Contribución de prefoldina a la expresión génica en células humanas

Contribución de prefoldina a la expresión génica en células humanas Laura Payán Bravo TESIS DOCOTORAL Universidad de Sevilla Marzo 2019 Índice 3 Índice ABREVIATURAS………………………………………………………………………………………………………… RESUMEN………………………………………………………………………………………………………………… INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………………….. 1. La expresión génica. 1.1 La transcripción. 1.1.1 La RNA polimerasa II. 1.1.2 Etapas de la transcripción. 1.1.3 Regulación de la transcripción. 1.2 El splicing. 1.2.1 El espliceosoma. 1.2.2 Definición del exón y del intrón. 1.2.3 El splicing alternativo. 1.2.4 Tipos de splicing alternativos. 1.3 Acoplamiento de la transcripción y el splicing. 2. La prefoldina. 2.1 Tipos de prefoldinas y su estructura. 2.2 Funciones citoplasmáticas. 2.3 Funciones nucleares. 3. Antecedentes. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………………………….. RESULTADOS……………………………………………………………………………………………………………. 1. PFDN5 se localiza mayoritariamente en el núcleo de células HCT116. 2. Estudio transcriptómico en células deficientes en PFDN2 y PFDN5. 2.1 Diseño de los experimentos del RNA-seq. 2.2 La deficiencia en PFDN5 reduce la viabilidad celular, no así la deficiencia en PFDN2. 2.3 La falta de suero modifica ligeramente el ciclo celular de la línea HCT116. 2.4 Obtención de muestras para los experimentos de RNA-seq. 2.5 La deficiencia de PFDN5, y en menor medida la de PFDN2, afecta a la expresión de un alto número de genes. 2.6 La deficiencia de PFDN5 y PFDN2 altera la expresión de categorías funcionales de genes. 2.7 La inducción por suero se ve más afectada por la deficiencia en PFDN5 que en PFDN2, aunque hay solapamiento. 7 13 17 19 19 19 20 24 29 30 32 33 34 35 37 38 41 42 46 49 53 55 58 58 59 62 63 64 68 75 4 Índice 3. La ausencia y deficiencia en PFDN5 afecta al ciclo celular. 3.1 Tanto la ausencia como la deficiencia de PFDN5 provocan una disminución de los niveles del resto de subunidades, aunque no de forma homogénea. 3.2 La ausencia y deficiencia en PFDN5 baja los niveles de expresión de genes de histonas. 3.3 La ausencia y deficiencia en PFDN5 incrementa los niveles de expresión de p21. 3.4 La deficiencia y ausencia de PFDN5 provocan ligeros cambios en el ciclo celular. 4. Prefoldina 5 se encuentra físicamente asociada al gen p21. 5. La deficiencia en PFDN5 afecta negativamente a la inducción por suero de los genes más largos y con mayor número de intrones. 5.1 Tras 90 minutos de inducción por suero, genes más largos o con mayor número de intrones se expresan menos en las células deficientes en PFDN5. 5.2 El tamaño de los genes y el número de intrones ejercen un efecto sinérgico en el nivel de inducción tras la adición de suero en las células deficientes en PFDN5. 6. La deficiencia en PFDN5 y PFDN2 aumenta los niveles de pre-mRNA. 6.1 La deficiencia en PFDN5 y PFDN2 provoca variaciones en la ratio exónica antes y después de la inducción con suero. 6.2 Los cambios en la ratio exónica ocasionados por la deficiencia en PFDN5 se asocian al nivel de expresión de los genes. 6.3 Validación de las alteraciones de splicing observadas tras la inducción por suero en células carentes de PFDN5. 7. La deficiencia en PFDN5 afecta sutilmente a la maduración alternativa del premRNA. 8. La deficiencia en PFDN5 ocasiona defectos en el acoplamiento del splicing del pre-mRNA a la transcripción. 9. La deficiencia y ausencia de PFDN5 disminuye los niveles de RNAPII Ser2-P. 10. No logramos detectar interacciones físicas entre PFDN5, CDK9 y factores de splicing. 11. PFDN5 se asocia físicamente a los genes CTNNBL1 y CD44. 77 77 78 80 81 83 85 85 88 89 89 90 93 95 99 101 104 105 5 Índice DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………………………………... 1. Algunos de los cambios observados en células deficientes en PFDN2 y PFDN5 podrían estar mediados por la función citoplásmica de la prefoldina. 2. Otros de los cambios observados en células deficientes en PFDN5 podrían deberse a su relación con c-Myc. 3. Cambios de expresión de genes relacionados con el control del ciclo celular. 4. PFDN5 contribuye de forma general al proceso de transcripción dependiente de RNAPII. 5. La deficiencia o carencia de PFDN5 causa defectos en el splicing del premRNA. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………………. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………………………………….…. 1. Organismo y condiciones de cultivo. 1.1 Línea bacteriana y condiciones de cultivo. 1.2 Líneas celulares y condiciones de cultivo. 2. Oligonucleótidos y plásmidos. 2.1 Oligonucleótidos. 2.2 Pequeños RNAs de interferencia (siRNAs). 2.3 Plásmidos. 3. Manipulación y análisis del DNA. 3.1 Asilamiento de DNA plasmídico bacteriano. 3.2 Electroforesis de DNA en geles de agarosa. 3.3 Purificación, cuantificación y secuenciación de DNA. 3.4 Amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa. 3.5 PCR a tiempo real. 3.6 Transformación de bacterias por quimiocompetencia. 3.7 Transfección transitoria de líneas celulares animales con DNA plamídico. 4 Manipulación y análisis del RNA. 4.1 Aislamiento y cuantificación del RNA de líneas celulares animales. 4.2 Tratamiento con DNAsa y reacción de retrotranscripción. 4.3 Transfección transitoria de líneas celulares animales con siRNAs. 5 Extracción y análisis de proteínas. 5.1 Obtención de extractos totales de proteínas de líneas celulares animales. 5.2 Electroforesis de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida. 6. Métodos inmunológicos. 6.1 Anticuerpos 107 109 110 111 112 114 119 123 125 125 125 126 126 128 128 130 130 131 131 131 132 132 133 133 133 133 134 134 134 135 135 135 6 Índice 6.2 Ensayo de Western Blot (WB). 6.3 Co-inmunoprecitación. 6.4 Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). 6.5 Inmunofluorescencia (IF). 7. Microscopía de fluorescencia 8. Determinación de focos de γ-H2A.X: IF y conteo. 9. Ensayo de viabilidad celular. 10. Análisis del ciclo celular por citometría de flujo. 11. Análisis masivo de la expresión génica mediante RNA-seq. 11.1 Metodología. 11.2 Análisis bioinformático. 12. Ensayos de splicing. 12.1 Minigenes. 12.2 Análisis de la velocidad y procesividad de la RNAPII y el splicing cotranscripcional. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………………………. 137 138 139 141 142 142 142 143 144 144 145 146 146 146 149 Abreviaturas 15 Resumen La prefoldina es una cochaperona que está presente en todos los organismos eucarióticos. Es conocida principalmente por su importante función en la dinámica del citoesqueleto, al favorecer el plegamiento de los monómeros de actina y tubulina durante su ensamblaje en filamentos de actina y microtúbulos, respectivamente. Adicionalmente, diferentes subunidades de este complejo heterohexamérico han sido encontradas en el núcleo y relacionadas con procesos nucleares en levaduras, plantas y metazoos. En esta tesis nos hemos propuesto estudiar qué papel desempeña la prefoldina en la expresión génica en células humanas. Para ello, hemos realizado un ensayo de RNA- seq que nos permitiera analizar qué efectos ocasionaba la deficiencia de las subunidades PFDN2 y PFDN5 en el transcriptoma de las células, bajo diferentes condiciones nutricionales. Los resultados mostraron que la deficiencia de estas dos subunidades afectó a la expresión de multitud de genes, siendo el efecto de PFDN5 más severo que el de PFDN2. Una parte de estos defectos puede ser explicado como consecuencia indirecta del papel de la prefoldina en la dinámica del citoesqueleto. Otros, pueden explicarse por la conocida función de PFDN5 como co-represor del protoncogén c-Myc. Además de estos efectos predecibles según lo conocido previamente, en nuestros resultados encontramos evidencias de la participación de estas subunidades en otros fenómenos. Por ejemplo, hemos encontrado un efecto de PFDN5 sobre la expresión del gen CDKN1A, que codifica para p21, un represor de la progresión del ciclo celular. Además, hemos detectado que PFDN5 se localiza físicamente sobre dicho gen. Este resultado nos permite explicar su influencia sobre la expresión de genes que se expresan cíclicamente, como los que codifican histonas. Asimismo, hemos detectado que las células deficientes en PFDN5 presentan deficiencias en la expresión de genes en función de sus características físicas, no funcionales, como su longitud o el número de intrones que presentan. También observamos que la deficiencia de PFDN5, y en menor medida la de PFDN2, empeoró de forma generalizada la eficiencia del procesamiento de intrones en el pre-mRNA, especialmente en los transcritos inmaduros de los genes que se expresan más. 16 Resumen Igualmente hemos comprobado que las células deficientes en PFDN5 mostraron defectos en el acoplamiento temporal entre splicing y elongación de la transcripción, así como una disminución drástica de los niveles de fosforilación de la RNA polimerasa II en los residuos Ser2 de su dominio CTD. Los genes que muestran estas deficiencias en ausencia de PFDN5 presentan ocupación de esta proteína a lo largo de su región transcrita. En conjunto, nuestros resultados apoyan que la prefoldina contribuye de forma general al proceso de expresión génica en células humanas, al margen de los efectos regulatorios que sus otras funciones celulares puedan causar indirectamente. Introducción 19 Introducción 1. LA EXPRESIÓN GÉNICA. La expresión génica es el proceso por el cual la información contenida en el genoma es utilizada para dirigir la síntesis de un producto génico específico según el requerimiento de cada organismo en un determinado momento. La molécula más importante en este proceso es el RNA (ácido ribonucleico), pues se encarga de transferir la información genética desde el núcleo, donde reside el DNA (ácido desoxirribonucleico), al citoplasma, donde se lleva a cabo la síntesis proteica por los ribosomas. 1.1. La transcripción. Una de las principales etapas de la expresión génica es la transcripción, donde a partir del DNA se van a sintetizar los distintos tipos de RNA. Entre ellos, los RNA mensajeros (mRNA) van a ser procesados para formar mRNA maduros. Finalmente, serán exportados al citoplasma y traducidos a proteínas por los ribosomas (Svetlov and Nudler, 2013). 1.1.1. La RNA polimerasa II. En los organismos eucariontes, la transcripción es llevada a cabo por tres polimerasas diferentes: la RNA polimerasa I, que transcribe únicamente genes que codifican para los RNA ribosómicos (rRNA) 5.8S, 18S y 28S; la RNA polimerasa II (RNAPII), que transcribe genes que codifican proteínas, así como la mayoría de RNAs no codificantes pequeños nucleares (snRNAs); y la RNA polimerasa III (RNAPIII), que transcribe genes cortos que dan lugar a RNA transferentes (tRNA) y al rRNA 5S (Roeder, 2005). Todas ellas comparten homología en muchas de sus subunidades (Allison et al., 1985; Cramer, 2002). Sin embargo, la subunidad mayor (RPB1) de la RNAPII presenta un extenso dominio carboxiterminal (CTD) sin una estructura definida y evolutivamente conservado, del que carecen el resto de las polimerasas (Chapman et al., 2008; Corden et al., 1985). El CTD está compuesto de varias repeticiones del heptapéptido Tyr1-Ser2- Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Entre los eucariontes, hay una relación directa entre la 20 Introducción complejidad del genoma y la longitud del CTD, desde las 26 repeticiones de levaduras hasta las 52 de mamíferos (Egloff and Murphy, 2008). El CTD de la RNAPII es esencial para la viabilidad de los organismos y la síntesis del RNA, aunque se ha visto que deleciones parciales permiten la supervivencia de éstos (Nonet et al., 1987; Litingtung et al., 1998; Meininghaus et al., 2000). Sin embargo, este dominio es prescindible en la iniciación de la transcripción in vitro (Fong, 2003; McCracken et al., 1997; Zehring et al., 1988). Las fosforilaciones de algunos de los residuos del CTD están relacionadas con diferentes etapas de la transcripción, lo que da lugar a lo que se conoce como código CTD (Egloff and Murphy, 2008). De éstas, las más estudiadas son las fosforilaciones en serina 2 (Ser2) y serina 5 (Ser5) (ver apartado 1.1.2) (Egloff and Murphy, 2008; Patturajan et al., 1998). También la serina 7 (Ser7) es fosforilada, jugando un papel fundamental en la transcripción de snRNAs (ver apartado 1.1.2) (Chapman et al., 2007; Egloff et al., 2007; Yurko and Manley, 2018), así como la treonina 4 (Thr4), requerida para un correcto procesamiento del extremo 3’ de los mRNA de histonas (Hsin et al., 2011). Por tanto, en el código CTD se requieren quinasas y fosfatasas capaces de discernir entre los distintos residuos del CTD que van a fosforilar o desfosforilar, respectivamente. 1.1.2. Etapas de la transcripción. Clásicamente, el proceso de transcripción se divide en 3 etapas: iniciación, elongación y terminación. En cada una de ellas intervienen numerosos factores reguladores como la secuencia del DNA, la estructura de la cromatina (influenciada por las modificaciones de histonas y/o los factores remodeladores de la cromatina) o los factores de transcripción (Panning and Taatjes, 2008). Además, el patrón de fosforilación también regula el acoplamiento de cada fase de la trascripción con otros procesos necesarios para la expresión génica, respondiendo de este modo a diferentes condiciones celulares y extracelulares (Egloff and Murphy, 2008; Montes et al., 2012). 21 Introducción Iniciación. La iniciación de la transcripción comienza con la unión de activadores de la transcripción, en respuesta a un estímulo, a secuencias específicas del DNA situadas aguas arribas del sitio de inicio de la transcripción (TSS, transcription start site). Aunque esta unión es necesaria para inducir la expresión génica, hay genes que muestran niveles de expresión basal en su ausencia (Pugh, 2000). A su vez, estos activadores van a reclutar a otros factores llamados co-activadores, los cuales desempeñarán diversas funciones como regular la actividad del complejo transcripcional, modificar y remodelar la cromatina, comunicar con los activadores y reclutar a la maquinaria transcripcional (Taatjes et al., 2004). Entre los principales co-activadores se encuentra el complejo multiproteico Mediator, el cual es necesario para el ensamblaje del complejo de preiniciación (PIC, pre-initiation complex) (Conaway et al., 2005). El PIC está formado por la RNAPII y los factores generales de transcripción (GTFs), los cuales posicionan a la RNAPII sobre los elementos reguladores del DNA, determinando, de este modo, el sitio de inicio de la transcripción. Los GTFs son: TFIIA, TFIIB, TFIID (complejo multiproteico capaz de unirse a secuencias promotoras específicas), TFIIE, TFIIF y TFIIH (complejo encargado de fosforilar la Ser5 del CTD de la RNAPII), todos ellos muy conservados evolutivamente (Buratowski, 2009; Roeder, 1996). La RNAPII y los GTFs, una vez posicionados en el promotor, abrirán la doble cadena del DNA y comenzará la transcripción, formándose los primeros enlaces entre ribonucleótidos complementarios a los de la cadena molde (Grünberg and Hahn, 2013; Sainsbury et al., 2015). Elongación. Durante la elongación se produce la adición de ribonucleótidos a la cadena de RNA creciente. Esta etapa se divide a su vez en dos partes: elongación temprana y elongación tardía, diferenciadas principalmente en el residuo de serina del CTD que se encuentra fosforilado en cada una de ellas. Una vez terminada la fase de iniciación (Figura I-1A), la serina 5 del CTD es fosforilada por la quinasa CDK7 (cyclin dependent kinase 7) que forma parte del TFIIH (Figura I-1B), provocando que el complejo Mediator se disocie de la RNAPII y desestabilice la unión entre la RNAPII y el PIC (Max et al., 2007) Esta fase transitoria 22 Introducción entre la iniciación y la elongación temprana se conoce como promoter clearance o escape del promotor, puesto que dicha modificación facilita que la RNAPII escape del promotor (Buratowski, 2009; Saunders et al., 2006). En la mayoría de los genes de mamíferos, la elongación temprana acaba en una pausa de la RNAPII a unos 20-100 pb del promotor (Jonkers et al., 2014). La fosforilación en Ser2 es necesaria para la salida de esta pausa (Ni et al., 2008). Durante la elongación tardía, la serina 2 del CTD es fosforilada por la quinasa CDK9, subunidad catalítica del factor de elongación positivo P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor-b), aunque también pueden hacerlo las quinasas CDK12 y CDK13 (Figura I-1C). Esta modificación convierte a la RNAPII en su forma procesiva (Buratowski, 2009; Liang et al., 2015). En esta fase también va a ser fosforilada la Ser7, lo cual es necesario para reclutar a la fosfatasa que va a desfosforilar a Ser5-P (Yurko and Manley, 2018). Las fosforilaciones en Ser2 y Ser5 permiten a la RNAPII reclutar a diferentes enzimas y factores que intervienen en los procesos de poliadenilación, capping y splicing (Figura I-1C) así como metiltranferasas y desacetilasas de histonas (Egloff and Murphy, 2008; Jeronimo et al., 2013). También la fosforilación en Ser7 facilita la interacción entre la maquinaría de transcripción e Integrator, un complejo que participa en el procesamiento del extremo 3’ de los snRNAs (Yurko and Manley, 2018). Terminación. La terminación de la transcripción es esencial para evitar la transcripción de genes que estén corriente abajo y prevenir la formación de RNAs antisentidos que puedan interferir con la síntesis normal de pre-RNAs (Richard and Manley, 2009). Esta etapa está íntimamente relacionada con el procesamiento del extremo 3’ del RNA y la poliadenilación (Yonaha and Proudfoot, 2000) (Figura I-1D). De forma general, el reconocimiento del sitio polyA produce cambios conformacionales en el complejo de elongación, haciendo que la RNAPII se disocie de ciertos factores de elongación al mismo tiempo que otros necesarios para la terminación de la transcripción son reclutados (Richard and Manley, 2009). 23 Introducción En los genes de mamíferos que codifican proteínas, la terminación de la trascripción se desencadena por el factor específico de corte y poliadenilación (CPSF), el factor estimulador del corte (CstF), y los factores de corte CFI y CFII (Porrua and Libri, 2015). Cuando CPSF, junto con CstF, reconozcan secuencias específicas, como la señal de poliadenilación (PAS), en la región 3’ que no se traduce del RNA, los factores de corte Figure I-1. Modificación del CTD de la RNAPII durante la transcripción de genes que codifican proteínas. A) El CTD de la RNAPII, la cual es reclutada al promotor por el complejo de preiniciación, está desfosforilado. B) El CTD se localiza cerca del canal de salida del RNA. La fosforilación de la Ser5 por la subunidad CDK7 del factor general de transcripción TFIIH, justo después de la iniciación, ayuda a reclutar y activar a las enzimas encargadas del capping del transcrito emergente. C) La subsecuente fosforilación en la Ser2 por la subunidad CDK9 del factor de elongación positivo b (P-TEFb), activa la elongación y el procesamiento del RNA. La fosforilación de la Ser7 también ocurre durante la transcripción, aunque su función en la expresión de genes que codifican proteínas está menos clara (Yurko and Manley, 2018). En levaduras y algunos genes de mamíferos, la Ser5 es desfosforilada a medida que la transcripción avanza hacia el extremo 3’ (Phatnani and Greenleaf, 2008). D) Tras la escisión del pre-mRNA y la poliadenilación, se produce la desfosforilación del CTD, lo cual podría ayudar a que la RNAPII se desacople y esté lista para otra ronda de transcripción. Las fosforilaciones se muestran en círculos naranjas con una “P”. Imagen adaptada de Egloff and Murphy, 2008. 24 Introducción escinden el RNA. A continuación, éste es poliadenilado en el extremo 3’ para favorecer su exportación al citoplasma donde será traducido (Porrua and Libri, 2015). El corte del extremo 3’ del mRNA proporciona un sitio de entrada para la exonucleasa 5’-3’ Xrn2, la cual va a degradar el mRNA naciente hasta alcanzar a la RNAPII que lo está transcribiendo (Porrua and Libri, 2015). Esto hará que la RNAPII sea liberada de la cadena molde de DNA poniendo fin al proceso de transcripción (Richard and Manley, 2009). Una vez liberada la RNAPII, ésta se recicla para sucesivos ciclos de transcripción, lo cual facilita nuevas rondas productivas de elongación (Figura I-1D) (Yao et al., 2007). 1.1.3. Regulación de la trascripción. Hace algo más de una década, la iniciación de la transcripción era considerada como el paso limitante en la regulación de la transcripción. Sin embargo, numerosos estudios realizados en los últimos años establecen la fase de elongación como una etapa determinante en la regulación de este proceso en eucariontes (Price, 2008). Factores reguladores de la elongación de la transcripción. Los factores que regulan la elongación transcripcional se pueden clasificar en dos grupos: factores negativos de elongación (N-TEFs, Negative transcription factor) y factores positivos de elongación (P-TEFs, Positive transcription factor) (Marshall and Price, 1992). Entre los primeros, estarían los factores DSIF y NELF (que como se explicará en siguiente apartado, promueven la parada de la RNAPII). Y pertenecerían a los P-TEFs tanto los clásicos factores TFIIS, TFIIF y p-TEFb, como otros que también promueven la elongación de la transcripción, por ejemplo, las quinasas/fosfatasas encargadas de modificar el CTD de la RNAPII (Sims et al., 2004). A medida que la RNAPII va elongando, va encontrando obstáculos como los nucleosomas o la tensión torsional derivada de la apertura necesaria de la doble cadena, conocida como burbuja transcripcional (Kouzine et al., 2013; Kulaeva et al., 2013). Algunos de esos obstáculos pueden resultar en la terminación prematura de la transcripción (Sheridan et al., 2019). Como consecuencia, los genes más largos, en los 31 Introducción estabilizada con proteínas de la propia U1 snRNP y la presencia de miembros de la familia de proteínas ricas en serina y arginina (SR) (Wahl et al., 2009). Después de esto, se produce la unión del factor de splicing SF1/BBP a la secuencia intrónica conocida como BPS (Branch-Point Sequence) localizada cerca del extremo 3’ del intrón. Al mismo tiempo, también tiene lugar la unión de U2AF65 al tracto de polipirimidinas (Py) y la unión de U2AF35 a la secuencia AG del sitio 3’ de splicing (3’ splice site, 3’SS). Juntas, todas estas interacciones tempranas conforman el complejo E, el cuál es esencial para el reconocimiento inicial de los sitios 5’SS y 3’SS de un intrón (Wahl et al., 2009). A continuación, U2 snRNP se va a unir, por complementariedad de bases, al BPS del pre-mRNA, desplazando del mismo al factor SF1-BBP en una reacción dependiente de ATP que da lugar al complejo A o pre-espliceosoma. Esta unión RNA-RNA es estabilizada por proteínas de la propia U2 snRNP así como por U2AF65 (Wahl et al., 2009). Figura I-4. Ensamblaje del espliceosoma mayor (modelo de definición de intrones) y reacción de splicing. Esquema de la formación de cada complejo (E, A, B, C) durante las etapas de ensamblaje del espliceosoma. Se representan las subunidades snRNPs U1, U2, U4, U5 y U6; así como los factores de splicing SF1 y U2AF. 3’SS, sitio de splicing 3’ (AG); 5’SS, sitio de splicing 5’ (GU); BPS, branch point site; Py, tracto de polipirimidinas. 32 Introducción Seguidamente, son reclutadas U4/U6 y U5 snRNP que se unen para formar el complejo B (Wahl et al., 2009). La U6 snRNP está formada por el U6 snRNA y el complejo LSM2-8 (Tharun, 2009). De entre las proteínas que forman U5, es destacable PRPF8, ya que forma parte del sitio activo del espliceosoma (Nguyen et al., 2013). Aunque todas las snRNPs están ya presentes en el complejo B, éste es catalíticamente inactivo y requiere de una serie de reordenamientos conformacionales para ser activado. Durante la activación del espliceosoma, U1 y U4 snRNP son liberados dando lugar finalmente al complejo C o complejo catalítico, por ser el responsable de llevar a cabo el proceso de splicing propiamente dicho, mediante una reacción de transesterificación dependiente de ATP. Finalmente, el espliceosoma libera el mRNA así como las U2, U5 y U6 snRNP, que son recicladas para posteriores ciclos de splicing (Wahl et al., 2009). Espliceosoma menor. El espliceosoma menor está formado por la U5 snRNP, y las ribonucleoproteínas específicas U11 (análogo funcional de U1), U12 (U2), U4atac (U4) y U6tac (U6). Los análogos funcionales presentan estructuras secundarias similares a las de su equivalente en el espliceosoma mayor. También, el ensamblaje del espliceosoma menor ocurre de forma parecida al del mayor, siendo la diferencia principal la ausencia del complejo E (Turunen et al., 2013). El espliceosoma menor se encarga de procesar un tipo de intrones poco frecuentes conocidos como intrones U12. Estos intrones representan el 0,5% de todos los intrones de cualquier genoma y se diferencian del resto de intrones por las secuencias consenso de los sitios de splicing (AU y AC para los 3’SS y 5’SS, respectivamente) (Turunen et al., 2013). 1.2.2 Definición del exón y del intrón. Numerosos estudios también han demostrado que la longitud de los exones e intrones afecta al reconocimiento de los sitios de splicing, y por tanto, a la eficiencia de este proceso (De Conti et al., 2013). En vertebrados, los exones (con una media de 170 nucleótidos) son mucho más cortos que los intrones (miles de nucleótidos). En estos organismos, predomina el 33 Introducción mecanismo por el cual distintos componentes de la maquinaria de splicing se ensamblan en los sitios 5’SS y 3’SS de un exón. Este mecanismo se conoce como definición del exón (exon definition) (Figura I-5B). Por el contrario, en el resto de los eucariontes, la arquitectura del genoma se caracteriza por tener pequeños intrones y grandes exones. En este caso, el modelo de definición del intrón (intron definition) es el predominante, en el cual, los sitios de splicing se emparejan entre intrones, en lugar de exones (Figura I-4 y I-5A) (De Conti et al., 2013). 1.2.3 El splicing alternativo. Según la eficiencia con la que se ensambla el espliceosoma y ocurre el splicing, se distinguen dos tipos: splicing constitutivo y splicing alternativo. Figura I-5: Modelo de definición de intrones y exones. A) Modelo de definición de intrones acorde al emparejamiento entre los sitios de splicing a lo largo de un intrón, cuando los exones están separados por intrones cortos (< 250 pb). B) Modelo de definición de exones donde la comunicación entre los sitios de splicing ocurre a lo largo de un exón, cuando estos están separados por intrones largos (> 250 pb). Imagen adaptada de De Conti et al., 2013. 34 Introducción El splicing constitutivo es aquel que se produce cuando tanto el reconocimiento de un exón como el ensamblaje del espliceosoma se producen de forma correcta y del mismo modo en todos los pre-mRNAs de un determinado gen, dando lugar a una única molécula de mRNA. Por el contrario, el splicing alternativo es aquel en el que los sitios 5’SS y 3’SS compiten con otros sitios 5’SS y 3’SS por la unión de los componentes del espliceosoma. Consecuentemente, el exón no será procesado del mismo modo en todos los pre-mRNAs de un gen, por lo que se originarán diferentes mRNAs a partir de un solo pre-mRNA. Estos mRNAs dará lugar a proteínas diferentes, con funciones que pueden ser incluso opuestas, según el tejido o el tipo de célula. Por ello, el splicing alternativo contribuye a la diversidad genómica y a la especificad de tejidos (Chen and Manley, 2009). Aunque lo normal sea que durante las primeras etapas del ensamblaje del espliceosoma se determine qué tipo de splicing tendrá lugar, estudios recientes han demostrado numerosos ejemplos en los que esta decisión se toma durante las etapas tardías de dicho proceso, e incluso durante la reacción de transesterificación (Chen and Manley, 2009). 1.2.4. Tipos de splicing alternativos. Diversos análisis de secuenciación masiva estiman que más del 90% de los genes humanos son regulados por splicing alternativo. La existencia de este tipo de splicing implica el uso de 3’SS y 5’SS distintos a los convencionales. Por tanto, en un pre-mRNA con varios exones, el splicing alternativo puede darse de diversas formas (Black, 2003). Los diferentes tipos de splicing alternativo que existen son (Black, 2003): a. Exclusión de un exón: representa casi el 40% de los eventos de splicing alternativo en eucariontes superiores. Sin embargo, es bastante raro en eucariontes inferiores (Figura I-6A). b. Sitio donador alternativo: se produce cuando hay un sitio 3’ de splicing alternativo, dando lugar a un acortamiento del exón. Representa el 18,4% de los eventos de splicing alternativo en eucariontes superiores (Figura I-6B). 35 Introducción c. Sitio aceptor alternativo de splicing: se da cuando hay un sitio 5’ de splicing alternativo, produciéndose un exón más largo. Representa casi el 7,9% de los eventos de splicing alternativo en eucariontes superiores (Figura I-6C). d. Retención de intrón: tiene lugar cuando un intrón es incluido en el transcrito final. Es un evento poco frecuente en vertebrados e invertebrados, pues ocurre con una frecuencia de 5% (Figura I-6D). e. Exones mutuamente excluyentes: genera transcritos en los que varios exones no coinciden en el mRNA maduro. Es poco frecuente (Figura I-6E). f. Promotor alternativo: tiene lugar cuando el transcrito puede empezar en exones diferentes. Es poco frecuente (Figura I-6F). g. polyA alternativa: se produce cuando el mRNA puede terminar en diferentes exones. Es poco frecuente (Figura I-6G). 1.3. Acoplamiento de la transcripción y el splicing. Durante las dos últimas décadas se ha demostrado que muchos eventos de splicing ocurren de manera cotranscripcional, es decir, a la vez que se produce la B) A) C) D) E) F) G) Figura I-6. Tipos de splicing alternativo. Los exones constitutivos son mostrados en azul y las regiones procesadas de forma alternativa en morado. Los intrones se representan con líneas continuas y las diferentes opciones de splicing con líneas discontinuas. Imagen adaptada de Black, 2003. 36 Introducción transcripción del RNA, éste va siendo procesado por la maquinaria de splicing para dar lugar al transcrito maduro (Montes et al., 2012; Saldi et al., 2016). Un estudio reciente en levaduras ha demostrado que el splicing se produce cuando la RNAPII ha transcrito aproximadamente entre 26 y 129 nt aguas abajo del sitio 3’SS (Carrillo Oesterreich et al., 2016). Los cambios en los patrones de fosforilación del CTD de la RNAPII juegan un papel esencial en el acoplamiento espacial de estos dos procesos, pues a través de ellos, en este dominio se van a reclutar o liberar factores de procesamiento (entre ellos, factores de splicing) de forma específica en cada etapa de transcripción (Buratowski, 2009; Egloff and Murphy, 2008). Por ejemplo, se ha comprobado que el CTD favorece la activación del splicing a través del reclutamiento del complejo U2AF65-Prp19 (David et al., 2011). El reclutamiento al CTD de otros factores conocidos como acopladores de la transcripción y el splicing, podría modular la velocidad de elongación de la RNAPII a lo largo de un gen, o en una zona específica (Muñoz et al., 2010). Como se comentó en el apartado 1.1.3, la tasa de elongación de la RNAPII va a afectar a la transcripción, y por tanto, a los procesos cotranscripcionales como el splicing (Jonkers and Lis, 2015). Además, los cambios en la velocidad de elongación de la RNAPII también son capaces de regular el proceso de splicing alternativo cotranscripcional, puesto que va a determinar el periodo disponible para que el espliceosoma se ensamble en un sitio de splicing y elimine un intrón, antes de competir con el que se generará aguas abajo (Perales and Bentley, 2009). El hecho de que el procesamiento de los transcritos inmaduros se produzca de manera cotranscripcional aporta numerosas ventajas: i) ayuda a prevenir que el premRNA se degrade; ii) facilita el rápido reclutamiento de factores de splicing a la maquinaria transcripcional mientras está transcribiendo, de manera que el pre-mRNA pueda ser procesado inmediatamente después de haber sido transcrito, optimizando así la eficiencia de splicing; iii) y previene la hibridación entre el pre-mRNA y la hebra molde del DNA, un proceso que podría favorecer la inestabilidad genómica debido a la acumulación de rupturas en el DNA causadas por dicho estado de hibridación (Muñoz et al., 2010). 37 Introducción Por todo ello, los datos disponibles hasta el momento sugieren que la ventaja evolutiva de la cotranscripcionalidad reside en permitir el acoplamiento entre transcripción y splicing (Muñoz et al., 2010). 2. LA PREFOLDINA. El correcto plegamiento de las proteínas es un proceso fundamental para permitir la función de la mayoría de los componentes celulares, y dado que la conexión entre genes y fenotipo no ocurre si la transcripción y traducción no producen proteínas funcionales, las chaperonas podrían ser consideradas como la última parte de la maquinaria de expresión génica. Las chaperonas son un conjunto de factores presentes en todas las células, que actúan sobre proteínas no plegadas o parcialmente plegadas, impiden su agregación y modifican su estructura terciaria y/o cuaternaria. Normalmente, las chaperonas suelen estar ayudadas por una serie de cofactores conocidos como cochaperonas (Hartl et al., 2011). Ambas juegan un papel muy importante en el mantenimiento de la homeostasis de proteínas o proteostasis, es decir, en el equilibrio entre síntesis, plegamiento, ensamblaje y degradación de proteínas en respuesta a condiciones de estrés y medioambientales (Hartl et al., 2011). La prefoldina (PFD) es una cochaperona que fue descrita hace dos décadas de forma independiente por Elman Schiebel en Saccharomyces cerevisiae y por Nicholas Cowan en células de mamíferos, quienes vieron que este nuevo complejo era capaz de capturar monómeros de actina y tubulina no plegados, y favorecer su ensamblaje para dar lugar a polímeros del citoesqueleto (Geissler et al., 1998; Vainberg et al., 1998). Prefoldina, también conocida como GimC, no se encuentra presente en eubacterias, pero sí en arqueas, lo cual sugiere que éste podría ser el origen de su presencia en todos los organismos eucarióticos, desde protistas unicelulares hasta células humanas. Se trata de un complejo heterohexamérico que en arqueas está compuesto por dos subunidades α idénticas y cuatro subunidades β también iguales, y, sin embargo, en organismos eucarióticos el complejo canónico lo forman dos subunidades α y cuatro subunidades β distintas (Millán-Zambrano and Chávez, 2014). 38 Introducción Hasta el momento, ninguna de las subunidades de este complejo ha resultado esencial para los organismos estudiados, aunque sí que ha variado la gravedad de los fenotipos observados entre ellos. Por ejemplo, la deficiencia de prefoldina en S.cerevisiae empeoró el ensamblaje de filamentos de actina y tubulina. Por el contrario, en Caenorhabditis elegans y Drosophila, la deficiencia de prefoldina resultó en una letalidad embrionaria provocada por un citoesqueleto anormal. También los mutantes de Arabidopsis exhiben alteraciones del desarrollo relacionadas con una organización y dinámica de microtúbulos anormales (Payán-Bravo et al., 2018). La mutación de prefoldina en ratones (los cuales resultan viables hasta el nacimiento) también mostró fenotipos causados por defectos en el citoesqueleto, incluyendo degeneración de fotorreceptores, infertilidad masculina, disquinesia ciliar, pérdida neuronal y defectos en el desarrollo y función de las células B y T tubulina. Además de esto, la deficiencia de prefoldina también provocó acumulación de proteínas agregadas insolubles, lo cual se relaciona con el papel de prefoldina contra la agregación de proteínas (Chávez and Puerto-Camacho, 2016). 2.1. Tipos de prefoldinas y su estructura. A lo largo de la evolución, han ido multiplicándose las subunidades de prefoldina en el genoma de los organismos eucarióticos, lo cual ha favorecido la diversificación de dichas subunidades y la aparición de complejos alternativos con funciones específicas (Chávez and Puerto-Camacho, 2016). A continuación, se describen los tres tipos de complejos de prefoldinas que existen. Figura I-7. Estructura secundaria de las subunidades α y β de prefoldina. El número de horquillas β determina la clase de subunidad: en las subunidades α hay dos, mientras que en las subunidades β hay solo una. Las horquillas β se localizan, en ambos casos, entre las α-hélices superenrolladas. Modificado de Chávez and Puerto-Camacho, 2016. 39 Introducción Complejo canónico de prefoldina. Se trata de un complejo de 87 kDa que fue caracterizado por primera vez en Methanobacterium thermoautotrophicum. Todas sus subunidades presentan dos αhélice que forman estructuras superenrrolladas (coiled-coil) conectadas entre sí por una o dos horquillas β según si se tratan de subunidades β o subunidades α, respectivamente (Figura I-7) (Siegert et al., 2000). En arqueas, la estructura del complejo recuerda a los tentáculos de una medusa, donde el cuerpo lo formarían dobles barriles β y los tentáculos 6 estructuras superenrolladas, lo que es consistente con el ensamblaje de cuatro subunidades β, dentro de las cuales van a dimerizar dos subunidades α (Figura I-8A). En eucariontes, los datos aportados por experimentos de microscopía electrónica de baja resolución sugieren que la PFD humana presenta una estructura similar a la de arqueas, donde las dos subunidades α (PFDN3 y PFDN5) ocuparían el centro del complejo, y rodeándolas se encontrarían las subunidades β (PFDN1, PFDN2, PFDN4 y PFDN6) (Figura I-8B y I-8C) (Arranz et al., 2018). Las interacciones entre PFDN2 y PFDN3 y entre PFDN5 y PFDN6 son más estables que aquellas entre subunidades adyacentes (Simons et al., 2004) y este hecho confiere estabilidad al complejo (Chávez and Puerto-Camacho, 2016). Además, existe una regulación de los niveles de proteína de las distintas subunidades entre sí, lo cual ha sido demostrado in vivo mediante experimentos de deficiencia y sobreexpresión de subunidades, donde, por ejemplo, la deficiencia en una subunidad causa una bajada en la cantidad de las otras subunidades (Miyazawa et al., 2011). Este canónico heterohexámero contribuye al proceso de plegamiento estabilizando a un amplio rango de proteínas no nativas a las que posteriormente va a liberar para su correcto plegamiento asistido por chaperoninas (Arranz et al., 2018). En arqueas las puntas de las estructuras superenrolladas de PFDα y PFDβ interaccionan con las proteínas no nativas e impiden su agregación (Okochi et al., 2004). En dicha interacción, van a intervenir al menos una pareja de PFDβ adyacente y según el tamaño del sustrato, podrían ir acoplándose otras subunidades. En eucariontes, el mecanismo es diferente e involucra interacciones específicas con actina y tubulina basadas en la 40 Introducción carga de los residuos localizados en la región distal de las estructuras superenrolladas: mientras que las subunidades PFDN3 y PFDN4 son importantes para la interacción con actina, PFDN4 y PFDN5 lo son para la interacción con tubulina. Otra diferencia con respecto a arqueas, es que la prefoldina de eucariontes envuelve por completo a sus sustratos dentro de la cavidad (Arranz et al., 2018). Complejo alternativo o prefoldin-like complex. En eucariontes se ha visto que algunas de las subunidades β de prefoldina pueden participar en otros complejos estables en colaboración con otros polipéptidos diferentes, lo cual se conoce como complejos alternativos. En levaduras, solo la subunidad 6 forma parte de dichos complejos, mientras que en mamíferos podemos encontrar las subunidades 2 y 6. Otros de los componentes habituales de los complejos Figura I-8. Estructura de prefoldina en arqueas y humanos. (A) Diferentes vistas ortogonales de la estructura cristalográfica de prefoldina de M. thermoautotrophicum. Dos copias de PFDα (azul) ocupan la posición central y se encargan del mantenimiento del complejo, mientras que cuatro copias de PFDβ (rojo) rodean a las PFDα. (B) Estructura a baja resolución de la prefoldina humana, donde se muestran las 3 mismas vistas ortogonales obtenidas por microscopía electrónica y procesamiento de imágenes. (C) Modelo de la prefoldina de organismos eucarióticos donde se muestran las mismas 3 vistas generadas usando la estructura de M. thermoautotrophicum con la secuencia de PFD humana y la disposición de las subunidades obtenida (Simons et al., 2004). Barra. = 50 Å. Imagen de Arranz, Martín-Benito and Valpuesta, 2018. 47 Introducción Más tarde, se realizaron experimentos de ChIP para analizar los niveles de RNAPII Ser2-P en mutantes de levaduras carentes de las diferentes subunidades del complejo canónico de la prefoldina (datos no publicados). En ellos se vio que la ausencia de cada una de las prefoldinas provocó un fuerte descenso de los niveles de esta marca de la polimerasa que está elongando (Figura I-11). Este resultado iba en concordancia con los defectos transcripcionales causados por la ausencia de prefoldina que fueron mencionados anteriormente. Figura I-10: En levaduras, la prefoldina estimula la elongación de la trascripción favoreciendo la dinámica de la cromatina. Las subunidades Pfd1, Pfd4, Pfd5 y Pfd6 se unen a genes que se están transcribiendo. Se ha visto que Pfd1 contribuye a la elongación de la transcripción. Este efecto se observa muy bien en genes largos, donde además Pfd1 estimula el desalojo de histonas. La unión de la prefoldina a los genes se localiza en el extremo 3’ de estos, lo cual correlaciona con el perfil de la RNAPII fosforilada en Ser-2. Imagen adaptada de Millán- Zambrano and Chávez, 2014. 48 Introducción Este conjunto de datos muestra que la prefoldina de levaduras ejerce un papel positivo en la elongación transcripcional y favorece la dinámica de la cromatina de forma cotranscripcional. Figura I-11: La ausencia de las diferentes subunidades del complejo canónico de prefoldina los niveles de RNAPII Ser2-P. Se realizaron ensayos de ChIP a partir de extractos obtenidos de 6 mutantes diferentes de levaduras correspondientes a las 6 subunidades canónicas de prefoldina, y se analizó los niveles de Ser2-P relativizados a los niveles de RNAPII total (Rpb3). En todas las gráficas se representa valores promedios obtenidos de, al menos, 3 experimentos diferentes. Objetivos 51 Objetivos En este trabajo, nuestro propósito ha sido estudiar la contribución de la prefoldina a la expresión génica en el núcleo de las células humanas. Para lograr esto, nos planteamos los siguientes objetivos: 1. Estudiar los efectos globales que provoca la deficiencia de las subunidades PFDN2 y PFDN5 en el transcriptoma de células humanas y su regulación por suero. 2. Estudiar los efectos globales que provoca la deficiencia de PFDN2 y PFDN5 en el procesamiento del pre-mRNA de células humanas. 3. Explorar posibles mecanismos que expliquen los resultados de los objetivos anteriores. Resultados 55 Resultados 1. PFDN5 SE LOCALIZA MAYORITARIAMENTE EN EL NÚCLEO DE CÉLULAS HCT116. La subunidad 5 del complejo prefoldina presenta 4 isoformas (α, β, γ y δ) como consecuencia del splicing alternativo de su transcrito (Hagio et al., 2006). Clásicamente, estas variantes se han clasificado en dos grupos según su localización en la célula: el grupo formado por las isoformas α y γ, que se localizan predominantemente en el núcleo; y el grupo de las isoformas β y δ, que lo hacen en el citoplasma (Hagio et al., 2006). La isoforma predominante en las células es la isoforma α, formada por 154 aminoácidos (Hagio et al., 2006; Mori et al., 1998). Su transcrito contiene 6 exones, de los cuales destaca el exón 4 porque es el que codifica para el dominio de localización nuclear (Hagio et al., 2006). Tanto su localización en el núcleo como su presencia en la mayoría de las células hacían que la variante α fuese la más idónea para llevar a cabo el estudio de esta tesis, por lo que decidimos enfocar este trabajo en PFDN5-α (a partir de ahora PFDN5). El primer paso que dimos para investigar un posible papel de PFDN5 en expresión génica fue comprobar la localización de esta proteína en el núcleo de células HCT116, con las cuales se trabajó a lo largo de esta tesis. Se trata de células de carcinoma colorrectal de humanos, tejido dónde se expresan tanto PFDN5 como PFDN2 (subunidad común del complejo canónico y del complejo prefoldin-like con la que también hemos trabajado en esta tesis). Además, esta línea inmortal puede ser transfectada con gran facilidad, y no detiene su ciclo celular en ausencia de suero (véase apartado 2.3 de los resultados de esta tesis). Por todo ello, la línea HCT116 reunía las características idóneas para el desarrollo de este trabajo. Para localizar PFDN5, se diseñó una línea estable que la expresara etiquetada en el extremo N-terminal con EGFP (una variante mejorada de la proteína de fluorescencia verde). GFP está formada por 238 aminoácidos y su principal característica se basa en su fotoactividad, ya que al ser fotoestimulada emite fluorescencia visible (Prasher et al., 1992). Es por ello que GFP se ha convertido en uno de los genes marcadores más usados a nivel experimental en distintos tipos celulares, ya que permite estimar los niveles de expresión de la proteína y su ubicación en la célula (Misteli and Spector, 1997). 56 Resultados La generación de la línea reportera comenzó con la transfección de células HCT116 con el vector de expresión de EGFP-PFDN5. Este plásmido contiene el gen que codifica la proteína EGFP-PFDN5 bajo control del promotor constitutivo CMV. Como línea control, otra población del mismo tipo celular fue transfectada con el plásmido vacío (pEGFP-C1). Más tarde, se seleccionaron los clones capaces de crecer en medio selectivo suplementado con G418 (marcador de resistencia de los plásmidos mencionados anteriormente). Por último, se analizó el carácter fluorescente de varios FIGURA R-1. Caracterización de las líneas estables HCT116 GFP y HCT116 GFP-PFDN5. A) Análisis por citometría de flujo de los clones elegidos. En el eje horizontal se representa la intensidad del parámetro fluorescente (GFP) y en el vertical la intensidad de la autofluorescencia. B) Análisis por Western Blot del contenido de PFDN5 en las poblaciones seleccionadas. El panel superior izquierdo corresponde a la incubación con anticuerpo anti- PFDN5; el panel inferior izquierdo a la incubación con anti-GAPDH; y el panel derecho a la incubación con anti-GFP. B) A) 63 Resultados 2.4. Obtención de muestras para los experimentos de RNA-seq. El ensayo de RNA-seq quedó establecido finalmente del siguiente modo: antes de la extracción del RNA, las células se trataron con los diferentes siRNA durante 72 horas, de las cuales las últimas 48 horas estuvieron privadas de suero. La extracción del RNA se hizo antes de la adición del suero (t = 0 minutos), y 30 y 90 minutos después de ésta. El experimento se realizó por duplicado. En una primera aproximación para confirmar que el ensayo se había ejecutado correctamente, y antes de enviar las muestras a secuenciar, se comprobó el contenido en PFDN2 en las muestras transfectadas con el siPFDN2, y el de PFDN5 en las muestras transfectadas con el siPFDN5 mediante Western blot realizado con extractos totales recogidos del mismo experimento (Figura R-7A). Además, se determinó que la activación de la transcripción con suero había funcionado analizando los niveles de mRNA de FOS (Figura R-7B). FOS es un gen de respuesta temprana que presenta su pico máximo de expresión entre los 30 y los 60 minutos después de que se produzca el estímulo, y regresa a sus niveles de expresión basal a los 90 minutos (Healy et al., 2013). Nuestros resultados mostraron esta cinética de expresión sin cambios aparentes entre las células control y las deficientes en cada subunidad. Una vez realizada esta serie de chequeos, el RNA extraído y tratado con DNAsa se envió a secuenciar a la Unidad de Genómica del Centro de Regulación Genómica de Barcelona. Posteriormente se realizó el análisis bioinformático con la ayuda del Dr. Ildefonso Cases. Figura R-6. La privación de suero afecta de forma leve a la progresión del ciclo celular de las células HCT116. Análisis de la progresión del ciclo celular de células HCT116 que 24 horas después de ser sembradas, fueron cultivadas durante 48 horas en medio completo (A) o medio libre de suero (B), y, por último, marcadas con BrdU durante 15 minutos. El BrdU, que se incorpora a las células en fase S, fue visualizado marcándolo con anticuerpo anti-BrdU y usando un anticuerpo secundario unido a un fluoróforo. En el eje vertical se visualiza la intensidad emitida por el BrdU y en el horizontal la del Ioduro de Propidio (IP). C) Histograma de barras del porcentaje de células en cada fase del ciclo celular. En la gráfica se representa valores promedios ± la desviación estándar obtenidos de tres experimentos diferentes. *t- Student con valor P <0,05 y **t- Student con valor P <0,005. 64 Resultados 2.5 La deficiencia de PFDN5, y en menor medida la de PFDN2, altera la expresión de un alto número de genes. Los primeros resultados obtenidos del análisis bioinformático mostraron que las células transfectadas con el siPFDN5 presentan multitud de cambios en su transcriptoma, antes y después de la inducción con suero. No obstante, se trata de cambios muy pequeños. Por el contrario, las células transfectadas con el siPFDN2 muestran pocos cambios en la expresión génica, principalmente en los tiempos 0’ y 30’, donde apenas se observan diferencias con respecto al control. En ambos casos, las muestras recogidas 90 minutos después de la inducción con suero son las que mayor número de cambios presentan (Figura R-8A y 8B). Estas diferencias entre las células deficientes en PFDN2 y PFDN5 son coherentes con el diferente impacto en la viabilidad celular mostrada anteriormente (Figura R-5E). Figura R-7. Verificaciones realizadas en el ensayo de RNA-seq antes de enviar las muestras de cDNA a secuenciar. A) Se obtuvieron extractos totales de las diferentes muestras y condiciones, y se analizaron 40 µg de estos mediante Western Blot, utilizando los anticuerpos contra PFDN2, PFDN5 y GAPDH. B) Se realizó un ensayo de RT-qPCR a partir del RNA extraído de las diferentes muestras y condiciones y se analizaron los niveles de mRNA de FOS. En la gráfica se representan los valores promedio ± la desviación estándar de dos experimentos diferentes. 65 Resultados 66 Resultados A pesar del limitado efecto de la deficiencia en PFDN2 sobre el transcriptoma de nuestras células en ausencia de suero, el reducido número de genes afectados en dichas condiciones mostró un considerable solapamiento con los afectados por la deficiencia en PFDN5 (Figura R-8C). Además, la gran mayoría de genes comúnmente afectados por la deficiencia en las dos subunidades mostraron cambios en el mismo sentido respecto a las células control, lo que sugiere que la alteración del complejo canónico de prefoldina explica, al menos, una parte de los cambios detectados (Figura R-8D). Para identificar los genes afectados por la deficiencia en PFDN2 y PFDN5 independientemente de la presencia o ausencia de suero, buscamos aquellos genes que mostraron una alteración significativa (FRD<0.05) de su expresión en todas las condiciones analizadas. Los resultados volvieron a mostrar que los efectos de la depleción de PFDN5 eran más severos que los efectos de la depleción de PFDN2, ya que mientras con siPFDN5 se encontraron 231 genes diferencialmente expresados en los 3 tiempos, con siPFDN2 fueron únicamente 25 (Figura R-8E). El análisis de las categorías funcionales de genes (GOs) permite detectar cambios regulatorios en la expresión del genoma que pueden pasar inadvertidos con el análisis individual de genes. Los resultados obtenidos de dicho análisis no mostraron ninguna Figura R-8. La deficiencia en PFDN5, y en menor medida en PFDN2, causa cambios en el transcriptoma, tanto en ausencia de suero como al activar las células con suero. A) Representación de todos los genes secuenciados en el RNA-seq. Se muestra el logaritmo del cambio (log2FC) frente al nivel de expresión de los genes (definido como la media del logaritmo en base 2 de las cuentas por millón de las dos muestras de cada experimento). Las gráficas de la izquierda muestran los cambios transcriptómicos de las muestras transfectadas con el siPFDN5 con respecto al control, y las de la derecha, los de las muestras transfectadas con el siPFDN2. En negro se representan los genes no afectados, mientras que en rojo se muestran todos aquellos genes cuyo log2FC>0, FRD<0.05. B) Representación del número de genes afectados en cada muestra y tiempo. log2FC>0, FRD<0.05 C) Se muestra el número de genes expresados diferencialmente en las células transfectadas con el siPFDN2 (verde) y con el siPFDN5 (azul), y el solapamiento entre estos conjuntos, antes de la inducción con suero. D) Cambios de expresión de los genes comunes diferencialmente expresados en células deficientes en PFDN2 y PFDN5 antes de la inducción con suero. E) Representación del número de genes expresados diferencialmente en las células transfectadas con el siPFDN2 y con el siPFDN5 a cada tiempo y los genes que coinciden entre los distintos tiempos. 67 Resultados categoría funcional significativamente enriquecida (valor P <0.05) en los grupos de genes comunes entre los diferentes tiempos en las células deficientes en PFDN2, pero sí en las deficientes en PFDN5. Éstas fueron: “respuesta a estímulos externos”, “vía de señalización mediada por interleuquina-7” y “respuesta celular a estímulos químicos”. También detectamos que entre los 232 genes afectados por la deficiencia en PFDN5, antes y después de la inducción por suero, hubo varios relacionados con la organización y dinámica del citoesqueleto (FLII, TUBGCP6, CDC42EP4) lo que es esperable dada la demostrada vinculación funcional de las prefoldinas en ese proceso. Asimismo, la lista incluye al gen PFDN2, que se induce en condiciones de deficiencia de PFDN5, probablemente en respuesta a su propia desestabilización (véase más adelante). La lista de genes significativamente alterados por la deficiencia en PFDN5 en cualquier condición de suero también incluye genes funcionalmente implicados en diferentes fases del proceso de expresión génica, como factores de transcripción (TAF1C, E2F2, STAT6, USF1, MED24), factores de procesamiento del pre-mRNA (SMN2, Tabla R-1. 68 Resultados CPSF37, DDX39B) y factores modificadores de histonas (HDAC10, KMT5A) (Tabla R-1). Precisamente este último gen también está incluido en la lista de genes con expresión diferencial a tiempos 0’, 30’ y 90’ de las células deficientes en PFDN2 (Tabla R-1). Además, detectamos varios genes que codifican histonas (HIST1H3A, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3J) y reguladores del ciclo celular (CDKN1A, MKI67, CDK2AP2, MCM6) (Tabla R-1). 2.6. La deficiencia de PFDN5 y PFDN2 altera la expresión de categorías funcionales de genes. Además de lo anterior, también se realizó un análisis de las GOs de los genes diferencialmente expresados por la deficiencia en PFDN2 y PFDN5 a tiempo 0’, 30 y 90’. Las células deficientes en PFDN5 mostraron un total de 11 categorías funcionales afectadas a tiempo 0, de las cuales 7 mostraron expresión incrementada y 4 expresión disminuida (Tabla R-2). Entre las primeras se encontró la GO “organización de telómeros”, y entre las segundas, las categorías funcionales de “ensamblaje de nucleosomas” y “cambios conformacionales del DNA” (Tabla R-2). Este resultado, junto a los cambios de expresión de genes que codifican reguladores del ciclo celular mencionados anteriormente, sugieren una conexión funcional de PFDN5 con la replicación del genoma y el ciclo mitótico. La posible implicación de PFDN5 en la progresión del ciclo celular se analizará en el apartado 3.4 de los resultados de esta tesis. Asimismo, detectamos el incremento de expresión de varias categorías de genes relacionadas con señalización celular y respuesta a estímulos (Tabla R-2). A tiempo 30 solo hubo 5 categorías funcionales afectadas por la deficiencia en PFDN5, 2 disminuyeron su expresión y 3 la incrementaron (Tabla R-3). Estas tres últimas estaban relacionadas con morfogénesis, desarrollo y diferenciación celular (Tabla R-3). 69 Resultados Sin embargo, a tiempo 90 se detectaron muchas más categorías funcionales afectadas por la deficiencia en PFDN5 que en los tiempos anteriormente mencionados. Tabla R-2. Tabla R-3. 70 Resultados En total fueron 61 GOs afectadas, 28 de las cuales disminuyeron su expresión y 33 la incrementaron (Tabla R-4). Curiosamente en este caso, y al contrario que a tiempo 30, se encontraron disminuidas en su expresión numerosas GOs relacionadas con la morfogénesis, el desarrollo y la diferenciación. También fue el caso de las categorías funcionales de “adhesión celular”, “movimiento de componentes celulares o subcelulares” y “organización del citoesqueleto” (Tabla R-4). Los cambios de expresión de estas GOs podrían estar relacionados con la función del complejo canónico de prefoldina en el plegamiento de monómeros de actina y tubulina durante el ensamblaje de estructuras citoesqueléticas. Asimismo, entre las categorías funcionales con expresión incrementada encontramos un amplio número de GOs relacionadas con la biogénesis, funcionamiento y actividad metabólica de las mitocondrias (Tabla R-4). Este hecho puede derivar de la conexión funcional existente entre PFDN5 y c-Myc, un regulador que activa la expresión de genes mitocondriales en respuesta al suero (Kim et al., 2008). También en las células deficientes en PFDN5 y a tiempo 90, detectamos disminuida la expresión de las categorías funcionales “reguladores positivos de la transcripción por la RNAPII” y “reguladores negativos de la transcripción por la RNAPII”, e incrementadas las GOs “terminación de la transcripción de la cadena molde de DNA”, “ensamblaje de las snRNP en el espliceosoma” y “splicing del pre-mRNA vía espliceosoma” (Tabla R-4). Estos cambios sugieren alteraciones en el proceso de expresión génica durante estadios posteriores a la iniciación de la transcripción y han de considerarse a la hora de interpretar resultados posteriores de esta tesis doctoral. Tabla R-4. 71 Resultados 72 Resultados 79 Resultados Los niveles de mRNA de 4 de estos genes de histonas (H2AB, H2BB, H3J y H4B) fueron comprobados mediante ensayos de RT-qPCR, en los que se utilizó RNA extraído de células transfectadas con siPFDN5 y el mutante carente de PFDN5, que dos días después de ser sembradas, fueron incubadas en medio libre de suero. Los resultados demostraron que la deficiencia en PFDN5 ocasionó que los niveles de 3 de los 4 mRNA analizados disminuyeran ligeramente (Figura R-11B), de forma similar a lo detectado en el experimento de RNAseq (Figura R-11A). Sin embargo, la ausencia de PFDN5 provocó una caída más extrema en los niveles de todos los mRNA de histonas analizados (Figura R-11C). Estos resultados validan los datos obtenidos en el experimento de RNA-seq y sugieren, por un lado, que PFDN5 podría estar regulando, directa o indirectamente, la expresión de los genes de histonas afectando de este modo a la dinámica del genoma; A) B) C) Figura R-11. La ausencia y deficiencia en PFDN5 disminuye los niveles de mRNA de genes de histonas. A) Genes de histonas que en los resultados obtenidos del RNA-seq mostraban expresión diferencial en las células transfectadas con siPFDN5 con respecto al control. C y B) Se realizaron ensayos de RT-qPCR a partir del RNA extraído de células deficientes en PFDN5 y células sin PFDN5, que crecieron en ausencia de suero durante 48 horas. Posteriormente, se analizaron los niveles de mRNA de los genes que aparecen en la tabla. En la gráfica se representan valores promedio ± la desviación estándar obtenidos de 3 experimentos diferentes con células deficientes en PFDN5 (B) o carentes en PFDN5 (C). *t- Student con valor P <0,05 y **t- Student con valor P <0,005. 80 Resultados y por otro, que el ciclo celular de las células carentes o deficientes en PFDN5 podría estar afectado. 3.3. La ausencia y deficiencia en PFDN5 incrementa los niveles de expresión del gen p21. También nos llamó la atención que, en las mismas condiciones del ensayo (ausencia de suero), otros de los genes diferencialmente expresados fuese el gen CDKN1A, el cual incrementó su expresión en las células deficientes en PFDN5. CDKN1A codifica la proteína p21, un inhibidor de CDK que, entre otras funciones, detiene el progreso del ciclo celular ante una gran variedad de estímulos (Karimian et al., 2016). Dado que los datos transcriptómicos no solo mostraban que la deficiencia en PFDN5 provoca un descenso en la expresión de los genes de histonas, sino también una sobreexpresión de p21 (Figura R-12A), predecimos que se podrían estar dando cambios en el ciclo celular. Para corroborarlo, primero se realizaron ensayos de RT-qPCR en los que se utilizaron el mismo RNA extraído de células transfectadas con el siPFDN5 y el mutante carente de PFDN5, que dos días después de ser sembradas, fueron incubadas en medio libre de suero. Los resultados confirmaron que la deficiencia en PFDN5 provocó mayores niveles de mRNA de p21 (Figura R-12B) y que la carencia de esta subunidad ocasionó una subida aún más drástica de este mensajero (entre 6 y 7 veces más que en la línea WT) (Figura R-12C). Tanto los experimentos con siRNA como los realizados con la línea KO se realizaron en ausencia de suero. No sabíamos, por tanto, cómo afecta la ausencia o deficiencia en PFDN5 a la expresión de p21 en condiciones normales, es decir, en células incubadas en presencia de suero todo el tiempo. Para esclarecer si los efectos de la ausencia de PFDN5 sobre la expresión de p21 estaban mediados por suero, se realizó un ensayo de Western blot con extractos totales extraídos de células WT y células PFDN5 KO incubadas en medio completo. Las células deficientes en PFDN5 no presentaba diferencias en el contenido en p21 (Figura R-12D), en cambio las células 81 Resultados mutantes carentes de PFDN5 mostraron un aumento del contenido de esta proteína (Figura R-12E). 3.4. La deficiencia y ausencia de PFDN5 provocan ligeros cambios en el ciclo celular. Hipotetizamos que quizás el origen de la alta expresión de p21 podría ser que la falta de PFDN5 produjera daños en el DNA. De hecho, algunos de los genes con expresión alterada en ausencia de PFDN5, como POLM, están relacionados con reparación de daños en el DNA (Tabla R-1). Para averiguarlo, realizamos un ensayo de inmunofluorescencia que nos permitiera determinar el número de focos de γ-H2A.X (véase apartado 8 de materiales y métodos). Los focos de γ-H2A.X son marcadores del DNA dañado en su doble cadena, los cual induce la expresión de p21 y con ello la retención de las células en fase G1 (Fragkos et al., 2009). El experimento fue realizado en células transfectadas a la que se les privó de suero durante 48 horas. Los resultados Figura R-12. La deficiencia en PFDN5 aumenta los de niveles del mRNA de p21, antes y después de la inducción con suero, y no afecta a sus niveles proteicos. A) Gen p21 que en los resultados obtenidos del RNA-seq mostraba expresión diferencial en las células transfectadas con siPFDN5 con respecto al control. B y C) Se realizaron ensayos de RT-qPCR a partir del RNA extraído de células deficientes en PFDN5 (B) y células sin PFDN5 (C), que crecieron en ausencia de suero durante 48 horas. Posteriormente, se analizaron los niveles del mRNA de p21. En la gráfica se representan los valores promedio ± la desviación estándar obtenidos de 3 experimentos diferentes. *t- Student con valor P <0,05 y **t- Student con valor P <0,005. D y E) A partir de extractos totales obtenidos de células deficientes en PFDN5 (D) y carentes de PFDN5 (E) que crecieron en condiciones normales de suero se analizaron 20 µg de estos mediante western blot, utilizando los anticuerpos contra p21 y GAPDH como control de carga. 82 Resultados no mostraron un aumento en el número de focos en las células deficientes en PFDN5 con respecto a las células transfectadas con el siControl (Figura R- 13). Lo siguiente que hicimos fue realizar experimentos de citometría de flujo en células carentes y deficientes en PFDN5 que habían sido incubadas sin suero durante 48 horas (véase apartado 10 de materiales y métodos). La deficiencia en PFDN5 provocó cambios ligeros en el ciclo celular, con un porcentaje menor de células en fase G1, y mayor en fase G2 (Figura R-13A). Sin embargo, los resultados obtenidos en la línea mutante fueron distintos a los anteriores: la ausencia de PFDN5 ocasionó un aumento del porcentaje de células en fase G1, y una disminución de éstas en fase S (Figura R-13B). Mientras que los efectos en el ciclo celular causados por la deficiencia en PFDN5 no parecían ser debidos a p21, los efectos ocasionados por la ausencia de PFDN5 sí podrían estar mediados por una mayor expresión de p21, pues como se mencionó anteriormente, este factor retiene las células en fase G1 en respuesta a Figura R-13. Los efectos en el ciclo celular no se deben a que se genere daño en el ADN por la deficiencia en prefoldina. A) Histograma del número de focos de γ-H2A.X por célula, de células transfectadas con el siPFDN5 que crecieron sin suero durante 48 horas. El control positivo son células tratadas con etopóxido 20 µM durante una hora, y el negativo, células tratadas con DMSO durante una hora. Para el análisis se usó el anticuerpo primario anti γ-H2A.X, y el secundario Alexa Fluor 488 (rojo). Para la cuantificación, se contó el número de focos en 30 células. B) Imágenes tomadas de las diferentes condiciones en ausencia de suero. Barra = 20 μm. 83 Resultados multitud de estímulos externos (Karimian et al., 2016). Esto sugiere un papel protooncogénico para PFDN5, regulando la progresión del ciclo celular a través de p21. 4. PREFOLDINA 5 SE ENCUENTRA FÍSICAMENTE ASOCIADA AL GEN P21. Con todo lo visto hasta ahora, decidimos estudiar si la expresión del gen p21 podría estar regulada directamente por PFDN5. Dado que en levaduras varias subunidades de prefoldina son capaces de unirse al DNA (Millán-Zambrano et al., Figura R-14. La ausencia y deficiencia en PFDN5 produce efectos en el ciclo celular. A y B) Distribución en las distintas fases del ciclo celular de células HCT116 transfectadas con el siPFDN5 (A) o mutantes carentes de PFDN5 (B) incubadas en medio sin suero durante 48 horas. Por último, fueron marcadas con BrdU durante 15 minutos. El BrdU fue visualizado marcándolo con anticuerpo anti-BrdU y usando un anticuerpo secundario unido a un fluoróforo. En el eje vertical se visualiza la intensidad emitida por el BrdU y en el horizontal la del Ioduro de Propidio (IP). El experimento se repitió tres veces y los histogramas se representa la cuantificación y el análisis estadístico de los datos obtenidos. *t- Student con valor P <0,05 y **t- Student con valor P <0,005. B) A) 84 Resultados 2013), un posible mecanismo de regulación podría conllevar la unión de PFDN5 al DNA del gen p21. Para averiguar si PFDN5 interacciona con el gen p21, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). Dado que el anticuerpo comercial anti-PFDN5 utilizado en esta tesis no funciona en ensayos de inmunoprecipitación, tuvimos que abordar el experimento creando dos nuevas líneas estables a partir de la línea HCT116 WT: una expresaba PFDN5 etiquetada a Flag en su extremo carboxi-terminal, y la otra, expresaba solo la etiqueta Flag (control negativo). Flag es un péptido de 8 aminoácidos comúnmente utilizado para ser añadido a proteínas de interés mediante técnicas de DNA recombinante (Einhauer and Jungbauer, 2001). Para la generación de estas líneas, las células fueron transfectadas con el vector de expresión de la proteína Flag fusionada a PFDN5 (pFlag- PFDN5), que contiene el gen que codifica para la proteína Flag bajo control del promotor constitutivo CMV. Como línea control de los experimentos, otra población del mismo tipo celular fue transfectada con el plásmido vacío (pCMV-Tag 2A). Más tarde, se seleccionaron los clones capaces de crecer en medio selectivo suplementado con G418 (marcador de resistencia de los plásmidos mencionados anteriormente). Por último, se comprobó mediante Western blot el tamaño de PFDN5 en dichas líneas usando el anticuerpo anti-PFDN5. Tanto el WT como el control negativo mostraron una banda del mismo tamaño, que correspondía a PFDN5. Sin embargo, la línea HCT116 Flag-PFDN5, mostró dos bandas: una correspondía a la proteína endógena y la otra a Flag-PFDN5 (Figura R-15A). Una vez obtenidas las dos líneas, se realizaron cuatro experimentos independientes de ChIP a partir de extractos celulares recogidos de las líneas incubadas en medio completo. En el ensayo se analizaron dos regiones diferentes del gen p21: la primera situada en el primer exón y la segunda en el segundo exón (Figura R-15B). Los niveles de PFDN5 fueron normalizados primero al imput, y luego a una región intergénica del cromosoma V. Con todo ello se detectó una acumulación de PFDN5 asociada al primer exón del gen (Figura R-15C). Esto sugería que los cambios de expresión sobre este gen podrían estar mediados por una estrecha relación física entre prefoldina 5 y el primer exón de p21. 85 Resultados 5. LA DEFICIENCIA EN PFDN5 AFECTA NEGATIVAMENTE A LA INDUCCIÓN POR SUERO DE LOS GENES MÁS LARGOS Y CON MAYOR NÚMERO DE INTRONES. 5.1. Tras 90 minutos de inducción por suero, genes más largos o con mayor número de intrones se expresan menos en las células deficientes en PFDN5. Hasta el momento, nuestros datos han mostrado que la deficiencia en prefoldina 5, y en menor medida la deficiencia en prefoldina 2, afecta al transcriptoma de células humanas. Estos resultados pueden explicarse en términos regulatorios, dado que la deficiencia de prefoldinas puede originar alteraciones de la fisiología celular que den lugar a señales que activen o repriman la expresión de genes con capacidad de respuesta a la alteración producida. Sin embargo, los estudios realizados en S. cerevisiae han puesto de manifiesto que prefoldina contribuye de forma general a la elongación de la transcripción y la dinámica cotranscripcional de la cromatina (Millán- Zambrano et al., 2013). Este dato plantea la posibilidad de que parte de los efectos transcriptómicos observados en las células deficientes en PFDN2 y PFDN5 antes Figura R-15. Prefoldina 5 se encuentra físicamente asociada al exón 1 de p21. (A) Western blot realizado a partir de los extractos totales obtenidos de las líneas celulares HCT116 Flag y HCT116 Flag-PFDN5. Se analizaron 40 µg mediante western blot, utilizando los anticuerpos contra PFDN5 y GAPDH como control de carga (B). Dibujo esquemático para representar la localización de los oligonucleótidos utilizados en el ensayo de ChIP. (C) Histograma de barras de los niveles de PFDN5 en el gen p21. En la gráfica se representan los valores promedio ± la desviación estándar obtenidos de cuatro experimentos diferentes. *t- Student con valor P <0,05 y **t- Student con valor P <0,005. A) C) B) 86 Resultados descritos, sean consecuencia de una contribución similar de las subunidades de prefoldina humana a la elongación transcripcional y los fenómenos asociados a ella. En nuestro laboratorio se ha demostrado que la ausencia de PFDN1 en S. cerevisiae provoca defectos transcripcionales en los genes largos (Millán-Zambrano et al., 2013). Además, numerosos estudios realizados a gran escala han relacionado la expresión génica con el tamaño de los genes (Castillo-Davis et al., 2002; Chiaromonte et al., 2003). Por tanto, decidimos estudiar cómo influye la longitud de los genes en el efecto que causa la deficiencia en PFND5 en su expresión, antes y después de la inducción con suero. Para ello, se realizó un nuevo análisis bioinformático en el que los genes fueron divididos en 5 quintiles según su longitud. Se excluyeron los genes de expresión altísima, ya que estos genes suelen ser cortos (Castillo-Davis et al., 2002; Chiaromonte et al., 2003) y podrían interferir en el análisis. Los resultados de la Figura R-16A muestran que la longitud no tuvo un efecto importante sobre la diferencia de expresión a tiempos 0’ y 30’. Sin embargo, a tiempo 90’ la ratio de expresión de las células deficientes en PFDN5 respecto a las células control disminuía a medida que aumentaba el tamaño de los genes (Figura R-16A). En otras palabras, el efecto de la depleción de PFDN5 sobre la expresión génica 90 minutos después de la inducción por suero es ligeramente dependiente de la longitud del gen. La longitud de los genes también está directamente relacionada con el número de exones que éstos tienen (Regulapati et al., 2008). Decidimos por tanto repetir el análisis anterior tras clasificar los genes en cinco quintiles en función de su número de intrones. Los resultados volvieron a no mostrar efectos relevantes del número de intrones en los tiempos 0’ y 30’, pero sí mostraron ratios de expresión menores en las células deficientes en PFDN5 respecto a las células control a medida que aumentaba el número de intrones (Figura R-16B). Es decir, a tiempo 90’ los genes con más intrones se expresaron menos en las células deficientes en PFDN5, que los genes con menor número de intrones. 87 Resultados Figura R-16. La longitud de los genes y el número de intrones afectan a las diferencias de expresión causadas por la deficiencia en PFDN5. Se representa la variación de las diferencias de expresión siPFDN5 / siControl (eje vertical) con respecto a la longitud de los genes (A) y el número de intrones (B) (eje horizontal) a tiempos 0’, 30’ y 90’ tras la inducción con suero. B) A) 88 Resultados 5.2. El tamaño de los genes y el número de intrones ejercen un efecto sinérgico en el nivel de inducción tras la adición de suero en las células deficientes en PFDN5. Puesto que la longitud de los genes correlaciona positivamente con el número de exones (Regulapati et al., 2008), y por tanto de intrones, ambos resultados podrían deberse únicamente a una de las dos variables. Alternativamente ambas variables podrían ser independientes, en cuyo caso esperaríamos un efecto sinérgico por longitud del gen y por número de intrones. Con el objetivo de dilucidar este aspecto, decidimos centrarnos en estudiar los genes que 90’ después de la adición del suero se inducían en las células control y analizar si dicha inducción se veía afectada por la deficiencia de PFDN5. Los resultados nos mostraron que que el número de intrones intensificaba de forma muy significativa el efecto negativo de la longitud sobre el nivel de inducción, pero esto ocurría exclusivamente en las células deficientes en PFDN5, no así en las células control. Estos resultados quedan reflejados gráficamente en la figura R-17, donde se representa el efecto de la longitud en los genes con un nivel medio de intrones frente a aquellos con un número de intrones inferior o superior a la media en una desviación estándar. 95 Resultados 7. LA DEFICIENCIA EN PFDN5 AFECTA SUTILMENTE A LA MADURACIÓN ALTERNATIVA DEL PRE-mRNA. Hasta el momento, nuestros datos mostraban que la deficiencia en prefoldina 5 afectaba a la eficiencia del pre-mRNA splicing. Nos preguntamos si ello estaría ocasionando también defectos en los procesos de splicing alternativo. En una primera aproximación para responder a esta pregunta, se estudió si la deficiencia en PFDN5 afectó a la frecuencia con la que ocurren diferentes eventos de splicing alternativo utilizando para ello la herramienta bioinformática desarrollada por el Dr. Alamancos (Alamancos et al., 2015) (Figura R-23A). Este análisis bioinformático de los datos del RNA-seq nos permitió comparar la frecuencia de un determinado evento de splicing alternativo entre las células tratadas con el siRNA control y aquellas tratadas con el siRNA de PFDN5. Quisimos ver si la deficiencia en PFDN5 aumentaba o Figura R-22. La ausencia de PFDN5 provoca la acumulación de pre-mRNA tras inducir las células con suero. Se realizaron ensayos de RT-qPCR a partir del ARN extraído de células WT y célula PFDN5 KO de 3 réplicas biológicas ensayadas del mismo modo que el ARN-seq, y se determinó el nivel de pre-mRNA en dos regiones diferentes los genes SSRM2 y FASN. En las gráficas se representan los valores promedio ± la desviación estándar obtenidos de 3 experimentos diferentes. Los datos del ARN inmaduro se normalizaron primero al maduro, y a continuación, al tiempo 0’. En ninguno de los casos las diferencias medidas tuvieron significación con valor P <0,05, pero en todos ellos se observó la misma tendencia de acumulación de pre-mRNA a tiempo 90’ en las células carentes de PFDN5. 96 Resultados disminuía la frecuencia de los distintos transcritos derivados de splicing alternativo. Para cada una de estas posibilidades se usó una aproximación distinta. Para ver si disminuía la frecuencia de eventos de splicing alternativo, se tomaron en cuenta solo aquellos eventos que ocurrían en al menos un 10 % de los transcritos en el siRNA control. Sobre este total de eventos, el porcentaje de aquellos que disminuían su frecuencia en las células problema en al menos un 10 % está representado en la Figura R-23B. Por otro lado, para ver si aumentaba la frecuencia en las células problema, se tuvieron en cuenta todos los posibles eventos de splicing alternativo y se contaron aquellos cuya frecuencia sube al menos un 10% en las células transfectadas con el siPFDN5 (Figura R-23C). Imagen adaptada de Alamancos et al., 2015. Figura R-23. La deficiencia en PFDN5, ocasionó ligeros cambios en las frecuencias con la que ocurren diferentes eventos de splicing alternativo, sin que ninguna de éstas estuviese particularmente afectada. A) Dibujo esquemático de los diferentes eventos de maduración del pre-mRNA. B) Histograma de barras donde se representa el porcentaje de eventos de splicing alternativo que ocurren con menos frecuencia en células deficientes en PFDN5. C) Histograma de barras donde se representan el porcentaje de la frecuencia con que aparecen nuevos eventos de splicing alternativo en células deficientes en PFDN5. 97 Resultados La disminución de los niveles de PFDN5 ocasionó una variación en la frecuencia de los diferentes eventos de splicing alternativo de forma general, es decir, ninguna modalidad de maduración alternativa del pre-mRNA se encontraba particularmente afectada en las células deficientes en PFDN5 (Figura R-23B). Estos datos sugieren que la carencia de PFDN5 provoca disfunciones en el procesamiento del pre-mRNA que tienen un impacto general en los fenómenos de splicing alternativo. Decidimos asimismo realizar un ensayo funcional que nos permitiera estudiar in vitro cómo impacta la ausencia de prefoldina 5 sobre la regulación de un determinado evento de splicing alternativo. Para ello, se decidió realizar experimentos de minigenes, los cuales se llevaron a cabo en el laboratorio del Dr. Carles Suñé (Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra, Granada). Los minigenes son vectores de expresión eucarióticos que contienen una región con maduración alternativa y secuencias genómicas flanqueantes, y por ello, constituyen una buena herramienta para estudiar la regulación del splicing alternativo (Cooper, 2005). El minigen reportero de splicing alternativo utilizado en este estudio fue el del gen Fas (Figura R-24A). El receptor de muerte celular Fas/CD95 para el que codifica este gen, puede ser procesado alternativamente para excluir el exón 6 de su mRNA dando lugar a una forma soluble cuya función es inhibir la apoptosis (Cascino et al., 1995; Cheng et al., 1994). FIGURA R-24. Caracterización de la línea estable HCT116 PFDN5 KO + GFP-PFDN5. A) Análisis por citometría de flujo de clon seleccionado. B) Análisis por Western Blot del contenido de PFDN5 en el clon seleccionado. 98 Resultados Las líneas utilizadas en este ensayo fueron la WT, PFDN5 KO y una nueva línea “rescate” que se realizó a partir de la anterior. Para la generación de ésta, células HCT116 PFDN5 KO fueron transfectadas con el vector pEGFP-PFDN5 utilizado antes. Posteriormente, los clones capaces de crecer en medio selectivo suplementado con G418 fueron seleccionados. Por último, se analizó el carácter fluorescente de varios de los clones seleccionados por citometría de flujo (Figura R-24A), se eligió un candidato fluorescente y se comprobó mediante Western blot que expresaba PFDN5 (Figura R- 24B). Una vez extraído el RNA de las diferentes líneas transfectadas con la construcción reportera, se analizó el resultado del splicing de los minigenes por RTPCR, cuyos productos fueron resueltos en geles de agarosa (véase apartado 3.8 de materiales y métodos). Los resultados obtenidos mostraron que la ausencia de PFDN5 generó algo más de cantidad de la isoforma corta de Fas (aquella que no contiene el exón 6). En cambio, cuando PFDN5 está presente, tanto en la línea WT como en la línea “rescate”, se observó un ligero incremento de la isoforma larga de Fas (Figura R- 25B). Aunque las diferencias encontradas son sutiles y no resultaron estadísticamente significativas (t-sudent, p<0,05), el rescate del fenotipo por parte de la línea que expresa EGFP-PFDN5 parece indicar que el efecto es específico de la falta de PFDN5. En resumen, estos resultados indican que PFDN5 influye, aunque de forma sutil, en splicing alternativo. FIGURA R-25. Los efectos de la ausencia de prefoldina 5 sobre el splicing alternativo son muy leves. A) Dibujo esquemático de las isoformas alternativas del minigen Fas. B) Histograma de barras de las ratios isoforma corta / isoforma larga del minigen Fas. En la gráfica se representan los valores promedio ± la desviación estándar obtenidos de cinco experimentos diferentes. 99 Resultados 8. LA DEFICIENCIA EN PFDN5 OCASIONA DEFECTOS EN EL ACOPLAMIENTO DEL SPLICING DEL pre-mRNA A LA TRANSCRIPCIÓN. Varios de los resultados ya citados apuntan a que la deficiencia en PFDN5 podría causar alteraciones tanto en la transcripción como en splicing del pre-mRNA. Es más, los resultados mostrados en la figura R-17 indican que la influencia de PFDN5 sobre la inducción de la expresión génica en respuesta al suero depende tanto de la longitud de los genes como del número de intrones que tengan, lo que sugiere que las alteraciones en el splicing del pre-mRNA causadas por la deficiencia de PFDN5 podrían estar teniendo lugar en el contexto de la elongación transcripcional. Con todo lo visto hasta el momento, nos preguntamos si los defectos en splicing podrían deberse a una alteración del acoplamiento de éste a la trascripción, un fenómeno bien conocido (véase apartado 1.3 de la introducción de esta tesis). Un desacoplamiento de estos procesos podría provocar un retraso en el splicing con el consiguiente aumento de los niveles de RNA inmaduro y eventualmente el fallo en la formación de una molécula madura de RNA que impactaría negativamente en los niveles de expresión del gen. Para averiguarlo, analizamos la aparición del pre-mRNA a lo largo de un gen modelo para este tipo de estudios, el gen CTNNBL1 (Singh and Padgett, 2010). Para conseguir tener una población sincronizada de RNAPIIs, las células se trataron previamente con DRB, un inhibidor reversible de la fosforilación dependiente de P- TEFb en la Ser2 del CTD que provoca que las RNAs polimerasas II se detengan al inicio de la fase de elongación (Price, 2000). El inhibidor es reversible, lo que permite a las células continuar la transcripción una vez eliminada la droga. Los niveles de pre-mRNA se analizaron a diferentes tiempos después del lavado del DRB en varias regiones del gen. Se utilizaron dos parejas de oligonucleótidos por cada región analizada, para así medir tanto la aparición de un intrón en el RNA naciente, como su eliminación por splicing (Figura R-26A) (véase apartado 12.2 de materiales y métodos). El experimento permite además determinar la velocidad de avance de la RNAPII a lo largo del gen. Los ensayos se realizaron tanto en células control (transfectadas con el siControl) como en células deficientes en PFDN5 (transfectadas con el siPFDN5). 100 Resultados A) 101 Resultados Los resultados de este ensayo demostraron que la depleción de PFDN5 no afectó a la velocidad de la RNAPII, dado que la transcripción de los intrones 1, 4 y 5 ocurrió en el mismo momento después de lavar el DRB, tanto en el control como en las células deficientes en PFDN5 (Figura R-26B, 26C y 26D). La transcripción del intrón 15 no la llegamos a detectar en ninguno de los casos, ya que, seguramente, éste comience a transcribirse después del último punto tomado en nuestro experimento (Figura R-26E). Sin embargo, la falta de prefoldina 5 sí que ocasionó defectos en el procesamiento de los intrones analizados. En las células control tanto la eliminación del intrón 4 como la del intrón 5 ocurrió 50 minutos después del lavado del DRB, sin embargo, en las células transfectadas con el siPFDN5 no se detectó el procesamiento de estos intrones (Figura R-26F y 26G). Estos resultados indican que la deficiencia en PFDN5 desacopla el procesamiento de intrones de la elongación transcripcional. Como no se produce una alteración simultánea de la velocidad de las RNAs polimerasas II, la alteración del acoplamiento entre elongación y splicing no es consecuencia de una aceleración o desaceleración de la elongación transcripcional. 9. LA DEFICIENCIA Y AUSENCIA DE PFDN5 DISMINUYE LOS NIVELES DE RNAPII- Ser2-P. Como ya mencionamos en la introducción de esta tesis, los cambios en los patrones de fosforilación del CTD juegan un papel fundamental en el splicing cotranscripcional, pues contribuyen al reclutamiento y liberación de factores de procesamiento del RNA en las inmediaciones del transcrito naciente al mismo tiempo que la polimerasa está elongando (Komarnitsky et al., 2000; Montes et al., 2012). Figura R-26. La deficiencia en prefoldina 5 ocasiona defectos en el splicing cotranscripcional. A) Esquema que representa el gen CTNNBL1 completo, con la localización de los oligonucleótidos utilizados. B, C, D, E, F y G) Se realizaron ensayos de RT-qPCR a partir del RNA extraído de células transfectadas con el siControl y el siPFDN5, y tratadas con DRB durante 3 horas. Se tomaron muestras cada 10 minutos a partir del lavado del DRB. Se analizaron diferentes regiones del gen CTNNBL1. Los datos del RNA inmaduro se normalizaron primero al maduro, y a continuación, a la muestra sin tratar con DRB. B, C, D y E) Niveles de pre-mRNA en distintos puntos a lo largo del gen. F y G) Eventos de splicing cotranscripcional (medidos por la presencia del pre-mRNA sin el intrón x) en distintos puntos a lo largo del gen. Nomenclatura: Ex1 = Exón 1; In1 = Intrón 1. WT y célula PFDN5 KO de 3 réplicas biológicas ensayadas del mismo modo que el RNA-seq y se analizó los niveles de mRNA de 4 genes con defectos en la maduración de intrones. En las gráficas se representan valores promedios ± la desviación estándar obtenidos de 3 experimentos diferentes. *t- Student con P-valor <0,05 y **t- Student con P-valor <0,005. 102 Resultados Dado que la depleción de prefoldina 5 ocasiona defectos en el splicing cotranscripcional, nos preguntamos si también estaría alterando los patrones de fosforilación del CTD, concretamente, la fosforilación en serina 2. Para averiguarlo, decidimos realizar ensayos de ChIP (véase apartado 6.4 de materiales y métodos) en los que estudiamos los niveles de RNAPII-Ser2-P en células deficientes en PFDN5. Además, corroboramos los resultados obtenidos realizando un segundo ChIP con células mutantes que carecían de PFDN5. Los niveles de Ser2 fosforilada fueron analizados en diferentes regiones del gen CTNNBL1. Primero, todos los datos fueron normalizados al imput, y luego, los valores de Ser2-P fueron normalizados a los niveles de RNAPII total. Tanto en las células deficientes en PFDN5 como en las células carentes de ésta, descendieron drásticamente los niveles de Ser2 fosforilada en todas las regiones analizadas (Figura R-27A y 27B). Resultados similares se obtuvieron en CD44, otro gen modelo para splicing alternativo (Saint-André et al., 2011) (Figura 27C-D). Merece destacarse que este fenotipo también se produce en mutantes de levaduras carentes de las diferentes subunidades del complejo prefoldina (Figura I-13), lo que indica que el efecto de prefoldina sobre los niveles de RNAPII fosforilada en Ser2 está conservado evolutivamente. Para investigar si los defectos en la fosforilación de Ser2 podrían deberse a un efecto indirecto sobre la expresión de CDK9, un gen que codifica la principal quinasa que controla la fosforilación de la serina 2 del CTD (Liang et al., 2015), se estudiaron los niveles de mRNA de éste. En los resultados de las RT-qPCR se vio, por un lado, que la deficiencia en PFDN5 no modificó los niveles del mRNA de CDK9 ni antes ni después de la inducción con suero (Figura R-27E), y, por otro lado, que la ausencia de PFDN5 aumentó ligeramente los niveles de éste (Figura R-27F). Esto no explicaría el descenso en los niveles de fosforilación en la serina 2 del CTD, por lo que descartamos que este fenotipo fuese debido a un efecto indirecto de la ausencia de PFDN5 sobre CDK9. 103 Resultados Figura R-27. La deficiencia y ausencia de prefoldina 5 disminuyen los niveles de RNAPII Ser2-P. A, B, C y D) Se realizaron ensayos de ChIP a partir de extractos obtenidos de células transfectadas con los RNA interferentes (A y C) y células WT y PFDN5 KO (B y D) de 3 réplicas biológicas ensayadas en condiciones normales de suero. Todos los datos fueron normalizados primero al imput, y luego los valores de Ser2-P fueron normalizados a los niveles de RNAPII total. También se realizaron ensayos de RT-qPCR a partir del RNA extraído de células transfectadas con los RNA interferentes (E) y células WT y PFDN5 KO (F) utilizadas en ensayos con las mismas condiciones que el RNA-seq, y se analizó los niveles de mRNA de CDK9. En todas las gráficas se representa valores promedios ± la desviación estándar obtenidos de 3 experimentos diferentes. *t- Student con valor P <0,05 y **t- Student con valor P <0,005. 104 Resultados 10. NO LOGRAMOS DETECTAR INTERACCIONES FÍSICAS ENTRE PFDN5, CDK9 Y FACTORES DE SPLICING. Para averiguar a qué se debían los defectos generales en la eficiencia de splicing, así como la bajada de los niveles de RNAPII Ser2-P, ocasionados por la deficiencia y ausencia de prefoldina 5, se planteó analizar si existían interacciones físicas directas entre PFDN5 y algún componente del espliceosoma y/o CDK9, por lo que decidimos realizar ensayos de co-inmunoprecipitación. Teníamos dos factores candidatos a posibles interactores de prefoldina: el factor LSM8 y el factor PRPF8. El primero es un factor que forma parte del complejo nuclear LSM2-8, el cual se une y estabiliza al RNA nuclear pequeño (snRNA) U6, forma el cuerpo de la ribonucleoprotreína (RNP) pequeña U6, e interviene en el splicing de los pre-mRNA (Tharun, 2009). Este factor fue sugerido por el Dr. David Alabadí (Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, CSIC, Valencia) quién ha detectado interacciones físicas entre este factor y subunidades de prefoldina en Arabidopsis (datos aún no publicados). En cuanto a PRPF8, es un componente central del espliceosoma, que estabiliza al pre-mRNA en el sitio activo a través de interacciones con la subunidad U5 (Luo et al., 1999; MacRae et al., 2018). Los resultados de dos análisis masivos, que estudian las interacciones entre chaperonas y sus clientes en células humanas y levaduras, señalan a dicho factor de splicing como un posible interactor de prefoldina (Gong et al., 2009; Taipale et al., 2014). En base a estos datos, se realizaron ensayos de co-inmuprecipitación de proteínas con las líneas HCT116 GFP-PFDN5 (que como se detalló en el apartado 1.2 es una línea que sobreexpresa PFDN5 etiquetado con GFP), y la línea HCT116 GFP (como control). Para favorecer la detección de interacciones débiles, este ensayo fue realizado con DSP, un entrecruzador que permite mantener unidos enlaces débiles (véase apartado 6.3 de materiales y métodos). Como control positivo se utilizó el anticuerpo anti-PFDN1 y como negativo el anticuerpo anti-GAPDH. No se detectaron interacciones físicas entre PFDN5 y los candidatos LSM8, PRPF8 y CDK9 (Figura R-28). 111 Discusión membrana de la mitocondria”) (Tabla R-4), puesto que los genes implicados en la biogénesis mitocondrial son claras dianas de c-Myc (Kim et al., 2008; Morrish and Hockenbery, 2014). Además, la expresión de los genes que constituyen la categoría funcional “regulación de la diferenciación celular” se encuentra disminuida en la células deficientes en PFDN5 (Tabla R-4), algo que podría relacionarse con el papel represor de c-Myc sobre los genes implicados en diferenciación celular (Nie et al., 2012). Ninguna de estas categorías funcionales se encontró alterada en las células deficientes en PFDN2, lo que refuerza que el cambio de estas GOs por deficiencia de PFDN5 sea mediado por c-Myc. 3. Cambios de expresión de genes relacionados con el control del ciclo celular Entre los genes alterados en el transcriptoma de las células deficientes en PFDN5 antes y después de la inducción con suero, se encontraban varios relacionados con el control del ciclo celular y la replicación del genoma. Uno de los genes significativamente inducido por la carencia de PFDN5 fue CDKN1A, que codifica para la proteína p21. Se ha descrito que c-Myc es capaz de antagonizar la actividad de p21 en el ciclo celular, reprimiendo la expresión de este inhibidor de ciclinas a través de diversos mecanismos. El mejor estudiado es el mecanismo por el cual c-Myc interrumpe la interacción de p53 con el promotor de p21, a través de la cual se induce la expresión de éste último (Bretones et al., 2015). p53 es capaz de inducir la expresión de p21 en respuesta a diferentes situaciones de estrés, como por ejemplo, el daño en el DNA (Karimian et al., 2016). En nuestros datos transcriptómicos obtenidos del análisis del RNA-seq, no detectamos un cambio significativo de la expresión de p53 en células deficientes en PFDN5 (log2FC 0.049 y valor P 0.61); y nuestros experimentos de inmunofluorescencia tampoco mostraron que la deficiencia de PFDN5 provocase daño en el DNA (Figura R-13). Por tanto, nuestros resultados señalan que la sobrexpresión de p21 causada por la deficiencia de PFDN5 es independiente de la vía de p53. Alternativamente, c-Myc puede reprimir el promotor de p21 de forma independiente a p53 (Gartel et al., 2001). Si esta función estuviese mediada por el papel represor de PFDN5 sobre la capacidad transactivadora de c-Myc, los bajos 112 Discusión niveles o la ausencia de PFDN5 podrían hacer que c-Myc ejerciese un papel activador sobre p21, desencadenando la inducción de este gen. El hecho de que hayamos detectado la presencia física de PFDN5 en la región 5’ de p21 es coherente con esta hipótesis. En Drosophila melanogaster se ha descrito que la deficiencia de PFDN3 provoca alteraciones en los husos y centrosomas (Delgehyr et al., 2012), lo cual podría provocar defectos en la segregación cromosómica. Si ocurriese algo similar por la deficiencia en PFDN5 en nuestras células, la inducción de p21 podría ser una respuesta que permitiría detener la mitosis (Bertoli et al., 2013). Esta hipótesis se ajusta a la leve acumulación de células en fase G2 observada en células deficientes en PFDN5 (Figura R-14A), sin embargo, no explica el pequeño incremento de células en fase G1 en el mutante que carece de PFDN5 (Figura R-14B). Acorde a la sobrexpresión de p21 y la ligera acumulación de células en fase G1 en el knockout, o en G2 en el knockdown, detectamos una disminución de la expresión de la categoría funcional “ensamblaje de nucleosomas”, de la cual forman parte principalmente los genes de histonas, cuya expresión se encuentra estrictamente regulada por el ciclo celular (Ewen, 2000) (véase apartado 1.1.3 de la introducción de este manuscrito). La disminución de la expresión de los genes de histonas fue mucho más acusada en el mutante de PFDN5 que en las células tratadas con el siPFDN5, como así lo fue también la inducción de p21. Estos resultados sugieren que la inducción de p21 en células carentes de PFDN5 retrasa su entrada en fase S, lo que hace disminuir la expresión de genes con expresión específica durante esta fase del ciclo, como las histonas. 4. PFDN5 contribuye de forma general al proceso de transcripción dependiente de RNAPII. Nuestro laboratorio ha puesto de manifiesto un papel general de la prefoldina en la elongación de la transcripción en Saccharomyces cerevisiae, favoreciendo la expresión de genes largos y la dinámica de cromatina asociada a la transcripción (Millán-Zambrano et al., 2013). De existir una función similar en la prefoldina humana, esperaríamos que su deficiencia provocase alteraciones de expresión en función de las 113 Discusión características físicas de los genes, por ejemplo, de su longitud, al margen de su pertenencia a categorías funcionales. El análisis de los datos transcriptómicos de las células deficientes en PFDN5 confirma esta hipótesis, puesto que la expresión en condiciones de inducción por suero resultó significativamente disminuida en función de la longitud de los genes en las células deficientes en PFDN5 (Figura R-24A). Obtuvimos resultados similares cuando analizamos el efecto de la deficiencia en PFDN5 sobre la expresión de los genes en función del número de intrones, otra característica independiente de las categorías funcionales (Figura R-24B). Puesto que el número de intrones correlaciona con la longitud de los genes (Regulapati et al., 2008) este resultado confirma una influencia de PFDN5 sobre la transcripción de genes largos y/o sobre la expresión de genes con alto número de intrones. Dada la correlación antes apuntada, ambos fenómenos (efectos de longitud y de número de intrones) podrían ser dependientes. Sin embargo, nuestro análisis del efecto de la deficiencia de PFDN5 sobre la inducción de la expresión por suero indica que la longitud y el número de intrones contribuyen sinérgicamente al efecto negativo causado por la deficiencia de PFDN5 (Figura R-25). Ello sugiere que la deficiencia en PFDN5 provoca defectos en la elongación transcripcional, al igual que lo observado en levaduras con varias subunidades de prefoldina (Millán-Zambrano et al., 2013). Los análisis del estado de fosforilación de la Ser-2 del CTD de la RNAPII en CTNNBL1 y CD44 muestran un descenso muy acusado en las células deficientes en PFDN5 o carentes de esta subunidad (Figura R-27A-D), tal y como se ha detectado en los mutantes de levaduras carentes de las diferentes subunidades del complejo prefoldina (Figura I-11). Este hecho apoya fuertemente que la deficiencia de PFDN5 cause defectos transcripcionales durante la fase de elongación también en células humanas. Sin embargo, no hemos detectado diferencias de velocidad de la elongación en el gen CTNNBL1 de células deficientes en PFDN5 (Figura R-26) lo que descarta alteraciones drásticas del complejo de elongación. 114 Discusión 5. La deficiencia o carencia de PFDN5 causa defectos en el splicing del premRNA. El efecto negativo del número de intrones sobre la expresión en células deficientes en PFDN5 es consistente con los resultados del análisis de la eficiencia de procesamiento del pre-mRNA. Hemos detectado que, mientras las células control mejoraban la eficiencia del splicing tras la adición del suero, las células deficientes en PFDN5, y en menor medida las deficientes en PFDN2, la empeoraban (Figura R-19). El hecho de que ambas subunidades provoquen efectos similares en el splicing del premRNA indica que estamos ante un fenómeno mediado, probablemente, por el complejo canónico de prefoldina. Puesto que el splicing es un fenómeno que ocurre en gran medida de forma cotranscripcional (Herzel et al., 2017), nuestros resultados pueden explicarse en el contexto del acoplamiento entre splicing y transcripción (Figura D-1A). Y así lo demuestran los resultados obtenidos en nuestros ensayos de splicing en el gen CTNNBL1, donde observamos un claro desacoplamiento del splicing del pre-mRNA respecto de la elongación de la transcripción (Figura R-26). Los defectos en Ser2-P producidos por la deficiencia en PFDN5 pueden explicar este desacoplamiento, ya que la fosforilación del CTD en Ser2 juega un papel fundamental en el reclutamiento de factores de splicing a la RNAPII elongante (Gu et al., 2013). Por tanto, la deficiencia en PFDN5 causaría un estado defectuoso de la fosforilación del CTD que, a su vez, podría resultar en un reclutamiento anómalo de los factores de splicing durante la transcripción (Figura D-1B). Asimismo, los bajos niveles de Ser2 ocasionaría problemas en la síntesis de mRNA maduro de forma general, pero posiblemente estén afectando más a los genes largos y con alto número de intrones, tal y como nuestros resultados lo evidencian. De hecho, ha sido comprobado que la transcripción de los genes de mayor longitud y con muchos exones se ve más afectada por la disminución de los niveles de Ser2-P que la del resto de genes (Blazek et al., 2011). No hemos detectado un descenso de la expresión de la quinasa CDK9 que fosforila la Ser2 del CTD (Figura R-27E-F), ni tampoco una interacción física entre 115 Discusión PFDN5 y CDK9 (Figura R-29). En nuestro estudio transcriptómico tampoco se detectó una disminución de la expresión de CDK12 y CDK13, las otras dos quinasas capaces de fosforilar a Ser2. No disponemos por tanto de evidencias que permitan explicar la disminución de la fosforilación de Ser2 por una acción de la prefoldina sobre las quinasas. Por tanto, es posible que los reducidos niveles de fosforilación en Ser2 sean consecuencia de un funcionamiento defectuoso del proceso de elongación que cause una desfosforilación prematura. Figura D-1. Modelo por el cual se explica que prefoldina podría influir de forma general en la elongación de la transcripción, y el splicing cotranscripcional. A) Prefoldina contribuye positivamente al proceso de elongación de la transcripción, lo que facilita el splicing cotranscripcional. B) La falta de prefoldina ocasiona defectos transcripcionales y disminuye los niveles de Ser2-P. Este hecho dificulta el reclutamiento cotranscripcional de la maquinaria de splicing y provoca un desacoplamiento entre transcripción y splicing. 116 Discusión Alternativamente, los defectos transcripcionales detectados podrían ser consecuencia de un mal funcionamiento del pre-mRNA splicing. Un mal procesamiento de los transcritos inmaduros podría producir defectos en la fosforilación del CTD en Ser2, tal como ha sido propuesto (Koga et al., 2015). Según este modelo alternativo, los defectos en la fosforilación de Ser2 serían consecuencia de las alteraciones en el splicing, y no al revés, lo que implicaría que la prefoldina actuase funcionalmente sobre la maquinaria de splicing. Varias subunidades del espliceosoma han sido propuestas como posibles clientes de las diferentes subunidades de prefoldina a partir de estudios proteómicos realizados en células humanas y levaduras (Gong et al., 2009; Taipale et al., 2014). Entre ellas destaca PRPF8, ya que forma parte del sitio activo del espliceosoma (Nguyen et al., 2013). Un estudio reciente ha demostrado además que Hsp90 y R2TP, dos de las cochaperonas con las que colabora el complejo alternativo de prefoldina, estabilizan a PRPF8 en el citoplasma de células humanas y lo ayudan a ensamblarse a U5 snRNP en el núcleo (Malinová et al., 2017), lo cual refuerza la idea de que prefoldina pueda estar interaccionando físicamente con factores de splicing. Otro de los posibles clientes de PFDN5 propuestos fue el factor LSM8, que forma parte del complejo LSM2-8 que interacciona con la U6 snRNP (Tharun, 2009). Este factor ha sido detectado como interactor de prefoldina en plantas (comunicación personal de los laboratorios de Julio Salinas (CIB-CSIC) y Miguel Ángel Blázquez y David Alabadí (IBMCP-CSIC). A pesar de nuestros esfuerzos por detectar posibles interacciones de PFDN5 con PRP8 y LSM8 mediante experimentos de co-inmunoprecipitación, éstos no han dado resultados positivos (Figura R-28). Por tanto, no podemos confirmar esta hipótesis. Nuestros resultados experimentales no nos permiten por tanto confirmar ninguno de los dos modelos propuestos. Sin embargo, las siguientes evidencias nos hacen inclinarnos por el primero de ellos (Figura D-1): 1. El hecho de que la deficiencia en PFDN5 no afecte en particular a ninguna modalidad de procesamiento alternativo del pre-mRNA (Figura R-23) sugiere que la prefoldina no estimula específicamente ningún paso del proceso de splicing, sino que ejerce un efecto general sobre el mismo, probablemente de forma indirecta. 117 Discusión 2. Hemos detectado que en ausencia de suero la eficiencia del splicing del premRNA fue más alta en las células deficientes en PFDN5 que en las células control (Figura R-19), lo que parece indicar que dicha deficiencia no produce un efecto primario sobre el splicing, sino que éste es el resultado indirecto de la función de PFDN5 en otros procesos celulares que se ven influidos por el estado nutricional de las células. 3. Por último, si la PFDN5 actuase directamente sobre la maquinaría de splicing no se requeriría la presencia física de ésta en el sitio de la transcripción. Sin embargo, nuestros resultados de ChIP muestran a PFDN5 asociada físicamente al gen CTNNBL1 (Figura R-29), en el que hemos detectado el efecto de prefoldina sobre el acoplamiento transcripcional del splicing (Figura R-26), así como al gen CD44 (Figura R- 29), donde la deficiencia en PFDN5 produce también un descenso claro de la fosforilación de Ser2. Conclusiones 127 Materiales y métodos NOMBRE SENTIDO 5’-3’ ANTISENTIDO 5’-3’ USO REFERENCIA CTNNBL1 Ex5- In6 TGAAGAGGGAGCAGAAGTGCTCAT CAAAGCAACTCAGGCAATGGCA qPCR-RT (Singh and Padgett, 2009) CTNNBL1 STOP + 4000 pb TGGGTAGCTGAGAGGGAGGTG ATTATTGGCCCCACTGTGCAG qPCR-RT / ChIP Esta tesis CD44 Ex1 TCCCTCCGTCTTAGGTCACTGTTT CCTCGGAAGTTGGCTGCAGTTT ChIP (Saint-André et al., 2011) CD44-Ex9 GAAACTGGAACCCAGAAGCACA TGATGCTCATGGTGAATGAGGG ChIP (Saint-André et al., 2011) CD44-Ex19 TGATCAACAGTGGCAATGGAGC TCTGACGACTCCTTGTTCACCA ChIP (Saint-André et al., 2011) CD44 STOP + 4000 pb CCTGTGGTCCCAGCTACTC CTCACTCTTCACCCAGGCTG ChIP Esta tesis NT Chr.V CTGTACCTGGGGTTCATTCATT CAGTAAGCCGTTCACTCTCAC ChIP (Gómez- Herreros et al., 2014) P21 Ex1 GGGGCGGTTGTATATCAGG GGCTCCACAAGGAACTGACT ChIP Esta tesis P21 Ex2 CTGCCCAAGCTCTACCTTC GGTCCACATGGTCTTCCTCT qPCR-RT / ChIP (Saramaki, 2006) HIST1H3J AGCTGCTCATCCGCAAACTG AGCACAGAGGTTGGTGTCTTCAAAG qPCR-RT Esta tesis HIST1H4B CGGTAAAGGTTTGGGTAAGGGA CAAACCGGAAATTCGCTTAACC qPCR-RT Esta tesis HIST1H2AB GCTTAATAAACTCTTGGGGCGT TCCCTTGGCCTTATGATGG qCR-RT Esta tesis HIST1H2BJ TATTCCATCTATGTGTACAAGGTTCTG AAGC ATGCGCTCGAAAATGTCGTTC qPCR-RT Esta tesis HIST3H2BB ATCACGTCCCGCGAAGTG TTCAGGACGCCGAGGAAC qPCR-RT Esta tesis DSP Ex13- In13 CATAGAGAAGATCAGGGCCATG CACAAAAGCACTGCTACACAGC qPCR-RT Esta tesis DSP Ex14 ATCATCTCCAAACATCTCTGAGC qPCR-RT Esta tesis FASN Ex22- In22 AGAACATGCCCAGCCTGAAG TGTCTGTGCTGTCTCCTGCA qPCR-RT Esta tesis FASN Ex23 GTGGCCGTGTAGCTCAGCT qPCR-RT Esta tesis EVPL Ex21- In21 TTGCAAAGGCCTATACTGAGG GGAGAGGAGGGAAGGAGACT qPCR-RT Esta tesis 128 Materiales y métodos 2.2. Pequeños RNAs de interferencia (siRNAs). 2.3. Plásmidos. El vector de expresión en eucariota pFlag-PFDN5 (construido a partir del vector comercial pCMV-Tag 2A, que codifica para la proteína FLAG) fue obtenido mediante técnicas convencionales de PCR (ver apartado 3.4). En ellas, se usaron el par de oligonucleótidos EcoR1-PFDN5 Fw / PFDN5-SalI Rv para amplificar la secuencia de la isoforma α de PFDN5 a partir del cDNA extraído de células HCT116. Posteriormente, el producto de PCR se incubó a 72 ºC en presencia de Taq y ATP NOMBRE SENTIDO 5’-3’ ANTISENTIDO 5’-3’ USO REFERENCIA EVPL Ex22 CTTTGCATCATGGGTCCTTC qPCR-RT Esta tesis HSP90B1 Ex4- In4 ACTGATGAAAATGCTCTTTCTGG GCCACTGCAAAATAATCTAGCC qPCR-RT Esta tesis HSP90B1 Ex5 GCTTGTCCCAGATTTGGCTA qPCR-RT Esta tesis csnPT1 y csnPT2 GTCGACACTTGCTCAAC AAGCTTGCATCGAATCAGTAG qPCR-RT (Becerra et al., 2015) EcoRI-PFDN5 Fw PFDN5- SalI Rv GGCACGAATTCCATGGCGCAGTCTAT TAACATCA TTCGTCGACCTCAGGCCTTAGCAGT AGCCT PCR Esta tesis XhoI-PFDN5 Fw PFDN5- EcoRI Rv GGCACTCGAGACATGGCGCAGTCTAT TAACATCA GGCACGAATTCCTCAGGCCTTAGCA GTAGCCT PCR Esta tesis GEN SIRNA SECUENCIA (5’-3’) REFERENCIA Luciferasa siControl CGUACGCGGAAUACUUCGA (Tjeertes, Miller and Jackson, 2009) Prefoldina 5 siPFDN5 AGAGAAGACAGCUGAGGAU Esta tesis Prefoldina 2 siPFDN2 A GACACUGACACAGCAGCUU Esta tesis Prefoldina 2 siPFDN2 B CUCGUAAGUGCUACCGCAU Esta tesis Prefoldina 2 siPFDN2 C CAGCCUAGUGAUCGAUACA Esta tesis Tabla M-3: siRNAs utilizados. 129 Materiales y métodos para añadirle un nucleótido A en cada extremo que facilitaría la ligación de estos fragmentos al plásmido pGEM-T. Este vector, en su forma lineal, posee un nucleótido de timina en sus extremos 3’, los cuales actúan como extremos cohesivos con los fragmentos de DNA amplificados por PCR, ya que son generados con un nucleótido de adenina en los extremos 3’. La presencia de un nucleótido de timina en los extremos 3’ del vector impide además la recircularización de éste, aumentando la eficiencia del proceso de ligación. Una vez ligado el inserto al vector, se transformó la cepa DH5α de Escherichia coli (ver apartado 3.6). Para seleccionar los clones positivos, el sitio de clonamiento múltiple del vector interrumpe la secuencia codificante del péptido α de la enzima β-galactosidasa. Dicha enzima hidroliza el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido, X-gal, generando un precipitado de color azul. Así pues, proporcionando este sustrato al medio de cultivo (LB), las colonias que adquieren este color se identifican como negativas, y las blancas como positivas. A continuación, se aisló el plásmido (ver apartado 3.1) y se digirió con la pareja de enzimas EcoRI-SalI. Luego, se corrió un gel de agarosa para separar los fragmentos del DNA digerido, y se purificó la banda correspondiente al inserto (ver apartado 3.1). Finalmente, este se clonó en el vector pCMV-Tag 2A, previamente digerido con el mismo par de enzimas mencionado anteriormente. Del mismo modo fueron generados los plásmidos pLSm8-EGFP y pEGFP- PFDN5, basados en los vectores comerciales pEGFP-N1 y pEGFP-C1 respectivamente, los cuales codifican para la proteína fluorescente EGFP. Las parejas de oligonucleótidos utilizados en la PCR fueron EcoRI-LSm8 Fw / LSm8-SalI Rv para amplificar la secuencia de LSm8 y el par XhoI-PFDN5 Fw / PFDN5-EcoRI Rv para amplificar la secuencia de PFDN5. PLÁSMIDO ANTIBIÓTICO DE SELECCIÓN PROMOTOR APLICACIÓN EN LA TESIS REFERENCIA pEGFP-C1 Kanamicina G418 CMV Línea HCT116 con el plásmido integrado que expresa EGFP. Addgene Tabla M-4: Plásmidos utilizados. 130 Materiales y métodos PLÁSMIDO ANTIBIÓTICO DE SELECCIÓN PROMOTOR APLICACIÓN EN LA TESIS REFERENCIA pEGFP- PFDN5 Kanamicina G418 CMV Línea HCT116 con el plásmido integrado que expresa EGFPPFDN5. Esta tesis pCMV-Tag 2A Kanamicina G418 CMV Línea HCT116 con el plásmido integrado que expresa Flag. Addgene pFlag-PFDN5 Kanamicina G418 CMV Línea HCT116 con el plásmido integrado que expresa Flag- PFDN5. Esta tesis pGEM-T Ampicilina Clonaje. Promega Minigen Fas Ampicilina Análisis del splicing del gen reportero Fas en las líneas HCT116 y HCT116 KO. Cedido por el Dr. Carles Suñé 3. MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DEL DNA. 3.1. Aislamiento de DNA plasmídico bacteriano. El aislamiento de DNA plasmídico a pequeña escala se llevó a cabo mediante lisis alcalina. Para ello, se centrifugaron 2 ml de cultivo bacteriano a máxima velocidad durante 1 minuto. Las células, contenidas en el precipitado, se resuspendieron en 100 µl de la solución 1 y tras 5 minutos a temperatura ambiente (RT) se añadieron 200 µl de la solución 2, se mezcló por inversión y se incubó posteriormente 5 minutos en hielo. Tras la adición de 150 µl de la solución 3, la mezcla resultante se invirtió varias veces y posteriormente se incubó 5 min en hielo. Las proteínas, el DNA cromosómico y los restos celulares se eliminaron por centrifugación a máxima velocidad durante 5 minutos. La precipitación del DNA plasmídico se llevó a cabo añadiendo dos volúmenes de etanol puro, incubando 2 minutos a temperatura ambiente y centrifugando posteriormente a máxima velocidad durante 5 minutos. Al precipitado obtenido se añadió etanol al 70 % para eliminar las sales. Se volvió a centrifugar a máxima velocidad durante 5 minutos y finalmente el precipitado resultante se resuspendió en 50 µl de TE 1X. Para la obtención de DNA plasmídico más puro a mediana escala, se utilizó el kit comercial de midiprep de Zymo Research, siguiendo las instrucciones del fabricante. • Solución 1: Glucosa 50 mM; Tris-HCl pH 8 25 mM y EDTA pH 8 10 mM. • Solución 2: NaOH 0,2 M; SDS 1 %. 131 Materiales y métodos • Solución 3: Acetato potásico 3 M; ácido acético glacial 11,5 %. • TE: Tris-HCl pH 8 10 mM y EDTA pH 8 1 mM. 3.2. Electroforesis de DNA en geles de agarosa. La separación de fragmentos de DNA se llevó a cabo según el método de Sambrook (Sambrook, 1989). Para la electroforesis de DNA en se utilizaron geles de agarosa al 0,8-2,5 % (p/v) en tampón TAE. El porcentaje de agarosa varió en función del tamaño de los fragmentos de DNA que se quiso analizar. A todos los geles se les añadió Red Safe (Intron Biotechnology). Antes de realizar las electroforesis, a cada muestra se le añadió tampón de carga de DNA. Para determinar el tamaño de los fragmentos de DNA analizados se utilizó el patrón comercial 1 Kb plus DNA ladder (Invitrogen). El DNA se visualizó con el transiluminador BioDoc-it (UVP), y se imprimió con la impresora Digital Graphic Printer UP-D895MD (Sony). • TAE: Tris-acetato 40 mM; EDTA pH8 1 mM; ácido acético glacial 20 mM. 3.3. Purificación, cuantificación y secuenciación de DNA. Para la purificación de DNA desde geles de agarosa se usó el kit comercial de Intron Biotechnology siguiendo las indicaciones del fabricante. La concentración de DNA en solución se estimó por espectrofotometría (Nanodrop One, de Thermo). La secuenciación de fragmentos de DNA se llevó a cabo en el servicio de secuenciación del IBiS, usando un secuenciador automático AB3500 de Applied Biosystems. 3.4. Amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa. Para amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó el termociclador T100TM (BioRad). Los oligonucleótidos utilizados como cebadores en la reacción (Tabla M-2) fueron sintetizados por SIGMA. 132 Materiales y métodos En los ensayos de clonings se utilizaron las siguientes condiciones estándar para cada reacción: 10 µl de tampón comercial 5X Phusion, 1 µl de una mezcla de dNTPs 10 mM, 2,5 µl de cada oligonucleótido 10 µM, 0,5 µl de la polimerasa de DNA Phusion (2 U/µl) y entre 1 y 6 ng de DNA molde en un volumen final de 50 µl. La reacción tipo constó de 1 ciclo de 30 segundos a 98 ºC; 35 ciclos de 10 segundos a 98 ºC, seguido de 30 segundos a la temperatura de apareamiento de los oligonucleótidos al DNA molde y posteriormente 30 segundos/Kb de DNA a amplificar a 72 ºC; para finalizar, 1 ciclo de 10 minutos a 72 ºC. 3.5. PCR a tiempo real. Las PCRs cuantitativas (qPCR) se realizaron con un termociclador de PCR a tiempo real (Light Cycler 480 II, de Roche) que permite conocer la cantidad de DNA amplificado en cada momento de la reacción. Para la qPCR se mezclaron en frío 4 μl de la muestra de CDNA y 6 μl de una mezcla que contenía 0.5 μL de la mezcla (sentido y antisentido) de los oligonucleótidos a 10 μM, 0.5 μL de H2O miliQ y 5 μL de SYBR Green Premix Ex Taq 2X (TAKARA). La reacción tipo constó de: 1 ciclo de 10 segundos a 95 ºC, 40 ciclos de [(a) 5 segundos a 95 ºC, (b) 20 segundos a 60 ºC], y 1 ciclo de [(a) 1 segundo a 95 ºC, (b) 11 segundos a 65 ºC, (c) 1 segundo a 95 ºC]. Para testar la eficiencia de los oligonucleótidos empleados (Tabla M-2) se realizó una recta patrón a partir de diluciones seriadas de una muestra de cDNA por cada par de oligonucleótidos y se comprobó si las pendientes de las rectas tenían un valor cercano a -3.3, lo que indica una eficiencia de amplificación del 100 %. 3.6. Transformación de bacterias por quimiocompetencia. La transformación de E.coli DH5α se llevó a cabo mediante transformación por choque térmico. En este proceso, 100 µl de solución de células competentes, previamente preparadas en el laboratorio utilizando el protocolo descrito por Hanahan (Hanahan 1983), se mezclaron con 50 ng de DNA. Luego, se incubó en hielo 10 minutos y a continuación se sometió a un choque térmico durante 1,5 minutos a 42 ºC. Después, se mantuvo en hielo durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 800 µl de LB a la mezcla que se incubó una o dos horas a 37 ºC en agitación. Transcurrido este tiempo se recogieron las células por centrifugación y se 133 Materiales y métodos sembraron en medio LB sólido con su correspondiente antibiótico para seleccionar aquellas bacterias portadoras del plásmido que contenga el gen de resistencia. 3.7. Transfección transitoria de líneas celulares animales con DNA plasmídico. Las células se transfectaron utilizando TurboFect™ Transfection Reagent (ThermoFisher). Este reactivo es una mezcla de lípidos y otros componentes que permite transfectar DNA en una gran variedad de líneas celulares con una alta eficiencia y baja toxicidad. El día previo a la transfección, se sembraron entre 105 y 106 células. Para la transfección de células sembradas en placas de 6 pocillos, se mezclaron en un tubo 6 µl del agente de transfección y 100 µl de Opti-MEM™ (ThermoFisher). La mezcla se vorteó durante 5 minutos y luego, se añadió 2 µg del plásmido y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Por último, la mezcla se añadió gota a gota sobre las células en cultivo. Al día siguiente se añadió el antibiótico de resistencia G418 para seleccionar positivamente las células portadoras del plásmido. Aproximadamente 48 horas más tarde se procesaron las células para su análisis. Para la generación de líneas estables modificadas, se siguió este protocolo. Los clones positivos fueron seleccionados tras varios días de cultivo en presencia de G418. Posteriormente fueron comprobados por citometría de flujo y/o ensayos de western blot. 4. MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DEL RNA. 4.1. Aislamiento y cuantificación del RNA de líneas celulares animales. El aislamiento de RNA se llevó a cabo con el sistema RNAeasy mini kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de RNA en solución se estimó por espectrofotometría (Nanodrop One, de Thermo). 4.2. Tratamiento con DNAsa y reacción de retrotranscripción. Para la obtención CDNA total a partir de RNA (1 µg/reacción) se empleó hexanucleótidos y la enzima retrotranscriptasa (RT) utilizando el sistema Super- 134 Materiales y métodos ScriptTM III First Strand Synthesis for RT-PCR (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Como control, una de las reacciones careció de la enzima. Antes de proceder con la retrotranscripción, se eliminó el posible DNA contaminante. Para ello se utilizó la enzima RQ1 RNAse-Free DNAse (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Por cada µg de RNA a tratar se utilizó una unidad de DNAsa en un volumen de reacción de 10 µl. 4.3. Transfección transitoria de líneas celulares animales con siRNAs. La transfección transitoria de siRNAs fue realizada en placas de distintos tamaños de acuerdo con los requerimientos de cada experimento. Para placas de 60 mm, fueron sembradas 450000 células el día previo a la transfección. Entonces, el medio de cultivo fue eliminado y reemplazado por 2 ml de medio Opti-MEM™. En esta ocasión, el agente de transfección utilizado fue la Oligofectamina (Invitrogen). Para la transfección se mezclaron en un tubo (A) 15 µl de siRNA a 20 mM y 350 µl de Opti-MEM™ y en un tubo (B) 30 µl de Opti-MEM™ y 8 µl de Oligofectamina. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 7 minutos. A continuación, se mezcló el contenido de los tubos A y B y se incubaron durante 20 minutos. Por último, se añadió la mezcla a las células gota a gota y se incubaron durante 5 horas, tras las cuales se eliminó este medio y se añadió medio completo. Las células fueron cultivadas en estas condiciones otras 48-72 horas más. 5. EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS. 5.1. Obtención de extractos totales de proteínas de líneas celulares animales. Para la obtención de un extracto proteico total, se recogieron en PBS y se centrifugaron a 900 x g durante 3 minutos. Los precipitados obtenidos se resuspendieron en tampón Laemmli 2X (105 células/100 µl de tampón) y se hirvieron durante 5 minutos. A continuación, se sonicaron las muestras en el biorruptor fijado a la máxima potencia y con ciclos de encendido y apagado de 30 segundos durante 2 minutos. 135 Materiales y métodos • PBS: NaCl 138 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, KCl 3 mM, pH 7,4. • Tampón Laemmli 2X: Tris-HCl pH 6,8 125 mM; glicerol 20 %; SDS 4 %; DTT 0,2M y azul de bromofenol 1 %. 5.2. Electroforesis de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida. La electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes se llevó a cabo según el protocolo descrito por Laemmli (Laemmli, 1970) para geles discontinuos de poliacrilamida, utilizando el sistema Mini-Potean IITM (BioRad). Los geles constaban de dos partes: la de empaquetamiento, que favorecía la correcta migración de las muestras; y la de separación, donde las proteínas migraban según su peso molecular. En este trabajo se usaron geles en los que su zona de separación contenía poliacrilamida al 6 % o 12 % según el peso molecular de las proteínas a estudiar. Una vez cargados los geles, migraron a 180 V a temperatura ambiente durante 50 minutos. Como patrón de masa molecular se usó una mezcla de proteínas comerciales, Dual Color (BioRad). Tras finalizar la electroforesis, las proteínas presentes en los geles de poliacrilamida fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa para un posterior tratamiento de western blot. • Tampón de electroforesis: Trizma base 25 mM, glicina 250 mM, SDS 0.1 %. 6. MÉTODOS INMUNOLÓGICOS. 6.1. Anticuerpos. A continuación, se detallan los anticuerpos primarios (Tabla M-5) y secundarios (Tabla M-6) utilizados en esta tesis, indicando el antígeno que reconocen, su origen, procedencia y las diluciones usadas para inmunofluorescencia (IF), inmunoprecipatación de la cromatina (ChIP) y western blot (WB). ANTICUERPO CONTRA: ANTÍGENO ORIGEN PROCEDENCIA IF ChIP WB GAPDH Proteína completa (humana) Ratón monoclonal Santa Cruz 47724 - - 1:1000 Tabla M-5: Anticuerpos primarios utilizados. 136 Materiales y métodos ANTICUERPO CONTRA: ANTÍGENO ORIGEN PROCEDENCIA IF ChIP WB PFDN1 aa 105-118 (humano) Conejo monoclonal Abcam 151708 - - 1:500 PFDN2 aa 104-154 (humano) Conejo policlonal Bethyl A304-807A - - 1:100 PFDN3 aa 1-143 (humano) Conejo policlonal Abcam 96085 - - 1:500 PFDN4 Proteína completa (humana) Conejo policlonal Abcam 168438 - - 1:200 PFDN5 aa 1-154 (humano) Ratón monoclonal Santa Cruz 271150 - - 1:100 PFDN6 aa 1-103 (humano) Ratón monoclonal Santa Cruz 376733 - - 1:100 FLAG M2 DYKDDDDK Ratón monoclonal F3165 - 8 µg / ml - GFP Completa Ratón monoclonal Roche - - 1:1000 Fibrilarina aa 1-100 (humano) Conejo policlonal Abcam 5821 1 mg / ml - - BrdU Bromodeoxiuridina Ratón monoclonal Santa Cruz 1:1000 - - 8WG16 Proteína completa (humana) Ratón monoclonal ThermoFisher MA1-10882 - 8 µg / ml - RNAPII CTD repeat (phospho S2) P-Ser2 del dominio C-terminal Conejo policlonal Abcam 5095 - 5 µg / ml - p21 aa 1-100 (humano) Conejo monoclonal Abcam 109520 - - 1:1000 H2A.X (Ser139) aa 134-142 (humana) Ratón monoclonal Millipore 05-636 - - 1:1000 LSM8 Dominio C-terminal de LSm8 Ratón monoclonal Santa Cruz 81315 - - 1:20 PRPF8 [2834C1a] Proteína completa (humana) Ratón monoclonal Abcam 51366 - - 1:100 CDK9 Dominio C-terminal Conejo policlonal Abcam 484 - - 1:2000 143 Materiales y métodos (Thermo). En cada pocillo se cultivaron 250.000 células que 24 h después se transfectaron según el protocolo habitual, y se recogieron para su conteo a las horas indicadas. Para contar las células se usó una cámara Neubauer. Cada conteo se realizó 3 veces y se calculó la media y la desviación estándar de los valores obtenidos. 10. ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR POR CITOMETRÍA DE FLUJO. Para realizar este experimento las células se trataron con BrdU 10 µM durante 15 minutos a 37 ºC. A continuación, se tripsinizaron, se recogieron y se centrifugaron a 900 x g durante 5 minutos a 23 ºC. Posteriormente se hizo un lavado con PBS y se volvió a centrifugar en las mismas condiciones. Después, las muestras se fijaron con 1 ml de etanol frío al 70 %, gota a gota y en agitación constante con el vortex a mínima velocidad. Para realizar el marcaje con yoduro de propidio (PI), las células se centrifugaron a 900 x g durante 3 minutos, y el pellet obtenido fue resuspendido en 1 ml de 2 N HCl/Tritón x-100 en agitación constante con el vortex a mínima velocidad. Las muestras se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente y luego, se centrifugaron 3 minutos a 900 x g. Para neutralizar las muestras, el pellet obtenido se resuspendió en 1 ml de 0,1 M Na2Ba4O7, pH 8,5, y se centrifugó en las mismas condiciones. El pellet obtenido se resuspendió en 500 µl de una mezcla madre que contenía PBS 0,5 % Tween 20/0,1 % BSA y el anticuerpo anti Brdu diluído. Las muestras se incubaron girando toda la noche a 4 ºC. Al día siguiente, se centrifugaron las células 3 minutos a 900 x g, y el pellet obtenido se resuspendió en 500 µl de una mezcla madre que contenía PBS 0,5 % Tween 20 / 0,1 % BSA y el anticuerpo Alexa Fluor 488 diluido. Las muestras se incubaron una hora a temperatura ambiente, y posteriormente se centrifugaron en las mismas condiciones. El pellet fue resuspendido en 500 µl de una mezcla que llevaba PBS, RNAse 10 mg / ml y 1.24 µl de PI, y se incubaron durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Finalmente, las células se centrifugaron 3 minutos a 900 x g, y el pellet resuspendió en 500 µl de PBS. Para evitar la agregación, las muestras fueron filtradas antes de pasarlas por el citómetro. 144 Materiales y métodos Este análisis se hizo en diferentes poblaciones de células, unas transfectadas con el siControl y otras transfectadas con el siPFDN5. Las transfecciones se hicieron con Oligofectamine™ Reagent (ver apartado 4.3). Además, los ensayos se llevaron a cabo con y sin suero, es decir, hubo poblaciones de células a las que se les privó de suero al día siguiente de ser transfectadas, y que crecieron en estas condiciones durante 48 horas y hubo poblaciones de células que crecieron en medio completo. El experimento también fue ensayado en poblaciones de células WT y poblaciones de células que carecían de PFDN5. Del mismo modo los ensayos se llevaron a cabo con y sin suero. 11. ANÁLISIS MASIVO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE RNA-seq. 11.1. Metodología. Para analizar el efecto de la depleción de dos de las subunidades del complejo Prefoldina, PFDN2 y PFDN5, en la expresión de genes a escala genómica, se realizó una secuenciación masiva del RNA Poly (A) (Poly (A) RNA-seq). Con el objetivo de estudiar mejor posibles defectos en la expresión de genes, el ensayo se desarrolló en condiciones de hambre de suero, para posteriormente añadir suero y estimular la expresión génica. En este ensayó se partió de 375.000 células sembradas en placas P60 por condición, que 24 horas después, fueron transfectadas por separado con 3 RNA de interferencia diferentes: el siControl (condición control), y el siPFDN2 y siPFDN5 (para reducir los niveles de las subunidades de prefoldina 2 y 5 respectivamente). Las transfecciones se hicieron con Oligofectamine™ Reagent (ver apartado 4.3). Al día siguiente, a las células se les sustituyó el medio completo por medio sin suero y fueron cultivadas en estas condiciones durante 48 horas. Tras este periodo de tiempo, se reemplazó el medio sin suero por medio completo y se extrajo RNA total de las diferentes poblaciones celulares a tres tiempos distintos: antes de la inducción de la expresión con suero (tiempo 0), y 30 y 90 minutos después de la inducción. El RNA extraído fue tratado con DNAsa y se generó cDNA mediante retrotrancripción. 145 Materiales y métodos 11.2. Análisis bioinformático. La secuenciación masiva de las muestras de RNA se llevó a cabo en la Unidad de Genómica del Centro de Regulación Genómica de Barcelona. Para este trabajo se optó por una secuenciación total y pareada (paired end) del RNA. Las librerías correspondientes fueron preparadas tras eliminar la señal correspondiente a los RNAs ribosómicos de los datos. Las secuencias obtenidas se sometieron a pruebas de control de calidad con el paquete FASTQC v.0.11.5. Tras esto, fueron alineadas al genoma de referencia (obtenido desde la web www.ensembl.org/info/data/ftp/index.html, versión Homo_sapiens_GRCh37.74_chr); usando el programa Kallisto (Bray et al., 2016) para el estudio de la expresión diferencial entre las distintas muestras, y el programa HISAT2 (Pertea et al., 2017) para calcular la ratio exónica. En este caso, las secuencias se mapearon al genoma completo y luego se cuantificaron aquellas que mapeaban dentro de las coordenadas de los genes completos (según la anotación de ENSEMBL versión 79) y las que mapeaban dentro de los exones. Para el análisis de expresión diferencial entre las muestras transfectadas con el siControl, el siPFDN2 y el siPFDN5, en el tiempo 0’, 30’ y 90’, y el análisis de los cambios de expresión de PFDN2 y PFDN5 con respecto al tiempo 0’, se usó el paquete edgeR de Bioconductor, considerando expresados diferencialmente todos los genes con un FDR<0.05. En el análisis de enriquecimiento funcional de las muestras transfectadas con el siPFDN2 y el siPFDN5 a tiempo 0’, 30’ y 90’, se utilizó el paquete GOFunction de Bioconductor seleccionando términos GO con un FDR<0.05. El análisis de las ratios exónicas de las muestras transfectadas con el siControl, siPFDN2 y siPFDN5 a tiempo 0’, 30’ y 90’, se llevó a cabo con el entorno estadístico R, mientras que las gráficas se generaron con el paquete ggplot2 de R. Para analizar posibles cambios en el splicing alternativo entre el control y la muestra con PFDN5 deplecionada a tiempo 0’, 30’ y 90’, se utilizó el paquete 146 Materiales y métodos DESeq2 de R, considerando diferencialmente expresados los exones con un FDR<0.05. Para determinar el efecto de la longitud o el número de intrones sobre la ratio de expresión siPFDN5/siControl y la ratio intrones/exones a tiempo 0’, 30’, y 90’, se utilizó la anotación de genes de ENSEMBL versión 79., y el paquete estadístico R. 12. ENSAYOS DE SPLICING. 12.1. Minigenes. Para analizar el efecto de PFDN5 en el splicing, células de las líneas HCT116 WT, HCT116 PFDN5 KO y HCT116 PFDN5 KO + GFP-PFDN5 fueron transfectadas con 0,5 μg del minigen de Fas usando turbofect (ver apartado 3.7). El RNA total era extraído 24 horas más tarde, y 800 ng del RNA obtenido se retro-transcribía con MLV retrotranscriptase (Invitrogen) durante 1 h a 37ºC utilizando el oligo csnPT2 para el minigen Fas. Un cuarto de la reacción se amplificó tras 35 ciclos de PCR (Tm 61,5ºC) utilizando las siguientes condiciones estándar para cada reacción: 2,5 µl de tampón comercial 10X, 2 µl de MgCl2, 1 µl de una mezcla de dNTPs 10 mM, 2,5 µl de los oligonucleótidos csnPT1/csnPT2 a 10 µM, 0,5 µl de la polimerasa de DNA. Los productos de la PCR fueron resueltos en geles de agarosa al 2,5%. Las intensidades de las bandas fueron cuantificadas con el programa Image Lab 6.0 (Bio-Rad). El experimento se realizó cinco veces. Los valores están representados como la ratio entre la isoforma corta y la isoforma larga del gen. 12.2. Análisis de la velocidad y procesividad de la RNAPII y el splicing cotranscripcional. En este ensayo se sembraron por duplicado 375.000 células en placas P60. Al día siguiente se procedió a la transfección del siPFDN5 y el siControl utilizando para ello Oligofectamine™ Reagent. 72 horas después de transfectar los RNA de interferencia, se añadió al medio de cultivo el inhibidor de la elongación transcripcional DRB (5,6-Dichloro-1-β-D-dibofuranosylbenzimidazole) a 1 µM, y se dejó actuar durante 3 horas en una atmósfera húmeda, a 37°C, y con CO2 al 5%. 147 Materiales y métodos Como control, se dejó una placa por condición sin tratar con DRB. A continuación, las células fueron lavadas con PBS y se les puso de nuevo medio completo fresco. A partir de este momento, RNA total fue extraído cada 10 minutos de cada una de las poblaciones. El RNA obtenido fue tratado con DNAsa y retrotrascrito (ver apartado 4.2). Por último, a partir del CDNA obtenido se realizó una PCR a tiempo real (ver apartado 3.5) utilizando oligonucleótidos repartidos a lo largo del gen CTNNBL1. Por un lado, para ver el efecto de la depleción de PFDN5 en la velocidad de la RNAPII, se utilizaron oligonucleótidos que amplificaban parte de un exón y su intrón adyacente. Por otro lado, para analizar el splicing cotranscripcional entre dichas condiciones, se utilizaron oligonucleótidos que amplificaban parte un exón y del intrón adyacente al exón posterior a este (Figura M-1). Figura M-1: Localización de los oligonucleótidos. A y B) Dibujo esquemático donde se muestra con flechas azules, el lugar donde se localizarían los oligonucleótidos utilizados según si se quiere analizar la transcripción de un intrón (A) o la eliminación de este (B). A) B) Bibliografía 151 Bibliografía Abe, A., Takahashi-Niki, K., Takekoshi, Y., Shimizu, T., Kitaura, H., Maita, H., Iguchi-Ariga, S.M.M., and Ariga, H. (2013). Prefoldin plays a role as a clearance factor in preventing proteasome inhibitor-induced protein aggregation. J. Biol. Chem. 288, 27764–27776. Alamancos, G.P., Pagès, A., Trincado, J.L., Bellora, N., and Eyras, E. (2015). Leveraging transcript quantification for fast computation of alternative splicing profiles. RNA 21, 1521–1531. Allfrey, G., Faulkner, R., and Mirsky, A.E. (1964). Possible role in the regulation of RNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 315, 786–794. Allison, L.A., Moyle, M., Shales, M., and Ingles, C.J. (1985). Extensive homology among the largest subunits of eukaryotic and prokaryotic RNA polymerases. Cell 42, 599– 610. Arranz, R., Martín-Benito, J., and Valpuesta, J.M. (2018). Structure and function of the cochaperone Prefoldin. In Prefoldins: The New Chaperones, pp. 119–131. Ast, G. (2004). 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