Estudio de la ubicuitilación del complejo MRN mediada por SCF(bTrCP/FBXW7): implicaciones biológicas

Departamento de Microbiología Estudio de la ubicuitilación del complejo MRN mediada por SCF(βTrCP/FBXW7): implicaciones biológicas TESIS DOCTORAL ALEJANDRO BELMONTE FERNÁNDEZ Sevilla, 2023 Departamento de Microbiología Estudio de la ubicuitilación del complejo MRN mediada por SCF(βTrCP/FBXW7): implicaciones biológicas Memoria presentada por el Graduado D. Alejandro Belmonte Fernández para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad de Sevilla Alejandro Belmonte Fernández Director del trabajo de investigación: Francisco Romero Portillo Sevilla, Abril 2023 Índice Índice III ÍNDICE DE CONTENIDOS III ÍNDICE DE TABLAS VII ÍNDICE DE FIGURAS VIII PRINCIPALES SIGLAS Y ABREVIATURAS XII Índice de contenidos Resumen 4 Introducción 1. El cáncer: un problema global 9 1.1. Biología del cáncer: las células cancerosas y el microambiente tumoral 9 1.2. Principales opciones terapéuticas 15 1.3. Quimioterapia basada en platinos: cisplatino 18 • Mecanismo de acción 19 • Mecanismos de resistencia al tratamiento 23 o Previos a la diana 24 o En la diana 25 o Posteriores a la diana 26 o Fuera de la diana 27 2. La reparación de roturas de doble cadena en el ADN 28 2.1. Unión de extremos no homólogos (NHEJ) 28 2.2. Recombinación homóloga (HR) 30 2.3. El complejo MRN 33 • Estructura de los componentes del complejo MRN 33 • Principales funciones del complejo MRN 36 • Patologías asociadas a defectos en el complejo MRN 40 3. La ubicuitilación de proteínas 43 3.1. Diversidad de la ubicuitilación 43 3.2. Maquinaria implicada y mecanismo de acción 45 3.3. El complejo ligasa de ubicuitina SCF 47 • La proteína F-box TrCP 50 o Sustratos de SCF(TrCP) destacables y regulación 51 o Papel de SCF(TrCP) en la transformación tumoral 53 • La proteína F-box FBXW7 55 o Sustratos de SCF(FBXW7) destacables y regulación 56 o Papel de SCF(FBXW7) en la transformación tumoral 57 3.4. Sistemas de degradación de proteínas dependientes de ubicuitina 59 • La vía del proteasoma 59 • La vía de la autofagia/lisosoma 61 Objetivos 69 Materiales y métodos Índice IV 1. Material biológico 73 1.1. Bacterias 73 1.2. Células de mamífero 73 • Cultivo de líneas celulares 74 • Descongelación y congelación de células 75 • Tratamiento con diversos compuestos 75 2. Manipulación de ácidos nucleicos 77 2.1. Plásmidos 77 2.2. Aislamiento de plásmidos de bacterias 79 2.3. Digestión de ADN con enzimas de restricción 79 2.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa 80 2.5. Purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa 80 2.6. Purificación mediante precipitación fenólica 80 2.7. Ligación de fragmentos de ADN 81 2.8. Reacciones de PCR 81 • Oligonucleótidos cebadores 81 • Amplificación de fragmentos de ADN para clonación 82 • Análisis de transformantes por PCR 82 2.9. Mutagénesis puntual 82 2.10. Transformación de bacterias electrocompetentes 83 2.11. Secuenciación 83 2.12. Transfección transitoria de células de mamíferos 84 • Transfección por electroporación 84 • Transfección con sistemas lipídicos 84 2.13. Producción de lentivirus 85 2.14. Transducción con lentivirus 85 2.15. ARNs pequeños de interferencia (siRNAs) 86 2.16. Silenciamiento génico transitorio 86 3. Análisis de proteínas 87 3.1. Preparación de extractos celulares 87 • Extractos totales 87 • Extractos celulares NP-40 87 • Fraccionamiento subcelular 88 o Obtención de extractos citosólicos y nucleares 88 o Obtención de extractos cromatínicos 89 o Obtención de fracciones enriquecidas en lisosomas 89 3.2. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford 90 3.3. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida-SDS 90 3.4. Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa 91 3.5. Fijación de proteínas 91 3.6. Tinción con rojo Ponceau 91 Índice V 3.7. Inmunodetección de proteínas 91 3.8. Transcripción-traducción in vitro 93 3.9. Ensayos de ubicuitilación 93 • Ubicuitilación in vitro 93 o Migración y tinción con azul de Coomassie 93 o Secado de geles y autorradiografía 94 • Ubicuitilación in vitro 94 3.10. Ensayos de co-inmunoprecipitación 95 4. Técnicas celulares 97 4.1. Inmunofluorescencia 97 4.2. Análisis de apoptosis mediante citometría de flujo 98 4.3. Análisis de actividad -galactosidasa en células senescentes 98 5. Cuantificación y análisis estadístico 99 Resultados 1. Caracterización de la asociación de TrCP y FBXW7 con las proteínas del complejo MRN. 103 1.1. TrCP y FBXW7 interaccionan in vivo con las proteínas del complejo MRN. 103 1.2. SCF(TrCP) y SCF(FBXW7) ubicuitilan proteínas del complejo MRN tanto in vitro como in vivo. 108 1.3. Búsqueda de motivos consenso de interacción con TrCP y FBXW7 en el complejo MRN. 110 1.4. Estudio de las potenciales quinasas implicadas en la asociación proteína F-box/sustrato. 114 2. Función de la asociación de las proteínas F-box con el complejo MRN. 118 2.1. Papel de la asociación entre SCF(TrCP) y el complejo MRN. 118 2.2. Estudio funcional de la ubicuitilación del complejo MRN por SCF(FBXW7). 121 • SCF(FBXW7) promueve la degradación del complejo MRN a través de la vía de la autofagia/lisosoma. 121 • El complejo MRN se asocia con p62/LC3 en el núcleo celular tras ser ubicuitilado por SCF(FBXW7). 125 • SCF(FBXW7) induce la localización del complejo MRN en los lisosomas. 131 • La apoptosis provocada por agentes genotóxicos estimula la degradación autofágica del complejo MRN mediada por SCF(FBXW7). 135 3. Efecto de la sobreexpresión de  TrCP en condiciones de senescencia. 143 Discusión 1. El complejo MRN, un nuevo sustrato de las ligasas de ubicuitina SCF(TrCP) y SCF(FBXW7). 156 Índice XII Principales siglas y abreviaturas A: alanina AUTOTAC: quimera dirigida a la autofagia C: cisteína C-terminal: extremo carboxilo terminal de una proteína o polipéptido CDKs: quinasas dependientes de ciclinas Cis: cisplatino Con A: concanamicina A CPD: fosfodegrón de CDC4 (FBXW7) D: ácido aspártico DMSO: dimetilsulfóxido DSB(s): rotura(s) de doble cadena del ADN DUB(s): desubicuitilasa(s) Dx: doxorrubicina E: ácido glutámico EN: extracto nuclear G: glicina HR: recombinación homóloga I: isoleucina IP: inmunoprecipitación K: lisina KU: complejo formado por KU70 y KU80 L: leucina lncRNAs: ARNs largos no codificantes MMR: reparación de errores de emparejamiento MRN: complejo formado por MRE11, RAD50 y NBS1 N: asparagina N-terminal: extremo amino terminal de una proteína o polipéptido NER: reparación por escisión de nucleótidos NHEJ: unión de extremos no homólogos Índice XIII P: prolina PROTAC: quimera dirigida a la proteólisis Q: glutamina R: arginina Rapa: rapamicina S: serina S100: extracto citosólico SASP: fenotipo secretor asociado a la senescencia SCF(TrCP/FBXW7): complejo formado por SKP1, CUL1, y TrCP o FBXW7 como proteína F-box siRNA: ARN pequeño de interferencia T: treonina TLS: síntesis por translesión Tre: trehalosa Ub: ubicuitina V: valina Wb: Western-blot Resumen Resumen 4 El cisplatino, como otros fármacos basados en platino, se encuentra entre los compuestos más usados en las quimioterapias contra distintos tipos de cánceres. Entre sus múltiples efectos, el cisplatino se une al ADN generando una gran variedad de lesiones que provocan, en última instancia, la muerte celular. Algunas de estas lesiones, en concreto las roturas de doble cadena, pueden ser reparadas por recombinación homóloga o por unión de extremos no homólogos, provocando resistencias al fármaco. Uno de los principales intervinientes en la reparación de las roturas de doble cadena es el complejo MRN (MRE11, RAD50 y NBS1), esencial para la identificación de las roturas, el reclutamiento de diversos factores de señalización y el procesamiento, todo ello encaminado a la reparación de las mismas. El complejo MRN también interviene en otros procesos, como la reparación del ADN tras la formación de aductos o tras el colapso de horquillas de replicación. Dado su papel en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, los defectos en los componentes del complejo MRN se han asociado con enfermedades como el cáncer. La ubicuitilación de proteínas es una modificación post-traduccional que desempeña importantes funciones en la célula: desde la degradación de proteínas vía proteasoma o lisosoma, hasta la modificación de la localización de proteínas concretas o participando en procesos de señalización. La ubicuitilación de las proteínas tiene un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis celular. Por ello, las alteraciones en la ubicuitilación de determinadas proteínas pueden contribuir a la transformación tumoral. En el proceso de ubicuitilación intervienen distintas enzimas, entre las que destaca la ligasa de ubicuitina, por ser la encargada del reconocimiento del sustrato. La ligasa de ubicuitina SCF está formada por una serie de subunidades entre las que se encuentran las proteínas F-box, cuyo papel es identificar a los sustratos específicos de esta ligasa. Dos de las proteínas F-box más destacadas de SCF son TrCP y FBXW7. Ambas son responsables de la ubicuitilación de una gran variedad de sustratos implicados en múltiples procesos celulares, y tanto estos como dichas proteínas F-box se han relacionado con diferentes aspectos de la transformación tumoral. En esta Tesis nos hemos centrado en el estudio del complejo MRN como potencial sustrato de SCF(TrCP/FBXW7). En el laboratorio se había realizado un estudio de las proteínas que interaccionaban con TrCP y FBXW7 mediante espectrometría de masas, y entre ellas estaban algunos de los componentes del complejo MRN. Ahora hemos podido confirmar que existe una asociación in vivo entre estas proteínas F-box y el complejo MRN en el núcleo de las células de mamífero. Además, tanto SCF(TrCP) como SCF(FBXW7) son capaces de ubicuitilar in vitro e in vivo ciertos componentes del complejo, por lo que este es sustratos de ambas ligasas de ubicuitina. La asociación entre TrCP y MRN ocurre a través de MRE11, que es la diana in vivo de esta proteína F-box, y está regulada por las quinasas p70S6K y GSK3. Esta última quinasa también interviene en la asociación de FBXW7 con el complejo MRN. Resumen 5 Profundizando en el papel fisiológico de las asociaciones entre estas proteínas F- box y el complejo MRN, pusimos de manifiesto que TrCP estimula la localización de los componentes del complejo en la cromatina, aunque se requieren más estudios para conocer la relevancia de estos resultados. Por su parte, la interacción entre FBXW7 y el complejo MRN induce la degradación del mismo por la vía de la autofagia/lisosoma. La ubicuitilación llevada a cabo por SCF(FBXW7) permite que el complejo MRN se asocie con los mediadores del flujo autofágico, p62 y LC3, en el núcleo de la célula para, posteriormente, trasladarse a los lisosomas, donde se llevará a cabo su degradación. Este proceso se potencia cuando la célula entra en apoptosis derivada del tratamiento con agentes genotóxicos. Por último, a raíz de los ensayos que realizamos estudiando el comportamiento del complejo MRN en respuesta a cisplatino, observamos en varias líneas celulares que el tratamiento con dosis subletales de cisplatino provocaba su entrada en senescencia. Sin embargo, en las líneas celulares equivalentes que sobreexpresaban  TrCP se producía muerte celular, mostrando además unos niveles de p21 CIP1 inferiores a los de las correspondientes líneas silvestres. En la Tesis discutimos las implicaciones derivadas de todos estos resultados. Introducción Introducción 15 1.2. Principales opciones terapéuticas Los tratamientos contra el cáncer han experimentado una gran evolución en las últimas décadas a medida que se ha alcanzado un mayor conocimiento de la biología y el desarrollo de esta enfermedad. Tradicionalmente, los tratamientos más utilizados han sido la resección quirúrgica del tumor localizado en un tejido u órgano específico, junto con radioterapia y quimioterapia. La radioterapia consiste en la eliminación de las células tumorales mediante radiación de alta energía y se utiliza en una proporción elevada de pacientes (Baskar et al, 2012). Por su parte, la quimioterapia utiliza fármacos citotóxicos que atacan especialmente a células con tasas de proliferación altas, como las células cancerígenas, pero también afectan a otras células normales que proliferan rápidamente, como las células de la piel, la médula ósea o el epitelio del tracto gastrointestinal. Esto causa una elevada toxicidad, provocando los efectos secundarios más comunes asociados a estos tratamientos (Chabner & Roberts Jr, 2005). El repertorio de fármacos quimioterápicos es enormemente variado. Los primeros grupos de fármacos utilizados fueron los agentes alquilantes (derivados de las mostazas nitrogenadas, como la ciclofosfamida, entre otros), que causan citotoxicidad al añadir grupos alquilo al ADN, y los antimetabolitos (aminopterina, metotrexato, etc.), que son moléculas cuya estructura mimetiza la de metabolitos fisiológicos provocando el bloqueo de ciertas reacciones enzimáticas e inhibiendo la replicación del ADN y, en última instancia, la proliferación celular. Destacan también los fármacos antimitóticos (vinblastina, paclitaxel, etc.), que interfieren en la dinámica de los microtúbulos y bloquean la mitosis impidiendo la proliferación; los antibióticos citotóxicos (doxorrubicina, actinomicina D, etc.); los inhibidores de poliaminas y su transporte (-difluorometilornitina, entre otros) y los agentes moduladores de hierro (deferoxamina, triapina, etc.) (Falzone et al, 2018). A la variedad de quimioterapias existentes hay que sumar las terapias combinadas que se aplican hace décadas y han mejorado sustancialmente los resultados en los pacientes (Shewach & Kuchta, 2009). En la práctica clínica resulta también común el uso de terapias hormonales, beneficiosas contra aquellos tumores que tienen una pronunciada dependencia hormonal, como los de mama o próstata. Consiste en el uso de compuestos que interfieren con la producción de hormonas, como los inhibidores de la aromatasa, o bloquean ciertos receptores hormonales, como los antiandrógenos (Fairchild et al, 2015; Abraham & Staffurth, 2016). No obstante, la escasa especificidad y los importantes efectos secundarios de las terapias clásicas ponen de manifiesto la necesidad de buscar nuevos tratamientos más tolerables y efectivos. En este sentido, el conocimiento cada vez mayor sobre las rutas celulares de señalización que dirigen procesos fundamentales para el mantenimiento de las células tumorales ha permitido el desarrollo de nuevas terapias que mejoran en eficacia y reducen los efectos indeseados de las quimioterapias tradicionales. Son las llamadas terapias dirigidas (Figura 2). Estas terapias tienen como objetivo bloquear Introducción 16 rutas o proteínas específicas, es decir, dianas moleculares como receptores, factores de crecimiento, quinasas o moléculas relacionadas con la apoptosis o la angiogénesis, que están presentes también en células normales pero que suelen estar sobreexpresadas o mutadas en las células cancerígenas, resultando esenciales para el mantenimiento de las mismas. De esta manera, el efecto tóxico se concentra en las células malignas, minimizándose en las células sanas y evitándose así buena parte de los posibles efectos secundarios (Chabner & Roberts Jr, 2005). Figura 2. Dianas moleculares de algunas terapias dirigidas. Se representan anticuerpos monoclonales dirigidos contra factores de crecimiento específicos, que impiden que estos interaccionen con sus receptores, o contra receptores quinasas de tirosina (RTK) extracelulares, que bloquean la señalización a través de estos. También se muestran algunos inhibidores de proteínas quinasas (inhibidores de EGFR y VEGFR, inhibidores de ALK/EML4, inhibidores de BCR-ABL, inhibidores de RAF, inhibidores de mTOR e inhibidores de MEK). Todos estos compuestos interfieren rutas o proteínas específicas que son esenciales para el mantenimiento de las células cancerígenas. Figura modificada a partir de Falzone et al, 2018. Entre las terapias dirigidas destaca la inmunoterapia. Los tratamientos inmunoterapéuticos tienen como objetivo estimular el sistema inmune del paciente para que sea capaz de reconocer y atacar a las células cancerosas. Estas terapias, cuya efectividad se ha demostrado contra diferentes tipos de cáncer, incluyen el uso de anticuerpos monoclonales contra diferentes antígenos, citoquinas, vacunas o terapias basadas en células (Lee Ventola, 2017a, 2017b). Los anticuerpos monoclonales se han convertido en una parte fundamental de las terapias contra el cáncer, gracias a su versatilidad en el reconocimiento de diferentes receptores u otras proteínas celulares (Falzone et al, 2018). Así, pueden ejercer una acción citotóxica directamente sobre las células tumorales estimulando el sistema inmune para que desarrolle respuestas Introducción 17 anticancerígenas, bloquear los mecanismos inmunosupresores que permiten que las células cancerosas escapen del sistema inmune o anular el efecto de moléculas angiogénicas que estimulan la vascularización del tumor (Zahavi & Weiner, 2020; Falzone et al, 2018; Guo & Cui, 2020). Por otro lado, dentro de las terapias dirigidas nos encontramos un grupo amplio de pequeñas moléculas inhibidoras. Son compuestos de bajo peso molecular que se pueden unir con gran afinidad a un rango amplio de dianas extracelulares e intracelulares, entre las que destacan quinasas de tirosina, quinasas de serina/treonina, maquinaria de regulación epigenética o proteínas de la familia BCL-2 (Sharma et al, 2022; Bedard et al, 2020). La selectividad de estos compuestos es variable, lo que permite dividirlos en dos grandes grupos: los inhibidores multiquinasa, que están dirigidos simultáneamente contra diversas quinasas de la célula, y los inhibidores selectivos, que tienen menos dianas e incluso, en algunos casos, solo una, lo que es especialmente eficaz en aquellos tumores que presentan dependencia de una oncoproteína concreta o alguna vulnerabilidad específica (Bedard et al, 2020; Paez et al, 2004). Asimismo, para evitar la falta de especificidad de la quimioterapia tradicional, se han desarrollado sistemas para el envío dirigido de moléculas citotóxicas conjugadas a anticuerpos monoclonales o ligandos peptídicos, o incluidas en nanoestructuras transportadoras. El conocimiento de marcadores específicos presentes en la superficie de las células tumorales de forma exclusiva, o más abundante de lo habitual en una célula normal, permite que, con estos métodos, se alcance una mayor concentración del fármaco en las células cancerosas, reduciendo así la toxicidad periférica (Hughes, 2010; Allen, 2002; Okarvi, 2008; Danhier et al, 2010). Existe una gran variedad de nanoestructuras con aplicación en la terapia contra el cáncer, como por ejemplo las nanopartículas poliméricas, dendrímeros o liposomas. Estas nanoestructuras se pueden “cargar” por diferentes métodos y hacer diana en las células tumorales bien a través de antígenos específicos o gracias a la elevada permeabilidad de los vasos sanguíneos neoformados que nutren el tumor. Esto, junto al pobre drenaje linfático del mismo, hace que los nanotransportadores se acumulen pasivamente en los tejidos neoplásicos en lugar de hacerlo en los tejidos sanos. Sin embargo, pese a sus ventajas, también presentan ciertas limitaciones, como la dificultad para penetrar en las regiones profundas del tumor (Gmeiner & Ghosh, 2015; Zhao et al, 2018). Los tratamientos contra el cáncer constituyen un campo en constante evolución. Las opciones terapéuticas se han multiplicado, apareciendo nuevas líneas de tratamiento que presentan una mayor eficacia respecto a las tradicionales, con una reducción significativa de los efectos secundarios sobre los tejidos sanos. Sin embargo, factores como la amplia heterogeneidad intra e intertumoral, la diversidad de tipos celulares, tejidos y órganos a los que el cáncer puede afectar, o el hecho de que los tumores no sean estáticos sino que vayan evolucionando con el tiempo a medida que Introducción 18 acumulan nuevas mutaciones, entre otros factores (Duffy, 2013), hacen que el tratamiento para esta enfermedad siga siendo un reto a día de hoy. 1.3. Quimioterapia basada en platinos: cisplatino Entre los fármacos quimioterapéuticos más utilizados en la clínica destacan los agentes basados en platino. Son compuestos de coordinación metálicos constituidos por un átomo de platino central al que se le unen diversos ligandos. Entre ellos, nos centraremos en el cisplatino (cis-[Pt(NH3)2Cl2], cis-diaminodicloroplatino (II) o CDDP). En su caso, al platino central se le unen 4 ligandos formando una geometría plana cuadrada: dos grupos amino fuertemente unidos al átomo de platino y dos grupos cloruro en posición cis que permitirán ejercer su acción citotóxica (Dasari & Bernard Tchounwou, 2014). El cisplatino fue sintetizado por primera vez por Michele Peyrone en 1844 y su estructura química elucidada por Alfred Werner en 1893 (Dasari & Bernard Tchounwou, 2014). Sin embargo, el efecto antitumoral de este compuesto comenzó a estudiarse a partir de las observaciones realizadas por el físico americano Barnett Rosenberg y su equipo en la década de 1960. Intentando averiguar el posible efecto de la aplicación de un campo eléctrico sobre el crecimiento bacteriano, descubrieron por casualidad que, a partir de los electrodos de platino inmersos en el medio de cultivo bacteriano que estaban utilizando, se formaban sales de platino que impedían la división bacteriana. De entre las sales formadas, los mayores efectos se observaron en el caso del cisplatino (Rosenberg et al, 1967, 1965). Estudios posteriores comprobaron que el efecto antiproliferativo de este compuesto también era aplicable al cáncer (Rosenberg et al, 1969). Así, en 1978 la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration, FDA) de Estados Unidos aprobó el uso del cisplatino como nuevo fármaco contra el cáncer, dando comienzo así a una nueva etapa revolucionaria en quimioterapia marcada por el desarrollo y uso de agentes basados en platino (Prestayko et al, 1979). Desde sus inicios, los fármacos derivados del platino, en especial el cisplatino, son el pilar fundamental de la quimioterapia para el tratamiento de varios tipos de cánceres, entre los que destacan los de testículo, vejiga, pulmón, ovario, cuello uterino, esófago, estómago, mama, próstata y cabeza y cuello (Kelland, 2007). Sus aplicaciones son múltiples, abarcando distintos regímenes de tratamiento en combinación con otros fármacos quimioterápicos o radioterapia (Wang et al, 2021). El fármaco suele provocar una respuesta terapéutica inicial exitosa, asociada con una remisión completa o parcial, o una estabilización de la enfermedad (Galluzzi et al, 2012). Por desgracia, también puede provocar diversos efectos secundarios en los pacientes, como nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, cardiotoxicidad, ototoxicidad o neurotoxicidad, así como náuseas y vómitos (Dasari & Bernard Tchounwou, 2014; Introducción 19 Dilruba & Kalayda, 2016; Kelland, 2007; Cvitkovic et al, 1977). Además, la resistencia al cisplatino representa un obstáculo importante para el éxito del tratamiento. Ciertos tumores son intrínsecamente resistentes al fármaco mientras que otros originalmente sensibles desarrollan resistencia gradualmente después de la respuesta inicial (Galluzzi et al, 2012). Los importantes efectos secundarios y la aparición de quimiorresistencias impulsaron el desarrollo de nuevos compuestos derivados del original, en cuyas estructuras los ligandos iniciales son sustituidos por otros diferentes (Figura 3), afectando con ello a su actividad biológica (Dasari & Bernard Tchounwou, 2014). Así, pasando por la segunda generación de compuestos en la década de 1980, representada por el carboplatino, y la tercera generación a principios de los 2000, representada por el oxaliplatino, llegamos hasta las versiones más recientes, donde la variedad de compuestos derivados del platino se diversifica mucho más (satraplatino, nedaplatino, heptaplatino o lobaplatino, entre otros) (Dilruba & Kalayda, 2016). Con todos estos compuestos se pretende mantener o mejorar la eficacia del original, a la vez que reducir los efectos secundarios y la aparición de resistencias. No obstante, el tratamiento con cisplatino sigue siendo todavía la opción preferente en múltiples situaciones clínicas. Figura 3. Estructura molecular del cisplatino y de algunos de sus compuestos derivados. Figura modificada a partir de Mastalarz et al, 2020. • Mecanismo de acción Tras confirmarse el efecto antitumoral del cisplatino, comenzó a estudiarse su mecanismo de acción (Figura 4). En el torrente sanguíneo y en los fluidos extracelulares el fármaco tiene escasa actividad, siendo prácticamente inerte. A día de hoy, el mecanismo por el cual el cisplatino se incorpora a la célula sigue sin estar totalmente definido. Tradicionalmente se pensaba que la entrada ocurría por difusión Introducción 20 pasiva a través de la membrana plasmática y por medio de transportadores específicos (Gately & Howell, 1993). Diversos estudios han demostrado que entra en la célula a través del sistema de transportadores del cobre CTR, como CTR1 y CTR2, una familia de proteínas transmembrana que participan en el transporte y homeostasis de este metal (Kilari et al, 2016). Por otro lado, también se ha visto que intervienen los canales de aniones regulados por volumen (VRACs, del inglés volume-regulated anion channels), formados por heterómeros de la proteína LRRC8. Se ha estimado que una proporción elevada del cisplatino que entra en la célula depende de sus subunidades LRRC8A y LRRC8D (Planells‐Cases et al, 2015). Además de estos transportadores, se han descrito otros potenciales candidatos, aunque tienen un papel menos definido (Rottenberg et al, 2021). Una vez dentro de la célula, la molécula de cisplatino debe activarse, para lo cual se sustituyen uno o los dos grupos cis-cloruro que posee inicialmente por moléculas de agua. Por tanto, la activación del cisplatino depende de las condiciones del medio, en concreto, de la concentración fisiológica del ion cloruro: en la sangre, la concentración es de alrededor de 100 mM, suficientemente alta como para mantener la molécula de cisplatino en su estado inicial inactivo. Dentro de las células, la concentración del ion es bastante más baja, lo que permite la sustitución de estos grupos por agua, con la consiguiente activación de la molécula (Chu, 1994). Figura 4. Mecanismo de acción del cisplatino. Cuando el fármaco se incorpora a la célula, la baja concentración intracelular del ion cloruro permite la hidratación de la molécula de cisplatino, que se torna reactiva. Entonces, ejerce su acción citotóxica tanto a nivel citoplasmático como nuclear, provocando así la muerte celular. Figura modificada a partir de Wang et al, 2021. Las formas mono y bi-hidratadas del cisplatino son altamente reactivas, causando efectos citotóxicos tanto a nivel citoplasmático como a nivel nuclear. Si bien la diana clásica del cisplatino es el ADN celular, además de unirse y lesionar también el ADN mitocondrial, los efectos de este fármaco a nivel citoplasmático son destacables, ya Introducción 21 que se ha demostrado una citotoxicidad significativa en células enucleadas (Berndtsson et al, 2007). Una proporción considerable del cisplatino que entra en la célula interacciona con una gran variedad de moléculas nucleófilas presentes en el citoplasma, como el glutatión reducido (GSH), los grupos tiol o sulfhidrilo de proteínas como las metalotioneínas o ciertos fosfolípidos, entre otras (Galluzzi et al, 2014). Estas interacciones facilitan la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés reactive oxygen species) que tienen un papel dual, favoreciendo por un lado la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MOMP, del inglés mitochondrial outer membrane permeabilization) que conduce a la apoptosis, y agravando por otro lado el daño en el ADN causado por el cisplatino directamente (Sancho-Martínez et al, 2012). A nivel nuclear, el cisplatino se une con gran afinidad al ADN, concretamente a los sitios N7 de las purinas, generando monoaductos y enlaces intracatenarios 1,2 y 1,3 (Chen et al, 2016a). Las uniones intracatenarias 1,2 constituyen la lesión más frecuente, contribuyendo en gran medida a la citotoxicidad (Chaney et al, 2005). También, aunque en menor proporción, se generan enlaces intercatenarios (Ming et al, 2017), los cuales, al unir covalentemente las dos hebras de la molécula de ADN, obstaculizan la apertura de la doble hélice que tiene lugar en diferentes procesos como el de replicación (o la transcripción), provocando el colapso de la horquilla de replicación y la aparición de roturas de doble cadena (DSBs, del inglés double-strand breaks) (Rocha et al, 2018). Toda esta variedad de lesiones en el ADN puede ser reparada por diferentes vías, entre las que destacan la reparación por escisión de nucleótidos (NER, del inglés nucleotide excision repair), la reparación de errores de emparejamiento (MMR, del inglés mismatch repair), la recombinación homóloga (HR, del inglés homologous recombination) y la unión de extremos no homólogos o recombinación no homóloga (NHEJ, del inglés nonhomologous end joining) (Martin et al, 2008). En consecuencia, los aductos y los enlaces en las cadenas de ADN alteran y dañan la estructura de la doble hélice e interfieren con los procesos de replicación y transcripción. Se activa entonces la respuesta a daños en el ADN, provocando una parada del ciclo celular, fenómeno que permite a los mecanismos de reparación reestablecer la integridad del ADN, evitando así posibles mitosis anormales (Vitale et al, 2011). Si el daño es excesivo y no se puede reparar, las células entran en muerte celular programada, generalmente apoptosis (Figura 5). Muy resumidamente, esto implica la activación secuencial de las quinasas ATM y ATR, que activan a sus proteínas efectoras CHK2 y CHK1, respectivamente, quienes a su vez fosforilan a la proteína supresora de tumores p53 provocando su estabilización (Roos et al, 2016). Esta ejerce diversas funciones tanto a nivel nuclear, activando la expresión de genes cuyos productos estimulan la apoptosis, como a nivel citoplasmático, lo que promueve la permeabilización de la membrana externa de la mitocondria, desencadenando así la Introducción 22 apoptosis intrínseca, promovida internamente en la célula. También se estimula la expresión de genes que codifican componentes de la vía apoptótica extrínseca, promovida por factores externos (Kroemer et al, 2007; Galluzzi et al, 2011). La vía extrínseca se activa cuando ligandos concretos se unen a receptores específicos de la membrana plasmática, miembros de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR). Tras la unión, se transmiten señales al interior celular que reclutan procaspasas e inician la cascada apoptótica (Kischkel et al, 1995). Por su parte, en la vía intrínseca intervienen las proteínas de la familia BCL-2, que facilitan la formación de poros en la membrana externa mitocondrial, permitiendo así la liberación del citocromo C al citoplasma. Este se une al factor activador de proteasas apoptóticas APAF1 y, junto a la procaspasa 9, forman el apoptosoma. Se produce entonces la activación de otras caspasas, como las caspasas 3 y 7, que se encargarán de procesar diversos sustratos celulares (Nuñez et al, 1998). Introducción 23 Figura 5. Apoptosis derivada del daño en el ADN. El daño en el ADN activa la apoptosis, tanto por la vía intrínseca como extrínseca, a través de 3 efectores principales: JNK, p53 y MYC. Respecto a la vía extrínseca, se activan proteínas que actúan a modo de ligandos de los receptores de muerte localizados en la membrana plasmática, como es el caso del ligando FAS (FASL) para el receptor FASR. Tras la unión ligando-receptor, estos receptores transmiten señales al interior celular por medio del complejo señalizador de inducción de muerte (DISC) provocando la activación de las caspasas. Respecto a la vía intrínseca, la estabilización de p53 debida a las fosforilaciones llevadas a cabo por CHK2 y CHK1, activadas a su vez por ATM y ATR, y la inducción de MYC, entre otros factores, promueven que los miembros proapoptóticos de la familia BCL-2 inhiban a los antiapoptóticos y generen poros en la membrana externa mitocondrial, permeabilizándola. Tiene lugar entonces la liberación del citocromo C al citoplasma, el cual se asocia con APAF1 y la procaspasa 9, formando el apoptosoma. Este complejo facilita la activación de las caspasas 3 y 7, que se encargan de ejecutar el resto del programa apoptótico mediante el procesado de diversos sustratos, como proteínas de ciclo o de reparación del ADN. Además, procesan a ICAD, inhibidor de la DNasa activada por caspasas (CAD), lo que permite que esta fragmente el ADN celular. Figura modificada a partir de Roos et al, 2016. • Mecanismos de resistencia al tratamiento Como se ha descrito anteriormente, la buena respuesta inicial que muestran los pacientes de diversos tipos de tumores al tratamiento con cisplatino a menudo deriva en la aparición de resistencias que provocan el fracaso terapéutico. Dado que en la acción citotóxica de este fármaco intervienen diversos mecanismos moleculares, el fenotipo de resistencia puede deberse a alteraciones en uno o más de uno de esos circuitos (Galluzzi et al, 2012). Los mecanismos de resistencia al cisplatino suelen clasificarse según el momento en que tenga lugar el fenómeno respecto al principal objetivo del fármaco: la unión al ADN celular. Así, podemos encontrar mecanismos de resistencia previos a la diana, en la diana, posteriores a la diana o fuera de esta (Figura 6). Introducción 24 Figura 6. Mecanismos de resistencia al cisplatino. Se representan los mecanismos previos a la diana (1), como la reducción de la entrada del fármaco o su inactivación citoplasmática; en la diana (2), como una mayor eficacia de los mecanismos de reparación de daños en el ADN o una mayor capacidad para tolerar los daños; posteriores a la diana (3), como la inactivación de la proteína p53; y fuera de la diana (4), como una mayor actividad autofágica. Figura modificada a partir de Dilruba & Kalayda, 2016. o Previos a la diana Se distinguen dos mecanismos principales por los que las células cancerosas pueden eludir el efecto del cisplatino antes de que este ejerza su acción citotóxica: la reducción de la acumulación intracelular de cisplatino y la inactivación del cisplatino citoplasmático. La reducción de la acumulación intracelular del fármaco puede deberse bien a una disminución en la entrada del mismo o bien a un aumento en su expulsión. El tratamiento con cisplatino puede seleccionar células con una menor expresión del transportador de cobre CTR1, lo que conlleva a una menor entrada de este fármaco (Holzer et al, 2006). También se ha asociado a este fenómeno la pérdida de las subunidades LRRC8A y LRRC8D de los canales tipo VRACs (Planells‐Cases et al, 2015). Por otro lado, las ATPasas de tipo P extrusoras de cobre, ATP7A y ATP7B, parecen estar implicadas en la excreción del cisplatino. ATP7A lo aísla en vesículas para evitar una mayor distribución, mientras que ATP7B es responsable de su expulsión (Kalayda et al, 2008; Safaei, 2006). Estos transportadores se han encontrado sobreexpresados en células cancerosas resistentes a cisplatino (Samimi et al, 2004). Igualmente, se ha estudiado que la sobreexpresión de proteínas de resistencia a múltiples fármacos, especialmente MRP2, miembro de la familia de transportadores ABC, también Introducción 31 ADN, como la histona H2AX, cuya fosforilación es un marcador temprano de la presencia de DSBs en la cromatina, así como otras proteínas implicadas en distintas etapas de la HR (Li et al, 2000; Matsuoka et al, 2007; Savic et al, 2009; Wang et al, 2013a). Para que tenga lugar la reparación de los daños en el ADN por HR es necesario que se generen extremos con salientes 3’-hidroxilo de cadena sencilla a ambos lados del punto de rotura. Con este fin tiene lugar una resección inicial en la que participa la subunidad MRE11 del complejo MRN, cuya actividad nucleasa permite procesar los extremos dañados. En este paso no sólo interviene este complejo, sino también CtIP y BRCA1 (Huertas, 2010; Cejka & Symington, 2021). La ligasa de ubicuitina BRCA1 interacciona con CtIP y lo poliubicuitila, lo que resulta esencial para su reclutamiento en los sitios de daño en el ADN y la apropiada resección (Chen et al, 2008; Yu et al, 2006; Yun & Hiom, 2009). Se forma así un complejo MRN/CtIP/BRCA1 que lleva a cabo una resección corta a ambos lados de la rotura. Posteriormente, esta resección se amplia y acelera por medio de otras nucleasas como EXO1, la nucleasa/helicasa DNA2 y la helicasa BLM, formándose así tramos más largos de ADN monocatenario (Cejka & Symington, 2021). En todo este proceso intervienen además las quinasas ATM y ATR, miembros de la familia de proteínas quinasas PIKKs, que modulan la actividad de algunas de las proteínas que intervienen en la resección, como el complejo MRN, EXO1 y DNA2 (Jasin & Rothstein, 2013; Symington & Gautier, 2011). Los segmentos generados de ADN de cadena sencilla se cubren rápidamente con la proteína RPA, que estabiliza y protege estas estructuras monocatenarias de la acción de las nucleasas. No obstante, para que continúe el proceso de reparación, RPA debe ser desplazada y sustituida por la recombinasa RAD51. Dado que RPA se une con mayor afinidad que RAD51 a las secuencias de ADN de cadena sencilla, se requiere la acción adicional de proteínas mediadoras. En concreto la proteína BRCA2, que es reclutada en la DSB a través de BRCA1, y parálogos de RAD51, entre otros (Sun et al, 2019; Talens et al, 2017). Una vez que la recombinasa RAD51 se une establemente al ADN monocatenario, los filamentos nucleoproteicos generados pueden invadir la cromátida hermana para buscar la correspondiente secuencia homóloga. Se forma entonces una estructura D-loop en la que el extremo 3’ de la hebra invasora actúa como cebador a partir del cual la polimerasa de ADN sintetiza la nueva hebra usando la homóloga como molde (Rahimian et al, 2020). Finalmente, las estructuras generadas se pueden resolver con o sin intercambio de información genética culminando así la reparación de la DSB (Hartlerode & Scully, 2009). Introducción 32 Figura 8. Reparación de DSBs por la ruta de la recombinación homóloga (HR). Figura modificada a partir de una modificación realizada por Fernández Ávila, 2016 de Hartlerode & Scully, 2009. La elección de la ruta de reparación (NHEJ o HR) depende fundamentalmente del ciclo celular. Para llevar a cabo la HR se requiere la presencia de cromátidas hermanas, las cuales se generan durante la replicación del ADN que tiene lugar en la fase S. Además, las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) regulan la actividad de diversos sustratos que intervienen en la resección de las hebras del ADN (Ceccaldi et al, 2016). La formación de ADN de cadena sencilla extendido en los puntos de rotura favorece la HR y evita la reparación mediada por NHEJ, ruta en la que la resección es mínima o inexistente. En la regulación de este proceso juega un papel fundamental la Introducción 33 fosforilación de CtIP. En las fases S y G2, las CDKs fosforilan a CtIP en diferentes residuos, estimulando así la resección (Wang et al, 2013). Estas fosforilaciones no sólo aumentan su actividad, sino que también incrementan su interacción con BRCA1 (Huertas & Jackson, 2009; Yu & Chen, 2004), lo cual, como indicamos anteriormente, resulta esencial para la resección inicial. Esta regulación dependiente de CDKs también afecta a otros actores clave de la HR, como EXO1 (Tomimatsu et al, 2014). En cambio, la NHEJ se favorece por la localización de KU70/KU80 en los extremos rotos del ADN, que los protege y evita la resección (Kieffer & Lowndes, 2022). Otros factores importantes para la elección de la ruta de reparación son 53BP1 y BRCA1, que exhiben papeles antagónicos en la reparación de las DSBs. 53BP1 se asocia con RIF1 y el complejo Shieldin en las DSBs en la fase G1 para proteger los extremos del ADN roto, promoviendo así la NHEJ, mientras que BRCA1 promueve la resección de los extremos rotos a través de su interacción con CtIP en las fases S/G2, estimulando la HR. Además, aparte de las diferentes fosforilaciones, otros tipos de modificaciones posttraduccionales como la metilación, la acetilación o la ubicuitilación, entre otras, tanto en las histonas como en los propios factores que intervienen en la NHEJ/HR, también influyen en la determinación de la ruta de reparación del daño (Ray & Raghavan, 2021; Cejka & Symington, 2021). 2.3. El complejo MRN Como hemos mencionado anteriormente, el complejo formado por las proteínas MRE11, RAD50 y NBS1, denominado complejo MRN, tiene un papel esencial en la respuesta a los daños en el ADN. Está entre los primeros sensores de las DSBs, interviniendo tanto en el reconocimiento de la lesión, como en la señalización, el procesamiento y la reparación de la misma (Oh & Symington, 2018; Rupnik et al, 2010; Williams et al, 2010). Para llevar a cabo esta variedad de funciones, el complejo presenta distintas actividades desde un punto de vista bioquímico, entre las que destacan: la hidrólisis de ATP, la capacidad para interaccionar con moléculas de ADN y de ejercer como puente entre ellas, las actividades endonucleasa y exonucleasa y la interacción con otras proteínas efectoras (Bian et al, 2019). • Estructura de los componentes del complejo MRN El complejo MRN es un complejo heterohexamérico compuesto por dos subunidades de la proteína MRE11, dos de RAD50 y dos de NBS1. El núcleo catalítico del complejo está formado por las dos subunidades de MRE11 y por los dominios ATPasa de RAD50, constituyendo en conjunto la zona de unión y procesamiento del ADN (Bian et al, 2019). MRE11 y RAD50 están ampliamente conservados filogenéticamente, mientras que NBS1 sólo se encuentra en eucariotas, actuando Introducción 34 como proteína de andamiaje fundamental para la interacción con otras proteínas (Rahman et al, 2020). MRE11 es una proteína que pertenece a la superfamilia de las metalofosfoesterasas similares a la calcineurina (Matange et al, 2015). Posee un dominio fosfodiesterasa N-terminal (Figura 9A) con actividad exonucleasa 3’-5’ dependiente de Mn2+ capaz de procesar moléculas bicatenarias de ADN, y actividad endonucleasa capaz de procesar ADN de cadena sencilla, siendo ambas funciones claves para la resección de los extremos rotos del ADN (Buis et al, 2008). Este dominio coordina los dos iones Mn2+ requeridos para la actividad catalítica de la proteína a través de 7 residuos conservados. Además, facilita la dimerización de las dos subunidades de MRE11 del complejo e incluye los sitios de unión a NBS1, por lo que no sólo es responsable de la actividad nucleasa de la proteína, sino que también contribuye al ensamblaje y estabilización del propio complejo (Hopfner et al, 2001; Schiller et al, 2012). Cerca de esta región se localiza un dominio cap que puede provocar el desenrollamiento de la doble hélice del ADN con el fin de orientarla correctamente para la resección (Williams et al, 2008). Por su parte, la región C- terminal posee un dominio de unión a RAD50 y dos dominios de unión al ADN (Lafrance-Vanasse et al, 2015). Por tanto, MRE11 interacciona con NBS1 y RAD50, mientras que estos no interaccionan directamente entre sí para constituir el complejo. Asimismo, esta región C-terminal está sujeta a modificaciones post-traduccionales, como la metilación de los residuos de arginina presentes en ciertas secuencias ricas en glicina/arginina, que se ha demostrado importante para la actividad exonucleasa de la proteína y la activación de la quinasa ATR (Déry et al, 2008; Yu et al, 2012). Por tanto, MRE11 es un componente esencial tanto para la formación del complejo MRN como para la unión al ADN y la actividad enzimática del propio complejo (Lamarche et al, 2010). RAD50 es un miembro de la superfamilia de proteínas ATPasas de tipo ABC (del inglés ATP-binding cassette). Por su conformación, pertenece también a la familia de proteínas para el mantenimiento estructural de los cromosomas (SMC, por sus siglas en inglés) (Hopfner & Tainer, 2003; Tatebe et al, 2020). Se trata del componente de mayor tamaño del complejo MRN, con 1312 aminoácidos frente a los 708 de MRE11 y los 754 de NBS1. En los extremos N-terminal y C-terminal de RAD50 se encuentran los subdominios con actividad ATPasa (Figura 9B), que cuando se pliegan generan el dominio completo (Hopfner et al, 2000). Además, estas regiones contienen los motivos Walker A y Walker B, que son fundamentales para la unión a nucleótidos (Rojowska et al, 2014). Entre ambos subdominios de la proteína se extiende una región amplia de hélices superenrolladas antiparalelas que posee un motivo central CXXC que coordina Zn2+ (gancho de zinc o zinc-hook). Esta estructura media la dimerización, dependiente de Zn2+, de las subunidades de RAD50 y permite la formación de puentes flexibles a diferentes distancias, lo que resulta esencial para mantener juntos los extremos rotos Introducción 35 del ADN en el proceso de reparación (Hopfner et al, 2002; Park et al, 2017). La conformación de RAD50 en el complejo depende de la unión a moléculas de ATP, como veremos a continuación. La interacción entre RAD50 y MRE11 ocurre a través de los dominios de unión específicos situados a ambos lados de la región de hélices superenrolladas. El complejo funcional formado por los dímeros de estas dos proteínas (llamado MR o M2R2) se ha conservado en los 3 dominios de la vida, lo que refleja el papel crítico que ambos componentes desempeñan en la célula (Möckel et al, 2012; Lim et al, 2011). Figura 9. Representación esquemática de los dominios principales de MRE11, RAD50 y NBS1. DBD: DNA-binding domain. FHA: fork-head associated domain, BRCT: breast cancer-associated 1 C-terminal domain. Figura modificada a partir de Bian et al, 2019. Como ya hemos indicado, la proteína NBS1 o nibrina, codificada en humanos por el gen NBN, es la subunidad del complejo MRN específica de los eucariotas. En su extremo N-terminal posee un dominio FHA y dos dominios BRCT en tándem (Figura 9C), que son importantes para la interacción con múltiples proteínas fosforiladas (Lafrance-Vanasse et al, 2015). Estos dominios están ampliamente conservados entre proteínas nucleares eucariotas implicadas en procesos como los puntos de control del ciclo celular y la reparación del ADN. A través de ellos, NBS1 es capaz de interaccionar con proteínas básicas en la señalización, reparación y respuesta a daños en el ADN como -H2AX, MDC1 o CtIP (Saito et al, 2013). Aunque el resto de su estructura está menos definida, se sabe que el extremo C-terminal posee otras regiones críticas para la interacción con MRE11, ATM, RNF20 o RAD18 (Schiller et al, 2012; Saito et al, 2013; Lee & Paull, 2004). Además de estas regiones, NBS1 presenta motivos Ser-Gln (SQ) en su zona central, que son secuencias consenso de fosforilación por ATM o ATR. Los residuos de esta región están altamente conservados en vertebrados y tienen un papel importante en la transducción de señales que ocurre durante la respuesta a daños en el ADN (Saito et al, 2013; Qiu & Huang, 2021). Introducción 36 • Principales funciones del complejo MRN El complejo MRN interviene en diferentes eventos celulares, de entre los que destaca la respuesta a las DSBs. En este ámbito, el papel del complejo ha sido ampliamente estudiado, interviniendo tanto en la detección de las DSBs como en la señalización, el procesamiento y la reparación de las mismas. Cuando se produce el daño en el ADN, el complejo MRN reconoce y se une rápidamente a las DSBs. Así, es reclutado en los sitios dañados a través de -H2AX y RAD17, los cuales interaccionan con NBS1 (Kinner et al, 2008; Wang et al, 2014a). Una vez unido, el complejo MRN recluta a su vez a otras proteínas implicadas en la respuesta a los daños en el ADN, incluyendo la quinasa ATM, que también interacciona con NBS1. Tras su activación por autofosforilación, ATM fosforila otras proteínas diana para iniciar nuevas rutas de señalización. Entre sus sustratos se encuentran los componentes del propio complejo MRN y MDC1, que a su vez reclutará más moléculas de MRN en las DSBs, amplificando así la señalización en un bucle de retroalimentación positiva esencial para la reparación del daño (Syed & Tainer, 2018; Qiu & Huang, 2021). En los puntos de rotura, el complejo MRN desempeña otro papel fundamental ya que mantiene próximos los extremos rotos y actúa como puente entre distintas moléculas de ADN. Estas funciones se llevan a cabo gracias a la estructura de RAD50, concretamente, a las regiones de hélices superenrolladas antiparalelas que culminan en el gancho de zinc (Hopfner et al, 2002; Lafrance-Vanasse et al, 2015). Estas regiones permiten la interacción entre diferentes subunidades de RAD50, propiciando la formación de puentes entre la molécula de ADN rota y su correspondiente en la cromátida hermana. De esta manera, contribuye a la posterior creación de las estructuras D-loop, comunes en el proceso de HR. Asimismo, también podría facilitar el alineamiento y aproximación de los extremos de ADN rotos que vayan a ser reparados por NHEJ (Bian et al, 2019). La localización del complejo MRN en las DSBs es uno de los eventos que dirige la reparación de la rotura por HR. Como describimos anteriormente, para que este fenómeno tenga lugar es necesario que a ambos lados del punto de rotura se generen regiones amplias de cadena sencilla con salientes 3’-hidroxilo. Debe ocurrir, por tanto, una degradación de los extremos 5’ a ambos lados de la rotura, dependiente de MRE11. Según el modelo generalmente aceptado (Figura 10), el complejo MRN inicia la resección mediante la actividad endonucleasa de MRE11, que genera un corte en el interior de las hebras a degradar a ambos lados de la DSB. A continuación, partiendo de ese corte, MRE11 en colaboración con CtIP digiere las hebras gracias a su actividad exonucleasa en dirección 3’-5’ hacia la DSB (Liu & Huang, 2016). Tras esta resección inicial, que genera un primer fragmento corto de ADN monocatenario, se incorporan otras enzimas con actividad nucleasa como EXO1 o DNA2 quienes, junto a BLM y otros factores, ampliarán la resección en sentido 5’-3’ hacia el interior de las hebras de ADN. Así, las hebras de cadena sencilla generadas con salientes extensos 3’-hidroxilo Introducción 37 continuarán la reparación vía HR (Cejka & Symington, 2021). En este proceso de resección amplia se ha propuesto otra función para el complejo MRN independiente de su actividad catalítica. Se ha visto que la nucleasa EXO1 es inhibida de manera potente por la unión de RPA a las regiones de ADN monocatenarias que se van generando durante la digestión (Myler et al, 2016; Genschel & Modrich, 2003). Se cree que el complejo MRN podría interaccionar con EXO1 y desplazarse junto con la maquinaria de resección para evitar la inhibición inducida por RPA (Myler et al, 2017). Figura 10. Procesamiento de los extremos de una DSB durante la HR. El complejo MRN, junto a CtIP, inicia la resección por medio de un corte interior en las hebras a degradar, que son procesadas primero en sentido 3’-5’ (se muestra sólo a MRE11 para simplificar). A continuación, otros factores extienden la resección en dirección 5’-3’, generando amplios salientes 3’-hidroxilo que son cubiertos por la proteína RPA y continúan la reparación por HR. Figura modificada a partir de Shibata et al, 2018. Sin embargo, este modelo no explica por qué los extremos 3’ generados en la DSB no son también degradados por la actividad exonucleasa de MRE11. Un estudio reciente (Cannavo et al, 2019) pone el foco sobre la regulación que RAD50 ejerce sobre la actividad nucleasa de MRE11, a través de su función ATPasa. El complejo MRN no es un complejo estructuralmente estático, sino que experimenta cambios conformacionales cuando el dominio ATPasa de RAD50 une ATP (Figura 11). Cuando esto ocurre, las hélices superenrolladas antiparalelas de las dos subunidades de RAD50 se pliegan entre ellas y forman una estructura compacta y rígida. Esta conformación “cerrada” permite acomodar la doble hélice del ADN, pero bloquea el acceso de la misma a los sitios activos del dímero de MRE11. Cuando se produce la hidrólisis del ATP, la estructura rígida desaparece y las subunidades de RAD50 recuperan un estado más flexible y relajado. En esta conformación “abierta”, los sitios activos de MRE11 quedan libres para albergar las hebras de ADN y poder ejercer su actividad nucleasa Introducción 38 (Liu et al, 2016a). Por tanto, el ciclado entre ambas conformaciones del complejo MRN es clave en la regulación de la actividad nucleasa de MRE11. Figura 11. Cambio de conformación del complejo MRN dependiente de ATP. Cuando los dominios ATPasa de las moléculas de RAD50 no unen ATP, el complejo presenta una conformación “abierta” que permite el acceso del ADN a los sitios activos de MRE11 y, por tanto, su procesamiento. La unión del ATP hace que el complejo adopte una conformación “cerrada” que impide al ADN acceder a los sitios activos de MRE11. La hidrolisis del ATP permite el paso de la conformación “cerrada” a la “abierta”, regulando así la actividad del complejo. Figura modificada a partir de Bian et al, 2019. El complejo MRN también actúa en la reparación de los extremos de ADN que presentan aductos de proteínas (Deshpande et al, 2016). Es capaz de procesar y separar complejos proteicos unidos covalentemente al ADN genómico, como ocurre con las topoisomerasas (Aparicio et al, 2016). Asimismo, el complejo también parece intervenir en la reparación de las DSBs que presentan estructuras de horquilla en sus extremos (Li et al, 2017; Runge & Li, 2018). En lo que se refiere a la NHEJ, el papel del complejo MRN está menos definido. Principalmente, participa a través de la actividad nucleasa de MRE11 en los pasos de resección iniciales que tienen lugar en las formas alternativas de NHEJ dependientes de resección y búsqueda de regiones de microhomología para la reparación. En estas rutas, además de MRE11, también intervienen otros componentes de las vías de HR y NHEJ clásicas como CtIP, BRCA1, EXO1 o Artemis, entre otros (Sharma et al, 2015; Dutta et al, 2017; Biehs et al, 2017; Rass et al, 2009). Por otro lado, el complejo MRN también participa en el procesamiento de las horquillas de replicación fallidas. El estrés replicativo puede provocar una ralentización, atasco o colapso de la horquilla de replicación. Estas situaciones derivan de fenómenos como el daño en el ADN, la formación de estructuras anormales en el ADN, la aparición de aductos proteína-ADN o los híbridos ADN-ARN (Zeman & Cimprich, 2014). Cuando tiene lugar la parada o el colapso de la horquilla, el complejo MRN se une a estas zonas y promueve la activación de ATR, quinasa fundamental en la respuesta a estrés replicativo, y el reinicio de la replicación (Oakley et al, 2009; Gatei et al, 2014). Para ello, la actividad nucleasa del complejo produce la resección de las Introducción 39 hebras de ADN nacientes permitiendo la liberación del replisoma de la zona colapsada (Aze et al, 2013). Sin embargo, la resección debe estar bien regulada para evitar una degradación excesiva de la horquilla debida a la actividad exonucleasa de MRE11 (Hashimoto et al, 2010; Vallerga et al, 2015). Así, otras proteínas colaboran en la regulación de esta resección, por ejemplo BRCA2, que frena la digestión de las hebras de cadena sencilla nacientes promoviendo en ellas la formación de nucleofilamentos de RAD51 (Kolinjivadi et al, 2017; Schlacher et al, 2011). También se ha descrito la implicación del complejo MRN en los telómeros. Estas estructuras constan de secuencias de ADN repetitivas y no codificantes que protegen los extremos de los cromosomas eucariotas ante la posible pérdida de la información genética contenida en las regiones próximas a ellos. Debido a las limitaciones de las polimerasas de ADN que intervienen en el proceso de replicación, los telómeros van acortando su longitud en cada ciclo de replicación y división celular hasta alcanzar una longitud crítica, momento en el que la célula entra en senescencia o en apoptosis (Lamarche et al, 2010). Los telómeros están protegidos por un conjunto de proteínas que forman el complejo shelterin, las cuales generan una envoltura nucleoproteica que estabiliza los extremos de los cromosomas. En este contexto, el complejo MRN colabora con el complejo shelterin para evitar que los extremos del cromosoma sean tratados como DSBs y por tanto “reparados”, lo que favorece la estabilidad genómica (Marcand, 2014; Marcomini & Gasser, 2015). Cuando los telómeros se vuelven disfuncionales, por ejemplo, debido a la disrupción de algún componente del complejo shelterin, son reconocidos como DSBs, provocando la activación de la señalización de respuesta a daños en el ADN. Así, pueden tener lugar fusiones cromosómicas producto de la “reparación” de los telómeros por NHEJ (Celli & de Lange, 2005). En este caso, el complejo MRN intervendría en la detección y señalización vía ATM de estos telómeros disfuncionales. Además, dependiendo de la etapa del ciclo celular y la estructura específica que presenten los telómeros, MRN podría promover o suprimir la fusión mediada por NHEJ (Lamarche et al, 2010), favoreciendo o no la inestabilidad genómica, respectivamente. El complejo MRN interviene asimismo en la detección, señalización y defensa contra las infecciones virales (Stracker et al, 2002). Este complejo, junto a otras proteínas, detecta la presencia de ADN viral e inicia una cascada de señalización vinculada al daño en el ADN y a la respuesta inmune innata (Lilley et al, 2007). Como sabemos, cuando se produce un daño en el ADN celular, la activación de ATM por MRN se amplifica a una región de más de una megabase, lo que conlleva la formación de los focos de daño en el ADN, la parada del ciclo celular y la reparación del daño (Polo & Jackson, 2011). Sin embargo, cuando tiene lugar una infección viral, la unión de MRN al ADN del virus activa una respuesta local mediada por ATM, debido al pequeño tamaño del ADN vírico. Esta señalización local evita la parada del ciclo celular y la inducción de una respuesta a daños en el ADN global cuando se da la infección, lo que permite a la Introducción 40 célula distinguir entre la señalización derivada del daño en su genoma de la derivada de un ADN exógeno. En este caso, el resultado será la inhibición de la replicación del ADN vírico (Shah & O’Shea, 2015). El reconocimiento y unión del complejo MRN al ADN del virus ocurre en el citoplasma e induce la producción de interferón de tipo I a través de la activación del factor nuclear B (NF-B), que a su vez estimula diferentes proteínas implicadas en la producción de ese mediador de la respuesta inmune (Kondo et al, 2013). Sin embargo, ciertas proteínas codificadas por el genoma vírico pueden asociarse a MRN (y a otras proteínas implicadas en la reparación de daños en el ADN de la célula hospedadora) e inactivarlo a través de su relocalización y degradación por medio de modificaciones post-traduccionales como la SUMOilación y la ubicuitilación (Stracker et al, 2002; Sohn & Hearing, 2012; Liu et al, 2005). • Patologías asociadas a defectos en el complejo MRN Las mutaciones en genes esenciales para la respuesta a los daños en el ADN que afectan al nivel de las proteínas o a su funcionalidad se han relacionado de manera clara con el cáncer y otras enfermedades (Romero-Laorden & Castro, 2017; Chae et al, 2016; Knijnenburg et al, 2018; Vineis et al, 2009). En este sentido, diversas mutaciones en los genes de los componentes del complejo MRN también se han vinculado con múltiples escenarios patológicos. De hecho, la disrupción de estos genes provoca letalidad embrionaria en ratones (Xiao & Weaver, 1997; Luo et al, 1999; Zhu et al, 2001), lo que demuestra el papel fundamental que este complejo desempeña en la supervivencia celular. En humanos, las mutaciones hipomórficas en cualquiera de los genes que codifican las proteínas del complejo pueden causar patologías asociadas con la inestabilidad genómica (van den Bosch et al, 2003). Tal vez el fenotipo patológico más clásico asociado a un defecto en MRN es el síndrome de rotura de Nijmegen (NBS, del inglés Nijmegen break syndrome), una enfermedad rara autosómica recesiva causada por mutaciones hipomórficas del gen NBN, que codifica la proteína NBS1. Entre sus características clínicas destacan microcefalia, inmunodeficiencia, retraso mental y de crecimiento, radiosensibilidad y una mayor predisposición a padecer infecciones y cáncer, particularmente el linfoma no Hodgkin de células B (Chrzanowska et al, 2012; Digweed & Sperling, 2004). La mutación más comúnmente observada en los pacientes de NBS es la 657del5, una deleción de 5 nucleótidos en el exón 6 de NBN, que genera dos formas truncadas de la proteína original: un fragmento N-terminal de aproximadamente 26 kDa (p26) y otro C-terminal de 70 kDa (p70) (Maser et al, 2001). El fragmento p26 abarca desde el aminoácido 1 al 218 de NBS1, lo que incluye el dominio FHA y el primer dominio BRCT, mientras que el fragmento p70 comprende del aminoácido 221 al final de la secuencia. Este incluye, por tanto, el segundo dominio BRCT y otras regiones que permiten la Introducción 47 una región por la que pueden interaccionar con la enzima E2 y otra región con un residuo de cisteína capaz de formar enlace con la molécula de ubicuitina. Así, la principal característica que distingue a este tipo de enzimas E3 es que son capaces de unir la ubicuitina portada por la E2 como paso previo a su adición al sustrato (Sluimer & Distel, 2018). Por su parte, las E3 de tipo RING no llegan a interaccionar con la ubicuitina, sino que la transfieren directamente desde la enzima E2 al sustrato, actuando de puente gracias a su dominio catalítico, denominado dominio RING o U- box (Deshaies & Joazeiro, 2009; Metzger et al, 2012). Presentan una gran versatilidad, ya que pueden utilizar una misma enzima E2 durante el proceso de elongación de la cadena de ubicuitinas, o utilizar una E2 para la ubicuitilación inicial y otra diferente para añadir las posteriores ubicuitinas y elongar la cadena (Komander & Rape, 2012; Zheng & Shabek, 2017). Las ligasas de ubicuitina de tipo RING constituyen una extensa familia de proteínas que se puede subdividir en dos categorías: las ligasas de tipo c- CBL, en las que el dominio catalítico y el que reconoce a los sustratos están integrados en la misma subunidad, y las ligasas de tipo culina-RING (o CRLs), en las que ambos dominios se localizan en subunidades independientes (Joazeiro et al, 1999; Petroski & Deshaies, 2005). Finalmente, las E3 de tipo RBR tienen un mecanismo de acción intermedio entre las HECT y las RING. Presentan en su estructura dos dominios RING, uno de los cuales (RING1) facilita la asociación de la E2, mientras que el otro (RING2) permite la unión de la ubicuitina a un residuo de cisteína de la propia E3 como paso previo a la transferencia al sustrato (Smit & Sixma, 2014). Para revertir el proceso de ubicuitilación también existen enzimas denominadas desubicuitilasas (DUBs), que son peptidasas capaces de escindir las moléculas de ubicuitina a partir de las cadenas generadas o de las propias proteínas sustrato. Estas enzimas están ganando cada vez más relevancia como potenciales dianas terapéuticas, dado que su desregulación se ha relacionado con diferentes enfermedades neurodegenerativas, el cáncer y procesos inflamatorios (Harrigan et al, 2018). 3.3. El complejo ligasa de ubicuitina SCF Entre las ligasas de ubicuitina E3 de tipo culina-RING destaca el complejo SCF (SKP1/CUL1/proteína F-box), que interviene en procesos celulares tan importantes como la regulación de la proliferación o la supervivencia celular, entre otras muchas funciones. Este complejo está constituido por 3 subunidades constantes: CUL1, SKP1 y RBX1, y una subunidad variable: la proteína F-box, que otorga la especificidad al complejo SCF en su conjunto (Zheng et al, 2002). La estructura del complejo SCF se puede observar en la Figura 14. El componente central del complejo es la proteína culina (CUL1) que actúa como un andamio que permite la unión de la subunidad SKP1 a través de su extremo N-terminal y de RBX1 por el extremo C-terminal. SKP1, a su vez, ejerce de puente entre CUL1 y la proteína F- Introducción 48 box. Las proteínas F-box poseen un dominio que se encarga del reconocimiento e interacción con los sustratos específicos que van a ser ubicuitilados, y un dominio F a través del cual se asocian a SKP1. En humanos, existe una gran variedad de proteínas F-box que suelen clasificarse en 3 grupos según la estructura de su dominio de interacción con los sustratos: las FBXW, que poseen repeticiones WD40, un motivo de 40 aminoácidos que suele terminar en el dipéptido triptófano-ácido aspártico; las FBXL, que poseen repeticiones ricas en leucina o LRRs; y las FBXO, que poseen otro tipo de dominio distinto de los anteriores. La subunidad RBX1 es la proteína que se une a la enzima E2 cargada con la ubicuitina. Posee el dominio RING que cataliza la transferencia de la ubicuitina desde la E2 al sustrato reconocido por la proteína F-box. Asimismo, RBX1 también permite la unión de una enzima E2 que se encarga de modificar post-traduccionalmente a la proteína culina. En concreto, posibilita la unión de una proteína similar a la ubicuitina denominada NEDD8, que promueve un cambio conformacional fundamental para la actividad del propio complejo SCF, ya que facilitará la ubicuitilación de las proteínas sustrato (Cardozo & Pagano, 2004; Nakayama & Nakayama, 2006; Skaar et al, 2014). Figura 14. Componentes del complejo ligasa de ubicuitina SCF. Se representan unidos al complejo la enzima E2 cargada con la ubicuitina y la proteína sustrato ubicuitilada. Al tratarse de una ligasa de ubicuitina E3 de tipo culina-RING, la transferencia de la molécula de ubicuitina es directa desde la enzima E2 al sustrato gracias al dominio catalítico localizado en la subunidad RBX1. El sustrato, por su parte, es reconocido por una subunidad diferente del complejo: la proteína F-box. Figura modificada a partir de Skaar et al, 2014. Además de los distintos factores que regulan la actividad del complejo SCF, es fundamental la regulación de la interacción entre la proteína F-box y los sustratos. Esta interacción debe ser rápida y específica para que el complejo SCF pueda llevar a cabo la ubicuitilación de los sustratos correctos en el momento adecuado. Por ello, los propios sustratos están fuertemente regulados, permitiendo o no la interacción con la proteína F-box. Generalmente, las proteínas F-box reconocen unos motivos cortos y específicos en los sustratos que se denominan degrones (Ravid & Hochstrasser, 2008). Para que ocurra el reconocimiento y la interacción es frecuente que el degrón experimente algún tipo de modificación post-traduccional previa que asegure que la interacción ocurra sólo en las condiciones adecuadas (Figura 15). Una de las modificaciones más frecuentes es la fosforilación de residuos concretos del degrón, que pasaría a denominarse fosfodegrón. Los residuos que se fosforilan suelen ser Introducción 49 serinas o treoninas, aunque a veces los degrones presentan aminoácidos ácidos que actúan como fosfomiméticos, es decir, simulando un estado de fosforilación constante. En estos casos, la regulación de la interacción estaría fuera del degrón. La fosforilación del degrón puede estar mediada por una única quinasa o por varias cuando existe más de un sitio de fosforilación en el motivo. También puede ocurrir que para que se dé la fosforilación reguladora de la interacción previamente haya tenido que fosforilarse otro residuo (fosforilación cebadora), que puede estar situado en el propio fosfodegrón o fuera de él. Asimismo, pueden darse fosforilaciones en otros motivos ajenos al degrón, pero que sean fundamentales para que la proteína F-box lo reconozca, por ejemplo, cuando la fosforilación provoca un cambio conformacional en el sustrato que deja expuesto el degrón, que antes era inaccesible. En otros casos, sin embargo, la fosforilación del degrón impide que sea reconocido por la proteína F-box, por lo que esta modificación debe retirarse para que pueda ocurrir la interacción (Skaar et al, 2013). Además de la fosforilación, existen otros mecanismos que pueden mediar en el reconocimiento de los sustratos por parte de la proteína F-box, como pueden ser la glicosilación del degrón o la intervención de ciertos cofactores y otras moléculas pequeñas. Para complicar más la cuestión, en algunos casos la proteína F-box puede unirse a la proteína sustrato por medio de ciertos dominios que no siguen el patrón habitual de los degrones (Skaar et al, 2013). En otras ocasiones, puede reconocer y unirse a degrones concretos sin que estos requieran modificación previa. En este caso, intervendrían otros tipos de mecanismos para regular la ubicuitilación, como podría ser la diferente localización de la ligasa y el sustrato, que sólo coincidirían en determinadas condiciones (D’Angiolella et al, 2012, 2010). Además, también pueden combinarse distintos mecanismos de los mencionados para el reconocimiento de los sustratos (Hao et al, 2005). Así, se van añadiendo nuevas capas de regulación que aumentan la complejidad y permiten un control mucho más preciso del reconocimiento del sustrato y su ubicuitilación. Introducción 50 Figura 15. Formas de reconocimiento del sustrato por parte de las proteínas F-box. Para que una proteína F-box reconozca a un sustrato específico en el momento preciso, es frecuente que el degrón deba experimentar ciertas modificaciones post-traduccionales previas. Por ejemplo, la fosforilación de residuos específicos, con o sin fosforilación cebadora. En otros casos, la fosforilación induce un cambio conformacional que hace accesible al degrón. Sin embargo, también es posible que la fosforilación impida el reconocimiento, lo que requiere la intervención de fosfatasas. También pueden darse otras modificaciones como glicosilaciones, o bien ser necesaria la participación de un cofactor o molécula pequeña. Incluso, puede ser que la proteína F-box reconozca degrones sin modificar, o se una a dominios que no sigan el patrón clásico de los degrones. Figura modificada a partir de Skaar et al, 2013. • La proteína F-box TrCP TrCP es una de las proteínas F-box mejor caracterizadas. Pertenece al grupo de proteínas F-box de tipo FBXW, al poseer varias repeticiones WD40 en su dominio de interacción con los sustratos, y se encuentra altamente conservada en la evolución. En mamíferos, podemos encontrar dos genes parálogos de  TrCP:  TrCP1 y  TrCP2, el primero localizado en el cromosoma 10, región 10q24, y el segundo en el cromosoma 5, región 5q35 (Fuchs et al, 2004). TrCP1, también conocida como FBXW1, puede presentar 2 isoformas,  y , mientras que TrCP2, también llamada FBXW11, puede presentar un total de 3 isoformas, ,  y . Todas ellas se obtienen por maduración alternativa del transcrito original de sus respectivos genes (Putters et al, 2011). Todas estas isoformas comparten una estructura básica (Figura 16): en la región C-terminal Introducción 51 poseen las repeticiones WD40 en tándem, mientras que en la región N-terminal poseen el dominio F y el dominio D o de dimerización, gracias al cual pueden formarse tanto homodímeros como heterodímeros de la proteína, lo que influye de manera sustancial en la especificidad por los sustratos. En el extremo N-terminal se localiza además una región variable cuya secuencia difiere de unas isoformas a otras. Pese a esta diferencia, las distintas isoformas parecen desempeñar funciones fisiológicas y bioquímicas redundantes (Nakayama et al, 2003; Suzuki et al, 2000). Figura 16. Representación esquemática de los dominios principales de las isoformas de TrCP1 y TrCP2. En dirección N-terminal – C-terminal se representan los dominios variables (V), de dimerización (D), F y WD40. Debajo de las isoformas agrupadas se muestran las secuencias aminoacídicas de los dominios V de cada isoforma. Estas se obtienen por maduración alternativa de los transcritos originales de  TrCP1 y  TrCP2. Figura modificada a partir de Putters et al, 2011. o Sustratos de SCF(  TrCP) destacables y regulación El motivo consenso que reconoce TrCP en los sustratos es D-S-G-X2-3-S, donde X representa cualquier aminoácido. Esta secuencia, sin embargo, puede presentar múltiples variantes dependiendo del sustrato específico, entre ellas, la más simple que es la sustitución de las serinas por treoninas. Para que el degrón sea correctamente reconocido por TrCP y tenga lugar la interacción, se requiere que ambas serinas (o treoninas) estén previamente fosforiladas (Frescas & Pagano, 2008; Lau et al, 2012). En Introducción 52 la fosforilación de estos residuos pueden intervenir diferentes quinasas, siendo GSK3 la más descrita hasta el momento (Robertson et al, 2018). Los diversos e importantes procesos celulares en los que interviene TrCP están determinados por la enorme variedad de sustratos con los que interacciona y facilita su ubicuitilación. Señalaremos a continuación algunos ejemplos. En el contexto de la transducción de señales, cabe destacar el papel de TrCP en la regulación de la vía WNT/-catenina, ruta fundamental en el desarrollo embrionario y en ciertos procesos tumorigénicos. Cuando la vía está inactiva, -catenina es fosforilada, en primer lugar, por la quinasa CK1 y, en segundo lugar, por GSK3 en el degrón reconocido por TrCP, lo que permite su interacción con esta proteína F-box y su consecuente ubicuitilación y en este caso degradación por la vía del proteasoma (Stamos & Weis, 2013; Liu et al, 2002). Al activarse la ruta, -catenina deja de ser fosforilada y evita su degradación. Esto permite que se transloque al núcleo para activar la expresión de determinados genes. Además, también induce un aumento en la expresión de la propia proteína F-box, lo que regula en última instancia la actividad del complejo SCF(TrCP) (Spiegelman et al, 2000). El papel de TrCP en las rutas de señalización celular no se limita a la vía WNT/-catenina, sino que también interviene en otras rutas, como la vía PI3K/AKT/mTOR regulando la degradación de DEPTOR, inhibidor natural de mTOR; la vía ERBB a través de la degradación de ERBB2; o la vía de NF-B, mediando en la degradación de IB (Zhao et al, 2011; Wang et al, 2014b; Kroll et al, 1999), entre otras. TrCP también interviene en la regulación y avance del ciclo celular mediante la degradación de diversos sustratos implicados en este proceso, entre los que podemos señalar WEE1 (Watanabe et al, 2004), EMI1 (Guardavaccaro et al, 2003), CDC25 (Kanemori et al, 2005), ciclina D1 (Wei et al, 2008), ciclina F (Mavrommati et al, 2018) o PLK1 (Giráldez et al, 2017). Asimismo, TrCP desempeña varios roles en la respuesta a los daños en el ADN. Cuando se detecta una lesión en el ADN, TrCP favorece la parada del ciclo celular que permite el procesamiento y reparación de los daños. La activación de CHK1 y CHK2 provoca la fosforilación de CDC25, promoviendo su ubicuitilación por SCF(TrCP) y posterior degradación, provocando así una reducción de los complejos ciclinas-CDKs activos (Jin et al, 2003; Busino et al, 2003). Por otro lado, SCF(TrCP) también promueve la degradación de MDM2, regulador negativo de p53, favoreciendo así la acumulación de esta proteína y la consecuente parada del ciclo a través de la inducción de p21 CIP1 (Inuzuka et al, 2010). Además, SCF(TrCP) también juega un papel en la parada del ciclo celular tras radiación UV para reparar los daños, induciendo la degradación de securina (Limón-Mortés et al, 2008). Finalmente, una vez que los daños han sido reparados, SCF(TrCP) induce la degradación de sustratos específicos como WEE1 o claspina, que intervienen en la ruta ATR-CHK1, favoreciendo en este caso el avance del ciclo celular tras daño (Watanabe et al, 2004; Mailand et al, 2006). Introducción 53 Además, TrCP también regula sustratos que intervienen en la transcripción de determinados genes, como PER1, PER2 o FOXO3, en fenómenos de migración celular y transición epitelio-mesénquima, como SNAIL o TWIST, en la regulación de la cascada apoptótica, como MCL-1 o la procaspasa 3, en procesos relacionados con la respuesta inmune, como IRAK1 o PD-L1 o en infecciones víricas (Bi et al, 2021). De hecho, la degradación de la proteína CD4 en el contexto de la infección por el virus VIH-1 fue la primera actividad que se describió para TrCP humana (Margottin et al, 1998). Como TrCP participa en la ubicuitilación de numerosas proteínas, claves en una gran variedad de procesos fisiológicos y patológicos, sus niveles y su actividad están estrictamente regulados. En ello intervienen múltiples mecanismos, entre los que se incluyen ARNs largos no codificantes (lncRNAs), ARNs pequeños no codificantes (microRNAs), diversas rutas de señalización como la ruta de las quinasas MAP (MAPK), la actividad de las enzimas DUBs o determinados pseudosustratos. Estos últimos son moléculas que se unen a la proteína F-box y regulan su actividad sin necesidad de ser ubicuitilados por la misma (Bi et al, 2021), como por ejemplo la proteína nuclear hnRNP-U. La interacción entre TrCP1 y hnRNP-U estabiliza a la proteína F-box y además permite su translocación del núcleo al citoplasma, donde podrá intervenir en la ubicuitilación de determinados sustratos citoplasmáticos (Davis et al, 2002). En relación a esto, la localización subcelular de TrCP también regula su función, al permitir o no el acceso a sustratos concretos. TrCP1 presenta una localización fundamentalmente nuclear, mientras que TrCP2 se localiza tanto a nivel nuclear como citoplasmático (Davis et al, 2002; Lassot et al, 2001), si bien se requieren estudios más precisos en este ámbito. Por último, los niveles de TrCP también se regulan mediante su degradación. Curiosamente, TrCP1 y TrCP2 son capaces de ubicuitilarse recíprocamente para inducir su propia degradación. Cuando homodimerizan a través de su dominio D, TrCP1 o TrCP2 actúan reconociendo sustratos en el complejo SCF, pero cuando forman heterodímeros suelen facilitar su autodegradación (Cui et al, 2020a). Sin embargo, existen otras proteínas F-box que también son capaces de reconocer a TrCP como proteína sustrato para su ubicuitilación y degradación, como puede ser SKP2 (Wei et al, 2012). o Papel de SCF(  TrCP) en la transformación tumoral Como acabamos de describir, TrCP interviene en procesos celulares esenciales. Por ello, la desregulación de los niveles y/o de la actividad de esta proteína F-box se ha vinculado con distintas enfermedades, entre ellas el cáncer. En esta cuestión, el papel de TrCP es complejo, ya que puede actuar como oncoproteína o como proteína supresora de tumores (Figura 17). Su papel como oncoproteína está apoyado por el hecho de que la sobreexpresión de  TrCP1 se ha detectado en cáncer colorrectal, hepatoblastomas, melanomas y cáncer de páncreas (Ougolkov et al, 2004; Koch et al, Introducción 54 2005; Müerköster et al, 2005; Liu et al, 2007). De manera muy similar, la sobreexpresión de  TrCP2 también se ha detectado en cáncer de próstata, mama y estómago (Fuchs et al, 2004). Además, SCF(TrCP) media en la ubicuitilación (y degradación) de proteínas supresoras de tumores, entre las que destaca IB, regulador negativo de NF-B. Este factor de transcripción interviene en procesos como la inflamación y la respuesta inmune, y promueve la expresión de genes vinculados con la transformación tumoral, por lo que se ha encontrado en niveles altos en distintos tipos de cáncer (Karin & Greten, 2005). Por tanto, la degradación de IB promovida por SCF(TrCP) favorece la actividad de NF-B y la tumorigénesis (Liu et al, 2007; Dhawan & Richmond, 2002). También podemos citar la degradación de DEPTOR, que conlleva la activación de la vía de mTOR y promueve la proliferación celular y la migración (Cui et al, 2020a). No obstante, en ocasiones la degradación de DEPTOR tiene el efecto contrario, jugando un papel más bien de supresora de tumores. Esto se debe a que la vía mTOR integra multitud de señales diferentes y controla numerosos procesos celulares, por lo que puede tener un efecto promotor o supresor de tumores, según el contexto (Zhao et al, 2011; Gao et al, 2011). Asimismo, se han documentado mutaciones que generan formas defectuosas de TrCP en distintos tipos de cáncer, incluyendo de mama, próstata y estómago (Saitoh & Katoh, 2001; Kim et al, 2007; Gerstein et al, 2002; Wood et al, 2007), indicando una función como supresora tumoral. Estas formas no funcionales suelen ser incapaces de interaccionar con los sustratos, lo que favorece la estabilización y acumulación de ciertas oncoproteínas, como -catenina o MDM2, entre otros (Bi et al, 2021). Estos han sido sólo algunos ejemplos, pero parece claro que TrCP ejerce un papel dual en relación a la tumorigénesis según los sustratos sobre los que actúe y el tipo de tumor. Figura 17. Actividades asociadas a TrCP según algunos de los sustratos sobre los que actúa. TrCP puede presentar actividad de supresor tumoral o de oncoproteína dependiendo de si favorece la degradación de proteínas promotoras o inhibidoras de la proliferación, respectivamente. También puede presentar otros tipos de actividades cuando actúa sobre sustratos implicados en contextos diferentes. Figura modificada a partir de Skaar et al, 2013. Introducción 55 • La proteína F-box FBXW7 FBXW7, denominada también FBW7 o hCDC4, es otra proteína F-box ampliamente estudiada, que pertenece al grupo de las de tipo FBXW. En humanos, FBXW7 se localiza en el cromosoma 4, concretamente en la región 4q31.3. Este gen codifica 3 isoformas (,  y ) que se expresan a partir de promotores diferentes, cada una de ellas con su propio control transcripcional. Las 3 isoformas comparten 10 exones y difieren en el exón inicial, lo que hace que sus regiones N-terminal sean distintas mientras que las regiones C-terminal son comunes a todas (Figura 18). Así, en su estructura comparten las repeticiones WD40 en tándem, el dominio F y el dominio D, además de una secuencia de localización nuclear. Sin embargo, el extremo N-terminal variable es el que determina la localización subcelular de cada isoforma: FBXW7 se localiza fundamentalmente en el nucleoplasma, FBXW7 en el citoplasma y FBXW7 en el nucleolo. La isoforma  posee otra secuencia de localización nuclear en el extremo variable N-terminal, mientras que la isoforma  posee un dominio transmembrana que permite su localización en la membrana del retículo endoplasmático (Yumimoto & Nakayama, 2020; Fan et al, 2022). La expresión de cada isoforma varía dependiendo del tejido, de manera que la isoforma  se expresa ubicuamente, la isoforma  se expresa fundamentalmente en cerebro y testículo, y la isoforma  en el tejido cardíaco y el músculo esquelético (Spruck et al, 2002; Matsumoto et al, 2006). Figura 18. Estructura del gen FBXW7 y principales dominios de las isoformas que codifica. Todas las isoformas comparten, en dirección N-terminal – C-terminal, una secuencia de localización nuclear (NLS) y los dominios de dimerización (D), F y WD40. Se diferencian en la secuencia aminoacídica del extremo N-terminal, donde la isoforma  posee otra NLS y la  posee un dominio transmembrana (TMD). Esto es consecuencia de que las 3 isoformas comparten un total de 10 exones (c1-c10), y varían en el exón inicial. Figura modificada a partir de Yumimoto & Nakayama, 2020. Introducción 56 o Sustratos de SCF(FBXW7) destacables y regulación FBXW7 interacciona con sus sustratos a través de los degrones presentes en ellos, que en este caso se denominan CPDs (del inglés CDC4-phosphodegron). Los CPDs suelen presentar la secuencia consenso -X----S/T-P-P-X-S/T, donde X representa cualquier aminoácido y  un aminoácido hidrofóbico (Nash et al, 2001; Hao et al, 2007). Cuando ambas serinas o treoninas del motivo están fosforiladas, el sustrato es reconocido por las repeticiones WD40 de FBXW7 y tiene lugar la interacción. La quinasa que realiza estas fosforilaciones suele ser GSK3 (Heo et al, 2016). Sin embargo, la secuencia del CPD admite variaciones según el sustrato, como puede ser la sustitución de los residuos fosforilables (serina/treonina) por aminoácidos fosfomiméticos (ácido aspártico o glutámico). En ocasiones, la secuencia del sitio de interacción se aleja más aún del consenso, siendo entonces un CPD subóptimo, que puede presentar baja afinidad por FBXW7. Algunos sustratos poseen más de un CPD, como es el caso de ciclina E, que posee dos: uno en su región C-terminal que tiene la secuencia óptima, y otro en su región N-terminal que tiene baja afinidad por la proteína F-box (Hao et al, 2007). La mayor parte de los sustratos de SCF(FBXW7) interaccionan y son ubicuitilados en el nucleoplasma, lo que coincide con el hecho de que FBXW7 sea la isoforma más abundante en la célula. Uno de los sustratos más característicos de esta ligasa de ubicuitina es ciclina E, que desempeña un papel fundamental en el avance del ciclo celular. Esta ciclina forma un complejo con CDK2 que está activo durante un periodo muy breve de tiempo en la transición de la fase G1 a S. Se encarga de fosforilar multitud de sustratos que facilitan la formación de los complejos de iniciación de la replicación a partir de los complejos de pre-replicación, la reparación de los posibles daños en el ADN y la duplicación y maduración de los centrosomas, entre otras funciones (Deckbar et al, 2011). Por tanto, los niveles de la ciclina E deben estar estrictamente regulados evitando así una segunda ronda de replicación en la fase S. Una vez que la célula supera la transición G1/S, SCF(FBXW7) ubicuitila a la ciclina E, provocando su degradación vía proteasoma (Koepp et al, 2001). En condiciones de estrés genotóxico, FBXW7 promueve la ubicuitilación y degradación de ciertas proteínas esenciales para el avance del ciclo celular y la respuesta a los daños en el ADN, como p53 y PLK1, entre otras. Como hemos explicado anteriormente, el daño en el ADN favorece la estabilización y activación de p53, que induce la parada del ciclo celular. Tras la reparación de los daños, SCF(FBXW7) interviene en la degradación de p53, favoreciendo la recuperación del ciclo y la proliferación celular (Galindo-Moreno et al, 2019; Cui et al, 2020b; Tripathi et al, 2019). La quinasa PLK1, por su parte, lleva a cabo importantes funciones en distintos puntos del ciclo celular, como la regulación de proteínas que intervienen en los complejos pre-replicativos, la maduración de los centrosomas o la separación de las cromátidas hermanas (Strebhardt, 2010; Tsvetkov & Stern, 2005). Cuando se producen Introducción 63 es la activación del complejo ULK, constituido por las proteínas ULK1, ATG13, ATG101 y FIP200. La activación del complejo dependerá de estímulos como la falta de nutrientes o energía, o determinadas situaciones de estrés, que se transmiten a través de redes de señalización celular en las que mTORC1 tiene un papel esencial. Cuando hay abundancia de nutrientes, la autofagia estará inhibida gracias a mTORC1, que inactiva el complejo ULK al fosforilar a ULK1 y ATG13. En cambio, cuando hay escasez de nutrientes como la glucosa, la quinasa AMPK se encarga de promover la autofagia de dos maneras complementarias: inactivando a mTORC1 y activando al complejo ULK mediante la fosforilación de ULK1 (Mizushima, 2010; Kim et al, 2011a; Kaushal & Shah, 2016). Figura 22. Etapas de la formación del autofagosoma y la degradación de sus cargos. En condiciones de abundancia de nutrientes, mTORC1 se encarga de inactivar al complejo ULK, bloqueando así la autofagia. Ciertas situaciones como la escasez de nutrientes inhiben a mTORC1, lo que permite la activación del complejo ULK (1). Este fosforila diversos sustratos, como ATG9, fundamental para el ensamblaje de fragmentos de membrana durante la etapa de nucleación, o ciertos componentes del complejo PI3K clase III, encargado de producir PI3P (2). El fagóforo crece progresivamente alrededor de los cargos, a la vez que la proteína LC3 es procesada primero a LC3-I y luego lipidada para formar LC3-II (3). Esta se inserta en la membrana del autofagosoma en crecimiento, que termina por cerrarse y dar el autofagosoma maduro, conteniendo los cargos a degradar (4). En la autofagia selectiva de sustratos ubicuitilados, proteínas como p62 interaccionan con el material a degradar y con LC3-II, garantizando su incorporación al autofagosoma. Los lisosomas cargados de proteasas se fusionan con el autofagosoma (5), permitiendo así la degradación de su contenido. Por último, los productos de la degradación se devuelven al citoplasma gracias a las permeasas de membrana, permitiendo así su reciclaje (6). Figura modificada a partir de Izadi et al, 2021. Introducción 64 ULK1 está sujeto a fosforilaciones tanto activadoras como inhibidoras, según el contexto celular. Esta proteína es una quinasa de serina/treonina que ejerce como principal efector del complejo ULK. Entre los sustratos de ULK1 destaca ATG9, que es fundamental en la etapa de nucleación. La nucleación consiste en el ensamblaje de porciones de membranas para formar el fagóforo, la estructura membranosa precursora del autofagosoma. Estos fragmentos de membrana pueden producirse de novo o derivar de otras membranas ya formadas tanto de orgánulos como de la membrana plasmática (Tooze & Yoshimori, 2010; Gómez-Sánchez et al, 2021). Generalmente, el fagóforo se forma por la fusión de pequeñas vesículas que contienen ATG9 atravesando la membrana, lo que favorece el ensamblaje. Otros de los sustratos de ULK1 son algunos de los componentes del complejo PI3K clase III, formado por las proteínas VPS15, VPS34 y Beclina 1, entre otras (Wang & Kundu, 2017). Este complejo participa en la producción de fosfatidilinositol-3-fosfato (PI3P), un fosfolípido clave en la formación del autofagosoma (Jaber et al, 2012). A medida que la estructura membranosa inicial va incorporando nuevo material, va creciendo alrededor de los elementos a degradar. En paralelo, la proteasa ATG4 procesa a LC3, otro componente esencial de la maquinaria autofágica, generando la forma LC3-I. A continuación, LC3-I es sometido a un proceso de lipidación por el cual se une covalentemente a fosfatidiletanolamina (PE), generando así la forma LC3-II. En este proceso operan una serie de enzimas, de manera semejante a la cascada de ubicuitilación. Así, intervienen de manera secuencial las enzimas ATG7, que actúa a modo de enzima E1, ATG3, que actúa a modo de E2, y el complejo formado por las proteínas ATG5, ATG12 y ATG16, que actúa de manera equivalente a la enzima E3 (Lamb et al, 2013). LC3-II se inserta entonces en ambos lados de la membrana en crecimiento. Esta continúa su elongación y curvatura hasta cerrarse por completo, formando el autofagosoma maduro, que contiene todo el material a degradar (Reggiori & Ungermann, 2017; Cebollero et al, 2012). Finalmente, el autofagosoma se fusiona con el lisosoma, liberando los cargos en su interior. El contenido del autolisosoma resultante se degrada gracias a la acción de diversas proteasas contenidas en el lisosoma, como las catepsinas. Tras la digestión de los cargos, las (macro)moléculas generadas son liberadas al citoplasma a través de las permeasas de la membrana lisosomal, para su posterior reciclado como precursores metabólicos (Rudnik & Damme, 2021; Müller et al, 2012; Klionsky et al, 2014). La degradación de sustratos por medio de la autofagia selectiva puede ser dependiente de ubicuitilación o independiente de ella. En este último caso, participan mecanismos alternativos para el reconocimiento de los sustratos que han de ser degradados específicamente, como el uso de proteínas similares a la ubicuitina, motivos que permiten interacciones proteína-proteína concretas o señales basadas en lípidos o azúcares (Khaminets et al, 2016). En la degradación selectiva de los sustratos ubicuitilados suelen intervenir receptores o adaptadores de la autofagia, como citamos Introducción 65 anteriormente. Estas proteínas poseen en su estructura un dominio de unión a la ubicuitina (dominio UBD) a través del cual reconocen e interaccionan con las ubicuitinas del cargo, y un dominio de interacción con LC3 (dominio LIR). De esta manera, se unen tanto al cargo a degradar como a la proteína LC3 ya inserta en la membrana del autofagosoma (LC3-II), asegurando así la incorporación al mismo y posterior degradación. La proteína p62/SQSTM1 es el adaptador clásico de la vía autofágica, aunque existen otros como NBR1 o NDP52. p62 reconoce sustratos marcados con cadenas de ubicuitina enlazadas a través de K48 (Chen et al, 2016b) o K63, aunque tradicionalmente se ha descrito una mayor afinidad por las segundas (Liu et al, 2016b; Lippai & Low, 2014). Experimentalmente, tanto el nivel de p62, que correlaciona inversamente con la actividad autofágica, como la conversión de LC3-I a LC3-II se utilizan como marcadores de autofagia (Slobodkin & Elazar, 2013; Lippai & Low, 2014). Por último, destacar que la autofagia puede estimularse, además de por la privación de nutrientes anteriormente citada, por estrés oxidativo o daño en el ADN, entre otros, con el fin de preservar la homeostasis celular (Kroemer et al, 2010). En el caso del daño en el ADN (Figura 23), la activación de ATM provoca la inhibición de mTORC1 vía AMPK, lo que induce la autofagia. ATM y ATR también provocan la estabilización y activación de p53, del que se han descrito papeles tanto en la activación como en la inhibición de la autofagia. Respecto a la estimulación de esta vía, p53 puede por un lado activar AMPK, con el efecto ya descrito, o por otro lado promover la expresión de la proteína moduladora de la autofagia regulada por daño, DRAM, una proteína lisosomal que facilita la autofagia. Asimismo, p53 puede estimular la expresión de la fosfatasa PTEN, un inhibidor de la vía PI3K/AKT. En ambos casos, el resultado es la inhibición de mTORC1 con la consiguiente activación de la vía autofágica (Zhang et al, 2015). Figura 23. Efecto del tratamiento con agentes genotóxicos sobre la autofagia. El daño en el ADN derivado del tratamiento provoca en última instancia la activación de la autofagia a través de la inhibición por diversas vías de mTORC1. Figura modificada a partir de Zhang et al, 2015. Objetivos Objetivos 69 En los últimos años, nuestro grupo de investigación se ha centrado en la identificación y el estudio de nuevos sustratos de las ligasas de ubicuitina SCF(TrCP) y SCF(FBXW7), interesándonos especialmente por aquellos que pudieran estar implicados en el proceso tumorigénico. El objetivo general de nuestro trabajo es averiguar la relevancia de esas interacciones en el contexto de la célula cancerosa, ya que se han publicado multitud de estudios que relacionan la desregulación de la estabilidad de las proteínas con el cáncer. Por tanto, la búsqueda de nuevos sustratos y la determinación del posible papel de su regulación por ubicuitilación en la formación o desarrollo de tumores permitirá obtener potenciales dianas terapéuticas contra esta enfermedad. En esta Tesis nos hemos centrado específicamente en el estudio del complejo MRE11-RAD50-NBS1, tras su identificación como posible sustrato de las ligasas de ubicuitina SCF(TrCP) y SCF(FBXW7) en ensayos de espectrometría de masas. Para ello, hemos abordado los siguientes objetivos concretos: 1. Validar las interacciones entre TrCP y FBXW7 y las proteínas del complejo MRN, y averiguar si son sustratos de las correspondientes ligasas de ubicuitina. 2. Caracterizar la asociación entre ambas proteínas F-box y el complejo MRN. 3. Analizar desde un punto de vista funcional el papel de la ubicuitilación del complejo MRN llevada a cabo por SCF(TrCP) y SCF(FBXW7). Materiales y métodos Materiales y métodos 79 pCMV HA RAD50 S913G Vector derivado de pCMV HA RAD50 en el que se ha cambiado el aminoácido Ser 913 por Gly mediante mutagénesis dirigida. Esta Tesis pCMV HA RAD50 T Vector derivado de pCMV HA RAD50 S784G en el que se ha cambiado el aminoácido Thr 790 por Ala mediante mutagénesis dirigida. Esta Tesis pCMV HA RAD50 FB Vector derivado de pCMV HA RAD50 S913G en el que se han cambiado los aminoácidos Glu 916 por Gly, Thr 917 por Ala y Thr 918 por Ala mediante mutagénesis dirigida. Esta Tesis pCMV6 MRE11 MycFlag Vector de expresión en células de mamífero que lleva clonado el ADNc de MRE11 humano fusionado a Myc-Flag. OriGene pCMV6 MRE11 T597A MycFlag Vector derivado de pCMV6 MRE11 MycFlag en el que se ha cambiado el aminoácido Thr 597 por Ala mediante mutagénesis dirigida. Esta Tesis pCMV6 MRE11 T MycFlag Vector derivado de pCMV6 MRE11 T597A MycFlag en el que se han cambiado los aminoácidos Glu 600 por Gly, Thr 601 por Ala, Ser 602 por Ala y Thr 603 por Ala mediante mutagénesis dirigida. Esta Tesis pCW7 (pRBG4 Myc Ub) Plásmido que expresa el gen de la ubicuitina fusionado a Myc. ATCC Tabla 3. Plásmidos utilizados. 2.2. Aislamiento de plásmidos de bacterias El aislamiento de plásmidos de cultivos bacterianos obtenidos a partir de colonias aisladas se realizó con diferentes kits comerciales dependiendo de la cantidad de ADN plasmídico que se quisiera obtener. Para obtener cantidades pequeñas de ADN plasmídico, partimos de cultivos bacterianos de hasta 4 mL y realizamos minipreparaciones utilizando el kit Isolate II Plasmid Mini Kit (BioLine), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para obtener grandes cantidades de ADN plasmídico de elevada pureza, partimos de cultivos bacterianos de 200 mL y realizamos maxipreparaciones utilizando el kit FavorPrep™ Plasmid DNA Extraction Maxi Kit (Favorgen), siguiendo también las indicaciones del producto. Una vez obtenidas las diferentes preparaciones plasmídicas, medimos la concentración y pureza del ADN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (ThermoFisher Scientific). 2.3. Digestión de ADN con enzimas de restricción Las endonucleasas de restricción se utilizaron según las instrucciones del fabricante (New England Biolabs). Cuando se requería gran cantidad de ADN digerido, la restricción se prolongaba en el tiempo y se añadía más endonucleasa a mitad del proceso. Materiales y métodos 80 2.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa Los fragmentos de ADN se separaron por tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Las muestras de ADN se mezclaron con la cantidad correspondiente de tampón de carga 6X, y se cargaron en geles preparados con una concentración de agarosa entre 0,5 y 1,5% (según el tamaño del fragmento a visualizar o aislar) en tampón TAE 0,5X y 0,4 g/mL de bromuro de etidio (stock de 10 mg/mL, Sigma- Aldrich). Las muestras se acompañaron con un marcador con diferentes fragmentos de ADN de tamaño conocido (escalera de 1 kb, Gibco). La electroforesis se realizó en un equipo iMupid, de Eurogentec, utilizando el mismo tampón TAE 0,5X (sin bromuro de etidio) como electrolito, basándonos en el método descrito por Maniatis y colaboradores (Maniatis et al, 1982). Tras la migración, las bandas de ADN se visualizaron utilizando un transiluminador equipado con lámpara ultravioleta (GelDoc- 2000, BioRad) y se fotografiaron con una videocámara. Por último, las imágenes obtenidas se analizaron con el programa Quantity One de BioRad. Tampón de carga 6X: 40% (p/v) sacarosa, 0,25% (p/v) azul de bromofenol y 6 mM EDTA pH 8. Conservar a 4 °C. Tampón TAE: 40 mM Tris-acetato pH 8, 5 mM acetato sódico y 2 mM EDTA. Conservar a temperatura ambiente. 2.5. Purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa Con el fin de aislar y purificar fragmentos de ADN concretos previamente separados por electroforesis en gel de agarosa, utilizamos el kit Isolate II PCR and Gel kit (BioLine), siguiendo en todo momento las instrucciones del fabricante. 2.6. Purificación mediante precipitación fenólica Para purificar el ADN y extraer las proteínas, por ejemplo, tras una restricción, en primer lugar, añadimos a la muestra un volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Tras agitar la mezcla, centrifugamos durante 5 min a 14.000 rpm y temperatura ambiente. De esta manera, se obtuvo una fase acuosa que contenía el ADN libre de contaminación proteica. A continuación, precipitamos dicho ADN añadiendo la décima parte del volumen de la fase acuosa de acetato de sodio 3 M pH 5,2, 2,2 volúmenes de etanol absoluto a -20 °C y 1,5 L de glucógeno (20 mg/mL, Roche) si la cantidad de ADN a precipitar era pequeña. La mezcla se mantuvo a esta temperatura durante al menos 30 min y posteriormente se centrifugó durante otros 30 min a 14.000 rpm y 4 °C. El precipitado de ADN resultante se lavó con etanol al 70% a -20 °C y, por último, se secó y se resuspendió en H2O bidestilada. Materiales y métodos 81 2.7. Ligación de fragmentos de ADN La ligación de fragmentos de ADN se realizó con la ligasa de T4 siguiendo las indicaciones del fabricante (New England Biolabs). Para estas reacciones usamos una relación vector/inserto de 1 a 7. Las ligaciones se incubaron durante 4 h a temperatura ambiente. Posteriormente, el ADN se purificó mediante precipitación fenólica y se resuspendió en un volumen de 5 L de H2O bidestilada estéril. Después, utilizamos 1 L para transformar E. coli por electroporación. 2.8. Reacciones de PCR • Oligonucleótidos cebadores Los oligonucleótidos empleados como cebadores en las distintas reacciones de PCR, todos ellos adquiridos en Sigma-Aldrich, fueron los siguientes: Oligonucleótido Secuencia FBW7-S 5’ ACGTGAATTCAATCAGGAACTGCTCTCTGTGG 3’ FBW7-R 5’ ACGTGTCGACTCACTTCATGTCCACATCAAAGT 3’ Lenti bTrCP-S 5’ ACGTACTAGTCCACCATGTACCCATACGATGTTC 3’ Lenti FBXW7-S 5’ ACGTCTGCAGCCGCCATGGGCCGCATCTTTTACCCA TACGATG 3’ Lenti FBXW7Spe1-S 5’ ACGTACTAGTCCGCCATGGGCCGCATCTTTTACCCATACGATG 3’ MRE11-mut.597-S 5’ AAGAGCAGACGCTGGTCTGGA 3’ MRE11-mut.597-R 5’ CCTCTTTGAGACCCTCCTC 3’ MRE11-mut.600/3-S 5’ GCTGCCCGTAGCAGGAACTCAAAG 3’ MRE11-mut.600/3-R 5’ AGCCCCCAGACCAGCGTCTGCTC 3’ NBS1-S 5’ ACGTGTCGACGTGGAAACTGCTGCCCGCCGC 3’ NBS1-R 5’ ACGTGTCGACTTATCTTCTCCTTTTTAAATAAGGATTGT 3’ NBS1-mut.273-S 5’ TGTTGTTGATGCAGGAATAACAAACTCAC 3’ NBS1-mut.273-R 5’ CACGTTCCCGGAGCCAAA 3’ NBS1-mut.337-S 5’ AAAGACAACAGCTCCAGGACC 3’ NBS1-mut.337-R 5’ AATCCTGTACTGGGATGG 3’ NBS1-mut.343-S 5’ ACCAAGCCTTGCACAAGGCGT 3’ NBS1-mut.343-R 5’ CCTGGAGTTGTTGTCTTTAATCCTG 3’ NBS1-mut.276/8-S 5’ ACGCACAGACCTTAATTCCTG 3’ NBS1-mut.276/8-R 5’ TTGCTATTCCTGCATCAACAAC 3’ NBS1-mut.341/3-S 5’ CTCCAGGACCAGGCCTTGCACAAGGCGTG 3’ NBS1-mut.341/3-R 5’ CTGTTGTCTTTAATCCTGTACTGGGATGG 3’ pLenti-R 5’ GTACGCGTAGAATCGAGACCG 3’ RAD50-S 5’ ACGTGAATTCTCCCGGATCGAAAAGATGAGCATTC 3’ RAD50-R 5’ ACGTCTCGAGTTAATGAACATTGAATCCCAGGGAGCTAA 3’ RAD50-mut.784-S 5’ TGAAGAAGAAGGTGCCAAAGTATG 3’ RAD50-mut.784-R 5’ GGCATTATTGTACCCAAG 3’ RAD50-mut.913-S 5’ AGAGCAGGTAGGCCCTTTGGA 3’ RAD50-mut.913-R 5’ TTAGCATCCTTTATCTCTCTGTAC 3’ Materiales y métodos 82 RAD50-mut.790-S 5’ AGTATGCCTGGCAGATGTTAC 3’ RAD50-mut.790-R 5’ TTGGCACCTTCTTCTTCAG 3’ RAD50-mut.916/8-S 5’ GGCCCTTTGGGAGCAGCATTGGAAAAG 3’ RAD50-mut.916/8-R 5’ TACCTGCTCTTTAGCATC 3’ Trcp-R2 5’ ACGTGTCGACTTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTTC 3’ Tabla 4. Oligonucleótidos empleados en las reacciones de PCR. • Amplificación de fragmentos de ADN para clonación Ciertos fragmentos de ADN de interés se amplificaron por PCR a partir de un vector de partida con el fin de clonarlos en otro vector de expresión. Estas reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 50 L, conteniendo 20 ng de ADN molde, 1 L de cada oligonucleótido cebador (a 100 M), 1 L de la mezcla de los 4 nucleótidos (dNTP, 10 mM), 0,5 L de Phusion High-Fidelity DNA Polimerase (New England Biolabs) y 10 L del tampón 5X de la polimerasa. La reacción se llevó a cabo en un termociclador Perkin Elmer 2400. • Análisis de transformantes por PCR Para identificar las bacterias transformadas con una determinada construcción se realizó una PCR a partir de las colonias obtenidas tras la transformación. Para ello, dichas colonias se picaron con palillos estériles en otra placa con el mismo medio, para conservar las bacterias, y en tubos de PCR previamente preparados con 25 L de la mezcla de reacción. Por último, la presencia del producto de la PCR se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa, y la fidelidad de la clonación por secuenciación. 2.9. Mutagénesis puntual Con el fin de generar versiones mutantes de RAD50, NBS1 y MRE11 utilizamos el kit Q5 site-directed mutagenesis Kit de New England Biolabs, siguiendo las indicaciones del fabricante. El primer paso fue diseñar los oligonucleótidos cebadores (recogidos en la Tabla 4) en los que se incorporaron los cambios de bases para producir los cambios de aminoácidos deseados. Después, se realizó una reacción de PCR utilizando como ADN molde los plásmidos correspondientes. Los productos de la PCR se incubaron con una mezcla enzimática que contenía una quinasa y una ligasa, necesarias para circularizar los plásmidos neoformados, y la enzima de restricción DpnI, que degradaba el ADN metilado (ADN molde) y hemimetilado (híbrido entre ADN molde y producto de la PCR), quedando solo los plásmidos amplificados en la PCR ya circularizados. Por último, para la transformación, se utilizaron bacterias quimiocompetentes y 5 L de la mezcla anterior. Tras una incubación de 30 min en hielo, la mezcla se sometió a un Materiales y métodos 83 choque térmico de 30 seg a 42 °C. Luego, se incubó de nuevo en hielo durante 5 min y se añadió 1 mL de medio LB. A continuación, la mezcla se mantuvo a 37 °C durante 1 h en agitación suave, y se cultivó en medio LB sólido con el antibiótico correspondiente al marcador de selección del plásmido utilizado. Las colonias obtenidas se analizaron por PCR y algunos de los clones positivos se mandaron a secuenciar para comprobar que los cambios introducidos en las secuencias de nucleótidos eran los correctos. 2.10. Transformación de bacterias electrocompetentes Para transformar bacterias con los plásmidos de interés, habitualmente recurrimos a la electroporación. Las diferentes estirpes de E. coli electrocompetentes se transformaron siguiendo las instrucciones del fabricante del electroporador (Gene Pulser II, BioRad). Se utilizaron 40 L de bacterias y 1 L de ADN, correspondiente a 100 ng como máximo. Las electroporaciones se llevaron a cabo en cubetas de 0,2 cm de grosor (BioRad), con las siguientes condiciones: 2,5 kV, 200  y 25 F, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Tras incubar las bacterias en 1 mL de medio LB a 37 °C, se sembraron en medio LB sólido suplementado con el antibiótico correspondiente al marcador de selección del plásmido. Finalmente, las colonias obtenidas se analizaron mediante PCR. 2.11. Secuenciación Las construcciones obtenidas tras los procesos de clonación y mutagénesis puntual se secuenciaron en centros especializados para comprobar que estuvieran libres de errores antes de usarlas en los diferentes ensayos. La comparación entre las secuencias obtenidas y las esperadas se realizó utilizando el programa BLAST (Altschul et al, 1990). Los oligonucleótidos empleados en las secuenciaciones, todos ellos adquiridos en Sigma-Aldrich, fueron los siguientes: Oligonucleótido Secuencia MRE11Seq 5’ CAGCAGCAACCAACAAAGG 3’ NBS1Seq 5’ GGGGAAGCTAGGTTGATAAC 3’ RAD50Seq 5’ GCTGGGACTTGTGCCCAT 3’ Tabla 5. Oligonucleótidos empleados en las reacciones de secuenciación. Materiales y métodos 84 2.12. Transfección transitoria de células de mamíferos Para los ensayos de transfección se usaron preparaciones de ADN plasmídico obtenidas según los protocolos mencionados anteriormente. Se siguieron diferentes métodos de transfección: • Transfección por electroporación Las transfecciones por electroporación se realizaron en la línea celular Cos-7, utilizando para cada transfección 107 células procedentes de cultivos no saturados. Las células se despegaron como se ha descrito anteriormente y se contabilizaron con una cámara de Petroff-Hauser (Marienfeld Superior), se centrifugaron a 1.000 rpm durante 8 min y se resuspendieron en medio de electroporación a razón de 107 células por cada 200 L. El ADN usado en las electroporaciones (40 g como máximo) se llevó a un volumen final de 50 L con H2O bidestilada estéril y NaCl a una concentración final de 200 mM. A esta mezcla se añadieron 200 L de la suspensión celular previa y todo el conjunto se pasó a una cubeta de electroporación de 0,4 cm de grosor (BioRad). Se utilizó un electroporador Gene Pulser II (BioRad) con las siguientes condiciones: 200 V, resistencia en infinito y 950 F. Tras el pulso eléctrico, las células se pasaron a un tubo con 10 mL de medio de electroporación fresco y se centrifugaron a 1.000 rpm durante 8 min. Para acabar, se resuspendieron en medio de cultivo y se realizaron las diluciones apropiadas. En general, la expresión de los ADNc transfectados con este método alcanzaba su pico máximo entre 18 – 24 h tras la transfección, bajando considerablemente a partir de ese momento. Medio de electroporación: medio de cultivo suplementado con 15 mM de HEPES sódico a pH 7,4. • Transfección con sistemas lipídicos Las transfecciones con sistemas lipídicos se realizaron en la línea celular HEK293T utilizando el kit Xfect (Takara), siguiendo las indicaciones del fabricante. Estos ensayos se realizaron en cajas de 6 pocillos a partir de cultivos subconfluentes (entre 50 y 70% de ocupación). El ADN utilizado (7,5 g como máximo) se diluyó en tampón para ADN (Xfect reaction buffer) y se añadió la cantidad adecuada de polímero (Xfect polymer). Posteriormente, se dejó reposar mínimo 10 min para asegurar la interacción polímero- ADN. Por último, la mezcla se añadió al medio de cultivo en que se encontraban las células. Materiales y métodos 85 El tiempo óptimo de transfección fue de 48 h, aunque algunos ensayos se hicieron a tiempos distintos según las necesidades experimentales. 2.13. Producción de lentivirus Una vez que clonamos los genes de interés (HA  TrCP, HA  TrCP  F, HA FBXW7 y HA FBXW7   F) en pLenti 6.3/V5-DEST, nos aseguramos en primer lugar que las construcciones se expresaban apropiadamente. Para ello, se transfectaron estos vectores en células HEK293T utilizando el kit Xfect (Takara), según lo descrito en el apartado Transfección con sistemas lipídicos. Comprobada la correcta expresión de estas construcciones mediante Western blot, pasamos a la producción de los lentivirus correspondientes. Se transfectaron células HEK293T con los plásmidos pLenti 6.3/V5- DEST (con el gen de interés), pRSV-Rev, pMDLg/pRRE y pMD2.G, en una relación 4:1:2,6:1,4. Tras 48 h, se habían formado los lentivirus y liberado al medio de cultivo. Retiramos dicho medio y lo centrifugamos a 1.200 rpm y 4 °C durante 20 min para descartar posibles contaminantes celulares. El sobrenadante obtenido con la suspensión de lentivirus se filtró con ayuda de una jeringuilla a través de un disco Puradisc de 25 mm y 0,45 m de tamaño de poro (Cytiva). A continuación, añadimos a este filtrado un tercio de su volumen de Lenti-X-concentrator (Clontech) y lo mantuvimos en agitación a 4 °C durante 4 h. Después, la mezcla se centrifugó a 1.500 g y 4 °C durante 1 h, descartamos el sobrenadante y el precipitado obtenido, que contenía los lentivirus, se resuspendió en 200 L de PBS 1X. Por último, titulamos los virus utilizando Lenti-X-GoStix (Clontech), obteniendo un título superior a 5x105 ifu o unidades infecciosas/mL. La suspensión de lentivirus se almacenó a -80 °C en alícuotas de un solo uso. 2.14. Transducción con lentivirus Antes de realizar la transducción se determinó la dosis mínima de blasticidina capaz de matar a las células no transducidas. Para ello, se trataron cultivos de células subconfluentes con un rango amplio de dosis del fármaco (2,5 – 40 g/mL) y se observó su evolución hasta un máximo de 7 días. Así, se determinó que la dosis apropiada de blasticidina para las líneas celulares utilizadas en este trabajo era 20 g/mL. Para realizar las transducciones con los lentivirus, las líneas celulares de interés se cultivaron en cajas de 6 pocillos hasta alcanzar una confluencia del 70%. Se añadió entonces una alícuota de 10 L de lentivirus concentrados al medio de cultivo celular, manteniendo siempre un pocillo sin lentivirus como control de la transducción. Tras 24 h de infección, se retiró el medio de cultivo y se añadió medio nuevo con 20 g/mL de blasticidina, tanto a las células transducidas como al control. Las células seleccionadas Materiales y métodos 86 con la blasticidina se amplificaron escalonadamente, manteniendo la presencia del antibiótico en el medio de cultivo en todo momento, y se congelaron cuando alcanzaron el crecimiento adecuado. La correcta expresión de los genes transducidos se comprobó mediante Western-blot tanto en el proceso de amplificación como en las líneas celulares establecidas y congeladas. 2.15. ARNs pequeños de interferencia (siRNAs) Los ARNs pequeños de interferencia fueron adquiridos en Sigma-Aldrich. En los ensayos de silenciamiento génico transitorio se emplearon los siguientes siRNAs: siRNA Secuencia Referencia EGFP 5’ CCUACGCCACCAAUUUCGU 3’ (Lee et al, 2007) FBXW7 5’ GUGAAGUUGUUGGAGUAGA 3’ (van Drogen et al, 2006) HA TrCP 5’ CUUAUGAUGUACCAGACUA 3’ Esta Tesis LC3 5’ GAAGGCGCUUACAGCUCAA 3’ (Gao et al, 2010) p62 5’ GUAAGCCUAGGUGUUGUCA 3’ (Pursiheimo et al, 2009) Tabla 6. ARNs pequeños de interferencia utilizados. Se muestra la secuencia 5’-3’ de la cadena sentido del dúplex de ARN. 2.16. Silenciamiento génico transitorio Con el fin de inhibir la expresión de determinados genes de interés, se realizaron ensayos de silenciamiento génico transitorio con 50 nM de ARNs pequeños de interferencia (siRNA, ver la Tabla 6), utilizando lipofectamina (Invitrogen) como reactivo de transfección. Las células empleadas generalmente fueron U2OS, que debían presentar una confluencia del 65 – 75%. Se incubaron en medio de cultivo OPTI-MEM (Gibco) un mínimo de 3 h previo a la interferencia. A continuación, diluimos por separado tanto los ARNs pequeños de interferencia como la cantidad adecuada de lipofectamina en medio OPTI-MEM. Incubamos 5 min a temperatura ambiente, mezclamos entre sí ambos componentes e incubamos otros 20 min para asegurar la interacción polímero-ARN. La mezcla se añadió al medio de cultivo y se mantuvo durante un mínimo de 4 – 5 h. Finalmente, se retiró y se añadió medio de cultivo fresco. Las células se recogieron a las 48 h de la interferencia. Materiales y métodos 87 3. Análisis de proteínas 3.1. Preparación de extractos celulares Se han realizado diferentes tipos dependiendo de la finalidad y las necesidades experimentales. • Extractos totales Para extraer la totalidad de las proteínas celulares, incluyendo las proteínas unidas a ácidos nucleicos, utilizamos tampón RIPA con alta concentración de sal (420 mM NaCl), suplementado con inhibidores de proteasas. Los precipitados celulares se resuspendieron con ayuda de un agitador tipo vórtex en un volumen estimado del tampón. Después, se sonicaron utilizando un sonicador Bandelin SONOPLUS mini20 al 50% de potencia, durante 1,5 min en pulsos de 0,5 seg con pausas de 1 seg. Posteriormente, las muestras se mantuvieron un mínimo de 30 min en agitación a 4 °C. Para finalizar, se centrifugaron 30 min a 14.000 rpm y 4 °C, y los sobrenadantes obtenidos se conservaron a -80 °C para su uso posterior. Tampón RIPA con 420 mM NaCl e inhibidores de proteasas: 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% dodecilsulfato de sodio (SDS), 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10% glicerol, 420 mM NaCl, CLAP y PMSF. Mezcla de inhibidores de proteasas (CLAP 500X): preparar los siguientes stocks: quimostatina (Sigma-Aldrich, 5 mg/mL en DMSO), pepstatina (Sigma-Aldrich, 0,5 mg/mL en metanol), leupeptina (Sigma-Aldrich, 0,5 mg/mL en H2O bidestilada), aprotinina (Sigma-Aldrich, 0,5 mg/mL en PBS 1X). Para generar la mezcla 500X, combinar volúmenes iguales de los cuatro inhibidores y completar con H2O bidestilada si fuera necesario. Conservar a -20 °C. PMSF 100X: 100 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo(PMSF, Sigma-Aldrich) en etanol absoluto. Conservar a -20 °C. • Extractos celulares NP-40 Para los ensayos de inmunoprecipitación, los precipitados celulares se lisaron en tampón NP-40 con alta concentración de sal (420 mM NaCl) para obtener también las proteínas unidas a ácidos nucleicos, suplementado con inhibidores de proteasas. Se resuspendieron en un volumen estimado de tampón de lisis y se mantuvieron un mínimo de 30 min en agitación a 4 °C. Después, las muestras se centrifugaron 30 min a 14.000 rpm. Los sobrenadantes obtenidos se diluyeron con tampón NP-40 sin sal suplementado con inhibidores de proteasas, para rebajar la concentración de sal del extracto hasta 150 mM. Finalmente, los extractos obtenidos se conservaron a -80 °C hasta su uso. Tampón NP-40 con 420 mM NaCl e inhibidores de proteasas: 1% NP-40, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10% glicerol, 420 mM NaCl, CLAP y PMSF. Tampón NP-40 sin sal con inhibidores de proteasas: 1% NP-40, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10% glicerol, CLAP y PMSF. Materiales y métodos 88 • Fraccionamiento subcelular Se han aplicado varios protocolos de fraccionamiento subcelular, que se detallan a continuación: o Obtención de extractos citosólicos y nucleares Para obtener los extractos citosólicos y nucleares seguimos el protocolo de Dignam y colaboradores (Dignam et al, 1983) con ligeras modificaciones. Los precipitados celulares fueron resuspendidos en 5 volúmenes (respecto al volumen del precipitado) de tampón A, hipotónico, para favorecer la rotura de la membrana plasmática. Después, se centrifugaron y se resuspendieron en 2 volúmenes del mismo tampón A. Se sometieron entonces a presión mecánica con ayuda de un pistón automático (Kimble Chase) para favorecer la rotura de las membranas citoplasmáticas y la liberación de su contenido. Cada cierto tiempo, las muestras se fueron analizando al microscopio en preparaciones con azul de tripano para distinguir la presencia de células enteras (no teñidas) y de núcleos intactos (teñidos de azul). Cuando la proporción de núcleos intactos superó considerablemente la de células enteras, las muestras se centrifugaron a 2.000 rpm durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante resultante correspondió a la fracción citosólica y el precipitado a la fracción enriquecida en núcleos. Al sobrenadante se le añadieron 0,11 volúmenes (respecto al volumen obtenido tras la centrifugación) de tampón B y se incubó en agitación a 4 °C durante un mínimo de 30 min. Tras esto, se centrifugó a 14.000 rpm y 4 °C durante 1 h. El sobrenadante resultante se denominó S100 y se conservó a -80 °C. El precipitado enriquecido en núcleos se centrifugó 20 min a 14.000 rpm y 4 °C para eliminar los restos de citosol presentes. Luego, se resuspendió en un volumen estimado de tampón C y se incubó en agitación a 4 °C durante un mínimo de 30 min. Tras esto, se centrifugó a 14.000 rpm y 4 °C durante otros 30 min. El sobrenadante resultante se denominó extracto nuclear (EN) y se conservó a -80 °C. Para los ensayos de inmunoprecipitación realizados en extractos nucleares fue necesario rebajar la concentración de sal hasta 150 mM, para lo cual utilizamos tampón C sin sal. Tampón A: 10 mM HEPES pH 7,9, 1,5 mM MgCl2·6H2O, 10 mM KCl, CLAP, PMSF y 0,5 mM DTT. Tampón B: 0,3 M HEPES pH 7,9, 30 mM MgCl2·6H2O, 1,4 M KCl, 9% NP-40, 20% glicerol, CLAP y PMSF. Tampón C: 20 mM HEPES pH 7,9, 1,5 mM MgCl2·6H2O, 10% glicerol, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 0,2 mM EDTA, CLAP, PMSF y 0,5 mM DTT. Tampón C sin sal: 20 mM HEPES pH 7,9, 1,5 mM MgCl2·6H2O, 10% glicerol, 1% NP-40, 0,2 mM EDTA, CLAP, PMSF y 0,5 mM DTT. Materiales y métodos 95 concentración de sal del extracto hasta 150 mM y la concentración de SDS hasta el 1%. De esta manera, posibilitamos la interacción anticuerpo-proteína de interés durante el ensayo de inmunoprecipitación posterior. Finalmente, los extractos obtenidos se conservaron a -80 °C para su uso futuro. En todos los casos se realizó la inmunoprecipitación de la proteína sustrato de estudio y sus formas ubicuitiladas se detectaron en un Western blot posterior con los anticuerpos apropiados. Tampón de lisis para ubicuitilación in vivo: 1% NP-40, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10% glicerol, 420 mM NaCl, 5% SDS, 10 mM iodoacetamida (Sigma-Aldrich), CLAP y PMSF. Tampón de lisis para ubicuitilación in vivo sin sal ni SDS: 1% NP-40, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10% glicerol, 10 mM iodoacetamida, CLAP y PMSF. 3.10. Ensayos de co-inmunoprecipitación Con esta técnica pudimos detectar interacciones entre proteínas in vivo. Consiste en utilizar anticuerpos para reconocer e inmunoprecipitar una proteína específica en un extracto para, posteriormente, analizar mediante western blot las proteínas que vienen asociadas a ella (las proteínas que co-inmunoprecipitan). Los ensayos de inmunoprecipitación (IP) se realizaron en extractos obtenidos por diferentes métodos, como se ha visto anteriormente, pero siempre asegurando una concentración de NaCl final de 150 mM. Para cada inmunoprecipitación se utilizó entre 1 y 2 mg de proteína total. En primer lugar, realizamos una etapa de limpieza de interacciones inespecíficas o preclearing con IgG de la especie del anticuerpo primario, incubando los extractos celulares con IgG de ratón (Santa Cruz Biotechnology) o conejo (suero total de conejo) durante 30 min a 4 °C en agitación. A continuación, se añadieron 20 μL de proteína A- sefarosa (para anticuerpos producidos en conejo) o proteína G-sefarosa (para anticuerpos producidos en ratón), ambas de Cytiva, y se incubaron durante 45 min en las mismas condiciones. Tras esto, las muestras se centrifugaron 2 min a 5.000 rpm y se reservaron los sobrenadantes. En segundo lugar, realizamos la inmunoprecipitación propiamente dicha, añadiendo a la mitad de los sobrenadantes el anticuerpo contra la proteína de interés e incubamos las muestras durante 2 h a 4 °C en agitación. Como control, incubamos la otra mitad del extracto con la IgG correspondiente, utilizando una cantidad en g equivalente al anticuerpo primario en las mismas condiciones. Después, se añadieron 20 μL de proteína A/G-sefarosa y se incubaron durante 1 h más. De nuevo, las muestras se centrifugaron 2 min a 5.000 rpm y los sobrenadantes se descartaron o se conservaron a -80 °C. Por último, las matrices de proteína A/G-sefarosa obtenidas anteriormente se lavaron 6 veces con el mismo tampón utilizado para la extracción de proteínas en cada Materiales y métodos 96 experimento. Las proteínas inmunoprecipitadas se solubilizaron añadiendo tampón de carga Laemmli 4X e incubando 6 min a 95 °C. Finalmente, las muestras se analizaron mediante Western blot. En algunas ocasiones también se analizaron los extractos celulares antes y después de realizar la inmunoprecipitación para comprobar la eficacia de ésta. Los anticuerpos empleados para inmunoprecipitar las diferentes proteínas de interés se relacionan en la siguiente tabla: Anticuerpo Clonicidad/especie Casa comercial Concentración TrCP Monoclonal de conejo Cell Signaling Technology 1:200 FBXW7 Policlonal de conejo Bethyl Laboratories 1:100 Flag Monoclonal de ratón Sigma-Aldrich 1:100 HA.11 Monoclonal de ratón BioLegend 1:200 MRE11 Monoclonal de conejo Cell Signaling Technology 1:100 MRE11 Monoclonal de ratón Santa Cruz Biotechnology 1:50 NBS1 Monoclonal de conejo Cell Signaling Technology 1:100 RAD50 Policlonal de conejo Novus Biologicals 1:100 RAD50 Monoclonal de ratón Santa Cruz Biotechnology 1:50 Tabla 8. Anticuerpos utilizados para inmunoprecipitar proteínas. Materiales y métodos 97 4. Técnicas celulares 4.1. Inmunofluorescencia Los ensayos de inmunofluorescencia se realizaron con cultivos de células adherentes crecidas sobre cubreobjetos, tanto en las condiciones habituales de crecimiento como tras diversos tratamientos. Para empezar, las células se lavaron con PBS, precalentado a 37 °C, para eliminar los restos de medio de cultivo. Luego, se fijaron con metanol puro conservado a -20 °C durante 10 min, manteniendo las preparaciones en hielo este tiempo. Después de otro lavado con PBS, se permeabilizaron con una solución al 0,25% de Tritón X-100 durante 10 min. Tras esto, incubamos las preparaciones con solución de bloqueo durante 1 h y preparamos los anticuerpos primarios diluidos a las concentraciones apropiadas en la misma solución de bloqueo. Las muestras se incubaron 1 h en una cámara húmeda con la mezcla del anticuerpo primario y luego se lavaron con PBS. A continuación, se cubrieron con una preparación de anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína o rodamina (Alexa Fluor 488 dye y Alexa Fluor 555 dye, ThermoFisher Scientific), a las concentraciones recomendadas por el fabricante, en solución de bloqueo y se incubaron 35 – 45 min. Tras un nuevo lavado con PBS, se deshidrataron en etanol absoluto durante 2 min. Por último, se utilizó medio de montaje líquido (ibidi Mounting Medium With DAPI, Ibidi), que tenía incorporado DAPI para contrateñir el ADN, y se sellaron los márgenes de las preparaciones con laca de uñas. Los cubreobjetos ya montados se conservaron a 4 °C hasta su análisis al microscopio. Las preparaciones se observaron con un microscopio Leica DMi8 con objetivo de inmersión PlanApo 63X y las imágenes obtenidas se procesaron posteriormente con el programa informático ImageJ. Los anticuerpos utilizados en los ensayos de inmunofluorescencia se relacionan en la siguiente tabla: Anticuerpo Clonicidad/especie Casa comercial Concentración LAMP-1 Monoclonal de ratón Santa Cruz Biotechnology 1:500 LC3 Policlonal de conejo Novus Biologicals 1:400 MRE11 Monoclonal de ratón Santa Cruz Biotechnology 1:500 NBS1 Monoclonal de conejo Cell Signaling Technology 1:100 p62 Policlonal de conejo Novus Biologicals 1:2.000 RAD50 Monoclonal de ratón GeneTex 1:200 Tabla 9. Anticuerpos empleados en ensayos de inmunofluorescencia. Solución de bloqueo: 1% BSA y 0,1% Tween 20 en PBS. Materiales y métodos 98 4.2. Análisis de apoptosis mediante citometría de flujo Para evaluar la muerte celular por apoptosis en poblaciones de células en cultivo tras determinados tratamientos recurrimos al análisis por citometría de flujo utilizando el kit FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, de BD Biosciences. Este kit nos permite detectar las células apoptóticas gracias a la interacción entre la proteína anexina V y la fosfatidilserina que las células apoptóticas exponen en la cara externa de su membrana plasmática. Para preparar los controles de marcaje, mezclamos en 3 tubos independientes 200 L de suspensión celular de cada una de las condiciones del ensayo. Estos junto con las demás muestras se centrifugaron a 2.000 rpm durante 3 min y los precipitados celulares obtenidos se lavaron dos veces con PBS. A continuación, se centrifugaron a 3.000 rpm 10 min y se resuspendieron en el volumen adecuado de tampón 1X de unión a anexina. Después, se añadieron 5 L de anexina V y 5 L de yoduro de propidio a cada una de las muestras celulares, mientras que de los 3 controles de marcaje a uno no se le añadió nada, a otro se le añadió anexina V y al último yoduro de propidio. Todas las muestras se mantuvieron en oscuridad durante 15 min. Por último, se ajustó el volumen final de cada una añadiendo la cantidad adecuada de tampón 1X de unión a anexina, y se examinaron las células mediante un citómetro de flujo analítico FACSCanto II (BD Biosciences). Los resultados se analizaron mediante el software Diva. Todos los reactivos necesarios fueron aportados por el kit. Para la realización de estos ensayos contamos con la colaboración de los Dres. Miguel Ángel Japón y Carmen Sáez, del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla). 4.3. Análisis de actividad -galactosidasa en células senescentes Con el fin de detectar células senescentes en cultivo tras tratamientos específicos utilizamos el kit Senescence  -Galactosidase Staining Kit, de Cell Signaling Technology. Con él podemos reconocer células senescentes gracias a que éstas presentan actividad enzimática -galactosidasa lisosomal, detectable a pH 6. Así, son capaces de procesar X-gal, un sustrato análogo de la lactosa cuya hidrólisis genera un compuesto azul insoluble. Este tiñe las células que expresan esa enzima, y que son, por tanto, células senescentes. Para realizar estos ensayos partimos de células dispuestas en cajas de 3,5 cm de diámetro (-Dish, Ibidi). En primer lugar, retiramos el medio de cultivo y lavamos con PBS para eliminar los restos de medio. A continuación, cubrimos las células con 1 mL de solución fijadora e incubamos durante 10 – 15 min a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, lavamos 2 veces con PBS y cubrimos con 1 mL de solución de tinción de -galactosidasa. Sellamos las placas con parafilm para evitar la evaporación Materiales y métodos 99 e incubamos a 37 °C en una estufa sin CO2, protegidas de la luz. El tiempo de incubación fue variable dependiendo de la intensidad del marcaje resultante, aunque por lo general este comenzó a observarse a partir de las 4 h de incubación. Una vez obtenido el marcaje adecuado, se analizó directamente al microscopio o se retiró la solución de tinción de -galactosidasa y las células se conservaron a 4 °C cubiertas con glicerol al 70% hasta su análisis. Todos los reactivos necesarios fueron aportados por el kit, y las soluciones se prepararon justo antes de utilizarlas. Las preparaciones se observaron con un microscopio Olympus BX61 con objetivo de 10X y las imágenes obtenidas se procesaron posteriormente con el programa informático ImageJ. Solución fijadora 1X: diluir el reactivo 10X Fixative Solution en H2O bidestilada. Preparar la cantidad justa para agotar en el ensayo. Solución de tinción 1X: diluir el reactivo 10X Staining Solution en H2O bidestilada. Preparar la cantidad justa para agotar en el ensayo. X-gal: disolver 20 mg en 1 mL de dimetilformamida. Conservar a -20 °C protegido de la luz. Solución de tinción de -galactosidasa: 93% de solución de tinción 1X, 5% de X-gal 20 mg/mL, 1% del reactivo 100X solution A y 1% del reactivo 100X solution B. Ajustar a pH 6. 5. Cuantificación y análisis estadístico En ciertos ensayos se cuantificó la intensidad de las bandas obtenidas por Western blot para comprobar si determinadas condiciones experimentales provocaban cambios sustanciales en los niveles de las proteínas estudiadas. Para el análisis densitométrico de las imágenes se utilizó el programa informático ImageJ y para los cálculos posteriores el paquete informático Microsoft Excel. Para el análisis estadístico, los experimentos se realizaron al menos tres veces y los datos obtenidos se examinaron con el programa informático GraphPad Prism y el test t de Student de muestras desapareadas para analizar las diferencias entre dos condiciones. Estas diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando se obtuvo un valor p inferior a 0,05. Resultados Resultados 103 1. Caracterización de la asociación de  TrCP y FBXW7 con las proteínas del complejo MRN. En estudios previos de nuestro laboratorio identificamos las proteínas que coinmunoprecipitaban con HA TrCP (Herrero-Ruiz, 2015) y Flag FBXW7 (Giráldez, 2014) en ensayos de transfección transitoria en células Cos-7 mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS). El análisis de las secuencias peptídicas obtenidas tras dos ensayos independientes de espectrometría de masas reveló un gran número de proteínas candidatas con diferente grado de fiabilidad en función del número de péptidos independientes obtenidos y de la reproducibilidad. Entre ellas se encontraban proteínas del complejo MRN. Como ya nos hemos referido en la Introducción de esta Tesis, este complejo sensor de los daños en el ADN podría tener un papel relevante en los fenómenos de resistencia a diferentes tratamientos en pacientes de cáncer. Por tanto, en primer lugar, nos decidimos a caracterizar la asociación de TrCP y FBXW7 con las proteínas del complejo. Hay que señalar que, en adelante, cuando hablemos de TrCP, nos estaremos refiriendo a TrCP1 (Margottin et al, 1998), mientras que cuando hablemos de FBXW7, nos referiremos siempre a la isoforma FBXW7 (Liu et al, 2010). 1.1. TrCP y FBXW7 interaccionan in vivo con las proteínas del complejo MRN. Como acabamos de mencionar, tanto la inmunoprecipitación de HA TrCP como la de Flag FBXW7 precipitaron algunas de las proteínas del complejo MRN. En el caso de la inmunoprecipitación de Flag FBXW7, tan solo identificamos un péptido único correspondiente a los aminoácidos 468-478 de MRE11 (Figura 24). Figura 24. Identificación de un péptido único perteneciente a MRE11 en la inmunoprecipitación de Flag FBXW7 mediante espectrometría de masas en tándem. En la figura se presenta el perfil con el patrón de los fragmentos obtenidos para el péptido identificado de MRE11, así como su secuencia. Por su parte, en la inmunoprecipitación de HA TrCP identificamos tres péptidos únicos correspondientes a los aminoácidos 99-107, 491-511 y 934-948 de RAD50, y un péptido único, aminoácidos 414-424, de NBS1 (Figura 25). Resultados 104 Figura 25. Identificación de péptidos únicos pertenecientes a RAD50 y NBS1 en la inmunoprecipitación de HA TrCP mediante espectrometría de masas en tándem. En la figura se presentan los perfiles con los patrones de los fragmentos obtenidos para cada uno de los péptidos identificados, cuyas secuencias se muestran también, en el caso de RAD50 (A) y NBS1 (B). Para confirmar estos datos preliminares, nos dispusimos a repetir las inmunoprecipitaciones previas, pero analizando la co-inmunoprecipitación de las proteínas del complejo mediante Western-blot. Para ello, transfectamos por electroporación células Cos-7 con pCS2HA TrCP y pCDNA3 Flag FBXW7, por separado. Tras esperar a que las construcciones alcanzaran su máxima expresión, recogimos las células y preparamos extractos citosólicos y nucleares, según se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente, inmunoprecipitamos las proteínas F-box utilizando los anticuerpos anti-HA y anti-Flag, respectivamente, y analizamos las proteínas coinmunoprecipitadas con los anticuerpos apropiados. En la Figura 26 se observa que la Resultados 111 consenso se encuentran en todos los sustratos conocidos de SCF(TrCP) o SCF(FBXW7) (Wang et al, 2014c; Yumimoto & Nakayama, 2020). El motivo consenso de unión a TrCP generalmente aceptado es: D-S-G-X2-3-S, siendo X cualquier aminoácido. Sobre este motivo se han aceptado algunas variantes (Wang et al, 2014c): • Ácido glutámico (E), en lugar de ácido aspártico (D), en la primera posición. • Treonina (T), en lugar de serina (S), en las posiciones segunda y última. • Alanina (A), en lugar de glicina (G), en la posición tercera. • En ocasiones, también son válidos aminoácidos ácidos (fosfomiméticos) en lugar de serinas o treoninas fosforiladas. Estas combinaciones y variantes, que lo alejan en mayor o menor medida de la secuencia estándar, dificultan su identificación. Asimismo, se han documentado sustratos de SCF(TrCP) en los que no ha sido posible determinar la secuencia del degrón (Wang et al, 2014c). Con este planteamiento logramos seleccionar un motivo potencial en cada una de las 3 proteínas del complejo MRN (ver Tabla 10). Tabla 10. Motivos de unión a TrCP identificados y mutados en los componentes del complejo MRN. En los motivos identificados se han incluido y mutado algunos aminoácidos cercanos por si su proximidad pudiera permitir la interacción tras el cambio de los aminoácidos del propio motivo. En negrita se destacan los aminoácidos cambiados. Mediante mutagénesis dirigida, generamos versiones mutantes de las 3 proteínas cambiando la primera serina o treonina del motivo por alanina o glicina. Las mutaciones se confirmaron por secuenciación. Para conocer cómo afectaban in vivo esas mutaciones a la asociación con TrCP, estudiamos si se perdía, o como mínimo disminuía, la co-inmunoprecipitación entre los mutantes y la proteína F-box. Transfectamos las células Cos-7 con los plásmidos que codificaban las versiones silvestre y mutante de cada proteína del complejo MRN, respectivamente. Tras recoger las células y preparar extractos NP-40, inmunoprecipitamos TrCP endógena y analizamos las co-inmunoprecipitaciones mediante Western-blot. Desafortunadamente, ninguna de las proteínas mutadas perdía la interacción con TrCP, así que decidimos generar nuevos mutantes a partir de los anteriores Proteína Motivo identificado Primeros mutantes Segundos mutantes Nombre Nuevo motivo Nombre Nuevo motivo MRE11 596 DTGLETST 603 T597A 596 DAGLETST 603 MRE11 T 596 DAGLGAAA 603 RAD50 783 ESAKVCLT 790 S784G 783 EGAKVCLT 790 RAD50 T 783 EGAKVCLA 790 NBS1 272 DTGITNS 278 T273A 272 DAGITNS 278 NBS1 T 272 DAGIANA 278 Resultados 112 cambiando la segunda serina o treonina (o aminoácido ácido) igualmente a alanina o glicina. Además, los nuevos mutantes incluían mutaciones en otros aminoácidos potencialmente fosforilables o ácidos localizados próximos al motivo. En la Tabla 10 se recogen todos esos cambios en las secuencias de aminoácidos de MRE11, RAD50 y NBS1. Una vez confirmados los nuevos cambios, repetimos los ensayos de transfección e inmunoprecipitación como se ha descrito anteriormente. En esta ocasión, tampoco obtuvimos pérdida de interacción con los mutantes RAD50 T y NBS1 T, pero sí con el mutante MRE11 T. Como se observa en la Figura 35, al inmunoprecipitar TrCP en las células transfectadas con pCMV6 MRE11 MycFlag vienen asociadas todas las proteínas del complejo MRN. Sin embargo, en las células transfectadas con pCMV6 MRE11 T MycFlag no se observa co-inmunoprecipitación de MRE11 T, disminuyendo también la asociación de RAD50 y NBS1. Como control de la inmunoprecipitación utilizamos PLK1 (Giráldez et al, 2017). Esto nos indica que existe una interacción directa entre MRE11 y TrCP a través del motivo identificado. No obstante, el hecho de que SCF(TrCP) ubicuitile in vitro a las 3 proteínas del complejo sugiere que NBS1 y RAD50 también poseen sitios de interacción que no hemos localizado. Figura 35. El mutante MRE11 T pierde la asociación con TrCP. Las células Cos-7 fueron transfectadas con los plásmidos indicados. Tras preparar los extractos, inmunoprecipitamos TrCP y analizamos por Western-blot la asociación o pérdida de ella con las formas silvestre y mutante de MRE11. Como control se utilizó IgG de conejo. Los ensayos se realizaron por triplicado. Ext: muestras de los extractos celulares empleados para las IPs. Respecto a FBXW7, el motivo consenso establecido es: -X----S/T-P-P-X-S/T, siendo X cualquier aminoácido y  un aminoácido hidrofóbico. Sobre este esquema se pueden aceptar variantes: Resultados 113 • Un aminoácido cualquiera en lugar de la segunda prolina (P). • Aminoácidos ácidos (fosfomiméticos) en lugar de serinas o treoninas fosforiladas. Como ocurría anteriormente con la secuencia del fosfodegrón de TrCP, hay que tener en cuenta que el motivo de interacción puede variar más aún respecto a esta secuencia consenso. Incluso, puede que algunos sustratos carezcan de secuencias que se asemejen a la misma (Yumimoto & Nakayama, 2020). Con estas indicaciones, en la secuencia de MRE11 no encontramos ningún motivo que se pareciera al consenso, mientras que en RAD50 y NBS1 pudimos seleccionar un motivo en cada proteína (ver Tabla 11). Tabla 11. Motivos de unión a FBXW7 identificados y mutados en los componentes del complejo MRN. En los motivos identificados se han incluido y mutado algunos aminoácidos cercanos por si su proximidad pudiera permitir la interacción tras el cambio de los aminoácidos del propio motivo. En negrita se destacan los aminoácidos cambiados. Siguiendo el proceso anteriormente descrito, generamos por mutagénesis puntual versiones de estas dos proteínas con cambios en la primera serina o treonina del consenso. Además, en el caso de NBS1, generamos otro mutante en la serina 343, que está localizada junto al potencial CPD y es diana de la quinasa ATM (Lim et al, 2000; Gatei et al, 2000). Tras confirmar por secuenciación los cambios incorporados, repetimos el proceso anterior para averiguar si se perdía la co-inmunoprecipitación entre la proteína F-box y los mutantes generados. Por desgracia, las proteínas mutadas no perdieron la interacción con FBXW7, así que generamos nuevos mutantes a partir de los previos. En el caso de NBS1, el nuevo mutante englobaba las dos mutaciones construidas anteriormente, e incluía la mutación de una serina adicional. En la Tabla 11 se recogen todos estos cambios en las secuencias de aminoácidos tanto de RAD50 como de NBS1. Repetimos los ensayos de transfección y de inmunoprecipitación de la ligasa endógena, pero estos no aportaron resultados claros. El hecho de que no se hayan obtenido resultados positivos con ninguna de las proteínas sugiere que deben existir otros motivos no consenso responsables de la interacción. Proteína Motivo identificado Primeros mutantes Segundos mutantes Nombre Nuevo motivo Nombre Nuevo motivo RAD50 912 VSPLETT 918 S913G 912 VGPLETT 918 RAD50 FB 912 VGPLGAA 918 NBS1 337 TPGPSLS 343 T337A 337 APGPSLS 343 NBS1 FB 337 APGPGLA 343 S343A 337 TPGPSLA 343 Resultados 114 1.4. Estudio de las potenciales quinasas implicadas en la asociación proteína F-box/sustrato. Como señalamos anteriormente, para que las proteínas F-box reconozcan a sus sustratos suele ser necesario que el degrón experimente ciertas modificaciones posttraduccionales. Entre estas modificaciones destaca la fosforilación de residuos específicos del propio degrón, denominado entonces fosfodegrón (Skaar et al, 2013). Por ello, para seguir con la caracterización de las interacciones detectadas, quisimos estudiar qué quinasa mediaba en las asociaciones. Dado que la asociación entre TrCP y FBXW7 y el complejo MRN se detectó en células cultivadas en condiciones normales de crecimiento, se podía pensar que la quinasa que mediara esta asociación debía ser una quinasa que actuara en condiciones basales, lo que restringía las posibilidades, sin descartar que otras quinasas pudieran intervenir en otras condiciones. En primer lugar, decidimos estudiar la posible implicación de GSK3, quinasa que clásicamente fosforila sustratos que van a ser reconocidos y poliubicuitilados por SCF(TrCP) y SCF(FBXW7) (Robertson et al, 2018; Heo et al, 2016) Para estudiar el potencial papel de GSK3 en la asociación TrCP/MRN, utilizamos CHIR-99021, compuesto que activa la vía WNT/-catenina inhibiendo a GSK3 (Galindo- Moreno et al, 2019). Electroporamos células Cos-7 con pCS2 HA TrCP y las cultivamos posteriormente en presencia y ausencia de CHIR-99021. Inmunoprecipitamos la proteína F-box sobreexpresada y observamos que en las células cultivadas en condiciones control co-inmunoprecipitaban las 3 proteínas del complejo MRN, mientras que en aquellas tratadas con CHIR-99021 la interacción se reducía notablemente (Figura 36). Como control del experimento utilizamos -catenina, cuya interacción con TrCP depende de GSK3 (Hart et al, 1999), por lo que también se redujo con el tratamiento. También utilizamos WEE1, en este caso como control negativo, ya que su interacción con TrCP depende de otras quinasas (Watanabe et al, 2004, 2005). Confirmamos así que el tratamiento con CHIR-99021 no afectaba a su asociación con la proteína F-box. Resultados 115 Figura 36. El tratamiento con CHIR- 99021, inhibidor de la quinasa GSK3, reduce la asociación entre las proteínas del complejo MRN y HA TrCP. Las células Cos-7 fueron transfectadas con pCS2 HA TrCP, y parte de ellas tratadas con CHIR-99021 durante 24h. Tras inmunoprecipitar HA TrCP, analizamos la asociación al complejo MRN mediante Western-blot. Como control se usó IgG de ratón. El ensayo se realizó por duplicado. Ext: muestras de los extractos celulares empleados para las IPs. En segundo lugar, estudiamos CK2, quinasa que participa en procesos biológicos fundamentales como la regulación del ciclo celular, la apoptosis o la respuesta a daños en el ADN, entre otros. Generalmente, se considera que esta quinasa actúa de manera constitutiva, aunque también existen evidencias de que la fosforilación de determinados sustratos está regulada de diversas formas (Roffey & Litchfield, 2021). Dado que CK2 participa en la fosforilación de algunos de los sustratos de SCF(TrCP) (Watanabe et al, 2005), quisimos estudiar su posible implicación en la interacción de esta ligasa de ubicuitina con el complejo MRN. Con este fin, utilizamos TBB, un inhibidor de CK2 de gran especificidad (Watanabe et al, 2005). Seguimos el mismo procedimiento del ensayo anterior, cultivando en este caso las células electroporadas en presencia y ausencia de TBB. Sin embargo, tras inmunoprecipitar la proteína F-box, comprobamos que no había diferencia en la interacción TrCP/MRN entre las células control y las tratadas con el inhibidor de CK2 (resultados no mostrados), descartando así que esta quinasa pudiera tener un papel en la asociación en nuestras condiciones. Por último, estudiamos la implicación de la quinasa p70S6K. Se ha publicado que esta quinasa fosforila a MRE11 en la treonina 597 (Piscitello et al, 2018), residuo que se encuentra en el fosfodegrón que hemos identificado para TrCP. Por ello, pensamos que p70S6K podría intervenir en la asociación entre TrCP y MRN, a través de la fosforilación de MRE11. Para comprobar esta hipótesis, utilizamos PF-4708671, un inhibidor de p70S6K (Piscitello et al, 2018). Transfectamos por electroporación células Cos-7 con pCS2 HA TrCP y las cultivamos en presencia y ausencia de PF-4708671. Igual que antes, inmunoprecipitamos HA TrCP y observamos que la coinmunoprecipitación de MRN fue ligeramente inferior tras el tratamiento con PF- Resultados 116 4708671 respecto a la condición sin tratar (Figura 37). Como control de la actividad del compuesto, utilizamos la forma fosforilada e inactiva de la quinasa (p-p70S6K). En conjunto, estos resultados sugieren que al menos las quinasas GSK3 y p70S6K tendrían un papel en la asociación de TrCP con el complejo MRN. Figura 37. El tratamiento con PF- 4708671, inhibidor de la quinasa p70S6K, afecta a la asociación entre las proteínas del complejo MRN y HA TrCP. El ensayo se realizó como se ha indicado en la figura anterior, pero tratando en este caso las células con PF- 4708671 durante 24h. El ensayo se realizó por duplicado. Ext: muestras de los extractos celulares empleados para las IPs. *: banda inespecífica. Respecto a la asociación FBXW7/MRN, volvimos a poner el foco sobre GSK3. Electroporamos células Cos-7 con pCDNA3 Flag FBXW7 y, al igual que en los ensayos anteriores, las cultivamos en presencia y ausencia de CHIR-99021. Inmunoprecipitamos Flag FBXW7 y observamos la co-inmunoprecipitación de las 3 proteínas del complejo en condiciones control, y una disminución de todas ellas tras el tratamiento con CHIR-99021 (Figura 38). Este resultado sugiere una implicación de GSK3 también en la asociación de FBXW7 con el complejo MRN. Figura 38. El tratamiento con CHIR- 99021 reduce la asociación entre las proteínas del complejo MRN y Flag FBXW7. En esta ocasión, las células Cos-7 fueron transfectadas con pCDNA3 Flag FBXW7, y tratadas con CHIR-99021 durante 24h. La inmunoprecipitación de Flag FBXW7 fue analizada por Western-blot. Como control se usó IgG de ratón. El ensayo se realizó por duplicado. Ext: muestras de los extractos celulares empleados para las IPs. Resultados 117 Finalmente, estudiamos el efecto de la inhibición de CK2 sobre la asociación del complejo MRN con FBXW7, ya que se ha publicado que interviene en la fosforilación de otros sustratos de esta proteína F-box (Chen et al, 2011). Sin embargo, en este caso el tratamiento con TBB tampoco alteró la asociación entre FBXW7 y las 3 proteínas del complejo (resultados no mostrados). Por tanto, de acuerdo con los ensayos realizados, consideramos a GSK3 como quinasa responsable de la interacción FBXW7/MRN. Resultados 118 2. Función de la asociación de las proteínas F-box con el complejo MRN. En este segundo bloque de resultados, nos vamos a centrar en analizar el papel que cumple la interacción entre las proteínas F-box de nuestro estudio y MRN, exponiendo por separado los resultados obtenidos para TrCP y para FBXW7. 2.1. Papel de la asociación entre SCF(TrCP) y el complejo MRN. Para intentar clarificar el papel de TrCP respecto al complejo MRN, en primer lugar, estudiamos la posible poliubicuitilación in vivo del mismo, en este caso mediada por ubicuitinas unidas a través de K63, ya que previamente comprobamos que no se detectaban poliubicuitilaciones de tipo K48. Para realizar estos ensayos, seguimos la misma metodología anteriormente descrita. Tras preparar los extractos, inmunoprecipitamos la proteína correspondiente del complejo MRN y analizamos mediante Western-blot la presencia de poliubicuitilaciones con un anticuerpo antiubicuitina K63. Así, observamos que SCF(TrCP) fue capaz de poliubicuitilar a MRE11, pero no a RAD50 ni NBS1 (Figura 39). Figura 39. MRE11 es ubicuitilado in vivo por SCF(TrCP) mediante ubicuitinas unidas a través de la lisina 63. Los ensayos se realizaron como se ha indicado en apartados previos. Los corchetes señalan las formas poliubicuitiladas de alto peso molecular, con uniones ubicuitina-ubicuitina a través de K63. Los ensayos se realizaron por duplicado. Como se ha indicado en la Introducción, las cadenas de ubicuitina que presentan enlaces de tipo K63 suelen estar implicadas en procesos de señalización, modificando la localización de proteínas específicas o interviniendo en rutas de reparación de daños Resultados 119 en el ADN, entre otras (Pickart & Fushman, 2004; Haglund & Dikic, 2005). Dado que el complejo MRN actúa como sensor de daños en el ADN, decidimos averiguar cómo afectaba a los niveles de dicho complejo el daño en el ADN producido por cisplatino, agente genotóxico de amplio uso en quimioterapia. Cultivamos células U2OS en presencia de 10 M de cisplatino (Yu et al, 2016) durante 12, 24 y 48 h, observando que, en estas condiciones, no había cambios sustanciales en los niveles de las proteínas del complejo (Figura 40A). Igualmente, cultivamos con cisplatino las células U2OS::HA  TrCP, que sobreexpresaban constitutivamente HA  TrCP, y tampoco se detectaron cambios de relevancia en los niveles de MRN (Figura 40B). Estos resultados unidos a la poliubicuitilación in vivo de MRE11 mediada por ubicuitinas enlazadas a través de la lisina 63 anteriormente descrita, nos llevaron a pensar que, quizá, la poliubicuitilación mediada por TrCP tendría un papel en la localización del complejo MRN. Figura 40. El tratamiento con 10 M de cisplatino no altera los niveles del complejo MRN, independientemente de la sobreexpresión de HA  TrCP. (A) Las células U2OS fueron tratadas con cisplatino a la dosis y tiempos indicados. Se prepararon extractos totales y analizamos mediante Western-blot la evolución de las proteínas del complejo MRN. (B) Como en el apartado A, pero utilizando la línea celular U2OS::HA  TrCP para comprobar si la sobreexpresión de la proteína F-box afectaba a la estabilidad del complejo en esas condiciones. Los ensayos se realizaron por triplicado. Para averiguarlo, preparamos extractos cromatínicos según el protocolo descrito en Materiales y Métodos a partir de las células U2OS y U2OS::HA  TrCP. Como control de especificidad, utilizamos la línea U2OS::HA FBXW7, que sobreexpresa HA FBXW7 constitutivamente. Analizamos si la distribución de las 3 proteínas del complejo MRN variaba entre las fracciones cromatínicas y solubles con la sobreexpresión de alguno de los genes que codificaban las proteínas F-box. La Figura 41 muestra que la sobreexpresión de HA  TrCP provocó un incremento de la localización del complejo en Resultados 120 la cromatina, siendo específico de esta proteína F-box, ya que no ocurrió con la sobreexpresión de HA FBXW7. Sea por el incremento de MRN en la cromatina o por la acción directa de HA TrCP, también observamos un incremento de CtIP en la cromatina, otra proteína implicada en la cascada de reparación de daños en el ADN. Figura 41. La sobreexpresión de HA  TrCP favorece la localización en la cromatina del complejo MRN. A partir de cultivos de las líneas U2OS, U2OS::HA  TrCP y U2OS::HA FBXW7 en condiciones normales de crecimiento se prepararon extractos cromatínicos y se estudió mediante Western-blot la distribución de las proteínas indicadas. Como marcadores de pureza de las fracciones obtenidas, y también a modo de control de carga, utilizamos las proteínas Histona H1 para la fracción cromatínica, y -tubulina para la fracción soluble. El ensayo se realizó por triplicado. Este resultado fue confirmado utilizando la línea celular U2OS::HA  TrCP  F, que sobreexpresa la versión dominante negativa de HA  TrCP. Tras preparar de nuevo extractos cromatínicos, comprobamos que la sobreexpresión de HA  TrCP provocaba una acumulación de MRN en la cromatina que no se observaba al sobreexpresar HA  TrCP  F (Figura 42). En consecuencia, estos datos sugieren que TrCP interviene en la localización del complejo MRN en la cromatina. Resultados 127 indicadas. (B) Representación gráfica de los niveles de las proteínas mostradas en A. Utilizamos el test t de Student de muestras desapareadas para comparar los niveles presentes en ambas líneas. ***: p < 0.001. Las barras de error representan la desviación estándar (n=5). Por tanto, no sólo FBXW7 sino también p62 y LC3 están implicados en la degradación del complejo MRN. Quisimos averiguar entonces si podíamos detectar la interacción in vivo entre las proteínas del complejo MRN y las de la maquinaria autofágica. Cultivamos las células U2OS en condiciones control o tratadas con NH4Cl y preparamos extractos celulares NP40. Inmunoprecipitamos cada una de las proteínas del complejo y estudiamos la asociación a p62 y LC3 mediante Western-blot. Así, pusimos de manifiesto que MRE11, RAD50 y NBS1 se asociaban tanto a p62 como a LC3, y que esta asociación sólo se podía observar cuando se bloqueaba el flujo autofágico, probablemente porque de lo contrario MRN estaría siendo degradado por esta vía (Figura 49). Figura 49. Las proteínas del complejo MRN interaccionan con p62 y LC3. Los extractos obtenidos a partir de células U2OS con o sin bloqueo de la autofagia fueron utilizados para inmunoprecipitar individualmente MRE11 (A), RAD50 (B) y NBS1 (C). La asociación con mediadores del flujo autofágico fue analizada por Western-blot. Como control se usaron IgGs de ratón o conejo según el caso. Los ensayos se realizaron por triplicado. Ext: muestras de los extractos celulares empleados para las IPs. *: banda inespecífica. El complejo MRN se localiza esencialmente en el núcleo celular (Vissinga et al, 2009), mientras que p62 y LC3 se localizan tanto en el núcleo como en el citoplasma (Drake et al, 2010; Pankiv et al, 2010). Por tanto, para conocer donde ocurría esta Resultados 128 asociación, preparamos extractos citosólicos y nucleares de las células U2OS tratadas con NH4Cl, e inmunoprecipitamos el complejo MRN en ambas fracciones utilizando el anticuerpo anti-NBS1, elegido por su eficacia en este tipo de ensayo. Así, en la Figura 50 se observa que NBS1, que trae consigo a MRE11 y RAD50, co-inmunoprecipitó p62 y LC3 sólo en el extracto nuclear. Este resultado no elimina la posibilidad de que hubiera cierta interacción fuera del núcleo que no se detectara por cuestiones de sensibilidad de la técnica empleada, aunque en cualquier caso sería menos abundante que la que ocurre en el núcleo. Figura 50. La interacción entre el complejo MRN y p62/LC3 tiene lugar en el núcleo celular. La inmunoprecipitación de NBS1 se realizó tanto en los extractos citosólicos (S100) como en los extractos nucleares (EN) de células U2OS con bloqueo de la autofagia. Como control se usó IgG de conejo. El ensayo se realizó por triplicado. Con el fin de conocer la localización de las proteínas del complejo MRN, p62 y LC3 en la célula tanto en condiciones control como tras bloqueo de la vía de la autofagia/lisosoma, realizamos ensayos de microscopía de fluorescencia. Utilizamos células U2OS sin tratar y tratadas con concanamicina A y visualizamos las proteínas MRE11 y RAD50 junto con p62 y LC3, respectivamente. En condiciones control, RAD50 y MRE11 tienen una localización esencialmente nuclear. Por su parte, LC3 tendría una localización más difusa en toda la célula. En el caso de p62 también es así, aunque presenta además un punteado más discreto. Tras el tratamiento con concanamicina A, p62 y LC3 presentan una localización perinuclear, con un aspecto aparentemente vesicular. RAD50, especialmente, y MRE11 también incrementan el marcaje en esa zona (Figura 51). Resultados 129 Figura 51. El bloqueo de la vía de la autofagia/lisosoma fomenta la localización perinuclear de LC3/RAD50 y p62/MRE11. Ensayos de inmunofluorescencia en células U2OS tratadas o no con concanamicina A durante 8h. Las flechas amarillas señalan las áreas ampliadas (X2). Las barras de escala representan 10 M. (A) Localización de LC3 marcado en verde, RAD50 en rojo, la fusión de ambos y DAPI en azul. (B) Localización de p62 marcado en verde, MRE11 en rojo, la fusión de ambos y DAPI en azul. (C) Porcentajes de células que muestran RAD50 y LC3 en la periferia nuclear (P.N.) en condiciones control y tras el bloqueo de la autofagia. Se ha utilizado el test t de Student de muestras desapareadas para comparar ambos valores. ****: p < 0.0001. Las barras de error representan la desviación estándar (n=3). (D) Similar a C, pero mostrando los porcentajes de células que presentan MRE11 y p62 en la periferia nuclear (P.N.). Resultados 130 Dado que MRE11, RAD50 y NBS1 colocalizan en el núcleo celular (Figura 52), estimamos que los resultados obtenidos en el ensayo anterior con los dos primeros son extensibles a NBS1, que no ha podido ser estudiado respecto a p62 y LC3 por problemas de clonicidad de los anticuerpos empleados. Por tanto, la inhibición de las enzimas lisosomales favorece una localización perinuclear del complejo MRN y de p62 y LC3. Figura 52. NBS1 colocaliza con MRE11 y RAD50 en el núcleo celular. Ensayos de inmunofluorescencia en células U2OS en condiciones normales de crecimiento, mostrando la localización de NBS1 marcado en verde, MRE11 o RAD50 en rojo, la fusión de ambos, que presenta la colocalización en amarillo, y DAPI en azul. La barra de escala representa 10 M. Los ensayos se realizaron por duplicado. Como ya hemos mencionado con anterioridad, los sustratos que van a ser degradados por vía autofágica suelen ser previamente ubicuitilados para que puedan ser reconocidos por las proteínas adaptadoras (Lippai & Low, 2014). Por ello, quisimos averiguar si la interacción entre MRN y p62/LC3 estaba mediada por la ubicuitilación del complejo llevada a cabo por SCF(FBXW7). Con este fin, cultivamos las células U2OS, U2OS::HA FBXW7 y U2OS::HA FBXW7  F en condiciones de bloqueo del flujo autofágico, preparamos extractos nucleares e inmunoprecipitamos el complejo MRN utilizando el anticuerpo anti-NBS1. Como observamos en la Figura 53, en las células que sobreexpresan HA FBXW7 se muestra una mayor co-inmunoprecipitación de p62, y sobre todo de LC3, en comparación con la detectada en las células silvestres. Por el contrario, en las células que sobreexpresan HA FBXW7  F la co-inmunoprecipitación de ambos mediadores de la ruta autofágica es prácticamente nula. Por tanto, estos resultados muestran la implicación funcional de la ligasa de ubicuitina SCF(FBXW7) en la interacción del complejo MRN con p62 y LC3. Así, es muy probable que la poliubicuitilación del complejo inducida por SCF(FBXW7) provoque su asociación a p62/LC3 en el núcleo de la célula. Resultados 131 a Figura 53. La ubicuitilación de SCF(FBXW7) sobre el complejo MRN permite su interacción con p62/LC3. Los extractos nucleares de las líneas celulares indicadas, todas cultivadas con NH4Cl durante 24h, fueron utilizados para inmunoprecipitar NBS1. Las co-inmunoprecipitaciones de las proteínas de interés se analizaron mediante Western-blot. Como control se usó IgG de conejo. El ensayo se realizó por triplicado. Ext: muestra del extracto nuclear de la línea U2OS empleado para la IP. • SCF(FBXW7) induce la localización del complejo MRN en los lisosomas. Una vez que el complejo MRN se asocia a la maquinaria autofágica debe ser trasladado al lisosoma para su degradación. Por ello, quisimos averiguar si las proteínas del complejo podrían detectarse también en los lisosomas. Con este fin, y siguiendo el protocolo descrito en Materiales y Métodos, preparamos extractos enriquecidos en lisosomas a partir de cultivos celulares crecidos en condiciones normales y tras el bloqueo del flujo autofágico con NH4Cl. Este último tratamiento evitaría la degradación de las proteínas en el lisosoma, lo que nos permitiría detectarlas. Tras llevar a cabo pruebas en diferentes modelos celulares, llegamos a la conclusión de que las células HeLa eran el mejor modelo para este tipo de ensayos. Tratamos estas células durante 24 h con NH4Cl, y observamos que las 3 proteínas del complejo MRN se acumulaban en la fracción lisosomal, indicando que sin el inhibidor estarían siendo degradadas (Figura 54). Resultados 132 d Figura 54. El bloqueo de la vía autofágica permite detectar las proteínas del complejo MRN en la fracción lisosomal celular. Se obtuvieron extractos citosólicos, enriquecidos en lisosomas y nucleares a partir de células HeLa cultivadas en condiciones control y con bloqueo de la autofagia. El contenido de cada fracción subcelular se analizó por Western-blot, empleando un 5% de la fracción citosólica, un 30% de la lisosomal y un 2,5% de la nuclear. Como control de pureza del fraccionamiento, y a su vez control de carga, se usaron los siguientes marcadores: -tubulina para el citosol, LAMP-1 para la fracción lisosomal e Histona H1 para la nuclear. El ensayo se realizó por duplicado. *: banda inespecífica. A continuación, quisimos saber si la presencia del complejo MRN en los lisosomas era dependiente de SCF(FBXW7). Para ello, estudiamos el efecto de la sobreexpresión de HA FBXW7 sobre la localización lisosomal del complejo. Utilizamos las células HeLa y HeLa::HA FBXW7 cultivadas en condiciones normales de crecimiento y tratadas con NH4Cl. Como control de especificidad utilizamos la línea HeLa::HA  TrCP. Comparando el contenido de la fracción lisosomal obtenida en cada línea pudimos comprobar que la sobreexpresión de HA FBXW7 provocaba una mayor presencia en los lisosomas de las proteínas del complejo MRN, respecto a lo detectado en la línea silvestre. Además, este resultado fue específico de esta proteína F-box, ya que la sobreexpresión de HA  TrCP no tuvo ese efecto (Figura 55A). Resultados 133 Figura 55. La sobreexpresión de HA FBXW7 potencia la presencia de los componentes del complejo MRN en la fracción lisosomal. (A) Los extractos enriquecidos en lisosomas obtenidos a partir de los cultivos celulares indicados se analizaron por Western-blot, empleando el 30% de las fracciones. Los niveles cuantitativos de las proteínas del complejo MRN se determinaron en relación al control de carga (LAMP-1). (B) Similar al ensayo mostrado en A, pero incorporando en este caso la línea HeLa::HA FBXW7  F. Los ensayos se realizaron por duplicado. *: banda inespecífica. Para complementar el experimento anterior, repetimos el mismo tipo de ensayo utilizando además la línea HeLa::HA FBXW7  F con el fin de revertir el efecto de la sobreexpresión de HA FBXW7 sobre la localización lisosomal del complejo. Como se observa en la Figura 55B, FBXW7 F provocó una menor acumulación en los lisosomas de las 3 proteínas del complejo MRN en comparación con la acumulación observada con FBXW7. Por último, quisimos estudiar la presencia del complejo MRN en los lisosomas in vivo en ensayos de inmunofluorescencia. Cultivamos las células U2OS y U2OS::HA FBXW7  F en presencia y ausencia de concanamicina A y analizamos la distribución de NBS1, como representante del complejo MRN, junto con la de LAMP-1, como marcador de las membranas lisosomales (Eskelinen, 2006; Arhzaouy et al, 2019). En la Figura 56 podemos observar que el tratamiento con concanamicina A provoca una acumulación de NBS1 en las vesículas lisosomales marcadas con anti-LAMP-1 de la línea U2OS. Sin embargo, este doble marcaje no se observa en la línea que sobreexpresa HA FBXW7  F. Estos resultados indican que la actividad de SCF(FBXW7) sobre el complejo MRN propicia su localización en los lisosomas. Resultados 134 Figura 56. La localización de NBS1 en los lisosomas que se detecta al bloquear la vía autofágica en células silvestres no sucede con la sobreexpresión de HA FBXW7  F. Ensayos de inmunofluorescencia en células U2OS y U2OS::HA FBXW7  F tratadas o no con concanamicina A durante 8h. Las flechas amarillas señalan las áreas ampliadas (X2). Las barras de escala representan 10 M. (A) Localización en la línea U2OS de NBS1 marcado en verde, LAMP-1 en rojo, la fusión de ambos y DAPI en azul. (B) Como en A, pero en la línea U2OS::HA FBXW7  F. (C) Porcentajes de células que muestran NBS1 en las vesículas marcadas con LAMP-1 para cada línea celular tras el tratamiento con concanamicina A. Se ha utilizado el test t de Student de muestras desapareadas para comparar ambos valores. ****: p < 0.0001. Las barras de error representan la desviación estándar (n=3). Resultados 135 Realizados estos ensayos podemos concluir que las proteínas del complejo MRN, tras interaccionar con p62/LC3 en el núcleo, se localizan en los lisosomas para su degradación en este compartimento. Además, SCF(FBXW7) es el responsable de la degradación autofágica del complejo MRN al posibilitar la asociación de este con p62/LC3 lo cual, siguiendo la dinámica de la vía de la autofagia, asegura en última instancia su degradación en los lisosomas. • La apoptosis provocada por agentes genotóxicos estimula la degradación autofágica del complejo MRN mediada por SCF(FBXW7). Tras caracterizar la implicación de la vía autofágica en el recambio basal del complejo MRN, quisimos averiguar si esta degradación podría estimularse en otras condiciones. La autofagia es un proceso de degradación selectiva de sustratos que se potencia principalmente por falta de nutrientes, pero también por otras situaciones de estrés celular tales como el daño en el ADN, la hipoxia, el estrés del retículo o la infección por patógenos, entre otros (Kroemer et al, 2010). Dada la importancia de la escasez de nutrientes en la activación de la vía autofágica, decidimos empezar nuestro estudio comprobando si esta situación podría estimular la degradación de MRN. Para ello, sometimos las células HeLa a deprivación de suero cultivándolas 3 días en medio al 0,15% de suero fetal bovino, utilizando como control las células cultivadas en medio completo (10% de suero). Analizando la caída en el nivel de p62 y el incremento de LC3-II, pudimos comprobar que la deprivación de suero produjo una eficaz activación del flujo autofágico. No obstante, esto no trajo consigo una mayor degradación de las proteínas del complejo MRN (Figura 57). Figura 57. La deprivación de nutrientes no produce una caída en los niveles del complejo MRN, pese a la activación de la autofagia. Los extractos totales de las células HeLa cultivadas con dos porcentajes de suero fetal bovino (SFB) diferentes se analizaron por Westernblot. Los niveles cuantitativos de las proteínas del complejo MRN se determinaron en relación al control de carga (-tubulina). El ensayo se realizó por duplicado. Resultados 136 Descartada la deprivación de suero, continuamos con la búsqueda de estímulos capaces de incrementar la degradación autofágica de MRN. Decidimos centrarnos en el estudio del daño en el ADN, dado el papel de dicho complejo en la respuesta al estrés genotóxico. Anteriormente, señalamos que el tratamiento con dosis inferiores a 10 M de cisplatino no provocaba cambios sustanciales en los niveles de MRN. Por tanto, realizamos una cinética de dosis de cisplatino para comprobar la evolución del complejo a dosis superiores a las utilizadas previamente. Como se observa en la Figura 58A, las dosis más altas de cisplatino provocan una disminución considerable en los niveles de MRE11, RAD50 y NBS1, coincidiendo con una activación de la autofagia medida por la degradación de p62 y la aparición de LC3-II. También vemos que estas dosis elevadas inducen apoptosis, detectada por la aparición de la proteína PARP fragmentada, la caspasa 3 activa y la acumulación de -H2AX. Para confirmar la muerte celular, analizamos por citometría de flujo células tratadas en estas mismas condiciones con el fin de cuantificar el porcentaje de células positivas para anexina V. Comprobamos que las dosis de cisplatino que inducen la degradación del complejo MRN presentan los mayores porcentajes de células apoptóticas, positivas para anexina V (Figura 58B). 239 Supplementary Figure S4. Comparison of the percentage of U2OS versus U2OS::HA FBXW7  F cells treated with Con A displaying NBS1 in lysosomes. A, B, C. Ponceau staining from filters used in figures 4A, B, C. Images show the similar load level of the lanes of each fraction. D. Quantification of Con A-treated U2OS and U2OS::HA FBXW7  F cells showing NBS1 in lysosome visualized with anti-LAMP1. Error bars represent the SD (n = 3). ****p < 0.0001 (Student’s t test). 240 Supplementary Figure S5. Doxorubicin-induced cell death increases the degradation of the MRN complex. A. U2OS cells were incubated with different concentrations of doxorubicin (Dx) for 24 h. Whole cell extracts were analyzed by immunoblotting. Western blots are representative of two replicates. B. Percentage of annexin V positive U2OS cells treated as described before were detected by flow cytometry. Error bars represent the SD (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01 (Student’s t test). 241 Supplementary Figure S6. Expression level of MRN complex proteins in U2OS Flp In T-REx HA FBXW7  F. Whole cell extracts from U2OS Flp In T-REx HA FBXW7  F treated or not with doxycycline (DOX, 2 g/ml) for 24 h were analyzed by Western-blotting. 242 SUPPLEMENTARY TABLES Supplementary Table S1. Densitometric analysis of replicate immunoblots similar to that shown in Supplementary Figure S1. FIG S1C Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Control 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 1h MG132 0.87112 0.93232 0.90172 0.04327 2h MG132 0.76978 0.81255 0.79117 0.03024 4h MG132 0.79488 0.84197 0.81843 0.03330 8h MG132 0.87854 0.91098 0.89476 0.02294 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Control 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 1h MG132 1.05455 1.12476 1.08966 0.04965 2h MG132 1.14955 1.06564 1.10760 0.05933 4h MG132 0.97023 0.89655 0.93339 0.05210 8h MG132 0.81993 0.78564 0.80279 0.02425 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Control 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 1h MG132 1.08055 1.09776 1.08916 0.01217 2h MG132 1.12121 1.20966 1.16544 0.06254 4h MG132 0.77033 0.81843 0.79438 0.03401 8h MG132 0.89476 0.91878 0.90677 0.01698 RAD50 NBS1 MRE11 243 Supplementary Table S2. Densitometric analysis of replicate immunoblots similar to that shown in Figure 4. FIG 4B Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD HeLa + NH4Cl 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 HeLa::HA  TrCP + NH4Cl 0.79133 0.92455 0.85794 0.09420 HeLa::HA FBXW7 + NH4Cl 1.71881 1.60121 1.66001 0.08316 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD HeLa + NH4Cl 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 HeLa::HA  TrCP + NH4Cl 0.89021 0.78388 0.83705 0.07519 HeLa::HA FBXW7 + NH4Cl 1.89176 2.04655 1.96916 0.10945 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD HeLa + NH4Cl 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 HeLa::HA  TrCP + NH4Cl 1.10912 0.95077 1.02995 0.11197 HeLa::HA FBXW7 + NH4Cl 2.76812 3.04955 2.90884 0.19900 FIG 4C Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD HeLa + NH4Cl 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 HeLa::HA FBXW7 + NH4Cl 3.21176 2.85532 3.03354 0.25204 HeLa::HA FBXW7  F+ NH4Cl 1.58055 1.21832 1.39944 0.25614 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD HeLa + NH4Cl 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 HeLa::HA FBXW7 + NH4Cl 3.47777 3.19465 3.33621 0.20020 HeLa::HA FBXW7  F+ NH4Cl 1.80811 1.68475 1.74643 0.08723 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD HeLa + NH4Cl 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 HeLa::HA FBXW7 + NH4Cl 2.06634 1.80855 1.93745 0.18229 HeLa::HA FBXW7  F+ NH4Cl 0.38844 0.75187 0.57016 0.25698 RAD50 NBS1 MRE11 RAD50 NBS1 MRE11 244 Supplementary Table S3. Densitometric analysis of replicate immunoblots similar to that shown in Figure 5. FIG 5A Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 10% FCS 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 0.15% FCS 1.45222 1.59178 1.52200 0.09868 0.15% FCS + ConA 1.38088 1.54465 1.46277 0.11580 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 10% FCS 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 0.15% FCS 1.32433 1.38854 1.35644 0.04540 0.15% FCS + ConA 1.20882 1.31874 1.26378 0.07773 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 10% FCS 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 0.15% FCS 1.35676 1.45454 1.40565 0.06914 0.15% FCS + ConA 1.44098 1.60567 1.52333 0.11645 RAD50 NBS1 MRE11 FIG 5B Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 0 M CDDP 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 10 M CDDP 1.07087 1.25342 1.16215 0.12908 30 M CDDP 0.67865 0.79122 0.73494 0.07960 50 M CDDP 0.74455 0.65065 0.69760 0.06640 70 M CDDP 0.34376 0.28865 0.31621 0.03897 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 0 M CDDP 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 10 M CDDP 1.64087 1.50878 1.57483 0.09340 30 M CDDP 1.48345 1.57186 1.52766 0.06252 50 M CDDP 0.57066 0.63487 0.60277 0.04540 70 M CDDP 0.12954 0.20176 0.16565 0.05107 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 0 M CDDP 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 10 M CDDP 1.17477 1.03954 1.10716 0.09562 30 M CDDP 1.14843 1.19129 1.16986 0.03031 50 M CDDP 0.37745 0.43491 0.40618 0.04063 70 M CDDP 0.15533 0.24722 0.20128 0.06498 RAD50 NBS1 MRE11 245 FIG 5D Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Unt 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 CDDP 0.49097 0.60566 0.54832 0.08110 CDDP + NH4Cl 0.90122 0.96466 0.93294 0.04486 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Unt 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 CDDP 0.42276 0.54512 0.48394 0.08652 CDDP + NH4Cl 0.78843 0.87012 0.82928 0.05776 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Unt 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 CDDP 0.38043 0.48843 0.43443 0.07637 CDDP + NH4Cl 1.08922 0.93456 1.01189 0.10936 RAD50 NBS1 MRE11 246 FIG 5E Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Unt 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 CDDP + siRNA EGFP 0.18045 0.19188 0.18617 0.00808 CDDP + siRNA FBXW7 1.19177 1.27754 1.23466 0.06065 CDDP + siRNA EGFP + ConA 1.18045 1.32132 1.25089 0.09961 CDDP + siRNA FBXW7 + ConA 1.02754 1.05531 1.04143 0.01964 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Unt 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 CDDP + siRNA EGFP 0.52766 0.63552 0.58159 0.07627 CDDP + siRNA FBXW7 1.22199 1.34365 1.28282 0.08603 CDDP + siRNA EGFP + ConA 1.13176 1.18099 1.15638 0.03481 CDDP + siRNA FBXW7 + ConA 1.15154 1.00961 1.08058 0.10036 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Unt 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 CDDP + siRNA EGFP 0.24454 0.18376 0.21415 0.04298 CDDP + siRNA FBXW7 0.74772 0.61455 0.68114 0.09417 CDDP + siRNA EGFP + ConA 0.44876 0.48832 0.46854 0.02797 CDDP + siRNA FBXW7 + ConA 0.64452 0.62787 0.63620 0.01177 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD Unt 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 CDDP + siRNA EGFP 2.90232 3.40956 3.15594 0.35867 CDDP + siRNA FBXW7 5.24456 6.32786 5.78621 0.76601 CDDP + siRNA EGFP + ConA 2.51877 3.14032 2.82955 0.43950 CDDP + siRNA FBXW7 + ConA 5.23077 6.56176 5.89627 0.94115 Cyclin E RAD50 NBS1 MRE11 247 Supplementary Table S4. Densitometric analysis of replicate immunoblots similar to that shown in Supplementary Figure S5. FIG S5A Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 0 M Dx 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 0.25 M Dx 0.98232 1.07076 1.02654 0.06254 0.5 M Dx 0.92112 0.89098 0.90605 0.02131 1 M Dx 0.94987 1.08999 1.01993 0.09908 2.5 M Dx 0.42876 0.52455 0.47666 0.06773 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 0 M Dx 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 0.25 M Dx 0.94434 1.02955 0.98695 0.06025 0.5 M Dx 0.92111 0.98954 0.95533 0.04839 1 M Dx 0.53453 0.46886 0.50170 0.04644 2.5 M Dx 0.32966 0.29292 0.31129 0.02598 Replicate 1 Replicate 2 Mean value SD 0 M Dx 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 0.25 M Dx 0.78821 0.92965 0.85893 0.10001 0.5 M Dx 0.52176 0.69987 0.61082 0.12594 1 M Dx 0.21943 0.30766 0.26355 0.06239 2.5 M Dx 0.23887 0.28551 0.26219 0.03298 RAD50 NBS1 MRE11