Poli-ADP-ribosilación de proteínas y función en procesos biológicos

FACULTAD DE BIOLOGÍA TRABAJO FIN DE GRADO BIOQUÍMICA Poli-ADP-ribosilación de proteínas y función en procesos biológicos Ronald Fabricio Borja Guachamín Dpto. de Genética Tutora: Rosa M.ª Luna Varo Curso académico: 2021/2022 ÍNDICE GLOSARIO DE ABREVIATURAS ............................................................................. 1 1. RESUMEN .................................................................................................................. 2 2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 3 2.1. ADP-ribosilación y familia ADP-ribosiltransferasas .................................... 3 2.2. Familia ARTDs ................................................................................................ 4 2.3. Elementos del proceso de PARilación ............................................................ 5 2.4. Mecanismos de regulación de la PARilación ................................................. 8 2.5. Más allá de la ADP-ribosilación de proteínas ............................................... 9 3. FUNCIONES BIOLÓGICAS ................................................................................ 10 3.1. Reparación del ADN ...................................................................................... 10 3.2. Regulación de la cromatina y la expresión génica ...................................... 13 3.3. Biogénesis del ARN y ribosomas .................................................................. 16 3.3.1. Implicación de PARP en la biogénesis de ARN ................................... 16 3.3.2. Implicación de PARP en la ribogénesis ................................................ 19 3.4. Mantenimiento de la integridad de los telómeros ....................................... 20 4. APLICACIONES TERAPÉUTICAS ................................................................... 23 4.1. Inhibidores de ARTDs ................................................................................... 23 4.2. Aplicaciones de inhibidores ARTDs en cáncer ........................................... 24 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ............................................................... 27 6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 28 Página | 1 GLOSARIO DE ABREVIATURAS ARH3: ADP-ribosil hidrolasa 3 ARTs: ADP-ribosiltransferasas ARTD: ART similares a la toxina diftérica BER: Reparación por escisión de base CAT: Dominio catalítico DSB: Rotura de cadena doble en el ADN Dominio WGR: Dominio triptófano-glicina-arginina HD: Subdominio helicoidal HR: Recombinación homóloga hTERT: Telomerasa transcriptasa inversa MAR: Mono-ADP-ribosa NAD+: Dinucleótido de nicotinamida y adenina NMN: Mononucleótido de nicotinamida NELF: Factor de elongación negativo NHEJ: Reparación por unión de extremos no homólogos PAR: Poli-ADP-ribosa PARG: PAR glicohidrolasa PARP: Poli-ADP-ribosa polimerasa PARPi: Inhibidores de PARP PBM: Dominios de unión a PAR PBZ: Motivos de dedo de Zinc de unión a PAR RBP: Proteína de unión a ARN RNAPII: ARN polimerasa II snoRNA: ARN nucleolar pequeño SSB: Rotura de cadena simple en el ADN TNKS: Tankirasas Página | 2 1. RESUMEN Las modificaciones postraduccionales son muy importantes para la regulación de las proteínas y de numerosos procesos biológicos. Entre estas modificaciones destaca la ADP-ribosilación, una modificación reversible catalizada por la superfamilia de ADP- ribosiltransferasas que emplean el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) para transferir ADP-ribosa a proteínas diana. Dentro de esta superfamilia, se encuentran las Poli-ADP-ribosa polimerasas PARP1/2 y las tankirasas TNKs1/2 capaces de desempeñar la poli-ADP-ribosilación de proteínas. Esta reacción se conoce como PARilación, la cual puede ser revertida por enzimas hidrolasas como PARG. El proceso de PARilación es un proceso complejo en el que tanto el reclutamiento de las enzimas ADP-ribosiltransferasas como su activación esta mediada por interacciones con ácidos nucleicos y otras proteínas, así como modificaciones postraduccionales incluyéndose la propia autoPARilación de estas enzimas. La PARilación es muy importante porque está implicada en diferentes procesos celulares esenciales como la reparación del ADN, la regulación de la cromatina y la expresión génica, la biogénesis del ARN y ribosomas, y en el mantenimiento de los telómeros. El número de procesos en el que interviene la PARilación es creciente y en los últimos años, como fruto de la investigación básica, las PARPs y TNKs se han convertido en objetivos terapéuticos para el tratamiento de ciertas patologías en el campo de la Biomedicina. En este trabajo se revisará el estado de conocimiento de estas enzimas, su función y regulación en el contexto de diferentes procesos biológicos, así como el empleo de inhibidores en el tratamiento de enfermedades como el cáncer. Página | 3 2. INTRODUCCIÓN 2.1. ADP-ribosilación y familia ADP-ribosiltransferasas Hace casi 60 años Chambon y sus colaboradores descubrieron la poli-ADP-ribosilación (Chambon et al., 1963). Su hallazgo permitió iniciar un nuevo campo de la ciencia, que aún hoy en día continúa siendo explorado. La ADP-ribosilación es una modificación postraduccional (PTM) reversible de proteínas que ejerce un papel importante en numerosos procesos biológicos. Consiste en la transferencia a un sustrato de una unidad de ADP-ribosa (ADPr), mono-ADP-ribosa (MAR), proceso denominado MARilación, o de varias unidades de ADP-ribosa, poli- ADP-ribosa (PAR), proceso denominado PARilación (Gupte et al., 2017) (fig.1A). Fig. 1| A) Estructura químicas de mono-ADPr y poli-ADPr. La poli-ADP-ribosa se puede elongar mediante la adición de unidades de ADP-ribosa de forma lineal o ramificada. B) Reacción de ADP-ribosilación. Se transfiere ADP-ribosa a partir de NAD+ con la liberación de Nam. Las proteínas se ven modificadas con una o varias unidades de ADP-ribosa según sean catalizadas por Mono-ARTs o Poli-ARTs, respectivamente. C) Superfamilia de ADP ribosiltransferasas (ARTs). En este esquema se excluyen la familia R-[ST] y la familia HHh. ADPr, ADP-ribosa; NAD+, dinucleótido de nicotinamida y adenina; Nam, nicotinamida; PARP, poli-ADP-ribosa polimerasa; TNKS, tankirasas. Adaptada de (Huang & Kraus, 2022; Lüscher et al., 2021). La ADP-ribosilación es catalizada por una superfamilia de proteínas llamadas ADP- ribosiltransferasas (ARTs), que transfieren ADPr del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) a un sustrato a través de enlaces N-, O- o S- glucosídicos (Lüscher et al., 2021) (fig.1B). C A B Página | 4 En cuanto a su estructura, la superfamilia ARTs contiene un subdominio específico denominado ART, dentro del cual se encuentran los aminoácidos necesarios para la catálisis y la unión de NAD+ (Cohen & Chang, 2018). Según los aminoácidos hallados en el subdominio ART pueden distinguirse tres subfamilias: HY-[EDQ], R-[ST] y HHh. Cada una de ellas comparte una estructura general compuesta por una hoja β dividida y dos regiones helicoidales (Lüscher et al., 2021). En este trabajo me centraré en la familia HY[EDQ] o también llamada ART similares a la toxina diftérica (ARTD) donde se encuentran las Poli-ADP-ribosa polimerasas (PARPs) y tankirasas (TNKs) (fig.1C). 2.2. Familia ARTDs La familia ARTDs tiene en total 17 miembros que provocan la ADP-ribosilación de proteínas como, por ejemplo, histonas, enzimas, factores de transcripción y hasta de las propias PARP (automodificación) (Malgras et al., 2021). La mayoría de los integrantes de ARTDs llevan a cabo la MARilación de proteínas, mientras que, solo cuatro componentes son capaces de realizar la PARilación (PARPs-1, -2 y TNKs-1, 2) sin necesidad de un molde durante el proceso (McGurk et al., 2019). Será en estos últimos miembros capaces de PARilar en los que se centrará la revisión (tabla 1). ARTD PARP1 (116 kDa) PARP2 (66 kDa) TNK1 (142 kDa) TNK2 (127 kDa) Actividad Poli Poli Poli/Oligo Poli/Oligo Secuencia de la tríada catalítica HYE HYE HYE HYE Macromoléculas ADP-ribosiladas Proteínas ADN Proteínas ADN Proteínas Proteínas Localización Núcleo Núcleo Núcleo Citoplasma Telómeros Aparato Golgi Núcleo Citoplasma Telómeros Aparato Golgi Tabla 1|Características principales de las ARTDs encargados de la PARilación. Secuencia HYE (His-Tyr-Glu). Modificado de Manco et al., 2022. Estos cuatro integrantes de la familia ARTDs tienen diferencias a nivel estructural. A nivel de ejemplo en la figura 2 se muestra el esquema de los dominios de la proteína PARP1. Así, comenzando por el extremo N-terminal, PARP1 consta de un motivo de unión a ADN con tres motivos de dedos de zinc (F1, F2, F3) y una señal de localización Página | 5 nuclear; tras este se encuentra un dominio de automodificación, que contiene un extremo BRCA1 C-terminal (BRCT) encargado de mediar la interacción proteína-proteína y un motivo de cremallera de leucina (LZ); seguido del cual se localiza un motivo de triptófano, glicina y arginina (WGR); finalmente, en el extremo C-terminal se encuentra el dominio catalítico (CAT) compuesto por el subdominio helicoidal (HD) y el subdominio ADP-ribosiltransferasa (ART) (Huang & Kraus, 2022; van Beek et al., 2021) (fig.2). PARP2 comparte la región C-terminal con los dominios WGR y CAT, mientras que su extremo N-terminal, en humanos, es una región intrínsecamente desordenada (van Beek et al., 2021). En relación con las tankirasas, ambas tienen dominios altamente conservados y comparten el dominio catalítico (CAT) en su extremo C-terminal. También, cerca del extremo N-terminal se localiza un domino SAM, implicado en la formación de dímeros. Y, tras este, ocupando la mayor parte de la estructura de las tankirasas, se encuentran cinco grupos de repeticiones de anquirina, implicados en las interacciones proteínaproteína. La diferencia entre ambas radica en que, TNK1 contiene una región N-terminal rica en histidina, prolina y serina (HPS) no presente en TNK2 (Yu et al., 2022). 2.3. Elementos del proceso de PARilación Dentro del proceso de PARilación puede realizarse una clasificación a nivel de funcionalidad, donde se distinguen escritores (writers), familia ARTD; lectores (readers), Fig. 2|Esquema de los dominios de PARP1. Se indican los dominios estructurales y funcionales de la proteína PARP1 humana. ART, ADP-ribosiltransferasa; BRCT, BRCA1 C-terminal; HD, subdominio helicoidal; LZ, cremallera de leucina; NLS, señal de localización nuclear; WGR, motivo de triptófano, glicina y arginina; ZN, dedo de zinc. Adaptada de (Huang & Kraus, 2022). Página | 6 proteínas con motivos de unión a PAR; y borradores (erasers), encargados de eliminar cadenas PAR (Poltronieri et al., 2021) (fig.3). Los escritores (writers) de la familia ARTD son las polienzimas PARPs (PARP1, PARP2) y las tankirasas (TNK1, TNK2) que unen covalentemente las unidades de ADP- ribosa en los sustratos mediante enlaces α(1→2) O-glucosídicos en cadenas lineales o ramificadas (fig.3). Todas ellas albergan la secuencia catalítica HYE (His-Tyr-Glu), siendo los residuos de histidina y tirosina necesarios para la orientación del NAD+, mientras que el glutamato es requerido en la actividad catalítica (Gupte et al., 2017). La principal diferencia entre las tankirasas y PARPs radica en la capacidad de poli-ADP- ribosilar. Mientras que PARP1 y PARP2 pueden sintetizar largas cadenas lineales de PAR alternadas con segmentos ramificados, las tankirasas solo modifican los sustratos añadiendo algunas unidades de ADP-ribosa, dando lugar a cadenas cortas de PAR de unas 20 unidades (Manco et al., 2022). Además, PARP1 y PARP2 son dependientes de ADN y tienen la capacidad de formar un heterodímero entre ellas capaz de llevar a cabo la ADP-ribosilación la una sobre la otra (Poltronieri et al., 2021). Por otra parte, se denominan lectores (readers) a aquellas proteínas que poseen dominios o motivos capaces de reconocer y unirse a los sustratos de ADP-ribosa. Dentro de los dominios de estos lectores se encuentran algunos altamente caracterizados como dominios de unión a PAR (PMB), dominios WWE (dominio interacción proteínaproteína), macrodominios y motivos de dedos de Zinc con unión a PARP (PBZ) (fig.3). Fig. 3|Dinámica de ADP-ribosilación. Los miembros de la familia ARTD (PARPs1/2 y TNKs1/2) actúan como escritores (writers) añadiendo unidades de ADP-ribosa a la proteína diana y formando cadenas PAR. Para ello, requieren NAD+, este es suministrado por NMNAT, es decir, ejercen el papel de alimentadores (feeders). Las cadenas PAR son reconocidas por lectores (readers) que contienen dominios de unión a PAR o dominios WWE, entre otros. La eliminación de PAR es catalizada por borradores (erasers) como PARG o ARH3. NAD+, dinucleótido de nicotinamida y adenina; NAM, nicotinamida; NMN, mononucleótido de nicotinamida. Adaptada de (Gupte et al., 2017). Página | 7 Los PMB se caracterizan por ser secuencias cortas de unos 20 aminoácidos, mientras que los macrodominios son grandes dominios globulares de entre 130 y 190 aminoácidos aproximadamente capaces de unirse a un monómero de ADP-ribosa o la parte terminal de ADP-ribosa en una cadena PAR. Los PBZ son algo mayores que los PMB, de unos 30 aminoácidos que se unen en las zonas de unión de las unidades de ADP-ribosa de las cadenas y a los monómeros. Mientras que, los dominios WWE, se unen de forma exclusiva a los oligómeros o polímeros de ADP-ribosa y contienen residuos conservados de triptófano y glutamato (Gupte et al., 2017). Estos dominios o motivos se encuentran en diferentes proteínas, por ejemplo, los macrodominios se encuentran presentes en las histonas y, los PMB son característicos de proteínas involucradas en la respuesta de daño al ADN, la remodelación de la cromatina o el procesamiento del ARN. Por su parte, el dominio WWE se localiza en las E3 ubiquitin ligasas y algunas ARTDs como PARP1 y las tankirasas. Los PBZ se encuentran en proteínas involucradas en la regulación de los puntos de control activados en respuesta al daño del ADN (Poltronieri et al., 2021). Por último, hay que destacar que existen otros dominios que también actúan como lectores, aunque son menos conocidos como los ricos en glicina y arginina (GAR), los motivos de reconocimiento de ARN (RRM) y los dominios asociados a Forkhead de unión a fosfolípidos (FHA) y BRCA1 C-terminal (BRCT) (Gupte et al., 2017). Finalmente, los borradores (erasers), son aquellas enzimas capaces de eliminar los residuos PAR de las proteínas de forma que contribuyen a la dinámica de ADP-ribosa en la célula. Entre estos borradores se incluyen enzimas hidrolasas tales como ADP-ribosil hidrolasa 3 (ARH3), PAR glicohidrolasa (PARG), ADP-ribosa glicohidrolasa terminal (TARG), Mono-ADP ribosilhidrolasa 1 (MacroD1) y Mono-ADP ribosilhidrolasa 2 (MacroD2) (fig.3). Muchas de ellas tienen una estructura característica con un pliegue que permite interaccionar con los sustratos ribosilados de ADP (Gupte et al., 2017). Sin embargo, el mecanismo por el cuál llevan a cabo el proceso de “borrado” es diferente, por ejemplo, tanto PARG como ARH3 muestra actividad hidrolítica exo- o endoglicosilasa y escinden los enlaces ribosa-ribosa dejando un ADPr terminal unido al residuo de aminoácido aceptor del sustrato. Por su parte, TARG, MacroD1 y MacroD2 son capaces de hidrolizar el enlace éster entre la ribosa y los aminoácidos aceptores, llevando a la eliminación completa de PAR (Manco et al., 2022). Tanto las PARPs como las tankirasas son dependientes de una fuente de NAD+ para poder llevar a cabo el proceso de PARilación. Es por este motivo que debe existir una Página | 14 Con el fin de que la estructura de la cromatina se remodele y se vuelva accesible, tanto para la ARN polimerasa como para los factores de transcripción, PARP1 regula las estructuras tridimensionales de la cromatina o puede actuar de forma local (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). A nivel de la estructura 3D, PARP1 actúa regulando estructuras tridimensionales de cromatina de orden superior a través de la interacción con el factor de unión a CCCTC (CTFG). La PARilación estabiliza la unión de CTFG al ADN. Además, esta interacción es recíproca y cooperativa, pudiendo ser el factor el que induzca la activación de PARP1. Como resultado la estructura de la cromatina se abre facilitando las interacciones intracromosómica y dando lugar a la formación de bucles de cromatina que aumentan la expresión de ciertos genes (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). En la regulación localizada, en respuesta a señales ambientales o del desarrollo, PARP1 se une cerca de los promotores de los genes transcripcionalmente activos. Así, PARP1 compite con la histona conectora H1 por la unión a la cromatina, promoviendo una arquitectura abierta de la cromatina e impulsando la expresión génica, suceso independiente de la actividad catalítica de PARP1. Además, PARP1 puede PARilar a la enzima lisina desmetilasa 5B (KDM5B) de forma que impide su unión a la cromatina y previene la desmetilación de las lisinas en la posición cuatro de la histona 3 (H3K4me3), ocasionando un aumento de la transcripción. O sobre la ADN metiltransferasa DNMT1, cuya PARilación inhibe su capacidad de metilar al ADN aumentando, igualmente, la transcripción (Huang & Kraus, 2022). Fig. 7|Funciones de PARP1 en la regulación de la cromatina. PARP1 puede modular la estructura y la función de la cromatina mediante la ADP-ribosilación de histonas y de sus respectivas variantes o regulando a los remodeladores de la cromatina. También, la PARilación puede estimular (flecha roja) o inhibir ciertas modificaciones postraduccionales como la fosforilación. Imagen adaptada de (Huang & Kraus, 2022). Página | 15 Las histonas como H1, así como histonas del núcleo (H2A, H2B, H3 y H4) e incluso muchas variantes histónicas son sustratos para la ADPRilación. Así, se han descubierto sitios específicos de ADPRilación en las histonas, de forma que, dependiendo del residuo en el que se lleve a cabo, la respuesta biológica cambiaría. De esta forma, durante las respuestas al daño del ADN, por ejemplo, la ADP-ribosilación ocurre de forma predominante en los residuos de serina y cuenta con el factor accesorio para la PARilación de histonas HPF1. Siendo el complejo PARP2-HPF1 responsable de la unión de nucleosomas y alineación del ADN roto para su posterior ligadura (van Beek et al., 2021). Por su parte, la histona H4 tiene la capacidad de activar a PARP1 de forma prolongada mediante su unión al dominio CAT manteniendo la cromatina en un estado laxo para que pueda acceder la maquinaria de transcripción (Thomas et al., 2019). Mientras que, en sitios en los que hay daño al ADN, PARP1 se une a variantes histónicas como macroH2A1.2, siendo capaz de reclutar a la desmetilasa KDM5A lo que resulta en la represión de la transcripción génica (Huang & Kraus, 2022). En general, los PARP nucleares regulan y reclutan a remodeladores de cromatina, complejos de represión de la transcripción en la respuesta al daño del ADN y a factores que median la reparación como NR4A (Ray Chaudhuri & Nussenzweig, 2017). Entre los remodeladores destaca ALC1. Esta enzima es reclutada y activada por PARP1, reposicionando los nucleosomas y relajando la cromatina para aumentar la accesibilidad a los factores de reparación. Igualmente, se reclutan de forma dependiente de PARP1 otros remodeladores que promueven la reparación por NHEJ, como SMARCA5 capaz de interaccionar con la ubiquitina ligasa E3 PARilada o CHD2 que desencadena la deposición de la variante histónica H3.3 en las regiones dañadas haciendo que se relaje la cromatina (Ray Chaudhuri & Nussenzweig, 2017). Por el contrario, la PARilación de los remodeladores, también puede provocar su degradación por ubiquitinación, tal es el caso de BRD7, un componente del complejo de remodelación de cromatina SWI/SNF (Huang & Kraus, 2022). Asimismo, entre los complejos de represión de transcripción reclutados por PARP1 se encuentran las proteínas del complejo de remodelación de nucleosoma y desacetilasa CHD4 y MTA1 (NuRD), así como miembros del complejo represivo Polycomb (PRC1) (Ray Chaudhuri & Nussenzweig, 2017). Por lo tanto, en los lugares de ADN dañado PARP1 puede relajar la cromatina a través del desplazamiento de los nucleosomas para, a continuación, reprimir la actividad Página | 16 transcripcional evitando la interferencia entre la maquinaria de reparación y la de transcripción (Ray Chaudhuri & Nussenzweig, 2017). 3.3. Biogénesis del ARN y ribosomas Cada vez existe más evidencia de que los eventos de PARilación mediados por PARP1 y PARP2 son reguladores claves en el proceso de síntesis de proteínas. De forma que, estas enzimas, participan activamente en la síntesis, el procesamiento y la traducción del ARN mensajero (ARNm) y, también, en el proceso de transcripción y biogénesis de ribosomas. La regulación de estos procesos puede darse por la unión directa al ARN o sus proteínas de unión, o bien, a través de la PARilación o el reconocimiento de PAR por moléculas diana. En cuanto a los dominios con los que interacciona con el ARN, parecen ser distintos para PARP1 y PARP2. En PARP1 todos los dominios están implicados en la unión, pero cobran mayor importancia el C-terminal y el dominio de Zinc 3, F3, aunque la ausencia de F3 no impide la unión al ARN. En el caso de PARP2, el dominio WGR se requiere tanto para la unión como para la activación de su actividad catalítica (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). 3.3.1. Implicación de PARP en la biogénesis de ARN Para que la transcripción tenga lugar, tanto la ARN polimerasa como los factores de transcripción deben ser capaces de acceder a las secuencias promotoras del ADN. Por lo tanto, el primer paso es la reorganización de la estructura de la cromatina, para el que la implicación de PARP se ha descrito en el apartado anterior. Una vez accesible el ADN, PARP participa como regulador directo de la maquinaria de transcripción (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). Así, PARP1 tiene la capacidad de actuar de forma similar a un factor de transcripción clásico al unirse a los promotores o, interaccionar con otros factores de transcripción actuando como coactivador o correpresor (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). Una vez iniciada la transcripción, la ARN polimerasa II (RNAPII) lleva a cabo la elongación del ARNm. En este paso, PARP1 actúa a través del factor negativo de elongación NELF. Durante la pausa de RNAPII, un punto de control para garantizar el reclutamiento adecuado de factores de empalme y alargamiento, NELF se une junto a PARP1 al pre-ARNm. Una vez unidos la fosforilación parcial del dominio C-terminal de la Pol II recluta a la región de baja complejidad del factor de elongación P-TEFb activando a la quinasa CDK9 que, a su vez, hiperfosforila el C-terminal de la polimerasa Página | 17 y fosforila a NELF-E, subdominio de NELF. Esta fosforilación es la responsable de que PARP1 se autoPARile y PARile a NELF-E, impidiendo la unión de este último factor al ARN y su función. De esta forma tanto PARP1 como NELF-E se liberan del pre-ARNm y, permiten a la RNAPII realizar la elongación de la transcripción (Eleazer & Fondufe- Mittendorf, 2021; Gibson et al., 2016) (fig.8). Durante la elongación del mensajero tienen lugar los eventos de empalme alternativo. En este procesamiento del ARNm, PARP1 se une a los nucleosomas en las regiones entre exones e intrones. Esta asociación entre la cromatina y PARP1 afecta de forma directa al empalme alternativo, mientras que, la autoPARilación de PARP1 regula indirectamente a través de la PARilación de las propias histonas o de los factores de empalme (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). Según la estructura de la cromatina, se han propuesto dos modelos no excluyentes que explican la regulación del procesamiento alternativo de exones/intrones y en los que podría actuar PARP1. El primero es el modelo cinético, en el que la estructura de la cromatina regula la velocidad de elongación de la RNAPII influyendo en el resultado del empalme (Nieto Moreno et al., 2015). En este caso, PARP1 puede modificar la estructura de la cromatina de forma que se crea una barrera a la elongación (Eleazer & Fondufe- Mittendorf, 2021). En el segundo modelo, denominado adaptador, la cromatina o sus Fig. 8|Papel de PARP1 en la elongación del ARNm. En la pausa de transcripción de RNAPII, el ARNm naciente se asocia a PARP1 y NELF-E. La fosforilación parcial del dominio C-terminal de la polimerasa activa a la región P-TEFb que, a su vez, activa a CDK9. Esta enzima hiperfosforila el C-terminal de la RNAPII y fosforila a NELF-E. La fosforilación de NELF-E actúa como señal de PARilación para PARP1, que también se autoPARila. Estas PARilaciones inhiben sus uniones al ARNm, liberándose y permitiendo la elongación de RNAPII. RNAPII, ARN polimerasa II. Modificado de (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). Página | 18 factores asociados reclutan a factores de empalme que se unen el ARNm (Nieto Moreno et al., 2015). PARP1 se une al pre-ARNm y recluta a los factores de empalme al ARN (E. Matveeva et al., 2016). Además de los factores de empalme, en el procesamiento alternativo están implicadas 3 tipos de proteínas de unión al ARN (RBP): ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP), proteínas ricas en serina (SRP) y ribonucleoproteínas heterogéneas (hnRNP). Estas proteínas y factores de empalme pueden ver su actividad alterada por PARP1 a través de interacciones covalentes proteínaproteína, por la PARilación de los propios factores de empalme o por la interacción no covalente de las RBPs a través de las cadenas PAR resultantes de la autoPARilación de PARP1 (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021; Huang & Kraus, 2022). El paso final del procesamiento de ARNm maduro es la escisión endonucleolítica y la síntesis de la cola poli (A). En este proceso de poliadenilación PARP1 es capaz de PARilar a las enzimas poli(A)polimerasas provocando su disociación del ARNm y consiguiendo que se vea afectada tanto al transporte como la estabilidad del ARN mensajero (di Giammartino et al., 2013). A nivel de estabilidad del ARNm varios estudios relacionaron a los knockdown de PARP1, con una reducción significativa de la vida media del ARNm diana de la enzima. También en estas células con nivel reducido de PARP1 se observó un incremento de la transcripción de genes implicados en la vía NMD (Nosense-mediated mRNA decay), que se encarga de eliminar el ARNm con codones de terminación tempranos. Por lo tanto, es probable que PARP1 esté involucrada en la vía NMD (E. A. Matveeva, Mathbout, et al., 2019). Asimismo, la PARilación de HuR, una proteína de unión a AREs (elementos ricos en adenilato y uridilato que se encuentran dentro de la región 3’UTR de los ARNm) aumenta la estabilidad del ARNm. Sin embargo, todos estos mecanismos por los cuales PARP1 media la estabilidad del mensajero son aún desconocidos (Ke et al., 2017). Por último, para que tenga lugar la expresión de los genes eucariotas, se necesita que el ARNm, así como algunas moléculas de ARN no codificante se transporten desde el núcleo hasta el citoplasma donde tendrá lugar la traducción en los ribosomas. En la exportación el ARNm se transporta formando complejos con proteínas de unión a ARN y proteínas receptoras capaces de interaccionar con los poros nucleares. De tal forma que, PARP1 media este proceso bien a través de la interacción con los receptores o con los complejos. Un ejemplo es la PARilación de ciertas subunidades del complejo Página | 19 THO/TREX, implicado en la transcripción y transporte del ARNm, la cual estimula las interacciones entre las subunidades (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). 3.3.2. Implicación de PARP en la ribogénesis Tanto PARP1 y PARP2 están altamente involucradas en la regulación de la transcripción del ARNr, el procesamiento del pre-ARNr y en la formación de ribosomas. Este proceso de biogénesis de ribosomas y síntesis de ARNr tiene lugar en el nucléolo y es de vital importancia para la traducción adecuada de las proteínas. PARP1 tiene la capacidad de interaccionar con dos tipos de ARN nucleolares: ARN asociado a los promotores y ARN nucleolar pequeño (snoRNA) mediando la PARilación en la transcripción del ARNr (Huang & Kraus, 2022). Como ejemplo a estas interacciones se encuentra la PARilación de TIP5, un componente del complejo de remodelación nucleolar, que se produce a través de ARN asociados al promotor y promueve el silenciamiento de la cromatina del ARNr en la replicación (Huang & Kraus, 2022). Mientras que, en la PARilación de DDX21, una helicasa de ARN, la activación de PARP1 está mediada por snoRNA. En este caso, DDX21 PARilada se localiza en el nucléolo, potenciando la transcripción del ARNr, aumentando el ensamblaje de los ribosomas y la síntesis de proteínas. En el cáncer de Fig. 9|A) PARilación de DDX21 mediada por snoRNA. B) Tinción inmunohistoquímica de PARP1 y DDX21en muestras de tejido mamario canceroso de pacientes con PARP-1 alta y baja. C) Cuantificación nucleolar de DDX21 en muestras de cáncer de mama con PARP-1 baja (a) y alta (b). Barras de escala 50µm. Las cajas de C son estadísticamente diferentes (p < 0.05, prueba t-student de dos colas). Modificado de (Kim et al., 2019). Página | 20 mama, un alto nivel de PARP1 provoca la localización nucleolar de DDX21 que conlleva un aumento de la proliferación celular y el crecimiento tumoral (Kim et al., 2019) (fig.9). En ausencia de estrés, sobre un 40% de PARP1 se encuentra en el nucléolo, esto es debido a que PARP1 contiene una señal de localización nucleolar en su extremo N- terminal. Y, no sólo su ubicación en el nucléolo es importante sino también su capacidad para localizar a otras proteínas nucleolares implicadas en la biogénesis ribosomal. Como muestra de ello, PARP1 y PARP2 activas relocalizan a la ADP-ribosa hidrolasa TARG1 al nucleoplasma mediante PARilación en respuesta al daño en el ADN. Mientras que, en ausencia de daño, la hidrolasa TARG1 se localiza principalmente en el nucléolo controlando la transcripción del ARNr (Huang & Kraus, 2022; Kim et al., 2020). Además, la PARilación también podría interrumpir el ensamblaje de los ribosomas interfiriendo con la interacción entre el ARNr y las proteínas ribosómicas. Encontrándose que algunas subunidades ribosómicas ribosiladas darían lugar a una unión debilitada y a la interrupción del ensamblaje. Del mismo modo, las propias proteínas ribosómicas PARiladas también podrían ser causantes de defectos en la traducción proteica (Eleazer & Fondufe-Mittendorf, 2021). 3.4. Mantenimiento de la integridad de los telómeros Los telómeros son complejos de nucleoproteínas necesarios para la conservación de la estabilidad genómica, ya que se encargan de proteger los extremos de los cromosomas. Su pérdida ocasionaría múltiples enfermedades humanas. Entre los factores que tienen un papel en la preservación de la integridad de los telómeros se encuentran las ADP- ribosiltransferasas, sobre todo las TNKs1/2, aunque recientemente, hay estudios que indican que tanto PARP1 como PARP2, también, tendrían una función en la protección de los telómeros (Muoio et al., 2022). Los telómeros están formados por ADN telomérico compuesto por repeticiones de TTAGGG, cuya hebra rica en G acaba en un saliente monocatenario 3’ que se pliega hacia atrás uniéndose con la hebra C del ADN de doble cadena aguas arriba. Por consiguiente, se forma un bucle D que dará lugar a una estructura de orden superior llamada bucle T. Otra peculiaridad de los telómeros es su vinculación con Shelterina, un complejo proteico de 6 subunidades (TRF1, TRF2, POT1, TIN2, TPP1 y RAP1), que protege al telómero de reparaciones de ADN no solicitadas, y también contribuye al mantenimiento de su estructura. Por último, se encuentra la telomerasa, una Página | 21 ribonucleoproteína que mantiene la longitud de los telómeros al incorporar repeticiones de TTAGGG. La cual se encuentra compuesta por una transcriptasa inversa de telomerasa (hTERT) y un componente de ARN (hTERC), además de otros factores proteicos (Muoio et al., 2022). Las TNKs intervienen en la conservación de los telómeros mediante tres maneras: regulando la telomerasa, resolviendo la cohesión de los telómeros, reparando el ADN telomérico (Azarm & Smith, 2020). Las TNKs participan en la regulación de la telomerasa mediante la PARilación de TRF1, una subunidad de Shelterina, regula la telomerasa por medio del control de su acceso al ADN telomérico. La PARilación de TRF1 provoca su liberación del ADN y, como consecuencia, que la telomerasa pueda ingresar a los telómeros y alargarlos. Esta acción puede verse interrumpida por la subunidad TIN2 que impide la PARilación de TRF1, aunque aún no se comprende qué circunstancias desencadenan este acontecimiento (fig.10A). En definitiva, la sobreexpresión de las TNKs ocasiona el alargamiento de los telómeros en tanto que su inhibición o mutación provoca el acortamiento (Azarm & Smith, 2020; Muoio et al., 2022) (fig.10B). Fig. 10| Vías de regulación de la telomerasa y análisis de líneas celulares knockout de TNKs humanas generadas por CRISPR-Cas9. A) Actividad de TNKs sobre TRF1 y de PARP1 sobre TERT. La PARilación de TRF1 por TNKs provoca su desplazamiento del ADN para que la telomerasa acceda a los telómeros. Además, TIN2 regula negativamente a TNK1. Por otro lado, PARP1 podría PARilar a TERT para que la telomerasa pueda unirse al ADN. B) Análisis de la longitud de telómeros de células knockout de TNKs (DKO). Análisis Southern blot con sondas específicas para telómeros de células WT y DKO a un tiempo temprano (E) y a un tiempo tardío (T). Se observa un acortamiento de los telómeros en células DKO. C) Regulación de la expresión del gen de la telomerasa por PARP1. PARP1 podría controlar la expresión del gen hTERT al interactuar con el factor KLF4. La PARilación afecta a la interacción PARP1/KLF4 y disminuye la expresión de hTERT. DKO, doble knockout de TNKs1/2; DP, duplicaciones de población. Imagen adaptada de (Bhardwaj et al., 2017; Muoio et al., 2022). Página | 22 Existen ciertas incertidumbres en cuanto al papel que tiene PARP1 en la regulación de la telomerasa. Un posible mecanismo sería que PARP1 ejerce su actividad sobre hTERT permitiendo que se reclute la telomerasa al ADN telomérico (fig.10A), otro mecanismo sería la interacción de PARP1 con factores de transcripción como KLF4, de tal manera que actúa en el control de la expresión del gen hTERT (Muoio et al., 2022) (fig.10C). Por último, también hay evidencias de que PARP1 puede regular el ensamblaje de la telomerasa (Savelyev et al., 2021). Las TNKs, también, intervienen en la resolución de la cohesión de los telómeros. En knockdown de TNKs se observa que las cromátidas hermanas presentan separación en los centrómeros y en los brazos cromosómicos, pero no se ven separadas en los telómeros, indicando que las TNKs tienen un papel en la resolución de los telómeros. (Eisemann & Pascal, 2020). Al contrario que en la regulación de la telomerasa, TNK1 y TNK2 no tienen funciones superpuestas, ya que las células knockout de TNK1 y TNK2 muestran el mismo fenotipo, es decir, una cohesión persistente de los telómeros. Es más, el doble knockout muestra un fenotipo más acusado que los knockout individuales (Bhardwaj et al., 2017). Además, una mutación, generada por CRIPSR, en el sitio de unión a TNK de TRF1 permitió ver que se necesita esta subunidad para reclutar a TNK en los telómeros y, así, hacer la resolución (Azarm & Smith, 2020). Finalmente, las TNKs ayudan a mantener la integridad del genoma mediante la reparación del ADN telomérico. Al no ser enzimas dependientes de ADN, no se activan directamente por el daño causado a este, sino que actúan indirectamente en la reparación mediante sus socios de unión como MDC1 (fomenta la reparación de DSB por HR), MERIT40 (también participa en las respuestas a DSB) o la proteína telomérica TRF1 (Azarm & Smith, 2020; Eisemann & Pascal, 2020). Este último es fundamental para la intervención de las TNKs en los telómeros, ya que la interacción TNKs-TRF1 resulta clave para el reclutamiento de proteínas de reparación como XRCC1 y Polβ involucradas en las rutas de reparación de SSB y BER (Muoio et al., 2022). De igual importancia, con relación a la replicación de los telómeros, estos están sujetos al estrés de replicación ocasionando que las repeticiones teloméricas formen estructuras G4 que pueden ser un obstáculo para la replicación y contribuir a la inestabilidad genética. Se ha visto que la PARilación por PARP1 de ciertas helicasas favorecería la resolución de estas estructuras, evitando problemas en el avance de la replicación (Muoio et al., 2022). Página | 23 4. APLICACIONES TERAPÉUTICAS 4.1. Inhibidores de ARTDs Los inhibidores de ARTDs son sustancias que interfieren con las funciones de las enzimas encargadas de la PARilación. En concreto, inhibidores de PARP1 y PARP2 han sido ampliamente estudiados a nivel clínico. La mayoría de los inhibidores desarrollados hasta la fecha carecen de especificidad por cada una de las PARPs, pudiendo un mismo inhibidor contrarrestar la actividad tanto de PARP1 como de PARP2 y, con alta probabilidad la de otras PARPs (Lüscher et al., 2021). Este efecto pleiotrópico puede tener consecuencias no deseadas por lo que debería buscarse una mayor especificidad en los inhibidores. En cuanto al mecanismo de acción de los inhibidores, la mayoría interfiere con el bolsillo de unión a NAD+, de ahí la inespecificidad de la inhibición (Gupte et al., 2017). Aunque parece que dependiendo del inhibidor se muestran mayor selectividad para algunas ARTDs como olaparib, que tiene alta potencia, pero es menos selectivo para PARP1 y PARP2 (Thorsell et al., 2017). Actualmente, los inhibidores aprobados son aquellos específicos para el tratamiento del cáncer en el que hay defectos en la reparación del daño al ADN por recombinación homóloga, como es el caso de los tumores con mutaciones en los supresores tumorales BRCA1 o BRCA2 (Lüscher et al., 2021). Nombre Descripción Referencia Olaparib Es muy eficaz en pacientes con cáncer de mama con mutación BRCA de línea germinal. (Robson et al., 2017) Rucaparib Puede ser empleado en pacientes con cáncer de ovario con mutación en BRCA. (Shirley, 2019) XAV939 Puede ser usado en el carcinoma hepatocelular. (W. Wang et al., 2021) G007-LK Puede ser aplicado en el cáncer colorrectal. (Solberg et al., 2018) Tabla 3|Inhibidores de PARP/TNKS y sus usos clínicos. Sin embargo, es más reciente la investigación de los inhibidores de las tankirasas, que están arrojando datos prometedores de cara a su empleo en terapia contra el cáncer. Los inhibidores que se están probando actualmente son moléculas pequeñas que, en su mayoría, compiten con el NAD+ por el dominio catalítico de las TNKs. Este sitio de unión se compone de un subsitio de unión a nicotinamida y otro de unión a adenosina. Por lo Página | 30 Shirley, M. (2019). Rucaparib: A Review in Ovarian Cancer. Targeted Oncology, 14(2), 237–246. https://doi.org/10.1007/s11523- 019-00629-5 Solberg, N. T., Waaler, J., Lund, K., Mygland, L., Olsen, P. A., & Krauss, S. (2018). TANKYRASE inhibition enhances the antiproliferative effect of PI3K and EGFR inhibition, mutually affecting β-CATENIN and AKT signaling in colorectal cancer. Molecular Cancer Research, 16(3), 543–553. https://doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-17-0362 Thomas, C., Ji, Y., Wu, C., Datz, H., Boyle, C., MacLeod, B., Patel, S., Ampofo, M., Currie, M., Harbin, J., Pechenkina, K., Lodhi, N., Johnson, S. J., & Tulin, A. v. (2019). Hit and run versus long-term activation of PARP-1 by its different domains finetunes nuclear processes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(20), 9941– 9946. https://doi.org/10.1073/pnas.1901183116 Thorsell, A. G., Ekblad, T., Karlberg, T., Löw, M., Pinto, A. F., Trésaugues, L., Moche, M., Cohen, M. S., & Schüler, H. (2017). Structural Basis for Potency and Promiscuity in Poly(ADP-ribose) Polymerase (PARP) and Tankyrase Inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry, 60(4), 1262–1271. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6b00990 van Beek, L., McClay, É., Patel, S., Schimpl, M., Spagnolo, L., & Maia de Oliveira, T. (2021). 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