Sistemas autoemulsionables sólidos de clonazepam como alternativa para mejorar sus propiedades de solubilidad y biodisponibilidad

SISTEMAS AUTOEMULSIONABLES SÓLIDOS DE CLONAZEPAM COMO ALTERNATIVA PARA MEJORAR SUS PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD Y BIODISPONIBILIDAD Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Enrique Pérez Terrón Curso 2023/2024 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Grado en Farmacia Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica TRABAJO FIN DE GRADO SISTEMAS AUTOEMULSIONABLES SÓLIDOS DE CLONAZEPAM COMO ALTERNATIVA PARA MEJORAR SUS PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD Y BIODISPONIBILIDAD ALUMNO: Enrique Pérez Terrón TUTORA: Prof.ª Dra. María Luisa González Rodríguez TIPO DE PROYECTO: Experimental PRESENTACIÓN: Facultad de Farmacia FECHA: junio de 2024 AGRADECIMIENTOS Este proyecto de investigación no podría haberse llevado a cabo sin la dedicación y el interés constante de mi tutora, la doctora Dª. María Luisa González Rodríguez, a quien agradezco toda la dedicación hacia mi persona, y el ímpetu y las ganas de enseñar constantemente, no solo una amplia variedad de conocimientos acerca de la Tecnología Farmacéutica, sino también unos valores fundamentales que deberíamos tener presentes en nuestras vidas. Me gustaría agradecer también a Ana Fernández Romero su participación en el trabajo de investigación, su paciencia y las ganas de enseñar a los demás han sido claves para poder alcanzar los objetivos de este proyecto. Y, por supuesto, mi familia, mi novia y amigos, gracias por el apoyo y por cada consejo que me han brindado durante todo este proceso. Gracias a todos ellos, su ayuda y la motivación que me han transmitido ha sido fundamental para lograr el objetivo que marcamos al inicio del curso. A todos ellos, mi agradecimiento y admiración por el trabajo realizado y el tiempo compartido conmigo. Este trabajo forma parte del proyecto de Beca de Colaboración concedida en su convocatoria para el curso 2023/2024 por el Ministerio de Educación y Formación Profesional, con número de solicitud 23CO1/007974. 1 RESUMEN Clonazepam, por su efecto ansiolítico, constituye uno de los fármacos más utilizados como alternativa terapéutica en trastornos de ansiedad. Con el objetivo de ofrecer estrategias que mejoren su solubilidad y biodisponibilidad, se planteó la formulación de sistemas autoemulsionables (SEDDS), y estos, a su vez, adsorberlos a unos portadores sólidos para paliar los posibles inconvenientes que pudiera presentar este tipo de formulación líquida, obteniendo de esta forma, un sistema autoemulsionable sólido (SEDDS-S). Para optimizar la formulación del SEDDS-S, se utilizó la herramienta del diseño experimental (matriz 27-run Box-Benhken) para estudiar la influencia de cuatro variables a tres niveles: la concentración de clonazepam, la proporción lactosa/ Aerosil® 300, el porcentaje de SEDDS líquido añadido y el método de adición. Se caracterizó la formulación optimizada en términos de principio activo disuelto, uniformidad de contenido, capacidad de autoemulsionar en medio ácido y capacidad de liberación del fármaco. El análisis estadístico de los resultados de la matriz estableció que se debe utilizar un 28 % de SEDDS (compuesto por aceite de lavanda y caléndula, Tween® 80, Labrafil® M2130 y Aerosil® 300) una concentración de clonazepam del 0.21 %, una ratio lactosa/ Aerosil® 99/1 % y un método de adición de mezcla a intervalos. El estudio de solubilidad muestra una mejoría de este parámetro en el SEDDS-S con relación al fármaco solo. El ensayo de uniformidad de contenido mostró que el sistema estaba dentro de las especificaciones establecidas; además, la capacidad de autoemulsionar del SEDDS-S facilitaba la disolución del fármaco de la propia emulsión; sin embargo, la liberación de clonazepam a partir de su forma farmacéutica tiene lugar de forma prolongada en el tiempo evaluado. PALABRAS CLAVE: Clonazepam, ansiedad, sistema autoemulsionable, liberación, solubilidad. 2 ÍNDICE INDICE DE FIGURAS Y TABLAS ............................................................................................................ 3 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................... 5 1.1. ANSIEDAD ...................................................................................................................................... 5 1.2. CLONAZEPAM ............................................................................................................................... 6 1.3. ACEITE ESENCIAL DE LAVANDA .............................................................................................. 7 1.4. SISTEMAS AUTOEMULSIONABLES .......................................................................................... 8 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 9 3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................. 9 3.1. MATERIALES ................................................................................................................................. 9 3.2. EQUIPOS ....................................................................................................................................... 10 3.3. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO DE CLONAZEPAM POR HPLC ................. 10 3.4. SELECCIÓN DE LA MEZCLA DE ACEITES ............................................................................. 11 3.5. SELECCIÓN DE LA MEZCLA SURFACTANTE-COSURFACTANTE ..................................... 11 3.6. ELABORACIÓN DEL SEDDS LÍQUIDO .................................................................................... 12 3.7 CARACTERIZACIÓN DE LOS SEDDS ....................................................................................... 13 3.8. ELABORACIÓN DE LOS SEDDS-S ............................................................................................ 14 3.8.1. Selección del sólido adsorbente .............................................................................................. 14 3.8.2. Optimización del proceso de elaboración de SEDDS-S ......................................................... 15 3.9. CARACTERIZACIÓN DE LOS SEDDS-S ................................................................................... 17 3.9.1. Solubilidad de clonazepam en medios gástrico, intestinal y agua ........................................... 17 3.9.2. Uniformidad de contenido ...................................................................................................... 18 3.9.3. Ángulo de reposo .................................................................................................................... 18 3.9.4. Rendimiento ............................................................................................................................ 18 3.9.5. Estudios de autoemulsión en medio gástrico .......................................................................... 18 3.10 ESTUDIOS DE DISOLUCIÓN IN VITRO ................................................................................... 19 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................. 20 4.1 CUANTIFICACIÓN DE CLONAZEPAM POR HPLC ................................................................. 20 4.2 ELABORACIÓN DEL SEDDS LÍQUIDO DEFINITIVO Y SELECCIÓN DEL PORTADOR SÓLIDO ................................................................................................................................................ 20 4.3 DISEÑO DE EXPERIMENTOS ..................................................................................................... 22 4.3.1. Análisis de las medias marginales (ANOM) ........................................................................... 24 4.3.2. Análisis de la varianza (ANOVA) ........................................................................................... 26 4.3.3. Diagramas de Pareto ............................................................................................................... 28 4.3.4. Superficie de respuesta y análisis de regresión ....................................................................... 29 4.4. ESTUDIO DE SOLUBILIDAD DE CLONAZEPAM EN AGUA, MEDIO ÁCIDO Y MEDIO INTESTINAL ........................................................................................................................................ 31 4.5. OPTIMIZACIÓN DE LA FORMULACIÓN FINAL Y ELABORACIÓN DE LA FORMA FARMACEÚTICA DEFINITIVA ......................................................................................................... 32 5. CONCLUSIONES .................................................................................................................................. 34 6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................... 35 3 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS • Figura 1. Proceso general de elaboración de un sistema autoemulsionable sólido (SEDDS-S). Modificado del artículo de Singh et al. 2020 • Figura 2. Recta de calibrado de clonazepam. • Figura 3. Gráficos de análisis de las medias (ANOM) correspondientes al ángulo de reposo con respecto a la concentración de fármaco, el porcentaje de SEDDS, la ratio lactosa/Aerosil® y el método de adición. • Figura 4. Gráficos de análisis de las medias (ANOM) correspondientes a la uniformidad de contenido con respecto a la concentración de fármaco, el porcentaje de SEDDS, la ratio lactosa/Aerosil® y el método de adición. • Figura 5. Gráficos de análisis de las medias (ANOM) correspondientes al rendimiento con respecto a la concentración de fármaco, el porcentaje de SEDDS, la ratio lactosa/Aerosil® y el método de adición. • Figura 6. Análisis de la varianza (ANOVA) de los experimentos realizados, según el ángulo de reposo. • Figura 7. Análisis de la varianza (ANOVA) de los experimentos realizados, según la uniformidad de contenido. • Figura 8. Análisis de la varianza (ANOVA) de los experimentos realizados, según el rendimiento. • Figura 9. Diagramas de Pareto que recogen los efectos I-hat/2 según el ángulo de reposo (gráfica A), la uniformidad de contenido (gráfica B) y el rendimiento (gráfica C). Concentración de fármaco (A), ratio lactosa/Aerosil® (B), porcentaje de SEDDS clásico (C), y método de adición (D). • Figura 10. Superficies de respuesta de las variables: Ángulo de reposo (gráfica A), uniformidad de contenido (gráfica B) y rendimiento (gráfica C). • Figura 11. Acondicionamiento primario del sistema autoemulsionable sólido de clonazepam (SEDDS-S) en cápsulas duras. 4 • Tabla 1. Resumen de la terapéutica farmacológica actual frente a la ansiedad, recogida en la guía de práctica clínica para el manejo de pacientes con trastornos de ansiedad en atención primaria. (España. Ministerio de Sanidad y Consumo and Agencia Laín Entralgo (Madrid). Unidad de Evaluación de Tecnologías Sanitarias. 2008) • Tabla 2. Fórmulas utilizadas para la elaboración del SEDDS clásico. • Tabla 3. Factores seleccionados en el estudio y sus niveles. • Tabla 4. Ensayos correspondientes a la matriz 27-run Box-Benhken. Mez. Con.: mezclado continuo; Man: manual. Mez. Int.: mezclado a intervalos. • Tabla 5. Formulación del sistema autoemulsionable líquido (SEDDS). • Tabla 6. Resultados obtenidos para las diferentes variables de respuesta analizadas: ángulo de reposo, uniformidad de contenido y rendimiento. • Tabla 7. Solubilidad del clonazepam incorporado en diversos sistemas y en diferentes medios: agua, medio ácido e intestinal. • Tabla 8. Ensayo correspondiente a la uniformidad de masa. Cap: cápsula; P: peso; DE: desviación estándar. 5 1. INTRODUCCIÓN 1.1. ANSIEDAD La ansiedad constituye hoy día una de las patologías de mayor prevalencia mundial en cuanto a trastornos del Sistema Nervioso Central (SNC) se refiere. (Gloria y Loayza, 2017) La activación del Sistema Nervioso Simpático (SNS) es la respuesta fisiológica más prominente que genera ansiedad, generando síntomas característicos, como temblores, sofocos, escalofríos, sudores, respiración entrecortada, palpitaciones, presión en el pecho, etc. Según estudios, la ansiedad es la sexta causa principal de discapacidad en el mundo ya que, incluso los síntomas leves de esta pueden causar sensaciones desagradables en el sujeto. Los afectados por dicha patología presentan una menor calidad de vida y un peor funcionamiento psicosocial, y debido a que solo el 60 % de los pacientes mejora, es indispensable buscar alternativas terapéuticas que faciliten el tratamiento de este problema de tan alta prevalencia en nuestra sociedad. (De Costa y Manfro, 2019) El abordaje de esta patología incluye alternativas que van desde medidas farmacológicas hasta las no farmacológicas, entre las que destacan: disminuir el consumo de bebidas alcohólicas y con cafeína, realizar ejercicio aeróbico regular, apoyar e incluir a los pacientes en programas de apoyo psicosocial, entre otras alternativas. (Garrido, 2008) Dentro del tratamiento farmacológico, cabe destacar que este variará según las características y el desarrollo de la patología según la persona. Dentro de las alternativas más usadas destacan algunos antidepresivos como amitriptilina, citalopram, fluoxetina o sertralina, algunas benzodiacepinas y algunos ansiolíticos como lorazepam, alprazolam, diazepam o en nuestro caso, clonazepam. (Also et al., 2024) En la tabla 1 se muestra un resumen de los tratamientos mencionados, estableciendo diferentes grados de recomendación, desde el más recomendable, continuando con otras alternativas terapéuticas, según criterios específicos ya estipulados, como se menciona en la guía clínica para manejar pacientes con trastornos de ansiedad en atención primaria. (Unidad de Evaluación de Tecnologías Sanitarias, 2008) 6 Tabla 1. Resumen de la terapéutica farmacológica actual frente a la ansiedad, recogida en la guía de práctica clínica para el manejo de pacientes con trastornos de ansiedad en atención primaria. (España. Ministerio de Sanidad y Consumo y Agencia Laín Entralgo (Madrid). Unidad de Evalución de Tecnologías Sanitarias. 2008) 1.2. CLONAZEPAM Clonazepam es un fármaco perteneciente al grupo de las benzodiacepinas, que actúa a nivel del SNC. Este se une a unas subunidades específicas del receptor GABA, que interviene en la inhibición rápida del SNC. Ejerce su acción ansiolítica 13 Tabla 2. Fórmulas utilizadas para la elaboración del SEDDS clásico. Aceite lavanda Aceite caléndula Gelucire® 50/13 Labrafil® M2130 Aerosil® 300 Tween® 80 F1 17 % 0 % 41.5 % 38.5 % 3 % - F2 17 % 8 % 37.5 % 34.5 % 3 % - F3 17 % 18 % 32.5 % 29.5 % 3 % - F4 17 % 28 % 27.5 % 24.5 % 3 % - F5 17 % 38 % 22.5 % 19.5 % 3 % 0 % F6 17 % 38 % 17.5 % 14.5 % 3 % 10 % F7 17 % 28 % 0 % 24.5 % 3 % 27.5 % 3.7 CARACTERIZACIÓN DE LOS SEDDS Una vez elaboradas las formulaciones, se seleccionó una para continuar los estudios de elaboración del SEDDS sólido. Para ello, se caracterizaron los sistemas en términos de tamaños de gotícula y el índice de polidispersión obtenidos tras contactar con un medio acuoso. Se busca que la autoemulsión que se forme presente el menor tamaño de gotícula posible con el fin de aumentar la estabilidad de la emulsión formada. (Inugala et al., 2015) Para realizar estas mediciones, se simuló el comportamiento de cada una en medio gástrico. Para ello, se preparó 1 L de medio a partir de 7 mL de HCl, 3.2 g de pepsina y 2 g de NaCl, según estudios previos de simulación en este tipo de medio gástrico, en formulaciones autoemulsionables de aceite de oliva virgen extra de nuestro grupo de investigación, ya mencionado anteriormente. (Fernández Romero et al., 2023) A continuación, se añadió 1 g de cada fórmula a 100 mL de medio, cuyas condiciones eran 37 ºC y 500 rpm, durante 2 horas. Para medir el tamaño de gotícula que adquiere la emulsión formada, y el índice de polidispersión (PDI), que representa la variación de los tamaños de las partículas medidas, se emplea un equipo Z-sizer. Es interesante obtener un PDI pequeño ya que, representa una población más homogénea. Para ello, fue suficiente con tomar una alícuota de 1 mL, sin diluir, una vez finalizado el tiempo de 2 horas y lo añadimos en una cubeta para su medición. 14 3.8. ELABORACIÓN DE LOS SEDDS-S 3.8.1. Selección del sólido adsorbente Tras seleccionar la formulación de mayor interés para el proyecto, hubo que elegir la técnica más adecuada para pasar del SEDDS convencional a uno sólido. Entre las técnicas más usadas y eficaces para conseguirlo, destaca la liofilización, el spray-drying, la extrusión por fusión en caliente o la adsorción a portadores sólidos. (Jannin et al., 2008). De manera general, se muestra en la Figura 1 el proceso de elaboración de los SEDDS-S utilizando adsorción en soportes sólidos, que fue la que se seleccionó. (Singh et al., 2020) Figura 1. Proceso general de elaboración de un sistema autoemulsionable sólido (SEDDS-S). Modificado del artículo de Singh et al. (2020) En el proceso de adsorción a portadores sólidos es fundamental la elección del sólido o sólidos que actuarán como adsorbentes del SEDDS. Para ello, previamente es necesario seleccionar los materiales con los que se va a trabajar, y mediante el ensayo del ángulo de reposo, realizado según las condiciones establecidas en la Real Farmacopea Española, se elegirá la mezcla de sólidos más adecuada. Esta etapa resulta de gran importancia ya que la elección de dichos portadores puede influir en la formulación final del SEDDS-S. (Chavan et al., 2015) El ensayo del ángulo de reposo es un parámetro indicativo de la fluidez de un sólido. Consiste en determinar el ángulo que forma una determinada cantidad de 15 sólido al caer por el orificio de un embudo. Para su realización, colocamos un embudo de cristal a una altura de 4 cm, y debajo un papel milimétrico; a continuación, pesaremos 5 g de muestra a analizar y lo dejaremos caer. Con la ayuda del papel milimétrico mediremos el diámetro de la base del cono formado y la altura de este, y mediante la aplicación de una fórmula, obtendremos el ángulo formado, quedándonos con aquellas muestras que presenten un menor ángulo de reposo. En dos ocasiones se hizo este mismo ensayo, primero, para hacer un cribado de sólidos y así quedarnos con aquellos que presenten mejor fluidez; en esta primera vez, se seleccionaron PVP, lactosa, celulosa microcristalina y sílice coloidal (Aerosil® 300). Y segundo, mezclando aquellos sólidos seleccionados junto con una proporción de la formulación de SEDDS establecida, para poder así seleccionar la combinación de adsorbentes más adecuada según el ángulo de reposo que presenten. 3.8.2. Optimización del proceso de elaboración de SEDDS-S La elaboración de SEDDS-S, a los que poder incorporar fármacos como el clonazepam, requiere del manejo y optimización de muchos factores a considerar en el proceso. En este estudio, se aplicó el diseño de experimentos (DoE), una herramienta con poder estadístico para poder optimizar nuestra formulación, lo que nos permitió variar diversos factores de forma simultánea para poder identificar de qué manera influía cada factor, reduciendo de esta manera el número de ensayos experimentales a realizar y el tiempo en su realización, con el objetivo de facilitar la optimización de la formulación final, con una base estadística. (González‐Rodríguez et al., 2012) En primer lugar, se llevó a cabo un estudio de cribado de distintos factores sobre diferentes respuestas. En nuestro caso, las variables seleccionadas fueron: concentración de clonazepam (0.1 %, 0.21 % y 0.31% del total de la formulación), la ratio lactosa/Aerosil® (99.99/0.1 % correspondiente a la ratio A, 99.95/0.5 % correspondiente a la ratio B y 99/1 % correspondiente con la ratio C. Es importante mencionar que estos porcentajes son los referidos a la cantidad restante de formulación una vez añadido el SEDDS líquido), el porcentaje de SEDDS líquido añadido y el método de adición, a tres niveles cada uno (Tabla 3). 16 De todos los diseños posibles, se seleccionó la matriz llamada 27-run Box- Benhken, con el fin de conocer aquellos factores que influían significativamente en las respuestas seleccionadas (Tabla 4). Tabla 3. Factores seleccionados en el estudio y sus niveles. Factores Nivel -1 (inferior) Nivel 0 (central) Nivel +1 (superior) Conc. clonazepam 0.1 0.21 0.31 Ratio L/A A B C SEDDS % 8 18 28 Met. Adic. Mez. Con. Man. Mez. Int. Tabla 4. Ensayos correspondientes a la matriz 27-run Box-Benhken. Mez. Con.: mezclado continuo; Man: manual. Mez. Int.: mezclado a intervalos. Muestra Conc.Fc o. Ratio L/A SEDDS % Met. Adic. 1 0.1 A 18 Mez. Con. 2 0.1 C 18 Mez. Con. 3 0.31 A 18 Mez. Con. 4 0.31 C 18 Mez. Con. 5 0.21 B 8 Man. 6 0.21 B 8 Mez. Int. 7 0.21 B 28 Man. 8 0.21 B 28 Mez. Int. 9 0.21 B 18 Mez. Con. 10 0.1 B 18 Man. 11 0.1 B 18 Mez. Int. 12 0.31 B 18 Man. 13 0.31 B 18 Mez. Int. 14 0.21 A 8 Mez. Con. 15 0.21 A 28 Mez. Con. 16 0.21 C 8 Mez. Con. 17 0.21 C 28 Mez. Con. 18 0.21 B 18 Mez. Con. 19 0.1 B 8 Mez. Con. 20 0.1 B 28 Mez. Con. 21 0.31 B 8 Mez. Con. 22 0.31 B 28 Mez. Con. 23 0.21 A 18 Man. 24 0.21 A 18 Mez. Int. 25 0.21 C 18 Man. 26 0.21 C 18 Mez. Int. 27 0.21 B 18 Mez. Con. 17 Las respuestas evaluadas fueron: el ángulo de reposo, la uniformidad de contenido y el rendimiento, las cuales serán descritas en el siguiente apartado. Tras la realización de los experimentos, los datos fueron tratados realizando análisis de las medias marginales (ANOM) y de la varianza (ANOVA), principalmente. También se elaboraron diagramas de Pareto con el fin de analizar de manera más visual las variables estudiadas para cada respuesta, en un diagrama de barras, de mayor a menor tamaño cada una, desde la que más significación presenta para cada respuesta, hasta la que menos. Y superficies de respuesta, que informan sobre la significación de cada parámetro estudiado a las respuestas obtenidas; así, la representación obtenida, con una gama de colores, permite representar las condiciones óptimas para nuestra formulación. 3.9. CARACTERIZACIÓN DE LOS SEDDS-S 3.9.1. Solubilidad de clonazepam en medios gástrico, intestinal y agua Con el objetivo de analizar si el SEDDS-S propuesto mejora la solubilidad del clonazepam, se realizó un ensayo en el que se comparará la solubilidad del principio activo solo (en tres medios diferentes: agua, medio ácido y medio intestinal), con la solubilidad del mismo fármaco, pero incorporado a nuestro SEDDS, tanto el clásico, como tras su adsorción a los portadores sólidos, en los mismos tres medios mencionados. Para ello, se procedió en primer lugar a la elaboración de los medios gástrico e intestinal. El medio gástrico es una solución de ácido clorhídrico 0.1 M, mientras que el segundo es una solución de fosfato de sodio dodecahidrato 0.2 M. A continuación, se pesó 1 mg de clonazepam, se añadió a un tubo de ensayo y se añadió 1 mL del medio correspondiente. El ensayo se llevó a cabo por duplicado, por lo que habrá: dos tubos para clonazepam en agua, dos para clonazepam en medio ácido y dos para clonazepam en medio intestinal. Además, se siguió el mismo procedimiento para analizar la solubilidad del clonazepam tanto en el SEDDS clásico como el sólido, calculando la cantidad de muestra a añadir en cada tubo equivalente a 1 mg de clonazepam. Una vez preparadas todas las muestras, se colocaron en un equipo de agitación orbital (Unitronic Vaivén), con unas condiciones de 37 ºC (temperatura fisiológica) y 18 50 rpm y se dejaron bajo estas condiciones durante cuatro días seguidos. Pasado este tiempo, las muestras se filtraron, se tomó una alícuota de 30 µL de cada muestra y se diluyeron hasta 1 mL. Tras esto, se analizaron por HPLC. 3.9.2. Uniformidad de contenido Para conocer si el clonazepam se distribuye homogéneamente en todo el lote, se llevó a cabo el ensayo de uniformidad de contenido. Para realizarlo, se extrajeron tres alícuotas de 5 mg cada una, de cada uno de los lotes elaborados, y se colocaron cada una de ellas en un eppendorf. A continuación, se añadieron 5 mL de acetonitrilo a cada eppendorf y se agitaron bien cada una de las muestras para favorecer la extracción del clonazepam del SEDDS-S. Finalmente, se filtraron las muestras para su posterior análisis en el HPLC. 3.9.3. Ángulo de reposo Este ensayo se realizó según la Real Farmacopea Española, como se explicó anteriormente en el apartado 3.8.1 selección del sólido adsorbente. Al igual que en el caso anterior para los portadores sólidos por separado, el ensayo se realizó como menciona Vikas Agarwal en su artículo. (Agarwal et al., 2009) 3.9.4. Rendimiento El ensayo para calcular el rendimiento tiene como objetivo analizar qué cantidad (en porcentaje) de principio activo hay presente en nuestra formulación con relación al que se añadió teóricamente. El procedimiento para su realización es el mismo que para el ensayo de uniformidad de contenido, mencionado en el apartado 3.9.2, con la única diferencia de que hay que tener en cuenta la cantidad teórica que debería estar presente con relación a la cantidad real que hay para llegar a conocer el rendimiento. 3.9.5. Estudios de autoemulsión en medio gástrico Este ensayo consistió en simular el proceso de autoemulsión de las formulaciones en medio gástrico con la formulación que, a priori, ha obtenido mejores resultados, para poder estudiar en mayor profundidad el comportamiento de esta. Una vez terminada la simulación y tomadas las alícuotas a los tiempos establecidos, se analizaron por HPLC. 19 Además, se realizó el mismo ensayo en medio gástrico, pero solo con el fármaco y simultáneamente con la mezcla de lactosa/Aerosil® y el clonazepam; todo en las mismas proporciones equivalentes a la fórmula original, con la diferencia de que no se añade el SEDDS. Para realizar estos ensayos, se utilizaron 500 mg de la fórmula que queramos analizar y 100 mL de medio gástrico, a 37 ºC y 500 rpm, tomando alícuotas a los 30 min, 1 h, 1.5 h y 2 h. 3.10 ESTUDIOS DE DISOLUCIÓN IN VITRO Para poder ejecutar los ensayos de liberación in vitro, es necesario acondicionar los SEDDS-S en una forma farmacéutica. En este caso, se optó por las cápsulas de gelatina de tamaño 0, corroborado que la formulación que se usará es la correcta y que el principio activo se libera convenientemente. Para ello, se elaboraron 20 cápsulas transparentes del tamaño 0, usando un capsulador del mismo tamaño; y de manera paralela, se elaboraron otras 20 cápsulas, que se utilizarán como grupo control, cuyo contenido está formado por clonazepam y la mezcla lactosa/Aerosil®. Una vez elaboradas las 40 cápsulas, se sometieron a los ensayos de uniformidad de masa y uniformidad de contenido según las condiciones recogidas en la Real Farmacopea Española. A continuación, se seleccionaron tres de cada lote para realizar el ensayo de disolución. Previamente, se elaboraron los medios necesarios para realizar dicho ensayo, siguiendo la Farmacopea Española: medio gástrico, usando HCl, hasta obtener 750 mL 0.1 M y, por otro lado, medio intestinal, usando Na2PO4 · 12H2O, obteniendo 250 mL 0.2 M. Estas cantidades son las necesarias para cada vaso de disolución en la que se incorporará una cápsula de manera individual, por lo que habría que repetirlo otras 5 veces. Para este ensayo, se empleó el equipo de disolución 708-DS, introduciendo cada cápsula en su cestillo y añadiendo el medio gástrico a cada vaso. Se estableció una velocidad de agitación de 50 rpm y se mantuvo la temperatura constante de 37 ºC gracias a un baño de agua exterior que recubre cada uno de los vasos. (Sanka et al., 2016) Se tomaron alícuotas de cada vaso cada 30 minutos hasta alcanzar las 2 horas de ensayo (cada alícuota debe filtrarse previamente, antes de ser introducidas en viales para su posterior análisis por HPLC). Alcanzadas las 2 horas de ensayo, se añadirán 20 los 250 mL de medio intestinal, hasta alcanzar un volumen de 1 L total, y se corregirá el pH hasta 6.8, si fuera necesario. A partir de este momento las alícuotas se toman cada hora, hasta alcanzar las 4 horas y las 6 horas de ensayo totales. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 CUANTIFICACIÓN DE CLONAZEPAM POR HPLC Para conocer la concentración real de fármaco presente en nuestras muestras, se elaboró una recta de calibrado de clonazepam, que relaciona el área del pico generado en el cromatograma, con la concentración de principio activo presente en cada muestra. Esta recta de calibrado se muestra en la Figura 2. Figura 2. Recta de calibrado de clonazepam. Se observa en la gráfica que el método analítico aplicado es lineal en el rango de concentraciones de 0.01 a 0.1 mg/mL. 4.2 ELABORACIÓN DEL SEDDS LÍQUIDO DEFINITIVO Y SELECCIÓN DEL PORTADOR SÓLIDO Tras el ensayo que determinaba en que aceite vegetal era más soluble el clonazepam, se seleccionó el aceite de caléndula. El fundamento principal por el que se seleccionó este aceite fue porque todo el clonazepam añadido estaba disuelto a las dos horas de ensayo, mientras que, en el resto de los vehículos oleosos, había fármaco en suspensión (no disuelto). Por tanto, la combinación de aceites vegetales a usar fue la mezcla de aceite de lavanda y de caléndula. 21 A continuación, tras elaborar diversas formulaciones con distintas proporciones de aceite e incluso algunas de ellas con la modificación de algún excipiente tensioactivo/cotensioactivo, se analizó la consistencia que presentaba cada una y el tamaño que presentaba la emulsión formada tras su simulación en medio gástrico, de forma que se seleccionaría la que presentara menor tamaño de partícula y una menor polidispersión. Se observó que, a mayor proporción de tensioactivos en la formulación, menor era el tamaño promedio de partícula obtenido al medir cada una de las muestras; en concreto, para una proporción del 52 % de tensioactivos (Tween® 80 y Labrafil® M2130, correspondientes a la fórmula 7), obtuvimos un tamaño medio de partícula de 210 nm, el menor de todas las muestras analizadas. Además, el hecho de que, a mayor proporción de tensioactivos, menor es el tamaño de partícula de la emulsión formada, lo podemos corroborar con resultados obtenidos en otros estudios. (Balakrishnan et al., 2009) (González Lucia et al., 2020) De todas las combinaciones, se seleccionó la formulación de SEDDS F7, mostrada en la tabla 5. Tabla 5. Formulación del sistema autoemulsionable líquido (SEDDS). EXCIPIENTE CANTIDAD (%) Aceite de lavanda 17 Aceite de caléndula 28 Tween® 80 27.5 Labrafil® M2130 24.5 Aerosil® 300 3 Tras elaborar el SEDDS líquido, se hicieron los ensayos pertinentes para seleccionar los mejores sólidos adsorbentes. La determinación del ensayo del ángulo de reposo concluyó que, de los posibles candidatos, fue la mezcla de lactosa y 22 Aerosil® 300, un diluyente y un deslizante, los que proporcionaron mejores propiedades de fluidez (menor ángulo de reposo). La lactosa es un excipiente muy conocido y usado normalmente como diluyente en medicamentos que se administran vía oral. (Kubbinga et al., 2014) Por otra parte, el Aerosil® es considerado un vehículo a base de sílice, que ha sido utilizado directamente como adsorbente físico para lípidos líquidos, generalmente incorporándose mediante procedimientos de mezcla simple. Hemos seleccionado este excipiente por presentar una buena capacidad de adsorción de aceite, aparte de ser ventajoso su uso para generar polvos con buena fluidez y capacidad de compresibilidad. (Tan et al., 2013) Tras analizar el tamaño de partícula en el equipo Z-sizer, y como ya se mencionó anteriormente en este mismo apartado, el tamaño de emulsión obtenido en el ensayo, inferior a los 250 nm, nos permitió trabajar con dicha formulación de manera eficaz. 4.3 DISEÑO DE EXPERIMENTOS Con el objetivo de determinar la influencia de los factores anteriormente ya mencionados, que podrían afectar a la elaboración y caracterización de nuestros SEDDS-S, se realizaron los experimentos establecidos según la matriz 27-run de Box- Benhken. En la tabla 4 se expusieron estos experimentos en la parte de materiales y métodos, citada anteriormente. Se analizaron las variables de respuesta, que fueron en este caso, el ángulo de reposo, la uniformidad de contenido y el rendimiento, cada una de ellas, por duplicado. De esta manera, podemos analizar cómo afecta cada parámetro de forma significativa a cada valor de respuesta analizado. Los resultados se muestran en la Tabla 6. 29 Figura 9. Diagramas de Pareto que recogen los efectos I-hat/2 según el ángulo de reposo (gráfica A), la uniformidad de contenido (gráfica B) y el rendimiento (gráfica C). Concentración de fármaco (A), ratio lactosa/Aerosil® (B), porcentaje de SEDDS clásico (C), y método de adición (D). Por último, en el diagrama de Pareto para la uniformidad de contenido, se aprecia que todas las variables tienen un valor numérico muy pequeño, porque ya vimos que ninguno de los factores afectaba significativamente, por ello, aunque representa la gráfica descendente, no tendría sentido interpretarla de manera equitativa al resto. 4.3.4. Superficie de respuesta y análisis de regresión Las superficies de respuesta analizadas quedan reflejadas en la figura 10. Se han mostrado dichas superficies desde planos distintos para poder observar desde la mejor perspectiva posible estos gráficos, para así seleccionar los factores decisivos en futuras formulaciones. De esta forma, los colores azules y rosados representan las características óptimas para nuestro sistema. Asimismo, hay que tener en cuenta que la variable que más afecta es la proporción de SEDDS usada, que para optimizar la formulación sería conveniente usar un 28 % de SEDDS, como se obtiene en la superficie. Con respecto 30 a la concentración de fármaco, analizando todos los ensayos, ANOVA, ANOM y superficie de respuesta, la concentración de fármaco no implica influencia significativa, aunque en algunas gráficas se ha observado cierta mejoría al usarse una concentración del 0.21 % de clonazepam. A pesar de esto, podríamos usar la concentración que más nos convenga para optimizar nuestra formulación, siempre y cuando usemos un 28 % de SEDDS y un método de adición de mezcla por intervalos ya que, son las variables que mayor influencia y significación presentan. Figura 10. Superficies de respuesta de las variables: Ángulo de reposo (gráfica A), uniformidad de contenido (gráfica B) y rendimiento (gráfica C). El análisis de regresión, que relaciona mediante una ecuación las variables significativas en las respuestas, da lugar a tres ecuaciones: Ángulo de reposo = 48.7 + 0.0292 • Conc.fco (%) - 0.932 • SEDDS (%) Uniformidad de contenido = 29.2 – 0.0571 • Conc.fco (%) – 0.109 • SEDDS (%) Rendimiento = 25.2 – 1.72 • Conc.fco (%) + 3.4 • SEDDS (%) 31 Con los resultados obtenidos en este estudio, se propone como formulación la siguiente: SEDDS formado por aceite de lavanda (17 %), aceite de caléndula (28 %), Labrafil® M2130 (24.5 %), Aerosil® 300 (3 %) y Tween® 80 (27.5 %), al que se le incorpora el clonazepam, en la fase oleosa líquida (previa completa disolución del principio activo), a una concentración del 0.21 %. Esta formulación se adhiere a un portador sólido formado por una mezcla de lactosa y Aerosil® 300 en proporción 99.5/0.5 %; además, la cantidad de SEDDS líquido necesario se corresponde con un 28 %, del total de la formulación. El proceso de adsorción se realiza de manera manual, añadiendo gota a gota el SEDDS líquido a la mezcla de los portadores sólidos, hasta que esté completamente homogeneizado y sin presentar aglomeraciones de partículas. Tras conseguir el SEDDS-S, procedemos a su encapsulación y posterior acondicionamiento final. 4.4. ESTUDIO DE SOLUBILIDAD DE CLONAZEPAM EN AGUA, MEDIO ÁCIDO Y MEDIO INTESTINAL Una vez optimizada la composición del SEDD-S con clonazepam y aceite esencial de lavanda, se valoró la solubilidad del clonazepam en esta formulación, para evidenciar el objetivo del trabajo. El estudio se realizó, como se detalló en el apartado de metodología, en los diferentes medios del tracto gastrointestinal, comparado con agua. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 7. Tabla 7. Solubilidad del clonazepam incorporado en diversos sistemas y en diferentes medios: agua, medio ácido e intestinal. Solubilidad Agua Medio ácido Medio intestinal Clonazepam sólo 0.042 mg/mL 0.046 mg/mL 0.052 mg/mL SEDDS clásico 0.62 mg/mL 0.77 mg/mL 0.81 mg/mL SEDDS-S 0.80 mg/mL 0.91 mg/mL 1.00 mg/mL De esta forma, se puede corroborar que la incorporación del clonazepam a los SEDDS-S, mejora la solubilidad del principio activo, en especial en presencia de medio ácido e intestinal, simulando las condiciones fisiológicas. Analizando los datos de solubilidad, los valores menores se corresponden con el clonazepam en medio 32 acuoso, mejorando en el medio intestinal. Esto se explica analizando el pKa del fármaco, que presenta un valor de 4.9. Al incrementar el pH del medio, favorecemos la ionización del compuesto, mejorando así la solubilidad a pH básico. 4.5. OPTIMIZACIÓN DE LA FORMULACIÓN FINAL Y ELABORACIÓN DE LA FORMA FARMACEÚTICA DEFINITIVA Dentro de la metodología empleada, una vez obtenido y caracterizado el SEDDS-S, se procederá a su incorporación en una forma farmacéutica definitiva, con la que intentaremos mejorar la terapéutica de las personas con trastornos de ansiedad y otras patologías neurológicas relacionadas. Los SEDDS-S fueron acondicionados en cápsulas de gelatina duras, como se recoge en la Metodología, cuya apariencia se recoge en la Figura 11. Figura 11. Acondicionamiento primario del sistema autoemulsionable sólido de clonazepam (SEDDS-S) en cápsulas duras. Una vez elaboradas las cápsulas, se realizaron los ensayos de uniformidad de masa (este último, ya mencionado anteriormente), viendo que las cápsulas elaboradas estaban dentro de los márgenes establecidos por Real Farmacopea Española. 33 Tabla 8. Ensayo correspondiente a la uniformidad de masa. Cap: cápsula; P: peso; DE: desviación estándar Cap 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P (mg) 583 577 581 576 570 572 581 590 577 588 Cap 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 P (mg) 584 585 581 585 588 576 589 579 578 570 Media 580.5 DE (%) 6.1 Los perfiles de liberación in vitro obtenidos muestran diferentes comportamientos de disolución del clonazepam a partir de los SEDDS-S y a partir de la mezcla física del fármaco con los excipientes sólidos. Se observa claramente que el clonazepam a partir del grupo control se disuelve en un porcentaje mucho mayor que las cápsulas que contienen la formulación propuesta. Podríamos sospechar que es por la composición oleosa del sistema, consiguiendo de esta manera una liberación prolongada del fármaco del SEDDS-S, lo que justifica que la gráfica alcance un menor porcentaje de liberación del clonazepam en comparación al grupo control en el que el fármaco se libera de forma más inmediata. Figura 12. Representación gráfica de los perfiles de disolución del SEDDS-S encapsulado (SEDDS-S) y del fármaco junto con la mezcla lactosa/Aerosil® encapsulado (grupo control). Analizando los resultados y comparando con otros estudios revisados en la literatura, no se han obtenidos los resultados que se preveían en un principio. Esperábamos que el SEDDS-S, que incorpora clonazepam, presentara mejor perfil de 34 liberación que el fármaco puro o el fármaco solo en combinación con los excipientes sólidos, como es en nuestro caso. La diferencia con otros autores es la composición de los materiales adsorbentes (Sanka et al. 2016). Llegados a este punto, hay diversas cuestiones que podrían afectar a la obtención de estos perfiles de liberación prolongada, como la composición del SEDDS y su interacción con el material adsorbente. Ni mucho menos cabe menospreciar este resultado, ya que la formulación obtenida podría ser utilizada por otras vías de administración en donde el fármaco puede permanecer como reservorio por períodos más prolongados de tiempo. 5. CONCLUSIONES Tras analizar todos los resultados obtenidos, se puntualizan las siguientes conclusiones: 1. Hay que seleccionar con precisión y eficacia la mezcla de aceites y tensioactivos, sin escatimar tiempo en los ensayos que sean necesarios. Esto es así ya que, variaciones muy pequeñas en los porcentajes que representan cada uno de los componentes de la formulación, pueden influir de manera muy significativa en el tamaño de gotícula, generando un sistema autoemulsionable no deseado. 2. Con relación al SEDDS sólido y al diseño de experimentos, se concluyó que cuanto mayor sea la proporción de SEDDS líquido usado y con un método de adición por mezcla a intervalos, los resultados fueron mejores con relación al rendimiento y la uniformidad de contenido. Aun a sabiendas de esto, es importante saber que una gran proporción excesiva de SEDDS líquido puede generar la formación de aglomerados y reducir la capacidad de flujo del SEDDS-S, dificultando el proceso de encapsulación y otros ensayos. Por ello, hay que incidir especialmente en el proceso de mezclado, evitando que se formen estos aglomerados, y si fuera necesario, enfriando la muestras, para facilitar su desagregación. 3. Los componentes del SEDDS influyen en la liberación del clonazepam a partir del SEDDS sólido, alcanzándose porcentajes de liberación del 30 % frente al 80 % alcanzado por el clonazepam en presencia únicamente de lactosa y Aerosil® 300. 4. La siguiente etapa consistirá en hacer un estudio basado en el aceite de lavanda presente en esta formulación, analizando si este puede afectar la disolución del clonazepam, basándonos en los estudios de Dallay et al. acerca del linalool y su comportamiento en emulsiones. (Dallay et al. 2024) 35 Por los resultados obtenidos, podríamos decir que la técnica aplicada para mejorar los problemas de solubilidad del clonazepam, podría ser una estrategia prometedora; no obstante, hay que continuar con los estudios que nos ayuden a solventar aquellas dificultades a las que nos enfrentamos aun teniendo una formulación estable. 6. BIBLIOGRAFÍA • Agarwal V, Siddiqui A, Ali H, Nazzal S. Dissolution and powder flow characterization of solid self-emulsified drug delivery system (SEDDS). Int J Pharm. 2009;366(1–2):44–52. • Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios. CIMA: Centro de Información Online de Medicamentos de la AEMPS [en línea]. [Consultado en mayo 2024]. Disponible en: https://cima.aemps.es/cima/dochtml/ft/84238/FT_84238.html • Also Fontanet A, Echiburu Salinas N, Pinto Asenjo J. Tratamiento farmacológico de los trastornos de ansiedad. Aten Prim Práct. 2024;6(1):100189. • Amidon GL, Lennernäs H, Shah VP, Crison JR. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm Res. 1995;12(3):413–20. • Balakrishnan P, Lee BJ, Oh DH, Kim JO, Hong MJ, Jee JP, et al. Enhanced oral bioavailability of dexibuprofen by a novel solid Self-emulsifying drug delivery system (SEDDS). Eur J Pharm Biopharm. 2009;72(3):539–45. • Bares IF, Pehourcq F, Jarry C. Development of a rapid RP-HPLC method for the determination of clonazepam in human plasma. J Pharm Biomed Anal. 2004;36(4):865–9. • Benedí J, Gómez del Rio MA. Ansiedad. Tratamiento farmacológico y fitoterápico. Formación Continuada Farmacia, un espacio de salud. 2007;21(1):50–5. • Chavan RB, Modi SR, Bansal AK. Role of solid carriers in pharmaceutical performance of solid supersaturable SEDDS of celecoxib. Int J Pharm. 2015;495(1):374–84. • Dallay C, Malhiac C, Duchemin B, Savary G, Picard C. Effect of linalool on lamellar-structured emulsions: From molecular organization to organoleptic properties. Food Hydrocoll. 2024;149:109575. • De Costa MA, Manfro GG. Generalized anxiety disorder: Advances in neuroimaging studies. Braz J Psychiatry. 2019;41:279. 36 • El Maghraby GM, Arafa MF, Sultan AA. Self-emulsifying systems for drug delivery: advances and challenges. In: Advanced and Modern Approaches for Drug Delivery. Elsevier; 2023. p. 33–75. • Fernández-Romero AM, Arroyo García CM, Sánchez Hidalgo M, González- Rodríguez ML. Desarrollo de sistemas autoemulsionables de aceite de oliva virgen extra para el tratamiento de Lupus Eritematoso Sistémico. Reunión Internacional de Ciencias Farmacéuticas, Rosario (Argentina), 2023. • Garrido Picazo MM. Manejo de la ansiedad en Atención Primaria. SEMERGEN - Medicina de Familia. 2008;34(8):407–10. • Gloria D, Loayza L. Relación entre el nivel de estrés, ansiedad y estado de ánimo en docentes y madres de familia que atiende a niños con necesidades Especiales de los CEBE Caritas del distrito de Paucarpata 2017. Universidad Católica de Santa Marí. Arequipa (Perú). 2017. • González LR, Villarreal OS, Bernad B, Josefa M, Barreto MM, Calderón M, et al. Desarrollo y evaluación de un sistema autoemulsionable de Etoricoxib. Revista TEDIQ. 2020;6(6):2020. • González‐Rodríguez ML, Mouram I, Cózar‐Bernal MJ, Villasmil S, Rabasco AM. Applying the Taguchi method to optimize sumatriptan succinate niosomes as drug carriers for skin delivery. J Pharm Sci. 2012;101(10):3845–63. • Harada H, Kashiwadani H, Kanmura Y, Kuwaki T. Linalool Odor-Induced Anxiolytic Effects in Mice. Front Behav Neurosci. 2018;23:12. • Inugala S, Eedara BB, Sunkavalli S, Dhurke R, Kandadi P, Jukanti R, et al. Solid self-nanoemulsifying drug delivery system (S-SNEDDS) of darunavir for improved dissolution and oral bioavailability: In vitro and in vivo evaluation. Eur J Pharm Sci. 2015;74:1–10. • Jannin V, Musakhanian J, Marchaud D. Approaches for the development of solid and semi-solid lipid-based formulations. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60:734–46. • Kubbinga M, Moghani L, Langguth P. Novel insights into excipient effects on the biopharmaceutics of APIs from different BCS classes: Lactose in solid oral dosage forms. Eur J Pharm Sci. 2014;61(1):27–31. • Maji I, Mahajan S, Sriram A, Medtiya P, Vasave R, Khatri DK, et al. Solid self emulsifying drug delivery system: Superior mode for oral delivery of hydrophobic cargos. J Contr Release. 2021;337:646–60. 37 • de Melo Alves Silva LC, de Oliveira Mendes F de C, de Castro Teixeira F, de Lima Fernandes TE, Barros Ribeiro KR, da Silva Leal KC, et al. Use of Lavandula angustifolia essential oil as a complementary therapy in adult health care: A scoping review. Heliyon. 2023;9. • Ministerio de Sanidad y Consumo. Agencia Laín Entralgo (Madrid). Unidad de Evaluación de Tecnologías Sanitarias. Guía de práctica clínica para el manejo de pacientes con trastornos de ansiedad en atención primaria: versión resumida. Agencia Laín Entralgo. Unidad de Evaluación de Tecnologías Sanitarias; 2008 [en línea]. [Consultado en Mayo 2024]. Disponible en: https://portal.guiasalud.es/gpc/guia-de-practica-clinica-para-el-manejo-de- pacientes-con-trastornos-de-ansiedad-en-atencion-primaria/ • Raman Kallakunta V, Dudhipala N, Nyavanandi D, Sarabu S, Yadav Janga K, Ajjarapu S, et al. Formulation and processing of solid self-emulsifying drug delivery systems (HME S-SEDDS): A single-step manufacturing process via hotmelt extrusion technology through response surface methodology. Int J Pharm. 2023;641. • Sanka K, Suda D, Bakshi V. Optimization of solid-self nanoemulsifying drug delivery system for solubility and release profile of clonazepam using simplex lattice design. J Drug Deliv Sci Technol. 2016;33:114–24. • Sila-On W, Vardhanabhuti N, Ongpipattanakul B, Kulvanich P. Influence of incorporation methods on partitioning behavior of lipophilic drugs into various phases of a parenteral lipid emulsion. AAPS PharmSciTech. 2008;9(2):684–92. • Singh N, Rai S, Bhattacharya S. A Conceptual Analysis of Solid Self-emulsifying Drug Delivery System and its Associate Patents for the Treatment of Cancer. Recent Pat Nanotechnol. 2020;15(2):92–104. • Tan A, Rao S, Prestidge CA. Transforming Lipid-Based Oral Drug Delivery Systems into Solid Dosage Forms: An Overview of Solid Carriers, Physicochemical Properties, and Biopharmaceutical Performance. Pharm Res. 2013;30(12):2993–3017.