Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa

hjkl b t i df hjkl Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Trabajo Fin de Máster Facultad de Biología Dulcenombre de Maria del Saz Navarro Septiembre 2016 Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa. Trabajo de Fin de Máster Biología Avanzada. Línea Aplicada e Industral. Departamento de Microbiología Sevilla, 12 de septiembre de 2016 El tutor El estudiante M. Rosario Espuny Gómez María del Saz Navarro Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 2 Contenido Resumen ................................................................................................................................................ 3 Introducción ........................................................................................................................................... 3 Objetivos ................................................................................................................................................ 5 Materiales y Métodos ............................................................................................................................. 6 Bacterias, medios y condiciones de cultivo ......................................................................................... 6 Ensayos de Movilidad de tipo Swimming ............................................................................................ 7 Tolerancia a Sustancias antimicrobianas ............................................................................................. 7 Ensayo para la determinación de la producción de moléculas implicadas en quorum sensing ............... 7 Estudio de la producción de polisacáridos extracelulares ..................................................................... 8 Estudios con M. sativa en condiciones controladas .............................................................................. 8 Ensayo de competitividad mediante detección del gen GusA, en plantas de alfalfa ............................... 9 Resultados ............................................................................................................................................ 10 Caracterización de los rizobios E. medicae SVQ748 y E. meliloti Rm2011 y sus derivados ................ 10 Efecto del cadmio sobre la simbiosis de E. medicae SVQ748 y E. meliloti 2011 y sus derivados en alfalfa ............................................................................................................................................... 13 Competitividad por la nodulación de E. meliloti 2011 y sus derivados en alfalfa ................................ 17 Discusión ............................................................................................................................................. 17 Agradecimientos .................................................................................................................................. 19 Bibliografía .......................................................................................................................................... 19 Foto de portada: Plantas de un ensayo de este trabajo. Autor: Luis Manuel Osuna Cascajosa. Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 3 Resumen En este trabajo se pretende conocer el efecto del cadmio sobre la simbiosis que establecen E. medicae SVQ748 y E. meliloti Rm2011 con M. sativa, así como el papel de los genes nolG y nolF, pertenecientes a la familia RND de bombas de expulsión de metales pesados y otras sustancias antimicrobianas, en la tolerancia frente a éstas y en la simbiosis en ausencia y presencia de cadmio. Para ello se han estudiado las resistencias que presentan dichas bacterias y sus respectivos mutantes en los genes nolG y nolF a metales pesados, antimicrobianos y antibióticos; se han analizado comparativamente la movilidad de tipo swimming, la producción de polisacáridos extracelulares y de moléculas implicadas en quorum sensing. Además, se ha investigado cómo afectan las mutaciones en nolG y nolF en la cinética, la competitividad y la eficiencia de la nodulación de M. sativa en ausencia y en presencia de cadmio. Los resultados obtenidos permiten concluir que los genes nolG y nolF no parecen intervenir en la resistencia a las sustancias tóxicas usadas pero sí tienen un papel en la simbiosis. Introducción Los rizobios son bacterias Gram negativas pertenecientes a las α-, β- y γ-proteobacteria, que en ausencia de nitrógeno combinado pueden fijar nitrógeno atmosférico (N2) en simbiosis con plantas leguminosas. Entre sus leguminosas hospedadoras se encuentran un gran número de plantas de interés comercial como la judía, la soja, etc. En esta asociación, la bacteria induce en la planta el desarrollo de un nuevo órgano, el nódulo, en cuyo interior se produce la fijación biológica del N2 (FBN)[1,2]. La interacción comienza con un diálogo molecular entre la planta y el rizobio que conlleva la expresión coordinada de un gran número de genes[3–5]. La formación del nódulo implica un reconocimiento específico entre la bacteria y la planta, la invasión de las células de la planta por la bacteria y otros cambios en la estructura y bioquímica de ambos organismos[2]. Los rizobios son atraídos específicamente y crecen en la rizosfera, estimulados por compuestos exudados por la raíz, tanto nutrientes como flavonoides, compuestos polifenólicos. Cada planta secreta una serie de flavonoides que inducen la expresión en el rizobio compatible de genes esenciales en el proceso de nodulación: genes nod, nol y noe[6]. Estos genes, localizados generalmente en el plásmido simbiótico son los encargados de la síntesis de una serie de moléculas señal, los lipo-quito-oligosacáridos (LCO) o factores Nod. Todas las especies de rizobios producen factores Nod con la misma estructura básica: un esqueleto oligosacarídico constituido por 4-5 restos de N-acetilglucosamina, sustituido en su extremo no reductor por un ácido graso. Además, cada especie de rizobio produce un conjunto de factores Nod con diferentes sustituciones que determinan qué leguminosas pueden nodular[7,8]. Junto los factores Nod, el reconocimiento del rizobio por la planta se produce a través de moléculas superficiales, como los polisacáridos β-glucanos cíclicos, los lipopolisacáridos, los exopolisacáridos (EPS) y los polisacáridos capsulares tipo antígeno-K[9,10] que permiten la entrada en las células de la raíz, crucial para el desarrollo del nódulo fijador[2,11]. Una vez iniciado el diálogo molecular, las bacterias colonizan la superficie de la raíz e inducen la curvatura del pelo radical[12] y la invaginación de la membrana plasmática del pelo radical generando el tubo de infección. Simultáneamente se activa el ciclo celular de las células del córtex de la raíz y cuando el tubo de infección alcanza las células del primordio, las Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 4 bacterias son liberadas al citoplasma de éstas rodeadas por una membrana peribacteroidea derivada de la membrana celular vegetal. Finalmente las bacterias se diferencian a bacteroides responsables de la FBN y el primordio nodular a nódulo maduro. La planta proporciona a la bacteria nutrientes y el ambiente microaeróbico necesario para la FBN. Las bacterias pueden producir y detectar señales permitiendo a toda una población iniciar una actividad concreta al alcanzar una concentración critica de células, fenómeno conocido como quorum sensing (QS). En bacterias Gram negativas, las moléculas señal de quorum más utilizadas son las N-acil homoserina lactonas (AHL). Los genes regulados por QS están implicados en cambios adaptativos de las poblaciones bacterianas modificando su comportamiento al alcanzar una cierta densidad celular[13]. Los genes controlados por QS regulan procesos como la transferencia de plásmidos, producción de toxinas, inhibición del crecimiento, adaptación a la fase estacionaria, formación de biopelículas, producción de EPS, movilidad, eficiencia en la nodulación, desarrollo del simbiosoma y FBN que son esenciales para un establecimiento exitoso de la simbiosis o de la relación patogénica con hospedadores ecuariotas[14,15]. El swimming es un movimiento dependiente de flagelos que se da en medios acuosos y en superficies que presentan un fluido sobre ellas y se caracteriza por un patrón de movimiento bacteriano desorganizado[16]. La movilidad confiere a las bacterias mayor eficacia en obtención de nutrientes, acceder a mejores nichos, evitar el efecto de sustancias tóxicas o una mejor dispersión bacteriana en el medio ambiente. La FBN está fuertemente influida por el estado fisiológico de la planta, por ello, un rizobio persistente y competitivo no desarrolla su capacidad real de FBN si existen factores limitantes o estresantes[17] como déficit hídrico, presencia de metales pesados, salinidad o altas temperaturas. Muchos metales son esenciales para el crecimiento de los organismos pero otros pueden ser perjudiciales como el Cs, Al, y Cd que no tienen una función esencial conocida y se pueden acumular. Las plantas presentan mecanismos intrínsecos de respuesta al estrés por metales pesados a través de quelantes metálicos formando fitoquelatinas y complejos metálicos de metalotioneínas y su posterior eliminación. Igualmente, las bacterias utilizan diversos mecanismos para protegerse de los metales pesados: transformaciones rédox, producción de péptidos y proteínas de unión, precipitación orgánica e inorgánica, transporte activo, flujo y compartimentalización celular. Además, las paredes celulares y otras estructuras presentan la capacidad de unir metales. Entre los mecanismos de bombeo se encuentran, la superfamilia de proteínas RND (resistencia-nodulación-división celular), la familia CDF (facilitadora de la difusión de los cationes) y las ATPasas tipo P. La gran superfamilia de bombas de ATP están implicadas en el transporte de metales a través de las membranas celulares en contra de gradiente de concentración para mantener una concentración constante y no tóxica dentro del citoplasma[18]. El transporte mediado por CDF se impulsa por un gradiente de concentración, un gradiente osmótico, potencial hídrico, potencial de pH o un gradiente de potasio[19,20]. La superfamilia RND son proteínas implicadas en el transporte de metales pesados, en la nodulación de leguminosas y en la división celular. Dentro de esta superfamilia se encuentran la familia HME-RND (eflujo de metales pesados) y la familia HAE-RND, (eflujo de compuestos hidrófobos y anfipáticos). Normalmente adyacente al gen que codifica las proteínas RND se encuentra un gen que codifica una proteína de la familia MFP (proteínas de fusión a membrana). Además, muchas proteínas Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 5 RND cooperan con una tercera proteína de la familia de las OMF (factores de membrana externa). Juntas, estas tres proteínas forman un complejo que permite el paso de iones desde la membrana citoplasmática, el citoplasma o del periplasma hacia el exterior pasando por la membrana externa. E. meliloti Rm2011 presenta un operón constituido por los genes nodMnolFnolGnodN bajo un promotor inducible por flavonoides (nodbox), importante para una nodulación eficiente de la alfalfa[21]. NodM tiene homología con una glucosamina sintetasa y mutaciones en nodM o nodN tienen efecto en la nodulación dependiendo de la planta. Además, un mutante en nodM de E. meliloti producía menos factores de nodulación aunque no presentaba cambios en su estructura, desarrollaba nódulos tardíos y menos eficientes fijando nitrógeno y el desarrollo de los bacteroides de este mutante estaba afectado. El análisis in silico de nolFG sugiere que codifican una bomba de tipo RND, donde NolG constituye el transportador de membrana interna y NolF la MFP que conecta el transportador con el tercer componente del sistema, una proteína localizada en la membrana externa u OMF codificada por un gen que no está ligado a nolFG. La función durante la simbiosis de la bomba codificada por los genes nolFG no está clara y tampoco están establecidos los sustratos que transporta. En E. meliloti AK631 se pensaba que NolFG están involucrados en la nodulación, dado que mutantes por inserción de Tn5 en cualquiera de estos genes presentaban retraso y una reducción del número de nódulos en alfalfa[21]. Más tarde, se sugirió que la inserción de Tn5 en los genes nolFG no disminuyó los niveles de transcripción del gen corriente abajo, nodN, que codifica una proteína necesaria para la producción eficiente de factores Nod[22]. Más recientemente, la mutación por deleción en nolG[23], no alteró el fenotipo simbiótico, por lo que es probable que las mutaciones causadas por Tn5 en los genes NolFG ocasionaran un efecto polar sobre la expresión del gen nodN y que éste fuera el causante del fenotipo de nodulación. Algunos autores[24] sugieren que el sistema RND codificado por los genes nolFG pudiera transportar factores Nod[24], mientras que otros[25] no encuentran evidencias experimentales sobre ese papel y proponen que nolG podría estar implicado en la expulsión de antibióticos o desoxicolato, más que en el proceso simbiótico rizobio-leguminosa[25]. Objetivos Con estos antecedentes, los objetivos marcados son el estudio de los efectos de la mutación de los genes nolG y nolF de la familia RND de E. meliloti Rm2011 y E. medicae SVQ748 en: 1. La resistencia a metales pesados y a antimicrobianos. 2. La producción de moléculas implicadas en quorum sensing. 3. La movilidad tipo swimming. 4. La producción de polisacáridos extracelulares. 5. La cinética y la competitividad por la nodulación en plantas de M. sativa. Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 6 Materiales y Métodos Bacterias, medios y condiciones de cultivo Las bacterias utilizadas se recogen en la Tabla 1 y se cultivaron en los medios detallados en la Tabla 2 a una temperatura de 28ºC y un pH de 6,8-7,0. Los medios se esterilizaron en autoclave 20 minutos a 1 atmosfera de sobrepresión (121ºC). Cuando fue necesario se utilizaron los antibióticos mostrados en la Tabla 3. Tabla 1. Estirpes bacterianas utilizadas en este trabajo. Ensifer meliloti Estirpe Características relevantes Referencia Rm2011 Mutante espontáneo estreptomicina resistente derivado de SU47 (Antes Sm2011). [26] Rm2011 NolG Rm 2011mTn5STM.1.07.H05 SMa0875 NolG efflux transporter, Sm R Km R gusA. [27] Rm2011 NolF Rm2011mTn5STM.2.05.C02 SMa0876 NolF secretion protein. Sm R Km R gusA. [27] Ensifer medicae Estirpe Características relevantes Referencia SF3.41 Estirpe silvestre. [28] SVQ748 Mutante espontáneo rifampicina resistente derivado de SF3.41 [29] SVQ750 SVQ 748 mutado en el gen nolG por inserción del casete lacZ-Gm [29] SVQ758 SVQ748 mutado en el gen nolG por deleción en fase. [29] La estirpe silvestre Rm2011 a partir de ahora se nombrará como 2011 y los mutantes Rm2011 NolF a partir de ahora se nombrará como 2011NolF y Rm2011 NolG a partir de ahora se nombrará como 2011NolG. Tabla 2. Medios de cultivo empleados para el crecimiento de las bacterias. Medio TY[30] Extracto de levadura 3 g Triptona 5 g CaCl2 2H2O 0,65 g H2O destilada Completar hasta 1 L Medio YM[31] K 2 HPO 4 0,5 g MgSO4 7H2O 0,2 g NaCl 0,2 g Extracto de levadura 0,1 g Manitol 10/3 g* H2O destilada Completar hasta 1 L * 10 g para una solución YM (10) y 3g para una solución YM (3). Medio Bromfield Extracto de levadura 0,4 g Triptona 0,1 g CaCl2 x 2H2O 0,1 g Agar bacteriológico 3 g H2O destilada Completar hasta 1 L Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 7 Tabla 3. Antibióticos empleados para la selección de las bacterias. Agente selectivo E. meliloti (µg/mL) E. medicae (µg/mL) Placa Líquido Placa Líquido Estreptomicina (Spc) 400 400 Gentamicina (Gm) 25 12,5 50 12,5 Kanamicina (Km) 60 30 Rifampicina (Rif) 50 50 La rifampicina se disolvió en metanol, la tetraciclina en etanol al 70% y el ácido nalidíxico en una solución NaOH 0,1 M. Los demás antibióticos se disolvieron en agua. La temperatura de almacenamiento de los antibióticos fue de -20 ºC. Ensayos de Movilidad de tipo Swimming Se colocaron alícuotas de 3 μL de cultivo bacteriano en TY líquido (D.O.600 nm de 0,9-1) introduciendo la punta de una micropipeta hasta la mitad del grosor de placas con medio Bromfield (0,3% de agar), suplementado o no con el flavonoide inductor luteolina (1 µg/mL), se incubaron 6 días y se midió el diámetro de la colonia. Los resultados obtenidos de un mínimo de dos experimentos independientes (con al menos 3 réplicas técnicas), se les aplicó la desviación estándar. Tolerancia a Sustancias antimicrobianas La resistencia a metales pesados, antibióticos y sustancias bacterianas se analizó mediante el método de difusión en disco de Kirby-Bauer[32]. Para ello, se inocularon 2 mL de cultivo (D.O.600 nm 0,6) de la bacteria en 25 mL de medio TY (1% agar) templado. Una vez solidificado, se colocaron discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro a los que se añadieron 5 μL de diferentes concentraciones de las sustancias a ensayar (Tabla 4). Las placas se incubaron 2 días y se midieron los diámetros (mm) de las zonas de inhibición. Tabla 4. Sustancias antimicrobianas. Metales Antibióticos Sust. Antimicrobianas CdCl2 100 mM Ciprofloxacino 25 Agua oxigenada 30% CoCl2 100 mM Desoxicolato 0,5 g/mL Luteonina 5 mg/mL CuSo4 500 mM Novobiocina 75 Metanol NiCl2 200 mM Rifampicina 25 Naringenina 5 mg/mL ZnSO4 500 mM Piperacilina 10 SDS 20% Ensayo para la determinación de la producción de moléculas implicadas en quorum sensing Se realizaron ensayos de difusión en placa de Petri usando al biosensor A. tumefaciens NT1(pZRL4) curada del plásmido pTiC58 y que porta el plásmido pZRL4 con la fusión traG::lacZ y del gen traR, GmR [33]. Se colocaron cilindros metálicos estétiles (0,8 cm de diámetro y 1 cm de altura) en las placas sobre las que se añadió medio YMA(3). Una vez solidificado se añadieron a cada placa 4 mL de agar de cobertera con 400 µL de cultivo en fase estacionaria del biosensor y 40 µL de X-Gal (20 mg/mL). Tras solidificarse se retiraron los cilindros metálicos y en cada pocillo se añadieron 200 µL de los sobrenadantes bacterianos obtenidos previamente mediante centrifugación a partir de cultivos de 5-6 días en medio YM3. Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 8 Las placas se incubaron 48 horas y se midieron los halos desarrollados. Para la extracción, sobrenadantes de las bacterias crecidas 6 días en 5 mL de medio YM(3) se extrajeron con un volumen de acetato de etilo acidificado (0,1% de ácido acético glacial), se evaporaron hasta sequedad y se resuspendieron en un volumen adecuado del mismo solvente (aproximadamente 10 µL/mL de sobrenadante). El análisis se realizó mediante cromatografía en capa fina (TLC) en placas de silica gel 60 RP-18 F254S (1.05559 Merck) usando 4 µL de una concentracion de 50 µg/mL de los patrones: hexanoil homoserina lactona (HHL) y octanoil homoserina lactona (OHL). Se usó metanol:agua (60:40 v/v) como fase móvil. Finalmente, se dejó para evaporar el solvente. Las placas fueron reveladas con una mezcla de 20 mL de YM(3) 1,2% de agar, 10 mL de cultivo A. tumefaciens NT1(pZRL4) en fase estacionaria y 40 µL de X-Gal (40 mg/mL), que se vertió sobre la placa TLC previamente colocada en placas de Petri cuadradas. Se incubaron 48 horas o hasta la aparición de las manchas correspondientes[33]. Estudio de la producción de polisacáridos extracelulares Se colocaron 3 μL del cultivo en TY líquido de las bacterias (D.O.600 nm 0,9~1) en la superficie de placas de YMA(10), suplementado o no con el flavonoide inductor luteolina (1 µg/mL) y calcoflúor (100 µg/mL). Tras incubar 6 días, se midió el diámetro de la colonia y, cuando contenían calcoflúor, se observaron bajo luz UV. Se realizaron un mínimo de dos experimentos independientes (con al menos 3 réplicas técnicas) y se les aplicó la desviación estándar. Estudios con M. sativa en condiciones controladas Las plantas se cultivaron en la cámara de plantas con una intensidad lumínica de 500 μE x m-2 x s-1 (λ= 400~700 nm), fotoperiodo 16/8 horas luz/oscuridad, temperatura de 24/18ºC día/noche y humedad relativa de un 50%. Se utilizó la solución de Rigaud-Puppo carente de nitrógeno combinado y diluida a la mitad (0,5x). Cuando fue necesario se añadió el volumen adecuado de una solución concentrada y esterilizada mediante filtración de CdCl2 hasta conseguir las concentraciones finales deseadas. Solución de Rigaud-Puppo (1x)[34] PO4H2K 0,2 g SO 4 K 2 0,2 g SO4Mg7H2O 0,2 g Cl2Ca2H2O 0,1 g Solución de Gibson 1 mL Quelante de Hierro 0,02 g H2O destilada Completar hasta 1 L Agar 0,7 % El pH del medio se ajustó a 6,5-7,0 y posteriormente se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121ºC). Solución de micronutrientes de Gibson H 3 BO 3 2,86 g MnSO4 H2O 2,08 g ZnSO4 7H2O 0,22 g CuSO 4 5H 2 O 0,08 g Na2MoO4 0,13 H2O destilada Completar hasta 1L Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 15 Figura 9. Cinética de nodulación de alfalfa A. Silvestre SVQ748, B. Mutante SVQ750 y C. Mutante SVQ758 a diferentes concentraciones de cadmio: sin cadmio, 0,5 y 0,7 mg/L CdCl2. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 5 7 8 11 12 14 15 18 20 22 25 27 32 Nº nódulos d.p.i. A. SVQ748 0 Cd 0´5 Cd 0´7 Cd 0 2 4 6 8 10 12 14 16 5 7 8 11 12 14 15 18 20 22 25 27 32 Nº nódulos d.p.i. B. SVQ750 0 Cd 0´5 Cd 0´7 Cd 0 2 4 6 8 10 12 14 16 5 7 8 11 12 14 15 18 20 22 25 27 32 Nº nódulos d.p.i. C. SVQ758 0 Cd 0´5 Cd 0´7 Cd Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 16 Figura 10. Aspecto de las plantas de alfalfa, A. en ausencia de CdCl2, B. a 0,5 mg/L de Cd2Cl y C. a 0,7 mg/L de Cd2Cl tras la inoculación con el silvestre SVQ748 y los mutantes SVQ750 y SVQ758. Los ensayos con Rm2011 y sus derivados se realizaron en tubos de 18 mm de diámetro. En ausencia de cadmio, las plantas inoculadas con 2011NolF fueron más rápidas formando nódulos (7 d.p.i.) que las inoculadas con 2011 y 2011NolG (12 d.p.i.) (Figura 11A). Además, se detectó menor número de nódulos en las plantas inoculadas con 2011NolF y aún menor con 2011NolG al final del ensayo. A 0,5 mg/L de CdCl2, se observó un significativamente mayor número de nódulos en 2011NolG frente a 2011 a los 14 d.p.i y entre 2011NolG y 2011NolF a los 19 d.p.i. (Figura 10B). A 0,7 mg/L de CdCl2, mostraron un mayor número de nódulos las plantas inoculadas con 2011 que con 2011NolF y 2011NolG al final del ensayo. Además, las inoculadas con 2011 formaron nódulos a los 12 d.p.i., y las inoculadas con 2011NolF y 2011NolG no desarrollaron nódulos hasta los 19 y 20 d.p.i. (Figura 10C). 0 2 4 6 8 10 12 14 4 7 9 12 14 19 20 21 22 26 29 30 Nº nódulos d.p.i. A. Nodulación en ausencia de CdCl2 2011 2011 NolF 2011 NolG 0 2 4 6 8 10 12 14 4 7 9 12 14 19 20 21 22 26 29 30 Nº nódulos d.p.i. B. Nodulación en 0,5 mg/L CdCl2 2011 2011 NolF 2011 Nol G Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 17 Figura 10. Cinética de nodulación de alfalfa M. sativa inoculada con las estirpes 2011, 2011NolF y 2011NolG. Concentración de cadmio final: A. Sin cadmio, B. 0,5 mg/L CdCl2, 0,7 mg/L CdCl2. Los datos representan la media de 10 réplicas con 2 plantas en cada tubo. Los valores de los mutantes 2011NolF y 2011NolG se compararon individualmente con los de la estirpe parental 2011 usando el test ANOVA de un factor. Las letras representan diferencias significativas a una p < 0,05. Competitividad por la nodulación de E. meliloti 2011 y sus derivados en alfalfa Los ensayos de competitividad realizados mostraron claramente una mayor capacidad competitiva de 2011NolF frente al silvestre 2011, observándose que más del 60% de los nódulos estaban ocupados por 2011NolF. El mutante 2011NolG fue prácticamente similar a 2011 (47,4%). Discusión Se seleccionó el gen nolG para estudiar su posible papel en la resistencia a distintos tóxicos y en la simbiosis con la alfalfa en E. meliloti Rm2011 y E. medicae SVQ748 y, además, el gen nolF en E. meliloti Rm2011. Los estudios con antimicrobianos pusieron de manifiesto una alta resistencia intrínseca a sustancias como metanol, desoxicolato sódico, luteolina, naringenina, piperacilina y rifampicina en E. medicae SVQ748 y derivados y a metanol, desoxicolato sódico, luteolina, naringenina y tetraciclina en E. meliloti Rm2011 y derivados. No se encontraron diferencias significativas de tolerancia de los distintos mutantes en nolG y en nolF con respecto a los parentales (Figuras 1A, 1B, 2A y 2B), por lo que estos genes no parecen tener un papel importante en estas tolerancias, lo que concuerda con los datos obtenidos por otros autores[29,35,36]. Tampoco hubo diferencias en la tolerancia a los metales pesados ensayados entre 2011 y SVQ748 y sus respectivos mutantes (Figuras 1C y 2C). Por tanto, es posible que ninguno de estos genes tenga actividad destoxificadora de metales ni de otras sustancias en estas bacterias o bien porque no se expresaran en las condiciones ensayadas, dado que se encuentran bajo un promotor del tipo caja de nodulación; quizás estos ensayos habría que repetirlos en presencia de luteolina como flavonoide inductor. Por otra parte, el mutante por deleción SVQ758 fue más resistente que SVQ750 y SVQ748 y 2011 fue ligeramente más resistente que SVQ748 a los metales. 0 2 4 6 8 10 12 14 4 7 9 12 14 19 20 21 22 26 29 30 Nº nódulos d.p.i. C. Nodulación en 0,7 mg/L CdCl2 2011 2011 Nol F 2011 Nol G Diferencias Significativas B. Cinética de Nodulación (0,5 mg/L CdCl2) 14 d.p.i. 2011 2011NolG 2011Nol F 0,3 B 1,5 A 0,4 AB 19 d.p.i. 2011 2011NolG 2011Nol F 0,7 A 1,8 AB 0,6 B Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 18 Las mutaciones por inserción en nolF y en nolG de E. meliloti 2011 no causaron ningún efecto sobre la morfología de las colonias ni sobre la producción de EPS ni sin ni con luteolina. Sin embargo, los mutantes en nolG de E. medicae SVQ748 mostraron diferencias morfológicas mucho más drásticas en el mutante por inserción (Figura 4A). Además, este último presentó fluorescencia en ausencia de luteolina (Figura 4B y 4C), lo que indicaría que la mutación por inserción estaría afectando a otros factores que habría que determinar. En ausencia de luteolina, la mutación 2011NolF redujo significativamente la movilidad swimming. Sin embargo, con luteolina 2011NolG la aumentó (Figura 5). Esto indicaría un distinto papel de los genes en estado libre o bajo simbiosis. Lo que fue claro es la disminución en la movilidad de todas las cepas por la presencia de luteolina, datos que concuerdan con los obtenidos por Alías-Villegas (2016)[29]. Esta misma autora describió que E. medicae SVQ750 fue menos móvil con o sin luteolina que SVQ748. El distinto comportamiento que la mutación por inserción provoca sobre la movilidad tipo swimming indicaría un distinto papel del sistema RND, o de las sustancias que exporta, en la movilidad de estas bacterias. Por otro lado, el efecto reductor de la movilidad que provoca la luteolina en E. meliloti 2011 y E. medicae SVQ748 podría tener su explicación en la implicación simbiótica de la movilidad, ya que la luteolina actuaría como señal indicativa de la presencia de la planta, lo que activaría los sistemas de colonización, formación de biopelículas sobre la raíz, curvatura del pelo radical, etc. En cuanto al papel de estos genes en la simbiosis con la alfalfa, E. meliloti 2011NolG es igual de competitivo que su parental 2011. Sin embargo, 2011NolF fue más competitivo que el silvestre. Por lo que, de nuevo, se puso de manifiesto un diferente efecto en la mutación de nolG y nolF. Sin embargo, según lo reportado por Alías Villegas (2016)[29] el mutante SVQ750 no tenía alterada la competitividad frente a SVQ748. La mutación por inserción en nolG produjo un retraso en la formación de nódulos y reducción del número final de nódulos en E. medicae SVQ748, lo que no ocurrió en la mutación por deleción (Figura 6A), por lo que es posible que haya un efecto polar sobre el gen nodN o sobre otra característica de esta bacteria. Curiosamente, el mutante SVQ758 provocó un mayor peso de la planta que el parental SVQ748, aunque las diferencias no fueron significativas. Además, el cadmio a una concentración de 0,7 mg/L afectó a la cinética y al número de nódulos en E. medicae SVQ748 pero este efecto no se observó tan claramente en los mutantes en nolG. Curiosamente, el cadmio afectó en general más al silvestre que a los mutantes. Las mutaciones por inserción en nolF y nolG retrasaron la aparición de nódulos y disminuyeron el número de éstos en E. meliloti 2011. La adición de 0,5 y 0,7 mg/L de CdCl2 provocó una disminución drástica en la velocidad de aparición de los nódulos y en el numero de éstos tanto en el parental como en los dos mutantes; por lo que E. meliloti 2011 parece proteger a la simbiosis con la alfalfa en menor medida que E. medicae SVQ748. Los resultados obtenidos en este trabajo permiten concluir que los genes nolG de E. medicae SVQ748 y de E. meliloti 2011 así como el gen nolF de E. meliloti 2011 no parecen estar implicados en la tolerancia a sustancias antimicrobianas, antibióticos ni metales pesados. Sin embargo, tienen importancia en la movilidad de tipo swimming y en algunas otras características de estos rizobios. Además, mutaciones en estos genes tienen efectos en propiedades tan importantes simbióticamente como la cinética o la competitividad por la nodulación aunque el papel exacto pueda quedar por determinar. Además el cloruro de cadmio, a concentraciones de 0,7 mg/L afectan a la simbiosis de estas bacterias con la alfalfa. Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 19 Agradecimientos Estoy muy agradecida al Departamento de Microbiología de la Facultad de Biología de la Universidad de Sevilla, por permitirme desarrollar este trabajo, a la tutora del proyecto, la doctora María del Rosario Espuny, así como a todos los integrantes del departamento por sus consejos y la ayuda recibida en todo momento. Bibliografía 1. Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X. & Batut, J. 2009 Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: how many rhizobium recipes? Trends Microbiol. 17, 458–466. 2. Oldroyd, G. E. D., Murray, J. D., Poole, P. S. & Downie, J. A. 2011 The rules of engagement in the legume-rhizobial symbiosis. Annu. Rev. Genet. 45, 119–44. 3. D’Haeze, W. & Holsters, M. 2002 Nod factor structures, responses, and perception during initiation of nodule development. Glycobiology 12, 79R–105R. 4. Kondorosi, E., Mergaert, P. & Kereszt, A. 2013 A paradigm for endosymbiotic life: cell differentiation of Rhizobium bacteria provoked by host plant factors. Annu. Rev. Microbiol. 67, 611–28. 5. Patriarca, E. J., Tatè, R., Ferraioli, S. & Iaccarino, M. 2004 Organogenesis of legume root nodules. Int. Rev. Cytol. 234, 201–62. 6. Wang, D., Yang, S., Tang, F. & Zhu, H. 2012 Symbiosis specificity in the legume - rhizobial mutualism. Cell. Microbiol. 14, 334–342. 7. Minami, E., Kouchi, H., Carlson, R. W., Cohn, J. R., Kolli, V. K., Day, R. B., Ogawa, T. & Stacey, G. 1996 Cooperative action of lipo-chitin nodulation signals on the induction of the early nodulin, ENOD2, in soybean roots. Mol Plant Microbe Interact 9, 574–583. 8. Oldroyd, G. E. D. 2013 Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nat. Rev. Microbiol. 11, 252–63. (doi:10.1038/nrmicro2990) 9. Gage, D. J. 2004 Infection and invasion of roots by symbiotic nitrogen-fixing rhizobia during nodulation of temperate legumes. 68, 280–300. 10. Fraysse, N., Couderc, F. & Poinsot, V. 2003 Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis. Eur. J. Biochem. 270, 1365–1380. 11. Sharon, R., Long & David, W. & Ehrhardt 1989 New route to a sticky subject. Nature 338, 545–546. 12. Geurts, R. & Bisseling, T. 2002 Nod Factor Perception and Signalling. Plant Soil , 239– 249. 13. Daniels, R. et al. 2006 Quorum signal molecules as biosurfactants affecting swarming in Rhizobium etli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 14965–70. 14. Pérez-Montaño, F. et al. 2011 Nodulation-gene-inducing flavonoids increase overall production of autoinducers and expression of N-acyl homoserine lactone synthesis genes in rhizobia. Res. Microbiol. 162, 715–723. 15. Pérez-Montaño, F., Jiménez-Guerrero, I., Contreras Sánchez-Matamoros, R., López- Baena, F. J., Ollero, F. J., Rodríguez-Carvajal, M. A., Bellogín, R. A. & Espuny, M. R. Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 20 2013 Rice and bean AHL-mimic quorum-sensing signals specifically interfere with the capacity to form biofilms by plant-associated bacteria. Res. Microbiol. 164, 749–760. 16. Kearns, D. B. 2010 A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol 8, 634–644. 17. Walsh, K. B. 1995 Physiology of the legume nodule and its response to stress. Soil Biol. Biochem. 27, 637–655. 18. Nies, D. H. 2003 Efflux-mediated heavy metal resistance in prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev. 27, 313–339. 19. Guffanti, A. A., Wei, Y., Rood, S. V & Krulwich, T. A. 2002 An antiport mechanism for a member of the cation diffusion facilitator family: divalent cations efflux in exchange for K+ and H+. Mol Microbiol 45, 145–153. 20. Bloss, T., Clemens, S. & Nies, D. H. 2002 Characterization of the ZAT1p zinc transporter from Arabidopsis thaliana in microbial model organisms and reconstituted proteoliposomes. Planta 214, 783–791. 21. Baev, N., Endre, G., Petrovics, G., Banfalvi, Z. & Kondorosi, A. 1991 Six nodulation genes of nod box locus 4 in Rhizobium meliloti are involved in nodulation signal production: nodM codes for D-glucosamine synthetase. Mol Gen Genet 228, 113–124. 22. Baev, N., Schultze, M., Barlier, I., Ha, D. C., Virelizier, H., Kondorosi, E. & Kondorosi, A. 1992 Rhizobium nodM and nodN genes are common nod genes: nodM encodes functions for efficiency of nod signal production and bacteroid maturation. J Bacteriol 174, 7555–7565. 23. Eda, S., Mitsui, H. & Minamisawa, K. 2011 Involvement of the smeAB multidrug efflux pump in resistance to plant antimicrobials and contribution to nodulation competitiveness in Sinorhizobium meliloti. Appl Env. Microbiol 77, 2855–2862. 24. Saier Jr., M. H., Tam, R., Reizer, A. & Reizer, J. 1994 Two novel families of bacterial membrane proteins concerned with nodulation, cell division and transport. Mol Microbiol 11, 841–847. 25. Hernandez-Mendoza, A., Quinto, C., Segovia, L. & Perez-Rueda, E. 2007 Ligandbinding prediction in the resistance-nodulation-cell division (RND) proteins. Comput Biol Chem 31, 115–123. 26. Meade, H. M. & Signer, E. R. 1977 Genetic mapping of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 2076–2078. 27. Pobigaylo, N., Szymczak, S., Nattkemper, T. W. & Becker, A. 2008 Identification of genes relevant to symbiosis and competitiveness in Sinorhizobium meliloti using signature-tagged mutants. Mol Plant Microbe Interact 21, 219–231. 28. Alías-Villegas, C., Cubo, M. T., Lara-Dampier, V., Bellogín, R. A., Camacho, M., Temprano, F. & Espuny, M. R. 2015 Rhizobial strains isolated from nodules of Medicago marina in southwest Spain are abiotic-stress tolerant and symbiotically diverse. Syst. Appl. Microbiol. 38, 506–514. 29. Alías-Villegas, C. 2016 Caracterización de rizobios aislados de leguminosas del suroeste de Andalucía e implicación del gen nolG en la simbiosis Ensifer meliloti ORT12 - Medicago sativa. 30. Beringer, J. E. 2974 R Factor Transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. Efecto del cadmio en la simbiosis de Ensifer meliloti y E. medicae con Medicago sativa Dulcenombre de Maria del Saz Navarro 21 , 188–198. 31. Vincent, J. M. 1970 A manual for the practical study of root nodule bacteria. Oxford (Reino Unido): Blackwell Scientific Publication. 32. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C. & Turck, M. 1966 Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Tech Bull Regist Med Technol 36, 49–52. 33. Cha, C., Gao, P., Chen, Y. C., Shaw, P. D. & Farrand, S. K. 1998 Production of acylhomoserine lactone quorum-sensing signals by gram-negative plant-associated bacteria. Mol Plant Microbe Interact 11, 1119–1129. 34. Rigaud, J. & Puppo, A. 1975 Indole-3-acetic Acid Catabolism by Soybean Bacteroids. J. Gen. Microbiol. 88, 223–228. 35. Delorme, T. A., Gagliardi, J. V, Angle, J. S., van Berkum, P. & Chaney, R. L. 2003 Phenotypic and genetic diversity of rhizobia isolated from nodules of clover grown in a zinc and cadmium contaminated soil. Soil Sci. Soc. Am. J. 67, 1746–1754. 36. Wei, G. H., Tan, Z. Y., Zhu, M. E., Wang, E. T., Han, S. Z. & Chen, W. X. 2003 Characterization of rhizobia isolated from legume species within the genera Astragalus and Lespedeza grown in the Loess Plateau of China and description of Rhizobium loessense sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 53, 1575–1583.