Implementación, caracterización y validación biológica de técnicas de modificación superficial de titanio poroso pulvimetalúrgico para aplicaciones biomédicas.

0 Tesis Doctoral Implementación, caracterización y validación biológica de técnicas de modificación superficial de titanio poroso pulvimetalúrgico para aplicaciones biomédicas Cristina Domínguez Trujillo Directores: Yadir Torres Hernández José Antonio Rodríguez Ortiz Tutor: Francisco José Gotor Martínez Universidad de Sevilla Sevilla, 2019 Tesis Doctoral Ciencia y Tecnología de Nuevos Materiales Implementación, caracterización y validación biológica de técnicas de modificación superficial de titanio poroso pulvimetalúrgico para aplicaciones biomédicas Autor: Cristina Domínguez Trujillo Directores: Yadir Torres Hernández (Profesor Titular de Universidad) José Antonio Rodríguez Ortiz (Catedrático de Universidad) Departamento de Ingeniería y Ciencias de los Materiales y el Transporte Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2019 Tesis doctoral: Implementación, caracterización y validación biológica de técnicas de modificación superficial de titanio poroso pulvimetalúrgico para aplicaciones biomédicas Autor: Cristina Domínguez Trujillo Tutor: Francisco José Gotor Martínez El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2019 El Secretario del Tribunal A mi familia, por demostrarme día tras día que siempre están ahí. A Celia, Elvi y Salva, por no dejar nunca de creer en mí. A Raquel, por tirar de mí todos los días. 17 Contenido Lista de figuras .................................................................................................. 21 Lista de tablas .................................................................................................... 29 Glosario ............................................................................................................. 33 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN ............................................................................... 35 1.1 Biomateriales ............................................................................................... 37 a) Tipos de biomateriales ........................................................................ 42 b) Biomateriales metálicos ....................................................................... 44 1.2 El titanio ....................................................................................................... 48 1.3 Materiales metálicos porosos ...................................................................... 49 1.4 Mejora de la osteointegración ...................................................................... 53 1.4.1 Técnicas de modificación superficial del titanio ................................. 54 Métodos químicos ............................................................................. 57 1.4.2 Materiales bioactivos ......................................................................... 60 Hidroxiapatita (HA) ................................................................................ 61 a) Características principales de la HA ............................................. 61 b) Aplicaciones principales de la HA ................................................ 74 c) Recubrimientos bioactivos HA ...................................................... 75 d) Técnicas de recubrimientos de HA ............................................... 77 e) Combinaciones de HA con otros materiales................................. 83 Vidrio bioactivo ..................................................................................... 85 a) Características principales de los vidrios bioactivos ..................... 85 b) Aplicaciones de los vidrios bioactivos .......................................... 93 c) Formas de aplicación de los vidrios bioactivos ............................. 94 d) Técnicas de recubrimiento de vidrio bioactivo .............................. 96 18 e) Combinaciones de vidrio bioactivo con otros materiales ............ 101 f) Ensayos in vitro e in vivo ............................................................ 104 1.4.3 Formas de combatir la proliferación microbiana .............................. 105 Capítulo 2: OBJETIVOS .................................................................................... 111 2.1 Objetivo principal..................................................................................... 113 2.2 Objetivos específicos .............................................................................. 113 Capítulo 3: RESULTADOS ................................................................................ 117 3.1. Disminución del apantallamiento de tensiones: sustratos de Titanio poroso obtenidos por rutas pulvimetalúrgicas ........................................... 129 3.1.1 Caracterización microestructural de los sustratos porosos ..... 130 3.1.2 Caracterización de la superficie de los sustratos y las paredes de los poros ................................................................................................. 136 3.1.3 Comportamiento macro y micro-mecánico ................................. 143 3.1.4 Resistencia al rayado y desgaste ................................................. 148 3.1.5 Evaluación del comportamiento In vitro ...................................... 156 Cultivos celulares C2C12 ................................................................... 156 Proliferación de cepas de bacterias (E. coli, MRSA y P. aeruginosa)159 3.2. Mejora de la capacidad de osteointegración: tratamientos de modificación superficial ................................................................................ 168 3.2.1 Modificación de la rugosidad y la textura superficial de los sustratos de titanio porosos: ataque químico por inmersión ............ 168 Caracterización microestructural de las superficies de los sustratos y las paredes de los poros: influencia de la técnica de ataque químico 169 Caracterización de la superficie de los sustratos y las paredes de los poros: influencia del ataque químico .................................................... 172 Comportamiento macro-mecánico de los sustratos atacados por inmersión ............................................................................................. 181 19 Evaluación del comportamiento In vitro: Mejora del comportamiento celular de los sustratos atacados químicamente por inmersión ............ 183 3.2.2 Recubrimientos bioactivos ........................................................... 190 Deposición de hidroxiapatita: Técnica de sol-gel ............................ 191 Caracterización de la superficie de los sustratos recubiertos con HA: Estudio de la composición, homogeneidad, rugosidad y grado de infiltración del recubrimiento .............................................................. 191 Comportamiento micro-mecánico de los sustratos recubiertos con HA: microdureza ............................................................................... 195 Comportamiento tribomecánico de los sustratos recubiertos con HA: resistencia al rayado .................................................................. 195 Deposición de Bioglass: técnica de sedimentación por goteo ........... 200 Caracterización de la superficie de los sustratos recubiertos con BG: morfología y topografía superficial del recubrimiento ................. 200 Comportamiento micro y tribo-mecánico de los sustratos recubiertos con BG: Influencia del espesor, capacidad de infiltración y adherencia del recubrimiento (microdureza y resistencia al rayado) . 210 Evaluación del comportamiento In vitro: Bioactividad del recubrimiento de BG en SBF e influencia del número de capas de BG .......................................................................................................... 218 3.2.3 Recubrimiento antibacteriano (SPEEK) de los sustratos porosos ................................................................................................................. 223 Estudio de la proliferación de MRSA sobre los sustratos recubiertos: mejora del comportamiento bactericida ................................................ 223 Capítulo 4: DISCUSIÓN DE RESULTADOS ..................................................... 227 4.1 Caracterización y validación de los sustratos de Titanio poroso fabricados por pulvimetalurgia para solventar el apantallamiento de tensiones ........................................................................................................ 229 20 4.2 Evaluación de los tratamientos de modificación superficial para la mejora de la osteointegración ...................................................................... 255 4.2.1 Ataque químico por inmersión: análisis de la topografía, la integridad estructural y la capacidad de adhesión celular ......................................... 255 4.2.2. Recubrimientos cerámicos bioactivos ....................................... 280 Viabilidad y efectividad del uso de la técnica de sol-gel como ruta para deposición de hidroxiapatita sobre sustratos porosos ................... 280 Capacidad de la técnica de sedimentación por goteo para depositar recubrimientos de vidrios bioactivos: relación entre los parámetros del proceso y las propiedades de las capas de BG ......................... 290 4.2.3. Efecto del recubrimiento de SPEEK como agente antibacteriano ................................................................................................................. 308 Capítulo 5: CONCLUSIONS .............................................................................. 311 Bibliografía ......................................................................................................... 319 COMPENDIO DE TRABAJOS ............................................................................ 339 Lista de figuras 21 Lista de figuras Figura 1. Esperanza de vida desde 1950 a 2065 [2]. .......................................................... 38 Figura 2. a) Pérdida de masa ósea [3] y b) pérdida de resistencia ósea [4] en función de la edad y del género. ................................................................................................................ 39 Figura 3. Factores que influyen en la interacción de la intercara del implante con el tejido óseo para una correcta osteointegración [13]. ..................................................................... 41 Figura 4. Clasificación de los biomateriales atendiendo a su interacción con el cuerpo humano y a su evolución [15]. .............................................................................................. 42 Figura 5. Principales biomateriales metálicos y sus aplicaciones clínicas [21]. .................. 45 Figura 6. Fenómeno de apantallamiento de tensiones y consecuente reabsorción ósea [4]. .............................................................................................................................................. 46 Figura 7. Crecimiento de tejido fibroso en un implante metálico poroso [27]. ..................... 47 Figura 8. Proceso de fabricación que emplea la técnica de espaciadores [61]. .................. 53 Figura 9. Clasificación de los distintos métodos de modificación superficial encontrados en la literatura. ........................................................................................................................... 55 Figura 10. Esquema de los diferentes procesos durante el crecimiento del recubrimiento por CVD [96]. .............................................................................................................................. 60 Figura 11.: (a) Estructura atómica de la HA y (b) su proyección a lo largo del eje c [107] .. 62 Figura 12. Estructura jerárquica del hueso [103]. ................................................................ 64 Figura 13. Estructura del diente [10]. ................................................................................... 66 Figura 14. Imagen SEM de la HA con rango de tamaño de poro 250-400 μm [56]. ............ 73 Figura 15. Influencia de la porosidad en la (a) tenacidad a fractura y (b) resistencia a tracción [10, 107]. ............................................................................................................................... 74 Figura 16. Vías de síntesis de sol-gel [1]. ............................................................................ 78 Figura 17. Etapas del recubrimiento por inmersión (1) inmersión, (2) extracción y (3) secado [21, 22]. ................................................................................................................................. 82 Figura 18. Etapas de la deposición de recubrimiento por centrifugación. (1) deposición, (2) centrifugado, (3) escisión y (4) evaporación [5]. .................................................................. 83 Figura 19. Unidades estructurales básicas de SiO4-, constituidas por enlaces Si-O-Si. *NBO sin puentes de hidrógeno, BO con puentes de hidrógeno [146]. ......................................... 85 Figura 20. Sección de una muestra maciza de vidrio bioactivo tras 2 semanas de inmersión en fluido fisiológico simulado (SBF): imagen SEM (izquierda) y su correspondiente microanálisis EDS (derecha) [20]. ........................................................................................ 87 Figura 21. Scaffold de vidrio bioactivo realizado mediante fabricación aditiva [152]. .......... 90 Figura 22. Clasificación de los vidrios bioactivos según su bioactividad atendiendo al diagrama ternario de composición Na2O- SiO2-CaO [153]. ................................................... 91 Figura 23. Método de sol-gel [181]. ...................................................................................... 97 Figura 24. Difractogramas de a) vidrio 45S5 sinterizado a 1000 ºC (25 ºC/min) [183] y b) polvo de vidrio 45S5 en estado de recepción, sinterizado a 900 ºC durante 5 h y a 1000 ºC durante 1 h [184]. En todos los vidrios sinterizados se identifica la fase cristalina de Na2Ca2Si3O9. ...................................................................................................................... 100 Lista de figuras 22 Figura 25. Micrografía SEM de PLLA (variación del PLA) con un 94% de porosidad, con 15% en volumen de Bioglass® 45S5 [152]. ............................................................................... 103 Figura 26. Clasificación de nano-partículas en función de su composición química [231].108 Figura 27. Esquema de presentación de Resultados en esta Tesis doctoral. ................... 120 Figura 28. Caracterización de los sustratos porosos de titanio fabricados para solventar el apantallamiento de tensiones (extraído del esquema de la Figura 27). ............................ 130 Figura 29. Curvas de compresibilidad del polvo de Ti c.p. y de las mezclas de éste con el hidrógeno carbonato de amonio (BA) de rangos de tamaño de espaciador de 100-200 µm y 250-355 µm: a) Para 0-1200 MPa; b) Detalle de la anterior para 600-1200 MPa. ............ 131 Figura 30. Micrografías de los sustratos de titanio. a) sustrato denso, b) y c) sustratos porosos de tamaño de partícula de espaciador 100-200 y 250-355 µm, respectivamente. ............ 133 Figura 31. Distribuciones del Deq de los poros, obtenidas por IA, de los sustratos de titanio a) denso y b) poroso de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador. ....... 134 Figura 32. Distribución de tamaños de los poros. Fracción volumétrica (%) frente a Deq (µm) y reconstrucción en 3D de la tomografía de los sustratos porosos de titanio de tamaño de partícula de espaciador de a) 100-200 µm y b) 250-355 µm. ............................................ 136 Figura 33. Micrografías SEM de la superficie y del interior de un poro de los sustratos porosos de titanio para diferente rango de tamaño de partícula de espaciador: a y c) 100-200 µm, b y d) 250-355 µm. ................................................................................................................ 138 Figura 34. Distribución de Rugvol (%) y corte transversal 2D de la tomografía de los sustratos porosos de titanio con rango de tamaño de partícula de espaciador a) 100-200 µm y b) 250- 355 µm. ............................................................................................................................... 140 Figura 35. Imágenes 2  D de microscopía confocal láser de la superficie de los sustratos denso y porosos de titanio con diferente rango de tamaño de partícula de espaciador: a) denso, b) 100-200 µm y c) 250-355 µm. En estas imágenes se emplea una escala de colores para representar el relieve. ................................................................................................. 141 Figura 36. Imágenes 3D de microscopía confocal láser de la superficie de los sustratos denso y porosos de titanio con diferente rango de tamaño de espaciador: a) denso, b) 100-200 µm y c) 250-355 µm. ................................................................................................................. 142 Figura 37. Curvas tensión (  ) -deformación (  ) obtenidas por el ensayo de compresión para los sustratos porosos de titanio con rango de tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm y 250-355 µm. Ensayo realizado bajo la norma ASTM E9-09 [244]. ................................. 144 Figura 38. Curvas P-h para el sustrato denso y poroso de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador. ................................................................................................ 147 Figura 39. Esquema de las curvas P-h tras el ensayo de micro-indentación instrumentada para cada sustrato. ............................................................................................................. 147 Figura 40. Perfil topográfico de los sustratos denso y poroso de rango de tamaño de partícula de espaciador de 100-200 µm para la pre-palpación y tras el rayado (penetración permanente). ...................................................................................................................... 149 Figura 41. Recuperación elástica de los sustratos denso y poroso de rango de tamaño de partícula de espaciador de 100-200 µm durante y tras el rayado (penetración permanente). ............................................................................................................................................ 151 Figura 42. Imágenes SEM del surco generado en el ensayo de rayado para las muestras densa a) 120X, b) 500X y porosa de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador c) 120X, d) 500X. ............................................................................................. 152 Lista de figuras 23 Figura 43.Coeficiente de fricción (izquierda) y profundidad del surco-LVDT en mm (derecha) en función de la distancia recorrida en m para los sustratos denso y poroso de 100-200 µm de rango de tamaño de espaciador. ................................................................................... 153 Figura 44. Micrografías de la superficie de los sustratos tras el ensayo de desgaste por OM: a) denso y c) poroso de 100-200 µm, así como, con más detalle, por microscopía confocal para los sustratos: b) denso y d) poroso de 100-200 µm. .................................................. 155 Figura 45. Adhesión celular C2C12-GFP sobre los sustratos denso y porosos de rango de tamaño de espaciador 100-200 y 250-355 µm tras 24 h de cultivo. Viabilidad e imágenes obtenidas por microscopía invertida de fluorescencia. ...................................................... 157 Figura 46. Proliferación celular C2C12-GFP sobre los sustratos denso y porosos de rango de tamaño de espaciador 100-200 y 250-355 µm tras 4, 7 y 10 días de cultivo. Viabilidad e imágenes obtenidas por microscopía invertida de fluorescencia....................................... 158 Figura 47. Macrografías de la proliferación de E. coli sobre los diferentes sustratos de titanio: Denso, 100-200 µm y 250-355 µm (Protocolo P1, Concentración 1). ............................... 160 Figura 48. Unidades de formación de colonias de E. coli tras la filtración por membrana (Protocolo P1). .................................................................................................................... 161 Figura 49. Unidades de formación de colonias de E. coli en el interior de los poros de los sustratos porosos por filtración por membrana (Protocolo P3): a) valores absolutos; b) valores normalizados (se ha superpuesto una gráfica en otra dada la fuerte diferencia entre los valores de UFC, de dos órdenes, entre concentración 1 y la 2). ................................. 162 Figura 50. Macrografías de la proliferación de P. aeruginosa (método 2), para las tres diluciones estudiadas (0, -1 y -2), sobre los diferentes sustratos de titanio: a) denso, b) 100- 200 µm y c) 250-355 µm. ................................................................................................... 163 Figura 51. Unidades de formación de colonias de P. aeruginosa a dilución -1 tras el cultivo sobre los sustratos de titanio denso y porosos en valor a) absoluto y b) normalizado por la superficie total de la muestra.............................................................................................. 164 Figura 52. Macrografías de la proliferación de MRSA (método 2) para las tres diluciones estudiadas (0, -1 y .2) sobre los sustratos de titanio: a) denso, y porosos de b) 100-200 µm y c) 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador. ................................... 165 Figura 53. Ensayo de bacterias vivas/muertas para la cepa MRSA a concentración inicial de 104 UFC/ml (dilución 0) en los sustratos de titanio a) denso, y porosos de rango de tamaño de espaciador b) 100-200 µm y c) 250-355 µm. ................................................................ 166 Figura 54. Unidades de formación de colonias de MRSA a dilución -1 tras el cultivo sobre los sustratos de titanio denso y porosos en valor a) absoluto y b) normalizado por la superficie total de la muestra. ............................................................................................................. 167 Figura 55. Extracto del esquema de la Figura 27. Técnicas y caracterización estudiadas para la mejora de la osteointegración por la vía de modificación de la rugosidad y la textura de la superficie mediante ataque químico. .................................................................................. 169 Figura 56. Fracción volumétrica (%) frente a Deq (µm) de los sustratos porosos de titanio de tamaño de partícula de espaciador 100-200 y 250-355 µm atacados químicamente por inmersión a 125 s. .............................................................................................................. 172 Figura 57. Imágenes SEM del sustrato de titanio denso atacado por inmersión: a) 0 s, b) 125 s y c) 625 s. ........................................................................................................................ 173 Figura 58. Imágenes SEM de los sustratos de titanio atacados por inmersión de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador para a) 0 s, b) 125 s y c) 625 s y de 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador para d) 0 s, e) 125 s y f) 625 s. ....... 173 Figura 59. Imágenes SEM del interior de los poros de los sustratos de titanio atacados por inmersión de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador para a) 125 s y b) Lista de figuras 24 625 s y de 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador para c) 125 s y d) 625 s. .................................................................................................................................. 174 Figura 60. Distribución de la rugosidad volumétrica (%) de los sustratos porosos de titanio atacados químicamente por inmersión a 125 s con tamaño de partícula de espaciador 100- 200 y 250-355 µm. .............................................................................................................. 176 Figura 61. Imágenes de microscopía confocal 2½ D de los sustratos de titanio atacados por inmersión: denso a a) 125 s y b) 625 s, poroso de 100-200 µm a c) 125 s y d) 625 s y poroso de 250-355 µm a e) 125 s y f) 625 s. ................................................................................. 177 Figura 62. Imágenes 3D de microscopía confocal del sustrato de titanio denso atacado por inmersión; a) 125 s y b) 625 s. ........................................................................................... 178 Figura 63. Imágenes 3D de microscopía confocal del ataque por inmersión de los sustratos porosos de titanio de 100-200 µm: a) 125 s y b) 625 s; sustratos porosos de 250-355 µm: d) 125 s y e) 625 s. ................................................................................................................. 179 Figura 64. Curvas tensión (  ) - deformación (  ) obtenidas por el ensayo de compresión para los sustratos porosos de titanio con rango de tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm y 250-355 µm, atacados por inmersión a 125 y 625 s. Ensayo realizado bajo la norma ASTM E9-09 [244]. ........................................................................................................................ 182 Figura 65. Adhesión celular a los sustratos de titanio denso y porosos de 100-200 y 250-355 µm de tamaño de partícula de espaciador, atacados químicamente por inmersión a 125 y 625 s, respectivamente, tras 24 h de cultivo. ..................................................................... 184 Figura 66. Proliferación celular a los sustratos de titanio denso y porosos de 100-200 y 250- 355 µm de tamaño de partícula de espaciador, atacados químicamente por inmersión a 125 y 625 s, respectivamente, tras 4 días de cultivo. ............................................................... 185 Figura 67. Proliferación celular a los sustratos de titanio denso y porosos de 100-200 y 250- 355 µm de tamaño de partícula de espaciador, atacados químicamente por inmersión a 125 y 625 s respectivamente, tras 7 días de cultivo. ................................................................ 186 Figura 68. Proliferación celular tras 10 días de cultivo en los sustratos de titanio denso y porosos de 100-200 y 250-355 µm de tamaño de partícula de espaciador, atacados químicamente por inmersión a 125 y 625 s, respectivamente. .......................................... 187 Figura 69. Imágenes de adhesión celular tras 24 h obtenidas por microscopía invertida de fluorescencia de los sustratos denso y porosos de 100-200 y 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador, tras el ataque químico por inmersión a 125 y 625 s. 188 Figura 70. Imágenes de proliferación celular tras 7 días obtenidas por microscopía invertida de fluorescencia para los sustratos denso y porosos de 100-200 y 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador, tras el ataque químico por inmersión a 125 y 625 s. 189 Figura 71. Extracto del esquema de la Figura 27. Etapas seguidas para la mejora de la osteointegración por la vía de recubrimientos bioactivos. ................................................. 191 Figura 72. Espectros de EDX de la superficie del recubrimiento de HA mediante la técnica de sol-gel de los sustratos porosos de titanio con tamaño de partícula de espaciador a) 100- 200 µm y b) 250-355 µm. ................................................................................................... 192 Figura 73. Espectro FTIR de los sustratos porosos de titanio con tamaño de partícula de espaciador a) 100-200 µm y b) 250-355 µm recubiertos de HA mediante la técnica de solgel. ...................................................................................................................................... 192 Figura 74. Diagrama XRD de los sustratos porosos de titanio con tamaño de partícula de espaciador a) 100-200 µm y b) 250-355 µm recubiertos de HA mediante la técnica de solgel. ...................................................................................................................................... 193 Lista de tablas 31 máxima), C (penetración permanente), B-A (fluencia o creep a carga constante), (B-C)/B (Recuperación elástica). ..................................................................................................... 214 Tabla 37. Parámetros de rugosidad de la topografía de los sustratos denso y poroso de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm recubiertos con 3 capas de BG mediante la técnica de goteo en la etapa de pre-palpación y tras el rayado (penetración permanente). ............................................................................................................................................ 216 Tabla 38. Vm, RE, Máx y Mín, y  máx y  mín de los valores máximo y mínimo de penetración para los sustratos denso y poroso de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm recubiertos con 3 capas de BG mediante la técnica de goteo durante y tras el rayado (penetración permanente). ....................................................................... 217 Tabla 39. Concentraciones de los iones principales en la solución de referencia de SBF y en las soluciones correspondientes a las muestras de titanio densa de 3 capas y porosa de 100- 200 µm con 1 capa y 3 capas de BG depositado mediante la técnica de goteo, tras su inmersión durante 21 días, analizadas por ICP. ................................................................ 220 Tabla 40. Comparación de porosidades y morfología de los poros tras el proceso de sinterizado a partir de las distintas técnicas de caracterización microestructural utilizadas ............................................................................................................................................ 235 Tabla 41. Área estimada (AF, AP y AT) de los sustratos porosos a partir de los datos obtenidos por micro-CT. ...................................................................................................................... 239 Tabla 42. ∆PT (%) de los sustratos denso y porosos de ambos tamaños de partícula de espaciador, atacados a 125 y 625 s por inmersión, con respecto a sus análogos vírgenes por el método de Arquímedes. ................................................................................................. 257 Tabla 43. ∆PT (%) y ∆Deq (%) de los sustratos porosos de ambos tamaños de partícula de espaciador, atacados a 125 s por inmersión, con respecto a sus análogos vírgenes por micro- CT. ...................................................................................................................................... 257 Tabla 44. FWHM y Desviación Típica de las distribuciones de Deq de los sustratos porosos antes y después del ataque a 125 s. .................................................................................. 260 Tabla 45. Parámetros de rugosidad Sa obtenido por microscopía confocal láser de las superficies de los macro-poros y la matriz de Ti en función del contenido y rango de tamaño de espaciador, antes y tras el ataque químico por inmersión a 125 y 625 s. .................... 269 Tabla 46. Comparación del límite de fluencia de las muestras porosas de rango de tamaño de partícula de espaciador 100-200 y 250-355 µm, antes y tras ser atacadas químicamente por inmersión a 125 y 625 s. Límite de fluencia (σy) calculado por la norma convencional ASTM E9-9. ........................................................................................................................ 272 Tabla 47. Parámetro de rugosidad Sa, obtenido por microscopía confocal láser de las superficies vírgenes y recubiertas por HA de los sustratos porosos de Ti, en función del tamaño de espaciador y la zona estudiada. ....................................................................... 285 Tabla 48. Valores de microdureza Vickers para cargas HV0.3 y HV1 sobre los sustratos porosos de 100-200 y 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador, vírgenes y recubiertos de HA mediante la técnica de sol-gel. .......................................................... 286 Tabla 49.Comparación de los parámetros de rugosidad de la topografía, valor medio de penetración permanente y recuperación elástica (RE) del sustrato poroso de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm. ............................................................... 289 Tabla 50. Comparación de rugosidad aritmética Sa (µm), obtenida a partir de la microscopía confocal láser, entre los sustratos porosos de 100-200 y 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador, sin recubrir y recubiertos con 3 capas de BG. ............................ 296 Tabla 51. Comparación de parámetros de rugosidad de la topografía en la etapa de prepalpación, valor medio de penetración permanente y recuperación elástica (RE) del sustrato Lista de tablas 32 poroso de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm, sin recubrir y recubiertos con: 1) HA mediante la técnica de sol-gel y 2) 3 capas de BG mediante la técnica de goteo, tras el ensayo de rayado. ................................................................................... 300 Glosario 33 Glosario BG Vidrio bioactivo cp Comercialmente puro EDX Fluorescencia de rayos X por energía dispersiva FTIR Espectroscopía infrarroja de Transformada de Fourier HA Hidroxiapatita HV Dureza Vickers IA Análisis de Imagen ICP-MS Espectrometría atómica de masas Micro-CT Micro-tomografía computarizada MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina PEEK Poli-éter-éter-cetona SBF Fluido corporal simulado SEM Microscopía electrónica de barrido SPEEK Poli-éter-éter-cetona sulfonado TEC Coeficiente de dilatación térmica UFC Unidades de formación de colonias UFR Unidades de fluorescencia relativa US Ensayo de Ultrasonidos XRD Difracción de rayos X 34 35 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN 36 Introducción 37 Capítulo 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Biomateriales Las enfermedades degenerativas, consecuencia del reciente aumento de la esperanza de vida, así como el incremento del número de lesiones, propias de una vida más activa, son considerados una de las principales causas en el desarrollo de nuevos materiales y tratamientos enfocados al reemplazo de tejidos, contribuyendo a su vez al despliegue de la ciencia y la ingeniería [1]. El aumento de la esperanza de vida, entre otros motivos, se ve favorecido por el avance de la medicina, mejorando el tratamiento de enfermedades que presentan un alto índice de mortalidad. En la Figura 1 se muestra el gran crecimiento de la esperanza de vida que ha experimentado la población en las últimas décadas, así como el que se estima desde la actualidad hasta el año 2065. En concreto, se observa que España prevé un aumento de la esperanza de vida de unos 20 años. Capítulo 1 38 Figura 1. Esperanza de vida desde 1950 a 2065 [2]. Sin embargo, el aumento de esperanza de vida conlleva un envejecimiento de la población, y como consecuencia, la pérdida de densidad y resistencia ósea (Figura 2). Estas propiedades resultan ser máximas en torno a los 30-40 años, disminuyendo de manera más rápida para el caso de las mujeres que para los hombres como consecuencia de la menopausia. La pérdida de masa y resistencia ósea implica una mayor probabilidad de fractura del hueso, y por tanto, un aumento de la demanda de implantes. Introducción 39 Figura 2. a) Pérdida de masa ósea [3] y b) pérdida de resistencia ósea [4] en función de la edad y del género. La creciente demanda de materiales sintéticos, capaces de suplir las necesidades actuales en el campo de la medicina, conlleva el aporte de nuevos enfoques y métodos de síntesis que garanticen tanto la duración como la funcionalidad en el cuerpo humano. En este contexto, los biomateriales deben poseer unas características tanto mecánicas como biológicas adecuadas [5]. Han de ser biocompatibles, es decir, capaces de actuar de manera adecuada y con una correcta respuesta por parte del hueso huésped bajo circunstancias determinadas Capítulo 1 40 [6, 7]. Idealmente, debe ser lo más similar posible al hueso en términos estructurales y biológicos, así como no tóxico y bioinerte. Además, el avance de los últimos años ha posibilitado la presencia de otras propiedades como son la bioactividad, la cual permite una unión interfacial entre hueso y material, la habilidad de biodegradarse y la capacidad de liberar medicamentos que reduzcan la inflamación y el riesgo de aparición de infecciones tras la implantación [7-10]. El hueso se caracteriza por ser un sistema de remodelación constante, es decir, un sistema dinámico. Los osteoblastos y osteoclastos son las células encargadas de mantener un equilibrio entre la degradación del “hueso viejo” y la sintetización del “hueso nuevo”. En este sentido, el diseño y elección del biomaterial han de estar estrechamente ligados con la función que va a desempeñar (soporte, sustitución o relleno) [11]. Ciertas variables, como la porosidad y la rugosidad superficial permiten, además de conferir propiedades mecánicas parecidas a las del hueso, facilitar la adhesión de éste al implante. En este sentido, se hace imprescindible que el biomaterial no cause ninguna reacción inmunológica o inflamatoria (capacidad bioinerte). Sin embargo, la adhesión no es suficiente, sino que interesa que el hueso se integre en el mismo, fenómeno conocido como osteointegración. La osteointegración se define como el proceso donde se consigue y mantiene la fijación rígida clínicamente asintomática de los materiales aloplásticos durante la carga funcional [12]. La capacidad bioactiva, por su parte, es una propiedad que promueve la osteointegración del hueso al material. La correcta osteointegración depende, entre otros factores, de la intercara entre el hueso y el implante (Figura 3). Introducción 47 Figura 7. Crecimiento de tejido fibroso en un implante metálico poroso [27]. La Tabla 2 muestra las propiedades de densidad y rigidez de los principales biomateriales metálicos, así como las correspondientes al hueso cortical. Tabla 2. Propiedades mecánicas del hueso y de algunos metales empleados para su sustitución. Hueso cortical Acero inoxidable Aleaciones Co-Cr Titanio c.p. Módulo de Young (GPa) 22-25 190-210 190 116 Resistencia mecánica (MPa) 170 460-860 655 220 Densidad (g/cm3) 1.9 7.96 8.3 4.5 El titanio comercialmente puro (Ti c.p.) es el que presenta unas propiedades mecánicas más cercanas al hueso, con valores que permiten soportar los esfuerzos a los que el implante estará sometido en servicio [28]. Por ello, el titanio es de los metales más interesantes en términos de reemplazo total o parcial del hueso. Capítulo 1 48 1.2 El titanio El Ti c.p. y sus aleaciones, como se ha mencionado anteriormente, poseen unas excelentes propiedades mecánicas y un alta resistencia a la corrosión [29, 30], así como una buena biocompatibilidad, tanto en estudios in vitro como in vivo [31], además de ser bioinerte. Las propiedades que posee este material dependen de manera estrecha de la capa de óxido (TiO2) que se genera sobre su superficie como consecuencia de la autopasivación, con un espesor variable de entre 2-10 nm. Dicha capa protege al material de ataques químicos en ambientes agresivos, como el aire o fluidos corporales. Además, reacciona en solución acuosa, adsorbiendo y disociando moléculas orgánicas, pudiendo incluso llegar a actuar como catalizador para un gran número de reacciones químicas [32, 33]. A pesar de ser un buen candidato entre los biomateriales metálicos para el reemplazo óseo por sus buenas prestaciones, el Ti c.p. presenta ciertas limitaciones que ponen en duda su fiabilidad. Estos fallos son clasificados en dos tipos: fallos biomecánicos y biofuncionales. Los fallos biomecánicos se deben principalmente a: 1. El apantallamiento de tensiones, que desemboca en la fractura y la reabsorción ósea. A pesar de poseer unas propiedades más cercanas a las del hueso, estas siguen siendo mayores, originando una gran diferencia de rigidez (módulo de Young) entre el implante y el hueso (20 GPa para el hueso cortical y 1 GPa para el trabecular/esponjoso) [34, 35]. 2. Esfuerzos de fatiga y de desgaste, los cuales limitan la vida en servicio del propio material, comprometiendo su éxito clínico [36-38]. En este contexto, se requiere la implementación de modelos y criterios de diseño enfocados a la prevención del daño y no a su tolerancia [39, 40]. Por otro lado, también destaca su alta sensibilidad a la entalla, de manera que no es un material adecuado para funcionar como superficie de apoyo [6]. Los fallos biofuncionales están fuertemente relacionados con la integración entre el implante y el hueso [41-43]. Son causados principalmente por: Introducción 49 1. Los micro-movimientos que se generan en la intercara material-tejido óseo, que generan una capa de tejido fibroso que encapsula al implante, conllevando el aflojamiento de éste y, por tanto, a una pérdida de su funcionalidad, así como a una osteointegración deficiente [44]. 2. La adhesión de microorganismos a su superficie, originando así la aparición de infecciones que afectan a la correcta osteointegración, fundamentalmente ocasionadas por la acumulación de placa dentobacteriana durante la cirugía o por una deficiente cicatrización (fallos tempranos) o por la formación y crecimiento de dicha placa con el paso del tiempo (fallos tardíos), pudiendo provocar una peri-implantitis [45]. 1.3 Materiales metálicos porosos Uno de los fines de esta Tesis Doctoral es el empleo de materiales metálicos para afrontar uno de los problemas biomecánicos del titanio: el apantallamiento de tensiones. El fenómeno de apantallamiento de tensiones se enfoca en las propiedades mecánicas del material, en concreto, en el módulo de Young. El objetivo es reducir la diferencia entre la mayor rigidez del material en relación con la del hueso. En este sentido, se encuentran diferentes vías: - Obtención de aleaciones con un módulo de Young menor a 50 GPa. Estas aleaciones, además, permiten mejorar otras propiedades, como la resistencia a rotura [46, 47]. - Empleo de Ti poroso, de forma que se obtienen adicionalmente propiedades biofuncionales. Por un lado, la introducción de la porosidad se traduce en una reducción directa de la rigidez del material [36, 48-54]. Por otro, dicha porosidad favorece el crecimiento del hueso hacia el interior de los poros interconectados entre sí (bone in-growth) [53, 55]. De esta forma, se logra la infiltración del hueso, mejorando a su vez la adhesión implante-tejido óseo. El control de parámetros como la distribución, fracción volumétrica de la porosidad (40 % para hueso cortical y 70 % para trabecular), así como del Capítulo 1 50 tamaño, tipo (abiertos o cerrados) y morfología de los poros, resulta ser imprescindible a la hora de conseguir unas propiedades mecánicas adecuadas a la función que ha desempeñar el material [51]. Los materiales porosos son aquellos que poseen una parte significativa de su volumen ocupado por aire. En función de dicha fracción volumétrica, se diferencian en sólidos porosos (< 70%) y en sólidos celulares o espumas (> 70 %). La distribución de porosidad, a su vez, permite establecer también una distinción en cuanto a tipo de materiales. Por un lado, el material poroso monolítico presenta una porosidad homogénea en las tres direcciones del espacio. Por el contrario, los materiales porosos variables o gradientes muestran un reparto heterogéneo de la porosidad con una dirección preferencial en la variación de la distribución y características de sus poros. Son conocidos como “functionally graded materials”. P. Trueba, en su Tesis Doctoral “Desarrollo de titanio con porosidad gradiente radial y longitudinal para aplicaciones biomédicas” [51], documenta hasta 34 técnicas para fabricar metales porosos, comprendiendo como punto de partida el empleo de un metal líquido, polvo metálico, preforma metálica o una suspensión de polvo metálico. En cuanto al procesado, las rutas utilizadas son Técnicas de Moldeo (TM) o de Pulvimetalurgia (PM). La Tabla 3 recoge las diferentes técnicas de fabricación de materiales porosos reportadas en la literatura, así como el tipo de porosidad que generan. Tabla 3. Clasificación de las técnicas para la obtención de materiales metálicos porosos, en función del estado del material de partida. Nota: Todas las referencias de esta Tabla se encuentran en la Tesis Doctoral de P. Trueba [51]. Capítulo 1 52 En este contexto, la porosidad en un implante resulta ser un factor determinante no sólo para reducir el módulo de Young, sino en la proliferación de células madre mesenquimales, en la osteogénesis y en favorecer el crecimiento del hueso hacia el interior del implante (bone in-growth) [6]. En particular, la porosidad interconectada permite, a su vez, el paso de sangre y nutrientes esenciales para el crecimiento óseo [8]. Según la literatura, el tamaño de porosidad mínimo que garantiza el crecimiento del tejido hacia el interior del material es de 100 µm [10, 56, 57]. Otros estudios, sin embargo, fijan este tamaño a partir de las 50 µm [8, 56]. Las propiedades mecánicas dependen también de la orientación de los poros, siendo mejores en la dirección de estos y no en la perpendicular, cuando los poros son alargados [32]. Entre las técnicas citadas para la obtención de materiales porosos, en la presente Tesis Doctoral se emplea la técnica de espaciadores para fabricar los substratos porosos. Los “espaciadores” son materiales que, al mezclarse en cantidades adecuadas con el polvo metálico y prensar dicha mezcla por PM convencional, se eliminan fácilmente mediante diferentes procesos, generando un poro en el lugar de la partícula de espaciador (Figura 8). Permite controlar parámetros como la porosidad homogénea y el tamaño, además de destacar por la facilidad de eliminación del espaciador en las etapas previas y del proceso de sinterizado [52, 53, 58], Algunos de estos materiales son el magnesio, sacarosa, PVA, PMMA, NaF [59-66], bicarbonato de amonio, carbamida y NaCl [54, 67]. Introducción 53 Figura 8. Proceso de fabricación que emplea la técnica de espaciadores [61]. La técnica de espaciadores presenta una gran potencialidad, ya que permite generar un gradiente longitudinal de porosidad, tanto en proporción como en tamaño de poro mediante la apilación de varias capas. Adicionalmente, posibilita la aparición de canales o poros dirigidos (micro-panales) gracias al uso de fibras (metales o polímeros en forma de varillas) en lugar de partículas [68, 69]. Otra de sus aplicaciones es la combinación con la técnica HIP (Hot Isostatic Pressing) y su variante de encapsulamiento libre CF-HIP (Capsule-Free Hot Isostatic Pressing), empleando espaciadores de NaF y NH4(HCO3) [70, 71]. 1.4 Mejora de la osteointegración Los fallos biofuncionales tempranos que tienen lugar durante la intervención quirúrgica (sobrecarga y contaminación) están causados, principalmente, por el equipo médico. Sin embargo, los fallos tardíos están influenciados por las propiedades superficiales del material. La interacción entre el tejido óseo y el implante, así como la naturaleza físico-química de la superficie del material y la evitación de una posible colonización bacteriana se encuentran estrechamente relacionados con una buena osteointegración. Para combatir los problemas biofuncionales se vienen implementado diferentes técnicas cuyo fin es favorecer tanto la osteointegración como la cicatrización del tejido circundante, disminuyendo así el riesgo de proliferación de bacterias [72]. En Capítulo 1 54 esta Tesis Doctoral se abordan distintas vías para mejorar la osteointegración, así como para combatir la colonización bacteriana del Ti. 1.4.1 Técnicas de modificación superficial del titanio La optimización de la topografía y la química del material por diversas vías han sido las principales líneas seguidas en la consecución de una mejor osteointegración. Una de las vías seguidas, de carácter más biológico, consiste en la previa adición de proteínas (fibronectina o vitronectina), así como de moléculas que promuevan la respuesta celular con la superficie del implante, formando una matriz de colágeno sobre el mismo [41-43]. Otras técnicas empleadas son: La topografía (curvatura, rugosidad, porosidad, protuberancias, etc.) resulta ser una de las características esenciales para tener en cuenta cuando se realiza una implantación, ya que permite el anclaje del tejido óseo al material. Una topografía adecuada reduce los tiempos de osteointegración, consiguiendo una buena transmisión de cargas entre hueso e implante, alargando así la vida útil de este último y reduciendo la reabsorción ósea [73]. Se distinguen dos escalas en cuanto a la topografía de un material que afectan al proceso de integración del implante. La primera, a nivel micro, mientras que la segunda es a nivel nano. Varios estudios han discutido la influencia de una y otra, destacando el efecto positivo de la escala nanométrica en términos de rugosidad [74, 75]. Sin embargo, se ha observado que el verdadero potencial se encuentra en la combinación de ambas escalas micro y nano [76]. Entre los métodos de modificación superficial encontrados en la literatura se encuentran diversas técnicas, las cuales se clasifican en función del tipo de proceso en el que se basan. Esta clasificación se muestra en la Figura 9. Introducción 55 Figura 9. Clasificación de los distintos métodos de modificación superficial encontrados en la literatura. Los métodos mecánicos modifican la topografía de los materiales a escala micrométrica. Sus objetivos se centran en la eliminación de material contaminado de la superficie, la obtención de distintas rugosidades y, en el caso de implantes, en el aumento de puntos de anclaje para el tejido óseo [77]. Por su parte, los métodos litográficos se basan en la impresión por estampación de una matriz, haciendo posible la creación de diseños geométricos precisos a escala micro y nano-métrica a partir de ciertos patrones. De esta forma, es posible Capítulo 1 56 que se biofuncionalice la superficie de un material para promover la adhesión celular sobre el mismo [78]. Los métodos físicos modifican las características de la superficie del material sin la presencia de reacciones químicas. Por su parte, modifica la capa superficial o la deposita mediante energía térmica, cinética o eléctrica [79]. Los electroquímicos, sin embargo, se basan en la conexión de un dispositivo metálico al polo positivo de un circuito eléctrico, sumergiéndolo posteriormente en una solución electrolítica que contiene sustancias iónicas y/u oxidantes. Estas sustancias se incorporan a la superficie del substrato, variando así sus propiedades [79] . Dentro de los métodos electroquímicos, las técnicas se clasifican en anódicas o catódicas. Los métodos físico-químicos implican a la vez procesos tanto físicos como químicos para la modificación de la superficie. La síntesis por irradiación dirigida (directed irradiation synthesis, DIS), permite generar patrones a escala nano y mesométrica a partir de partículas cargadas sobre un semiconductor bajo condiciones no térmicas. La técnica DIS [80] utiliza haces de iones o corrientes que, al dirigirse a la superficie del material, generan combinaciones entre las partículas procedentes del haz y los átomos de la superficie, creando gradientes de especies reactivas con una nano-estructura determinada, que modifican la química de ésta [81, 82]. Puede aplicarse sobre metales, materiales compuesto y polímeros. El control de la topografía a nanoescala, depende del control de parámetros relacionados con el haz de iones, la energía, los gases empleados y la fluencia. Como resultado, se mejora tanto la adhesión como la proliferación celular [13]. Finalmente, los métodos químicos, en sentido estricto, engloban los tratamientos químicos, electroquímicos y bioquímicos. Sin embargo, debido al gran desarrollo de los electroquímicos, estos se pueden agrupar aparte. Mediante los métodos químicos se pretende incrementar la biocompatibilidad, bioactividad y conductividad ósea [79]. Por otro lado, se aumenta la resistencia frente a corrosión y se evita la Introducción 63 está limitada a zonas que no requieran grandes esfuerzos mecánicos. No obstante, estudios recientes han demostrado la posibilidad de ser combinada con metales para aumentar su resistencia [7, 22, 103]. a.2) La HA y el hueso La relación Ca/P del mineral de la matriz ósea tiene un valor de 1.67, muy cercano al del fosfato cálcico de la HA [7, 109-111]. Por su parte, la HA se considera un elemento acelerador de la formación del tejido óseo [8, 109], y su semejanza con el mismo ha conllevado al amplio desarrollo de la investigación de la HA sintética. Conocer la estructura jerárquica del hueso y sus materiales, así como sus propiedades mecánicas, es indispensable para comprender la importancia de la HA y su rol en la formación ósea (ver Figura 12). El hueso es una cerámica natural compuesta por fibras de colágeno que contienen materiales inorgánicos nanocristalinos en forma de varillas de 25-50 nm de longitud [103]. Este material inorgánico está formado, principalmente, por la “apatita biológica” o hidroxiapatita [110]. Por tanto, el hueso está constituido por un 20% en masa de colágeno, 69% de fosfato cálcico y un 9% de agua, así como por pequeñas cantidades de otros materiales orgánicos (proteínas, polisacáridos y lípidos) [10, 104, 107]. Capítulo 1 64 Figura 12. Estructura jerárquica del hueso [103]. El fosfato cálcico del hueso está formado por una parte amorfa (ACP) y por HA cristalizada, de forma que los cristales presentan una forma de platos o agujas con dimensiones de 40-60 nm de longitud, 20 nm de ancho y 1.5-5 nm de espesor aproximadamente [10, 107]. Los cristales se colocan sobre las fibras de colágeno, formando láminas concéntricas alrededor de los vasos sanguíneos y generando así el hueso cortical, que se alimenta a través de los conductos de Havers-Volkman. Por su parte, en el hueso trabecular o esponjoso la disposición tiene lugar en forma de contenedores lagunares de lechos polimorfos, y se nutre mediante lagunas vasculares [112]. En relación con las propiedades mecánicas del hueso, el componente orgánico (colágeno) confiere propiedades típicas de los polímeros, como son la alta tenacidad y el bajo módulo de Young. Por su parte, los inorgánicos (HA) otorgan cierta rigidez, de manera que la combinación resultante de ambos componentes puede asemejarse a un composite de alta tenacidad y módulo de Young relativamente alto Introducción 65 [10, 107]. Cabe destacar que la rigidez del hueso aumenta conforme se incrementa el contenido mineral. La Tabla 4 recoge las características mecánicas principales del hueso lamelar. Se observa que, parámetros tales como la humedad, el modo de aplicación y dirección de la carga, así como el tipo de hueso tienen una gran influencia en las propiedades mecánicas del mismo. Otros factores que afectan al comportamiento son la porosidad, orientación de las fibras de colágeno, la densidad del hueso y la disposición de los cristales de apatita. De esta forma, a mayor densidad ósea aumenta la resistencia a compresión y el módulo de elasticidad [10]. Tabla 4. Propiedades mecánicas del hueso cortical [10] La HA, debido a su similitud con la fase mineral de la matriz ósea, promueve la absorción de proteínas de la matriz extracelular, favoreciendo así la adhesión, proliferación y diferenciación de los osteoblastos que se encuentran alrededor del implante. De esta forma, los osteoblastos crecen desde el implante hacia el hueso, generando el hueso lamelar, una vez se ha ocupado todo el espacio entre el hueso y el implante, evitando al mismo tiempo la formación del tejido fibroso en la interfase implante-hueso [109]. Dentro de las funciones de la HA, cabe destacar su relevancia en el ámbito dental. La sustancia más dura del cuerpo es el esmalte (enamel), compuesto en un 97% en peso en cristales de HA (en forma de estructuras de varilla o prismas de 4 mm de Capítulo 1 66 diámetro) y el porcentaje restante en elementos orgánicos y agua. La dentina (dentine), por su parte, es la segunda sustancia más dura, y es muy similar al hueso cortical (Figura 13). En cuanto a las propiedades mecánicas, los dientes soportan de manera cíclica cargas de unos 20 MPa, por lo que requieren de altas propiedades mecánicas para su correcto funcionamiento (Tabla 5) [10]. Figura 13. Estructura del diente [10]. Introducción 67 Tabla 5. Propiedades mecánicas del diente [10] a.3) Orígenes de la HA Las vías de obtención de HA se dividen en dos: de forma natural y de forma sintética. La HA natural puede obtenerse a partir del hueso y del diente humano, de diferentes especies de mamíferos, así como de otros seres vivos marinos como el coral o la estrella de mar [10, 112]. Por otra parte, también puede obtenerse a partir de rocas sedimentarias o metamórficas que se encuentran en la naturaleza [10]. En cuanto a la HA obtenida de mamíferos, la composición química no presenta variaciones, mientras que sí se han observado cambios sustanciales en cuanto a la porosidad (Tabla 6) [112]. Capítulo 1 68 Tabla 6. Intervalos de tamaño de poro para HA natural de distintos orígenes [112]. La HA procedente del coral marino (HA coralina) se obtiene a partir de una transformación química del esqueleto coralino (CaCO3). La porosidad obtenida resulta ser uniforme, con un alto grado de interconexión tridimensional (en torno al 50-65 %), y con un tamaño de poro de unas 200 µm. Esta microestructura, junto con su composición química, le confieren una gran similitud con el hueso humano. Dicha reacción consiste en un intercambio hidrotérmico a 170 ºC y presiones que alcanzan los 10 MPa en una disolución de iones fosfato [56, 110]. Dentro de la HA coralina, destaca la HA-200 obtenida de los corales Porites (Cuba), con un tamaño de poro entre 190-230 µm. Como ventajas, presenta una composición muy similar a la del hueso tanto en elementos constituyentes como minoritarios, además de una relación Ca/P de 1.67, alta pureza y un contenido de iones CO32- por debajo del 2% [110]. No obstante, este tipo de HA presenta dos grandes inconvenientes. Por un lado, la cantidad limitada de coral marino disponible y, por otro lado, la dificultad para controlar la porosidad [56]. La Tabla 7 muestra las diferencias en cuanto a composición química de la HA humana y de la HA-200 [110]. Introducción 69 Tabla 7. Composición química de la fase inorgánica del hueso, el esmalte, la dentina y la HA- 200 [110]. En cuanto a la HA sintética, se puede obtener a través de diversas rutas de síntesis química, aunque presenta unas propiedades mecánicas deficientes a comparación de la natural, como baja resistencia y fácil solubilidad [11]. a.4) Síntesis de la HA Dentro de las rutas de síntesis de HA, existen dos vías principales para preparar los polvos de este material: las reacciones en estado sólido y los métodos húmedos. En función de la técnica utilizada, propiedades como el grado de cristalinidad, la morfología del polvo y su superficie específica, así como la estequiometría serán distintos [10, 107]. En general, las reacciones en estado sólido generan un producto estequiométrico y cristalizado. Sin embargo, se caracterizan por largos tiempos y altas temperaturas en el tratamiento térmico. Por su parte, los métodos húmedos se dividen en tres grupos: precipitación, técnica hidrotermal e hidrólisis de otros fosfatos de calcio alto. En el caso de la precipitación, Capítulo 1 70 la temperatura no supera los 100 ºC y forma cristales a escala nanométrica en forma de agujas, cuchillas, varillas o partículas equiaxiales. Sin embargo, el grado de cristalinidad y la estequiometría (relación Ca/P) obtenidas se encuentran por debajo de los valores óptimos y establecidos para una buena HA, al contrario que ocurre con la técnica hidrotermal. Esta técnica se caracteriza por formar unos cristales en el rango de los nm a los mm. En cuanto al último grupo de los métodos húmedos, la hidrólisis de diversos fosfatos de calcio requiere de temperaturas menores a 100 ºC, obteniendo HA del orden de micrómetros en forma de cuchillas o agujas, con el inconveniente de una relación de Ca/P que varía entre 1.50 y 1.71 [10, 105]. El problema común a todos los métodos húmedos es la presencia de iones carbonato y de otras impurezas en la HA formada. Sin embargo, existen otros métodos alternativos a las rutas mencionadas, como son el sol-gel, la electrocristalización, el método de flujo, pulverización-pirólisis, liofilización, irradiación de microondas, método mecano-químico y el proceso de emulsión, entre otros [10]. En general, el sinterizado de la HA conlleva la pérdida de radicales OH- y la posible descomposición de ésta a altas temperaturas, dificultando así el proceso. En este contexto, la máxima temperatura del proceso de sinterizado de la HA depende en gran medida de la atmósfera en la que se realiza. Así, si la humedad aumenta, la HA se estabiliza a altas temperaturas sin que se produzca su descomposición, alcanzando incluso los 1300 ºC. Por otro lado, se ha observado la influencia de la relación Ca/P, de forma que para valores en torno al 1.68, la HA no se descompone a temperaturas cercanas a los 1450 ºC con duraciones superiores a 3 h [107]. a.5) Cristalinidad de la HA El grado de cristalinidad de la HA resulta ser determinante a la hora de la reabsorción de ésta, de forma que, a mayor grado de cristalinidad, la HA se reabsorbe de manera más lenta. Este hecho implica un mayor tiempo para la integración del implante. Por otro lado, las sales de calcio amorfas presentan velocidades de absorción demasiado rápidas, conllevando un anclaje fibroso del Introducción 71 implante. Por ello, se hace indispensable la consecución de un equilibrio entre la HA y las sales de calcio que permitan una integración óptima del material implantado. Como soluciones a ello, podría fabricarse una estructura gradiente que contuviera HA cristalina en las capas interiores y sales de calcio en las exteriores, de forma que la parte externa agilizaría el proceso mientras que la interna aseguraría una buena integración con el hueso. Estudios recientes han demostrado que los fosfatos de calcio con cierto contenido en estroncio (Sr) propician la adhesión y proliferación de células osteoprecursoras, favoreciendo así la actividad osteoblástica. En cuanto a estudios in vivo, se ha observado que este elemento favorece tanto el crecimiento óseo como la osteointegración [113]. Actualmente en el mercado, la cristalinidad de los implantes varía entre el 50 y 90 % [109]. Por otro lado, el avance de la nanotecnología ha desarrollado HA sintética en forma de polvos nanométricos, los cuales presentan una mejor sinterizabilidad y densificación como consecuencia de una mayor área superficial. De esta forma, se ha logrado mejorar la resistencia a fractura del material y otras propiedades mecánicas [103], así como un mayor aumento en la adhesión de osteoblastos por tratarse de un nanomaterial [112]. a.6) Propiedades mecánicas de la HA Para los implantes que requieren el soporte de cargas mecánicas y que están fabricados de HA se suele emplear HA densa, ya que su resistencia es superior a la de la porosa [107]. Las propiedades mecánicas más importantes de la HA quedan recogidas en la Tabla 8. Cabe destacar que, dichos valores presentan una gran dispersión. Esto se debe a la micro-porosidad inherente al proceso de fabricación de la HA densa, así como al tamaño de grano, las impurezas presentes y la distribución de fuerzas del material. Por otro lado, se observa que la resistencia óptima se obtiene para la relación Ca/P de 1.67 [10, 107]. Capítulo 1 72 Tabla 8. Propiedades mecánicas de la HA densa [10, 107]. Propiedades mecánicas de la HA densa Resistencia a compresión (MPa) 120-900 Resistencia a flexión (MPa) 38-250 Resistencia a tracción (MPa) 38-300 Módulo de Young (GPa) 35-120 Dureza Vickers (GPa) 3-7 Módulo de Weibull 5-18 Tenacidad a fractura (MPa·m1/2) 0.8-1.2 Otro de los factores que más influyen en las propiedades mecánicas es la temperatura del proceso de sinterizado. A mayor temperatura, se obtienen mayores resistencias de compresión, flexión, torsión y módulo de elasticidad. Cabe destacar que, para temperaturas comprendidas entre los 1000-1100 ºC, la HA muestra propiedades de superplasticidad, con un mecanismo de deformación basado en el deslizamiento de los límites de grano [10, 107]. La Tabla 9 muestra la variación de estas propiedades en función de la temperatura empleada en el tratamiento térmico. Tabla 9. Propiedades mecánicas de la HA sintética tras el proceso de sinterizado a diferentes temperaturas [111]. La HA porosa, por su parte, presenta peores propiedades mecánicas (Tabla 10), como una peor resistencia a fatiga. Sin embargo, resulta ser mejor que la densa en cuanto a ser más osteoconductora y más fácilmente reabsorbible. Introducción 79 El desarrollo de esta técnica ha posibilitado la obtención de una gran diversidad de materiales, como los basados en sílice (BG) [1, 122-125], en fosfatos (materiales reabsorbibles) [126-132], metales (Fe-O, Ti-O, Zn-O) [1, 133-137], híbridos orgánicos e inorgánicos (formados por fases distintas donde tienen lugar distintas reacciones químicas) [1, 138], y basados en fosfatos de calcio (CaP) [1]. Entre los fosfatos de calcio más comunes sintetizados por esta técnica destaca, como se ha comentado antes, la HA. Se genera a partir de la mezcla a nivel molecular de precursores de calcio y de fósforo, mejorando la homogeneidad química del mineral a comparación de otras técnicas convencionales como la precipitación húmeda, la síntesis hidrotermal y las reacciones de estado sólido [139, 140]. La ausencia de un medio anhidro, característico de las rutas basadas en alcóxidos, minimiza la precipitación de fases CaP indeseables, focalizándose así en la especie deseada [1, 121]. En cuanto a la temperatura del proceso, esta depende de los precursores empleados, en términos de actividad y naturaleza química. Entre los precursores del fósforo más destacados se encuentran el trietilfosfito y el trietilfosfato [139, 140]. Sin embargo, este último conlleva una cinética de formación de HA pobre, requiriendo un tiempo prolongado de reacción y alta temperatura de solución. d.2) Formación de HA por sol-gel y sus ventajas Dentro de la técnica de sol-gel, existen distintas variantes para la producción de HA. Estas variantes comprenden desde el método propiamente dicho [141, 142]hasta los precursores de fósforo (trietilfosfito [141, 142], pentóxido de fósforo [21]) y calcio (nitrato de calcio tetrahidratado [142, 143]) empleados. En general, se suele usar como disolvente agua o etanol [22]. La formación de HA tiene lugar tras cinco etapas. La primera de ellas es la hidrólisis y policondensación de los precursores. Para ello, se emplean metales alcóxidos (MOR), formados por un metal (M), un óxido (O) y un grupo alcalino (R). Los metales se disuelven en alcohol y se hidratan añadiendo agua, de forma que las moléculas Capítulo 1 80 hidratadas se unen mediante condensación repetidas veces hasta formar el sol (M- O-M). Seguidamente, tiene lugar la gelación, donde las partículas coloidales del sol se unen de forma gradual hasta obtener una red tridimensional que alcanza un tamaño macroscópico (gel). Por otro lado, la evaporación del disolvente implica también el desarrollo de esta etapa. La tercera etapa, denominada envejecimiento, conlleva la variación de las propiedades del gel, debido a una policondensación prolongada, la disolución y la reprecipitación de monómeros y oligómeros. La deshidratación del gel es el cuarto paso, de forma que se obtiene un gel seco, así como la correspondiente contracción de este. Es importante el control de este punto del proceso, ya que pueden aparecer tensiones residuales y deformaciones. Finalmente, el gel amorfo experimenta una densificación y una cristalización, con el fin de obtener un material con porosidad reducida y con estructural cristalina. Para ello, el gel se sinteriza mediante un tratamiento térmico [96]. De entre las numerosas ventajas que ofrece la técnica de sol-gel, permite a parte de la formación de HA, el depositarla como recubrimiento, obteniendo una capa fina y químicamente homogénea gracias a procesos que tienen lugar a escala nanoscópica [141-143]. En cuanto al grosor de la capa, puede asemejarse al obtenido por deposición catódica (alrededor de 1 µm) [141]. En cuanto al coste, resulta ser una técnica económica y sencilla, a diferencia de otras nombradas anteriormente, como el plasma-espray [144]. Por otro lado, permite realizarse a bajas temperaturas gracias al pequeño tamaño de partícula, de forma que permite el uso de materiales que se degradan o alteran a temperaturas altas, así como la inclusión de biomoléculas, proteínas, medicamentos, etc. Asimismo, evita el agrietamiento y la existencia de tensiones residuales en el caso de recubrimientos, consecuencias derivadas de las diferencias del coeficiente de dilatación térmica (TEC) de substrato y recubrimiento [1]. Introducción 81 Otra de sus ventajas es que permite realizar recubrimientos sobre formas complejas e irregulares, con mayores fuerzas de adhesión al substrato que los recubrimientos biomiméticos [21, 22, 143]. La resistencia, así como la posibilidad de controlar la microestructura y composición de la capa obtenida, permiten obtener la porosidad, morfología, tamaño y otras características de la superficie que se deseen [1]. La técnica de sol-gel consigue grandes niveles de biocompatibilidad, gracias a la superficie específica (lo que permite la posible liberación dosificada de medicamentos), y a su riqueza química, que posibilita la funcionalización mediante biomoléculas adecuadas [1]. d.3) Técnicas de deposición vía sol-gel Entre las técnicas de deposición, destacan principalmente el recubrimiento por inmersión y el recubrimiento por centrifugación [121]. - Recubrimiento por inmersión Esta técnica, conocida como dip coating, ha sido ampliamente estudiada para recubrir materiales biometálicos, ya que mejora la adhesión [22]. Consta de tres etapas. La primera de ellas es la inmersión en el sol (Figura 17-1), para retirarlo posteriormente a una velocidad controlada de pocos cm/min (extracción, Figura 17-2) [5, 21, 121]. Gracias a la velocidad de extracción, así como al número de inmersiones y a la concentración del sol es posible controlar el espesor de la capa (en torno a 0.05-15 mm) [22]. Finalmente, tiene lugar el secado (Figura 17-3) y sinterizado de la muestra, densificando así el recubrimiento adherido al substrato mediante un tratamiento térmico. Capítulo 1 82 Figura 17. Etapas del recubrimiento por inmersión (1) inmersión, (2) extracción y (3) secado [21, 22]. Es una técnica sencilla y rápida, de bajo coste y que permite una buena homogeneidad del revestimiento a superficies irregulares [21, 22]. - Recubrimiento por centrifugación El recubrimiento por centrifugación (spin coating), permite aplicar capas finas a substratos planos (discos o placas) mediante un equipo llamado spin coater o spinner [145]. Actualmente es una técnica en desarrollo, al contrario que la técnica de recubrimiento por inmersión. Tiene dos variantes. La primera, consiste en verter la solución sobre el substrato mientras éste gira. La segunda, por su parte, es similar al dip coating explicado anteriormente, con la salvedad de que, en la etapa de extracción, el substrato se extrae a una velocidad controlada al mismo tiempo que gira gracias a la acción de un motor. Esta última es conocida como método de inmersión y centrifugación. En ambas variantes, tienen lugar cuatro etapas principales: deposición, centrifugado, escisión y evaporación (Figura 18). La evaporación del disolvente y el drenaje rotacional son los que provocan la deposición propiamente dicha. Finalmente, es necesario someter a la muestra a un tratamiento térmico para el Introducción 83 sinterizado del recubrimiento. Para controlar el grosor de la capa, el proceso puede ser repetido reiteradas veces [5]. Figura 18. Etapas de la deposición de recubrimiento por centrifugación. (1) deposición, (2) centrifugado, (3) escisión y (4) evaporación [5]. e) Combinaciones de HA con otros materiales El campo de los composites basados en HA resulta ser muy amplio, abarcando desde las cerámicas hasta los polímeros [10, 107]. En el caso de los composites cerámicos basados en HA, se aumentan sus propiedades mecánicas (dureza y resistencia), implicando también como efecto indeseable el aumento del módulo de Young [10]. Además, el hecho de introducir elementos externos en la matriz de HA puede disminuir la bioactividad, influir de manera negativa en la biocompatibilidad y facilitar la descomposición del HA en fosfato de calcio. La circona con pequeñas partículas de itrio (ZrO2(Y2O3)) mejora la resistencia de la HA, aumentando la resistencia a flexión y la tenacidad a fractura con el contenido en ZrO2. Sin embargo, su uso está limitado debido a que el calcio de la HA estabiliza la circona durante el proceso de sinterizado [107]. Capítulo 1 84 Los composites con vidrios bioactivos, por el contrario, mejoran las propiedades mecánicas sin comprometer la bioactividad y la biocompatibilidad, aunque presentan también como inconveniente al promover la descomposición de la HA en grandes cantidades de fosfato cálcico. No obstante, los composites cerámicos basados en HA no tienen aún gran aplicación biomédica, debido a sus dificultades de fabricación y de las limitados propiedades mecánicas que poseen. Los composites poliméricos, por el contrario, poseen una gran variedad de combinaciones distintas con sus correspondientes propiedades. En general, aumentando el contenido de HA, se incrementa el módulo de Young, así como la bioactividad. Sin embargo, la ductilidad disminuye. Un ejemplo de estos composites poliméricos es la combinación HA/PE (polietileno). Se caracteriza por tener una transición dúctil-frágil con un contenido en volumen del 40-45 % de HA y un módulo de Young de 1-8 GPa. En este tipo de sistemas, se observa que la tenacidad a fractura alcanza valores mayores para contenidos por debajo del 40 % de HA que los del hueso cortical, siendo similares al mismo para un contenido entre el 40-45 %. Sin embargo, cabe destacar que estos compuestos no son biodegradables, y que al ser parcialmente bioinertes, se inhibe en cierta medida la unión implante – hueso [10, 107]. Otro de los composites poliméricos más conocidos es el HA/colágeno, cuya composición es muy similar a la del hueso. En conjunto, este composite presenta una osteoconducción mayor que la HA o el colágeno de manera individual. Como ventaja, cabe destacar su biodegradabilidad, así como su posibilidad de ser controlada. Con respecto a sus deficientes propiedades mecánicas [10], presenta un bajo módulo de Young (2 MPa) y una resistencia a tracción de unos 6.5 MPa [107]. Este composite suele ser muy efectivo al emplearse como relleno de defectos en huesos largos. Introducción 85 Vidrio bioactivo a) Características principales de los vidrios bioactivos Los vidrios bioactivos comprenden una gran variedad, compuestos principalmente por un sistema de SiO2-CaO-MgO-Na2O-K2O-P2O5 [20], siendo su estructura atómica la representada en la Figura 19. El primero de ellos se conoce como Bioglass® 45S5, descubierto por L. Hench en 1969 [146]. Figura 19. Unidades estructurales básicas de SiO4-, constituidas por enlaces Si-O-Si. *NBO sin puentes de hidrógeno, BO con puentes de hidrógeno [146]. La principal característica de este tipo de biomateriales es su capacidad de precipitar HA en la superficie del vidrio cuando se pone en contacto con fluido fisiológico, haciendo posible la unión con el tejido óseo. Químicamente, la HA que se forma es muy similar a la del hueso, favoreciendo así la osteointegración del implante. La formación y precipitación de HA sobre el vidrio bioactivo tiene lugar en cinco pasos principales. En primer lugar, se produce un intercambio rápido de iones Na+ o Ca2+ con H+ en la solución (Ecuación 1), de forma que se crean uniones de silanol (Si-OH) en la superficie del vidrio, donde además se incrementa el pH [25]. 𝑆𝑖 − 𝑂 − 𝑁𝑎++ 𝐻++𝑂𝐻−→𝑆𝑖 −𝑂𝐻++𝑁𝑎+(𝑎𝑞) + 𝑂𝐻− Ecuación 1. Intercambio de iones y formación de uniones silanol en la precipitación de HA sobre la superficie de vidrio bioactivo Capítulo 1 86 El pH alto conlleva que los iones OH- rompan la red de sílice (Si-O-Si). De esta forma, se produce un aumento de Si-OH en la interfase vidrio-solución, de forma que posteriormente tiene lugar la condensación de estos en la superficie del vidrio (polimerización de la capa rica en sílice). Seguidamente, tiene lugar una migración de los grupos Ca2+ y PO43-, formando una película rica en CaO-P2O5 en la capa de sílice. A partir de este momento, se incorporan hidroxilos y carbonatos desde la solución, formándose así la HA tras la cristalización de la película generada [25]. En cuanto a la adhesión ósea, tiene lugar tras la adsorción de proteínas por la propia capa de HA, de forma que las células comienzan a unirse para posteriormente diferenciarse y formar la matriz ósea [25]. a.1) Bioactividad La composición del vidrio tiene un papel primordial en la formación de HA y, por tanto, en el grado de bioactividad. En este contexto, bajos contenidos en silicio implican una mayor disolución del vidrio, como consecuencia de una menor conexión de la red de sílice y una mayor facilidad en su rotura [25]. La Figura 20 muestra la variación en la composición de la superficie del vidrio bioactivo sobre la que se deposita la HA. Se genera una estructura multicapa, en la que en la parte interna el contenido en Si es mayor, mientras que en la interfase vidrio bioactivo-SBF aumenta el contenido en Ca y P [20]. Introducción 87 Figura 20. Sección de una muestra maciza de vidrio bioactivo tras 2 semanas de inmersión en fluido fisiológico simulado (SBF): imagen SEM (izquierda) y su correspondiente microanálisis EDS (derecha) [20]. El vidrio bioactivo, a diferencia del resto de biomateriales, presenta no sólo la capacidad de osteoconducción, sino también la de osteoinducción. La primera se caracteriza por lograr el crecimiento celular a partir de células ya existentes, mientras que la segunda genera nuevas células óseas en la intercara implantehueso. Por otro lado, presenta otras propiedades, como favorecer la neovascularización (formación de nuevos vasos sanguíneos) [147]. Este hecho resulta ser crucial en la formación de nuevo tejido. En concreto, el cobre ha demostrado promover la neovascularización, por lo que ha considerado su inclusión en matrices de vidrio bioactivo. De esta forma, conforme el vidrio se disuelve, los iones cobre se liberan favoreciendo así la creación de nuevos vasos [148]. Otras de las características que presentan son la capacidad antiinflamatoria y antibacteriana [147], disminuyendo así el riesgo de infecciones que conlleva el uso de implantes, y, por tanto, su fallo [149]. Capítulo 1 88 a.2) Propiedades mecánicas Los implantes requieren un buen comportamiento mecánico una vez que se encuentran en el interior del cuerpo humano, ya que están sometidos a multitud de cargas externas. Sin embargo, los vidrios bioactivos, en tanto que materiales cerámicos, presentan unas propiedades mecánicas deficientes, comprometiendo así su empleo y aplicaciones [147]. Presentan una alta fragilidad, pudiendo ocasionar la fractura del implante. Debido a ello, se suelen emplear como estructuras porosas (scaffolds) cuya función es la regeneración de tejido óseo, siempre y cuando no exijan elevadas propiedades mecánicas. A título de ejemplo, algunas de las propiedades mecánicas del BG bioactivos quedan recogidas en la Tabla 11. Debido a las limitaciones mecánicas que poseen estos biomateriales, la ingeniería de diseño de implantes ha optado por emplearlos como recubrimientos de materiales metálicos, de forma que se aprovechan tanto las propiedades mecánicas del metal como las propiedades bioactivas de los vidrios para obtener una buena osteointegración. Sin embargo, existe aún un inconveniente a resolver: la unión deficiente entre recubrimiento y substrato en la intercara. Tabla 11. Propiedades mecánicas del Bioglass® 45S5 [150]. Propiedad Valor Resistencia a la flexión 41 MPa Tenacidad a la fractura 0.57 MPa·m1/2 Dureza 620 HV Módulo de Young 37 GPa a.3) Rugosidad superficial La superficie específica, porosidad del vidrio y tamaño de partícula generan una determinada rugosidad superficial de los vidrios bioactivos, que se encuentra estrechamente ligada a la bioactividad. Mayor rugosidad en los vidrios bioactivos Introducción 95 Se suelen emplear en la regeneración de tejidos de la piel, vejiga, vías respiratorias, cartílago y hueso [167]. c.2) Partículas de vidrio bioactivo Las partículas de vidrio bioactivo se suelen usar en cirugía ortopédica y odontología. Son excelentes reparadores de defectos óseos, ya que tienen la capacidad de regenerar el propio tejido. El tamaño de las partículas se encuentra entre las 90- 710 µm, y su empleo comenzó a sustituir la técnica del autotrasplante. Algunos de estos productos son comercialmente conocidos como PerioGlass®, NovaBone® y NovaMin® [25]. c.3) Recubrimientos El empleo de los vidrios bioactivos como recubrimientos de materiales metálicos, solventa las limitaciones que presentan sus propiedades mecánicas. Sin embargo, es aún un reto conseguir recubrimientos con buena adhesión al substrato y con una degradación controlada. Para lograr una adhesión adecuada, los TEC del metal y del vidrio deben ser similares, de forma que al aplicar el tratamiento térmico no se generen tensiones que puedan generar grietas y la rotura del implante [156, 168]. Los vidrios bioactivos con alto contenido en sílice presentan TEC cercanos a los del titanio. Sin embargo, tal y como se ha comentado, un aumento de sílice en la composición puede comprometer la capacidad bioactiva de los mismos, comprometiendo en este sentido su funcionalidad [168, 169]. El empleo de recubrimientos bioactivos permite mejorar la osteointegración del implante, así como estabilizar la unión al hueso y evitar la posible liberación de iones metálicos al fluido fisiológico que puedan ser tóxicos. Sin embargo, la degradación del vidrio bioactivo puede conllevar la inestabilidad del propio implante. En este contexto, se busca tener composiciones distintas en la superficie del recubrimiento y en la intercara del metal (composición gradiente), con el fin de conseguir el objetivo dual de una buena adhesión (distintas composiciones implicarían distintos TEC), a Capítulo 1 96 la vez que se limita su grado de disolución, beneficiando así la estabilidad del implante a largo plazo [170]. d) Técnicas de recubrimiento de vidrio bioactivo La elección de la técnica de recubrimiento influye en propiedades como la adhesión al substrato, la porosidad y, por tanto, a la bioactividad [171]. Entre las técnicas más usadas, destacan la deposición electroforética (EPD) [172, 173], deposición por láser pulsado [174], laser cladding [175, 176], proyección térmica [177-179], la técnica de sol-gel y el esmaltado. d.1) Sol-gel La técnica de se basa en la síntesis de una suspensión coloidal o de partículas sólidas que, tras la hidrólisis y condensación forman un material sólido lleno de solvente, como se comentó en el apartado Técnicas de recubrimientos de HA. Una de las principales ventajas de este método es que no requiere de altas temperaturas, lo que evita la cristalización del vidrio. Por otro lado, las partículas obtenidas presentan una composición homogénea [180]. Este proceso genera materiales policristalinos y amorfos de forma sencilla, con características especiales en su composición y propiedades. Esto se consigue por medio del proceso de envejecimiento y del posterior tratamiento térmico, de forma que se obtiene el material o bien en forma de monolito o bien como película delgada [181] (Figura 23). Introducción 97 Figura 23. Método de sol-gel [181]. Loa procesos de mezcla de este método tienen lugar a escala nanoscópica, de forma que se consiguen recubrimientos con una gran homogeneidad y que se adaptan a formas muy complejas de topografía. En cuanto a los métodos de deposición, existen diversas posibilidades, como son el rociado, la inmersión (dip coating), la aplicación centrífuga (spin coating), etc [142]. d.2) Sinterizado y esmaltado del vidrio. El proceso de sinterizado a altas temperaturas es uno de los métodos principales tanto en la fabricación de vidrio bioactivo como en el empleo de recubrimientos. Este proceso permite una buena unión entre las partículas, pero a su vez, se produce la cristalización total o parcial del vidrio. El esmaltado, por su parte, se trata de una técnica empleada ampliamente para recubrir substratos metálicos con vidrio, con una temperatura del proceso que debe evitar tanto la cristalización del vidrio como la degradación del substrato, por lo que debe ser elegida con precaución. En general, la temperatura debe ser superior a los 600 ºC. En ambos procesos de recubrimiento, se emplea una pieza de vidrio o una suspensión en polvo, de forma que, tras ser depositados, se someten al correspondiente tratamiento térmico. Capítulo 1 98 El proceso de esmaltado permite crear capas de tan solo unos micrómetros de espesor hasta capas gruesas (centenares de micrómetros) [20]. Sin embargo, debido a que las temperaturas son menos elevadas que para el sinterizado, se pueden originar reacciones e interacciones vidrio-metal que disminuyan la adhesión. De este modo, la diferencia del TEC puede provocar estrés térmico, y con ello la aparición de grietas. Para solucionar estos problemas, se propone la creación de una capa intermedia entre el vidrio y el metal [20]. Entre los factores más influyentes en el proceso de sinterizado, cabe destacar el tamaño de las partículas de vidrio. Al reducir las partículas, el proceso de sinterizado mejora, pero también aumenta la cristalización. El inconveniente de la cristalización es que conlleva una reducción de la bioactividad y, en el caso de cristalización parcial, inestabilidad como consecuencia de la degradación de la estructura amorfa [25], pudiendo desembocar en el fallo del implante. Para evitar la cristalización del vidrio, las condiciones del tratamiento térmico deberían situarse en la “ventana de sinterizado”, cuyo rango se encuentra entre la temperatura de transición vítrea y la de fusión del vidrio. En este sentido, se requiere superar la temperatura de transición vítrea pero no la temperatura de cristalización, con el fin de mantener una estructura amorfa. Sin embargo, este margen resulta ser muy estrecho, de forma que es imposible evitar la formación de estructuras cristalinas. Por ello, es necesario llegar a una solución de compromiso, de forma que se consiga un buen sinterizado a la vez que se mantenga la bioactividad de este. El contenido en sílice resulta ser otra de las variables más importantes en la cristalización del vidrio, de forma que, a mayor contenido, se reduce la formación de estructuras cristalinas. Sin embargo, un mayor contenido implica a su vez una mayor conectividad de la red de sílice, disminuyendo el grado de degradación del vidrio y, por tanto, su bioactividad. Sin embargo, ciertos estudios de carácter cuantitativo han demostrado que la cristalinidad reduce la cinética de formación de HA, si bien no inhibe su generación [182-184]. De acuerdo con los resultados, no existen diferencias sustanciales en cuanto a cristalinidad en el rango de temperaturas entre los 800–1000°C, donde Introducción 99 aparece la fase cristalina del silicato de calcio sódico (Na2Ca2Si3O9) (Figura 24). Los patrones característicos de esta fase se encuentran en la cartografía estándar PDF 22.1455. En cuanto a la formación de HA, el factor más influyente resulta ser la microestructura y la porosidad del vidrio, relacionado directamente con la densificación (sinterizabilidad) que experimentan sus partículas. Capítulo 1 100 Figura 24. Difractogramas de a) vidrio 45S5 sinterizado a 1000 ºC (25 ºC/min) [183] y b) polvo de vidrio 45S5 en estado de recepción, sinterizado a 900 ºC durante 5 h y a 1000 ºC durante 1 h [184]. En todos los vidrios sinterizados se identifica la fase cristalina de Na2Ca2Si3O9. Otra de las opciones para reducir la cristalización es ampliar la “ventana del proceso de sinterizado”, variando la composición química del vidrio. A raíz de esto, se han Introducción 101 desarrollado nuevos vidrios bioactivos con mayor contenido en sílice, como el 13- 93 [25], así como otros métodos de síntesis de vidrio bioactivo, destacando el solgel, que consigue un vidrio amorfo con nanoporosidad que mejora la respuesta celular debido a una mayor superficie [25]. Por el contrario, ciertos estudios afirman que la cristalización del vidrio no inhibe la bioactividad, sino que afecta a la cinética de formación de HA en presencia de SBF, reduciéndola a la mitad para vidrios bioactivos de más de un 60 % de cristalización. Además, demostraron también la importancia de la porosidad del vidrio, de forma que porosidades menores al 36 % producían capas más gruesas de HA [185]. Los recubrimientos de vidrio graduales (con gradiente) pueden ser una de las opciones para generar una capa intermedia. Un estudio en el que se emplearon los vidrios 6P61 (colocado en la intercara con el metal por tener un TEC similar) y 6P55 (en la superficie por tener una mayor bioactividad), reveló que, tras el esmaltado, se produjo una cristalización parcial del recubrimiento, pero no una disminución de la bioactividad en la estructura amorfa. Una vez realizado el tratamiento térmico, se formaron grietas en la capa superficial, al contrario que en la capa intermedia, como consecuencia de un TEC próximo con el metal. Por ello, las grietas no se difundieron ni atravesaron el recubrimiento, evitando así la delaminación. Otro de los motivos es que la presencia de estructuras cristalinas reduce considerablemente esta propagación [186]. e) Combinaciones de vidrio bioactivo con otros materiales La buena bioactividad que presentan los vidrios bioactivos ha permitido la realización de combinaciones con otros materiales, con el fin de mejorar las propiedades biológicas de éstos últimos y, a su vez, suplir las carencias mecánicas que presentan (fragilidad y poca resistencia). Dentro de los sistemas de vidrio bioactivo destacan los vidrios con cerámicas, con polímeros y con metales. Los sistemas con cerámicas más conocidos son las combinaciones con HA y con nanomateriales de carbono. Debido a las limitaciones que presenta la HA sintética en cuanto a propiedades mecánicas y baja biodegradabilidad [161, 187], se pueden Capítulo 1 102 ocasionar fallos del implante. Como solución, es posible reforzar la HA con vidrio bioactivo. En este sistema, el vidrio bioactivo estimula la formación de hueso gracias a la liberación de iones, teniendo gran influencia en la angiogénesis y en la neovascularización [188], de forma que el sistema se puede degradar y unir con el hueso al mismo tiempo de forma rápida. El principal inconveniente de estos sistemas es la temperatura que se requiere para la sinterización (1200-1300 ºC), ya que se pueden producir reacciones entre el vidrio y la HA sintética, formando fases perjudiciales, conllevando la cristalización del vidrio bioactivo y la degradación de la HA. Para solventar esto, se propone emplear vidrios bioactivos con menor temperatura de sinterización, como el BG_Ca [189]. Por su parte, los sistemas con nanomateriales de carbono confieren a los vidrios bioactivos las propiedades tribológicas y de resistencia a fractura de las que carecen. Uno de los materiales más empleados es el grafeno, aunque presenta dos problemas. Por un lado, tiende a aglomerarse, mientras que, por otro, es complicado fabricar grafeno a gran escala. Para solucionar este problema, se introduce óxido de grafeno como precursor gracias a su alta capacidad de dispersión, empleando la descarga de plasma. En este dominio se encuentran sistemas de vidrio bioactivo reforzados con nanoplaquetas de grafeno (GNPs), nanotubos de carbono (CNTs), con el que se consiguen buenas propiedades mecánicas, eléctricas y térmicas, pudiendo ser de una pared (SWC-NTs) y multipared (MWCNTs), y el sistema MWCTNs/Bioglass® 45S5, que emplea también la descarga de plasma [150, 190]. El hueso está formado por una combinación de polímero natural (colágeno) y una cerámica (HA biológica) [191]. Este sistema sirve de inspiración en el acoplamiento entre polímeros biodegradables y vidrios bioactivos en aplicaciones como relleno de defectos en huesos, implantes temporales y scaffolds para la regeneración de tejidos. Se caracterizan por ser composiciones en las que se introduce resistencia y bioactividad a los polímeros, a la vez que se mantienen flexibilidad y la capacidad de deformación bajo cargas [192]. El vidrio bioactivo fomenta la nucleación y el crecimiento de la capa de HA sobre la superficie del scaffolds, de forma que, a su vez, la degradación del polímero se ve frenada y se Introducción 103 consigue una mayor osteconducción y crecimiento celular. Los polímeros más frecuentes son como el ácido poliláctico (PLA) (Figura 25), el ácido poliglicólico (PGA) y el poli-láctico-co-glicólico (PLGA) [193]. Figura 25. Micrografía SEM de PLLA (variación del PLA) con un 94% de porosidad, con 15% en volumen de Bioglass® 45S5 [152]. Los sistemas de vidrio bioactivo con metales se caracterizan por conferir una gran resistencia mecánica. En estas combinaciones, existe la opción de una matriz metálica reforzada con el vidrio o a la inversa, empleando el metal como refuerzo. Dentro de este grupo, destacan las composiciones con magnesio y sus aleaciones, con acero 316L, titanio, cobre y plata, donde los dos últimos confieren propiedades antibacterianas. En el caso del magnesio y sus aleaciones, destaca la matriz de la aleación ZK30 (3% peso en Zn, 0,6% peso en Zr y el resto Mg) [194, 195], donde el Zn refuerza el Mg frente a corrosión y se considera un micronutriente esencial en el cuerpo humano, mientras que el Zr mejora la resistencia de la aleación y presenta buena compatibilidad y osteointegración [194]. La inclusión de vidrio bioactivo implica una Capítulo 1 104 disminución en cuanto a resistencia, aunque esta sigue siendo mayor que la del hueso cortical, y un aumento de la bioactividad del magnesio [195]. Por su parte, los sistemas de vidrio bioactivo con acero 316L permiten mejorar tanto la resistencia como la capacidad de deformación del vidrio, confiriendo unas propiedades elásticas cercanas a las del hueso [196]. De forma espontánea, aparece una transición gradiente en la intercara del acero y el vidrio, de forma que el hierro del primero se dispersa en el vidrio y el silicio de este hace lo mismo entre las capas de óxido de las fibras de acero [147]. Las combinaciones con titanio permiten fabricar nanocompuestos con mayor resistencia a la fractura en comparación con los vidrios bioactivos y que poseen mejor biocompatibilidad que el titanio microcristalino [197, 198]. Dentro de estas composiciones, es recurrente el empleo del vidrio bioactivo como recubrimiento del titanio y sus aleaciones, consiguiendo una buena adhesión mediante capas nanoestrucuradas en la cara de la unión que, a su vez, se puede mejorar mediante la formación de dendritas de Ti5Si3 en el vidrio. Como se ha glosado anteriormente, la capa de óxido y el contenido en silicio juegan un papel importante en la delaminación del recubrimiento y en su degradación, por lo que es necesario controlar las reacciones que se puedan producir y afecten a la adhesión e integridad estructural del recubrimiento [156]. f) Ensayos in vitro e in vivo Evaluar el comportamiento que los biomateriales presentarán en el cuerpo humano una vez hayan sido trasplantados se hace indispensable para su validación. Los ensayos in vitro se caracterizan por ser una reproducción artificial de lo natural, evitando así el uso de animales. En este contexto, es posible simular el plasma de la sangre humana mediante una solución de SBF (fluido corporal simulado, Simulated Body Fluid). Este hecho permite el estudio de la bioactividad de un material de una manera bastante cercana a la realidad [199]. El desarrollo de un SBF adecuado ha seguido un camino difícil, en el que la optimización del método para su consecución estaba influida por diversos factores 111 Capítulo 2: OBJETIVOS 112 Objetivos 113 Capítulo 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo principal El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral es fabricar y caracterizar discos de titanio poroso modificados superficialmente que permitan garantizar el deseado equilibrio biomecánico (rigidez, resistencia mecánica, al rayado y desgaste) y biofuncional (bone in-growth, osteointegración y resistencia a la proliferación de bacterias), necesario para aplicaciones biomédicas (sustitución parcial del tejido óseo cortical). 2.2 Objetivos específicos A su vez, la consecución del Objetivo principal requiere de hitos y/o tareas relacionados y agrupados en dos objetivos específicos: Fabricación y caracterización de discos de titanio poroso • Implementar y validar la viabilidad del uso de la técnica de espaciadores en términos de repetitividad y fiabilidad para fabricar piezas de titanio comercialmente puro con porosidad controlada (tipo, tamaño, distribución y morfología), usando dos rangos de tamaños de espaciadores (100-200 m y 250-355 m). El contenido en volumen de espaciador, así como las condiciones de sinterización (temperatura, tiempo y atmósfera) se han propuesto en trabajos Capítulo 2 114 previos realizados en el Grupo de investigación (Aplicaciones Porosas Avanzadas), en el que se ha desarrollado la presente Tesis Doctoral. • Caracterizar la porosidad (fracción total e interconectada, factor de forma, rugosidad superficial, distribución de tamaños y diámetro equivalente), usando técnicas con distinta resolución espacial (2D y 3D). • Evaluar el comportamiento tribo-mecánico (escala macro y micro), relacionándolo con el papel de la porosidad. Descripción del tipo y mecanismos de daño asociado a las solicitaciones. • Estudio del comportamiento in vitro de los sustratos porosos: cultivos celulares (premioblastos C2C12-GFP) y cepas de bacterias (E. coli, MRSA y P. aureginosa). Influencia de la porosidad, del área y la rugosidad superficial (plana y sustratos). Modificación superficial. Influencia en la capacidad de osteointegración de los discos de titanio poroso • Empleo de una ruta de modificación superficial mediante ataque químico por inmersión. Control de los parámetros del proceso y relación con las modificaciones microestructurales (fracción, tamaño y morfología de la porosidad), rugosidad (tipo, grado y generación de texturas) de la superficie plana y las paredes de los poros, así como en el comportamiento tribo-mecánico y celular. • Implementar las técnicas de sol-gel y goteo para depositar recubrimientos bioactivos frágiles (hidroxiapatita y vidrio bioactivo, respectivamente). Evaluar, controlar y optimizar las variables del proceso de deposición, el papel de las características microestructurales y mecánicas del sustrato, así como la influencia en las características de los recubrimientos obtenidos (composición, homogeneidad, espesor, adherencia, microdureza, bioactividad, etc.). • Depositar recubrimientos antibacterianos de SPEEK sobre los sustratos de titanio porosos. Evaluar su capacidad antibacteriana, así Objetivos 115 como la influencia de la porosidad en el proceso y el comportamiento bactericida. 116 117 Capítulo 3: RESULTADOS 118 Resultados 119 Capítulo 3. RESULTADOS Los capítulos anteriores exponen la problemática de salud mundial que justifica la necesidad de nuevos tipos de materiales para implantes (sustitución total o parcial) de un tejido óseo cortical. En este contexto, el titanio comercialmente puro (Ti cp) con una porosidad controlada y una superficie modificada (física y/o químicamente) se presenta como un serio candidato capaz de garantizar el equilibrio biomecánico y biofuncional que se requiere en la aplicación clínica. La presente Tesis Doctoral contempla la recopilación de los resultados obtenidos en el marco de este problema de salud. Éstos han sido presentados en los congresos nacionales e internacionales más importantes de las áreas en las que versa esta investigación (biomateriales y materiales porosos). Además, se han concretado en la publicación de seis publicaciones indexadas de alto factor de impacto, por lo que la misma se engloba en la Modalidad “por compendio”. La Figura 27 presenta un esquema en el que se resumen todos los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, los cuales se irán desglosando en los sucesivos apartados, para más tarde ser discutidos en el Capítulo 4. Antes de continuar, se listan las técnicas de caracterización empleadas en esta Tesis, pudiéndose consultar detalles de éstas en las citadas publicaciones científicas (ver al final del manuscrito). Capítulo 3 120 Figura 27. Esquema de presentación de Resultados en esta Tesis doctoral. Si bien esta Tesis Doctoral sigue la modalidad por compendio, a continuación, se realiza un breve resumen de la fabricación y modificación de los sustratos de titanio. Para solucionar el apantallamiento de tensiones, primera limitación que presenta el titanio como biomaterial, se han fabricado sustratos de titanio por ruta PM convencional (sustrato denso) y mediante la técnica de espaciadores (sustratos porosos). Las muestras densas partieron de polvo de titanio de pureza comercial (SEJONG Materials Co. Ltd., Corea del Sur, D [4,3] de 59 μm), Ti cp, siendo prensadas a 1300 MPa en una máquina Instron modelo 5505, serie H1514 Resultados 127 vivas/muertas por microscopía confocal, empleando un microscopio Zeiss LSM 700 confocal (Alemania). iii. Inmersión de los sustratos porosos de titanio recubiertos con BG en SBF: Se caracterizó y analizó el crecimiento de HA tras la inmersión de los sustratos recubiertos en SBF [199] durante 21 días. Los detalles de los distintos procedimientos experimentales y de la caracterización pueden ser consultados con mayor profundidad en las publicaciones anexas de esta tesis por compendio. La Tabla 14 recoge, de manera esquemática, la aplicación de cada una de las técnicas empleadas en la presente Tesis Doctoral para la caracterización de los sustratos antes y después de ser modificados, siendo entre ellas complementarias. Tabla 14. Aplicación de las técnicas empleadas en la caracterización de sustratos y recubrimientos fabricados en la presente Tesis Doctoral. Sustratos vírgenes Sustratos atacados por inmersión Recubrimiento de HA Recubrimiento de BG Recubrimiento con SPEEK AI - Porosidad 2D, Topografía visual X X Micro-CT - Porosidad 2D y 3D, Topografía visual, Rugosidad 3D X X M. Arquímedes - Porosidad 3D X X Composición EDX X X X X ICP X Fases y estructura cristalina FTIR X XRD X X X X SEM - Topografía visual X X X X X Confocal (Topografía visual, Rugosidad 3D) X X X X Integridad estructural y Homogeneidad US Test de compresión X X Micro-dureza X X Ensayo de rayado - Rugosidad 2D, Integridad estructural y Homogeneidad X X X Ensayo de desgaste - Integridad estructural y Homogeneidad X Comportamiento biológico Cultivos Celulares X X Cultivos con cepas bacterianas X Inmersión en SBF X Resultados 129 3.1. Disminución del apantallamiento de tensiones: sustratos de Titanio poroso obtenidos por rutas pulvimetalúrgicas La pulvimetalurgia (Powder Metallurgy, PM) convencional, así como la técnica de espaciadores (space-holder technique), han sido los métodos empleados en la fabricación de los sustratos de la presente Tesis. Se fabricaron tres tipos de sustratos de Ti cp, uno denso y dos porosos, éstos últimos con una mezcla del 50 % v/v de espaciador. El sustrato denso fue obtenido por PM convencional y los porosos mediante la técnica de espaciadores. Los rangos de tamaño de partícula de espaciador (NH4HCO3) fueron de 100-200 y 250-355 µm, y fueron escogidos para lograr un equilibrio entre las propiedades mecánicas y biofuncionales del sustrato. El menor rango empleado (100-200 µm) genera un tamaño de poro tal que permite la infiltración del hueso hacia el interior de los poros del sustrato sin comprometer el comportamiento mecánico del material, más estudiado en la literatura y en trabajos previos [36,52,53,55,58]. Por su parte, el mayor rango de tamaño elegido (250-355 µm) pretende facilitar una mejor infiltración hacia el interior, promoviendo en mayor medida la penetración de los recubrimientos ensayados, el crecimiento del hueso hacia el interior (bone in-growth) y la adhesión celular. Sin embargo, un mayor tamaño de poro puede suponer pérdida de resistencia mecánica, aunque se podría ver compensada por la propia formación de hueso en el interior de los poros. En cualquier caso, la meta propuesta, es conseguir un equilibrio biomecánico y biofuncional. La Figura 28 recoge, de manera ordenada, la caracterización realizada sobre estos sustratos vírgenes (sin ningún tipo de tratamiento sobre su superficie), así como los parámetros y variables significativas estudiadas en cada una de ellas. Capítulo 3 130 Figura 28. Caracterización de los sustratos porosos de titanio fabricados para solventar el apantallamiento de tensiones (extraído del esquema de la Figura 27). 3.1.1 Caracterización microestructural de los sustratos porosos Los sustratos obtenidos, en cuanto a la similitud con el diseño de partida, dependen fuertemente del polvo metálico y de las partículas de espaciador empleado. En este contexto, se hace necesaria el estudio de las curvas de compresibilidad de los materiales para fabricar los sustratos de forma óptima. Las curvas de compresibilidad de las muestras porosas y densa se presentan en la Figura 29. Se aprecia que para bajas presiones de compactación (< 800 MPa) la densidad relativa obtenida en ambos sustratos porosos es similar entre ellos, pero superior a la de la muestra densa. Sin embargo, a mayores presiones de compactación (> 800 MPa), éstas pasan a tener una densidad inferior a la de la muestra densa, si bien se mantiene el comportamiento relativo entre las muestras porosas. Resultados 131 Figura 29. Curvas de compresibilidad del polvo de Ti c.p. y de las mezclas de éste con el hidrógeno carbonato de amonio (BA) de rangos de tamaño de espaciador de 100-200 µm y 250-355 µm: a) Para 0-1200 MPa; b) Detalle de la anterior para 600-1200 MPa. La caracterización microestructural de los sustratos, se llevó a cabo por diversas técnicas, siendo objeto de estudio, entre otros, parámetros como la PT y Pi, morfología de los poros generados por el espaciador (Deq y Ff) y topografía (rugosidad de la superficie). Se empleó el método de Arquímedes para caracterizar la porosidad de los sustratos fabricados. La Tabla 15 muestra la porosidad (%), total e interconectada, de los sustratos de titanio, representadas de menor a mayor rango de tamaño de espaciador. Se observa que la porosidad total es siempre superior a la interconectada, como era de esperar. Asimismo, los valores de porosidad total son de 45.9 % para ambos sustratos porosos, mientras los de porosidad interconectada corresponden al 43.7 y 41.0 % para las muestras porosas de menor y mayor rango de tamaño de espaciador, respectivamente. La diferencia entre ambas porosidades corresponde a la porosidad cerrada o aislada. Es interesante remarcar las porosidades obtenidas en el sustrato denso, siendo de 2.4 % para PT y de 1.3 % para la Pi. Capítulo 3 132 Tabla 15. Porosidad total e interconectada por el método de Arquímedes de los sustratos denso y porosos de titanio de ambos rangos de tamaño de partícula de espaciador tras el proceso de sinterizado. PT (%) Pi (%) Densa 2.4 ± 0.2 1.3 ± 0.2 100-200 µm 45.9 ± 0.6 43.7 ± 0.8 250-355 µm 45.9 ±0.2 41.0 ± 0.1 La Figura 30 muestra las micrografías de los sustratos de titanio (denso y porosos). Pueden observarse claramente dos poblaciones distintas de poros. Por un lado, aparece una porosidad más fina en todos los sustratos, que incluye la muestra densa (Figura 30 a). Esta es una porosidad inherente al propio proceso PM convencional. En segundo lugar, se obtiene una población de poros de tamaño mucho mayor, Figura 30 b y c, debida a los poros generados por las partículas de espaciador en la técnica de espaciadores, correspondiente a los sustratos porosos de tamaño de partícula de espaciador 100-200 y 250-355 µm, respectivamente. Resultados 133 Figura 30. Micrografías de los sustratos de titanio. a) sustrato denso, b) y c) sustratos porosos de tamaño de partícula de espaciador 100-200 y 250-355 µm, respectivamente. La Tabla 16 presenta la porosidad total (PT) y las propiedades principales de la morfología de los poros obtenidas por IA, tales como el diámetro equivalente (Deq) y el factor de forma (Ff) de los poros, para cada tipo de sustrato. Tabla 16. PT, Deq y Ff de los poros por la técnica de IA. IA PT (%) Deq medio (µm) Ff Densa 1.2 ± 0.2 5.5 ± 0.2 0.99 ± 0.00 100-200 µm 50.3 ± 1.3 161.1 ± 28.5 0.67 ± 0.03 250-355 µm 48.7 ± 1.9 261.5 ± 9.0 0.67 ± 0.01 La porosidad total de la muestra densa, observada en la Figura 30 a, es 1.2%. Asimismo, resulta ser del 50.3 y 48.7% para los sustratos porosos. El tamaño de los poros, medido por el Deq medio, muestra que los poros de la muestra densa tienen un tamaño medio de 5.5 µm. Asimismo, resultan ser de 161 y 261 µm para los sustratos porosos. Por otra parte, el factor de forma (Ff) es de 0.99 para el Capítulo 3 134 sustrato denso, mientras es de 0.67 para ambos sustratos porosos. En dicho análisis, en los sustratos porosos no se ha tenido en cuenta la porosidad más fina, identificada en el sustrato denso, con el fin de obtener únicamente la caracterización de los poros que genera el espaciador empleado. La distribución de tamaños de poro (Figura 31) también es posible realizarla a partir de los datos obtenidos por análisis de imagen. Figura 31. Distribuciones del Deq de los poros, obtenidas por IA, de los sustratos de titanio a) denso y b) poroso de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador. La Figura 31 a muestra que el 100% de los poros en el sustrato denso (del orden de 500 poros), son menores de 50 µm. Por el contrario, en los sustratos porosos Resultados 135 sólo se han contado menos de 5 poros de hasta 50 µm. Asimismo, los poros mayores de 50 µm son mucho menos numerosos, alcanzando algunos tamaños frecuencias de hasta 20 poros, mientras el total del número de poros mayores de 50 µm es alrededor de 100. No se ha presentado la gráfica correspondiente al sustrato poroso de 250-355 µm, cuyo resultado es similar. La Tabla 17 recoge los valores de PT (%), Deq medio (μm), y rugosidad superficial del interior de los poros por unidad de volumen, Rugsup (mm2/mm3), de los sustratos porosos de ambos rangos de tamaño de espaciador, obtenidos por micro-CT. Los sustratos densos, por su parte, no se contemplaron en el estudio de porosidad debido a las limitaciones en la resolución del equipo para micro- CT. Tabla 17. Parámetros obtenidos por micro-CT de los sustratos porosos de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm y 250-355 µm. Micro-CT PT (%) Deq medio (µm) Rugsup (mm2/mm3) 100-200 µm 49.8 ± 11.4 172.6 ± 6.4 17.3 ± 1.3 250-355 µm 40.8 ± 11.4 240.3 ± 6.4 10.7 ± 0.8 La porosidad total es de 49.8 y 40.8% para los sustratos porosos de 100-200 µm y 250-355 µm, respectivamente. Es decir, disminuye al aumentar el tamaño del espaciador. Un comportamiento similar se observa con la Rugsup, que pasa de 17.3 a 10.7 mm2/mm3. Por el contrario, el tamaño medio de los poros pasa de 172.6 a 240.3 µm, al aumentar el tamaño del espaciador. La Figura 32 muestra, para ambos sustratos porosos, la distribución de tamaño de los poros, representando la fracción volumétrica (%) frente al Deq (μm). El Deq, obtenido mediante micro-CT, presenta una distribución del tipo campana de Gauss, con valores de la anchura a media altura (FWHM) de 106.6 y de 98.5 µm para las muestras con tamaños de partícula de espaciador de 100-200 y 250- 355 µm, respectivamente, y desviaciones típicas de 45.3 y 41.8 µm, igualmente. Capítulo 3 136 Figura 32. Distribución de tamaños de los poros. Fracción volumétrica (%) frente a Deq (µm) y reconstrucción en 3D de la tomografía de los sustratos porosos de titanio de tamaño de partícula de espaciador de a) 100-200 µm y b) 250-355 µm. Adicionalmente, en la Figura 32 se representan en una reconstrucción 3D, la totalidad de poros segmentados y diferenciados en colores dentro de una matriz transparente que simula la matriz de titanio para cada sustrato poroso obtenido por micro-CT. 3.1.2 Caracterización de la superficie de los sustratos y las paredes de los poros Las características de la superficie tienen una gran importancia pues nos permitirá conocer ésta y poder estudiar como varían con las modificaciones superficiales que se van a realizar y relacionar éstas con su influencia en la mejora del comportamiento biofuncional. Resultados 143 (Norma ISO 25178, [246]) presentados en la Tabla 19. Estos parámetros característicos corresponden a la altura media aritmética (Sa), altura media cuadrática (Sq) y altura máxima medida (Sz). Para ello, se ha diferenciado en la zona correspondiente a la matriz de titanio (zona plana) y los poros de la superficie (zona porosa). Tabla 19. Parámetros de rugosidad (Sa, Sq, Sz) obtenidos por microscopía confocal láser de las superficies de los macro-poros y la matriz de Ti en función del contenido y rango de tamaño de espaciador. PT (%) Parámetros de Rugosidad Sa (µm) Sq (µm) Sz (µm) Densa Plana 2.9 0.7 11.0 79.2 100 – 200 µm Plana 47.0 5.0 9.0 97.6 Porosa 15.5 22.2 166.7 250 – 355 µm Plana 46.4 3.4 8.8 147.2 Porosa 30.8 4.0 274.2 En la parte plana, Sa es de 0.7 µm para el sustrato denso, siendo de 5.0 y 3.4 µm para los sustratos de 100-200 µm y 250-355 µm, respectivamente. Sq es de 11.0 µm para el sustrato denso, al igual se ha obtenido 9.0 µm para el sustrato de 100-200 µm y 8.8 µm, para el de 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador. Asimismo, Sz es de 79.2 µm para el sustrato denso, mientras que resulta ser de 97.6 y 147.2 µm, para los sustratos de 100-200 µm y 250-355 µm, respectivamente. En la parte porosa, el valor de Sa es de 15.5 y 30.8 µm, para los sustratos de 100-200 µm y 250-355 µm, respectivamente. Sq por su parte, resulta ser 22.2 µm para el sustrato de 100-200 µm, mientras que para la muestra porosa de 250- 355 µm es de 40.1 µm. Finalmente, para la parte porosa, Sz es de 166.7 y 274.2 µm, para los sustratos de 100-200 µm y 250-355 µm, respectivamente. 3.1.3 Comportamiento macro y micro-mecánico El análisis del comportamiento mecánico se llevó a cabo a través de dos técnicas distintas. Por un lado, mediante la técnica de ultrasonidos (US) se evaluó el módulo de Young dinámico gracias a la propagación de ondas transversales y longitudinales a lo largo de los sustratos. En segundo lugar, se realizó el ensayo Capítulo 3 144 de compresión uniaxial con un objetivo similar: obtener el módulo de Young a través del análisis de la curva de tensión-deformación, así como el límite de fluencia. Este ensayo se realiza por la aplicación de la norma convencional del ensayo de compresión de materiales metálicos a temperatura ambiente, ASTM E9-9 [244]. Una vez se obtienen las propiedades mecánicas correspondientes de cada sustrato por estas vías, es posible compararlas con las correspondientes al hueso cortical, comprobando así si mediante el proceso de fabricación del titanio poroso empleado se resuelve el apantallamiento de tensiones. La Figura 37 grafica las curvas de tensión (  ) - deformación (  ) de cada uno de los sustratos porosos de titanio tras el ensayo de compresión. No ha sido posible representar la gráfica del sustrato denso, ya que la máquina Instron tendría que aplicar cargas mayores de lo que nominalmente puede, por lo que no fue posible completar el ensayo. Figura 37. Curvas tensión () -deformación () obtenidas por el ensayo de compresión para los sustratos porosos de titanio con rango de tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm y 250-355 µm. Ensayo realizado bajo la norma ASTM E9-09 [244]. Resultados 145 La Tabla 20 muestra los valores de las muestras de estudio del Módulo de Young dinámico obtenido por el ensayo de ultrasonidos, y del módulo de Young y límite de fluencia, obtenidos por el ensayo de compresión (Figura 11). Como referencia, los valores correspondientes del hueso de estos parámetros son de 20-25 GPa para el módulo de Young y de 150-180 MPa de límite de fluencia. Tabla 20. Propiedades mecánicas de las muestras densa y porosas de rango de tamaño de partícula de espaciador 100-200 y 250-355 µm. Ed: módulo de Young dinámico obtenido por la técnica de ultrasonidos. Ec y σy: módulo de Young corregido y límite de fluencia, respectivamente, calculados por la norma convencional ASTM E9-09 [244]. Técnica de US Ensayo de compresión uniaxial ASTM E9-09 Ed (GPa) Ec (GPa) σy (MPa) Denso 101.2 ± 0.3 95.0 ± 1.0 628.0 ± 5.0 100-200 µm 20.8 ± 0.1 26.0 ± 0.9 126.9 ± 21.0 250-355 µm 22.8 ± 0.2 23.1 ± 1.0 117.8 ± 14.0 Los resultados de US muestran que Ed es 101.2 GPa para el sustrato denso y de 20.8 y 22.8 GPa, para los sustratos porosos de 100-200 y 250-355 µm, respectivamente. El ensayo de compresión revela valores de Ec de 95.0 GPa para la muestra densa, así como de 628.0 MPa para σy. Por su parte, las muestras porosas de 100-200 y 250-355 µm presentan unos resultados de 26.0 y 23.1 GPa para el Ec, respectivamente, y de 126.9 y 117.8 MPa para el σy, respectivamente. La Tabla 21 muestra la microdureza Vickers de cada una de las muestras de titanio, tanto densa como porosas, para distintas cargas aplicadas. En ambos casos, el ensayo se ejecutó en la matriz de titanio de los sustratos, con el fin de observar la influencia de la existencia y tamaño de los poros. Capítulo 3 146 Tabla 21. Micro-dureza Vickers para cargas HV0.3 y HV1 sobre los sustratos denso y porosos de 100-200 y 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador. Micro-dureza Vickers HV0.3 HV1 Denso 377 ± 39 342 ± 16 100-200 µm 401 ± 4 167 ± 28 250-355 µm 356 ± 25 152 ± 28 Los resultados revelan que, para cargas de indentación bajas (HV0.3), los valores de microdureza son similares para ambos tipos de sustrato (denso y porosos), encontrándose en un intervalo de 350-400 HV0.3. Sin embargo, al incrementar la carga aplicada hasta HV1, disminuye la microdureza para los porosos, siendo 167 HV1 para el menor rango de tamaño de espaciador y ligeramente inferior para el mayor, con un valor de 152 HV1. La Figura 38 muestra los ensayos de micro-indentación instrumentada Vickers con carga máxima de 1 N de los sustratos de titanio tras el proceso de sinterizado (denso y poroso de tamaño de espaciador 100-200 µm), donde P es la carga aplicada en N y h la penetración en el sustrato en µm [247-250]. Los ensayos se ejecutaron en matriz de titanio (sin abarcar poros) en todos los sustratos, con el objetivo de analizar la influencia de éstos. Resultados 147 Figura 38. Curvas P-h para el sustrato denso y poroso de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador. La forma de las curvas sigue el esquema de la Figura 39. A partir de la misma, se realiza el análisis de las curvas, sabiendo que A corresponde a la carga máxima del ensayo, B a la penetración máxima y C a la penetración permanente. A partir de dichos puntos, se puede calcular la fluencia o fenómeno de creep a carga constante (B-A), así como la recuperación elástica (B-C)/B. Figura 39. Esquema de las curvas P-h tras el ensayo de micro-indentación instrumentada para cada sustrato. Capítulo 3 148 Los resultados obtenidos tras el estudio de las curvas de la Figura 38 se recogen en la Tabla 22. Tabla 22. Parámetros principales de las curvas P-h del ensayo de micro-indentación instrumentada de los sustratos denso y poroso de tamaño de espaciador 100-200 µm vírgenes: A (carga máxima del ensayo), B (penetración máxima), C (penetración permanente), B-A (fluencia o creep a carga constante), (B-C)/B (recuperación elástica). A (µm) B (µm) C (µm) B-A (µm) (B-C)/B (%) Densa 17.5 18.3 11.7 0.9 36.3 100-200 µm 21.7 23.1 10.3 1.4 55.5 Como era de esperar, la penetración máxima (B) resulta ser mayor para la muestra porosa de 100-200 µm frente a densa, con valores de 23.1 y 18.3 µm respectivamente. Sin embargo, la penetración permanente (C) presenta un valor algo mayor para la densa (11.7 µm) que para la porosa (10.3 µm), como consecuencia de una menor recuperación elástica (B-C)/B (36.3 y 55.5 %, respectivamente). En cuanto al fenómeno de creep, se obtiene un valor de 1.4 µm para el sustrato poroso de 100-200 µm algo mayor que para el denso que es de 0.9 µm. 3.1.4 Resistencia al rayado y desgaste El estudio del comportamiento del sustrato tras someterlo a distintas cargas superficiales se hace indispensable con vistas a emplearlo como sustituto del hueso cortical. Una vez los implantes son insertados en el cuerpo humano, están sometidos a distintas cargas, que dan lugar a fricciones que generan desgaste. Por ello, se requiere un análisis de la respuesta que proporciona el material ante estas situaciones. Se analizaron diversas propiedades, además de la dureza del material, como la resistencia al rayado y la resistencia al desgaste. El ensayo de rayado se ejecuta en tres etapas. La primera etapa corresponde a la pre-palpación, en la que se obtiene el perfil topográfico del substrato, prácticamente sin ejercer carga. La segunda consiste en el propio rayado, aplicando una carga (constante o incremental) a la vez que el indentador se desplaza una determinada longitud, de forma que se genera un surco en la superficie de la muestra. Finalmente, la tercera etapa es conocida como penetración permanente, donde el indentador recorre de nuevo el surco Resultados 149 generado, prácticamente sin aplicar carga, obteniendo un nuevo perfil topográfico. Esta técnica permite determinar la recuperación elástica del sustrato, definiéndose como la diferencia existente entre las etapas de rayado y penetración permanente. El ensayo de rayado se llevó a cabo a carga constante de 5 N y con un desplazamiento del indentador cónico-esferoidal tipo Rockwell de 2.5 mm. Los resultados del ensayo para las muestras densa y porosa de tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm se grafican en la Figura 40. El otro sustrato de mayor rango de tamaño de espaciador presentó resultados similares a los correspondientes a 100-200 µm. Figura 40. Perfil topográfico de los sustratos denso y poroso de rango de tamaño de partícula de espaciador de 100-200 µm para la pre-palpación y tras el rayado (penetración permanente). Las curvas anteriores presentan el perfil de la superficie de los sustratos, antes y después del rayado. Para el caso del sustrato denso, el perfil resulta ser muy homogéneo, sin apenas variaciones en su longitud. Sin embargo, la muestra porosa revela grandes diferencias de altura a lo largo de todo el recorrido en la etapa de pre-palpación, consecuencia de la existencia de poros. Por su parte, tras el rayado, las diferencias se acentúan, mostrando un perfil incluso más heterogéneo que el correspondiente a la pre-palpación, tanto en el interior de los poros como en la parte plana. La interpretación de estas gráficas requiere la determinación varios parámetros. Los parámetros de rugosidad 2D tras el ensayo de rayado, tales como la Capítulo 3 150 rugosidad media aritmética (Ra), media cuadrática (Rq) y la altura de las irregularidades en 10 puntos (Rz), se recogen en la Tabla 23. Tabla 23. Parámetros de rugosidad de la topografía de los sustratos denso y poroso de rango de tamaño de partícula de espaciador de 100-200 µm para la pre-palpación y tras el rayado (penetración permanente). Ra (µm) Rq (µm) Rz (µm) Denso Pre-palpación 1.1 1.3 5.5 Penetración permanente 1.0 1.3 4.7 100-200 µm Pre-palpación 3.5 5.2 32.5 Penetración permanente 6.7 9.1 36.3 Los datos de la Tabla 23 muestran valores similares tanto en la etapa de prepalpación como en la de penetración permanente para el sustrato denso (del orden de 1.0 µm para Ra, de 1.3 µm para Rq, y de 5.5 µm para Rz), mientras que para el poroso de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador, los resultados son ligeramente mayores en la etapa de penetración permanente. En este sentido, para el poroso se revela un Ra de 3.5 y de 6.7 µm en las etapas de pre-palpación y de penetración permanente, respectivamente, siendo de 5.2 y 9.1 µm para Rq en las correspondientes etapas y de 32.5 y 36.3 µm para Rz, respectivamente. Tras el ensayo de rayado, los sustratos, denso y porosos de ambos rangos de tamaño de partícula de espaciador, experimentan una recuperación elástica en el surco generado. Esa recuperación elástica resulta ser la diferencia entre la penetración durante el rayado y la profundidad de penetración permanente que queda en el sustrato, las cuales se grafican en la Figura 41 para ambos materiales. Los parámetros principales de este análisis se presentan en la Tabla 24 para ambos tipos de sustrato, denso y de tamaño de espaciador 100-200 µm. Para el caso de la muestra de 250-355 µm, los resultados fueron similares al este último. Resultados 151 Figura 41. Recuperación elástica de los sustratos denso y poroso de rango de tamaño de partícula de espaciador de 100-200 µm durante y tras el rayado (penetración permanente). De igual forma que anteriormente, la interpretación de estas gráficas requiere la determinación varios parámetros. Los parámetros de rugosidad 2D tras el ensayo de rayado, tales como, valor medio de penetración (Vm), recuperación elástica (RE), penetración máxima (Máx) y mínima (Mín) y diferencia máxima (  máx) y mínima (  mín) de los valores máximo y mínimo de penetración, se recogen en la Tabla 24. Tabla 24. Vm, RE, Máx y Mín, y  máx y  mín de los valores máximo y mínimo de penetración para los sustratos denso y poroso de rango de tamaño de partícula de espaciador de 100-200 µm durante y tras el rayado (penetración permanente). Vm (µm) RE (µm) Máx (µm) Mín (µm)  máx (µm)  mín (µm) Densa Rayado 10.7 2.8 13.6 9.3 7.4 1.6 Penetración permanente 7.9 10.9 6.2 100-200 µm Rayado 8.8 4.0 34.5 -4.4 38.8 36.3 Penetración permanente 4.9 31.9 -4.4 Los valores medios de penetración (Vm) son mayores para la muestra densa que para la porosa de 100-200 µm, siendo 10.7 µm para el rayado y 7.9 µm para la penetración permanente, frente a 8.8 µm y 4.9 µm para el sustrato poroso, respectivamente. Dichos resultados originan una recuperación elástica (RE) mayor para el sustrato poroso (4.0 µm) que para el denso (2.8 µm). Sin embargo, Capítulo 3 152 la muestra porosa presenta valores mayores de penetración, tanto mínima (Mín) como máxima (Máx), en ambas etapas de rayado (-4.4 y 34.5 µm, respectivamente) y de penetración permanente (-4.4 y 31.9 µm, respectivamente). El sustrato denso, por su parte, obtuvo valores de penetración permanente máxima (Máx) y mínima (Mín) en la etapa de rayado de 13.6 y 9.3 µm, y de 10.9 y 6.2 µm. Estos resultados, generan una diferencia máxima (  máx) de 7.4 µm para la densa y 38.8 µm para la porosa, así como diferencias mínimas (  mín) de 1.6 y 36.3 µm, respectivamente. La Figura 42 presenta micrografías SEM de los surcos generados en el ensayo de rayado. Figura 42. Imágenes SEM del surco generado en el ensayo de rayado para las muestras densa a) 120X, b) 500X y porosa de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador c) 120X, d) 500X. El surco generado en el sustrato denso resulta ser continuo, claro y bien definido, con un ancho regular a lo largo de todo el recorrido. Por el contrario, el surco correspondiente al sustrato poroso es discontinuo como consecuencia de la Discusión de resultados 255 poros, por tanto, promueve la proliferación y la adhesión tanto en el borde como en el interior de estos, sin presentar diferencias notables en cuanto a tamaño. Respecto al estudio bacteriológico, en general, se observan niveles de proliferación mayores para los sustratos porosos que para los densos, consecuencia de un incremento del área de contacto (poros interconectados provistos de paredes rugosas). Este mismo hecho fue observado para las tres cepas bacterianas estudiadas. A diferencia del comportamiento celular, el análisis de proliferación de bacterias revela la influencia del tamaño de poro, así como de la concentración inicial de bacterias del medio de cultivo. En este sentido, se observa que un mayor tamaño de poro favorece el aumento del número de colonias de bacterias. Se manifiesta, por tanto, la importancia de la presencia de poros en los sustratos, tanto para la proliferación celular (deseada), como para la de bacterias (no deseada), siendo determinante el tamaño de poro para esta última. 4.2 Evaluación de los tratamientos de modificación superficial para la mejora de la osteointegración El estudio para mejorar la integración del hueso y los sustratos se llevó a cabo siguiendo líneas distintas, tal y como se expone en el apartado ” 3.2. Mejora de la capacidad de osteointegración: tratamientos de modificación superficial”. 4.2.1 Ataque químico por inmersión: análisis de la topografía, la integridad estructural y la capacidad de adhesión celular Tal y como se ha expuesto en la presente tesis doctoral, se llevaron a cabo dos tipos de ataque por inmersión en HF, a igual concentración, diferenciados en el tiempo de exposición de ataque: 125 y 625 s. Las porosidades, total e interconectada, de los sustratos atacados por inmersión para ambos tiempos de ataque, aumentan en todos los casos con respecto a sus análogos vírgenes (Tabla 26 frente a resultados de Arquímedes de la Tabla 40, respectivamente). Las variaciones de PT tras los ataques de inmersión se grafican en la Figura 105. Capítulo 4 256 Figura 105. Porosidad total por el método de Arquímedes para los sustratos denso y porosos de 100-200 y 250-355 µm, antes (0 s) y tras el ataque por inmersión a 125 y 625 s. De igual forma, dichas diferencias en la porosidad se cuantifican en la Tabla 42, donde se recopilan los incrementos de PT (∆PT), tomando como referencia las muestras vírgenes. Como cabe esperar, se observa que, de forma global, las porosidades aumentan con el tiempo de exposición al ácido, con la excepción de la muestra densa. El sustrato denso virgen se caracteriza por tener una porosidad abierta, como se ha referido anteriormente. El ataque a 125 s aumenta dicha porosidad, acentuando las pequeñas irregularidades que puedan existir en la superficie. Sin embargo, a altos tiempos de ataque (625 s), el efecto que tiene lugar resulta ser contrario, homogeneizando la superficie y desdibujando los poros procedentes del proceso de fabricación. Discusión de resultados 257 Tabla 42. ∆PT (%) de los sustratos denso y porosos de ambos tamaños de partícula de espaciador, atacados a 125 y 625 s por inmersión, con respecto a sus análogos vírgenes por el método de Arquímedes. ∆PT (%) Densa 125 s 5.2 625 s 4.0 100-200 µm 125 s 1.2 625 s 4.5 250-355 µm 125 s 3.1 625 s 4.5 En general, no se observan tendencias muy claras. A pesar de ello, se evidencian cambios en la porosidad de las muestras atacadas. Como se comentó previamente, la porosidad total de los sustratos, antes y después del ataque, resulta ser prácticamente interconectada, representando la porosidad cerrada un porcentaje muy pequeño de la total (Tabla 15 y Tabla 26). Al aumentar la porosidad total tras el ataque, lo que realmente se incrementa es el % de porosidad interconectada. Este hecho pone de manifiesto que, tras el ataque químico, puede favorecerse el crecimiento del hueso al interior del material (bone in-growth). Mediante micro-CT, al igual que ocurrió para los sustratos sin atacar, se caracterizó la porosidad (PT (%), Deq medio y fracción volumétrica de la porosidad en % vs Deq) tras el ataque químico por inmersión a 125 s, mostrándose en la Tabla 43 las variaciones respecto a los sustratos vírgenes. Tabla 43. ∆PT (%) y ∆Deq (%) de los sustratos porosos de ambos tamaños de partícula de espaciador, atacados a 125 s por inmersión, con respecto a sus análogos vírgenes por micro-CT. ∆PT (%) ∆Deq (%) 100-200 µm -0.6 7.1 250-355 µm 4.7 29.8 Capítulo 4 258 La PT del sustrato 100-200 µm de tamaño de espaciador, casi no se ve alterada por el ataque a 125 s, presentando un valor similar al de su sustrato análogo virgen (ver Tabla 17 y Tabla 27). En cuanto al Deq medio, aumenta en un 7,1 % tras el ataque de la muestra. Por su parte, las variaciones, tanto de PT como del Deq de los poros para el sustrato poroso de 250-355 µm, presentan cambios mucho más acusados. En este caso, la PT de la muestra tras el ataque a 125 s se ve incrementada en un 4.7 % con respecto a la muestra virgen, confirmando los resultados preliminares por el método de Arquímedes de la Tabla 42 (mayor incremento para la muestra de mayor tamaño de poro). En cuanto al Deq medio, aumenta un 29.8 %, variación mucho más elevada que para la muestra de menor rango de tamaño de espaciador. Esto puede explicarse debido a una mayor facilidad de intrusión del ácido a través del sustrato de 250-355 µm. Las distribuciones de Deq también muestran de forma gráfica las diferencias que se han expuesto. En general, éstas son más anchas y están desplazadas a la derecha respecto de la de los sustratos vírgenes tras ser atacados a 125 s (Tabla 44). Por otra parte, esto corrobora los resultados expuestos en la Tabla 43, de manera que el ataque ácido incrementa el Deq medio de los poros (Figura 106 y Figura 107), obteniendo en ambas muestras atacadas a 125 s unos parámetros de distribución que resultan ser mayores que sus análogas vírgenes. Discusión de resultados 259 Figura 106. Fracción volumétrica (%) frente a Deq (µm) de los sustratos porosos de titanio de tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm virgen y atacado químicamente por inmersión a 125 s. Capítulo 4 260 Figura 107. Fracción volumétrica (%) frente a Deq (µm) de los sustratos porosos de titanio de tamaño de partícula de espaciador 250-355 µm virgen y atacado químicamente por inmersión a 125 s. Tabla 44. FWHM y Desviación Típica de las distribuciones de Deq de los sustratos porosos antes y después del ataque a 125 s. FWHM (µm) Desv. Típica (µm) 100-200 µm Sin atacar 106.6 45.3 100-200 µm Atacada 135.3 57.5 250-355 µm Sin atacar 98.5 41.8 250-355 µm Atacada 206.0 87.5 Discusión de resultados 261 Mientras que, para los sustratos porosos vírgenes, las curvas correspondientes son relativamente similares (FWHM y desviación típica), el ataque químico genera grandes diferencias de FWHM y desviación típica, siendo estos valores mayores para el sustrato de mayor rango de tamaño de espaciador. Las micrografías SEM de las Figura 57 y Figura 58 para los sustratos atacados químicamente por inmersión, muestran evidencias de un ataque mucho más agresivo para el mayor tiempo de exposición al ácido (625 s) en ambos tipos de sustratos denso y poroso. En los sustratos de 100-200 µm de tamaño de espaciador, las probetas sumergidas se encuentran en contacto con la solución ácida alrededor de todo su volumen, permitiendo la infiltración del fluido por capilaridad a través toda la superficie de la probeta hacia el interior. Por tanto, a mayor tiempo de ataque, más contacto hay entre la solución y los sustratos. Cabe destacar que para las probetas densas atacadas por inmersión (Figura 57), el ataque ha revelado los límites de grano perfectamente delimitados, junto con los poros procedentes del proceso de fabricación en la parte central de los mismos. Adicionalmente, aparecen unas formas geométricas que simulan picaduras sobre los sustratos metálicos, haciéndose especialmente notorias en la parte plana de las matrices de titanio, tanto en la densa como en las porosas (Figura 57 y Figura 58). En cuanto a los sustratos porosos, la topografía del interior de los poros revela un patrón de rugosidad distinto, apreciándose un aumento de rugosidad en la superficie interior de los poros a escala submicrométrica (Figura 59). El resultado es una topografía mucho homogénea. Este patrón se acentúa y se hace más brusco tras el ataque a 625 s. Al adentrarse en la forma geométrica que aparece en la superficie plana de los sustratos, se observa que el patrón de rugosidad generado en su interior es similar al que se genera en las paredes de los poros de los sustratos de 100-200 y 250-355 µm de tamaño de partícula de espaciador (Figura 108). Capítulo 4 262 Figura 108. Imágenes SEM de la muestra porosa de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador tras el ataque por inmersión a 125 s. a) formas geométricas de la parte plana a menores aumentos, b) interior de las formas geométricas de la parte plana a mayores aumentos, c) pared de uno de los poros de la muestra a menores aumentos y d) pared de uno de los poros a mayores aumentos. En el ataque por inmersión, cuando el tiempo de exposición al ácido aumenta (625 s), las estratificaciones que estaban presentes en el interior de los poros de los sustratos atacados a 125 s se suavizan, reduciendo los escalones que genera el ataque. Adicionalmente, tiene lugar la aparición de formas geométricas, similares a las observadas en la parte plana de los sustratos atacados a 125 s, en las paredes de los poros tras el ataque a 625 s, acentuando aún más el patrón de rugosidad generado (Figura 109). Discusión de resultados 263 Figura 109. Interior de un poro de la muestra de 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador que presenta formas geométricas tras el ataque por inmersión a 625 s: a) Pared del poro a menores aumentos y b) pared del poro a mayores aumentos. En este contexto, se sometió a las muestras atacadas por inmersión (125 s) a la técnica de micro-CT, tal y como se procedió con los sustratos vírgenes. Los resultados de la Figura 60 evidencian una distribución de Rugvol (%) más amplia para el menor rango de tamaño de partícula de espaciador (100-200 µm) frente a la del tamaño de 250-355 µm. Este hecho se explica en términos de superficie, ya que, a menor tamaño de poro, se obtiene una mayor área específica y, por tanto, una topografía más rugosa. Cuando la solución de ataque penetra en el interior de las muestras, ésta atacará de forma más significativa aquel sustrato que presente más superficie de contacto, generando consecuentemente, una topografía adicional a la existente en los vírgenes. Comparando los sustratos porosos atacados a 125 s con sus correspondientes vírgenes (Figura 110 y Figura 111), se observa en ambos sustratos que este tiempo de ataque por inmersión presenta los histogramas desplazados ligeramente hacia la derecha del sustrato sin atacar. Esta desviación se debe al incremento de rugosidad que experimenta la superficie de los sustratos tras el ataque químico. Capítulo 4 264 Figura 110. Distribución de la rugosidad volumétrica (%) para el sustrato poroso de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm virgen y atacado químicamente por inmersión a 125 s. Discusión de resultados 271 Figura 113. Curvas tensión () - deformación () obtenidas por el ensayo de compresión para los sustratos porosos de titanio con rango de tamaño de partícula de espaciador 100- 200 µm y 250-355 µm, vírgenes y atacados por inmersión a 125 y 625 s. Ensayo realizado bajo la norma ASTM E9-09 [244]. En cuanto al límite de fluencia, se observan valores similares para un mismo tipo de sustrato. Sin embargo, se aprecia una disminución clara del límite de fluencia (σy) con relación a los resultados obtenidos para los sustratos vírgenes (Tabla 46), como consecuencia de un aumento de la PT. El límite de fluencia σy, además, depende del tamaño de poro, mostrando valores más bajos conforme el Deq medio aumenta. Capítulo 4 272 Tabla 46. Comparación del límite de fluencia de las muestras porosas de rango de tamaño de partícula de espaciador 100-200 y 250-355 µm, antes y tras ser atacadas químicamente por inmersión a 125 y 625 s. Límite de fluencia (σy) calculado por la norma convencional ASTM E9-9. Límite de fluencia, σy (MPa) 0 s 125 s 625 s 100-200 µm 126.9 60.0 62.0 250-355 µm 117.8 23.0 22.0 Tras las caracterizaciones llevadas a cabo, se confirma que las variaciones microestructurales y topográficas llevadas a cabo mediante el ataque químico conllevan una modificación severa de la superficie y porosidad de los sustratos, en términos de volumen y de morfología. Asimismo, se produce una disminución de las propiedades mecánicas con el aumento del tiempo de ataque. Por tanto, el ataque químico, potencialmente mejora factores que favorecen la osteointegración, pero empeora su comportamiento mecánico. Tras la caracterización llevada a cabo, es necesario el estudio de viabilidad biológica de los sustratos atacados. Varios estudios han reportado que la topografía, química y la energía superficial de los biomateriales metálicos tienen una gran influencia en la adhesión celular inicial y en el proceso de diferenciación osteoblástica [261, 262]. Además, está recogido en la literatura que el incremento en los valores de rugosidad tras el ataque químico o el anodizado conllevan un incremento del área superficial, mejorando así los procesos de adhesión y diferenciación celular [263, 264]. La Figura 65 muestra, en general, una mayor actividad metabólica tras 24 h de cultivo a mayor tiempo de ataque. Además, se observa una actividad metabólica más notable para los sustratos denso y poroso de 250-355 µm atacados por inmersión a 625 s. Por su parte, el sustrato de 100-200 µm de tamaño de partícula de espaciador presentó un comportamiento con niveles similares para ambos tiempos de ataque. Sin embargo, el sustrato con mayor actividad metabólica entre Discusión de resultados 273 los sustratos atacados por inmersión a 125 s fue el de 100-200 µm, mientras para 625 s fue el de 250-355 µm. Tras 4 días de cultivo, los sustratos presentaron tendencias distintas (Figura 66). En concreto, la muestra de mayor rango de tamaño de espaciador mostró los niveles más altos para el tiempo de ataque por inmersión de 125 s, seguida por el sustrato de 100-200 µm atacado a 625 s. En el caso de las probetas densas, los valores fueron similares para ambos tiempos de ataque. Los resultados obtenidos son similares a los reportados por Chang et al., quienes cultivaron células madre mesenquimales sobre superficies de titanio con un 70 % de porosidad. De igual forma, aunque la densidad celular tras 24 h resultó ser baja, ésta aumentó debido a la migración y proliferación tras 4 días de cultivo [265]. En general, las muestras atacadas por inmersión a ambos tiempos tras 7 días de cultivo no obtuvieron grandes diferencias al compararlas entre sí (Figura 67). Destaca la muestra porosa de 100-200 µm, ya que presentó valores similares para ambos tiempos de ataque. Por otro lado, también es interesante remarcar la disminución de actividad metabólica del sustrato de 250-355 µm, atacado a 625 s. Por último, la actividad metabólica celular sobre los sustratos de titanio tras 10 días de cultivo (Figura 68), muestra, en general para todas las muestras atacadas, unos niveles mayores de proliferación para el tiempo de ataque de 125 s. Adicionalmente, revela la mayor proliferación para la muestra densa atacada a 125 s. En lo referente a las muestras porosas, sin embargo, los niveles más altos se centraron en aquéllos atacados durante 125 s, siendo mayor para el sustrato de menor rango de tamaño de espaciador. Los resultados obtenidos tras 10 días de cultivo no revelan diferencias significativas para el sustrato de los del sustrato de 250-355 µm, atacado a 625 s al ser comparado con 7 días de cultivo. Si se analiza la adhesión celular, así como la proliferación, medidas mediante los niveles de actividad metabólica que presenta cada tipo de sustrato (estado virgen y atacado químicamente por inmersión a 125 y 625 s), se observa, a grandes rasgos (Figura 114, Figura 115 y Figura 116), que si se comparan las muestras atacadas a Capítulo 4 274 125 s con sus correspondientes vírgenes, estos niveles también resultan ser superiores en el caso de los sustratos porosos vírgenes. En cuanto a los tiempos de ataque, los mayores resultados se obtienen para las muestras atacadas a 125 s frente al ataque a 625 s, tras 10 días de cultivo en todos los casos. Esto implica que, el ataque por inmersión a 625 s puede considerarse demasiado agresivo, generando una rugosidad adicional quizás demasiado pequeña para que las células consigan una buena adhesión. Esto último se confirma en las curvas de la Figura 114, Figura 115 y Figura 116, donde se ilustran las tendencias de proliferación celular en función del tiempo de ataque para cada sustrato. En general, se observan los mejores resultados para el tiempo de ataque de 125 s, de forma que la proliferación aumenta considerablemente conforme avanzan los días de cultivo. Por el contrario, el tiempo de ataque a 625 s presenta, para todos los sustratos estudiados, una proliferación más lenta a lo largo de los días de cultivo, obteniendo unos valores finales menores. El motivo puede ser la obtención de una rugosidad que no es la adecuada para que las células se adhieran al sustrato, por tratarse de un ataque más agresivo, como se comentó anteriormente. En cuanto a las muestras vírgenes, las tendencias observadas no son claras. Mientras que para la muestra densa, como cabe esperar debido a su superficie pulida, los niveles de proliferación crecen de forma más lenta y son menores (Figura 114), para la muestra porosa de 250-355 µm se aprecia un comportamiento contrario, alcanzando mayores niveles y de manera más rápida que la muestra atacada a 125 s (Figura 116). Con respecto al sustrato de menor rango de tamaño de espaciador (Figura 115), la curva revela una proliferación más lenta que para las muestras atacadas químicamente durante 7 días de cultivo, alcanzando en la fase final (10 días), niveles similares a los obtenidos tras el ataque a 125 s. A la vista de estos resultados, se puede concluir que los sustratos vírgenes, con la excepción del denso, poseen una rugosidad adecuada para la proliferación de bacterias. Sin embargo, los niveles de proliferación se ven mejorados tras el tratamiento químico por inmsersion de las muestras a 125 s, obteniendo un crecimiento más rápido durante los días de cultivo. Discusión de resultados 275 Figura 114. Adhesión tras 24h y evolución de la proliferación celular tras 4, 7 y 10 días de cultivo sobre el sustrato denso virgen, y atacados por inmersión a 125 s y a 625 s respectivamente. Figura 115. Adhesión tras 24h y evolución de la proliferación celular tras 4, 7 y 10 días de cultivo sobre el sustrato poroso de 100-200 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador virgen, y atacados por inmersión a 125 s y a 625 s respectivamente. Capítulo 4 276 Figura 116. Adhesión tras 24h y evolución de la proliferación celular tras 4, 7 y 10 días de cultivo sobre el sustrato poroso de 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador virgen, y atacados por inmersión a 125 s y a 625 s respectivamente. En relación con las imágenes obtenidas por microscopía invertida de fluorescencia, se muestran tendencias similares a las observadas para los sustratos vírgenes. En la etapa de adhesión celular (Figura 69), se manifiesta una mayor densidad celular para el sustrato denso frente a los porosos, para el tiempo de ataque de 125 s. Por el contrario, el resto de los sustratos atacados (625 s), muestran niveles de densidad celular similares. Este hecho, observado previamente en los cultivos con C2C12- GFP de los sustratos vírgenes, indica una vez más que las células se adhieren tras 24 h a los sustratos porosos, pero de manera deficiente, debido a la pérdida en la siembra. Sin embargo, la densidad celular aumenta considerablemente tras el estudio de proliferación (Figura 70). En concreto, se observa un mayor crecimiento de las células en el interior y en el borde de los poros para las ambas muestras porosas atacadas a 125 s, destacando también el sustrato poroso de 250-355 µm de rango de tamaño de espaciador atacado a 625 s. Puede establecerse que, en cuanto al tiempo de ataque, no se aprecian grandes diferencias para el sustrato con mayor tamaño de partícula de espaciador. Sin embargo, para el de 100-200 µm, se muestra una mayor densidad celular a 125 s. Discusión de resultados 277 Al comparar los resultados por microscopía de microscopía de fluorescencia invertida de los sustratos atacados con sus análogos vírgenes (Figura 46), se confirma lo expuesto anteriormente: los mayores niveles de densidad celular, y, por tanto, de proliferación, se obtienen para las muestras vírgenes y para los sustratos atacados a 125 s. En relación con la morfología, se observa que, tras 24 h, las células depositadas en el sustrato macizo presentan una forma más irregular, manifestando la adhesión a la superficie de éste. Sin embargo, las muestras porosas muestran células más redondeadas y desenfocadas, sin influencia del tipo de ataque. Este hecho corrobora que la adhesión aún no ha sido completa, de manera que es posible encontrar las células en el fondo del pocillo o bien dentro de los poros, tal y como ocurre en los sustratos vírgenes previamente estudiados. Por el contrario, tras 7 días de cultivo, en ambos tipos de sustratos porosos atacados, las células presentan una morfología de tipo fibroblástica, consecuencia de que se han adherido a la superficie de las muestras y han adecuado su forma a la topografía de esta. En este caso, las células desenfocadas se aprecian dentro de los poros, confirmando así la potencialidad de los sustratos porosos para mejorar el bone in-growth. En este contexto, el sustrato con mayor rango de tamaño de espaciador (250-355 µm), muestra considerablemente más células desenfocadas que el de menor rango (100-200 µm). Tras esto, se puede afirmar que un mayor tamaño de poro permite una mayor infiltración del tejido óseo en el interior del implante. En general, las tendencias son similares entre los sustratos antes y después del ataque químico, presentando una densidad celular menor tras 24 h de cultivo para los sustratos porosos como consecuencia del proceso de siembra. Sin embargo, la modificación superficial de los sustratos de titanio mediante ataque químico conlleva una mejora en la adhesión, proliferación y diferenciación celular con respecto a las muestras vírgenes. En concreto, el ataque químico a 125 s favorece la biocompatibilidad celular, mientras que el de 625 s mejora la diferenciación de osteoblastos. Adicionalmente, se ha constatado que el tamaño de poro tiene Capítulo 4 278 influencia en el comportamiento de las muestras atacadas (Figura 118 y Figura 119), mientras que es un parámetro no determinante en los sustratos vírgenes (Figura 117). Figura 117. Adhesión tras 24h y evolución de la proliferación celular tras 4, 7 y 10 días de cultivo sobre los sustratos porosos de 100-200 y 250-355 µm vírgenes. Discusión de resultados 279 Figura 118. Adhesión tras 24h y evolución de la proliferación celular tras 4, 7 y 10 días de cultivo sobre los sustratos porosos de 100-200 y 250-355 µm atacados por inmersión a 125 s. Figura 119. Adhesión tras 24h y evolución de la proliferación celular tras 4, 7 y 10 días de cultivo sobre los sustratos porosos de 100-200 y 250-355 µm atacados por inmersión a 625 s. Capítulo 4 280 En este caso, los resultados muestran que, un menor tamaño de poro origina mayores niveles de proliferación celular en los sustratos atacados para ambos tiempos de ataque (125 y 625 s), lo que se facilitaría una mayor infiltración del tejido óseo en el interior del implante. Sin embargo, en cuanto a los vírgenes, los niveles de proliferación son similares para ambos tipos de muestra, no influyendo así el tamaño de poro en el comportamiento celular. 4.2.2. Recubrimientos cerámicos bioactivos El empleo de los recubrimientos como la HA y el BG tienen el objeto de transformar las superficies de bioinertes a bioactivas, promoviendo en ambos casos la formación de HA. La HA (Ca10(PO4)6(OH)2) es un fosfato cálcico cuya composición y estructura son muy similares a las del hueso, como se ha comentado anteriormente. Está formada por una relación Ca/P semejante a la del componente inorgánico de la matriz ósea, por lo que resulta ser un acelerador en la formación de tejido óseo. Es por ello que, resulta ser un material altamente atractivo para las aplicaciones biomédicas. Viabilidad y efectividad del uso de la técnica de sol-gel como ruta para deposición de hidroxiapatita sobre sustratos porosos En la presente Tesis, se estudia el sistema sustrato de titanio poroso recubierto con HA, con el fin de mejorar la osteointegración. Por ello, dicha combinación se estudia de forma análoga a los sustratos vírgenes, caracterizando el recubrimiento de manera microestructural y tribomecánica, con el fin de evaluar la homogeneidad, adhesión e integridad del recubrimiento. Es necesario mencionar la ausencia del estudio de la muestra densa recubierta con HA, debido a la falta de adhesión y de puntos de agarre sobre la superficie pulida de la misma. La Figura 72 muestra los espectros correspondientes a EDX de cada tipo de sustrato poroso recubierto. En ambos se detectan los elementos principales por excelencia de la HA: Ca, P y O. Cabe destacar que los picos de todos los elementos son más intensos para el sustrato poroso de 100-200 µm de rango de tamaño de Discusión de resultados 287 partículas que forman parte del recubrimiento. Las gráficas (Figura 76) muestran una mayor resistencia al rayado para el sustrato recubierto de mayor tamaño de poro (menor penetración durante el ensayo de rayado a carga incremental), reforzando los resultados de micro-indentación Vickers (menor espesor del recubrimiento de HA, mayor influencia de la matriz metálica para el sustrato de menor rango de tamaño de espaciador). Debido a que a grandes cargas se evalúa el sustrato de titanio (la penetración es mayor que el espesor del recubrimiento) y a un recubrimiento poroso que conlleva una adherencia incompleta, se realizaron ensayos de rayado a carga constante de 3 N, de forma que fuera posible evaluar en su mayor parte el recubrimiento. La Figura 77 también muestra, en la pre-palpación, un recubrimiento de HA mucho más homogéneo para la muestra de mayor rango de tamaño de partícula de espaciador, como se ilustró anteriormente. De forma cuantitativa, estos mismos resultados se pueden observar en los parámetros de rugosidad del perfil, donde los valores son ligeramente superiores para la muestra de 100-200 µm. Esta misma tendencia es la trazada por los parámetros de rugosidad de la Tabla 30, obtenidos por microscopía confocal. En cuanto a la penetración permanente, la topografía resulta ser de nuevo mucho más abrupta para el caso del tamaño de espaciador de 100-200 µm, ya que hay un mayor número de poros por unidad de longitud bajo la capa de HA que se ha depositado, dejando entrever que la infiltración del recubrimiento en los poros de este tamaño es menor. Como consecuencia, los parámetros de rugosidad de la Tabla 32 resultan ser mayores para el menor tamaño de poro. La Figura 78 muestra por su parte la recuperación elástica que experimentan ambos sistemas de sustrato poroso de titanio – recubrimiento. En general, la penetración in situ durante el rayado, así como la permanente (Figura 122), resultan ser mayores para el tamaño de partícula de espaciador de 250-355 µm. De nuevo, la explicación se debe a un menor espesor y una mayor homogeneidad del recubrimiento. Es por ello, que la recuperación elástica en esta combinación resulta ser algo menor (Tabla 33), como consecuencia de una mayor influencia del recubrimiento cerámico frente al sustrato Capítulo 4 288 metálico. Por el contrario, en el caso del tamaño de partícula de espaciador de 100- 200 µm, la heterogeneidad del recubrimiento de HA conlleva una mayor recuperación elástica en términos generales, como consecuencia de que la matriz metálica presenta menor rigidez que la HA (cerámica). Figura 122. Penetración permanente de los sustratos porosos de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm y 250-355 µm recubiertos de HA mediante la técnica de sol-gel. Atendiendo a las diferencias entre sustrato virgen y sustrato recubierto para el tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm (Tabla 49), se observa una topografía más rugosa para las muestras con la capa de HA, como cabría esperar frente a un sustrato pulido, debido a la propia naturaleza de la HA (rugosa), la acumulación de las partículas de HA en ciertas zonas de la muestra y a la infiltración del recubrimiento en los poros. Frente a la penetración permanente y a la recuperación elástica, se obtienen diferencias no esperadas, debido a la rigidez de la HA como material cerámico frente a la matriz metálica. Sin embargo, esto se debe a diversos factores: en primer lugar, el recubrimiento depositado es altamente poroso, con una fracción volumétrica de poros mayor que la de los discos porosos de titanio, de manera que las propiedades mecánicas del recubrimiento son mucho Discusión de resultados 289 menores que las del sustrato; por otro lado, al realizar el ensayo de rayado parte del recubrimiento se desprende, penetrando más el indentador. De igual forma, al desprenderse el recubrimiento, es posible arrastrar más material y que se produzcan ciertas acumulaciones, de forma que se falseen los datos de recuperación elástica cuando se comparan con los sustratos vírgenes. Tabla 49.Comparación de los parámetros de rugosidad de la topografía, valor medio de penetración permanente y recuperación elástica (RE) del sustrato poroso de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm. 100-200 µm Prepalpación Penetración permanente (µm) RE (µm) Ra (µm) Rq (µm) Ry (µm) Rz (µm) Virgen 4.9 5.2 32.5 32.5 4.9 4.0 Recubrimiento de HA 15.6 18.4 59.8 59.8 36.0 11.9 Tras esta discusión, se valida la técnica de sol-gel como medio para depositar recubrimientos de HA, así como el tratamiento térmico de la HA depositada a 450 ºC, obteniéndose un recubrimiento poroso y adherido a la superficie del sustrato de titanio, en el que la estructura de la HA resulta ser cristalina. Esta adhesión de la HA se debe a una unión mecánica, en el que los poros funcionan como puntos de anclaje, así como a cierta unión química. No obstante, se observan mejores propiedades mecánicas para el menor tamaño de poro (100-200 µm), como consecuencia de una mayor influencia del sustrato metálico poroso frente a la cerámica depositada. El recubrimiento de HA ejerce un doble papel: por un lado, previene la corrosión del sustrato, ya que reduce la liberación de iones metálicos; en segundo lugar, convierte la superficie inerte en una superficie con un recubrimiento bioactivo, promoviendo así la adherencia del hueso. Capítulo 4 290 Capacidad de la técnica de sedimentación por goteo para depositar recubrimientos de vidrios bioactivos: relación entre los parámetros del proceso y las propiedades de las capas de BG En esta ruta propuesta para la mejora de la osteointegración, las partículas del BG 45S5 se depositaron en forma de capas sucesivas, lo que permitió el estudio y optimización de distintos sistemas recubrimiento de BG – sustrato de titanio. Otros parámetros principales para tener en cuenta en la obtención de un recubrimiento con buena integridad estructural son los relativos al tratamiento térmico al que se somete el sistema. En la presente tesis doctoral, siguiendo experiencias previas, se utilizó una rampa para el proceso de sinterizado de las partículas de BG de hasta 820 ºC, manteniendo esta temperatura durante 5 s en condiciones de alto vacío. La optimización del recubrimiento, como se ha mencionado anteriormente, tuvo como objetivos principales la consecución de la homogeneidad de éste al sustrato, de una correcta capacidad de infiltración hacia el interior de los poros, así como adherencia y una integridad microestructural adecuada, sin presencia de grietas o de desconche (cracking y chipping). Se evaluaron los sustratos denso y porosos de titanio con distinto rango de tamaño de partícula de espaciador y la deposición de diversas capas de recubrimiento, como muestra las macrografías de la Figura 79, realizándose hasta tres capas. En las macrografías se puede observar la influencia de las variables anteriormente mencionadas (sustrato y numero de capas). Se aprecia cómo a medida que aumenta del número de capas, se consigue una mayor homogeneidad e infiltración del recubrimiento a través de los poros de la matriz de titanio, en especial para el sustrato poroso de rango de tamaño de partícula de espaciador de 100-200 µm. En cuanto a la adhesión del BG sobre los sustratos de titanio, resulta ser mejor para los sustratos porosos una vez se ha realizado el tratamiento térmico, debido a la no presencia de grietas ni de desconches en el recubrimiento, no ocurriendo lo mismo para el caso del denso. Este hecho se debe principalmente a dos factores. Por un lado, a la diferencia de coeficiente de expansión térmica (TEC) entre sustrato y Discusión de resultados 291 recubrimiento, de manera que la presencia de grietas en el sustrato denso es inevitable. En segundo lugar, a los puntos de anclaje que presentan los sustratos porosos frente a los densos, como consecuencia de la rugosidad de las paredes de los poros y de la interconectividad entre los mismos [36, 52, 58]. Por otro lado, la heterogeneidad de la topografía del recubrimiento disminuye conforme aumenta el número de capas, ya que las partículas de BG se van depositando unas sobre otras. Este efecto resulta ser mayor para los sustratos porosos de titanio, debido a que dichas partículas van rellenando los poros hasta cubrirlos en su mayor medida. Por ello, la cantidad de BG que queda depositada es mayor en los sustratos porosos que en el denso, de forma que es posible esto promoverá una mayor formación de HA tras sumergir los sustratos en SBF, como se verá en apartados posteriores de la presente tesis doctoral. La Figura 80 muestra una micrografía SEM del corte transversal de la probeta de 100-200 de rango de tamaño de partícula de espaciador recubierta, donde se puede apreciar la infiltración de las partículas de BG en los poros descubiertos de la superficie, promoviendo potencialmente una infiltración mayor del hueso al interior del sustrato, así como una mejor osteointegración, objetivo principal de este trabajo. Dicha infiltración se corrobora con el análisis de EDX de las distintas zonas del sistema sustrato-recubrimiento, mostrando concretamente picos intensos de Si y Ca para el caso del poro infiltrado en comparación a la matriz de titanio y a un poro interno y aparentemente aislado en el interior de esta. Como cabe esperar, dichos resultados fueron similares tanto para la muestra densa como la porosa de 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador. En cuanto a la morfología del 45S5, cabe destacar que, tras el tratamiento térmico, el BG pasa de un estado amorfo a un estado cristalino, tal y como muestran los difractogramas de la Figura 81. De esta forma, se confirma la fase cristalina Na2Ca2Si3O9, cuyos patrones característicos se encuentran en la cartoteca PDF 22.1455. Esta misma fase ha sido también identificada en la literatura tras el proceso de sinterización de otros vidrios [34,182, 280]. Capítulo 4 292 La cristalización de los vidrios bioactivos ha sido ampliamente estudiada en la literatura, de forma que la aparición de la fase cristalina del silicato de calcio sódico (Na2Ca2Si3O9) depende fuertemente del tamaño de partícula de vidrio, así como de las condiciones a las que se lleva a cabo el tratamiento térmico. En concreto, dicha fase se hace predominante en condiciones de alta temperatura, por encima de los 800–1000°C. En la Figura 123, se presentan los difractogramas de los recubrimientos de BG sobre muestras porosas de rango de tamaño de partícula de espaciador de 100-200 µm, tratados térmicamente en dos equipos distintos. Por un lado, se empleó un horno de molibdeno, y por otro, un horno de tubo cerámico. En ambos casos, la rampa de calentamiento fue la misma (820ºC durante 5 s, atmósfera de 10-5 mbar y enfriamiento en el horno). Se observa que, para el horno de molibdeno, el estado del recubrimiento es totalmente cristalino, mientras que, para el horno de tubo cerámico, se obtiene una morfología de las partículas semicristalina, mostrando una pequeña parte amorfa. Cabe cuestionarse la razón por la que, tratándose del mismo ciclo térmico, las mismas condiciones de atmósfera y un enfriamiento en el horno, se generan resultados tan distintos. Uno de los principales motivos, es que cada horno tiene una inercia de temperatura distinta, no siendo posible el mismo control de temperatura y de la rampa del tratamiento térmico. Otro de los factores que afectan al proceso es el propio controlador del horno, así como la precisión de éste, no siendo posible determinar la temperatura real a la que se realiza el proceso. Estos hechos ponen de manifiesto la importancia no sólo del tratamiento térmico en el proceso de sinterizado del vidrio, sino también la del equipo donde se lleva a cabo, imponiendo la necesidad de optimización de éste para obtener un recubrimiento adecuado en cuanto a propiedades bioactivas. Discusión de resultados 293 Figura 123. Espectro XRD del sustrato poroso de 100-200 de rango de tamaño de partícula de espaciador, recubierto con 3 capas de BG, sometidos al proceso de sinterizado (820 ºC durante 5 s), tras la deposición del recubrimiento en a) un horno de molibdeno y b) un horno de tubo cerámico. En líneas generales, las Figura 82 y Figura 83 muestran un recubrimiento homogéneo, pero no continuo, sobre ambos sustratos porosos. Sin embargo, se observa una peor sinterizabilidad en el caso del recubrimiento del sustrato poroso de rango de tamaño de espaciador 250-355 µm, ya que se observan ciertas grietas micrométricas. Este hecho se puede explicar debido a que, en dicho sustrato, hay menor número de poros por unidad de superficie, por lo que la matriz remanente de titanio entre ellos es mayor. Puesto que la superficie está pulida (como ocurría en el caso del sustrato denso frente al poroso comentado previamente), la aparición de grietas como consecuencia de la diferencia de TEC es irremediable. En cuanto a la sinterizabilidad del recubrimiento, tanto para las zonas planas como para las porosas, cabe destacar que a mayores aumentos en las imágenes SEM se observa la misma morfología y estructura de las partículas de BG (Figura 82 y Figura 83, b y c). Adicionalmente, dichas micrografías corroboran la microporosidad de este recubrimiento. En cuanto al recubrimiento sobre los poros, en el caso del sustrato de rango de tamaño de espaciador de 100-200 µm (Figura 82 c), la infiltración del recubrimiento se evidencia de manera clara hacia el interior de éste, mientras que para el mayor Capítulo 4 294 rango de tamaño, las partículas de BG se reparten de manera más regular (Figura 83 c). Por su parte, la Figura 84 presenta este hecho de manera brusca y acentuada, dejando ver en ciertas zonas la matriz de titanio bajo el recubrimiento, como consecuencia de la adhesión deficiente de las partículas de BG a la superficie de la muestra. En la Figura 124 se muestra la presencia de grietas sobre el sustrato denso, que originan el desconche del recubrimiento como consecuencia de un déficit en la adherencia a la matriz metálica. Figura 124. Micrografía SEM de las grietas formadas sobre el sustrato denso tras el recubrimiento de BG de 3 capas. En este contexto, es interesante el estudio del espesor de recubrimiento obtenido tanto para el sustrato denso como para el poroso de 100-200 µm (Figura 85). Se observa cómo se obtiene un espesor mayor con la presencia de porosidad, debido a que la adherencia al sustrato es mejor. Debido a esto, cabe plantearse la influencia tanto de la porosidad del sustrato como del tamaño de poro. La Figura 125 presenta las imágenes SEM de sustratos porosos de una porosidad del 30 % en volumen Discusión de resultados 295 para dos rangos distintos de tamaño de espaciador (100-200 y 355-500 µm). Tras la medida de los espesores, se obtuvo para el sustrato con menor rango de tamaño de partícula de espaciador un recubrimiento de 138 µm, mientras que para el tamaño mayor el espesor disminuyó drásticamente (51 µm). En cuanto a la influencia del tamaño medio de poro de los sustratos para una misma fracción volumétrica de porosidad, se evidencia que, a gran tamaño tiene lugar una mayor infiltración del recubrimiento en el interior de los poros, debido a un mayor volumen a rellenar por las partículas de vidrio (Figura 125 b y d). Consecuentemente, el espesor resultante es menor. Figura 125. Micrografías SEM de la sección transversal de sustratos porosos de a) y b) 100- 200 µm; c) y d) 355-500 µm, de rango de tamaño de partícula de espaciador tras el recubrimiento de BG de 3 capas. Ambos con una porosidad del 30 % en volumen. Infiltración de las partículas de BG en los poros del sustrato. Capítulo 4 296 Comparando los resultados obtenidos para los sustratos estudiados en esta tesis doctoral (50 % en volumen de porosidad), se puede establecer que, a mayor porosidad, el espesor aumenta para un mismo tamaño medio de poro, debido al aumento de área específica del sustrato en el interior de los poros, que implica una mayor adhesión. La infiltración del recubrimiento en el interior los sustratos porosos se observa también en las imágenes de la topografía 3D realizadas por microscopía confocal (Figura 86), donde el recubrimiento se presenta, de forma visual, más uniforme al infiltrarse en los poros del sustrato de mayor rango de tamaño de partícula de espaciador (250-355 µm). Sin embargo, atendiendo a los parámetros de rugosidad mediante confocal, la topografía del recubrimiento resulta ser más rugosa tanto en la parte plana como en la parte porosa para el sustrato poroso de 250-355 µm (Tabla 34). Si se comparan los parámetros de los sustratos porosos recubiertos con los sustratos vírgenes, se observa, sin embargo, que mientras que en las zonas planas la rugosidad de la topografía aumenta al depositar el recubrimiento, en las zonas porosas la tendencia es contraria, disminuyendo los valores de dichos parámetros de forma clara (Tabla 50). Esto se debe a que la zona plana de la muestra virgen se encuentra pulida, mientras que, en la zona porosa, al depositarse el recubrimiento las partículas se adhieren a las paredes rugosas y rellenan los poros, de forma que los patrones de rugosidad comentados en el apartado 4.1, quedan sobrepuestos por el BG. Tabla 50. Comparación de rugosidad aritmética Sa (µm), obtenida a partir de la microscopía confocal láser, entre los sustratos porosos de 100-200 y 250-355 µm de rango de tamaño de partícula de espaciador, sin recubrir y recubiertos con 3 capas de BG. Sa (µm) Virgen Recubrimiento de HA Recubrimiento de BG 100-200 µm Plana 5.0 31.9 3.2 Porosa 15.5 8.1 250-355 µm Plana 3.4 23.2 6.1 Porosa 30.8 18.2 Discusión de resultados 303 en los poros del sustrato, y como consecuencia una liberación y posterior consumo de iones mayor. Esta circunstancia se corrobora al comparar los resultados de concentración de los iones de Si, donde la solución de la muestra porosa presenta 6.1 mg/ml frente 2.7 mg/ml para la densa. El intercambio de iones Si entre la solución de SBF y el recubrimiento de vidrio resulta de gran internes de estudio, ya que tanto la concentración de Si como la bioactividad del vidrio se ven muy influenciadas por las propiedades químicas y físicas del vidrio (área superficial, rugosidad y composición química entre otras). El rol de los iones Si en el hueso humano tiene una doble función en cuanto a bioactividad se refiere. Por un lado, ciertos autores reportan que la presencia de estos iones promueve la formación y proliferación de osteoblastos, pero a su vez, inhibe el proceso de inducción y actuación de los osteoclastos [281]. Al recubrir los sustratos de titanio con proteínas, los macrófagos reaccionan con el titanio generando un fenotipo M1, el cual evoluciona a un fenotipo M2 típico en el proceso de regeneración de tejidos. Mientras que los osteoblastos generan hueso, los osteoclastos son células especializadas en la resorción de la matriz ósea, de forma que contribuyen en la remodelación del hueso. Si los osteoclastos se erradican completamente, pueden tener lugar efectos tóxicos por diferentes componentes [282]. En este contexto, es sumamente importante tener un equilibrio que autorregule ambas funciones (homeostasis), y, por tanto, se hace necesario el controlar la liberación de iones Si de la capa de recubrimiento de BG. En cuanto al contenido de Ti en la solución, resultó ser despreciable para todas las muestras (≤ 0.003 mg/ml), confirmando la integridad estructural de las muestras fabricadas. Los difractogramas de la Figura 92 muestran la formación de HA tras la inmersión durante 21 días de las muestras recubiertas con BG en SBF, con el fin de evaluar la influencia del número de capas. Tras la inmersión de los sustratos durante 21 días en SBF, mediante DRX, se ha determinado que la fase cristalina de la capa de BG, Na2Ca2Si3O9, comienza a Capítulo 4 304 desaparecer, dando lugar a una capa de HA sobre la superficie de los mismos. En el caso de 1 capa de BG para la muestra porosa de 100-200 µm de tamaño de partícula de espaciador, el difractograma (Figura 92 A) no muestra los picos característicos de la HA, revelando que no se ha producido su formación. Sin embargo, para el caso de los discos denso y poroso recubiertos con 3 capas (Figura 92 B y C), se observa que la fase cristalina Na2Ca2Si3O9 desaparece completamente, como se reporta en estudios previos [184]. Dichos difractogramas presentan los picos característicos de la HA, corroborando su formación [183,184] [283, 284]. La aparición de HA para los casos de recubrimiento de 3 capas puede explicarse debido a que la cantidad de vidrio depositado sobre los sustratos es mayor. De esta forma, se confirma que su formación no depende en sí de la presencia de la fase cristalina previamente comentada antes de la inmersión en SBF [285, 286]. Este hecho plantea la mejora potencial en la osteointegración para aplicaciones biomédicas futuras [287, 288]. En cuanto a los difractogramas de la Figura 92, cabe destacar la presencia de TiO2 en fase rutilo y anatasa, siendo el rutilo predominante. Ciertos estudios han reportado que ambas fases tienen, además, un efecto positivo en términos de mejora de osteointegración [289]. La Figura 93 presenta las micrografías SEM de los sustratos recubiertos con BG (denso y porosos de ambos rangos de tamaño de espaciador estudiados en este trabajo), tras la inmersión de estos en SBF durante 21 días. En ellas se observa la ausencia de HA para los sustratos recubiertos con 1 capa de BG, mientras que existe una clara presencia para los sustratos recubiertos con 3 capas. Por ello, se corrobora que la fase cristalina no influye en la inhibición de formación de HA, como se expuso anteriormente. Tras el análisis realizado, se determina la importancia de la velocidad de la temperatura y la atmósfera durante el tratamiento térmico del BG, para el control de la cristalización del vidrio y de las propiedades mecánicas, ligadas a la microporosidad de este, la calidad de unión entre las partículas de BG y la intercara sustrato-recubrimiento. En este sentido, es de suma importancia alcanzar un Discusión de resultados 305 compromiso entre la diferencia de TEC y la bioactividad del vidrio tras la posible cristalización. En cuanto a la formación de HA, se aprecia un aumento de la bioactividad para el recubrimiento constituido por 3 capas. Las imágenes SEM de las probetas recubiertas con 3 capas de BG muestran la morfología típica de la HA (Figura 93), similar a la encontrada en la literatura [183,184, 283, 284]. Tras el análisis, se puede concluir que, a mayor número de capas, mayor BG es depositado. A mayores aumentos, se aprecia una morfología de las partículas de HA aproximadamente regular en cuanto a forma, pero no en tamaño, así como la formación de aglomerados cristalinos, también observada en el recubrimiento de HA por la técnica de sol-gel (Figura 75). En cuanto a la HA depositada por esta técnica y la precipitada tras sumergir los sustratos recubiertos con BG en SBF, se evidencia que, aunque la morfología de las partículas es similar, estas resultan ser mayores para el caso del recubrimiento con BG, así como tiene lugar una mayor formación de compuestos policristalinos (Figura 127). Para el caso de la HA formada por sol-gel, sólo es posible observar dicha morfología a grandes aumentos, debido a la presencia de partículas extremadamente finas. De igual forma, se visualiza una mayor porosidad para el recubrimiento de HA por la técnica de sol-gel, reforzando que dicha porosidad puede ser un factor claramente influyente en las propiedades mecánicas y biofuncionales del sistema sustratorecubrimiento. Capítulo 4 306 Figura 127. Micrografías SEM de la HA para el sustrato poroso de titanio con tamaño de partícula de espaciador 100-200 µm, recubierto con: a) HA mediante la técnica de sol-gel y b) 3 capas de BG mediante la técnica de goteo tras la inmersión durante 21 días en SBF. Si se comparan las imágenes SEM de la HA obtenida en la presente tesis doctoral, tanto del recubrimiento por la técnica de sol-gel como la formada tras la inmersión de los sustratos recubiertos con 3 capas de BG en SBF durante 21 días, con HA de Discusión de resultados 307 procedencia humana y sintética (Figura 128), se confirma que las morfologías son muy próximas entre sí. En concreto, la HA obtenida por la técnica de sol-gel (Figura 128 c) muestra rasgos muy similares a la HA de procedencia sintética (Figura 128 b). Por su parte, la HA formada tras la inmersión en SBF (Figura 128 d), muestra un tamaño mayor y unos aglomerados más regulares y redondeados. Figura 128. Micrografías SEM de HA de distintas procedencias: a) humana, b) sintética, c) del recubrimiento de HA de los sustratos de titanio obtenido por la técnica de sol-gel y d) HA formada a partir de la inmersión de los sustratos de titanio recubiertos con BG en SBF durante 21 días. Tras este análisis de las HA obtenidas, de carácter semi-cuantitativo, se validan las técnicas empleadas como potencialmente útiles en uno de los objetivos más importantes de la presente tesis doctoral: la posible mejora de la osteointegración. Capítulo 4 308 4.2.3. Efecto del recubrimiento de SPEEK como agente antibacteriano La caracterización del recubrimiento consistió en la evaluación visual y del comportamiento bacteriano de éste, con el fin de cuantificar la capacidad antibactericida. Las micrografías SEM de la Figura 95 muestran un recubrimiento que cubre de forma homogénea a la superficie de los sustratos (denso y poroso), dejando entrever la topografía de los sustratos vírgenes, suavizando de alguna manera las irregularidades de estos en su superficie (bordes de los poros). Sin embargo, cabe destacar la presencia de burbujas de aire en la superficie de los recubrimientos, como consecuencia de una adhesión no perfecta a las muestras. En concreto, se aprecia un mayor número de burbujas en la muestra densa, conllevando una disminución de la adherencia. Tras los estudios del comportamiento bacteriano de los sustratos recubiertos, se observó una ligera disminución en el caso de la muestra densa, mientras que para las porosas de ambos rangos de tamaño de espaciador el crecimiento se inhibió prácticamente para la concentración inicial y las diluciones -1 y -2 (Figura 96). Estas observaciones pueden ser explicadas por dos factores y/o su combinación. En primer lugar, es posible que el recubrimiento rellene las cavidades de los poros, impidiendo, por tanto, la penetración de bacterias y su proliferación en su interior. Esto se debería a la buena infiltración que tiene lugar en los sustratos porosos, como se ha demostrado tras la deposición de otros recubrimientos en trabajos previos sobre sustratos similares (PEEK/chitosan, vidrios bioactivos/chitosan, HA/vidrios bioactivos, etc.) [290, 291]. Cabe destacar que este hecho podría afectar también en términos de oseointegración. Sin embargo, no habría influencia sobre el equilibrio biomecánico de los sustratos, ya que el recubrimiento tan sólo repercute en la superficie de éstos. Por otro lado, la presencia de sulfatos puede ser la razón de la inhibición de proliferación bacteriana, gracias a la capacidad esterilizadora que presenta. Discusión de resultados 309 Por tanto, se puede establecer que el tratamiento superficial de recubrimiento de los sustratos de titanio con SPEEK, inhibe la proliferación de MRSA para todo tipo de muestra, tanto porosas como densa, siendo potencialmente una solución antibacteriana muy económica. 310 311 Capítulo 5: CONCLUSIONS 312 319 Bibliografía 320 Referencias 321 Referencias [1] G. J. Owens, R. K. Singh, F. Foroutan, M. Alqaysi, H. C.M., C. Mahapatra, H. Kim and J. C. Knowles, "Sol-gel based materials for biomedical applications," Prog. Mater. Sci., vol. 77, pp. 1-79, 2016. [2] M. Roser, "Life Expectancy," [Online]. Available: https://ourworldindata.org/life-expectancy. [3] R. U. Anatomy & Physiology, "OpenStax CNX," [Online]. Available: https://cnx.org/contents/FPtK[email protected]:g-vsB2Y2@4/Exercise-Nutrition-Hormones-and- Bone-Tissue. [4] L. L. Hench and J. Jones, Biomaterials, Artificial Organs and Tissue Engineering, Cambridge, England: Woodhead Pub. Ltd., 2005. [5] S. V. 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