverso Dnajc5 knockout convencional 25938CAAGAATGCAACCTCAGATGACSilvestre directoHomocigoto=150 pb Heterocigoto=150 y336pb Silvestre=336pb 25939CTTTTAAGTGTGTTTACTTTTTGGTGComún reverso Oimr8574GAGCGCGCGCGGCGGAGTTGTTGACKnockout directo Dnajc5flox/flox condicional FMS‐2014‐ 14TATCGGTAAGCAGCCGTGTTAACCTransgén directo Homocigoto=900 pb Hemicigoto=900y 678pb Silvestre=678pb FMS‐2014‐ 15TATAGCATTCACTCCTGCCAACCCTransgén reverso Snap25flox/flox condicional Snap ForwardCCCTGGGGAACCACGGCAGATransgén directo Homocigoto=382 pb Hemicigoto=454y 382pb Silvestre=454pb Snap ReverseTCCCAGGAAACAGCACAGCGTTransgén reverso Tabla1.Cebadoresutilizadosparaelgenotipadodelosratones. Descripcióndelosnombres,secuencias,tiposytamañosdelosproductosdePCRdetodosloscebadores usadosparagenotiparcadalíneaderatóngeneraday/outilizadaenestatesis.
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MaterialesyMétodos 37 Figura11.EstrategiadecrucesparagenerarlalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox. Esquemadelaestrategiadecrucesparaestablecercoloniasderatonesparentalesconlosqueconseguir finalmentelosratonesexperimentalesconlosgenotiposCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.LosratonestransgénicosCaMKIIαCreERT2(Erdmannetal.,2007)contienen untransgénderivadodeunvectorBAC(CromosomaArtificialBacteriano)queexpresalaproteínade fusiónCreERT2bajoelcontroldeloselementosreguladoresdelgenCaMKIIα.Paralageneracióndeestos ratones,insertaronporrecombinaciónhomólogaenbacterialaproteínadefusiónCreERT2enmarcoen elATGdelgenCaMKIIαpresenteenunBACquecontiene143kbdeADNgenómicoderatón(RP24‐ 243J21).ElinsertogenómicomodificadoseseparódelBACyseintrodujoenlalíneagerminalderatón porinyeccióndeovocitos.EllocusAi27DserepresentacomosedescribeenladocumentacióndeThe JacksonLaboratory.SecomponeporunpotenciadorCMV‐IE/promotorhíbridodebeta‐actinadepollo/ beta‐globinadeconejo(CAG),unsitioFRT,uncodóndeterminaciónflanqueadoporsitiosloxP(con codonesdeterminaciónenlos3marcosdelecturayunaseñalpoliA),ungendefusiónChR2(H134R)‐ tdTomatodemamífero,unelementoreguladorpostranscripcionaldelvirusdelahepatitisdelamarmota (WPRE;paramejorarlaexpresióndeproteínas),unaseñalpoliAdeBGHyunsitioAttLhíbridoresultante delaeliminaciónconunarecombinasaespecíficadesitio(PhiC31o)delcasetePGK‐FRT‐Neo‐poliA flanqueadoporAttB/AttP.Lageneracióndelgendefusiónserealizóutilizandolosprimeros315 aminoácidosdelacanalrodopsina‐2(derivadadelalgaverdeChlamydomonasreinhardtii)quese modificaronparaalbergarcodonesoptimizadosparalaexpresiónenmamíferosyunasustituciónde gananciadefunciónH134R(CACaCGC)paramejorarlasfotocorrientesestacionarias.Estasecuenciase fusionóenmarcoconelextremoaminodeunasecuenciadetdTomato(doscopias).Laconstrucciónfinal seinsertóenelintrón2dellocusGt(ROSA)26Sor.LasecuenciamutadadelgenDnajc5floxeadofue generadaporEUCOMM,ycontieneunsitioFRTydossitiosloxPqueflanqueanelexón3.Enlosratones experimentalesserepresentanlosdosalelosdeDnajc5encadacaso,mientrasquelosalelosde CaMKIIαCreERT2yAi27Dnoestánrepresentados. ParaelgenotipadodelosratonesserealizóunaextraccióndeADNgenómicoapartirdela biopsiadecadaratónymediantelatécnicadePCRdeamplificacióndefragmentosdeADNse determinóelgenotipodecadaratónparaunaleloconcretoutilizandoloscebadoresespecíficos (Tabla1).ElaleloCaMKIIαcreERT2knock‐insedetectóutilizandoloscebadoresERT2‐1(común directo)yERT2‐3reverso,mientrasqueelalelosilvestresedetectóconelcebadorcomúnERT2‐ 1yelcebadorERT2‐2reverso,permitiendolaidentificaciónderatoneshomocigotos(375pb), hemicigotos(375y290pb)ysilvestres(290pb)(loscebadoresfueronaportadosporel laboratoriodelDr.ÁngelBarco,Alicante).LaconstrucciónChR2/tdTomato(Ai27D)sereconoció utilizandoloscebadoresoIMR9103yoIMR9105yelalelosilvestreutilizandoloscebadores oIMR9020yoIMR9021(todosdeTheJacksonLaboratory),permitiendodistinguirentreratones homocigotos(315pb),hemocigotos(315y297pb)ysilvestres(297pb).Parareconocerelalelo Dnajc5floxeadoutilizamosloscebadoresFMS‐2014‐14yFMS‐2014‐15pero,además,para distinguirentreDnajc5flox/+yDnajc5flox/‐necesitamosreconocerelaleloDnajc5silvestreyKO. Paraello,usamoselcebadorcomúnreverso25939yloscebadoresdirectos25938paradetectar elalelosilvestreyOimr8574paraelaleloKO.Estoscebadorestambiénseutilizanparael genotipadodelalíneaderatónDnajc5convencional.
MaterialesyMétodos 38 1.2.GeneraciónygenotipadodelalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox Otradelasprincipaleslíneasderatónutilizadasenestatesisdoctoraleslalínea CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox.Comosemencionóanteriormente,paralageneracióndeesta líneatambiénsehanutilizadoratonesCaMKIIαcreERT2knock‐inyratonesAi27Dquesehan cruzadoconratonescondicionalesSnap25flox/floxquecontienenfloxeadoelaleloSnap25.La estrategiadecrucesutilizadasedescribeacontinuación.Enprimerlugar,secruzaronanimales CaMKIIαcreERT2hemicigotosconratonesSnap25flox/flox.Ensegundolugar,losratones CaMKIIαcreERT2hemi:Snap25flox/floxsecruzaronconanimalesAi27Dhomocigotosparaintroducirla proteínadefusiónChR2/tdTomato.UnavezconseguimosobtenerratonesCaMKIIαcreERT2 hemi:Ai27Dhomo:Snap25flox/+(primerparental)secruzaronconratonescondicionalesSnap25flox/flox (segundoparental)paraobtenerlosratonesexperimentales:CaMKIIαcreERT2 hemi:Ai27Dhemi:Snap25flox/+comocontrolesyCaMKIIαcreERT2hemi:Ai27Dhemi:Snap25flox/floxcomo knockoutcondicional(Snap25cKO).Comosehacomentadoenlaanteriorlíneaderatón,tanto enlosanimalescontrolescomoenlosSnap25cKOlosalelosCaMKIIαcreERT2yAi27Dpermanecen enhemicigosis,porello,lanomenclaturasimplificadaqueutilizaremoses CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+,Snap25flox/+,F/+paralosratonescontrolesy CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox,Snap25flox/flox,F/FparalosratonesSnap25cKO(Figura12). ParaelgenotipadodelaleloCaMKIIαcreERT2knock‐inydelaconstrucciónChR2/tdTomato (Ai27D)seutilizaronlosmismoscebadoresquesehandescritoenelapartadoanterior.Para reconocerelaleloSnap25floxeadousamosloscebadoresSnapForwardySnapReverse permitiendodistinguirratoneshomocigotos(382pb),hemicigotos(454y382pb)ysilvestres (454pb)(Tabla1). Figura12.EstrategiadecrucesparagenerarlalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox. Esquemadelaestrategiadecrucesparaestablecercoloniasderatonesparentalesconlosqueconseguir finalmentelosratonesexperimentalesconlosgenotiposCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox.LaconstruccióngenéticadelosratonestransgénicosCaMKIIαCreERT2y Ai27Dsehadescritoenlafiguraanterior.LaconstrucciónSnap25floxsegenerómedianterecombinaciones enunBACqueimplicaunaseriedepasosintermedios,incluyendolainsercióndemarcadoresdeselección extraíblescomoelmarcadorPgk‐EM7‐neoqueseeliminódelaconstrucciónfinalquedandounsitioFRT entrelosdossitiosloxPqueflanqueanelexón5a/5b(serepresentasegúndescriben(Hoerder‐ Suabedissenetal.,2019)).EnlosratonesexperimentalesserepresentanlosdosalelosdeSnap25encada caso,mientrasquelosalelosdeCaMKIIαCreERT2yAi27Dnoestánrepresentados.
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MaterialesyMétodos 40 1.3.Tratamientocontamoxifeno Comosehadescritopreviamente,losratonesdeambaslíneas CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5floxyCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25floxexpresanlaproteínadefusión CreERT2bajoelcontroldeloselementosreguladoresdelgenCaMKIIα.Laproteínadefusión CreERT2consisteenuncodónmejoradodeCre‐recombinasa(Shimsheketal.,2002)yundominio deuniónaligandomutadodelreceptordeestrógenohumano(ERT2)(Feiletal.,1997)(Indraet al.,1999).ERT2contieneunaseñaldelocalizaciónnuclearquesedesenmascaraalunirseal ligando.DosmutacionespuntualesenelERT2permitenlaunióndelligandosintético4‐hidroxi‐ tamoxifeno(TMX)yevitanlaactivacióndeCreERT2porelligandonatural,elestradiolendógeno. Porlotanto,laformainactivadelaproteínadefusiónCreERT2sinligandoresideenelcitoplasma yalunirsealtamoxifenosetrasladaalnúcleodonderealizalarecombinacióndesitioespecífica (Figura13A).Losratonesdeambaslíneasrecibieroneltamoxifenoenladietaenformade pienso(ENVIGO,TD.55125.I)conunmesdeedad.Laduracióndeladietatamoxifenofue diferenteencadalínea:losratonesdelalíneaCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5floxsealimentaroncon piensotamoxifenodurante30díasyfueronprocesados30díasdespués(post‐TMX)enla mayoríadelosexperimentosdeestatesis(Figura13B),aunqueenalgunosexperimentos tambiénseutilizaronratonesprocesadosalos8,9,16y22mesespost‐TMX;losratonesdela líneaCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25floxsealimentaroncontamoxifenodurante14‐17díasyfueron procesadosjustoalfinalizareltratamientoyaqueseobservóquealgunosdelosratonesSnap25 cKOmoríantranscurridos15‐17díasconladietatamoxifeno(Figura13C). 2.ValidacióngenómicadelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox 2.1.ExtraccióndeADN ParavalidarlaactividaddelacrerecombinasapararecombinarelaleloDnajc5floxeadoen losratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐30díasdespués deltratamientocontamoxifeno(30díaspost‐TMX),seextrajoADNdehipocampo,corteza, cerebeloycola.Además,seextrajoADNdelassiguientesmuestrasqueseutilizaroncomo controles:dehipocampo,cortezaycerebelodeunratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/floxcon tresmesesdevida(P90;90díasdespuésdenacer)quenorecibiótamoxifeno,decoladeuna parejaderatonescontrol(Dnajc5+/+)yKO(Dnajc5‐/‐)conunmesdevida(P30),ydeunapareja deratonesdelalíneaUBC‐cre‐ERT2:Dnajc5flox/floxcrepositivo(cre+)ycrenegativo(cre‐)(P123‐ 125;33‐35díaspost‐TMX)conlaquetambiénsetrabajaenellaboratorioyenlosquelacre recombinasatambiénesinducibleportamoxifeno(recibeneltamoxifenoalosdosmesesde edaddurante30díasyseprocesaronalos33‐35díasdespuésdeladietacontamoxifeno).
MaterialesyMétodos 47 tiempoconelobjetofamiliar).Unapreferenciaporelobjetonuevoinferioral50%indica deteriorodelamemoria(Denningeretal.,2018).Losratonesquepasaronconambosobjetos menosde10segundosdeltiempototaldeinteracciónseexcluyerondelanálisis. Caja1Caja2Caja3 Objeto1Objeto2Objeto1Objeto2Objeto1Objeto2 FamiliarizaciónSaleroSaleroLegoLegoFrascoFrasco Despuésde1hSaleroLegoLegoFrascoFrascoSalero Despuésde24hSaleroFrascoLegoSaleroFrascoLego Tabla5.Distribucióndelosobjetosencadafasedelreconocimientodeobjetonuevo. Enlastrescajas,elobjeto1essiempreelobjetofamiliaryelobjeto2eselquesevacambiandoencada fasedelexperimento. Figura15.Objetosyfasesdelreconocimientodeobjectonuevo. A,Objetosutilizadosparaelexperimento.B,Imagensuperiordelacajatomadadurantecadafasedel experimento:familiarización,MCP(memoriaacortoplazo,despuésde1h)yMLP(memoriaalargoplazo, despuésde24h),enlaquesepuedeobservarladistribucióndelosobjetos. 5.3.2.Condicionamientodelmiedocontextual Paraelexperimentodecondicionamientodelmiedocontextualseutilizóuncubículode condicionamientoconparedesnegrasysuelodevarillasdemetalparalaadministraciónde descargaseléctricasenlaspatas(Panlab,HarvardApparatus).Elexperimentoconstadedos etapasqueserealizaronendosdíasconsecutivos.Elprimerdíasellevóacabolaetapade
MaterialesyMétodos 48 condicionamientosiguiendoelsiguienteprotocolo:losratonessecolocaronindividualmenteen lacámaraydespuésde2mindeexploraciónlibreseproporcionóunadescargasuavede0.2mA durante2s;posteriormente,seaplicarondosdescargaseléctricasenintervalosde2min (IntervaloentrePruebas);finalmente,losratonessedevolvieronasusjaulas2mindespuésde laúltimadescarga.Elsegundodía(alas24h)seevaluólamemoriacontextualdelmiedo exponiendoalosratonesalmismocubículodurante5minsinrecibirdescargas(Figura16).En cadaetapasecuantificóelcomportamientodecongelacióndelosratonesutilizandoel programaPackwin(Panlab,HarvardApparatus).Paracuantificarlosepisodiosdecongelación, elprogramaestableceunapuntuaciónarbitraria:17paraelumbralinferiory80comoumbral superior,esdecir,laactividadregistradapordebajode17seconsiderócomportamientode congelaciónyporencimade80comounaelevadaactividad.Durantelasdosetapasdel experimento,semantuvolaluzapagadadelcubículodecondicionamientoyunruidoblancode 60dB. Figura16.Fasesdelcondicionamientodelmiedocontextual. A,RepresentacióndelprotocoloqueseaplicaenlafasedecondicionamientoyB,despuésde24hpara evaluarlamemoriacontextualdelmiedo. 6.Análisisdeproteínas 6.1.Extraccióndelasmuestras Seobtuvieronmuestrasdehipocampoderatonescontrol(Dnajc5+/+)yDnajc5KO(Dnajc5 ‐/‐)aP30‐31,yderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐a P90,alos31‐32díasdespuésderecibirladietatamoxifeno(31‐32díaspost‐TMX).Tambiénse extrajohipocampo,cortezaycerebeloderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+y
MaterialesyMétodos 49 CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxaP45,alos14‐15díasdepermanecerconladietatamoxifeno (14‐15díasconTMX).Lostejidosseextrajeronentampónfosfatosalino(PBS:phosphatebuffer saline)1X(137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.4)frío,se congelarondemanerainstantáneaennitrógenolíquidoyseconservarona‐80ºChastasuuso. 6.2.Diseccióndelhipocampo Paracomprobarlosnivelesdeexpresióndeproteínasendosáreasdiferentesdel hipocamposeextrajeroncerebrosderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(n=3)y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(n=3)alos29‐31díaspost‐TMXyenunvibratomo(VT1200S, Leica)conPBS1Xseobtuvieronrodajascoronalesde500µm.Seseleccionaronlasrodajasque conteníanhipocampoysetransfirieronaunaplacadePetriconPBS1Xfrío.Utilizandolalupa estereoscópicaNikonSMZ645seaislóelhipocampoysediseccionóconunbisturíseparando, porunlado,eláreaCA1juntoconlascolateralesdeSchaffer(áreaCA1)y,porotrolado,elárea CA3juntoconlasfibrasmusgosasyelgirodentado(DG:dentategyrus)(áreaCA3+DG)(Figura 17).Lasseccionesdecadaáreaydecadaratónsecoleccionaronentubosdemicrocentrífuga, secongelarondemanerainstantáneaennitrógenolíquidoyseconservarona‐80ºChastasu uso. Figura17.Métodoparaladiseccióndelhipocampo. Representacióndelprocesoqueseutilizóparadiseccionarelhipocampoendosáreasdiferenciadas:el áreaCA1juntoconlascolateralesdeSchaffer(SC)yeláreaCA3juntoconelgirodentado(DG).SC: colateralesdeSchaffer;MF:fibrasmusgosas;DG:girodentado. 6.3.Procesadodelasmuestras LalisisylahomogeneizacióndelostejidosserealizóentampónRIPA(20mMTris‐HClpH 7.4,150mMNaCl,1mMEDTA,1%IGEPAL,0.1%SDS)coninhibidoresdeproteasas(P8340, Sigma)yfosfatasas(P5726,Sigma)utilizandounhomogeneizadordecristal.Lasmuestrasse mantuvieronencontinuaagitacióndurante2horasenhieloyseagitaronenunvórtexcada15‐ 30min.Posteriormente,secentrifugaronalamáximavelocidad(14000rpm)durante15 minutosa4ºCylossobrenadantesserecolectaroncomolisados.Sedeterminólaconcentración deproteínasutilizandoelPierceBCAProteinAssayKit(23227,ThermoScientific)yfinalmente,
MaterialesyMétodos 50 aloslisadosseañadiótampónLaemmli4Xsuplementadocon0.4Mbeta‐mercaptoetanolpara conseguirunaconcentraciónfinaldeLaemmlia1X(50mMTris‐HClpH6.8,10%glicerol,2%SDS, 0.0067%azuldebromofenol,0.1Mbeta‐mercaptoetanol).Lasmuestrassecalentarona45ºC durante10‐15minsinagitación. 6.4.Westernblot Elwesternblotserealizómediantelaelectroforesisengeldepoliacrilamidacon dodecilsulfatosódico(SDS‐PAGE:sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel).Seutilizarongeles enlosqueelgeldeapilamientosepreparóal3%deacrilamida(2.38mlH2OmiliQ,0.94mlTris‐ HCl0.5MpH6.8,375µlacrilamida30%,37.5µlSDS10%,50µlAPS10%,5µlTEMED)yelgel deresoluciónal10%deacrilamida(3mlH2OmiliQ,1.85mlTris‐HCl1.5MpH8.8,2.5ml acrilamida30%,75µlSDS10%,50µlAPS10%,5µlTEMED).Secargaroncantidadesequivalentes deproteínaylaelectroforesisserealizóeneltampóndeelectroforesisal1X(25.5mMglicina, 2.5mMTris,0.1%SDS,pH8.4±0.2)a50mVconstantesdurantemediahora(paraquetodas lasproteínasavancenporelgeldeapilamientoysesitúenalamismaaltura)yposteriormente, a100mVconstantesdurante2hutilizandolafuentedealimentaciónPowerPacBasic(Bio‐Rad). Después,lasmuestrasenlosgelesdeacrilamidasetransfirieronamembranasPVDF(1620177, Biorad)entampóndetransferencia1Xfrío(25.5mMglicina,2.5mMTris,20%metanol,0.1% SDS)a200mVconstantesdurante2hoa0,8mAdurantetodalanochea4ºC.Lasmembranas selavarontresvecesentampónTrissalinoyTween20(TBS‐T)1X(13.7mMNaCl,2mMTris, 0.1%Tween20,pH7.5)ysebloquearoncon3%AlbúminadeSueroBovino(BSA:bovineserum albumin)o3%lecheenTBS‐T1Xdurante1hatemperaturaambienteconunaagitaciónmedia. Luego,lasmembranasseincubaronconloscorrespondientesanticuerposprimarios(Tabla6) disueltosen3%BSAenTBS‐T1Xdurantetodalanochea4ºC.Posteriormente,selavarontres vecesconTBS‐T1Xyseincubarondurante1hatemperaturaambienteconagitaciónmediacon loscorrespondientesanticuerpossecundariosconjugadosconperoxidasaderábanopicante (HRP:horseradishperoxidase)(Tabla7)disueltosen3%BSAenTBS‐T1X.Comocontroldecarga seutilizóelanticuerpoanti‐β‐actina.ParaelreveladodelwesternblotseutilizóelClarity WesternECLSubstrate(170‐5060,BIORAD)ylasimágenessetomaronutilizandounChemidoc TouchImagingSystem(ThermoFisherScientific).
MaterialesyMétodos 51 TécnicaProteínaAnticuerpo primario Especie huéspedConcentraciónReferencia Westernblot CSPα/DNAJC5Anti‐CSPα Conejo1:2000 ENZOLife Science;NºCat. ADI‐VAP‐SV003‐E SNAP25Anti‐SNAP25,clon SMI81Ratón1:10000Biolegend; NºCat.836301 Sinaptotagmina1 Antisynaptotagmin1 cytoplasmatictail, clon41.1 Ratón1:2000SynapticSystems; NºCat.105011 Hsc70 Anti‐Uncoating ATPaseHsc70, clon3C5 Ratón1:1500SynapticSystems; NºCat.149011 Sinaptofisina2 Antisynaptophysin2 andp38‐2 Conejo1:2000SynapticSystems; NºCat.102003 Sinaptotagmina2znp‐1Ratón1:1000 Developmental Studies HybridomaBank Sinaptobrevina2 Antisynaptobrevin2/ VAMP2,clon69.1 Ratón1:10000SynapticSystems; NºCat.104211 β‐actinaAnti‐β‐actina, clonAC‐74Ratón1:5000Sigma;NºCat. A2228 Inmunofluorescencia CSPα/DNAJC5Anti‐CSPα Conejo1:1000 ENZOLife Science;NºCat. ADI‐VAP‐SV003‐E tdTomatoCPCA‐mCherryPollo1:1000 EnCor Biotechnology Inc. SNAP25Anti‐SNAP25,clon SMI81)Ratón1:5000Biolegend; NºCat.836301 Sinapsina1,2Anti‐sinapsina1,2Cobaya1:500SynapticSystems; NºCat.106004 ATP5GAnti‐ATP5GConejo 1:1000 (recuperación deantígeno) Abcam; NºCat.ab96655 Inmunohistoquímica campoclaro CSPα/DNAJC5Anti‐CSPα Conejo1:1000 ENZOLife Science;NºCat. ADI‐VAP‐SV003‐E tdTomatoCPCA‐mCherryPollo1:1000 EnCor Biotechnology Inc. SNAP25Anti‐SNAP25,clon SMI81)Ratón1:5000Biolegend; NºCat.836301 Tabla6.Anticuerposprimarios. Resumendelosanticuerposprimariosutilizadosenestatesisenlosexperimentosdewesternblot, inmunofluorescenciaeinmunohistoquímicadecampoclaro.
MaterialesyMétodos 52 6.5.Determinacióndelrangolinealparaladeteccióncuantitativadelwesternblot Paraelanálisiscuantitativodelwesternblotesnecesariodeterminarelrangolinealparala proteínaobjetivodeestudioyelcontroldecarga.Elrangolinealdedetecciónpermite determinarcuántamuestrasedebecargarparaquelaintensidaddelabandaseaproporcional alacantidaddelaproteínaobjetivo(Pillai‐Kastoorietal.,2020).Así,sedeterminóelrangolineal delasdosproteínasmásestudiadasenestatesisdoctoralcomosonCSPα/DNAJC5ySNAP25,así comodelcontroldecargaβ‐actina.Paraello,seprocesóelhipocampodeunratóncontrolP30y seprepararondilucionesseriadasdelamuestraconlassiguientescantidadesdeproteínaen30 µldelisado:61.56µg,30.78µg,15.39µg,7.70µg,3.85µg,1.92µg.Secargaronlasdiluciones enungeldepoliacrilamidaconSDS(3%acrilamidaelgeldeapilamientoy10%acrilamidaelgel deresolución)yserealizóelwesternblotsegúnsehadetalladoenelapartadoanterior.Trasel reveladodelamembranaseadquirieronimágenesconlaexposiciónóptimautilizandoun ChemiDocImagingSystem(Bio‐Rad)ylasbandassecuantificaronconelprogramade procesamientodeimagenImageJ(NationalInstitutesofHealth).Serepresentólaseñalobtenida paracadaproteínaobjetivorespectoalacantidaddemuestracargada(Figura18). Figura18.Rangolinealdedetecciónmediantewesternblot. A,Resultadodelwesternblotrealizadocondiferentescantidadesdeproteínasdehipocampodeunratón controlP30mostrandolospesosmolecularesylasbandasdelasproteínasCSPα/DNAJC5,SNAP25ydel controldecargaβ‐actina.B,Representacióndelaseñalobtenidaparacadaproteínafrentealacantidad deproteínacargada. 6.6.Cuantificacióndelosnivelesdeproteína Lasimágenesdelreveladodelwesternblotseadquirieronconlaexposiciónóptima utilizandounChemiDocImagingSystem(Bio‐Rad)ylasbandasseanalizaronycuantificaron utilizandoelprogramadeprocesamientodeimagenImageJ(NationalInstitutesofHealth).Por cadamuestra,lacuantificacióndelaexpresióndelaproteínaanalizadasecompensóconelnivel
MaterialesyMétodos 53 deexpresióndelaproteínaβ‐actinautilizadacomocontroldecarga.Losdatosserepresentaron endiagramasdebarrasnormalizadosconlosdatosdelratóncontrol. TécnicaAnticuerpo secundario Especie huéspedEspecificidadConcentraciónReferencia Westernblot Anti‐ratón Peroxidaseconjugated AffiniPure CabraIgG(H+L)1:10000 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.115‐035‐166 Anti‐conejo Peroxidaseconjugated AffiniPure CabraIgG(H+L)1:10000 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.111‐035‐144 Inmunofluorescencia Anti‐conejo AlexaFluor647 AffiniPure CabraIgG(H+L)1:500 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.111‐605‐144 Anti‐pollo Rhodamine Red™‐X conjugated AffiniPure BurroIgYᵻᵻ(IgG) (H+L)1:500 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.703‐295‐155 Anti‐ratón AlexaFluor488 AffiniPure BurroIgG(H+L)1:500 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.715‐545‐151 Anti‐cobaya AlexaFluor647 AffiniPure CabraIgG(H+L)1:500 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.106‐605‐003 Anti‐conejo Cy3‐AffiniPureBurroIgG(H+L)1:500 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.711‐165‐152 Inmunohistoquímica campoclaro Anti‐ratón Biotin‐SP‐ conjugated AffiniPure BurroIgG1:1000 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.715‐065‐151 Anti‐pollo Biotin‐SP‐ conjugated AffiniPure Burro IgYᵻᵻ(IgG) (H+L)1:1000 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;Nº Cat.703‐065‐155 Tabla7.Anticuerpossecundarios. Resumendelosanticuerpossecundariosutilizadosenestatesisenlosexperimentosdewesternblot, inmunofluorescenciaeinmunohistoquímicadecampoclaro.
MaterialesyMétodos 54 7.Inmunohistoquímica 7.1.Perfusiónyobtencióndelasrodajasdecerebro SeperfundieronratonesDnajc5+/+,Dnajc5+/‐ yDnajc5‐/‐ aP25‐26;ratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐aP90(30díaspost‐TMX)ya los8,9y22mesespost‐TMX;yratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxaP45(14‐17díasconTMX).Losratonesseanestesiaroncon 2%tribromoetanolyserealizóunaperfusióntranscardíacaconPBS1X(pH7.4)paraeliminarla sangredelostejidos,yposteriormentecon4%paraformaldehído(PFA)entampónfosfato(PB: phosphatebuffer)1X(19.98mMNa2HPO4,79.59mMKH2PO4,pH7.4)parafijarlostejidos.Se extrajeronloscerebrosysemantuvieronensoluciónfijadora4%PFAdurantetodalanochea 4ºC.Acontinuación,loscerebrossecrioprotegieronen30%sacarosaenPB1Xcon0.01%azida sódicayseconservarona4ºChastasuuso.Seutilizóuncriostato(LeicaCM1950)paraobtener rodajasdecerebrode40µmenelplanocoronalylasrodajasseconservaronen50%glicerol enPBS1Xa‐20ºChastasuuso. 7.2.Inmunohistoquímicadecampoclaro Paralatécnicadeinmunohistoquímicadecampoclaroseseleccionarontresrodajas coronalesconhipocampodecadaratónparacadaanticuerpoprimarioutilizado.Lasrodajas coronalesconhipocamposelavarontresvecesenPBS1Xyparabloquearlaperoxidasa endógenaseincubaronen3%H2O2y10%metanolenPBS1Xdurante10minatemperatura ambienteysevolvieronalavarenPBS1X.Sebloquearonensolucióndebloqueo(3%suerofetal bovino(FBS:fetalbovineserum)y0.3%TritónX‐100enPBS1X)durante1hatemperatura ambienteconagitaciónmedia.Lasrodajasseincubaronconlosapropiadosanticuerpos primarios(Tabla6)ensolucióndebloqueodurantetodalanochea4ºC.Posteriormente,se lavaronenPBS1Xyseincubaronenloscorrespondientesanticuerpossecundariosbiotinilados (Tabla7)diluidosen0.3%TritónX‐100enPBS1Xdurante2hatemperaturaambientecon agitaciónmedia.DespuésdevarioslavadosenPBS1X,seincubaronenunasolucióndeavidinabiotina‐peroxidasa(ABCkit,VECTASTAIN,VectorLaboratories)durante1hatemperatura ambienteconagitaciónmediaysevolvieronalavarvariasvecesenPBS1X.Pararevelarel marcajeinmunoperoxidasaespecíficodecadaanticuerpobiotiniladoempleadoseutilizóuna solucióncompuestapor0.02%diaminobenzodina(DAB),0.04%sulfatodeníquelyamonioy 0.01%H2O2enPB1X.Lasrodajasseincubaronconestasolucióneltiemponecesario,específico decadaanticuerpo,yseparólareaccióndereveladoañadiendoPB1Xalmismotiempoalas rodajasdeambosgenotipos.Finalmente,serealizaronvarioslavadosenPB1Xylasrodajasse
MaterialesyMétodos 55 montaronenportaobjetosgelatinizadosysedejaronsecar.Paradeshidratarlasrodajasse pasaronatravésdeunabateríadealcoholes(1minenH2Odestilada,1minen70%etanol,1 min80%etanol,1min90%etanol,1min96%etanol,dosvecesen100%etanoldurante1min, dosvecesenxiloldurante1miny,12minenxilol).SecolocaronloscubreobjetosconDPX (Sigma)ysedejaronsecar.LasimágenessetomaronutilizandoelmicroscopioNewCASTBX‐61 (Olympus)yunobjetivo4X(Olympus). Enelreveladodelosexperimentosdeinmunohistoquímicaencortesdehipocampode ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐adiferentesedades (30díaspost‐TMXy50díaspost‐TMX)seobtuvodiferentetonalidadenelmarcajesegúnellote deDABqueseutilizóencadacaso.Sinembargo,cabedestacarqueparaelreveladodelos cortesdelosratonescontrolyDnajc5cKO,decadaedadanalizada,siempreseutilizóelDABdel mismolote. 7.3.Inmunofluorescencia Seseleccionarontresrodajascoronalesconhipocampodecadaratónparalos experimentosdeinmunofluorescencia.Enprimerlugar,lasrodajasselavarontresvecesenPBS 1X.Paraaquellosanticuerposquenecesitanaplicarelprotocoloderecuperacióndeantígeno, seincubaronlasrodajasen10mMcitratodesodioenPBS1X,pH6,durante30mina80ºC,se lavarontresvecesenPBS1X,sebloquearonen2%lechedesnatadayTritónX‐100enPBS1X durante30min,yluegoselavarontresvecesenPBS1X.Entonces,seincubaronensoluciónde bloqueo(3%FBSy0.3%TritónX‐100enPBS1X)durante1hatemperaturaambientecon agitaciónmedia.Posteriormente,seincubaronconlosapropiadosanticuerposprimarios(Tabla 6)ensolucióndebloqueodurantetodalanochea4ºC.LasrodajasselavarontresvecesenPBS 1X,yseincubaronconloscorrespondientesanticuerpossecundarios(Tabla7)enoscuridad durante2hatemperaturaambienteconagitaciónmedia.Finalmente,lasrodajasselavaron tresvecesenPBS1X,semontaronenportaobjetos,selesañadióelmediodemontaje fluorescenteDAKO(S3023,Dako)oFluorSaveReagent(345789,Merck),secolocaronlos cubreobjetosysedejaronsecardurante1‐2díasenoscuridada4ºC.Lasimágenessetomaron conelmicroscopioconfocalNikonA1R+. 7.4.Cuantificacióndelasimágenesdeinmunofluorescencia SecuantificólaexpresióndelasproteínasCSPα/DNAJC5ySNAP25,ydelmarcador fluorescentetdTomatoenelhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,tantojóvenesalos30‐31díaspost‐TMX(3mesesdeedad)
MaterialesyMétodos 56 comoenvejecidosalos8‐9mesespost‐TMX(10‐11mesesdeedad).Tambiénsecuantificóla expresióndelasproteínasCSPα/DNAJC5,SNAP25ysinapsina1,2enelhipocampoderatones Dnajc5+/+,Dnajc5+/‐yDnajc5‐/‐aP25‐26. EnlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5floxsetomaronlasimágenesconelmicroscopio confocalNikonA1R+,mientrasquelasimágenesdelosratonesDnajc5setomaronconel microscopioconfocalLeicaStellaris8.Paralasimágenesdelhipocampocompletoseusóun objetivo10Xconelescaneodemosaico,conunintervalode1‐1.5µmenelejez,yparaobtener lasimágenesdemayormagnificacióndelasáreasCA1yCA3seusóunobjetivo20Xdeinmersión enaceite,conunintervalode0.5‐1µmenelejez.Lasimágenesdelasregionesdeinterésse tomaronen:3hipocamposdecadaratónenlosratonesjóvenesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+ (n=3)yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(n=3);2hipocamposdecadaratónenlosratones envejecidosCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(n=3)yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(n=3);y4 hipocamposdecadaratónenlosratonesDnajc5+/+(n=3),Dnajc5+/‐(n=3)yDnajc5‐/‐(n=3). LasimágenesseanalizaronutilizandoelmódulodemedidadelprogramaImageJ(National InstitutesofHealth)conelquesecuantificólaintensidaddelafluorescenciadecadamarcador. Paracadaimagen,seseleccionóunáreade100x100µm(enelstratumradiatumenlaregión delaCA1yenelstratumlucidumenlaregióndelaCA3)ysecuantificólaintensidaddela fluorescenciaespecíficaencadaplanodelejez(9planosenlosratonesjóvenes CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox;15planosenlosratonesDnajc5yenlosratonesenvejecidos CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox).SeobtuvolaratioCSPα/tdTomatoySNAP25/tdTomatoenlos ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,ylaratio CSPα/sinapsinaySNAP25/sinapsinaenlosratonesDnajc5+/+,Dnajc5+/‐ yDnajc5‐/‐.Se calcularonlospromediosdelasratiosencadaáreaanalizadadecadaratónyfinalmente,se obtuvoelvalormedioporgenotipo. 8.HibridacióninsitudeARN EnelexperimentodehibridacióninsitudeARNseutilizaron4ratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y4ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐aP90(30‐31días post‐TMX). 8.1.Criopreservaciónyobtencióndeloscortesdecerebro Losratonesseanestesiaroncon2%tribromoetanolyseextrajeroninmediatamentelos cerebros.SeañadiócompuestodeinclusióncriogénicaOCT(Tissue‐Tek)enunosmoldes individualesqueseprepararonconpapeldealuminio,secolocaronloscerebrosenvertical
MaterialesyMétodos 63 Posteriormente,selavarondosvecesenPBS1XyseincubaronconfluoresceínaavidinaD(A‐ 2001,VectorLaboratories)diluida(1:500)en0.3%TritónX‐100enPBS1Xdurantetodalanoche a4ºC.Finalmente,lasrodajasselavarondosvecesenPBS1X,semontaronenportas,seles añadióelmediodemontajefluorescenteDAKO(S3023,Dako),secolocaronloscubreobjetosy sedejaronsecardurante1‐2díasenoscuridada4ºC. 10.3.Cuantificaciónyclasificacióndelasespinasdendríticas LasimágenesseadquirieronconunmicroscopioconfocalNikonA1R+.Paraobtener imágenesquemostraranlasneuronascompletas,seutilizóelescaneodemosaicosconun objetivode10X(Nikon)conunaumentode2yunobjetivode40X(Nikon),ambosconun intervalode0.5µmenelejez.Lasimágenesdelasdendritasconunamagnificaciónmayorse obtuvieronconunobjetivo60X(Nikon)deinmersiónenaceiteconunaumentode3.5yun intervalode0.1–0.2µmenelejez.Setomaronimágenesdelasdendritasapicalesproximales, concretamentesecundariasyterciarias,de5neuronasdecadagenotipo(3ratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y3ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐).Lasimágenesse analizaronutilizandoImarisx649.6(OxfordInstruments)yseutilizólaextensiónclasificación deespinasdeImarisparacuantificaryclasificarlasespinasdendríticas.Parafacilitarla reconstrucciónen3Dsesegmentaronlasdendritasutilizandounaregióndeinterésde300x 200px,obteniendoelmismonúmerodesegmentosporcadagenotipo. Paraobtenerimágenescompletasdetodaslasneuronasdecadagenotiposeutilizóel microscopioconfocalLeicaStellaris8conunobjetivode20X(Leica)deinmersiónenaceitecon unaumentode0.75yunintervalode1µmenelejez.Lasimágenesfueronanalizadasconel programaImageJyseutilizóelcomplementocontadordecélulasparacuantificarelnúmerode dendritasapicales. 11.Microscopíaelectrónicadetransmisión ParalamicroscopíaelectrónicaseprocesaronratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8y16mesespost‐TMX.Losratonesseanestesiaroncon 2%tribromoetanol,sedecapitaronyseextrajeronloscerebrosquefuerontransferidosauna solucióndecorteenfríocompuestapor:222mMsacarosa,11mMglucosa,3mMKCl,1mM NaH2PO4,26mMNaHCO3,7mMMgCl2,y0.5mMCaCl2(osmolaridad300‐310mOsmol/kg,pH 7.4)previamenteburbujeadaconcarbógeno(95%O2,5%CO2).Loscerebrossecortaron utilizandounvibratomo(VT1200S,Leica)paraobtenerrodajashorizontalesde200µm.A continuación,lasrodajassefijaronenunasolucióncon0.1Mcacodilatosódicoy2.5%
MaterialesyMétodos 64 glutaraldehído,pH7.4,durante2hatemperaturaambiente,seguidodedoslavadosen0.1M cacodilatosódicodurante10mincadalavado.Lasrodajassemantuvieronen0.1Mcacodilato sódicocon0.01%azidasódicaa4ºChastasuuso.ParalainclusiónenlaresinaSpurr,las muestrassefijaronen1%OsO4,setiñeroncon2%acetatodeuranilo,sedeshidrataronenun gradientehastael100%deacetonayseinfiltraronenungradientedeacetonaaresinaSpurr. Posteriormente,seobtuvieronseccionesultrafinasde70nm. LasimágenessetomaronenunmicroscopioelectrónicodetransmisiónZeissLibra120.Las imágenesfueronanalizadasconelprogramaImageJyseutilizóelcomplementocontadorde célulasparacuantificarelnúmerodeacumulacionesopartículasdelipofuscinaencadaimagen deaumentode2000Xqueequivaleaunáreade203µm2.Secalculóelnúmeropromediode partículasporimagenyporratón(71imágenesde3ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y 63imágenesde3ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos16mesespost‐TMX).Finalmente, serepresentóelpromedioporgenotipo. 12.Análisisestadístico LosanálisisestadísticosserealizaronutilizandoGraphPadPrism9.Losgráficosdebarras representanlamedia±errorestándardelamedia(SEM:standarderrorofthemean)ylos cambiosconp<0.05seconsideraronestadísticamentesignificativos.Losanálisisestadísticos siempreserealizarontraslavalidacióndelanormalidadconlaspruebasdeShapiro‐Wilk.Las diferenciasentredosgruposexperimentalesseevaluaronconlapruebatdeStudentnopareada dedoscolasparalosdatosqueseguíanunadistribuciónnormal,conlapruebadeUdeMann‐ Whitneyparalosdatosquenoseguíanunadistribuciónnormal.Lasdiferenciasentretresomás gruposexperimentalesseevaluaronconANOVAdeunavíaconlacomparaciónmúltiplede Tukey.LapruebadeKolmogorov‐Smirnovseutilizóparacompararlasdistribucionesdelosdatos decadagruporepresentadosenloshistogramas.
RESULTADOS
Resultados 66 1.EstudiodelhipocampoenratonesDnajc5knockout 1.1.EstudiodelaexpresiónydistribucióndeCSPα/DNAJC5enelhipocampo TrabajospreviosenratonesDnajc5knockout(KO)convencionaleshandemostradola reduccióndeCSPα/DNAJC5mediantewesternblotenlisadosdecerebrocompleto,cortezae hipocampo(Fernández‐Chacónetal.,2004;García‐Junco‐Clementeetal.,2010).Además,varias publicacionesrespectoaCSPα/DNAJC5hanevaluadolaexpresióndelasproteínasSNAREen lisadosdecerebrocompletoydecortezaderatonescarentesdeCSPα/DNAJC5(Chandraetal., 2005;Sharmaetal.,2011,2012). Enestatesisdoctoral,paracomprobarlacaídadeCSPα/DNAJC5enelhipocampoderatones Dnajc5heterocigotos(HET;Dnajc5+/‐)yDnajc5KO(Dnajc5‐/‐),encomparaciónconlos controles(Dnajc5+/+),ydemostrarsiladisminuciónoausenciadeCSPα/DNAJC5alterala expresióndelaproteínaSNARESNAP25enelhipocampo,seanalizómediantewesternblotla expresióndeCSPα/DNAJC5ySNAP25.Paraello,seutilizaronlisadosdehipocampoderatones controles(Dnajc5+/+),Dnajc5HET(Dnajc5+/‐)yDnajc5KO(Dnajc5‐/‐)aP24‐29(n=3ratones porgenotipo).SeobservóquelosnivelesdeCSPα/DNAJC5sereducenun35%enelDnajc5HET (**p=0.0024,ANOVA‐Tukey)ycaeensutotalidadenelDnajc5KO(****p<0.0001,ANOVA‐ Tukey),encomparaciónconelcontrol(Tabla8;Figura22),comoseesperaba(Fernández‐ Chacónetal.,2004;Tobabenetal.,2001).Curiosamente,noseapreciaroncambiossignificativos enlosnivelesdeSNAP25enelDnajc5HET(ns,p=0.2408,ANOVA‐Tukey).Sinembargo,síse observóunareducciónsignificativadeSNAP25enelDnajc5KO(****p<0.0001,ANOVA‐Tukey), encomparaciónconelcontrol(Tabla8;Figura22). ProteínaDnajc5+/+Dnajc5+/‐ Dnajc5‐/‐ Valorp +/+vs+/‐ +/+vs‐/‐ +/‐vs‐/‐ CSPα 1.00±0.070.65±0.010.01±0.00**p=0.0024****p<0.0001****p<0.0001 SNAP251.00±0.040.91±0.050.41±0.01ns,p=0.2408****p<0.0001***p=0.0002 Tabla8.ResumendelosnivelesdeCSPα/DNAJC5ySNAP25enhipocampoderatonesDnajc5controles, HETyKO. Semuestranlospromediosnormalizadosrespectoacontrol±elerrorestándardelamedia(SEM)delos nivelesdeCSPα/DNAJC5ySNAP25enhipocampoderatonescontroles(Dnajc5+/+),Dnajc5HET(Dnajc5 +/‐)yDnajc5KO(Dnajc5‐/‐)aP24‐29detectadosmediantewesternblot.Enlastresúltimascolumnasse representanlosvalorespobtenidostrasevaluarlosdatosconANOVAdeunavíaconlacomparación múltipledeTukey.Seindicanlasdiferenciasestadísticamentesignificativas:**p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001.ReferidoalaFigura22B.
Resultados 67 EstosresultadosconfirmaronladisminuciónyausenciadeCSPα/DNAJC5enelhipocampo deratonesDnajc5HETyKO,respectivamente.Además,sedemostróqueenelhipocampode losratonescarentesdeCSPα/DNAJC5tambiéndisminuyelaexpresióndeSNAP25,como previamentehabíanobservadoencerebrocompletoycortezaderatonesDnajc5KO(Sharmaet al.,2011,2012;Chandraetal.,2005). Figura22.ExpresióndeCSPα/DNAJC5ySNAP25enhipocampoderatonesDnajc5controles,HETyKO. A,Resultadodelwesternblotrealizadoconproteínasdehipocampoderatonescontroles(Dnajc5+/+), Dnajc5HET(Dnajc5+/‐)yDnajc5KO(Dnajc5‐/‐)aP24‐29mostrandolospesosmolecularesylasbandas delasproteínasCSPα/DNAJC5ySNAP25.Laslíneasqueindicanlospesosmolecularesserepresentanen laposiciónajustadaparacadagel.B,Cuantificacionesdelosnivelesdeproteínanormalizadasrespectoal control.Seutilizaβ‐actinacomocontroldecarga.Sedetectaunadisminuciónsignificativadelaexpresión deSNAP25enratonesDnajc5KOencomparaciónconloscontroles,ademásdelaausenciacompletade CSPα/DNAJC5enlosratonesDnajc5KO.Lasmuestrasprovienendetresgeles/transferenciaquese procesaronenparalelo.n=3ratonesporgenotipo.Serepresentanlosvalorespromediosyelerror estándardelamedia(SEM).LapruebaANOVAdeunavíaconlacomparaciónmúltipledeTukeyseutilizó paradeterminarlasignificanciaestadística:**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001. Acontinuación,seaplicólatécnicadeinmunofluorescenciaparacomprobarlaexpresiónde SNAP25enlosdiferentesestratosdelhipocampoantelareducciónoausenciadela cochaperonaCSPα/DNAJC5enlosterminalespresinápticos.Seutilizaronrodajasdehipocampo deratonescontroles(Dnajc5+/+),Dnajc5HET(Dnajc5+/‐)yDnajc5KO(Dnajc5‐/‐)aP25‐26 (n=3ratonesporgenotipo).SeobservóladisminucióndelaexpresióndeCSPα/DNAJC5enel hipocampodelosratonesDnajc5HETencomparaciónconloscontrolesylaausenciatotalde expresióndeCSPα/DNAJC5enlosratonesDnajc5KO(Figura23).Noseobservarondiferencias enlaexpresióndeSNAP25enelhipocampodelosratonesDnajc5HETencomparaciónconlos controles.Sinembargo,enelhipocampodelosratonesDnajc5KOseaprecióunareducción considerablementeenlaexpresióndeSNAP25,aunquecuriosamente,nodisminuíaenel stratumlucidum(sl)encomparaciónconloscontrolesyDnajc5HET(Figura23).
Resultados 68 Figura23.DisminucióndelaexpresióndeSNAP25enelhipocampoderatonesDnajc5KO. ImágenesdeinmunofluorescenciamostrandolaexpresióndeCSPα/DNAJC5(cian)ySNAP25(verde)en cortesdehipocampoderatonescontroles(Dnajc5+/+),Dnajc5HET(Dnajc5+/‐)yDnajc5KO(Dnajc5‐/‐) aP25‐26.SeobservalareducciónyausenciadelaexpresióndeCSPα/DNAJC5enelhipocampodelos ratonesDnajc5HETyKO,respectivamente.Curiosamente,laexpresióndeSNAP25solosereduceenel hipocampodelosratonesDnajc5KOperonoenlasfibrasmusgosas(MF).so:stratumoriens;sr:stratum radiatum;sl:stratumlucidum;iml:capamolecularinterna;H:hilusdelgirodentado;DG:girodentado; áreasCA1yCA3delhipocampo;MF:fibrasmusgosas;SC:colateralesdeSchaffer. Porelstratumlucidumrecorrenlasfibrasmusgosas(MF,mossyfibers)delascélulas granularesdelgirodentadoyhacensinapsisconlasneuronaspiramidalesdeCA3(sinapsisMFCA3).EstasinapsisMF‐CA3esglutamatérgicaexcitadora,ysorprendentemente,apesardela ausenciadeCSPα/DNAJC5enelterminalpresináptico,nosealterabalaexpresióndeSNAP25. Noobstante,otrasinapsisglutamatérgicaexcitadoradelhipocampoeslasinapsisentrelas colateralesdeSchaffer(SC;Schaffercollaterals)delasneuronaspiramidalesdelaCA3ylas neuronaspiramidalesdelaCA1(sinapsisSC‐CA1),lacualtienelugarenelstratumradiatum,en elquesíseaprecióunareduccióndelaexpresióndeSNAP25antelaausenciadeCSPα/DNAJC5. Acontinuación,paracuantificarestadiferenciadeexpresióndeSNAP25enelhipocampo deratonescarentesdeCSPα/DNAJC5setomaronimágenesdemayormagnificacióndelaregión SC‐CA1,queincluyeelstratumradiatum(sr),ydelaregiónMF‐CA3,queincluyeelstratum lucidum(sl)(Figura24A,B).Concretamente,secuantificólaintensidaddefluorescenciade CSPα/DNAJC5,SNAP25ysinapsina(utilizadocomocontroldeexpresión)enunáreade100x 100µmenelstratumradiatumdelaregiónSC‐CA1yenelstratumlucidumenlaregiónMF‐CA3 (Figura24B)(versecciónMaterialesyMétodos).
Resultados 69 RatioEstratosDnajc5+/+Dnajc5+/‐Dnajc5‐/‐ Valorp +/+vs+/‐ +/+vs‐/‐ +/‐vs‐/‐ CSPα/ sinapsina s. radiatum1.05±0.100.97±0.140.42±0.12ns, p=0.8959 * p=0.0257 * p=0.0440 s.lucidum1.25±0.041.24±0.090.39±0.04ns, p=0.9898 *** p=0.0001 *** p=0.0001 SNAP25/ sinapsina s. radiatum0.60±0.100.63±0.040.35±0.01ns, p=0.9386 ns, p=0.0607 * p=0.0399 s.lucidum0.45±0.030.52±0.010.48±0.01ns, p=0.0585 ns, p=0.5136 ns, p=0.2549 Tabla9.RatiosdeintensidaddefluorescenciadeCSPα/sinapsinaySNAP25/sinapsinaenelstratum radiatumyelstratumlucidumdelhipocampoderatonesDnajc5controles,HETyKO. Semuestranlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delaratiodeintensidadde fluorescenciadeCSPα/sinapsinaySNAP25/sinapsinacuantificadosenelstratumradiatumyenelstratum lucidumencortesdehipocampoderatonescontroles(Dnajc5+/+),Dnajc5HET(Dnajc5+/‐)yDnajc5KO (Dnajc5‐/‐)aP25‐26.Enlastresúltimascolumnasserepresentanlosvalorespobtenidostrascomparar losdatosconlapruebaANOVAdeunavíaconlacomparaciónmúltipledeTukey.Seindicanlasdiferencias estadísticamentesignificativas:*p<0.05**p<0.01,***p<0.001.ReferidoalaFigura24C,D. Secomprobólasimilarexpresióndelaproteínapresinápticasinapsinaentrelosgenotipos, tantoenelstratumradiatum(Dnajc5+/+:69.28±6.93;Dnajc5+/‐:69.31±6.89;Dnajc5‐/‐: 72.45±7.95,ns,p=0.9398,ANOVAdeunavía)comoenelstratumlucidum(Dnajc5+/+:82.13± 4.16;Dnajc5+/‐:76.51±3.58;Dnajc5‐/‐:78.98±10.84,ns,p=0.8547,ANOVAdeunavía),lo quedemostrabalavalidezdeutilizarestaproteínacomocontroldeexpresiónparala cuantificación.Deestaforma,seobtuvolaratiodeintensidaddefluorescenciaCSPα/sinapsina ySNAP25/sinapsina,yserepresentóelpromedioporgenotipoyporelestratodelhipocampo analizado.Elanálisisdelosdatosdemostrólareducciónsignificativadelaexpresiónde CSPα/DNAJC5enelstratumradiatum(sr)yenelstratumlucidum(sl)delosratonesDnajc5HET (sr:*p=0.0257;sl:***p=0.0001,ANOVA‐Tukey)yDnajc5KO(sr:*p=0.0440;sl:***p=0.0001, ANOVA‐Tukey),encomparaciónconelcontrol(Tabla9;Figura24B,C).Sinembargo,laexpresión deSNAP25soloseredujosignificativamenteenelstratumradiatumdelosratonesDnajc5KO (*p=0.0399,ANOVA‐Tukey)sinmostrarcambiosenelstratumlucidum(ns,p=0.2549,ANOVA‐ Tukey),encomparaciónconlosratonesDnajc5HET(Tabla9;Figura24B,D). EstosresultadosconfirmaronqueenlascolateralesdeSchaffer,quediscurrenporel stratumradiatum,laausenciadelacochaperonaCSPα/DNAJC5reducelosnivelesdeSNAP25 enelterminalpresináptico.Acontinuación,nospreguntamossilareduccióndelaproteína SNAP25,necesariaparalaformacióndelcomplejoSNARE,podríaestaralterandolatransmisión sinápticaenlasinapsisglutamatérgicadelhipocampoentrelascolateralesdeSchafferylas neuronaspiramidalesdelaCA1(sinapsisSC‐CA1).
Resultados 70 Figura24.ReduccióndelaexpresióndeSNAP25enelstratumradiatumsinmostrarcambiosenel stratumlucidumenelhipocampoderatonesDnajc5KO. A,Imágenesdelhipocampocompletoderatonescontroles(Dnajc5+/+),Dnajc5HET(Dnajc5+/‐)yDnajc5 KO(Dnajc5‐/‐)aP25‐26mostrandosimultáneamentelaexpresióndesinapsina(rojo),CSPα/DNAJC5 (cian)ySNAP25(verde).Elrecuadrodepuntosblancosindicalasdosregionesdeinterés(SC‐CA1yMFCA3).B,ImágenesdemayormagnificacióndelasregionesseleccionadasenA,mostrandolaexpresiónde sinapsina,CSPα/DNAJC5ySNAP25.Elrecuadrodepuntosblancosindicaeláreaenelquesecuantificala intensidaddefluorescenciadecadamarcador.C,D,Gráficosdebarrasrepresentandolospromediosde laratiodeintensidaddefluorescenciadeCSPα/sinapsinaySNAP25/sinapsinacuantificadasenB. Curiosamente,seobservaunadisminuciónsignificativadelaexpresióndeSNAP25enelstratumradiatum peronoenelelstratumlucidumdelosratonesDnajc5KO.n=3ratonesdecadagenotipo.Lasbarrasde errorrepresentanelerrorestándardelamedia(SEM).LapruebaANOVAdeunavíaconlacomparación múltipledeTukeyseutilizóparadeterminarlasignificanciaestadística:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001. sr:stratumradiatum;sl:stratumlucidum;MF:fibrasmusgosas;SC:colateralesdeSchaffer.
Resultados 71 1.2.Análisiselectrofisiológicodelatransmisiónsinápticaglutamatérgicaenel hipocampoderatonesDnajc5KOycontroles 1.2.1.Estudiodelaliberaciónespontáneadeglutamatomedianteelregistrode corrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs)enlasinapsisSC‐CA1 Loshallazgosdetrabajospreviosrealizadosencultivosdeneuronascorticalessugierenque laneurodegeneraciónenratonesDnajc5KOseproduceprincipalmenteporlafunción defectuosadeSNAP25queafectaelensamblajedelcomplejoSNARE(Sharmaetal.,2011,2012). EnestatesisdoctoralqueremoscomprobarsilareducciónenlosnivelesdeSNAP25que observamosenelhipocampoderatonesDnajc5KOaP24‐29afectaalafuncionalidadsináptica glutamatérgicadelhipocampo.Paraello,analizamoslaliberaciónespontáneadeglutamatoen lasinapsisentrelascolateralesdeSchaffer(SC)ylasneuronaspiramidalesdelaCA1del hipocampo(sinapsisSC‐CA1),enlaqueobservamosquesereducensignificativamentelos nivelesdeSNAP25antelaausenciadeCSPα/DNAJC5.Serealizaronregistrosdecorrientes postsinápticasminiatura(mEPSCs)enlascélulaspiramidalesdelaCA1,usandotetrodotoxina (TTX)paraevitarlageneracióndepotencialdeacción,picrotoxinaparabloquearlosreceptores deGABAAyfijandoelpotencialdemembranaa–70mV,asegurandoasíquetodaslascorrientes postsinápticasdetectadasfueranglutamatérgicas.Independientementedelospotencialesde acciónpresinápticos,lasvesículassinápticaspuedenfusionarseespontáneamenteconla membranapresinápticaliberandoneurotransmisor(FattyKatz,1952).Así,deacuerdoconla teoríacuánticadeliberacióndeneurotransmisor(DelCastilloyKatz,1954),lascorrientes postsinápticasexcitadorasminiaturasonelresultadodelafusiónespontáneadeunaúnica vesículaenelterminalpresináptico,presumiblementecadaunadeellasconelmismocontenido deneurotransmisor,originandolaactivacióndelosreceptorespostsinápticosdeglutamatoyla generacióndeunacorrienteiónicadepequeñaamplitud(evento). Paraelanálisisdelosregistrosobtenidos(Figura25A),semidieronvariosparámetrosdelos eventosdetectadosyserepresentóelpromedioporgenotipo(n=20célulasde5ratonesDnajc5 +/+yn=20célulasde5ratonesDnajc5‐/‐)(Figura25B).Igualmente,seobtuvieronhistogramas contodosloseventosindividualesporgenotipoparaalgunosparámetros(n=1575eventosde ratonesDnajc5+/+yn=1331eventosderatonesDnajc5‐/‐).Esteanálisismostróquenohay cambiosenlafrecuencia,eltiempodesubidadel20al80%,laduracióndelanchodeleventoa lamitaddelaamplitudmáxima(HW;half‐widthduration)ylaconstantedetiempodurantela fasededecaimientodelasmEPSCsenlasneuronaspiramidalesdelaCA1delosratonesDnajc5 KOencomparaciónconloscontroles(Tabla10;Figura25C,E,F,G).Sinembargo,seencontró
Resultados 72 quelaamplituddelasmEPSCsenelDnajc5KOsereducesignificativamenteencomparación conelcontrol(*p=0.0213,tdeStudent)(Tabla10;Figura25D).Lacargadelascorrientes postsinápticasfuealgoinferiorenelDnajc5‐/‐encomparaciónconladelcontrol,loquese explicabaporladisminuciónenlaamplituddelasmEPSCsenlosDnjac5KO.Sinembargo,esta diferencianoerasignificativa(Tabla10;Figura25H). mEPSCsDnajc5+/+Dnajc5‐/‐ ValorpPruebaestadística Frecuencia(Hz)0.41±0.040.39±0.04ns,p=0.5601UdeMann‐Whitney Amplitud(pA)14.12±0.9411.40±0.64*p=0.0213tdeStudent Tiempodesubida(ms)1.04±0.071.06±0.06ns,p=0.8087tdeStudent H‐W(ms)6.12±0.306.55±0.29ns,p=0.2964tdeStudent Decaimiento(ms)6.47±0.336.80±0.32ns,p=0.4745tdeStudent Carga(pA*ms)97.83±6.5479.13±7.18ns,p=0.0615tdeStudent Tabla10.ResumendelaspropiedadesdelasmEPSCsregistradasenlascélulaspiramidalesdelaCA1 enratonesDnajc5controlesyKO. Semuestranlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delafrecuencia,laamplitud,el tiempodesubida,elH‐W(half‐width),eldecaimientoylacargadelasmEPSCsregistradasenlascélulas piramidalesdelaCA1encortesdehipocampoderatonescontroles(Dnajc5+/+)yDnajc5KO(Dnajc5‐/‐) aP26‐31.Enlapenúltimacolumnaserepresentanlosvalorespobtenidostrasevaluarlosdatosconla pruebatdeStudentoUdeMann‐Whitney,segúnseespecificaenlaúltimacolumna.Seindicanlas diferenciasestadísticamentesignificativas:*p<0.05.ReferidoalaFigura25C‐H. Portanto,seobservóquelaausenciadeCSPα/DNAJC5enelterminalpresinápticonogenera alteracionesenlacinéticaoenlafrecuenciadelaliberaciónespontáneadeglutamato,perosí reduceeltamañodelascorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura,comopreviamentese hadescritoencultivodeneuronasdehipocampoenratonesDnajc5KO(García‐Junco‐Clemente etal.,2010). Figura25.Disminucióndelaamplituddelascorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs) enlascélulaspiramidalesdelaCA1dehipocampoenratonesDnajc5KO. A,RegistrosdemEPSCsgeneradasporlaliberaciónespontáneadeglutamatoyregistradasencélulas piramidalesdelaCA1enratonescontroles(Dnajc5+/+)yDnajc5KO(Dnajc5‐/‐)aP26‐31.B,Eventos promediodemEPSCsparaambosgenotipos.C,D,E,HistogramaydistribuciónacumuladadelasmEPSCs registradasencadagenotipo,ygráficodebarrasconlosvalorespromediodelafrecuencia,laamplitud, yeltiempodesubidaanalizadoseneleventopromediodelasmEPSCsdecadacélulaporgenotipo.F,G, H,GráficosdebarrasconlospromediosdelH‐W(half‐width),eldecaimientoylacargaanalizadostambién eneleventopromediodelasmEPSCsdecadacélulaporgenotipo.Sepuedeapreciarladisminución significativadelaamplituddelasmEPSCsenlascélulaspiramidalesdelaCA1enlosratonesDnajc5KO. Losnúmerosqueaparecendentrodelasbarrasindicanelnúmerodecélulasyratonesutilizados(Dnajc5 +/+:n=20célulasde5ratonesyDnajc5‐/‐:n=20célulasde5ratones).Lasbarrasdeerrorrepresentanel errorestándardelamedia(SEM).LapruebadeKolmogorov‐Smirnov(KS)seutilizóparadeterminarlas diferenciasentregenotiposenladistribucióndelosdatosenloshistogramas:intervaloentreeventos (**p=0.0019,KS),amplitud(****p<0.0001,KS),tiempodesubida(ns,p=0.4452,KS).Laspruebastde StudentyUdeMann‐Whitneyindicaronlasignificanciaestadísticaentrelosvalorespromedio:*p<0.05.
Resultados 79 CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,confirmandoladeleción específicadelaleloDnajc5porlaCreERT2‐recombinasaenlascélulasglutamatérgicasdel hipocampoycorteza.Tambiénsepudoapreciarunabandade750pb(Figura27B,flechanegra), correspondientealaleloDnajc5control(+)yKO(‐),tantoenloscontrolesDnajc5+/+yDnajc5‐ /‐comoenlosexperimentalesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ ,yaqueestosúltimosllevabanunaleloDnajc5control(+)yotroKO(‐),respectivamente. Además,sepudoobservarlabandade1029pb(Figura27B,flechagris)delaleloDnajc5floxeado sinrecombinarenloscontrolesDnajc5flox/floxsineltransgénUBCCreERT2,enelADNdelacola delosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,comose esperaba,yenelADNdelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/floxquenohabíarecibido tamoxifeno,indicandoenesteúltimocasoqueeltamoxifenoesestrictamentenecesariopara laactividaddelaCreERT2‐recombinasaynoexistíanfugasdelaactividadrecombinasa.
Resultados 80 Figura27.ValidaciónmediantePCRdelarecombinacióndelalelofloxeadoDnajc5porlaactividad CreERT2‐recombinasabajoelpromotorCaMKIIα. A,EstrategiadePCRdeADNgenómicoparaamplificarelexón3delgenDnajc5ydistinguirentreelalelo Dnajc5control(+),Dnajc5KO(‐),Dnajc5floxeado(tm1c)yDnajc5recombinado(tm1d).Loscebadores utilizadosserepresentanconflechasverdesenelsitiodondehibridanconsusecuenciadiana,donde01 esSLB‐2017‐01y02esSLB‐2017‐02.Aladerechasemuestranlostamañosdelasbandasobtenidastras laPCRencadacaso.Losintronesserepresentanconlíneasnegras,losexones2y4conrecuadrosgrises, elexón3conunrecuadroblancoresaltandosupapelenlaestrategiadiseñadaylosexones1y5nose representanporlarestriccióndeespacio.Todaslasrepresentacionesestánescaladas,exceptolossitios FRTyLoxP,lalongituddeloscebadoresyelcasetedeβ‐actina+neomicinaenelaleloDnjac5KO(‐).B, ImagendelgeldeelectroforesisenelquesemuestranlosproductosdelaPCRtantodelADNdelos controles(alaizquierdadelmarcadordepesomolecular)comodelosratonesexperimentales(ala derechadelmarcadordepesomolecular,exceptoelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/flox(F/F)quese utilizacomocontroldelaactividaddelaCreERT2sintamoxifeno(‐TMX)).Labandade245pb(flecharoja) confirmalarecombinacióneficienteenellocusDnajc5traslaactividadCreERT2inducidaportamoxifeno (+TMX)enhipocampoycortezaderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(F/+)y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(F/‐)(30díaspost‐TMX).Enestasmuestrastambiénaparecelabandade 750pb(flechanegra)correspondientealaleloDnjac5control(+)yDnajc5KO(‐),sinembargo,nose amplificalabandade1029pb(flechagris)delaleloDnajc5floxeadodeaquellascélulasquecarecendel promotorCaMKIIα,lacualsípodemosapreciarenlasmuestrasdecerebeloprobablementeporlamenor saturacióndeloscebadores. Sinembargo,enlasmuestrasdehipocampoycortezaenlosratonesexperimentales CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐noaparecelabandade1029 pbdelaleloDnajc5floxeadonorecombinadodeaquellascélulasquecarecendelpromotor CaMKIIαyque,portanto,noexpresanlaCreERT2‐recombinasa.Pensamosqueestabandanose amplificaporlasaturacióndeloscebadoresamplificandolabandade245pbdemenortamaño yquesísepuedeapreciarenlasmuestrasdecerebeloporlaescasaocasiausenciadeesta bandademenortamaño.Porúltimo,cabedestacarlaausenciadelabandade245pbenelADN decoladelaparejaderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ tratadoscontamoxifeno,poniendodemanifiestolaespecificidaddelaactividadCreERT2‐ recombinasasoloenaquellascélulasqueexpresanelpromotordeCaMKIIα. UnavezvalidadoelmodeloderatónanivelgenéticomediantePCRcontinuamosconla validaciónanivelbioquímico. 2.2.2.AnálisisdelosnivelesdeCSPα/DNAJC5enelhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ LosresultadospreviosqueobtuvimosenhipocampoderatonesDnajc5KOconvencionales (descritosenseccionesanteriores)hicieroncentrarnuestrointerésenelestudiodelhipocampo enlosratonescondicionalesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox.Así,paracomprobarlacaídade CSPα/DNAJC5enlosratonescondicionales,serealizówesternblotsconlisadosdehipocampo
Resultados 81 deratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ alos31‐32días post‐tamoxifeno(n=3ratonesporgenotipo).Tambiénsecomprobólaexpresióndeotras proteínaspresinápticascomoSNAP25,Hsc70,sinaptotagmina1(Syt1),sinaptotagmina2(Syt2), sinaptobrevina2(Syb2)ysinaptofisina2(Syph2).Seutilizaroncomocontroleslisadosde hipocampoderatonesDnajc5+/+yDnajc5‐/‐aP30‐31(1mes)(n=3ratonesporgenotipo). CSPα/DNAJC5SNAP25Hsc70Sinaptotagmina1 Dnajc5+/+1.00±0.141.00±0.121.00±0.211.00±0.03 Dnajc5‐/‐ 0.02±0.000.16±0.080.90±0.020.96±0.01 Valorp**p=0.0022**p=0.0045ns,p=0.6603ns,p=0.3152 Dnajc5flox/+1.00±0.051.00±0.081.00±0.111.00±0.07 Dnajc5flox/‐0.15±0.010.63±0.051.03±0.070.95±0.10 Valorp****p<0.0001*p=0.0148ns,p=0.8340ns,p=0.6880 Sinaptotagmina2Sinaptobrevina2Sinaptofisina2 Dnajc5+/+1.00±0.181.00±0.121.00±0.10 Dnajc5‐/‐ 0.81±0.031.16±0.071.24±0.04 Valorpns,p=0.3564ns,p=0.3136ns,p=0.0882 Dnajc5flox/+1.00±0.051.00±0.061.00±0.08 Dnajc5flox/‐0.95±0.041.01±0.100.89±0.05 Valorpns,p=0.5012ns,p=0.9565ns,p=0.7000 Tabla13.Resumendelosnivelesdeproteínaspresinápticasenhipocampodelosratones experimentales. Semuestranlasmediasnormalizadasconsusrespectivoscontroles±elerrorestándardelamedia(SEM) delosnivelesdeCSPα/DNAJC5,SNAP25,Hsc70,sinaptotagmina1(Syt1),sinaptotagmina2(Syt2), sinaptobrevina2(Syb2)ysinaptofisina2(Syph2)detectadosmediantewesternblotenhipocampode ratonesDnajc5+/+yDnajc5‐/‐ aP30‐31yderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos31‐32díaspost‐TMX.Tambiénserepresentanloscorrespondientes valorespobtenidostrasevaluarlosdatosconlapruebatdeStudent,exceptolosdatosdeDnajc5flox/+vs Dnajc5flox/‐desinaptofisina2queseevaluaronconlapruebaUdeMann‐Whitney.Seindicanlas diferenciasestadísticamentesignificativas:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001.Referidoala Figura28B. SedemostróquelaexpresióndeCSPα/DNAJC5caesignificativamenteenlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos30díaspost‐TMX(****p<0.0001,pruebatdeStudent)y tambiénenlosratonesDnajc5‐/‐ (**p=0.0022,pruebatdeStudent)(Tabla13;Figura28). Curiosamente,seobservóunareducciónsignificativaenlosnivelesdeSNAP25enlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐encomparaciónconelcontrolCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+ (*p=0.0148,pruebatdeStudent)(Tabla13;Figura28).Estosresultadoscoincidenconla disminucióndeSNAP25quepreviamentesehadescritoenestatesisdoctoralenelratónDnajc5 KO,yquesecorroboródenuevoenesteexperimentoencomparaciónconlosratonesDnajc5 +/+(**p=0.0045,pruebatdeStudent)(Tabla13;Figura28).Noseapreciarondiferencias significativasenelrestodelasproteínaspresinápticasanalizadas(Tabla13;Figura28).
Resultados 82 Figura28.Expresióndeproteínaspresinápticasenhipocampodelosratonesexperimentales. A,SemuestranlospesosmolecularesylasbandasdelasproteínasCSPα/DNAJC5,SNAP25,Hsc70,Syt1, Syt2,Syb2ySyph2obtenidasmediantewesternblotconlisadosdehipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos31‐32díaspost‐TMXyderatones Dnajc5+/+yDnajc5‐/‐aP30‐31utilizadoscomocontrol.B,Cuantificacionesdelosnivelesdeproteína normalizadosconsusrespectivoscontroles(Dnajc5‐/‐ consucontrolDnajc5+/+yDnajc5flox/‐ consu controlDnajc5flox/+).Seutilizaβ‐actinacomocontroldecarga.Sedemuestralaeliminacióneficientede CSPα/DNAJC5enlosratonesDnajc5flox/‐yseapreciaunareducciónsignificativaenlosnivelesdeSNAP25. También,secorroboralaeliminacióndeCSPα/DNAJC5ylareduccióndeSNAP25enlosratonesDnajc5 KO.n=3ratonesporgenotipo.Lasbarrassonlasmediasylasbarrasdeerrorrepresentanelerrorestándar delamedia(SEM).LapruebatdeStudentylapruebaUdeMann‐Whitneyseutilizaronparadeterminar lasignificanciaestadística:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001.
Resultados 83 EstosresultadosconfirmaronlaeficientedelecióndeCSPα/DNAJC5enelratón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ ycómolaausenciadeCSPα/DNAJC5exclusivamenteenlas neuronasglutamatérgicastambiénreducíalosnivelesdeSNAP25enlassinapsisdelhipocampo. 2.2.3.DistribuciónyexpresióndeCSPα/DNAJC5endiferentestiposneuronalesdel hipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ ParaobtenerunavisióngeneraldelaexpresióndeCSPα/DNAJC5ydelaproteína fluorescentetdTomatoenelhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ trasla actividadCreERT2‐recombinasainducidaportamoxifeno,realizamosexperimentosde inmunohistoquímicadecampoclaro.Paraesteexperimentoutilizamoscomoanimal experimentalunratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ycomocontrolunratónAi27D:Dnajc5flox/‐ quecarecedelaconstrucciónCaMKIIαcreERT2,esdecir,noexpresalaCreERT2bajoelpromotorde laCaMKIIα.Ambosratonesrecibierondietatamoxifenoalos2mesesdeedaddurante1mes. UtilizamoselcontrolAi27D:Dnajc5flox/‐porquealnoexpresarlaCreERT2‐recombinasa:(1)nose recombinaelcodóndeparadafloxeadoqueprecedealaconstrucciónChR2/tdTomato(Ai27D) ynoseexpresarálaproteínafluorescentetdTomato,permitiéndonoscomprobarqueel tamoxifenosinlaCreERT2notieneefectividady,(2)tampocoserecombinaráelalelofloxeadode Dnajc5flox/‐porloqueseráunheterocigotoparaelgenDnajc5(recordarqueelcontrolquese utilizóenelrestodeexperimentosfueunratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+quetrasla actividaddelaCreERT2‐recombinasaeraheterocigotoparaelgenDnajc5). MedianteinmunohistoquímicaseanalizólaexpresióndeCSPα/DNAJC5ytdTomatoen hipocampoderatonesAi27D:Dnajc5flox/‐yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos30yalos50días despuésdehaberrecibidoeltamoxifeno(30y50díaspost‐TMX)(n=1ratónporgenotipoy edad).SepudocomprobarlaeficazreduccióndeCSPα/DNAJC5endiferentesestratosdel hipocampoenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ alos30y50díaspost‐TMXen comparaciónconsusrespectivoscontrolesAi27D:Dnajc5flox/‐(Figura29AyB,panelessuperiores deCSPα/DNAJC5).Concretamente,laeliminacióndeCSPα/DNAJC5seaprecióabundantemente enelstratumoriens(so),elstratumradiatum(sr),lacapamolecularinterna(iml:innermolecular layer),elhilusdelgirodentado(H)yelstratumlucidum(sl).LacaídadeCSPα/DNAJC5parece algomayora50díaspost‐TMX,sinembargo,lainmunohistoquímicanoesunatécnica cuantitativa.Porello,observandolaeficientereduccióndeCSPα/DNAJC5queyaseapreciabaa 30díaspost‐TMX,decidimosparalosdemásexperimentosutilizarlosratonesa30díaspost‐ TMXparaasífacilitarlarealizacióndelosexperimentosdeelectrofisiologíaquesedificulta bastanteconlaedaddelratón.
Resultados 84 Figura29.ReduccióndeCSPα/DNAJC5yexpresióndetdTomatoenelhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alosalos30y50díaspost‐TMX. A,ImágenesdeinmunohistoquímicadecampoclaromostrandolaexpresióndeCSPα/DNAJC5(paneles superiores)ydetdTomato(panelesinferiores)encortesdehipocampoderatonesAi27D:Dnajc5flox/‐y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos30díaspost‐TMX.B,IgualqueenA,perosemuestrancortesde hipocampoderatonesAi27D:Dnajc5flox/‐yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos50díaspost‐TMX.Enel hipocampodelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ sepuedeapreciarladisminuciónde CSPα/DNAJC5encomparaciónconelcontrolylaexpresióndetdTomatoenlassinapsisqueexpresan CaMKIIα.NoseobservaexpresióndetdTomatoenelratóncontrolAi27D:Dnajc5flox/‐comoeradeesperar. so:stratumoriens;sp:stratumpyramidale;sr:stratumradiatum;slm:stratumlacunosum‐moleculare;ml: capamoleculardelgirodentado(molecularlayerofdentategyrus);oml:capamolecularexterna(outer molecularlayer);iml:capamolecularinterna(innermolecularlayer);gl:capadecélulasgranulares (granulecelllayer);H:hilusdelgirodentado;sl:stratumlucidum;DG:girodentado;áreasCA1yCA3.
Resultados 85 Porotrolado,noseobtuvoexpresióndetdTomatoenlosratonesAi27D:Dnajc5flox/‐,como seesperabaporlaausenciadelaconstrucciónCaMKIIαcreERT2quesehadetalladoanteriormente, ysísepudoobservarlaexpresióndetdTomatoengeneralentodaslascapasyestratosdel hipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alosalos30y50díaspost‐TMX(Figura 29AyB,panelesinferioresdetdTomato).Estosresultadosdemostraronlaexpresiónenel hipocampodelaCreERT2bajoelpromotordelaCaMKIIαysueficienteactividadrecombinasa permitiendolaexpresióndetdTomatoenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. Losresultadosdelwesternblotydelainmunohistoquímicademostraronlaeficiente reduccióndeCSPα/DNAJC5enelhipocampodelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.Por tanto,seconsideróelratóncondicionalCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5floxcomounmodeloválido paraestudiarlosefectosquesubyacenaladelecióndeDnajc5específicamenteenlasneuronas glutamatérgicas.Enconsecuencia,continuamosinvestigandoelfenotipoquedesarrollanestos ratones. 2.3.Estudiodelaviabilidad,longevidadyfenotiponeurológicoyconductualdelos ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ 2.3.1.Supervivenciaycurvadepesocorporal LosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐nomostraron unaletalidadtemprananiunfenotipodistinguibleinmediatamentedespuésdenacer.Serealizó unacurvadesupervivenciadesdelos0díasdespuésderecibireltamoxifeno(2mesesdeedad) hastalos16mesespost‐tamoxifeno(18mesesdeedad)(Figura30A)yseobtuvoun92.857%de supervivenciadelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yun60.714%desupervivenciade losratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(**p=0.0043,pruebaLong‐rank(Mantel‐Cox);n=28 ratonesporgenotipo)(Figura30B).Estosresultadosdemostraronquelamortalidaddelos ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐oDnajc5knockoutcondicionales(Dnajc5cKO)aumenta apartirdelos18mesesdeedad(16mesespost‐TMX).Además,seobservóqueencomparación conloscontroles,losratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos16mesespost‐tamoxifeno, aunquenodesarrollabanproblemasdemovilidad,mostraronmenorvitalidad,unaspecto desaliñadoporfaltadeacicalamiento,yenalgunosseapreciólaespaldaencorvada(síntomade malestarodolor)(Figura30).
Resultados 86 Machos Tiempopost‐TMXDnajc5flox/+(g)Dnajc5flox/‐(g)ValorpPruebaestadísitica 0días18.90±1.06(5)18.56±1.25(6)ns,p=0.8444tdeStudent 1mes24.90±1.02(12)26.23±0.59(10)ns,p=0.2982tdeStudent 2meses30.93±2.57(5)32.13±0.64(3)ns,p=0.2500UdeMann‐Whitney 3meses33.87±2.15(7)34.60±1.14(4)ns,p=0.8138tdeStudent 4meses40.37±2.97(5)36.83±0.66(3)ns,p=0.4087tdeStudent 5meses34.36±2.05(8)34.33±0.69(11)ns,p=0.6422UdeMann‐Whitney 6meses38.86±1.61(10)35.30±1.75(5)ns,p=0.1958tdeStudent 7meses33.98±2.07(4)36.68±0.48(8)ns,p=0.1134tdeStudent 8meses39.24±1.46(12)38.84±1.25(14)ns,p=0.8353tdeStudent 9meses41.48±1.66(12)40.02±0.83(12)ns,p=0.4402tdeStudent 10meses42.66±1.26(15)40.53±0.72(13)ns,p=0.1732UdeMann‐Whitney 11meses43.68±1.43(11)39.85±2.03(5)ns,p=0.0856UdeMann‐Whitney Tabla14.Resumendelosvaloresdepesocorporalenlosratonesmachoexperimentales. Serepresentanlospromedios±elerrorestándardelamedia(SEM)delospesoscorporalesdelosratones machoCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐desdelos0díaspost‐TMXhasta los11mesespost‐TMX.Entreparéntesisseindicaelnúmeroderatonesencadacaso.Enlapenúltima columnaserepresentanlosvalorespobtenidostrasevaluarlosdatosconlapruebatdeStudentoUde Mann‐Whitney,segúnseespecificaenlaúltimacolumna.ReferidoalaFigura30D. Hembras Tiempopost‐TMXDnajc5flox/+(g)Dnajc5flox/‐(g)ValorpPruebaestadísitica 0días16.92±0.88(7)16.41±0.87(3)ns,p=0.7410tdeStudent 1mes20.94±0.51(12)23.71±0.33(13)***p=0.0001tdeStudent 5meses24.50±0.86(6)27.84±0.78(6)*p=0.0166tdeStudent 6meses23.87±0.46(3)29.40±0.99(5)*p=0.0357UdeMann‐Whitney 7meses26.36±1.16(5)31.18±1.32(5)*p=0.0253tdeStudent 8meses27.23±1.36(11)33.83±0.63(12)***p=0.0009UdeMann‐Whitney 9meses29.24±1.73(8)35.37±1.25(10)**p=0.0094tdeStudent 10meses30.01±2.09(8)35.55±1.13(12)*p=0.0104tdeStudent 11meses28.37±1.47(3)36.74±1.72(7)*p=0.0188tdeStudent Tabla15.Resumendelosvaloresdepesocorporalenlosratoneshembraexperimentales. Serepresentanlospromedios±elerrorestándardelamedia(SEM)delospesoscorporalesdelosratones hembraCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐desdelos0díaspost‐TMX hastalos11mesespost‐TMX.Entreparéntesisseindicaelnúmeroderatonesencadacaso.Enla penúltimacolumnaserepresentanlosvalorespobtenidostrasevaluarlosdatosconlapruebatde StudentoUdeMann‐Whitney,segúnseespecificaenlaúltimacolumna.Seindicanlasdiferencias estadísticamentesignificativas:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.ReferidoalaFigura30E.
Resultados 87 Figura30.CurvadesupervivenciaydepesocorporalderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. A,Representaciónesquemáticadelcalendariodeladietatamoxifeno(TMX)ydeltiempopost‐TMXque correspondeacadaedad.B,AnálisisdesupervivenciadelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐hastalos16mesespost‐tamoxifeno(18mesesdeedad).Lasignificancia estadísticasecalculómediantelapruebadeLong‐rank(Mantel‐Cox)(**p=0.0043).C,Imagendeunratón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(izquierda)yunratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(derecha)alos16 mesespost‐TMX.Laspuntasdeflechaseñalanlafaltadeacicalamientoylaespaldaencorvadaquese apreciaenelratónDnajc5cKO.D,Curvadepesocorporalparalosratonesmacho CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐desdelos0díashastalos11meses post‐TMX.Noseobservarondiferenciassignificativas.E,Curvadepesocorporalparalosratoneshembra CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐desdelos0díashastalos11meses post‐TMX.Cambiossignificativosseobservarondesdelos30díaspost‐TMX.Lasbarrasdeerror representanelerrorestándardelamedia(SEM).LapruebatdeStudentylapruebaUdeMann‐Whitney seutilizaronparadeterminarlasignificanciaestadística:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.
Resultados 88 Tambiénserealizóunacurvadepesocorporaldesdelos0díaspost‐tamoxifenohastalos 11mesespost‐tamoxifeno.Lospesoscorporalesdelosmachosydelashembrasson naturalmentediferentes,porellosedecidiórealizarelestudioporseparadoparacadasexo(la ndeesteexperimentoesvariableparacadagenotipo,edadysexoporqueserecogieronlos pesosdediferentesratonesquesefueronprocesandoparaexperimentos).Losdatosdelacurva depesomostraronquelosratonesmachoCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐noexperimentaron ningúncambioenelpesocorporalencomparaciónconlosratonesmachocontrol(p.ej.0días post‐TMX:p=0.8444,ns,pruebatdeStudent;11mesespost‐TMX:p=0.0856,ns,pruebaUde Mann‐Whitney)(Tabla14;Figura30D).Sinembargo,enlosratoneshembra CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐sepudoapreciarunaumentoenelpesocorporalapartirde1 mespost‐tamoxifenoencomparaciónconlosratoneshembracontrol.Elaumentodepeso corporalenlashembrasDnajc5cKOfueestadísticamentesignificativodesde1meshastalos11 mesespost‐TMX(p.ej.0díaspost‐TMX:p=0.7410,ns,pruebatdeStudent;1mespost‐TMX: ***p=0.0001,pruebatdeStudent;11mesespost‐TMX:*p=0.0188,pruebatdeStudent)(Tabla 15;Figura30E). Estosdatosindicanque,ladeleciónespecíficadeDnajc5enlasneuronasglutamatérgicas aumentalamortalidadapartirdelos18mesesdeedad(16mesespost‐TMX)eincrementael pesocorporalenhembrasCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.Acontinuación,paracomprobarsi losratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐desarrollabanalgúnfenotipoconductualysiexistían diferenciasenelcomportamientoentrelosmachosylashembras,realizamosdiferentes estudiosdecomportamiento. 2.3.2.Análisisdelfenotiponeurológicoyconductual Paralosestudiosdecomportamientoquesedescribenacontinuación,seutilizaronratones machoyratoneshembraCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos 25‐46díaspost‐TMX(3mesesdeedad).Seescogióestaedadporquelosratoneshembra CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐experimentaronunincrementoenelpesocorporalapartirdel primermesdespuésdehaberrecibidoladietacontamoxifeno(3mesesdeedad).Además, previamentemediantePCRsedemostróladeleciónespecíficadelaleloDnajc5enlascélulas glutamatérgicasdelhipocampoycortezaaesaedad.Losestudiosdecomportamientose centraronenevaluartantolaactividadlocomotoraymotora(dadaladelecióndeDnajc5en corteza)comolamemoria(dadaladelecióndeDnajc5enhipocampo)enlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.
Resultados 95 2.3.2.4.Evaluacióndelamemoria EnlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐seeliminaCSPα/DNAJC5específicamenteen lassinapsisglutamatérgicasdelhipocampo,estructuraimplicadaenlaformacióndelamemoria yenlarecuperaciónderecuerdossobrepersonasoanimales,lugares,objetosyeventos(Zemla yBasu,2017).Porello,serealizaronestudiosdecomportamientoparaevaluardiferentestipos dememoriaenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐: memoriadetrabajoymemoriacontextual. 2.3.2.4.1.Memoriadereconocimientodeunobjetonuevo Lapruebadereconocimientodeunobjetonuevosebasaenlapreferenciainnatadelratón porlanovedadypermiteestudiarlamemoriadereconocimientodeobjetosacorto(1hora)y largoplazo(24horas).Enestapruebaseevitaelestrésinducidoquesegeneraenelratóncon otraspruebascomunesdeevaluacióndelamemoriacomoelcondicionamientoalmiedo(Kim yCho,2020),porello,serealizaantes. Enunaprimerafasedefamiliarización,alratónselepresentandosobjetosiguales(objeto familiar)y1horamástarde,paraevaluarlamemoriaacortoplazo(MCP),sesustituyóunode losobjetosporunobjetodiferente(objetonuevo1).Alas24horasdespués,paraevaluarla memoriaalargoplazo(MLP),semantuvoelobjetofamiliarenlamismaposiciónysecambióel otroobjetoporunonuevodiferente(objetonuevo2)(Figura33A).Encadafasesecuantificóel tiempoqueelratóninteraccionabaconelobjetofamiliaryconelobjetonuevoencadacaso (versecciónMaterialesyMétodos). Paraestapruebasesepararonlosmachosdelashembras(machos:n=11 CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yn=8CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐;hembras:n=4 CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yn=4CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐).Lainteraccióntotalcon losobjetosfuesimilarenlosratonesmachoyhembrasCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐tanto1horadespués(MCP)comoalas24horas(MLP).Solose aprecióenlaMCPunaligeradisminucióneneltiempototaldeinteracciónenlashembras CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐peronoeraestadísticamentesignificativo(MCP(machos: p=0.8925,ns,pruebatdeStudent;hembras:p=0.0606,ns,pruebatdeStudent),MLP(machos: p=0.9039,ns,pruebaUdeMann‐Whitney;hembras:p=0.9153,ns,pruebatdeStudent))(Tabla 21;Figura33B).Tambiénseevaluóelporcentajedeltiempototaldeinteracciónconelnuevo objetoynoseencontrarondiferenciassignificativasenlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐encomparaciónconloscontroles,nienlosmachosnienlas
Resultados 96 hembras(MCP(machos:p=0.6452,ns,pruebatdeStudent;hembras:p=0.5552,ns,pruebatde Student),MLP(machos:p=0.6655,ns,pruebatdeStudent;hembras:p=0.9538,ns,pruebatde Student))(Tabla21;Figura33B).Además,lapreferenciaporelobjetonuevofuesiempre superioral50%indicandoquenoexisteningúndeterioroenlamemoriadetrabajoniacortoni alargoplazoenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. Tampocosedetectaroncambioseneltiempodeinteraccióntotalnienelporcentajede interacciónconelobjetonuevocuandoseanalizaronlosdatosjuntosmezclandoambossexos enelgrupocontrolyenelDnajc5cKO(Tabla22;Figura33C). MachosHembras Dnajc5flox/+Dnajc5flox/‐Dnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ Memoriaa cortoplazo (1h) Interaccióntotal(s)33.22±2.7432.52±4.6445.53±3.8528.45±6.33 Interacciónconel objetonuevo(%)59.14±4.8262.47±5.0257.24±8.9064.50±7.48 Memoriaa largoplazo (24h) Interaccióntotal(s)29.65±3.2727.54±3.1323.40±2.4622.96±3.11 Interacciónconel objetonuevo(%)68.80±3.5066.33±4.5161.37±7.0660.81±6.03 Tabla21.Resumendelosparámetrosanalizadosenlapruebadereconocimientodeobjetonuevo realizadaalosratonesexperimentales(machosyhembras). Serepresentanlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)deltiempodeinteraccióntotal conambosobjetosyelporcentajedeinteracciónconelobjetonuevoqueexperimentanlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐a1mespost‐TMXdurantelapruebade reconocimientodeobjetonuevo,distinguiendoentremachosyhembras.Unapreferenciaporelobjeto nuevoinferioral50%indicadeteriorodelamemoria.ReferidoalaFigura33B. Ambossexos Dnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpEstadística Memoriaa cortoplazo (1h) Interaccióntotal(s)36.50±2.6231.16±3.62ns,p=0.2327tdeStudent Interacciónconel objetonuevo(%)58.63±4.1063.15±3.98ns,p=0.4440tdeStudent Memoriaa largoplazo (24h) Interaccióntotal(s)27.98±2.5526.01±2.34ns,p=0.5816UdeMann‐ Whitney Interacciónconel objetonuevo(%)66.82±3.1764.49±3.54ns,p=0.6281tdeStudent Tabla22.Resumendelosparámetrosanalizadosenlapruebadereconocimientodeobjetonuevo realizadaalosratonesexperimentales(ambossexos). Serepresentanlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)deltiempodeinteraccióntotal conambosobjetosyelporcentajedeinteracciónconelobjetonuevoqueexperimentanlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐a1mespost‐TMXdurantelapruebade reconocimientodeobjetonuevo,sindistinguirentresexos.Unapreferenciaporelobjetonuevoinferior al50%indicadeteriorodelamemoria.Enlapenúltimacolumnaserepresentanlosvalorespobtenidos trasevaluarlosdatosconlapruebatdeStudentoUdeMann‐Whitney,segúnseespecificaenlaúltima columna.ReferidoalaFigura33C.
Resultados 97
Resultados 98 Figura33.Memoriadereconocimientodeunobjetonuevoacortoylargoplazoenlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐a1mespost‐TMX. A,Representacióndelaconfiguracióndelosobjetos(familiarynuevo)queseutilizóencadafase: familiarización,MCP(memoriaacortoplazo,1horadespués),MLP(memoriaalargoplazo,24horas después).B,Cuantificacionesdeltiempodeinteraccióntotalconambosobjetos(s)yelporcentajede tiempoconelobjetonuevoevaluados1horadespuésdelafasedefamiliarización(MCP)enlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,distinguiendoentremachosyhembras porseparadoyambossexosjuntos.C,MismoanálisisqueenB,peroevaluado24horasdespuésdela fasedefamiliarización(MLP).Serepresentanlasmediasylasbarrasdeerrorconelerrorestándardela media(SEM)yencadagráficaseindicaelnúmeroderatonesporgenotipo.LapruebatdeStudentyla pruebaUdeMann‐Whitneyseutilizaronparadeterminarlasignificanciaestadística. 2.3.2.4.2.Memoriadecondicionamientodelmiedocontextual Elcondicionamientodelmiedocontextualsebasaenelaprendizajedelmiedoyenesta pruebalosratonesaprendenaasociaruncontextoneutralconunestímuloaversivoymuestran respuestasdemiedoauncontextoqueprediceelpeligro(KimyCho,2020).Estapruebaconsta deunaprimeraetapadecondicionamientoenlaquedespuésde2mindelibreexploracióndel ratónporelcubículo,seproporcionaron3descargaseléctricassuavesde0.2mAdurante2sen intervalosde2min(Intervaloentrepruebas),yunasegundaetapaalas24henlaqueseexpuso alratónalmismocubículodurante5minsinrecibirdescargas(contextual).Encadaetapase cuantificóelcomportamientodecongelaciónofreezingdelosratones(versecciónMateriales yMétodos). Paraestapruebasesepararonlosmachosdelashembras(machos:n=11 CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yn=10CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐;hembras:n=7 CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yn=9CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐).Noseobservaron diferenciassignificativasenelporcentajedefreezingqueexperimentaronlosmachosylas hembrasCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐encomparaciónconloscontroles CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+enningunadelasdiferentesfases:exploración(machos: p=0.7367,ns,pruebaUdeMann‐Whitney;hembras:p=0.6818,ns,pruebaUdeMann‐Whitney), intervaloentrepruebas1(machos:p=0.1313,ns,pruebaUdeMann‐Whitney;hembras: p=0.9493,ns,pruebaUdeMann‐Whitney),intervaloentrepruebas2(machos:p=0.2142,ns, pruebatdeStudent;hembras:p=0.2171,ns,pruebatdeStudent),intervaloentrepruebas3 (machos:p=0.8633,ns,pruebaUdeMann‐Whitney;hembras:p>0.9999,ns,pruebaUdeMann‐ Whitney),contextual(machos:p=0.0610,ns,pruebaUdeMann‐Whitney;hembras:p=0.2523, ns,pruebaUdeMann‐Whitney)(Tabla23;Figura34B).Losresultadosfueronsimilaresenlos machosylashembras,porello,tambiénseanalizaronlosdatosjuntossindistinguirentresexos (Tabla24;Figura34C).Secomprobólaausenciadecambiosenelcomportamientode
Resultados 99 congelaciónanteuncontextoquegeneraaversiónentrelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐yloscontrolesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+. %Freezingdurante:MachosHembras Dnajc5flox/+Dnajc5flox/‐Dnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ Exploración 0.64±0.200.79±0.451.23±0.660.86±0.48 Intervaloentrepruebas110.72±4.212.88±1.2317.82±6.4117.20±6.76 Intervaloentrepruebas246.45±7.4334.07±5.9473.06±4.1656.91±10.46 Intervaloentrepruebas365.27±5.0965.09±5.4187.77±3.2985.65±4.76 Contextual80.10±5.1289.75±3.3595.66±1.1089.76±3.03 Tabla23.Porcentajedefreezingqueexperimentanlosratonesexperimentales(machosyhembras)en lapruebadecondicionamientodelmiedocontextual. Serepresentanlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delporcentajede comportamientodecongelaciónofreezingqueexperimentanlosratonesmachoyhembras CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐a1mespost‐TMXdurantecadaunade lasfasesdelapruebadecondicionamientodelmiedocontextual.ReferidoalaFigura34B. %Freezingdurante:Ambossexos Dnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpEstadística Exploración 0.87±0.280.82±0.32ns,p=0.5933UdeMann‐Whitney Intervaloentrepruebas113.48±3.569.66±3.59ns,p=0.1975UdeMann‐Whitney Intervaloentrepruebas256.80±5.6744.89±6.29ns,p=0.1697tdeStudent Intervaloentrepruebas374.02±4.2374.83±4.28ns,p=0.8942tdeStudent Contextual86.15±3.6089.76±2.21ns,p=0.4476UdeMann‐Whitney Tabla24.Porcentajedefreezingqueexperimentanlosratonesexperimentales(ambossexos)enla pruebadecondicionamientodelmiedocontextual. Serepresentanlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delporcentajede comportamientodecongelaciónofreezingqueexperimentanlosratonesmachoyhembras CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐a1mespost‐TMXdurantecadaunade lasfasesdelapruebadecondicionamientodelmiedocontextual.Enlapenúltimacolumnaserepresentan losvalorespobtenidostrasevaluarlosdatosconlapruebatdeStudentoUdeMann‐Whitney,segúnse especificaenlaúltimacolumna.ReferidoalaFigura34C. Losresultadosdelapruebadereconocimientodeunobjetonuevoacortoylargoplazoy delapruebadecondicionamientodelmiedocontextualmostraronqueladelecióndeDnajc5 enlosratonescondicionalesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐nogeneradefectosaparentesenla memoria.Además,sedemostróquenoexistendiferenciasentreelcomportamientodelos machosylashembrasCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,porello,seutilizaronindistintamente ratonesdeambossexosenelrestodelosexperimentosdeestatesisdoctoral. Antelaausenciadeunaparentefenotipoconductualenlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,continuamoslainvestigacióncentrándonosenelestudiodeun posiblefenotipoenlassinapsisdelhipocampo.
Resultados 100
Resultados 101 Figura34.Memoriadecondicionamientodelmiedocontextualenlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐a1mespost‐TMX. A,Esquemadelasfasesdelaprimeraetapadecondicionamientoylasegundaetapadespuésde24horas paraevaluarlamemoriacontextualdelmiedo.B,Cuantificacionesdelporcentajedecomportamientode congelaciónofreezingqueexperimentanlosratonesmachoylosratoneshembra CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐encadafase.C,Mismoanálisisqueen B,perosindistinguirentresexos.Serepresentanlasmediasylasbarrasdeerrorconelerrorestándarde lamedia(SEM),yseindicaelnúmeroderatonesporgenotipo.LapruebatdeStudentylapruebaUde Mann‐Whitneyseutilizaronparadeterminarlasignificanciaestadística. 2.4.Estudiodelassinapsisglutamatérgicasenelhipocampodelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ 2.4.1.EstudiodelaexpresióndeCSPα/DNAJC5 Comosehadescritoenunasecciónanterior,sedemostrólareduccióndeCSPα/DNAJC5en diferentesestratosdelhipocampoenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ mediante inmunohistoquímicadecampoclaro.Acontinuación,medianteinmunofluorescenciaenrodajas dehipocamposevolvióacomprobarlaexpresióndeCSPα/DNAJC5ytdTomato,prestando especialatenciónalaexpresiónenlasprincipalessinapsisdelhipocampo.Paraeste experimentoseutilizaronratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(n=3),comocontroles,y ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(n=3)alos30díaspost‐TMX.Seobservólaexpresiónde tdTomatoengeneralportodoelhipocampotantoenlosratonescontrolescomoenlosDnajc5 cKO,demostrandounavezmáslaeficienteactividaddelaenzimaCreERT2‐recombinasa expresadabajoelpromotordelaCaMKIIαeinducidaporeltamoxifenoenambosgenotipos (Figura35).Además,encomparaciónconelcontrol,secomprobódenuevolareducciónde CSPα/DNAJC5enlossiguientesestratosdelhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐:elstratumoriens(so),elstratumradiatum(sr),lacapa molecularinterna(iml),elhilusdelgirodentado(H)yelstratumlucidum(sl)(Figura35). Concretamente,lacaídadeCSPα/DNAJC5enelstratumlucidumenelqueseencuentranlas fibrasmusgosas(MF)‐axonesdelascélulasgranularesdelgirodentado‐,yenelstratum radiatumenelqueseencuentranlascolateralesdeSchaffer(SC)‐axonesdelascélulas piramidalesdelaCA3‐,hizocentrarnuestraatenciónendossinapsisdelcircuitotrisinápticodel hipocampo.Estassinapsisfueron:(1)lasinapsisformadaentrelasfibrasmusgosasylas dendritasdelascélulaspiramidalesdeláreadelaCA3(MF‐CA3)y(2)lasinapsisformadaentre lascolateralesdeSchafferylasdendritasdelascélulaspiramidalesdeláreadelaCA1(SC‐CA1). Acontinuación,nospreguntamossienestassinapsisfundamentalesdelhipocampola eliminacióndeCSPα/DNAJC5supondríaalgunaalteraciónensucorrectofuncionamiento.
Resultados 102 Figura35.EliminacióndeCSPα/DNAJC5enlassinapsisMF‐CA3ySC‐CA1delhipocampoenratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alosalos30díaspost‐TMX. ImágenesdeinmunofluorescenciamostrandolaexpresióndeCSPα/DNAJC5,detdTomatoydeambosa lavezencortesdehipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos30díaspost‐TMX.SepuedeobservarlaeliminacióndeCSPα/DNAJC5 endiferentesestratosdelhipocampodelratónDnajc5cKOylaexpresióndetdTomatosimilaraladel control,demostrandoconestoúltimoquelaCreERT2‐recombinasaactúaporigualenelcontrolyenel Dnajc5cKO.so:stratumoriens;sp:stratumpiramidale;sr:stratumradiatum;iml:capamolecularinterna; H:hilusdelgirodentado;sl:stratumlucidum;DG:girodentado;áreasCA1yCA3delhipocampo;MF: fibrasmusgosas;SC:colateralesdeSchaffer. 2.4.2.Análisiselectrofisiológicodelatransmisiónsinápticaglutamatérgicaenel hipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ MedianteinmunofluorescenciademostramospreviamentelacaídadeCSPα/DNAJC5endos sinapsisprincipalesdelhipocampo(MF‐CA3ySC‐CA1)enelmodeloderatóncondicional CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.ParainvestigarlarelevanciadeCSPα/DNAJC5enelcorrecto funcionamientodeestassinapsis,nospropusimosestudiarlaliberaciónespontáneamediante elregistrodecorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs)enambassinapsis, utilizandocortesdehipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y
Resultados 103 CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos30díaspost‐TMX(3mesesdeedad).Cabedestacarla complejidadquesupusorealizarestosregistroselectrofisiológicosencortesdehipocampode ratonesadultos,dadaladificultadparamantenerlaviabilidadóptimadelasneuronasdeltejido cortadoaesaedad.Paraoptimizarlarealizacióndeestosexperimentossesiguióunmétodode recuperaciónprotectoradeN‐Metil‐D‐Glucamina(NMDG)(Tingetal.,2018)(verlasecciónde MaterialesyMétodos). 2.4.2.1.AnálisiselectrofisiológicodelasinapsisSC‐CA1delhipocampo 2.4.2.1.1.Estudiodelaliberaciónespontáneadeglutamatomedianteelregistrode corrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs) LascélulaspiramidalesdelaCA3proyectanhacialascélulaspiramidalesdelaCA1através delascolateralesdeSchaffer(SC),formandolasinapsisSC‐CA1delcircuitotrisinápticodel hipocampo(SprustonyMcBain,2007).Enestecaso,paraanalizarlaliberaciónespontáneade glutamatoenlasinapsisSC‐CA1seregistraroncorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura (mEPSCs)enlascélulaspiramidalesdelaCA1(Figura36A),usandoTTXypicrotoxina. mEPSCsDnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpPruebaestadística Frecuencia(Hz)1.46±0.142.88±0.29****p<0.0001UdeMann‐Whitney Amplitud(pA)10.85±0.5112.68±1.08ns,p=0.4773UdeMann‐Whitney Tiempodesubida(ms)0.93±0.060.82±0.05ns,p=0.3721UdeMann‐Whitney H‐W(ms)5.64±0.256.06±0.32ns,p=0.3130tdeStudent Decaimiento(ms)5.87±0.256.17±0.32ns,p=0.4502tdeStudent Carga(pA*ms)67.39±3.6984.72±5.66**p=0.0084UdeMann‐Whitney Tabla25.ResumendelaspropiedadesdelasmEPSCsregistradasenlascélulaspiramidalesdelaCA1 enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐35díaspost‐TMX. Semuestranlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delafrecuencia,laamplitud,el tiempodesubida,elH‐W(half‐width),eldecaimientoylacargadelasmEPSCsregistradasenlascélulas piramidalesdelaCA1encortesdehipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐35díaspost‐TMX.Enlapenúltimacolumnaserepresentanlos valorespobtenidostrasevaluarlosdatosconlapruebatdeStudentoUdeMann‐Whitney,segúnse especificaenlaúltimacolumna.Seindicanlasdiferenciasestadísticamentesignificativas:**p<0.01, ***p<0.001,****p<0.0001.ReferidoalaFigura36C‐H. Paraelestudiodelosresultados,seanalizaronvariosparámetrosdeloseventosindividuales yserepresentóelpromedioporgenotipo(Figura36B)(n=21célulasde5ratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yn=20célulasde5ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐). Tambiénseobtuvieronloshistogramascontodosloseventosindividualesporgenotipopara variosparámetros(n=3792eventosderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yn=5723 eventosderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐).Esteanálisisdemostrólaausenciade
Resultados 104 cambiossignificativosenlaamplitud,eltiempodesubida,elH‐W(half‐width)yeldecaimiento delasmEPSCsregistradasenlascélulaspiramidalesdelaCA1delosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,encomparaciónconloscontroles CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(Tabla25;Figura36D‐G).Sinembargo,lafrecuenciadelas mEPSCsenlosratonesDnajc5cKOaumentósignificativamente,siendocasieldobledela frecuenciaobtenidaenloscontroles(****p<0.0001,UdeMann‐Whitney)(Tabla25;Figura 36C).Además,tambiénseobservóunincrementoenlacargadelascorrientespostsinápticasen losratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ encomparaciónconladelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(**p=0.0084,UdeMann‐Whitney)(Tabla25;Figura36H).Esta diferenciaenlacargasepodríaexplicarporelpequeñoincrementoqueseaprecióenla amplitudyeneldecaimientodelasmEPSCsenratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,aunque nofueransignificativosenningúncaso,perosucombinaciónsereflejóenunaumentodela carga. ElaumentoenlafrecuenciadelasmEPSCsregistradasenlasneuronaspiramidalesdelaCA1 enelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ podríaindicarlaexistenciadeunproblema presinápticoenlasinapsisSC‐CA1.Acontinuación,paracomprobarsianivelpresinápticola sinapsisSC‐CA1enlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ presentabaalteracionesenla liberaciónevocaday/oenlaprobabilidaddeliberación,analizamoslaplasticidadacortoplazo mediantelaestimulacióndepulsopareado. Figura36.Aumentodelafrecuenciadelascorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs)en lascélulaspiramidalesdelaCA1dehipocampoenratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐35 díaspost‐TMX. A,RegistrosdemEPSCsencélulaspiramidalesdelaCA1enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+ (Flox/+)yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ (Flox/‐)alos29‐35díaspost‐TMX.B,Eventospromediode mEPSCsparaambosgenotipos.C,D,E,HistogramaydistribuciónacumuladadelasmEPSCsregistradas encadagenotipo,ygráficodebarrasconlosvalorespromediodelafrecuencia,laamplitud,yeltiempo desubidaanalizadoseneleventopromediodelasmEPSCsdecadacélulaporgenotipo.F,G,H,Gráficos debarrasconlospromediosdelH‐W(half‐width),eldecaimientoylacarga,analizadostambiénenel eventopromediodelasmEPSCsdecadacélulaporgenotipo.Nóteseunaumentosignificativoenla frecuenciayenlacargademEPSCsenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐encomparaciónconlos controles.Losnúmerosqueaparecendentrodelasbarrasindicanelnúmerodecélulasyratones utilizados(Flox/+:n=21célulasde5ratonesyFlox/‐:n=20célulasde5ratones).Lasbarrasdeerror representanelerrorestándardelamedia(SEM).LapruebadeKolmogorov‐Smirnov(KS)seutilizópara determinarlasdiferenciasentregenotiposenladistribucióndelosdatosenloshistogramas:intervalo entreeventos(****p<0.0001,KS),amplitud(****p<0.0001,KS),tiempodesubida(ns,p=0.1331,KS).Las pruebastdeStudentyUdeMann‐Whitneyindicaronlasignificanciaestadísticaentrelosvalores promedio:**p<0.01,****p<0.0001.
Resultados 111 Figura38.Lascorrientespostsinápticasexcitadorasminiatura(mEPSCs)noexperimentancambiosen lascélulaspiramidalesdelaCA3enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐33díaspost‐TMX. A,RegistrosdemEPSCsgeneradasporlaliberaciónespontáneadeglutamatoyregistradasencélulas piramidalesdelaCA3enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(Flox/+)y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(Flox/‐)alos29‐33díaspost‐TMX.B,EventospromediodemEPSCspara ambosgenotipos.C,D,E,HistogramaydistribuciónacumuladadelasmEPSCsregistradasencada genotipo,ygráficodebarrasconlosvalorespromediodelafrecuencia,laamplitud,yeltiempodesubida analizadoseneleventopromediodelasmEPSCsdecadacélulaporgenotipo.F,G,H,Gráficosdebarras conlospromediosdelH‐W(half‐width),eldecaimientoylacargaanalizadostambiénenelevento promediodelasmEPSCsdecadacélulaporgenotipo.Noseapreciandiferenciassignificativasenla frecuencia,laamplitud,nienlacinéticadelasmEPSCsenlasinapsisMF‐CA3encomparaciónconlos controles.Losnúmerosqueaparecendentrodelasbarrasindicanelnúmerodecélulasyratones utilizados(Flox/+:n=18célulasde5ratonesyFlox/‐:n=20célulasde5ratones).Lasbarrasdeerror representanelerrorestándardelamedia(SEM).LapruebadeKolmogorov‐Smirnov(KS)seutilizópara determinarlasdiferenciasentregenotiposenladistribucióndelosdatosenloshistogramas:intervalo entreeventos(**p=0.0011,KS),amplitud(**p=0.005,KS),tiempodesubida(****p<0.0001,KS).Las pruebastdeStudentyUdeMann‐Whitneyindicaronlasignificanciaestadísticaentrelosvalores promedio. Estudiosprevioshandemostradoquetraslaeliminacióndelascélulasdelgirodentadopor radiacióngammasesuprimenlasmEPSCsconunaamplitudmayorde45pA(>45pA), sugiriendoqueestoseventosprovienenespecíficamentedelasfibrasmusgosas(MFmEPSCs), mientrasqueloseventosmáspequeños(<45pA)puedenprovenirdecualquieradelastres entradasglutamatérgicasprincipalesalasneuronaspiramidalesdelaCA3:delasfibras musgosas,delavíaperforanteodelavíacomisural/asociacional(D.A.Henzeetal.,1997).Con elobjetivodecomprobarsienlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐latransmisión sinápticaespontáneaqueprovieneespecíficamentedesdelasfibrasmusgosassealteraantela ausenciadelacochaperonaCSPα/DNAJC5,sefiltraronlasmEPSCsdistinguiendoentrelas mEPSCsde>45pA(MFmEPSCs)ylasmEPSCsde<45pA(Figura39A).Así,seobtuvieron2767 eventos<45pAy595eventos>45pAen18célulasde5ratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+,y2665eventos<45pAy724eventos>45pAen20célulasde 5ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.Noseobservarondiferenciassignificativasenlas frecuenciasyamplitudespromediodelasmEPSCsde<45pAnienlasMFmEPSCsde>45pA entregenotipos(Tabla29;Figura39B‐E).Portanto,secomprobóquelaausenciade CSPα/DNAJC5enlosterminalesexcitadoresnoalterabalaliberaciónespontáneadeglutamato enlasinapsisMF‐CA3,nienelrestodelasaferenciasglutamatérgicasquerecibenlasneuronas piramidalesdelaCA3.
Resultados 112 mEPSCs<45pADnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpPruebaestadística Frecuencia(Hz)0.66±0.110.64±0.07ns,p=0.7560UdeMann‐Whitney Amplitud(pA)25.00±1.3923.92±0.91ns,p=0.5121tdeStudent MFmEPSCs>45pADnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpPruebaestadística Frecuencia(Hz)0.22±0.070.18±0.03ns,p=0.5151UdeMann‐Whitney Amplitud(pA)83.30±4.9287.93±5.19ns,p=0.5233tdeStudent Tabla29.ResumendelafrecuenciayamplitudpromediodelasmEPSCsde<45pAy>45pAregistradas enlascélulaspiramidalesdelaCA3. Semuestranlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delafrecuenciaylaamplitudde lasmEPSCsregistradasenlascélulaspiramidalesdelaCA3encortesdehipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ alos29‐33díaspost‐TMX, distinguiendoentrelasmEPSCsde<45pAy>45pA,siendoestasúltimasespecíficasdelatransmisión sinápticadesdelasfibrasmusgosas(MFmEPSCs).Enlapenúltimacolumnaserepresentanlosvaloresp obtenidostrasevaluarlosdatosconlapruebatdeStudentoUdeMann‐Whitney,segúnseespecificaen laúltimacolumna.ReferidoalaFigura39B‐E. Figura39.AusenciadecambiosenlasmEPSCsqueprovienenespecíficamentedelasfibrasmusgosas(> 45pA)odetodaslasaferenciasglutamatérgicas(>45pA)delascélulaspiramidalesdelaCA3enlos ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. A,RegistrorepresentativodemEPSCsregistradasencélulaspiramidalesdelaCA3.Seseñalaennaranja uneventoconunaamplitudmayorde45pA(>45pA),probablementeimpulsadoporlasfibrasmusgosas (MFmEPSCs),yenverdeuneventoconunaamplitudmenorde45pA(<45pA),procedentedealguna delastresaferenciasglutamatérgicasprincipalesdelascélulaspiramidalesdelaCA3.B,C,Frecuenciay amplitudpromediodelasMFmEPSCs>45pA.D,E,FrecuenciayamplitudpromediodelasmEPSCs<45 pA.Losnúmerosqueaparecendentrodelasbarrasindicanelnúmerodecélulasyratonesutilizados (CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(Flox/+):n=18célulasde5ratonesyCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ (Flox/‐):n=20célulasde5ratones).Lasbarrasdeerrorrepresentanelerrorestándardelamedia(SEM). LapruebatdeStudentylapruebaUdeMann‐Whitneyseutilizaronparadeterminarlasignificancia estadística.
Resultados 113 Trasanalizarlatransmisiónsinápticaglutamatérgicaendossinapsisprincipalesdel hipocampoenratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,secomprobólaausenciadecambiosen lasmEPSCsenlasinapsisMF‐CA3mientrasquelasinapsisSC‐CA1sídesarrollóunfenotipo sinápticoenlaliberaciónespontánea,singrandescambiosenlaliberaciónevocada,antela ausenciadeCSPα/DNAJC5.Acontinuación,enestatesisdoctoralnoscentramosenla reconstruccióndeneuronaspiramidalesdelaCA1conelobjetivodeanalizarlasespinas dendríticaspostsinápticas,yaqueunmayornúmerodeespinaspodríareflejarunaumentoen elnúmerodeterminalessinápticosquejustificaríaelaumentodelafrecuenciadelasmEPSCs enlasinapsisSC‐CA1delosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. 2.4.3.Análisismorfológicodeespinasdendríticasenneuronaspiramidalesdelaregión CA1delhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ EnlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐elfenotiposinápticoseobservaalregistrar lasmEPSCsenlasneuronaspiramidalesdelaCA1delhipocampo.Estasneuronasselocalizan enelstratumpyramidale(sp)delhipocampodesdedondeproyectansusdendritasbasaleshacia elstratumoriens(so)ysusdendritasapicaleshaciaelstratumradiatum(sr)yelstratum lacunosum‐moleculare(slm).EnlasdendritasapicalesdelasneuronasdelaCA1sedistinguen dostipos:lasproximales,máscercanasalsomayquediscurrenporelstratumradiatumdonde recibenlosimpulsosexcitadoresdelascolateralesdeSchafferqueprovienendelasneuronas piramidalesdelaCA3;ylasdistales,másalejadasdelsomayqueporelstratumlacunosummolecularedonderecibenestímulosdelavíaperforante(SprustonyMcBain,2007)(Figura40A, B). ParacomprobarsienlasinapsisSC‐CA1enlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐existe algunaalteraciónmorfológicaanivelpostsináptico,sereconstruyeronneuronaspiramidalesde laCA1.Seutilizólatécnicadepatch‐clampparainyectarintracelularmentebiocitinaenlas neuronasdelaCA1enelhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(n=3)y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(n=3)alos28‐35díaspost‐TMX(verlaseccióndeMaterialesy Métodos).Sereconstruyeronuntotalde5neuronasde3ratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y5neuronasde3ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ (Figura40C).Dadaladificultaddelatécnicadepatch‐clampqueseutilizóparalasinyecciones yteniendoencuentaladificultadañadidadelaedaddelosratones(3meses)paramantenerla viabilidaddelasneuronasduranteelexperimento,sepuedecomprobarquelainyecciónfue máseficienteenunasneuronasqueenotras.LasimágenesseprocesaronutilizandoImaris9.6
Resultados 114 (OxfordInstruments)paraeliminarelfondoyobtenerlareconstrucciónen3Ddelasneuronas inyectadas(Figura40B,C). SecuantificóelnúmerototaldedendritasapicalesencadaneuronareconstruidadelaCA1 yseobtuvoelpromedioporgenotipo.Noseencontrarondiferenciasentrelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ (Tabla30;Figura40D).Por tanto,secomprobóqueelnúmerodedendritasapicalesdelasneuronaspiramidalesdelaCA1 delhipocamponoseveíamodificadoantelaausenciadeCSPα/DNAJC5enlasneuronas glutamatérgicas.Sinembargo,nospreguntamossienlasdendritasapicalesproximalesdela CA1,querecibenlosestímulosdelascolateralesdeSchaffer,podríaexistiralgunaalteraciónen elnúmeroolamorfologíadelasespinasdendríticas. Nºdendritasapicales Dnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpPruebaestadística 31±4.0327±3.72ns,p=0.4456tdeStudent Tabla30.NúmerodedendritasapicalesdeneuronasdelaCA1enhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. Semuestraelpromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delnúmerototaldedendritasapicalesde neuronasdelaCA1inyectadasconbiocitinaenratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos28‐35díaspost‐TMX.Tambiénsemuestraelvalorpobtenidotras evaluarlosdatosconlapruebatdeStudent.ReferidoalaFigura40D. Así,conelobjetivodeanalizarlasespinasdendríticasdelasneuronasdelaCA1quereciben losimpulsosdelascolateralesdeSchaffer,setomaronimágenesdemayormagnificación específicamentedelasdendritasapicalesproximalesquediscurrenporelstratumradiatum (Figura41A,B),concretamentededendritassecundariasyterciarias.Lasimágenesse procesaronenImaris9.6(OxfordInstruments)paraobtenerlareconstrucciónen3Dy cuantificaryclasificarlasespinasdendríticas.Parafacilitarlareconstrucciónsesegmentaronlas dendritasutilizandounaregióndeinterésde300x200px(Figura41C,EyD,F),demaneraque seanalizóelmismonúmerodesegmentosporcadagenotipo.UtilizandolaextensióndeImaris clasificacióndeespinas,seobtuvolaclasificacióndelasespinasdendríticas(stubby,mushroom, longthinyfilopodia)(Figura41G,H),secuantificóelnúmerodeespinasdendríticas normalizándoloconlalongituddelossegmentosanalizados(nºespinas/µm)yseanalizóla longitudyelvolumendelasespinas.
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Resultados 116 Figura40.InyecciónintracelularconbiocitinayreconstruccióndeneuronaspiramidalesdelaCA1en hipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos28‐35 díaspost‐TMX. A,ImagenconfocaldeunaneuronadelaCA1inyectadaconbiocitinamediantelatécnicadepatch‐clamp. B,MismaimagenqueenA,peroprocesadaenImaris9.6.Sepuedeapreciarelsomadelaneuronaenel stratumpyramidale(sp)delhipocampo,lasdendritasbasalesqueproyectanhaciaelstratumoriens(so), lasdendritasapicalesqueproyectanhaciaelstratumradiatum(sr)donderecibenlosestímulosdelas colateralesdeSchaffer(SC)queprovienendelaspiramidalesdelaCA3(verenA)ylasdendritasapicales distalesqueproyectanhaciaelstratumlacunosum‐moleculare(slm).C,Reconstrucciónde5neuronasde laCA1deratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y5neuronasderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.D,Gráficodebarrasrepresentandoelpromediodelnúmerototalde dendritasapicalesporgenotipo.Noseobservandiferenciassignificativasenelnúmerodedendritas apicalesdelasneuronasCA1entrelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐encomparaciónconlos controles.Lasbarrasdeerrorrepresentanelerrorestándardelamedia(SEM).Seutilizólapruebatde Studentparadeterminarlasignificanciaestadística. Elnúmerodeespinas/µmdecadatipofuesimilarenambosgrupos(Tabla31;Figura41I)y tampocoseobtuvierondiferenciassignificativasenelnúmerototaldeespinas/µmnienla longitudnienelvolumendelasespinasdendríticasdelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐encomparaciónconlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+ (Tabla31;Figura41J,K,L).Portanto,losresultadosconfirmaronqueelaumentoenlafrecuencia delaliberaciónespontáneadeglutamatoquepresentabanlosratonescondicionales CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐nosedebíaporunaumentoenelnúmerodeespinasdendríticas postsinápticas. Nºespinas/µmDnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpPrueba estadística S tubby0.56±0.070.59±0.05ns,p=0.6671tdeStudent Mushroom0.08±0.000.10±0.01ns,p=0.1593tdeStudent LongThin0.24±0.010.18±0.03ns,p=0.0648tdeStudent Filopodia0.27±0.030.21±0.03ns,p=0.2354tdeStudent Nºtotaldeespinas/µm1.15±0.051.08±0.03ns,p=0.3075tdeStudent Longitudespinas(µm)1.11±0.041.04±0.05ns,p=0.3291tdeStudent Volumenespinas(µm3)0.15±0.010.15±0.02ns,p=0.8898tdeStudent Tabla31.Valoresdelosparámetrosanalizadosenlasespinasdendríticasdedendritasapicales proximalesdeneuronasdelaCA1enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. Semuestranlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delnºdeespinas/µmsegúnsu clasificaciónenstubby,mushroom,longthinyfilopodia,elnºtotaldeespinas/µmylalongitudyel volumendelasespinasdendríticasdetectadasendendritasapicalesproximalesdeneuronasdelaCA1 inyectadasconbiocitinaencortesdehipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos28‐35díaspost‐TMX.Tambiénserepresentanlosvalorespobtenidos trasevaluarlosdatosconlapruebatdeStudent.ReferidoalaFigura41I‐L.
Resultados 117
Resultados 118 Figura41.Similarnúmeroymorfologíadelasespinasdendríticasendendritasapicalesproximalesde neuronaspiramidalesdelaCA1enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. A,B,ReconstruccióndeunaneuronapiramidaldelaCA1inyectadaconbiocitinaenhipocampodeun ratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(A)yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(B).C,D,Imágenesdemayor aumentomostrandounadendritadeunratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(C)y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ (D)queseproyectahorizontalmenteysobrelaquesemarcaconun recuadrounaregióndeinterés.E,F,Imágenesrecortadasyampliadasdelaregióndeinterésseleccionada enCyD,respectivamente.Seseñalanaespinasdendríticasconunapuntadeflechablanca.G,H, resultadodelareconstrucciónen3DdelaregiónamplificadaenEyF,respectivamente.Semuestrala clasificacióndelasespinassegúnsuforma:stubby(s)enrojo,mushroom(m)enverde,longthin(lt)en azulyfilopodia(f)enrosa.I,J,K,L,Serepresentanengráficosdebarraslospromediosdelnúmerode espinas/µmdecadatipo,elnúmerototaldeespinas/µm,lalongitud(µm)yelvolumen(µm3)delas espinasdendríticasanalizadasporgenotipo.Losnúmerosenlasbarrasindicanelnúmerodeneuronas inyectadasylosratonesutilizados(Flox/+:n=5neuronasde3ratonesyFlox/‐:n=5neuronasde3ratones). Lasbarrasdeerrorrepresentanelerrorestándardelamedia(SEM).SeutilizólapruebatdeStudentpara determinarlasignificanciaestadística. Losresultadosobtenidoshastaelmomento,tantoenelestudioanivelpresinápticodela liberaciónevocadaenlasinapsisSC‐CA1comoenelestudioanivelpostsinápticodelasespinas dendríticasenneuronasdelaCA1,nodieronexplicaciónalfenotipoqueseencontróenla liberaciónespontáneadeglutamatoenlasinapsisSC‐CA1enlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.Porestemotivo,lasiguientepreguntaquenosplanteamosen estatesisdoctoralessilacaídadelosnivelesdeSNAP25,queobservamosenhipocampotrasla eliminacióndeCSPα/DNAJC5enlasneuronasglutamatérgicas,podríaguardarrelaciónconel fenotiposinápticoquedesarrollanlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. 2.4.4.EstudiodelaexpresiónydistribucióndeSNAP25ensinapsisglutamatérgicasen elhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ Comosehadescritoanteriormenteenestatesisdoctoral,mediantewesternblotse comprobóquelosnivelesdeSNAP25sereducensignificativamenteenelhipocampodelos ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ encomparaciónconloscontroles CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+.Porotrolado,losresultadosdelestudiodelaliberación espontáneaendossinapsisprincipalesdelhipocampodemostraronque,antelaausenciade CSPα/DNAJC5enlasneuronasglutamatérgicas,sedesarrollaunfenotiposinápticoenlasinapsis SC‐CA1ynoenlasinapsisMF‐CA3.Anteestosresultados,enestatesisestamosinteresadosen estudiarlaexpresióndelaproteínaSNAP25específicamenteenestasdossinapsisdel hipocampoquesecomportandeformadiferenteantelafaltadelacochaperonaCSPα/DNAJC5.
Resultados 119 ParacomprobarlosnivelesdeSNAP25enlassinapsisSC‐CA1yMF‐CA3,seobtuvieron rodajasdehipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐31díaspost‐TMX(n=3ratonesporgenotipo),yse diseccionaronconunbisturísiguiendoelpatróndecortequeserepresentaconunalínea discontinuaenlaFigura42A.Así,seconsiguiósepararyprocesarindependientemente:porun lado,lascolateralesdeSchafferjuntoconlasneuronaspiramidalesdelaCA1(regiónCA1),y, porotrolado,lasneuronaspiramidalesdelaCA3juntoconlasfibrasmusgosasyelgirodentado (regiónCA3+DG)(versecciónMaterialesyMétodos)(Figura42A).Serealizóunwesternblot conloslisadosdelasdosregionesysecomprobólaexpresióndeCSPα/DNAJC5ydelaproteína SNAREpresinápticaSNAP25.EnlosratonescondicionalesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ se comprobólacaídasignificativadelosnivelesdeCSPα/DNAJC5enambasregionesanalizadas (CA1:**p=0.0014,pruebatdeStudent;CA3+DG:***p=0.0002,pruebatdeStudent)(Tabla32; Figura42B,C),comoseesperaba.Asimismo,seaprecióunadisminuciónsignificativaenlos nivelesdeSNAP25enambasregionesdelhipocampodelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐encomparaciónconlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+ (CA1:*p=0.0265,pruebatdeStudent;CA3+DG:*p=0.0223,pruebatdeStudent)(Tabla32; Figura42B,C). ProteínaRegiones Dnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpEstadística CSPα/DNAJC5CA11.00±0.110.11±0.02**p=0.0014tdeStudent CA3+DG1.00±0.040.18±0.05***p=0.0002tdeStudent SNAP25CA1 1.00±0.080.68±0.04*p=0.0265tdeStudent CA3+DG1.00±0.030.76±0.06*p=0.0223tdeStudent Tabla32.ResumendelosnivelesdeCSPα/DNAJC5ySNAP25detectadosmediantewesternbloten diferentesregionesdelhipocampodelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. Semuestranlasmediasnormalizadasconelcontrol±elerrorestándardelamedia(SEM)delosniveles deCSPα/DNAJC5ySNAP25detectadosmediantewesternblotenlasregionesCA1yCA3+DGde hipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐31días post‐TMX.Tambiénserepresentanloscorrespondientesvalorespobtenidostrasevaluarlosdatosconla pruebatdeStudent.Seindicanlasdiferenciasestadísticamentesignificativas:*p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001.ReferidoalaFigura42C. EstosresultadoscorroboraronlacaídadeSNAP25enelhipocampoderatonescarentesde CSPα/DNAJC5exclusivamenteenlasneuronasglutamatérgicas.Además,sedemostróquelos nivelesdeSNAP25disminuyenparalelamenteenlaregiónCA1,queincluyelasinapsisSC‐CA1, yenlaregiónCA3+DG,queincluyelasinapsisMF‐CA3.
Resultados 120 Figura42.SimilarreduccióndelosnivelesdeSNAP25enlasregionesCA1yCA3diseccionadasdel hipocampoenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos29‐31díaspost‐TMX. A,Representacióndelmétododediseccióndelhipocampoqueseutilizóparaobtenerlisados independientesdeláreadelaCA1conlascolateralesdeSchaffer(CA1),ydeláreadelaCA3juntoconel girodentado(CA3+DG).B,SemuestranlospesosmolecularesylasbandasdelasproteínasCSPα/DNAJC5 ySNAP25obtenidasmediantewesternblotconlisadosdelasdiferentesregionesdiseccionadasdel hipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(Dnajc5flox/+oF/+)y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ (Dnajc5flox/‐ oF/‐)alos29‐31díaspost‐TMX.Seutilizaβ‐actinacomo controldecarga.C,Gráficodebarrasrepresentandolasmediasdelosnivelesdeproteínanormalizados conelcontrolDnajc5flox/+.SecorroboralacaídadelosnivelesdeCSPα/DNAJC5ySNAP25enelhipocampo delosratonesDnajc5cKO,demostrandounareduccióndeSNAP25paralelaenlasregionesCA1yCA3+ DG.n=3ratonesporgenotipo.Lasbarrasdeerrorrepresentanelerrorestándardelamedia(SEM).Se utilizólapruebatdeStudentparadeterminarlasignificanciaestadística:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.
Resultados 127
Resultados 128 Figura45.SimilarexpresióndeARNmdeSnap25enlasinapsisSC‐CA1yMF‐CA3enlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐. A,ImágenesdelhipocampocompletoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,alos30‐31díaspost‐TMX,mostrandolaexpresióndeARNmdeSnap25 (verde)detectadomediantelatécnicadeRNAscope.ElDAPI(magenta)marcalosnúcleoscelulares.Se indicaconpuntasdeflechablancaspordondetranscurrenlasfibrasmusgosas(MF)ylascolateralesde Schaffer(SC).Seseñalaconlíneasdiscontinuasblancaslasáreasdeinterés:áreaCA3,incluyendolas célulaspiramidalesdelaCA3enlasquesetraduceSNAP25queparticipaenlasinapsisSC‐CA1;y,área DG,incluyendolascélulasgranularesdelgirodentadoenlasquesetraduceSNAP25queparticipaenla sinapsisMF‐CA3.B,C,ImágenesdemayormagnificacióndelasáreasdeinterésindicadasenA,mostrando lascélulaspiramidalesdelaCA3enBylascélulasgranularesdelgirodentadoenD.Encadacaso,se muestralaimagenamplificadadeunaúnicacéluladeambosgenotipos.D,E,Gráficosdebarras representandolospromediosdelaintensidaddefluorescencia(UA:unidadesarbitrarias)delARNmde Snap25expresadoenlascélulaspiramidalesdelaCA3enC,yenlascélulasgranularesdelgirodentado enE,enambosgenotipos.Noseapreciarondiferenciassignificativasentregenotipos.Sinembargo, nóteselamayorexpresióndeARNmdeSnap25enlascélulaspiramidalesdelaCA3encomparacióncon lascélulasgranularesdelgirodentado.n=4ratonesdecadagenotipo.Lasbarrasdeerrorrepresentanel errorestándardelamedia(SEM).LapruebatdeStudentseutilizóparadeterminarlasignificancia estadística.DG:girodentado;áreasCA1yCA3delhipocampo;MF:fibrasmusgosas;SC:colateralesde Schaffer. Hastaahora,losexperimentosdeestatesisdoctoralsehanrealizadoconratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos30díasdespuésdehaber finalizadoladietacontamoxifeno(3mesesdeedad).Noobstante,paracomprobarsila diferentereduccióndeSNAP25enlassinapsishipocampalesglutamatérgicasantelaausencia deCSPα/DNAJC5semanteníaenratonesenvejecidos,seanalizóacontinuaciónmediante inmunofluorescencialaexpresióndeCSPα/DNAJC5ySNAP25enhipocampoderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesesdespuésdehaberrecibidoeltamoxifeno(10‐11 mesesdeedad). 2.4.4.2.MantenimientoalargoplazodelaproteínaSNAP25 ParacomprobarlaexpresióndeSNAP25enratonesquehubiesenpermanecidomásde1 messinCSPα/DNAJC5enlasneuronasglutamatérgicas,seutilizaronratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐de10‐11mesesdeedad,que habíanrecibidodietacontamoxifenoalmesdeedaddurante1mesyseprocesaronalos8‐9 mesestrashaberfinalizadoladietacontamoxifeno.Así,secomprobómediante inmunofluorescencialaexpresióndeCSPα/DNAJC5ySNAP25enrodajasdehipocampode ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+(n=3)yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐(n=3)alos8‐9 mesespost‐TMX. Enprimerlugar,secomprobóquelaexpresióndelmarcadorfluorescenteendógeno tdTomatofuesimilarenelhipocampodelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+,ydelratón
Resultados 129 CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,indicandounaactividadsemejanteenlaCreERT2‐recombinasa tantoenelcontrolcomoenelDnajc5cKO(Figura46,imágenessuperioresdetdTomato).Se observóqueenelhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ alos8‐9meses despuésderecibireltamoxifenopermaneceeliminadoCSPα/DNAJC5enelstratumoriens(so), elstratumradiatum(sr)porelquediscurrenlascolateralesdeSchaffer(SC)yenlacapa molecularinterna(iml),comoyaseobservóalos30díaspost‐TMX(Figura46,imágenesde CSPα/DNAJC5).Cabedestacarqueenelcontroltambiénseobservómenortinciónde CSPα/DNAJC5enlacapamolecularinternaquenoseaprecióalos30díaspost‐TMX.Además, enelstratumlucidum(sl),porelquediscurrenlosterminalesdelasfibrasmusgosas,seencontró unatincióndispersadeCSPα/DNAJC5enelDnajc5cKOquecuriosamentenoestabapresente enlosratonesmásjóvenesde3meses(30díaspost‐TMX).LaexpresióndeCSPα/DNAJC5enel stratumlucidumdelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesespost‐TMXsetrataba deunpunteadodispersoencomparaciónconelcontroleinterpretamosquelapresenciade CSPα/DNAJC5podríaprovenirdelosterminalesdelasfibrasmusgosasdenuevascélulas granularesnacidasporneurogénesisadultadespuésdelainterrupcióndeTMX(Figura46, recuadroamplificadoenlasimágenesdeCSPα/DNAJC5).Noobstante,laexpresióndeSNAP25 enelhipocampodelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐fuesimilaralaqueencontramos alos30díaspost‐TMX.Así,coincidiendoconlaeliminacióndeCSPα/DNAJC5,seaprecióuna reduccióndeSNAP25enelstratumoriens(so),elstratumradiatum(sr)yenlacapamolecular interna(iml),mientrasquepermanecíainalteradoenelstratumlucidum(sl)(Figura46, imágenesdeSNAP25).Nótesequeenlassinapsisglutamatérgicasdelhipocampotras8‐9meses sinlacochaperonaCSPα/DNAJC5,laproteínasinápticaSNAP25permanecedisminuidaenlos terminalesdelascolateralesdeSchafferynosealteraenlosterminalesdelasfibrasmusgosas. Figura46.ExpresióndeCSPα/DNAJC5enlosterminalesdelasfibrasmusgosasenratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesespost‐TMXydisminucióndeSNAP25enlasneuronas glutamatérgicasexceptoenlasfibrasmusgosas. ImágenesdeinmunofluorescenciamostrandolaexpresióndetdTomato(rojo),CSPα/DNAJC5(cian)y SNAP25(verde)encortesdehipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesespost‐TMX.EnlasimágenesdeCSPα/DNAJC5delcontroly delDnajc5cKOseremarcaunazonadelstratumlucidum(sl)quesemuestraampliadaenlaesquina superiorderecha,respectivamente.Curiosamente,enelDnajc5cKOseobservaexpresióndispersade CSPα/DNAJC5enlosterminalesdelasfibrasmusgosas(MF)queprovienendelasnuevascélulas granularesresultantesdeneurogénesis.SNAP25permanecedisminuidoenelstratumradiatum(sr)pero nosealteraenelstratumlucidum(sl).so:stratumoriens;sr:stratumradiatum;sl:stratumlucidum;iml: capamolecularinterna(innermolecularlayer);H:hilusdelgirodentado;DG:girodentado;áreasCA1y CA3delhipocampo;MF:fibrasmusgosas;SC:colateralesdeSchaffer.
Resultados 130 Acontinuación,sesiguióelmismopatrónqueseutilizóenlosratonesmásjóvenespara cuantificarlaexpresióndeCSPα/DNAJC5ySNAP25enlassiguientesdosregionesdeinterésdel hipocampo:laregiónSC‐CA1ylaregiónMF‐CA3(Figura47A,B).Secuantificólaintensidadde fluorescenciadelostresmarcadores(tdTomato,CSPα/DNAJC5ySNAP25)enunáreade100x 100µmenelstratumradiatumdelaregiónSC‐CA1yenelstratumlucidumenlaregiónMFCA3,enambosgenotipos(Figura47B)(versecciónMaterialesyMétodos).Laexpresiónde tdTomatofuesimilarenambosgrupostantoenelstratumradiatum (CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+:91.18±15.76;CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐:96.47±15.05, ns,p=0.8201,tdeStudent)comoenelstratumlucidum(CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+:56.70 ±2.01;CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐:59.69±11.68,ns,p=0.8137,tdeStudent),demanera queseutilizótdTomatoparanormalizarlaexpresióndeCSPα/DNAJC5ySNAP25.Seobtuvola ratiodeintensidaddefluorescenciaCSPα/tdTomatoySNAP25/tdTomato,yserepresentóel promedioporgenotipoyporelestratodelhipocampoanalizado.Losresultadosdemostraron queenelstratumradiatumdelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesespost‐ TMXlaexpresióndeCSPα/DNAJC5semantienereducidasignificativamente(*p=0.0464,tde Student),comoseesperaba(Tabla35;Figura48B,C).Sinembargo,sedemostróqueenel
Resultados 131 stratumlucidumdelosratonesDnajc5cKO,aunquelaexpresióndeCSPα/DNAJC5eramenory másdispersaencomparaciónconelcontrol,noseencontrarondiferenciassignificativas(ns, p=0.4000,UdeMann‐Whitney)(Tabla35;Figura47B,C)comoconsecuenciadelaexpresiónde CSPα/DNAJC5enlosterminalesdelasfibrasmusgosasdelasnuevascélulasgranulares procedentesdeneurogénesisalolargodelos8‐9mesestraslainterrupcióndeladieta tamoxifeno.Además,sedemostróque,alos8‐9mesespost‐TMX,SNAP25semanteníareducido significativamenteenelstratumradiatumenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ en comparaciónconelcontrol(**p=0.0071,tdeStudent),delocontrario,nosealterabaenel stratumlucidum(ns,p=0.2731,tdeStudent)(Tabla35;Figura47B,D). 8‐9mesespost‐TMX RatioEstratosDnajc5flox/+Dnajc5flox/‐ValorpEstadística CSPα/tdTomatos.radiatum0.26±0.060.08±0.02*p=0.0464tdeStudent s.lucidum0.71±0.160.41±0.09ns;p=0.4000UdeMann‐Whitney SNAP25/tdTomatos.radiatum0.35±0.05 0.08±0.01**p=0.0071tdeStudent s.lucidum0.54±0.020.66±0.09ns;p=0.2731tdeStudent Tabla35.RatiosdeintensidaddefluorescenciadeCSPα/tdTomatoySNAP25/tdTomatoenelstratum radiatumyelstratumlucidumdelhipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesespost‐TMX. Semuestranlosvalorespromedio±elerrorestándardelamedia(SEM)delaratiodeintensidadde fluorescenciadeCSPα/tdTomatoySNAP25/tdTomatocuantificadosenelstratumradiatumyenel stratumlucidumencortesdehipocampoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesespost‐TMX.Enlapenúltimacolumnaserepresentanlos valorespobtenidostrasevaluarlosdatosconlapruebatdeStudentoUdeMann‐Whitneycomoseindica enlaúltimacolumna.ReferidoalaFigura47C,D. TantoenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐jóvenes(3meses,30díaspost‐TMX) comoenlosenvejecidos(10‐11meses,8‐9mesespost‐TMX),losresultadosdemostraronla importanciadelacochaperonaCSPα/DNAJC5paramantenerlosnivelesdelaproteínaSNARE SNAP25enlasinapsisglutamatérgicaentrelascolateralesdeSchafferylasneuronaspiramidales delaCA1(SC‐CA1)peronoenlasinapsisentrelasfibrasmusgosasylasneuronaspiramidales delaCA3(MF‐CA3).CoincidiendoconlareduccióndeSNAP25enlasinapsisSC‐CA1,enlos ratonesDnajc5cKOseencontróunfenotiposinápticoenlaliberaciónespontáneadeglutamato enestamismasinapsis.ConsiderandodichacorrelacióndefenotiposenlasinapsisSC‐CA1ante laausenciadelacochaperonaCSPα/DNAJC5,nospreguntamossilafaltadeSNAP25enlas sinapsisglutamatérgicaspodríafenocopiaralratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.Coneste propósito,generamosunalíneaderatóncondicionalparainducirladelecióngénicadeSNAP25 exclusivamenteenneuronasglutamatérgicasenratonesadultos.
Resultados 132
Resultados 133 Figura47.CuantificacióndelaexpresióndeCSPα/DNAJC5ySNAP25enlassinapsisglutamatérgicasSCCA1yMF‐CA3enratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐alos8‐9mesespost‐TMX. A,ImágenesdelhipocampocompletoderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐,alos8‐9mesespost‐TMX(10‐11mesesdeedad),mostrando simultáneamentelaexpresióndetdTomato(rojo),CSPα/DNAJC5(cian)ySNAP25(verde)(verimágenes independientesdecadamarcadorenlaFigura46).Semarcaconunrecuadrodepuntosblancoslasdos regionesdeinterés(SC‐CA1yMF‐CA3).B,Imágenesdemayormagnificacióndelasregionesdeinterés seleccionadasenA(SC‐CA1alaizquierda,MF‐CA3aladerecha),mostrandoindependientementela expresióndetdTomato,CSPα/DNAJC5ySNAP25.Semarcaconunrecuadrodepuntosblancoslas regionesdeinterésenlasquesecuantificalaintensidaddefluorescenciadecadamarcadorenambos genotipos:enelstratumradiatum(sr)enlaregiónSC‐CA1;yenelstratumlucidum(sl)enlaregiónMFCA3.C,D,Gráficosdebarrasrepresentandolasmediasdelaratiodeintensidaddefluorescenciade CSPα/tdTomatoySNAP25/tdTomatocuantificadosenlasregionesdeinterésseleccionadasenB.Nótese lacaídasignificativadeCSPα/DNAJC5ySNAP25enelstratumradiatumdelosratonesDnajc5cKO,sin embargo,noseobtienendiferenciassignificativasenelstratumlucidumencomparaciónconelcontrol. peronoenlasfibrasmusgosas,seobservaqueenelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐.n=3ratones decadagenotipo.Lasbarrasdeerrorrepresentanelerrorestándardelamedia(SEM).Laspruebastde StudentoUdeMann‐Whitneyseutilizaronparadeterminarlasignificanciaestadística.sr:stratum radiatum;sl:stratumlucidum;áreasCA1yCA3delhipocampo;MF:fibrasmusgosas;SC:colateralesde Schaffer. 3.GeneraciónycaracterizacióndeunalíneaderatónKOcondicionalparaladeleción génicadeSNAP25enneuronasglutamatérgicasdelhipocampo 3.1.GeneracióndelalíneaderatónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox ParaestudiarelefectodeinactivargenéticamenteSNAP25enungrupoconcretode neuronas,seutilizaronlosratonestransgénicosSnap25flox(Marques‐Smithetal.,2016;Gustus etal.,2018;Hoerder‐Suabedissenetal.,2019)ysecruzaronconlosratonestransgénicos CaMKIIαcreERT2yAi27D(versecciónMaterialesyMétodos).Así,segeneróelmodeloderatón condicionalCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25floxquecarecíadeSNAP25exclusivamenteenaquellas célulasqueexpresanCaMKIIα,entreellaslasneuronasglutamatérgicasexcitadoras,ytambién expresabalaproteínadefusiónChR2‐tdTomato.Estudiospreviosdemostraronquelosratones knockouthomocigotosparaSnap25(Snap25KO)moríanalnacerporinsuficienciarespiratoria (Washbourneetal.,2002).Sinembargo,estenuevomodeloderatóncondicionalpermitíala delecióndeSnap25concontroltemporalbajolaactividaddeunaCreERT2‐recombinasainducida portamoxifeno. 3.2.Estudiodelaviabilidad,longevidadyfenotiponeurológicodelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox LosratonesexperimentalesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+(controles)y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox(Snap25knockoutcondicionalesoSnap25cKO)nomostraron
Resultados 134 unaletalidadtemprananiunfenotipodistinguibleinmediatamentedespuésdenacer.Estos ratonesrecibieronladietacontamoxifenoalmesdeedadeinicialmenteseplanteódurante1 mes,igualandolostiemposdetratamientoalosqueseutilizaronparaelmodeloderatón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox.Sinembargo,seobservóqueaumentabalamortalidaddelos ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxapartirdelos15díasconladietatamoxifeno(1mes ymediodeedad).Así,serealizóunacurvadesupervivenciadesdeelprimerdíaquerecibieron ladietaconTMXhastaeldecimoséptimodíadepermanecerconelTMXyseobtuvoun100% desupervivenciadelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+yun60%desupervivenciade losratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox(*p=0.0289,pruebaLong‐rank(Mantel‐Cox);n=10 ratonesporgenotipo)(Figura48A,B). Figura48.LetalidadtempranadelosratonescondicionalesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxalos15 díasdelaactivacióndelaCreERT2‐recombinasaconTMX. A,Representaciónesquemáticadelcalendariodeadministracióndeladietacontamoxifeno(TMX).B, AnálisisdesupervivenciadelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+y CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxdurantelos17primerosdíasquerecibenladietaTMX.Lasignificancia estadísticasecalculómediantelapruebadeLong‐rank(Mantel‐Cox)(*p=0.0397).C,Imágenesdel intestinoextendidodeunratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+yunratón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxalos15díasdeiniciareltratamientoconTMX(1mesymediodeedad). Seseñalaconpuntasdeflecharojaslasangrecoaguladaenelinteriordelintestinodeunratón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox.D,Gráficodebarrasrepresentandoelporcentajederatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxquemanifiestanhemorragia intestinalalos14‐15díasconelTMX.
Resultados 135 Además,algunosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxapartirdelos14díascondieta TMXmostraronunmalestadogeneralcaracterizadoporespaldaencorvada,aspectodesaliñado porfaltadeacicalamientoymenoractividadconreduccióndemovilidadenalgunoscasos.Estos signosestabanestrechamenterelacionadosconeldolor.Curiosamente,analizandoelestadode losdiferentesórganosdeestosratonesencontramoscúmulosdesangreprocedentesdeuna hemorragiaintestinalenel43%delosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox,en comparaciónconloscontrolesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+enlosqueel100%delos ratonespresentaronunintestinonormalsinningúnprocesohemorrágico(Figura48C,D). Lashemorragiasintestinalesseobservaronenlosratonesquemanifestabandebilidad.Por tanto,interpretamosquelossignosdemalestargeneraldelosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxpodríandebersealdolorcausadoporlosprocesos hemorrágicosenelintestino.Caberesaltarqueenlosratones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox,traslaactivacióndelaCreERT2‐recombinasaporelTMX,se conseguíaladelecióngénicadeSnap25entodaslascélulasqueexpresabanelpromotordela CaMKIIα.Así,lahemorragiaintestinalobservadaenlosratonesSnap25cKOsugeríaparálisis intestinalporafectacióndelosterminalesdelsistemanerviosoentéricodebidoaldéficitde SNAP25comoconsecuenciadeunainduccióninesperadadelaactividadCreERT2‐recombinasaen esasneuronas(Gaoetal.,2012). LaletalidadtempranadelosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxapartirdelos15 primerosdíasconTMXnosobligóaacotarelrangodetiempoparaprocesarlosratones experimentalesalos14‐16díasconTMX.Así,seprocedióacontinuaciónacomprobarsiesta cortaventanadetiempotraslaactivacióndelaCreERT2‐recombinasaconelTMXerasuficiente parareducirlosnivelesdeSNAP25enlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox. 3.3.AnálisisycursotemporaldelosnivelesdeSNAP25enhipocampo,cortezay cerebeloderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox ConelfindecaracterizarlosnivelesdeexpresióndelaproteínaSNAP25endiferentes estructurasdelsistemanerviosocentralenelratóncondicional CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxtras14‐15díasdelaactivacióndelaCreERT2‐recombinasase realizaronexperimentosdewesternblot.Así,seobtuvieronlisadosdehipocampo,cortezay cerebeloderatonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxalos 14‐15díasconTMX(n=3ratonesporgenotipo).
Resultados 136 EstructuraProteínaSnap25flox/+Snap25flox/floxValorpPruebaestadística Hipocampo SNAP251.00±0.030.26±0.03****p<0.0001tdeStudent CSPα/DNAJC51.00±0.050.93±0.03ns,p=0.2812tdeStudent Syt11.00±0.110.89±0.12ns,p=0.5568tdeStudent Syt21.00±0.070.92±0.05ns,p=0.3999tdeStudent Syb21.00±0.080.96±0.05ns,p=0.6545tdeStudent Corteza SNAP251.00±0.100.23±0.05**p=0.0022tdeStudent CSPα/DNAJC51.00±0.050.97±0.01ns,p=0.6440tdeStudent Syt21.00±0.020.98±0.04ns,p=0.4000UdeMann‐Whitney Syb21.00±0.051.12±0.06ns,p=0.9769tdeStudent Cerebelo SNAP251.00±0.030.92±0.10ns,p=0.4681tdeStudent CSPα/DNAJC51.00±0.060.97±0.08ns,p=0.7956tdeStudent Syt21.00±0.071.01±0.03ns,p=0.8989tdeStudent Syb21.00±0.010.98±0.08ns,p=0.8128tdeStudent Tabla36.Resumendelosnivelesdeproteínaspresinápticasenhipocampo,cortezaycerebelodelos ratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox. Semuestranlasmediasnormalizadasconsusrespectivoscontroles±elerrorestándardelamedia(SEM) delosnivelesdeSNAP25,CSPα/DNAJC5,sinaptotagmina1(Syt1),sinaptotagmina2(Syt2)y sinaptobrevina2(Syb2)detectadosmediantewesternblotenhipocampo,cortezaycerebeloderatones CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/+yCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxalos14‐15díasconTMX(1mesy mediodeedad).Tambiénserepresentanloscorrespondientesvalorespobtenidostrasevaluarlosdatos conlapruebatdeStudentoUdeMann‐Whitney,comoseespecificaenlaúltimacolumna.Seindicanlas diferenciasestadísticamentesignificativas:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001.Referidoala Figura49B,D,F. SecomprobóqueenlosratonesCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxsereducen significativamentelosnivelesdeSNAP25enelhipocampo(****p<0.0001,pruebatdeStudent) ylacorteza(**p=0.0022,pruebatdeStudent)peronoenelcerebelo(ns,p=0.4681,pruebat deStudent)(Tabla36;Figura49).Tambiénsecomprobólaexpresióndeotrasproteínas presinápticascomoCSPα/DNAJC5,sinaptotagmina1(Syt1),sinaptotagmina2(Syt2),y sinaptobrevina2(Syb2).Noseencontrarondiferenciassignificativasenlosnivelesdeestas proteínasentreelratónCaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxyelcontrolenningunadelas estructuras(Tabla36;Figura49),demostrándosequelaausenciadeSNAP25enlassinapsis glutamatérgicasnoalteralaexpresióndelasproteínaspresinápticasanalizadas. EstosresultadosdemostraronquedesdelaactivaciónconTMXdelaCreERT2‐recombinasa paraladelecióngénicadeSnap25eransuficientes14‐15díasparaqueenelratón CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/floxdisminuyeranlosnivelesdelaproteínaSNAP25enel hipocampoylacorteza,estructurasconunelevadonúmerodesinapsisglutamatérgicas.A continuación,medianteinmunohistoquímicaseestudiólacaídaprogresivadeSNAP25enel hipocampodelosratonesSnap25cKOparadeterminareltiempoalqueseprocesaríanlos ratonesexperimentales.