Implicación de la mitocondria y del complejo NLRP3-inflamasoma en la fisiopatología de la fibromialgia

Departamento de Estomatología Facultad de Odontología Universidad de Sevilla Tesis Doctoral Implicación de la mitocondria y del complejo NLRP3-inflamasoma en la fisiopatología de la fibromialgia Mario David Cordero Morales Sevilla, 2015 Departamento de Estomatología Facultad de Odontología Universidad de Sevilla Implicación de la mitocondria y del complejo NLRP3-inflamasoma en la fisiopatología de la fibromialgia Memoria de tesis presentada por Mario David Cordero Morales, Graduado en Nutrición Humana y Dietética por la Universidad Pablo de Olavide de Sevilla, para optar al GRADO DE DOCTOR Los directores Pedro Bullón Fernández José Antonio Sánchez Alcázar Sevilla, a 26 de Octubre de 2015 D. PEDRO BULLÓN FERNÁNDEZ, DOCTOR EN MEDICINA POR LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Y CATEDRÁTICO DE MEDICINA ORAL DEL DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA DE LA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA. Y D. JOSÉ ANTONIO SÁNCHEZ ALCÁZAR, DOCTOR EN MEDICINA POR LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Y PROFESOR TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, ANATOMÍA Y BIOLOGÍA CELULAR DE LA UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE INFORMAN que Don Mario David Cordero Morales, graduado en Nutrición Humana y Dietética por la Universidad Pablo de Olavide, ha realizado bajo su dirección el trabajo titulado “Implicación de la mitocondria y del complejo NLRP3-inflamasoma en la fisiopatología de la fibromialgia” y que a su juicio reúne los méritos suficientes para optar al grado de Doctor. Para que conste, firman la presente en Sevilla, a 26 de Octubre de 2015 Dr. Pedro Bullón Fernández Dr. José Antonio Sánchez Alcázar “Si hay algo en nosotros verdaderamente divino, es la voluntad. Por ella afirmamos la personalidad, templamos el carácter, desafiamos la adversidad, reconstruimos el cerebro y nos superamos diariamente” Santiago Ramón y Cajal Y al final……lo conseguí AGRADECIMIENTOS Dicen que podemos ser y hacer todo aquello que nos propongamos, la cuestión es cómo y cuándo. El tiempo pasa y la vida nos pone obstáculos que vamos superando con mayor o menor éxito. Mi padre siempre decía que confiaba en esta cabecita loca y que podría hacer todo lo que me propusiera, pero tenía que luchar por ello y trabajar con constancia. Tengo grabado en mi memoria los recuerdos de mi infancia en mi Triana del alma, de muy pequeño capturando insectos en la vía de mi barriada para mi colección, observando los pájaros y tomando notas, construyendo un terrario con mi padre para observar las lagartijas que cogía en los jardines. Aún recuerdo, cuando mi hermana Mari Carmen, me regaló con uno de sus primeros sueldos un conjunto de pipetas, matraces, probetas y tubos de ensayo que conseguimos en una farmacia para poder hacer mis “experimentos”, y es que el Quimicefa se me quedaba pequeño. Y para esto, mi padre nuevamente, me ayudaba a construir una gradilla con paneles de madera de manualidades. Siempre quise ser científico, siempre tuve la necesidad de explorar, aprender y descubrir. Y a pesar de que en vez de dedicarme a estudiar, se me pasaba el tiempo haciendo estas cosas mi padre confió en mí. Y ahora, por fin después de muchas cosas en la vida, ha llegado el final, el doctorado. El final y el principio, por supuesto. Y son muchas las personas que han pasado por este periodo de mi vida. Mi profesor, Juan Gonzáles, del Instituto Vicente Aleixandre, quién me dejaba ir al laboratorio de prácticas en el BUP porque supo ver la vocación científica en mí. Tras un silencio en mi vida, pasé a estudiar el módulo de técnico de laboratorio, un periodo de mi vida en el que me comí los libros y resurgió en mi ese afán por comerme el mundo y ya no pude parar; la prueba de mayores de 25, entrar en medicina, las prácticas en el Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, el cambio de carrera, el master……….Y tanta gente que pasó por mi vida!!!! Tengo por ello que agradecer tantas cosas, al grupo de Plácido Navas, con quién hice las prácticas, y aprendí tanto, conocí a los jóvenes futuros científicos, Gloria, María, Mariví, José, a los jefes, Guillermo, Carlos, Juan Carlos, Emilio, Claudio,……. A mis compañeras de armas, Ángela, quién me acompaño desde el primer día de entrada en el laboratorio, a Mª Ángeles, con quien formé un estupendo equipo. Ángel Carrión, aún nos queda camino que recorrer en nuestros proyectos. Y allí conocí a mi maestro y codirector de la tesis, José Antonio, alias el súper. RESUMEN La fibromialgia (FM) es un síndrome de dolor crónico generalizado de alta prevalencia mundial que supone un verdadero enigma clínico dado su heterogeneidad y su desconocida etiología. Su fisiopatología ha sido ampliamente investigada y se han propuesto varias hipótesis biológicas entre las cuales, la inflamación, la disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo han mostrado una gran implicación. Nuestro estudio ha profundizado en el papel de la disfunción mitocondrial mediante el uso de un modelo in vitro utilizado para el estudio de las patologías mitocondriales. Para ello, hemos usado fibroblastos de piel mediante los cuales, hemos descrito una deficiencia de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial, una deficiencia de CoQ10, así como un incremento del daño oxidativo. Además, esta disfunción mitocondrial provocada la activación de un complejo multiproteico denominado, complejo NLRP3-inflamasoma el cual, es responsable se la inflamación sistémica. Por otro lado, muchos de los síntomas asociados con las enfermedades mitocondriales, como intolerancia al ejercicio, fatiga, miopatía están presentes en muchos pacientes con FM que presentan disfunción mitocondrial. En este estudio, mostramos una mutación en el gen citocromo b del ADN mitocondrial (ADNmt) en una familia con FM y la implicación del complejo NLRP3-inflamasoma en varias mutaciones mitocondriales. Tras la secuenciación de ADNmt de varios pacientes con FM, encontramos una mutación mitocondrial homoplásmica m.15804T > C en el gen mtCYB en un paciente transmitida por vía materna, que aparece en todos miembros de la familia con el diagnóstico de FM. La mutación estaba presente en varios tejidos de la paciente. Los fibroblastos de piel de la paciente mostraron disfunción mitocondrial y estrés oxidativo asociado a la activación del complejo NLRP3-inflamasoma así como una mejora del metabolismo celular tras la inhibición del complejo inflamasoma o la suplementación con CoQ10. Los cíbridos trans- mitocondriales que portaban la mutación m.15804T> C mostraron las alteraciones fisiopatológicas observadas en los fibroblastos de la paciente con FM. Interesantemente, la activación del complejo NLRP3-inflamasoma también se observó en líneas de fibroblastos derivados de pacientes con otras enfermedades mitocondriales como Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidentes cerebrovasculares (MELAS), Epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas (MERRF) y Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON). En este trabajo mostramos por primera vez una mutación en el ADNmt responsable de la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo y la activación inflamasoma asociado con una familia con diagnóstico de FM. Sobre la base de nuestros datos, se propone el análisis de secuencias del ADNmt en pacientes con FM con evidencias de herencia materna como una posible herramienta de diagnóstico. Además, la activación NLRP3-inflamasoma como consecuencia de la disfunción mitocondrial podría estar implicada en la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales. 1 Abreviaturas ABREVIATURAS 16673-34-0: 5-cloro-2-metoxi-N- [2- (4-sulfamoilfenil) etil] benzamida 8-oxo-G: 8-hidroxideoxiguanosina ACR: Colegio Americano de Reumatología ADNmt: ADN mitocondrial ADNn: ADN nuclear ATP: Adenosín trifosfato ASC: Proteína adaptadora BMCs: Células mononucleares de sangre periférica BMI: Índice de masa corporal CS: Citrato sintasa CoQ10: Coenzima Q10 CPEO: Oftalmoplejia externa progresiva crónica Cu/ZnSOD: Superóxido de cobre/zinc dismutasa DCPIP: 2,6-Dicloroindofenol sodio hidratado DTNB: 5,5′-Dithiobis (2-ácido nitrobenzoico) FBS: Suero fetal bovino FM: Fibromialgia FIQ: Cuestionario de Impacto de Fibromialgia Mario David Cordero Morales 2 GPX: Glutation peroxidasa H2O2: Peróxido de hidrógeno HRP: Peroxidasa de rábano picante IMC: Índice de masa corporal IOD: Intensidad óptica integrada LHON: Neuropatía óptica hereditaria de Leber LPS: Lipopolisacárido LRR: Leucine rich region MELAS: Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular MERRF: Epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas MnSOD: Manganeso superóxido dismutasa mtNOS: Óxido nítrico sintasa mitocondrial NARP: Debilidad muscular neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa NLR: Receptor Nod-like NO: Óxido nítrico O2: Oxígeno OCR: Tasa de consumo de oxígeno ONOO-: Peroxinitrito 3 Abreviaturas OXPHOS: Fosforilación oxidativa PABA: 4-aminobenzoato PBMC: Células mononucleares de sangre periférica PCr: Fosfocreatina PEG: Polietilenglicol RMN: Resonancia magnética nuclear ROS: Especies reactivas de Oxígeno SRC: Capacidad respiratoria de repuesto VAS: Escala analógica visual Mario David Cordero Morales 4 5 Introducción INTRODUCCIÓN Mario David Cordero Morales 6 7 Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1.1. La mitocondria Las mitocondrias son importantes orgánulos de doble membrana presentes en prácticamente todas las células eucariotas. Una de las principales funciones de la mitocondria es la producción de ATP a través del sistema conocido como fosforilación oxidativa mediante una serie de reacciones mediadas por complejos multiprotéicos codificadas tanto por el ADN nuclear (ADNn) como el ADN mitocondrial (ADNmt) (Haas et al., 2008; De Greaves et al., 2012) (Figura 1). Por otra parte, las mitocondrias juegan un papel crucial en muchos otros procesos metabólicos y regulatorios, y en una variedad de mecanismos patológicos (Turrens, 2003; Haas et al., 2008). La enorme actividad bioenergética y respiratoria que tiene lugar en las mitocondrias hacen de esta un entorno con alta producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que son responsables tanto del daño que se produce dentro de la mitocondria como de la producción de altos niveles de estrés oxidativo y daño en otras partes de la célula (membranas, orgánulos, ADN, etc) (Turrens, 2003). Mario David Cordero Morales 14 Figura 4. Mecanismo de producción de especies reactivas de oxígeno en la cadena respiratoria mitocondrial. Fuente: modificado de Turrens JF, 2003. cit c3-: citocromo c3; CuZnSOD: cobre-zinc superóxido dismutasa; H2O2: peróxido de hidrógeno; MnSOD: manganeso superóxido dismutasa; O2: oxígeno; O2-: anión superóxido. 1.3. Enfermedades mitocondriales En 1962, el Dr. Rolf Luft describe por primera vez una enfermedad asociada a la mitocondria, concretamente a la transducción de la energía en las mitocondrias (Luft et al., 1962). Se trató de un paciente de 30 años que presentaba debilidad general, transpiración excesiva, no incremento de peso a pesar de aumentar la ingesta, y un alto metabolismo basal. En este caso, el diagnóstico mostró un fallo en el mecanismo de acoplamiento de la fosforilación oxidativa. A partir de este momento la medicina mitocondrial comienza a adquirir relevancia, habiéndose descrito hasta la fecha 150 15 Introducción patologías genéticas asociadas a la mitocondria. Las enfermedades mitocondriales son un grupo de trastornos producidos por un fallo en el sistema de fosforilación oxidativa, con la consiguiente deficiencia de ATP. Constituyen un grupo muy heterogéneo de enfermedades de fenotipo complejo (Rubio Lightowlers et al., 2015). Dada la variedad de afectaciones que causan, son enfermedades multisistémicas que se originan por alteraciones en los genes que codifican las reacciones metabólicas que tienen lugar en la mitocondria. Esto conlleva la aparición de múltiples signos y síntomas por la afectación de distintos órganos y tejidos, como el músculo, el sistema nervioso, el corazón, el riñón o las glándulas endocrinas, siendo sobre todo el músculo y el sistema nervioso los más vulnerables debido a su alta demanda energética, por lo que son los principales tejidos afectados en estas enfermedades (Taylor et al., 2005). Las manifestaciones clínicas de estas afecciones son muy variadas, incluyendo deterioro de las funciones mentales, trastornos motores, intolerancia al ejercicio, epilepsia, retinosis pigmentaria, accidentes vasculares, oftalmoplejía, cardiomiopatía, sordera, insuficiencia hepática y pancreática así como acidosis metabólica (Dimauro e Hirano, 2009). Debemos tener en cuenta que las patologías mitocondriales no solo son aquellas que se producen por alteraciones en los genes del ADNmt dado que para su función, la mitocondria cuenta tanto con los genes codificados por su propio ADN, como por genes codificados a partir de ADNn. Por ello, las enfermedades mitocondriales se clasifican desde un punto de vista genético en dos grupos: Mario David Cordero Morales 16 Enfermedades por defectos en el ADN mitocondrial: En este grupo incluimos mutaciones puntuales (sustituciones de bases) y mutaciones por reordenamientos simples o complejos de nucleótidos (deleciones, duplicaciones, inserciones), y pueden afectar a cualquiera de los 37 genes del genoma mitocondrial (Haas et al., 2008). El grado de afectación en este tipo de alteraciones dependerá del grado de heteroplasmia, que consiste en el número de copias de ADNmt que presentan la mutación. En este sentido, es necesario que la mutación afecte a un número mínimo de copias para que la célula presente el correspondiente defecto bioquímico (Dowling, 2014), por lo que la expresión clínica de una mutación puntual vendrá determinada por la relación entre copias sanas y mutadas en los diferentes tejidos (Haas et al., 2008; Dowling, 2014). La mayoría de las mutaciones puntuales en genes que codifican proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial son de herencia materna (Figura 5), ya que se dan en los genes del ADN mitocondrial, y tienen carácter multistémico. Sin embargo, se presentan también casos de mutaciones esporádicas y específicas de tejido (Andreu, et al., 2004). Entre estas patologías destacan: Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), Síndrome de Leigh y Debilidad muscular neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa (NARP), Epilepsia mioclónica y fibras rojas de aspecto rasgado (MERRF), Encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios que asemejan a la apoplejía (MELAS), Síndrome de Kearns- Sayre, el Síndrome de Pearson y la Oftalmoplejia externa progresiva crónica (CPEO) (Chinnery et al., 2014). 17 Introducción Figura 5. Esquema del perfil de herencia materna característica de las enfermedades mitocondriales causadas por mutaciones en el ADN mitocondrial. Fuente: modificado de http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations. Enfermedades asociadas a defectos en el ADN nuclear El ADNn codifica multitud de proteínas (se estima que cerca de 3000 genes) que son transportadas hasta la mitocondria para desempeñar gran variedad de funciones (Ng y Turnbull, 2015). Por ello, muchas enfermedades mitocondriales hereditarias están causadas por mutaciones en genes nucleares en cuyo caso se presentan con herencia de tipo mendeliana. Estos genes codifican para cada una de las funciones relacionadas con la mitocondria como: Padre afectado Madre no afectada Padre no afectado Madre afectada Hijos afectados Hijos no afectados Afectados No afectados Mario David Cordero Morales 18  Subunidades estructurales de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial.  Ensamblaje de complejos mitocondriales.  Señalización intergenómica entre DNAn y ADNmt.  Ensamblaje y estabilidad mitocondrial.  Replicación mitocondrial y biogénesis.  Fisión-fusión.  Vía oxidación de ácidos grasos.  Proteínas del ciclo de Krebs. En este sentido, existen patologías asociadas a fallos en cada uno de estos genes y por tanto rutas metabólicas. Algunos ejemplos importantes en este grupo son las mutaciones en los genes del complejo I: NDUFV1, NDUFV2, NDUFS1, NDUFS2, NDUFS4, NDUFS6, NDUFS7, NDUFS8 asociadas a la enfermedad de Leigh, leucodistrofia, cardiomiopatía y encefalopatías así como epilepsia mioclónica. Asociadas al complejo II: flavoproteina y SDHD asociadas a la enfermedad de Leigh y paraganglioma hereditario, o los genes relacionados con la síntesis de CoQ10 que se asocian a fallos en los complejos I, II y III dando como consecuencias miopatía, ataxia y problemas de desarrollo. Existen también ejemplos en cuanto al ensamblaje y estabilidad de las mitocondrias como las mutaciones en los genes: SURF1, SCO1 y SCO2, COS10 asociadas al síndrome de Leigh y a la encefalopatía infantil (Ng y Turnbull, 2015). Desde un punto de vista terapéutico, estas patologías no tienen tratamientos eficaces actualmente dado su complejidad. Sin embargo, actualmente las terapias de este conjunto de enfermedades están enfocadas a la protección y mejora del metabolismo mitocondrial. Algunos de los compuestos comúnmente usados son: L-carnitina, necesaria para el transporte de ácidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondrial donde se somete a β 19 Introducción –oxidación; L-arginina, que aumenta la disponibilidad de óxido nítrico conduciendo a mejorar la vasodilatación intracerebral y el flujo sanguíneo; creatina, que se almacena principalmente en el músculo, corazón, y cerebro, es metabolizado en fosfocreatina que es un fosfato esencial donante para regeneración de ATP en el músculo y el cerebro; y el CoQ10, cuyas funciones ya hemos mencionado (El-Hattab et al., 2015). 1.4. Inflamación e inflamasoma. La inflamación es una respuesta del cuerpo a la lesión tisular, y desempeña un papel esencial en la reparación de tejidos. Sin embargo, la inflamación crónica y fuera de control supone un evento patológico con graves resultados en el daño tisular. La inflamación es inducida por diversos estímulos, y es el resultado de un cambio en el equilibrio entre las citoquinas anti-inflamatorias tales como IL-4, IL-5, IL-10 o TGF-β y pro-inflamatorias como IL-1β, IL-18 o TNFα entre otras, mediadas en su mayoría por la activación el factor de trascripción NFκB en respuesta a diferentes patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o señales de peligro (DAMP) (Harijith et al., 2014). En los últimos años, las citoquinas IL-1β, IL-18 han adquirido un papel protagonista en numerosos procesos patológicos no solo por su papel proinflamatorio, sino por ser las principales citoquinas activadas por el complejo inflamasoma. El complejo inflamasoma es un complejo multiproteico que comprende un sensor intracelular, por lo general un receptor Nod-like (NLR), el precursor de la pro-caspasa-1 y el adaptador de ASC cuya activación conduce a la maduración de la caspasa-1 y el procesamiento de sus sustratos, IL-1β e IL-18 (Figura 6). Los NLR son receptores citosólicos que regulan la inflamación y la apoptosis. Están formados por tres dominios en la región amino-terminal, que se encargan de mediar la transducción de la señal y/o la activación de caspasas inflamatorias como la caspasa-1. En la región central presentan un dominio de unión a nucléotidos, responsable de la oligomerización (NOD) que depende del ATP, y en la región carboxi- Mario David Cordero Morales 20 terminal contiene una secuencia repetitiva rica en leucinas o LRR (leucine rich region), con la que se une a ligandos específicos. La familia de NLR está constituida por una gran variedad de miembros (Figura 7). Figura 6. Estructura del complejo inflamasoma. A. Hélice formada por la unión de una proteína NLR, el precursor de la pro-caspasa-1 y el adaptador de ASC. Modificado de Elinav et al., 2013. B. Estructura de la hélice tomada por microscopía electrónica. Modificado de Chai J y Shi, 2014. NLR ASC Caspasa 1 A B 21 Introducción Figura 7. Relación de la familia de NLRs descritos hasta la fecha. Modificado de Chai J y Shi, 2014. De todos los NLRs, NLRP3 es el más estudiado y se activa por una amplia gama de señales de estrés celular, y precisamente se ha demostrado que los ROS y la disfunción mitocondrial son importantes activadores de la inflamación mediada por inflamasoma (Zhou et al., 2011; Shimada et al., 2014). A este respecto, el estado del ADNmt adquiere una gran relevancia puesto que suele estar relacionado con la aparición de alteraciones moleculares (mutaciones, deleciones, depleciones y polimorfismos) que conllevan un incremento del estrés oxidativo y una considerable disfunción mitocondrial que dificulta el correcto funcionamiento de la mitocondria. Mario David Cordero Morales 22 1.5. La fibromialgia. La fibromialgia (FM) es un síndrome de dolor crónico generalizado acompañado de otros síntomas como, disminución del umbral del dolor, fatiga muscular, intolerancia al ejercicio, dolor de cabeza, trastornos del sueño y la depresión. Es una condición crónica que se caracteriza por un patrón de síntomas difíciles de diagnosticar y tratar. La FM se diagnostica de acuerdo con los criterios de clasificación establecidos por el Colegio Americano de Reumatología (ACR) (Wolfe et al., 1990) e investigaciones de laboratorio de rutina no suelen ser de utilidad puesto que dan resultados normales (Yunus et al., 1981). La prevalencia de la FM en los países industrializados oscila entre 0,4% y 4% en la población (que afecta a por lo menos 5 millones de personas en los Estados Unidos y 800.000 en España) y es 11 veces más frecuente en mujeres que en hombres (Lawrence et el ., 2008). Su alta prevalencia hace que la FM sea un problema importante en los países desarrollados en los últimos años. La FM provoca absentismo laboral y se ha asociado con un alto coste de utilización de servicios médicos así como una alta tasa de invalidez. Por otra parte, el uso de medicamentos y necesidades médicas aumenta notablemente una vez confirmado el diagnóstico por lo que se estima que el coste de los servicios anuales de salud de los pacientes con FM es del doble que la de los pacientes con otras patologías de dolor crónico y pacientes sin dolor. Además, el hecho de que sus criterios diagnósticos sean solamente clínicos y altamente subjetivos, y que su etiopatogenia aún no se ha aclarado hace muy difícil el estudio y el enfoque terapéutico de la enfermedad. Aunque la etiología de la FM no está clara, las evidencias sugieren que factores biológicos, genéticos y ambientales están implicados. Se han observado cambios en la actividad neuronal en el sistema nervioso central, un anormal metabolismo de aminas biogénicas, trastornos inmunológicos y del estrés oxidativo que pueden, entre otros factores, contribuir al desarrollo de la enfermedad. La FM se ha relacionado también con 23 Introducción alteraciones del eje hipotálamo-hipófisis junto con desequilibrio de la neurotransmisión, que implican aminoácidos excitadores, catecolaminas, sustancia P y serotonina (5-HT) (Russell et al., 1994; Crofford et al., 1996; Neeck, 2002). Los síntomas del paciente pueden derivar de una mala modulación del estrés, una sensibilización de las neuronas nociceptoras específicas y por tanto, disminución del umbral del dolor en respuesta a múltiples factores ambientales, tales como trauma mecánico o emocional, el estrés crónico o incluso infecciones. En los últimos años, se ha aportado nueva información a nuestra comprensión de la fisiopatología de FM. Algunos polimorfismos genéticos así como incremento de anticuerpos han sido asociados con la FM, como anticuerpos contra el sistema serotoninérgico de 5-HTT (Bazzichi et al., 2006a;. Tander et al., 2008), el polimorfismo del gen de la catecol-O-methytransferase (Gursoy et al., 2004), polimorfismo de repetición del receptor de D4 dopamina exón II (Buskila et al., 2004), y los anticuerpos contra la serotonina (Klein et al., 1992; Werle et al., 2001). También se han postulado alteraciones en el metabolismo, transporte y recaptación de la serotonina, y la sustancia P (Staud y Spaeth, 2008; Alnigenis y Barland, 2001; Schwarz et al., 2002). Por otra parte, la homeostasis de las citoquinas inflamatorias han sido consideradas en la patogénesis de FM (Wallace, 2001; Wallace et al., 2006). Por otro lado, varios estudios han propuesto una participación de la disfunción mitocondrial y altos niveles de estrés oxidativo en pacientes con FM, lo que sugiere que este proceso puede contribuir a la fisiopatología de esta enfermedad. 1.5.1. Disfunción mitocondrial en la FM Debido a que los principales síntomas en la FM (dolor, rigidez y fatiga) se encuentran asociados a los músculos, se han estudiado las biopsias musculares, sobre todo de trapecio Mario David Cordero Morales 30 31 Objetivos 2. OBJETIVOS Para entender la implicación de la mitocondria y el ADNmt en la fisiopatología de la FM y su relación con el complejo NLRP3-inflamasoma como sensor del estrés celular, el presente estudio plantea los siguientes objetivos:  Caracterizar la implicación de la disfunción mitocondrial así como del complejo NLRP3-inflamasoma en la fisiopatología de células mononucleares de pacientes con FM.  Caracterizar la fisiopatología mitocondrial de la FM en fibroblastos de paciente como modelo in vitro.  Determinar la presencia de alteraciones en el ADNmt en pacientes con FM.  Estudio de la activación del complejo NLRP3-inflamasoma en otros modelos de patología mitocondrial como la enfermedad de MELAS (miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidentes cerebrovasculares) con la mutación m.3243A> G en el gen tRNALeu (UUR), la enfermedad de MERRF (epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas) con la mutación m.8344A> G en el gen MTTK, y la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) con la mutación m.11778G> A en el gen MT-ND4. Mario David Cordero Morales 32 33 Material y Métodos MATERIAL Y MÉTODOS Mario David Cordero Morales 34 35 Material y Métodos 3. MATERIAL Y MÉTODOS El estudio se realizó con la aprobación del comité de ética de la Universidad de Sevilla, de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y todas las Conferencias Internacionales de Armonización y Guías de Buenas Práctica Clínicas. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de comenzar el estudio. 3.1. Pacientes Se eligieron pacientes mayores de 18 años de edad que cumplían los criterios de diagnóstico del American College of Rheumatology 1990 para FM. Estos criterios incluyen una historia de dolor musculo-esquelético generalizado en los lados derecho e izquierdo del cuerpo, así como por encima y por debajo de la cintura, con una duración mínima de 3 meses, y la sensibilidad a la presión a 11 o más de 18 sitios específicos (puntos dolorosos), con sensibilidad moderada o más grave a la palpación digital. Los criterios de exclusión fueron las enfermedades infecciosas agudas en las 3 semanas anteriores; patologías psiquiátricas, metabólicas, autoinmunes, síndrome de fatiga crónica, enfermedades inflamatorias crónicas o dérmicas; hábitos no deseados (por ejemplo, el tabaquismo, el alcohol, etc.); enfermedades orales (por ejemplo, periodontitis); condiciones médicas que requieren tratamiento con glucocorticoides, estatinas o fármacos antidepresivos; abuso pasado o actual o dependencia de sustancias estupefacientes, así como embarazo o lactancia actual. Todos los pacientes tenían un estilo de vida sedentario. Los datos clínicos se obtuvieron a partir de un examen físico, y se evaluaron utilizando el Cuestionario de Impacto de Fibromialgia (FIQ), incluyendo las escalas analógicas visuales sobre el dolor general y difuso típico de FM (VAS). Mario David Cordero Morales 36 3.2. Reactivos. Los reactivos 2,6-Dicloroindofenol sodio hidratado (DCPIP), 5,5′-Dithiobis (2-ácido nitrobenzoico) (DTNB), Triton, Acetil CoA, Oxalacetato, BSA-EDTA, CoQ1, Rotenona, KCN, Succinato, Antimicina A, Citocromo C, tripsina (0,25% Trypsin-EDTA Solution) y coctel inhibidor de proteasas, junto con el inhibidor de la síntesis de CoQ 4- aminobenzoato (PABA) y lipopolisacárido de E. coli fueron adquiridos de la casa comercial Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El anticuerpo anti- GAPDH anticuerpo monoclonal de Calbiochem - Merck Chemicals Ltd. (Nottingham, Reino Unido). Los anticuerpos específicos para los complejos mitocondriales complejo anti- I humano (subunidad 39 kDa), complejo II (30 kDa subunidad I), Complejo III (subunidad Core 1) y Complejo IV (COX II), MitosoxTM, PicoGreen, BODIPY 581/591 y Hoechst 3342, fueron adquiridos de Invitrogen / Molecular Sondas (Eugene, Oregón). Los anticuerpos complejo I subunidad 8kDa y complejo II subunidad 70 kDa y OGG - 1 fueron de Abcam (Cambridge, Reino Unido). Los anticuerpos para catalasa y MnSOD fueron adquiridos en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anticuerpo anti-citocromo c se adquirió en PharMingen (BD Bioscience, San Jose, California). Los anticuerpos anticaspase-1 y anti-caspasa 3 activa fueron adquiridos en Cell Signaling Technology. El anticuerpo anti - NLRP3 de Adipogen (San Diego, EE.UU.) y anti -IL - 1β (p17) de Santa Cruz de Biotecnología. Un cóctel de inhibidores de proteasa (cóctel completo) se adquirió de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). El kit de sustrato Immun estrella HRP era de Bio -Rad Laboratories Inc. (Hercules, CA). 37 Material y Métodos 3.3. Cultivos de fibroblastos Los fibroblastos derivados de los pacientes y controles se obtuvieron de acuerdo con las declaraciones de Helsinki de 1964, revisada en 2001 y el consentimiento informado de los pacientes. Los fibroblastos se cultivaron en un medio D- MEM (4.500 mg / L de glucosa, L - glutamina, piruvato), (Gibco, Invitrogen, Eugene, OR, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco, Invitrogen, Eugene, Oregón, EE.UU.) y antibióticos (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5 %. 3.4. Líneas celulares 3.4.1. Líneas de fibroblastos de fibromialgia En este proyecto hemos trabajado con líneas de fibroblastos de piel aislados de tres pacientes con diagnóstico de FM mediante biopsia de piel en condiciones de esterilidad con punch de 4mm. Las pacientes fueron tres mujeres de 40, 42 y 42 años de edad. Los datos clínicos serán mostrados en el apartado de resultados. 3.4.2. Líneas de fibroblastos de enfermedades mitocondriales Los fibroblastos MELAS se obtuvieron de un paciente que presentaba una mutación A por G heteroplásmica en el nucleótido 3243 en el gen tRNALeu (UUR). Clínicamente, el paciente presentaba encefalomiopatía, episodios tipo ictus, y acidosis láctica, además de baja estatura, diabetes mellitus, sordera, demencia y ataxia. El nivel de heteroplasmia fue del 43 % en los fibroblastos. La fisiopatología molecular de estos fibroblastos se describen en las referencias Cotán et al., 2011. Las células fueron cedidas por la Dra. Sandra Jackson del Hospital Universitario Carl Gustav Carus, Dresden (Alemania). Mario David Cordero Morales 38 Los fibroblastos MERRF se obtuvieron de un paciente que presentaba una mutación m.8344A > G con una heteroplasmia del 57 %. La fisiopatología molecular se describe en las referencias de la Mata et al., 2012. Las células fueron cedidas por la Dra. Sandra Jackson del Hospital Universitario Carl Gustav Carus, Dresden (Alemania). Los fibroblastos LHON se obtuvieron de un paciente que presentaba una mutación m.11778G >A. Los fibroblastos LHON no habían sido caracterizados antes de este trabajo. Las células fueron cedidas por la Dra. Sandra Jackson del Hospital Universitario Carl Gustav Carus, Dresden (Alemania). 3.5. Muestras sangre La recogida de muestras sanguíneas se hizo de forma ambulatoria mediante punción venosa con Vacutainer en condiciones de esterilidad, en tubos con anticoagulante EDTA. Se tomaron 16 ml de sangre a cada paciente. 3.6. Aislamiento de PBMC mediante Ficoll-PaqueTM PLUS. Para la obtención de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se utilizó el protocolo basado en la utilización del polisacárido hidrofílico Ficoll-PaqueTM PLUS. Para este protocolo usamos entre 2,5 - 3 ml de sangre heparinizada y mezclada con 1,5 ml de solución salina equilibrada (BSS, Balanced Salt Solution), solución salina con glucosa que mantenía la viabilidad de las células sanguíneas. Para cada 2 ml de sangre con BSS, se utilizó 1,5 ml de Ficoll-PaqueTM PLUS. El primer paso consistía en introducir el Ficoll- PaqueTM PLUS dentro de un tubo Corning de 15 o 50 ml, dependiendo del volumen de sangre obtenido. A continuación, la sangre se introduce lentamente con una pipeta 39 Material y Métodos Pasteur, evitando que se mezclase con la capa de Ficoll-PaqueTM PLUS. Posteriormente se centrifuga a 900 g con una centrífuga basculante durante 40 min. Tras la centrifugación se observaba la separación de los componentes de la sangre, una fase superior amarilla de plasma, seguida de una interfase que contenía los monocitos y linfocitos (PBMC) situada encima del Ficoll y, finalmente, un precipitado formado por plaquetas, eritrocitos y demás fragmentos celulares. Recogimos la interfase formada por monocitos y linfocitos con una pipeta Pasteur, y se pasaba a un nuevo tubo Corning, donde por cada mililitro de células recogidas se añadían 3 ml de tampón BSS, se invertía y se centrifugaba a 900 g durante 10 min para eliminar las plaquetas y limpiar las PBMC. 3.7. Obtención de muestras biológicas. Las muestras de, orina, biopsia de piel y saliva se obtuvieron de la paciente en la que se observó la mutación. La primera muestra de orina de la mañana de 30-40 ml se recogió mediante un tubo de centrífuga de 50 ml limpio (producido por Corning) y se centrifugó a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener sedimentos. La saliva no estimulada se obtuvo por babeo pasivo en tubos de 1,5 ml (Eppendorf, Hamburg, DE). Aproximadamente 3 ml de toda la saliva se centrifugó a 1500 g a 4 ° C durante 10 minutos. Después de desechar cuidadosamente el sobrenadante, el sedimento celular insoluble se lavó dos veces usando tampón de PBS enfriado con hielo y se almacenó a - 80 ºC hasta su análisis. La biopsia de piel fue tomada de la misma forma que para obtener los fibroblastos. Mario David Cordero Morales 46 - Tampón KP 100mM pH7 500 μl 50mM - KCN 30mM 50 μl 1,5mM - DCPIP 1mM 100 μl 0,1mM - Homogenado 20μl - Agua destilada 230μl Agitar e incubar 2 minutos a 30ºC, para después añadir: - Succinato 320mM 100 μl 32mM Agitar, incubar 30 segundos a 30ºC y leer 2 minutos a λ=600nm, para luego añadir: - CoQ1 10mM 5μl 5μM Cálculos: *ɛ = 19 mM-1cm-1 Actividad SDH: se usa el Δ de la reacción del succinato Actividad Complejo II: se usa el Δ de la reacción con el CoQ1 3.12.6. Complejo III: DBH2 – Citocromo C Oxidorreductasa Cada muestra se analizará en paralelo con Antimicina y sin Antimicina. - Tampón KP 100mM pH7,5 500μl 50mM - NaN3 50mM 40μl 2mM - BSA-EDTA 1% 100μl - ± Antimicina A (1mg/ml EtOH 50%) 10μl - Agua destilada 285μl en la cubeta con Antimicina 259μl en la cubeta sin Antimicina 47 Material y Métodos - DBH2 10mM 5μl 50μM Agitar y leer la línea base durante 2 minutos a 30ºC y λ=550nm: - Homogenado 10μl Agitar y leer 2 minutos a 30ºC y λ=550nm: - CoQ1 10mM 5μl 5μM Cálculos para actividad sensible a Antimicina: *ɛ = 21 mM-1cm-1 = Abs / min sin Antimicina - Abs / min con Antimicina 3.12.7. Complejo I + III: NAHD – Citocromo C – Reductasa En el siguiente orden se añade a la cubeta: - Tampón KP 100mM pH7,5 550μl - Citocromo C 1mM 100μl - KCN 30μl - Homogenado 10μl - Agua destilada 210μl Agitar y leer la línea base durante 2 minutos a 30ºC y λ=550nm, para después añadir iniciadores de la actividad: - NADH 1mM 100μl Agitar y leer 2 minutos a 30ºC y λ=550nm Cálculos: *ɛ = 21 mM-1cm-1 (Abs/min) = Abs / min con NADH Mario David Cordero Morales 48 3.12.8. Complejo II + III: Succinato – Citocromo C – Reductasa En el siguiente orden se añade a la cubeta: - Tampón KP 100mM pH7,5 550μl - Citocromo C 1mM 100μl - KCN 30μl - Homogenado 30μl - Agua destilada 190μl Agitar y leer la línea base durante 2 minutos a 30ºC y λ=550nm, para después añadir iniciadores de la actividad: - Succinato 30mM 100μl Agitar y leer 2 minutos a 30ºC y λ=550nm Cálculos: *ɛ = 21 mM-1cm-1 (Abs/min) = Abs / min con succinato 3.12.9. Complejo IV - Citocromo C Oxidasa En el siguiente orden se añade a la cubeta: - Tampón KP 100mM pH7 100μl 10mM - Citocromo C 800μM (1%) Reducido 100μl 80μl - Agua destilada 790μl Agitar e incubar 2 minutos a 38ºC y λ=550nm, para después añadir: - Homogenado 10μl Agitar y leer la durante 2 minutos a 38ºC y λ=550nm. 49 Material y Métodos Cálculos para actividad COX: *ɛ = 21 mM-1cm-1 = Abs / min de la reacción con Citocromo C reducido 3.13. Análisis de proteínas mediante Western-Blot. 3.13.1. Cuantificación de proteínas por el método Bradford. Para determinar la cantidad de proteínas para los ensayos de Western-Blot se usó una modificación del método colorimétrico de Bradford (Bradford, 1976) ideada para muestras que contienen membranas (Stoschek, 1990). El ensayo se realizó añadiendo en una cubeta de espectrofotómetro 50 μl de NaOH 1M, 20 μL de la muestra y 1 ml de reactivo de Bradford. Tras dejar incubar la mezcla 5 minutos a temperatura ambiente y protegida de la luz, se midió la absorbancia a 595nm en un espectofotómetro UniCam UV 500 (Thermo Spectronic). La cantidad de proteína fue determinada mediante una recta patrón realizada con cantidades conocidas de inmunoglobulina G (0-28 μg). 3.13.2. SDS-Page y Western-Blot. El análisis de las proteínas que estaban presentes en los lisados celulares se llevó a cabo mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), según el procedimiento descrito por Laemli (Laemli, 1970), a una intensidad de 35mM/gel en un sistema MiniProtean III (Bio-Rad) y con tampón de carrera TGS10X (Tris/Glycine/SDS Buffer 10X, BioRad). Se prepararon geles de diferentes concentraciones de acrilamida de acuerdo a las necesidades del peso molecular de las proteínas a estudiar y al 4% el gel condensador. Realizamos la electroforesis a 120 V en tampón de electroforesis TGS (Tris/Glicina/SDS, Bio-Rad). Tras la electroforesis se procedió a la transferencia (Trans- Blot, SD, Semi-Dry Transfer Cell con fuente de alimentación Bio-Rad Power Pac 1000) a 25V y durante 45 minutos en tampón de transferencia TG (Tris/Glycine Buffer 10X, BioRad). Se usaron membranas de Nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amerscham Mario David Cordero Morales 50 Biosciences). Finalizada la transferencia, para comprobar que la misma se ha realizado correctamente, la membrana de nitrocelulosa fue teñida con una solución de Rojo Ponceau al 0.5% en ácido acético al 1%. Después de desteñir el rojo Ponceau con ácido acético 1%, las membranas fueron bloqueadas con TTBS (Tris 20mM pH 7.6, NaCl 150 mM+Twenn-20 0,05%)+Leche 0,5% a 4ºC durante 16 horas. 3.13.3. Inmunodetección con anticuerpos y electrotransferencia de proteínas Las membranas, una vez bloqueadas se incubaron con los anticuerpos primarios durante toda la noches a 4ºC en TTBS (TBS, Tween-20 al 0.05%, agua destilada y leche en polvo). A continuación, lavamos las membranas tres veces durante 5 minutos cada lavado en TTBS (TBS, Tween-20 al 0.05%, agua destilada). Posteriormente, las membranas fueron incubadas con el correspondiente anticuerpo secundario, que está marcado con peroxidasas de rábano HRP para catalizar la oxidación del luminol en presencia del peróxido de hidrógeno, durante 2 horas en TTBS (igual que el primario). Realizamos la detección de la proteína por quimioluminiscencia mediante el kit comercial immun-Star HRP Chemiliminiscent (BioRad Laboratories) y películas fotográficas CL- XposureTMFilm (Clear Blue X-Ray Film, Pierce). La imagen de Western blot se cuantificó utilizando el software ImageJ (ver: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). 3.14. Amplificación por PCR y secuenciación El ADNmt completo se amplificó a partir de ADN total en 24 fragmentos superpuestos de PCR de 800-1.000 pb de largo. Los cebadores fueron cuidadosamente diseñados utilizando la secuencia Cambridge revisada de referencia para el ADNmt (www.mitomap.org/mitoseq.html). 51 Material y Métodos Los fragmentos de PCR se secuenciaron en sistema secuenciador ABI 3730 (Applied Biosystems; www.appliedbiosystems.com; Foster City, CA) usando un kit de secuenciación BigDye v3.1 (Applied Biosystems; www.appliedbiosystems.com; Foster City, CA). El montaje y la identificación de las variaciones en el ADN mitocondrial se realizó usando el paquete Staden (Bonfield et al., 1995). Para este propósito se utilizó la secuencia de referencia revisado mitocondrial humano DNA Cambridge (www.mitomap.org/mitoseq.html). Todo el proceso se llevó a cabo en Secugen (Madrid, España). 3.15. Niveles IL-1β e IL-18 Los niveles de IL-1β (Genway, San Diego CA, EE.UU.) e IL-18 en suero (Biosensis, Australia) se analizaron por duplicado por los kits ELISA comerciales. Brevemente, el procedimiento consistió en pipetear en una placa multipocillos cuyos pocillos estaban revestidos de un anticuerpo específico para la IL-1β, 100 µl de suero de cada sujeto y se dejó incubar durante una hora a temperatura ambiente. Tras esta incubación y los lavados correspondientes, se procedió a la incubación con un segundo anticuerpo biotinilado durante otra hora. Buscar qué es esto. Durante la primera incubación, el antígeno IL-1β se une de forma simultánea al anticuerpo inmovilizado en un sitio, y al anticuerpo biotinilado en un segundo sitio. Después de la eliminación del exceso de este segundo anticuerpo, se añadió la enzima estreptavidina-peroxidasa. Ésta se une al anticuerpo biotinilado para completar el sándwich de cuatro miembros. Después de una incubación y del lavado para eliminar toda la enzima no unida, se añadió una solución de sustrato, que actúa sobre la enzima unida para producir color. Finalmente las muestras fueron analizadas en un espectrofotómetro (iMark microplate, Bio-Rad) a una longitud de onda Mario David Cordero Morales 52 de 450nm. La intensidad de este producto coloreado es directamente proporcional a la concentración de IL-1β presente en las muestras. Para la determinación de los niveles de IL-18 presente en el suero de los sujetos, se utilizó igualmente un Kit de ELISA (Biosensis, Australia), procediendo como indica el fabricante. Se añadieron 100 µl de cada muestra en una placa que estaba revestida de un anticuerpo monoclonal específico para IL-18 y se incubaron durante una hora. Durante esta primera incubación, IL-18 es capturado e inmovilizado sobre la placa. Después del lavado, un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-IL-18 anticuerpo se pipeteó en los pocillos, y se incubó durante una hora. La unión del anticuerpo conjugado HRP a los pocillos completa el sándwich de tres miembros. Tras el lavado, la actividad de HRP se detectó mediante la incubación del reactivo de sustrato TMB durante 30 minutos. La incubación del reactivo de sustrato dentro de los pocillos produce un color que es proporcional a la cantidad de IL-18 contenida en la muestra. Al final del período de incubación, la reacción se paró añadiendo a cada pocillo una solución que termina la reacción catalizada por HRP y estabiliza el color formado. La absorbancia de cada pocillo se midió a 450 nm utilizando un lector de placa iMark microplate, Bio-Rad. 3.16. Niveles de ATP Los niveles de ATP se determinaron en homogenados celulares mediante un ensayo de bioluminiscencia utilizando un kit de determinación de ATP (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este kit se basa en el requerimiento de ATP por parte de la luciferasa para la producción de luz, de manera que a mayor contenido de ATP de la muestra, mayor emisión de luz. De esta forma, en los ensayos se mezclaron cantidades proporcionales de una solución de reacción que contenía luciferasa de 53 Material y Métodos luciérnaga recombinante y su sustrato D- luciferin, con los homogenados de tejido, para medir posteriormente la luminiscencia emitida con un luminómetro modelo Luminoskan TL Plus (Thermos Lab Systems) a una longitud de onda de 560nm. Para la cuantificación final, se realizó una recta de calibrado con muestras de ATP de concentración conocida. 3.17. Cuantificación de ADNmt El ADN se extrajo por lisis celular estándar. Los cebadores utilizados fueron: para el ADN mitocondrial, mtF3212 (5'-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3 ') y mtR3319 (5'- TGGCCATGGGTATGTTGTTAA-3') y para el ADN nuclear para la normalización, 18S rRNA 18S1546F gen (5'-3-TAGAGGGACAAGTGGCGTTC ') y 18S1650R (5'- CGCTGAGCCAGTCAGTGT3'). Las unidades arbitrarias se calcularon como la relación entre la banda de densidad óptica correspondiente a la del ADNmt estudiado en el ciclo 20-30th y la del ADNn en el ciclo de amplificación 15th. 3.18. Genotipado de la mutación en pacientes y cíbridos Una vez que se extrajo el ADN, la amplificación por PCR del fragmento de mtCYB que contiene la mutación, desde 15.700 hasta 16.003 nucleótidos de ADNmt, se realizó usando los siguientes cebadores: 5'-TCCATCAGGGTATCCTCTCC-3 'y 5'- GGAGGCAAGCATAAGACTGG -3', produciendo un producto final de 300 pb. Los productos de amplificación fueron digeridos con la enzima de BbvI y se fraccionó en un gel de agarosa al 2,5%. Después de la electroforesis en gel de ADN no mutante y los fragmentos de ADN mitocondrial mutantes pueden ser discriminados debido a que en el Mario David Cordero Morales 54 ensayo de restricción BbvI se generara un patrón de bandas diferencial (no mutante ADNmt: fragmento de 300 pb, y el ADNmt mutante: 181 y 119 fragmentos bp). 3.19. Producción mitocondrial de ROS La generación mitocondrial de ROS en PBMCs y fibroblastos fueron determinados mediante el uso de MitoSOX™, un indicador de la dismutasa mitocondrial en rojo. Citometría de flujo. Aproximadamente 1-x-106 células se incubaron con 1μM MitoSOXTM rojo durante 30 min a 37°C, se lavó dos veces con PBS, se resuspendieron en 500 ml de PBS y se analizaron por citometría de flujo en un citómetro Epics XL, Beckman Coulter, Brea, California, EE.UU. (excitación a 510 nm y detección de fluorescencia a 580 nm). Microscopía de fluorescencia. Los fibroblastos cultivados sobre cubres-objetos estériles en placas de 6 pocillos de 9,6cm2/pocillo (Nunc Multidishes 6 well, NuncTM), en medio DMEM-4500mg/L Glucosa más 10% FBS se incubaron con MitoSOX™ Red durante 30 min a 37 ° C, se lavaron dos veces en PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 0,5-1 h a temperatura ambiente, y se lavaron dos veces con PBS. Después de eso, las células se incubaron durante 10 min a 37 ° C con anticitocromo c anticuerpo (Invitrogen, Barcelona, España) para marcar las mitocondrias. Las muestras se visualizaron por microscopía de fluorescencia usando un microscopio TCS SL de Leica. 3.20. Determinación de la peroxidación lipídica Se cultivaron las células sobre cubres-objetos estériles en placas de 6 pocillos de 9,6cm2/pocillo (Nunc Multidishes 6 well, NuncTM), en medio DMEM-4500mg/L 55 Material y Métodos Glucosa más 10% FBS. Una vez alcanzada la densidad deseada, se añadió al medio C11- Bodipy 1μM (BODIPY® 581/591 C11, Molecular Probes) y se incubó el cultivo durante 30 minutos a 37ºC. Posteriormente se lavó la monocapa celular con PBS y se montaron los cubres sobre los portas con Mounting medium for fluorescente (Vector Laboratories, Burlingame, CA). El colorante fluorescente C11-Bodipy 581/59 se inserta en las membranas lipídicas y permite la evaluación cuantitativa de lípidos oxidados y no oxidados, fluorescentes en color verde o rojo respectivamente. Las muestras se visualizaron por microscopía de fluorescencia usando un microscopio TCS SL de Leica. 3.21. Cuantificación de la tasa de proliferación celular Se cultivaron 100.000 fibroblastos durante 72 horas. Tras desechar las células muertas retirando el medio de cultivo y reemplazándolo por medio fresco, las células fueron contadas usando un microscopio invertido con objetivo 40X (Olympus CK40). 3.22. Determinación de los niveles de daño oxidativo del ADN por 8- hidroxideoxiguanosina. Para la determinación de la 8-hidroxideoxiguanosina (8-oxo-G) se utilizó el kit de la 8- oxo-dGuo-EIA-BIOTECH (OXIS Health Products, Inc. 6040 N Cutter Circle, Suite 317 Portland, OR 97217-3935 U.S.A.), tal como sigue: a una placa en la cual está fijada la 8- oxo-dGuo se añadió el anticuerpo monoclonal de 8-oxo-G y la muestra o estándar. La 8- oxo-dGuo en la muestra o estándar compite con el 8-oxo-G unido a la placa por los sitios de unión del anticuerpo monoclonal de 8-oxo-G. Los anticuerpos que se han unido a la 8-oxo-dGuo de la muestra son lavados, mientras que aquellos que se han unido a la 8- Mario David Cordero Morales 62 IMC, Índice de masa corporal; FIQ, Cuestionario de impacto de la Fibromialgia; VAS, Escala Visual Analógica. n=20 y 30 para controles y FM respectivamente. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. Por otro lado, una de las principales características de esta enfermedad desde el punto de vista diagnóstico, es la falta de marcadores alterados en las pruebas diagnósticas comúnmente usadas en la práctica clínica. En este sentido, nuestros pacientes no mostraron ninguna alteración relevante en los valores analíticos bioquímicos de rutina (Tabla 2) Tabla 2. Parámetros de bioquímica sérica en pacientes con FM. n=20 para controles y n=30 para pacientes con FM respectivamente. Parámetros bioquímicos Controles Pacientes Glucosa (mg/dL) 93.8 ± 15.2 98.1 ± 12.2 Ácido úrico (mg/dL) 3.9 ± 1.5 3.1 ± 1.6 GOT (mU/mL) 21.9 ± 8.8 25.2 ± 7.3 GPT (mU/mL) 23.5 ± 5.1 24.6 ± 6.1 Creatina kinasa (IU/L) 671.1 ± 42.3 623.5 ± 34.4 Colesterol (mg/dL) 179.9 ± 53.4 176.9 ± 59.1 Triglicéridos (mg/dL) 157.5 ± 60.1 144.9 ± 52.3 4.1. Disfunción mitocondrial en PBMC de pacientes con FM Las alteraciones de la cadena respiratoria mitocondrial son uno de los marcadores más utilizados para detectar la presencia de disfunción mitocondrial. En este sentido, hemos observado una importante reducción de la actividad de los complejos de la cadena 63 Resultados respiratoria mitocondrial, entre el 50-60%, en las PBMC de los pacientes en comparación con las células control (Figura 9). Figura 9. Actividades enzimáticas de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en PBMC de pacientes con FM. n = 20 y 30 para el grupo control y grupo de FM, respectivamente. Actividades enzimáticas mitocondriales. La determinación de la actividad enzimática de cada uno de los complejos se llevó a cabo por análisis espectrofotométrico según se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se expresan en U/CS (unidades por citrato sintasa), y representan la media±DS de tres experimentos independientes. * P < 0,001 y ** P < 0,01 entre los pacientes de control y FM. Esta reducción de la actividad en la cadena mitocondrial en PBMC era acompañada de una importante reducción de los niveles de expresión de las proteínas mitocondriales Mario David Cordero Morales 64 correspondientes a los complejos I y el complejo III (Figura 10A y 1B) apoyando los resultados obtenidos en la medida de la actividad enzimática mitocondrial. Figura 10. Expresión de proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial. A. Niveles de expresión de las proteína de los complejo mitocondriales I (subunidad 39 kDa), complejo III (Subunidad Core I), y oxoguanina-glicosilasa 8 (OGG - 1, una enzima ADN glicosilasa responsable de la escisión de 7,8 -dihidro- 8 -oxoguanine (8 - oxo G). B. Los niveles de las proteína se determinaron por análisis densitométrico (IOD, intensidad óptica integrada) de tres Western blots diferentes y normalizados respecto la señal de GADPH, utilizando PBMC a partir de cuatro pacientes con FM representativos, en comparación con un grupo de 5 saludable sujetos de control por edad y sexo. El CoQ10 es un componente clave de la cadena respiratoria mitocondrial debido a su función en la transferencia de electrones de los complejos I y II del complejo III, por lo que las deficiencias de este transportador de electrones están asociadas con la disfunción mitocondrial en una variedad de trastornos humanos. De acuerdo con esto, en nuestros pacientes hemos podido observar una considerable reducción de los niveles de CoQ10 (46%) respecto del valor medio de las células control en las PBMC de los pacientes con FM (Figura 11A). Por otra parte, para determinar el efecto de la disfunción mitocondrial 65 Resultados en la bioenergética celular, medimos los niveles de ATP intracelulares en PBMC de los controles y pacientes con FM. Tras la determinación, pudimos observar que los niveles de ATP se mostraban reducidos al 76% respecto a los controles (p <0,001) (Figura 11B). Figura 11. Disfunción bioenergética y estrés oxidativo en PBMC de controles y pacientes con FM. A. Niveles de CoQ10 en células de control y FM determinadas mediante extracción con hexano y separación por HPLC como se describe en Material y Métodos. B. Los niveles de ATP en control y FM BMC se analizaron por bioluminiscencia como se describe en Material y Métodos. C y D. Se analizaron la producción de ROS mitocondriales y la producción de 8-oxo-G en PBMC de los pacientes de control y FM por citometría de flujo y el kit de EIA como se describe en Material y Métodos. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P < 0,001, ** P < 0,01 entre las células del grupo control y FM. Mario David Cordero Morales 66 4.2. Estrés oxidativo en PBMC de los pacientes con FM Está bien establecido que la disfunción mitocondrial está asociada con la inducción de la producción de ROS en las mitocondrias. Además, el estrés oxidativo se ha propuesto como un evento relevante en la patogénesis de FM que muestra una correlación positiva significativa con los síntomas clínicos. A fin de evaluar el estrés oxidativo en FM, se determinó la producción de ROS mitocondrial en las PBMC a partir de controles y de pacientes con FM mediante el uso de MitoSOX, un indicador de superóxido mitocondrial. La producción de superóxido mitocondrial fue significativamente mayor en PBMC de los pacientes con FM respecto a los controles (p <0,001) (Figura 11C). Además, como marcador de estrés oxidativo, se determinaron los niveles de expresión de 8-oxoguanina glicosilasa (OGG1), una ADN enzima glicosilasa responsable de la escisión de 7,8- dihidro-8-oxoguanina (8-oxo-G), un subproducto de base mutagénica que se produce como resultado de la exposición del ADN a los ROS, y los niveles de 8-oxo-G en PBMC de los pacientes. Como muestra la figura, los pacientes con FM mostraron significativamente más altos niveles de OGG1 (Figura 10A) y 8-oxo-G en las PBMC de los pacientes con FM (Figura 11D). Estos datos muestran un intenso daño oxidativo del ADN como consecuencia del alto nivel de ROS que observamos en las células de los pacientes respecto a los controles sanos. 4.3. Activación del complejo inflamasoma por el estrés oxidativo involucrados en el dolor de la FM Como ya hemos mencionado anteriormente, la mitocondria y el estrés oxidativo constituyen dos importantes inductores de la activación del complejo inflamasoma. Zhou y colaboradores mostraron que la inhibición de los complejos I, II o III inducía un 67 Resultados incremento en la producción de ROS que provocaba la activación del complejo NLRP3- inflamasoma (Zhou et al., 2011). Dado que nuestros pacientes mostraron una considerable disfunción mitocondrial marcada por reducida actividad de los complejos I y II con importante incremento en la producción de ROS mitocondriales, nos propusimos analizar la activación de las proteínas relacionados con el inflamasoma. Nuestros resultados mostraron un importante aumento de la expresión génica NLRP3 y de la caspasa-1, aumento de los niveles de expresión de proteínas NLRP3 y la caspasa-1 escindida que sugiere la activación del inflamasoma (Figura 12A y 12B). Dado que la activación de la caspasa-1 está también relacionada con la apoptosis o muerte celular, comparamos esta activación con la de otra caspasa relacionada con la muerte celular pero no con la inflamación como la caspasa-3. No observamos activación de la caspasa-3, por lo que la activación de caspasa-1 no era secundaria a la activación de vía de muerte celular por apoptosis. Mario David Cordero Morales 68 Figura 12. Activación del complejo NLRP3-inflamasoma en PBMCs de pacientes con FM respecto a controles. Los niveles de proteína NLRP3 y de la activación de caspasa 1 se analizaron por Western blot. Los niveles de proteína se determinaron mediante análisis densitométrico (IOD, intensidad óptica integrada) de tres Western blots diferentes y normalizadas respecto a GADPH, utilizando PBMC a partir de cuatro pacientes con FM representativos, en comparación con un conjunto de 5 sujetos control de igual edad y sexo. PBMC de individuos sanos fueron tratados con lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli para ser usados como control positivo de la activación de caspasa-1. Este incremento en las proteínas era acompañado de un incremento de transcritos tanto de NLRP3 como de Caspasa-1 (Figura 13). Figura 13. Activación del complejo NLRP3-inflamasoma en PBMCs de pacientes con FM respecto a controles determinada por expresión a tiempo real. A. Niveles de expresión de B. Los niveles de las proteína se determinaron por análisis densitométrico (IOD, intensidad óptica integrada) de tres Western blots diferentes y normalizados respecto la señal de GADPH, utilizando PBMC a partir de cuatro pacientes con FM representativos, en comparación con un grupo de 5 saludable sujetos de control por edad y sexo. de NLRP3 y B. Caspasa 1 determinados por Real time RT-PCR cuantitativa. n = 20 para el control y n = 69 Resultados 30 para el grupo de FM, respectivamente. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P < 0,05 entre los pacientes del grupo control y FM. La consecuencia final de la activación del complejo inflamasoma es la liberación de la forma activa de las IL-1β e IL-18 como una forma de inflamación sistémica. En ese sentido, sería lógica la presencia de incrementaros niveles de estas citoquinas en la sangre de los pacientes. En nuestro estudio, estas citoquinas implicadas en la activación del inflamasoma y la inflamación, como la IL-1β e IL-18, se encontraron incrementadas en suero de pacientes con FM (Figura 14A y 14B). Figura 14. Niveles de IL-1β (A) e IL-18 (B) en suero de los pacientes con FM en comparación con los controles sanos. La determinación se hizo mediante ELISA tal y como se describe en el Material y métodos. n = 20 para el control y n = 30 para el grupo de FM, respectivamente. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. P < 0,001 entre el control y los pacientes con FM. Mario David Cordero Morales 70 Estos niveles de IL- 1β incrementados en suero de los pacientes se correlacionaban con los niveles de proteína IL- 1β en su forma activa (p17) en las PBMC (Figura 15A). Dado que nuestros datos parecen mostrar que la activación del complejo inflamasoma en nuestros pacientes viene mediada por la disfunción mitocondrial y el consecuente estrés oxidativo, las PBMC de pacientes con FM fueron aisladas y cultivadas con CoQ10 para tratar la deficiencia detectada en las células de los pacientes y por su potencial antioxidante y protector de la mitocondria. Tras el tratamiento en cultivo con CoQ10 30μM después de 24 h las células mostraron una importante reducción de la caspasa-1 activa así como de los niveles de proteína IL- 1β (p17) (Figura 15B y 15C). Figura 15. Efecto del tratamiento con CoQ10 en la activación del complejo inflamasoma en células de pacientes con FM. A. Niveles de proteína IL-1β en la forma activa p17 en PBMC de varios pacientes comparados con PBMC de controles sanos y la IL- 1β. B. Efectos del tratamiento con CoQ10 30µM en los niveles de proteína IL- 1β p17 tras 24h de incubación. C. Niveles proteicos de caspasa-1 activa en PBMC de los pacientes antes y después del tratamiento CoQ10 30µM. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P < 0,001 entre el control y los pacientes con FM. 71 Resultados Por otro lado, y dado que nuestros resultados mostraron que el tratamiento con un antioxidante y protector mitocondrial reducían la activación del complejo inflamasoma, realizamos una correlación mediante Pearson entre los niveles séricos de IL-1β y los niveles tanto de CoQ10 como marcador de la disfunción mitocondrial de estos pacientes como los niveles de ROS mitocondriales. Los niveles séricos de IL-1β en pacientes con FM mostraron una correlación negativa significativa (P<0.05) con los niveles de CoQ10 y una correlación positiva significativa (p<0,001) con los niveles de ROS mitocondriales (Figura 16A y 16B). Mario David Cordero Morales 78 Tabla 3. Características de pacientes y controles. Control 1 Control 2 FM1 FM2 FM3 Edad (años) 42 41 40 42 42 Puntos dolorosos --- --- 14 13 15 Duración enfermedad (años) --- --- 7 6 8 Sexo Mujer Mujer Mujer Mujer Mujer IMC 20.80 21.15 20.14 21.80 20.04 FIQ, range 0-80 --- --- 63 65 61 VAS, range 0-10 --- --- 8 7 8 Glucosa (mg/dL) 93.2 92.4 94.3 93.15 92.2 Ácido Urico(mg/dL) 3.8 3.9 3.2 3.7 3.7 GOT (mU/mL) 25.4 24.3 25.5 23.4 24.1 GPT (mU/mL) 24.5 23.1 25.2 24.9 24.1 Creatina kinasa(IU/L) 650.1 648.3 652.4 649.3 650.1 Colesterol (mg/dL) 178.9 179.4 169.4 178.6 165.2 Triglicerides (mg/dL) 152.6 159.3 155.7 153.3 157.1 IMC: índice de masa corporal; FIQ: Cuestionario de Impacto de Fibromialgia; VAS: escala analógica visual. Los fibroblastos de pacientes con FM mostraron una reducción significativa en las actividades de las enzimas respiratoria mitocondrial en comparación con los fibroblastos de control (Figura 19). 79 Resultados Figura 19. La actividad enzimática de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en los fibroblastos de la piel de los pacientes con FM. Las actividades enzimáticas mitocondriales se determinaron como se describe en Materiales y Métodos. Resultados (media ± DE) se expresan en U / CS (unidades por citrato sintasa). * P < 0,001 ; ** P < 0,01 entre los pacientes de control y FM. De igual forma que en los resultados observados en las PBMC de los pacientes con FM, los niveles de expresión de proteínas mitocondriales se correlacionaron con la reducción de las actividades observadas en las enzimas respiratorias (Figura 20). Mario David Cordero Morales 80 Figura 20. Los niveles de expresión de las proteínas de las subunidades de los complejos I, II, III y IV mitocondriales determinados mediante western blot. Los niveles de proteína se determinaron mediante análisis densitométrico (IOD, la intensidad óptica integrada) de tres transferencias de Western diferentes y se normalizó con respecto a GADPH, utilizando fibroblastos a partir de tres pacientes con FM, en comparación con un grupo de fibroblastos de 5 por edad y sexo sano sujetos de control. * P < 0,001; ** P < 0,01; *** P < 0,05 entre los pacientes de control y FM. Dado que los fibroblastos mostraron una clara disfunción mitocondrial, cabría esperar un descenso en el metabolismo bioenergético de las células. Para ello, se investigó la función mitocondrial mediante la medición de los valores de tasa de consumo de oxígeno (OCR) en los fibroblastos de control y de FM, expuestos secuencialmente a cada uno de cuatro 81 Resultados moduladores de la fosforilación oxidativa (OXPHOS): oligomicina (un inhibidor de la F1Fo-ATPasa o complejo V), 2,4-DNP (desacoplamiento de la cadena de transporte de electrones de la fosforilación oxidativa) y antimicina / rotenona (inhibidores de los complejo I y III respectivamente) (Figura 21A). El OCR basal estaba considerablemente afectado en los fibroblastos de los pacientes de FM en comparación con los controles (Figura 21B). La capacidad respiratoria de repuesto (SRC) de las células, o capacidad de las células para aumentar la producción de ATP, se obtuvo mediante el cálculo de la media de los valores de OCR después de la inyección de 2,4-DNP menos la respiración basal y podría ser utilizado como un indicador de lo cerca que una célula está funcionando al máximo límite bioenergético. Los fibroblastos de pacientes con FM mostraron una disminución significativa de SRC en comparación con las células control (Figura 21C). Mario David Cordero Morales 82 Figura 21. Tasa de consumo de oxígeno (OCR) en las células de los pacientes del grupo control y FM. A. El nivel de OCR se determinó usando el Seahorse XF- 24 extracelular Flux Analyzer con la inyección secuencial de oligomicina (1 mg / mL), 2,4- DNP (100 mM), rotenona (1 M) en el punto de tiempo indicado. B. El OCR basal se observa marcadamente afectado en las células de FM en comparación con el control. C. La capacidad respiratoria de repuesto (SRC) de los fibroblastos FM mostró una disminución significativa con respecto al control fibroblastos. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P < 0,001 entre los pacientes de control y FM. Esta reducida capacidad respiratoria por parte de las células mostró consecuencias desde el punto de vista bioenergético en las células de los pacientes, observándose bajos niveles de ATP (Figura 22). Figura 22. Bioenergética de fibroblastos de pacientes con FM determinados por luminiscencia tal y como se describe en el apartado de material y métodos. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P < 0,001; ** P < 0,01 entre los pacientes de control y FM. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Control 1 Control 2 Control 3 FM1 FM2 FM3 Niveles de ATP (nMol/mg proteína) * ** * 83 Resultados Además, de forma similar a los resultados observados previamente en PBMC, los fibroblastos de pacientes con FM también mostraron una disminución de los niveles de CoQ10 en comparación con los controles (Figura 23A). El contenido de CoQ10 de fibroblastos del paciente 1 se observó reducido en un 70%, paciente 2 en un 78% y de paciente 3 en un 82%. Además, los fibroblastos de pacientes también mostraron un menor número de mitocondrias en cuanto a un reducido contenido de ADN mitocondrial en comparación con los valores de fibroblastos control. Nuestros resultados mostraron que el contenido de ADNmt fue 30 a 50% menor en los fibroblastos de FM (Figura 23B). Este resultado se confirmó además mediante la visualización del número de copias de ADNmt por célula utilizando la tinción PicoGreen y microscopía de fluorescencia. Las copias de ADNmt se observaron significativamente reducidas en los fibroblastos de FM (Figura 23C y 23D). Mario David Cordero Morales 84 Figura 23. A. Los niveles de CoQ10 en células de control y FM determinados mediante HPLC. B. Número de copias de ADNmt que se midió mediante RTPCR como se describe en Material y Métodos. C y D. Imágenes del ADNmt mediante tinción PicoGreen y cuantificación de puntos de PicoGreen en los fibroblastos de control y FM. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. Bar = 15 micras * P < 0,001; ** P < 0,01 entre los pacientes de control y FM. 85 Resultados 4.6. Niveles de estrés oxidativo en los fibroblastos de pacientes con FM Uno de los efectos de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial es la formación de ROS como el superóxido, el peróxido de hidrógeno y los radicales hidroxílicos. De hecho, en condiciones normales entre el 2% y el 5% de los electrones transportados en la cadena respiratoria mitocondrial se pierden en forma de radicales libres. Por tanto, parece lógico pensar que el trastorno en la actividad de los complejos mitocondriales pueda llevar aparejada una alteración en la producción de dichas ROS (Cotán et al., 2011). Con el fin de analizar la generación de ROS en los fibroblastos de pacientes con FM como consecuencia de la disfunción mitocondrial descrita, cuantificamos los niveles de producción de ROS mitocondriales mediante citometría de flujo usando MitoSOX. La producción de superóxido mitocondrial fue significativamente mayor en los fibroblastos de FM en comparación con los controles (p <0,001) (Figura 24A). Estos ROS producidas por la mitocondria son compuestos altamente reactivos, que atacan a las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos iniciando reacciones de peroxidación, por lo que causan lesiones en los tejidos al dañar los componentes estructurales básicos de las células. Para comprobar si un desequilibrio entre las defensas antioxidantes y la producción de ROS están dañando componentes celulares, realizamos ensayos de peroxidación lipídica en fibroblastos de FM usando C11-Bodipy, un análogo de los ácidos grasos de las membranas celulares con la propiedad de emitir fluorescencia en el espectro visible. Como consecuencia de la oxidación producida por las ROS, la fluorescencia del C11-Bodipi pasa del rango del rojo al del verde, mostrando el ratio de oxidación/reducción de las bicapas lipídicas (Drummen GP, et al, 2001). Nuestros datos confirmaron que los fibroblastos de FM sufrían un alto grado de peroxidación de sus membranas en comparación con fibroblastos control (Figura 24B). Mario David Cordero Morales 86 Figura 24. Estrés oxidativo en fibroblastos de pacientes con FM. A. Producción de ROS mitocondrial analizada en fibroblastos de los pacientes control y FM por citometría de flujo como se describe en Material y Métodos. B. Cuantificación de la peroxidación lipídica en los fibroblastos de control y FM. Los datos representan la proporción de lípido reducido /oxidado. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P < 0,001, a P < 0,01 entre los pacientes del grupo control y FM. 0 20 40 60 80 100 120 Control 1 Control 2 Control 3 FM1 FM2 FM3 Producción ROS Mitocondriales Fluorescence (a.u.) A * * a B 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Control 1 Control 2 Control 3 FM1 FM2 FM3 Lipid Peroxidarion Arbitrary units (a.u.) Reduced Oxidated * a a a * * 87 Resultados Este incremento en la producción de ROS mitocondriales era también observado por microscopía de fluorescencia mostrando la colocalización de fluorescencia de MitoSOX con un marcador de mitocondrias (Figura 25A). Además, en la figura 25 se muestran las imágenes de la peroxidación lipídica (Figura 25B). Figura 25. Estrés oxidativo en fibroblastos de pacientes con FM por microscopía de fluorescencia. A. Producción de ROS mitocondriales determinado mediante MitoSOX un indicador de la dismutasa mitocondrial en rojo B. La peroxidación de las bicapas lipídicas se determinó por microscopía de fluorescencia mediante C11-Bodipy 581/59 de acuerdo se describe en Materiales y Métodos. El colorante fluorescente C11-Bodipy 581/59 se inserta en las membranas lipídicas y permite la evaluación cuantitativa de lípidos oxidados (fluorescentes en color verde) y no oxidados (color rojo). Mario David Cordero Morales 94 MT-TT G15928A G15928A MT-DLOOP T16519C A263G 302insCC- CCC 310insC 514inCA T16126C A16163G C16186T T16189C C16294T T16519C A73G A263G 302insCC 310insC 514inCA T16519C A263G T152C 310insC T16126C A16163G C16186T T16189C C16294T T16519C A73G A263G 302insCC 310insC 514inCA T16519C A263G T152C 310insC 95 Resultados 4.8. Análisis molecular de la mutación encontrada La transición T → C en la paciente 3 genera un nuevo sitio de restricción para la enzima BbvI que nos permitió diseñar un ensayo de PCR para el diagnóstico de la mutación m.15.804 (Figura 28A). El análisis molecular en la paciente 3, una mujer de 45 años de edad, mostró que la mutación 15804 fue homoplásmica en las células de sangre, orina y muestras de saliva (Figura 28B). Además, se evaluaron varios miembros de la familia de la paciente 3, a partir de tres generaciones (Figura 28C). El pedigrí mostró claramente un patrón típico de herencia materna e interesantemente, la mutación estuvo presente en los miembros con manifestación clínica típica de FM cuyo diagnóstico se estableció según criterios ACR. -: Sin Bbvl +: Corte con Bbvl P: Paciente Corte Bbvl Paciente FM Control sano Piel Orina Saliva Mario David Cordero Morales 96 Figura 28. Análisis de genotipado de la mutación mtCYB. A. Ilustración de la mutación encontrada en la paciente 3 en el gen mtCYB. El m15.804 transición C → T genera un nuevo sitio de restricción (GCAGC) para la enzima BbvI. La amplificación por PCR de muestras de ADN y la digestión con restricción BbvI permite identificar los diferentes haplotipos por patrón específico de bandas de ADN en la electroforesis en gel de agarosa. B. el análisis molecular en la paciente 3 mostró que la mutación estaba en homoplasmia en las células de la orina, muestras de saliva y biopsia de piel. C. el análisis del pedigrí de la familia de la paciente 3 a lo largo de tres generaciones. Símbolos blancos y negros denotan las personas con o sin síntomas de la FM, respectivamente. Formas: hombre, círculos: mujer. Además de la paciente 3, los pacientes familiares P4, P5 y P6 (ver pedigrí en la figura 9) con mutación refieren una pérdida auditiva moderada en sus antecedentes clínicos. Curiosamente, la pérdida de audición se ha descrito y relacionado con FM (Bayazit et al., 2002; Wolfe et al, 2012). La evaluación de parámetros de laboratorio en la paciente 3 se mostraban en rangos normales, incluyendo lactato en sangre, electrolitos, la creatina quinasa, y el perfil lipídico (Tabla 6). La mutación en homosplasmia encontrada fue el único cambio sospechoso observado en la paciente 3 y la familia que no se observa en otros pacientes y controles habiéndose estudiado en otros 60 pacientes y en 40 controles, lo que sugiere que podría estar asociada con la enfermedad en la familia. 97 Resultados Tabla 6. Parámetros bioquímicos séricos en la paciente 3. Parámetros bioquímicos Paciente Rango normal Glucosa (mg/dL) 99 76-110 Urea (mg/dL) 17 10-50 Proteínas totales (g/dL) 6.8 6.6-8.7 Na (mEq/L) 142 135-145 K (mEq/L) 4.2 3.5-5 Ácido úrico (mg/dL) 3.9 2.4-5.7 Creatinina (mg/dL) 0.71 0.5-0.9 Ca (mg/dL) 9.4 8.5-10.5 Fosfato (mg/dL) 3.44 2.7-4.5 Bilirubina (mg/dL) 0.39 0.2-1 Fosfatasa alcalina (U/L) 55 35-104 GOT (mU/mL) 21.9 5-37 GPT (mU/mL) 23.5 5-41 Creatina kinasa (U/L) 73 10-190 Colesterol (mg/dL) 155 80-200 HDL Colesterol (mg/dL) 65 50-100 LDL Colesterol (mg/dL) 69 <120 Triglicéridos (mg/dL) 50 50-150 4.9.Análisis de la estructura y secuencia de aminoácidos La mutación en la proteína CYB sustituye un residuo de valina parcialmente conservado en una alanina. Este es un cambio conservador que parece no afectar a la función o estructura. Sin embargo, este mismo cambio ha sido encontrado previamente en otra proteína de la cadena respiratoria mitocondrial, COXIII correspondiente al complejo IV, asociada con el síndrome de Leigh (Mkaouar-Rebai et al., 2011). Tras la comparación de los residuos del cambio y su conservación, se observa que hay una alta similitud en esa misma región en ambas proteínas (Figura 29). En ambas proteínas el residuo valina Mario David Cordero Morales 98 aparece en la posición central de una hélice trans-membrana enriquecida con residuos hidrofóbicos con características similares. Este análisis nos muestra que ambos cambios pueden llegar a tener características fisiopatológicas. Figura 29. Conservación y estructura de similitud de la mutación Val- Ala entre CYB y COXIII. A. conservación, imagen-muestra de la región circundante (6 residuos en cada lado) para la mutación en las dos proteínas. La altura de la columna corresponde a la conservación en esa posición (contenido de la información), y la altura de cada letra se relaciona en la frecuencia de esa letra en esa posición. La ocupación es la probabilidad de observar una letra en una posición, y la probabilidad de inserción y la longitud dependen de insertos putativos en la alineación. La mutación aparece en diferentes dominios Pfam de las dos proteínas: b citocromo C-terminal para CYB, y citocromo c oxidasa subunidad III para COXIII. B. posición de la mutación ampliada que muestra la probabilidad de residuos. C, estructura de la región de las dos proteínas, que corresponde a parte de una hélice transmembrana. El residuo valina se resalta en rojo. 99 Resultados 4.10. Estudios fisiopatológicos En consonancia con el hecho de que la nueva mutación se detectó en una proteína del complejo III, los fibroblastos de la piel de la paciente 3 e hijo mostraron una reducción de los niveles de la actividad del complejo III (Figura 30A) asociada con la deficiencia de CoQ10 (Figura 30B), la reducción de los niveles de ATP, los niveles altos de mitocondrial de ROS, la reducción de los contenidos de ADNmt (Figura 30C-E) y la proliferación tasa baja de las células (Figura 31). Mario David Cordero Morales 100 Figura 30. Fisiopatología de fibroblastos de la paciente 3 e hijo. A, actividad de la cadena respiratoria en fibroblastos de la paciente 3 y su hijo en comparación con el control. B, niveles de CoQ10. C, niveles de bioenergética de los fibroblastos por determinación de ATP. D, producción de ROS mitocondriales. E, 101 Resultados reducido contenido de ADNmt en fibroblastos de los pacientes de FM en comparación con los controles sanos. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P <0,001; ** P <0,005 entre los controles y los pacientes con FM. Figura 31. Crecimiento de las células determinadas en fibroblastos de ambos pacientes comparados con controles. Similares alteraciones fisiopatológicas se observaron en otras muestras biológicas de la paciente 3, tales como las células de la sangre, la orina, las muestras de saliva y plaquetas (Tabla 7). Control Paciente 3 Hijo Mario David Cordero Morales 102 Tabla 7. Datos bioquímicos en diferentes muestras biológicas de la paciente 3. Los cambios se muestran por porcentaje respecto a controles sanos. Sangre Células de orina Células de saliva Plaquetas Complejo III 49% 28% 33% 45% CoQ10 40% 31% 60% 50% ATP 42% 36% 36% 70% mtDNA/nDNA 37% 30% 32% 47% Para evaluar la disfunción mitocondrial se midió la tasa de OCR en fibroblastos de la paciente 3 e hijo. Las determinaciones se realizaron mediante la exposición secuencial de las células a cuatro moduladores de la fosforilación oxidativa (OXPHOS): oligomicina (un inhibidor de F1Fo-ATPasa o complejo V), 2, 4-DNP (desacoplamiento de la cadena de transporte de electrones de la fosforilación oxidativa) y antimicina / rotenona (complejo I e inhibidores III respectivamente). El OCR basal en las células de FM era notablemente inferior respecto al control, con valores de aproximadamente 2,8 veces (p<0,05) más bajo que los controles (Figura 32A y B). La SRC de las células se obtuvo mediante el cálculo de la media de los valores de OCR después de la inyección de 2,4- DNP menos la respiración basal, y se puede utilizar como un indicador de cómo de cerca a su límite bioenergético está funcionando una célula. El SRC en las células FM fue significativamente baja (5 veces, p<0,05) en comparación con las células control (Figure 32C). 103 Resultados Figura 32. A. OCR se determinó a través de Seahorse XF-24 extracelular Flux Analyzer con la inyección secuencial de oligomicina (1 mg / ml), 2,4-DNP (100 mM), antimicina/rotenona (1 µM) en el punto de tiempo indicado en cada pocillo, después de la medición del nivel basal. B. El OCR basal estaba considerablemente afectado en las células de los pacientes. C. La capacidad respiratoria de repuesto (SRC) en fibroblastos de FM mostró una disminución significativa. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P <0,001 entre los controles y los pacientes con FM. 4.11. Activación del complejo NLRP3-inflamasoma En condiciones de estrés oxidativo, las mitocondrias pueden ser dañados y a su vez, dañar a la propia célula resultando una disfunción celular y un incremento de la inflamación (Cordero et al., 2013b). De esta forma, la inhibición del complejo I o III de la cadena respiratoria mitocondrial se ha demostrado que induce un incremento en la producción de ROS y la activación inflamasoma NLRP3 (Zhou et al., 2011; Shimada et al., 2012; Ding et al., 2014) En este sentido, hemos analizado la activación de proteínas relacionadas con el inflamasoma en la paciente 3. Encontramos un aumento en los niveles de expresión de NLRP3, caspasa 1 p20, e IL-1β (p17) en los fibroblastos de la paciente 3 (Figura 33A) * * * * A B C Mario David Cordero Morales 110 Figura 38. A. Niveles bioenergéticos de cíbridos mutantes evaluados mediante la determinación de ATP. B. la producción de ROS mitocondriales fue analizado en cíbridos por citometría de flujo. C. Caspasa 1p20 y IL- 1β (p17) se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western.. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * p < 0.001 entre los controles y los pacientes con FM. La evaluación del efecto del cambio de aminoácido en la estructura de la proteína mostró que la mutación (rojo) se localizó en una zona opuesta del sitio de unión ubiquinona (verde) (Figura 39). Por tanto, se prevé una buena respuesta de las células al tratamiento con CoQ10. Figura 39. Estructura tridimensional del mtCYB mostrando la mutación (rojo) localizada en la zona opuesta al sitio de unión ubiquinona (verde). 111 Resultados De acuerdo a esto, los fibroblastos de la paciente con la mutación fueron suplementados con CoQ10 30 µM. Tras 24 h de tratamiento, se observó una significativa mejora de la tasa OCR así como de la capacidad respiratoria de repuesto lo que demostró una restauración metabólica en los fibroblastos tratados a pesar de la presencia de la mutación (Figura 40). Figura 40. Fisiopatología de fibroblastos mutantes de paciente con mutación después del tratamiento con CoQ10 30 µM. La OCR se controló a través Seahorse XF-24 extracelular Flux Analyzer con la inyección secuencial de oligomicina (1 mg / mL), 2,4-DNP (100 mM), rotenona (1 M) en el punto de tiempo indicado en cada pocillo, después de la medición del ritmo basal. La OCR basal fue marcadamente afectada en las células de paciente, y mejoró con CoQ10. Además, la capacidad respiratoria de repuesto (SRC) en fibroblastos FM mostró una disminución significativa que fue mejorada por CoQ10. Los datos representan la media - SD de tres experimentos separados. * p <0,001; ** p <0,005 entre los controles y los pacientes de FM. p <0,001 entre los pacientes con FM y el tratamiento con CoQ10. Mario David Cordero Morales 112 La deficiencia de CoQ10 se ha asociado comúnmente con enfermedades mitocondriales, y su suplementación se ha documentado como un tratamiento efectivo (Roos et al., 2014; Quinzii et al., 2010; Hargreaves, 2014; Chen et al., 2015). Teniendo en cuenta que previamente se ha demostrado que el tratamiento con CoQ10 induce una significativa mejora clínica en pacientes con FM (Cordero et al., 2012, 2013a), todos los pacientes con mutación comenzaron el tratamiento oral con CoQ10 (5 mg/Kg/día). Después de 7 meses, los pacientes mostraron una mejora significativa en los síntomas clínicos asociados con la restauración a niveles normales de los parámetros bioquímicos alterados (Tabla 8). 113 Resultados Tabla 8. Cambios clínicos y bioquímicos en la paciente 3 (probando) y los miembros de la familia portadores de la mutación (identificados según el pedigree de la figura 9) tras 7 meses de tratamiento oral con CoQ10. Probando Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 Paciente 5 Paciente 6 Parámetros Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Puntos dolorosos 12 6 14 7 11 7 13 5 11 4 13 3 FIQ, rango 0-80 66 21 69 20 64 22 67 20 57 18 51 16 Dolor 8 3 8 4 8 2 9 4 7 2 7 2 Fatiga 7 3 8 2 8 4 8 1 8 1 8 3 Fatiga matutina 5 2 5 2 6 2 6 1 6 1 5 2 Rigidez 9 2 7 3 8 2 7 2 6 3 4 2 Ansiedad 6 3 7 3 7 2 8 3 7 2 5 1 Depresion 7 2 6 3 8 2 8 4 5 2 4 1 VAS dolor, rango 0-10 8 3 9 3 7 3 9 4 7 3 8 1 VAS Fatiga, rango 0-10 7 3 7 3 8 2 8 2 8 1 7 2 Citrate sintasa (Actividad específica) 4.7 18.3 3.7 15.6 4.1 15.9 3.8 16.6 8.1 21.3 6.3 19.1 Niveles deATP (nMol/mgProteína) 5.2 20.4 4.1 19.4 5.8 17.4 3.9 22.1 5.4 26.4 3.7 23.4 IL-1β (pg/ml) 24.3 5.4 26.1 6.1 21.3 7.1 26.3 4.8 25.2 4.4 27.1 3.4 mtDNA copy number(nDNA/mtDNA) 0.4 0.9 0.5 0.8 0.6 0.9 0.3 0.7 0.3 1 0.3 0.9 Mario David Cordero Morales 114 115 Discusión DISCUSIÓN Mario David Cordero Morales 116 117 Discusión 5. DISCUSIÓN La presente tesis doctoral ha estudiado el papel de la disfunción mitocondrial como un importante agente relacionado con la fisiopatología de la FM, así como su implicación en el estrés oxidativo descrito en estos pacientes y su relación con un nuevo mecanismo inflamatorio como es el complejo NLRP3-inflamasoma. Dado que se trata de una patología de enorme complejidad tanto clínica como científica por su gran heterogeneidad, nuestro estudio pretende aportar una caracterización de los mecanismos moleculares que competen a una población de pacientes de esta patología, o más bien, lo que podríamos definir como un subgrupo. Para definir este conjunto de pacientes, hemos estudiado tres importantes bloques. Por un lado la inflamación, donde se han realizado numerosas contribuciones que sugieren que las citoquinas pueden desempeñar un papel importante en la FM (Salemi et al., 2003; Ross et al., 2010; Wang et al., 2008; Bazzichi et al., 2007; Nakamura et al., 2010; Togo et al., 2009) e incluso se ha observado una correlación entre citoquinas y varios síntomas comunes en FM (Bazzichi et al., 2007; Maes et al., 1999). Sin embargo, hay resultados discrepantes en cuanto a la implicación de la inflamación en la FM (Menzies et al., 2010). Nuestro estudio ha mostrado un incremento de las dos citoquinas implicadas con el complejo inflamasoma. Además, estos pacientes mostraron una importante disfunción mitocondrial en las células mononucleares. La inhibición del complejo I o III de la cadena respiratoria mitocondrial ha demostrado que induce la producción de ROS y una consecuente activación del complejo NLRP3-inflamasoma (Zhou et al., 2009). En este sentido, nuestros datos en las PBMC de pacientes con FM indican una deficiencia en la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial, acompañada de una deficiencia de CoQ10 y aumento de la producción de ROS mitocondrial, así como un aumento en los niveles de expresión de Mario David Cordero Morales 118 marcadores de daño oxidativo en el ADN, ambos activadores del inflamasoma y la inflamación (Mabley et al., 2005; Zhou et al., 2009). El inflamasoma ha surgido en los últimos años como un sensor del estrés metabólico y oxidativo. De hecho, se ha implicado en el desarrollo de las principales enfermedades metabólicas como la gota, la diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina inducida por la obesidad. Por otra parte, la NLRP3-inflamasoma se ha implicado en otras patologías humanas tales como el cáncer, la asbestosis y la enfermedad de Alzheimer (Menu y Vince, 2011). Es por ello que en los últimos años las investigaciones se han centrado que la identificación de nuevas patologías en las que este complejo tenga una implicación directa o indirecta. En nuestros pacientes, hemos observado su implicación por el aumento de la activación de proteínas propias del inflamasoma como NLRP3, caspasa 1 e IL-1β en las PBMC y el aumento de los niveles séricos de citoquinas como IL-1β e IL- 18. En respuesta a la disfunción mitocondrial, y dado que la inflamación puede ser activada por el estrés oxidativo, las células activan sus mecanismos de defensa antioxidante (Pagano et al., 2014). Sin embargo, se ha descrito que los mecanismos de compensación antioxidante en los pacientes con FM se encuentran reducidos en los pacientes de FM, lo que conduce a un continuo incremento del estrés oxidativo que mantiene el daño oxidativo en las mitocondrias y otros orgánulos celulares y ADN (Altindag et al., 2006; Bagis et al., 2005; Ozgocmen et al., 2006) y, por tanto, una predisposición al daño inflamatorio. En nuestro estudio, la inflamación se ha mostrado asociada con síntomas de FM con correlaciones significativamente positivas entre IL-1β y IL-18 niveles de suero y las puntuaciones de dolor lo que sugiere un componente inflamatorio en la inducción de dolor. Estos resultados muestran consonancia con publicaciones previas que señalan el papel patológico de los niveles séricos de IL-1β en la FM (Salemi et al., 2003; Ross et al., 2010). Además, Feng y colaboradores han 119 Discusión demostrado la implicación del gen MEFV que codifica para la pirina, un importante regulador del inflamasoma controlando de este modo la activación de la caspasa-1 y por tanto, la liberación de IL-1β (Feng et al., 2009). Estos datos preliminares de Feng et al., están de acuerdo con nuestros resultados. Por otro lado, según nuestros resultados, la correlación negativa entre los niveles de IL-1β e IL-18 y niveles de CoQ10 y la correlación positiva con los niveles de ROS mitocondriales y puntuaciones de la escala de dolor son compatible con la hipótesis de que la inflamación en FM depende de la disfunción mitocondrial. Para demostrar esto, realizamos un ensayo in vitro de inhibición del CoQ10 en el que reproducimos los mismos resultados de disfunción mitocondrial y activación del complejo inflamasoma. Estos datos sugieren que en FM, la activación del inflamasoma es dependiente de una disfunción mitocondrial en la cual, el CoQ10 adquiere un papel importante. La deficiencia de CoQ10 provoca una reducción de las actividades del complejo II + III, el complejo III y complejo IV, una reducción de la expresión de las proteínas mitocondriales implicadas en la fosforilación oxidativa, una disminución de potencial de membrana mitocondrial, un aumento de la producción de ROS, la activación del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPT), mitofagia de las mitocondrias disfuncionales, y una reducción del crecimiento celular (Quinzii et al., 2008; Rodríguez-Hernández et al., 2009). Dado que en las PBMC de pacientes con FM hemos observado una clara deficiencia de CoQ10 y disfunción mitocondrial, hemos intentado profundizar en el metabolismo mitocondrial a través de un modelo in vitro comúnmente usado en el estudio de las enfermedades mitocondriales, como son los fibroblastos de piel. En nuestros experimentos mostramos definitivamente que existe una disfunción mitocondrial en los fibroblastos derivados de los pacientes con FM. Alteraciones como la deficiencia de CoQ10 y de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial, acompañada de un déficit de las proteínas de los complejos, un descenso de la masa Mario David Cordero Morales 126 por lo que el tratamiento con antioxidantes también podría ser eficaz en estas enfermedades (Harijith et al., 2014). El actual enfoque farmacológico de las enfermedades mitocondriales se basa en la eliminación de metabolitos tóxicos, utilizando eliminadores de ROS y la administración de diferentes compuestos deficientes como CoQ10. En consecuencia, el complejo inflamasoma que se activa por la producción de ROS mitocondriales puede ser inhibida selectivamente por los antioxidantes del tipo lipofílico. Curiosamente, hemos observado que el CoQ10 inhibe la activación de NLRP3- inflamasoma en PBMC así como una significativa mejora de la respiración celular en los fibroblastos y una mejora clínica y molecular en los pacientes de la familia tratada con CoQ10. Además, el compuesto MitoQ, un derivado de CoQ10 dirigido a las mitocondrias, también se ha observado inhibir al NLRP3-inflamasoma (Dashdorj et al., 2013). Como el CoQ10 es un tratamiento común para las enfermedades mitocondriales (Montini et al., 2008; Quinzii et al., 2010; Hargreaves, 2014), aquí mostramos otro posible mecanismo por el cual el tratamiento CoQ10 puede ser eficaz en estos pacientes. En resumen, en nuestro estudio proponemos la implicación de la disfunción mitocondrial en un conjunto de pacientes, así como la implicación del complejo inflamasoma como una consecuencia de tal disfunción mitocondrial. Además, una disfunción mitocondrial puede ocurrir por numerosos factores entre los que destacan la aparición de mutaciones en el ADNmt. En este caso, y dado el grado de similitud en cuanto a sintomatología y patrón de herencia en muchos casos de fibromialgia con las miopatías mitocondriales, el análisis de secuencias de ADNmt podría estar indicado en pacientes con FM con una clara evidencia de herencia materna enmascarando enfermedades mitocondriales entre los pacientes con FM que podrían beneficiarse de tener un diagnóstico genético por análisis de secuencias del ADNmt y ser candidatos para el tratamiento con compuestos orientados a la mitocondria. Por otra parte, la implicación del complejo inflamasoma como un sensor 127 Discusión de estrés podría ser inductor del daño en los tejidos y agravar los síntomas en estas enfermedades. Mario David Cordero Morales 128 129 Conclusiones CONCLUSIONES Mario David Cordero Morales 130 131 Conclusiones 6. CONCLUSIONES Nuestro estudio aporta las siguientes conclusiones en base a los resultados obtenidos en nuestro proyecto: 1. Los fibroblastos de pacientes con FM presentan una disfunción mitocondrial con un déficit en la cadena respiratoria mitocondrial, déficit de CoQ10 y altos niveles de daño oxidativo. 2. Los pacientes con FM que presentan herencia materna así como síntomas tales como intolerancia al ejercicio, miopatía, etc, son candidatos al diagnóstico genético mitocondrial. 3. Las mutaciones en el ADNmt podrían encontrarse en pacientes con patologías mitocondriales que mimetizan el fenotipo clínico de la FM. 4. Las mutaciones en el ADNmt podrían explicar el alto grado de herencia materna descrito en algunos pacientes diagnosticados de FM. 5. La disfunción mitocondrial induce la activación del complejo inflamasoma en pacientes con FM. 6. El complejo inflamasoma interviene en la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales mediadas por la disfunción mitocondrial. 7. La inhibición del inflamasoma podría ser una terapia prometedora para los pacientes con enfermedades mitocondriales. 8. El tratamiento con CoQ10 induce una mejora de la disfunción mitocondrial y de la activación del complejo inflamasoma reduciendo las manifestaciones patológicas de la enfermedad. Mario David Cordero Morales 132 133 Bibliografía BIBLIOGRAFÍA Mario David Cordero Morales 134 135 Bibliografía 7. BIBLIOGRAFÍA Acin-Perez R, Enriquez JA. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837:444-50, 2004. Andreu AL and Gonzalo-Sanz R. Las enfermedades mitocondriales: Una clasificación para el siglo XXI. Neurología. 19:15-22, 2004. Alnigenis MNY and Barland P. Fibromyalgia syndrome and serotonin. Clin Exp Rheumatol. 19:205–210, 2001. Area-Gomez E, Schon EA. Mitochondrial genetics and disease. J Child Neurol. 29:1208-15, 2014. 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