Significancia de la diarrea persistente por parásitos en el síndrome de diarrea crónica pediátrico.

TESIS DOCTORAL FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Microbiología y Parasitología SIGNIFICANCIA DE LA DIARREA PERSISTENTE POR PARÁSITOS EN EL SÍNDROME DE DIARREA CRÓNICA PEDIÁTRICO ESPERANZA LEPE BALSALOBRE Sevilla, 2018 I Dña. CONCEPCIÓN ARIZA ASTOLFI, PROFESORA TITULAR DE PARASITOLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral que lleva por título: “Significancia de la diarrea persistente por parásitos en el síndrome de diarrea crónica pediátrico” , presentada por Dña. Esperanza Lepe Balsalobre para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. Revisado el texto, doy mi conformidad para su presentación y defensa para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Fdo. Dra. Concepción Ariza Astolfi DIRECTORA DE LA TESIS 15 de Noviembre de 2018 II III Dña. CRISTINA ÚBEDA AGUILERA, PROFESORA ASOCIADA DEL INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DE LA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHILE CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral que lleva por título: “Significancia de la diarrea persistente por parásitos en el síndrome de diarrea crónica pediátrico” , presentada por Dña. Esperanza Lepe Balsalobre para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. Revisado el texto, doy mi conformidad para su presentación y defensa para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Fdo. Dra Cristina Úbeda Aguilera DIRECTORA DE LA TESIS 15 de Noviembre de 2018 IV V VI AGRADECIMIENTOS En primer lugar, quiero agradecer la realización de este proyecto a mis directores de tesis, la Dra Concepción Ariza Astolfi, Profesora asociada del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, por su motivación y ánimo constante; y a la Dra Cristina Úbeda Aguilera, Profesora Asociada del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Facultad de Ciencias de la Universidad Autónoma de Chile, por todo lo que me ha enseñado y por la confianza que ha depositado en mí. Al Dr José Manuel Úbeda Ontiveros, Catedrático de Parasitología del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, por su inestimable ayuda y orientación durante la realización de este proyecto. A mi tutor, José Manuel Guerra García, por toda la ayuda y orientación en este proyecto. Gracias a todo el personal facultativo y técnico del Servicio de Bioquímica del Hospital de Valme. En especial, al Dr Antonio Moro Ortiz y a la Dra María del Mar Viloria Peñas, dos grandes profesionales y excelentes personas que siempre me han animado en este proyecto y de quienes he aprendido tanto a lo largo de mi formación. Y, por último, a mi familia y a Javier, por su apoyo y compresión durante todo este largo camino. VII El agradecimiento es la memoria del corazón Lao-tsé (570-490 a.C.) XIV Tabla 35: Distribución de las muestras positivas a parásitos y leucocitos fecales. Tabla 36: Distribución de las muestras en función del resultado en la prueba de cuerpos reductores en heces. Tabla 37: Distribución de las muestras en función del resultado del estudio de grasas en heces. Tabla 38: Distribución de las muestras positivas a parásitos en función de los procesos de malabsorción y maladigestión. Tabla 39: Análisis general de los resultados de laboratorio obtenidos. XV XVI LISTA DE FIGURAS Figura 1: Porcentaje de niños con edad menor o igual a 4 años. Figura 2: Distribución de las muestras con diagnóstico inicial de diarrea persistente en función de la edad. Figura 3: Distribución de las muestras con diagnóstico inicial de diarrea persistente y dolor abdominal en función de la edad. Figura 4: Carta de color para determinación de cuerpos reductores en heces. Figura 5: Vista de los resultados obtenidos en función del canal de color aplicado. Figura 6: Proceso de amplificación para el gen de la beta giardina y para el gen RNA ssr. Figura 7: Proceso de extracción de compuestos volátiles del espacio de cabeza estático. Figura 8: Tinciones de Kinyoun positivas correspondientes a los pacientes nº 12, 279, 1233, 1236. Figura 9: Tinciones de Auramina positivas correspondientes a los pacientes nº 147, 278, 1232, 1301. Figura 10: Imágenes microscópicas de los casos discrepantes correspondientes a Blastocystis sp. Figura 11: Imágenes microscópicas de los casos discrepantes correspondientes a Giardia sp. Figura 12: Imágenes por inmunofluorescencia de los casos discrepantes correspondientes a Giardia sp. Figura 13: Electroforesis de los fragmentos amplificados en la PCR in house para estudio de los casos discrepantes de Giardia sp. Figura 14: Cromatogramas pertenecientes a pacientes sin giardiasis (a) y a pacientes con giardiasis (b). XVII Figura 15. Distribución de las muestras analizadas representadas para CP1 y CP2. Figura 16. Distribución de los valores y su relación con las muestras. Figura 17: Valores de calprotectina en el total de la población estudiada. Figura 18: Valores de calprotectina en el grupo de menores de 1 año. Figura 19: Valores de calprotectina en el grupo de 1 a 4 años. Figura 20: Valores de calprotectina en el grupo de 5 a 14 años. Figura 21: Valores de calprotectina en el grupo de niños con diarrea persistente. Figura 22: Valores de calprotectina en el grupo de niños con diarrea persistente más dolor abdominal. Figura 23: Valores de calprotectina en el grupo de niños con diarrea persistente más hematoquecia. Figura 24: Valores de calprotectina en el grupo de niños con malabsorción de azúcares y/o grasas. Figura 25: Valores de calprotectina en el grupo de niños con infección bacteriana. Figura 26: Valores de calprotectina en el grupo de niños con infección parasitaria. Figura 27: Valores de calprotectina en el grupo de niños con infección por parásitos patógenos. Figura 28: Valores de calprotectina en el grupo de niños con infección por parásitos no patógenos. XVIII XIX RESUMEN INTRODUCCION Y ANTECEDENTES A la hora de enfocar el estudio de la diarrea persistente en el niño, desde el punto de vista infeccioso, es muy importante la localización y el grado de desarrollo de los países donde residen los pacientes. En general, en los niños pertenecientes a países desarrollados, es probable que la diarrea crónica sea desencadenada por una enfermedad subyacente que causa malabsorción o alteraciones en la digestión. Sin embargo, las infecciones entéricas (particularmente en pacientes inmunodeprimidos) y los factores dietéticos pueden jugar un papel importante en algunos casos. Además, en los países desarrollados, la diarrea funcional representa una alta proporción de diarreas crónicas en los niños. En base a lo anterior, la diarrea crónica de etiología bacteriana ( Salmonella sp y Campylobacter sp) y vírica (Rotavirus, Adenovirus) en estos países es poco frecuente. Respecto a la etiología parasitaria (generalmente por Giardia lamblia ), hay menos evidencia, aunque existen estudios que consideran que los parásitos rara vez causan diarrea persistente en niños con un sistema inmune intacto. La importancia de la diarrea persistente de etiología parasitaria en niños en la provincia de Sevilla en la actualidad, es poco conocida y su conocimiento podría ser de gran ayuda para su enfoque diagnóstico. OBJETIVOS Determinar la prevalencia de parasitismo intestinal en niños con síndrome de diarrea crónica/persistente en el área sanitaria adscrita al Hospital Universitario de Valme y evaluar la utilidad de técnicas microscópicas, moleculares y cromatográficas en el diagnóstico de la enfermedad parasitaria en el síndrome de diarrea crónica/persistente infantil. XX MATERIAL Y METODOS Estudio de prevalencia de la etiología de la diarrea persistente en general y de la parasitaria en particular en población infantil sintomática, mediante un estudio descriptivo, de corte transversal en el periodo de un año (mayo 2016-mayo 2017). La metodología utilizada, incluye el estudio de la etiología de causa no infecciosa mediante microscopía, digestión de principios inmediatos y determinación cuantitativa de calprotectina. El estudio de la etiología de causa infecciosa, incluyó la realización de coprocultivo, microscopía con y sin concentración, técnicas moleculares, inmunocromatográficas y cromatográficas. RESULTADOS Y CONCLUSIONES El estudio en conjunto de las pruebas de laboratorio mostró que en el 11,3% de los casos de diarrea persistente en niños del Area Sanitaria adscrita la Hospital Universitario de Valme se detectaba un microorganismo infeccioso, en el 11,7% se demostraban procesos de malabsorción o maladigestión y en el 12,2% procesos inflamatorios, aunque en muchas ocasiones, estos procesos no eran hallazgos aislados, sino que estaban interrelacionados. En concreto, en el 7,1% se detectó la presencia de parásitos, correspondiendo el 2,6% a parasitos considerados clasicamente patógenos ( Giardia sp y Cryptosporidium sp). La etiología bacteriana fue responsable del 3,9% de los casos, siendo Campylobacter sp era la etiología bacteriana más prevalente. Los resultados de este trabajo demuestran que las técnicas moleculares son en general menos sensibles que la microscopía convencional para el diagnóstico de la infección parasitaria en niños con diarrea persistente debido a la baja carga parasitaria y a la presencia de inhibidores en las XXI muestras. Las técnicas cromatográficas, mostraron una alta sensibilidad a la hora de discriminar casos de pacientes con diarrea por Giardia sp de aquellos que presentaban un cuadro diarreico sin etiología parasitaria. En base a los resultados, el estudio de parásitos en la diarrea persistente en niños, se debería plantear en base a algoritmos de decisión basados en técnicas de detección altamente sensibles. XXII 1 I. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES 8 déficit congénito de IgA) (Polanco-Allué et al., 2010) el estudio en heces de los niveles de calprotectina fecal que aumentan en la inflamación intestinal y a menudo son útiles para distinguir las causas inflamatorias de las no inflamatorias de la diarrea crónica. Sin embargo, las características de la prueba varían según la prevalencia de la enfermedad inflamatoria intestinal en la población de estudio. Por lo tanto, la prueba puede usarse para enfocar la siguiente etapa de la investigación, pero los resultados no deben interpretarse para incluir o excluir firmemente cualquier categoría de enfermedad (Vaos et al., 2013). El estudio bioquímico inicial de las heces debe incluir: 1. Determinación del pH, electrolitos y sustancias reductoras para heces acuosas. El “gap" osmótico de las heces se puede usar para estimar las contribuciones relativas de los electrolitos y no electrolitos a la retención de agua en la luz intestinal. En la diarrea osmótica, los no electrolitos causan retención de agua (Baran, 2014). La detección de sustancias reductoras (tabletas Clinitest), de estar presentes sugieren intolerancia a monosacáridos del tipo glucosa, polímeros de glucosa o maltodextrinas; o intolerancia a disacáridos del tipo lactosa (Velasco-Benitez, 2004). 2. Sangre oculta, leucocitos fecales. La determinación de sangre oculta (métodos inmunoquímicos) y leucocitos fecales (microscopía) tienen cierta capacidad para predecir procesos inflamatorios. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad de cada una de estas pruebas es baja (Tibble et al., 2002). 3. Grasas en heces: existen una amplia variedad de pruebas para detectar malabsorción de grasas (esteatorrea). El estándar de oro para el diagnóstico de la esteatorrea es la estimación cuantitativa de la grasa de las heces, generalmente realizada durante 72 horas. Debido a que la recolección de las heces durante 72 horas es engorrosa, las pruebas cualitativas también se usan para detectar la esteatorrea. Estas incluyen la tinción Sudán III y un método 9 gravimétrico rápido. La sensibilidad y fiabilidad de la prueba de Sudán III está limitada por la variabilidad en su rendimiento e interpretación (Khouri et al., 1989). 3.2 Estudios microbiológicos en heces 3.2.1 Diagnóstico de la diarrea persistente por bacterias y virus En escasas ocasiones se aísla Campylobacter sp, Salmonella sp o se detectan virus entéricos como origen de una diarrea persistente en niños de países desarrollados (JKellermayer et al., 2017) aun así, el estudio bacteriológico de las heces mediante cultivo (el llamado coprocultivo) forma parte de la mayoría de los protocolos de estudio inicial de la diarrea persistente (Ramos et al., 2010) y es la técnica de referencia (Álvarez et al., 2017). En general, en el coprocultivo se utilizan distintos medios diferenciales y selectivos. Para el caso de Salmonella sp , se utilizan medios poco selectivos como el agar MacConkey o medios con selectividad moderada como el agar Salmonella - Shigella . La utilización de medios líquidos de enriquecimiento como el caldo de selenito es muy importante ya que en los casos de diarrea persistente suele encontrarse una baja concentración de salmonelas en las heces. En el caso de Campylobacter sp también se emplean medios selectivos como el medio de Butzler o Skirrow que incorporan antibióticos para inhibir el crecimiento de la flora intestinal, además se deben incubar en atmósfera microaerofílica y 42ºC. Aunque la contribución de los virus al síndrome de diarrea persistente es poco importante (enteritis viral prolongada), el estudio de virus entéricos (Rotavirus y Adenovirus principalmente) también tiende a incorporarse rutinariamente en la valoración inicial del paciente (Schiller, 2004). El diagnóstico rutinario se basa en métodos directos, consistentes generalmente en la detección de las partículas víricas o sus antígenos mediante anticuerpos monoclonales (Álvarez et al., 2017). 10 En la actualidad se dispone de métodos de inmunocromatografía, técnicas de enzimoinmunoanálisis (EIA) convencional, técnicas de EIA de membrana y técnicas de aglutinación de partículas de látex. La incorporación del diagnóstico molecular en forma de paneles moleculares múltiples, también conocidos como paneles sindrómicos, en el estudio de la diarrea crónica es más controvertido y aunque importante para el estudio de la diarrea aguda (Khare et al., 2014), es menos rentable en la crónica por la baja carga bacteriana de las muestras (Pankhurst et al., 2014). En términos de sensibilidad, se ha demostrado que la PCR aumenta la detección de muchos microorganismos respecto al coprocultivo con la excepción de Salmonella sp (Cunningham et al., 2010), donde el enriquecimiento en caldo selenito aporta una mejor sensibilidad al coprocultivo. 3.2.2 Diagnóstico de la diarrea persistente por parásitos El examen microscópico sigue siendo el método tradicional para el estudio de parásitos de heces (García, 2009), tanto el examen en fresco, como las técnicas de concentración (sedimentación o flotación). Además, los trofozoítos de protozoos no se visualizarán tras los estudios de concentración ya que el procedimiento suele destruirlos y por ese motivo es imprescindible el examen en fresco como fase inicial del estudio microscópico. Además, el diagnóstico microscópico de los coccidios ( Cryptosporidium sp) requiere la utilización de tinciones específicas, generalmente una modificación de la tinción de Ziehl-Neelsen, denominada tinción de Kinyoun . Sin embargo, la sensibilidad de las técnicas microscópicas, parece no adecuada para el estudio de los protozoos más prevalentes en los casos de diarrea persistente, en algunos estudios se comunican valores de 54,8% y 66,4% para Cryptosporidium sp y Giardia sp respectivamente (McHardy et al., 2014). A lo anterior hay que unir otros factores que influyen en la sensibilidad de la microscopía tales como la 11 excreción esporádica (que requiere el examen de múltiples muestras de heces), la administración previa de antiparasitarios, el intervalo de recolección de las muestras y la conservación de las heces. La detección microscópica mediante tinción con anticuerpos fluorescentes aumenta significativamente la sensibilidad y la especificidad en la detección de protozoos entéricos (Manser et al., 2014). La detección de Giardia sp por inmunofluorescencia directa muestra una sensibilidad que oscila entre 99-100% y una especificidad del 100% respecto a las técnicas convencionales (66% de la microscopía convencional y 93% tinción tricrómica convencional) (García et al., 1992). Para Cryptosporidium sp, los resultados son también adecuados con sensibilidades que oscilan entre el 93-100% para la inmunofluorescencia respecto al 54,8-92% de la tinción ácidoresistente modificada (Alles et al., 1995). En el caso de Blastocystis sp la técnica muestra una sensibilidad que oscila entre 73-87% (tinción tricrómica 50%) y una especificidad del 97,3% (tinción tricrómica 50%) (Dogruman et al., 2010; Marhoumy et al., 2015). Para obviar el uso de la microscopía, se han desarrollado pruebas rápidas de detección de antígenos de Giardia sp y Cryptosporidium sp mediante inmunocromatografía o enzimoinmunoensayo (ELISA). Estas pruebas muestran sensibilidades entre el 63-83% y especificidades del 97-100% para Giardia sp y del 47-100% y 46-100% para Cryptosporidium sp (Agnamey et al., 2011). A la vista de la amplia variabilidad de las especificidades y particularmente las sensibilidades de estas pruebas el US Council of State and Territorial Epidemiologists excluye los casos diagnosticados como Cryptosporidium sp mediante inmunocromatografía y los considera probables en lugar de confirmados. 4. Diagnóstico no tradicional de laboratorio de la diarrea crónica y/o persistente 12 4.1 Empleo de métodos moleculares Como resultado de las limitaciones de los ensayos microscópicos e inmunológicos, se han desarrollado métodos de detección basados en pruebas moleculares. Este enfoque presenta numerosas ventajas sobre los métodos tradicionales, en principio una mayor sensibilidad y especificidad, capacidad de utilizar distintas dianas moleculares en un ensayo múltiple, la posibilidad de cuantificación y tipado molecular, y un tiempo de respuesta rápido, particularmente cuando la PCR está acoplada a un sistema automatizado de extracción de ADN (Verweij et al., 2014). Se sabe que la inhibición de la PCR por parte de los componentes fecales es un problema grave (Monteiro et al., 1997). Los inhibidores son polisacáridos complejos que posiblemente se originan a partir del contenido vegetal de la dieta. Además, los métodos moleculares en el caso de la detección directa desde las heces y su rendimiento se afectan mucho si las muestras han sido conservadas en SAF o PVA, además son particularmente sensibles a la calidad y pureza del ADN de partida, por lo que la elección de un método de extracción eficiente es un paso crítico, ya que se han observado diferencias de rendimiento entre diferentes equipos de extracción (Paulos et al., 2016). El abordaje del diagnóstico molecular de la diarrea de etiología parasitaria, principalmente de los protozoos, ha experimentado distintos enfoques en los últimos años, desde los métodos de PCR in house a la introducción de las plataformas síndromicas. 4.1.1 PCR in house En general, se han desarrollado múltiples protocolos moleculares in house para la detección de protozoos en heces en casos de diarrea. En general, estas técnicas no se han estandarizado y han sido dirigidas en su mayoría, a estudios de investigación más que al diagnóstico clínico de rutina. Además, son técnicas que no 13 permiten el procesado de un gran número de muestras al ser métodos muy manuales. En la actualidad el diagnóstico está basado en el empleo de PCR en tiempo real con sondas TaqMan o SYBR Green empleando cebadores que amplifican secuencias de la subunidad pequeña del ARN ribósomico 18S. Los estudios publicados, no evalúan la sensibilidad de estas técnicas, aunque en general se comparan a la microscopía convencional y concluyen que son más sensibles. La especificidad si ha sido evaluada demostrando que la PCR multiplex en tiempo real para la detección de Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum muestra una especificidad del 100% (Verweij et al., 2003). 4.1.2 Plataformas de PCR modulares Estas plataformas, son la evolución comercial de los protocolos moleculares in house . Sólo existe en el mercado una plataforma disponible el Lightmix® Parasitical Kit (Roche/TIB Molbiol). La plataforma LightMix Modular contienen cebadores premezclados con sondas de hidrólisis y controles positivos obviando los problemas de estandarización de los protocolos in house . El sistema modular LightMix permite trabajar en formato multiplex, con 6 fluoróforos, incluyendo un control interno de amplificación, y detectar los parásitos en el LC-480® de Roche. Las sondas son independientes, lo cual permite crear combinaciones de hasta 5 parásitos por muestra ( Entamoeba histolytica , Giardia sp, Dientamoeba sp, Cryptosporidium sp y Blastocystis sp), debido a que los perfiles térmicos de amplificación son comunes y comparten el mismo reactivo de amplificación. La plataforma ha demostrado una sensibilidad del 100% para todos los protozoos, y especificidades del 93,2% para B. hominis , 98% para G. intestinalis , 99,8% para especies de Cryptosporidium sp, 84% para D. fragilis y 100% para E. histolytica (Byrne et al, 2015). 14 4.1.3 Plataformas de PCR múltiples En la actualidad, la mayoría de los distintos equipos aprobados por la FDA o con marcado CE, están basados en pruebas de PCR mediante plataformas múltiples. La mayoría permiten la detección e identificación simultánea de los protozoos intestinales más comunes (así como de bacterias y/o virus) y podrían ser utilizados en el diagnóstico del síndrome de diarrea persistente. Las plataformas disponibles en la actualidad son: el BD MAXTM Enteric Parasite Panel (EPP) (Becton, Dickinson and Company, EE. UU.), el panel gastrointestinal Luminex xTAG1 (Luminex Corporation, Toronto, Canadá), el Biofire FilmArrayTM Panel gastrointestinal (BioFire Diagnostics, Salt Lake City, UT), Verigene Enteric Pathogens (EP) (Luminex) y el EasyScreenTM Enteric Parasite Detection Kit (Genetic Signatures, Sydney, Australia). Todos emplean sistemas automatizados de extracción y permiten el estudio simultáneo de distintas muestras. La sensibilidad y especificidad de estas plataformas varía según los equipos. El BD MAXTM Enteric Parasite Panel muestra una sensibilidad y especificidad del 98,2% y 99,5% para G. duodenalis y del 95,5% y 99,6% para Cryptosporidium sp, respectivamente (Madison-Antenucci, 2016). En el caso del Luminex xTAG, la sensibilidad y especificidad es del 95–100% y 99–100% para G. duodenalis y del 95–100% y 100% para Cryptosporidium sp, respectivamente (Perry, M. et al., 2014). Para el Biofire FilmArray, la sensibilidad y especificidad publicada oscila entre el 100% y 99,5– 100% para G. duodenalis y del 95–100% y 99.6–100% para Cryptosporidium sp respectivamente (Huang et al., 2016). Por último, el Verigene Enteric Pathogens (EP) test (Luminex) muestra una sensibilidad del 92% para G. duodenalis , 100% para Cryptosporidium sp y 96% para Blastocystis sp (Stark et al., 2014). La gran ventaja de estas plataformas es la gran automatización de los estudios, sin embargo, al ser paneles cerrados, es obligatorio el estudio simultáneo de virus, 15 bacterias y parásitos; lo que, unido a su alto coste económico, impide un adecuado planteamiento de los estudios en términos de eficiencia diagnóstica. 4.1.4 Métodos moleculares emergentes Una desventaja de los métodos moleculares anteriores es que solo pueden detectar los parásitos previamente definidos en los equipos. Una estrategia alternativa aprovecha la creciente disponibilidad de plataformas de secuenciación masiva (next-generation sequencing, NGS) (Lecuit et al., 2014). En la actualidad, la metagenómica shotgun, es capaz de perfilar toda la diversidad microbiana o patobioma (microbioma patógeno), incluidas bacterias, protozoos, helmintos y virus, simultáneamente, y podría ser de mucha utilidad en el síndrome de diarrea persistente (Schneeberger et al., 2016). Estas técnicas requieren la disponibilidad de genomas de referencia parciales o completos y como en la actualidad se han secuenciado muchos genomas de parásitos entéricos, incluyendo Cryptosporidium sp, Giardia sp y Blastocystis sp, esto facilitará la incorporación al diagnóstico del síndrome de diarrea crónica de las plataformas de secuenciación masiva. 4.2 Empleo de cromatografía de gases 4.2.1 Importancia de los compuestos volátiles como compuestos clave para diagnóstico de enfermedades En la actualidad, las metodologías empleadas para el diagnóstico de enfermedades se han diversificado en gran medida. La búsqueda de biomarcadores específicos de enfermedades es una tendencia en varias áreas de investigación. En concreto, los compuestos orgánicos volátiles (COV) determinados por métodos cromatográficos se han evaluado como compuestos clave para el diagnóstico de una gran variedad de enfermedades (Shirasu et al, 2011). 16 Las alteraciones en los perfiles de los COV en las muestras estudiadas (heces, orina, sudor, aliento) son un reflejo de los procesos metabólicos fisiológicos y fisiopatológicos que pueden ocurrir en el organismo. Este hecho explica que el olfato se haya utilizado durante mucho tiempo para detectar enfermedades; así, los médicos tradicionales chinos observaron distintos olores en la orina de pacientes diabéticos y a finales del siglo XIX, Robert Koch identificó olores distintivos en heridas infectadas por microorganismos (Chan et al, 2016). Debido a esto, hay estudios muy novedosos sobre la asociación entre distintas enfermedades (Alzheimer, Parkinson, cáncer) y los COV, en concreto, un estudio demuestra diferencias significativas en aire exhalado de pacientes con cáncer de mama y controles sanos (Changsong et al, 2014). Estos métodos de diagnóstico para la detección de compuestos orgánicos volátiles son método-dependientes ya que abarcan distintas técnicas cromatográficas, como la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (Buijck et al, 2016) hasta métodos electrónicos como eNose (Wojnowski et al, 2017) que son menos discriminatorios de la etiología infecciosa, pero, en general, permiten un abordaje integral de los procesos de diarrea persistente. Además, el límite de detección de los métodos cromatográficos permite la determinación de compuestos volátiles que se encuentran presentes en diversas matrices en concentraciones muy pequeñas. Es por esto que, los métodos cromatográficos permiten un abordaje muy distinto e interesante del síndrome de la diarrea crónica al de los estudios expuestos en apartados anteriores. Estos métodos no se centran en un solo microorganismo, sino en el estudio de biomarcadores lo que permite un abordaje integral en el estudio de la muestra. 4.2.2 Compuestos encontrados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas intestinales 17 La determinación de compuestos volátiles como biomarcadores de enfermedades infecciosas ha sido estudiado previamente por otros autores. En concreto, el estudio del perfil de compuestos orgánicos volátiles aplicado al diagnóstico de la diarrea infecciosa, no está extensamente desarrollado y el limitado número de estudios impiden establecer un perfil uniforme para las distintas etiologías. En base a lo anterior, los estudios disponibles buscan más establecer patrones de compuestos en comparación con controles sanos. En el caso de la diarrea por Clostridium difficile , los estudios publicados demuestran que las muestras fecales positivas podrían distinguirse de los controles en función de sus perfiles de compuestos orgánicos volátiles. Así, Tait et al. (2014) demuestran un perfil de aumento de 2-fluoro-4-metilfenol y ácido isocaproico; Garner et al. (2009) demuestra un perfil de disminución de 2-etanol; tolueno, 6- metil-3,5-heptadieno-2-ona y ácido hexanoico; y, por último, Probert et al. (2004) constata un perfil único de aumento de 5-metil-2-furancarboxialdehído. En el caso de la diarrea por Campylobacter jejuni ; Garner et al. (2009) demuestran un perfil de aumento de 1-butoxi-2-propanol y ausencia de 3-metil furano y dimetilsulfido; Probert et al. (2004) demuestran un perfil con ausencia de terpenos e hidrocarburos. Mientras que en la diarrea por Vibrio cholerae , Garner et al. (2009) constata un perfil con aumento de dimetil disulfido y pmenth-1-en-8-ol. Por otro lado, estas técnicas también se han empleado en el abordaje del estudio de la etiología vírica de la diarrea, aunque los trabajos se han centrado exclusivamente en el diagnóstico de la diarrea por rotavirus donde (Al-Kateb et al, 2012) se demuestra un perfil de aumento de aldehídos y 2-3-butanediona y en otro estudio (Probert et al, 2004) se constata un perfil único con aumento de dodecanoato de etilo de etilo. Por último, el abordaje del estudio de la etiología parasitaria de la diarrea está menos desarrollado y sólo existe un trabajo que aborda el diagnóstico de la diarrea 24 del total de muestras remitidas si bien se hallaron hasta 12 tipos de parásitos, el más frecuentemente encontrado ha fue Blastocystis sp. seguido de Giardia lamblia , Endolimax nana y Entamoeba coli . Es interesante remarcar, que con excepción del estudio de Chover-Lara et al. (2010) en Valencia, en nuestro país en los diferentes estudios coproparasitológicos realizados en los últimos 50 años no existe referencia a Dientamoeba fragilis , excepción hecha de Cataluña. Concretamente, un estudio realizado en 1978-79 en pacientes que acuden al Servicio de Microbiología del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau y otro estudio realizado en guarderías en 1981-82 detectan frecuencias del 7,8% y del 12,3%, respectivamente, apareciendo D. fragilis como la segunda especie más prevalente después de Giardia lamblia . Asimismo, en el segundo de estos estudios se destaca la mayor incidencia de D. fragilis frente a los demás protozoos intestinales detectados en aquellos casos con positividad a la oxiuriasis (Gomila et al., 2003). 25 II. HIPÓTESIS 26 HIPÓTESIS Las mejoras en las condiciones sociosanitarias en España y más concretamente en Sevilla, deben haber afectado a la prevalencia de la enfermedad parasitaria intestinal en niños, por lo que la importancia de la etiología parasitaria en el síndrome de diarrea persistente pediátrico debe haber disminuido. Las heces de pacientes con procesos diarreicos por giardiasis presentan compuestos volátiles característicos que son producto de la presencia del parásito, los cuáles permiten distingur entre un paciente con diarrea por Giardia sp y un proceso diarreico por otras causas, pudiendo ser éstos biomarcadores para esta infección. 27 II. OBJETIVOS 28 III. OBJETIVOS Objetivo principal Determinar la prevalencia de parasitismo intestinal en niños con síndrome de diarrea crónica/persistente en el área sanitaria adscrita al Hospital Universitario de Valme. Objetivos secundarios Determinar las características clínicas de los niños con diarrea persistente de etiología parasitaria. Determinar la prevalencia de otras etiologías en el síndrome de diarrea crónica/persistente infantil. Evaluar la utilidad de las técnicas moleculares en el diagnóstico de la enfermedad parasitaria en el síndrome de diarrea crónica/persistente infantil. Evaluar la utilidad de las técnicas cromatográficas en el diagnóstico de la enfermedad parasitaria en el síndrome de diarrea crónica/persistente infantil. 29 IV. MATERIAL Y MÉTODOS 30 IV. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Diseño, duración y lugar de realización del estudio Estudio de prevalencia de la etiología de la diarrea persistente en general y de la parasitaria en particular en población infantil sintomática, mediante un estudio descriptivo, de corte transversal en el periodo de un año (mayo 2016-mayo 2017). El ámbito territorial se circunscribió al área sanitaria adscrita al Hospital Universitario de Valme. La diarrea crónica se definió como la diarrea que dura más de 14 días y no se asocia exclusivamente a causa infecciosa. Cálculo del tamaño de muestra Los cálculos para obtener el tamaño de la muestra y la selección de la misma se han realizado mediante el software Raosoft sample size calculator, accesible via web (http://www.raosoft.com/samplesize.html) para un tamaño de muestra de 3.412 niños, con un margen de error del 3%, un nivel de confianza del 95% y una variabilidad del 50%; en base a las fórmulas: x = Z(c/100)2r(100-r) n = N x/((N-1)E2 + x) E = Sqrt[(N - n)x/n(N-1)] Donde n es el tamaño de muestra, E el margen de error, N es el tamaño de la población, r es la variabilidad positiva, y Z (c/100) es el valor crítico para el nivel de confianza c. Este cálculo se basa en la distribución normal. 31 Software empleado Los datos se obtuvieron del software del hospital y fueron incluidos en una base de datos construida en Excel Office de Microsoft 2016. Consideraciones éticas La aprobación ética para el estudio se obtuvo del Comité Ético del Hospital Universitario de Valme. 2. Características y motivo clínico de la población estudiada El estudio incluyó a niños entre 1 mes y 14 años de edad. La población diana fue de 3.412 niños, aproximadamente el 9% de la población infantil del área (37.110 niños), que acudía a consulta de Atención Primaria o Atención Especializada por diarrea crónica y/o dolor abdominal en dicho periodo y que remitían una muestra de heces para estudio al Laboratorio Clínico del Hospital Universitario de Valme. La recolección de las muestras se realizó de forma proporcional a la distribución de edad de los niños que consultaban y se estratificó por estacionalidad: primavera, verano, otoño e invierno. Se incluyeron un total de 777 niños en el estudio, la mediana de edad fue de 6 años con un rango de edad entre 2 meses a 14 años (tabla 1), el porcentaje de niños con una edad menor o igual a 4 años incluidos fue del 42% (328/777) (figura 1). Respecto al sexo de los niños incluidos: 406 (52%) eran niños y 371 (48%) niñas (tabla 2). Respecto a su procedencia 761 (98%) procedían de atención primaria y 16 (2%) de atención especializada (tabla 3), en la tabla 4 se especifican el número de niños según su lugar de residencia. 32 Edad (años) Número pacientes 0,2 3 0,3 2 0,4 1 0,5 4 0,6 6 0,7 4 0,8 1 0,9 4 1 103 2 103 3 40 4 57 5 52 6 59 7 41 8 53 9 64 10 71 11 34 12 39 13 22 14 14 Total 777 Tabla 1. Distribución de los niños en función de la edad. 33 Figura 1. Porcentaje de niños con edad menor o igual a 4 años. Sexo Número de pacientes Porcentaje Niños 406 52% Niñas 371 48% Total 777 100% Tabla 2. Distribución de las muestras en función del sexo. Procedencia Número de pacientes Porcentaje Atención especializada 16 2% Atención primaria 761 98% Total 777 100% Tabla 3. Distribución de las muestras en función de la procedencia. 40 6. Desechar el contenido de cada pocillo y lavar 5 veces con 250 µl de solución de lavado. Después del último lavado, eliminar el tampón de lavado residual golpeando firmemente la placa sobre el papel absoarbente. 7. Agregar 100 ul de conjugado en cada pocillo. 8. Cubrir la placa e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. 9. Desechar el contenido de cada pocillo y lavar 5 veces con 250 µl de solución de lavado. Después del último lavado, eliminar el tampón de lavado residual golpeando firmemente la placa sobre el papel absoarbente. 10. Agregar 100 µl de sustrato en cada pocillo y mezclar bien. 11. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 12. Agregar 100 µl de solución de parada en cada pocillo y mezclar bien. 13. Medir la absorción inmediatamente con un lector de ELISA a 450 nm contra 620 nm como referencia. Interpretación de los resultados: Para el cálculo de los resultados se aplica el “algoritmo de 4 parámetros” que consiste en utilizar una ordenada lineal para la densidad óptica y una función logarítmica en el eje de abscisa para la concentración. Nota: cuando se aplica una abscisa logarítmica, el cero del estándar debe especificarse con un valor inferior a 1. Los extractos de heces se conservaron durante un máximo de tres meses a -20 °C hasta su análisis. Los resultados fueron interpretados en base a los criterios de Diamantti et al. 41 3.3 Determinación de cuerpos reductores en heces Método: AimTab Reducing Substances Tablets (Germain Laboratories). Técnica: añadir 1 volumen de muestras por cada 2 volúmenes de agua desionizada. 1. Homogenización de la muestra con ayuda de pipeta Pasteur. 2. Usando una pipeta Pasteur, transferir 15 gotas de esta suspensión en un nuevo tubo. 3. Añadir una pastilla de reactivo AimTab Reducing Sustances Tablets (Germaine Laboratories). 4. Esperar 15 segundos que ocurra la reacción exotérmica y comparar el color producido con la carta de color del protocolo de la técnica. Figura 4. Carta de color para determinación de cuerpos reductores en heces. En caso de que exista lactosa en las heces, el grupo carbonilo funcional libre de ésta reacciona con el Cu2+ del reactivo ocurriendo la reacción de Benedict-Fehling (reacción de reducción). Interpretación de los resultados: 42 Resultado negativo: color azul. Resultado positivo: trazas (0,25%), 1+ (0,5%), 2+ (0.75%), 3+ (1%), o 4+ (valor superior o igual a 2%). 3.4 Estudio de grasas en heces Método: tinción de las heces con Sudan III Técnica: mezclar una pequeña cantidad de heces con una cantidad igual de etanol 95% en un tubo. 1. Añadir dos gotas de Sudan III en la mezcla anterior. Mezclar bien y esperar unos minutos. 2. Usando una pipeta, depositar una gota en un portaobjetos y observar al microscopio las gotas de grasas (grasa neutra) y cristales aciculares (ácidos grasos). 3. Añadir 4 gotas de ácido acético glacial en el tubo que contiene la muestra. Mezclar con la ayuda de una pipeta y depositar una gota en un portaobjetos. 4. Calentar suavemente el portaobjetos sobre una llama. 5. Observar de nuevo al microscopio 40X las gotas de color rojo. Interpretación de los resultados: <100 gotas antes o después de calentar: se informa como grasa no incrementada. >100 gotas antes o después de calentar: se informa como grasa incrementada. 43 Si existen cristales aciculares de ácidos grasos antes de calentar y gotas de grasa después de calentar: se informará como ácidos grasos incrementados. 3.5 Estudio de fibras musculares y almidón en heces Método: tinción con Lugol (Panreac) de las heces. Técnica: diluir una pequeña cantidad de heces en 3 mL de suero fisiológico. 1. Homogenizar la muestra con ayuda de pipeta Pasteur. 2. Depositar una gota de la dilución en un portaobjetos y añadirle una gota de Lugol. 3. Esperar unos minutos a que se tiña la muestra y observar al microscopio con objetivo de x40. Interpretación de los resultados: Los gránulos de almidón se colorean de azul oscuro. Fibras musculares se observan como cilindros cortos atravesados de estrías. 4. Estudio de la etiología de causa infecciosa 4.1 Estudio de bacterias Método: coprocultivo. 44 Técnica: Preparar una emulsión de 1-2 g de heces en solución salina fisiológica, a partir de la cual se inoculan los medios de cultivo. Inocular con asa de 10 µL, placas de agar sangre, agar MacConkey, agar Salmonella - Shigella y agar Campy-BAP. Incubar a 37ºC durante 48 horas en estufa de aire las placas de agar sangre, agar MacConkey, agar Salmonella - Shigella y a 42ºC en campana con sobre de microaerofilia la placa de agar Campy-BAP. Identificar las colonias lactosa negativa del agar MacConkey o las colonias del agar Salmonella -Shigella con centro negro mediante galería de identificación BBL Enterotube II (BBL) y aglutinación mediante M-IDENT® Campylobacter (Microkit). 4.2 Estudio de virus Método: el estudio de Rotavirus y Adenovirus se realizó por inmunocromatografía ROTA-ADENOVIRUS combo cassette (Cromatest-Linear Chemicals). Preparación de la muestra 1. Desenroscar la cubierta y con ayuda del aplicador se toma una muestra de las heces. Para ello se pasa el aplicador por la muestra recogiendo una pequeña cantidad de heces, si la muestra fuera líquida se tomarán 100 µL de la misma con una pipeta, introducir la muestra en el tubo para dilución. 2. Cerrar el tubo que contiene la muestra y el diluyente. Agitar para facilitar la dispersión de la muestra. 45 Técnica 1. Previamente el dispositivo, las muestras de heces y los controles se deben acondicionar a la temperatura ambiente (15-30ºC). 2. Agitar el tubo de dilución de la muestra para asegurar una buena dispersión. Cortar la punta del tapón. 3. Sacar el dispositivo de reacción Rota-Adeno virus de su envase para utilizarlo inmediatamente. 4. Tomar 5 gotas o 150 µL del líquido y depositarlas en la ventana circular marcada con una flecha o una S en el dispositivo. 5. Leer el resultado a los 10 minutos (deben de aparecer líneas coloreadas). Interpretación de resultados: NEGATIVO: Una sola línea de color VERDE aparece en la ventana central del dispositivo de reacción, en la zona marcada con la letra C (línea de control). ROTAVIRUS POSITIVO: Además de la línea de control VERDE, también aparece una línea ROJA (línea de resultado de Rotavirus) en la zona marcada con la letra T (zona de resultado). ADENOVIRUS POSITIVO: Además de la línea de control VERDE, también aparece una línea AZUL (línea de resultado de Adenovirus) en la zona marcada con la letra T (zona de resultado). ROTAVIRUS-ADENOVIRUS POSITIVO: Todas las líneas anteriores aparecen al mismo tiempo durante la prueba debido a una infección simultánea de Rotavirus y Adenovirus. Se vería una línea VERDE en la zona de control y una línea ROJA y una AZUL en la zona de resultados. 46 INVÁLIDO: Cuando la línea de control (VERDE) no aparece independientemente de que aparezca o no la/s línea/s de resultado (ROJA/AZUL). 4.3 Estudio de parásitos Una vez recibidas las muestras, éstas se dividieron en dos partes: 1. Una parte sin conservar, que se destinará al estudio microscópico directo y técnicas cromatográficas. 2. Otra parte conservada en formol-acetato (SAF) para técnicas de concentración, tinciones y técnicas moleculares. 4.3.1 Examen microscópico A. Examen microscópico directo sin concentración Procedimiento: 1. Depositar una gota de solución salina (NaCl al 0,85%) en el lado izquierdo del portaobjetos y una gota de lugol (solución de trabajo 1:5 en agua destilada) en el lado derecho del portaobjetos. 2. Tomar una pequeña cantidad de muestra fecal y emulsionar completamente las heces en solución salina y lugol usando un aplicador. La muestra debe extenderse lo suficiente para lograr una prepararación fina (suficientemente delgada como para que pueda leerse un texto a través de ella). 3. Colocar un cubreobjetos de 22 mm en ángulo en el borde de la preparación emulsionada y dejar caer con suavidad. 47 4. Visualizar sistemáticamente toda la extensión mediante campos superpuestos con el objetivo 10x. 5. Cambiar a objetivo 40X para el estudio más detallado de cualquier estructura protozoaria sospechosa. B. Examen microscópico tras concentración (formol-eter) Procedimiento: 1. Homogenizar la muestra hasta conseguir que se resuspenda uniformemente y se mezcle bien con el fijador. 2. Homogenizar aproximadamente 1 g de la muestra de heces en 10 mL de solución de formalina al 10%, en un tubo de vidrio de 15 mL. 3. Después de 5 minutos, filtrar la suspensión, a través de una gasa doble instalada en un embudo, a otro tubo de 15 mL. 4. Agregar 3 mL de éter sulfúrico, tapar el tubo y mezclar fuertemente durante 30 segundos. 5. Centrifugar a 2000 rpm durante dos minutos, retirar las capas superiores que contienen éter y los restos de alimentos de la materia fecal. 6. Tomar una pequeña cantidad del sedimento y emulsionar completamente las heces en solución salina y lugol usando un aplicador. La muestra debe extenderse lo suficiente para lograr una preparación fina (suficientemente delgada como para que pueda leerse un texto a través de ella). 7. Colocar un cubreobjetos de 22 mm en ángulo en el borde de la preparación emulsionada y dejar caer con suavidad. 48 8. Visualizar sistemáticamente toda la extensión mediante campos superpuestos con el objetivo 10x. 9. Cambiar a objetivo 40X para un estudio más detallado de cualquier estructura protozoaria sospechosa. 4.3.2 Tinciones específicas A. Coloración de Kinyoun modificada para Cryptosporidium sp Procedimiento: 1. Fijar el frotis (a partir del sedimento obtenido tras la concentración formoléter) en metanol absoluto durante cinco minutos. 2. Cubrir la preparación con carboxifucsina y teñir durante 5 minutos. 3. Lavar con agua. 4. Decolorar con alcohol – ácido durante un minuto. 5. Lavar con agua 6. Cubrir la preparación con azul de metileno al 1% y teñir durante 1 minuto. 7. Lavar con agua y dejar secar. 8. Montar en glicerina para microscopía. 9. Cuando el montaje está seco, examinar primero el frotis de control antes de proceder a las muestras del paciente. 49 10. Examinar microscópicamente mediante objetivos x40 y x100 mediante campos superpuestos. Los ooquistes de Cryptosporidium sp se teñirán de rosa a rojo sobre un fondo verde-azulado. 11. B. Tinción de Auramina-Rodamina para Cryptosporidium sp Procedimiento: 1. Fijar el frotis (a partir del sedimento obtenido tras la concentración formoléter) en metanol absoluto durante cinco minutos. 2. Cubrir la extensión con una solución de auramina y teñir durante 10 minutos 3. Lavar con agua. 4. Decolorar con alcohol-ácido durante 4 minutos. 5. Lavar con agua. 6. Cubrir con solución de rojo de tiazina durante 3 minutos. 7. Lavar con agua 8. Cuando el montaje está seco, examinar primero el frotis de control antes de proceder a las muestras del paciente. 9. Examinar con microscopio de fluorescencia con objetivo x40 mediante campos superpuestos. Los ooquistes de Cryptosporidium sp se teñirán de rosa a rojo sobre un fondo verde-azulado. 10. Los ooquistes presentarán fluorescencia verde brillante sobre fondo negro y el resto de elementos se colorearán de rojo. C. Tinción de Field 56 Realizar el análisis de datos usando el método de "Second Derivative Maximum method” (Automated (F'' max). El número de ciclo para el "Crossing Point (CP)” de cada muestra se calcula automáticamente. Abrir un análisis para cada canal de color, activar la compensación de color para cada uno y guardar. Realizar una vista previa de los resultados: los controles positivos deben ser positivos, los controles negativos deben ser negativos, comprobar que la separación de canales está funcionando (funcionalidad de la compensación del color). El control de reacción debe ser visible en la mayoría de los pocillos (se permite que falle para las muestras altamente positivas). Figura 5. Vista de los resultados obtenidos en función del canal de color aplicado. 57 La siguiente tabla, es la salida del sistema para una lectura interpretada de los resultados. Tabla 10. Interpretación de los resultados en función del canal analizado. A. Determinación de la sensibilidad de la técnica molecular Se estudiaron 3 muestras de heces parasitadas con Giardia lamblia y consideradas microscópicamente como concentración parasitaria alta (aproximadamente 840 quistes/microL; muestra 1), media (aproximadamente 490 quistes/microL; muestra 2) y muy baja (aproximadamente 30 quistes/microL; muestra 3). De cada muestra se realizó una dilución seriada por duplicado, cuantificándose microscópicamente cada una (número de quistes de Giardia lamblia por microlitro) en cámara de Burker. La extracción se realizó en un equipo Magna Pure (Roche Diagnostics) y para ello las muestras fueron diluidas 1/10 en STAR buffer y pretratadas con MagNA Pure Bacteria Lysis Buffer. La amplificación molecular, se realizó por PCR en tiempo real (LightMix® Modular Giardia Roche Diagnostics) amplificando un fragmento de 62 bp del gen 18s rRNA de Giardia lamblia en un equipo Cobas z480. El límite de detección, se definió como la dilución más baja que mostraba resultado positivo en el 100% de los casos. 58 B. Estudio molecular de los casos discrepantes de las técnicas moleculares con las técnicas microscópicas Para el análisis de los casos discrepantes de Giardia sp entre la microscopía y la técnica molecular se llevo a cabo la amplificación de DNA de Giardia sp de todos los casos discrepantes, y dos casos no discrepantes que se tomaron como control positivo de la prueba. Con la finalidad de que una vez amplificado el gen en las muestras fuera secuenciado en un laboratorio externo. La amplificación del DNA se realizó siguiendo dos PCR: B.1 Amplificación del gen de la beta giardina: Se trata de una nested-PCR. Los cebadores utilizados han sido descritos previamente (Mahbubani et al, 1992) y fueron sintetizados por Roche Diagnostics. Cebadores Tamaño fragmento amplificado (pb) G7 (5´-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC-3´) 753 G759 (5´-GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3´) 384 G376 (5´-CATAACGACGCCATCGCGGCTCTCAGGAA-3´) Tabla 11. Cebadores empleados en la amplificación del gen de la beta giardina. Se emplearon las siguientes condiciones para amplificar el DNA: Reactivos Concentración final DNA 5 µl 59 Tampón PCR 1x Cebadores 10 pmol dNTPs 200 µM Taq polimerasa 2,5 unidades Tabla 12. Condiciones para la amplificación del gen de la beta giardina. El volumen final de la reacción de ajustó con ddH2O a 50 µl. B.2 Amplificación de un fragmento genético de RNA ssr: Los cebadores utilizados han sido descritos previamente (Hopkins et al., 1997) y fueron sintetizados por Roche Diagnostics. Cebadores Tamaño fragmento amplificado (pb) RH11 (5´-CATCCGGTCGATCCTGCC-3´) 292 RH4 (5´-AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCCAGG-3´) Tabla 13. Cebadores empleados en la amplificación del gen RNA ssr. Se emplearon las siguientes condiciones para amplificar el DNA: Reactivos Concentración final DNA 5 µl 60 Tampón PCR 1x Cebadores 10 pmol dNTPs 200 µM Taq polimerasa 2,5 unidades Tabla 14. Condiciones para la amplificación del gen RNA ssr. El volumen final de la reacción de ajustó con ddH2O a 50 µl. El proceso de amplificación para ambas PCR, se llevó a cabo de un termociclador Applued Biosystems 2720 Thermal Cycler en las siguientes condiciones: Figura 6. Proceso de amplificación para el gen de la beta giardina y para el gen RNA ssr. 61 Para la visualización de los fragmentos amplificados se realizó una electroforesis submarina en gel de agarosa en tampón TBE 0,5x. Se mezcla 4 µl del producto de PCR con 1 µl de tampón de carga 5x y se dispensan en los pocillos del gel sumergido en TBE 0,5x. Se reserva un pocillo para el marcador de peso molecular (Escalera de 1500 pb). El gel se somete a electroforesis en tampón TBE 0,5x a 200V durante 1 hora. A continuación, se visualizaron las bandas amplificadas con un transiluminador de luz ultravioleta. 4.3.4 Métodos cromatográficos Para la determinación de compuestos volátiles se utilizó el 4-metil-2-pentanol como patrón interno suministrado por Merck (Darmstadt, Germany) y cloruro sódico adquirido en Sigma Aldrich (Madrid, España). A. Extracción y análisis de compuestos volátiles Los compuestos volátiles fueron extraídos mediante extracción del espacio de cabeza estático (Static Headspace Extraction HS). Para ello, 3,5 g de heces fueron introducidos en un vial de 20 mL al que se le adicionaron 3,5 mL de una mezcla de agua destilada de cloruro sódico al 20 % para forzar el paso de los compuestos volátiles a la fase gaseosa. Seguidamente, se añadieron 10 µL de 4-metil-2-pentanol (0,75 mgL-1) como estándar interno. Para finalizar se cerró el vial con tapón de rosca de alumnio con septum de silicona/PETF (VWR International Eurolab S.L., Barcelona, España) y fue colocado en el carril del automuestreador del equipo. Los análisis se llevaron a cabo en un Cromatógrafo de gases Thermo Scientific acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (TSQ8000-Thermo Scientific). equipado con un muestreador e inyector automático. La muestra en el 62 vial fue incubada durante 30 minutos a una temperatura de 50ºC con agitación contínua mientras tiene lugar el calentamiento. Transcurrido este tiempo, se tomaron 800 µL de gas del espacio de cabeza y se inyectaron en el cromatógrafo gaseoso empleando una jeringa de 1 mL de capacidad de calentada (50ºC) en modo Split 10:1. La temperatura de inyección fue de 250ºC y la y se analizó en una columna ZB-WAXplus (30 m× 0.25 mm, 0.25 μm espesor, Zebron). El gas portador fue Helio a un flujo constante de 1 mL/min. La temperatura del horno comenzó a 40 ºC manteniéndose un minuto para después subir a 100ºC a razón de 2,5ºC/min y a continuación hasta 200ºC a razón de 15ºC/min. Figura 7. Proceso de extracción de compuestos volátiles del espacio de cabeza estático. La temperatura de la línea de transferencia fue mantenida a 240ºC. La adquisición de datos del espectro de ionización fue en modo SCAN (30-300 amu) y grabados a 70 eV de energía. El procesado de los datos se realizó con el sofware Xcalibur™ (Thermo Fischer Scientific). La identificación de los compuestos fue llevada a cabo con la comparación de los espectros de masa obtenidos de cada molécula con los espectros de referencia de la librería de compuestos del software NIST 98. Además, se inyectó una serie de alcanos patrón (C7-C30) para calcular los índices Kovats con los que 63 se comparó los índices de retención de los compuestos de este estudio con los encontrados en la bibliografía para apoyar la identificación. Además, se calculó la abundancia relativa de cada compuesto con respecto al patrón interno 4-metil-2- pentanol. 64 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 65 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Estudio de la etiología de causa infecciosa 1.1 Estudio de parásitos 1.1.1 Resultados del estudio microscópico A. Examen microscópico directo sin concentración de las heces El examen microscópico sin concentración detectó formas parasitarias en 32 (4,1%) de las muestras, siendo Blastocystis sp con 21 (2,7%) y Giardia sp con 11 (1,4%) los parásitos más prevalentes (tabla 15). Examen en fresco Número de pacientes Porcentaje Blastocystis sp 20 2,6% Giardia sp 10 1,3% Blastocystis sp y Giardia sp 1 0,1% Negativo 745 95,9% Total 777 100,0% Tabla 15. Distribución de las muestras en función del resultado del estudio microscópico en fresco. B. Examen microscópico tras concentración de las heces 72 En la tabla 21, se muestra una comparativa del rendimiento de los distintos métodos empleados en la detección de los parásitos. Se observa que la técnica de concentración fue la que mejor rendimiento mostró a la hora de detectar los parásitos (46/777) aun teniendo en cuenta su incapacidad de detectar Cryptosporidium sp, la técnica molecular detectó 43/777 parásitos teniendo peor rendimiento respecto a la técnica de concentración en Blastocystis sp y Giardia sp con 31 vs 25 y 8 vs 13 respectivamente. Método de detección Ex. en fresco Ex. por concentración Tinción de Kinyoun Tinción Auramina Estudio molecular Blastocystis sp 21 31 - - 25 Cryptosporidium sp - - 8 8 8 Dientamoeba sp 0 0 - - 2 Giardia sp 11 13 - - 8 Endolimax sp 0 2 - - - Tabla 21. Comparativa del rendimiento de los distintos métodos empleados en el estudio de parásitos. En la tabla 22, se muestra el detalle de positividad de las distintas técnicas empleadas en relación a los niños estudiados. 73 Parásitos Nº Ex. en fresco Ex. por concentración Kinyoun Estudio molecular Blastocystis sp 65 Positivo Positivo Negativo Negativo 72 Negativo Positivo Negativo Negativo 73 Negativo Positivo Negativo Negativo 189 Negativo Positivo Negativo Positivo 359 Negativo Positivo Negativo Positivo 381 Positivo Positivo Negativo Positivo 599 Positivo Positivo Negativo Positivo 606 Positivo Positivo Negativo Positivo 632 Negativo Positivo Negativo Positivo 661 Positivo Positivo Negativo Negativo 690 Positivo Positivo Negativo Positivo 704 Positivo Positivo Negativo Positivo 973 Positivo Positivo Negativo Positivo 976 Positivo Positivo Negativo Positivo 996 Positivo Positivo Negativo Negativo 1115 Negativo Positivo Negativo Negativo 1120 Negativo Positivo Negativo Positivo 1160 Positivo Positivo Negativo Positivo 1185 Negativo Positivo Negativo Positivo 1191 Positivo Positivo Negativo Positivo 1225 Positivo Positivo Negativo Positivo 1244 Positivo Positivo Negativo Positivo 1251 Positivo Positivo Negativo Positivo 1275 Positivo Positivo Negativo Positivo 1279 Positivo Positivo Negativo Positivo 1290 Positivo Positivo Negativo Positivo 1302 Positivo Positivo Negativo Positivo 1323 Negativo Positivo Negativo Positivo 1325 Negativo Positivo Negativo Positivo 1337 Positivo Positivo Negativo Positivo 1338 Positivo Positivo Negativo Positivo 12 Negativo Negativo Positivo Positivo 74 Cryptosporidium sp 147 Negativo Negativo Positivo Positivo 278 Negativo Negativo Positivo Positivo 279 Negativo Negativo Positivo Positivo 1232 Negativo Negativo Positivo Positivo 1233 Negativo Negativo Positivo Positivo 1301 Negativo Negativo Positivo Positivo 1336 Negativo Negativo Positivo Positivo Dientamoeba sp 44 Negativo Negativo Negativo Positivo 96 Negativo Negativo Negativo Positivo Endolimax sp 2 Negativo Positivo Negativo Negativo 6 Negativo Positivo Negativo Negativo Giardia sp 82 Positivo Positivo Negativo Positivo 149 Negativo Positivo Negativo Negativo 358 Positivo Positivo Negativo Negativo 539 Positivo Positivo Negativo Positivo 787 Positivo Positivo Negativo Negativo 951 Positivo Positivo Negativo Positivo 1000 Positivo Positivo Negativo Negativo 1016 Negativo Positivo Negativo Positivo 1107 Positivo Positivo Negativo Positivo 1119 Positivo Positivo Negativo Negativo 1258 Positivo Positivo Negativo Positivo 1310 Positivo Positivo Negativo Positivo 1338 Positivo Positivo Negativo Positivo Tabla 22. Resultado del estudio de parásitos en función de las técnicas empleadas 1.1.5 Comparación de las técnicas microscópicas vs moleculares para la detección de parásitos 75 En general, las técnicas microscópicas proporcionaron mejor rendimiento que las pruebas moleculares en la detección de parásitos, 54 vs 43 casos. La comparación de ambas técnicas, se realizó con el módulo de comparación de técnicas diagnósticas del programa Epidat 3.1, tomando como referencia el examen microscópico junto a la técnica de auramina, demostró lo siguiente: A. Comparación en general de ambas técnicas A la vista de los resultados, se constató que las técnicas moleculares para la detección de parásitos en niños con diarrea persistente presentaban una sensibilidad del 79,6% y una especificidad del 100%. B. Comparación de la capacidad de detectar Giardia sp 76 En el caso de Giardia sp, se constató que las técnicas moleculares para la detección de parásitos en niños con diarrea persistente presentaban una sensibilidad del 61,5% y una especificidad del 100%. C. Comparación de la capacidad de detectar Blastocystis sp En el caso de Bastocystis sp, se constató que las técnicas moleculares para la detección de parásitos en niños con diarrea persistente presentaban una sensibilidad del 80,6% y una especificidad del 100%. 77 D. Comparación de la capacidad de detectar Cryptosporidium sp En el caso de Cryptosporidium sp, la concordancia entre ambas pruebas fue del 100%. 1.1.6 Estudios complementarios de los resultados discrepantes entre las distintas técnicas de detección de parásitos El análisis del rendimiento en la detección de parásitos entre la técnica de concentración y la plataforma molecular LightMix® Modular Gastro Parasite Multiplex Testing mostró 6 casos discrepantes en la capacidad de detección de Blastocystis sp y 5 de Giardia sp. Estas diferencias fueron estudiadas mediante métodos alternativos. A. Evaluación de la sensibilidad en la detección de parásitos de la técnica molecular 78 En base a nuestra evaluación, la PCR LightMix® Modular Giardia presentó una sensibilidad de 10 quistes por µL. Por tanto, muestras con una concentración muy baja de Giardia lamblia (entre 10-1 quistes/ microL) circunstancia que ocurre en los casos de diarrea crónica, podrían ser negativas en el estudio molecular de las muestras fecales de estos pacientes. Aunque la técnica tiene un límite de detección de 3 copias de ADN parasitario, el pequeño volumen de muestra empleado en la extracción y la dificultad para la rotura de los quistes en el pretratamiento, puede limitar la utilidad como alternativa a la microscopia convencional (tabla 23 y 24). Muestra Concentración inicial (quistes/µL) Concentración tras dilución (quistes/µL) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 nº1 843 428 227 109 52 23 11 5 3 848 431 236 113 55 26 12 5 1 nº2 490 241 123 61 30 13 5 2 493 244 125 63 32 12 6 4 1 nº3 31 13 8 5 33 14 7 4 1 Tabla 22. Concentración de las muestras estudiadas en la dilución seriada. Dilución Ciclo de detección 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 Muestra nº1 31,63 33,83 34,32 35,30 35,67 36,55 37,21 - - 31,61 33,85 34,34 35,32 35,71 36,68 37,23 - - Muestra nº2 32,60 34,10 34,98 35,23 36,13 37,17 - - - 32,61 34,07 35,07 35,25 36,23 37,21 - - - Muestra nº3 36,14 37,19 - - - - - - - 36,25 37,06 - - - - - - - Tabla 24. Ciclo de amplificación de las muestras estudiadas en cada dilución realizada. 79 Análisis de los casos discrepantes de Blastocystis sp Las muestras discrepantes en la detección de Blastocystis sp (pacientes: 65, 72, 73, 661, 996 y 1117) fueron reevaluadas por microscopía óptica y por tinción de Field, demostrándose de forma inequívoca que correspondían a formas parasitarias compatibles con Blastocystis sp. 80 Figura 10. Imágenes microscópicas de los casos discrepantes correspondientes a Blastocystis sp. 81 Análisis de los casos discrepantes de Giardia sp Las muestras discrepantes en la detección de Giardia sp (pacientes: 149, 358, 787, 1000 y 1119) fueron reevaluadas por microscopía óptica, microscopía de fluorescencia y por amplificación molecular mediante PCR in house y por técnicas cromatográficas. Figura 11. Imágenes microscópicas de los casos discrepantes correspondientes a Giardia sp. 88 Virus Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Coprocultivo Negativo Ngativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Salmonella sp N egativo Parásitos Blastocystis sp Blastocystis sp Blastocystis sp Blastocystis sp Blastocystis sp Cryptosporidium sp Cryptosporidium sp Blastocystis sp Giardia sp Blastocystis sp Digestión Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo <100 gotas <100 gotas Negativo Negativo Negativo Cuerpos reductores 0,25% Negativo Negativo Negativo Negativo 0,25% Negativo 1% 0,25% Negativo Calprotectina 10 10 17 10 10 10 10 873 105 102 Lecuco. fecales Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo <5 <5 >10 5 a 10 <5 Datos clínicos Dolor abdominal y diarrea prolongada. Discreto deficit de IgA y elevación de IgE Dolor abdominal y diarrea prolongada Estudio por diarrea y dolor abdominal crónico Dolor abdominal y diarrea prolongada Diarrea de un mes de evolución Desde hace 3 meses, episodios de diarreas de característica liquida sin productos patológicos acompañados de dolor abdominal tipo cólico Diarrea de dos meses de evolución con dolor abdominal, dolor de cabeza Dolor abdominal con diarrea. Enfermedad inflamatoria intestinal Sangre tras deposiciones desde hace unos dos meses. Fisura anal. Dolor con la deposición Diarrea de meses de evolución con hilos de sangre en ocasiones Motivo de petición Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persisente y hematoquecia Diarrea persisente y hematoquecia Sexo H H H M H H H H H H Edad 11 6 12 5 10 5 11 8 4 12 89 Virus Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Coprocultivo Negativo Ngativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Parásitos Blastocystis sp Blastocystis sp Cryptospotidium sp Blastocystis sp Giardia sp Blastocystis sp Blastocystis sp Cryptospotidium sp Blastocystis sp Giardia sp y Blastocystis sp Digestión Negativo Negativo <100 gotas Negativo Negativo Negativo Negativo <100 gotas Negativo Negativo Cuerpos reductores Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 0,25% Negativo Negativo Calprotectina 10 10 10 10 10 10 10 10 34 34 Lecuco. fecales Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Datos clínicos Diarrea y dolor abdominal de meses de evolución Diarrea prolongada no filiada Dolor ocular dos meses antes del estudio abdominal, dolor de cabeza Diarrea y dolor abdominal tipo crónico, IgG discretamente disminuido Diarrea recurrente, serología de Helicobacter positiva. Diarrea de un mes de evolución. Ligero descendo de IgA Diarrea y dolor abdominal de un mes de evolución. Ligero descendo de IgA Dolor abdominal de meses de evolución con episodios de diarrea Diarrea prolongada Motivo de petición Diarrea persistente y dolor abdominal Diarea persistente Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente Diarrea persistente Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente y dolor abdominal Diarrea persistente Diarrea persistente y dolor abdominal Sexo H H M H H M M H H M Edad 6 8 13 9 11 9 5 10 9 9 90 Tabla 26. Características clínicas de los casos de parasitosis estudiados. Los datos clínicos más importantes por tipo de parásito fueron los siguientes: A. Blastocystis sp La mediana de edad de los niños Blastocystis sp fue de 7 años (rango: 1-14 años). El motivo principal de solicitud de los estudios fue el de diarrea prolongada con dolor abdominal (66,6 casos), seguida de diarrea persistente (23,3%), siendo las restantes diarrea persistente con hematoquecia (2 casos) y diarrea persistente asociada a vómitos (1 caso). Tras la revisión de la Historia de Salud, en 5/30 casos se constató déficit de IgA, enfermedad celiaca en 2/31, enfermedad inflamatoria intestinal en 1/31. En dos casos, la presencia de Blastocystis sp estuvo asociada a infección bacteriana por Campylobacter sp y Salmonella sp. En seis de los casos se constató valores de calprotectina elevados (>50 µg/g) y estaban asociados a los episodios de diarrea bacteriana, enfermedad inflamatoria intestinal o hematoquecia. En cinco casos se detectó la presencia de azúcares reductores o grasas en las heces, pero asociados a enfermedad inflamatoria intestinal, celiaquía o déficit de IgA. En uno de los casos, se constató dolor ocular, en este caso los niveles de calprotectina eran superiores a 50 µg/g. 91 Motivo petición Calprotectina Malabsorción/ Maladigestión Coprocultivo Datos clínicos Diarrea persistente <10 No Negativo Deposiciones semilíquidas de tres semanas de evolución. Molestias abdominales. <10 No Negativo Diarrea de 1 mes de evolución <10 No Negativo Diarrea prolongada no filiada <10 No Negativo Ligero déficit de IgA <10 No Negativo Ligero déficit de IgA 34 No Negativo Diarrea prolongada 114 No Salmonella sp Diarrea de 20 días de evolución de consistencia liquida. Diarrea persistente y dolor abdominal <10 No Negativo Diarrea y dolor abdominal de meses de evolución. <10 No Negativo Diarrea y dolor abdominal intermitente desde hace tres semanas, IgE discretamente elevada. <10 No Negativo Diarrea y dolor abdominal tipo crónico, IgG discretamente disminuida. <10 No Negativo Dolor abdominal con episódicos de diarrea de meses de evolución. <10 No Negativo Dolor abdominal con episodios de diarrea persistente <10 No Negativo Dolor abdominal con episodios de diarrea de larga evolución <10 No Negativo Dolor abdominal de 1 mes de evolución con episodios de diarrea <10 No Negativo Dolor abdominal y diarrea prolongada <10 No Negativo Diarrea prolongada en paciente con talasemia, serología de Helicobacter positiva. <10 No Negativo Refiere desde hace semanas diarrea con dolor abdominal frecuente con cefaleas que mejoran tras deposición <10 Si Negativo Dolor abdominal crónico asociado a diarrea intermitente de meses de evolución. Ac antitrasglutaminasa y anti endomisio +++ (enfermedad celiaca) <10 No Negativo Dolor abdominal de 2 meses de evolución con déficit de IgA y celiaquía. <10 No Negativo Dolor abdominal y diarrea prolongada. Discreto déficit de IgA y elevación de IgE 17 No Negativo Estudio por diarrea y dolor abdominal crónico 92 36 Si Negativo Dolor abdominal de semanas de evolución con episodios de diarrea. Déficit IgA e IgG 184 No Negativo Dolor abdominal de 1 mes de evolución con diarrea. Presentó dolor ocular dos semanas antes del estudio. 218 No Campylobac ter sp Diarrea de semanas de evolución asociado a dolor abdominal 873 Si Negativo Dolor abdominal con diarrea. Enfermedad inflamatoria intestinal Diarrea persistent e y hematoquecia 102 No Negativo Diarrea de meses de evolución con hilos de sangre en ocasiones 570 No Negativo Diarrea de evolución con hilos de sangre en algunas ocasiones Diarrea persistente y vómitos <10 No Negativo Cuadro de vómitos y diarrea prolongada Tabla 27. Datos clínicos de los casos positivos a Blastocystis sp detectados. B. Cryptosporidium sp La edad de los niños osciló entre 1 y 13 años, con una mediana de 7 años. El motivo principal de solicitud de los estudios fue el de diarrea prolongada con dolor abdominal en el 75% de los casos, seguida de diarrea persistente asociada a hematoquecia en el 25% restante. Todos los pacientes (100%), presentaban malabsorción de azúcares o grasas. En tres niños se objetivaron valores de calprotectina elevados (valores entre 65-219 µg/g), dos estaban asociados a episodios de hematoquecia y el otro a diarrea persistente con dolor abdominal, pero no se pudieron obtener datos clínicos adicionales. 93 Tras la revisión de la Historia de Salud, no se constataron datos adicionales, aunque tres de los niños presentaban dolores de cabeza y uno dolor ocular. Motivo petición Calprotectina Malabsorción/ Maladigestión Coprocultivo Datos clínicos Diarrea persistente y dolor abdominal <10 Si Negativo Desde hace 3 meses, episodios de diarreas de característica liquida sin productos patológicos acompañados de dolor abdominal tipo cólico. <10 Si Negativo Diarrea de dos meses de evolución con dolor abdominal <10 Si Negativo Dolor abdominal con episodios de diarrea intermitente, dolor de cabeza. <10 Si Negativo Dolor abdominal de meses de evolución con episodios de diarrea <10 Si Negativo Dolor ocular dos meses antes del estudio abdominal, dolor de cabeza, dolor de cabeza. 219 Si Negativo Deposiciones diarreicas recurrentes. Dolor tipo cólico Diarrea persistente y hematoqueci a 65 Si Negativo Refiere hace un mes estreñimiento alternando con deposiciones diarreicas posteriores. A veces hilos de sangre. 95 Si Negativo Deposiciones diarreicas de 3 semanas de evolución con algunos hilos de sangre. Dolor abdominal tipo cólico. Tabla 28. Datos clínicos de los casos positivos a Cryptosporidium sp detectados. C. Giardia sp La edad de los niños osciló entre 2 y 11 años, con una mediana de 4 años. El motivo clínico principal asociado a la solicitud de estudio de parásitos en los episodios de giardiasis, se basó en una sintomatología de diarrea persistente asociada a dolor abdominal en un 46,2% de los casos, seguido de diarrea persistente sin dolor abdominal (23,1% de los casos) y la asociada a hematoquecia (23,1% de los casos). 94 Otros hallazgos en las heces, asociados a la presencia de Giardia sp: -En el 85% de los casos de parasitosis por Giardia sp de nuestro estudio se detectó la presencia de azúcares reductores o grasas en las heces. -En 5 (38,5%) de los niños se constató que las heces tenían características inflamatorias, con niveles de calprotectina que oscilaron entre 46 y 233 mcg/g, en dos casos asociados a infección concomitante por Salmonella sp, en uno asociado a exacerbación de una enfermedad inflamatoria intestinal, en los dos restantes no había datos clínicos complementarios en la historia pero en uno de ellos estaba asociado a hematoquecia (un signo de alarma de enfermedad inflamatoria intestinal) y el otro a episodios de diarrea persistente con dolor abdominal y déficit de IgA., en total, tres niños (23%) presentaban déficit de IgA. -En 6 casos (46,1%), se constató manifestaciones extraintestinales de la infección, en forma de trastornos oculares, se constató que en dos de los casos los niños fueron derivados al oftalmólogo siendo el resto de los episodios manejados por su pediatra. En la mayoría de los casos se objetivó dolor ocular y los pacientes fueron diagnosticados de conjuntivitis. En conjunto, en 10/13 (76,9%) de los casos la presencia de Giardia sp estuvo asociada a alteraciones inmunológicas o inflamatorias. En la tabla 30 se pueden observar con detalle las características de laboratorio y clínicas asociadas a la presencia de Giardia sp. 95 Motivo petición Calprotectina Malabsorción/ Maladigestión Coprocultivo Datos clínicos Diarrea persistente <10 No Negativo Diarrea recurrente, serología de Helicobacter positiva. <10 Si Negativo Diarrea de un mes de evolución, Ig dentro de los niveles normales. Alfa1- antitripsina: 203,3 mg/dl (90-200) 233 Si Negativo Pérdida de peso y diarrea persistente. Déficit IgA (IgA: 23,6 (90-400) IgG: 312,7 (840-1860)). Dolor y prurito ocular, diagnosticado de conjuntivitis. Diarrea persistente y dolor abdominal <10 Si Negativo Deposiciones pastosas desde hace varias semanas, no se relaciona con comidas, algunos vómitos. Diagnosticado de conjuntivitis de dos semanas de evolución, semanas de antes del estudio abdominal. <10 Si Negativo Diarrea crónica y dolor abdominal. <10 Si Negativo Diarrea prolongada asociada a dolor abdominal 46 Si Negativo Diarrea y dolor abdominal y eosinofilia, imnunoglobulinas en suero con discreto descenso de IgG y IgA y eosinofilia. Semanas antes refiere dolor ocular y prurito. 51 Si Salmonella sp Diarrea y dolor abdominal de 3 semanas de evolución. Se retira lactosa de la dieta, test de aire espirado negativo. Diarrea persistente y hematoquecia 104 Si Negativo Diarrea y sangre en heces en las ultimas deposiciones. Refiere llevar meses con misma clínica y ha empeorado en los últimos días, dolor ocular de repetición. Diagnosticado de colitis ulcerosa en tratamiento con infliximab. 105 Si Salmonella sp Emisión de sangre roja tras deposiciones desde hace unos dos meses. Fisura anal. Dolor con la deposición 150 Si Negativo Diarrea prolongada con hilos de sangre, Discreto descenso IgA: 52,50 (85-390). Dolor y sequedad ocular. Diarrea persistente , dolor abdominal y dolor ocular 23 Si Negativo Diarrea persistente, refiere dolor en boca y ojos. Cierta sialorrea. Un mes antes estudio abdominal. Diarrea persistente y dolor abdominal <10 No Negativo 96 Tabla 29. Datos clínicos de los casos positivos a Giardia sp detectados. D. Dientamoeba sp, Endolimax sp Dientamoeba sp: respecto a las características clínicas de los dos casos, se constató que en ambos el motivo clínico de estudio fue un síndrome de diarrea persistente, En uno de los casos la presencia de Dientamoeba sp estaba asociada a valores de calprotectina elevados y coprocultivo negativo. Endolimax sp: respecto a la sintomatología clínica que motivó el estudio de parásitos, uno de los niños presentaba diarrea persistente y dolor abdominal, y otro diarrea persistente asociada a hematoquecia, ambos con niveles de calprotectina elevados y coprocultivo negativo. 1.2 Estudio de bacterias y virus 1.2.1 Resultados del estudio de bacterias De las 777 muestras estudiadas, en 31 (4%) de las muestras se aislaron bacterias de interés clínico, siendo Campylobacter sp la bacteria más prevalente con 19 casos (2,4%) seguida de Salmonella sp con 11 (1,5%) de los casos, en 3 casos la infección fue por más de un microorganismo (tabla 12). 97 Resultado del coprocultivo Número de pacientes Porcentaje Aeromonas sp 1 0,1% Campylobacter sp 18 2,3% Campylobacter sp y Aeromonas sp 1 0,1% Salmonella sp 9 1,2% Salmonella sp y Aeromonas sp 2 0,3% Negativo 746 96,0% Total 777 100% Tabla 30. Distribución de las muestras en función del resultado del coprocultivo. La correspondencia entre el motivo clínico de petición y los aislamientos mostró que el 48% de los casos correspondían a diarrea persistente con dolor abdominal y el 32% a diarrea persistente (tabla 13). En cuatro pacientes, se detectaron parásitos asociados a la diarrea bacteriana: Giardia sp (2 casos) y Blastocystis sp asociados a diarrea por Salmonella sp y un caso de Blastocystis sp asociado a diarrea por Campylobacter sp. Resultado del coprocultivo Motivo de la petición Número de pacientes Aeromonas sp Diarrea persistente y fiebre 1 Campylobacter sp Diarrea persistente 6 Diarrea persistente y dolor abdominal 11 Diarrea persistente y vómitos 1 Aeromonas sp y Campylobacter sp Diarrea persistente 1 Salmonella sp Diarrea persistente 2 Diarrea persistente y dolor abdominal 5 104 de la diarrea crónica y/o persistente en nuestro país (Vila et al., 2005) donde se recomienda de forma sistemática un estudio detallado de parásitos en su diagnóstico diferencial. En base a los resultados de este estudio, sería importante reconsiderar, el papel de la etiología de la infección parasitaria en niños con diarrea persistente en España, asimilándolo al de otros países industrializados y proponer enfoques distintos a los empleados en la actualidad para su diagnóstico. Restringir el estudio de parásitos a niños con factores de riesgo comprobados o a un curso prolongado e inexplicable de diarrea, puede ahorrarles a los sistemas de salud tanto tiempo como gastos innecesarios. Las estrategias para ayudar a los pediatras a decidir cuándo indicar un estudio de parásitos en heces, incluiría restringir estas pruebas a los pacientes con una indicación clara que genere un alto índice de sospecha, estableciendo criterios clínicos que orientaran cuándo es apropiado la solicitud de estudio de parásitos. 1.3.4 Características de laboratorio y clínicas de los casos Establecer criterios clínicos que orienten o generen un alto índice de sospecha de etiología parasitaria en niños con diarrea persistente, es básico a la hora de enfocar su estudio. En base a los resultados de este trabajo, se realiza una aproximación a las características clínicas mas importantes. A. Parásitos con significado clínico bien contrastado a) Casos de Giardia sp Del análisis de los casos de Giardia sp, se dedujeron una serie de aspectos importantes asociados a la detección del parásito. 105 -Respecto a la edad, se presentaba un agrupamiento en torno a los 4 años (niños relativamente pequeños), con 9 (77%) casos en la franja de edad entre 1 y 5 años. Este aspecto está también contrastado en otro estudio realizado en Sevilla sobre muestras hospitalarias (Coronel et al., 2017) donde la mediana de casos se situaba también en los cuatro años. En España, en otros estudios anteriores, la mayoría de los casos se situaban también en la franja de 1 a 4 años (Carmena et al., 2012). -Respecto al motivo clínico principal asociado de solicitud del estudio de parásitos, se basó en una sintomatología de diarrea persistente asociada a dolor abdominal en un 46,2% de los casos, este es un aspecto clínico bien contrastado (Robertson et al., 2010; Wolfe, 1992; Hill, 2001), aunque otros estudios indican la existencia de mucha variabilidad individual en la sintomatología debido a la naturaleza intermitente de la diarrea (Jones, 1988). En nuestro estudio la diarrea persistente sin dolor abdominal (23,1% de los casos) y la asociada a hematoquecia (23,1%) también estuvieron presentes y están comunicados en otros estudios (Wolfe, 1984), aunque la hematoquecia es un signo muy poco frecuente y podría tener relación con otras patologías concomitantes. -En el 85% de los casos de parasitosis por Giardia sp de nuestro estudio se detectó la presencia de azúcares reductores o grasas en las heces, esta asociación está bien contrastada en otros estudios que relacionan la malabsorción de azúcares o grasas con la presencia del parásito (Wolfe, 1992; Gillon, 1985; Meyer et al., 1979). -En 5 pacientes se constató que las heces tenían características inflamatorias, con niveles de calprotectina que oscilaron entre 46 y 233 µg/g, en dos casos asociados a infección concomitante por Salmonella sp, en uno asociado a exacerbación de una enfermedad inflamatoria intestinal, en los dos restantes no había datos clínicos complementarios en la historia, pero en uno de ellos estaba asociado a hematoquecia (un signo de alarma de enfermedad inflamatoria intestinal). Otros aspectos clínicos complementarios tras la revisión de la historia. 106 Tres niños (23%) presentaban déficit de IgA, dado que la barrera protectora del sistema gastrointestinal se ve afectada en la deficiencia de IgA, los protozoos como Giardia pueden adherirse al epitelio, proliferar y causar infección lo que es un aspecto bien conocido (Zinneman et al., 1972). Se constató la existencia de trastornos oculares en el 46,1% de los niños, la clínica generalmente era de dolor ocular asociado a conjuntivitis, esta asociación fue comunicada por Barraquer en 1938 que hacía referencia a la existencia de episodios de iridociclitis, coroiditis y hemorragia retiniana en pacientes de giardiasis (Barraquer, 1938), posteriormente confirmada por distintos estudios que han comunicado una asociación entre la presencia de uveitis y vasculitis retiniana, con la giardiasis (Carrol et al., 1961; Knox et al., 1982). Además, Pettoello et al. (1990) comunicaron la presencia de lesiones degenerativas de la retina (en forma de “sal y pimienta) en el 8,8% de niños que padecían giardiasis. Posteriormente, Corsi et al. (1998) demostraron afectación retiniana en el 20% de los niños parasitados por Giardia sp y la asociaron con títulos altos de inmunocomplejos circulantes (mecanismo de hipersensibilidad tipo III). En nuestro estudio, no existió una evaluación oftalmológica detallada de los casos, pero la catalogación de los trastornos oculares como conjuntivitis (ojo rojo) unida a la presencia de dolor ocular podrían sugerir más la existencia de uveitis que el diagnóstico de conjuntivitis que se realizó. b) Casos de Cryptosporidium sp Del análisis de los casos de Cryptosporidium sp, se dedujeron una serie de aspectos importantes asociados a la detección del parásito. -Respecto a la edad, se presentaba un agrupamiento en torno a los 7 años, con un 65,2% de los casos en la franja de edad de 7 a 13 años. Estos resultados, no coinciden con otros estudios publicados, donde la mayoría de casos se sitúan por debajo de los 5 años. Así, en otro estudio realizado en Sevilla sobre muestras hospitalarias (Coronel et al., 2017) la mediana de edad de los casos se situaba en los dos años. A nivel europeo, también se comunica una mayor prevalencia entre 107 los niños menores de 5 años, aspecto que probablemente refleja una mayor exposición al parásito como resultado de una peor higiene, así como una falta parcial de inmunidad (Cacciò et al., 2016). En un estudio sobre el papel de Cryptosporidium sp en casos de diarrea persistente, también se indican una mayor incidencia en menores de 2 años respecto a niños de mayor edad (50% vs 38%), pero el estudio incluía niños con antecedentes de viajes y otros sin domicilio fijo, y por tanto no comparable a la población de este estudio (Phillips et al., 1992). -Respecto al motivo clínico principal asociado de solicitud del estudio de parásitos asociado a los episodios de cryptoporidiasis, se basó en una sintomatología de diarrea persistente asociada a dolor abdominal en un 75% de los casos, seguida por una sintomatología de diarrea persistente asociada a hematoquecia en el 25% de los casos. Esta presentación clínica, coincide con otros estudios europeos donde la diarrea persistente por Cryptosporidium sp está asociada a otros síntomas gastrointestinales, principalmente dolor abdominal, siendo la hematoquecia menos común, pero también asociada a los casos de infección (Hunter et al., 2004; Rehn et al., 2015). Lo anterior, contrasta con lo publicado en los estudios de diarrea persistente por Cryptosporidium sp en países en desarrollo donde es poco común que la infección curse con dolor abdominal o hematoquecia (Platts-Mills et al., 2015). -En el 100% de los casos de parasitosis por Cryptosporidium sp de nuestro estudio se detectó la presencia de azúcares reductores o grasas en las heces, esta asociación está bien contrastada en otros estudios que relacionan la malabsorción de azúcares o grasas con la presencia del parásito. Estos estudios indican que Cryptosporidium sp produce un deterioro de la función de absorción intestinal con un cambio significativo en los niveles de grasas en heces y una disminución de la excreción de D-xilosa que conduce al desarrollo de un síndrome de malabsorción intestinal (Handousa et al., 1991; Barbot et al., 2001). 108 -En 3 niños se constató que las heces tenían características inflamatorias, con niveles de calprotectina que oscilaron entre 65 y 219 µg/g, no había datos clínicos complementarios en la historia, pero en dos de ellos estaba asociado a hematoquecia (un signo de alarma de enfermedad inflamatoria intestinal). No se constató infección bacteriana concomitante en ninguno de los casos. No está descrita la existencia de una diarrea inflamatoria asociada a la infección por Cryptosporidium sp, pero sí su asociación con una enfermedad inflamatoria intestinal (Vadlamudi et al., 2013), además la criptosporidiosis puede diagnosticarse erróneamente como una recaída de la enfermedad inflamatoria y conducir a un tratamiento inapropiado. -Otros aspectos clínicos complementarios tras la revisión de la historia, en tres niños se constató la existencia de sintomatología extraintestinal, asociada al episodio de diarrea persistente. En tres niños (37,5%) se constató la existencia de dolor de cabeza recurrente, en uno de ellos asociado a dolor ocular. Esta sintomatología extraintestinal, se ha comunicado en otros estudios europeos, donde la sintomatología extraintestinal mas frecuente en los casos de infección persistente por Cryptosporidium sp es el dolor articular (no constatado en nuestro estudio), seguido del dolor de cabeza y el dolor ocular. El mecanismo inmunológico de afectación ocular, a diferencia de lo que ocurre en la infección por Giardia sp, no ha sido estudiado (Hunter et al., 2004; Rehn et al., 2015). B. Parásitos con significado clínico no bien contrastado a) Casos de Blastocystis sp Del análisis de los casos de Blastocystis sp se dedujeron una serie de aspectos importantes asociados a la detección del parásito. 109 -Respecto a edad de los casos, la mediana de edad se situó en 7 años, con un agrupamiento la franja de 6 a 9 años, que incluía el 57% de los casos. Este resultado, coincide con otro estudio publicado en Sevilla sobre muestras hospitalarias, donde la mediana de casos se sitúa en los 6-7 años (Coronel et al., 2017). Sin embargo, la relación de Blastocystis sp con la edad es controvertida (Stensvold et al., 2016), existen poblaciones con alta prevalencia donde el parásito se detecta a edades muy tempranas, mientras que, en otras poblaciones, particularmente donde la prevalencia general es mas baja, muchos individuos pueden adquirir Blastocystis sp a edades mas tardías. Además, no está claro si la edad de la colonización tiene alguna importancia clínica. -Respecto al motivo clínico principal asociado de solicitud del estudio de parásitos asociado a la presencia de Blastocystis sp, se basó en una sintomatología de diarrea persistente asociada a dolor abdominal en un 66,6% de los casos, seguida por una sintomatología de diarrea persistente asociada a hematoquecia en el 23,3% de los casos. Esta sintomatología, coincide con la comunicada en otros estudios donde la infección se ha asociado a signos y síntomas como diarrea, estreñimiento, dolor abdominal, náuseas, anorexia, vómitos, fatiga, flatulencia, distensión abdominal, proctosigmoiditis hemorrágica, urticaria crónica o artritis infecciosa (Tan, 2008; Tan et al., 2010). Sin embargo, el significado clínico de la infección por Blastocystis es controvertido y otros estudios han encontrado falta de correlación entre infección y la presentación clínica (Scanlan et al., 2014; Leder et al., 2005). -En el 16,6% de los casos de parasitosis por Blastocystis sp de nuestro estudio se detectó la presencia de azúcares reductores o grasas en las heces. No está descrita la asociación entre la presencia de Blastocystis sp y episodios de malabsorción (Behera et al., 2008). Sin embargo, estos casos estaban asociados a celiquía, déficit de IgA o enfermedad inflamatoria intestinal que son causas conocidas de malabsorción de azucáres o grasas, aspecto comunicado en otro estudio (Bálint et 110 al., 2014) y que podrían justificar estos hallazgos con independencia de la presencia de Blastocystis sp. -En 5 niños se constató que las heces tenían características inflamatorias, con niveles de calprotectina que oscilaron entre 102 y 873 µg/g, en dos de estos casos asociados a infección bacteriana por Salmonella sp y Campylobacter sp y otro a enfermedad inflamatoria intestinal diagnóstica, además en dos casos mas se asoció a hematoquecia, aspectos que justificarían las características inflamatorias de las heces. No está descrita la existencia de una diarrea inflamatoria asociada a la infección por Blastocystis sp, pero sí su asociación con enfermedad inflamatoria intestinal (Cekin et al., 2012). -Otros aspectos clínicos complementarios tras la revisión de la historia, en dos niños (6,6%) se constató la existencia de sintomatología extra-intestinal, en forma de dolor de ocular y vómitos. La asociación de Blastocystis sp y vómitos está descrita en algunos estudios (Tan, 2008), pero no la asociación con dolor ocular. b) Casos de Dientamoeba sp y Endolimax sp La prevalencia en heces de estos parásitos en niños con diarrea persistente fue muy baja, 0,25% para ambos. La edad de los casos de Dientamoeba sp fue de 1 y 4 años y para Endolimax sp de 9 meses y 5 años. No existen estudios específicos que relacionen la edad y la presencia de Dientamoeba en las heces, pero la baja prevalencia encontrada, es un reflejo de lo publicado en la literatura en los últimos años, donde la prevalencia en Dientamoeba en niños con diarrea o clínica gastrointestinal es muy variable, oscilando entre prevalencias muy altas del 32-64% (Bruijnesteijn et al., 2009; Maas et al., 2014) a prevalencias extremadamente bajas o moderadas del 0-2% (Mumcuoglu et al., 2013; Church et al., 2010; Kasssem et al., 2007). 111 Respecto a las características clínicas de los dos casos, se constató que en ambos el motivo clínico de estudio fue un síndrome de diarrea persistente. Aunque la patogenicidad de Dientamoeba sp ha sido debatida durante muchos años (Turner, 1985), la infección crónica está descrita, con una duración media de la diarrea de 1-2 meses, siendo el dolor abdominal la sintomatología asociada más común (Johnson et al., 2004). En uno de los casos la presencia de Dientamoeba sp estaba asociada a valores de calprotectina elevados, aunque está descrita la asociación del parásito con enfermedad inflamatoria intestinal, en general se considera que no hay asociación entre colitis activa y la presencia del parásito (Stark et al., 2016). En el caso de Endolimax sp, la baja prevalencia encontrada, no pudo ser contrastada. No existe evidencia de la asociación del parásito con diarrea crónica o persistente en la literatura científica, aunque abundan los trabajos que proporcionan datos sobre la prevalencia en general en encuestas parasitarias. Esto se puede explicar, por la aparición del parásito en estudios que investigan la prevalencia de parásitos intestinales en población general. En base a estos estudios, se considera que la prevalencia en población europea oscila entre el 1,7% en población sana y 5,4% en población con diarrea (Poulsen et al., 2016). Sin embargo, estudios en niños, son más escasos, pero en dos estudios realizados en Sevilla en los últimos años se comunican prevalencias del 1,6% en niños sanos (Perez et al., 1997) y del 4,2% en niños de atención primaria con diarrea (Coronel et al., 2017). Respecto a la sintomatología clínica que motivó el estudio de parásitos, uno de los niños presentaba diarrea persistente y dolor abdominal, y otro diarrea persistente asociada a hematoquecia, ambos con niveles de calprotectina elevados y coprocultivo negativo. Lo anterior, es sugestivo de enfermedad inflamatoria intestinal, aunque no había datos en la historia clínica para confirmar la sospecha. De todas formas, en base a los estudios publicados, existe muy poca evidencia a 112 favor de que Endolimax sp deba considerarse un patógeno con capacidad de causar diarrea o inflamación intestinal (Poulsen et al., 2016). 1.3.5 Evaluación de las distintas técnicas microscópicas y moleculares para la detección de parásitos a) Técnicas microscópicas con y sin concentración De la comparación del rendimiento de ambas técnicas en nuestro estudio, se constató que la microscopía sin concentración era menos sensible (aproximadamente un 70%) que la microscopía con concentración para la detección de parasitos en niños con diarrea persistente. Este aspecto, coincide con otros estudios (Hailu et al., 2015; Restrepo et al., 2013) que comunican que la carga de parásitos en la muestra y la cantidad de muestra tomada durante el examen comprometen en gran medida la sensibilidad de la microscopía directa. Aunque dada su moderada sensibilidad, la microscopía directa podría considerarse en un primer paso de la evaluación en niños con diarrea persistente, el empleo de un método de concentración es esencial para aumentar las posibilidades de de detección de parásitos, siempre que la técnica esté bien estandarizada (Manser et al., 2016). b) Técnicas microscópicas vs moleculares Los resultados de este trabajo demuestran que las técnicas moleculares son en general menos sensibles (sensibilidad aproximadamente del 80%) que la microscopía convencional (concentración de las heces mas tinción de auramina o Kinyoun) para el diagnóstico de la infección parasitaria en niños con diarrea persistente. Al igual que en nuestro trabajo, otros estudios han comunicado un 113 rendimiento no adecuado de las técnicas moleculares para la detección de parasitos (Uchôa et al., 2018; Laude et al., 2016) y se contraponen a otra serie de estudios que encuentran que las técnicas de PCR en tiempo real proporcionan una sensibilidad adicional sobre la microscopía convencional (Verweij et al., 2011; McHardy et al., 2014). Sin embargo, este estudio es el primero que evalúa el rendimiento de las técnicas moleculares en el estudio de la diarrea persistente n el niño y por tanto sus resultados no son comparables. Además, estas discrepancias habría que considerarlas también en el contexto del tipo de técnica molecular empleada para el diagnóstico, ya que al igual que en este trabajo, la mayoría de los estudios mas recientes están basados en el uso de plataformas diagnósticas comerciales basadas en técnicas de PCR multiplex, sobre todo para protozoos, como alternativa a la microscopía de rutina (Gray et al., 2014; Stark et al., 2014; Ten Hove et al., 2007), y el rendimiento de estas plataformas puede variar mucho entre distintas marcas comerciales (Hartmeyer et al., 2017; Rijsman et al., 2016). Lo anterior, lleva a que el empleo de técnicas comerciales de PCR multiplex unido al tipo de población estudiada, incluya una serie de variables que afectan al rendimiento y que deberían ser tenidas en cuenta a la hora de valorar sus resultados. a) Carga parasitaria. La carga de ADN parasitario está muy influenciada por las variaciones diarias en la excrección de parásitos y la distribución no homogénea de los parasitos dentro la muestra, lo que sugiere que se debería prestar una atención especial a la homogeneización de las heces y que es probablemente un paso esencial debido a que la cantidad de heces utilizadas para la extracción de ADN es menor que la necesaria para microscopía (Hawash et al., 2014; Elfving et al., 2014). Por otro lado, la baja carga parasitaria que caracteriza la patogénesis de algunas parasitosis crónicas es un factor determinante en el rendimiento de las técnicas moleculares (Stensvold, 2012; Vanathy et al., 2017). En este trabajo, se ha evaluado 120 Estos compuestos azufrados han sido descritos por otros autores como biomarcadores en enfermedades diversas como carcinoma colorrectal, infección por Campylobacter jejuni , o cólera (Batty et al.,2015; Garner et al., 2007, 2009). Sin embargo, para la síntesis de metionina por parte del microorganismo, es necesaria la presencia de la L-Cisteina, y este aminoácido ha sido descrito como imprescindible para la supervivencia de Giardia sp (Luján y Nash, 1994). Por tanto, podría ser posible que, en el caso de los pacientes con procesos diarreico de etiología no parasitaria, estos compuestos se estén produciendo en grandes cantidades de manera normal como ocurre en las heces por parte de la microbiota intestinal. Sin embargo, en el caso de los pacientes con giardiasis, la formación de estos compuestos puede verse impedida por la alta demanda por su precursor (L-cisteina) por parte del parásito. En base a esto, se justificaría la presencia de cantidades menores de disulfuro de dimetilo y disulfuro de trimetilo en las heces de los pacientes con giardiasis, provocando que no pudieran ser detectables con la muestra tomada del espacio de cabeza. Por tanto, la ausencia de estos compuestos en el espacio de cabeza de muestras de heces podría ser un indicador de presencia de Giardia sp o de otro microorganismo cuyo metabolismo sea dependiente de manera estricta del aminoácido cisteína. Esto coincide de manera parcial con lo observado por Bond et al. (2015), los cuales al extraer por el método de microextracción en fase sólida los compuestos volátiles del espacio de cabeza de heces de pacientes con y sin giardiasis, encontraron que el disulfuro de trimetilo efectivamente se encontraba en menor cantidad en los pacientes con el parásito. Sin embargo, estas diferencias fueron relativamente pequeñas y además no señalaban diferencias con respecto al disulfuro de dimetilo. 121 Con respecto al grupo de los alcoholes se observaron tendencias interesantes de dos alcoholes. El primero de ellos, el 1,3-dimetoxi-2-propanol, sólo apareció en los pacientes con giardiasis, en concreto, en 6 de los 7 pacientes diagnosticados. Y el segundo, el 1,4-dimetoxi-2,3-Butanediol, apareció igualmente solo en los pacientes con giardiasis, en este caso, en el 100% de los pacientes. Estos compuestos, podrían estar ejerciendo una acción parecida a algunos alcoholes alifáticos de cadena larga que ejercen un efecto inhibidor del crecimiento de otros microorganismos creando un nicho ecológico a Giardia sp (Elgaali et al., 2002). Existe poca base bibliográfica sobre la presencia de estos dos compuestos y Giardia sp, además de no haber sido descritos nunca en heces. Ante la ausencia de trabajos de estudio de los compuestos volátiles en Giardia sp a excepción del trabajo de Bond et al. (2015) podría indicar la posibilidad de ser estos dos compuestos producto del metabolismo particular de este parásito. En relación al 1,4-dimetoxi-2,3-Butanediol existe sólo una referencia bibliográfica clara que señala este compuesto como posible marcador de cáncer de mama en muestras analizadas de exhalación de pacientes con la enfermedad diagnosticada vs. pacientes control (Wang et al., 2014). En este trabajo atribuyen la aparición de este alcohol al estrés oxidativo (Knight, J. A., 1998). Referente al grupo de los compuestos terpénicos no se observaron tendencias destacables. Son compuestos que en la mayoría de matrices suelen tener un aporte importante al aroma global, ya que su umbral de percepción es muy bajo y son responsables de las notas cítricas y verdes. Sin embargo, en las heces el resto de compuestos volátiles presentes no permiten a los compuestos terpénicos expresarse. Varios de los compuestos terpénicos encontrados en este estudio han sido observados en heces de pacientes con colitis ulcerosa, y con infecciones de Campylobacter jejuni y Clostridium difficile (Garner et al., 2007). Además, en algunas enfermedades como la infección por Campylobacter jejuni , los terpenos han sido destacados como posibles biomarcadores (Probert et al., 2004). 122 A pesar de que los compuestos ácidos son comunes de encontrar en las heces, en este estudio se encontró únicamente ácido acético en el espacio de cabeza de las muestras analizadas. Concretamente, sólo se detectó en las muestras de heces de todos los pacientes diagnosticados con giardiasis y en ninguno de los pacientes control. Los ácidos grasos de cadena corta como el acético suelen ser producto del metabolismo de carbohidratos no digeribles como la fibra, proteínas, péptidos por parte de bacterias colónicas (Backhed et al., 2005). La cantidad de ácidos grasos de cadena corta presente en las heces puede ser un indicativo en ciertas enfermedades relacionadas con el tracto intestinal. Si se encuentran en altas cantidades pueden indicar enfermedad celíaca, enfermedad de hígado graso no alcohólica, infección con Clostridium difficile (Di Carlo et al., 2009; Del Chierico et al. 2017; Garner et al., 2007). Nuestros resultados coinciden con los hallados por (Bond et al., 2015), quienes recientemente describieron como un posible marcador de la infección con Giardia sp al ácido acético. (Bond et al., 2015) analizaron los compuestos volátiles del espacio de cabeza de heces de 16 pacientes con Giardia sp y 17 controles, y en 12 de los infectados encontraron este volátil y en los no infectados únicamente en uno. Así la presencia de ácido acético podría ser in biomarcador de la presencia de este parásito en el hospedador. . 123 Figura 14. Cromatogramas pertenecientes a pacientes sin giardiasis (a) y a pacientes con giardiasis (b). Otro compuesto volátil remarcable sería el p-cresol (4-metilfenol). Este compuesto es un fenol volátil que es tóxico para el ser humano, de hecho, es un biomarcador para la evaluación de la salud del intestino delgado en humanos (Birkett et al., 1996; Muir et al., 2004; De Preter et al., 2006). En este estudio, este compuesto sólo 124 se encontró en las heces de los pacientes con procesos diarreícos de etiología no parasitaria, en concreto en la mitad de las muestras analizadas. Este fenol, ha sido descrito como biomarcador en heces por ejemplo en la infección por Clostridium difficile (Tait et al., 2014). Debido a la cantidad de datos generados a lo largo de este estudio, se realizó un análisis de componentes principales (ACP) utilizando todos los compuestos volátiles y la suma total de cada grupo químico (30 variables), para permitir una reducción de la dimensión y lograr una mejor comprensión del conjunto obtenido de los resultados. La Figura 15 la distribución de las muestras analizadas representadas para CP1 y CP2, que representaron el 27,8% y el 14,4% de la varianza, respectivamente (422% de la varianza acumulada). Además, la Figura 16 muestra los valores para las variables y cómo se relacionan con las muestras. Se puede observar cómo la CP1 parece separar a las muestras de heces en función de la presencia de infección por Giardia sp. 125 Figura 15. Distribución de las muestras analizadas representadas para CP1 y CP2. Figura 16. Distribución de los valores y su relación con las muestras. 2. Estudio de la etiología de causa no infecciosa 2.1 Estudio microscópico para la detección de leucocitos fecales La presencia de leucocitos fecales se constató en 62 muestras, un 7,9% del total en estudio, de ellas 2,8% con escasos leucocitos (<5 leucocitos x40), 3,3% con moderados (5 a 10 leucocitos x40) y 1,8% con abundantes leucocitos. 126 La relación entre el motivo de petición y la presencia de leucocitos en heces, fue la siguiente: en 15 el motivo fue diarrea persistente, en 31 diarrea persistente y dolor abdominal, en 14 diarrea persistente y hematoquecia y, en 1 caso diarrea persistente y fiebre y diarrea persistente y vómitos respectivamente, en tabla 7 se puede observan detalladamente estos resultados. Leucocitos Motivo petición Número de pacientes <5 Diarrea persistente 4 Diarrea persistente y dolor abdominal 11 Diarrea persistente y hematoquecia 7 Total <5 22 >10 Diarrea persistente 4 Diarrea persistente y dolor abdominal 8 Diarrea persistente y hematoquecia 2 Total >10 14 5 a 10 Diarrea persistente 7 Diarrea persistente y dolor abdominal 12 Diarrea persistente y fiebre 1 Diarrea persistente y hematoquecia 5 Diarrea persistente y vómitos 1 Total 5 a 10 26 Total 62 Tabla 34. Distribución de las muestras en función del motivo de la petición y la presencia de leucocitos fecales. La presencia de leucocitos fue asociada a enfermedad inflamatoria intestinal en 4 casos (6,4%), celiaquía en 2 casos (3,2%) y a diarrea bacteriana en 31 casos (50%). De los pacientes con presencia de parásitos, en un 22,5% (14/53) de las muestras que presentaban leucocitos fecales, Tabla 8. 127 Leucocitos Parásitos Número de pacientes <5 Blastocystis sp 1 Cryptosporidium sp 4 Giardia sp 3 Total <5 8 >10 Blastocystis sp 1 Total >10 1 5 a 10 Blastocystis sp 3 Endolimax sp 1 Giardia sp 1 Total 5 a 10 5 Total 14 Tabla 35. Distribución de las muestras positivas a parásitos y leucocitos fecales. La asociación de parásitos en heces y leucocitos fecales, estuvo relacionada con enfermedad inflamatoria intestinal en 2 casos y a diarrea bacteriana en 4 casos ( Salmonella sp, Campylobacter sp). En 8 pacientes no se objetivó la causa en el momento del estudio, pero 7 casos presentaban hematoquecia. Del análisis de los datos, se constata que el 5,1% de las muestras presentaban niveles valorables (moderados o altos) de leucocitos en las heces, mientras que niveles bajos aparecían en el 2,8% de las muestras. Estos procesos inflamatorios estaban relacionados en un 50% con infección bacteriana, enfermedad inflamatoria intestinal en el 6,4% y celiaquía en el 3,2%; aspecto bien reseñado por Harris et al. (1972) que indica que el examen de las heces en busca de leucocitos es un procedimiento rápido y confiable para el diagnóstico precoz de la causa de la diarrea, sobre todo de origen bacteriano. Sin embargo, otros estudios demuestran que la detección de leucocitos en heces tiene un bajo rendimiento para la 128 diferenciación entre gastroenteritis infecciosa y no infecciosa (Savola et al., 2001; Granville et al., 2004). En el caso de la relación de la enfermedad parasitaria con la presencia de leucocitos en heces, nuestro estudio detectó la presencia de parásitos en el 22,5% de las muestras con leucocitos fecales, pero asociada a su vez a enfermedad inflamatoria intestinal o hematoquecia (un marcador clinico de enfermedad inflamatoria intestinal) o a diarrea bacteriana. Por tanto, per se, no parece que la diarrea persistente de origen parasitario esté asociada a la presencia de leucocitos fecales (Mercado et al., 2011). Aunque, su poder discriminatorio es bajo cuando la enfermedad parasitaria coexiste con procesos bacterianos o autoinmunes (Huicho et al., 1996; Huicho et al., 1997). 2.2 Estudio bioquímico: determinación de cuerpos reductores en heces Se detectaron cuerpos reductores en heces en el 5,2 % de las muestras (39/777), en la tabla 9 se puede ver el detalle de los resultados. De ellas, en 20 (51%) correspondían a muestras en la que se detectaron parásitos. De las 19 muestras (49%) en que no se detectaron parásitos, estudios posteriores (no incluidos en este estudio) diagnosticaron 13 casos de intolerancia a la lactosa y 3 casos de celiaquía, uno de los cuales coexistía con la presencia de Cryptosporidium sp en las heces. Cuerpos reductores Número de pacientes Porcentaje 0,25% 13 1,7% 0,50% 4 0,5% 1% 4 0,6% 2% 5 0,6% Negativo 750 97% Total 777 100% 129 Tabla 36. Distribución de las muestras en función del resultado en la prueba de cuerpos reductores en heces. 2.3 Estudio bioquímico: estudio de malabsorción de grasas en heces Se constató malabsorción de grasas (>100 gotas) en el 1,2% de las pacientes (9/777), aunque en el 4,4% (34/777) de los pacientes se constató la presencia de gotas de grasa a niveles más bajos, en la tabla 10 se puede ver el detalle de los resultados. De ellas, en 7 (16,3%) correspondían a muestras en la que se detectaron parásitos en su mayoría Cryptosporidium sp (6) y en una Giardia sp y con un nivel de excreción bajo, <100 gotas en todos los casos. De las 36 muestras (83,7%) en que no se detectaron parásitos, estudios posteriores (no incluidos en este estudio) diagnosticaron 3 casos de celiaquía y uno de enfermedad inflamatoria intestinal. Número de gotas de grasa Número de pacientes Porcentaje >100 gotas 9 1,2% <100 gotas 28 3,6% Negativo 740 95,2% Total 777 100% Tabla 37. Distribución de las muestras en función del resultado del estudio de grasas en heces. 2.4 Estudio bioquímico: estudio de fibras musculares y almidón en heces