El efecto biofumigante de especies de la familia Brassicaceae en hongos fitopatógenos

Universidad de Sevilla Departamento de Microbiología TESIS DOCTORAL El efecto biofumigante de especies de la familia Brassicaceae en hongos fitopatógenos 2019 Autor: Julia Picón Toro Directores: Miguel Ángel Caviedes Formento María del Carmen Morales Rodríguez Este trabajo ha sido realizado en el Instituto de Investigación Agraria Finca La Orden-Valdesequera (Guadajira, Badajoz), perteneciente al Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX). A mis padres “La tierra es suficiente para todos pero no para la voracidad de los consumidores”. Mahatma Gandhi AGRADECIMIENTOS Después de tantos obstáculos en el camino para realizar esta tesis, aún no me creo que es el momento de escribir los agradecimientos. Este capítulo de mi vida empezó cuando me dieron una beca de formación de tecnólogos en la Finca La Orden-Valdesequera en 2006, desde entonces hasta hoy han pasado unos cuantos años llenos de adversidades e incertidumbres. No obstante, gracias al esfuerzo y a la ayuda recibida de forma desinteresada por parte de muchas personas, el final de este capítulo se aproxima. Antes de poner punto y final quiero agradecer a todos aquellos que han colaborado directamente e indirectamente en la realización de esta tesis. Al Departamento de Cultivos Extensivos que me acogió a mi llegada al centro y me ayudó en el desempeño de las diferentes labores para la puesta en marcha y desarrollo de los ensayos de campo. Gracias a todo el personal técnico y de campo (Adri, Teo y especialmente a Juani, estés donde estés siempre te recordaré) por vuestra ayuda y apoyo. Al Departamento de Fitopatología, que me brindó la oportunidad de realizar la tesis, además de especializarme en el campo de los hongos de suelo. Carmen, Carolina y Eloy gracias por vuestra acogida y paciencia para enseñarme todas las técnicas de análisis de hongos y por ayudarme a realizar todos los ensayos que forman parte de esta tesis. No me puedo quedar atrás a Ángela, mi becaria, sin ella no podría haber realizado mis ensayos de 400 placas. Gracias por estar ahí, por ayudarme siempre, por tus consejos y por compartir esa cajita en los tiempos adversos, que no fueron pocos...El que fuéramos unas “pringuis” no nos impidió que disfrutásemos día a día en el trabajo, estábamos acostumbradas, siempre había algo que podía ocurrir (inundaciones, pulgones, contaminaciones…). A Benito, por darle prioridad a mis ensayos de campo; al equipo de malas hierbas, gracias Loli por estar siempre ahí; a Mónica, por tu apoyo y por compartir los instrumentos de medida de las propiedades del suelo; a las chicas de forestales (Mª José y María) por poner un poco de alegría en el pasillo… AGRADECIMIENTOS A los que llegaron más tarde a este capítulo, Ramón y Charo, muchísimas gracias por acogerme como si me conocieseis de toda la vida. A ti, Miguel Ángel, que sin conocerme y de forma desinteresada te ofreciste a continuar y a terminar esta tesis, muchas gracias, sin ti (usted) esta tesis nunca hubiese finalizado, simplemente los datos hubieran quedado en el cajón. A Carmen, la otra parte esencial y clave en la finalización de la tesis, gracias por tu paciencia en la corrección, releer y releer. Alguien tenía que poner orden a todos esos datos!! Gracias. A mi familia, a mis padres, por siempre estar ahí y animarme en todo momento a continuar con esta tesis, y especialmente a mi hermana, por insistir e insistir que había que acabar la tesis. A mis amigas, por su compañía y apoyo en los momentos difíciles. A mis compañeros de departamento del IES de Llerena, especialmente a Lola y Antonio, por darme siempre prioridad en todo, enseñarme, ayudarme y, por supuesto, compartir esos momentos de puesta en común. A Marcelo, el último en llegar a este capítulo de mi vida, hacemos un gran equipo. Gracias por hacerme las cosas tan fáciles, por tu paciencia y entender todas mis “ocupaciones”. Gracias 9 ÍNDICE Índice .......................................................................................................... 9 Resumen ....................................................................................................15 Abstract ......................................................................................................17 Capítulo 1: Introducción general ................................................................19 1.1. Introducción ................................................................................... 21 1.1.1. Técnicas de control de hongos fitopatógenos ................................... 21 1.1.1.1. Biofumigación .................................................................... 22 1.1.1.2. Solarización ....................................................................... 28 1.1.1.3. Biosolarización ................................................................... 30 1.1.2. El suelo ...................................................................................... 31 1.1.2.1. Efecto de las técnicas de control de patógenos en las propiedades del suelo ............................................................................ 34 1.1.3. La tristeza del pimiento y la fusariosis vascular del tabaco: dos enfermedades causadas por hongos fitopatógenos del suelo ............. 37 1.1.3.1. La tristeza del pimiento ....................................................... 39 1.1.3.1.1. El cultivo de pimiento para pimentón ............................ 40 1.1.3.1.2. Síntomas de la enfermedad de la tristeza y agente causal ...................................................................... 43 1.1.3.1.2.1. Género Phytophthora de Bary .................................. 45 1.1.3.1.2.1.1. Phytophthora nicotianae Breda de Haan ........... 49 1.1.3.2. La fusariosis vascular del tabaco ........................................... 51 1.1.3.2.1. El cultivo de tabaco en Extremadura ............................ 51 1.1.3.2.2. Síntomas de la fusariosis vascular y agente causal ......... 54 1.1.3.2.2.1. Género Fusarium Link............................................. 56 1.1.3.2.2.1.1. Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. y Hans . 58 1.2. Objetivo general .............................................................................. 59 Capítulo 2: Evaluación en condiciones de laboratorio de las técnicas de biofumigación, biosolarización y solarización para el control de Phytophthora nicotianae y Fusarium oxysporum ........................................................... ...65 2.1. Introducción ................................................................................... 63 2.2. Objetivo ......................................................................................... 64 2.3. Inhibición del crecimiento miceliar de Phytophthora nicotianae y Fusarium oxysporum ..................................................................................... 64 2.3.1. Efecto de la especie de Brassicaceae y parte de la planta empleada como biofumigante ............................................................................... 65 2.3.1.1. Material y métodos ............................................................. 65 2.3.1.1.1. Material biofumigante ................................................. 65 2.3.1.1.2. Material fúngico ......................................................... 66 2.3.1.1.3. Medida de la inhibición del crecimiento miceliar ............. 67 2.3.1.2. Análisis estadístico .............................................................. 68 2.3.1.3. Resultados ......................................................................... 69 2.3.1.3.1. Efecto de la especie de Brassicaceae (parte aérea) en la inhibición del crecimiento miceliar ................................ 69 17 ABSTRACT The intensification of agricultural activity has provoked, on the one hand, the loss of organic matter which is directly related with natural soil fertility, on the other hand, the proliferation of pathogen organisms that cause diseases in crops. The current prohibition of many agrochemicals products has led to search for viable and sustainable techniques for the control of phytopathogenic fungi, responsible for numerous losses of crops yield. In this memory of thesis it was studied the effects of biofumigation, biosolarisation and solarisation techniques on the control of fungal species P. nicotianae y F. oxysporum, which cause the pepper “tristeza” disease and Fusarium wilt of tobacco in the region of Extremadura. This memory is divided into two blocks. In the first block it is described the different tests carried out under controlled conditions in order to adjust the techniques and assess different factors related to the toxicity of biofumigant species, the susceptibility of fungal species, the temperature and exposure times. Among the results, it highlights the toxicity of B. carinata pellets compared to the rest of tested materials, the major susceptibility of P. nicotianae´s mycelium and the effect of the temperature, alone or combined with biofumigant species, on the inoculum inactivation of both fungal species. In the second block are detailed the applied techniques under field conditions during the months of March-April for the control of P. nicotianae. The results showed that these techniques are not effective to control the pepper “tristeza” disease in Extremadura in spring. It should be noted that although these techniques were not feasible under the conditions tested, the repeated application of treatments has changed the physical, chemical and biological properties of the soil. However, an increase in pepper for paprika production has been observed as a result of improvements in soil properties. Capítulo 1 I ntroducción general 21 Capítulo 1 1.1. Introducción 1.1.1. Técnicas de control de hongos fitopatógenos Uno de los mayores impactos de la agricultura reside en la aplicación masiva de agroquímicos y maquinaria agraria pesada, que constituyen los logros más destacados de la “Revolución Agraria” iniciada en el siglo XIX, aprovechando las ventajas del rápido desarrollo de los conocimientos de la química y de la mecánica. Al mismo tiempo, se olvida paulatinamente el conocimiento campesino, resultado de diez mil años de cultura agraria, que ha permitido el desarrollo de una agricultura adaptada a las características ecológicas de cada región, comarca o localidad (Bello et al., 2008). En este escenario es necesario introducir nuevos planteamientos para producir alimentos de calidad de forma sostenible, aplicando los últimos avances científicos y tecnológicos en el sector agrario y que protejan la integridad de los recursos naturales, asegurando la interacción equilibrada de los seres humanos, el agrosistema y el ambiente (Altieri, 1997; Ibáñez et al., 2005; Bello et al., 2008). En agricultura, uno de los factores clave en la producción de cultivos es la proliferación de organismos patógenos del suelo, responsables de la aparición de plagas y enfermedades. A nivel mundial, este problema se ha resuelto, durante muchos años, mediante la aplicación de fumigantes del suelo como el bromuro de metilo (Bell et al., 1996; Katan, 2005; Bello et al., 2008). Desde el descubrimiento de su efectividad contra patógenos de origen edáfico allá por la década de los años 30 del siglo pasado, su empleo se fue extendiendo hasta alcanzar un gran apogeo en la década de los setenta en los países de Centroeuropa, y llegando por entonces, al litoral mediterráneo (Martínez et al., 2009). En Europa, a través de la Directiva 91/414/CE y posterior Reglamento CE 1107/2009, los pesticidas autorizados se revisaron y su uso se armonizó en los 22 Introducción general países europeos. Durante esta evaluación, cerca del 70 % de las materias activas se prohibieron en el mercado. La Directiva 2009/128 CE estableció un marco de acción comunitaria para conseguir un uso sostenible de los plaguicidas, teniendo en cuenta los enfoques de precaución y de prevención. El objetivo era “reducir los riesgos y los impactos del uso de plaguicidas en la salud humana y el medio ambiente y a la vez fomentar el desarrollo y la introducción del manejo integrado de plagas junto con técnicas alternativas con el fin de reducir la dependencia del uso de plaguicidas químicos”. Además, en línea con el creciente interés por la seguridad alimentaria (Reglamento CE 10/2001) y por la reducción de la contaminación debida a las emisiones de dióxido de carbono (Directiva 28/2009 CE), esta Directiva fomenta el uso de alternativas no químicas para la protección de plantas. El marco político promueve un cambio estructural en el sistema de producción de alimentos, para conseguir alimentos más saludables en un medio ambiente más limpio. La prohibición de numerosos pesticidas ha desencadenado la búsqueda de estrategias alternativas y sostenibles para el control integrado de plagas en la agricultura y la horticultura. 1.1.1.1. Biofumigación Kirkegaard et al. (1993) y Angus et al. (1994) emplearon el término biofumigación para describir la supresión de patógenos y plagas del suelo con rotaciones de Brassica o cultivos para enmienda en verde. Posteriormente, Bello et al. (1999, 2000) definieron la biofumigación como la acción de las sustancias volátiles producidas en la biodegradación de la materia orgánica en el control de los patógenos de las plantas, incrementándose su eficacia cuando se incluyen en un sistema integrado de producción de cultivos. Los gases y otros productos resultantes de la descomposición de enmiendas orgánicas y residuos agroindustriales se utilizan como biofumigantes para el control de los organismos patógenos vegetales (Bello et al., 2003). El efecto biofumigante de las enmiendas orgánicas sobre los patógenos se debe, entre 23 Capítulo 1 otros factores, a los compuestos tóxicos volátiles, condiciones anaeróbicas y el incremento de la capacidad supresiva del suelo (Bonanomi et al., 2007; Arriaga et al., 2011; Núñez-Zofío et al., 2011, 2012). Se ha comprobado que, por lo general, cualquier tipo de materia orgánica puede actuar como biofumigante, dependiendo su eficacia de la dosis y del método de aplicación (Bello et al., 2000). La adición de materia orgánica al suelo para mejorar la fertilidad y controlar las plagas y enfermedades es una práctica casi tan antigua como la agricultura; produciendo modificaciones en las características físicas y químicas del suelo, mejorando la disponibilidad de nutrientes utilizables por la planta e incrementando las poblaciones de los nematodos saprófagos (Bello et al., 2004; Díez-Rojo, 2010). Se han ensayado una amplia variedad de materiales como enmiendas al suelo para controlar nematodos, hongos fitoparásitos y flora arvense. Estos materiales incluyen estiércol de ganado, residuos de industrias papeleras y forestales, de industrias pesqueras y de marisqueras, numerosos subproductos de agricultura, alimentación y otras industrias, así como residuos de plantas con compuestos alelopáticos (Hoitink, 1988; Stirling, 1991; Bello et al., 2000). Las plantas de la familia Brassicaceae (Crucíferas) contienen en sus tejidos cantidades considerables de glucosinolatos (GSLs) (Kirkegaard y Sarwar, 1998). Los glucosinolatos son sustancias alelopáticas biosintéticas derivados de aminoácidos (Hill et al., 2003) que se producen en todas las plantas del orden Capparales y en algunas otras plantas (Kjaer, 1960; Rodman, 1978; Bjerg y Sørensen, 1987). Estos compuestos, que son relativamente inactivos frente a los microorganismos, son hidrolizados por la isoenzima mirosinasa (Thioglucosidasa; CE 3.2.1.147), que cataliza la hidrólisis de la cadena β-D- tioglucopiranosida (Bjergegaard et al., 1994; Bellostas et al., 2003; Bjergegaard et al., 2003). Como se observa en la Figura 1.1, en la hidrólisis de los GSLs por la enzima mirosinasa se liberan fundamentalmente isotiocianatos (ITCs), así como tiocianatos, nitrilos y otros compuestos en menores proporciones. Los glucosinolatos pueden representar una fuente viable de aleloquímicos de control para una gran variedad 24 Introducción general de patógenos del suelo, incluidas las malas hierbas (Kirkegaard y Sarwar, 1998). Los ITCs son potentes biocidas frente a nematodos, bacterias, hongos e insectos (Fenwick et al., 1983; Brown y Morra, 1997; Rosa et al., 1997). Muchos ITCs tienen una potente actividad antimicrobiana como es el caso del metil-ITC, principio activo de algunos de los fumigantes comerciales de suelo más utilizados (Landis y Campbell, 1990). Las enzimas mirosinasas están separadas de sus sustratos (GSLs) en los tejidos vegetales intactos. Se ha observado que los glucosinolatos se encuentran en las vacuolas de diferentes tipos celulares de la planta (Grob y Matile, 1979; Pocock et al., 1987); por el contrario, la mirosinasa se localiza en gránulos, solo dentro de células especializadas y distribuidas entre las demás células de los tejidos de la planta (Thangstad et al., 1991; Höglund et al., 1992). Debido a que las vacuolas que contienen los glucosinolatos no parecen estar presentes en las células especializadas donde se encuentra la mirosinasa, la separación se produce de forma intercelular y no de forma intracelular. La ruptura de los tejidos celulares permite la mezcla de glucosinolatos y la mirosinasa dando lugar a la liberación rápida de los productos de la degradación de glucosinolatos (Brown y Morra, 1997). Figura 1.1. Hidrólisis de los glucosinolatos por la vía de la mirosinasa (Recuperado de Mari et al., 1993). 25 Capítulo 1 Los productos liberados de la hidrólisis presentan formas variadas, son biológicamente activos y con estructuras definidas por el tipo de glucosinolato y las condiciones de la reacción (Bjergegaard et al., 1994; Palmieri et al., 1998; Buskov et al., 2000). Se han identificado más de 130 glucosinolatos, y más de 30 de ellos están presentes en especies de Brassica (Fahey et al., 2001; Sørensen, 2001). El tipo y la concentración de glucosinolatos que se encuentran en la familia Brassicaceae varían entre especies (Picón-Toro, 2011; Morales-Rodríguez, 2011; Morales- Rodríguez et al., 2012, 2014), así como entre cultivares de la misma especie (Bradshaw et al., 1984; Kirkegaard y Sarwar, 1998; Doheny-Adams et al., 2018), y consecuentemente la concentración y tipo de productos biocidas producidos por la hidrólisis de estos también varían (Mithen, 1992; Kirkegaard y Sarwar, 1998). Sin embargo, los principales GSLs y sus respectivas proporciones son relativamente estables y predecibles para especies y subespecies concretas (Rosa et al., 1997). Con el fin de alcanzar la cantidad efectiva de GSLs a la hora de su aplicación en campo, hay que tener en cuenta, entre otros factores, la producción de biomasa de la especie y su contenido en glucosinolatos; eligiendo especies con elevadas producciones de biomasa (por ejemplo, Brassica oleracea), especies con elevadas concentraciones de GSLs en los tejidos (por ejemplo, Brassica napus oleifera bianual) o bien especies con niveles moderados de producción de biomasa y concentración de GSLs (por ejemplo Brassica nigra) (Kirkegaard y Sarwar, 1998). Factores tan importantes como la producción de GSLs son la capacidad de estos para liberar ITCs y el tipo de ITC liberado. Así, en el caso de Brassica napus, B. campestris y B. oleracea solo el 50 % del total de GSLs liberan ITCs al hidrolizarse, contrastando con B. nigra, B. carinata, B. juncea, Sinapis alba y otras malas hierbas en las que la mayoría de los GSLs que contienen se liberan como ITCs (Kirkegaard y Sarwar, 1998). Los niveles de glucosinolatos y los compuestos relacionados varían durante el desarrollo de la planta (Bellostas et al., 2004; Morales-Rodríguez, 2011; Morales-Rodríguez et al., 2012) y entre los tejidos de la planta (Clossais-Besnard 32 Introducción general agronómicas tienen un fuerte impacto sobre el suelo, el medio ambiente y la salud de las personas (Bello et al., 2008). Stolte et al. (2016) señalaron las principales amenazas del suelo que están presentes en la Unión Europea: erosión, pérdida de materia orgánica, compactación, salinización, contaminación, desprendimientos de tierras, sellado y pérdida de biodiversidad. La degradación del suelo es una realidad y, por ello, es necesaria su protección. En los últimos años han surgido nuevos modelos de gestión que tratan de minimizar la intensificación de la agricultura industrial y la degradación de los suelos. La agroecología aborda de forma integral la gestión agraria, dada la complejidad del suelo como sistema y tiene como objetivo principal el conocimiento de elementos y procesos claves que regulan el funcionamiento de los agrosistemas, con el fin de establecer las bases científicas para una gestión eficaz de los sistemas agrarios, en armonía con el ambiente (Bello et al., 2008). El enfoque agroecológico considera la fertilidad como la capacidad de un suelo de cultivo de mantener de manera perdurable, un nivel de producción estable y de calidad, conservando un estado de alta estabilidad frente a los procesos que implican su degradación además de un alto grado de resiliencia (Labrador, 2008). Por tanto, la fertilidad es una expresión del estado de los componentes y de los procesos biológicos, químicos y físicos de un suelo. Las actuaciones para el manejo eficiente de la fertilidad deben ir enfocadas al conocimiento de los parámetros que la determinan y posteriormente a las interacciones entre esos parámetros con los factores bióticos del agrosistema. Los factores que determinan la fertilidad se pueden clasificar en: - Físicos: condicionan el desarrollo del sistema radicular y el aporte hídrico. La fertilidad física es función de la textura del suelo, de la estructura y de la estabilidad de los agregados, que influyen en la porosidad, densidad aparente, permeabilidad y penetrabilidad. 33 Capítulo 1 - Químicos: definen el estado físico-químico del medio, la reserva y disponibilidad de nutrientes. La fertilidad química viene determinada por el pH, la conductividad eléctrica, la capacidad de intercambio catiónico, materia orgánica y el contenido de macronutrientes y micronutrientes. - Biológicos: determinados por la actividad de los microorganismos del suelo. La microbiota del suelo utiliza la materia orgánica como sustrato y fuente de energía, interviniendo en la producción de enzimas, ciclo del carbono y del nitrógeno, transformaciones biológicas de nutrientes y procesos de humificación y mineralización (Bernal, 2004). El manejo de la fertilidad de los suelos de cultivo está ligado a la utilización de la fertilización orgánica, ya que el contenido de materia orgánica en el suelo está estrechamente unido con el potencial productivo y el grado de resistencia frente a la erosión y degradación (Labrador, 2008). La materia orgánica desempeña distintas funciones clave en los agrosistemas al actuar sobre las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo (Labrador, 2008). Las características edafoclimáticas de ciertas áreas, como la zona mediterránea, favorecen los procesos de degradación y mineralización de la materia orgánica del suelo, provocando una pérdida de materia orgánica. Esta pérdida afecta negativamente a las diferentes propiedades del suelo (Bernal, 2004). En Extremadura, los suelos de las Vegas del Guadiana tienen una clara aptitud agrícola y durante siglos se han cultivado de forma tradicional. La necesidad de incrementar la producción para aumentar la competitividad ha conducido a una situación en la que algunos de los mejores suelos están afectados por procesos erosivos que, aunque no son destacables, tienen consecuencias negativas desde el punto de vista económico y ambiental (Peña, 2013). El mantenimiento de un nivel adecuado de materia orgánica es decisivo para la conservación de la funcionalidad de los suelos agrícolas (Labrador, 2008). 34 Introducción general La adición de enmiendas y residuos orgánicos a los suelos es una práctica común que está muy extendida en España y otros países de clima mediterráneo, donde los suelos se caracterizan, en general, por su bajo contenido en materia orgánica, debido al predominio de los procesos de mineralización frente a los de humificación (Peña, 2013). 1.1.2.1. Efecto de las técnicas de control de patógenos en las propiedades del suelo Tanto en sistemas agrarios convencionales como en agricultura ecológica, se ha propuesto la incorporación de enmiendas orgánicas al suelo como una estrategia para mejorar las propiedades del suelo. La adición de enmiendas orgánicas puede modificar las propiedades químicas, físicas y biológicas del suelo (López-Piñeiro et al., 2011). No obstante, la respuesta de los suelos de los aportes de materiales orgánicos no va a ser siempre la misma, ya que va a depender de su naturaleza y de su calidad (Fernández et al., 2004; Pérez- Piqueres et al., 2006; Tejada et al., 2008). Uno de los retos de la agroecología es convertir y revalorizar los residuos que genera la actividad productiva (estiércol, restos de cosecha, residuos agroindustriales, etc.,) en recursos que contribuyan a una mejora de los suelos, permitiendo una reducción del consumo energético en los agrosistemas (Guzmán-Casado et al., 1999). Las enmiendas orgánicas influyen principalmente en las comunidades microbiológicas, incluidos algunos hongos patógenos saprófitos debido a que utilizan los materiales aportados como fuente de alimento (Bending et al., 2004; Fang et al., 2011). Estos cambios en la microbiota pueden influir en todo el ecosistema del suelo a través de la interacción trófica con la red nutritiva del suelo (Schutter et al., 2001). La aplicación de materia orgánica podría directa o indirectamente cambiar la incidencia de una enfermedad causada por hongos patógenos habitantes del suelo (Pérez, 2014), ya que a través del aumento de la 35 Capítulo 1 actividad y biomasa microbiana, puede contribuir a mejorar la supresividad1 del suelo (Bonanomi et al., 2007; Janvier et al., 2007). Los mecanismos involucrados en el control de patógenos mediante el aporte de enmiendas orgánicas pueden ser de diversa índole, incluyendo la acción de los compuestos que resultan tóxicos (Tsao y Oster, 1981; Shetty et al., 2000), la alteración de las propiedades del suelo que afectan a la supervivencia de los organismos (Keinath, 1996), la estimulación de la actividad de los organismos de control biológico (Dutta e Isaac, 1979) así como la mejora e inducción de resistencias (Hoitink y Boehm, 1999). La biofumigación es una técnica para el control de patógenos que mejora las características del suelo y la nutrición de la planta, incrementa el número de nematodos saprófagos, además induce cambios microbiológicos, con una proliferación inicial de microorganismos que depende de los recursos añadidos (Bello et al., 2004). Mitidieri et al. (2009) señalaron que la biofumigación puede provocar un cambio en la composición de la microbiota del suelo y aumentar la proporción de los antagonistas. Wang et al. (2014) mostraron que la biofumigación con harina de semilla de colza redujo la infectividad de Phytophthora capsici a través de las alteraciones en la comunidad microbiana del suelo. La incorporación de enmiendas orgánicas en forma de abonos verdes tiene efectos benéficos sobre el desarrollo de los cultivos siguientes, ya que aumenta el contenido de materia orgánica del suelo, mejorando la estructura y la penetración del agua en el mismo (Pung, 2003; Kirkegaard y Matthiessen, 2004). Se han observado incrementos en la producción de cultivos en aquellos suelos en 1 Supresividad: concepto holístico inspirado en la propiedad de homeostasis de los ecosistemas estables, es decir, de su resistencia al cambio, la cual impide o frena la introducción o el éxito de especies patógenas (Núñez-Zofío, 2011). Según Baker y Cook (1974), la supresividad de un suelo viene mediada por diferentes mecanismos: (i) el patógeno no se establece y/o persiste, (ii) el patógeno se establece pero no causa daño o el daño que causa es mínimo, o (iii) el patógeno se establece y causa daño por un tiempo pero el daño es poco importante a pesar de que el patógeno es capaz de persistir en el suelo. 36 Introducción general los que se han aplicado tratamientos biofumigantes (Mattner et al., 2008; Mitidieri et al., 2009; Hansen y Keinath, 2013; Wang et al., 2014). La biosolarización tiene varios efectos beneficiosos, como la mejora de las propiedades físico-químicas del suelo, el control de patógenos y la obtención de mejores cosechas comerciales, obteniendo unos resultados similares a los obtenidos con la fumigación con bromuro de metilo (Ros et al., 2008). Fernández et al. (2004) obtuvieron una mejora de la velocidad de infiltración, una reducción de los efectos depresivos y mermas en rendimientos de la cosecha al biosolarizar el suelo aportando estiércoles de origen animal. La mejora de las características físicas del suelo por el aporte de materia orgánica mediante biosolarización podrían explicar la reducción de la fatiga en algunos invernaderos del Campo de Cartagena (Guerrero, 2012). Núñez-Zofío et al. (2012) estudiaron el efecto reiterado de la biosolarización, con diferentes enmiendas orgánicas, en el control de Phytophthora spp. y en las propiedades del suelo. Esta técnica mejoró las propiedades hídricas del suelo al reducir la densidad aparente y aumentar la infiltración. Los suelos biosolarizados mostraron valores más altos en las propiedades físico-químicas y microbianas del suelo que los suelos no tratados (control). En relación a la solarización, el modo de acción es complejo, implica una destrucción térmica directa de los propágulos, cambios en la actividad microbiana, y cambios en las propiedades físico-químicas del suelo (Gamliel y Stapleton, 1993). Las temperaturas alcanzan ciertos niveles que son letales para muchos fitopatógenos, al mismo tiempo se producen cambios físicos y biológicos en el suelo que contribuyen al efecto biocida (Chen y Katan, 1980; Pullman et al., 1981; Ristaino et al., 1991). Cullman et al. (2006) indican que la solarización durante varias semanas ayuda a controlar los hongos patógenos y los nematodos fitoparásitos, además puede tener varios efectos indirectos en la biota edáfica, incrementando la competencia o estimulando los organismos termotolerantes. Lombardo et al. (2012) señalan que la solarización consiguió controlar 37 Capítulo 1 satisfactoriamente los patógenos del tomate y malas hierbas, al mismo tiempo que mejoró la producción del cultivo de tomate. La aplicación de la solarización en diferentes estudios ha resultado en una mejora del crecimiento de las plantas e incremento de las cosechas (Gamliel y Stapleton, 1993; Lira-Saldívar et al., 2004; Mauromicale et al., 2005), además de inducir supresividad frente al restablecimiento de hongos patógenos en suelos tratados (Greenberger et al., 1987; Gamliel y Katan, 1993). Estos efectos pueden ser parcialmente atribuidos, al incremento de las poblaciones beneficiosas de hongos y bacterias en la rizosfera y raíces de las plantas cultivadas en suelos solarizados (Chen et al., 1991; Gamliel y Katan, 1991; Gamliel y Katan, 1993). 1.1.3. La tristeza del pimiento y la fusariosis vascular del tabaco: dos enfermedades causadas por hongos fitopatógenos del suelo En la agricultura mundial los hongos fitopatógenos son causantes de enfermedades pre y postcosecha en los cultivos de hortalizas, cereales y frutas, siendo estos responsables de cuantiosas pérdidas económicas. El daño que ocasionan no solo se refiere a las pérdidas de producción económica, sino también a las pérdidas en la producción biológica, debido a la alteración en el crecimiento y desarrollo de las plantas hospedadoras atacadas por estos microorganismos (Agrios, 2005). Los patógenos del suelo constituyen un componente crítico en los agrosistemas, ya que desempeñan diversas funciones ecológicas que inciden en la producción de alimentos (Ellouze et al., 2014) y son los causantes de las mayores pérdidas ocasionadas en algunos cultivos de gran importancia económica en el sur de Europa (Gullino, 2000). Estas pérdidas conducen a la aplicación de miles de toneladas de agroquímicos en todo el mundo, y a la necesidad persistente de desarrollar nuevos fungicidas más eficaces y respetuosos con el medio ambiente (Juárez-Becerra et al., 2010). Existen más de 8.000 especies de hongos que producen enfermedades en las plantas (Rodríguez et al., 2001), estas pueden ser infectadas y dañadas por 38 Introducción general más de una especie de hongo fitopatógeno, y de igual forma, una especie de hongo fitopatógeno puede atacar a más de una especie (National Academy of Sciences, 1980; Agrios, 1988). Algunos géneros y especies fúngicas presentan una gran capacidad de adaptación y se encuentran ampliamente distribuidos, mientras que otros presentan características de adaptación más limitadas o bien son sumamente especializados, lo cual restringe su distribución (Cook y Baker, 1983). Esta capacidad adaptativa de los hongos fitopatógenos depende del grado de relación hongo-hospedador. Los hongos fitopatógenos telúricos pueden sobrevivir durante varios años en el suelo en forma de estructuras de resistencia y causar graves pérdidas en distintos cultivos haciendo que extensas zonas agrícolas dejen de ser adecuadas para el cultivo (Ambrósio et al., 2009). Las estructuras de resistencia, como clamidosporas y microesclerocios, permanecen libres y quiescentes en el ambiente edáfico hasta que son estimuladas por un potencial huésped, o merced a su capacidad de crecimiento saprofítico en ausencia de este (Jiménez-Díaz et al., 2004). Estos hongos infectan los tejidos subterráneos de la planta susceptible causando lesiones necróticas y podredumbres del sistema radical (p.ej. Fusarium spp., Phytophthora spp.), marchiteces vasculares (p.ej. F. oxysporum spp., Verticillium spp.) y muerte de plántulas (p.ej. Pythium spp., Rhizoctonia spp.). La complejidad del ecosistema edáfico, y en particular de las enfermedades que afectan al sistema radical de la planta, dificultan el control eficiente de estas (Jiménez-Díaz et al., 2004), siendo esencial el manejo de estos hongos, para optimizar la productividad y la sostenibilidad de los sistemas agrarios (Ellouze et al., 2014). La mayoría de los trabajos de investigación se centran en los géneros Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia y Pythium debido al amplio rango de plantas hospedantes que atacan, a su distribución cosmopolita y a los elevados daños económicos que provocan en cultivos de importancia económica (Rodríguez et al., 2001). Dean et al. (2012) publicaron la lista de los 10 hongos fitopatógenos considerados de mayor importancia económica y/o científica. El orden de la lista fue el siguiente: (1) Magnaporthe oryzae; (2) Botrytis cinerea; (3) Puccinia spp.; 39 Capítulo 1 (4) Fusarium graminearum; (5) Fusarium oxysporum; (6) Blumeria graminis; (7) Mycosphaerella graminicola; (8) Colletotrichum spp.; (9) Ustilago maydis; (10) Melampsora lini. Clarkson et al. (2015) criticaron este ranking por la ausencia de especies de los géneros Verticillium y Phytophthora, considerados de gran importancia, dada su incidencia en una amplia gama de cultivos tradicionales en toda Europa. Phytophthora se encuentra entre los géneros más importantes de los hongos fitopatógenos y ha sido objeto de cuatro libros importantes en menos de veinte años (Erwin y Ribeiro, 1996). Dos cultivos representativos y de gran importancia socioeconómica para la Comunidad Autónoma de Extremadura, como son el pimiento (Capsicum annuum L.) para pimentón y el tabaco (Nicotiana tabacum L.), son afectados por enfermedades fúngicas de origen edáfico: la tristeza del pimiento y la fusariosis vascular del tabaco. 1.1.3.1. La tristeza del pimiento A nivel mundial, la Tristeza o Seca del pimiento es una de las amenazas más graves para la producción de Capsicum (Tian y Babadoost, 2004). Esta enfermedad presenta la mayor trascendencia económica en el cultivo de esta especie hortícola en los países mediterráneos (Palazón y Palazón, 1989). A pesar de que la enfermedad se conoce en España desde la antigüedad, la primera publicación data de 1964 (Davila, 1964), y no fue hasta 1970 cuando la enfermedad fue considerada como una epidemia en este país (Bartual et al., 1991). Esta enfermedad se presenta como limitante del cultivo en áreas de producción del pimiento con deficiencias en los drenajes o suelos altamente contaminados dadas las dificultades de control (Tello y Lacasa, 2004). Las plantaciones de pimiento para pimentón de los valles del norte de Extremadura están afectadas por esta enfermedad. 40 Introducción general 1.1.3.1.1. El cultivo de pimiento para pimentón Las regiones de España donde se cultiva pimiento para pimentón son Extremadura, Murcia, Alicante, Ávila y Baleares. Entre estas destacan especialmente las dos primeras, siendo consideradas de marcada tradición pimentonera (Pereira-Jiménez et al., 2011). Este es el cultivo hortícola, de entre los importantes, que mayor descenso de superficie ha sufrido. Dos razones justifican este hecho: por un lado, la fuerte subida del coste de la mano de obra ocurrida a finales de los años setenta, que comprometió la rentabilidad de una producción en la que no se había abordado la mecanización de la recolección y, por otro lado, la entrada masiva de pimientos secos procedentes de otras zonas del mundo capaces de producir mucho más barato que los agricultores extremeños y murcianos (Bartolomé-García et al., 2013). El pimiento para pimentón es uno de los cultivos más característicos de Extremadura, localizándose su producción en los valles de los ríos Tiétar, Alagón, Árrago y Ambroz, al norte de la provincia de Cáceres. En el valle del Tiétar se encuentra la Comarca de La Vera, de la que toma nombre el pimentón de Cáceres, conocido como “Pimentón de la Vera”. Para asegurar la calidad del pimentón y proteger el producto autóctono, el Gobierno Autonómico de Extremadura aprobó en 1991 el Reglamento de la Denominación de Calidad “Pimentón de la Vera”, y en el año 1998 el Reglamento de la Denominación de Origen “Pimentón de la Vera”. Posteriormente, se aprobó el Reglamento de la Denominación de Origen Protegida (D.O.P.) “Pimentón de la Vera” en el año 2005; cuyo objetivo es controlar y proteger la calidad, además de, asegurar la trazabilidad de un pimentón que se diferencia de otros: por su aroma y sabor ahumados, estabilidad de color y fuerte poder antioxidante. El Reglamento de la D.O.P. define al “Pimentón de La Vera” como el “producto obtenido de la molienda de frutos totalmente rojos, de la especie C. annuum var. longum L., de las variedades del grupo de las “Ocales”, Jaranda, Jariza y Jeromín, y de la especie C. annuum L., la variedad Bola, recolectados 41 Capítulo 1 maduros, sanos, limpios, con el color característico de la variedad, libres de ataques de plagas o enfermedades, secados con leña de encina y/o roble, por el sistema tradicional de La Vera, y que proceda de la zona de producción”. Esta comprende 53 términos municipales pertenecientes a las comarcas de La Vera, Campo Arañuelo, Valle del Alagón y Valle del Ambroz. El cultivo de pimiento para pimentón se ha estabilizado en esta comunidad y la superficie de este cultivo ha pasado de 331 ha en 1991 a más de 1.200 ha en el año 2014, lo que representa el 70 % de toda la superficie que se cultiva en toda España (MAPAMA). En Extremadura, la superficie cultivada de pimiento para pimentón fue de 1.576 ha que produjeron 4.776 T en el año 2017 (Consejería de Medio Ambiente y Rural, Políticas Agrarias y Territorio, 2018). Los cultivares Jaranda y Jariza son los recomendados por la Denominación de Origen en su Reglamento de 1998. Actualmente es el cultivar Jaranda el que se cultiva de forma mayoritaria, seguido por el ecotipo Bola (información proporcionada por el Consejo Regulador de la D.O. Pimentón de La Vera). El pimiento para pimentón es un cultivo que ha estado al margen de la aplicación de innovaciones tecnológicas en todos los procesos que intervienen para obtener el producto final. Se trata de un cultivo de gran importancia social, que necesita mucha mano de obra, ya que la recolección no está mecanizada. Dado que la recolección manual supone entre el 30 y el 35 % de los gastos totales de cultivo, la mecanización de este cultivo se considera necesaria para asegurar la viabilidad de la producción (Bartolomé-García et al., 2013). Además, el secado tradicional con corriente vertical con humo de leña de encina es realizado por el agricultor, que cuenta con instalaciones de secado en su propia explotación. Posteriormente, el pimiento seco es molido en alguna de las veinticuatro industrias molineras de la zona, de las que trece están acogidas a la D.O.P. Pimentón de la Vera (Bartolomé-García et al., 2006). 48 Introducción general Figura 1.4. A Clamidosporas de Phytophthora nicotianae teñidas con azul de lactofenol (Recuperada de Picón-Toro, 2011). B. Hinchamientos hifales de Phytophthora nicotianae teñidos con azul de lactofenol (Recuperada de Picón-Toro, 2011). Los hinchamientos hifales son globosos e irregulares en su forma (Figura 1.4.B), normalmente hialinos, terminales o intercalares, se encuentran a menudo en agrupaciones y no están delimitados por septos (Blackwell, 1949). Los hinchamientos hifales son comunes en P. cinnamomi, P. cryptogea, P. drechsleri, P. megasperma y P. nicotianae. La pared en muchos casos es menor de 0,5 μm y similar a la pared miceliar (Erwin y Ribeiro, 1996). Las estructuras sexuales de Phytophthora son el anteridio (componente masculino) y el oogonio (componente femenino). El oogonio está delimitado de la hifa por un septo. La oospora se forma dentro del oogonio, es globosa y con doble pared (teóricamente triple, pero la epispora en Phytophthora es tan delgada que puede ser ignorada); la pared exterior es delgada mientras que la interior puede ser muy gruesa (Blackwell, 1949). La oospora diploide germina bajo condiciones favorables mediante la producción de uno o varios tubos germinativos en cuyos se extremos se puede dar o no la formación de un esporangio. Algunas especies de Phytophthora son homotálicas (auto-fértiles), en las cuales las estructuras sexuales se producen en un único cultivo, mientras que otras son heterotálicas (auto-estériles). En las especies heterotálicas, los aislados de apareamiento o tipos de complementación se designan como A1 y A2. Las oosporas de las especies heterotálicas se forman cuando están presentes los dos tipos de complementación A1 y A2 en un medio adecuado. La función de B A 49 Capítulo 1 las oosporas en las especies homotálicas es la persistencia de propágulos en el material vegetal infectado (Slusher et al., 1974; Stack y Millar, 1985). El papel de las oosporas en tipos heterotálicos aún no se conoce con exactitud, pero hay evidencias de que el cruzamiento entre A1 y A2 puede dar lugar a nuevas razas o biotipos (Erwin y Ribeiro, 1996). 1.1.3.1.2.1.1. Phytophthora nicotianae Breda de Haan Phytophthora nicotianae posee unas características morfológicas propias que le diferencian del resto de especies del género Phytophthora. El crecimiento de las colonias de P. nicotianae en medio PDA es de tipo aracnoide, las hifas presentan paredes irregulares, de aspecto coraloide y con hinchamientos hifales, es frecuente la formación de clamidosporas tanto terminales como intercalares (Figura 1.5.A). Figura 1.5.A. Micelio de P. nicotianae teñido con azul de lactofenol con hifas de paredes irregulares de aspecto coraloide, con hinchamientos hifales y clamidosporas (Recuperada de Picón-Toro, 2011). B. Esporangios de P. nicotianae al microscopio óptico teñidos de azul de lactofenol (Recuperada de Picón-Toro, 2011). Los esporangios son terminales no caducos, con forma subesférica –ovoide, con papilas prominentes, generalmente unipapilados y en ocasiones bipapilados (Figura 1.5.B). Los oogonios no son ornamentados (Figura 1.6) y es característico en P. nicotianae la posición anfigina del anteridio respecto al oogonio. A B 50 Introducción general Figura 1.6. Imagen al microscopio óptico de las estructuras sexuales de P. nicotianae: oogonio y anteridio en posición anfigina (Recuperada de Picón-Toro, 2011). P. nicotianae es una especie que puede ser patógena para un gran número de especies vegetales y es capaz de persistir en el suelo en forma de clamidosporas y oosporas en la ausencia de condiciones favorables y de un hospedador susceptible (Erwin y Ribeiro, 1996). Es una de las especies fitopatógenas de suelo más ampliamente distribuida y destructiva (Erwin y Ribeiro, 1996) y es responsable de grandes pérdidas en un elevado número de plantas hospedadoras (Panabières et al., 2016). Pérez (2011) estudió 27 aislados de Phytophthora procedentes de plantas de pimiento de varias procedencias (Almería, País Vasco y la mayoría de Murcia), de los cuales 7 eran de P. capsici y el resto de P. nicotianae. Guerrero (2012) caracterizó las poblaciones de Phytophthora spp. (70 aislados) de los invernaderos de pimiento del Campo de Cartagena, perteneciendo la mayoría de los aislados a P. nicotianae. Rodríguez-Molina et al. (2010b) y Morales-Rodríguez (2011) caracterizaron 27 aislados de P. nicotianae procedentes de plantas de pimiento enfermas cultivadas en los valles del Tiétar y el Alagón (Cáceres), y todos ellos fueron heterotálicos y del tipo de compatibilidad A2, lo que sugiere que la principal estructura de conservación del patógeno en esta zona son las clamidosporas. 51 Capítulo 1 1.1.3.2. La fusariosis vascular del tabaco La fusariosis vascular del tabaco está extendida en regiones productoras de tabaco y puede causar significantes pérdidas en la producción y calidad del cultivo. El patógeno que produce esta enfermedad es bastante variable y afecta a varios hospedadores, asociados a formas especiales y razas de tabaco, batata o algodón (LaMondia, 2015). La fusariosis vascular puede convertirse en una de las enfermedades más graves del cultivo de tabaco, especialmente cuando se asocia a infecciones del nematodo Globodera tabacum (LaMondia y Taylor, 1987; LaMondia, 1992, 1995). En Europa, la fusariosis vascular del tabaco se ha descrito en Italia (Diana y Piccirillo, 1994), Grecia (Tjamos et al., 2006) y España (Rodríguez-Molina et al., 2007). 1.1.3.2.1. El cultivo de tabaco en Extremadura La industria del tabaco constituye un sector muy relevante en España, tanto por la producción como por la transformación de la hoja de tabaco. Esta industria aporta a las arcas públicas más de 9.100 millones de euros anuales, el equivalente al 5 % del total de los ingresos tributarios (AFI et al., 2017). España es el tercer productor de hoja de tabaco de Europa, con una cuota del 15 % sobre el total en 2016 (AFI et al., 2017). El cultivo de tabaco en España se concentra en Extremadura, con una superficie que representa el 97 % sobre el total nacional, seguida de Andalucía (1,5 %) en el año 2016. En ese año, la producción española alcanzó 29.238 T, de las que 28.297 T corresponden a Extremadura (96,8 %) (MAPAMA). Según los datos de la Consejería de Medio Ambiente y Rural, Políticas Agrarias y Territorio del Gobierno de Extremadura, en el año 2017 la superficie cultivada en Extremadura fue igual a 8.527 ha que produjeron 28.845 T de tabaco. Las razones de índole técnica, vinculadas a la calidad agronómica de los suelos y de las aguas de riego, así como factores ambientales, de tradición y de concentración de las industrias receptoras, han motivado que el área geográfica 52 Introducción general de producción de tabaco se localice mayoritariamente en la zona norte de Cáceres, con especial representatividad en los valles del Tiétar, Alagón y Árrago (Guzmán et al., 2003). En estos valles se localizan tres comarcas que dependen crucialmente de las plantaciones de tabaco: Comarcas de Campo Arañuelo, la Vera y Alagón, que producen aproximadamente el 50 %, 35 % y 8 %, respectivamente, de la producción total nacional (AFI et al., 2015). En el Valle del Tiétar se localiza la principal zona de producción, con una superficie aproximada de 8.700 ha de tabaco tipo Virginia y 1.400 ha de tipo Burley (Guzmán, 2010; Rodríguez-Molina et al., 2013). El tabaco Virginia constituye el 96 % del total de la producción, seguido de las variedades Burley (3,3 %) y Havana (0,74 %) (OITAB, 2018). Hace aproximadamente 35 años, con el Plan de Reordenación del Sector Tabaquero del 82, se implantó la reconversión del Burley (tabaco negro) al Virginia (tabaco rubio). En consecuencia, fueron necesarias grandes inversiones para adaptarse a las necesidades de esta nueva variedad. A pesar de la importancia socioeconómica del cultivo de tabaco en Extremadura, a lo largo de estos años este se ha visto comprometido por varias razones: el recorte de las subvenciones de la Unión Europea, la promulgación de las “leyes antitabaco” que establecieron la prohibición general de fumar en espacios públicos y determinados espacios privados, la prohibición total del patrocinio y de la publicidad, las incertidumbres de los acuerdos de compra de tabaco por las multinacionales cada campaña, el comercio ilegal, las enfermedades del cultivo y la prohibición de numerosos pesticidas, y por último, una mayor regulación en el envasado, etiquetado e ingredientes (Directiva Europea sobre Productos del Tabaco (2014/40/UE). Actualmente, España es el tercer productor de hoja de tabaco de la Unión Europea gracias al éxito de un modelo productivo que funciona con el compromiso de los agricultores, de la industria y de las instituciones de Extremadura (AFI et al., 2017). El cultivo de tabaco es un sector estratégico para la región y el motor económico de las comarcas del norte de Cáceres, ya que genera un gran número de puestos de trabajo y miles de unidades familiares dependen de esta actividad (AFI et al., 2017). Por otra parte, la Organización Interprofesional del Tabaco en 53 Capítulo 1 España (OITAB) ha resaltado la sostenibilidad del cultivo, consecuencia de la inversión en tecnología para lograr una producción de altísima calidad y respetuosa con el medio ambiente. Entre los años 2011 y 2015, los cultivadores de tabaco invirtieron más de 60 millones de euros en sus instalaciones de curado, con el fin de sustituir el empleo de combustibles fósiles por biomasa (AFI et al., 2017). Además, la región extremeña se sitúa a la cabeza en materia de trazabilidad de la hoja de tabaco, regulada por el reciente Decreto 117/2018 para frenar el comercio ilegal y garantizar la procedencia y calidad del producto. En la Orden de 2 de marzo de 2010, por la que se aprueba la Norma Técnica Específica de Producción Integrada de Tabaco, se especifican las prácticas de obligado cumplimiento para los operadores en las fases de producción, primera transformación y comercialización del tabaco en la Comunidad Autónoma de Extremadura. Esta Orden obliga a los productores al establecimiento de un programa de rotación de cultivo. En el Cuadro 1 de la Orden de 2 de marzo de 2010, se recogen las plagas/enfermedades que afectan al cultivo de tabaco, entre ellas, la fusariosis vascular del tabaco (Fusarium oxysporum) que puede aparecer en todas las fases del desarrollo del cultivo. Durante el cultivo de tabaco no se puede aplicar ningún tratamiento químico para combatir la fusariosis, por lo que es necesario utilizar diferentes técnicas para reducir la incidencia de esta enfermedad, como la rotación o la aplicación de fumigantes de suelo antes del establecimiento del cultivo. Bennett et al. (2011) indicaron que los fumigantes de suelo más efectivos para el control de F. oxysporum fueron el bromuro de metilo y la cloropicrina, que actualmente están prohibidos. Ante la necesidad de desinfectar los suelos para evitar pérdidas en la producción, la Comunidad Autónoma de Extremadura amparándose en el art. 53 del Reglamento 1107/2009 ha solicitado la autorización excepcional para el uso y comercialización de productos a base de 1,3 dicloropropeno para la desinfección del suelo en el cultivo de tabaco desde el 1 de marzo al 28 de mayo de 2019 (Consejería de Medio Ambiente y Rural, Políticas agrarias y Territorio). 54 Introducción general 1.1.3.2.2. Síntomas de la fusariosis vascular del tabaco y agente causal Los nematodos formadores de nódulos del género Meloidogyne han constituido durante mucho tiempo uno de los principales problemas fitopatológicos asociados al cultivo de tabaco en el valle del Tiétar (Espárrago, 1999; Navas et al., 2001). En el año 2001 se detectaron por primera vez poblaciones de nematodos formadores de quistes del complejo Globodera tabacum asociados a síntomas característicos de fusariosis vascular (Figura 1.7.A) en tabaco tipo Virginia (Espárrago y Blanco, 2002). Los nematodos formadores de nódulos, Meloidogyne spp., y los nematodos formadores de quistes, G. tabacum, incrementan la severidad de la fusariosis vascular del tabaco al incrementar los lugares de infección para el hongo en las zonas dañadas por los nematodos (LaMondia y Taylor, 1987; LaMondia, 1992). Figura 1.7. A. Parcela de tabaco afectada por fusariosis vascular (Recuperado de Rodríguez-Molina et al., 2009). B. Planta de tabaco con síntomas de la fusariosis vascular: hojas pequeñas y amarillentas, deformes, con nervios principales curvados (Recuperado de Picón-Toro, 2011). Los síntomas observados en las plantas (Figura 1.7.B) fueron: marchitamiento, amarilleamiento y secado de las hojas unilateralmente; hojas enanas y deformadas con nervios centrales curvados; necrosis vasculares en tallos y peciolos de las hojas (Rodríguez-Molina et al., 2007). Del sistema vascular de las plantas enfermas se obtuvieron aislados de F. oxysporum (Figura 1.8.A), que tras ser inoculados con la variedad sensible Ct-681 reprodujeron los síntomas A B 55 Capítulo 1 observados en las plantas enfermas (Figura 1.8.B) (Espárrago et al., 2004; Rodríguez-Molina et al., 2007). Figura 1.8. A. Placa de PDA sembrada con fragmentos de peciolos de hojas de tabaco enfermas de fusariosis vascular (Recuperado de Picón-Toro, 2011). B. Plantas de tabaco de la variedad Ct-681 inoculadas con F. oxysporum aislado de una planta de tabaco afectada por fusariosis vascular (Recuperado de Picón-Toro, 2011). La fusariosis vascular del tabaco puede ser causada por F. oxysporum f. sp. nicotianae, F. oxysporum f. sp. vasiinfectum o F. oxysporum f. sp. batatas (Smith y Shaw, 1943; Armstrong y Armstrong, 1968). Armstrong y Armstrong (1968) excluyeron a F. oxysporum f. sp. nicotianae de la lista de las formas especializadas de F. oxysporum al no encontrar aislados específicos para el tabaco. En Japón se ha descrito una nueva especie, Fusarium kyushuense (Aoki y O'Donnell, 1998), que causa fusariosis vascular del tabaco en China (Wang et al., 2013). Rodríguez-Molina et al. (2007) después de realizar inoculaciones en los hospedadores diferenciales (algodón (Gossypium hirsutum L. var. Acala, batatas (Ipomoea batatas) y tabaco Burley y Virginia), identificaron a F. oxysporum f. sp. batatas como agente causal de la fusariosis vascular del tabaco en Extremadura. Posteriormente, Rodríguez-Molina et al. (2013) comunicaron el hallazgo de la existencia de las razas 1 y 2 de F. oxysporum f. sp. batatas en Extremadura. Estos autores caracterizaron 40 aislados, procedentes del suelo y de plantas enfermas procedentes de campos de cultivo de tabaco, mediante estudios de patogenicidad, grupos de compatibilidad vegetativa (VCG) y amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD). El análisis de patogenicidad permitió clasificar los aislados en dos razas. La raza 1 incluye aislados de tabaco A B 56 Introducción general Burley, patógenos para tabaco, batata y algodón; y a la raza 2 pertenecen los aislados de tabaco Virginia patógenos solo para tabaco Virginia. Los análisis de VCG y RAPD diferenciaron claramente los aislados de la raza 1 de los de la raza 2, sugiriendo que las dos razas de F. oxysporum f. sp. batatas en Extremadura podrían tener distintos orígenes y pertenecer a dos linajes diferentes. 1.1.3.2.2.1. Género Fusarium Link Desde la VII edición del Dictionary of the Fungi (Hawksworth et al., 1995) y hasta la actualidad, el género Fusarium se encuentra situado taxonómicamente en el reino Fungi, dentro del filo Deuteromycota, clase Hyphomycetes, orden Moniliales, familia Tuberculariaceae. El filo Deuteromycota incluye a hongos en fase asexual o con fase sexual desconocida. El género Fusarium engloba a aquellas especies que producen conidias pluricelulares en forma de huso, de hoz y/o de cruasán (Messiaen y Cassini, 1968). Las formas sexuales, cuando se encuentran, se incluyen dentro del orden Hypocreales. El carácter fundamental en la taxonomía de Fusarium es la forma de las macroconidias, aunque también se consideran otras características en la diferenciación de especies, como la presencia/ausencia de microconidias y su forma, la presencia/ausencia de clamidosporas y las características de las células conidiógenas. Las conidias están dispersas en el micelio aéreo o en esporodoquios o masas limosas (pionnotes). Las células conidiógenas en Fusarium pueden ser de dos tipos: monofiálidas o polifiálidas. Las monofiálidas tienen un único poro por el que se liberan las endoconidias, mientras que las polifiálidas presentan varios poros de salida (Booth, 1971). Las especies de Fusarium pueden producir tres tipos de esporas: macroconidias, microconidias y clamidosporas. Las macroconidias son curvadas, pluriseptadas, con una célula apical más o menos puntiaguda y en muchas especies con una célula basal en forma de pie, y se 57 Capítulo 1 pueden producir en monofiálidas y polifiálidas en el micelio aéreo, pero también en monofiálidas cortas agrupadas en estructuras especializadas denominadas esporodoquios. Las microconidias pueden variar en forma (elipsoidales, fusiformes, claviformes, piriformes o subglobosos) y tamaño, se producen en el micelio aéreo, ya sea en grupos o en cadenas, y se pueden originar tanto en monofiálidas como en polifiálidas. Finalmente, las clamidosporas son estructuras de resistencia con paredes engrosadas y alto contenido lipídico; en el caso de estar presentes, pueden ser intercalares o terminales. Algunas especies forman esclerocios irregulares, de color beige, ocre, pardo o gris oscuro. Las colonias pueden tener varios colores: blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado, púrpura, celeste, verde aceituna o pardo. El micelio es ralo o denso, ya sea algodonoso, como un fieltro o con una zona central de funículos, pero en algunos casos es limoso (Burgess et al., 1994; Leslie y Summerell, 2006). Fusarium constituye un género amplio y complejo de hongos causantes de una gran variedad de enfermedades en plantas, produce numerosas micotoxinas y se está convirtiendo en un importante patógeno humano (Jiménez-Fernández, 2011). Las especies de Fusarium se encuentran distribuidas por todo el mundo (Nelson, 1990). La mayoría de ellas se encuentran normalmente en el suelo, ya sea como parásitos de plantas o como saprófitos, aunque también hay especies que son capaces de colonizar las partes aéreas de las plantas (Burgess, 1981). Fusarium es uno de los géneros de hongos fitopatógenos más incidentes y devastadores de cultivos en el planeta en los últimos años (Villa-Martínez et al., 2015), incluye especies patógenas de plantas de gran importancia económica, que ocasionan enfermedades caracterizadas por la aparición de marchitez, tizones, pudriciones en cultivos ornamentales y forestales en ecosistemas agrícolas y naturales (Ma et al., 2013). Fusarium comprende al menos 300 especies filogenéticas genealógicamente exclusivas. Las especies patógenas de plantas se incluyen en cuatro grupos principales: Fusarium fujikuroi especies complex, Fusarium graminearum especies complex, Fusarium solani especies complex y Fusarium oxysporum especies complex (Aoki et al., 2014). 64 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum eficacia de la biofumigación con diferentes especies de Brassicaceae en ensayos en condiciones controladas de laboratorio. En realidad, poco se conoce sobre la relación entre la temperatura y los tipos y cantidades de ITCs liberados por los tejidos de Brassicaceae y, por tanto, entre la temperatura y la eficacia de estos tejidos en la inactivación de los hongos fitopatógenos. 2.2. Objetivo El objetivo principal de este capítulo fue evaluar la susceptibilidad de diferentes estructuras fúngicas de P. nicotianae y F. oxysporum a la toxicidad de los productos liberados por varias especies de Brassicaceae. Además, estudiar los factores que influyen en la respuesta de los hongos frente a estos compuestos tóxicos, como el tipo de material biofumigante (fresco, pellets y harina de semilla), temperatura y tiempo de exposición. Este objetivo general se concretó en dos objetivos más específicos: - Estudiar las diferencias en la inhibición del crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. oxysporum, por compuestos liberados por las partes aérea y subterránea de varias especies de Brassicaceae, pellets de B. carinata (BioFence®) y torta de colza. - Evaluar la inactivación de distintos tipos de inóculo de P. nicotianae y F. oxysporum por el efecto de los productos liberados por especies de Brassicaceae en fresco y pellets de B. carinata (BioFence®) combinados con diferentes condiciones de temperatura (constante o fluctuante). 2.3. Inhibición del crecimiento miceliar de Phytophthora nicotianae y Fusarium oxysporum Con la realización de este ensayo se quería comprobar si las especies de Brassicaceae elegidas por su alto potencial biofumigante, según Kirkegaard y 65 Capítulo 2 Sarwar (1998), eran capaces de inhibir el crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. oxysporum, de cara a utilizar estas mismas especies en el ensayo de campo. Al mismo tiempo, se probaba si existían muchas diferencias de inhibición según la parte de la planta empleada con el objetivo de utilizar las especies que causaran mayor inhibición para ambas partes. 2.3.1. Efecto de la especie de Brassicaceae y parte de la planta empleada como biofumigante 2.3.1.1. Material y métodos Para evaluar la susceptibilidad de P. nicotianae y F. oxysporum a los compuestos biofumigantes liberados por la parte aérea y subterránea de distintas crucíferas, se determinó la inhibición del crecimiento miceliar de aislados de estas dos especies fúngicas. Se estudió la influencia de varios factores: la especie de hongo fitopatógeno, la parte de la planta utilizada y la especie de Brassicaceae. 2.3.1.1.1. Material biofumigante Como material biofumigante se emplearon las especies Brassica nigra L. (mostaza negra), Sinapis alba L. (mostaza blanca), Brassica oleracea L. var. italica (brócoli), Brassica napus L. var. oleifera (colza de primavera) y Capsella bursa-pastoris Moench. (bolsa de pastor). Se ensayó la parte aérea (tallo, hojas, flores y silícuas) y la parte subterránea (raíces) de las plantas de todas las especies menos de C. bursa-pastoris, de la que solo se ensayó la parte aérea. Las especies ensayadas se cultivaron en parcelas de la Finca La Orden desde octubre de 2010 a marzo-abril de 2011 (Figura 2.1), excepto C. bursa-pastoris que se presentó como mala hierba en parcelas sin cultivo. 66 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Figura 2.1. Cultivo de B. nigra en la Finca La Orden (Recuperado de Picón-Toro, 2011). Bellostas et al. (2004) afirmaron que en B. nigra, B. carinata, B. juncea y B. rapa la mayor concentración de GSLs se encontraba en los órganos reproductivos comparada con las partes vegetativas, sugiriendo que el aprovechamiento óptimo como biofumigantes sería cuando se encontraran en las fases más tardías del crecimiento. En base a estas afirmaciones, las plantas utilizadas en el ensayo se recogieron al final del periodo de crecimiento. El estado fenólogico de las plantas fue, según las claves de Berkenkamp (1973): 3.3 (las silicuas inferiores de los racimos empezándose a llenar) en B. nigra y 3.4 - 4.0 (todos los botones florales abiertos y engorde de semillas - semillas en las vainas inferiores de los racimos completamente llenas, transparentes) para el resto de las especies. En relación a B. oleracea, el estado en el que se utilizó la planta fue el de la recolección comercial. 2.3.1.1.2. Material fúngico El material fúngico utilizado fueron 12 aislados: 67 Capítulo 2 - 6 aislados de P. nicotianae: 3 procedentes de plantas de pimiento de los valles del Tiétar y el Alagón (P13, P23 y P32) y 3 procedentes de plantas de tomate de las Vegas del Guadiana (T3, T6 y T8). - 6 aislados de F. oxysporum f. sp. batatas procedentes de plantas de tabaco del valle del Tiétar (Fo-12, F1-B4, F2-C3, F4-A1, F4-B2 y F4-C4). Cada uno de los aislados se desarrolló en medio PDA (Patata Dextrosa Agar) durante 7-10 días. Se tomó una pastilla de 4 mm de diámetro del borde de cada colonia, disponiéndose en una nueva placa de Petri (55 mm de diámetro) con 7,5 ml de PDA. Todas las placas fueron incubadas durante 24 h a 25 ºC y transferidas, pasado este tiempo, a bandejas de plástico de 55 x 35 x 8 cm (largo x ancho x alto) con las partes aérea y subterránea de cada una de las especies biofumigantes, de acuerdo a la metodología propuesta por Morales-Rodríguez et al. (2010). 2.3.1.1.3. Medida de la inhibición del crecimiento miceliar Las plantas se recogieron el mismo día del ensayo, separándose la parte aérea de la subterránea. Las raíces se lavaron con agua para eliminar la tierra de la rizosfera y a continuación, se secaron sobre papel de filtro. Se trocearon por separado las dos partes de la planta (Figura 2.2.A) y en cada bandeja se dispusieron 320 g del material a ensayar, de manera que el material vegetal formara una capa uniforme cubriendo toda la base de la bandeja. Sobre esta capa vegetal se colocó una rejilla de plástico (Figura 2.2.B) con el fin de que los fragmentos vegetales no estuviesen en contacto directo con las placas de medio PDA, evitándose así posibles contaminaciones. Tanto las bandejas como las rejillas se expusieron a luz ultravioleta durante 15 minutos antes de su utilización. 68 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Figura 2.2.A. Triturado de B. oleracea (Recuperado de Picón-Toro, 2011). B. Triturado de B. nigra dispuesto en la bandeja, encima se colocó una rejilla de plástico para minimizar el riesgo de contaminaciones (Recuperado de Picón-Toro, 2011). Sobre estas rejillas se dispusieron las placas de Petri con el disco de siembra y sin tapadera. Para evitar el escape de los compuestos volátiles desprendidos de los tejidos, las bandejas se sellaron con plástico. Con el fin de impedir la desecación del biofumigante, así como del medio de cultivo, se introdujeron en cada una de las bandejas tiras de papel humedecido. En el caso de los testigos, en lugar del material vegetal se colocó en la base de la bandeja papel de filtro humedecido con agua destilada. Las bandejas se incubaron a 25 ºC en condiciones de oscuridad. El diámetro de las colonias se midió a las 72 h, tomándose dos medidas de diámetro perpendiculares de cada una de las placas. Para calcular el porcentaje de inhibición, el crecimiento radial se expresó como porcentaje de la media del crecimiento del testigo. Se estudió el efecto de la parte aérea y subterránea (cuello y raíces) de las especies de B. nigra, S. alba, B. oleracea y B. napus y también el efecto de la parte aérea de C. bursa-pastoris en la inhibición del crecimiento de las dos especies de hongos (P. nicotianae y F. oxysporum). Se realizaron 3 repeticiones por cada parte de la planta y especie de Brassicaceae y 3 repeticiones de testigo por cada especie biofumigante. 2.3.1.2. Análisis estadístico B A 69 Capítulo 2 Para el análisis estadístico los datos se expresaron en tanto por uno, realizándose la transformación ”arcoseno” para cumplir los requisitos de normalidad y homocedasticidad (Sokal y Rohlf, 1995). Posteriormente, los datos se analizaron mediante el Análisis de la Varianza (ANOVA) seguido del test de Tukey para la determinación de grupos homogéneos. Para la realización de los análisis se utilizó el programa estadístico R versión 3.5.1 (R Development Core Team, 2018). 2.3.1.3. Resultados 2.3.1.3.1. Efecto de la especie de Brassicaceae (parte aérea) en la inhibición del crecimiento miceliar Las cinco especies de Brassicaceae inhibieron el crecimiento miceliar de P. nicotianae y de F. oxysporum. En la Figura 2.3 se presenta el porcentaje de inhibición del crecimiento miceliar que produjo cada especie de Brassicaceae en cada especie de hongo. Figura 2.3. Inhibición del crecimiento miceliar (% ± desviación estándar) producido por el efecto de la parte aérea de cada una de las especies biofumigantes para las dos especies de hongos. Para cada especie de hongo, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente (Test de Tukey, P>0,05). 70 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Los resultados del análisis de la varianza con dos factores fijos (especie de hongo y biofumigante) se presentan en la Tabla 2.1. Tabla 2.1. Efecto de la especie de hongo (E), biofumigante (B) y la interacción especie de hongo x biofumigante (ExB) en la inhibición del crecimiento miceliar. ANOVA con dos factores fijos. Fuente SC gl CM F P Especie de hongo (E) 1,80 1 1,80 199,74 0,00 Biofumigante (B) 0,83 4 0,21 23,13 0,00 ExB 0,20 4 0,05 5,57 0,00 Residuos 1,52 169 0,01 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. La inhibición del crecimiento miceliar difirió significativamente entre especies de hongos y entre biofumigantes y fue significativa la interacción especie de hongo x biofumigante. Se realizaron ANOVAs con un factor fijo (especie de hongo) para cada biofumigante, y los resultados se muestran en la Tabla 2.2. Tabla 2.2. Efecto de la especie de hongo (E) en la inhibición del crecimiento miceliar para cada una de las especies biofumigantes. ANOVAs con un factor fijo. Biofumigante Fuente SC gl CM F P B. nigra Especie (E) 0,44 1 0,44 43,91 0,00 Residuos 0,33 33 0,01 S. alba Especie (E) 0,08 1 0,08 8,81 0,00 Residuos 0,3 34 0,00 B. oleracea Especie (E) 0,54 1 0,54 63,01 0,00 Residuos 0,29 34 0,00 B. napus Especie (E) 0,7 1 0,70 132,3 0,00 Residuos 0,18 34 0,00 C. bursa - pastoris Especie (E) 0,23 1 0,23 18,43 0,00 Residuos 0,42 34 0,01 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. Los resultados de los ANOVAs indicaron que para cada una de las especies biofumigantes estudiadas fueron significativas (P<0,05) las diferencias entre las especies de hongos, en todas ellas P. nicotianae presentó un porcentaje de inhibición significativamente (P<0,05) mayor que F. oxysporum. 71 Capítulo 2 Para el estudio del efecto de la especie biofumigante se realizaron ANOVAs con un factor fijo (biofumigante) para cada especie de hongo. El efecto del biofumigante fue significativo tanto para P. nicotianae (F=6,08; P<0,05) como para F. oxysporum (F=28,03; P<0,05), por ello, se realizó un test de comparación de medias de Tukey para cada especie. En las dos especies de hongos se diferenciaron significativamente (P<0,05) varios grupos homogéneos (Figura 2.3). En P. nicotianae las especies biofumigantes que presentaron mayor porcentaje de inhibición fueron C. bursa-pastoris y B. napus, y la que menos B. oleracea. Sin embargo, en el caso de F. oxysporum, fueron las especies C. bursapastoris y S. alba las que más inhibieron y B. oleracea la especie que inhibió menos, como en P. nicotianae. 2.3.1.3.2. Efecto de la parte de la planta empleada y de la especie de Brassicaceae en la inhibición del crecimiento miceliar Tanto la parte aérea como la subterránea de las cuatro especies ensayadas inhibieron el crecimiento miceliar de P. nicotianae y de F. oxysporum. Los resultados del análisis de la varianza con tres factores fijos (especie de hongo, especie biofumigante y parte de la planta) se presentan en la Tabla 2.3. Tabla 2.3. Efecto de la especie de hongo (E), biofumigante (B), parte de la planta empleada (P) y las interacciones especie de hongo x biofumigante (ExB), especie de hongo x parte de la planta (ExP), biofumigante x parte de la planta (BxP) y especie de hongo x biofumigante x parte de la planta (ExBxP) en la inhibición del crecimiento miceliar. ANOVA con tres factores fijos. Fuente SC gl CM F P Especie de hongo (E) 5,00 1 5,00 582,89 0,00 Biofumigante (B) 0,43 3 0,14 16,75 0,00 Parte de la planta (P) 0,66 1 0,66 76,52 0,00 ExB 0,15 3 0,05 5,66 0,00 ExP 0,22 1 0,22 25,15 0,00 BxP 0,12 3 0,04 4,60 0,00 ExBxP 0,08 3 0,03 2,96 0,03 Residuos 2,31 269 0,00 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. 72 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum La inhibición del crecimiento miceliar difirió significativamente entre especies de hongos, biofumigantes y partes de la planta, y fueron significativas todas las interacciones estudiadas. La interacción especie de hongo x parte de la planta fue significativa (P<0,05) y para estudiar las diferencias de susceptibilidad a la parte subterránea de la planta según la especie de hongo, se realizaron ANOVAs con un factor fijo (especie de hongo) para cada biofumigante. Los resultados se muestran en la Tabla 2.4. Tabla 2.4. Efecto de la especie de hongo (E) en la inhibición del crecimiento miceliar para la parte subterránea de las diferentes especies biofumigantes. ANOVAs con 1 factor fijo. Biofumigante Fuente SC gl CM F P B. nigra Especie (E) 0,90 1 0,90 109,03 0,00 Residuos 0,26 32 0,01 S. alba Especie (E) 0,84 1 0,84 73,86 0,00 Residuos 0,39 34 0,01 B. oleracea Especie (E) 0,70 1 0,70 74,41 0,00 Residuos 0,32 34 0,01 B. napus Especie (E) 1,24 1 1,24 182,04 0,00 Residuos 0,23 34 0,01 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. Los resultados de los ANOVAs indicaron que las dos especies de hongos difieren significativamente (P<0,05) en susceptibilidad a cada una de las especies biofumigantes. La inhibición del crecimiento miceliar en P. nicotianae fue significativamente (P<0,05) mayor que en F. oxysporum para todos los biofumigantes (Figura 2.4). 73 Capítulo 2 Figura 2.4. Inhibición del crecimiento miceliar (% ± desviación estándar) de P. nicotianae y F. oxysporum debido al efecto de la parte subterránea de las especies biofumigantes. Para estudiar el efecto de la especie biofumigante y la parte de la planta en la inhibición del crecimiento de P. nicotianae y de F. oxysporum se realizaron ANOVAs con dos factores fijos (biofumigante y parte de la planta) para cada especie de hongo. Los resultados se presentan en la Tabla 2.5. Tabla 2.5. Efecto del biofumigante (B), de la parte de la planta (P) y la interacción biofumigante x parte de la planta (BxP) en la inhibición del crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. oxysporum. ANOVAs con dos factores fijos. Especie de hongo Fuente SC gl CM F P P. nicotianae Biofumigante (B) 0,17 3 0,06 5,46 0,00 Parte de planta (P) 0,81 1 0,81 78,05 0,00 BxP 0,04 3 0,01 1,42 0,24 Residuos 1,39 133 0,01 F. oxysporum Biofumigante (B) 0,39 3 0,13 19,15 0,00 Parte de planta (P) 0,06 1 0,06 9,06 0,00 BxP 0,15 3 0,05 7,27 0,00 Residuos 0,92 136 0,00 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. Para las dos especies de hongos la inhibición del crecimiento miceliar difirió significativamente entre biofumigantes y parte de la planta, y la interacción biofumigante x parte de la planta fue significativa para F. oxysporum, pero no lo 80 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Por ello, como señalaron Kirkegaard y Sarwar (1998) son los tipos de GSLs predominantes en los tejidos aéreos de cada especie los que determinan su potencial biofumigante. Si se considera la parte aérea de los biofumigantes, la especie que más inhibió fue C. bursa-pastoris, mientras B. oleracea fue la que menos, tanto en P. nicotianae como en F. oxysporum. La eficacia de las otras especies biofumigantes varió según la especie de hongo. Estos resultados indican que hay diferencias entre los compuestos liberados por las distintas especies biofumigantes; estas diferencias pueden ser cualitativas, cuantitativas, o de ambos tipos, y son las responsables de la respuesta diferencial de los dos hongos estudiados. Cada especie de Brassicaceae tiene un perfil característico de glucosinolatos que se hidrolizan en sus correspondientes isotiocianatos (Smolinska et al., 2003). C. bursa-pastoris es una mala hierba que aparece asociada a los cultivos de crucíferas. Dada su capacidad biofumigante se podría plantear su explotación como especie biofumigante para incorporar como abono verde. Su escasa producción de biomasa es el principal factor limitante, como ocurre con otras especies de malas hierbas (Kirkegaard y Sarwar, 1998). B. oleracea var. italica fue la especie cuya parte aérea causó la menor inhibición de crecimiento en las dos especies de hongo. Esto pudo deberse, por un lado, a la limitada capacidad de liberar ITCs, ya que aproximadamente solo la mitad de su contenido en GSLs se transforma en ITCs (Kirkegaard y Sarwar, 1998). Por otro lado, al estado fenológico elegido, que no fue el más adecuado, ya que en este estado las concentraciones de GSLs son elevadas en la pella, pero bajas en las hojas (Rangkadilok et al., 2002). Es importante conocer el perfil de glucosinolatos presente en cada especie biofumigante para plantear estrategias eficaces frente a patógenos concretos. Manici et al. (1997) mostraron que los productos de la hidrólisis de GSLs alifáticos como el 3-metilsulfinilpropilo-ITC fueron altamente tóxicos para F. culmorum. Mayton et al. (1996) encontraron que la toxicidad a F. sambucinum estaba 81 Capítulo 2 relacionada con la liberación de ITCs alílicos. El uso de brásicas que produzcan altas concentraciones de GSLs alifáticos con sustituciones de azufre o alílico-GSLs pueden incrementar la eficacia de la biofumigación cuando Fusarium spp. sea el patógeno diana (Lazzeri et al., 2004). Los GSLs predominantes en B. oleracea var. italica son GSLs alifáticos (4- metilsulfinilbutilo-GSL y 3-butenilo-GSL) e indólicos (3-indolmetilo-GSL) (Kushad et al., 1999). B. nigra presenta una elevada concentración de 2-propenilo (GSL alifático) y en B. napus el perfil de GSLs está determinado por bajas concentraciones de GSLs alifáticos (3-butenilo-GSL, 4-pentenilo-GSL y formas hidroxi derivadas de estos) y GSLs aromáticos (feniletilo-GSL). S. alba y especies relacionadas de malas hierbas presentan bajos niveles de GSLs alifáticos y, en cambio, elevadas concentraciones de GSLs aromáticos, principalmente hidroxibenzilo-GSL y feniletilo-GSL, los cuales están ausentes en las otras especies de Brassicaceae (Kirkegaard y Sarwar, 1998). C. bursa-pastoris contiene cantidades significativas de 3-butenilo-ITC (Vaughn y Berhow, 2005) y varios GSLs que no son muy comunes, metilsulfinilalquilo-GSLs (9- metilsulfinilnonilo-GSL y 10-metilsulfinildecilo-GSL) (Daxenbichler et al., 1991). Si se tiene en cuenta el tipo de GSL, aromático o alifático, predominante en las especies biofumigantes y su efecto en la inhibición del crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. oxysporum, no se aprecia una relación clara entre la toxicidad y el tipo de glucosinolato. En este sentido, Smolinska et al. (2003) señalaron que la actividad fungicida de los ITCs está fuertemente determinada por la naturaleza de la estructura molecular, pero esa actividad no está relacionada con el carácter alifático o aromático. Considerando que en las especies de Brassicaceae ensayadas el principal aporte de biomasa es el de la parte aérea, los resultados obtenidos indican que para el control de P. nicotianae la especie más indicada por su eficacia en la inhibición del crecimiento miceliar sería B. napus, aunque también serían recomendables B. nigra y S. alba. Sin embargo, para el control de F. oxysporum la especie más indicada sería S. alba. C. bursa-pastoris sería adecuada para el 82 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum control de los dos patógenos (P. nicotianae y F. oxysporum) pero su escasa producción de biomasa se presenta como factor que limita su aplicación práctica. 2.3.2. Pellets de Brassica carinata (BioFence®) y torta de colza como materiales biofumigantes En el ensayo anterior se había demostrado que las especies de Brassicaceae elegidas eran capaces de inhibir el crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. oxysporum, pero las condiciones edafoclimáticas influían decisivamente en el desarrollo de estas especies en condiciones de campo. No todas las especies germinaban igual y proporcionaban la misma producción de materia verde/seca al final del cultivo, tampoco presentaban la misma resistencia a periodos prolongados de sequía-lluvia. Además, en condiciones de campo no proporcionaban resultados satisfactorios para el control de P. nicotianae, como puede observarse en el apartado 3.4.2. Ante esta situación, había que buscar nuevos materiales biofumigantes cuya acción fuera independiente de las condiciones agroclimáticas, y al mismo tiempo, aseguraran un control eficaz de los patógenos estudiados. Se optó por probar con unos pellets disponibles en el mercado con el nombre comercial de BioFence® (Triumph Italia SPA) y elaborados a partir de harina de semilla de Brassica carinata (Lazzeri et al., 2008). Asimismo, para darle un aprovechamiento se comprobó el efecto fungicida de la harina de semilla de B. napus var. oleifera (torta de colza), subproducto agroindustrial obtenido de la extracción del aceite contenido en las semillas para la producción experimental de biodiesel en la Finca La Orden. 2.3.2.1. Material y métodos Para evaluar la susceptibilidad de P. nicotianae y F. oxysporum a los compuestos biofumigantes liberados por los pellets de B. carinata, BioFence® (Triumph Italia SPA) y la torta de colza (B. napus var. oleifera) se determinó la inhibición del crecimiento miceliar de aislados de estas dos especies fúngicas. Se 83 Capítulo 2 estudió la influencia de varios factores: especie de hongo, dosis empleada y aislado. La metodología utilizada fue una adaptación de la descrita por Morales- Rodríguez (2010). Los materiales biofumigantes (pellets o torta de colza) se distribuyeron uniformemente en el fondo de las bandejas donde fueron triturados. Para facilitar la liberación de los ITCs, se les añadió agua a razón de 3:2 (mbiofumigante: magua) que se mezcló homogéneamente con el biofumigante. A continuación, en cada una de las bandejas se colocó una rejilla de plástico sobre la que se colocaron las placas de Petri con los discos de siembra y sin tapadera. Las bandejas se sellaron con plástico, se incubaron a 25 ºC y a las 72 h se realizaron las medidas del diámetro de las colonias. Se realizaron 3 repeticiones por cada dosis y material biofumigante y 3 repeticiones de testigo por cada biofumigante. Los cálculos de la medida de la inhibición del crecimiento miceliar y el análisis estadístico de los datos se realizaron de la misma forma que en el punto anterior (2.3.1). 2.3.2.1.1. Material biofumigante Como material biofumigante se emplearon pellets de B. carinata (BioFence®) y harina de semilla de B. napus var. oleifera (torta de colza). A. Pellets de B. carinata En primer lugar se evaluó el efecto de los pellets de B. carinata, comercializados como BioFence®, a una dosis inicial de 96 g. Posteriormente, en base a los resultados de inhibición obtenidos con esta dosis inicial y varias pruebas posteriores, la dosis fue significativamente reducida a 0,1875 g de BioFence® con el objeto de obtener inhibiciones similares a las obtenidas al utilizar material fresco de las especies de Brassicaceae. 84 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Se realizaron 3 repeticiones por aislado fúngico y 3 repeticiones de testigo. B. Torta de colza Se evaluó el efecto de la dosis empleada, 24 g y 48 g, en la inhibición del crecimiento de las dos especies de hongos. Se realizaron 3 repeticiones por cada dosis y 3 repeticiones de testigo. Previamente se habían realizado análisis con dosis de 0,1 g, 0,25 g, 0,5 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 6 g y 12 g, pero la inhibición fue muy reducida o nula en la mayoría de los aislados fúngicos. 2.3.2.1.2. Material fúngico El material fúngico utilizado fueron 12 aislados, que se cultivaron en medio PDA: - 6 aislados de P. nicotianae: los mismos que en el apartado 2.2.1.2.2 (P13, P23, P32, T3, T6 y T8). - 6 aislados de F. oxysporum f. sp. batatas procedentes de plantas de tabaco del valle del Tiétar (M22-1, M23-4, M31-3, M32-3, M51-2, M57-3). 2.3.2.2. Resultados 2.3.2.2.1. Efecto de los pellets de B. carinata en la inhibición del crecimiento miceliar La dosis inicial de 96 g de BioFence® inhibió significativamente a las dos especies de hongos, e incluso, la inhibición fue del 100 % en algunos aislados. El análisis de la varianza a una vía (especie) no mostró diferencias significativas de inhibición entre las especies fúngicas para esta dosis (F=1,24; P>0,05). La inhibición media (± desviación estándar) fue del 94,26 ± 3,11 %. Con respecto a la dosis de 0,1875 g, los resultados del análisis de la varianza a una vía (especie) mostraron diferencias significativas de inhibición entre las especies de hongos (F=12,52; P<0,05). La inhibición causada por los 85 Capítulo 2 pellets de B. carinata fue significativamente mayor para P. nicotianae (26,00 ± 14,60 %) que para F. oxysporum (11,00 ± 9,23 %). Los datos mostraron una variabilidad muy alta, que podría estar asociada a la diferente sensibilidad de estos aislados frente a los compuestos, por ello, se hizo un análisis de varianza a una vía (aislado) para cada especie de hongo. Los resultados mostraron diferencias significativas de inhibición entre los aislados de P. nicotianae (F=6,84; P<0,05) y F. oxysporum (F=280,79; P<0,05). Para ambas especies de hongos se diferenciaron dos grupos homogéneos para los aislados de P. nicotianae y cuatro grupos para F. oxysporum (Tabla 2.7). Tabla 2.7. Inhibición del crecimiento miceliar (%) (valor medio ± desviación estándar) de los aislados de las especies fúngicas P. nicotianae y F. oxysporum por el efecto biofumigante de los pellets de B. carinata. Especie de hongo Aislado Inhibición P13 18,42 ± 4,55 b P23 19,04 ± 2,43 b P. nicotianae P32 39,22 ± 2,19 a T3 30,49 ± 3,34 a T6 29,47 ± 10,13 a T8 19,35 ± 6,58 b M22 - 1 6,33 ± 2,06 bc M23 - 4 3,60 ± 0,93 cd M31 - 3 2,70 ± 1,39 d F. oxysporum M32 - 3 42,65 ± 2,58 a M51 - 2 5,26 ± 0,77 bcd M57 - 3 6,74 ± 0,88 b Los aislados de cada especie fúngica seguidos de la misma letra no difieren estadísticamente (P>0,05) de acuerdo al test de Tukey. Los aislados de P. nicotianae y F. oxysporum más sensibles a los compuestos liberados por los pellets de B. carinata fueron P32 y M32-3, respectivamente. Cabe señalar que los aislados de F. oxysporum expuestos a los compuestos volátiles liberados por los pellets de B. carinata mostraron diferencias en la morfología y color con los respectivos aislados sin tratamiento (testigos). 86 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum 2.3.2.2.2. Efecto de la torta de colza en la inhibición del crecimiento miceliar Las dos dosis empleadas de torta de colza (24 y 48 g) inhibieron el crecimiento miceliar de P. nicotianae y de F. oxysporum. Los resultados del análisis de la varianza con dos factores fijos (especie de hongo y dosis) se presentan en la Tabla 2.8. Tabla 2.8. Efecto de la especie de hongo (E), dosis (D) y la interacción especie biofumigante x dosis (ExD) en la inhibición del crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. oxysporum. ANOVA con dos factores fijos. Fuente SC gl CM F P Especie de hongo (E) 0,28 1 0,28 32,85 0,00 Dosis (D) 0,08 1 0,08 9,43 0,00 ExD 0,00 1 0,00 0,08 0,77 Residuos 0,58 68 0,00 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. La inhibición del crecimiento miceliar difirió significativamente entre especies de hongo y dosis empleadas, por el contrario, la interacción de ambos factores no fue significativa. Posteriormente, se realizaron los análisis de la varianza a una vía para cada uno de los factores estudiados. El análisis de la varianza para el factor fijo especie de hongo, mostró diferencias significativas (P<0,05) de inhibición entre las especies (F=29,66). P. nicotianae (33,33 ± 10,97 %) presentó una inhibición significativamente mayor que F. oxysporum (21,47 ± 7,12 %). En relación a la dosis empleada, los resultados del análisis de varianza a una vía indicaron que la inhibición difirió significativamente entre dosis (F=6,54; P<0,05). La dosis de 24 g, que produjo una inhibición media (± desviación estándar) de 24,17 ± 11,42 %, fue significativamente menos efectiva que la de 48 g, con un valor medio de inhibición de 30,64 ± 9,56 %. 87 Capítulo 2 Asimismo, para cada una de las especies fúngicas se estudió la diferencia de sensibilidad entre los aislados, para ello se realizaron ANOVAs a dos vías (aislado y dosis), cuyos resultados se presentan en la Tabla 2.9. Tabla 2.9. Efecto del aislado (A), dosis (D) y la interacción aislado x dosis (AxD) en la inhibición del crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. oxysporum. ANOVAs con dos factores fijos. Especie de hongo Fuente SC gl CM F P P. nicotianae Aislado (A) 0,29 5 0,06 11,36 0,00 Dosis (D) 0,03 1 0,03 6,44 0,02 AxD 0,03 5 0,01 1,09 0,39 Residuos 0,12 24 0,01 Aislado (A) 0,09 5 0,02 9,64 0,00 F. oxysporum Dosis (D) 0,05 1 0,05 27,29 0,00 AxD 0,01 5 0,00 1,25 0,32 Residuos 0,04 24 0,00 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. Los resultados mostraron diferencias significativas de inhibición entre los aislados y dosis para las dos especies de hongos, sin embargo, la interacción aislado x dosis no fue significativa. Posteriormente, se realizó un ANOVA simple a una vía (aislado) para cada especie fúngica (Tabla 2.10) y estos análisis indicaron la existencia de diferencias de inhibición entre los aislados de las dos especies de hongos. A continuación, se realizó un test de comparaciones de medias (Test de Tukey) para cada especie fúngica, agrupándose los aislados en varios grupos homogéneos como puede observarse en la Tabla 2.11. Tabla 2.10. Efecto del aislado (A) en la inhibición del crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. oxysporum. ANOVAs con un factor fijo. Especie de hongo Fuente SC gl CM F P P. nicotianae Aislado (A) 0,29 5 0,06 9,51 0,00 Residuos 0,19 30 0,00 F. oxysporum Aislado (A) 0,09 5 0,02 5,02 0,00 Residuos 0,10 30 0,00 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. 88 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Tabla 2.11. Inhibición del crecimiento miceliar (%) (valor medio ± desviación estándar) de los aislados de las especies fúngicas P. nicotianae y F. oxysporum por el efecto biofumigante de la torta de colza. Especie de hongo Aislado Inhibición P13 36,67 ± 6,28 b P23 38,63 ± 6,76 ab P. nicotianae P32 45,98 ± 7,92 a T3 31,62 ± 5,04 bc T6 19,25 ± 8,72 d T8 27,84 ± 8,74 cd M22 - 1 14,84 ± 8,81 c M23 - 4 19,59 ± 5,04 bc M31 - 3 20,89 ± 3,14 bc F. oxysporum M32 - 3 30,27 ± 7,27 a M51 - 2 19,52 ± 3,07 bc M57 - 3 23,72 ± 4,35 ab Los aislados para cada especie fúngica seguidos de las mismas letras no difieren estadísticamente (Test de Tukey, P>0,05). Al igual que para los pellets de B. carinata, los aislados de P. nicotianae y F. oxysporum más sensibles a los compuestos liberados por la torta de colza fueron P32 y M32-3, respectivamente. Por último, para cada especie fúngica se realizó un análisis de la varianza a una vía (dosis). Los resultados solo mostraron diferencias significativas de inhibición entre las dos dosis para F. oxysporum (F=11,83; P<0,05). El valor medio de inhibición (± desviación estándar) de F. oxysporum a la dosis de 24 g (17,90 ± 6,24 %) fue menor que a 48 g (25,04 ± 6,20 %). Los aislados fúngicos de F. oxysporum en presencia de los compuestos volátiles liberados por los pellets y la torta de colza mostraron diferencias en relación a la morfología y color de sus colonias con respecto a los testigos. 2.3.2.3. Discusión Los pellets de B. carinata y la torta de colza inhibieron el crecimiento miceliar de los aislados de P. nicotianae y F. oxysporum. 89 Capítulo 2 Varios autores han descrito la inhibición del crecimiento miceliar por harina de semillas de brásicas para distintas especies fúngicas: Aphanomyces euteiches (Smolinska et al., 1997), F. oxysporum (Fayzalla et al., 2009; Shaban et al., 2011), Fusarium sambucinum (Mayton et al., 1996), Pythium ultimum (Charan et al., 1999), Rhizoctonia solani (Charan et al., 1999, Fayzalla et al., 2009). Por otra parte, en la literatura científica se ha registrado la inhibición del micelio por el uso de pellets (BioFence®) en P. nicotianae (Morales-Rodríguez et al., 2014; Serrano-Pérez et al., 2017), Phytophthora cinnamomi (Morales-Rodríguez et al., 2016) y Fusarium circinatum (Morales-Rodríguez et al., 2018). Con este último estudio sobre la inhibición del crecimiento miceliar se corrobora que P. nicotianae es más susceptible que F. oxysporum al efecto biofumigante de todos los materiales biofumigantes ensayados (brásicas en verde, torta de colza y pellets (BioFence®). Y como se ha dicho anteriormente, estas diferencias de sensibilidad pueden atribuirse a la composición de la pared celular y estructura de la membrana de cada una de estas especies fúngicas, y que influyen en la penetración de los ITCs en las células. La variación en la sensibilidad a diferentes ITCs no es solo entre especies de hongos, sino que estas diferencias se encuentran también entre aislados de una misma especie (Mari et al. ,1993; Smith y Kirkegaard, 2002). Morales- Rodríguez et al. (2010, 2012) reportaron la existencia de diferencias de inhibición entre aislados de P. nicotianae por el efecto biofumigante de distintas especies de Brassicaceae en fresco y en forma de pellets (Morales-Rodríguez et al., 2014; Serrano-Pérez et al., 2017). En este ensayo, los pellets de B. carinata (BioFence®) inhibieron significativamente el crecimiento de las dos especies de hongos estudiadas, P. nicotianae y F. oxysporum, a una dosis muy baja (0,1875 g) frente a los 320 g utilizados de material fresco. La importancia de este producto comercial radica en la elevada toxicidad que permite inhibir el crecimiento de las especies fúngicas con cantidades mínimas de producto. La cantidad de material fresco utilizada en los ensayos fue de 96 g, a esta dosis de BioFence® se produjo la inhibición del 96 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum ambiente. Posteriormente el medio se filtró por muselina estéril y se centrifugó a 5.000 r.p.m. durante 25 minutos. Tras eliminar el sobrenadante, el precipitado se resuspendió en agua destilada estéril y se mezcló asépticamente con talco a razón de 1 ml de suspensión por 2 g de talco. La mezcla se desecó en un desecador de vidrio y después se trituró antes de ser introducido en un recipiente estéril en el que se conservó a la temperatura ambiente del laboratorio Se determinó la densidad del inóculo de F. oxysporum preparando diluciones seriadas en agua destilada estéril desde 10-1 hasta la 10-6. Por cada dilución preparada se analizaron 10 ml repartidos en 10 placas de Petri a razón de 1 ml por placa. A cada placa se incorporaron 10 ml de medio agar-malta acidificado. Tras homogeneizar el contenido de las placas, estas se incubaron a 25 ºC y oscuridad durante cuatro días, pasado este tiempo se contabilizaron las colonias. La concentración del inóculo-talco empleado fue de 3,05·107 u.f.c.·ml- 1 . 2.4.1.1.4. Cuantificación del inóculo de Fusarium oxysporum Para cuantificar el inóculo viable en los 5 g de tierra de las bolsas después del tiempo de incubación en las distintas condiciones se siguió el método descrito por Tello et al. (1991) y Rodríguez-Molina (1996) basado en añadir una pequeña cantidad de tierra a analizar al medio selectivo de Komada (1975) en fusión. Así, los 5 g de tierra contenidos en cada bolsa se extendieron en una placa de Petri (55 mm de diámetro) para la desecación a temperatura ambiente durante 3 días. Previo al análisis, se trituraron las muestras de tierra con un mortero de porcelana y se tamizaron con un tamiz de 200 m de luz. Tanto el mortero como el tamiz se desinfectaron entre muestra y muestra flameando con alcohol. Por cada muestra muestra de tierra a analizar se prepararon cuatro tubos eppendorf de 1 ml con una cantidad de tierra comprendida entre 0,8640 g y 0,9206 g. El medio Komada se enfrió hasta 40-42 ºC y se dispensó en placas de Petri de vidrio (90 mm) a razón de 8 ml por placa y en fusión se añadió la tierra contenida en cada uno de los tubos, homogeneizándose con ligeros movimientos. Las placas se incubaron a 25-28 ºC bajo luz fluorescente continua durante 5 días. 97 Capítulo 2 Pasado este tiempo, se contaron las colonias desarrolladas en cada placa (Figura 2.10) y los resultados fueron expresados en u.f.c.·g-1 de tierra. Figura 2.10. Placas de vidrio con colonias de F. oxysporum sobre medio Komada. A: en posición normal. B: en posición invertida (Imágenes recuperadas de Picón-Toro, 2011). 2.4.2. Análisis estadístico Para el análisis estadístico los datos relativos al porcentaje de inactivación se expresaron en tanto por uno, realizándose posteriormente la transformación “arcoseno” para cumplir los requisitos de normalidad y homocedasticidad (Sokal y Rohlf, 1995). En el resto de los datos no se realizó transformación para el análisis estadístico de los mismos. Posteriormente, los datos se analizaron mediante el análisis de varianza seguido del test de Tukey para la determinación de grupos homogéneos. Para la realización de los análisis se utilizó el paquete de software R versión 3.5.1 (R Development Core Team, 2018). 2.4.3. Efecto de las especies de Brassicaceae, pellets de B. carinata y de la temperatura constante y fluctuante Con el objeto de evaluar las condiciones óptimas para la inactivación del inóculo se ensayaron los materiales biofumigantes en diferentes regímenes de temperatura constante y fluctuante. A B 98 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum A. Ensayo en condiciones de temperatura constante con especies de Brassicaceae Se estudió el efecto de la inactivación en el triturado miceliar de P. nicotianae y el inóculo-talco de F. oxysporum, inoculados a razón de 103 u.f.c.·g- 1 y 105 u.f.c. g-1 de tierra, respectivamente. Se ensayaron dos condiciones de temperatura constante, 20 ºC y 25 ºC, durante un periodo de 14 días. Como material biofumigante se empleó la parte aérea (tallos, hojas, flores y silicuas) de 3 especies de Brassicaceae: B. nigra, S. alba y C. bursa-pastoris. El estado fenológico de las plantas en el momento de realizar el ensayo fue, según las claves de Berkenkamp (1973): 4.4 (todas las semillas marrones en las silicuas inferiores de los racimos) en B. nigra, 3.0 (apertura de primeras flores en la yema terminal) en S. alba y 4.5 (todas las semillas marrones en las silículas superiores de los racimos) en C. bursa-pastoris. A.1. Resultados Las tres especies de Brassicaceae inactivaron parte del inóculo de P. nicotianae y de F. oxysporum. Los resultados del análisis de la varianza con tres factores fijos (especie de hongo, especie biofumigante y temperatura) realizado para estudiar el efecto de los factores en la inactivación del inóculo se presentan en la Tabla 2.12. 99 Capítulo 2 Tabla 2.12. Efecto de la especie de hongo (E), el biofumigante (B), la temperatura (Tª) y las interacciones especie de hongo x biofumigante (ExB), especie de hongo x temperatura (ExTª), biofumigante x temperatura (BxTª) y especie de hongo x biofumigante x temperatura (ExBxTª) en la inactivación del inóculo. ANOVA con tres factores fijos. Fuente SC gl CM F P Especie de hongo (E) 9,47 1 9,47 360,55 0,00 Biofumigante (B) 16,93 2 8,47 532,61 0,00 Temperatura (Tª) 14,00 1 14,00 322,22 0,00 ExB 6,05 2 3,03 115,17 0,00 ExTª 4,08 1 4,08 155,27 0,00 BxTª 1,69 2 0,86 32,17 0,00 ExBxTª 0,52 2 0,26 9,89 0,00 Residuos 7,59 289 0,03 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. La inactivación del inóculo difirió significativamente entre especies de hongos, biofumigantes y temperaturas y fueron significativas todas las interacciones. Por ello, se realizaron análisis de varianza con dos factores fijos (biofumigante y temperatura) para cada especie de hongo ensayada y los resultados se presentan en la Tabla 2.13. Tabla 2.13. Efecto del biofumigante (B), de la temperatura (Tª) y la interacción biofumigante x temperatura (BxTª) en la inactivación del inóculo de P. nicotianae y F. oxysporum. ANOVAs con dos factores fijos. Especie de hongo Fuente SC gl CM F P P. nicotianae Biofumigante (B) 23,16 2 11,58 329,85 0,00 Temperatura (Tª) 17,20 1 17,20 490,00 0,00 BxTª 2,04 2 1,02 29,11 0,00 Residuos 7,16 204 0,04 F. oxysporum Biofumigante (B) 0,50 2 0,25 48,78 0,00 Temperatura (Tª) 0,20 1 0,20 40,10 0,00 BxTª 0,17 2 0,08 16,36 0,00 Residuos 0,43 85 0,00 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad 100 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Para las dos especies de hongos la inactivación del inóculo difirió significativamente entre biofumigantes y temperaturas, y fue significativa la interacción biofumigante x temperatura. En el caso de P. nicotianae, para cada temperatura se realizó un ANOVA con un factor fijo (biofumigante) seguido de un test de comparaciones múltiples de Tukey. El efecto de la especie biofumigante fue significativo tanto a 20 ºC (F=57,76; P<0,05) como a 25 ºC (F=306,07; P<0,05). Y se diferenciaron significativamente (P<0,05) dos grupos homógeneos para cada temperatura (Figura 2.11), y el orden de los biofumigantes, de mayor a menor inactivación del inóculo, fue el mismo para las dos temperaturas: C. bursa-pastoris = B. nigra > S. alba. Se realizaron ANOVAs con un factor fijo (temperatura) para cada especie biofumigante. El efecto de la temperatura fue significativo para B. nigra (F=665,15; P<0,05), S. alba (F=21,104; P<0,05) y C. bursa-pastoris (F=521,19; P<0,05). En la Figura 2.11 se observan claramente diferencias en la inactivación del inóculo entre las dos temperaturas ya que para todas las especies biofumigantes la inactivación a 25 ºC fue mayor que a 20 ºC. Figura 2.11. Inactivación del inóculo de P. nicotianae (% ± desviación estándar) producido por cada una de las especies biofumigantes para las dos temperaturas ensayadas. Para cada temperatura, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente (Test de Tukey, P<0,05). 101 Capítulo 2 Igual que en el caso de P. nicotianae, para F. oxysporum, se realizó un ANOVA con un factor fijo (biofumigante) para cada temperatura seguido de un test de comparaciones múltiples de Tukey. El efecto de la especie biofumigante fue significativo tanto a 20 ºC (F=50,16; P<0,05) como a 25 ºC (F=13,32; P<0,05). Para la temperatura de 20 ºC, se diferenciaron significativamente (P<0,05) tres grupos homogéneos (Figura 2.12), y el orden de los biofumigantes de mayor a menor efecto en la inactivación del inóculo fue el siguiente: C. bursapastoris > S. alba > B. nigra. Sin embargo, a 25 ºC, solo se diferenciaron dos grupos homogéneos: C. bursa-pastoris > S. alba = B. nigra. Para estudiar el efecto de la temperatura se realizó un ANOVA con un factor fijo (temperatura) para cada una de las especies biofumigantes. Los resultados de los ANOVAs indican que no hay diferencias significativas entre temperaturas para S. alba (F=1,81; P>0,05) y C. bursa-pastoris (F=3,55; P>0,05) y si para B. nigra (F=40,23; P<0,05), siendo significativamente mayor la inactivación a 25 ºC (99,0 ± 1,0 %) que a 20º C (94,3 ± 3,7 %). Figura 2.12. Inactivación del inóculo de F. oxysporum (% ± desviación estándar) producido por cada una de las especies biofumigantes para las dos temperaturas ensayadas. Para cada temperatura, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente (Test de Tukey, P>0,05). 102 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum A.2. Discusión Los resultados obtenidos en este ensayo indican que las distintas especies de Brassicaceae y la temperatura influyeron en la inactivación del inóculo de P. nicotianae y de F. oxysporum. Así, se observaron diferencias en la inactivación del inóculo en función de la especie de hongo, la temperatura y la especie biofumigante ensayada. Las especies de Brassicaceae ensayadas a 20 y 25 ºC produjeron inactivación del inóculo de P. nicotianae y F. oxysporum, lo que indica que a esas temperaturas relativamente bajas respecto a las de solarización, los tejidos de las Brassicaceae liberan compuestos volátiles que son tóxicos para los propágulos fúngicos. Se observaron diferencias de susceptibilidad entre las dos especies de hongos, mostrándose F. oxysporum más sensible que P. nicotianae a las dos temperaturas constantes ensayadas. Sin embargo, en el estudio de la inhibición del crecimiento miceliar descrito en el punto 2.3. del presente capítulo, F. oxysporum se mostró menos sensible que P. nicotianae a las especies de Brassicaceae en fresco, pellets de B. carinata y torta de colza . Las diferencias en susceptibilidad observadas entre especies pueden estar relacionadas con los distintos tipos de inóculo de cada especie empleados en cada ensayo. A diferencia de los ensayos de inhibición de crecimiento miceliar, en los ensayos de inactivación se emplean inóculos compuestos por distintos tipos de propágulos. En el triturado de micelio de P. nicotianae se pueden encontrar fragmentos de micelio, esporangios, zoosporas y clamidosporas, y el inóculo-talco de F. oxysporum según Couteaudier (1989) está constituido principalmente por microconidias de pared simple (40 %) y microconidias de doble pared (38 %) denominadas microclamidosporas. Smolinska et al. (2003) realizaron un estudio para evaluar la sensibilidad de cuatro aislados de F. oxysporum en distintos etapas de desarrollo a la exposición de ITCs puros. Los resultados indicaron que para esta especie, la inhibición del crecimiento miceliar fue relativamente pequeña, sugiriendo que el micelio representa una etapa bastante resistente en el ciclo de vida del patógeno. Del mismo modo, la formación de conidias tampoco 103 Capítulo 2 se vio afectada por los ITCs. Por el contrario, la germinación de conidias y clamidosporas se redujo considerablemente por el efecto de los ITCs, concluyendo que estas dos etapas del ciclo de vida de F.oxysporum son las más susceptibles a los tratamientos biofumigantes. La susceptibilidad de P. nicotianae según la fase del ciclo de vida parece diferir de lo observado en F. oxysporum, ya que Greenhalgh y Mitchell (1976) señalan que el efecto del propenilo-ITC en el micelio de P. nicotianae debería ser más perjudicial que en los esporangios, porque el micelio es una etapa activa mientras que la etapa de esporangio no. Los resultados obtenidos indican que en el caso de F. oxysporum los compuestos volátiles liberados a temperaturas relativamente bajas (20 y 25 ºC) inactivan más del 90 % del inóculo en todos los casos. C. bursa-pastoris fue la especie más eficaz a ambas temperaturas y tan solo en el caso de B. nigra la inactivación a 25 ºC fue significativamente mayor que a 20 ºC. Dado que las densidades de inóculo empleadas en los ensayos son muy superiores a las detectadas habitualmente en suelos naturales (Nash y Snyder, 1965; Tello y Lacasa, 1990; Vázquez, 1990; Rodríguez-Molina, 1996), los resultados obtenidos sugieren que la biofumigación con las especies de Brassicaceae ensayadas, podría ser una estrategia de control de la fusariosis vascular del tabaco eficaz por si misma, sin necesidad de combinarla con solarización. Son necesarios ensayos en condiciones de campo, en suelos naturalmente infectados con F. oxysporum f. sp. batatas, para confirmar la eficacia real de la biofumigación. En el caso de P. nicotianae la inactivación a 25 ºC fue significativamente mayor que a 20 ºC para las tres especies de Brassicaceae. S. alba fue la especie menos efectiva a ambas temperaturas, mientras que a 25 ºC se llegó a la inactivación del 100 % del inóculo con B. nigra y C. bursa-pastoris. Por tanto, aunque a ambas temperaturas hay liberación de volátiles, los compuestos liberados por las tres especies a 25 ºC son más eficaces en la inactivación, probablemente porque sea mayor la cantidad liberada a esta temperatura. Las diferencias de eficacia detectadas entre las especies de Brassicaceae pueden estar asociadas al estado fenológico en que se encontraban las plantas 104 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum utilizadas en el ensayo. S. alba presentaba un estado 3.0, B. nigra 4.4 y C. bursapastoris 4.5. Los niveles de glucosinolatos y los compuestos relacionados varían durante el desarrollo de la planta y entre los tejidos de la planta (Clossais- Besnard y Larher, 1991; Rosa et al., 1996). B. Ensayo en condiciones de temperatura fluctuante con especies de Brassicaceae. Condiciones de biosolarización y biofumigación en Murcia y Extremadura Con este ensayo se pretendía indagar más sobre las condiciones reales de las técnicas de biofumigación y biosolarización en Murcia y Extremadura para el control de P. nicotianae en campo. Para ello, se estudió la inactivación de las clamidosporas de P. nicotianae (500 clamidosporas·g-1 de tierra.) por el efecto de varias especies de Brassicaceae ensayadas en diferentes regímenes de temperatura fluctuantes. Se ensayaron tres regímenes de temperaturas diarias fluctuantes durante 14 días. Para establecer estos regímenes se emplearon los datos de las temperaturas registradas en el suelo en ensayos previos de biofumigación realizados en Extremadura y en Murcia en 2008 y 2009, respectivamente. El cálculo de los diferentes regímenes se hizo estableciendo intervalos de 2,5 ºC entre los valores mínimos y máximos de temperatura registradas por las sondas. Por cada intervalo de temperatura fijado se calculó el número de horas acumuladas en todo el periodo estudiado y se relativizaron a día de 24 horas. Se establecieron tres regímenes de temperaturas fluctuantes diarias: - T1 (temperaturas elevadas): 4 h a 30 ºC, 8 h a 33 ºC, 8 h a 37 ºC y 4 h a 40 ºC. Corresponde a las condiciones de biosolarización con estiércol fresco de oveja en invernadero en Murcia en el mes de agosto. - T2 (temperaturas intermedias): 4 h a 27 ºC, 12 h a 30 ºC y 8 h a 33 ºC. Corresponde a las condiciones de biosolarización con vinaza de remolacha en invernadero en Murcia en el mes de agosto. 105 Capítulo 2 - T3 (temperaturas bajas): 7,5 h a 14 ºC, 12 h a 16 ºC y 4,5 h a 19 ºC. Corresponde a las condiciones de biofumigación con especies de Brassicaceae en marzo al aire libre en Extremadura. El material biofumigante empleado fue la parte aérea (tallos, hojas, flores y silicuas) de 5 especies de Brassicaceae: B. nigra, S. alba, B. oleracea var. botrytis, B. carinata y C. bursa-pastoris. El estado fenológico de las plantas en el momento de realizar el ensayo fue, según las claves de Berkenkamp (1973): 4.0 (semillas en las silicuas inferiores de los racimos completamente llenas, transparentes) en B. nigra, 3.3 (silículas inferiores de los racimos empezándose a llenar) en S. alba, 2.4 (botones florales amarilleando) en B. carinata y 5.0 (silículas marrones y quebradizas; tallos secos) en C. bursa-pastoris. En B. oleracea el estado fenológico correspondía al de la recolección comercial. B.1. Resultados a) Régimen de temperaturas elevadas (T1). En T1 las cinco especies biofumigantes inactivaron totalmente el inóculo, pero en el testigo no biofumigado hubo una supervivencia del 11 % (55 ± 55 u.f.c.·g-1 de tierra). b) Régimen de temperaturas medias (T2). En T2 la inactivación del inóculo fue total con todos los biofumigantes, excepto con B. carinata, con una supervivencia del 51 % del inóculo (257 ± 132 u.f.c.·g-1 de tierra); en el testigo la supervivencia fue del 73 % (365 ± 189 u.f.c.·g-1 de tierra). c) Régimen de temperaturas bajas (T3). En T3 ninguna especie biofumigante inactivó totalmente el inóculo, aunque para todos los biofumigantes, incluyendo el testigo, se produjo inactivación de parte de este. 112 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum inóculo para la temperatura y el tiempo pero la interacción de ambos factores no fue significativa (Tabla 2.15). Tabla 2.15. Efecto de la temperatura (Tª) y tiempo de exposición (T) y la interacción temperatura x tiempo (TªxT) en la inactivación del inóculo-talco de F. oxysporum. ANOVA con dos factores fijos. Fuente SC gl CM F P Temperatura (Tª) 0,95 1 0,94 15,5 0,00 Tiempo (T) 1,60 3 0,53 8,75 0,00 TªxT 0,12 3 0,04 0,67 0,58 Residuos 6,10 100 0,06 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. Posteriormente, se realizaron ANOVAs a una vía para los factores temperatura y tiempo. El ANOVA a una vía (temperatura) mostró diferencias de inactivación entre temperaturas (F=12,81; P<0,05). La inactivación a 30 ºC (20,48 ± 26,08 %) fue significativamente menor que a 25 ºC (37,61 ± 24,40 %). El ANOVA a una vía (tiempo) presentó diferencias de inactivación entre los tiempos de exposición ensayados (F=8,64; P<0,05). Posteriormente, el test de comparaciones múltiples agrupó los tiempos en tres grupos homogéneos; la inactivación promedio (± desviación estándar) a las 24 horas fue de 34,16 ± 18,84 % ab; a las 48 horas igual a 43,25 ± 22,22 % a; a los 7 días fue de 29,89 ± 20,13 % b; y a los 14 días igual a 10,22 ± 32,78 % c. La inactivación más elevada del inóculo de F. oxysporum se produjo cuando el inóculo estuvo expuesto a los compuestos volátiles liberados por los pellets durante 48 horas. Con respecto a la especie P. nicotianae, se realizó un análisis de varianza a tres vías (tipo de inóculo, temperatura y tiempo de exposición) que se presenta en la Tabla 2.16. Los resultados mostraron diferencias significativas de inactivación entre tipos de inóculo, temperatura y tiempos de exposición, además, todas las interacciones fueron significativas. Dados estos resultados, se 113 Capítulo 2 estudió para cada temperatura el efecto del tipo de inóculo, tiempo de exposición e interacción de ambos factores (Tabla 2.17). Tabla 2.16. Efecto del tipo de inóculo de P. nicotianae (I), temperatura (Tª) y tiempo de exposición (T) y las interacciones tipo de inóculo x temperatura (IxTª), tipo de inóculo x tiempo (IxT), temperatura x tiempo (TªxT) y tipo de inóculo x temperatura x tiempo (IxTªxT) en la inactivación. ANOVA con tres factores fijos. Fuente SC gl CM F P Inóculo (I) 3,70 1 3,70 149,28 0,00 Temperatura (Tª) 25,33 1 25,33 1021,27 0,00 Tiempo (T) 1, 4 4 3 0, 4 8 19,35 0,00 IxTª 0, 49 1 0,49 19,64 0,00 IxT 3,18 3 1,06 42,75 0,00 TªxT 29, 14 3 9, 71 391,60 0,00 IxTªxT 4,05 3 1,35 54, 48 0,00 Residuos 14,2 4 574 0,0 3 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad Tabla 2.17. Efecto del tipo de inóculo (I), tiempo de exposición (T) y la interacción tipo de inóculo x tiempo (IxT), en la inactivación de P. nicotianae a las dos temperaturas ensayadas. ANOVAs con dos factores fijos. Temperatura (Tª) Fuente SC gl CM F P 25 ºC Inóculo (I) 4,02 1 4,02 375,00 0,00 Tiempo (T) 20,59 3 6,87 640 , 90 0,00 IxT 3,82 3 1,27 118,70 0,00 Residuos 3,01 282 0,01 30 ºC Inóculo (I) 1, 17 1 1, 17 30,41 0,00 Tiempo (T) 11,01 3 3,67 95,50 0,00 IxT 2,44 3 0,81 21,19 0,00 Residuos 11,22 292 0,04 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. Los resultados de los ANOVAs presentados en la Tabla 2.17 mostraron que para las dos temperaturas ensayadas fue significativo el efecto del tipo de inóculo, tiempo de exposición y la interacción de ambos factores. Posteriormente, se estudió la interacción para cada temperatura. 114 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Para el estudio de la interacción a 25 ºC se realizaron los correspondientes ANOVAs a una vía. Los ANOVAs a una vía (tipo de inóculo) mostraron diferencias significativas de inactivación entre los tiempos de exposición para el inóculo triturado-miceliar (F=394,42; P<0,05) y el inóculo-clamidosporas (F=368,88; P<0,05). A continuación, se realizó el test de comparaciones múltiples para cada tipo de inóculo. Con respecto al inóculo triturado miceliar se diferenciaron cuatro grupos homogéneos y tres para el inóculo clamidosporas (Figura 2.14). Figura 2.14. Inactivación del inóculo triturado miceliar y clamidosporas de P. nicotianae (% ± desviación estándar) producido por los pellets de B. carinata a 24 h, 48 h, 7 días y 14 días a la temperatura de 25 ºC. Para cada tipo de inóculo, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente (Test de Tukey, P>0,05). La inactivación del inóculo-triturado miceliar fue disminuyendo a medida que aumentó el tiempo en el que el inóculo estuvo expuesto al material biofumigante, siendo máxima la inactivación a 24 horas y mínima o inexistente a los 14 días. Sin embargo, para las clamidosporas la inactivación fue máxima a 48 horas, se observó un descenso de la inactivación conforme aumentó el tiempo de exposición del inóculo frente al material biofumigante. 115 Capítulo 2 Los ANOVAs a una vía (tiempo de exposición) mostraron diferencias significativas de inactivación entre los dos tipos de inóculo para todos los tiempos excepto para el tiempo 24 horas (Tabla 2.18). A 25 ºC, el inóculo-clamidosporas presentó una inactivación mayor que el triturado miceliar para todos los tiempos, salvo a 24 horas que no presentó diferencias de inactivación con respecto al triturado miceliar. Tabla 2.18. Efecto del tipo de inóculo (I) en la inactivación de P. nicotianae por los pellets de B. carinata a los tiempos de exposición 24 h, 48 h, 7 días y 14 días a la temperatura de 25 ºC. ANOVAs con un factor fijo. Tiempo (T) Fuente SC gl CM F P 24 h Inóculo (I) 0,00 1 0,00 0,02 0,89 Residuos 0,65 78 0,01 48 h Inóculo (I) 5,62 1 5,62 663,50 0,00 Residuos 0,66 78 0,01 7 días Inóculo (I) 0,27 1 0,27 22,29 0,00 Residuos 0,93 78 0,01 14 días Inóculo (I) 2,84 1 2,84 175,40 0,00 Residuos 0,76 48 0,02 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. De igual manera, se estudió la interacción tipo de inóculo x tiempo de exposición a 30 ºC. Para ello, se hicieron ANOVAs a una vía (tipo de inóculo) que indicaron la existencia de diferencias significativas de inactivación del triturado miceliar (F=101,25; P<0,05) y de las clamidosporas (F=16,78; P<0,05) para los tiempos de exposición. Posteriormente, se compararon las medias mediante el test de Tukey, diferenciándose tres y cuatro grupos homogéneos para las clamidosporas y triturado miceliar, respectivamente (Figura 2.15). 116 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Figura 2.15. Inactivación del inóculo triturado miceliar y clamidosporas de P. nicotianae (% ± desviación estándar) producido por los pellets de B. carinata a 24 h, 48 h, 7 días y 14 días a la temperatura de 30 ºC. Para cada tipo de inóculo, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente (Test de Tukey, P>0,05). En general, para ambos tipos de inóculo de P. nicotianae la inactivación fue mayor conforme aumentó el tiempo de exposición a los compuestos liberados por el material biofumigante (Figura 2.15). A 30 ºC, se alcanzó el máximo de inactivación a los 14 días para el triturado miceliar, mientras que para las clamidosporas no hubo diferencias significativas de inactivación entre los tiempos 7 y 14 días. Tabla 2.19. Efecto del tipo de inóculo (I) en la inactivación de P. nicotianae por los pellets de B. carinata a los tiempos de exposición 24 h, 48 h, 7 días y 14 días a la temperatura de 30 ºC. ANOVAs con un factor fijo. Tiempo (T) Fuente SC gl CM F P 24 h Inóculo (I) 1,45 1 1,45 60,43 0,00 Residuos 1,87 78 0,02 48 h Inóculo (I) 1,56 1 1,56 61,66 0,00 Residuos 1,98 78 0,03 7 días Inóculo (I) 0,61 1 0,61 10,17 0,00 Residuos 4,05 68 0,06 14 días Inóculo (I) 0,52 1 0,52 10,62 0,00 Residuos 3,32 68 0,05 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. 117 Capítulo 2 Los ANOVAs a una vía (tiempo de exposición) mostraron diferencias significativas de inactivación entre los dos tipos de inóculo de P. nicotianae (clamidosporas y triturado miceliar) para todos los tiempos de exposición (Tabla 2.19). A 30 ºC, la inactivación de P. nicotianae fue significativamente mayor en las clamidosporas que en el triturado miceliar a 24 h, 48 h y 7 días. Solamente la inactivación por los pellets fue superior en el triturado miceliar respecto de las clamidosporas en el tiempo 14 días. b. Efecto de la temperatura constante en la supervivencia del inóculo en los testigos de P. nicotianae y F. oxysporum a diferentes tiempos de exposición En este ensayo los datos relativos a los testigos a 0h, 24 h, 48 h, 7 y 14 días nos permitía evaluar el efecto de la temperatura y tiempo de exposición en la supervivencia del inóculo. Por ello, se realizó un análisis de la varianza a dos vías (temperatura y tiempo de exposición) para estudiar el efecto de estos factores en la supervivencia del inóculo de los testigos de las dos especies fúngicas. 1. Inóculo-talco de F. oxysporum La supervivencia del inóculo-talco en los testigos solamente presentó diferencias significativas (P<0,05) entre los tiempos de exposición (Tabla 2.20). Tabla 2.20. Efecto de la temperatura (Tª) y el tiempo de exposición (T) en la supervivencia del inóculo-talco en los testigos de F. oxysporum. ANOVA con dos factores fijos. Fuente SC gl CM F P Temperatura (Tª) 1,01 · 10 7 1 1,01 · 10 7 0,27 0,6 0 Tiempo (T) 6,50 · 10 8 4 1,62 · 10 8 4,32 0,00 TªxT 1,08 · 10 7 4 2,70 · 10 7 0,72 0,58 Residuos 5,38 · 10 9 143 3,76 · 10 7 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. 118 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum El test de comparaciones múltiples de Tukey permitió diferenciar significativamente (P<0,05) dos grupos homogéneos entre los tiempos de exposición, la supervivencia promedio ± desviación estándar a 0 h fue de 13.910 ± 6.271 u.f.c.·g-1 de tierra ab; 24 horas: 16.251 ± 6.842 u.f.c.·g-1 de tierra b; 48 horas: 16.572 ± 5.223 u.f.c.·g-1 de tierra b; 7 días : 13.988 ± 3.946 u.f.c.·g- 1 de tierra ab; 14 días: 10.899 ± 7.426 u.f.c.·g-1 de tierra a. De acuerdo a estos resultados, la supervivencia del inóculo-talco de F. oxysporum a los 14 días fue significativamente menor que a 24 y 48 horas. 2. Triturado miceliar de P. nicotianae Al estudiar el efecto de la temperatura y tiempo de exposición en la supervivencia del inóculo-triturado miceliar en los testigos de P. nicotianae se observaron diferencias significativas (P<0,05) de supervivencia entre temperaturas y tiempos de exposición, además la interacción de ambos factores fue significativa (Tabla 2.21). Tabla 2.21. Efecto de la temperatura (Tª) y el tiempo de exposición (T) en la supervivencia del inóculo-triturado miceliar en los testigos de P. nicotianae. ANOVA con dos factores fijos. Fuente SC gl CM F P Temperatura (Tª) 1,94 · 10 8 1 1,94 · 10 8 1882,10 0,00 Tiempo (T) 6,85 · 10 7 4 1,71 · 10 7 166,00 0,00 TªxT 5,70 · 10 7 4 1,42 · 10 7 138,20 0,00 Residuos 3,69 · 10 7 358 1,03 · 10 5 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. Dado que la interacción temperatura x tiempo de exposición fue significativa (P<0,05) se estudió por separado cada uno de los factores. Para ello se realizó un ANOVA con un factor fijo (tiempo de exposición) para cada temperatura. Los resultados indicaron la existencia de diferencias en la supervivencia del inóculo-triturado miceliar entre los tiempos de exposición para la temperatura de 25 ºC (F=148,30; P<0,05) y 30 ºC (F=31,27; P<0,05). Se realizó un test de comparaciones múltiples de Tukey para cada una de las 119 Capítulo 2 temperaturas; a 25 ºC se diferenciaron 4 grupos homogéneos y a 30 ºC solamente dos (Figura 2.16). A 25 ºC la supervivencia del inóculo fue máxima a los 7 días y mínima a 0 h, mientras que a 30 ºC la supervivencia fue mínima a 0 h y para el resto de tiempos no hubo diferencias significativas de supervivencia (Figura 2.16). Figura 2.16. Supervivencia del inóculo-triturado miceliar en los testigos de P. nicotianae (u.f.c.·g-1 ± desviación estándar) a 0 h, 24 h, 48 h, 7 días y 14 días bajo las temperaturas de 25 ºC y 30 ºC. Para cada temperatura, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente (Test de Tukey, P>0,05). Además, para cada tiempo de exposición se realizó un ANOVA con un factor fijo (temperatura) y los resultados se recogen en la Tabla 2.22. Para todos los tiempos de exposición las diferencias de supervivencia del inóculo entre temperaturas fueron significativas (P<0,05) (Tabla 2.22). La supervivencia del inóculo del triturado-miceliar en los testigos de P. nicotianae fue significativamente mayor a 25 ºC que a 30 ºC para todos los tiempos de exposición. 120 Evaluación in vitro de técnicas para el control de P. nicotianae y F. oxysporum Tabla 2.22. Efecto de la temperatura (Tª) en la inactivación del inóculo-triturado miceliar de P. nicotianae a los tiempos de exposición de 0 h, 24 h, 48 h, 7 días y 14 días. ANOVAs con un factor fijo. Tiempo (T) Fuente SC gl CM F P 0 h Temperatura (Tª) 4,51·10 6 1 4,51·10 6 782,20 0,00 Residuos 4,4 4 · 10 5 77 5,77 · 10 3 24 h Temperatura (Tª) 7,11·10 6 1 7,11·10 6 725,30 0,00 Residuos 6,6 7 · 10 5 68 9,81 · 10 3 48 h Temperatura (Tª) 6,71·10 7 1 6,71·10 7 2123,00 0,00 Residuos 2,1 4 · 10 6 68 3,16 · 10 4 7 días Temperatura (Tª) 1,16·10 8 1 1,16·10 8 241,00 0,00 Residuos 3, 26 · 10 7 68 4,80 · 10 5 14 días Temperatura (Tª) 4,29·10 7 1 4,29·10 7 3221,00 0,00 Residuos 1,02·10 7 77 1,33·10 4 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. 3. Clamidosporas de P. nicotianae Al igual que para el triturado miceliar, la supervivencia del inóculoclamidosporas de P. nicotianae mostró diferencias significativas de supervivencia entre temperaturas y tiempos de exposición, también la interacción de ambos factores fue significativa (Tabla 2.23). Tabla 2.23. Efecto de la temperatura (Tª) y el tiempo de exposición (T) en la supervivencia del inóculo-clamidosporas en los testigos de P. nicotianae. ANOVA con dos factores fijos. Fuente SC gl CM F P Temperatura (Tª) 1,06 · 10 8 1 1,06 · 10 8 870 ,10 0,00 Tiempo (T) 7,29 · 10 7 4 1,82 · 10 7 149,3 0 0,00 TªxT 5, 19 · 10 7 4 1,30 · 10 7 1 06,3 0 0,00 Residuos 4,51 · 10 7 369 1 ,22 · 10 5 SC: suma de cuadrados. gl: grados de libertad. CM: cuadrados medios. F: F-Fisher. P: probabilidad. Para el estudio de la interacción temperatura x tiempo se analizó por separado cada uno de los factores, realizándose un ANOVA con un factor fijo (tiempo de exposición) para cada temperatura. Como en el inóculo-triturado miceliar, la supervivencia del inóculo-clamidosporas mostró diferencias 121 Capítulo 2 significativas entre los tiempos de exposición para la temperatura de 25 ºC (F=133,20; P<0,05) y 30 ºC (F=43,70; P<0,05). Posteriormente, para cada una de las temperaturas se diferenciaron varios grupos homogéneos entre los tiempos de exposición de acuerdo al test de Tukey (Figura 2.17). A 25 ºC la supervivencia fue máxima a los 7 días y mínima a las 0 h, mientras que a 30 ºC la supervivencia fue máxima a los 7 días y mínima a los 14 días. Figura 2.17. Supervivencia del inóculo-clamidosporas en los testigos de P. nicotianae (u.f.c.·g-1 ± desviación estándar) a 0 h, 24 h, 48 h, 7 días y 14 días incubados a las temperaturas de 25 ºC y 30 ºC. Para cada temperatura, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente (Test de Tukey, P>0,05). Asimismo, para cada tiempo de exposición se realizó un ANOVA considerando la temperatura como factor fijo (Tabla 2.24). Según los resultados recogidos en la Tabla 2.23, el inóculo mostró diferencias de supervivencia entre las temperaturas (25 ºC y 30 ºC) para todos los tiempos de exposición. La supervivencia del inóculo-clamidosporas en los testigos de P. nicotianae fue significativamente mayor a 25 ºC que a 30 ºC para todos los tiempos de exposición excepto para el tiempo 0 h. 129 Capítulo 3 3.1. Introducción Phytophthora nicotianae es el principal agente causal de la tristeza de pimiento en Cáceres (Rodríguez-Molina et al., 2010b). El cultivo de pimiento para pimentón es un cultivo de primavera-verano en esta región. Una opción ideal para el control de P. nicotianae sería cultivar especies de Brassicaceae durante el otoño-invierno y, en primavera, aplicar los tratamientos de solarización, biofumigación y biosolarización solos o en combinación con pellets (BioFence®) o harinas de semilla para el control del agente causal, aproximadamente un mes antes del trasplante de plantas de pimiento para pimentón. Los cultivos de brásicas son muy interesantes en Extremadura por rotar con los cultivos de verano, aumentar el nivel de utilización de la tierra y ser compatibles con las condiciones edafoclimáticas. Para optimizar las técnicas de biofumigación y de biosolarización es necesario elegir especies de Brassicaceae con un elevado potencial biofumigante, es decir, con una alta producción de biomasa y una elevada concentración de GSLs en los tejidos, así como, poseer la capacidad de liberar la mayor cantidad de ITCs. Asimismo, el cultivo de determinadas especies de brásicas, como la coliflor o el brócoli, permitirían un doble aprovechamiento: la explotación comercial de las pellas y la incorporación al suelo de los restos vegetales como material biofumigante. Previamente, en el capítulo anterior se ha demostrado la eficacia de varios materiales biofumigantes en el control de P. nicotianae. La biofumigación con material fresco de especies de Brassicaceae y los sistemas de rotación incrementan la materia orgánica del suelo, mejoran la estructura y controlan la erosión (Matthiessen y Shackleton, 2005). No obstante, esta práctica presenta varios aspectos negativos, como las costosas actividades agrícolas durante el cultivo, la pérdida de al menos un ciclo de producción con la consiguiente pérdida de ingresos (Lazzeri et al., 2008), la variación en la producción de biomasa y la dependencia de los factores climáticos y edáficos (Rodríguez-Molina et al., 2015). Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 130 La aplicación de harina de semilla de brásicas como material biofumigante permite la reutilización de residuos agroindustriales y tiene varias ventajas con respecto a los abonos verdes, como la disponibilidad durante todo el año y su bajo contenido de humedad, lo que permite almacenarla con un perfil estable de GSL (Rodríguez-Molina et al., 2015). Además, es posible alcanzar un control más rigoroso sobre las dosis de aplicación, así como una distribución más uniforme en el perfil del suelo (Mazzola y Zhao, 2010). El uso de biofumigantes en pellets (BioFence®) supera varias de las limitaciones de la biofumigación con materiales vegetales frescos, como tener que romper los tejidos antes de incorporarlos al suelo para que tenga lugar la hidrólisis y posterior liberación de ITCs, además, permite aprovechar concentraciones de GLSs imposibles de alcanzar mediante la aplicación de abonos verdes (Lazzeri et al., 2008). La adición de enmiendas orgánicas mejora las propiedades físico-químicas y la fertilidad del suelo, influye en las comunidades microbiológicas y disminuye indirectamente las enfermedades fúngicas mediante la alteración de la microbiota del suelo, además, promueve el desarrollo de microorganismos supresores (Zaccardelli et al., 2013). 3.2. Objetivo El objetivo general de este capítulo fue evaluar, en condiciones de campo en primavera, el efecto de distintos tratamientos de solarización, biofumigación, y biosolarización usando diferentes especies de Brassicaceae (en forma de abono verde, harina de semilla o pellets), en la supervivencia e infectividad del inóculo de P. nicotianae. Además, estudiar el efecto de estos tratamientos en las propiedades físico-químicas del suelo, en la producción de pimiento para pimentón y en la composición cualitativa y cuantitativa de la microbiota fúngica del suelo. 131 Capítulo 3 3.3. Finca experimental El ensayo de campo se realizó en una de las parcelas (X: 702328; Y: 4303769) de la finca experimental Finca La Orden (38º 51' 36000'' N, 06º 39' 55000'' W), perteneciente al Instituto de Investigaciones Científicas Finca La Orden-Valdesequera, que forma parte del Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX). La Finca La Orden está situada en el término de Lobón, en las Vegas Bajas del Guadiana (Badajoz), con una superficie de 205 ha (95 ha de regadío y 110 ha de secano) dedicadas fundamentalmente a ensayos con diferentes cultivos agrícolas. La principal causa de degradación de los suelos de la Finca La Orden y de las Vegas del Guadiana, con pendientes inferiores al 1 %, es el bajo contenido en materia orgánica que provoca una inestabilidad estructural que se ve reflejada por un encostramiento del suelo, aumento de la compactación y reducción de la permeabilidad, lo que conlleva a frecuentes encharcamientos del terreno. El ensayo de campo se estableció en un suelo de tipo Alfisol Typic Haploxeralf, según la taxonomía de USDA-Soil Taxonomy (Jiménez et al., 1976). Este suelo presenta una textura franco-arenosa, con las siguientes proporciones: 59,8 % de arena, 13,5 % de arcilla y 26,7 % de limo. Algunos parámetros químicos fueron determinados al inicio del establecimiento del ensayo, presentando los siguientes valores medios: 0,51 % de materia orgánica oxidable, 45 ppm de fósforo asimilable y 0,11 meq/100 g de potasio. El clima de las Vegas del Guadiana es mediterráneo semi-árido. Los valores medios de las variables meteorológicas durante los años en los que se realizaron los experimentos (2008-2012) fueron los siguientes: a) Tª media anual: 16,13 ºC; b) precipitación media anual: 498 mm; c) humedad media relativa: 88,56 % (http://www.redarexplus.gobex.es). Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 132 3.4. Material y métodos 3.4.1. Diseño experimental En el ensayo de campo se planteó un diseño de bloques al azar con 4 repeticiones, y parcelas elementales de 5 x 5 m, separadas por pasillos de 3 m (Figura 3.1.). Los tratamientos de solarización, biofumigación y biosolarización se realizaron en la misma parcela de la Finca La Orden durante cuatro años consecutivos, desde 2008 a 2012, siguiendo, de forma general, las operaciones que se describen a continuación. Figura 3.1. Diseño experimental del ensayo de campo. Imagen de las parcelas elementales de 5 x 5 m, separadas por pasillos de 3 m en la Finca La Orden (Esta tesis). Previo a la implantación del ensayo, en las dos primeras campañas, se realizó un aporte de compost a razón de 20 t·ha-1 que se incorporó al terreno con un pase de rotovator en los primeros 20-25 cm del suelo. En la Tabla 3.1 se recoge el análisis químico de la enmienda orgánica (compost) utilizada en cada una de las campañas. Cada campaña, para evitar la presencia de malas hierbas, competidoras de estas especies biofumigantes, se aplicó un tratamiento herbicida con Trifluralina a una dosis de 1,5 l·ha-1. Posteriormente, se marcaron las parcelas y se abonaron las parcelas con 8- 15 -15 (N-P-K) a razón de 600 kg·ha- 1, no aplicándose abono en las parcelas testigo. Se sembraron las especies biofumigantes que fueron diferentes para cada campaña y al final del cultivo, en el mes de marzo, fueron incorporadas al suelo, marcando el inicio de los 133 Capítulo 3 tratamientos de biofumigación, biosolarización y solarización para evaluar la infectividad y supervivencia del inóculo de Phytophthora nicotianae. Previamente a la incorporación de las especies al suelo, se midió la producción de biomasa de las especies. Para realizar la medida de producción se utilizó un marco de 0,50 x 0,50 m, y se calculó la materia verde y seca producida e incorporada al suelo para cada una de las especies. Las especies biofumigantes se incorporaron al suelo mediante una labor de rotovator (Figura 3.2) a una profundidad de 20-30 cm. Tabla 3.1. Análisis químico de la enmienda orgánica (compost) aplicada al suelo previo al establecimiento del ensayo de campo en las Campañas 2008-2009 y 2009- 2010. Parámetro Campaña 2008 - 2009 Campaña 2009 - 2010 Materia orgánica total 16,34 % 14,00 % Relación C/N 6,634 8,336 Nitrógeno total 1,20 % 0,79 % Nitrógeno orgánico 1,10 % 0,75 % Potasio soluble en agua 1,78 % K 2 O 0,56 % K 2 O Fósforo sol. citrato amónico neutro 0,8 % P 2 O 5 0,75 % P 2 O 5 Calcio total 1,46 % CaO 1,70 % CaO Magnesio total 0,52 % MgO 0,65 % MgO Sodio total 3085 ppm 1309 ppm Azufre total 0,5 % SO 3 __ Cobre total 11 ppm 17 ppm Hierro total 7532 ppm 6027 ppm Manganeso total 240 ppm 213 ppm Zinc total 63 ppm 82 ppm Extracto húmico total 4,72 % 4,12 % Ácidos húmicos 3,20 % 2,60 % Fósforo soluble en ácidos minerales 0,93 % P 2 O 5 0,99 % P 2 O 5 Humedad 32,20 % 45,10 % Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 134 Figura 3.2. Incorporación de especies biofumigantes al suelo mediante labor de rotovator en el mes de marzo (Esta tesis). En cada parcela elemental se introdujeron bolsas de tierra infectada con clamidosporas de P. nicotianae (sondas biológicas) a 15 cm y 30 cm de profundidad, se establecieron tres repeticiones por parcela. Además, se registró la temperatura y la humedad del suelo a estas dos profundidades para cada uno de los tratamientos aplicados. Tras el enterrado de sondas, tanto biológicas como de temperatura y humedad, se regaron las parcelas mediante aspersión durante 2 horas para favorecer el sellado del suelo e impedir el escape de los ITCs. Posteriormente, se colocaron los plásticos (polietileno transparente de 0,05 mm de grosor) en aquellas parcelas cuyos tratamientos lo requerían. Una vez finalizados los diferentes tratamientos a finales del mes de abril, se procedió a levantar los plásticos (Figura 3.3) y retirar las sondas de temperatura, humedad y biológicas, estas últimas para su análisis en el laboratorio. 135 Capítulo 3 Figura 3.3. Levantamiento de plásticos de las parcelas tratadas al finalizar el periodo de desinfección (Esta tesis). Varios días después del levantamiento de plásticos, en cada una de las parcelas del ensayo se recogieron muestras compuestas de tierra para su análisis químico. Posteriormente, se realizaron labores con chisel, rotovator y conformador para preparar el terreno, previo a la instalación del cultivo de pimiento para pimentón. Después de estas labores, se reconstruyeron las parcelas elementales, se abonaron con 9 -18 -27 (N-P-K) a razón de 400 kg ha- 1 y se instaló el riego por goteo. Una vez comprobado el funcionamiento del sistema de riego, se trasplantaron las plantas de pimiento para pimentón C. annuum var. Jaranda usando un marco de 0,70 x 0,30 m. Durante el desarrollo del cultivo de pimiento (Figura 3.4), se aplicó el abonado de cobertura mediante fertirrigación. La cantidad de abono líquido, dosificado en cuatro veces, fue de 48 l N20, 54 l P15 y 72 l K15. Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 136 Figura 3.4. Cultivo de pimiento para pimentón en parcelas previamente tratadas mediante biofumigación, biosolarización y solarización en la Finca La Orden (Esta tesis). A primeros de septiembre, se hicieron las medidas de producción de pimiento total, verde y rojo por parcela, estimándose la producción media ± desviación estándar para ver si había diferencias significativas entre los tratamientos. Una vez realizadas todas las medidas, se segaron las plantas de pimiento con una picadora-segadora de forraje, y se incorporaron los residuos vegetales al suelo mediante pase cruzado de gradas. Para evaluar los parámetros físico-químicos del suelo se tomaron muestras compuestas de suelo al inicio del establecimiento del ensayo (octubre de 2008) y después de finalizar los tratamientos en cada una de las campañas, en el mes de mayo. Además, al inicio de cada una de las campañas se hicieron medidas in situ de la resistencia a la penetrabilidad y densidad aparente por triplicado. En la Figura 3.5 se representa un cronograma general de las principales actividades realizadas en cada una de las campañas del estudio. 137 Capítulo 3 Figura 3.5. Cronograma general de las actividades desarrolladas en cada una de las campañas del ensayo de campo. Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 144 Las medidas de resistencia a la penetrabilidad y densidad aparente no se pudieron realizar al inicio del establecimiento del ensayo (octubre de 2008) debido a las continuas lluvias, por lo que se tuvieron que realizar “excepcionalmente” en el mes de febrero en los tratamientos testigo. Estas mediciones se repitieron en octubre de 2009, antes de establecer el nuevo ensayo de campo. El cronograma de las principales actividades desarrolladas en la Campaña 2008-2009 se recoge en la Figura 3.8. 145 Capítulo 3 Figura 3.8. Cronograma general de las actividades desarrolladas en la Campaña 2008-2009. Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 146 A.1. Resultados I. Supervivencia e infectividad La supervivencia de P. nicotianae fue muy elevada, en el 97,06 % de las muestras analizadas el inóculo sobrevivió. Del análisis mediante regresión logística se obtuvo el siguiente modelo que permite calcular la probabilidad de supervivencia del inóculo. Supervivencia= 𝑒, 1+𝑒, Este modelo reduce significativamente la desviación (P<0,05) y el p-valor de los residuos (P>0,05) indica que no existe una pérdida de ajuste significativa, por tanto, el modelo es útil para predecir la probabilidad de supervivencia del inóculo. Ninguna de las variables estudiadas (profundidad y tratamiento) fueron estadísticamente significativas (P<0,05) para explicar la supervivencia del inóculo, es decir, ni la profundidad ni los tratamientos aplicados influyeron en la supervivencia del inóculo. En relación a la variable infectividad, el 37,92 % de las muestras analizadas provocaron enfermedad en las plantas del bioensayo. El modelo obtenido por regresión logística fue igual a: Infectividad = 𝑒, ,.. 1+𝑒,,.. Este modelo redujo significativamente la desviación (P<0,05) y permite predecir la probabilidad de infectividad del inóculo de P. nicotianae. De las variables explicativas, solo el tratamiento de biofumigación con B. oleracea influyó significativamente (P<0,05) en la reducción de la infectividad. Este tratamiento redujo 1,22 veces la probabilidad de que el inóculo produzca enfermedad en la planta de pimiento. Por el contrario, ni la profundidad ni el resto de tratamientos influyeron en la variable respuesta estudiada, la infectividad del inóculo. 147 Capítulo 3 La tabla de contingencia (Tabla 3.2) permite estudiar la relación entre las variables supervivencia e infectividad del inóculo de P. nicotianae. En esta tabla se presentan las frecuencias observadas para cada una de las diferentes categorías (0 y 1) de las variables. Tabla 3.2. Tabla de contingencia para estudiar la relación entre la supervivencia e infectividad del inóculo de P. nicotianae durante la campaña 2008-2009. Supervivencia Infectividad 0 1 0 2 145 1 5 86 Para conocer si existía relación entre las variables estudiadas se realizó un contraste de hipótesis mediante la prueba de χ2 de Pearson. Según los resultados de este contraste, las variables supervivencia y la infectividad no están relacionadas significativamente a un nivel de significación del 0,05. II. Temperatura Las temperaturas registradas durante la desinfección del suelo se comportaron de forma similar a ambas profundidades para todos los tratamientos, aunque las fluctuaciones diarias fueron mayores a 15 cm que a 30 cm. Las temperaturas medias fueron bajas, inferiores a 25 ºC en todos los tratamientos, y las temperaturas máximas oscilaron entre 36,2 ºC (B. oleracea + P, 15 cm) y 20,0 ºC (B. nigra, 30 cm). El análisis de la varianza a dos vías (tratamiento y profundidad) presentó diferencias significativas (P<0,05) de temperatura media para los factores tratamiento (F=165,12) y profundidad (F=9,05), la interacción tratamiento x profundidad fue significativa (F=3,18). Se realizaron ANOVAs con un factor fijo (tratamiento) y los resultados indicaron que las temperaturas medias no difirieron significativamente entre profundidades, excepto para los tratamientos B. oleracea + P y Testigo + P. Estos Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 148 tratamientos presentaron una mayor temperatura a 15 cm que a 30 cm, siendo las diferencias de temperatura entre ambas profundidades igual a 2,1 ºC para B. oleracea + P y 1,4 ºC para el tratamiento Testigo + P. Los ANOVAs con un factor fijo (profundidad) mostraron que para las dos profundidades había diferencias significativas de temperatura entre los tratamientos. Para cada profundidad se diferenciaron varios grupos homogéneos entre los tratamientos de acuerdo al test de mínima diferencia significativa (LSD) de Fisher (Tabla 3.3). Tabla 3.3. Temperatura media del suelo ± desviación estándar a 15 y 30 cm de profundidad en los tratamientos ensayados en la primavera de 2009. Temperatura (º C) Tratamiento 15 cm 30 cm B. carinata 16,0 ± 1,9 a 15,8 ± 1,5 a B. carinata + P 21,6 ± 2,2 b 20,8 ± 2,0 c B. oleracea 16,4 ± 1,9 a 16,1 ± 1,4 ab B. oleracea + P 23,5 ± 2,5 c 21,4 ± 2,4 cd B. nigra 16,0 ± 1,5 a 15,8 ± 1,4 a B. nigra + P 21,7 ± 2,1 b 22,2 ± 2,8 d S. alba 16,0 ± 1,6 a 16,8 ± 1,8 b S. alba + P 21,2 ± 3,0 b 20,7 ± 2,8 c Testigo 16,2 ± 1,8 a 16,0 ± 1,4 ab Testigo + P 22,8 ± 2,3 c 21,4 ± 2,2 cd Para cada profundidad los tratamientos seguidos de la misma letra no difieren estadísticamente (P>0,05) según el test de mínima diferencia significativa (LSD) de Fisher. La temperatura de los tratamientos con plástico difirió significativamente de la de los tratamientos sin plástico a las dos profundidades. La diferencia de temperatura a 15 y 30 cm por el efecto del plástico fue de 6,1 ºC y 5,4 ºC, respectivamente. Solamente el 7,5 % del tiempo de aplicación de los tratamientos la temperatura fue superior a 25 ºC. El tratamiento B. oleracea + P presentó el mayor número de horas acumuladas en el intervalo de temperatura 25 -35 ºC, y además, fue el único tratamiento que superó los 35 ºC (10 horas). 149 Capítulo 3 A.2. Discusión En esta primera campaña la supervivencia del inóculo de P. nicotianae fue muy elevada y no se vio afectada ni por los tratamientos aplicados ni por la profundidad a la que fue enterrado el inóculo. Por el contrario, la infectividad del inóculo (38 %) fue relativamente baja en relación a la supervivencia del mismo (97 %), no observándose relación entre ambas variables. No solo la infectividad fue inferior a la supervivencia sino también esta variable fue influenciada por el tratamiento B. oleracea, que redujo la incidencia de la enfermedad. Las temperaturas medias registradas durante el periodo de aplicación de los tratamientos fueron bajas, inferiores a 25 ºC, y pudieron favorecer la germinación de las clamidosporas y facilitar la multiplicación del inóculo ya que estas temperaturas son próximas a la temperatura óptima de crecimiento (26 ºC) de P. nicotianae (Morales-Rodríguez, 2011). Picón-Toro (2011) observó la multiplicación del inóculo de P. nicotianae a temperaturas constantes, 20 y 25 ºC, siendo la multiplicación mayor a 25 ºC. Coelho et al. (2000) señalaron que las clamidosporas de P. nicotianae pueden sobrevivir a exposiciones de 35 ºC durante 480 h. Las temperaturas registradas están muy alejadas de las reportadas por otros autores para los tratamientos de biosolarización y solarización. Lombardo et al. (2012) indicaron que durante la solarización se alcanzaron temperaturas medias de 43,1 ºC y 43,2 ºC y temperaturas máximas de 46,2 ºC y 48 ºC. En el año 2010, los ensayos realizados en invernaderos de Murcia por Lacasa et al. (2015) registraron temperaturas por encima de 35 ºC entre 723 y 930 horas en tratamientos de biosolarización con crucíferas, mientras que en este ensayo solo se superaron los 35 ºC durante 10 horas en uno de los tratamientos (B. oleracea + P). Las especies biofumigantes, combinadas con o sin plástico, tampoco redujeron el inóculo de P. nicotianae. No obstante, Picón-Toro et al. (2012a) observaron en condiciones in vitro que diferentes especies de Brassicaceae inactivaron el inóculo a temperaturas de 20 y 25 ºC. A pesar de que estas temperaturas son relativamente bajas, los tejidos vegetales liberaron Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 150 compuestos volátiles que fueron tóxicos para el inóculo de P. nicotianae. La inactivación fue diferente para las distintas especies empleadas, Capsella bursapastoris y Brassica nigra inactivaron el 100 % del inóculo a 25 ºC. A pesar de que estas temperaturas son relativamente bajas, los tejidos vegetales liberaron compuestos volátiles que fueron tóxicos para el inóculo de P. nicotianae. Las especies utilizadas en el ensayo de campo fueron elegidas por su potencial biofumigante, alto contenido de GSLs, elevada producción de biomasa y previamente habían sido ensayadas en condiciones in vitro. La biomasa incorporada para cada una de las especies fue variable, solo los tratamientos con las especies B. carinata y S. alba incorporaron cantidades similares a la recomendada (50 t·ha-1) por Bello et al. (2004). No obstante, ni la especie ni la cantidad de materia incorporada afectaron a la supervivencia del inóculo. Borek et al. (1995) indicaron que la eficiencia de conversión de GSLs a ITCs en el suelo podría ser tan baja como del 15 %. La hidrólisis de los GSLs y, por lo tanto, la formación de ITCs en el suelo es dependiente del nivel de maceración de los tejidos vegetales (Morales-Rodríguez et al., 2014). Morra y Kirkegaard (2002) obtuvieron muy bajas concentraciones de ITCs en el suelo tras la incorporación de brásicas (B. juncea y B. napus), solamente detectaron el 1 % de la concentración de ITCs prevista a partir de tejidos con alta concentración de GSLs. Mattner et al. (2008) no encontraron niveles detectables de ITCs en el suelo tras la incorporación de cosechas biofumigantes mediante rotovator. Por otra parte, Doheny-Adams et al. (2018) resaltan que los resultados de laboratorio basados en la toxicidad de ITCs no son siempre traducidos en resultados de campo. Los ITCs generados varían en la vida media, reactividad, volatilidad y porcentaje de absorción por la materia orgánica, lo que provoca comportamientos complejos en el suelo. En consecuencia, las dosis efectivas son variables y dependen de factores ambientales (tipo y densidad del suelo, humedad y temperatura) y factores biológicos (especie vegetal, etapa de crecimiento, tipo de tejido y estación). 151 Capítulo 3 En relación a la infectividad, esta fue muy baja en comparación con la supervivencia del inóculo. Solamente el tratamiento B. oleracea redujo la infectividad, aproximadamente 1,22 veces. La baja incidencia de la enfermedad puede ser atribuida a varios factores: la incapacidad del patógeno para producir enfermedad, la baja concentración del inóculo y la “supresividad de enfermedad” del suelo (Weller et al., 2002), esta puede ser natural o estar relacionada con los cambios microbiológicos experimentados en el suelo por la aplicación de diferentes tratamientos. B. Campaña 2009-2010 Inicialmente los tratamientos iban a ser iguales a los de la primera campaña, de hecho, el 26 de octubre de 2009 se sembraron las mismas especies a las mismas dosis de siembra que en el año 2008. Sin embargo, la germinación de las semillas y el desarrollo de los cultivos fueron muy irregulares debido a las condiciones meteorológicas, y finalmente, se descartó el aprovechamiento de los cultivos de B. carinata y B. oleracea var. botrytis. Los tratamientos ensayados fueron:1) B. nigra /B. nigra + Plástico; 2) S. alba / S. alba + Plástico; 3) Testigo / Testigo + Plástico. El 23 de marzo de 2010 se incorporaron las especies cultivadas al suelo y se enterraron las sondas biológicas, de temperatura y humedad. Previamente se había medido la producción media de materia verde/seca ± desviación estándar (n=8) de las especies: B. nigra: 4,37 ± 0,40 / 0,94 ± 0,08 kg·m-2 y S. alba: 1,78 ± 0,70 / 0,45 ± 0,16 kg·m-2. Los estados fenológicos de las especies, de acuerdo a las claves de Berkenkamp, fueron los siguientes: 1) B. nigra: 4.2 (semillas en las silicuas inferiores de color verde oscuro); 2) S. alba: 3.2 (todas las yemas florales abiertas y aumento de tamaño de semillas). La finalización del periodo de desinfección tuvo lugar el día 4 de mayo de 2010 con el levantamiento de plásticos y la retirada de sondas de temperatura, humedad y biológicas. Dos días después se recogieron las muestras de suelo de cada parcela para el análisis químico, con el objetivo de determinar las posibles Evaluación de técnicas para el control de P. nicotianae en condiciones de campo 152 diferencias en los parámetros antes y después de aplicar los tratamientos. A mediados del mes de mayo se preparó el terreno mediante laboreo para el trasplante de pimiento que se realizó el 19 de mayo de 2010, finalizando el cultivo el 13 de septiembre de 2010 con la medida de producción de pimiento rojo y verde. Posteriormente, se segó el cultivo de pimiento e incorporó al suelo mediante pase cruzado de gradas. A mediados del mes de octubre se realizaron las medidas de los parámetros físicos: densidad aparente y resistencia a la penetrabilidad. En la Figura 3.9 se representa el cronograma de las principales actividades realizadas durante esta campaña. 153 Capítulo 3 Figura 3.9. Cronograma general de las actividades desarrolladas en la Campaña 2009-2010. 256 Discusi ón general biofumigantes que causaran la mayor inhibición para ambas partes, para posteriormente ser utilizadas en el ensayo de campo. Se observó que la parte subterránea de las especies biofumigantes ensayadas era más eficaz que la parte aérea en la inhibición de P. nicotianae, pero el orden de eficacia era el mismo para las dos partes de la planta. Sin embargo, para F. oxysporum no se observaron diferencias de inhibición entre las dos partes excepto para B. oleracea, cuya parte subterránea causó mayor inhibición. Todas las especies biofumigantes ensayadas inhibían el crecimiento de las especies fúngicas, sin embargo, no todas eran igual de eficaces. Por otra parte, en condiciones de campo, no todas las especies germinaban igual y producían la misma cantidad de materia verde/seca al final del cultivo. Ante esta situación se optó por buscar nuevos materiales más estables, de fácil adquisición y que evitasen el cultivo de las brásicas, como los pellets de B. carinata (BioFence®) y torta de colza, cuya acción sería independiente de las condiciones agroclimáticas y fuesen más efectivas en el control de los patógenos. Tanto los pellets como la torta de colza inhibieron a las dos especies fúngicas pero a dosis muy inferiores en comparación con las empleadas con el material fresco. Además, los aislados de P. nicotianae y F. oxysporum mostraron diferencias de sensibilidad a los compuestos liberados por los pellets y la torta de colza. Previamente ya había sido descrito la existencia de diferencias de inhibición entre aislados de P. nicotianae por el efecto biofumigante de distintas especies de Brassicaceae en fresco (Morales-Rodríguez et al., 2010, 2012) y en forma de pellets (Morales-Rodríguez et al., 2014; Serrano-Pérez et al., 2017). Cabe señalar que P. nicotianae se mostró más sensible que F. oxysporum a todos los materiales ensayados, posiblemente debido a las diferencias de composición de la pared celular y estructura de la membrana entre ambas especies (Bartnicki-Garcia, 1987). Los pellets de B. carinata fueron los materiales más eficaces en la inhibición del crecimiento miceliar de P. nicotianae y F. 257 Capítulo 4 oxysporum. Estos resultados eran prometedores, en el sentido que su uso podría asegurar la inactivación del inóculo sin necesidad de cultivar las especies de Brassicaceae, y en consecuencia, se ahorrarían todos los costes derivados del cultivo. No obstante, había que demostrar el efecto de los pellets en condiciones de campo. Por otro lado, era importante comprobar si los compuestos liberados por las especies de Brassicaceae (en fresco) eran capaces de inactivar los distintos tipos de inóculo de P. nicotianae y F. oxysporum. Primero se demostró que las especies biofumigantes ensayadas en fresco inactivaron el inóculo de ambas especies fúngicas a temperaturas relativamente bajas (20 y 25 ºC). Para F. oxysporum no se observaron diferencias de inactivación entre temperaturas salvo para B. nigra que presentó mayor inactivación a 25 ºC. Sin embargo, el efecto fue mayor a 25 ºC que a 20 ºC para P. nicotianae, probablemente porque a esta temperatura la inactivación del inóculo pudo ser superior y, además, podría haberse liberado una mayor cantidad de compuestos volátiles. En un segundo experimento se ensayaron las especies de Brassicaceae a temperaturas fluctuantes elevadas, medias y bajas simulando bajo condiciones de campo la biosolarización y biofumigación en Murcia y Extremadura. Las especies de Brassicaceae (en fresco) ensayadas a temperaturas fluctuantes elevadas o medias inactivaron totalmente las clamidosporas de P. nicotianae, excepto en el caso de B. carinata, que las inactivó parcialmente a temperaturas medias. Por el contrario, la inactivación de las clamidosporas de P. nicotianae fue baja cuando las especies de Brassicaceae se ensayaron a temperaturas fluctuantes bajas. Igualmente, en los testigos no biofumigados se produjo una inactivación considerable del inóculo a temperaturas fluctuantes elevadas, pero no a las temperaturas medias o bajas. 258 Discusi ón general De los resultados de este experimento se dedujo que la temperatura por sí sola produce una inactivación considerable del inóculo de P. nicotianae a temperaturas fluctuantes elevadas y la inactivación fue total cuando se combinó con especies de Brassicaceae. En concordancia con estos resultados, Lacasa et al. (2015) y Rodríguez-Molina et al. (2015) observaron reducciones de la densidad del inóculo de P. nicotianae al aplicar tratamientos de solarización en el suelo, además, la temperatura afecta a la volatilidad y a la concentración de los ITCs producidos durante la hidrólisis de los GSLs (Price et al., 2005). Un tercer ensayo corroboró el efecto exclusivo de la temperatura en la inactivación del inóculo de los testigos de P. nicotianae que fue significativamente mayor a 30 ºC que a 25 ºC. Con respecto a F. oxysporum, se observó inactivación del inóculo de los testigos pero no hubo diferencias significativas entre las dos temperaturas. También se probó el efecto de los pellets de B. carinata (BioFence®) en la inactivación del inóculo-talco de F. oxysporum que fue significativamente mayor a 25 ºC que a 30 ºC. No obstante, resultados en la misma línea fueron obtenidos por Morales-Rodríguez et al. (2018) que concluyeron que los pellets de B. carinata presentaron una mayor eficacia a 10 ºC que a 20 ºC en la inhibición de la germinación de las conidias de F. circinatum. Por el contrario, la inactivación de P. nicotianae, en general, fue mayor a 30 ºC que a 25 ºC para los dos tipos de inóculo. Conviene subrayar que a pesar de que las clamidosporas son estructuras de resistencia, por lo general, fueron más susceptibles a los pellets que el triturado miceliar de P. nicotianae a 25 y 30 ºC. Smolinska et al. (2013) observaron que el efecto de los ITCs fue más relevante en la germinación de conidias y clamidosporas que en la inhibición del crecimiento miceliar de F. oxysporum. Asimismo, se observó que la efectividad de los pellets disminuyó con el tiempo de exposición (24 h, 48 h, 7 y 14 días) para F. oxysporum (25 y 30 ºC) y P. nicotianae (25 ºC). A los 14 días la inactivación fue mínima ya que la mayoría de los ITCs son liberados en las primeras horas después de hidratar los pellets 259 Capítulo 4 (De Nicola et al., 2013; Lazzeri, 2014). En contraposición, la inactivación de P. nicotianae a 30 ºC aumentó con el tiempo de exposición a los pellets. De los ensayos de laboratorio se deduce que es necesario aplicar diferentes técnicas para el control efectivo de P. nicotianae y F. oxysporum. La susceptibilidad de las estructuras fúngicas de ambas especies es diferente para los materiales biofumigantes ensayados y condiciones de temperatura. La temperatura es un factor clave para reducir la supervivencia del inóculo y garantizar el control eficaz de los patógenos. Igualmente, es fundamental elegir los materiales biofumigantes más eficaces para optimizar la aplicación de estas técnicas, destacando los pellets de B. carinata (BioFence®) por su acción en la inhibición del crecimiento miceliar e inactivación del inóculo de las especies fúngicas a dosis muy bajas. En la segunda parte del trabajo se evaluaron las técnicas de biofumigación, biosolarización y solarización para el control de P. nicotianae en condiciones de campo. La tristeza del pimiento es una enfermedad considerada como un factor limitante del cultivo, siendo P. nicotianae su principal agente causal en Extremadura (Rodríguez-Molina et al., 2010b). En la literatura científica existían artículos relativos al uso de estas técnicas en invernaderos de Murcia para el control de Phytophthora spp. en cultivos de pimiento para pimentón. Algunos autores mostraron la eficacia de estas técnicas, como Lacasa et al. (1999) que observaron que la biosolarización era eficaz para el control de la tristeza del pimiento durante los meses de julio y agosto. Guerrero et al. (2004a, 2004b) concluyeron que la reiteración de la biosolarización durante varios años había proporcionado niveles aceptables de control de P. capsici en invernaderos del Campo de Cartagena (Murcia). Además, se observaban cambios en las propiedades físicas y químicas del suelo (Fernández et al., 2004) y mejoras de la producción de pimiento (Guerrero et al., 2004a). 260 Discusi ón general Estas mismas técnicas podrían ser válidas para controlar la tristeza del pimiento en Extremadura y mejorar las propiedades físico-químicas del suelo. Pero la puesta en práctica de estas novedosas técnicas en Extremadura exigía del estudio de estas bajo condiciones de campo para evaluar con detalle los pormenores de dichas técnicas, partiendo de los resultados obtenidos en los ensayos de laboratorio. Por un lado, las técnicas de biofumigación, biosolarización y solarización tenían que ser compatibles con las condiciones agroclimáticas de Extremadura y, por otro lado, debían respetar el ciclo de cultivo (mayo-septiembre) de pimiento para pimentón en esta comunidad. Además, se quería comprobar si estas técnicas podrían mejorar las propiedades de los suelos para aumentar la producción de los cultivos. Se eligió una parcela de la Finca “La Orden” (CICYTEX) situada en el término de Lobón, en las Vegas Bajas de Guadiana (Badajoz). El suelo de esta parcela era representativo de la zona, con unas características propias consecuencia de la intensa actividad agrícola y del manejo inadecuado del suelo. En general, el bajo contenido de materia orgánica provoca inestabilidad en los agregados del suelo que se traduce en un aumento de la compactación, encostramiento, reducción de la permeabilidad y sellado del suelo. Estos problemas dificultan la germinación y nascencia de plántulas, influyendo, por tanto, en la producción de los cultivos. El ciclo del cultivo de pimiento para pimentón en Extremadura comienza con el trasplante de las plantas a mediados de mayo y finaliza en septiembre. El suelo está ocupado por el cultivo durante los meses más favorables para la biodesinfección (Guerrero et al., 2004), por lo que había que desarrollar técnicas usando diferentes materiales biofumigantes y dosis compatibles con el cultivo de pimiento. Para ello, se establecieron ensayos con distintas especies de Brassicaceae que se sembraron en octubre y se incorporaron al suelo en el mes de marzo, en el que previamente se habían introducido las sondas biológicas y sondas de temperatura y humedad. 261 Capítulo 4 De la interpretación de los resultados de supervivencia e infectividad del inóculo de P. nicotianae de las dos primeras campañas se dedujo que bajo las condiciones ensayadas, las técnicas de biofumigación, biosolarización y solarización no proporcionaban un control eficaz del patógeno, independientemente de la profundidad de enterrado del inóculo. Por una parte, los cultivos no proporcionaron una cantidad suficiente de materia biofumigante debido a que los cultivos no se desarrollaron adecuadamente por las dificultades en la germinación y nascencia, las condiciones climáticas y las particularidades de cada especie de Brassicaceae. Por otra parte, el principal factor limitante de la eficacia de estas técnicas eran las bajas temperaturas alcanzadas en los meses de marzo y abril en Extremadura. De hecho, los resultados de los ensayos realizados en condiciones controladas coincidían con los obtenidos en el campo. El inóculo (clamidosporas) de P. nicotianae sobrevivía cuando era expuesto a varias especies biofumigantes en el régimen temperaturas fluctuantes bajas, correspondiente a las condiciones de biofumigación con especies de Brassicaceae en marzo al aire libre en Extremadura. Sin embargo, cuando el inóculo fue expuesto a especies biofumigantes bajo regímenes de temperaturas fluctuantes elevadas (correspondientes a condiciones de biosolarización con estiércol fresco de oveja en invernadero en Murcia en el mes de agosto) la inactivación fue total, solo hubo supervivencia del 11 % en el testigo. Las altas temperaturas juegan un papel muy importante en estas técnicas ya que acentúan el efecto de la biofumigación al aumentar la liberación de sustancias volátiles (Ploeg et al., 2001). Ante la falta de eficacia de los tratamientos hasta ahora ensayados en condiciones de campo, se decidió incorporar nuevos materiales biofumigantes, como la torta de colza, en el momento de la incorporación de las especies biofumigantes en verde. El objetivo era incrementar la concentración de compuestos tóxicos para compensar las bajas temperaturas, insuficientes para inactivar el inóculo de P. nicotianae. Además, con la adición de torta de colza al suelo se aprovechaba un subproducto generado por la extracción de biodiesel de las semillas de B. napus var. oleifera en la Finca La Orden. En la literatura 262 Discusi ón general científica aparecían referencias sobre las propiedades de la harina de semilla de especies de Brassicaceae, para suprimir el crecimiento miceliar de varias especies fúngicas. Por ello, previamente al uso de la torta de colza en el campo se comprobó en condiciones controladas su efecto fungitóxico, observándose que inhibía el crecimiento miceliar de P. nicotianae pero a dosis inferiores a las utilizadas para las especies biofumigantes en verde. En la tercera campaña, en el momento de incorporar los cultivos de B. nigra y S. alba se añadió torta de colza a razón de 7.000 y 14000 kg·ha-1. En comparación con otras campañas las temperaturas registradas fueron mayores y se redujo la supervivencia global, solo se detectó el inóculo de P. nicotianae en el 29 % de las muestras. Esta reducción pudo estar relacionada con el alcance de mayores temperaturas en todos los tratamientos por el uso del plástico y de la torta de colza, a excepción del testigo. El análisis mediante regresión logística indicó que la adición de torta de colza a los tratamientos testigos y posterior cubierta con plástico redujeron la supervivencia del inóculo de P. nicotianae, esta reducción fue mayor a la dosis de 14.000 kg·ha-1 por una mayor liberación de compuestos tóxicos. Sin embargo, los valores de infectividad fueron similares a los de otras campañas. A pesar de que se habían reducido los valores de supervivencia del inóculo, el control de P. nicotianae aún era insuficiente y necesario aplicar materiales que liberasen mayor cantidad de compuestos volátiles. En el País Vasco, varios autores habían mejorado la eficacia de la biofumigación añadiendo pellets de B. carinata en el momento de incorporar el cultivo en verde de S. alba cuando las temperaturas del suelo eran moderadas (Núñez-Zofío et al., 2011). Sin embargo, en este estudio la adición de pellets de B. carinata (BioFence®) no implicó mejoras en los resultados de supervivencia e infectividad del inóculo de P. nicotianae. En definitiva, la aplicación de las técnicas de solarización, biosolarización y biofumigación con especies de Brassicaceae, pellets de B. carinata (BioFence®) y torta de colza durante la primavera no consiguieron reducir el 100 % de la 263 Capítulo 4 supervivencia e infectividad del inóculo de P. nicotianae en condiciones de campo para ninguna de las campañas del estudio. Cabe destacar la falta de correlación entre las variables supervivencia e infectividad. Tanto en la primera como en la última campaña, las variables supervivencia e infectividad no mostraron relación, la detección del inóculo en las muestras era muy alta frente a una baja infectividad. Esto podría deberse a que, por una parte, el método de detección de la presencia del inóculo fuera muy sensible y el número de propágulos fuese insuficiente para provocar enfermedad, y por otra parte, a que el suelo se comportase como supresivo al alterar la composición de la microbiota fúngica al aplicar los tratamientos de biofumigación, biosolarización y solarización. La adición de materia orgánica en forma de enmienda actúa como fuente de energía y carbono para los microorganismos del suelo. Estos pueden controlar los patógenos edáficos, bien al degradar la materia orgánica produciendo compuestos tóxicos, bien a través de mecanismos antagonistas como competencia, antibiosis, parasitismo, predación, etc., (Janvier et al., 2007). En la última campaña del estudio se corroboró que al aplicar los tratamientos se generaron cambios cualitativos y cuantitativos en la microbiota fúngica que podrían explicar el comportamiento supresivo del suelo por el aumento de hongos antagonistas. Se redujo la densidad de los géneros Aspergillus, Fusarium y Penicillium, en cambio, se incrementó la de los géneros Rhizopus-Mucor. También, se observaron cambios en la composición de la población fusárica, Fusarium solani fue la especie más representada después de los tratamientos mientras que F. oxysporum y F. roseum mostraron densidades similares. En particular, destacaron los tratamientos MB + TC y MB + BioF que presentan los mayores valores de densidad para todas las especies de Fusarium y población fusárica total. En este sentido, Smolinska y Kowalczyk (2014) y Paudel y Carpenter-Boggs (2014) reportaron un aumento de Fusarium spp. al aplicar harina de semillas de brásicas. 264 Discusi ón general Por otra parte, la reiteración de técnicas de biofumigación, biosolarización y solarización en rotación con los cultivos de pimiento, la adición de compost y la incorporación de los restos de vegetales de pimiento han reducido la densidad aparente del suelo. Varios autores explican este descenso por el aumento del espacio poroso al mezclar las enmiendas con el suelo. Por el contrario, la resistencia a la penetrabilidad del suelo no ha mejorado por la aplicación de tratamientos. La profundidad influye decisivamente en la resistencia a la penetrabilidad y conforme ha avanzado el estudio se han alcanzado valores más altos de resistencia a una menor profundidad. Además de la profundidad hay muchos otros factores que no fueron tenidos en cuenta en este estudio y que influyen en la resistencia a la penetrabilidad como el contenido de humedad del suelo, el contenido de materia orgánica, la heterogeneidad del suelo, etc. Igualmente, la aplicación reiterada de tratamientos ha mejorado la fertilidad del suelo al aumentar los valores de los parámetros químicos del suelo: materia orgánica oxidable, conductividad eléctrica, pH, nitrógeno total, fósforo asimilable, potasio, calcio magnesio y sulfatos. Igualmente, Fernández et al. (2004) y Núñez-Zofío et al. (2012) observaron cambios en las propiedades químicas al aplicar biosolarización en los suelos de cultivo de pimiento en invernaderos de Murcia y País Vasco, respectivamente. Por último, como consecuencia de la mejora de las propiedades físicas (densidad aparente) y químicas por la aplicación reiterada de las técnicas de biofumigación, biosolarización y solarización se observó un incremento de la producción de pimiento para pimentón. Del mismo modo, los cambios en la microbiota fúngica generados por la adición de materia orgánica han podido favorecer una mejora de la fertilidad del suelo y, por tanto, un aumento de la producción del cultivo de pimiento. Núñez-Zofío et al. (2012) observaron un incremento en la producción de pimiento por la aplicación reiterada de tratamientos de biosolarización. No obstante, en este estudio no se encontraron diferencias de producción de pimiento entre los tratamientos aplicados para cada campaña salvo en la última. En la Campaña 2011-2012, en general, los 265 Capítulo 4 tratamientos que presentaron mayor producción de pimiento fueron aquellos en los que se incorporó torta de colza y BioFence®. Por el contrario, los tratamientos de menor producción fueron los tratamientos Testigo y Testigo + P. La torta de colza y los pellets (BioFence®) además de ser materiales biofumigantes constituyen una fuente de nutrientes esenciales que aumentan la producción de los cultivos. En conclusión, esta memoria de tesis aporta datos relevantes sobre los factores de mayor influencia en la efectividad de las técnicas de biofumigación, biosolarización y solarización para el control de P. nicotianae y F. oxysporum, como la temperatura y el tipo de biofumigante empleado que son claves para reducir la presencia del inóculo a niveles residuales. Aunque las técnicas aplicadas en campo no consiguieron un control eficaz del inóculo de P. nicotianae, se observaron mejoras en las propiedades físicas y químicas del suelo, así como un aumento de la producción de pimento para pimentón. Capítulo 6 Referencias bibliográficas 275 Capítulo 6 Adebola, M. O., Amadi, J. E., 2010.Antagonistic activities of Paecilomyces and Rhizopus species against the cocoa black pod pathogen (Phytophthora palmivora). African Scientists 11(4): 235 – 239. Agrios, G. N., 1988. Plant Pathology. 3 rd Edición, Academic Press. New York. 803 pp. Agrios, G. N., 2005. Plant Pathology. Academic Press, New York, USA, 952 pp. Alabouvette, C., 1983. La receptivité des sols aux fusarioses vasculaires. Role de la competition nutritive entre microorganismes. Thèse Doct. Univ. Nancy I, Nancy, 158 pp. Alabouvette, C., Couteaudier, Y., Louvet, J., 1984. Recherches sur la resistance des sols aux maladies. IX. Dynamique des populations de Fusarium oxysporum f. sp. melonis dans un sol rèsistant et dans un sol sensible aux fusarioses vasculaires. Agronomie, 4 (8): 729-733. Alfaro, A., Vegh, I., 1971. La “Tristeza” o “Seca” del pimiento producida por Phytophthora capsici Leonian. Anales INIA, Serie Prot. Veg., 1: 9-42. Altieri, M. A., 1997. Agroecología. Bases científicas para una agricultura sustentable, CLADES, La Habana, Cuba, 249 pp. Al-Turki, A., Dick, W., 2003. Myrosinase Activity in Soil. SCI. Soc. Am. J., 67:139-145. Ambrósio, M. M. Q., Bueno, C. J., Padovani, C. R., Souza, N. L., 2009. Sobrevivência de fungos fitopatogênicos habitantes do solo, em microcosmo, simulando solarização com prévia incorporação de materiais orgánicos. Summa Phytopathol., Botucatu, v. 35, n. 1, p. 20-25. AFI (Analistas Financieros Internacionales), Confederación de Organizaciones Empresariales, Mesa del Tabaco., 2015. La importancia del sector del tabaco en la economía española. 84 pp. Analistas Financieros Internacionales, Mesa del Tabaco., 2017. La importancia del sector del tabaco en la economía española. 84 pp. Andrades, M., Martínez, M. E., 2014. Fertilidad del suelo y parámetros que la definen. Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones. Logroño. 29 pp. Andrés-Ares, J. L., Rivera Martínez, A., Fernández Paz, J., 2005. Resistance of pepper germplasm to Phytophthora capsici isolates collected in northwest Spain. Span. J. Agric. Res., 3(4): 429-436. Angus, J. F., Gardner, P. A., Kirkegaard, J. A., Desmarchelier, J. M., 1994. Biofumigation: Isothiocyanates released from Brassica roots inhibit growth of the take-all fungus. Plant Soil, 162: 107-112. Ansani, C. V., Matsuoka, K., 1983. Infectividade e viabilidade de oósporos de Phytophthora capsici no solo. Fitopatol. Bras., 8: 137-146. Antoniou, P. P., Tjamos, E. C., Giannakou, J. O., 2014. Low-cost and effective approaches of soil disinfestation of plastic houses or open field crops in Greece. Acta Horticult., 1044: 29-42. Aoki, T., O´Donnell, K., 1998. Fusarium kyushuense sp. nov. from Japan. Mycoscience, 39 (1):1-6. Aoki, T., O´Donnell, K., Geiser, D. M., 2014. Systematics of key phytopathogenic Fusarium species: current status and future challenges. Journal of General Plant Pathology 80(3):189-201. Aragón, A., García, M. G., Filguera, R. R., Pachepsky, Y. A., 2000. Maximum compactability of Argentine soils from the Proctor test: The relationship with organic carbon and water content. Soil Till. Res., 56: 197-204. Armstrong, G. M., Armstrong, J. K., 1968. Formae specials and races of Fusarium oxysporum causing a tracheomycosis in the syndrome of disease. Phytopathology, 58:1242-6. Armstrong, G. M., Armstrong, J. K., 1981. Another approach to race classification of Fusarium oxysporum f.sp. pisi. Phytopathology, 71:474-478. Arriaga, H., Núñez-Zofio, M., Larregla, S., Merino, P., 2011. Gaseous emissions from soil biodisinfestation by animal manure on a greenhouse pepper crop. Crop Protection, 30: 412-419. Assis, R. L., Lazarini, G. D., Lancas, K. P., Cargnelutti Filho, A., 2009. Avaliação da resistência do solo à penetração em diferentes solos com a variação do teor de água. Engenharia Agrícola, 29(4): 558- 568. Aulakh, M. S., Khera, T. S., Doran, J. W. , Kuldip-Singh, Bijay-Singh, 2000. Yields and nitrogen dynamics in a rice-wheat system using green manure and inorganic fertilizer. Soil Sci. Soc. Am. J., 64: 1867– 1876. 276 Referencias bibliográ ficas Avendaño-Prieto, B. L., Avendaño-Prieto, G., Cruz, W., Cárdenas-Avendaño, A., 2014. Guía de referencia para investigadores no expertos en el uso de estadística multivariada. Perspect. Psicol., 10: 013- 027. Aydi Ben Abdahall, R., Jabnoun-Khiareddine, H., Mokni-Tlili, S., Nefzi, A., Medimagh-Saidane, S., et al., 2015. Endophytic Baccillus spp. from Wild Solanaceae and Their Antifungal Potential against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Elucidated Using Whole Cells, Filtrate Cultures and Organic Extracts. J. Plant Pathol. Microbiol., 6: 324. Azimzadeh, Y., Shirvani, M., Shariatmadari, H., 2016. Rhizosphere and green manure effects on soil chemical attributes and metal bioavailability as a function of the distance from plant roots in mono and mixed corn and canola cultures. Archives of Agronomy and Soil Science, 62 (8): 1066-1081. Baker, K. F., Cook, R. J., 1974. Biological Control of Pathogens. W.H. Fremman Company. San Francisco, U.S. 433p. Ballasote, M. J., Bejarano, J., Blanco, M. A., Jiménez-Díaz, R. M., Melero, J. M., 1994. La solarización del suelo: una estrategia para controlar enfermedades causadas por organismos de suelo y reducir las alternativas de cultivo. Investigación Agraria: Fuera de serie, 2: 207-212. Barbercheck M. E., Von Broembsen S. L., 1986. Effects of soil solarization on plant-parasitic nematodes and Phytophthora cinnamomi in South Africa. Plant Dis., 70: 945-950. Bartnicki-Garcia, S., 1969. Cell wall differentiation in the Phycomycetes. Phytopathology, 59:1065-1071. Bartnicki-Garcia, S., 1970. Cell wall composition and other biochemical markers in fungus phylogeny. 81- 102 pp. En: Phytochemical Phylogeny. J. B. Harborne, ed. Academic Press, London. Bartnicki-Garcia, S., 1973. Cell wall genesis in a natural protoplast: The zoospore of Phytophthora palmivora. 77-91 pp. En: Yeast, Mould, and Plant Protoplasts. J. R. Villanueva, I. García-Acha, S. Gascón, y F. Uruburu, eds. Academic Press, London. Bartnicki-Garcia S., 1987. The cell wall - a crucial structure in fungal evolution. En: Evolutionary Biology of the Fungi. Eds. A.D.M. Rayner, C.M. Brasier and D. Moore. pp 390-403. Cambridge University Press, New York. Bartnicki-García, S., Wang, M. C., 1983. Biochemical aspects of morphogenesis in Phytophthora. 121-137 pp. En: Phytophthora: It´s Byiology, Taxonomy, Ecology, and Pathology. D. C. Erwin, S. Bartnicki- García and P. H. Tsao, eds. American Phytopathological Society, St. Paul, Minn. Bartolomé-García, T. J., Velázquez Otero R., Gómez-Aguado Gutiérrez, M., 2006. El Sector Hortícola. En: La Agricultura y la Ganadería Extremeña. Informe 2005 y Análisis de una Década: 1996-2005. Ed. Caja de Ahorros de Badajoz. Indugrafic S.L., Badajoz. Bartolomé-García, T. J., Velázquez, R., Córdoba, M.G., Coleto, J. M., 2013. Avances en la mecanización del cultivo de pimiento para pimentón en la comarca de la Vera (Cáceres). En: La Agricultura y la Ganadería Extremeña en 2012. Fundación Caja Badajoz. Badajoz. Bartual, R., Marsal, J. I., Carbonel, E. A., Tello, J. C., Campos, T., 1991. Genética de la resistencia a Phytophthora capsici Leon en pimiento. Bol. San. Veg. Plagas, 17: 3-124. Bell, C. H., Price, N., Chakrabarti, B., 1996. The methyl bromide issue. Bell C H, Price N, Chakrabarti B., (eds.) J. New York, N.Y: Wiley & Sons, 254 pp. Bello, A., Díez-Rojo, M. A., López-Cepero, J., López-Pérez, J. A., García-Álvarez, A., 2008. Principios ecológicos en la gestión de los agrosistemas. ARBOR Ciencia, Pensamiento y Sistema, 729: 19-29. Bello, A., López-Pérez, J. A, Díaz-Virulinche, L., de León, L., Sanz, R., Escuer, M., 1999. Local resources as methyl bromide alternatives in nematodes control. Abstracts of the XXXI Annual Meeting ONTA, June 21-25, San Juan, Puerto Rico. Nematropica 29, 116. Bello, A., López-Pérez, J. A., Sanz, R., Escuer, M., Herrero, J., 2000. Biofumigation and organic amendments. Fregional Workshop on Methyl Bromide alternatives for North Africa and Southern European Countries, United Nations Environment Programme (UNEP), Francia, 113-141 pp. Bello A., López-Pérez J. A., García Álvarez A., 2003. Biofumigación en agricultura extensiva de regadío. Fundación Ruralcaja Alicante y Ediciones Mundi-Prensa, Alicante, 670. Bello, A., López-Pérez, J.A., García-Alvárez, A., Arcos, S.C., Ros, C., Guerrero, M.M., Guirao, P., Lacasa, A., 2004. Biofumigación con solarización para el control de los nematodos en cultivo de pimiento. En: Lacasa, A., Guerrero, M. M., Oncina, M., Mora, J. A., eds. Desinfección de suelos en invernaderos de 277 Capítulo 6 pimiento. Publicaciones de la Consejería de Agricultura, Agua y Medio Ambiente. Región de Murcia. Jornadas 16: 129-207. Bellostas, N., Jørgensen, A. L. W., Lundin, N. V. F., Petersen, I. L., Sørensen, H., Sørensen, J. C. Sørensen, R., Tidmand, K. D., 2003. Comparison of physicochemical properties of myrosinase isoenzymes in seeds of Brassica species of the U triangle. En: Proceedings of the 11 th International Rapeseed Congress, Copenhagen, Denmark, 720-723 pp. Bellostas, N., Sørensen, J. C., Sørensen, H., 2004. Qualitative and quantitative evaluation of glucosinolates in cruciferous plants during their life cycles. Agroindustria, 3:5-10. Bending, G. D., Turner, M. K., Rayns, F., Marx, M. C., Wood, M., 2004. Microbial and biochemical soil quality indicators and their potential for differentiating areas under contrasting agricultural management regimes. Soil Biology and Biochemistry, 36(11):1785-1792. Bennett, R. S., Spurgeon, D. W., DeTar, W. R., Gerik, J. S., Hutmacher, R. B., Hanson, B. D., 2011. Efficacy of four soil treatments against Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum race 4 on cotton. Plant. Dis., 95:967-976. Bergamin, A. C., Vitorino, A. C. T., Lempp, B., Souza, C. M. A., Souza, F. R., 2010. Anatomia radicular de milho em solo compactado. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 45(3): 299-305. Berkenkamp, B., 1973. A growth-stage key for rape. C. J. Plant Sci. 53, 413. Bianchini, A., Maia, J. C. S., Magalhaes, P. S. G., Capellini, N., Umezu, C. K., 2002. Penetrógrafo eletrônico automático. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, 6(2): 332-336. Bernal, M. P., 2004. Fertilidad y contaminación de suelos agrícolas. Aplicación al cultivo de la vid. CSIC. Bimpong, C. E., Clerk, G. C., 1970. Motility and chemotaxis in zoospores of Phytophthora palmivora (Butl.) Butl. Ann. Bot., 34: 617-624. Bjerg, B., Sørensen, H., 1987. Quantitative analysis of glucosinolates in oilseed rape based on HPLC of desulfoglucosinolates and HPLC of intact glucosinolates. En: Wathelet J. P. (ed.). World Crops: Production, Utilization, Description. Glucosinolates in Rapeseeds: Analytical Aspects. Bjergegaard, C. Li, P.W., Michaelsen, S., Møller, P., Otte, J., Sørensen, H., 1994. Glucosinolates and their transformation products – compounds with a broad biological activity. En: Bioactive substances in Food of Plant Origin, Proceedings of the International Euro Food Tox IV Conference, Olsztyn, Poland. Kozlowska, H., Fornal, J and Zdunczyk, Z. Eds.1: 1-15. Bjergegaard, C., Mortensen, K., Petersen, I. L., Sørensen, H., Sørensen, J. C., 2003. Isolation and characterization of myrosinase isoenzymes occurring in Brassica napus L. and Sinapis alba L. 712- 715 pp. En: Proceedings of the 11 th International Rapeseed Congress, Copenhagen, Denmark. Black, C. A., 1965. Methods of soil analysis. Part I. American Society of Agronomy, Madison. 790 pp. Blackwell, E., 1949. Terminology in Phytophthora. Commonw. Mycol. Instit. Mycol. Pap., 30, 24 pp. Blake, G. R., Hartge, K. H., 1986. Bulk density. In: Klute, A., Ed., Methods of Soil Analysis, Part 1—Physical and Mineralogical Methods, 2nd Edition, Agronomy Monograph 9, American Society of Agronomy— Soil Science Society of America, Madison, 363-382. Blaya, J., Lacasa, C. M., Lacasa, A., Pascual, J. A., 2014. Characterization of Phytophthora nicotianae isolates in south-east Spain and their detection and quantification through a real-time TaqMan PCR. J. Sci. Food Agric. 95, 1243-1251. Blok, W. J., Lamers, J. G., Termorshuizen, A. J., Bollen, G. J., 2000. Control of soilborne plant pathogens by incorporating fresh organic amendments followed by tarping. Phytopathology, 90: 253-259. Blok, W. J., Bollen, G. J., 1995. Fungi on roots and stem bases of asparagus in the Netherlands: species and pathogenicity. Eur. J. Plant Pathol., 101: 15–24. Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, F., 2007. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. J. Plant Pathol., 89: 311-324. Booth, C., 1971. The genus Fusarium. Commonwealth Mycol. Inst., Kew, 237 pp. Booth, E. J., Walker, K. C., Griffiths, D. W., 1991. A time-course study of the effect of sulphur on glucosinolatos in oilseed rape (Brassica napus) from the vegetative stage to madurity. J. Sci. Food Agric., 56: 479-493. 278 Referencias bibliográ ficas Borek, V., Morra, M. J., Brown, P. D., McCafferey, J. P., 1995. Transformation of the glucosinolate-derived allelochemicals allyl isothiocyanate and allylnitril in soil. J. Agric. Food Chem., 43: 1935–1940. Borrás, H., Pérez, M. C., Noriega, J., Felix, E., Martín, A., Rodríguez, Y., Mosqueda, M., 1997. Empleo de Trichoderma sp. en el control de la pudrición piña causada por Phytopthora nicotianae var. parasitica en segmentos de tallos. Cuadernos de Fitopatología, 54: 148–149. Bowen, H. D., 1981. Alleviating mechanical impedance. In: ARKIN, G. F., TAYLOR, H. M. Modifying the root environment to reduce crop stress. St. Joseph: American Society of Agricultural Engineers, p. 21- 57. Bowers, J. H., Papavizas, G. C., Johnston, S. A., 1990. Effect of soil temperature and soil-water matric potential on the survival of Phytophthora capsici in natural soil. Plant Dis., 74: 771-777. Bradford, J. M., 1986. Penetrability. In: KLUTE, A. (ed.) Methods of soil analysis: physical and mineralogical methods, Madison: American Society of Agronomy, 463-478 pp. Bradshaw, J. E., Heaney, R. K., Macfarlane Smith, W. H., Gowers, S., Gemmell, D. J., Fenwick G. R., 1984. The glucosinolate content of some fodder Brassicas. J. Sci. Food Agr., 35: 977-981. Brar, B. S., Singh, J., Singh, G., Kaur, G., 2015. Effects of Long Term Application of Inorganic and Organic Fertilizers on Soil Organic Carbon and Physical Properties in Maize–Wheat Rotation. Agronomy, 5: 220-238. Brown, P. D., Morra, M. J., 1997. Control of soil-borne plant pests using glucosinolate containing plants. Adv. Agron., 61: 167-231. Bulluck, L. R., Brosius, M., Evanylo, G. K., Ristaino, J. B., 2002. Organic and synthetic fertility, amendments influence soil microbial, physical, and chemical properties on organic and conventional farms. Appl. Soil Ecol., 19:147–160. Burgess, L. W., 1981. General ecology of the Fusaria, 225-235. In: P. E. Nelson, T. A. Tousson and R. J. Cook (eds.). Fusarium: diseases, biology and taxonomy. The Pennsylvania State Univ. Press, Univ. Park and London, 457 pp. Burgess, B., Ummerell, S., Bullock, K., Gott y Backhouse, P., 1994. Laboratory Manual for Fusarium Research, 3 rd ed. University of Sydney and Botanic Gardens, Department of Crop Sciences, Fusarium Research Laboratory, Sydney, Australia. 191 pp. Buskov, S., Hansen, L. B., Olsen, C. E., Sørensen, H., Sørensen, J. C., Sørensen, S., 2000. Determination of ascorbigens in autolysates of various Brassica species using supercritical fluid chromatography. J. Agric. Food Chem., 48: 2693-2701. Campbell, D. C., Kondra, Z. P., 1978. Relationships among growth patterns, yield components and yield of rapeseed. Can. J. Plant Sci., 58: 87-93. Campbell, D. J, O´Sullivan, M. F., 1991. The cone penetrometer in relation to trafficability, compaction, and tillage. In: Smith, K. A., Mullins, C. E. Soil analysis. New York, Marcell Dekker, p.399-423. Cenis, J. L., Fuchs, P., 1988. Efecto comparado de la solarización y el metam sodio en un cultivo de pimiento en invernadero. ITEA, 75: 21-38. Chamorro, M., Miranda, L., Domínguez, P., Medina, J. J., Soria, C., Romero, F., López Aranda, J. M., De los Santos, B., 2015. Evaluation of biosolarization for the control of charcoal rot disease (Macrophomina phaseolina) in strawberry. Crop Prot., 67: 279-286. Charan, C.S., Sams, S.E., 1999. Inhibition of Pythium ultimum and Rhizoctonia solani by shredded leaves of Brassica species. J. Am. Soc. Hort. Sci. ,124: 462- 467. Chaudhari, P. R., Ahire, D. V., Ahire, V, D., Chkravarty, M., Maity, S., 2013. Soil Bulk Density as related to Soil Texture, Organic Matter Content and available total Nutrients of Coimbatore Soil. International Journal of Scientific and Research Publications, Volume 3(2). Cheah, L-H., Marsh, A.T., Hedderley, D., Falloon, R. E., 2008. Crop rotation with Brassicas reduces Phytophthora populations in potato soil. Arable & Vegetable Crops. New Zealand Plant Protection, 61:256-260. Chellemi, D. O., Olson, S. M., Mitchell, D. J., 1994. Effects of soil solarization and fumigation on survival of soilborne pathogens of tomato in northern Florida. Plant Disease, 78: 1167-1172. 279 Capítulo 6 Chellemi, D. O., Olson, S. M., Mitchell, D. J., Secker, I., McSorley, R., 1997. Adaptation of soil solarization to the integrated management of soilborne pests of tomato under humid conditions. Phytopathology, 87: 250-258. Chen, Y., Katan, J., 1980. Effect of solar heating of soils by transparent polyethylene mulching on their chemical properties. Soil Sci., 130: 271-276. Chen, Y., Gamliel, A., Stapleton, J. J., Aviad, T., 1991. Chemical, physical, and microbial changes related to plant growth in disinfested soils. En: Katan, J., DeVay, J .E. (Eds.), Soil Solarization. CRC Press, Boca Raton (USA), 103-129. Chong, C., Bible, B., 1974. Variation in thiocyanate content of radish plants during ontogeny. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 99: 159-162. Clarkson, J., Debode, J., Furlan, L., Neilson, R., Wallenhammar, A. C., Zahrl, J., 2015. Mini-paper - Monitoring of soil-borne pathogens (fungi, protists and nematodes) and soil tests. Focus Group Soilborne diseases. Clossais-Besnard, N., Larher, F., 1991. Physiological role of glucosinolates in Brassica napus. Concentration and distribution pattern of glucosinolates among plant organs during a complete life cycle. J. Sci. Food Agric., 56: 25-38. Coelho, L., Chellemi, D. O., Mitchell, D. J., 1999. Efficacy of soil solarization and cabbage amendment for the control of Phytophthora spp. in North Florida. Plant Disease, 83: 293-299. Coelho, L., Mitchell D. J., Chellemi, D. O., 2000. Thermal inactivation of Phytophthora nicotianae. Phytopathology, 90: 1089-1097. Coelho, L., Mitchell, D. J., Chellemi, D. O., 2001. The effect of soil moisture and cabbage amendment on the thermos inactivation of Phytophthora nicotianae. Eur. J. Plant Pathol., 107: 883-894. Colla, P., Gilardi, G., Gullino, M. L., 2012. A review and critical analysis of the European situation of soilborne disease management in the vegetable sector. Phytoparasitica 40, 515-523. Consejería de Medio Ambiente y Rural, Políticas Agrarias y Territorio, Junta Extremadura, 2017. Superficies agrícolas y producciones vegetales. En: La Agricultura y la Ganadería Extremeña en 2017. Fundación Caja Badajoz. Badajoz. Cook, R. J., Baker, K. F., 1983. The Nature and Practise of Biological Control of Plant Pathogens. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minn. 539 pp. Costantini, A., 1996. Relationships between cone penetration resistance, bulk density, and moisture content in uncultivated, repacked, and cultivated hardsetting and non-hardsetting soils from the coastal lowlands of South-East Queensland. New Zealand Journal of Forestry Science, 26(3): 395-412. Couteadier, Y., 1989. Interactions microbiennes dans le sol et la rhizosphere: analyse du dèterminisme de la compétition entre populations de Fusarium. Thèse Doct. Univ. Claude Bernard, Lyon I, Lyon, 101 pp. Cuadrado, I., Gómez, J., 1983. Observaciones sobre el estado sanitarios de los cultivos hortícolas en Almería. Investigaciones sobre los cultivos hortícolas intensivos. Boletín Informativo, 5: 53-88. INIA CRIDA 10. Cullman, S. W., Duxbury, J. M., Lauren, J. G., Thies, J. E., 2006. Microbial community response to soil solarization in Nepal’s rice-wheat cropping system. Soil Biol. Biochem., 38: 3359-3371. DOI:10.1016/j.soilbio.2006.04.053. Daugovish, O., Downer, J., Becker, O., Browne, G., Duniway, J., 2004. Mustard-derived biofumigation for vegetable crops and strawberries. Agroindustria, 3: 335-338. Davis, D., 1964. Host fungitoxicants in selective pathogenecity of Fusarium oxysporum. Phytopathology, 54: 290-293. Davila, M., 1964. La enfermedad de la Tristeza del Pimiento. Boletín Informativo del Servicio de Plagas del Campo, 18: 10-11 Daxenbichler, M. E., Spencer, G. F., Carlson, D. G., Rose, G. B., Brinker, A. M., Powell, R. G., 1991. Glucosinolate composition of seeds from 297 species of wild plants. Phytochemistry, 30: 2623-2638. De March, G., McGregor, D. I., Seguin-Shwartz, G., 1989. Glucosinolate content of maturing pods and seed of high and low glucosinolate summer rape. Can. J. Plant Sci., 69: 929-932. 280 Referencias bibliográ ficas De Nicola, G. R., D’Avino, L., Curto, G., Malaguti, L., Ugolini, L., Cinti, S., et al., 2013. A new bio based liquid formulation with biofumigant and fertilising properties for drip irrigation distribution. Ind. Crops Prod., 42: 113-118. Dean, R., Van Kan, J. A. L., Pretorius, Z. A., Hammond-Kosack, K. E., Di Prieto, A., Spanu, P. D., Rudd, J. J., Dickman, M., Kahmann, R., Ellis, J., Foster, G. D., 2012. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology, 13, 414-430. Dexter, A. R., Czyz, E. A., Gat, O. P., 2007. A method for prediction of soil penetration resistance. Soil e Tillage Research, 93(1): 412-419. Diana, G., Piccirillo, P., 1994. Avversità de lla coltura del tobacco: funghi. Informatore Fitopatologico, 1: 7- 16. Dias Junior, M. S., Pierce, F. J., 1996. O processo de compactação do solo e sua modelagem. R. Bras. Ci. Solo, 20: 175-182. Díez-Rojo, M.A., 2010. Bases agronómicas para la utilización de restos agrarios en biodesinfección de suelos. Tesis doctoral. ETSIA, Universidad Politécnica de Madrid, 327 pp. Doheny-Adams, T., Lilley, C. J., Barker, A., Ellis, S., Wade, R., Atkinson, H. J., Urwin, P. E., Redeker, K., Hartley, S. E., 2018. Constant Isothiocyanate-Release Potentials across Biofumigant Seeding Rates. J. Agric. Food Chem., 66:5108-5116. Domínguez, P., Miranda, L., Soria, C., de los Santos, B., Chamorro, M., Romero, F., Daugovish, O., López- Aranda, J. M., Medina, J. J., 2014. Soil biosolarization for sustainable strawberry production. Agron. Sustain. Dev., 34: 821-829. Drobnica, L., Zemanova, M., Nemec, P., Antos, K., Kristian, P., Stullerova, A., Knoppova V., Nemec, J. R. P., 1967. Antifungal activity of isothiocyanates and related compounds. I. Naturally occuring isothiocyanates and their analogues. Appl. Microbiol., 15: 701- 709. Dutta, B. K., Isaac, I., 1979. Effects of organic amendments to soil on the rhizosphere microflora of antirrhinum infected with Verticillium dahliae Kleb. Plant and soil, 53: 99-103. El-Swaify, S. A., Dangler, E. W., 1982. Rainfall Erosion in the Tropics: A State-of-the-Art. In: Soil Erosion and Conservation in the Tropics. Madison, Wisconsin, 1982, pp: 1-26 (ASA Special Publication, 43). Ellouze, W., Taheri, A. E., Bainard, L. D., Yang, C., Bazghaleh, N., Navarro-Borrell, A., Hanson, K., Hamel, C., 2014. Soil fungal resources in annual cropping systems and their potential for management. Biomed Research International, 2014: 531824. DOI: 10.1155/2014/531824. Erwin, D. C., 1983. Variability within and among species of Phytophthora. En: Phytophthora: Its biology, taxonomy, ecology and pathology. The American Phytopathol. Society, St. Paul, MN. Erwin, D. C., Ribeiro, O. K., 1996. Phytophthora Diseases Worldwide. APS PRESS, St. Paul, Minnesota. 562 pp. Escuer, M., Cano, A., Bello, A., 2004. Nematodos fitoparásitos de la región de Murcia y alternativas de control. Desinfección de suelos en invernaderos de pimiento. Segunda jornada sobre alternativas viables al bromuro de metilo en pimiento de invernadero, Murcia, España, 27-57 pp. Espárrago, G., 1999. Nematodos en tabaco en Extremadura. En: Temas de I+D Agrario en Extremadura. Consejería de Agricultura y Comercio, Junta de Extremadura, Mérida. 271 pp. Espárrago, G., Blanco, I., 2002. First report of the Cyst Nematode (Globodera tabacum) Complex on fluecured tobbaco in Spain. Plant Disease, 86:1402. Espárrago Rodilla, G., Rodríguez-Molina, M. C., Verdejo Alonso, E., Palo Núñez, E., Blanco Martín, I., 2004. La Fusariosis Vascular del tabaco asociada a Globodera tabacum en el Valle del Tiétar (Extremadura). XII Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología. Lloret de Mar (Gerona), 143 pp. Fahey, O. J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P., 2001. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry, 56 (1): 5-51. Fang, X. L., Phillips, D., Li, H., Sivasithamparam, K., Barbetti, M. J., 2011. Comparisons of virulence of pathogens associated with crown and root diseases of strawberry in Western Australia with special reference to the effect of temperature. Sci. Hortic. 131, 39-48. Fang, J. G., Tsao, P. H., 1995. Efficacy of Penicillium funiculosum as a biological control agent against Phytophthora root rots of azalea and citrus. Phytopathology, 85: 871-878. 281 Capítulo 6 Fatima, K., Noureddine, K., Henni, J. E., Mabrouk, K., 2015. Antagonistic effect of Trichoderma harzianum against Phytophthora infestans In the North-West of Algeria. International Journal of Agronomy and Agricultural Research, 6(4):44-53. Fayzalla, E. A., El-Barougy, E., El-Rayes, M. M., 2009. Control of Soil-Borne Pathogenic Fungi of Soybean by Biofumigation with Mustard Seed Meal.Journal of Applied Sciencies, 9(12):2272-2279. Fenwick, G. R., Heaney, R. K., Mullin, W. J., 1983. Glucosinolates and their breakdown products in food and food plants. CRC Crit. Rev. Food Sci. Nut., 18: 123-201. Fernández, L., 2006. Manual de técnicas de análisis de suelos aplicadas a la remediación de sitios contaminados. Editorial Semarnat. México, pp. 117-128. Fernández, P., Guerrero, M., Ros, C., Bello, A., García, A., Lacasa, A., 2004. Efecto de la biofumigación+solarización sobre la características físicas y químicas de los suelos de pimiento del Sureste español. Actas de Horticultura, 42: 6-12. Fieldsend, J., Milford, G. F. J., 1994. Changes in glucosinolatos during crop development in single and double low genotypes of winter oilseed rape (Brassica napus): production and distribution in vegetative tissues and developing pods during development and potential role in the recycling of sulphur within the crop. Ann. Appl. Biol., 124: 531-542. Filion, M., St-Arnaud, M., Fortin, J. A., 1999. Direct interaction between the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices and different rhizosphere microorganisms. New Phytol., 141: 525–533. Freeman, S., Katan, J., 1988. Weaking effect on propagules of Fusarium by sublethal heating. Phytopathology, 78: 1656-1661. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), 1993. The state of food and agriculture. FAO Agriculture Series, 26. Rome (Italy), 328 pp. Forsythe, W., 1985. Física de Suelos. IICA. San José, Costa Rica, 212 pp. Franzén, L., Hjelmroos, M., Kallbeg, P., Brorström-Lundén, E., Juntto, S., Savolainen, A., 1994. The yellow snow episode of northern Fennoscandia, March 1991. A case study of long distance transport of soil, pollen and stable organic compounds. Atmos Environ, 28(2): 3587–3604. Gale, E.S., Hemphill, D. D., Myhre, E. A., Bary, A. I., Sullivan, D. M., Cogger, C. G., 2006. Estimating plantavailable nitrogen release from manures, composts, and specialty products. J. Environ. Qual., 35: 2321–2332. Gamliel, A., Austeraweil, M., Kritzman, M., 2000. Non-chemical approach to soilborne pest management - organic amendments. Crop Protection, 19: 847-853. Gamliel, A., Katan, J., 1991. Involvement of fluorescent pseudomonads and the other microorganisms, increased growth response of plants in solarized soils. Phytopathology, 81:494-502. Gambiel, A., Katan, J., 1993. Suppression of major and minor pathogens by fluorescent pseudomonads in solarized and nonsolarized soils. Phytopathology 83: 68-75. Gamliel, A., Stapleton, J. J., 1993. Characterization of antifungal volatile compounds evolved from solarized soil amended with cabbage residues. Phytopathology, 83: 899-905. Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D., 2004. Microbial diversity in soil: selection of microbial populations by plant and soil type and implications for disease suppressiveness. Annual Reviews of Phytopathology, 42: 243-270. Gelsomino, A., Keijzer-Wolters, A., Cacco, G., Van Elsas, J. D., 1999. Assesment of bacterial community structure in soil by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis. Journal of Microbiological Methods, 38: 1-15. George, E., Marschner, H., Jakobsen, I., 1995. Role of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in Uptake of Phosphorus and Nitrogen From Soil. Critical Reviews in Biotechnology, 15: 3-4,257-270. Gilardi, G., Demarchi, S., Gullino, M. L., Garibaldi, A., 2014. Managing Phytophthora crown and root rot on tomato by pre-plant treatments with biocontrol agents, resistance inducers, organic and mineral fertilizers under nursery conditions. Phytopathologia Mediterranea, 53 (2): 205-2015. Gilardi, G., Pugliese, M., Gullino, M. L., Garibaldi, A., 2016. Effect of different organic amendments on lettuce Fusarium wilt and on selected soilborne microorganisms. Plant Pathol., 65: 704-712. Goode, P. M., 1956. Infection of strawberry roots by zoospores of Phytophthora fragarie. Trans. Br. Mycol. Soc., 39: 367-377. 282 Referencias bibliográ ficas Greenberger, A., Yogev, A., Katan, J., 1987. Induced suppressiviness in solarized soils. Phytopathology, 77: 1663-1667. Greenhalgh, J. R., Mitchell, N. D., 1976. The involvement of flavour volatiles in the resistance to downy mildew of wild and cultivated forms of Brassica oleracea. New Phytol., 77: 391-398. Grob, K., Matile, P. H., 1979. Vacuolar location of glucosinolatos in horseradish root cells. Plant Sci. Lett., 14: 327-335. Guerrero, M. M., 2012. Biosolarización de invernaderos para cultivos de pimiento: manejo de patógenos y fatiga del suelo. Tesis Doctoral. Universidad Politécnica de Cartagena. Cartagena. 201 pp. Guerrero-Díaz, M. M., Lacasa-Martínez, C. M., Hernández-Piñera, A., Martínez-Alarcón, V., Lacasa-Plasencia, A., 2013. Evaluation of repeated biodisinfestation using Brassica carinata pellets to control Meloidogyne incognita in protected pepper crops. Journal of Agricultural Research, 11(2): 485-493. Guerrero, M. M., Ros, C.; Martínez, M.A., Barceló, N., Martínez, M. C., Guirao, P., Bello, A., Contreras, J., Lacasa, A., 2004a. Estabilidad en la eficacia desinfectante de la biofumigación con solarización en cultivos de pimiento. Actas de Horticultura, 42: 20-32. Guerrero, M. M., Ros, C., Guirao, P., Martínez, M. A., Martínez, M. C., Barceló, N., Bello, A., Lacasa, A., López, J. A., 2004b. Biofumigation plus solarisation efficacy for soil desinfection in sweet pepper greenhouses in the Southeast of Spain. Acta Horticulturae. Gullino, M. L., 2000. Status of methyl bromide alternatives for soil fumigation in Southern Europe. In: Methyl bromide alternatives for North African and Southern European countries. Eds. UNEP, pp. 87-92. Gulser, C., Candemir, F., 2012. Changes in penetration resistance of a clay field with organic waste applications. Eurasian J. Soil Sci., 1: 16–21. Gupta, R. C., Tandon, R. N., 1978. Mucor circinelloides a destructive hyperparasite of Rhizopus nigricans. Mycopathologia, 64 (2):125-127. Guzmán, J. L., 2010. El tabaco ante el plan de apoyo de 2010. En: La Agricultura y la Ganadería Extremeña. Informe 2009. Ed. Caja de Ahorros de Badajoz. Indugrafic S. L., Badajoz. Guzmán-Casado, G., González de Molina, M., Sevilla-Guzmán, E., 1999. Introducción a la Agroecología como desarrollo rural sostenible. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid. Guzmán, J. L., Coleto, J. M., Pulido, F., Rodríguez, J. A., 2003. La producción de tabaco en las zonas rurales de Extremadura y su contribución al desarrollo sostenible. Ed. Cultivadores de Tabaco en España. (http://www. cultivadoresdetabaco.com). Handiseni, M., Brown, J., Zemetra, R., Mazzola, M., 2011. Herbicidal activity of Brassicaceae seed meal on wild oat (Avena fatua), Italian ryegrass (Lolium multiflorum), redroot pigweed (Amaranthus retroflexus) and prickly lettuce (Lactuca serriola). Weed Technology, 25: 127-134. Hansen, Z. R., Keinath, A. P., 2013. Increased pepper yields following incorporation of biofumigation cover crops and the effects on soilborne pathogen populations and pepper diseases. Applied Soil Ecology, 63: 67-77. Hati, K., Swarup, A., Singh, D., Misra, A., Ghosh, P., 2006. Long-term continuous cropping, fertilisation, and manuring effects on physical properties and organic carbon content of a sandy loam soil. Soil Res., 44: 487–495. Hawksworth, D. L., Kirk, P. M., Sutton, B. C., Pegler, D. N., 1995. Dictionary of the fungi. CAB International. Wallingford. Haynes, R., Naidu, R., 1998. Influence of lime, fertilizer and manure applications on soil organic matter content and soil physical conditions: A review. Nutr. Cycl. Agroecosys., 51: 123–137. Hemmes, D. E., 1983. Cytology of Phytophthora. Pp. 9-40. En: Phytophthora. Its Biology, Taxonomy, Ecology and Pathology (ed. Erwin, D. C., Bartnikci- García, S. y Tsao, P. H.): 139-147. American Phytophathol. Society. St. Paul, Minnesota. Hemmes, D. E., Wong, L. D. S., 1975. Ultraestructure of chlamydospores of Phytophthora cinnamomi during development and germination. Can. J. Bot., 53:2945-2957. Henríquez, C., Cabalceta, G., 1999. Guía práctica para el estudio introductorio de los suelos con un enfoque agrícola. San José, Costa Rica Asociación Costarricense de la Ciencia del Suelo, 112 pp. 289 Capítulo 6 O’Donnell, A., G., Seasman, M., Macrae, A., Waite, I., Davies, J., T., 2001. Plants and fertilisers as drivers of change in microbial community structure and function in soils. Plant Soil, 232: 135– 145. Odum, E., 1972. Ecología. Editorial Interamericana. México. OITAB (Organización Interprofesional del Tabaco de España), 2018. https://www.hoy.es/agro/extremaduraproduce-tabaco-20180529003358-ntvo.html Ok, Y. S., Usman, A. R. A., Lee, S. S., Abd El-Azeem, S. A. M., Choi, B., Hashimoto, Y., Yang, J. E., 2011. Effects of rapeseed residue on lead and cadmium availability and uptake by rice plants in heavy metal contaminated paddy soil. Chemosphere, 85:677-682. Oka, Y. 2010. Mechanisms of nematodes suppressionby organic soil amendments. A review. Applied soil ecology, 44: 101-115. Otto, R. Silva, A. P., Franco, H. C. J., Oliveira, E. C. A.; Trivelin, P .C. O., 2011. High soil penetration resistance reduces sugarcane root system development. Soil and Tillage Research, 117: 201–210. Pabin, J., Lipiec, J., Wlodek, S., Biskupski, A., Kaus, A., 1998. Critical soil bulk density and strength for pea seedling root growth as related to other soil factors. Soil & Tillage Research, 46: 203-208. Palazón, C., 1988. Estudio de los posibles métodos de control de la “Tristeza” o “Seca” del pimiento. Tesis Doctoral, Universidad Politécnica de Valencia. Valencia, 231 pp. Palazón, C., Palazón, I., 1989. Estudios epidemiológicos sobre la “Tristeza” del pimiento en la zona del Valle Medio del Ebro. Bol. San. Veg. Plagas, 15: 233-262. Palmieri, S., Rollin, P., Sørensen, H., Sørensen, S., 1998. Enzyme technology for a potential glucosinolate utilization in Agro-Industry. Agro Food Ind. High Tech., 9 (1): 24-27. Panabières, F., Ali, G. S., Allagui, M. B., Dalio, R. J., Gudmestad, N. C., Kuhn, M. L., Zampounis, A., 2016. Phytophthora nicotianae diseases worldwide: newknowledge of a long-recognised pathogen. Phytopathol. Mediterr., 55 (1): 20. Patkowska, E., Konopinski, M., 2014. Antagonistic bacteria in the soil after cover crops cultivation. Plant Soil Environ., 60(2): 69-73. Paudel, B.R., Carpenter-Boggs, L. A., 2014. Biofumigation Potential of Brassica Soil Amendments in Douglasfir Seedlings. In: Wilkinson KM, Haase DL, Pinto JR, technical coordinators. National Proceedings: Forest and Conservation Nursery Associations—2013. Fort Collins (CO): USDA Forest Service, Rocky Mountain Research Station. Proceedings RMRS-P-72. 29-34. Peña, D., 2013. Aprovechamiento de residuos de almazaras en suelos de olivar y de las Vegas del Guadiana: efectos en la dinámica de los herbicidas MCPA, S- metacloro y metribuzina. Tesis Doctoral. Universidad de Extremadura, 312 pp. Pereira-Jiménez, C., Aranda-Medina, E., Córdoba-Ramos, M. G., Bartolomé-García, T. J., 2011. Estudio del papel antioxidante del pimentón de la Vera. En: La agricultura y la ganadería extremeñas: Informe 2010, 165-178. Ed. Caja de Ahorros de Badajoz. Indugrafic S.L., Badajoz. Pérez, M., 2011. Epidemiología y control de Phytophthora parasitica en cultivos de tomate y pimiento bajo abrigo en el Sureste Peninsular de España. Tesis Doctoral. Universidad de Almería. Almería, 249 pp. Pérez, G. M., 2014. Cuantificación de la microbiota fúngica y bacteriana en el suelo arenado de un cultivo bajo plástico en Almería. Proyecto Monográfico. I.T.A. Industrias Agrarias y Alimentarias. Universidad de Almería. Almería, 149 pp. Pérez, A., Martín, E., Giménez, M., Fernández, M., Gómez, J., 2014. Eficacia de la solarización y la biosolarización del suelo en el control de patógenos en cultivos enarenados. Vida Rural nº 378. 24- 30. Pérez-Piqueres, A., Edel-Hermann, V., Alabouvette, C., Steinberg, C., 2006. Response of soil microbial communities to compost amendments. Soil Biol Biochem, 38:460–470. Picón-Toro, J., 2011. “El efecto biofumigante de especies de la familia Brassicaceae en hongos fitopatógenos”. Trabajo Fin de Máster. Universidad de Extremadura. Badajoz, 89 pp. Picón-Toro, J., Morales-Rodríguez, M. C., Palo, C., Palo, E.J., García-Gallego, A., Rodríguez-Molina, M. C., 2012a. Influencia de la temperatura en el efecto biofumigante de especies de Brassicaceae: Inactivación in vitro de Phytophthora nicotianae y Fusarium oxysporum. XVI Congreso Sociedad Española de Fitopatología, Málaga. Resúmenes: 234. 290 Referencias bibliográ ficas Picón-Toro, J., Morales-Rodríguez, M. C., Palo, C., Palo, E.J., García-Gallego, A., Rodríguez-Molina, M. C., 2012b. Inhibición del crecimiento miceliar de Phytophthora nicotianae y Fusarium oxysporum por especies de Brassicaceae. XVI Congreso Sociedad Española de Fitopatología, Málaga. Resúmenes: 235. Ping, C. L., Jastrow, J. D., Jorgenson, M. T., Michaelson, G. J., Shur, Y. L., 2005. Permafrost soils and carbon cycling. Soil, 1: 147-171. Ploeg, A. T., 2000. Effects of amending soil with Tagetes patula cv. Single gold on Meloidogyne incognita infestation of tomato. Nematology 2, 489-493. Ploeg, A. T., Riverside, U. C., Stapleton, J. J., 2001. The effects of temperature, time, and amendment of soil with broccoli residues on the infestation of melon (Cucumis melo L.) by two rootknot nematode species. UC Plant Protection Quaterly. Online: www.uckac.edu/ppq. Pocock, K., Heaney, R. K., Wilkinson, A. P., Beaumont, J. E., Vaughan, J. G., Fewick, G. R., 1987. Changes in myrosinase activity and isoenzyme pattern, glucosinolate content and the cytology of myrosin cells in the leaves of heads of three cultivars of English white cabbage. J. Sci. Food Agric., 41: 245- 257. Ponchet, J., Ricci, P., Andreoli, C., Augé, G., 1972. Méthodes sélecives d’isolement du Phytophthora nicotianae f. sp. parasitica (Dastur) Waterh. á partir du sol. Ann Phytopathol., 4: 97-108. Porta, J., López-Acevedo, M., Roquero, C., 1999. Edafología para la agricultura y el medio ambiente. Ediciones Mundi-Prensa. 2ª Edición, 917 pp. Potgieter, C., 2012. Assessment of the biofumigation effect of Canola (Brassica napus) on soil microbial community function and structure. Master of Science in Environmental Sciences at the Potchefstroom. Price, A. J., Charron, C. S., Saxton, A. M., Sams, C. E., 2005. Allyl isothiocyanate and carbon dioxide produced during degradation of Brassica juncea tissue in different soil conditions. Hortscience, 40: 1734-1739. Pullman, G. S., DeVay, J. E., Garber, R. H., Weinhold, A. R., 1981. Soil solarization: effects on verticillium wilt of cotton and soilborne populations of Verticillium dahliae, Pythium spp., Rhizoctonia solani, and Thielaviopsis basicola. Phytopathology, 71: 954-959. Pung, H., 2003. Brassica green manure crops appear to improve soil properties. Biofumigation update. No 18:1. R Development Core Team, 2018. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing.https://www.r-project.org/ Ramírez-Villapudua J., Munnecke D. E., 1987. Control of cabbage yellows (Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans) by solar heating of field soils amended with dry cabbage residues. Plant Dis., 71: 217- 221. Rangkadilok, N., Nicolas, M. E., Bennett, R. N., Premier, R. R., Eagling, D. R., Taylor, P. W. J., 2002. Developmental changes of sinigrin and glucoraphanin in three Brassica species (Brassica nigra, Brassica juncea and Brassica oleracea var. italica). Sci. Horticult., 96: 11-26. Rasche, F., Hödl, V., Poll, C., Kandeler, E., Gerzabek, M. H., van Elsas, J. D., Sessitsch, A., 2006. Rhizosphere bacteria affected by transgenic potatoes with antibacterial activities compared to the effects of soil, wild-type potatoes, vegetation stage and pathogen exposure. FEMS Microbiology Ecology, 56: 219– 235. Ríos, P., Obregon, S., de Haro, A., Fernández, P., Sánchez, M. E., 2012. Evaluation of biofumigant plants for control of Quercus root rot caused by Phytophthora cinnamomi in rangeland ecosystems. In: 6 th Meet. IUFRO Working Party 7.02.09. Phytophthora in Forest and Natural Ecosystems. Córdoba, Spain. Ristaino, J.B., Thomas, W., 1997. Agriculture, methyl bromide and ozone hole: Can we fill the gaps? Plant Disease, 81: 964-977. Rioja Molina, A. E., 2002. Apuntes de Fitotecnia General, E.U.I.T.A., Ciudad Real. Rodman, J. E., 1978. Glucosinolates, Methods of Analysis some chemosystematic problems. Phytochem. Bull., 11 (1-2): 6-31. Rodríguez, M. P., 2001. Biodiversidad de los hongos fitopatógenos del suelo de México. Acta Zool. Mex (n.s.). Número especial 1:53-78. 291 Capítulo 6 Rodríguez-Molina, M. C., 1996. Ensayo de caracterización de suelos agrícolas y forestales de Extremadura tomando como indicadores a Fusarium Link y Pythium Pringsheim: La representatividad del muestreo. Tesis Doctoral. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Madrid. 209 pp. Rodríguez-Molina, M. C., Picón-Toro, J., Morales Rodríguez, M. C., Palo Osorio, C., Palo Núñez, E. J., Lacasa, A., 2010a. Efecto de la biofumigación con especies de Brassica y temperaturas diarias fluctuantes en la inactivación de clamidosporas de Phytophthora parasitica. XV Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología. Vitoria, del 27 de septiembre al 1 de octubre de 2010. pp. 392. Rodríguez-Molina, M. C., Morales-Rodríguez, M. C., Palo Osorio, C., Palo Nuñez, E., Verdejo Alonso, E., Duarte Maya, M. S., Picón-Toro, J., 2010b. Phytophthora nicotianae, the causal agent of root and crow rot (Tristeza disease) of red pepper in La Vera region (Cáceres, Spain). Span. J. Agric. Res., 8(3): 770-774. Rodríguez-Molina, M. C., Morales-Rodríguez, M. C., Palo Osorio, C., Osuna, M. D., Iglesias, M. J., García, J. A., 2013. Pathogenicity, vegetative compatibility and RAPD analysis of Fusarium oxysporum isolates from tobacco fields in Extremadura. European journal of plant pathology, 136 (3): 639-650. Rodríguez-Molina, M. C., Palo, E., Palo, C., Espárrago, G., Verdejo, E., Torres-Vila, L. M., García, J. A., Blanco, I., 2007. First report of Fusarium Wilt of flue-cure tobacco caused by Fusarium oxysporum f. sp. batatas in Spain. Plant Disease, 91 (3): 323. Rodríguez-Molina, M. C., Verdejo Alonso, E., García Barrado, J. A., Espárrago Rodilla, G., Morales Rodríguez, M. C., Palo Núñez, E., Palo Osorio, C., Torres-Vila, L. M., 2009. La Fusariosis Vascular del tabaco asociada a nematodos formadores de quistes del complejo Globodera tabacum en el Valle del Tiétar: estrategias de control. Bol. San. Veg. Plagas, 35: 103-114. Rodríguez-Molina, M. C., Serrano-Pérez, P., Palo, C., 2015. Effect of biofumigation with brassica pellets combined with Brassicaceae cover crops and plastic cover on the survival and infectivity of inoculum of Phytophthora nicotianae Breda de Haan. Pest Manag. Sci., 72, 1295–1301. Roquero, C., Porta, J., 1992. Agenda de campo para el estudio del suelo. Universidad Politécnica. E.T.S. Ingenieros Agrónomos. Madrid. Ros, M., García, C., Hernández, M. T., Lacasa, A., Fernández, P., Pascual, J. A., 2008. Effects of biosolarization as methylbromide alternative for Meloidogyne incognita control on quality of soil underpepper. Biology and Fertility of Soils, 45: 37-44. Rosa, E. A. S., Heaney, R. K., Fenwick, G. R., Portas, C. A. M., 1997. Glucosinolates in crop plants. Hort. Rev., 19: 99-215. Rosa, E. A. S., Heaney, R. K., Portas, C. A. M., Fenwick, G. R., 1996. Changes in glucosinolate concentrations in Brassica crops (B. oleracea and B. napus) throughout growing seasons. J. Sci. Food Agric., 71: 237-244. Rosa, E. A. S., Rodrigues, P. M. F., 1998. The effect of light and temperature on glucosinolate concentration in the leaves and roots of cabbage seedlings. J. Sci. Food Agric., 78: 208-212. Rouxel, F., Bouhot, D., 1971. Recherches sur l’ecologie des champignons parasites dans le sol. IV. Nouvelles mises au point concernant l’analyse sélective et quantitative des Fusarium oxysporum et Fusarium solani dans le sol. Annual Review of Phytopathology, 3(2): 171-188. Sarwar, M., Kirkegaard, J. A., 1998. Biofumigation potential of brassicas. II. Effect of environment and ontogeny on glucosinolate production and implications for screening. Plant Soil, 201, 91-101. Sarwar, M., Kirkegaard, J. A., Wong, P. T. W., Desmarchelier, J. M., 1998. Biofumigation potential of brassicas. III. In vitro toxicity of isothiocyanates to soil-borne fungal pathogens. Plant Soil, 201: 103-112. Schertz, D. L., 1985. Field Evaluation of the Effect of Soil Erosion on Crop Productivity. Purdue, USA. 22p. These Ph D. Purdue University. Schutter, M. E., Sandeno, J. M., Dick, R. P., 2001. Seasonal, soil type, and alternative management influences on microbial communities of vegetable cropping systems. Biology and Fertility of Soils, 34: 397-410. Sellam, A., Lacomi-Vasilescu, B., Hudhomme, P., Simoneau, P., 2007. In vitro antifungal activity of brassinin, camalexin and two isothiocyanates against the crucifer pathogens Alternaria brassicicola and Alternaria brassicae. Plant Pathol., 56: 296–301. 292 Referencias bibliográ ficas Sempere, F., Santamarina, M. P., 2008. Suppression of Nigrospora oryzae (Berk. & Broome) Petch by an aggressive mycoparasite and competitor, Penicillium oxalicum Currie & Thom. International Journal of Food Microbiology, 122 (1-2): 35-43. Serrano-Pérez, P., Palo, C., Rodríguez-Molina, M. C., 2017. Efficacy of Brassica carinata pellets to inhibit mycelial growth and chlamydospores germination of Phytophthora nicotianae at different temperature regimes. Scientia Horticulturae, 216: 126-133. Shaban, W.I., El-Barougy, E., and Zian, A.H. 2011. Control of lupine Fusarium wilt by biofumigation with mustard and canola seed meal. Tunisian Journal of Plant Protection 6: 87-98. Shetty, K. G., Subbarao, K. V., Huisman, O. C., Hubbard, J. C., 2000. Mechanism of broccoli mediated Verticillium wilt reduction in cauliflower. Phytopathology, 90: 305-310. Silva, V. R. da, Reichert, J. M., Reinert, D. J., Bortoluzzi, E. C., 2009. Soil water dynamics related to the degree of compaction of two brazilian oxisols under no-tillage. Revista Brasileira de Ciencia do Solo, 33(5): 1097-1104. Silva, W. M. da, Bianchini, A., Cunha, C. A. da, 2016. Modeling and correction of soil penetration resistence for variations in soil moisture and soil bulk density. Journal of the Brazilian Association of Agricultural Engineering, 36 (3): 449-459. Silva, A. P., Tormena, C. A., Fidalski, J., Imhoff, S., 2008. Funções de pedotransferência para as curvas de retenção de água e de resistência do solo à penetração. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, 32: 1-10. Singh, A., Islam, M. N., 2010. In vitro evaluation of Trichoderma spp. against Phytophthora nicotianae. Int. J. Expt. Agric. 1(1): 20-25. Singh, S., Pandey, A., Chaurasia, B., Palni, L. M. S., 2008. Diversity or arbuscular mycorrhizal fungi associated with the rhizosphere of tea growing in “natural” and “cultivated” ecosites. Biol. Fertil. Soils, 44: 2099-2103. Slusher, R. L., Haas, D. L., Carother, Z. B., Sinclair, J. B., 1974. Ultraestructure at the host-parasite interface of Phytophthora megaesperma var. sojae in soybean rootllets. Phytopathology, 64: 834-Soi840. Smith, B. J., Kirkegaard, J. A., 2002. In vitro inhibition of soil microorganisms by 2-phenylethyl isothiocyanate. Plant Pathol., 51: 585-593. Smith, W. H. M., Griffiths, D. W., 1988. A time-course study of glucosinolates in the ontogeny of forage rape (Brassica napus L.). J. Sci. Food Agric., 43: 121-134. Smith, T. E., Shaw, K. J., 1943. Pathogenicity studies with Fusaria isolated from tobacco, sweet potato and cotton. Phytopathology, 33: 469-483. Smolinska, U., Horbowicz, M., 1999. Fungicidal activity of volatiles from selected cruciferous plants against resting propagules of soil-borne fungal pathogens. J. Phytopathol., 147: 119-124. Smolinska, U., Knudsen, G. R., Morra, M. J., Borek, V., 1997. Inhibition of Aphanomyces euteiches f. sp. pisi by volatiles produced by hydrolysis of Brassica napus seed meal. Plant Dis., 81: 288-292. Smolinska U., Kowalczyk, W., 2014. The impact of the Brassicaceae plant materials added to the soil on the population of Fusarium solani (Mart.) Sacc. and Fusarium oxysporum Schlecht. Journal of Horticultural Research, 22: 123-129. Smolinska, U., Morra, M. J., Knudsen, G. R., James, R. L., 2003. Isothiocyanates produced by Brassicaceae species as inhibitors of Fusarium oxysporum. Plant Dis., 87: 407-412. Snyder, C. S., Bruulsema, T. W., Jensen, T. L. Fixen., P. E., 2009. Review of greenhouse gas emissions from crop production systems and fertilizer management effects. Agriculture, Ecosystems and Environment, 133: 247–266. Sokal, R. R., Rohlf, F. J., 1995. Biometry: the principles and practice of statistics in biological research. 3rd edition. W. H. Freeman and Co. New York. 887 pp. Souza, N. L., 1994. Solarização do solo. Summa Phytopathologica, 20: 3-15. Sørensen, J. C., 2001. Biorefined oilseed products – high quality products with added value. PhD Thesis. Chemistry Department, KVL, Denmark. Srivastava, D., Kapoor, R., Srivastava, S.,K., Mukerji, K.,G., 1996. Vesicular arbuscular mycorrhiza—an overview. In: Mukerji, K.G. (Ed.), Concepts in Mycorrhizal Research. Kluwer Academic Publishing, Netherlands, pp. 1 –39. 293 Capítulo 6 Stack, J. P., Millar, R. L., 1985. Relative survival potential of propagules of Phytophthora megaesperma f. sp. medicaginis. Phytopathology, 75: 1398-1404. Stamps, D. J., Waterhouse, G. M., Newhook, F. J., Hall, G. S., 1990. Revised tabular key to species of Phytophthora. Mycol. Papers, 162: 1-28. Stapleton, J. J., Devay, J. E., 1982. Effect of soil solarization on populations of selected soilborne microorganisms and growth of deciduous fruit tree seedlings. Phytopathology, 72: 323-326. Stelluti, M., Maiorana, M. and De Giorgio, D., 1998. Multivariate approach to evaluate the penetrometer resistance in different tillage systems. Soil and Tillage Research 3-4: 145-151. Stirling, G. R., 1991. Biological Control of Plant Parasitic Nematode: Progress, Problems and Prospects. Wallington, UK. Stolte, J., Tesfai, M., Øygarden, L., Kværnø, S., Keizer, J., Verheijen, F., Panagos, P., Cristiano Ballabio, C., Hessel, R., 2016. Soil threats in Europe. EUR 27607 EN. doi:10.2788/828742. Stone, J. K., Hansen, E. M., 1993. Green manure effects on soilborne pathogens. Proceedings: Northeastern and Intermountain Forest and Conservation Nursery Associations. St. Louis, Missouri. pp 57-64. Subba Rao N.S., 1999. Organic matter decomposition. In: N. S. Subba Rao. (4th ed.) Soil microbiology, Science Publishers, USA, 320 pp. Sutton, C. B., 1980. The Coelomycetes. Fungi Imperfecti with pycnidia acervuli and stroma. Commonwealth Mycological Institute. Kew, Surrey, England. UK., 696 pp. Tallapragada, P., Gudimi, M., 2011. Phosphate solubility and biocontrol activity of Trichoderma harzianum. Turk. J. Biol., 35: 593-600. Taylor, H. M., Burnett, E., 1964. Influence of soil strength on the root growth habit of plants. Soil Sci., 98: 174-180. Tejada, M., González, J. L., García-Martínez, A. M., Parrado, J., 2008. Effects of different green manures on soil biological properties and maize yield. Bioresource Technology, 99: 1758-1767. Tello J.C., 1988. La competición microbiana en el suelo. Horticultura, 39: 65-83. Tello, J. C., 1984. Enfermedades criptogámicas en hortalizas: observaciones en el litoral mediterráneo español. Comunicaciones INIA, Serie Prot. Veg. 22, 342 pp. Tello-Marquina, J. C., Alabouvette, C., 1984. Observations sur la persistance dans le sol des microconidies de Fusarium oxysporum. Agronomie, 4 (9): 885-890. Tello-Marquina, J. C., Alabouvette, C., Louvet, J., 1980. Aptitude à la conservation des microconidies de Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Ann. Phytopathol., 12 (3): 227-233. Tello, J. C., Camacho, F., 2010. Organismos para el control de hongos patógenos en los cultivos protegidos. Fundación Cajamar. El Ejido, Almería, 522 pp. Tello, J. C., García, M., 1977. Prospección de enfermedades micológicas en plantas hortícolas (tomate, pimiento, melón, sandía y judía). Publicación de la 7ª División Agraria, 28 pp. Tello, J. C., Lacasa, A., 1990. Fusarium oxysporum en los cultivos intensivos del literal mediterráneo de España. Fases parasitaria (fusariosis vasculares del tomate y del clavel) y no parasitaria. Bol. Inf. Téc. Econ. Agrar., 88 (2): 77-94. Tello, J., Lacasa, A., 2004. Las enfermedades de origen edáfico y su control en los pimentonales del Campo de Cartagena: una interpretación retrospectiva del sexenio 1979-1985. Phytoma, 157: 17-26. Tello, J. C., Palmero, D., de Cara, M., Moreno, A., Santos, M., 2011. El suelo como “ente vivo” y su relación con las enfermedades de las plantas. En: Meco, R., Lacasa C., Moreno, M.M. (coords.) Agricultura Ecológica en Secano. Soluciones sostenibles en ambientes mediterráneos. Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha, SEAE, Ediciones Mundi-Prensa. Tello, J. C., Palmero, D., García, A., de Cara, M., 2010. Biodesinfección del suelo para el control de micosis de origen edáfico, corrección de la “fatiga” y efecto sobre las propiedades físicoquímicas del suelo. En: Organismos para el control de patógenos en los cultivos protegidos. Prácticas culturales para una agricultura sostenible. Coord: J.C. Tello y F. Camacho. Fundación Cajamar. 294 Referencias bibliográ ficas Tello, J. C., Vares, F., Lacasa, A., 1991. Manual de Laboratorio. Diagnóstico de Hongos, Bacterias y Nematodos Fitopatógenos. MAPA, Dirección General de Sanidad de la Producción Agraria. Madrid, 484 pp. Thangstad, O. P., Evjen, K., Bones, A., 1991. Immunogold-EM localization of myrosinase in Brassicaceae. Protoplasma, 161: 85-93. Tian, D., Babadoost, M., 2004. Host range of Phytophthora capsici from pumpkin and pathogenicity of the isolates. Plant Dis. 88:485-489. Timmer, L. W., Graham, J. H., Zitko, S. E., 1998. Metalaxyl-resistant isolates of Phytophthora nicotianae: occurrence, sensitivity, and competitive parasitic ability on citrus. Plant Dis., 82: 254-261. Timonen, S., Finlay, R. D., Olsson, S., Soderstrom, B., 1996. Dynamics of phosphorous translocation in intact ectomycorrhizal systems: non-destructive monitoring using a B-scanner. FEMS Microbiology Ecology, 19: 171–180. Tortosa, J. M., 2009. El futuro del maldesarrollo. Revista Obets, 4: 67-83. Tjamos, S. E., Markakis, E. A., Antoniou, P., Paplomatas, E. J., 2006. First record of Fusarium wilt of tobacco in Greece imported as seedborne inoculum. Journal of Phytopathology, 154: 193-196. Tsao, P. H., 1971. Chlamydospore formation in sporangium-free liquid cultures of Phytophthora parasitica. Phytopathology, 61: 1412-1413. Tsao, P. H., Oster, J. J., 1981. Relation of ammonia and nitrous acid to suppression of Phytophthora in soils amended with nitrogenous organic substances. Phytopathology, 71: 53-59. Tuset, J. J., 1977. Contribución al conocimiento del género Phytophthora de Bary en España. Anales INIA. Serie Prot. Veg., 7: 11-106. Tüzel, Y., Duyar, H., Öztekin, G. B, Gürbüz-Kiliç, O., Anaç, D., Madanlar, N., Yoldas, Z., 2013. Effects of winter green manuring on organic cucumber production in unheated greenhouse conditions. Turk. J. Agric. For., 37: 315-325. Usaborisut, P., Ampanmanee, J., 2015. Compaction properties of silty soils in relation to soil texture, moisture content and organic matter. American J. Agric. Biological Sci., 10(4): 178-185. United States Department of Agriculture (USDA), 1981. Soil erosion effects on soil productivity: a research perspective. J. Soil and Water Conservation, 36 (2): 82-90. Van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A., 2009. Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems. Phytochem. Rev., 8: 171-186. Vaz, C. M. P., Manieri, J. M., De Maria, I. C., Tuller, M., 2011. Modeling and correction of soil penetration resistance for varying soil water content.Geoderma, Amsterdam, 166 (1): 92–101. Van Veen, J. A., Kuikman, P. J., 1990. Soil structural aspects of decomposition of organic matter by microorganisms. Biogeochemistry, 11(3): 213-233. Vaughn, S. F., Berhow, M. A., 2005. Glucosinolate hydrolysis products from various plant sources: pH effects, isolation, and purification. Industrial Crops and Products, 21: 193-202. Vázquez, R. A., 1990. Estudio sobre hongos de suelo de Galicia (Comarca de O Salnes, Pontevedra). Tesis Doct., Univ. de Santiago, Santiago, 250 pp. Villa-Martínez, A., Pérez-Leal, R., Morales-Morales, H. A., Soto-Parra, J. M., Martínez-Escudero, E., 2015. Situación actual en el control de Fusarium spp y evaluación de la actividad antifúngica de extractos vegetales. Acta Agronómica, 64(2):194-205. Walker, J. C., Morell, S., Foster, H. H., 1937. Toxicity of mustard oils and related sulphur compounds to certain fungi. Am. J. Bot., 24: 536-541. Walkley, A., 1935. An examination of methods for determining organic carbon and nitrogen in soils. Journal of Agricultural Science, 25: 598-609. Wang, X., Boevink, P., McLellan, H., Armstrong, M., Bukharova, T., Qin, Z., Birch, P. R. J., 2015.A host KH RNA-binding protein is a susceptibility factor targeted by an RXLR effector to promote late blight disease. Mol Plant, 8: 1385–1395. 295 Capítulo 6 Wang, L., Cai, K., Chen, Y., Wang, G., 2013. Silicon-mediated tomato resistance against Ralstonia solanacearum is associated with modification of soil microbial community structure and activity. Biol. Trace Element Res., 152: 275-283. Wang, C. Y., He, N. P., Zhang, J. J., Lv, Y. L., Wang, L., 2015. Long-term grazing exclusion improves the composition and stability of soil organic matter in Inner Mongolian grasslands. PLoS ONE, 10, e0128837. Wang, Q., Ma, Y., Yang, H., Chang, Z., 2014. Effect of biofumigation and chemical fumigation on soil microbial community structure and control of pepper Phytophthora blight. World J. Microbiol. Biotechnol., 30: 507-518. Warmington, R., Clarkson, J. P., 2016. Plant Soil, 401: 213. https://doi.org/10.1007/s11104-015-2742-8. Waterhouse, G. M., 1963. Key to the species Phytophthora de Bary. Commonw. Mycol. Inst., Mycol. Papers, 92: 1-22. Wei, F., Passey, T., Xu, X., 2016. Effects of individual and combined use of biofumigation-derived products on the viability of Verticillium dahliae microsclerotia in soil. Crop Prot., 79: 170-176. Weller, D. M., Raaijmakers. J. M., McSpadden Gardener, B. B., Thomashow, L. S., 2002. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens. Annual Review of Phytopathology, 40 (1): 309-348. Whittaker, R. H., 1969. New concepts of kingdoms of organisms. Science, 163(3863):150-160. Wood, J. L., 1975. Biochemistry. 56-221 pp. En: Chemistry and Biochemistry of Thiocyanic acid and its Derivatives. Ed. A Newman, Academic Press, London. Wright, S. F., Upadhyaya, A., 1998. A survey of soils for aggregate stability and glomalin, a glycoprotein produced by hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Soil, 198: 97–107. Yang, H., Niu, J., Tao, J., Gu, Y., Zhang, C., She, S., Chen, W., Yang, H., Yin, H., 2016. The Impacts of Different Green Manure on Soil Microbial Communities and Crop Health. Preprints, 2016090056 (doi: 10.20944/preprints201609.0056.v1). Yang, L., Xie, J., Jiang, D., Fu, Y., Li, G., Lin, F., 2008. Antifungal substances produced by Penicillium oxalicum strain PY-1—potential antibiotics against plant pathogenic fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24: 909-915. Yao, H., He, Z., Wilson, M. J., Campbell, C. D., 2000. Microbial biomass and community structure in a sequence of soils with increasing fertility and changing land use. Microbial Ecology, 40: 223–237. YongHong, W., Wei, R., FuGuo, Z., XingMing, Y., YangChung, X., QiRong, S., 2009. Study on conditions in solid-state fermentation of rapeseed meal by mixed strains for amino acid fertilizer. Scientia Agricultura Sinica, 42: 3530-3540. Yustika, R. D., Muchtar, M., 2016. Soil organic matter status and penetration resistance at alley cropping system on degraded acid dryland. Journal of Degraded and Mining Lands Management, 4(1): 675- 679. Zaccardelli, M., De Nicola, F., Villecco, D., Scotti, R., 2013. The development and suppressive activity of soil microbial communities under compost amendment. Journal of soil science and plant nutrition, 13(3): 730-742. Zentmyer, G. A., 1961. Chemotaxis of zoospores for root exudates. Science, 133: 1595-1596.