Papel de la glutaminasa en la progresión de esteatosis a esteatohepatitis

- 1 - Papel de la glutaminasa en la progresión de esteatosis a esteatohepatitis Lugar de realización: Grupo SeLiver (Laboratorio 213), Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) Marzo 2022 – Junio 2022 Tutor: Co-tutora: Alumna: Manuel Romero Gómez Rocío Muñoz Hernández Vanessa García Fernández GARCIA FERNANDEZ VANESSA - 72547888T Firmado digitalmente por GARCIA FERNANDEZ VANESSA - 72547888T Fecha: 2022.06.04 17:42:16 +02'00' MUÑOZ HERNANDE Z ROCIO - 48820459S Firmado digitalmente por MUÑOZ HERNANDEZ ROCIO - 48820459S Fecha: 2022.06.05 17:58:34 +02'00' ROMERO GOMEZ MANUEL - 34061923G Firmado digitalmente por ROMERO GOMEZ MANUEL - 34061923G Fecha: 2022.06.05 22:38:39 +02'00' - 2 - ÍNDICE 1. Resumen y palabras clave .................................................................................. 1 2. Introducción a. Esteatosis hepática metabólica ............................................................... 2 b. Glutaminolisis ........................................................................................ 3 i. Glutaminolisis y esteatosis ......................................................... 4 ii. Glutaminolisis y fibrosis ............................................................ 7 c. Tratamiento ............................................................................................ 7 d. Factores genéticos .................................................................................. 8 3. Objetivos ............................................................................................................ 10 4. Materiales y métodos a. Reclutamiento de pacientes .................................................................... 11 b. Determinación de los niveles de glutamina/glutamato .......................... 12 c. Determinación de polimorfismos genéticos en SCL1A3 y SCL1A5 ...... 14 d. Análisis del microsatélite en la región promotora del gen GLS ............ 15 e. Aislamiento de células epiteliales humanas de orina ............................. 15 f. Caracterización de las células epiteliales ............................................... 16 g. Reprogramación de células epiteliales a iPSCs...................................... 17 h. Análisis estadístico ................................................................................. 19 5. Resultados a. Características basales de los pacientes ................................................. 20 b. Niveles de glutamato, glutamina y ratio glutamato/glutamina .............. 21 c. Niveles de glutamato, glutamina y ratio glutamato/glutamina en función de la fibrosis .............................................................................. 21 d. Estudios de los polimorfismos genéticos en SLC1A3 y SLC1A5 en Pacientes EHmet y su correlación con los niveles de glutaminaglutamato solubles en suero ................................................................... 23 e. Estudio/Determinación del microsatélite de la región promotora del gen GLS y su correlación con los niveles de glutamina-glutamato Solubles en suero .................................................................................... 24 f. Aislamiento de células epiteliales a partir de orina de pacientes ........... 27 g. Caracterización de células epiteliales ..................................................... 28 h. Desdiferenciación de células epiteliales a iPSCs ................................... 30 6. Discusión ............................................................................................................ 34 - 3 - 7. Conclusión .......................................................................................................... 37 8. Bibliografía......................................................................................................... 38 - 1 - RESUMEN La esteatosis hepática metabólica (EHmet) es una enfermedad compleja caracterizada por el acúmulo de grasa en los hepatocitos, pudiendo progresar a cirrosis o carcinoma hepatocelular. Actualmente, existe un gran interés en la búsqueda de un método diagnóstico preciso y fiable, así como una gran necesidad de establecer una opción terapéutica eficaz. Los estudios actuales respaldan la idea de que la enzima glutaminasa (GLS) podría ser una buena diana terapéutica para frenar el avance de la enfermedad ya que, está fuertemente implicada en la aparición de la esteatosis y la fibrosis. Objetivos: (i) Determinar los niveles solubles de glutamina y glutamato en pacientes con EHmet diagnosticados por biopsia hepática. (ii) Estudiar polimorfismos genéticos en SLC1A3 y SLC1A5, ambos implicados en las rutas de glutaminolisis, en pacientes EHmet y su correlación con los niveles de glutamina-glutamato solubles en suero. (iii) Análisis del microsatélite en la región promotora del gen GLS y su correlación con los niveles de glutamina-glutamato solubles en suero. (iv) Aislamiento de células epiteliales de orina de pacientes con EHmet con distintos polimorfismos genéticos. (v) Caracterización de las células epiteliales. (vi) Desarrollo de un modelo in vitro de EHmet, basado en iPSCs provenientes de células epiteliales del paciente. Materiales y métodos: (i) Reclutamiento de pacientes para el estudio. (ii) Determinación de los niveles de glutamato y glutamina séricos en pacientes. (iii) Determinación de los polimorfismos genéticos en SCL1A3 y SCL1A5 en los pacientes. (iv) Análisis del microsatélite en la región promotora del gen GLS. (v) Aislamiento de células epiteliales de orina de pacientes. (vi) Reprogramación a iPSCs. Resultados: Existe relación entre el ratio de glutamato/glutamina con la severidad de la patología y con la fibrosis. Además, la presencia de un alelo del microsatélite largo o corto está relacionado con la severidad de la enfermedad, la esteatosis y el ballooning. Conclusión: Los pacientes con esteatohepatitis mostraron niveles significativamente superiores de glutamato y del ratio glutamato/glutamina. Existe una relación entre la longitud del microsatélite GLS y la presencia de esteatosis simple. Además, el aislamiento de células epiteliales de orina es una técnica que nos permite obtener iPSCs de manera no invasiva. PALABRAS CLAVE EHmet, iPSCs, glutaminolisis, glutamato, GLS, microsatélite - 2 - INTRODUCCIÓN ESTEATOSIS HEPÁTICA METABÓLICA La Esteatosis Hepática metabólica (EHmet) o NAFLD (non-alcoholic fatty liver disease) es una patología que tiene una prevalencia del 25%, pero que está aumentando debido a la pandemia de la obesidad, siendo una enfermedad de gran relevancia en nuestra sociedad(1). Además, se ha convertido una de las causas más comunes de enfermedad hepática en el mundo(2). EHmet es una enfermedad que se caracteriza por la presencia de esteatosis hepática (SS, simple esteatosis), que es la característica benigna de la enfermedad, donde se presenta un acúmulo excesivo de triglicéridos en los hepatocitos. La enfermedad puede progresar dando lugar a una esteatohepatitis (NASH, non-alcoholic steatohepatitis), donde la inflamación y el ballooning (degeneración del hepatocito) juegan un papel importante. Como estamos ante una enfermedad progresiva, puede llegar a desarrollarse cirrosis e incluso cáncer hepático(3) (Figura 1). Figura 1. Desarrollo de la enfermedad(4) Además de afectar al hígado, EHmet puede afectar a otros órganos, considerándose una enfermedad multisistémica. Los pacientes tienen un riesgo aumentado de padecer diabetes mellitus tipo II, enfermedades cardíacas y cardiovasculares o incluso enfermedad renal crónica(5). Aunque sea una de las enfermedades más relevantes del mundo, su patogénesis no se conoce completamente todavía, ya que es compleja y multifactorial(2). Es una enfermedad progresiva que tiene distintas manifestaciones y velocidad de progresión en cada paciente, ya que hay muchos factores de riesgo que entran en juego. Algunos de los factores de riesgo más importantes son el metabolismo, factores genéticos, la microbiota intestinal o factores ambientales entre otros(6). - 3 - Figura 2. Representación de la Fisiopatología de la enfermedad hepática metabólica (Madrilejos R, 2018)(7). Uno de los mecanismos más importantes por los que se va a desarrollar la enfermedad es la superación de la capacidad del hígado para metabolizar los sustratos energéticos primarios, carbohidratos y ácidos grasos, provocando estrés hepatocelular, lesiones e incluso muerte hepatocelular. El estrés es uno de los desencadenantes de la fibrosis(3). La acumulación de ácidos grasos libres en el hígado es uno de los primeros eventos por los que se caracteriza la enfermedad (2). Además, va a ocurrir una reducción de la beta-oxidación de los ácidos grasos, aumento de la lipogénesis de novo y alteraciones en la secreción de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)(8). Debido al estrés hepatocelular, las células hepáticas estrelladas (HSC) van a adquirir un fenotipo activo dando lugar a miofibroblastos(9), que son capaces de producir matriz extracelular (MEC), generando un desbalance entre la producción y degradación de MEC. El exceso de MEC va a producir una acumulación indeseada en el hígado, provocando la fibrosis. Esta fibrosis puede seguir progresando y evolucionar a cirrosis, e incluso, a cáncer hepático(10). GLUTAMINOLISIS La glutaminasa es una de las enzimas principales que regulan el metabolismo de la glutamina ya que es la encargada de catalizar el primer paso del proceso de obtención de glutamato y - 4 - amonio a partir de glutamina. El amonio obtenido es detoxificado por el hígado, por lo que los pacientes que tengan afectaciones hepáticas no van a ser capaces de eliminar ese amonio, como ocurre en los pacientes EHmet(11)(12). Por ello, los niveles de amonio estarán aumentados, provocando cambios morfológicos y activación de las HSC o incremento de la producción de ROS entre otras alteraciones(13). Existen dos tipos de isoformas de la glutaminasa: GLS1 y GLS2. La GLS2 es la principal enzima del hígado y su gen se localiza en el cromosoma 12, mientras que GLS1 es más ubicua y se encuentra en los riñones principalmente y está codificada por un gen del cromosoma 2. Se ha visto que en pacientes con cirrosis o cáncer hepático existe un cambio metabólico y GLS1 pasa a ser la isoforma más abundante en el hígado. La relevancia de la expresión de está isoforma en EHmet se conoce poco(14)(15). El glutamato que ha formado la glutaminasa a partir de glutamina es catabolizado por la glutamato deshidrogenasa o las transaminasas [glutamato-oxalacetato transaminasa (GOT), glutamato piruvato transaminasa (GPT) y fosfoserina transaminasa (PSAT)], dando como producto el -cetoglutarato, que se oxidará mediante el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA)(16). Por otro lado, el amonio generado por la glutaminasa será detoxificado mediante el ciclo de la urea. Figura 3. Representación del Metabolismo de la glutamina en condiciones fisiológicas Glutaminolisis y esteatosis Una característica de EHmet es la acumulación de lípidos en los hepatocitos. Ese acúmulo intrahepático de triglicéridos podría estar causado por una secreción disfuncional de las VLDL(17). En modelos animales con dieta deficiente en colina, que es el sustrato principal de la - 5 - síntesis de los fosfolípidos de la membrana de las VLDL, se produce un acumulo de grasa intrahepática(18). Si además de déficit de colina, se propone un modelo animal con dieta deficiente también en metionina, se encuentran cambios significativos en los niveles séricos de glutamina(19). Además, se ha demostrado que en el modelo animal con dicha alimentación durante seis semanas, aumenta los niveles de expresión tanto a nivel de ARNm como a nivel proteico de GLS1(15). Simon et al, también han demostrado recientemente que hay una sobreexpresión de GLS1 tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína en pacientes con esteatohepatitis frente a controles sanos. En cambio, la expresión de GLS2 disminuye en los pacientes con esteatohepatitis frente a controles sanos(15), confirmando que GLS1 juega un papel importante en la patogenia del EHmet. Además, Simon et al, también ha demostrado que la inhibición de GLS1 en el modelo deficiente en colina y metionina, reducía el estrés oxidativo y restauraba la síntesis y exportación de triglicéridos VLDL, reduciendo la esteatosis hepática(15). Por todo ello, se concluye que GLS1 está relacionada con la esteatosis hepática en EHmet. Trabajos previos de nuestro grupo realizados en un modelo animal HFHCC (High-Fat High Carbohidrate diet) mostraron un incremento en los niveles relativos de ARNm en el tejido de ratones con NASH vs control y esteatosis simple (p=0,019 y p=0,021, respectivamente) (Figura 4) Figura 4. Representación de la media de expresión de los niveles de GLS1 respecto al grupo control ± la desviación estándar. fold change gls1 (relative to control) Control Steatosis NASH 0 2 4 6 8 10 p=0,021 p=0,019 - 6 - Además, la actividad enzimática de GLS también estaba aumentada en los ratones esteatohepatitis respecto al grupo control (p=0,016) (Figura 5). Figura 5. Actividad específica de GLS1 expresada en mU/mg. Los datos representan la media de actividad en cada grupo ± la desviación estándar. En cuanto a los niveles proteicos de GLS1, también se observa un incremento a medida que va progresando la enfermedad (Figura 6). Control Esteatosis Esteatohepatitis Figura 6. Tinción IHQ con hematoxilina-eosina en tejido de ratón en los diferentes estadios de la enfermedad; control, esteatosis y esteatohepatitis (A, B y C). Tinción IHQ con GLS1 en tejido de ratón en los diferentes estadios de la enfermedad (D, E y F). Specific activity mU/mg Control Steatosis NASH 0 10 20 30 40 50 p=0,016 - 13 - Curva patrón de glutamato: En la placa, añadiremos también una curva patrón de glutamato para usar como control. Para ello, usaremos concentraciones de glutamato de 50 M, 25 M, 12.5 M, 6.25 M, 3.125 M, 1.56 M, 0.78 M y 0 M. El Glutamato del Kit de Promega tiene una concentración de 10 M por lo que para preparar la muestra de 50 M añadiremos 1 l de Glutamato y 199 l de PBS. Además, se añadirán 100 l de PBS en todos los Eppendorf restantes. De los 200 l de la concentración de 50 M se añaden 100 l al Eppendorf de 25 M y se diluye bien. Del Eppendorf de 25 M se cogen 100 l para añadirlos al Eppendorf de 12.5 M y así sucesivamente. La curva patrón también se cargará por duplicado. El esquema de la placa es el siguiente: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A M1 M1 M1 M1 M2 M2 M2 M2 M3 M3 M3 M3 B M4 M4 M4 M4 M5 M5 M5 M5 M6 M6 M6 M6 C M7 M7 M7 M7 M8 M8 M8 M8 M9 M9 M9 M9 D M10 M10 M10 M10 M11 M11 M11 M11 M12 M12 M12 M12 E M13 M13 M13 M13 M14 M14 M14 M14 M15 M15 M15 M15 F M16 M16 M16 M16 M17 M17 M17 M17 M18 M18 M18 M19 G 50  M 25  M 12.5  M 6.25  M 3.125  M 1.56  M 0.78  M 0  M M19 M19 M19 M19 H 50  M 25  M 12.5  M 6.25  M 3.125  M 1.56  M 0.78  M 0  M M20 M20 M20 M20 Glutaminase Enzyme Solution Glutaminase Buffer Preparación de los reactivos: Glutaminase Enzyme Solution (42 pocillos) Glutaminase Buffer 1050 l Glutaminase 5.25 l - 14 - Glutamate Detection Reagent (98 pocillos pocillos) Luciferin Detection Solution 4900 l Reductase 24.5 l Reductase Substrate 24.5 l Glutamate Dehydrogenase 98 l NAD 98 l Primero se añaden 25 l de Glutaminase Enzyme Solution o Glutaminase Buffer según el pocillo correspondiente y después se añaden 25 l de las muestras correspondientes en cada pocillo. Posteriormente se da una agitación y se incuba durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Luego añadir 50 l de Glutamate Detection Reagent en todos los pocillos y tras la agitación, incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Tras ese tiempo, leer la placa utilizando un lector de placas Infinite® 200 Pro. 3. DETERMINACIÓN DE POLIMORFISMOS GENÉTICAS EN SCL1A3 Y SCL1A5 El genotipado va a permitir analizar el ADN de los pacientes para conocer las bases específicas de nuestros SNP (single-nucleotide polymorphism) de interés. Para realizar el genotipado, primero se obtendrá el ADN de los pacientes partiendo de sangre total mediante MagNA Pure Compact Instrument (Roche). Para el genotipado, necesitamos preparar en un Eppendorf la siguiente mezcla para añadir 9l en cada pocillo de la placa. Máster mix 5 l/pocillo Primers + sonda 0.25 l/pocillo H2O 3.75 l Además, en cada pocillo también se añadirá 1 l de la muestra de ADN correspondiente. El volumen final será de 10 l (9 l de la mezcla + 1 l de la muestra). - 15 - Los SNP elegidos son los siguientes: - rs313853 (gen SCL1A5) - rs2562582 (gen SCL1A3) Se utilizará el kit FastStart Essential DNA Probes Master (Roche). Las placas que se utilizan son placas de 96 pocillos. Las sondas utilizadas son TaqMan y se utiliza la PCR a tiempo real (QuantStudio1, ThermoFisher). El protocolo que se utiliza tiene 40 ciclos de PCR. 4. ANÁLISIS DEL MICROSATÉLITE EN LA REGIÓN PROMOTORA DEL GEN GLS La determinación del microsatélite en los pacientes fue realizada por el D. Antonio Gil Gómez. Para ello, se realizó una amplificación de la región de interés del promotor de GLS mediante PCR. Los amplicones obtenidos fueron separados por tamaño mediante electroforesis capilar. 5. AISLAMIENTO DE CÉLULAS EPITELIALES HUMANAS DE ORINA Antes de comenzar con el protocolo de aislamiento de las células epiteliales, tenemos que preparar la solución de gelatina (Gelatina 1% PBS). Para conseguir 500 ml de la solución del Gelatina 1% PBS, tenemos que utilizar 5g de gelatina y 500 ml de PBS. Posteriormente, se tiene que autoclavar durante 30 minutos y conservar la solución a temperatura ambiente (RT). También hay que preparar los medios que se van a utilizar: 1. El medio D10 (500 ml), que está compuesto por: 1. 445 ml de DMEN high glucose 2. 50 ml FBS (Fetal Bovine Serum) 3. 5 ml de GPS 100x (Penicilin, Streptomyclin, Glutamine 100x) 2. El medio K (500 ml), que contiene: 1. 395 ml de EBM-2 (Endothelial Basal Medium) 2. 100 ml de FBS 3. 5 ml de GPS 100x - 16 - 4. Alícuotas: 10ml FBS, 2 ml hFGF-B, 0.5 ml VEGF, 0.5 ml R3-IGF-1, 0.5 ml ascorbic acid, 0.5 ml hEGF, 0.5 ml GA-1000, 0.5 ml Heparin 5. Posteriormente, hay que filtrarlo mediante el Sterilcup. Ambos medios se tienen que conservar a 4ºC y hay que calentarlos a 36ºC antes de utilizarlos. Para la obtención de células epiteliales utilizaremos placas de 6 pocillos que hay que tratar con 2 ml de gelatina al menos durante 10-15 minutos a 37ºC. Para el aislamiento de las células epiteliales, necesitaremos al menos 50 ml de muestra de orina en un envase estéril y se tiene que mantener en frio hasta su uso. Tras alicuotar la muestra, hay que centrifugar los falcon a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Eliminamos el sobrenadante y se resuspende el pellet en 10 ml de medio D10 para volver a centrifugar en las mismas condiciones (1500 rpm, 10 minutos, RT). Finalmente, tras eliminar el sobrenadante, se resuspende el pellet en medio K, que es un medio de aislamiento de células progenitoras. Por cada 50 ml de muestra de orina, se resuspende en 2 ml de medio K y se siembra en 1 pocillo de la placa p6. Se tiene que cambiar el medio K cada 2 días. Tras 7-14 días comenzarán a aparecer colonias de células epiteliales. 6. CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS EPITELIALES Cuando las células ya han crecido, vamos a caracterizarlas, para comprobar que son células epiteliales. Para ello usaremos diferentes marcadores y realizaremos inmunocitoquímica. Vamos a utilizar EpCam – FITC, CD31 – FITC y CD144 – FITC, todos ellos marcadores de superficie. Además, utilizaremos DAPI para teñir el núcleo. Para la inmunocitoquímica, se van a utilizar células epiteliales obtenidas de la orina de pacientes con EHmet y células endoteliales (ECFC) de cordón umbilical para usarlas como control negativo. Ambas son cultivos primarios aislados en el laboratorio. La tinción se va a realizar en cámaras de cultivo de 4 pocillos [4 Chamber Polystyrene Vessel Tissue Culture Treated Glass Slide (354104 / 354114)] para optimizar el uso de los anticuerpos. - 17 - El primer día descongelaremos las células epiteliales de pacientes y las ECFCs de cordón umbilical y las sembraremos en una placa previamente gelatinizada y les cambiaremos el medio cada dos días. Una vez que las células estén confluyentes, retiraremos el medio y lavaremos durante 10 minutos con PBS. Luego, añadiremos PFA 4% durante 20 minutos para fijar las células de la placa. Tras ese tiempo retiramos el PFA 4% y lavamos 3 veces con PBS. Prepararemos PBSBSA a 0,1% (10 ml PBS + 0,01g BSA). Añadiremos 200 l en cada pocillo y lo dejamos 1 hora en agitación, para evitar uniones inespecíficas. Para preparar los anticuerpos fluorescentes, añadiremos 400 l de PBS junto con 6 l del anticuerpo correspondiente (3:200). Los anticuerpos utilizados son EpCam (Invitrogen Anti- Human CD326 Alexa Fluor 488 (53832642)), CD144, (Miltenyi BioTec VE-Cadherin FITC Human (130100742)) y CD31 (BD FITC Mouse Anti-Human CD31 (55445)). Se tienen que dejar durante toda la noche a 4ºC en agitación. El esquema de anticuerpos conjugados que vamos a utilizar es el siguiente: Figura 8. Esquema de la distribución de los anticuerpos. Después, se retira la solución y se lava el exceso 3 veces con PBS. Añadimos DAPI (Invitrogen Termo Fisher Science (D21490)). Para preparar la solución de DAPI (1:1000), añadimos 2 l de DAPI en 2000 l de PBS. Se añade a la placa y se deja 10 minutos para lavar 3 veces con PBS. Finalmente, montamos el porta para observarlo al microscopio con el medio de montaje [VectaMount Permanent Mounting Medium]. 7. REPROGRAMACIÓN Placas de Matrigel: Primero hay que descongelar un vial de BD MatrigelTM (10 ml) en hielo overnight (ON). Los 10 ml de BD MatrigelTM se tienen que mezclar con 20 ml de KnockOut DMEM frio, trabajando siempre en hielo. Finalmente, se alícuota 1 ml en falcon de 50 ml y se guarda a -20ºC hasta su uso. - 18 - Justo antes de tratar las placas con Matrigel, descongelar una alícuota de 1 ml en hielo y añadir 29 ml KnockOut DMEM frio. Tras mezclar bien, añadir el Matrigel en las placas rápidamente y repartir homogéneamente por toda la placa. Finalmente, hay que incubar la placas a RT al menos 1 hora antes de su uso. Si la placa no se va a usar inmediatamente, se tiene que sellar con Parafilm y guardarla a 4ºC máximo 14 días. Antes del uso de la placa, se elimina el exceso de Matrigel y no se lava la placa. Preparación de las células para la transfección: Cuando las células epiteliales estén al 80% de la placa p10, se levantan para poder transfectarlas. Para ello, se tiene que retirar el medio y lavar la placa con PBS. Usando tripsina, se despegan las células de la placa y tras contrarrestar la tripsina con medio D10, se cuentan las células. Por cada reacción se necesitarán 800.000 células. Tras centrifugar las células (1500 rpm; 5 min; RT), eliminar el sobrenadante y lavar las células con PBS. Volver a centrifugar en las mismas condiciones (1500 rpm; 5 min; RT). Tras esta centrifugación, es recomendable eliminar el sobrenadante al máximo. Preparación de los materiales para la transfección: 1. En las placas de p6, se añade medio K sin antibiótico para tenerlo preparado para la transfección, así las células sufren menos. 2. El electroporador que vamos a utilizar es Invitrogen™ Neon™ Transfection System. En la cubeta del aparato negro donde va a entrar la punta con las células, hay que añadir 3 ml de Buffer electrolito (Buffer E). Tras rellenar la cubeta, insertarla en el aparato. Transfección: Tras eliminar bien el PBS (sobrenadante) de las células centrifugadas, resuspendemos las células en 30l de Buffer E (15 l por cada reacción) y hacemos dos transfecciones: a) control sin plásmido y b) células con el plásmido a 1g/l. Cuando ya están las células preparadas para electroporar, se enciende el eletroporador y se programa a 1200v, 15 ms, 4x. Con la punta, se cogen 10 l de la condición control, se introduce - 19 - la pipeta en el tubo Neón y se da el pulso. Tras el pulso se siembran las células inmediatamente en las placas p6 previamente preparadas con medio K sin antibiótico. Se tiene que repetir el mismo proceso para la condición con el plásmido. Tras un día en medio K sin antibióticos, añadir el medio K completo. Se tiene que renovar el medio K cada 48 horas. El día 3 tras la transfección, se empezará a utilizar el medio de reprogramación ReproTeSR Basal Medium, cambiando el medio cada 2 días. Feeding cells: Las feeding cells son células embrionarias irradiadas que se usan para dar soporte a las células transfectadas, las sembraremos en las placas tratadas con matrigel y las dejaremos 48 horas en K-Medium para posteriormente añadir las células transfectadas y co-cultivarlas con las feeding en medio ReproTeSR. Se levantan las células transfectadas y se co-cultivan con las feeding cells utilizando medio de reprogramación (ReproTeSR Basal Medium). El medio se cambia cada 48 horas hasta que comiencen a aparecer las colonias de iPSCs. Suelen tardar unas 2 semanas aproximadamente. 8. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Para analizar si las variables siguen una distribución normal se utilizó el test de Kolmogorov- Smirnov. El test T-student fue usado para comparar las variables con distribución normal y el test U-Mann Whitney para las variables no paramétricas. Para comparar las variables cualitativas se uso el test de chi-cuadrado (χ²). Los datos se compararon y analizaron mediante el software SPSS (versión 22.0; SPSS, Chicago, IL) y GraphPad Prism (versión 6.0; GraphPad Software, La Jolla, CA) fue usado para realizar los gráficos. Para todos los análisis, el valor de p0.05 fue considerado como estadísticamente significativo. - 20 - RESULTADOS 1. CARACTERÍSTICAS BASALES DE LOS PACIENTES Se incluyeron 60 pacientes en el estudio y se clasificaron según el SAF-score, siendo 28 de ellos esteatohepatitis y 22 esteatosis. Los 5 restantes no pudieron ser clasificados por faltar información referente a los datos de actividad de la biopsia hepática. Las características clínicas de los pacientes se encuentran resumidas en la Tabla 1. El porcentaje de mujeres en nuestro estudio es de 53,3%, es decir, 32 son mujeres y la media de edad es de 55,1 ± 11,3. Si analizamos los pacientes en base a la fibrosis, 14 (23,3%) tendrán F0, es decir, no tienen fibrosis. 14 (23,3%) pacientes tienen F1, 10 (16,7%) de los pacientes tienen F2, 12 (20%) tienen F3 y 9 (15%) son F4. Tamaño muestral 60 Mujeres (%) 53,3% (32) IMC (Kg/m2) 35,0± 7,3 Edad 55,1 ± 11,3 GGT (mg/dl) 90,6 ± 114,5 AST (U/L) 46,9 ± 27,3 ALT (UI/L) 55,8 ± 38,0 Fibrosis - F0; %, (n) 23,3% (14) - F1; %, (n) 23,3% (14) - F2; %, (n) 16,7% (10) - F3; %, (n) 20% (12) - F4; %, (n) 15% (9) Colesterol total (mg/dl) 186,0±40,3 HOMA 7,3 ±6,0 Hipertensión arterial (HTA)%, (n) 63,3% (38) Diabetes tipo II %, (n) 58,3% (35) Cirrosis %, (n) 10% (6) Esteatohepatitis 46,7% (28) - 21 - Tabla 1. Características basales de los pacientes. Los datos se expresan con la media ± SD para las variables cuantitativas y como %(n) para las variables cualitativas. IMC: índice de masa corporal, AST: aspartato aminotransferasa, ALT: alanina aminotransferasa; GGT: gamma glutamil transpeptidasa 2. NIVELES DE GLUTAMATO, GLUTAMINA Y RATIO GLUTAMATO/ GLUTAMINA EN ESTEATOSIS VS ESTEATOHEPATITIS Figura 9. Niveles de glutamato, glutamina y el ratio Glu/Gln según el grupo de pacientes (esteatosis vs esteatohepatitis) En la Figura 9 se representan los niveles de glutamato, glutamina y el ratio glutamato/glutamina en los dos grupos de estudio (esteatosis y esteatohepatitis). En el caso de los niveles de glutamato, podemos observar un aumento estadísticamente significativo en los niveles en el grupo de esteatohepatitis frente al grupo de esteatosis, con un p=0,09. En cuanto al ratio Glutamato/Glutamina, también se ve un aumento del ratio de esteatohepatitis frente a esteatosis, con una p=0,035, es decir, estadísticamente significativo. En cambio, en cuanto a los niveles de glutamina, no se observaron diferencias. 3. NIVELES DE GLUTAMATO, GLUTAMINA Y RATIO GLUTAMATO/ GLUTAMINA EN FUNCIÓN DE FIBROSIS Los pacientes también se clasificaron en función de la fibrosis presentada en la biopsia. Como ya hemos mencionado, 14 de los pacientes tenían un estadio de F0, 14 F1, 10 F2, 12 F3 y 9 F4. Esteatosis Esteatohepatitis -10 0 10 20 30 40 50 Ratio glutamato/glutamina p=0,035 Esteatosis Esteatohepatitis 0 500 1000 1500 Glutamato (µM) p=0.009 Esteatosis Esteatohepatitis 0 500 1000 1500 Glutamina (µM) p=0,165 - 22 - Figura 10. Niveles de glutamato, glutamina y el ratio Glu/Gln según el estadio de fibrosis. Como se puede ver en la Figura 10, no hay diferencias significativas en los estadios de fibrosis en los niveles de glutamato, niveles de glutamina o ratio glutamato/glutamina. Por ello, agrupamos la fibrosis en dos grupos: leve o significativa. En la fibrosis leve se incluye los estadios F0, F1 y F2 mientras que la fibrosis significativa agrupa los pacientes con estadios F3 y F4. Tenemos 25 pacientes con fibrosis leve (F0-F1) y 21 pacientes con fibrosis significativa (>F2). Figura 11. Niveles de glutamato, glutamina y el ratio Glu/Gln en función de fibrosis leve o significativa. Los niveles de glutamato están aumentados de manera significativa (p=0,044) en el grupo de fibrosis significativa. En el caso de los niveles de glutamina, están aumentados en el grupo de F0 F1 F2 F3 F4 -10 0 10 20 30 40 50 Ratio glutamato/glutamina F0 F1 F2 F3 F4 0 500 1000 1500 Glutamato (µM) F0 F1 F2 F3 F4 0 500 1000 1500 Glutamina (µM) Leve Significativa -10 0 10 20 30 40 50 Ratio glutamato/glutamina p=0.191 Leve Significativa 0 500 1000 1500 Glutamato (µM) p=0.044 Leve Significativa 0 500 1000 1500 Glutamina (µM) p=0.591 - 29 - Figura 14. ECFCs CD31+/DAPI+ al microscopio de fluorescencia con aumento 10X. Figura 15. ECFCs CD144+/DAPI+ al microscopio de fluorescencia con aumento 10X. Figura 16. Células epiteliales EpCam+/DAPI+ al microscopio de fluorescencia con aumento 20X. Figura 17. Células epiteliales CD31 - / DAPI + al microscopio de fluorescencia con aumento 10X. - 30 - 8. DESDIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS EPITELIALES A iPSCs Figura 18. Células transfectadas tras 72 horas del proceso de transfección. En la figura 18 podemos observar el plásmido dentro de las células. El plásmido está marcado con el marcador con tdTomato, por lo que las células que hayan adquirido el plásmido en su núcleo estarán marcadas de rojo. Además, se observa que el marcaje rojo coincide con células que se observan al microscopio de contraste de fases. Esto quiere decir, que el marcaje rojo no es del fondo, sino que corresponde a una célula. - 31 - Figura 19. Células transfectadas tras 7 días en cultivo. Figura 20. Células transfectadas tras 21 días en cultivo. En la Figura 20 podemos apreciar el estadio pre-iPSCs, último estadio previo a tener las iPSCs. En este punto, levantamos las células y las pasamos a una nueva placa para favorecer el crecimiento y la expansión de la colonia. - 32 - Figura 21. Colonias de iPSCs previa al aislamiento. En la Figura 21 se pueden observar las colonias de iPSCs obtenidas. Estas células estarían listas para levantar y sembrarlas en otra placa (p24) para que sigan creciendo. Figura 22. Colonia de iPSCs tras aislamiento en otra placa (p24) (10X) Figura 23. Colonia de iPSCs aislamiento en otra placa (p24) (20X) - 33 - En las Figuras 22 y 23 podemos observar una colonia de iPSCs tras su aislamiento. - 34 - DISCUSIÓN La esteatosis hepática metabólica (EHmet) aun teniendo una prevalencia del 25% de la población, no tiene tratamiento farmacológico aprobado(1). Los cambios en el estilo de vida es la opción terapéutica que existe hoy en día. Por ello, sería interesante buscar nuevas dianas farmacológicas para poder desarrollar algún tratamiento eficaz. La glutaminolisis, procedimiento por el cual se obtiene glutamato y amonio a partir de glutamina, puede ser una nueva diana terapéutica para los pacientes EHmet(11)(12). Se ha relacionado la glutaminolisis con la fibrosis y la esteatosis. Existen dos tipos de isoformas de la glutaminasa: GLS1 y GLS2. La GLS2 es la principal enzima en el hígado, mientras que la GLS1 tiene una distribución más ubicua, siendo su localización principal los riñones. Se ha visto que en pacientes con cirrosis o cáncer hepático, se produce un cambio metabólico y GLS1 pasa a ser la isoforma más predominante en el hígado(14)(15). Simon et al, demostraron que GLS1 estaba relacionada con la esteatosis en EHmet ya que si se inhibía dicha enzima en un modelo deficiente en colina y metionina, se restauraba la síntesis y exportación de los triglicéridos VLDL, reduciendo así la esteatosis hepática(15). Además, la glutaminolisis también se ha relacionado con la fibrosis. La activación de las células hepáticas estrelladas es importante en la generación de fibrosis y la glutaminolisis es determinante para la reprogramación metabólica necesaria que tienen que ocurrir en las células. La glutaminolisis permitirá el cumplimiento de la alta demanda bioenergética que tienen las HSC activadas. Además, inhibiendo la glutaminolisis, se ha visto que se reduce la acumulación de miofibroblastos(14). Para continuar trabajos previos realizados en nuestro grupo analizamos los niveles séricos de glutamina, de glutamato y el ratio glutamato/glutamina para relacionarlos con distintos aspectos de la enfermedad. Vimos que había una relación significativa de los niveles de glutamato y ratio de glutamato/glutamina en esteatosis vs esteatohepatitis. Los valores tanto del nivel de glutamato como del ratio glutamato/glutamina están aumentados en los pacientes con esteatohepatitis. Simon et al demostraron que había una sobreexpresión de GLS1 tanto a nivel proteico como a nivel de ARNm en pacientes con esteatohepatitis frente a controles sanos(15), - 35 - por lo que nuestros resultados estarían en consonancia con los resultados obtenidos en dicho artículo. Además, en la imunohistoquímica realizada en tejido de ratón en nuestro laboratorio, se observaba el aumento de GLS1 en esteatohepatitis. Además, aunque no obtengamos datos significativos estratificando los pacientes por el grado de fibrosis, si se clasifican en fibrosis leve frente a fibrosis significativa, observamos que los pacientes con fibrosis significativa tienen los niveles de glutamato aumentados de manera significativa. Estos resultados están relacionados con los obtenidos por Du et al, ya que vieron que los hígados que tenían mayor grado de fibrosis disminuían la concentración de glutamina y aumentaba la concentración de glutamato en comparación con hígados no fibróticos(20). En el caso de los SNPs estudiados, no obtenemos datos significativos, por lo que no encontramos asociación entre los genes SLC1A3 y SLC1A5 y la severidad de la patología. Posteriormente, analizando la relación de la longitud de las repeticiones del microsatélite del gen GLS con distintas características de la enfermedad, nos encontramos con una relación significativa entre la presencia de al menos un alelo largo con la severidad de la patología. Se observo que los pacientes que no tenían al menos un alelo largo, eran del grupo de esteatohepatitis predominantemente. Además, si se analiza la presencia de al menos un alelo largo en relación con la esteatosis, se observa que en pacientes con menos grasa hepática hay más presencia de al menos un alelo largo. Según Kuilenburg et al, la presencia de una expansión larga de tripletes produce una disminución de la transcripción de GLS(30), por lo que disminuirá la actividad de la enzima, avanzando menos en la enfermedad. Por eso, aquellos pacientes que no tienen alelos largos tienen un mayor avance de la enfermedad, llegando al estadio de esteatohepatitis. Luego, estudiamos la relación que tiene el microsatélite con el ballooning y vimos que el porcentaje de los pacientes con balonización marcada era menor entre los pacientes con al menos un alelo largo en comparación con los pacientes sin balonización. Al repetir los mismos estudios, pero con la presencia de dos alelos largos, vimos que solo salía significativo en relación con la severidad de la patología. Existe una mayor presencia de dos alelos largo-largo en los pacientes con esteatosis frente esteatohepatitis, por lo que los - 36 - resultados obtenidos estarían en consonancia con los resultados obtenidos por Kuilenburg et al(30). La obtención de iPSCs a partir de la células epiteliales obtenidas de orina de pacientes es un método poco invasivo para obtener una fuente inagotable de iPSCs. Además, estas células tendrán la carga genética del paciente, permitiendo realizar estudios para testar fármacos teniendo en cuenta la genética. Durante la realización del trabajo, conseguimos sembrar un total de 15 orinas de pacientes EHmet, obteniendo células epiteliales en 5 de ellas. Uno de los problemas que hemos tenido durante estos meses es la escasa muestra de orina aportada por los pacientes, ya que necesitamos un mínimo de 50 ml, siendo la muestra menor en diversas ocasiones. También hemos sido capaces de poner a punto el protocolo de reprogramación. Es un protocolo largo y de momento estamos en la fase de pre-iPSC. Cuando obtengamos iPSC, podríamos diferenciarlas a hepatocitos inducidos (iHep), para desarrollar un buen modelo para testar fármacos que actúen en la vía de la glutaminolisis. Esto nos permitiría testar los fármacos en base a la carga genética de los pacientes. Una de las mayores limitaciones de este proyecto es el escaso número de pacientes que hemos podido incluir, por lo que, en un futuro, sería convenientes aumentar el tamaño muestral para obtener resultados más sólidos. En un futuro, también se podría realizar a los pacientes la sobrecarga oral de glutamina (SOG) para poder relacionar los niveles de glutamina, glutamato y el ratio glutamato/glutamina séricos con los resultados obtenidos en la prueba SOG. Sería buena idea estudiar la expresión de GLS en el tejido hepático de los pacientes, para ver si hay alguna relación entre los niveles de glutamato y glutamina con los resultados obtenidos tras la tinción de GLS del tejido hepático. - 37 - CONCLUSIONES - Los pacientes con esteatohepatitis mostraron niveles significativamente superiores de glutamato, y una mayor ratio glu/gln en comparación con los pacientes con esteatosis simple, reflejando una posible alteración en la ruta de la glutaminolisis. - No existió una asociación entre los SNPs en SLC1A3 y SLC1A5 y la severidad de la patología, ni correlación con los niveles de glu/gln plasmáticos. - La longitud del microsatélite en GLS se asoció con la presencia de esteatosis simple en nuestra cohorte, pudiendo estar relacionado con una menor expresión/actividad de la enzima. Sin embargo, no encontramos asociación con los niveles de glu/gln solubles. - El aislamiento de epiteliales de orina de pacientes es una técnica relativamente sencilla y no invasiva y constituye un método eficiente para la obtención de iPSCs. - La obtención de iPSCs de pacientes con distintos polimorfismos asociados a GLS constituirían un modelo in vitro óptimo para el estudio de los fármacos que actúen en esta vía. - 38 - BIBLIOGRAFÍA 1. Mundi MS, Velapati S, Patel J, Kellogg TA, Abu Dayyeh BK, Hurt RT. Evolution of NAFLD and Its Management. Nutr Clin Pract. 2020;35(1):72–84. Doi: 10.1002/ncp.10449. 2. Kuchay MS, Choudhary NS, Mishra SK. Pathophysiological mechanisms underlying MAFLD. Diabetes Metab Syndr Clin Res Rev. 2020;14(6):1875–87. Doi: 10.1016/j.dsx.2020.09.026 3. Friedman SL, Neuschwander-Tetri BA, Rinella M, Sanyal AJ. Mechanisms of EHMET development and therapeutic strategies. Vol. 24, Nature Medicine. Nature Publishing Group; 2018. p. 908–22. 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