Remodelado de la entrada de calcio operada por los reservorios y su regulación por micrornas en la reestenosis vascular

Departamento de Fisiología Médica y Biofísica Facultad de Medicina Universidad de Sevilla REMODELADO DE LA ENTRADA DE CALCIO OPERADA POR LOS RESERVORIOS Y SU REGULACIÓN POR MICRORNAS EN LA REESTENOSIS VASCULAR Trabajo de investigación presentado por Marta Martín Bórnez para optar al Grado de Doctora por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2024 El Dr. Tarik Smani Hajami, Catedrático de la Universidad de Sevilla adscrito al Departamento de Fisiología Médica y Biofísica e Investigador Responsable del Grupo de Fisiopatología Cardiovascular del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), y la Dra. Débora Falcón Boyano, Doctora de la Universidad de Sevilla adscrita al Departamento de Fisiología Médica y Biofísica e Investigadora del Grupo de Fisiopatología Cardiovascular del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), certifican que: Dña. Marta Martín Bórnez, graduada en Bioquímica por la Universidad de Sevilla ha realizado bajo su supervisión y dirección el trabajo titulado: “Remodelado de la entrada de calcio operada por los reservorios y su regulación por microRNAs en la reestenosis vascular” que presenta para optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, firman el presente documento en Sevilla el 23 de febrero de 2024. Fdo. Tarik Smani Hajami Fdo. Débora Falcón Boyano FINANCIACIÓN El trabajo de investigación ha sido llevado a cabo en el laboratorio de Fisiopatología Cardiovascular del Instituto de Biomedicina de Sevilla con los siguientes proyectos de investigación concedidos: •Remodelado de la entrada de calcio en la angiogénesis (2016-2019). Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (Plan Estatal). Categoría: Investigadora. BFU2016-74932-C2-2-P. IP: Tarik Smani Hajami. •Detección precoz de cardiotoxicidad por antraciclinas: Imagen y marcadores circulantes para la detección precoz del daño miocárdico (2019-2021). Junta de Andalucía. Categoría: Investigadora. PI-0193- 2018. IP: Eva Calderón Sánchez. •Remodelado de la Expresión de Stim y Orai y de sus Mecanismos Reguladores en la Angiogénesis (2020-2023). Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Categoría: Investigadora. PID2019 104084GBC22. IP: Tarik Smani Hajami. DIVULGACIÓN CIENTÍFICA Durante esta tesis doctoral, parte de los resultados, y otros, han dado lugar a publicaciones en revistas internacionales y comunicaciones en congresos. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA 1. Débora Falcón; Eva María Calderón Sánchez; Isabel Mayoral González; Marta Martín Bórnez; Alejandro Domínguez Rodríguez; Encarnación Gutiérrez Carretero; Antonio Ordóñez Fernández; Juan Antonio Rosado; Tarik Smani (2024). Inhibition of adenylyl cyclase 8 prevents the upregulation of Orai1 channel, which improves cardiac function after myocardial infarction. Molecular Therapy. doi: 10.1016/j.ymthe.2024.01.026. (IF: 12.4) 2. Marta Martín Bórnez*; Débora Falcón*; Rosario Morrugares; Geraldine Siegfried; Abdel-Majid Khatib; Juan Antonio Rosado; Isabel Galeano Otero; Tarik Smani (2023). New Insights into the Reparative Angiogenesis after Myocardial Infarction. International Journal of Molecular Sciences. Aug 1;24(15):12298. doi: 10.3390/ijms241512298. (IF:5.6) 3. Marta Martín Bórnez; Elisa Bevilacqua; Débora Falcón; Tarik Smani. (2023). Remodelado vascular: nuevos conceptos sobre el papel de los canales de calcio regulados por los reservorios. Nuevas tendencias de investigación en la señalización celular en la era post-COVID. ISBN: 978-067-9023-78-2. 4. Isabel Mayoral González; Eva María Calderón Sánchez; Isabel Galeano Otero; Marta Martín Bórnez; Encarnación Gutiérrez Carretero; María Fernandez Velasco; Nieves Domenech; María Generosa Crespo Leiro; Antonio Ordoñez Fernandez; Ana María Gómez; Abdelkrim Hmadcha; Tarik Smani (2022). Cardiac protection induced by urocortin-2 enables the regulation of apoptosis and fibrosis after ischemia and reperfusion involving miR-29a modulation. Molecular Therapy: Nucleic Acid. doi: 10.1016/j.omtn.2022.01.003. (IF:8.886) 5. Eva María Calderón Sánchez*; Débora Falcón Boyano*; Marta Martín Bórnez*; Antonio Ordoñez; Tarik Smani (2021). Urocortin Role in Ischemia Cardioprotection and the Adverse Cardiac Remodeling. International Journal of Molecular Science. doi: 10.3390/ijms222212115. (IF:5.924) 6. Marta Martín Bórnez*; Isabel Galeano Otero*; Raquel del Toro; Tarik Smani (2020). TRPC and TRPV Channels’ Role in Vascular Remodeling and Disease. International Journal of Molecular Sciences. doi: 10.3390/ijms21176125 (IF:5.924) 7. Débora Falcón Boyano; Isabel María Galeano Otero; Marta Martín Bórnez, María Fernández-Velasco, Isabel Gallardo-Castillo, Juan A. Rosado, Antonio Ordóñez, Tarik Smani (2020). TRPC Channels: Dysregulation and Ca2+ Mishandling in Ischemic Heart Disease. Cells. doi: 10.3390/cells9010173. (IF: 6.600) 8. Débora Falcón Boyano; Isabel María Galeano Otero; Eva María Calderón Sánchez, Raquel del Toro, Marta Martín Bórnez, Juan A. Rosado, Abdelkrim Hmadcha; Tarik Smani (2019). TRP Channels: Current Perspectives in the Adverse Cardiac Remodeling. Frontiers in Physiology. doi: 10.3389/fphys.2019.00159. (IF: 3.367) COMUNICACIONES A CONGRESOS: 1. Marta Martín-Bórnez, Beltzane Domínguez-Liste, Débora Falcón, Tarik Smani. Orai1 is regulated by miRNAs in vascular restenosis. 8th World Congress Oxidative stress, calcium signalling and TRP channels. (2023). Isparta (Turquía). Póster. 2. Marta Martín-Bórnez, José Sánchez-Collado, Antonio Ordoñez-Fernández, Juan Antonio Rosado, Tarik Smani. Saraf implication in the vascular remodeling. FEBS-IUBMB-ENABLE conference 1st International Molecular Biosciences PhD & Postdoc Conference. (2022). Sevilla (España). Póster. 3. Marta Martín-Bórnez, José Sánchez-Collado, Antonio Ordoñez-Fernández, Juan Antonio Rosado, Tarik Smani. Saraf implication in the vascular remodeling. XL Congress of the Spanish Society of Physiological Sciences (SEFC). (2022). Badajoz (España). Póster. 4. Marta Martín-Bórnez, Juan Antonio Rosado, Antonio Ordoñez-Fernández, Tarik Smani. Saraf implication in the vascular remodeling. Congress Frontiers in Cardiovascular Medicine. (2022). Budapest (Hungary). Póster. 5. Marta Martín-Bórnez, Javier Ávila-Medina, Eva Calderón-Sánchez, Juan Antonio Rosado, Antonio Ordoñez-Fernández, Tarik Smani. Essential role of Orai1 and Saraf in vascular remodeling. International Symposium on Calcium Signaling and excitation-contraction coupling in cardiac, skeletal and smooth muscle. (2021). Online. Póster. 6. Marta Martín-Bórnez, Javier Ávila-Medina, Eva Calderón-Sánchez, Juan Antonio Rosado, Antonio Ordoñez-Fernández, Encarnación Gutiérrez, Tarik Smani. Essential role of Orai1 and Saraf in vascular remodeling. VII Red Española de Canales Iónicos (RECI). (2019). Cáceres (España). Comunicación oral. 7. Javier Ávila-Medina, Eva Calderón-Sánchez, Marta Martín-Bórnez, Juan Antonio Rosado, Tarik Smani. Role of Orai and Saraf in vascular smooth muscle cells proliferation. XXXIX Congress of the Spanish Society for Physiological Sciences (SEFC). (2018). Cádiz (España). Póster. I ÍNDICE DE FIGURAS INTRODUCCIÓN Figura 1. Estructura de los vasos sanguíneos………………………………………………….1 Figura 2. Representación de la estenosis producida en una arteria coronaria……………........3 Figura 3. Representación de una angioplastia coronaria transluminal percutánea y de la consecuente reestenosis producida……...……….…………………………………………….5 Figura 4. Representación de la plasticidad fenotípica de las células del músculo liso vascular de un fenotipo quiescente a uno sintético y su consecuente variación funcional……………..………………………………………………………...………….…..8 Figura 5. Representación del daño endotelial causado por una angioplastia y comienzo del proceso de formación de la capa neoíntima durante la reestenosis……...……………………………………………………………………………...9 Figura 6. Representación de la regulación de la homeostasis del calcio en las CMLV………...……...………………………………………………………………………11 Figura 7. Representación de los dominios estructurales de STIM1 y su modelo de activación……..……………………………………………………………………...……....15 Figura 8. Representación de la estructura molecular de Orai1……….……….…………….17 Figura 9. Representación de las diferencias de la secuencia de aminoácidos entre Orai1α y Oraiβ y de los sitios de unión que carece Oraiβ…………………….……………………….19 Figura 10. Mecanismo de actuación de Saraf…………..………………………….………..21 Figura 11. Mecanismo de activación de Store-Operated calcium entry (SOCE)…..……….23 Figura 12. Mecanismo de Ca2+ Store-Operated calcium entry (SOCE) en las CMLV durante el proceso de formación de la neoíntima…………..………………………………………...25 Figura 13. Representación esquemática de la síntesis, procesamiento y mecanismo de acción de los miRNAs………………………………………………………………………27 MATERIALES Y MÉTODOS Figura 14. Aislamiento de la arteria carótida derecha………………………….….……….38 II Figura 15. Imagen de la carótida aislada, introducción e inflado del balón durante el proceso de angioplastia………………………...……………………………………………………..39 Figura 16. Representación de la estructura de una arteria carótida y de sus capas: túnica íntima, túnica media y túnica adventicia………..……………………………………………………40 Figura 17. Imagen tomada por ecografía de una arteria carótida de rata en modo B en el eje longitudinal………………………………………...…………………………………...……42 Figura 18. Aislamiento de la arteria coronaria descendente anterior del corazón de una rata y cultivo primario de células de músculo liso……….………………………………………….43 Figura 19. Esquema del método de la medida de fluorescencia del FURA-2AM……………47 Figura 20. Espectro de fluorescencia FURA-2……………………………...……………….47 Figura 21. Registro de SOCE en CMLV controles estimuladas con tapsigargina…………...49 Figura 22. Esquema de la técnica de Proximity ligation assay……………………………….53 Figura 23. Mapa de los vectores utilizados para la medida de la actividad del promotor ORAI1…………………………………………………………………………………….….56 Figura 24. Reacciones enzimáticas de las enzimas Luciferasa firefly y Luciferasa de Renilla………………..............................................................................................................57 RESULTADOS Figura 25. Evaluación de la formación de la capa neoíntima tras la angioplastia mediante tinción hematoxilina-eosina de cortes transversales de las arterias carótidas…………...……73 Figura 26. Denudación endotelial de las arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia………………………………………………………………………..…………74 Figura 27. Validación de CIMA (Carotid Intima-Media Area) y ratio neoíntima/media……76 Figura 28. Efecto de la angioplastia carotídea medida por ecografía……………………...…77 Figura 29. Correlación entre la medida del CIMA analizada en cortes histológicos de las arterias carótidas lesionadas en comparación con la medida del CIMT mediante ecografía…………………………………………………………………………………......78 Figura 30. Expresión de la proliferación celular en la neoíntima mediante el marcaje de núcleos con Ki67 por inmunofluorescencia………………………………………………….79 Figura 31. Expresión de Orai1 en arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia comparada con arterias carótidas no lesionadas……………………………………………...80 Figura 32. La lesión vascular mediante angioplastia en carótidas de rata incrementa la expresión de Orai1…………………………………………………………………………...81 III Figura 33. Expresión de Saraf en arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia comparada con arterias carótidas no lesionadas………………………...……………………82 Figura 34. La lesión vascular mediante angioplastia en carótidas de rata incrementa la expresión de Saraf………………………………………………..…………………………..83 Figura 35. Expresión de Orai1 y Saraf en arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia..............................................................................................................................85 Figura 36. Intensidad de fluorescencia de Orai1 y Saraf en arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia y en arterias controles………………………………………...………86 Figura 37. Proximity ligation assay de Orai1 y Saraf en arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia………….……………………………………………………………………….88 Figura 38. Saraf interacciona con Orai1 en las arterias carótidas lesionadas………………...89 Figura 39. Expresión de Orai3 en arterias las carótidas lesionadas mediante angioplastia…..90 Figura 40. La lesión vascular mediante angioplastia en carótidas de rata incrementa la expresión de Orai3…………………………………………………………………………...91 Figura 41. La lesión vascular mediante angioplastia en carótidas de rata incrementa la expresión de STIM1…………………………………………………………………….........92 Figura 42. Silenciamiento de Orai1 y Saraf en cultivo primario de células de músculo liso de coronaria………………………………………………………………………………….….94 Figura 43. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la proliferación de CMLV de coronaria…..…………………………………………………………………………………95 Figura 44. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la proliferación estimulada por IGF-1 en CMLV de coronaria…………………………………………………………….….96 Figura 45. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la proliferación de CMLV de coronaria con pases………………………………………………………………………..…98 Figura 46. Silenciamiento de Orai1 y Saraf en la línea celular A7r5……………...………....99 Figura 47. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la proliferación de CMLV de la línea celular A7r5………………………………………………………...…………………100 Figura 48. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la entrada de Ca2+ a través de SOCE inducida por IGF-1 en el cultivo primario de CMLV de arteria coronaria…….……101 Figura 49. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la entrada de Ca2+ a través de SOCE inducida por tapsigargina en CMLV de la línea celular A7r5………………………102 Figura 50. Evaluación del efecto del silenciamiento de Saraf en la formación de IV neoíntima tras una angioplastia……………………………………………………...……104 Figura 51. Expresión de la proliferación celular en la neoíntima mediante el marcaje de núcleos con Ki67 por inmunofluorescencia de arterias carótidas de 1W incubadas con lentivirus shSaraf en comparación con el control lentivirus shGFP……………………….105 Figura 52. miRNAs diferencialmente expresados en las arterias carótidas lesionadas de 1W, 2W y 3W respecto a las arterias carótidas controles………………………………………...107 Figura 53 Representación de heatmap y volcano plot de la expresión de miRNAs diferencialmente expresados en las arterias lesionadas respecto a las arterias controles……………………………………………………………………………………108 Figura 54. Genes diferencialmente expresados en las arterias lesionadas de 1W y 3W respecto a las arterias controles y comparadas entre sí……………………………………………...109 Figura 55. Representación de heatmap y volcano plot de la expresión de genes diferencialmente expresados en las arterias lesionadas de 1W y 3W respecto a las arterias controles y de 1W vs 3W……………………………………………………………………110 Figura 56. Análisis del enriquecimiento de genes diferencialmente expresados de C vs 1W………………………………………………………………………………………….111 Figura 57. Esquema de diferentes miRNAs diferencialmente expresados en las arterias lesionadas de 1W respecto a las arterias controles y que son diana de Orai1, Orai3 y Saraf………………………………………………………………………………..……….113 Figura 58. Análisis del enriquecimiento de los genes diana de los miRNAs miR-17-5p, miR- 18-5p y miR-20a-5p………………….……………………………………………………..114 Figura 59. miRNAs seleccionados diferencialmente expresados en arterias lesionadas de 1W respecto a los controles……..………………………………………………………………115 Figura 60. Expresión de los miRNAs 17-5p, 20a-5p, 20b-5p y 18a-5p en las arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia analizadas por RT-qPCR respecto a 18S………………...116 Figura 61. Expresión de miR-18a-5p en CMLV de la línea celular A7r5……..……………117 Figura 62. Expresión del mRNA de Orai1, Orai3 y Saraf en CMLV de la línea celular A7r5 transfectadas con el mimic del miR-18a-5p…………………………………………..…….118 Figura 63. Regulación de la actividad transcripcional del promotor del gen ORAI1 por el miR 18a-5p y el miR-20a-5p en CMLV……………………………………………………….…119 Figura 64. Expresión de la proteína Orai1 en CMLV de la línea celular A7r5 transfectadas con miR-18a-5p…………………………………………………………………………….120 V Figura 65. Efecto de la sobreexpresión del miRNA miR-18a-5p mediante un mimic en la entrada de Ca2+ a través de SOCE inducida por tapsigargina en CMLV de la línea celular A7r5. ……………………………………………………………………………….……………..122 Figura 66. Efecto de la sobreexpresión mediante un mimic del miRNA miR-18a-5pen la proliferación celular de las CMLV de la línea celular A7r5…………………...…………….123 Figura 67. Efecto de la sobreexpresión mediante un mimic del miRNA miR-18a-5p en la migración celular de las CMLV de la línea celular A7r5……………...…………………….124 Figura 68. Expresión de mRNA de Thbs1, PTP4A y KIF23 en arterias lesionadas (1W, 2W y 3W) y no lesionadas (Control)……………………………………………………...………126 DISCUSIÓN Figura 69. La angioplastia provoca un remodelado vascular………………...……………..130 Figura 70. Expresión de los miRNAs 30b-5p en las arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia analizadas por RT-qPCR respecto a 18S……………………………..………..143 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Secuencia de siRNAs utilizados………………………………………...………….45 Tabla 2. Secuencia de mirVana® miRNA mimic utilizados……………………...…………45 Tabla 3. Anticuerpos primarios utilizados en la inmunofluorescencia……………...……….51 Tabla 4. Anticuerpos secundarios utilizados en la inmunofluorescencia…………………….51 Tabla 5. Anticuerpos primarios usados para Western blot……………………...……………60 Tabla 6. Anticuerpos secundarios usados para Western blot………………………...………60 Tabla 7. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la RT-qPCR…..65 Tabla 8. Oligonucleótidos de miRNA utilizados para la RT-qPCR………………………….65 VI VII ABREVIATURAS [Ca2+]i: concentración de Ca2+ intracelular [Ca2+]RS: concentración de Ca2+ en el retículo ARC: canal de Ca2+ regulado por el ácido araquidónico (Arachidonic Acid) CCA: arteria carótida común (Common Carotid Artery) CDI: inactivación dependiente de Ca2+ (Ca2+ Dependent Inactivation) CIMA: área íntima-media (Carotid Intima-Media Area) CIMT: grosor de la íntima-media carotídea (Carotid Intima-Media Thickness) CMLV: célula de músculo liso vascular CRAC: Ca2+ activada por la liberación de Ca2+ (Ca2+ Release Activated Ca2+) ECA: arteria carótida externa (External Carotid Artery) FBS: suero fetal bovino (Fetal Bovine Serum). ICA: arteria carótida interna (Internal Carotid Artery) IRS: restenosis intra-stent. (In-Stent Restenosis) PDGF: factor de crecimiento derivado de plaquetas (Platelet Derived Growth Factor) PKA: proteína quinasa A (Protein kinase A) PKC: proteína quinasa C (Protein Kinase C) PLA: técnica Proximity Ligation Assay. PLC: fosfolipasa C (Phospholipase C) RS: Retículo Sarcoplásmico (Sarcoplasmic Reticulum) SARAF: factor regulator asociado a SOCE (SOCE-Associated Regulatory Factor) SCDI: Slow Calcium-Dependent Inactivation SERCA: ATPasa de Ca2+ del retículo sarco/endoplásmico. (Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase). SOAR: dominio STIM-Orai Activating Region. SOCC: canal de Ca2+ operado por reservorios (Store Operated Ca2+ Channel). SOCE: entrada de Ca2+ regulada por reservorios (Store Operated Ca2+ Entry). STIM1: molécula de interacción estromal 1 (Stromal Interaction Molecule-1). TG: tapsigargina (Thapsigargin). TRPC: Transient Receptor Potential Canonical α-SMA: α-actina de músculo liso (α- Smooth Muscle Actin). VIII IX RESUMEN La cardiopatía isquémica constituye la principal causa de muerte en relación con las enfermedades cardiovasculares. Su tratamiento se basa en la revascularización coronaria mediante angioplastia con colocación de stent. Sin embargo, y a pesar de los avances terapéuticos, un alto porcentaje de pacientes reingresa en el hospital debido a un nuevo estrechamiento de la luz arterial, conocido por el nombre de reestenosis, que ocasiona una reducción del flujo sanguíneo coronario hacia el corazón. La principal causa de la reestenosis se atribuye a una proliferación y migración excesiva de las células del músculo liso vascular que provoca la formación de una nueva capa denominada neoíntima. Esto se debe al estrés desencadenado por daños en la pared vascular que promueven la inflamación y liberación de factores vasoactivos, citoquinas y miRNAs entre otros, acompañados con la desregulación de diferentes vías de señalización, incluyendo la homeostasis de Ca2+. En esta tesis doctoral se ha estudiado la desregulación de los componentes esenciales de la entrada de Ca2+ activada por el vaciado de los reservorios intracelulares, conocido como SOCE (Store Operated Ca2+ Entry), en un modelo animal de angioplastia carotídea y su papel en el remodelado vascular asociado a la formación de la neoíntima. Los resultados revelaron un incremento de la expresión de Orai1, STIM1 y Saraf en las arterias lesionadas por angioplastia. Además, demostramos una colocalización/interacción entre Orai1 y Saraf en la zona de la neoíntima que presenta una mayor proliferación celular. La inhibición de expresión de Orai1 y Saraf en CMLV demostró su implicación en la proliferación de las CMLV dependiendo de su estado de diferenciación. Por otro lado, los datos del microarray de expresión de microRNAs (miRNAs) en arterias carótidas lesionadas revelaron que se produce un incremento de miR-18a-5p, miR-17-5p, miR-20a-5p y miR-20b-5p, pertenecientes al clúster 17-92, asociado con la proliferación celular, y que tienen como dianas algunos componentes de SOCE. De hecho, demostramos que la 4 INTRODUCCIÓN remodelado se caracteriza por una migración, proliferación y desdiferenciación de las células del músculo liso vascular (CMLV) de la túnica media, así como por la transmigración de los monocitos y su diferenciación a macrófagos. En las últimas décadas, la mortalidad por cardiopatía isquémica se ha visto disminuida gracias a la implantación de técnicas de revascularización miocárdica mediante bypass coronario o a través de la intervención coronaria percutánea. La cirugía bypass juega un papel importante en pacientes con enfermedad coronaria obstructiva avanzada mientras que la intervención coronaria percutánea es el método de revascularización habitual utilizado en pacientes con síndrome coronario agudo y en pacientes estables con enfermedad menos compleja. Asimismo, la angioplastia de emergencia se considera el tratamiento estándar para el infarto de miocardio con elevación del segmento ST, ya que se ha demostrado que puede reducir significativamente la mortalidad en este contexto (Byrne et al., 2017). 2.1. La angioplastia como terapia de revascularización La angioplastia coronaria transluminal percutánea con balón e implantación de stent implica la inserción de un catéter a través de un acceso percutáneo en un vaso sanguíneo, generalmente en el brazo o la ingle. El catéter está equipado con un pequeño balón inflable en el extremo, que se dirige a la zona de la arteria coronaria donde se localiza la estenosis o la obstrucción. En este punto el balón se infla, comprimiendo la placa aterosclerótica y ensanchando la luz arterial mejorando así el flujo sanguíneo al corazón. Esta técnica se suele complementar con la colocación de un stent farmacológico para mantener la apertura del vaso y prevenir la recurrencia de la estenosis. Esta técnica permite restablecer el flujo sanguíneo normal en la arteria coronaria afectada (Figura 3A) (Byrne et al., 2017). 5 INTRODUCCIÓN Figura 3. Representación de una angioplastia coronaria transluminal percutánea y de la consecuente reestenosis producida. A. Proceso de angioplastia con catéter con balón y proceso de angioplastia con catéter con balón e implantación de stent. B. Reestenosis coronaria y reestenosis coronaria intra-stent. Modificado de (Yin et al., 2014). Realizada con Biorender. Esta técnica fue realizada por primera vez en Zurich en 1977 por el Dr. Andreas Gruentzig (Grüntzig et al., 1979). A pesar de la mejora que permitía esta intervención, desde los inicios presentó varias complicaciones. En primer lugar, durante los primeros minutos u horas posteriores a la intervención, se manifestaba un retroceso elástico y una activación y agregación plaquetaria que daban lugar a trombos (Omeh & Shlofmitz, 2023). Por otro lado, la principal limitación de la angioplastia fue la reestenosis que se generaba debido a una hiperplasia neointimal, que podía producirse a lo largo de semanas o meses (Figura 3B). En las primeras angioplastias que se realizaron, la reestenosis afectaba a un porcentaje significativo de pacientes, pudiendo llegar al 32-55% de los casos (Holmes et al., 1984). Debido a estas limitaciones, a lo largo de los años, la angioplastia coronaria percutánea ha experimentado una evolución continua (Byrne et al., 2017; Dangas et al., 2010). En 1980, se introdujeron los stent coronarios metálicos (BMS, Bare Metal Stent), unas mallas metálicas, expandibles que lograron disminuir la tasa de reestenosis a un 17-41% (Fischman et al., 1994; Sigwart et al., 1987). La reestenosis causada en este caso, se denomina reestenosis coronaria intra stent (IRS, In-Stent Restenosis). Esta reestenosis se define como un estrechamiento de más de un 50% de un segmento de un vaso sanguíneo previamente tratado con un stent, diagnosticado mediante ecografía intravascular o angiografía (Byrne et al., 2017). Por ello y con el fin de reducir aún más la reestenosis, se comenzaron a desarrollar stent farmacoactivos (DES, Drug-Eluting Stents) que 6 INTRODUCCIÓN permitían la liberación de fármacos de manera controlada y sostenida en los días posteriores al implante (Fattori & Piva, 2003). Actualmente, los fármacos utilizados tienen características antiinflamatorias, antitrombogénicas, antiproliferativas e inmunosupresoras (Yin et al., 2014). Entre ellos destacan el sirolimus y el paclitaxel correspondientes a los stent de la primera generación, o zotarolimus, everolimus y novolimus de la segunda generación. A pesar de la gran diversidad de stent utilizados, además de los nombrados anteriormente, se están usando stent liberadores de fármacos con polímeros biodegradables o armazones bioabsorbibles. Actualmente, los DES de segunda generación han pasado a ser los más usados en todo el mundo (Kalra et al., 2017; Tomberli et al., 2018). No obstante, a pesar de estos avances, los pacientes con ISR pueden volver a presentar síntomas clínicos, como angina inestable e infarto de miocardio en un 5- 10% de los casos, siendo necesario repetir la intervención (Pleva et al., 2018; Ullrich et al., 2021). Además, la reestenosis es una enfermedad compleja cuyos mecanismos fisiopatológicos aún no se han comprendido completamente y sigue siendo una limitación importante para esta técnica terapéutica (Kim & Dean, 2011). Por estos motivos en esta tesis doctoral nos centraremos en profundizar sobre su fisiopatología y mecanismos moleculares con el fin de mejorar la eficacia de este tratamiento. 3. EL PAPEL DE LAS CÉLULAS DEL MÚSCULO LISO EN LA REESTENOSIS 3.1. Células del músculo liso vascular (CMLV) Las células del músculo liso vascular (CMLV) son los componentes celulares mayoritarios de los vasos sanguíneos. Son células fusiformes que se caracterizan por tener invaginaciones a lo largo de la membrana plasmática, denominadas caveolas, donde se agrupan algunos canales iónicos y receptores específicos. Además, presentan un retículo endoplásmico bastante abundante, que se denomina retículo sarcoplásmico (RS). Este actúa como reservorio de Ca2+ que se libera hacia el citoplasma o se recapta 7 INTRODUCCIÓN permitiendo mantener la homeostasis de Ca2+ y por ende un desarrollo adecuado de determinadas funciones celulares (D. Wilson, 2011). La principal función de estas células es la contráctil ya que modulan la vasoconstricción y la vasodilatación, manteniendo el tono vascular y con ello la presión sanguínea. Además, proporcionan integridad estructural a los vasos sanguíneos permitiendo la distribución de la sangre a todos los tejidos. Las CMLV tienen una maquinaria contráctil compuesta principalmente por actina y miosina, que forman los filamentos delgados y gruesos, respectivamente. La contracción comienza con la activación de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que desencadena la activación de la enzima fosfolipasa C (PLC) la cual hidroliza el fosfatidilinositol 4,5- bifosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). El IP3 se une al receptor de IP3 localizado en el RS activándose la apertura de un canal de Ca2+ y provocando la liberación de Ca2+ del RS hacia el medio intracelular. Por otro lado, la despolarización de la membrana plasmática activa a los canales voltaje-dependiente permitiendo su apertura y la entrada de Ca2+. Todo ello provoca un aumento de la concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) que inicia la respuesta contráctil gracias a la formación del complejo con la calmodulina (CaM) que activa a la cadena ligera de la miosina (MLCK, Myosin Light Chain Kinase). El complejo MLCK/CaM activo fosforila a las cadenas ligeras reguladoras de la miosina mediante la hidrólisis del adenosín trifosfato (ATP, Adenosine Triphosphate). Esto provoca un cambio conformacional en la miosina que permite la formación de puentes cruzados con los filamentos de actina sobre los que se desliza provocando su acortamiento que activa la maquinaria contráctil (Z. Liu & Khalil, 2018). Otra característica importante de las CMLV es su gran plasticidad fenotípica. En condiciones fisiológicas, estas células se mantienen en un estado quiescente, con un estado migratorio mínimo y con capacidad contráctil. Este fenotipo se caracteriza por expresar proteínas contráctiles como la α-actina de músculo liso (αSMA, α-Smooth Muscle Actin), la cadena pesada de la miosina de músculo liso (SM-MHC, Smooth Muscle Myosin Heavy Chain), la SM22α o la calponina entre otras, que les permiten 8 INTRODUCCIÓN desempeñar esta función (Owens et al., 2004). Por otro lado, su plasticidad fenotípica permite que las CMLV pueden pasar de un fenotipo contráctil a un fenotipo proliferativo (Figura 4) contribuyendo así a mantener la estructura vascular mediante su capacidad de crecimiento, remodelado y reparación (House et al., 2008; Owens et al., 2004). Figura 4. Representación de la plasticidad fenotípica de las células del músculo liso vascular de un fenotipo quiescente a uno sintético y su consecuente variación funcional. CMLV: células del músculo liso vascular. Realizada con Biorender. El fenotipo sintético o proliferativo se caracteriza por una disminución de la expresión de proteínas contráctiles y la sobreexpresión de genes relacionados con el crecimiento celular, la proliferación, la migración y la síntesis de la matriz extracelular (Shawer et al., 2021). Este cambio fenotípico, puede inducirse por numerosas señales como pueden ser estímulos mecánicos, citoquinas y factores de crecimiento. Agonistas como la noradrenalina, angiotensina II o la endotelina, pueden estimular la proliferación y/o el crecimiento de las CMLV tanto en la hipertrofia como en la hiperplasia celular. Otros factores de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF, Platelet derived growth factor) o el factor de crecimiento insulínico (IGF-1, Insulin-like growth factor) también promueve la proliferación celular y contribuye a la reparación normal de los vasos (Bayes-Genis et al., 2000; Humeau et al., 2018). Este cambio fenotípico se ve implicado en diversas 9 INTRODUCCIÓN patologías cardiovasculares. En este aspecto, en respuesta a un estrés o a una lesión vascular como es el caso de una angioplastia, las CMLV se desdiferencian, proliferan y migran favoreciendo la progresión de la reestenosis (Cao et al., 2022; Green et al., 2021). 3.2. La reestenosis como consecuencia de un cambio fenotípico en las CMLV La reestenosis se define como un nuevo estrechamiento de la luz de la arteria que ocasiona una reducción del flujo sanguíneo coronario hacía el corazón pudiendo dar lugar a un nuevo infarto y posteriormente al desarrollo de insuficiencia cardíaca. Se produce como resultado de una respuesta adaptativa del vaso sanguíneo frente al daño vascular producido por una angioplastia que provoca un remodelado vascular, distinto al causado por la aterosclerosis. La principal causa es la proliferación y migración excesiva de las CMLV hacia la túnica íntima promovido por un cambio fenotípico (Figura 5). Figura 5. Representación del daño endotelial causado por una angioplastia y comienzo del proceso de formación de la capa neoíntima durante la reestenosis. El daño endotelial provocado por la angioplastia desencadena el proceso inflamatorio provocando la liberación de citoquinas proinflamatorias y factores de crecimiento, entre otros, por células inflamatorias y plaquetas. Como consecuencia de todo ello, las CMLV experimentan un cambio fenotípico 10 INTRODUCCIÓN promoviendo su proliferación y migración celular y generando la formación de la neoíntima. Realizada con Biorender. Figura adaptada de (Efovi & Xiao, 2023). Durante esta intervención, el inflado del balón rompe la placa aterosclerótica y daña el endotelio. A ello le sigue una inflamación, una activación plaquetaria y una liberación de factores de crecimiento y citoquinas proinflamatorias (D. P. Wilson, 2011). Esta fase se caracteriza por la activación de plaquetas y fibrina, y la adhesión de neutrófilos y monocitos circulantes. La liberación de factores de coagulación e inflamatorios estimulan la proliferación de las CMLV y la formación de matriz extracelular. Este periodo inflamatorio que continuará con una inflamación crónica tiene un periodo corto de semanas o meses (Omeh & Shlofmitz, 2023). Como resultado de todo ello, las CMLV experimentan un cambio fenotípico de su estado contráctil a sintético o proliferativo (Figura 5). El cambio fenotípico de las CMLV supone una proliferación y migración de estas células hacia la capa íntima de la pared arterial formándose una nueva capa denominada neoíntima (Jukema et al., 2011; Yin et al., 2014). En concreto, el cambio fenotípico de las CMLV se estimula por citoquinas proinflamatorias como el TNFα y la IL-β, proteínas quimioatrayentes como MCP-1 y el PDGF (Efovi & Xiao, 2023). Asimismo, el mantenimiento de las CMLV en su estado quiescente también se ve comprometido por el daño endotelial ya que las células endoteliales dañadas cesan de liberar óxido nítrico que suele disminuir la proliferación y migración de estas células (Jukema et al., 2011). Por otro lado, en estos procesos la homeostasis del Ca2+ juegan un papel esencial como se comentará en apartados posteriores. 4. HOMEOSTASIS DEL CALCIO EN LAS CÉLULAS DEL MÚSCULO LISO VASCULAR El ion Ca2+ desempeña un papel fundamental en las CMLV siendo responsable de regular una gran variedad de procesos fisiológicos, entre ellos la proliferación celular, la migración y la contracción (House et al., 2008). Este ion actúa como segundo 11 INTRODUCCIÓN mensajero en múltiples vías de señalización intracelular, participando activamente en la regulación enzimática y la activación de factores de transcripción (Berridge et al., 2000). Una célula en reposo mantiene una concentración intracelular de Ca2+ de 100 nM, mientras que el fluido extracelular presenta una concentración de entre 1 y 2 mM. En el caso del RS, el Ca2+ se encuentra a concentraciones que oscilan en el rango de micromolar. La regulación de la homeostasis de este ion es esencial para una transducción adecuada de señales celulares y para el mantenimiento de sus funciones fisiológicas (Berridge et al., 2003; Marín et al., 1998). Esta regulación evita una sobrecarga tóxica de Ca2+ en la célula que perturbaría el equilibrio intracelular comprometiendo la viabilidad celular (Benson & Trebak, 2023; Berridge et al., 1998; Clapham, 2007). La homeostasis del Ca2+ está estrechamente controlada de forma espacial y temporal por una gran variedad de canales iónicos, bombas e intercambiadores localizados tanto en la membrana plasmática como en orgánulos celulares como el RS (Figura 6). Figura 6. Representación de la regulación de la homeostasis del calcio en las CMLV. Se muestra una célula manteniendo una concentración intracelular de 100nM, mientras que el medio extracelular presenta concentraciones entre 1-2nM. En el caso del retículo 12 INTRODUCCIÓN sarcoplásmico el Ca2+ oscila en un rango micromolar. La homeostasis del Ca2+ está estrechamente controlada por una gran variedad de canales iónicos, bombas e intercambiadores localizados tanto en la membrana plasmática como en orgánulos celulares como el RS. RS: retículo sarcoplásmico; GPCR: receptor acoplado a proteína G; NCX: intercambiador Na+/Ca2+; SOCC: Store Operated Calcium Channel; PMCA: ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática; IP3R: receptor de IP3; RYR: receptor de rianodina; SERCA: ATPasa de Ca2+ del RS. Figura creada con Biorender. Entre ellos, los canales de Ca2+ voltaje dependientes o los canales SOCC (Store Operated Ca2+ Channel) permiten la entrada de Ca2+ en el citoplasma. Con respecto a la liberación de Ca2+ al espacio extracelular, actúan el intercambiador Na+/Ca2+ (NCX) o la bomba Na+/Ca2+ ATPasa de la membrana plasmática (PMCA), mientras que puede producirse una salida de Ca2+ del RS mediante la activación y apertura de los receptores de rianodina (RYR, Ryanodine Receptor) o del receptor de IP3 (IP3R, Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor), ambos localizados en la membrana del RS. Los RYR son activados por rianodina (Guerrero-Hernández et al., 2002), cafeína (Zucchi & Ronca-Testoni, 1997) o concentraciones demasiado elevadas de Ca2+ en el retículo (McCarron et al., 2016), mientras que el IP3R es activado por IP3 (Grayson et al., 2004). Por otro lado, se produce una recaptación de Ca2+ desde el citoplasma hasta el RS a través de una ATPasa del retículo sarcoplásmico (SERCA) (Chemaly et al., 2013). Todos estos componentes permiten regular los niveles de la [Ca2+]i y así mantener el equilibrio iónico y el potencial de membrana de estas células. A pesar de la regulación tan controlada de la homeostasis del Ca2+, ésta puede verse alterada por diversas señales o estímulos. De este modo, se puede desencadenar una entrada de Ca2+ desde el medio extracelular, así como una salida de los reservorios intracelulares hacia el citoplasma, provocando una señalización celular que afecta a diferentes funciones en las que este ion se ve implicado (Berridge et al., 2000). En esta tesis doctoral nos hemos centrado en la entrada de Ca2+ a través de los canales SOCC operada por los reservorios (SOCE). 13 INTRODUCCIÓN 4.1. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) En 1977, Putney observó por primera vez evidencias de una entrada de Ca2+ extracelular provocada por un vaciado de los reservorios de Ca2+ intracelulares (Putney, 1977). Posteriormente, en 1986, formalizó esta teoría con el nombre de entrada capacitativa de Ca2+ (ECC) (Putney, 1986). Según esta propuesta, el vaciado de los reservorios de Ca2+ intracelulares mediante la acción de IP3 desencadena una vía de entrada directa de Ca2+ desde el exterior hacia los reservorios, funcionando como un mecanismo de restauración de Ca2+ en el retículo. En 1989, Takemura confirmó esta teoría mediante un estudio en el que estimuló células acinares de la parótida con tapsigargina (TG) (Takemura et al., 1989), un inhibidor de SERCA. Este estímulo provocaba un vaciado de Ca2+ del retículo que desencadenaba la entrada extracelular de Ca2+. No obstante, en 1990 Putney (Kwan et al., 1990) se vio obligado a reevaluar su teoría pues observaron que la entrada de Ca2+ hacia los reservorios intracelulares se producía mediante una vía citoplasmática en lugar de a través una ruta directa entre el medio extracelular y los reservorios. Posteriormente, este proceso fue nombrado Store Operated Ca2+ Entry (SOCE). Fueron entonces estudios electrofisiológicos combinando patch-clamp y Fura-2 realizados por Hoth y Penner en 1992 (Hoth & Penner, 1992) los que determinaron una corriente pequeña y muy selectiva a Ca2+, a la que denominaron ICRAC o corrientes de Ca2+ activadas por la liberación de Ca2+ (CRAC, Ca2+ Release Activated Ca2+). Sin embargo, también se describirían otras corrientes denominadas ISOC o corrientes SOC (Store Operated Channel), que también dependían del vaciado de los reservorios intracelulares pero eran corrientes catiónicas, poco selectivas al Ca2+. Además, postularon que este mecanismo podría ser relevante en células no excitables para mantener concentraciones elevadas de Ca2+ intracelular y reponer los reservorios tras haber sido vaciados por la estimulación de receptores. Asimismo, más tarde se demostró que este mecanismo desempeña un papel crucial en células excitables, como las CMLV, actuando a través del mismo mecanismo de activación como profundizaremos posteriormente (Leung et al., 2008). 20 INTRODUCCIÓN Por una parte, carece del sitio de unión al PIP2 y a la caveolina, lo que parece conferirle una mayor movilidad en la membrana plasmática (Fukushima et al., 2012). Recientemente, se ha podido demostrar que bajo condiciones en las que se produce un vaciado de los reservorios intracelulares de Ca2+, Orai1β requiere de la presencia de Orai1α durante el proceso del transporte de esta proteína a la membrana plasmática (Jardin et al., 2023). Por otro lado, ambas isoformas generan corrientes ISOC e ICRAC, sin embargo, Orai1α muestra corrientes IARC y presenta una mayor CDI (Desai et al., 2015). De hecho, Orai1β carece de sitios de fosforilación de la PKC, implicados en la inhibición del canal, así como de la zona de unión para la AC8. Por ello, Orai1β podría estar implicado en diferentes patologías en las que requieren mayor actividad del canal Orai1 aportando una concentración mantenida de Ca2+ a las células (Sánchez-Collado et al., 2021; Trebak & Putney, 2017). 4.1.1.4. SARAF (SOCE associated regulatory factor) como regulador de SOCE SARAF (SOCE associated regulatory factor), también denominada TMEM66, es otro de los componentes implicados en la regulación de SOCE. Fue identificada y descrita en 2012 por Palty y col. (Palty et al., 2012). Esto se logró gracias a una búsqueda de genes mitocondriales implicados en los cambios en los niveles de Ca2+ en este orgánulo. Estructuralmente, SARAF es una proteína de 339 aminoácidos que presenta un único dominio transmembrana y que se localiza principalmente en el retículo endoplasmático, aunque en células de neuroblastoma se ha detectado en la membrana plasmática (Albarran, Lopez, Woodard, et al., 2016). Indagando más en su estructura, el extremo C-terminal se orienta hacia el citoplasma y es el implicado en la regulación de SOCE mediante la desestabilización de la unión STIM-Orai1. Por otro lado, el extremo N-terminal se localiza hacia el lumen del retículo y regula su actividad. En relación con su mecanismo de acción, Palty y col. demostraron, mediante estudios de microfluorimetría de Ca2+ y análisis electrofisiológicos en células T HEK293 y Jurkat, que SARAF está implicado en la SCDI del canal Orai1. No 21 INTRODUCCIÓN obstante, a pesar de que SARAF tiene un papel principal en la regulación de los canales CRAC, se ha descrito que esta proteína cuando se localiza en la membrana plasmática, como ocurre en células de neuroblastoma, interacciona con los canales ARC regulando negativamente la entrada de Ca2+ a través de estos (Albarran, Lopez, Woodard, et al., 2016). Además, Albarrán y col. también demostraron que SARAF puede interaccionar con TRPC1, independientemente de STIM1 y Orai1, actuando como regulador negativo de la entrada de Ca2+ a través de TRPC1 evitando una sobrecarga de Ca2+ en el interior celular (Albarrán et al., 2016). Actualmente, SARAF se ha identificado como una proteína asociada a STIM1 implicada en la SCDI de Orai1 (Jardín et al., 2018). En situación de reposo, SARAF se encuentra interaccionando con STIM1, lo que evita una activación espontánea de SOCE al impedir la interacción de STIM1 con Orai1 (Palty et al., 2012) (Figura 10). En concreto, esta interacción SARAF-STIM1 se lleva a cabo entre una región en el extremo C-terminal de SARAF con la región SOAR/OASF de STIM1, región de unión con Orai1 (Jha et al., 2013). Figura 10. Mecanismo de actuación de Saraf. En condiciones de reposo, SARAF interacciona con dominios de STIM1. Tras un vaciado del Ca2+ del reservorio (1), SARAF se disocia de STIM1 de manera transitoria (2) y permite la unión de STIM1 a Orai1 y SARAF vuelve a estar unido a STIM1 (3) (Dagan & Palty, 2021). En condiciones en las que se produce un vaciado de los reservorios de Ca2+, SARAF se disocia de STIM1 y se asocia al C-terminal de Orai1 durante la activación del canal y antes de que se produzca su SCDI, segundos más tarde vuelve a interaccionar con STIM1. Es decir, puede presentar un papel dual, contribuyendo 22 INTRODUCCIÓN inicialmente a la activación de CRAC y facilitando posteriormente una inactivación. (Albarran, Lopez, Amor, et al., 2016; Zomot et al., 2021). De hecho, se ha demostrado una interacción entre Orai1 y SARAF en células endoteliales durante la angiogénesis que permite el mantenimiento de SOCE, actuando, así como un activador del mismo (Galeano-Otero et al., 2021). 4.1.2. Mecanismo de activación SOCE El mecanismo de SOCE se desencadena debido a la depleción de los reservorios intracelulares de Ca2+, es decir al vaciado/liberación de Ca2+ del RS (Figura 11). Este vaciado puede ser provocado mediante diversos estímulos como la interacción de agonistas y factores de crecimiento con receptores tipo tirosina quinasa o receptores acoplados a proteínas G. Estos receptores activan a la PLC, que produce IP3. El IP3 se une a su receptor específico en la membrana del RS, conocido como IP3R, lo cual desencadena la liberación de Ca2+ desde el retículo hacia el citoplasma. En condiciones de disponibilidad de Ca2+ en el RS, SARAF se encuentra unida a STIM1 controlando la unión con Orai1 y evitando la activación de SOCE y la sobrecarga de Ca2+ en la célula (Jha et al., 2013; Palty et al., 2012). Sin embargo, la disminución de Ca2+ en RS es detectada por STIM1, en concreto por los dominios EF hand, lo cual produce un cambio conformacional de STIM1 y su oligomerización (Luik et al., 2008). Esto conlleva la disociación de STIM1-SARAF, exponiendo así el dominio de activación SOAR de STIM1, el cual interacciona con Orai1 ubicado en la membrana plasmática. Esta interacción induce la apertura de Orai1 y, como consecuencia, la entrada de Ca2+ hacia el interior celular (Avila-Medina et al., 2018). 23 INTRODUCCIÓN Figura 11. Mecanismo de activación de Store-Operated calcium entry (SOCE). En condiciones de reposo en las que el retículo sarcoplásmico (RS) se encuentra con altas concentraciones de Ca2+ (izquierda), la proteína Stromal interacting molecule 1 (STIM1) mantiene unidos iones de Ca2+ en sus dominios EF-hand, actuando como un sensor de la concentración de Ca2+. Bajo estas condiciones la proteína reguladora SOCE-associated regulatory factor (SARAF) se encuentra asociado a STIM1. La depleción de Ca2+ del retículo (derecha) viene provocada por la activación de receptores acoplados a proteínas G mediante agonistas. Su activación provoca la generación de IP3 que activa el receptor de IP3 localizado en la membrana del retículo y provoca la liberación de Ca2+ del RS. La disminución de Ca2+ es sensada por STIM1 provocando su cambio conformacional y su oligomerización, que conlleva la disociación de STIM1-SARAF permitiendo la unión STIM1-Orai1. En consecuencia, se produce la apertura del canal de Orai1 y la entrada de Ca2+ al medio intracelular. Para la vuelta a estado de reposo, parte del Ca2+ se recapta de nuevo al RS por la acción de SERCA. Figura creada con Biorender. Como se ha comentado anteriormente, en este proceso SARAF parece desempeñar un papel importante en la activación de SOCE, ya que se une a Orai1 y favorece su activación (Albarran, Lopez, Amor, et al., 2016; Jardín et al., 2018). Sin embargo, este proceso regulatorio de SARAF en las CMLV aún no se ha descrito previamente. 24 INTRODUCCIÓN 5. PAPEL DE SOCE EN LA PROLIFERACIÓN DE LAS CMLV DURANTE FORMACIÓN DE LA NEOÍNTIMA Las primeras evidencias de la presencia de SOCE en las CMLV se observaron en manos de Casteels y Droogmans en 1981 (Casteels & Droogmans, 1981). Estos estudios mostraban una entrada de Ca2+ desde el medio extracelular hacia los reservorios intracelulares en CMLV estimuladas con noradrenalina. Estas evidencias eran similares a las que observó posteriormente Putney en 1986, comentado anteriormente (Putney, 1986). En este tipo celular, SOCE interviene en procesos fisiológicos como la regulación del tono vascular, la vasculogénesis, la proliferación celular y la contracción. Además, Orai1 y Stim1 participan en la hiperplasia del músculo liso arterial en diferentes patologías como la hipertensión arterial pulmonar, la hipertensión y la reestenosis vascular (Avila-Medina et al., 2018; Johnson & Trebak, 2019; Spinelli & Trebak, 2016). En relación con el papel que desempeña SOCE en las CMLV durante el proceso de formación de la neoíntima tras una angioplastia, nos centramos en la relación entre un aumento de la [Ca2+]i ocasionada por SOCE y el aumento de la proliferación de las CMLV durante este proceso (Figura 12). Existen evidencias claras de la alteración en diferentes vías de señalización del Ca2+ durante la formación de la neoíntima en el proceso de reestenosis. En concreto, se han demostrado modificaciones en la actividad y/o expresión de canales iónicos, bombas y enzimas activadas por Ca2+ (House et al., 2008). En este contexto, los canales voltaje dependiente tipo L (Cav 1.2) se encuentran disminuidos en el fenotipo proliferativo y como consecuencia la función contráctil de estas células se ve comprometida. Respecto a los componentes de SOCE, tienen una función crítica como reguladores de la proliferación durante el proceso adaptativo de remodelado celular (Trebak, 2012). Concretamente, las CMLV con fenotipo proliferativo presentan altos niveles de STIM1 y Orai1, mientras que en las CMLV contráctiles, estas proteínas se ven disminuidas (Shawer et al., 2021). 25 INTRODUCCIÓN Figura 12. Mecanismo de Store-Operated calcium entry (SOCE) en las CMLV durante el proceso de formación de la neoíntima. Representación esquemática de los trastornos vasculares dependientes de la activación de SOCE en las CMLV. El daño vascular provocado por una angioplastia provoca un cambio fenotípico de las CMLV y un aumento de proteínas implicadas en proteínas como Orai1/2/3, STIM1 o SARAF, un aumento de la entrada de Ca2+ al medio intracelular y en consecuencia la proliferación y migración de las CMLV y el remodelado vascular. SOCE se encuentra implicado en proliferación y migración de las CMLV durante el proceso de reestenosis (Shawer et al., 2021). Tanto in vitro, en cultivos celulares de CMLV con fenotipo proliferativo como in vivo, en carótidas lesionadas en un modelo de angioplastia en rata se muestra una sobreexpresión de Orai1 y STIM1 así como un aumento de SOCE (Bisaillon et al., 2010; Potier et al., 2009). El Ca2+ desencadena la activación de diferentes rutas de señalización que finalizan en la activación de factores de transcripción (Kudryavtseva et al., 2013; Matchkov et al., 2012), como el factor nuclear de células T activadas (NFAT), el factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NFκB) o CREB (cAMP Response Element 26 INTRODUCCIÓN Binding), regulando la transcripción de genes implicados en la proliferación celular (Humeau et al., 2018). De hecho, un silenciamiento de Orai1 y de STIM1 inhibe la proliferación y la migración de las CMLV y reduce la formación de la neoíntima en la reestenosis. (Guo et al., 2009; Potier et al., 2009; W. Zhang et al., 2011). En el caso de Orai3, también se encuentra sobreexpresado en las arterias durante la reestenosis, aunque no se han mostrado evidencias de una relación con SOCE (González-Cobos et al., 2013). Con relación a SARAF, existen algunas evidencias de su papel en el remodelado vascular. Se ha observado una disminución de SARAF en la neoíntima de arterias carótidas procedentes de un modelo de rata de angioplastia, en comparación con arterias controles. Además, su sobreexpresión favorece a una reducción de la neoíntima en estas carótidas y, por tanto, una disminución de la proliferación y migración de las CMLV. (J. Yang et al., 2019). Sin embargo, aún no queda clara la regulación de SOCE por proteínas reguladoras como SARAF ni de la interacción entre SARAF y el complejo Orai1-STIM1 en las CMLV durante su proliferación en la reestenosis vascular. 6. PAPEL EMERGENTE DE LOS MIRNA EN LA REESTENOSIS Los microRNAs (miRNAs) son RNAs de pequeño tamaño (~18-22 nucleótidos) no codificante que presentan una estructura de horquilla monocatenaria, se expresan de manera endógena y regulan la expresión génica a nivel post transcripcional (He & Hannon, 2004). Los miRNAs han sido ampliamente estudiados tanto en su papel como posibles biomarcadores en diversas enfermedades cardiovasculares como la hipertrofia cardiaca, las arritmias o el infarto de miocardio (Galeano-Otero et al., 2020; Smani et al., 2020), como en su función como reguladores de múltiples procesos fisiológicos y patológicos. Su síntesis se inicia en la transcripción de regiones no codificantes del DNA genómico a la que le sigue un procesamiento en el núcleo (Figura 13). En primer lugar, generalmente por la acción de la RNA polimerasa II, se sintetiza un miRNA primario (pri-miRNA) (Ha & Kim, 2014; Lee et al., 2004) que se escinde por la actuación de una ribonucleasa denominada Drosha y la proteína de 27 INTRODUCCIÓN unión a ARN DiGeorge Syndrome Critical Region 8 (DGCR8) que da lugar a una molécula precursora, pre-miRNA. Esta se exporta al citoplasma por el complejo Exportina-5/RanGTP donde es procesado por la endonucleasa Dicer generando el miRNA maduro. Figura 13. Representación esquemática de la síntesis, procesamiento y mecanismo de acción de los miRNAs. Figura modificada de Biorender. El mecanismo de acción comienza con la unión a una proteína Argonauta (AGO) para formar un complejo ribonucleoproteico llamado RISC (del inglés, RNA-induced silencing complex). Este complejo reconoce y se une a secuencias específicas de RNA mensajero (mRNA) (Efovi & Xiao, 2023). Por una parte, de manera canónica, los miRNA se unen a la región 3’UTR del mRNA dando lugar a una estructura imperfecta provocando su degradación o inhibición. Sin embargo, los miRNAs pueden localizarse en el núcleo donde pueden unirse a regiones promotoras de genes 28 INTRODUCCIÓN induciendo alteraciones epigenéticas que silencian o activan la transcripción de estos (De Rosa et al., 2014; Place et al., 2008; Roberts, 2014). 6.1. Papel de los miRNAs en el proceso de reestenosis Durante el proceso de reestenosis, se produce estrés, daño celular y la activación celular, lo que desencadena la liberación de miRNAs detectables en el suero de los pacientes afectados. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, los miRNAs pueden considerarse biomarcadores pudiendo permitir un diagnóstico y un seguimiento de esta patología. Sin embargo, no son muchos los estudios existentes en ámbito. Entre ellos, se han identificados algunos miRNAs más sensibles y específicos, como son el miR-21, mir-100, miR-143 y mir-145, y otros como el miR- 93-5p, que se considera un biomarcador independiente más robusto para la predicción de la IRS (Varela et al., 2020). Además, estudios recientes realizados en nuestro laboratorio han propuesto el miR-30b-5p como un posible biomarcador pronóstico de la reestenosis debido a la disminución significativa de sus niveles en el suero pacientes con IRS en comparación con aquellos pacientes que no presentan IRS (Gutiérrez- Carretero et al., 2021). Relacionado con ello, se ha descrito que el miRNA-30 tiene como diana la enzima CAMKIIδ en carótidas de rata lesionadas mediante angioplastia ya que se ha observado una disminución de este miRNA que coincide con un aumento de expresión de CAMKIIδ. Además, la restauración de este miRNA previene el incremento de expresión de esta proteína, la proliferación de las CMLV y la formación de la neointima (Y. F. Liu et al., 2016). Actualmente, se han descrito numerosos miRNAs implicados en la regulación génica de diferentes vías de señalización específicas de las CMLV durante el proceso de reestenosis. La mayoría de los estudios se centran en el cambio fenotípico, en el aumento de la proliferación y en la migración que ocurre en las CMLV en esta patología (Efovi & Xiao, 2023). Concretamente, el miR-143 y miR-145 juegan un papel clave en la regulación del cambio fenotípico de las CMLV puesto que su expresión es suficiente para inducir su fenotipo quiescente frente al proliferativo (Cordes et al., 2009). Por otro lado, en el modelo de angioplastia carotídea en rata, se 29 INTRODUCCIÓN han descrito varios miRNAs implicados en el aumento de la proliferación de las CMLV. Este es el caso del miR-18a-5p que parece estar implicado en la diferenciación de las CMLV mediante la disminución de la expresión de syndecan4 (Kee et al., 2014) o del miR-21 (Ji et al., 2007) y del miR-93 que promueven la proliferación y la migración de las CMLV mediante su gen diana Mfn2 (Feng et al., 2019). Otros ejemplos son el miR-26a que tiene como diana el gen Smad1, mediador de la señal pro-contráctil, provocando la disminución de su expresión y favoreciendo el fenotipo proliferativo (X. Yang et al., 2017); el miR-146a que promueve la proliferación de las CMLV mediante la inhibición de KLF4 (Krüppel-like factor), una proteína con efecto antiproliferativo (S. G. Sun et al., 2011); o el miR-214 (Afzal et al., 2016) y el miR- 221/miR-222 (X. Liu et al., 2009), también implicados en este proceso. 6.2. Papel de los miRNAs como reguladores de SOCE Existen algunos estudios que muestran la regulación de algunos componentes de SOCE por miRNAs en diferentes tipos celulares y patologías. Un ejemplo de ello es el mir-424/322 que parece regular a STIM1 de forma indirecta durante el proceso de formación de la neoíntima en un modelo de angioplastia en rata (Merlet et al., 2013). En otras células como HeLa Orai1 está regulado por el miR-519 provocando una inhibición de la proliferación celular mediante la alteración de la homeostasis del Ca2+ durante el ciclo celular (Abdelmohsen et al., 2012). Además, una sobreexpresión del miR-34a-5p en células Jurkat disminuye SOCE debido a una reducción de la expresión de STIM1 y Orai3 (Diener et al., 2018). De igual modo, en la línea celular de cáncer de mama MCF-7, miR-34a reprime la expresión de Orai3 mientras que miR- 18a y miR-18b la regulan positivamente (Vashisht et al., 2018). Por otro lado, se ha podido comprobar que la expresión de STIM1 está regulada por diferentes miRNAs como por ejemplo el miR-185 y miR-195 que evitan la migración celular en células de cáncer de colon (Abdelmohsen et al., 2012; Zhuang et al., 2013). Sin embargo, aún se desconoce la regulación de SOCE mediada por miRNAs en el proceso de reestenosis. A pesar de ello, los estudios anteriormente mencionados podrían asegurar la existencia de esta regulación ya que se ha demostrado que están 37 MATERIALES Y MÉTODOS Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la actual legislación española de protección animal (Real Decreto 53/2013), de acuerdo con la Directiva 2010/63/EU del Parlamento Europeo y aprobada por el Comité de Ética de Cuidado Animal del Hospital Universitario Virgen del Rocío (HUVR) de Sevilla (N.º de proyecto CE: 27-05-15-256). Para conseguir los objetivos propuestos se realizaron experimentos in vivo con un modelo de angioplastia carotídea en rata e in vitro con cultivos celulares primarios de músculo liso vascular y con la línea celular de músculo liso A7r5. 1. MODELO DE ANGIOPLASTIA CAROTÍDEA El modelo animal de angioplastia que se empleó se basó en un modelo de lesión con balón de la arteria carótida en rata, descrito por el grupo de Trebak (W. Zhang & Trebak, 2014). Este modelo está bien establecido en el estudio de los mecanismos moleculares y celulares implicados en la desdiferenciación del músculo liso vascular, la formación de la neoíntima y el remodelado vascular. Se utilizaron ratas Wistar machos, de entre 350-400 g, para evitar la variable de la influencia de las hormonas femeninas, protectoras contra las enfermedades cardiovasculares. Todas las ratas se mantuvieron en condiciones óptimas de estabulación, con las variables ambientales de temperatura, humedad e iluminación adecuadas y se les proporcionó alimento y agua sin restricciones antes y después de la cirugía (ad libitum). Para la anestesia, se administró de manera intraperitoneal una solución de xilacina (20 mg/ml) y ketamina (50 mg/ml). Para llevar a cabo esta intervención, se seleccionó la arteria carótida común derecha (CCA, Common Carotid Artery), mientras que la carótida izquierda se tomó como control interno. Este control es necesario dado que la lesión desencadena una respuesta inflamatoria que afectaría a todo el organismo. En primer lugar, se disecan cuidadosamente las distintas capas musculares para localizar la arteria, y se aíslan por completo la CCA, la carótida interna (ICA, Internal Carotid Artery), la externa (ECA, External Carotid Artery) y la bifurcación entre ellas, tal y como se puede apreciar en la Figura 14. 38 MATERIALES Y MÉTODOS Figura 14. Aislamiento de la arteria carótida derecha. A la izquierda, se muestra el animal posicionado para el procedimiento quirúrgico y la zona de operación expuesta. A la derecha, la arteria carótida aislada después de la disección donde se pueden distinguir la arteria carótida común, la interna y la externa. A continuación, se procede a cortar el flujo sanguíneo de la ECA de manera irreversible y de la CCA y la ICA de manera reversible mediante micro clamps (Figura 15A). Con unas micro tijeras, se realiza una pequeña incisión en la ECA por donde se introduce un catéter provisto de un balón Fogarty 2F (Edwards Lifesciences, EEUU) (Figura 15B). El balón se infla tres veces con una presión de 3 atm para llevar a cabo la angioplastia, lo que provoca la lesión del endotelio vascular (Figura 15C). Una vez realizado este procedimiento, se anuda la ECA en la zona más cercana a la bifurcación para aislar la incisión y evitar la fuga del flujo sanguíneo, mientras que el resto del flujo se restablece retirando los micro clamps. Para garantizar el bienestar de las ratas tras la cirugía, se les administra el analgésico meloxicam vía subcutánea a una concentración de 1 mg/ml/kg. 39 MATERIALES Y MÉTODOS Figura 15. Imagen de la carótida aislada, introducción e inflado del balón durante el proceso de angioplastia. A: Arteria aislada con el flujo sanguíneo detenido por las suturas en la ECA y los micro clamps en la ICA y CCA. B: Introducción del balón por la incisión en la ECA hacia la CCA. C: Balón del catéter inflado en el interior de la arteria produciendo la lesión. 1.1. Extracción y procesamiento del tejido vascular Los animales fueron sacrificados a las 24 horas (h), una semana (1W), dos semanas (2W) o tres semanas (3W) después de la lesión mediante inyección intraperitoneal con una sobredosis letal de tiopental sódico (200 mg/kg). Posteriormente, se aislaron y extrajeron tanto las arterias lesionadas (derecha) como las controles (izquierda), las cuales se mantuvieron sumergidas en PBS 1X (Phosphate Buffered Saline, Sigma-Aldrich, EEUU) donde se limpiaron para eliminar todo el tejido conectivo adyacente, así como los restos de sangre. A continuación, las carótidas se procesaron dependiendo del estudio a realizar. Para los estudios morfológicos con hematoxilina-eosina, inmunofluorescencia y Proximity Ligation Assay (PLA), las carótidas (1W, 2W y 3W) se fijaron en una solución de formalina al 10 % (Formalin neutral buffered, 10%, Sigma-Aldrich, EEUU) durante toda la noche. La formalina se sustituyó por una solución de sacarosa al 15 % durante 6-12h, y posteriormente se pasaron a una solución de sacarosa al 30 40 MATERIALES Y MÉTODOS % durante toda la noche con la finalidad de crioproteger el tejido. Finalmente, se incluyeron en OCT (Optimum Cutting Temperature, Sajura Finetek, EEUU) y se congelaron a -80ºC para garantizar una buena inclusión de las muestras y formar un bloque que facilitara su corte. Se cortaron secciones transversales de 10 µm, utilizando el criostato Leica CM1950. Estos cortes se realizaron de manera transversal, a la altura de la arteria carótida común (Figura 16), donde se localiza el daño, para poder observar la evolución del daño en las diferentes capas de la arteria. Las secciones se conservaron a -20 ºC hasta su utilización. Para los estudios de expresión de proteínas, las arterias carótidas aisladas de ratas operadas de 1W, 2W y 3W se limpiaron y congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, y se mantuvieron a -80ºC hasta su uso. En el caso del estudio de mRNA y miRNAs se procedió de igual manera, pero también se incluyó el estudio de arterias procedentes de ratas operadas a las 24h. Figura 16. Representación de la estructura de una arteria carótida y de sus capas: túnica íntima, túnica media y túnica adventicia. Figura modificada de (Zaid et al., 2017) 41 MATERIALES Y MÉTODOS 2. EVALUACIÓN DE LA LESIÓN VASCULAR 2.1. Análisis morfométricos mediante tinción Hematoxilina-eosina Para el marcaje de hematoxilina-eosina, las secciones se descongelaron y se hidrataron mediante una serie de diluciones de etanol y xileno. Posteriormente, se lavaron con agua y se tiñeron con hematoxilina (Química Clínica Aplicada S.A, España) y eosina (Bio-Optica, Italia) junto con carbonato de litio. A continuación, las secciones se deshidrataron y se montaron con DAKO (Dako Fluorescence medium, Agilent Technologies, EEUU), y se mantuvieron a temperatura ambiente. La obtención de las imágenes se llevó a cabo utilizando el microscopio Olympus BX51 con un sistema de cámara digital Olympus DP70. Se obtuvieron imágenes a 10X, 20X y 40X con el programa cellP (Olympus Soft Imaging Solutions, Japón). Luego, se cuantificaron mediante el programa ImageJ (National Institutes of Health, EEUU), obteniéndose las áreas de la capa neoíntima y la capa media. Se calculó la relación neoíntima/media y la suma de las áreas de la capa íntima y media que hemos denominado CIMA (Carotid Intima-Media Area). 2.2. Imagen ultrasonido in vivo. Ecografía Para medir el CIMT (Carotid Intima-Media Thickness) y el acortamiento de la arteria carótida durante el ciclo cardíaco, se empleó el sistema de ultrasonido VevoTM 2100 (VisualSonics, Canadá) en modo B, con un transductor lineal MS250 que operó en un rango de frecuencia de 13-24 MHz. Estos experimentos fueron realizados por el servicio de imagen del Instituto de Biomedicina de Sevilla. En la Figura 17 se muestra una imagen de la ecografía de una arteria carótida y se representa la medida realizada. Se capturaron imágenes longitudinales al final de la diástole durante al menos tres latidos consecutivos, las cuales se midieron manualmente en una escala digitalizada. Para la medición del CIMT y el acortamiento de las arterias (Figura 17), se utilizaron ratas ligeramente anestesiadas con sevoflurano al 2 %, mientras se monitorizó su respiración, frecuencia cardíaca y la temperatura central rectal, la cual 42 MATERIALES Y MÉTODOS se mantuvo en torno a los 37 ºC con ayuda de un calentador de agua y una lámpara de calor. Figura 17. Imagen tomada por ecografía de una arteria carótida de rata en modo B en el eje longitudinal. Se señalan las diferentes partes de la arteria carótida así cómo la zona donde se lleva a cabo la medida del acortamiento y el CIMT. 3. CULTIVO DE MÚSCULO LISO VASCULAR (CMLV) 3.1. Cultivo primario de CMLV de arteria coronaria de rata Se utilizaron ratas Wistar de aproximadamente 250 g de peso que se sacrificaron mediante una administración intraperitoneal de una sobredosis letal de tiopental sódico (200 mg/kg). Se les realizó una toracotomía para extraer el corazón y disecar cuidadosamente la arteria coronaria descendente anterior a partir de la cual se obtuvieron las células del músculo liso para el cultivo primario (Smani et al., 2007). Medida acortamiento Arteria carótida externa Arteria carótida interna Arteria carótida común Bifurcación 43 MATERIALES Y MÉTODOS Para ello, el corazón extraído se mantuvo en una solución de dispersión (SD) fría (en mM: 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,44 KH2PO4, 0,42 NaH2PO4, 2 MgCl2, 4,17 NaHCO3, 0,2 CaCl2, 10 HEPES, 11,11 glucosa y 0,05 EGTA; pH 7,4) y la arteria coronaria se aisló haciendo uso de la lupa, unas micro tijeras y unas micro pinzas (Figura 18A). Figura 18. Aislamiento de la arteria coronaria descendente anterior del corazón de una rata y cultivo primario de células de músculo liso. La imagen A muestra el procedimiento del aislamiento de la arteria coronaria mientras que la imagen B muestra un cultivo de las células de músculo liso procedentes de la dispersión de esta arteria en un periodo de confluencia avanzado. Posteriormente, para la dispersión celular, la arteria se incubó con 1,5 mg/ml de elastasa (4 unidades/mg; Sigma-Aldrich, EEUU) y 2 mg/ml de colagenasa tipo I (125 unidades/mg; Sigma-Aldrich, EEUU) en DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Gibco, EEUU) con 1 % de penicilina/streptomicina durante 45 minutos (min) - 1 h a 37ᵒC en el incubador, comprobando cada cierto tiempo el estado de la arteria. Las células se terminaron de dispersar de forma mecánica usando una pipeta y tras la inactivación de las enzimas con un 10 % de FBS (Fetal Bovine Serum, Thermo Fisher Scientific, EEUU) en DMEM, se centrifugó descartando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet celular con DMEM al 10 % de FBS. A continuación, las células se sembraron en placas de 3 cm de diámetro. En el caso de 44 MATERIALES Y MÉTODOS los experimentos de inmunofluorescencia o microfluorimetría, las células se sembraron en placas con cubres. Las células se mantuvieron con medio de cultivo DMEM al 10 % de FBS hasta alcanzar la confluencia necesaria para comenzar los experimentos (Figura 18B). 3.2. Cultivo de la línea celular A7r5 de CMLV La línea celular utilizada como modelo de las células de músculo liso vascular fue la A7r5 (Rat Aorta Smooth Muscle Cell). Se trata de una línea de células de músculo liso vascular adherentes, extraídas de la aorta torácica de ratas embrionarias BDIX. Las células se cultivaron y mantuvieron en flask de 25 cm2 (SPL Life Science, Korea) y se sembraron en placas 24 well, placas de 3 cm o de 6 cm de diámetro (Thermo Fisher Scientific, EEUU) según el experimento a realizar. De igual modo que en el cultivo primario, las células se sembraron en placas con cubres para los experimentos de inmunofluorescencia o microfluorimetría. Los cultivos se mantuvieron a 37 ºC, en condiciones de humedad saturada y con una presión parcial de CO2 del 5 % en medio DMEM al 10 % de FBS y 1 % de penicilina/streptomicina. 3.3. Ensayos de transfección del cultivo de CMLV con siRNAs o mimics Para estudiar cómo la expresión de un gen se relaciona con las diferentes funciones celulares de las CMLV, se utilizaron siRNAs (RNA interferentes pequeños). Los siRNAs son secuencias de RNA que se unen específicamente a la secuencia de mRNA del gen de interés silenciando o inhibiendo su expresión. Por otro lado, se utilizaron mimics que son secuencias de miRNAs que mimetizan a los miRNAs endógenos, para estudiar los efectos de su sobreexpresión en los genes dianas a los que regula. Las células del músculo liso vascular coronario de cultivo primario se transfectaron al alcanzar una confluencia del 70 %, utilizando siRNA y mimics prediseñados que se detallan en las Tablas 1 y 2, respectivamente. 45 MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 1. Secuencia de siRNAs utilizados Tabla 2. Secuencia de mirVana® miRNA mimic utilizados. La transfección se realizó con el reactivo de transfección HiPerFect (Qiagen, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para llevar ello se utilizó 12 µl del reactivo HiPerFect que se diluyó junto con 2,5 µl siRNAs (10 µM) o 3 µl de mimics (10 µM) en 100 µl de medio Optimem (Gibco, EEUU). La mezcla se incubó durante 15 min a temperatura ambiente y se añadió a las placas incubadas previamente durante 1 h con 1 ml de Optimem quedando una concentración final de 25 nM en el caso de los siRNAs y 30 nM para los mimics. A las 3 h, se añadió 1 ml de medio DMEM con 0,1 % de FBS. Tras 24h de la transfección, las células se estimularon según el experimento a desarrollar y se cultivaron durante 24 tras el estímulo para los ensayos de medida de expresión de mRNA o 48h para los estudios de microfluorimetría, ensayos de inmunofluorescencia y medida de expresión proteica mediante western blot. siARN Sentido Antisentido Referencia siOrai1 5’-GGGUGAAGUUCUUACCGCU-3’ 5’-AGCGGUAAGAACUUCACCC-3’ Ambion, Thermo (EEUU) siSaraf 5’-AGAUAUUGCGUACAAAUUU-3’ 5’-AAAUUUGUACGCAAUAUCU-3’ Ambion, Thermo (EEUU) siSTIM1 5’-GGAUCUCAGAGGGAUUUGA-3’ 5’-UCAAAUCCCUCUCUGAGAUCC-3’ Ambion, Thermo (EEUU) siControl 5’-CAAUAGCAAUCAUUACCAU-3’ 5’-AUGGUAAUGAUUGCUAUUG-3’ Ambion, Thermo Fisher (EEUU) Mimics Secuencia madura de miRNA Referencia hsa-miR18a-5p 5’-UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG-3’ Ambion, Thermo (EEUU) hsa-miR20a-5p 5’-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3’ Ambion, Thermo (EEUU) Control negativo 5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3’ Dharmacon (UK) 52 MATERIALES Y MÉTODOS PBS 1X. Para marcar los núcleos celulares, se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente con 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) disuelto en PBS 1X. El DAPI es un agente intercalante que se une al DNA tiñendo los núcleos y que se usa como referencia para contar el número de células totales. Después, se lavaron de nuevo con PBS 1X y se colocó un cubreobjetos usando un preservador de fluorescencia DAKO para permitir la visualización y la toma de imágenes de las secciones de la arteria en un microscopio confocal TCS SP2 Leica (Leica Microsystems, Alemania). Se utilizó un objetivo 10X para la adquisición de la arteria completa y un objetivo de inmersión con un aumento 20X, para obtener un solo plano focal de cada sección. Para la adquisición de la fluorescencia de DAPI se excitó a 405 nm, mostrando una emisión a una λ entre 400-405 nm; para Alexa Fluor 488 se excitó a 488 nm, presentando una emisión a 505-546 nm; y para Alexa Fluor 594, se excitó a 594 nm, con una emisión a 593-667 nm. El programa utilizado para la adquisición fue LAS AF (Leica Application Suite, Leica Microsystems, Alemania) y las imágenes se procesaron mediante el programa Image J (National Institute of Health). Para evaluar la proliferación celular en las secciones de las arterias se utilizó el anticuerpo anti-Ki67 que se une específicamente a la proteína Ki67 (Tabla 3) (X. Sun & Kaufman, 2018). La cuantificación de células positivas para Ki67 se realizó manualmente en tres secciones aleatorias de cada arteria, utilizando el plugin Cell Counter de ImageJ y se cuantificó respecto al número total de núcleos en cada sección, marcados con DAPI. Los núcleos se cuantificaron automáticamente con ImageJ utilizando el plugin Analyze Particles siguiendo un protocolo de Conteo de núcleos mediante ImageJ. Para ello, convertimos el canal azul que representa los núcleos a 8 bit mediante la herramienta Split channel y teniendo en cuenta un buen ajuste del color y el brillo. A continuación, se utiliza la herramienta Threshold que permite elegir los pixeles que representan los núcleos según el valor de la intensidad. Mediante la herramienta Watershed y Erode, se consigue una buena diferenciación de los diferentes núcleos que finalmente se cuentan de forma automática con el plugin 53 MATERIALES Y MÉTODOS Analyze Particles, habiendo seleccionado previamente el tamaño mínimo que se consideraría un núcleo, así como la circularidad del mismo. 6.2. Proximity ligation assay en arterias carótidas lesionadas Para analizar la colocalización espacial de Saraf y Orai1 en las CMLV tras la lesión vascular, se utilizó la técnica de Proximity ligation assay (Duolink in situ PLA detection kit Red, Sigma-Aldrich, EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante. Esta técnica de fluorescencia permite detectar, visualizar y cuantificar interacciones entre proteínas mediante fluorescencia, y detecta si dos proteínas se encuentran a menos de 40 nm de distancia (Figura 22). Figura 22. Esquema de la técnica de Proximity ligation assay. A. Incubación con anticuerpos primarios. B. Incubación con anticuerpos secundarios marcados con sondas Duolink. C. Hibridación de las sondas de los diferentes anticuerpos localizados a menos de 40nm de distancia. D. Amplificación de la señal para su detección mediante microscopio de fluorescencia. Imagen tomada del protocolo del kit Duolink in situ PLA detection (Sigma- Aldrich, EEUU). Este procedimiento se llevó a cabo en las arterias carótidas del modelo de angioplastia. En primer lugar, las secciones se bloquearon con la solución de bloqueo proporcionada por el kit, solución de bloqueo Duolink durante 1 h a 37 ºC, seguida de una incubación con los anticuerpos primarios: anti-Saraf (1:200 rabbit, Abcam) y anti-Orai1 (1:200 mouse, Abcam) durante toda la noche a 4 ºC diluidos en una solución Antibody Diluent (Figura 22A). Después del lavado con tampón de lavado A, se agregaron anticuerpos secundarios marcados con sondas Duolink PLA antirabbit PLUS y anti-mouse MINUS durante 1 h a 37 ºC (Figura 22B). A continuación, 54 MATERIALES Y MÉTODOS se volvieron a lavar con el tampón A y se llevó a cabo un proceso de ligación que consiste en añadir una solución de ligación, que consta de dos oligonucleótidos y una enzima ligasa, durante 30 min a 37 ºC. Si las sondas Duolink están muy próximas (< 40 nm), hibridarán (Figura 22 C). El siguiente paso es la amplificación, donde tras haber lavado con el tampón A, añadimos una solución de amplificación durante 100 min a 37 ºC, que contiene nucleótidos y oligonucleótidos marcados fluorescentemente, así como una polimerasa que permitirá el proceso de amplificación solo si las proteínas se encuentran a menos de 40 nm de separación (Figura 22D). Por último, las muestras se lavaron con tampón de lavado B y se montaron con Duolink Mounting Medium que incluye DAPI para teñir los núcleos. De esta manera, las sondas marcadas con un fluoróforo rojo se visualizaron utilizando un microscopio confocal (Leica TCS SP2). Se utilizaron objetivos de 10X, 20X y 63X, y se tomaron imágenes de las secciones en diferentes planos z (0,4 μm) y posteriormente, se realizó una proyección máxima. Para verificar la técnica se llevó a cabo un control negativo utilizando solo un anticuerpo primario (rabbit anti-Saraf o mouse anti-Orai1). La adquisición de las imágenes se realizó utilizando una longitud de onda de excitación de 405nm para DAPI, con una emisión a 400-450nm y de 594 nm para el reactivo rojo, con una emisión entre 593-667 nm. Las imágenes obtenidas se procesaron y montaron utilizando el programa programa ImageJ. 6.3. Estudio de proliferación celular por inmunofluorescencia mediante BrDU Para evaluar la proliferación celular en cultivo, se empleó el ensayo de incorporación de 5’-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) (Sigma Aldrich, EEUU), un análogo de la base timidina que se incorpora al DNA recién sintetizados por las células en división. Este ensayo permitió determinar el porcentaje de células que estaban proliferando durante un periodo de tiempo específico. El estudio se realizó para determinar cómo afecta el silenciamiento de determinadas proteínas o cómo afecta la sobreexpresión de miRNA específicos a la proliferación celular. Para ello, las CMLV se sembraron en cubreobjetos y se cultivaron hasta alcanzar un 70-80 % de confluencia. Luego, se transfectaron con siRNA (siControl, siOrai1 y siSaraf) o 55 MATERIALES Y MÉTODOS mimics (mir18a-5p y/o mir20a-5p) tal y cómo se explica en el apartado 3.3 de Materiales y métodos. A las 24h tras la transfección, se estimuló la proliferación celular con diferentes estímulos que se detallaran en el apartado de Resultados. Tras 24h o 48h del estímulo proliferativo, dependiendo de si se trataba de la línea A7r5 o del cultivo primario de CMLV respectivamente, y 18 h antes de la inmunotinción se incorporó BrDu (10 µM) para detectar las células que habían proliferado durante ese periodo de tiempo. Para la inmunotinción, las células se lavaron en PBS 1X frío y se fijaron con formalina a temperatura ambiente durante 20 min. Se usó HCl 2M para desnaturalizar el DNA y exponer las bases para el reconocimiento antígeno-anticuerpo. Seguidamente, se neutralizó la muestra con tetraborato de sodio (0,1 M y pH 8,5) y se bloqueó durante 30 min en una solución de bloqueo (0,1 % Triton X-100 en PBS 1X, 3 % Suero de Cabra y 1 % de Bovine Serum Albumin, BSA). A continuación, las células se incubaron con el anticuerpo primario, mouse anti-BrdU (Sigma Aldrich, EEUU) diluido 1:300 en solución de bloqueo en una cámara humidificada durante 2 h a temperatura ambiente. Después de varios lavados con PBS 1X, las células se incubaron con el anticuerpo secundario (AlexaFluor FITC 488 goat anti-mouse-IgG, Thermo Fisher, EEUU), diluido a 1:400 en solución de bloqueo, durante 45 min en oscuridad a temperatura ambiente. Posteriormente, las muestras se incubaron con DAPI (Sigma Aldrich, EEUU) en PBS 1X durante 5 min. Por último, se montaron en medio DAKO (Dako Fluorescence medium, Agilent Technologies, EEUU). Para el análisis, las imágenes se tomaron en un microscopio Olympus equipado con una cámara digital Olympus DP70 con canales de fluorescencia DAPI y FITC. Los experimentos se realizaron por triplicado tomando un mínimo de 3 cubres por condición y 4-5 fotografías de cada cubre y condición con objetivo 20X. Como control negativo, las células se incubaron sólo con el anticuerpo secundario. El marcaje de BrdU se calculó como la relación entre el número de células positivas a BrdU, cuantificadas manualmente utilizando el plugin Cell Counter de ImageJ (National institutes of Health, USA), y el número total de células, marcadas con 56 MATERIALES Y MÉTODOS DAPI, cuantificadas automáticamente con ImageJ como se ha detallado anteriormente. 7. ENSAYOS CON GENES REPORTEROS Con el fin de dilucidar la actuación de determinados miRNA sobre la expresión de nuestros genes de interés, se utilizó el kit Dual Glo-Luciferase Reporter Assay System (Promega, EEUU), que permite medir simultáneamente la actividad de dos enzimas reporteras: luciferasa firefy y luciferasa de Renilla, dentro de un solo sistema. Ambas enzimas son monoméricas y no requieren modificaciones post-traduccionales, lo que permite que funcionen como reporteros inmediatamente después de la traducción. En nuestro estudio, se buscó evaluar el efecto de los miR-18a y miR-20a de interés sobre la regulación de la expresión de ORAI1 mediante su acción a nivel del promotor. Para ello, se encargó, a la empresa Condalab (Madrid, España) la amplificación de 2990 pares de bases (pb) del promotor de ORAI1 y su inserción en el vector pGL3 basic en los sitios de restricción XhoI y MluI (Figura 23A), lo que permitió la expresión de la luciferasa firefly bajo el control del promotor del gen ORAI1. Figura 23. Mapa de los vectores utilizados para la medida de la actividad del promotor ORAI1. A. Vector del gen de la luciferasa firefly bajo el control del promotor del gen ORAI1, introducido en los sitios de restricción XhoI y MluI. B. Vector que expresa el gen de la luciferasa de Renilla bajo el promotor constitutivo HSV-TK, y que se utiliza como control de la eficiencia de la transfección y para la normalización de la actividad del promotor ORAI1. 57 MATERIALES Y MÉTODOS Por otro lado, se utilizó el plásmido pRL-TK (Promega, EEUU) (Figura 23B) como control de eficiencia de la transfección y para la normalización de la actividad de la luciferasa firefly. Este plásmido es un vector comercial que expresa la luciferasa de Renilla bajo el control del promotor de la timidina kinasa (TK) del virus Herpes simplex (HSV-TK) y presenta una actividad constitutiva moderada.Los experimentos se realizaron en la línea celular de músculo liso A7r5. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos que, tras presentar una confluencia adecuada, se transfectaron usando el reactivo DharmaFECT kb DNA transfection reagent (Horizon, RU) según las instrucciones del fabricante. Se transfectaron 500 ng del plásmido pGL3-Orai1, 25 ng del plásmido pRL-TK y 30 µM del mimic, en medio con DMEM al 10% FBS. Al día siguiente, el medio se cambió a DMEM con 5% FBS para mantener concentraciones de suero similares a los experimentos de silenciamiento y de mimics, y se mantuvieron durante 24h más. Tras este periodo, se eliminó el medio de cultivo y se lavó con PBS 1X. Se añadieron 100 µl de PBS 1X y 100 µl de reactivo Dual Glo luciferasa, el cual provoca la lisis celular y proporciona el sustrato necesario para medir la actividad de la proteína luciferasa firefly mediante luminiscencia. Una vez medida la actividad de la luciferasa firefly, se añadieron 100 µl del reactivo Dual-Glo Stop & Glo que detiene la actividad de la luciferasa firefly y aporta el sustrato necesario para medir la actividad de la luciferasa de Renilla (Figura 24). Las medidas de luminiscencia se obtuvieron mediante un luminómetro modelo GloMax® Discover Microplate Reader (Promega, EEUU). Figura 24. Reacciones enzimáticas de las enzimas Luciferasa firefly y Luciferasa de Renilla. 58 MATERIALES Y MÉTODOS 8. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 8.1. Extracción y cuantificación de proteínas de muestras del modelo de angioplastia carotídea Para homogeneizar las arterias, se colocaron en un eppendorf Safe Lock de 0,2 ml (Eppendorf) junto con dos bolas de acero inoxidable de 2 mm de diámetro y se usó el sistema TissuerLyserII (Qiagen, Alemania). El homogenizador se programó a 30Hz durante 30 segundos (s). Después, los eppendorf con las arterias se pasaron a nitrógeno líquido y se centrifugaron a 4ºC durante 1 min a 13000 rpm (revoluciones por minuto). Este procedimiento se repitió al menos 3 veces hasta conseguir la homogenización del tejido. Para la extracción proteica se utilizaron dos protocolos diferentes, uno en el que se extraen conjuntamente proteínas junto con RNA y miRNA y otro en el que se extraen exclusivamente proteínas. En el caso de la obtención únicamente de proteínas se añadió buffer de lisis RIPA (Sigma-Aldrich, EEUU) suplementado con inhibidores de proteasas, inhibidores de fosfatasas y PMSF (1 mM) (Sigma-Aldrich, EEUU). Las muestras se incubaron en hielo durante 30 min con vórtex cada 5 min para favorecer la lisis celular. Finalmente, se centrifugaron durante 30 min a 13000 rpm quedando las proteínas en el sobrenadante y los restos celulares en el pellet. Para determinar la cantidad de proteínas obtenidas, se realizó una cuantificación con BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, EEUU) o con el método Bradford (Biorad, EEUU). Por otro lado, con el fin de extraer tanto proteínas como RNA y miRNA, una vez homogeneizado el tejido se añadió Qiazol lysis reagent (Qiagen, Alemania) y cloroformo, se vorteó y se centrifugó a 4ºC a 13000 rpm. Esto permitió separar las proteínas, que se localizaban en la fase superior acuosa. La fase que contenía las proteínas se trató para aislarlas. Para ello, se sedimentó el DNA mediante etanol 100 % y se centrifugó a 2000 g a 4ºC. Posteriormente, se empleó isopropanol para precipitar las proteínas, y finalmente se añadió una solución de lavado de hidrocloruro de guanidina (0,3 M en etanol 95%). Al pellet resultante, se le añadieron 50 µl de solución de Urea (10 M) y DTT (ditiotreitol) (50 mM). La cantidad de proteínas en 59 MATERIALES Y MÉTODOS cada muestra se determinó mediante el método Bradford (Biorad, EEUU) y se mantuvieron a -80ºC hasta su utilización. 8.2. Extracción, cuantificación y procesamiento de proteínas de las CMLV Para el estudio de la expresión proteica de las CMLV, tanto del cultivo primario de arteria coronaria como de la línea celular A7r5, se procedió la extracción de las proteínas con el buffer NP40, manteniendo condiciones frías durante todo el proceso para evitar la degradación de estas. Las células sembradas en las placas se lavaron con PBS 1X y se añadieron 80 µl de un buffer que contenía buffer de lisis NP40 (Roche, Suiza) suplementado con inhibidores de proteasas, inhibidores de fosfatasa y PMSF (1 mM), y con ayuda de un scrapper se rascó la placa y se recogió la solución en un eppendorf. Las proteínas se incubaron en hielo durante 30 min, se vortearon cada 5 min, y se centrifugaron durante 30 min a 13000 rpm. De esta forma, las proteínas quedaron en el sobrenadante. Las proteínas se cuantificaron mediante BCA protein Assay (Thermo Fisher Scientific, EEUU) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y se mantuvieron a -80ºC hasta su utilización. 8.3. Western blot Para realizar el western blot, se utilizó una cantidad igual de proteína en cada muestra, entre 30-40 µg, se añadió tampón de carga Laemmli sample buffer (Sigma- Aldrich, EEUU) y se desnaturalizaron a 95ºC durante 5 min antes de realizar la electroforesis en geles de SDS-PAGE. La concentración de poliacrilamida fue del 10 % o 12,5 % dependiendo de la proteína a analizar. Una vez separadas las proteínas mediante electroforesis, se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare, EEUU) en un sistema húmedo 16 h a 30 V. Se utilizó una tinción de Rojo Ponceau (Sigma-Aldrich, EEUU) para comprobar que las proteínas se habían transferido correctamente a la membrana. A continuación, las membranas se bloquearon con un 5 % de leche en polvo no grasa disuelta en PBS 1X con 0,1 % de Tween-20 (TBS-T) y se incubaron con el anticuerpo primario específico 60 MATERIALES Y MÉTODOS tal y como se muestra en la Tabla 5, disuelto en una solución de bloqueo (BSA al 3 % en TBS-T) a 4ºC durante toda la noche. Tabla 5. Anticuerpos primarios usados para Western blot. Al día siguiente, las membranas se lavaron con TBS-T y se incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes mostrados en la Tabla 6 diluidos en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios anti-IgG están conjugados con la enzima peroxidasa de rábano (HRP, horseradish peroxidase enzyme). Tabla 6. Anticuerpos secundarios usados para Western blot. Para la detección de las diferentes bandas, se utilizó el sistema Chemidoc (Biorad, EEUU) utilizando el reactivo de quimioluminiscencia Clarity Western ECL o Clarity MaxTM Western ECL (Biorad, EEUU). La cuantificación de las imágenes se realizó mediante un análisis densitométrico de las bandas de cada anticuerpo mediante el programa Image Lab (Biorad, EEUU) utilizando αSMA o GAPDH para normalizar la señal (Tabla 5). Anticuerpo primario Dilución Referencia Mouse anti-αSMA 1:400 Sigma-Aldrich (EEUU) Rabbit anti-SARAF 1:200 Abcam (RU) Mouse anti-STIM1 1:1000 Cell signalling Mouse anti-Orai1 1:500 Novus Biologicals (EEUU) Mouse anti-Orai1 1:250 Sigma-Aldrich (EEUU) Rabbit anti-Orai3 1:500 Alomone Anticuerpo primario Dilución Referencia HRP-Goat anti-rabbit IgG 1:10000 Jackson Inmuno Research (EEUU) HRP-Goat anti-mouse IgG 1:10000 Jackson Inmuno Research (EEUU) 61 MATERIALES Y MÉTODOS 8.4. Co-inmunoprecipitación La co-inmunoprecipitación se realizó en el grupo de investigación liderado por el Dr. Juan Antonio Rosado Dionisio de la Universidad de Extremadura. Los lisados de las carótidas se inmunoprecipitaron incubando 1 µg de anti-Orai1 (Sigma-Aldrich, EEUU) en perlas de agarosa (Merck Millipore, Alemania) durante toda la noche a 4 ºC. Después del lavado, las perlas se resuspendieron en Laemmli sample buffer. Las proteínas se separaron mediante un gel SDS-PAGE al 10 % (Biorad, EEUU) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Merck Millipore, Alemania). Las membranas se bloquearon 1 h a temperatura ambiente y luego se incubaron durante toda la noche con el anticuerpo anti-Saraf diluido 1:1000 (Abcam, Reino Unido). Para la detección del anticuerpo primario, las membranas se incubaron durante 1 h con un anticuerpo HRP-Goat anti-rabbit IgG (Jackson Inmunoresearch, EEUU) a temperatura ambiente. El reactivo de detección se diluyó 1:250 en TBS-T, y se expuso a reactivos de quimioluminiscencia durante 5 min. Después del stripping, la membrana se bloqueó durante toda la noche 4ºC y se incubó con el anticuerpo anti- Orai1 (Sigma-Aldrich, EEUU) diluido 1:1000 durante 2 h a temperatura ambiente. Para detectar Orai1, las membranas se incubaron durante 1 h con un anticuerpo HRP- Goat anti-rabbit IgG (Jackson Inmunoresearch) a temperatura ambiente. 9. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE RNA El estudio de la expresión mRNA de genes se realizó tanto en muestras de arterias carótidas del modelo animal como en CMLV de arteria coronaria y de la línea A7r5. Esta medida se llevó a cabo mediante PCR cuantitativa a tiempo real con transcripción inversa (RT-qPCR). Además, se evaluó la expresión de miRNAs en el modelo animal y en los cultivos celulares transfectados con mimics. 9.1. Extracción de mRNA y microRNA Se utilizaron dos procedimientos diferentes de extracción de RNA dependiendo del tamaño de RNA de interés a aislar y estudiar. Para la extracción de RNA total en la que se obtiene tanto el mRNA como miRNAs se utilizó el Kit RNeasy mini kit 68 MATERIALES Y MÉTODOS comparativo entre los diferentes grupos de carótidas respecto a su control, comparando los diferentes grupos de carótidas usando un fold-change superior a ± 2 y un análisis de ANOVA con un p-value < 0.05. La validación de los resultados obtenidos por el array se llevó a cabo por RT- qPCR como se detalla en el apartado 9.3 de Materiales y métodos. 11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis de los datos se realizó mediante el programa GraphPad Prism (GraphPad Software, EEUU). En cada estudio, se determinó previamente el tamaño muestral necesario. En referencia a los experimentos realizados en ratas Wistar, se esperaba un incremento de la neoíntima de al menos un 15% por lo que se decidió incluir al menos 5 animales de cada experimento, teniendo en cuenta un α del 5% y una potencia estadística del 90%. Para llevar a cabo el análisis estadístico de los diversos estudios realizados, primero se evaluó la normalidad de las distribuciones de los grupos utilizando la herramienta “Normality and Lognormality test” y se procedió a la identificación y exclusión de atípicos mediante el test “Identify outlier”. En los casos en los que se pudo establecer una distribución normal, la comparación de las medias se realizó mediante test paramétricos: para realizar las comparaciones entre dos grupos se utilizó la prueba de t de Student no pareada mientras que para comparar más de dos grupos se recurrió al análisis de varianzas ANOVA. En situaciones donde los datos no siguieron una distribución normal, se aplicaron pruebas no paramétricas. Para la comparación de dos grupos, se empleó la prueba Mann-Whitney, y en el caso de varios grupos, se llevó a cabo un test Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples. 69 MATERIALES Y MÉTODOS Los resultados obtenidos se representaron como la media ± la media del error estándar de la media (SEM, Standard Error Mean) y se normalizaron al grupo control del experimento. La significancia estadística se aceptó cuando el valor de p resultó ser menor que 0,05. RESULTADOS 73 RESULTADOS 1. VALIDACIÓN DEL MODELO DE ANGIOPLASTIA CAROTÍDEA EN RATA 1.1. La lesión de la carótida por angioplastia provoca la formación de la capa neoíntima y una denudación endotelial Para estudiar in vivo la formación de la capa neoíntima en las arterias tras el daño vascular provocado por un catéter, se utilizó el modelo de angioplastia carotídea en rata descrito en el apartado de Materiales y Métodos. Se realizaron tres grupos de estudio: 1 semana (1W), 2 semanas (2W) y 3 semanas (3W) tras la realización de la angioplastia. En primer lugar, para validar el modelo animal de lesión de carótida por angioplastia se evaluó la formación de la capa neoíntima mediante una tinción de hematoxilina-eosina en secciones transversales de arterias carótidas lesionadas y se compararon con arterias controles no lesionadas. En la Figura 25, se muestran imágenes representativas de arterias controles y arterias lesionadas de 1W, 2W y 3W, tras la realización de la angioplastia. Figura 25. Evaluación de la formación de la capa neoíntima tras la angioplastia mediante tinción hematoxilina-eosina de cortes transversales de las arterias carótidas. Imágenes 74 RESULTADOS representativas de la tinción de hematoxilina-eosina de secciones transversales de arterias carótidas controles y lesionadas de 1W, 2W y 3W tras la angioplastia (n = 3). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio Olympus BX51 con objetivo 10X (primera y segunda fila) y 40X (tercera fila). Barra de escala: 100 µm. 1W: 1 semana; 2W: 2 semanas; 3W: 3 semanas. N: Neoíntima. M: Media. A: Adventicia. Barra de escala: 100 µm. En estas imágenes se observa que tras una semana de la angioplastia se forma una capa neoíntima en las arterias lesionadas formada por CMLV. Además, el grosor de la capa de neoíntima mostró un aumento progresivo a medida que transcurrieron las semanas tras la angioplastia. En segundo lugar, se analizó la denudación endotelial mediante inmunofluorescencia en secciones transversales de las arterias carótidas controles y lesionadas (Figura 26). Figura 26. Denudación endotelial de las arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia. Imágenes representativas de la inmunofluorescencia de secciones transversales de arterias carótidas controles y lesionadas de 1W, 2W y 3W tras la angioplastia (n = 3) 75 RESULTADOS incubadas con mouse anti-αSMA (verde), rabbit anti-CD31 (rojo), y DAPI (azul). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal con objetivo 10X y 20X. El zoom corresponde a un aumento de 2 veces con el objetivo 20X. Barra de escala: 100 µm. 1W: 1 semana; 2W: 2 semanas; 3W: 3 semanas. En estas secciones se marcaron las CMLV con αSMA en verde, las células endoteliales con CD31 en rojo y los núcleos se marcaron con DAPI, en azul. El marcaje con CD31 permite detectar la capa endotelial intacta en las arterias controles mientras que en las arterias dañadas 1W después de la angioplastia, el marcaje CD31 (rojo) disminuye debido a una pérdida de la capa endotelial que es inexistente en las arterias lesionadas a las 2W y 3W de la lesión. Por otro lado, también se puede observar un aumento de la señal verde a partir de 1W tras la lesión debido a la aparición de la capa neoíntima formada por las CMLV. Por lo tanto, se pudo observar una pérdida de la capa endotelial debido al daño generado por el inflado del balón del catéter y como consecuencia se induce un aumento significativo de CMLV que da lugar a la formación de la neoíntima. Para confirmar los resultados observados en las imágenes se analizó el área de la capa neoíntima, de la capa media y la suma de las áreas de la capa íntima y media que hemos denominado CIMA (Carotid Intima-Media Area). En la Figura 27A se muestra un aumento significativo del CIMA en las arterias lesionadas comparadas con las arterias controles a los distintos tiempos de estudios. Además, se observa que el CIMA de las arterias lesionadas es mayor conforme aumenta el tiempo tras angioplastia. También, observamos un aumento del CIMA significativo en las arterias lesionadas por angioplastia tras 3W frente a las arterias de las ratas tras 1W y 2W de la lesión. Al comparar la ratio entre las áreas de la capa neoíntima y la capa media de las arterias lesionadas (Figura 27B), se observa un aumento progresivo en esta ratio al aumentar el tiempo tras la lesión debido a un aumento de la neoíntima, siendo esta diferencia estadísticamente significativa entre las arterias tras 1W y 3W de la lesión. 76 RESULTADOS Figura 27. Validación de CIMA (Carotid Intima-Media Area) y ratio neoíntima/media. A. Comparación del CIMA entre las arterias control y las arterias lesionadas (n = 3). B. Comparación de la ratio Neoíntima/Media entre arterias lesionadas (n = 3). 1W: 1 semana, 2W: 2 semanas, 3W: 3 semanas. Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*), (**) y (***) indican una significancia con un p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001, respectivamente. 1.2. La contracción de la arteria carótida disminuye tras la lesión provocada por una angioplastia y la consecuente formación de la neoíntima En tercer lugar, se comprobó en los mismos grupos experimentales la capacidad de contracción de la carótida mediante ecografía con el fin de determinar el efecto funcional que provocaba la lesión en las mismas. Mediante las imágenes obtenidas por ecografía se midió la suma del grosor de la capa íntima y media o CIMT (Carotid Intima-Media Thickness) y el acortamiento o shortening de las arterias durante el ciclo cardíaco. El CIMT es una medida ecográfica que se relaciona en la clínica con la enfermedad cardiovascular y refleja el grado de arteriosclerosis vascular (Naqvi & Lee, 2014; Qu & Qu, 2015; Touboul et al., 2012). Se realizaron ecografías antes de la cirugía en las dos carótidas (PRE) para analizar el CIMT y el acortamiento basal, mostrándose que el CIMT (Figura 28A) y el acortamiento (Figura 28B) de ambas carótidas es el mismo. Tras la lesión, se observa un aumento progresivo del CIMT de las arterias lesionadas comparadas con las arterias controles, no lesionadas, a medida que transcurren las semanas, siendo el aumento mayor a la tercera semana corroborando los resultados obtenidos en el análisis histológico. Por otro lado, se analizó el acortamiento de las arterias tras la lesión observándose un menor 77 RESULTADOS acortamiento en las arterias lesionadas en comparación con las arterias controles, a los distintos tiempos de estudio (Figura 28B) demostrando que el daño por angioplastia disminuye la capacidad de contracción de las arterias carótidas. No hubo cambios ni en el CIMT (Figura 28A) ni en el acortamiento (Figura 28B) de las arterias controles no lesionadas a medida que aumenta el tiempo tras la intervención. Figura 28. Efecto de la angioplastia carotídea medida por ecografía. A. Medida de la CIMT de las dos carótidas mediante ecografía antes de las operaciones (PRE) y en las arterias controles y lesionadas tras la angioplastia a los diferentes tiempos de estudio: 1W, 2W y 3W (n = 3) B. Medida del acortamiento o shortening realizada mediante ecografía antes de las operaciones y en arterias controles y lesionadas tras la angioplastia (n = 3). 1W: 1 semana; 2W: 2 semanas; 3W: 3 semanas; PRE: antes de la cirugía. Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*) y (***) indican una significancia con un p < 0.05 y p < 0.001, respectivamente. Finalmente, se realizó una correlación entre la medida del CIMA realizada sobre los cortes histológicos y la medida del CIMT realizada sobre las imágenes de ecografía (Figura 29) obteniéndose una correlación lineal positiva con un valor de r2 muy cercano a 1 (r2 = 0.996) demostrándose que ambas técnicas proporcionan los mismos resultados y, por tanto, confirmando que se puede utilizar la técnica de imagen para caracterizar la formación de neoíntima sin necesidad de sacrificar los animales. 84 RESULTADOS 24h de la angioplastia comparadas con arterias controles medidos mediante RT-qPCR (n = 3). Valores calculados usando el método 2-ΔΔCt tras la normalización con la expresión del endógeno 18S. B. La parte superior muestra una señal representativa de las muestras de la proteína de Saraf y del endógeno αSMA de una arteria control y arterias lesionadas (1W, 2W y 3W) mediante western blot. En la parte inferior se muestra la cuantificación representada como gráfico de barras de los niveles de expresión de Saraf en las arterias controles y lesionadas (n = 3) (densidad relativa normalizada al endógeno αSMA). Los valores se representan como la media ± S.E.M. 1W: 1 semana; 2W: 2 semanas; 3W: 3 semanas. (**) y (****) indica una significancia con un p < 0.01 y p < 0.0001 respectivamente. Los resultados obtenidos demuestran que los patrones de expresión de Saraf y Orai1 en las arterias lesionadas a los distintos tiempos de estudio son similares, sugiriendo que tanto Saraf como Orai1, podrían jugar un papel importante en el desarrollo de la formación de la neoíntima. 2.3. Orai1 y Saraf interaccionan en la neoíntima de arterias carótidas lesionadas por angioplastia Los resultados anteriores demuestran que Orai1 y Saraf presentan un patrón de expresión similares, la expresión de ambas proteínas aumenta en la neoíntima de las arterias lesionadas, por lo que quisimos estudiar si existía una interacción y, por tanto, una regulación entre ambas proteínas durante la formación de la neoíntima. Para ello, en primer lugar, se llevó a cabo una inmunofluorescencia en cortes transversales de arterias carótidas controles y lesionadas donde se marcó la proteína Orai1 (verde) y Saraf (rojo). En la Figura 35 se pueden corroborar los resultados anteriores, observándose la expresión de ambas proteínas en la neoíntima de las arterias lesionadas, siendo la señal mayor en el frente del lumen. 85 RESULTADOS Figura 35. Expresión de Orai1 y Saraf en arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia. Imágenes representativas de la inmunofluorescencia de secciones transversales de arterias carótidas controles y lesionadas de 1W, 2W y 3W (n = 3) incubadas con mouse anti- Orai1 (verde), rabbit anti-Saraf (rojo) y DAPI (azul). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal con objetivo 10X y 20X. El zoom corresponde a un aumento de 2 veces con el objetivo 20X. Barra de escala: 100 µm. 1W: 1 semana; 2W: 2 semanas; 3W: 3 semanas. Se puede observar una señal en color amarillo correspondiente a la superposición de la señal roja que marca Saraf con la señal verde que marca Orai1 en las arterias lesionadas en comparación con la arteria control, demostrando que ambas proteínas se expresan en la misma zona, sugiriendo su posible interacción. De nuevo, observamos el mismo marcaje, en la 2W y 3W que es mayor en el frente del lumen, lo que sugiere que podrían jugar un papel en la proliferación de las CMLV. Para analizar esta posible colocalización, se evaluaron los patrones de fluorescencia del marcaje de Orai1 y Saraf en los mismos grupos experimentales. En 86 RESULTADOS la Figura 36, se muestra a la derecha el espectro de fluorescencia a lo largo de la línea marcada en rojo en las imágenes de la izquierda en una arteria control y en arterias lesionadas de 1W, 2W y 3W tras la angioplastia. Figura 36. Intensidad de fluorescencia de Orai1 y Saraf en arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia y en arterias controles. Las gráficas representan las intensidades de fluorescencia de Orai1 (verde) y Saraf (rojo) a lo largo de la línea marcada en rojo en las imágenes de la izquierda. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal con objetivo 10X. * señala el frente del lumen. Barra de escala: 100 µm. 1W: 1 semana; 2W: 2 semanas; 3W: 3 semanas. 87 RESULTADOS En la arteria control observamos una mayor intensidad de fluorescencia de ambas proteínas en la zona central de la túnica media, aunque la intensidad de Orai1 es mayor que la de Saraf. No obstante, las arterias lesionadas a los distintos tiempos muestran un incremento de intensidad de fluorescencia tanto para Orai1 como para Saraf, aunque al igual que en la arteria control, la intensidad de Orai1 y, por tanto, su expresión es mayor que la de Saraf. Además, en las arterias lesionadas, este patrón de fluorescencia muestra una intensidad mayor de ambas proteínas en el frente del lumen de la zona de la neoíntima, señalado en la figura como *, que coincide con la zona de mayor proliferación de CMLV como se muestra en la Figura 35. Cabe resaltar que los espectros de fluorescencia casi solapan en la neoíntima con el paso de los días después de la lesión de la carótida. Por otro lado, para confirmar la colocalización o proximidad de estas dos proteínas se realizó una técnica más específica, el Proximity Ligation Assay (PLA), detallada en el apartado de Materiales y métodos, que permite detectar proteínas que están a una distancia menor a 40 nm. En la arteria de 1W tras la lesión se observaron puntos rojos (señal de colocalización) en la zona de la neoíntima (Figura 37) siendo mayor la presencia de estos puntos en la zona frente del lumen, sin embargo, en la arteria control no se observó la presencia de esta señal de colocalización. Estos resultados apoyan la posible interacción de las proteínas Orai1 y Saraf que podrían participar en el proceso de la formación de la neoíntima en las arterias lesionadas. 88 RESULTADOS Figura 37. Proximity ligation assay de Orai1 y Saraf en arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia. Proximity ligation assay realizado en cortes transversales de arterias control y arterias lesionadas de 1W (n = 2). Los cortes se incubaron con mouse anti-Orai1 y rabbit anti-Saraf. Los puntos rojos fluorescentes indican una proximidad de < 40nm de distancia entre Orai1 y Saraf. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal con objetivo 10X, 20X y 63X y se llevó a cabo una proyección máxima de planos en el eje z de 0,4 μm. Barra de escala: 100 µm. 1W: 1 semana. Finalmente, para validar la interacción de Orai1 y Saraf, se llevó a cabo una coinmunoprecipitación en colaboración con el grupo de investigación liderado por el Dr. Juan Antonio Rosado Dionisio de la Universidad de Extremadura. Esta técnica se realizó en homogenizados de lisados de arterias controles y lesionadas de 1W. Los resultados, presentados en la Figura 38, muestran una co-inmunoprecitación en la que se ensaya la interacción de Orai1 con STIM1 como control positivo ya que diversos estudios han demostrado la interacción de ambas proteínas (Park et al., 2009; Rodríguez-Moyano et al., 2013; Stathopulos et al., 2013; Yuan et al., 2009) y de Orai1 89 RESULTADOS con Saraf. Para ello se realizó una inmunoprecipitación del lisado proteico con un anticuerpo anti-Orai1 y, posteriormente, se realizó western blot usando un anticuerpo anti-SARAF y anti-STIM1. Los resultados obtenidos demuestran un aumento de la señal de quiomioluminiscencia de Orai1 y de Saraf en las arterias lesionadas tras 1W comparadas con las arterias controles confirmando que Orai1 interacciona con Saraf en las arterias lesionadas por angioplastia. Figura 38. Saraf interacciona con Orai1 en las arterias carótidas lesionadas. Coimunoprecipitación de homogeneizados de lisados de arterias lesionadas de 1W y de arterias controles (n = 5). Los lisados de las carótidas se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti- Orai1 y se sometieron a 10% SDS-PAGE y posterior western blot con anticuerpos específicos anti-STIM1 (Blot: STIM1) y anti-SARAF (Blot: SARAF) así como con anti-Orai1 (Input: ORAI1) como control de la inmunoprecipitación. 1W: 1 semana. Por lo tanto, los resultados obtenidos mediante el estudio de los patrones de fluorescencia de Orai1 y Saraf realizadas en cortes transversales de las arterias lesionadas (1W, 2W y 3W) en comparación con las arterias controles, el ensayo de PLA de ambas proteínas en arterias controles en comparación con arteria lesionadas (1W), así como el experimento por coinmunoprecipitación demuestran la interacción de estas dos proteínas en la neoíntima formada tras una lesión vascular mediante una angioplastia. 90 RESULTADOS 2.4. La expresión de Orai3 se mantiene aumentada tras la angioplastia carotídea Por otro lado, se analizó la expresión de la proteína Orai3 tras la angioplastia ya que algunos trabajos la han relacionado con la proliferación y migración de las CMLV y la formación de la neoíntima. Se ha descrito que Orai3 podría formar un canal de Ca2+ heterométrico con Orai1 en las CMLV que es activado por leucotrieno en las arterias carótidas de rata lesionadas por una angioplastia (González-Cobos et al., 2013; W. Zhang et al., 2015). En primer lugar, se realizó una inmunofluorescencia de Orai3 (rojo) en las arterias controles y lesionadas 1W y 3W posterior a la lesión vascular. En la Figura 39 se muestra que Orai3 se expresa tanto en la arteria control como en las arterias lesionadas. En estas últimas, la expresión se observa de una manera homogénea tanto en la túnica media como en la capa neoíntima. Por lo tanto, Orai3 presenta un patrón de expresión diferente a Orai1 y Saraf. Figura 39. Expresión de Orai3 en arterias las carótidas lesionadas mediante angioplastia. Imágenes representativas de la inmunofluorescencia de secciones transversales de arterias carótidas controles y lesionadas de 1W y 3W (n = 3) incubadas con rabbit anti-Orai3 (rojo) y DAPI (azul). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal con objetivo 10X y 20X. El zoom corresponde a un aumento de 2 veces con el objetivo 20X. Barra de escala: 100 µm. 1W: 1 semana; 3W: 3 semanas. En segundo lugar, se comprobaron los niveles de expresión de mRNA de Orai3 mediante RT-qPCR en las arterias carótidas a las 24h tras la angioplastia y la expresión 91 RESULTADOS de la proteína Orai3 mediante western blot tras 1W, 2W y 3W. Los resultados muestran un aumento significativo de la expresión de Orai3 en las arterias lesionadas a las 24h (Figura 40A) de la lesión comparada con las arterias controles. Finalmente, la cuantificación de la expresión de la proteína Orai3 (Figura 40B) mostró un aumento significativo de su expresión en las arterias lesionadas tras 2W y 3W de la angioplastia en comparación con las arterias no lesionadas. Sin embargo, a pesar de que se observa un incremento de expresión de Orai3 en las arterias lesionadas tras 1W de lesión respecto a las controles, este aumento no es estadísticamente significativo. Por lo tanto, a diferencia de las otras proteínas estudiadas (Orai1 y Saraf), la expresión de Orai3 se mantiene aumentada con el progreso de la lesión. Figura 40. La lesión vascular mediante angioplastia en carótidas de rata incrementa la expresión de Orai3. A. Niveles de expresión del mRNA de Orai3 en arterias lesionadas comparadas con arterias controles medidos mediante RT-qPCR (n = 3). Valores calculados usando el método 2-ΔΔCt tras la normalización con la expresión del endógeno 18S. B. La parte superior muestra una señal representativa de las muestras de la proteína de Orai3 y del endógeno αSMA de una arteria control y arterias lesionadas (1W, 2W y 3W) mediante western blot. En la parte de inferior se muestra la cuantificación representada como gráfico de barras de los niveles de expresión de Orai3 en las arterias controles y lesionadas (n = 3-6) (densidad relativa normalizada al endógeno αSMA). Los valores se presentan como la media ± S.E.M. (*) indica una significancia con un p < 0.05. 1W: 1 semana; 2W: 2 semanas; 3W: 3 semanas. 92 RESULTADOS 2.5. La expresión de STIM1 aumenta en las arterias carótidas lesionadas por la angioplastia STIM1 es otro componente relevante de la activación de SOCE. Por ello, se comprobó la expresión de la proteína STIM1 en las arterias lesionadas (Figura 41). En este caso, se comprobó su expresión a nivel proteico mediante western blot. Pudimos comprobar que, tal y como se encuentra descrito (W. Zhang et al., 2011), se produce un aumento significativo de STIM1 en las arterias lesionadas tras 1W de la angioplastia respecto a las arterias controles. Este incremento se mantiene significativo tras 2W de la angioplastia, mientras que a las 3W su nivel de expresión es similar respecto a las arterias controles. Figura 41. La lesión vascular mediante angioplastia en carótidas de rata incrementa la expresión de STIM1. La parte superior muestra una señal representativa de las muestras de la proteína de STIM1 y del endógeno αSMA de una arteria control y arterias lesionadas (1W, 2W y 3W) mediante western blot. En la parte inferior se muestra la cuantificación representada como gráfico de barras de los niveles de expresión de STIM1 en las arterias controles y lesionadas (n = 3-4) (densidad relativa normalizada al endógeno αSMA). Los valores se presentan como la media ± S.E.M. (*) indica una significancia con un p < 0.05. 1W: 1 semana; 2W: 2 semanas; 3W: 3 semanas. 93 RESULTADOS 3. PAPEL DE ORAI1 Y SARAF EN LA PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS DE MÚSCULO LISO Se conoce que la señalización del Ca2+ intracelular regula numerosos procesos celulares básicos, incluida la proliferación. Anteriormente, hemos demostrado un aumento de expresión de proteínas implicadas en la regulación del Ca2+ intracelular a través de SOCE, Orai1 y Saraf y los resultados sugieren un posible papel de la interacción de estas dos proteínas en la proliferación de las CMLV durante la formación de la neoíntima. Para estudiar más a fondo el papel de estas dos proteínas en la proliferación, se llevaron a cabo estudios in vitro en cultivos de CMLV. Para ello, se estudió cómo afectaba el silenciamiento de Orai1 o de Saraf a la proliferación celular. Esta medida se realizó mediante una inmunofluorescencia del marcaje con bromodeoxiuridina (Brdu) que permite realizar un conteo del número de células que se han dividido en un periodo de tiempo determinado. Los estudios se llevaron a cabo tanto en cultivo primario de CMLV de coronaria como en la línea de CMLV A7r5. 3.1. Orai1 es imprescindible para la proliferación de las CMLV de cultivo primario de coronaria En primer lugar, se comprobó el silenciamiento de Orai1 y Saraf producido por la transfección con siRNAs específicos para ambos mediante la cuantificación de su expresión por RT-qPCR. En la Figura 42 se observa una disminución de la expresión a nivel de mRNA tanto de Orai1 (Figura 42A) como de Saraf (Figura 42B) demostrando que los siRNAs silencian la expresión de sus genes diana. 100 RESULTADOS provoca un aumento descontrolado de la proliferación en estas células llegando a ser casi 5 veces mayor. Figura 47. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la proliferación de CMLV de la línea celular A7r5. A. Imágenes representativas de la inmunofluorescencia para Brdu (verde) y DAPI (azul) en CMLV transfectadas con un siRNA control (siControl), con siOrai o siSaraf. B. El gráfico de barras representa el porcentaje de células BrdU positivas respecto al número de células totales (n = 3). Las imágenes fueron tomadas con objetivo de 20X. Barra de escala: 100 µm. Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*) indica una significancia con un p < 0.05. Como conclusión, podemos confirmar que Orai1 es imprescindible para la proliferación de las CMLV estimuladas tanto con IGF-1 como con suero mientras que Saraf actúa de manera diferente dependiendo del tipo de cultivo celular y de su estado de diferenciación. 101 RESULTADOS 4. ACTIVACIÓN DE SOCE POR DIFERENTES ESTÍMULOS EN LAS CÉLULAS DE MÚSCULO LISO Una vez estudiado la implicación de Orai1 y Saraf en la proliferación celular, quisimos estudiar el papel que desempeñan en la entrada de Ca2+ a través de SOCE en las CMLV, puesto que se sabe que el Ca2+ intracelular desempeña un papel vital en la regulación de este proceso. Para ello, se realizaron experimentos de movilización de Ca2+ mediante microfluorimetría con FURA-2AM. Los experimentos se realizaron tanto en cultivo primario de CMLV de coronaria como en la línea celular A7r5 de CMLV. En primer lugar, se llevaron a cabo estudios de SOCE en cultivos primarios de arteria coronaria utilizando IGF-1 como estímulo del vaciado del retículo. Tras la incubación en 0Ca2+ con IGF-1 (10 ng/ml) las células se ven sometidas a un flujo continuo con una solución que contiene 2,5 mM de Ca2+ provocando la entrada de Ca2+ desde el exterior celular lo que induce un incremento de la [Ca2+]i (Figura 48A). En las células transfectadas con siOrai1 se observa una menor entrada de Ca2+ respecto a las células control mientras que el silenciamiento de Saraf provoca un aumento de esta (Figura 48A, B), sugiriendo que posee un papel inhibidor de SOCE. Igualmente, se comprobó la implicación de SOCE en la entrada de Ca2+ añadiendo GSK al final del experimento y se observó un descenso completo tras la adición del inhibidor. La cuantificación de los resultados se muestra en la Figura 48B, normalizados a la condición control (siControl). 102 RESULTADOS Figura 48. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la entrada de Ca2+ a través de SOCE inducida por IGF-1 en el cultivo primario de CMLV de arteria coronaria. A. Registros representativos de los cambios en la concentración de Ca2+ intracelular inducidor por IGF-1 (10 ng/ml) tras la adición de Ca2+ (2,5mM). Registros expresados como la ratio de la fluorescencia (F340/F380) normalizado al basal de CMLV de arteria coronaria incubadas con FURA-2AM y transfectadas con siControl, siOrai1 o siSaraf. * Indica la perfusión con el inhibidor GSK (10 µM). B. El gráfico de barras representa la ratio F340/F380 normalizado a la condición siControl y teniendo en cuenta el leakeage de las células (n = 3-7). Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*) y (**) indica una significancia con un p < 0.05 y p < 0.01. Además, se muestran los resultados obtenidos en la medida de SOCE en la línea A7r5. En la Figura 49A, se muestra un registro representativo de los cambios de la [Ca2+]i tras la adición de Ca2+ en CMLV de la línea A7r5 transfectadas con siOrai1, siSaraf o siControl incubadas previamente durante 4 min con TG para inducir SOCE. En la gráfica podemos observar un descenso significativo de esta entrada de Ca2+ mediada por TG en las células transfectadas con siOrai1 y un aumento significativo en las células transfectadas con siSaraf respecto a las transfectadas con un siRNA control (siControl) al igual que ocurría en el experimento anterior. En el caso de las células doblemente transfectadas con siOrai1 y siSaraf, también observamos un descenso significativo de SOCE, demostrando que en ausencia de Orai1 se afecta la entrada de Ca2+ independientemente de la ausencia o presencia de Saraf, ya que es el canal a través del cual se produce esta entrada de Ca2+ (Figura 49A, B). 103 RESULTADOS Figura 49. Efecto del silenciamiento de Orai1 y de Saraf en la entrada de Ca2+ a través de SOCE inducida por tapsigargina en CMLV de la línea celular A7r5. A. Registros representativos de los cambios en la concentración de Ca2+ intracelular inducidor por TG tras la adición de Ca2+ (2,5mM). Registros expresados como la ratio de la fluorescencia (F340/F380) normalizado al basal de CMLV de la línea A7r5 incubadas con FURA-2AM y transfectadas con siControl, siOrai1, siSaraf o siOrai1+siSaraf. B. El gráfico de barras representa la ratio F340/F380 normalizado a la condición siControl y teniendo en cuenta el leakeage de las células (n = 3-4). Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*) indica una significancia con un p < 0.05. Como conclusión de estos ensayos, podemos confirmar que Orai1 es imprescindible para la entrada de Ca2+ mediada por SOCE tanto en CMLV de cultivo primario de coronaria como en la línea A7r5 estimuladas tanto con IGF-1 como con TG, mientras que Saraf parece tener un papel regulador de SOCE provocando su inhibición. 5. ESTUDIO DE SARAF COMO DIANA TERAPÉUTICA EN LA ESTENOSIS DEL MODELO ANIMAL DE ANGIOPLASTIA Los resultados anteriores demuestran que el silenciamiento de Saraf provoca cambios en la proliferación a nivel celular, por ello se quiso comprobar su implicación en el desarrollo de la neoíntima en el modelo animal de angioplastia, ya que la expresión de Saraf se encuentra aumentada en la neoíntima principalmente en el frente 104 RESULTADOS del lumen. Para ello, se silenció Saraf mediante un lentivirus shSaraf y se procedió como se explica en el apartado de Materiales y métodos. Como control de la transfección se utilizó un lentivirus shGFP. El estudio se realizó en arterias lesionadas de 1W incubadas con shSaraf o shGFP. El análisis de la formación de la neoíntima se realizó mediante una tinción de hematoxilina eosina (Figura 50A) y la medición del de la ratio neoíntima/media y del CIMA (Figura 50B y C, respectivamente). El análisis de las imágenes muestra que la ratio neoíntima/media y el CIMA son parecidos en las arterias lesionadas en las que se ha silenciado Saraf con shSaraf y en las arterias lesionadas incubadas con shGFP tras 1W de la angioplastia. Figura 50. Evaluación del efecto del silenciamiento de Saraf en la formación de neoíntima tras una angioplastia. A. Tinción hematoxilina-eosina de cortes transversales de las arterias con 1W de lesión incubadas con lentivirus shGFP o lentivirus shSaraf. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio Olympus BX51 con objetivo 10X (primera fila) y 40X (segunda fila). N: Neoíntima. M: Media. A: Adventicia. Barra de escala: 100 µm. B. Comparación de la ratio Neoíntima/Media entre las arterias lesionadas e incubadas con shSaraf en comparación con las incubadas con shGFP tras 1W de la angioplastia. C. Comparación de CIMA (Carotid Intima-Media Area) entre las arterias lesionadas e incubadas con shSaraf en comparación con las incubadas con shGFP tras 1W de la angioplastia (n = 2-3). 1W: 1 semana. 105 RESULTADOS Por otro lado, quisimos tener una primera aproximación del análisis del efecto del silenciamiento de Saraf sobre la proliferación en las arterias lesionadas en el modelo animal. Para ello, se realizó una inmunofluorescencia de Ki67 (rojo) para marcar las células que están en proliferación. En la figura 51A se muestran imágenes representativas de arterias lesionadas tras 1W de la angioplastia incubadas son shSaraf o con shGFP. Además, en estas imágenes las CMLV están marcadas con calponina (verde) y los núcleos con DAPI (azul). Tanto en las arterias lesionadas en las que se ha silenciado Saraf (shSaraf) como en las arterias lesionadas incubadas con shGFP tras 1W de la angioplastia, se muestran células con núcleos marcados en rosa (Ki67). La cuantificación se llevó a cabo mediante la medida del porcentaje de células en proliferación positivos para Ki67(núcleos rosas) respecto al número total de núcleos (DAPI) en la zona de la neoíntima (Figura 51B). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre las arterias lesionadas incubadas con shSaraf y las incubadas con shGFP como control. Figura 51. Expresión de la proliferación celular en la neoíntima mediante el marcaje de núcleos con Ki67 por inmunofluorescencia de arterias carótidas de 1W incubadas con lentivirus shSaraf en comparación con el control lentivirus shGFP. A. Imágenes representativas de la inmunofluorescencia de secciones transversales de arterias carótidas lesionadas de 1W incubadas con lentivirus shSaraf y shGFP como control. Secciones incubadas con mouse anti-ki67 (rojo), rabbit calponina (verde) y DAPI (azul). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal con objetivo 10X y 20X. El zoom corresponde a un aumento de 2 veces con el objetivo 20X. B. El gráfico de barras representa el porcentaje de células Ki67 positivas respecto al número de células totales en la neoíntima (n=2-3). Barra de escala: 100 μm. 1W: 1 semana. 106 RESULTADOS Por lo tanto, en principio, y teniendo en cuenta el bajo número de experimentos realizados, estos resultados sugieren que Saraf no estaría implicado en la formación de la neoíntima ya que su silenciamiento no modifica la CIMA, la ratio neoíntima/media ni la proliferación celular. 6. IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS MIRNAS REGULADORES DE SOCE DURANTE EL PROCESO DE REESTENOSIS VASCULAR El proceso de formación de neoíntima suele ser inducida por un cambio de expresión de genes, factores de transcripción y de miRNAs. Una vez estudiados los componentes de SOCE en el modelo animal de angioplastia carotídea y su papel en la proliferación y en la entrada de Ca2+ a través de SOCE en CMLV, quisimos estudiar la posible regulación de estos componentes por miRNAs. 6.1. La lesión de la carótida por angioplastia produce una significativa desregulación en la expresión de miRNAs Para estudiar los cambios de expresión de los miRNAs en las arterias carótidas lesionadas respecto a las arterias carótidas controles se realizó un microarray. En el estudio se incluyeron 3 arterias lesionadas de cada tiempo de estudio (1W, 2W y 3W) y 3 arterias controles a las que se les extrajeron los miRNAs con un kit específico tal como se muestra en el apartado Materiales y métodos. En el análisis del microarray se tomaron como miRNAs diferencialmente expresados en las arterias lesionadas respecto a las arterias controles de cada uno de los grupos experimentales, aquellos con un fold change de ± 2 y un p < 0.05. La Figura 52 muestra una desregulación de 1951 miRNAs en las arterias de 1W tras la lesión de los cuales 1320 presentaban una disminución de su expresión y 631 una sobreexpresión respecto a las arterias controles. En las arterias de 2W tras la lesión, el número de miRNAs desregulados descendía a 1477 de los cuales 1036 se encontraban disminuidos y 441 sobreexpresados respecto las arterias controles. Finalmente, en las arterias tras 3W de lesión, el número de miRNAs desregulados era mucho menor, 312 miRNAs, de los cuales en 224 disminuían su expresión y solo 88 miRNAs presentaban un aumento de 107 RESULTADOS su expresión. Por lo tanto, es tras 1W de la angioplastia donde se observa un mayor número de miRNAs diferencialmente expresados entre las arterias lesionadas y las controles mientras que a medida que transcurren las semanas se produce una disminución progresiva en la desregulación de miRNAs. Además, podemos destacar de este análisis que hay un mayor número miRNAs en los que se observa una disminución de su expresión que el número de miRNAs que están sobreexpresados. Figura 52. miRNAs diferencialmente expresados en las arterias carótidas lesionadas de 1W, 2W y 3W respecto a las arterias carótidas controles. Representación del número de miRNAs totales desregulados (gris), miRNAs disminuidos (rojo) y miRNAs sobreexpresados (verde) en las arterias carótidas lesionadas a diferentes tiempos (1W, 2W y 3W) respecto a las arterias carótidas controles (fold change = ± 2; p < 0.05). 1W: 1 semana, 2W: 2 semanas, 3W: 3 semanas. A continuación, utilizando el software TAC, se estudió la agrupación de la expresión de miRNAs de las arterias carótidas lesionadas de 1W, 2W y 3W, en comparación con las arterias carótidas controles mediante la representación heatmap (Figura 53 A-C), observándose que las arterias de 1W son las que muestran un mejor agrupamiento. Además, en la Figura 53 D-F el análisis de volcano plot, donde se representa el p-value respecto al fold change, de la expresión de los miRNAs de las arterias carótidas lesionadas de 1W, 2W y 3W, en comparación con las arterias controles, muestra en rojo los miRNAs que presentan una disminución de expresión, en verde los miRNAs sobreexpresados y en gris aquellos miRNAs que no presentan 108 RESULTADOS diferencias de expresión tomando como referencia un fold change de ± 2 y un p < 0.05. A través de esta representación se puede observar una disminución del número de miRNAs diferencialmente expresados al aumentar el tiempo tras la angioplastia. Figura 53 Representación de heatmap y volcano plot de la expresión de miRNAs diferencialmente expresados en las arterias lesionadas respecto a las arterias controles. Representación de heatmap (A, B y C) y del volcano plot (D, E y F) de la expresión de miRNAs diferencialmente expresados, mostrando en verde los miRNAs sobreexpresados y en rojo los disminuidos. A y D corresponden a la comparación de las arterias carótidas lesionadas de 1W respecto a las arterias carótidas controles. B y E corresponden a la comparación de las arterias carótidas lesionadas de 2W respecto a las arterias carótidas controles. C y F corresponden a la comparación de las arterias carótidas lesionadas de 3W respecto a las arterias carótidas controles. (Fold change = ± 2; p < 0.05). 6.2. Perfil de expresión de genes en arterias carótidas lesionadas por angioplastia A continuación, se realizó un array de genes de 3 arterias lesionadas de 1W y de 3W y de 3 arterias controles. Estas muestras no presentaron una buena calidad, sin embargo, se llevó a cabo su análisis y se buscaron posibles genes dianas de los miRNAs sobreexpresados. El análisis del array indica alteraciones de expresión de genes en las arterias lesionadas respecto a las arterias controles (fold change ± 2 and p < 0.05) que se encuentran representados en la Figura 54. 109 RESULTADOS Figura 54. Genes diferencialmente expresados en las arterias lesionadas de 1W y 3W respecto a las arterias controles y comparadas entre sí. Representación del número de genes totales desregulados (gris), genes disminuidos (rojo) y genes sobreexpresados (verde) en las arterias carótidas lesionadas a diferentes tiempos (1W y 3W) y respecto a las arterias carótidas controles (fold change = ± 2; p < 0.05). 1W: 1 semana, 3W: 3 semanas. Las comparaciones que se llevaron a cabo muestran un mayor número de cambio de expresión en las arterias de 1W respecto al control que en las arterias de 3W, siendo 879 el número de genes desregulados a 1W y 449 genes diferencialmente expresado en las arterias de 3W, siguiendo la tendencia de los miRNAs. Tanto en las arterias lesionadas de 1W como de 3W el número de genes disminuidos respecto a las arterias controles es mayor que el número de genes que presentaban una sobreexpresión. Por otro lado, se compararon los genes diferencialmente expresados en las arterias de 1W respecto a las de 3W mostrando un mayor número de genes alterados que en las comparativas anteriores, siendo en este caso 1243 el número de genes que presentaba diferencias en su expresión. Además, podemos observar que, al comparar estos dos grupos experimentales, 1W y 3W, el número de genes con una sobreexpresión es mayor que los genes que presentan una disminución de la expresión, al contrario que pasaba respecto a los controles. Utilizando el software TAC, se estudió la agrupación de la expresión de genes de las arterias carótidas lesionadas de 1W y 3W, en comparación con las arterias carótidas controles mediante la representación heatmap (Figura 55 A y B), observándose que 116 RESULTADOS estos miRNAs presentan un aumento de expresión significativa respecto a las arterias controles. Observamos que a las 2W los miRNAs miR-17-5p, miR-20a-5p y miR- 20b-5p se encuentran sobreexpresados, mientras que el miR-18a-5p ya no muestra una diferencia estadísticamente significativa. Tras 3W de la angioplastia, podemos observar que estos miRNAs no presentan diferencia de expresión en las arterias lesionadas respecto a las arterias controles. Figura 60. Expresión de los miRNAs 17-5p, 20a-5p, 20b-5p y 18a-5p en las arterias carótidas lesionadas mediante angioplastia analizadas por RT-qPCR respecto a 18S. Niveles de expresión de los miRNAs 17-5p, 20a-5p, 20b-5p y 18a-5p en arterias lesionadas comparadas con arterias controles medidos mediante RT-qPCR tras 24h de la angioplastia (n = 6) (A) y tras 1W, 2W y 3W (n = 3) (B) de la angioplastia. Valores calculados usando el método 2-ΔΔCt tras la normalización con la expresión del endógeno 18S. Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*), (**), (***) y (****), indica una significancia con un 117 RESULTADOS p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001 y p < 0.0001 respectivamente. 1W: 1 semana, 2W: 2 semanas, 3W: 3 semanas. 7. ESTUDIO DE LA REGULACIÓN DE PROTEÍNAS IMPLICADAS EN SOCE POR EL MIR-18A-5p Una vez validada la sobreexpresión de estos miRNAs en el modelo animal, se estudió de manera más específica la regulación de la expresión de proteínas implicadas en SOCE, Orai1, Orai3 y Saraf, en las CMLV por el miR-18a-5p que, recientemente, se ha descrito que promueve la proliferación y la migración en las CMLV (Miao et al., 2020; Y. Zhang & Chen, 2020). 7.1. Estudio del papel del miR-18a-5p sobre la expresión de Orai1, Orai3 y Saraf en CMLV Teniendo en cuenta los resultados anteriormente descritos quisimos estudiar cómo afecta la sobreexpresión del miR18a-5p a la expresión de Orai1, Orai3 y Saraf. Para llevar a cabo estos experimentos, se transfectaron CMLV de la línea celular A7r5 con mimic miR-18a-5p simulando una sobreexpresión de este miRNA. La Figura 61 confirma un aumento significativo de los niveles de expresión del miR-18a-5p en las CMLV transfectadas con el mimic miR-18a-5 respecto a las células transfectadas con un mimic Control. Figura 61. Expresión de miR-18a-5p en CMLV de la línea celular A7r5. El gráfico de barras muestra los niveles de expresión del miR-18a-5p medido mediante RT-qPCR en células transfectadas con el mimic miR-18a-5p respecto a las transfectadas con el mimic Control (n = 3). Valores calculados usando el método 2-ΔΔCt tras la normalización con la expresión del endógeno 18S. Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*) indica una significancia con un p < 0.05. Control miR-18a-5p 0 200 400 600 800 1000 Expresión miR-18a-5p (fold change) ✱ 118 RESULTADOS A continuación, se estudiaron los niveles de expresión del mRNA de Orai1, Orai3 y Saraf en las CMLV A7r5 transfectadas con mimic miR-18a-5p. Los resultados mostraron un aumento de la expresión del mRNA de Orai1 (Figura 62A) y una disminución de Orai3 (Figura 62B) en las células transfectadas con el mimic respecto a las células controles. En el caso de Saraf observamos una disminución de la expresión que no resultó ser significativa (Figura 62C). Figura 62. Expresión del mRNA de Orai1, Orai3 y Saraf en CMLV de la línea celular A7r5 transfectadas con el mimic del miR-18a-5p. El gráfico de barras muestra los niveles de expresión de mRNA de Orai1 (A), Orai3 (B) y Saraf (C) medidos mediante RT-qPCR en las células transfectadas con el mimic del miR-18a-5p respecto a las transfectadas con el mimic Control (n = 4). Valores calculados usando el método 2-ΔΔCt tras la normalización con la expresión del endógeno 18S. Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*) y (**) indica una significancia con un p < 0.05 y p < 0.01. 7.2. El miR-18a-5p incrementa la actividad del promotor de Orai1 induciendo su sobreexpresión a nivel proteico Según el análisis in silico mostrado en la Figura 57, Orai1 no es diana directa de miR-18a-5p mientras que el miR-20a-5p sí. No obstante, en el modelo animal se observó un aumento de expresión tanto de Orai1 como del miR-18a-5p, por ello se quiso confirmar la regulación positiva de Orai1 por el miR-18a-5p. Para llevar a cabo este estudio, se realizó un experimento analizando la actividad del promotor de Orai1 en las CMLV transfectadas con el mimic miR-18a-5p para lo que se utilizó un 119 RESULTADOS plásmido en el que la expresión de la enzima luciferasa estaba bajo el control de una región de 3 Kb del promotor de Orai1 (pGL3 Basic 3Kb Orai1). La Figura 63 muestra la actividad luciferasa de las células A7r5 transfectadas en cuatro condiciones diferentes: con el plásmido pGL3 Basic 3Kb Orai1 y con mimic Control, con el pGL3 Basic 3Kb Orai1 y con el mimic miR 18a-5p, con el pGL3 Basic 3Kb Orai1 y el mimic 20a-5p y con el plásmido pGL3 Basic 3Kb Orai1 y ambos mimics. Los resultados muestran un incremento significativo de la actividad luciferasa en las células transfectadas con el miR-18a-5p indicando que hay a un incremento de la actividad de la región de 3Kb del promotor de Orai1. Figura 63. Regulación de la actividad transcripcional del promotor del gen ORAI1 por el miR-18a-5p y el miR-20a-5p en CMLV. El gráfico de barras muestra los niveles de actividad luciferasa del promotor pGL3 Basic 3Kb Orai1 en CMLV de la línea celular A7r5 transfectadas con mimic miR-18a-5p y el miR-20a-5p respecto a células transfectadas con mimic Control (n = 4-7) y con ambos miRNAs a la vez (n = 2). Valores normalizados respecto a la actividad luciferasa de la Renilla. Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*) y (**) indica una significancia con un p < 0.05 y p < 0.01 respectivamente. Control miR-18a-5p miR-20a-5p miR-18a-5p + miR-20a-5p 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Actividad luciferasa relativa (u.a) ✱✱ ✱ 120 RESULTADOS Por otro lado, se ensayó la regulación del promotor de Orai1 por el miR-20a-5p, que tiene a Orai1 como diana directa (Figura 57). En este caso, se observa que las CMLV transfectadas con este mimic junto con el plásmido de la luciferasa conducido por el promotor de Orai1 presentan una disminución de la actividad luciferasa respecto al Control como consecuencia de una disminución de la actividad del promotor de Orai1 (Figura 63). En las células transfectadas con ambos mimic se observó también una disminución de la actividad luciferasa respecto al Control, aunque solo se realizaron dos experimentos con esta condición y los resultados no son significativos. Estos resultados confirman que la sobreexpresión del miR-18a-5p provoca un aumento de la expresión de mRNA de Orai1 como consecuencia de un incremento de la actividad del promotor del gen en las CMLV, mientras que la sobreexpresión de miR-20a-5p disminuye la expresión de Orai1 y la de ambos muestra una tendencia también a la disminución. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, quisimos confirmar que el incremento de expresión de Orai1 a nivel de mRNA producido por la sobreexpresión del miR-18a-5p también se observaba a nivel de proteína. Para ello, se analizó, mediante western blot, la expresión proteica de Orai1 en las CMLV tras 48h de transfección con el mimic miR-18a-5p. En la Figura 64 se observa un incremento significativo de la expresión de la proteína Orai1 en las células transfectadas con el miR-18a-5p respecto a las células controles transfectadas con un mimic Control. 121 RESULTADOS Figura 64. Expresión de la proteína Orai1 en CMLV de la línea celular A7r5 transfectadas con miR-18a-5p. La parte superior muestra una señal representativa de las muestras de la proteína de Orai1 y del αSMA mediante western blot de las CMLV de la línea A7r5 transfectadas con mimic miR 18a-5p y con mimic Control. En la parte inferior se muestra la cuantificación representada como gráfico de barras de los niveles de expresión de Orai1 (densidad relativa) en CMLV transfectadas con mimic miR-18a-5p y con mimic Control normalizados al endógeno αSMA (n = 4). Los valores se representan como la media ± S.E.M. (*) indica una significancia con un p < 0.05. Estos resultados demuestran finalmente que la sobreexpresión del miR-18a-5p produce un incremento de expresión a nivel de proteína de Orai1 como consecuencia de un incremento del nivel de mRNA debido a un aumento de la actividad del promotor. 7.3. El miR-18a-5p provoca un aumento de SOCE inducido por tapsigargina en las CMLV Una vez comprobado que el miR-18a-5p regula de manera positiva la expresión de Orai1 en las CMLV, quisimos estudiar si este aumento de expresión afectaba a la entrada de Ca2+ a través de SOCE. En la Figura 65A se muestra un registro representativo de los cambios de la [Ca2+]i tras la adición de Ca2+ en CMLV de la línea A7r5 transfectadas con mimic Control o mimic miR-18a-5p incubadas previamente durante 4 min con 2 µM TG para inducir SOCE. En la gráfica se puede observar un aumento significativo del flujo de Ca2+ en las células que tienen sobreexpresado el miR-18a-5p en comparación con las células controles. Además, se comprobó que la entrada de Ca2+ se producía a través de los canales de SOCE mediante la adición del inhibidor 10 µM GSK (señalado en la gráfica como *) a la solución de 2,5 mM de Ca2+ al final del experimento, observándose una bajada significativa de la entrada de Ca2+. La cuantificación de los resultados en la Figura 65B se realizó seleccionando las 122 RESULTADOS células de la condición mimic miR-18a-5p que respondieron con un aumento de la entrada de Ca2+ estimulada con TG mayor que en la condición control. La media de la respuesta de SOCE en la situación control fue de 0.09, teniendo en cuenta en todo momento el leakeage de las células. Los resultados muestran que 179 células transfectadas con mimic miR-18a-5p de un total de 265 (68%) analizadas presentan un incremento de Ca2+ superior a 0.09 presentando un valor medio de 0.16. Además, cabe destacar, que en las células controles 88 de 193 células totales muestran una subida superior a 0.09, de forma que un 46% de las células controles responden por encima de la media respecto a un 68% de células transfectadas con el miR-18a-5p. De esta manera podemos confirmar que el miR-18a-5p está provocando un aumento de la entrada de Ca2+ a través de Orai1 debido a que aumenta la expresión de esta proteína. Figura 65. Efecto de la sobreexpresión del miRNA miR-18a-5p mediante un mimic en la entrada de Ca2+ a través de SOCE inducida por tapsigargina en CMLV de la línea celular A7r5. A. Registros representativos de los cambios en la concentración de Ca2+ intracelular inducidos por TG tras la adición de Ca2+ (2,5 mM). Registros expresados como la ratio de la fluorescencia (F340/380) normalizado al basal de CMLV de la línea A7r5 incubadas con FURA-2AM y transfectadas con mimic Control o mimic miR-18a-5p. “*” indica el momento de adición de 10 µM GSK B. El gráfico de barras representa la ratio F340/F380 de las células de la condición mimic Control (n = 193) y de la condición mimic miR-18a-5p (n = 179), estas últimas correspondientes a las células que presentan un SOCE superior a la condición control y teniendo en cuenta el leakeage de las células. Estos experimentos se han realizado en un n = 123 RESULTADOS 4. Los valores se representan como la media ± S.E.M. (****) indica una significancia con un p < 0.0001. 7.4. El miR-18a-5p parece no tener efecto sobre la proliferación y la migración de las CMLV Como se ha comentado anteriormente, el aumento de la entrada de Ca2+ a través de SOCE se relaciona con un aumento de la proliferación celular, por lo tanto, quisimos estudiar si este proceso se veía afectado por la sobreexpresión del miR-18a- 5p. Para ello, se transfectaron células A7r5 con mimic Control y mimic miR-18a-5p. La proliferación celular se estimuló con suero (5% FBS) y se ensayó a las 48h tras la transfección. En la Figura 66A, las imágenes representativas de la inmunofluorescencia muestran el marcaje de los núcleos con Brdu (verde) y DAPI (azul). Sin embargo, no se observaron diferencias en la proliferación entre las células control y las células con el miRNA sobreexpresado. La Figura 66B muestra el gráfico de barras correspondiente a la cuantificación en el cual no observamos ninguna diferencia entre ambas condiciones. Este experimento también se ensayó en CMLV de cultivo primario de coronaria observándose los mismos resultados (datos no mostrados). Figura 66. Efecto de la sobreexpresión mediante un mimic del miRNA miR-18a-5p en la proliferación celular de las CMLV de la línea celular A7r5. A. Imágenes representativas de la inmunofluorescencia para Brdu (verde) y DAPI (azul) en CMLV transfectadas con un mimic Control o con un mimic del miR-18a-5p. B. El gráfico de barras representa el 124 RESULTADOS porcentaje de células BrdU positivas respecto al número de células totales (n = 4). Las imágenes fueron tomadas con objetivo de 20X. Barra de escala: 100 µm. Los valores se representan como la media ± S.E.M. Por otro lado, se quiso comprobar qué efecto tendría la sobreexpresión del miR- 18a-5p sobre la migración de las CMLV. Para ello, se realizó un ensayo de migración basado en el cierre de la herida o wound healing en células de la línea A7r5 transfectadas con mimic Control o mimic miR-18a-5p y estimuladas con suero (5% FBS). La “herida” se realizó a las 24h de la transfección con una pipeta de 200 µl y se hizo un seguimiento del cierre mediante la realización de imágenes con un microscopio invertido a las 0h, 12h, 24h y 32h tras haber realizado la “herida”. Sin embargo, como se puede observar en la Figura 67A, la sobreexpresión del miR-18a- 5p no mostró un aumento de la capacidad migratoria de estas células. Figura 67. Efecto de la sobreexpresión mediante un mimic del miRNA miR-18a-5p en la migración celular de las CMLV de la línea celular A7r5. A. En la figura se muestran imágenes representativas de la evolución del cierre de la herida (0h, 12h, 24h y 32h) de las CMLV transfectadas con mimic Control o mimic miR-18a-5p en condiciones de DMEM + 5% FBS. B. Gráfico de la evolución del porcentaje de cierre de la herida (n = 3) en ambos grupos respecto al área a las 0h de cada condición. Imágenes tomadas con un microscopio invertido con objetivo 10X. Barra de escala: 200 µm. Los valores se representan como la media ± S.E.M. 125 RESULTADOS La cuantificación se muestra en la Figura 67B, donde se observa como a medida que pasan las horas la “herida” se va cerrando de manera similar en ambas condiciones no mostrando una diferencia entre la condición control y las células transfectadas con el mimic. Por tanto, estos resultados demuestran que a pesar de observarse un incremento de expresión de Orai1 y un aumento de SOCE en células en las que se ha sobreexpresado el mir18a-5p, no se observa efecto funcional ni a nivel de proliferación ni de migración. 8. ESTUDIO DE OTROS GENES RELACIONADOS CON EL CLÚSTER 17-92 Del array de genes, localizamos tres genes diferencialmente expresados en las arterias lesionadas en comparación con las arterias controles, que podrían estar implicados en el proceso de reestenosis y que son dianas de los miRNAs que hemos estudiado del clúster 17-92. Se trata de trombospondina 1 (THBS1), la proteína tirosina fosfatasa tipo IVA (PTP4A) y el KIF23. De manera in silico, hemos podido detectar que el miR-17-5p y el miR-20a-5p tienen como diana a Thbs1, Kif23 y el Ptp4a mientras que el Kif23 y el Ptp4a1 además son diana del miR-20b-5p. En primer lugar, se estudió la expresión de la THBS1. En nuestro modelo hemos podido comprobar que en la primera semana tras la lesión existe un aumento significativo del mRNA de THBS1 en comparación con las arterias controles sin observarse cambios de expresión tras 2W y 3W de la angioplastia (Figura 68A). En el caso del PTP4A observamos una clara disminución de su expresión a nivel de mRNA a todos los tiempos de lesión en comparación con las arterias controles (Figura 68B). Finalmente, la Figura 68C muestra un aumento de la expresión del mRNA de KIF23 1W tras la lesión vascular, y no se observan diferencias de expresión entre las arterias lesionadas y las controles tras 2W y 3W de la angioplastia.