Selenio y selenoproteinas frente al daño cardiovascular provocado por el "Binge Drinking".

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA PROGRAMA DE DOCTORADO DE BIOLOGÍA MOLECULAR, BIOMEDICINA E INVESTIGACIÓN CLÍNICA TESIS DOCTORAL SELENIO Y SELENOPROTEÍNAS FRENTE EL DAÑO CARDIOVASCULAR PROVOCADO POR EL “BINGE DRINKING” Paula Sobrino Calero Directoras: Dra. Mª Luisa Ojeda Murillo Dra. Olimpia Carreras Sánchez Sevilla, 2018 Dra. Dña. Mª Luisa Ojeda Murillo, Profesora Titular de Fisiología de la Universidad de Sevilla y Dra. Dña. Olimpia Carreras Sánchez, Catedrática de Fisiología de la Universidad de Sevilla, INFORMAN: que la Tesis Doctoral con el título: “SELENIO Y SELENOPROTEÍNAS FRENTE EL DAÑO CARDIOVASCULAR PROVOCADO POR EL “BINGE DRINKING”, presentada por la Gda. Paula Sobrino Calero, para optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Fisiología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, reuniendo los requisitos exigidos. Y para que así conste, en el cumplimiento de las disposiciones vigentes, extendemos el presente informe, en Sevilla a 6 de Julio de 2018. Prof. Dra. Prof. Dra. Dña. Mª Luisa Ojeda Murillo Dña. Olimpia Carreras Sánchez Doctorando Dña. Paula Sobrino Calero AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Hasta la actualidad parte de la memoria de esta Tesis Doctoral ha dado lugar a las siguientes publicaciones en Revistas Cientificas indexadas en el JCR. - Sobrino P, Ojeda ML, Nogales F, Murillo ML, Carreras O. Binge drinking affects kidney function, hydric balance, aldosterone levels and arterial pressure in adolescent rats: selenium as a possible hypotensor by improving oxidative balance. Toxicology and Applied Pharmacology. 2018. In press - Ojeda ML, Carreras O, Sobrino P, Murillo ML, Nogales F. Biological implications of selenium in adolescent rat exposed to binge drinking: Oxidative, immunologic and apoptotic balance. Toxicology and Applied Pharmacology. 2017b; 329: 165-172. - Serrano A, Nogales F, Sobrino P, Murillo ML, Carreras O, Ojeda ML. Heart selenoproteins status of metabolic syndrome-exposed pups: A potential target for attenuating cardiac damage. Mol. Nutr. Food Res. 2016, 60, 2633– 2641. Además, durante la realización de esta memoria de Tesis Doctoral han sido enviadas varias comunicaciones a congresos nacionales e internacionales en forma de poster y publicados sus abstracts. - Sobrino P, Ojeda ML, Murillo ML, Carreras O, Nogales F. Estado del selenio en la resistencia a la insulina y la programación metabólica. XII Congreso Sociedad Española de Nutricion Comunitaria (SENC). NUTRIMAD, Madrid 2018. - Sobrino P, Nogales F, Murillo ML, Ojeda ML, Carreras O. Selenio, ingesta y aprovechamiento energético durante la programación temprana. Un arma de doble filo. XII Congreso Sociedad Española de Nutricion Comunitaria (SENC). NUTRIMAD, Madrid 2018. - Ortiz-Rendón O, Sobrino P, Nogales F, Murillo ML, Carreras O, Ojeda ML. Binge drinking affects hydric balance and aldosterone levels increasing systolic blood pressure in adolescent rats. XXXIX Congreso de la Sociedad Española Ciencias Fisiologicas (SECF). Cádiz 2018. - Sobrino P, Serrano A, Ojeda ML, Nogales F, Carreras O. “Binge drinking” affects the amount of selenium biologically active in the tissues. Índice Paula Sobrino Calero 4.5.1.7. Peroxidación lipídica ................................................................. 82 4.5.1.8. Oxidación de proteínas .............................................................. 83 4.5.2. Análisis de la expresión de proteínas cardiacas y renales ............. 85 4.5.2.1. Homogenización tisular para wester blotting ............................ 85 4.5.2.2. Características generales de los anticuerpos ............................ 86 4.5.2.3. Electroforesis en gel de poliacrilamida con sds: sds-page ......... 87 4.5.2.4. Transferencia de proteínas ....................................................... 89 4.5.2.5. Inmunodetección ....................................................................... 90 4.5.2.6. Revelado .................................................................................... 91 4.6. Determinación de parámetros en suero y orina ...................................... 92 4.6.1. Determinaciones bioquímicas ........................................................ 92 4.6.1.1. Perfil bioquímico ........................................................................ 92 4.6.1.2. Parámetros relacionados con la función renal ........................... 93 4.6.2. Determinación de los niveles de aldosterona ................................. 93 4.7. Determinación de la frecuencia cardiaca y presión arterial ..................... 94 4.8. Marcadores de la función renal .............................................................. 95 4.8.1. Cálculo de la función renal ............................................................. 95 4.8.1.1. Aclaramientos .......................................................................... 95 4.8.1.2. Excreción fraccional de sodio ................................................... 95 4.8.1.3. Gradiente transtubular de potasio ............................................. 96 4.8.1.4. Osmolaridad .............................................................................. 96 4.9. Determinación de los marcadores vasculares ........................................ 96 4.10. Análisis estadístico ............................................................................... 97 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 101 Índice Paula Sobrino Calero 5.1. Control nutricional, morfológico y metabólico ........................................ 101 5.1.1. Control nutricional y morfológico .................................................. 101 5.1.2. Parámetros bioquímicos ............................................................... 103 5.2. Homeostasis de se ................................................................................ 106 5.3. Estudios en corazón .............................................................................. 108 5.3.1. Balance oxidativo .......................................................................... 108 5.3.2. Expresión de las enzimas antioxidantes GPx-1, GPx-3, GPx-4 y Sel P en el corazón ....................................................................... 111 5.3.3. Expresión de NF-κB p65 y caspasa 3 activada en el corazón ....... 114 5.3.4. Funcionalidad cardíaca ................................................................ 116 5.4. Estudios vasculares ............................................................................. 119 5.4.1. Balance oxidativo en suero .......................................................... 120 5.4.2. Marcadores vasculares ................................................................ 121 5.5. Estudios en el riñón .............................................................................. 124 5.5.1. Balance oxidativo .......................................................................... 124 5.5.2. Expresión de las enzimas antioxidantes GPx1, GPx3, GPx4 y Sel P en el riñón ............................................................................ 127 5.5.3. Expresión de NF-κB p65 y caspasa-3 activada en el riñón .......... 130 5.5.4. Valoración de la función renal ...................................................... 133 6. CONCLUSIONES ..................................................................................... 145 7. BIBLIOGRAFÍA......................................................................................... 151 Índice Paula Sobrino Calero ABREVIATURAS Abreviaturas Paula Sobrino Calero III ABREVIATURAS UTILIZADAS ACTH: Hormona adrenocorticotropa Ad: Adrenalina ADH: Alcohol deshidrogenasa ADH: Hormona antidiurética AG: Ácidos grasos. ALDH: Aldehído deshidrogenasa Aldo: Aldosterona ALT: Alanina transaminasa AMPĸ: Proteína quinasa adenosina monofosfato Ang I: Angiotensina I Ang II: Angiotensina AST: Aspartato transaminasa BD: “Binge drinking” C.D.A: Absorción aparente de Se CARD: Dominio de reclutamiento asociado a caspasas CAT: Catalasa CRH: Corticotropina CYP2E1: Citocromo P450 2E1 DD: Dominio de muerte DED: Dominio efector de muerte DIO: Deionidasas ECA: Enzima convertidora de angiotensina EEFA sintetasa: Ácido graso etil ester sintetasa EEFA: Ésteres etílicos de los ácidos grasos EFNa: Excreción fraccional de sodio eNOS: Óxido nítrico sintetasa EO: Estrés oxidativo ERO: Especie reactiva de oxigeno FASD: Trastornos del espectro alcohólico fetal FC: Frecuencia cardíaca GC: Grupos carbonilos GPx: Glutatión peroxidasa GR: Glutatión reductasa GSH: Glutatión GSSG: Glutatión oxidado GTTK: Grandiente transtubular de K+ HDL: Lipoproteínas plasmáticas de alta densidad HHA: Eje hipotalámico-hipofisario- adrenal Abreviaturas Paula Sobrino Calero IV HTA: Hipertensión IL-6: Interleukina 6 IRS-1: Sustrato de receptor de insulina K+: Potasio LDL: Lipoproteínas plasmáticas de baja densidad MDA: Malondialdehído Na+: Sodio Nad: Noradrenalina NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido NADPH: Nicotinamín adenín dinucleótido fosfato reducido NF-κB: Factor nuclear kappa B NO: Óxido nítrico PAD: Presión arterial diastólica PAM: Presión arterial media PAS: Presión arterial sistólica PPARα: Receptor de peroxisoma proliferador activado α PPARγ: Receptor activado por proliferador de peroxisomas γ PTEN: Fosfatidilinositol-3,4,5- trisfosfato 3-fosfatasa PTP1B: Proteína tirosina fosfatasa 1B RI: Resistencia a la insulina RL: Radicales libres Se: Selenio Sel P: Selenoproteína P SIRTs: Sirtuinas SMOE: Sistema microsomal oxidativo del etanol SNA: Sistema nervioso autónomo SNS: Sistema nervioso simpático SOD: Superóxido dismutasa SRAA: Sistema renina angiotensina aldosterona STAT3: Transductor de señal y activador de la transcripción 3 TBARS: Ácido tiobarbitúrico TFG: Tasa de filtración glomerular TNF-α: Factor de necrosis tumoral α tPAI-1: Inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 TrxR: Tioredoxinas reductasas UBE: Unidades de bebida estándar VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular LISTA DE FIGURAS Lista de Figuras Paula Sobrino Calero VII LISTA DE FIGURAS Figura 2.1.3. Esquema del metabolismo del etanol ....................................................... Figura 2.1.4. Esquema comparativo de las tres vías oxidativas de metabolización en el hígado, corazón y riñón ................................................................................................. Figura 2.2.1. Manifestaciones clínicas y mecanismos fisiopatológicos que se presentan en el sistema cardiovascular según el patrón de consumo de alcohol ........... Figura 2.2.2. Esquema de las cuatro enzimas antioxidantes endógenas ...................... Figura 2.2.2.1. Esquema de los mecanismos implicados en la génesis de la hipertensión tras el consumo agudo de alcohol ............................................................. Figura 2.2.3. Esquema de los efectos nocivos que provoca el consumo agudo de alcohol tipo “binge drinking” sobre sistema cardiovascular y renal ................................. Figura 2.2.3.1. Esquema de los efectos nocivos que provocan el consumo agudo de alcohol tipo “binge drinking” sobre el corazón. ............................................................... Figura 2.2.3.1.3.1. Vías extrínseca e intrínseca de la apoptosis ................................... Figura 2.2.3.1.3.2. Esquema de la apoptosis en cardiomiocitos .................................... Figura 2.2.3.2. Esquema de los efectos nocivos que provocan el consumo agudo de alcohol tipo “binge drinking” a nivel vascular .................................................................. Figura 2.2.3.3. Esquema de los efectos nocivos que provocan el consumo agudo de alcohol tipo “binge drinking” a nivel renal ....................................................................... Figura 2.3.2.1. Esquema de las principales selenoproteínas cardiacas ......................... Figura 2.3.2.2. Mecanismos del Se para prevenir la aterosclerosis .............................. Figura 2.3.3. Distribución de Se tisular y en suero en madres lactantes, crías recién nacidas y crías lactantes expuestas a un consumo crónico de alcohol y el efecto de la suplementación con Se .................................................................................................. Figura 4.1.1. Esquema del diseño experimental ............................................................ Figura 4.5.2.6. Resumen de la técnica de Western Blotting .......................................... Figura 5.3.1.1. Actividad de las enzimas antioxidantes SOD (A), CAT (B), GPx (C), GR (D) y niveles de GC (E) y MDA (F) ........................................................................... Lista de Tablas Paula Sobrino Calero XIV RESUMEN Resumen Paula Sobrino Calero 1 1. RESUMEN Actualmente, el consumo de alcohol en forma de “binge drinking” en los adolescentes es un problema social puesto que la adolescencia constituye una etapa de desarrollo muy vulnerable. Además, este patrón de consumo de alcohol produce estrés oxidativo debido a que su metabolismo oxidativo genera grandes cantidades de especies reactivas de oxigeno, comprometiendo a las enzimas antioxidantes endógenas. Este consumo agudo de alcohol afecta a la funcionalidad del sistema cardiovascular ya que existe una relación directa entre el BD y la aparición de arritmias e hipertensión, aunque los mecanismos que desencadenan estas patologías aún no se conocen con exactitud. Entre los mecanismos que cobran más peso están el estrés oxidativo generado y las alteraciones renales. El selenio, un elemento esencial para la vida, disminuye sus niveles tras el “binge drinking” comprometiendo la actividad antioxidante puesto que actúa fisiológicamente a través de diferentes selenoproteínas con función antioxidantes como la glutatión peroxidasa (GPx-1, GPx-3 y GPx-4) y la selenoproteína P. Para analizar la implicación del BD sobre el sistema cardiovascular y renal y la efectividad de la terapia de suplementación con Se, tras el consumo agudo de alcohol en adolescentes, se analizaron los depósitos tisulares y séricos de Se, asi como su absorción aparente y retención, y los parámetros metabólicos. También se midió la actividad antioxidante sérica, cardíaca y renal a través de las enzimas antioxidantes endógenas (CAT, SOD, GPx y GR) así como, la oxidación de lípidos y proteínas y, la expresión de GPx-1, GPx-3, GPx-4 y Sel P. Con el fin de valorar la funcionalidad de los órganos valorados, corazón y riñón, se ha determinado el balance inflamatorio y apoptótico mediante la expresión de NF-κB y caspasa-3, distintos marcadores vasculares y se ha medido la presión arterial y parámetros relacionados con la función renal. Los resultados muestran que el “binge drinking” disminuye los niveles de Se séricos y tisulares, modifica algunos parámetros bioquímicos relacionados Resumen Paula Sobrino Calero 2 con alteraciones hepáticas y metabólicas. El balance oxidativo esta disminuido en corazón y riñón, siendo la GPx la enzima más afectada por esta droga y, el balance inflamatorio y apoptótico está alterado en corazón y riñón por la menor expresión de GPx-4. El consumo agudo de alcohol compromete la funcionalidad cardíaca, aumentado la presión arterial y frecuencia cardiaca, y la funcionalidad renal disminuyendo la tasa de filtración glomerular y el aclaramiento de aldosterona, así como, produce disfunción endotelial al estar aumentado los marcadores vasculares Cav-1, VEGF, CTGF y tPAI-1. La suplementación con Se utilizada mejora sustancialmente el balance oxidativo, inflamatorio y apoptótico. A nivel funcional, previene la hipertensión arterial provocada por el BD puesto que disminuye la frecuencia cardiaca y mejora el balance hídrico y salino. En conclusión la suplementación de Se utilizada se podría considerarse como una terapia de gran eficiencia biológica en adolescentes que consumen alcohol tipo BD ya que previene las alteraciones cardiovasculares y renales que produce este tipo de consumo. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 5 2. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICO 2.1. ALCOHOL 2.1.1. Generalidades El alcohol, sustancia psicoactiva que crea dependencia, afecta a las personas y a las sociedades de diferentes maneras. Sus efectos están determinados por el volumen de alcohol consumido, el sexo, los hábitos de consumo y la calidad del alcohol. De acuerdo con la OMS (2018), la ingesta excesiva de alcohol es una de las principales causas de mortalidad, provocando 3,3 millones de muertes en el mundo al año lo que supone el 5,9% de todas las defunciones, y siendo el factor causal de más de 200 trastornos y enfermedades. Las consecuencias del consumo de alcohol presentan una etiología compleja, pudiendo ser el resultado de una combinación de factores genéticos, físicos, sociales y ambientales. En España, el consumo de alcohol se ha asociado tradicionalmente a la población adulta y se ha caracterizado por la regularidad de su uso, y su vinculación a la dieta y a los acontecimientos sociales. Sin embargo, en las últimas décadas se han experimentado cambios muy importantes en las cantidades ingeridas, en los patrones y en el significado de su consumo (Sánchez-Pardo, 2001), ya que, ha ganado popularidad entre los adolescentes un nuevo patrón de consumo de alcohol, llamado “binge drinking” (BD) o “botellón” (Sánchez-Pardo, 2002). 2.1.2. “Binge drinking” El “binge drinking” (termino anglosajón) o “botellón”, como es conocido en España, es un término que se utiliza para caracterizar un comportamiento que consiste en consumir alcohol de forma intensiva y episódicamente. En los Estados Unidos, ha sido definido como el patrón de consumo de alcohol que eleva el nivel de su concentración en sangre a 80 mg/dL, lo que equivaldría, en ese país, a 5 o más bebidas para hombres y 4 o más bebidas para mujeres, consumidas en aproximadamente dos horas (National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, 2004). Actualmente, de hecho, el alcohol es la droga más usada y distribuida entre los jóvenes (Lisdahl y cols., 2013). Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 6 En España, desde un punto de vista preventivo y encuadrado en un contexto de promoción de la salud pública, se ha sugerido la siguiente definición para el BD: consumo de 60 g o más, de alcohol en varones (6 bebidas) y de 40 g o más, en mujeres (4 bebidas), concentrado en una sesión de consumo (normalmente en un periodo de 4-6 horas), en la que se mantiene un determinado nivel de intoxicación (presencia de alcohol en la sangre no inferior a 0.8 g/L) (Ministerio de Sanidad y Consumo, 2008). Aspectos como las diferencias entre países en los gramos de alcohol de las unidades de bebida estándar (UBE), la frecuencia de los episodios de consumo y la duración de los mismos dificultan el establecimiento de una definición internacional del término (Parada y cols., 2011). Respecto a la prevalencia de alcohol, en España, esta es ligeramente mayor en las chicas y, en términos de edad, los mayores incrementos de esta práctica se producen entre los 14 y 16 años. A los 17 años, la dimensión que adquiere el botellón entre chicos y chicas es semejante, encontrando que aproximadamente 7 de cada 10 jóvenes ha participado en uno en el último año. Sin embargo, cuando se centra el análisis en el grupo que tiene 18 años, se percibe que el botellón está ligeramente más extendido entre los chicos. En España, la última encuesta realizada sobre alcohol y drogas en la población general (2015-2016), llevada a cabo por la Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (DGPNSD) publicada en 2016, por el Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad afirma que en referencia a los últimos 30 días, aproximadamente 2 de cada 3 jóvenes (68,2%) ha bebido alcohol, observando que el 22,2% de los estudiantes ha sufrido una borrachera en este periodo y el 32,2% ha realizado BD, es decir, ha tomado 5 o más vasos de bebidas alcohólicas en un intervalo aproximado de más de 2 horas. Según diversos autores el consumo abusivo de los jóvenes los fines de semana se ha convertido en un problema de salud pública que puede tener consecuencias a corto y largo plazo (Martinotti y cols., 2016; Johnston y cols., 2014; Timon y cols, 2012). Las consecuencias a corto plazo pueden ser coma etílico, accidentes de tráficos y comportamiento agresivo. Por otro lado, la principal consecuencia a largo plazo demostrada en numerosos estudios epidemiológicos (Ehlers y cols., 2010; Hicks y cols., 2010; Hingson y cols., Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 7 2008) es la dependencia al alcohol en la edad adulta cuando se ha consumido alcohol durante la adolescencia. En cualquier caso, el abuso agudo del consumo de alcohol afecta a todos los órganos, aunque los cambios más llamativos se produzcan a nivel del sistema nervioso central y del hígado, principal órgano metabolizador de esta droga que también se ve especialmente afectado. Recientemente, a corto plazo, se ha demostrado que hay apoptosis en los hepatocitos por la vía mitocondrial (Tian y cols., 2016). Además, Binder y cols. (2016) han encontrado, en el primer ensayo clínico que estudia el consumo agudo de alcohol y la función hepática, que un evento de BD puede dañar las células hepáticas ya que los niveles de aspartato transaminasa (AST) y alanina transaminasa (ALT) están aumentados, particularmente la ratio de transaminasas AST/ALT, la cual indica la existencia de daño hepático. En ratas, además de estar aumentada la ratio de transaminasas, también hay un aumento del estrés oxidativo (EO) (Ojeda y cols., 2016; Ojeda y cols., 2015; Nogales y cols., 2014). El EO es una situación de desequilibrio entre las moléculas oxidantes y reductoras en el organismo que daña a las biomoléculas y genera disfunción celular. El BD también tiene efectos a largo plazo a nivel hepático, ya que el consumo agudo de alcohol de forma repetida parece estar relacionado con tres hepatopatías distintas: hígado graso, hepatitis alcohólica y cirrosis alcohólica, la cual, eventualmente, puede progresar hasta el carcinoma hepatocelular (Shubha y cols., 2018). Por otro lado, cada vez más estudios afirman que el consumo agudo y puntual de alcohol daña al corazón y al riñón ya que este patrón de consumo ha sido relacionado con desórdenes cardiovasculares incluyendo cardiomiopatías, hipertensión arterial y enfermedad de la arteria coronaria (Piano y cols., 2017). Más aun, a nivel cardiovascular, el BD está asociado con un incremento de la presión sanguínea a largo plazo. Por lo tanto, los jóvenes expuestos a repetidos episodios de botellón presentan un alto riesgo de desarrollar pre-hipertensión arterial, hipertensión arterial e infarto de miocardio en la edad adulta y en la etapa de jóvenes adultos (de 18 a 30 años) (Piano y Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 14 La eliminación oxidativa extrahepática del etanol (aproximadamente el 10%) se realiza principalmente a través de la oxidación catalizada por la ADH, representada por las formas ADH1 y ADH4, que se distribuyen en varios tejidos extrahepáticos. Aunque es cuantitativamente poco importante, implica un nivel activo de oxidación de etanol en distintas células y tejidos del organismo. Los tejidos más implicados son sobre todo el pulmón (Yang y cols., 2002), cerebro (Galter y cols., 2003), estómago y riñón (Buhler y von Wartburg, 1982), esófago (Yin y cols., 1993), recto (Koivisto y Salaspuro, 1996), páncreas (Jelski y cols., 2011), intestino delgado y colon (Pronko y cols., 2002), glándula salival (Waskiewicz y cols., 2014), próstata (Gomez y cols., 2007), tiroide, suprarenal, tejido adiposo, piel, pecho y vesícula biliar (Saleem y cols., 1984) en los cuales se ha detectado las formas ADH1 y/o ADH4. Vías no Oxidativas: Como ya se comentó, además de las principales vías oxidativas, existen otros mecanismos para metabolizar el etanol que son las vías metabólicas no oxidativas: reacciones de conjugación, esterificación de los ácidos grasos y reacciones dependientes de radicales de oxígeno. En las reacciones de conjugación con acido glucurónico o con sulfato, el etanol puede ser metabolizado formando etilglucuronido o etilsulfato, actualmente usados como marcadores del consumo alcohólico, porque puede persistir y se puede detectar por largo tiempo después de que el alcohol se haya eliminado completamente del organismo (Wurst y cols., 2000). Otras de las vías no oxidativas es aquella por la que se forman los esteres etílicos de los ácidos grasos (EEFA) en los órganos dañados más frecuentemente por el alcohol: hígado y tejidos extrahepáticos, principalmente en el páncreas y tejido adiposo y, en menor medida, el cerebro y corazón (Quertemont, 2004; Beckemeir y Bora, 1998; Zimatkin y Deitrich, 1995). Los EEFA son metabolitos del etanol formados por la esterificación de este con los acidos grasos por la enzima acido graso etil ester sintetasa (EEFA sintetasa) presente en alta concentración en estos tejidos. Los efectos fisiológicos de la formación de esteres etílicos consisten en la afectación de la capacidad oxidativa de la mitocondria, aunque también se ha descrito su capacidad para Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 15 desordenar las membranas celulares. Estos metabolitos parecen tener una especial relevancia para el daño tisular cerebral originado por el consumo crónico de cantidades abundantes de alcohol (Aragon y cols., 2002; Laposata, 1996). La tercera de las vías no oxidativas son las reacciones dependientes de radicales libres ya que el etanol es un agente eliminador de radicales de oxigeno y se puede oxidar a acetaldehído al reaccionar ante especies con radicales del tipo hidroxilo o ferrilo. Estos radicales no tienen importancia metabólica por su toxicidad pero con estas reacciones es posible generar radicales de etanol, como el radical 1-hidroxietilo (Cederbaum, 1987). 2.1.4. Metabolismo del alcohol en el corazón y en el riñón El consumo agudo de alcohol afecta ampliamente al organismo, en especial al hígado, ya que como se ha comentado anteriormente, es el principal órgano metabolizador del etanol pero también el corazón y el riñón son órganos metabolizadores de etanol, pues parte del alcohol ingerido no metabolizado pasa a sangre y de allí a estos tejidos. Estos dos órganos presentan diferentes expresiones y actividades de las tres enzimas encargadas del metabolismo oxidativo del alcohol, haciendo que tengan sus peculiaridades a la hora de metabolizar el alcohol por vías oxidativas y generar EO. En el riñón, el metabolismo del etanol tiene lugar por las tres vías metabólicas oxidativas, ADH, SMOE y CAT, al igual que en el hígado (Figura 2.1.4). De estas tres vías oxidativas, la principal es la enzima ADH ya que el riñón constituye el tejido extrahepático que presenta mayor cantidad de esta enzima, del orden de ocho veces más cantidad de esta enzima que en el corazón y diez veces más que en el páncreas. Las otras dos vías también metabolizan el etanol ingerido, pero, en menor medida respecto a la ADH (Das y Vasudevan, 2008). Estudios previos determinan que, cuando las ratas son tratadas con alcohol al 20% durante 10 semanas se produce un incremento en las actividades de ADH y catalasa en el riñón (Orellana y cols., 1998). En el caso Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 16 de la enzima ADH el aumento es prácticamente el doble al valor control y en el de la catalasa es el triple. La isoforma de la ADH presente en este órgano es muy similar o idéntica a la ADH-1 del hígado (Qulali y cols., 1991). Por otro lado, la presencia de SMOE en el riñón no se ha medido expresamente pero se conoce que aumenta proporcionalmente tras el consumo de alcohol así como en el hígado (Teschke y cols., 1981), por lo tanto, también aumenta la producción de acetaldehído y EROs por esta vía cuando la concentración de alcohol que llega al riñón es elevada, como podría ser el caso del BD. Este aumento de la metabolización renal de etanol debido a los altos niveles de alcohol ingerido, provoca un aumento de los niveles de acetaldehído y NADH. Este exceso de NADH es reducido por el incremento de la actividad de las enzimas malato deshidrogenasa y aspartato transaminasa, aunque, tras un consumo elevado de alcohol, el riñón no es capaz de reducir el exceso de NADH ya que las enzimas que lo reducen no aumentan mas su actividad, por lo tanto, este exceso aumenta el EO ya que como se ha comentado anteriormente el exceso de NADH tiene consecuencia en la cadena transportadora de electrones produciendo un exceso de radicales superóxidos (Nechifor y Dinu, 2011). Para el BD no hay estudios que establezcan que ocurre lo mismo pero se puede afirmar que quizás el mecanismo de acción es similar ya que los niveles de alcohol son muy elevados. En consonancia con lo anterior, se ha demostrado que el consumo de alcohol también induce el aumento de la oxidación mitocondrial de los ácidos grasos, ya que el consumo de alcohol durante largos periodos de tiempo aumenta de tres a cuatro veces el CYP2E1 en los microsomas y peroxisomas del riñón. Por lo tanto, el CYP2E1 es bastante inducible por el consumo de alcohol en el riñón. Este hecho explica la tolerancia que presenta el organismo al alcohol (Orellana y cols., 1998). Respecto a las vías no oxidativas, una evidencia creciente sugiere que los EEFA juega un papel importante en el daño producido por el consumo de Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 17 alcohol. El consumo de alcohol causa un incremento significativo de los niveles de EEFA, principalmente en el cerebro y corazón pero también en el riñón e hígado. Este incremento puede estar asociado con el aumento de la actividad de la EEFA sintetasa (Beckemeier y Bora, 1998; Quertemont, 2004). En el corazón, al igual que el hígado y riñón (Figura 2.1.4), la metabolización del alcohol tiene lugar por las tres vías metabólicas oxidativas aunque estas actúan de forma distinta a los otros dos tejidos, ya que los niveles de ADH son bajos, la presencia de SMOE y los niveles de CAT están aumentados respecto a otros órganos (Orellana y cols., 1998; Fahimi y cols., 1979; Hicks y Fahimi, 1977; Herzog y Fahimi, 1976), jugando un papel más importante en el metabolismo oxidativo del alcohol, en el corazón, que la enzima ADH (Panchenko y cols., 1987; Antonenkov y Panchenko, 1986; Fahimi y cols.,1979). Figura 2.1.4. Esquema comparativo de las tres vías oxidativas de metabolización en el hígado, corazón y riñón. La figura indica la importancia de cada una de estas vías en los distintos tejidos según la cantidad de alcohol que metabolizan y cuál de estas vías se induce específicamente tras el consumo abusivo de alcohol BD (+). Se ha comprobado que tras el consumo de grandes cantidades de alcohol, la actividad de la enzima ADH en el corazón, aunque está presente, no se modifica, constituyendo una de las diferencias más significativa respecto al riñón e hígado. Sin embargo, las actividades de las enzimas SMOE y CAT se encuentran aumentadas tras el consumo de alcohol, aunque la enzima CAT es la principal enzima metabolizadora del etanol en el corazón. A este hecho se le añade que tras el consumo de alcohol, existe un incremento en el tamaño y número de peroxisomas en el corazón, localización celular de la CAT, por lo tanto, se observa un aumento en el tamaño del corazón. Este incremento de ADH SMOE CAT CAT (+) ADH SMOE ADH(+) CAT(+) SMOE(+) Mayor % Menor % Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 18 los peroxisomas debido al aumento de la actividad CAT tras el consumo de alcohol ha sido reflejado en el incremento del músculo cardiaco generando cardiomegalia e indicando que la enzima CAT juega un papel más importante en el metabolismo del alcohol en el corazón que la enzima ADH. Diversos autores han determinado que el metabolismo del etanol a través de la SMOE puede contribuir a la patogénesis de las cardiopatías alcohólicas, incluyendo disfunción contráctil, aumento del EO y apoptosis, posiblemente a través de la activación de las señales pro-apoptóticas JNK y ASK-1 (Zhang y cols., 2013). 2.2. ALCOHOL Y SISTEMA CARDIOVASCULAR 2.2.1. Generalidades El consumo de alcohol, el cual se conoce comúnmente como “beber”, ha estado integrado en la sociedad desde el comienzo de la historia. Sin embargo, en función del patrón de consumo, el alcohol puede tener efectos tóxicos o beneficiosos en el organismo, especialmente a nivel cardiovascular, por eso se denomina como una sustancia que produce hórmesis debido a que a baja concentración tiene el efecto contrario que a alta concentración a nivel cardiovascular. Como se ha comentado anteriormente, según la OMS, el consumo abusivo de alcohol provoca la muerte de 3,3 millones de personas al año, siendo causa de muerte por delante de la violencia, SIDA o tuberculosis. Sin embargo, su consumo moderado (de una a dos bebida al día en las mujeres y de dos a tres bebidas al día en los hombres) está asociado con un menor riesgo de mortalidad, de enfermedad coronaria, de isquemia, de trombosis y de síndrome metabólico, debido al mejor perfil lipídico que genera (las lipoproteínas plasmáticas de alta densidad (HDL) están aumentadas y las lipoproteínas plasmáticas de baja densidad (LDL) están disminuidas), aumento de la fibrinólisis y mayor sensibilidad a la insulina, disminución de los marcadores de disfunción endotelial y homocisteína, y al aumento de adiponectina y factor de crecimiento endotelial (Lucas y cols., 2005) (Figura 2.2.1). Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 19 Figura 2.2.1. Manifestaciones clínicas y mecanismos fisiopatológicos que se presentan en el sistema cardiovascular según el patrón de consumo de alcohol. Modificado de Lucas y cols., 2005. Por el contrario, el consumo de grandes cantidades de alcohol (más de 3 bebidas al día en las mujeres y más de 5 bebidas al día en el caso de los hombres) produce un aumento del EO, disfunción de los marcadores endoteliales y presencia de un perfil lipídico perjudicial ya que los niveles de triglicéridos están aumentados y los de HDL disminuidos, los cuales suponen factores de riesgo para el sistema cardiovascular, aumentando la presión arterial, arritmias y el síndrome metabólico. 2.2.2. Estrés oxidativo Como ya se comentó, el EO es una situación de desequilibrio entre las moléculas oxidantes y reductoras en el organismo, por lo tanto, puede aparecer por el aumento en la producción de RL o bien como consecuencia de una disminución de los antioxidantes endógenos. Radicales Libres: El término RL es utilizado con frecuencia para designar a un átomo o molécula que contiene uno o más electrones no pareados, lo cual hace que sea muy inestable y reactivo (Valko y cols., 2004). Los RL se forman en el interior CONSUMO DE ALCOHOL Y ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR MODERADO Hombre:25-40 g/día (2-4 UBEs) Mujer: 25 g/día (1-2 UBEs) CLÍNICA Enf. coronaria Enf. vascular periférica Isquemia Trombosis Síndrome metabólico MECANISMOS FISIOPATOLÓGICOS HDL-C LDL-C oxidado Sensibilidad a insulina Fibrinólisis Homocisteína VEGF y adiponectina Marcadores disfunción endotelial EXCESIVO Hombre: >40 g/día (>5 UBEs) Mujer: >25 g/día (>3 UBEs) CLÍNICA Hipertensión Arritmias Cardiomiopatía Fallo cardiaco Síndrome metabólico MECANISMOS FISIOPATOLÓGICOS Acetaldehído Estrés oxidativo Triglicéridos HDL-C Especies reactivas de nitrógeno Marcadores disfunción endotelial Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 20 de las células, en el citoplasma o en las mitocondrias, y en la membrana celular (Bianchi y Antunes, 1999). En general, los RL presentan una vida media corta y reaccionan de forma rápida con diversos compuestos, pudiendo oxidar biomoléculas y provocar daño molecular y celular. Dentro de los RL, es significativa la acción del grupo de radicales que contienen oxígeno, siendo estos conocidos como EROs (Wu y Cederbaum, 2003). Esta categoría, no incluye solo los EROs, como el anión O2- y el radical hidroxilo (OH•), sino también algunos derivados no radicales como el H2O2 y el oxígeno singlete (1O2*) (Battin y Brumaghim, 2009; Andresen y cols., 2006). En general las EROs se producen en el organismo y a bajas dosis tienen funciones fisiológicas. Cuando existe un incremento en su formación como en casos donde exista disfunción en la membrana de la mitocondria, NADPH oxidasa y xantina oxidasa (Figura 2.2.2) afectan negativamente al organismo. Mecanismos de defensa antioxidante: En el organismo existen numerosos y eficientes mecanismos de defensa antioxidante que actúan en función del tipo de especie dañina y del lugar donde ésta se genera. En las células, el sistema antioxidante es principalmente de tipo enzimático y en el espacio extracelular, es decir, en fluidos biológicos como el plasma, el sistema antioxidante es, principalmente, de tipo no enzimático. Las enzimas antioxidantes forman parte del sistema antioxidante endógeno, los antioxidantes no enzimáticos pueden ser endógenos como el GSH y exógenos. Las enzimas antioxidantes endógenas son el principal sistema de defensa frente al daño oxidativo y se encargan de eliminar las EROs, especialmente el radical O2- y H2O2, para evitar que, a partir de éstos, se generen otras especies más reactivas y peligrosas como el radical OH•, 1O2* y el anión peroxinitrito (ONOO-). Este sistema incluye a la enzima superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión reductasa (GR), todas ellas actúan de manera concatenada (Figura 2.2.2). Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 21 Figura 2.2.2. Esquema de las cuatro enzimas antioxidantes endógenas. La SOD constituye la primera fase de defensa antioxidante y cataliza la dismutación de los radicales O2- mediante su transformación en H2O2 y oxigeno molecular (O2). Actúa a valores de pH fisiológico, siendo su velocidad de catálisis máxima para valores de pH comprendidos entre 7 y 9 (Aydermir y Tarhan, 2001). Esta reacción también se produce de forma espontánea aunque de manera menos eficiente, ya que depende fuertemente de pH. En humanos se diferencian tres formas de SOD, que difieren con respecto a su ubicación en las células y los iones metálicos que requieren para su función, en el citosol (Cu/ZnSOD), en la mitocondrial (MnSOD) y la extracelular (ECSOD) (Valko y cols., 2006; Fattman y cols., 2003). La SOD citosólica es una proteína que posee dos subunidades idénticas, que contiene cobre y zinc en su centro activo, siendo el cobre responsable de la transferencia de electrones, mientras que el zinc desempeña únicamente un papel estabilizador. La SOD mitocondrial es una proteína tetramérica y contiene manganeso en su centro activo, y, aunque su contenido en tejidos humanos es aproximadamente la mitad del contenido de Cu/ZnSOD, la expresión de MnSOD es esencial para la supervivencia ya que tras utilizar ratones Mn-SOD O2- SOD H2O2 GPx H2OO2 CAT GSH GSSG GR Se OH- Oxida Proteínas (GC) Oxida lípidos (MDA) Daña ADN AcetilCoA O2CO2 NADH NAD+ NADPH Oxidasa XantinaOxidasa Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 22 knockout, se comprobó que estos presentaron una cardiomiopatía letal (Li y cols., 1995) y para el desarrollo de resistencia celular a la toxicidad inducida por EROs (Matés y cols., 1999). Además de su papel en la dismutación del O2- esta isoforma influye en la actividad de factores de transcripción tales como el HIF-1α, el AP-1, el NF-ĸB y el p53, y afecta la estabilidad del DNA (Miriyala y cols., 2012). La SOD extracelular, al igual que la citosólica, contiene cobre y zinc en su centro activo y posee una fuerte afinidad con la heparina y otros proteoglicanos. Se localiza en líquidos extracelulares como el plasma, la linfa y el líquido cerebroespinal y fluido sinovial (Alfonso y cols., 2007). La CAT se encuentra ampliamente distribuida en el organismo humano. A nivel celular se localiza principalmente en los peroxisomas (80%) y en el citosol (20%), aunque también se halla en la mitocondria del tejido cardiaco a baja concentración (Roberfroid y Buc-Calderon, 1995), donde ejerce un importante papel antioxidante (Radi y cols., 1993) y, a nivel tisular está presente, principalmente, en la sangre, medula ósea, corazón, riñones e hígado. Su actividad varía según el tejido, siendo más elevada en hígado, riñón y corazón, más baja en el tejido conectivo y los epitelios y prácticamente nula en el tejido nervioso (Céspedes y cols., 1996). Su función más significativa es la descomposición del H2O2 a H2O y O2. La CAT requiere que el ión Fe3+ se una a su sitio activo para poder ser eficaz. En cualquier caso, su afinidad por el H2O2 es baja por lo que requiere elevadas concentraciones de H2O2 para actuar, lo que la convierte en la enzima más relevante en la respuesta adaptativa celular frente a condiciones de estrés oxidativo (Roberfroid y Buc-Calderon, 1995; Cheesman y Slater, 1993). Este hecho sumado a que esta enzima posee una Km y Vmax muy altas para el H2O2 la convierte en la más adecuada para eliminar el peróxido de hidrogeno a nivel celular cuando éste se encuentra presente en concentraciones elevadas (Barja de Quiroga, 1997). Además al encontrarse mayoritariamente en los peroxisomas, la CAT es menos efectiva que la GPx frente al H2O2 producido en compartimentos como el citosol o la mitocondria (Ji, 1995). Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 23 La GPx es una de los principales componentes del sistema de defensa antioxidante que incorpora al Se en forma de selenocisteína dentro de su núcleo catalítico, por lo tanto, pertenece a la familia de las selenoproteínas. Estas enzimas catalizan la reducción de H2O2 y de hidroperóxidos orgánicos a H2O y O2 utilizando GSH como agente reductor (Negro, 2008; Papp y cols., 2007). En humanos se conocen cinco isoformas: GPx-1, ubicada en el citosol de todas las células del organismo; GPx-2, ubicada en el tracto gastrointestinal e hígado; GPx-3, puede estar en el interior o exterior de la célula y su importancia radica en que es una de las enzimas transportadoras de Se en el organismo; GPx-4, presente en las membranas celulares y GPx-6, especifica del epitelio olfativo y del tejido embrionario (Reeves y Hoffmann, 2009; Papp y cols., 2007; Brigelious-Flohé y cols., 2002). La GR es una enzima que forma parte del sistema antioxidante GPx/GR. Se encuentra ampliamente distribuida por el organismo, principalmente, en el hígado y los eritrocitos y, también se expresa en niveles elevados en los órganos reproductores de ambos sexos y en el epitelio pulmonar (Fujii y cols., 2011). Cataliza la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a GSH, el cual será utilizado por la GPx, en una reacción dependiente de NADPH. Los antioxidantes no enzimáticos, forman la segunda defensa antioxidante, son distintos compuestos antioxidantes endógenos y exógenos, que atrapan o neutralizan a los RL. Los antioxidantes de origen endógeno son GSH, urato, ubiquinol y proteínas plasmáticas, son sintetizados por el organismo humano, de modo que, cuando son modificados, se ponen en funcionamiento un mecanismo de síntesis para reemplazarlos. El GSH es uno de los mecanismos de defensa antioxidantes más importantes para el organismo. De hecho, es el antioxidante que se encuentra en mayores concentraciones intracelulares, pudiendo actuar como tal en reacciones enzimáticas y no enzimáticas. Los principales órganos responsables de su homeostasis son hígado, riñón, corazón, pulmón, intestino y músculo (Deneke y Fanburg, 1989). En el interior de las células se localiza principalmente en mitocondrias, retículo endoplásmico y núcleo. Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 30 Figura 2.2.3. Esquema de los efectos nocivos que provoca el consumo agudo de alcohol tipo “binge drinking” sobre sistema cardiovascular y renal. 2.2.3.1. Cardiopatía alcohólica Aunque el consumo moderado de alcohol podría ser beneficioso para las funciones cardiovasculares y reducir el riesgo de la enfermedad cardiaca, el consumo agudo de alcohol produce distintos tipos de cardiopatías debidas principalmente 1) al EO cardiovascular, 2) a cambios electrofisiológicos que producen arritmias, 3) al incremento de apoptosis que genera esta droga, 4) activación del SNA y 5) activación del SRAA (Piano y cols., 2017; Husain y cols., 2014). Consumo agudo de alcohol “Binge Drinking” CARDIOPATÍA ALCOHÓLICA Estrés oxidativo Cambios electofisiológicos (arritmias) Apoptosis NEFROPATÍA ALCOHÓLICA Estrés oxidativo Deformación en ultraestructuras renales Desequilibrios electrolíticos Na+y K+ DISFUNCIÓN ENDOTELIAL PERIFÉRICA, CORONARIA Y RENAL HIPERTENSIÓN Estrés oxidativo Activación del SRAA Ca intracelular Resistencia a la insulina Activación del SNA Metabolismo lipídico NO Hemostasis Activación del SNA Activación del SRAA Activación del SNA Activación del SRAA Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 31 Figura 2.2.3.1. Esquema de los efectos nocivos que provocan el consumo agudo de alcohol tipo “binge drinking” sobre el corazón. 2.2.3.1.1. Estrés oxidativo Como se ha comentado anteriormente, el consumo agudo de alcohol produce EO debido a su metabolismo oxidativo. En el caso del corazón, el BD contribuye a la disfunción cardiaca debido al aumento de los niveles de catecolaminas que genera numerosas EROs y altera la función mitocondrial (Ren y Wold, 2008; Lucas y cols., 2005; Kanan y cols., 2004; Mansouri y cols., 2001). Esta disfunción cardiaca se debe al incremento de las EROs y a la disminución de las reservas antioxidantes, que se asociado con la hipertrofia del ventrículo izquierdo y el fallo cardiaco (Van Deel y cols., 2008; Hamilton y cols., 2004). 2.2.3.1.2. Cambios electrofísiológicos Las arritmias cardiacas pueden desempañar un papel importante en el riesgo de padecer infarto de miocardio o muerte súbita. Estudios previos han determinado que en individuos sanos y en individuos con enfermedades cardiovasculares, el BD está asociado con un mayor riesgo de padecer ciertas arritmias cardiacas, como fibrilación auricular, una de las arritmias más comunes y fuertemente asociada con efectos cardiovasculares adversos, como derrame cerebral (Conen y cols., 2011). El BD incrementa la vulnerabilidad al desarrollo de arritmias debido a que el consumo agudo de alcohol altera las propiedades electrofisiológicas del corazón puesto que produce una reducción de los niveles de magnesio y CARDIOPATÍA ALCOHÓLICA Estrés oxidativo Cambios electofisiológicos (arritmias) Activación del SNA Activación del SRAA Apoptosis Consumo agudo de alcohol “BingeDrinking” Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 32 potasio en sangre, es decir, hipomagnesemia e hipopotasemia, respectivamente (George y cols., 2010). Además, Lorsheyd y cols., 2005 determinaron que el consumo agudo de alcohol prolonga el intervalo QT y acorta el periodo refractario auricular. La prolongación de este intervalo está relacionado con el desarrollo de arritmias ventriculares (Zhang y cols., 2011). 2.2.3.1.3. Apoptosis La apoptosis o muerte celular programada, es un mecanismo mediante el cual el organismo elimina las células no deseadas del organismo (Dillon y cols., 2012; Yu y cols., 2009; Los y cols., 1999). Es la forma más común de muerte celular y se produce durante el desarrollo, la remodelación tisular, procesos de defensa y en la respuesta inmune. Este proceso se ejecuta a través de una familia de cisteínas proteasa, conocidas como caspasas, que se sintetizan como zimógenos latentes, y se activan siguiendo un orden jerárquicos como iniciadores y efectores del proceso de muerte celular (Yu y cols., 2009). La apoptosis está controlada por los receptores de muerte presentes en la superficie celular (vía extrínseca) y otros a través de señales originadas dentro de las células (vía intrínseca) (Figura 2.2.3.1.3.). Figura 2.2.3.1.3.1. Vías extrínseca e intrínseca de la apoptosis. Modificado de Salvesen y Walsh, 2014 Ligando de muerte Receptor de muerte VÍA EXTRÍNSECA VÍA INTRÍNSECA Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 33 La vía extrínseca de señalización es la encargada del inicio de la apoptosis, se activa por la unión de ligandos de muerte, como FasL, a su receptor de muerte, receptor de Fas, afin de la superficie celular para reclutar y activar a las caspasas iniciadoras (Fricker y cols., 2013; Lee y Gustafsson, 1999; Ashkenazi y Dixit, 1998). Este proceso ocurre como consecuencia de interacciones homotipicas del dominio de muerte (DD) entre la región intracelular del receptor FasL y la proteína adaptadora FADD y las interacciones homotipicas del dominio efector de muerte (DED) entre FADD y el extremo N-terminal de la procaspasa 8 o la procaspasa 10 (Vercammen y cols., 2008). Este mecanismo constituye el complejo de señalización e inducción de muerte (Kischkel y cols., 1995) y la activación de los dominios de la proteasa de la procaspasa 8 y 10. Una vez activadas y procesadas, estas caspasas iniciadoras activan a las caspasas efectoras, caspasa 3 y 7, que en última instancia se encargan de proteolizar el contenido de la célula (Fricker y cols., 2013; Yu y cols., 2009; Momoi, 2006) (Figura 2.2.3.1.3.). La vía intrínseca se induce intracelularmente y puede ser desencadenada por daño en el DNA, grandes aumentos en la concentración de Ca2+ citosólico o estrés celular (Lozano y cols., 2009), así como un aumento en la generación de EROs en la mitocondria. Esto activa la expresión del gen supresor de tumores p53, que, a continuación, activa las proteínas proapoptóticas que esta mediada por la familia de proteína Bcl-2, compuesta por Bax y Bak, las cuales causan la liberación del citocromo c de la mitocondria y ellos conduce a la activación de la caspasa 9. Esta caspasa posee un dominio de reclutamiento asociado a caspasas (CARD) en el extremo N-terminal que media las señales de apoptosis después del daño mitocondrial. La caspasa 9 se activa a través del complejo apoptoma citosolico asociado con Apaf-1, que se une al citocromo c a través del dominio CARD (Fricker y cols., 2013; Momoi, 2004). Una vez que la caspasa-9 se activa, se produce la activación de otras caspasas, como las caspasas- 3 y 7 (Figura 2.2.3.1.3.). El consumo agudo de alcohol está asociado con el aumento de apoptosis en los cardiomiocitos (Doser y cols., 2009; Kandadi y cols., 2013), aunque los mecanismos mediante los cuales se producen no están del todo descrito. Por un lado, hay autores que establecen que, como se ha comentado Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 34 anteriormente el BD aumenta la producción de EROs. La mayoría de las EROs se generan dentro de la fosforilación oxidativa mitocondrial, un proceso mediante el cual los electrones de NADH y FADH se transfieren al O2 molecular a través de la cadena de cuatro complejos enzimáticos y se reduce a H2O. Las EROs activan a la proteína quinasa C-β (PKC-β) e induce la fosforilación de la proteína p66Shc produciendo la transferencia de esta proteína desde el citosol al interior de la mitocondria. Una vez en la mitocondria, la proteína p66Shc se une al complejo de importación TIM-TOM el cual es desestabilizado por las señales pro-apoptóticas y conduce a la liberación y activación de la proteína p66Shc. Una vez activado, el p66 oxida el citocromo c y cataliza la reducción de O2 a H2O2. Este ultimo induce la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (PTP), con posterior aumento de permeabilidad de la membrana mitocondrial a los iones, solutos y agua produciendo hinchazón y disrupción del organelo y la consiguiente liberación de factores pro-apoptótico, como el citocromo c, al citosol (Camici y cols., 2007). Por lo tanto, se considera que la proteína p66 es una enzima redox que genera el H2O2 mitocondrial como una señal para la apoptosis (Cosentino y cols., 2008) (Figura 2.2.3.1.3.). Figura 2.2.3.1.3.2. Esquema de la apoptosis en cardiomiocitos. Tomado de Wang y cols., 2015 Por otro lado, el BD favorece la producción de EROs, en situaciones de fallo cardiaco donde las EROs están muy aumentadas y se sabe que también son capaces de activar la vía extrínseca (Guan y cols., 2004). Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 35 Por otro lado, un estudio con ratones albinos transgénicos con Virus tipo B a los cuales se le insertaron el DNA de ADH clase I (puesto que es la isoforma más eficaz en la oxidación del etanol) se encontró que el consumo agudo de alcohol incrementó significativamente la expresión de las proteínas pro-apoptóticas Bax y Caspasa-3 en el corazón mientras que disminuyó los niveles de la proteína anti-apoptótica Bcl-2. El trasgén de ADH en sí mismo no produjo ningún efecto sobre la expresión de Bax, Bcl-2 y Caspasa-3 en ausencia de alcohol. Además, ni el consumo de alcohol ni el trasgén de ADH modificaron la vía extrínseca puesto que no se modificaron las proteínas de TNF-α, receptor y ligando Fas y caspasa-8, pero si aumentaron los niveles de citocromo c y pro-caspasa 9 en el citosol de los cardiomiocitos (Guo y Ren, 2010). 2.2.3.1.4. Activación del sistema nerviosos autónomo Como se ha comentado anteriormente en la figura 2.2.2.1, el consumo agudo de alcohol es uno de los patrones que más favorece el EO y activa al SNA, activando este, a su vez, al SNS que provoca el aumento de la frecuencia y excitabilidad cardiaca, aumento de la fuerza de contracción, de la velocidad de conducción y del gasto cardiaco. El eje HHA provoca el aumento de los niveles de cortisol y Aldo aumenta los efectos glucolipotóxicos en el corazón así como produce hipertrofia en los cardiomiocitos y, la Aldo produce remodelación cardiovascular en el corazón. 2.2.3.1.5. Activación del sistema renina-angiotensina-aldosterona Como se ha comentado anteriormente en la figura 2.2.2.1, el consumo agudo de alcohol es uno de los patrones que más favorece el EO y activa al SRAA, aumentando los niveles de Ang II que provoca vasocontricción y remodelación cardiovascular y, los de Aldo en el corazón. 2.2.3.2. Hipertensión Según la OMS, la hipertensión arterial (HTA), también conocida como tensión arterial alta, es un trastorno en que los vasos sanguíneos tienen una tensión persistentemente alta. Se considera elevada cuando la presión arterial Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 36 sistólica (PAS) es igual o superior a 140 mm Hg y/o la presión arterial diastólica (PAD) es igual o superior a 90 mm Hg. La OMS ha identificado la HTA como un factor de riesgo cardiovascular que representa un importante problema de salud pública en los países desarrollados y en desarrollo, afectando aproximadamente a mil millones de personas en todo el mundo. Es una patología asintomática hasta que causa complicaciones y, aunque es fácil de diagnosticar y tratar, en ausencia de tratamiento, incrementa de forma lineal y aumenta la incidencia de sufrir enfermedades cardiovasculares (cardiopatía isquémica, enfermedades cerebrovasculares, insuficiencia cardiaca, vasculopatías periféricas y neuropatías) y muerte súbita, con respecto a individuos normotensos de la misma edad y sexo (Tamargo y cols., 2007). Figura 2.2.3.2. Esquema de los efectos nocivos que provocan el consumo agudo de alcohol tipo “binge drinking” a nivel vascular. Numerosos estudios epidemiológicos, preclínicos y clínicos establecen una relación directa entre HTA y el consumo de grandes cantidades de alcohol. Sin embargo, los mecanismos a través de los cuales el alcohol aumenta la presión arterial son diversos, entre ellos se encuentran 1) el EO, 2) el incremento de la reactividad vascular debido al incremento de los niveles de Ca2+, 3) resistencia a la insulina, 4) estimulación de la secreción hipofisiaria de Consumo agudo de alcohol “Binge Drinking” HIPERTENSIÓN Estrés oxidativo Activación del SRAA Ca intracelular Resistencia a la insulina Activación del SNA Metabolismo lipídico NO Hemostasis Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 37 la hormona adrenocorticotropa (ACTH) que conlleva a un aumento de los niveles de cortisol, 5) la estimulación del sistema renina-angiotensina- aldosterona (SRAA), 6) la activación del sistema nervioso simpático (SNS), 7) alteración del perfil lipídico, problemas de coagulación y 8) la disminución de los niveles de oxido nítrico (NO) (Figura 2.2.3.2). 2.2.3.2.1. Estrés oxidativo En el sistema cardiovascular, el EO provocado por un aumento de los elementos oxidantes y/o disminución de los sistemas antioxidantes, se asocia con el desarrollo de diferentes enfermedades cardiovasculares como hipertensión, hipercolesterolemia, aterosclerosis o fallo cardiaco (Hamilton y cols., 2004). El exceso de EROs se relaciona con el desarrollo de un proceso inflamatorio en el sistema cardiovascular y con un incremento del daño peroxidativo, y, por tanto, de la oxidación de lipoproteínas LDL, que se acumulan en la pared arterial como consecuencia de su modificación oxidativa. Todos estos factores favorecen la progresión de aterosclerosis y de la disfunción endotelial que acompaña a esta patología (Bau y cols., 2007; Lebredo y cols., 2003). El EO es un mecanismo importante mediante el cual el consumo abusivo de alcohol produce efectos vasculares. Tirapelli y cols (2008) realizaron un investigación con ratas Wistar y llevando a cabo un modelo de consumo abusivo de alcohol, encontrando un incremento de los niveles de algunos marcadores oxidativos (Simplicio y cols., 2016; Gonzaga y cols., 2015; Yogi y cols., 2012). Se encontraron niveles plasmáticos de sustancias que reaccionan con el acido tiobarbitúrico (TBARS), un aumento del anión superóxido en las células endoteliales y en las células del musculo liso junto con un incremento de la expresión de la NADPH oxidasa, enzima encargada de generar el anión superóxido (Yogi y cols., 2012). Estos mismos investigadores, determinaron un incremento plasmático de la actividad de la ECA y renina y disminución de los niveles de oxido nítrico (NO), junto con un aumento de la presión arterial. Por lo tanto, concluyen que el consumo agudo de alcohol produce EO en los distintos vasos sanguíneos. Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 38 2.2.3.2.2. Aumento de Ca2+ intracelular El BD puede alterar directamente la vasoreactividad de las células del musculo liso ya que ratas tratadas con alcohol presentan vasoconstricción debido a que existe una mayor unión de Ca2+ en las células del músculo liso de las arterias y arteriolas que hacen que se aumente la sensibilidad a vasoconstrictores endógenos (Yang y cols., 2001). Se ha constatado un incremento de la respuesta vasoconstrictora a endotelina-1, un potente vasoconstrictor, en arteriolas aisladas de jóvenes adultos bebedores en comparación con no bebedores (Goslawski y cols., 2013). Sin embargo, en otro estudio basado en un modelo animal y al cual sólo se le administro una vez BD, no se encontró un incremento de la respuesta vasoconstrictora (Gonzaga y cols., 2014). Por lo tanto, la diferencia entre los dos últimos estudios puede estar relacionada con la duración del BD y las diferencias fisiológicas entre tejidos vasculares humanos y los animales. 2.2.3.2.3. Resistencia a la insulina La resistencia a la insulina (RI) se caracteriza por una diminución en la capacidad de la insulina para llevar a cabo sus funciones fisiológicas normales en los adipocitos, músculo e hígado, provocando un aumento de la insulinemia basal para mantener la glucemia en un rango normal (Meshkani y Adeli, 2009; Petersen y Shulman, 2006). Además, se ha demostrado que es un factor de riesgo cardiovascular y que los sujetos con mayor RI tienen más riesgo de desarrollar complicaciones vasculares (Sanhuenza y cols., 2014; Kilpatrick y cols., 2007). Se sabe que el consumo agudo de alcohol genera EO y, algunos autores han establecido que el EO y los niveles elevados de EROs están relacionados con el comienzo, la progresión y el desarrollo de diabetes y de RI (Zhai y cols., 2011), ya que activan las cascadas de señalización en respuesta al estrés como es el caso de la cascada de las MAP Kinasas (Al-Lahhman y cols., 2015). Mediante esta vía se induce la fosforilación de los residuos de serina (Ser)/treonina (Thr) de sustrato de receptor de insulina (IRS-1), lo que promueve la liberación de esta molécula del lado citoplasmático de la membrana y su posterior degradación y disminución. En definitiva, como Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 39 consecuencia del EO los niveles funcionales de IRS-1 disminuyen y la insulina no puede ejercer su acción en las células, lo que desencadena la resistencia a esta hormona. Además se sabe que el BD en ratas, produce RI debido a que disminuye la acción hipotalámica de la insulina. La interrupción de la señal hipotalámica esta mediada por citoquinas inflamatorias y fosfatasas tales como TNF-α, interleukina 6 (IL-6), NF-ĸB y proteína tirosina fosfatasa 1 B (PTP1B). Este hecho cobra especial relevancia entre la población adolescente (García-Ruiz y Fernández-Checa, 2013). Estudios previos demuestran que la hiperinsulinemia causa retención de Na+ y aumento de la actividad simpática, dos causas que aumentan la presión arterial (Sternberg y cols., 1994). Además, la insulina por si sola tiene acciones vasodilatadoras, las cuales dependen del NO pero al existir resistencia, disminuye la vasodilatación y produce HTA (Hayashi y cols., 1997). 2.2.3.2.4. Activación del sistema nervioso autónomo Como se ha mostrado en la figura 5, el consumo agudo de alcohol aumenta la generación de EROs produciendo EO que activa al SNA y, éste, a su vez activa el eje HHA y el SNS. La activación del eje HHA aumenta los niveles de cortisol y de Aldo que provoca disfunción endotelial y, la activación del SNS produce la liberación de las catecolaminas Ad y Nad que producen vasoconstricción. 2.2.3.2.5. Activación del sistema renina-angiotensina-aldosterona El EO que produce el BD activa el SRAA que conlleva al aumento de los niveles de renina en sangre, que a su vez, aumenta los niveles de Ang I y ésta aumenta los niveles de Ang II que produce vasoconstricción, disfunción endotelial y aumenta los niveles de Aldo, que también conlleva a la disfunción endotelial. 2.2.3.2.6. Metabolismo lipídico El BD también altera el metabolismo lipídico, los niveles de las lipoproteínas LDL y las lipoproteínas HDL. Algunos estudios han sugerido que Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 46 2.2.3.3.4. Activación del sistema nervioso autónomo Como se ha comentado anteriormente en la figura 2.2.2.1, el EO que se genera tras el consumo agudo de alcohol activa el SNA y al SNS, que provoca retención de Na+ y excreción de K+ debido al aumento de los niveles de Aldo. La activación del SNS aumenta los niveles de Ad y Nad que conlleva a una vasocontricción de la arteriola aferente, provocando que llegue menos cantidad de sangre al riñón y, en consecuencia, disminuye la tasa de filtración glomerular. 2.2.3.3.5. Activación del sistema renina angiotensina aldosterona Como se ha expuesto anteriormente en la figura 2.2.2.1, la activación del SRAA conlleva a un aumento de los niveles de Ang II y, en consecuencia, de Aldo favoreciendo de nuevo la reabsorción de Na+ y la excreción de K+, a nivel renal. 2.3. SELENIO Y SISTEMA CARDIOVASCULAR 2.3.1. Selenio y Selenoproteínas El selenio (Se) fue descubierto en 1817 por el químico sueco Jöns Jacobs Berzelius y, posteriormente, ha sido reconocido como un elemento esencial para todas las formas de vida, incluyendo los mamíferos (Lu y Holmgren, 2009). La selenometionina y selenocisteína son las principales formas orgánicas de Se encontradas en los alimentos de origen vegetal y animal, respectivamente. La ingesta de Se inorgánico, como selenato y selenito ocurre, principalmente, en forma de suplementos, y en el agua, siendo útil también como fuente nutricional en animales (Lucia y cols., 2010; Rayman, 2012). De manera general, el Se es bien absorbido por el tracto gastrointestinal (cerca del 93%) (Lucia y cols., 2010) y el contenido de Se en el organismo varía entre 10 y 20 mg, siendo inferior al 0.01% del peso corporal total (Forceville, 2001). Este nutriente es almacenado en los tejidos en concentraciones variables: el 30% del Se tisular se localiza en el hígado, el 15% en los riñones, un 30% en el músculo, un 10% en el plasma y el 15% restante se encuentra distribuido por otros órganos (Patrick, 2004). Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 47 Su biodisponibilidad depende de su absorción intestinal y de su conversión a una forma biológicamente activa, presentando las formas orgánicas del Se una mayor biodisponibilidad (Navarro-Alarcón y Cabrera Vique, 2008). Una vez ingerido, la transformación del Se a formas biológicamente activas tienen lugar mediante diferentes rutas metabólicas (Mercadal y cols., 2005). La selenometionina se incorpora al azar en lugar del aminoácido metionina, en distinas proteínas, y es transformada a selenocisteína mediante una transulfuración (Almondes y cols., 2010). La selenocisteína, en contra de la selenometionina, no se almacena de esta forma, sino que es catabolizada directamente y, el Se resultante (Selenuro) constituye otra reserva de Se. El Se es eliminado, principalmente, por excreción urinaria, sea en condiciones adecuadas de ingesta o en casos de suplementación, aunque también se produce una pérdida significativa por vía fecal, mientras que alrededor del 5% se elimina por vía cutánea y pulmonar (Lucia y cols., 2010; Castro, 2007). En la actualidad, se han identificado más de 25 selenoproteínas, todas ellas con Se en su centro catalítico, que desempeñan diversas funciones en la regulación de los procesos biológicos debido a que se expresan en tejidos y células diferentes, desempeñando numerosas acciones (Tabla 2.3.1). Dentro de estas selenoproteínas, las más conocidas y estudiadas son las enzimas antioxidantes endógenas GPxs (Rayman, 2012; Sánchez, 2009), las enzimas tioredoxinas reductasas (TrxR) que regulan numerosos procesos redox en las células, incluyendo la señalización y comunicación celular así como el metabolismo y la reparación de DNA (Maulik y Das, 2008) y las deionidasas (DIO) imprescindibles para el metabolismo de las hormonas tiroideas ya que deiodinizan estas hormonas (Schomburg y Köhrle, 2008). Por formar parte de las diferentes selenoproteínas, se le han atribuido al Se propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y antiapoptótica (Negro, 2008). Se cree que el Se está implicado en la modulación del EO, principalmente, a través de las diferentes GPxs (GPx1-GPx6) y por la selenoproteína P (Sel P), principal selenoproteína transportadora de Se en plasma, fundamentalmente, Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 48 reduciendo los niveles de la ERO H2O2 y los hidroperóxidos de lípidos y fosfolípidos de membranas celulares (Rayman, 2000). Así, la deficiencia de Se ha sido relacionada con diversas alteraciones como son el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, cáncer, infertilidad, deterioro de las funciones inmunes y tiroideas, de patologías neurodegenerativas como el Alzheimer y Parkinson, e incluso en la enfermedad alcohólica (Tinggi, 2008; Papp y cols., 2007; Johansson y cols.,1986). Tabla 2.3.1. Clasificación de las principales selenoproteínas presentes en el organismo según sus funciones. FUNCIÓN SELENOPROTEINAS Capacidad Antioxidante GPx1-GPx6, SelK, SelR, Sel W Señalización Redox TrxR1, TrxR2, TrxR3 Metabolismo Tiroideo DIO1, DIO2, DIO3 Transporte y almacenamiento Sel P Plegamiento de proteínas Sel 15, SelN, SelM, SelS Síntesis de selenofosfato SPS2 Función desconocida SelH, SElI, SelO, SelT, SelV En la presente memoria nos centraremos en el análisis de las GPxs y la Sel P por estar directamente relacionadas con el EO, principal daño biológico generado por el consumo de alcohol, especialmente en forma de BD. 2.3.1.1. Glutatión peroxidasas 2.3.1.1.1. Glutatión peroxidasa 1 La glutatión peroxidasa 1 (GPx-1) se localiza en el citosol celular y se expresa de manera ubicua (Tapiero y cols., 2003). La GPx-1 protege a las células de los fenómenos oxidativos generados por especies reactivas de oxigeno. Para ello, cataliza la reducción del H2O2 y de algunos hidroperóxidos orgánicos, utilizando el GSH como reductor, transformándolos en agua y alcoholes. Durante este proceso, el GSH es oxidado a GSSG, volviendo a su estado original por acción de la enzima GR, con el objetivo de mantener los niveles de GSH (Papp y cols., 2007). Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 49 La GPx-1 es una de las selenoproteínas mas sensibles a los cambios de Se en el organismo, presentando niveles drásticamente reducidos ante una disminución de este nanoelemento (Sunde y cols., 2009). La síntesis global de la proteína se reduce en condiciones de estrés como forma de reserva de recursos celulares y su recuperación se produce de forma más rápida que otras selenoproteínas por eso se analizan sus niveles para valorar las reservas biológicas de Se (Reeves y Hoffmann, 2009). Recientemente, esta selenoproteína ha sido relacionada con la RI, tanto por exceso como por defecto, pues afecta a la cascada de señalización de la insulina principalmente actuando sobre la proteína fosfatidilinositol-3,4,5- trisfosfato 3-fosfatasa (PTEN) y PTP1B (Lindtner y cols., 2013). 2.3.1.1.2. Glutatión peroxidasa 3 La glutatión peroxidasa 3 (GPx-3) se caracteriza por poseer una secuencia líder N-terminal y por carecer de una señal de retención en el retículo endoplasmático. Esto sugiere que la GPx-3 se sintetiza en el RE pero no se queda retenida aquí, si no que es liberada al plasma sin secuencia líder como una proteína glicosilada. Esta selenoproteína fue descrita por primera vez en el riñón, su órgano principal, desde donde es sintetizada y secretada al plasma, aunque también se ha encontrado en otros tejidos y fluidos corporales extracelulares como en el líquido de la cámara del ojo, luz coloide tiroide (Schomburg y Köhrle, 2008; Köhrle, 2005), el tejido adiposo (Maeda y cols., 1997) y líquido amniótico (Brigelius-Flohé, 1999), pulmón, músculo y corazón (Burk y cols., 2011). La GPx-3 actúa en estos tejidos en la matriz extracelular, reduciendo el H2O2 a nivel extracelular. Se ha encontrado GPx-3 en las membranas basales de células endoteliales de diferentes tejidos, como el tracto grastointestinal proveniente del plasma (Burk y cols., 2011). Junto con la Sel P, la GPx-3 representa el 97% de todo el Se en el plasma de ratones. Este hecho hace que esta selenoproteína esté asociada con el transporte Se y contribuya a la homeostasis de Se en el organismo. Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 50 La GPx-3 parece estar relacionada también de algún modo con la RI y los problemas cardiovasculares derivados, así en ratones obesos la expresión de GPx-3 disminuyó en tejido adiposo pero no en el riñón (Lee y cols., 2008). Parece que esta disminución de la síntesis de la GPx3 está mediada en los adipocitos por señales inflamatorias relacionadas con el TNFα y los lipopolisacáridos (LPS) (Lee y cols., 2008). Así mismo, también se han encontrado valores elevados de GPx-3 en el corazón de ratones diabéticos (Iwata y cols., 2006), es más, estos autores sugieren que la GPx-3 juega un papel primordial en la defensa antioxidante cardiaca frente al EO generado por la hiperglucemia. 2.3.1.1.3. Glutatión peroxidasa 4 La glutatión peroxidasa 4 (GPx-4) es una enzima esencial para la vida como se comprobó al utilizar ratones knockout GPx-4, que presentaron mortalidad embrionaria temprana (Liang y cols., 2009). Esta selenoproteína es la única GPx, y probablemente la única enzima antioxidante, que reduce de manera directa los hidroperóxidos de fosfolípidos en las membranas celulares y lipoproteínas (Brigelius-Flohé y Kipp, 2009). Debido a esta función biológica, la GPx-4 se encuentra íntimamente asociada a la membrana celular y mitocondrial, protegiendo específicamente a este orgánulo. De hecho esta selenoproteína se encuentra en la parte alta de la jerarquía de selenoproteínas frente a los depósitos de Se, disminuyendo su síntesis solo cuando los niveles de Se están muy deplecionados. Se ha comprobado que la sobreexpresión de esta enzima disminuye la activación del NF-ĸB en una diversidad de células sometidas a diferentes estímulos, lo que pone de manifiesto, aún más, su importancia como mediador en los procesos inflamatorios y antiapoptótico (Brigelius-Flohé y Kipp, 2009). Además, por amortiguación de la vía de señalización del NF-ĸB, la GPx-4 reduce la expresión de la metaloproteinasa 1 de la matriz, la cual se sobreexpresa durante los periodos de invasión y metástasis de diversos tumores (Ufer y Wang, 2011). Por otro lado, la GPx-4 se expresa de manera elevada en los testículos de mamíferos, existiendo estudios que correlacionan la infertilidad masculina Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 51 con una depleción de los niveles de GPx-4 (Foresta y cols., 2002; Imai y cols., 2001). Estando también implicada en la maduración de los espermatozoides, y por lo tanto, en la fertilidad masculina. Es el componente estructural principal de la cápsula espermática mitocondrial y juega un papel preponderante en la condensación de la cromatina espermática, al actuar como tiol de proteínas (Conrad y cols., 2005). 2.3.1.1.4. Selenoproteína P La selenoproteína P (Sel P) es una proteína de gran importancia muy abundante en el plasma y, se produce y libera en el hígado, siendo con la GPx- 1y GPx-4, las selenoproteínas más abundantes en el hígado. Esta proteína también se expresa en otros tejidos como corazón, riñón, testículos, cerebro, sistema digestivo y está asociada a células endoteliales (Moschos, 2000). La Sel P tiene dos propiedades importantes debido a que actúa como transportador de Se a los tejidos periféricos, ya que contiene un alto porcentaje del Se total del plasma, entorno un 60-70% (Combs, 2015) pues contiene 10 residuos de Se-Cys en su estructura y, además, actúa como antioxidante extracelular asociada al endotelio vascular (Saito y cols., 2004) que inhibe la actividad de los RL como el peroxinitrito e hidroperóxidos actuando en asociación con el GSH o la tiorredoxina (Andoh y cols., 2005). Recientemente, se ha identificado a la Sel P como una hepatokina que produce RI y altera el metabolismo de la glucosa en el hígado y el músculo esquelético en humanos asociada a la proteína mediadora de la homeostasis energética AMPk y el metabolismo energético (Misu y cols., 2010). Como ya se ha comentado, la biosíntesis de las selenoproteínas está organizada jerárquicamente, aunque no siguen una regla establecida, ya que las selenoproteínas no responden igual a la suplementación de Se y la demanda por parte de los órganos no es la misma. Pero si se establece una jerarquía en función de su actividad respecto a los niveles de Se existentes. Por lo tanto, si existe una deficiencia de Se no pueden expresarse todas las selenoproteínas a la vez, así que, se produce una regulación en la síntesis de algunas de ellas, mientras que aquellas selenoproteínas que realizan funciones más importantes, mantienen niveles altos de expresión (Brigelius-Flohé y Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 52 Flohé, 2016; Burk y Hill, 2015). Así las GPx-1 y GPx-3 ocupan el lugar más bajo en esta jerarquía, la GPx-4 depende del tejido en el que se encuentre se sintetiza en primer o segundo lugar. Este hecho lo confirman Barnes y cols., 2009 que demostraron que la deficiencia de Se produce una rápida disminución de los mRNA de la GPx-1 en riñón, hígado y músculo, así como de la GPx-3 en plasma. Sin embargo, la GPx-4 se sintetiza en primer lugar incluso cuando hay una deficiencia severa de Se, ya que esta selenoproteína es esencial para la vida, encontrándose, como hemos comentado anteriormente, en los niveles, más altos de la jerarquía (Burk y Hill, 2015). Por otro lado, la Sel P también se encuentra dentro de los primeros puestos ya que su expresión permanece incluso en condiciones de deficiencias severas (Burk y Hill, 2005). También hay que tener en cuenta que bajo condiciones selenodeficientes, el cerebro, los testículos y el tiroides se mantienen cerca de los niveles normales de Se, mientras que otros tejidos como el hígado, el pulmón y los pertenecientes al sistema inmune, muestran una bajada significante de Se así como de la síntesis de selenoproteínas (Brigelius-Flohé y Flohé, 2016). A este hecho habría que unir, que las distintas selenoproteínas no se sintetizan por igual en los diferentes tejidos. Por todo ello es necesario valorar la expresión de las distintas selenoproteínas individualmente en cada tejido. 2.3.2. Selenio y sistema cardiovascular El Se, como se ha comentado anteriormente, es un elemento traza con capacidad antioxidante ya que es parte esencial de las selenoproteínas GPxs, Sel P y las TrxRs con capacidad de detoxificar las EROs en los espacios intracelulares y extracelulares así como participa en la destrucción del peróxidos hidrogeno y de los hidroperóxidos orgánico, ayudando a mantener la integridad de las membranas celulares, protegiendo del daño oxidativo a biomoléculas como los lípidos, las lipoproteínas y el DNA, y reduciendo la agregación plaquetaria y la acumulación de LDL oxidadas en la pared de las arterias (Aaron y Hoffmann., 2015; Rayman, 2000). Además, mantener unos niveles adecuados de Se es importante para la síntesis de prostaciclinas, ya que se ha observado que en estados deficitarios, la acumulación de Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 53 hidroperóxidos inhibe la producción de esta sustancia vasodilatadora en el endotelio, y, además estimula la producción de tromboxano, que está asociado a la vasocontricción y la agregación plaquetaría (Rayman, 2000). Actualmente, se sabe que el Se está implicado en la etiología de la enfermedad cardiovascular y, en los últimos años, se ha despertado un gran interés en el papel que juega el Se en el sistema cardiovascular, por lo que ha aumentado la investigación experimental con objeto de conocer con mas detalles los mecanismos de acción a nivel cardiovascular y el posible potencial de Se en los tratamientos y prevención de estas enfermedades. Estudios previos experimentales y clínicos han demostrado que los niveles de Se y la enfermedad cardiovascular están relacionados. La incidencia de enfermedad cardiaca se correlaciona negativamente con los niveles de Se en sangre y el nivel de Se es un importante indicador para la determinación de la enfermedad cardiaca (Benstoem y cols., 2015; Vinceti y cols., 2014). La primera evidencia de que los niveles bajos de Se afectan a enfermedades cardiovasculares en humanos surgen tras la enfermedad de Keshan, una enfermedad cardiaca la cual es caracterizada por necrosis y calcificación del miocardio (Mchuron y cols., 2014; Xu y cols., 1997). Esta enfermedad es propia de una región de China donde el suelo tiene déficit de Se (Xu y cols., 1997; Li y cols., 1985). La deficiencia de Se se consideró como factor etiológico de esta enfermedad desde su descubrimiento en 1935, aunque posteriormente se consideró como un factor predisponente más que como un factor causal del desarrollo de esta cardiopatía (Beck y cols., 2003). 2.3.2.1. Selenio y corazón A nivel cardiaco, estudios previos demuestran que la lesión mitocondrial es el primer resultado del daño causado por la disminución de los niveles de Se en los cardiomiocitos. El déficit de Se se refleja en el daño de la membrana mitocondrial, la generación de ERO y la elevación de la oxidación lipídica que finalmente lleva a la apoptosis de los cardiomiocitos (Esteve y cols., 2014). Así, la importancia de los niveles adecuados de Se en la enfermedad cardiaca se debe principalmente a su efecto antioxidante, mediadas por GPx-1, GPx-3 y GPx-4. Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 54 La GPx-1 representa el papel más importante en el sistema cardiovascular debido a que es imprescindible para detoxificar intracelularmente las EROs de los cardiomiocitos. Además, una deficiencia de esta enzima conlleva a la disfunción endotelial, que a su vez produce anomalías estructurales significativas en los tejidos vasculares y cardiacos (Forgione y cols., 2002). También, protege al organismo de la isquemia producida por el daño oxidativo que provocan las EROs. Este hecho se constata en estudios con ratones transgénicos con sobreexpresión de GPx-1 que son más resistentes al infarto de miocardio, mientras que los ratones no transgénicos presentan una mayor suceptibilidad a sufrir daños vasculares (Maulik y cols., 1999; Yoshida y cols., 1997). La GPx-3 también protege del EO debido a la capacidad de neutralizar las EROs en los espacios extracelulares, por lo tanto, es una enzima importante para proteger a la matriz extracelular cardiaca y es efectiva contra accidentes vasculares. Destaca un estudio en el cual se muestra un papel de la GPx-3 en la regulación de la biodisponibilidad de NO producido a partir de plaquetas y células vasculares. Cuando disminuyen los niveles de esta enzima antioxidante aumenta la hiperreactividad de las plaquetas y el riesgo de sufrir trombosis (Freedman y cols., 1995). Además, parece ser que la GPx-3 juega un papel importante frente al daño oxidativo provocado en el tejido cardíaco por el EO generado por la hiperglucemia (Iwata y cols., 2006). La GPx-4 está involucrada en la reducción de los hidroperóxidos de fosfolípidos y colesterol unidos a la membrana plasmática y de diferentes orgánulos, entre ellos la mitocondria. Evitando así la peroxidación lipídica que incrementa el número de EROs que producen hipertrofia en los miocardiocitos (Hollander y cols., 2003). Al proteger a la mitocondria, disminuye la liberación de citocromo c por ésta y evita la cascada de señalización endógena apoptótica. Pero además, la GPx-4 contribuye directamente a remover distintos mediadores de la cascada de señalización de la apoptosis (Brigelius-Flohé, 2017). La GPx-4 también está inversamente relacionada con la activación de NF-κB en los cardiomiocitos, lo que hace que tenga funciones antiinflamatorias y antifibrótica sobre el corazón, evitando la hipertrofia cardiaca (Rose y Hoffmann, 2015). Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 55 Figura 2.3.2.1. Esquema de las principales selenoproteínas cardiacas. Imagen modificada de Rose y Hoffmann, 2015 Por otro lado, los canales de K+ y la apoptosis están íntimamente relacionados. Así la pérdida de iones de K+ promueve la apoptosis de células normales y conduce a la aparición y agravamiento de la enfermedad cardiaca (Molina y cols., 2015).Se sabe que los niveles bajos de Se afectan a los canales de K+ disminuyéndolos y a la expresión mitocondrial del transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) relacionado con el funcionamiento de la mitocondria (Koc y cols., 2016). Zhang y cols., 2017 encontraron que los niveles bajos de Se en los cardiomiocitos disminuye los canales de K+, la actividad de STAT3 y la función mitocondrial promoviendo la apoptosis. Por ello, los depósitos de Se en el corazón no deben estar deplecionados para que este órgano actúe eficazmente. Así, Liu y cols., 2013 encontraron que la toxicidad cardíaca generada por la adriamicina disminuye al suministrar una suplementación de Se, pues restauraba la actividad cardíaca de la GPx y la expresión cardíaca de los canales de K+. Localización Reacción catalizada Función en el SCV Citoplasma de cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales Espacio extracelular del tejido cardiaco y vasos Citoplasma, núcleo y mitocondria de cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales Elimina H2O2 protegiendo a lípidos, proteínas y DNA del EO.También protege del EO en isquemia DetoxificaEROs, protegiendo la matriz extracelular en el corazón, así como, plaquetas y células vasculares Detoxifica lípidos hidroperóxidos en la membrana plasmática y en la membrana de organúloscelulares en condiciones basales y en condiciones de EO como isquemia, hipertrofia y otras Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 62 de sodio). Tras esta suplementación se observó una mejora en la absorción y retención de Se en el organismo de las madres y también en el de las crías. En las crías recién nacidas mejora la biodisponibilidad de Se e incluso mejorar su estado nutricional (Figura 2.3.3) (Nogales y cols., 2011). También se encontró que la suplementación con Se tiene implicaciones antioxidantes en el hígado y en el riñón mejorando la actividad de la GPx y la función hepática (Ojeda y cols., 2012). Figura 2.3.3. Distribución de Se tisular y en suero en madres lactantes, crías recién nacidas y crías lactantes expuestas a un consumo crónico de alcohol y el efecto de la suplementación con Se. Tabla modificada de Ojeda y cols., 2017 Estudios en ratas adolescentes con patrón de consumo BD. Se ha confirmado que el consumo agudo en atracón repetido de alcohol en ratas adolescentes con 28 días de edad a las cuales se les administra intraperitonealmente alcohol (3 g/Kg/d) en suero salino fisiológico (20% v/v) tres días a la semana durante tres semanas, disminuyen los niveles séricos de Se (Ojeda y cols., 2015). En este trabajo se demuestra, por primera vez, que el BD produce una depleción severa en los depósitos hepáticos de Se que están MADRES LACTANTES •Ingesta sólida y peso corporal •Retención de Se •Contenido Se leche •Alteración de la distribución Se: : hígado, corazón y bazo; : músculo, y glándulas mamarias •actividad sérica GPx CRÍAS RECIÉN NACIDAS •Peso corporal •Longitud cráneo-caudal •Índice gestacional •Índice de superviviencia CRÍAS LACTANTES •Ingesta de leche •Peso corporal y longuitud c-c •Retención Se •Dépositostisulares Se •SUERO: Niveles Se y actividad GPx •HÍGADO: Se, actividad GPx oxidación proteínas; GPx1 yexpresiónGPx4 y SelP •RIÑÓN: Se, actividad GPx,  oxidación de lípidos y proteínas Et- OH •Ingesta sólida y peso corporal •Retención de Se •Contenido Se leche •Distribución tisular Se •Se en suero y actividad GPx Administración oral durante el periodo de inducción, gestación y lactancia (20% v/v) SuplementaciónSe en crías durante gestación y lactancia (0,5p.p.m. SS) •Peso corporal •Longitud cráneo-caudal •Índice gestacional •Índice de superviviencia •Ingesta de leche •Peso corporal y longuitud c-c •Retención Se •Dépositostisulares Se •SUERO: Niveles Se y actividad GPx •HÍGADO: Se, actividad GPx,oxidaciónprtoeínasGPx1 y= expresión GPx4 y SelP •RIÑÓN: Se, actividad GPx,  oxidación de lípidos y proteínas Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 63 relacionados directamente con una disminución de la actividad de la GPx-3 sérica y GPx-1 hepática, que contribuye al desequilibrio oxidativo generado por el BD. Por otro lado, la disminución de los depósitos de Se en el hígado afecta a la expresión de la GPx-1 y GPx-4. Este hecho podría estar relacionado con la menor expresión del factor transcripcional NF-κB en el hígado, una pieza clave en la regulación de los procesos inflamatorios. Posteriormente Ojeda y cols., 2017a comprobaron que los depósitos de Se tisulares estaban también deplecionados en el corazón y riñón de ratas adolescentes sometidas a BD, indicando que durante el consumo agudo y repetido de etanol, el organismo consume grandes cantidades tisulares de Se, probablemente porque necesita sintetizar grandes cantidades de GPx in situ para luchar contra el EO generado por el consumo agudo de alcohol. En este mismo trabajo se suplementó con Se en agua de bebida a los roedores siguiendo el modelo experimental anteriormente mencionado y, se observó que la suplementación es efectiva ya que aumenta la expresión GPx-1 y GPx-4 y evita la disminución de NF-kB y el incremento de los niveles caspasa-3, lo cual conduce a un mejor perfil hepático oxidativo, inflamatorio y apoptótico. Por lo tanto, se puede considerar que la terapia propuesta, la suplementación dietética con Se, tiene una gran eficacia biológica y es adecuada para los adolescentes que llevan a cabo un patrón de consumo agudo con el fin de evitar futuras complicaciones hepáticas (Ojeda y cols., 2017a) Antecedentes bibliográficos Paula Sobrino Calero 64 OBJETIVOS Objetivos Paula Sobrino Calero 67 3. OBJETIVOS Actualmente, el consumo agudo de alcohol tipo BD entre los adolescentes está en auge, siendo una situación de interés y de alarma social, ya que los adolescentes constituyen un grupo de población especialmente vulnerable. Este patrón agudo de consumo produce efectos nocivos sobre la salud debida, en parte, al metabolismo oxidativo de esta droga que genera un aumento en la producción de EROs, produciendo EO y daño celular. La mayoría de los estudios realizados hasta la fecha se han centrado en los efectos que ejerce el alcohol en forma de atracón sobre el SNC de los adolescentes, pero recientemente también se ha demostrado, clínicamente, que el hígado está especialmente comprometido por el consumo de alcohol en estos individuos. Así, se ha puesto de manifiesto en ratas adolescentes tras BD, que el alcohol a través de la ADH y especialmente de la SMOE genera grandes cantidades de EO y consume cantidades importantes de GSH, lo que compromete especialmente la actividad de la GPx. Por otro lado, este grupo de investigación ha demostrado recientemente, que este patrón de consumo en adolescentes altera específicamente la homeostasis de Se, disminuyendo la concentración de este micronutriente en el hígado y suero, comprometiendo, aún más la actividad de la selenoproteina GPx hepática y generando un desequilibrio en la actividad del resto de las enzimas antioxidantes. Suplementar dietéticamente con Se a este colectivo actúa beneficiosamente sobre el hígado, protegiendo a los hepatocitos del daño oxidativo, a través de la GPx. Además de provocar cambios bioquímicos a nivel sistémico relacionados, en parte, con las alteraciones hepáticas, el consumo agudo de alcohol también se relaciona con un desequilibrio metabólico como la RI e hígado graso, afectando a la funcionalidad del sistema cardiovascular. Se reconoce una relación directa entre el BD y la aparición de arritmias e hipertensión, sin embargo los mecanismos por los cuales se desencadenan no se conocen con exactitud. Entre los mecanismos que cobran más peso están el Objetivos Paula Sobrino Calero 68 EO generado, o la estimulación del SNS y SRAA, entrando también en juego el riñón y el balance electrolítico. Por todo ello, el objetivo principal de este estudio es evaluar, por primera vez, los cambios sobre el balance oxidativo que genera el BD repetido en ratas adolescentes sobre el sistema cardiovascular y renal. Como objetivos específicos, se estudiarán en corazón, suero y riñón, los depósitos de Se, la actividad GPx, la expresión de las principales selenoproteínas antioxidantes GPx-1, GPx-3, GPx-4 y Sel P, y su relación con diversos eventos moleculares como la estimulación del factor clave en la inflamación NF-κB y de la apoptosis a través de la caspasa-3, así como su relación con marcadores de daño endotelial. Además se analizarán diversos parámetros funcionales cardíacos y vasculares como la frecuencia cardíaca y la presión arterial, y renales como la tasa de filtración glomerular, los niveles de aldosterona y el balance hídricosalino entre otros, con el fin de encontrar relación con los cambios moleculares encontrados. Para constatar el papel que en todo ello juega el Se, el segundo objetivo planteado es la suplementación con éste micronutriente, con el fin de valorar si la suplementación con Se es una posible estrategia a tener en cuenta para amortiguar los cambios cardiovasculares y renales que genera el consumo de alcohol en forma de BD durante la adolescencia, analizándose de nuevo todos los parámetros anteriormente citados MATERIAL Y MÉTODOS Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 71 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 4.1.1. Animales y condiciones de experimentación Para la realización de este trabajo se utilizaron 32 machos adolescentes de la raza Wistar procedentes del Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. Estas ratas se recibieron con 21 días de edad y se alojaron en jaulas de plástico, con libre acceso a la comida y a la bebida. Las jaulas se ubicaron en el animalario de la Facultad de Farmacia, bajo condiciones controladas de luz (Ciclo de luz: 7:00 h mañana - 19:00 h tarde) y temperatura (22ºC). A los 28 días de edad, tras comenzar el periodo de la adolescencia, los animales se distribuyeron, de forma aleatoria, en cuatro grupos experimentales (n=8) denominados: Grupo control intraperitoneal (CI), grupo alcohol intraperitoneal (AI), grupo control intraperitoneal Se (CISe), grupo alcohol intraperitoneal Se (AISe). Las condiciones experimentales de cada grupo fueron:  CI: alimentado ad libitum con dieta base (0.23 ppm Se) y agua y, recibiendo, en los días correspondientes, una inyección intraperitoneal de solución salina.  Al: alimentado ad libitum con dieta base (0.23 ppm Se) y agua y, recibiendo, en los días correspondientes, una inyección intraperitoneal de etanol (3 g/Kg).  CISe: alimentado ad libitum con dieta base (0.23 ppm) y agua suplementada con Se (0.3 ppm Se), y, recibiendo, en los días correspondientes, una inyección intraperitoneal de solución salina.  AlSe: alimentado ad libitum con dieta base (0.23 ppm) y agua suplementada con Se (0.3 ppm Se), y, recibiendo, en los días correspondientes, una inyección intraperitoneal de etanol (3 g/Kg). Loa tratamientos se realizaron de acuerdo a los protocolos de manejo, cuidado y sacrificio de los animales, aprobado previamente por el Comité de Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 78 se acopla a la reacción que cataliza la glutatión reductasa (GR), midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm como consecuencia de la oxidación del NADPH. Los reactivos empleados en este método son: Tampón fosfato potásico (TPK) (pH = 7,4 a 4ºC), 250 mM ; Solución EDTA (en tampón TPK) (SIGMA), 10 mM; Solución azida (NaN3) (SIGMA), 10 mM; Solución NADPH (en NaHCO3 al 0,75% p/v) (SIGMA), 2 mM; Solución GR (en tampón TPK) (SIGMA), 10 U; Solución peróxido de hidrógeno (FORET), 2,5 mM y Solución glutatión reducido (SIGMA), 10 mM. Procedimiento: En una microcubeta de 1.5 mL de capacidad, se añaden 300 µL de TPK, 100 µL de EDTA, 100 µL de NaN3, 100 µL de NADPH, 100 µL de GSH, 100 µL de GR y 100µL de suero diluido en agua bidestilada (dilución 1/10) en ratas o 100 µl de homogeneizado de corazón de ratas (dilución 1/40) o 150 µl de homogeneizado de riñón de ratas (dilución 1/200). Después de incubar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente, se inicia la reacción con la adicción de 100 µL de H2O2 y se determina la actividad GPx siguiendo espectrofotométricamente la disminución de la absorbancia a 340 nm durante 3 minutos. Las muestras problema se midieron frente al blanco, que se trató de la misma manera y que contenían agua bidestilada (200 µL) en lugar de peróxido hidrógeno, para evitar el comienzo de la reacción. Cálculos: La actividad de la enzima GPx se calcula según la fórmula: mU/mg proteína = [ΔA(min) · Vf · 103 / ε · d · Vm · C] · D 2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ GR GPx Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 79 Donde: mU = nmol/minuto, ΔA(min) = incremento de absorbancia de la muestra por minuto, valor absoluto, Vf = volumen final en ml en la microcubeta, ε = coeficiente de absorción para el NADPH, cuyo valor es 6,22 mM-1 cm-1, d = paso de luz de la cubeta, 1 cm, Vm = volumen de muestra (homogeneizado diluido) en mL en la cubeta, C = concentración de proteínas de la muestra (mg proteína/mL), D = dilución del homogeneizado. 4.5.1.4. Actividad de la glutatión reductasa Fundamento: La glutatión reductasa (GR) es una enzima dependiente de nicotinamín adenín fosfato reducido (NADPH), que cataliza la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH). La determinación de la actividad GR se realizó según el método espectrofotométrico descrito por Worthington y Rosemeyer (1974) ligeramente modificado, donde se mide la disminución de absorbancia a 340 nm debida a la oxidación del NADPH. Los reactivos utilizados fueron: Tampón fosfato potásico (TPK) (pH = 7,4 a 4ºC), 0,066 M; Solución cloruro potásico (ACOFARMA), 2 M; Solución EDTA (en tampón TPK) (SIGMA), 10 mM; Solución glutatión oxidado GSSG (SIGMA), 10 mM y Solución NADPH (en NaHCO3 al 0,1% p/v) (SIGMA), 1 mM. Procedimiento: Para la determinación en homogeneizado de corazón y riñón de ratas, se añadieron en una microcubeta: 590 µL de tampón fosfato, 100 µL de KCl, 100 µL de EDTA, 100 µL de GSSG y 100 µL de NADPH. Después de 2 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción se inició adicionando 10 µL de homogeneizado puro, y se aguardó la disminución de absorbancia a 340 nm durante 3 minutos. Todas las muestras problema se midieron frente al blanco, que se preparó de la misma manera aunque contenía TPK en lugar del homogeneizado. Cálculos: La actividad de la enzima GR se obtiene por el siguiente cálculo: mU/mg = [ΔA(min) · Vf · 103 /  · d · Vm · C] Donde: mU = nmol/minuto, ΔA (min) = incremento de absorbancia de la muestra por minuto, valor absoluto, Vf = volumen final en ml en la microcubeta, = coeficiente de absorción para el NADPH, cuyo Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 80 valor es 6.22 mM-1 cm-1, d = paso de luz de la cubeta, 1 cm, Vm = volumen de muestra (homogeneizado) en ml en la cubeta, C = concentración de proteínas de la muestra (mg proteína/ml). 4.5.1.5. Actividad de la superóxido dismutasa Fundamento: La enzima superóxido dismutasa (SOD) está encargada de la formación de H2O2 y O2 a partir del radical superóxido (O2ˉ). 2 O2-. + 2 H+ H2O2 + O2 La actividad SOD se ensaya siguiendo el método descrito por Fridovich (1985), parcialmente modificado, en el que se utiliza el sistema xantina/xantina oxidasa para generar radicales superóxido (O2ˉ). El radical superóxido es capaz de reducir el citocromo c y esta reducción es inhibida por la enzima SOD, que compite por los radicales superóxidos y los “secuestra” llevando a cabo su dismutación. Por ello, según este método, el grado de inhibición en la reacción de reducción del citocromo c es un indicador de la actividad de la SOD. Los reactivos utilizados fueron: Tampón fosfato potásico (TPK) K2HPO4 / KH2 PO4 (pH = 7,8 a 4ºC) c/DTPA, 0,066 M; Solución xantina (SIGMA), 0,5 mM; Solución citocromo c (SIGMA), 100 µM; Solución cianuro sódico (NaCN) (PANREAC), 0,5 mM; Solución catalasa (SIGMA), 10 U y Solución xantina oxidasa (SIGMA), 25 U. Procedimiento: En una microcubeta se depositaron todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción, excepto la xantina oxidasa: 490 µL de TPK, 200 µL de xantina, 200 µL de citocromo c, 100 µL de NaCN, 100 µL de catalasa y 10 µL de muestra (suero/hígado). A continuación, se inició la reacción adicionando 10 µL de xantina oxidasa, y se observó el aumento de absorbancia a 550 nm durante 3 minutos, debido a la reducción del citocromo c. Para medir la reducción neta del citocromo c (es decir, en ausencia de SOD), se realizó una medida de referencia que se procesó de la misma forma pero no contenía muestra, de forma que se produjo la reducción del citocromo Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 81 c debida a la acción de los radicales superóxidos formados por el sistema xantina/xantina oxidasa. En las muestras, como se ha explicado anteriormente, la SOD compite con el citocromo c por los radicales superóxido, de forma que hubo una inhibición de la reducción del mismo. Se definió una unidad (U) de SOD como la cantidad de enzima que produce la inhibición de un 50 % de la reducción del citocromo c. Las muestras problema se midieron frente a su blanco de muestra, que se procesó de la misma forma pero la reacción no se inició con la adición de xantina oxidasa. Cálculos: Los resultados se expresan en U/mg proteína y se calculan según las siguientes expresiones: % inhibición = 100-[(∆Amuestra/min · 100)/ ∆Areferencia/min] U/mg proteína = % inhibición / (50 · c) Donde: ∆A = incremento de absorbancia y c = mg de proteína presente en la muestra. 4.5.1.6. Actividad de la catalasa Fundamento: La catalasa (CAT) es una enzima altamente activa que cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) a agua. H2O2 + H2O2 2 H2O2 + O2 Su determinación se llevó a cabo por el método descrito por Beers y Sizer (1952), en el cual la disminución de absorbancia debida a la desaparición de H2O2 es medida espectrofotométricamente a 240 nm. Los reactivos utilizados fueron: Tampón fosfato potásico (TPK) (pH= 7,4 a 4ºC), 0,066 M y Solución peróxido de hidrógeno (H2O2) (FORET), 1/100 v/v. Procedimiento: En una cubeta macro de cuarzo con un paso de luz de 1 cm, se añadió 2 mL de TPK y 120 µL de muestra (homogeneizado de corazón y riñón diluido en agua bidestilada 1/120). Posteriormente, se inició la reacción CAT Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 82 añadiendo 480 µL de H2O2 y se midió la disminución de absorbancia, debida a la reducción del peróxido de hidrógeno, a 240 nm durante 3 minutos. La medida se realizó frente al aire. Cálculos: La actividad de la enzima presente en la muestra se calcula según la fórmula: mU/mg proteína = [ΔA(min) · Vf / ε · d · Vm · C] · D Donde: U = µmol/minuto, ∆A(min) = incremento de absorbancia de la muestra por minuto, valor absoluto, Vf = volumen final en mL en la cubeta, ε = coeficiente de extinción molar de H2O2 (ε = 0.0394 mM-1 cm-1), d = paso de luz de la cubeta, 1 cm, Vm = volumen de muestra en la cubeta en ml, C = concentración de proteínas de la muestra (mg proteína/ml), D = dilución de homogeneizado. 4.5.1.7. Peroxidación lipídica Fundamento: Uno de los métodos más utilizados para evaluar la peroxidación lipídica es la cuantificación de malondialdehído (MDA) por medio de su reacción con el ácido tiobarbitúrico (TBA). El MDA es un producto final de la degradación oxidativa de los lípidos que, en condiciones de bajo pH y temperatura elevada, participa fácilmente en una reacción de adición nucleófila con el TBA, generando un pigmento rojo fluorescente (compuesto por una molécula de MDA y dos de TBA) que puede ser determinado por espectrofotometría. Para la determinación del MDA seguimos el método descrito por Beers y Sizer (1952), en el cual se valora espectrofotométricamente a 535 nm el aducto de color rojo formado al reaccionar el MDA con el TBA. Los reactivos usados para la determinación de la peroxidación lipídica fueron: Solución ácido tricloroacético (TCA) (MERCK), 20% p/v y Solución ácido tiobarbitúrico (TBA) (SIGMA) al 0,67% p/v. Procedimiento: En el interior de tubos eppendorf con tapón de seguridad, una alícuota de 150 µl de suero o homogeneizado de corazón y riñón se mezcló con un volumen igual de ácido tricloroacético (TCA) y se centrifugó durante 10 Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 83 minutos a 14000 g y 4ºC para precipitar las proteínas. Del sobrenadante que resultó, se tomó una alícuota (150 µl) y se añadió una parte igual de TBA al 0,67%, incubando la mezcla en un baño de agua hirviendo (100ºC) durante 10 minutos. Pasado este tiempo, se bajó la temperatura introduciendo los tubos en hielo y se midió la absorbancia de la muestra frente al blanco a 535nm. El blanco se procesó igual que una muestra pero contenía una alícuota de agua bidestilada en lugar de suero. Cálculos: La concentración de MDA presente en las muestras se calculó a través de la expresión: A = ε · C · d Donde: A = absorbancia de la muestra, ε = coeficiente de extinción molar para el MDA a 535 nm (ε = 153.10-3 ml/mol.cm), C = concentración de MDA en la muestra (mol/ml), d = paso de luz de la cubeta (1 cm). Los resultados se expresaron en moles de MDA formados/mg proteína en los 10 minutos de incubación. 4.5.1.8. Oxidación de proteínas Fundamento: La oxidación de proteínas provoca un aumento de los grupos carbonilos en éstas. La 2,4-dinitrofenilhidrazina se une a estos grupos para formar 2,4-dinitrofenilhidrazona, un complejo coloreado que absorbe a una longitud de onda de 366 nm (Reznick y Packer, 1994). Los reactivos utilizados para esta determinación fueron: Tampón fosfato potásico (TPK) (pH= 7,0 a 4ºC), 10 mM; Solución dodecil sulfato de sodio (SDS) (SIGMA), 24% p/v; Solución de dinitrofenilhidrazina (DNPH) (en HCL) (ACOFARMA), 10 mM; Solución TCA (MERCK), 20% p/v; Solución de etanol/acetato de etilo, 1/1 v/v y Solución guanidina en ácido fórmico (diluido en agua bidestilada 1/1 v/v), 6 M. Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 84 Procedimiento: A partir del suero o del homogeneizado de corazón y riñón se prepararon 300 µL de muestra que contenían aproximadamente una concentración de 5 mg proteína/mL. Para ello, una alícuota de suero u homogeneizado (125 µL) se mezcló con un volumen igual de SDS al 24% para solubilizar las proteínas, y se completó con TPK hasta alcanzar el volumen final deseado. La muestra se incubó durante 3 minutos en baño de agua a 100ºC y, posteriormente, se enfrió en hielo. A continuación, a los 300 µL de muestra se le añadieron 300 µL de DNPH y la mezcla se incubó a temperatura ambiente (25ºC) durante 1 hora, agitando cada 15 minutos. Pasado este tiempo, se añadió 300 µL de TCA y se centrifugó la mezcla 3 minutos a 11000 g y 4ºC. Tras desechar el sobrenadante, el precipitado obtenido se lavó tres veces con 1 mL de la solución de etanol/acetato de etilo, centrifugando (3 minutos, 11000 g, 4ºC) después de cada lavado y desechando el sobrenadante tras la centrifugación. Por último, el precipitado final se resuspendió en 600 µL de guanidina 6 M y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante toda la noche. Al día siguiente, la muestra se centrifugó a 11000 g, 4ºC durante 3 minutos y se midió la absorbancia del sobrenadante frente al blanco (solución de guanidina) a 366 nm. Cálculos: La concentración de los grupos carbonilos presente en la muestra se calculó a través de la expresión: A = ε · C · d Donde: A = absorbancia de la muestra, ε = coeficiente de extinción molar para la 2,4- dinitrofenilhidrazona (ε = 21000 M-1 cm-1), C = concentración de grupos carbonilos en la muestra (mol/L), d = paso de luz de la cubeta (1 cm). Los resultados se expresaron en nmoles de grupos carbonilos formados/mg proteína. Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 85 4.5.2. Análisis de la expresión de proteínas cardÍacas y renales 4.5.2.1. Homogenización tisular para Wester Blotting El corazón y riñón se homogeneizaron en tampón fosfato preparado en una dilución 1:10 p/v con los siguientes reactivos: K2HPO4 (PANREAC), 50mM; KH2 PO4 (PANREAC), 50mM y EDTA (SIGMA), 0,01mM. Previamente, un inhibidor de proteasas (Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets, ROCHE) fue añadido al tampón fosfato en la proporción 1/10. Por último, el homogeneizado obtenido se centrifugó a 2000 g. durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante final se dividió en alícuotas y se congeló a - 80ºC hasta llevar a cabo la determinación de proteínas totales y la inmunodetección de proteínas. 4.5.2.2. Características generales de los anticuerpos Los niveles de expresión de la GPx-1, GPx-3 GPx-4 ,Sel P, NF-κB y caspasa-3 fueron determinados por medio de la técnica de inmunodetección de proteínas o Western Blotting por el método de Laemmli (1970), que se utiliza para identificar y localizar proteínas en base a su capacidad para unirse a anticuerpos específicos, además de proporcionar información acerca del tamaño de la proteína de interés mediante la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma. Este proceso es necesario ya que todas estas macromoléculas están embebidas dentro de la matriz que forma el gel, lo que imposibilita realizar su detección, mientras que en la membrana, se encuentran accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma. En la Tabla 4.5.2.2 se encuentran las características de los anticuerpos y las diluciones usadas en cada determinación: Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 86 Tabla 4.5.2.2. Características de los anticuerpos usados en la Inmunodetección. Anticuerpo Clasificación y peso molecular Dilución Variante Referencia comercial GPx 1 Primario (23 kDa) 1:2.000 IgG policlonal en conejo (SC-30147) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY GPx 3 Primario (23 kDa) 1:2.000 IgG policlonal en conejo (SC-50496) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY GPx 4 Primario (21 kDa) 1:5.000 IgG policlonal en conejo (SC-50497) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY Sel P Primario (57 kDa) 1:2.500 IgG policlonal en conejo (SC-30162) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY NF-κB Primario (65 kDa) 1:1.000 IgG policlonal en conejo (SC-372) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY Caspasa-3 Primario (19 kDa) 1:1.000 IgG policlonal en conejo (Asp 175) CELL SIGNALING TECHNOLOGY Anti-rabbit IgG Secundario GPx1- 1:5.000 GPx3- 1:5.000 GPx4-1:10.000 Sel P-1:5.000 NF-Κb-1 :2.500 Caspasa-1:2.500 Anti-IgG en conejo (SC-2030) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY Anti-β- Actina (Mouse IgG1) Primario (42 kDa) 1:20.000 IgG1 monoclonal en ratón (A5441) SIGMA Anti-Mouse IgG1 Secundario 1:8.000 Anti-IgG1 monoclonal en ratón (A9044) SIGMA Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 87 4.5.2.3. Electroforesis en gel de poliacrilamida con sds: sds-page Fundamento: La separación de las proteínas según su masa molecular se efectuó por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se obtienen por la polimerización de moléculas de acrilamida y N,N´-metilén-bisacrilamida, disueltas en un tampón adecuado. Para ello, requieren la acción de un polimerizador como el persulfato amónico (APS), que al disolverse en agua induce la formación de diversos radicales libres en la acrilamida, favoreciendo de esta manera su polimerización. La gelificación se consigue mediante la formación de enlaces cruzados en presencia de la bisacrilamida. Así se obtiene una malla de cadenas de poliacrilamida. A este proceso de polimerización también se añade un estabilizador de los radicales libres, el tetrametilén diamina (TEMED). La separación de proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) se realiza en función de su carga y de su forma, dependiendo esta última del plegamiento de la proteína. Los detergentes desnaturalizan las proteínas, rompiendo el plegamiento y consiguen que todas las proteínas presenten la misma forma y también una densidad de carga muy similar. El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente que se une en una proporción de aproximadamente 1,4 g de SDS por 1 g de proteína, lo que proporciona una relación carga/masa muy uniforme para la mayor parte de las proteínas. El tratamiento simultáneo con un agente reductor de puentes disulfuro, como el 2-mercaptoetanol, asegura que la proteína está completamente desnaturalizada antes de ser cargada en el gel, garantizando que corre de manera uniforme. Para controlar visualmente el avance de la proteína en la electroforesis y evitar que sobrepase el extremo del gel, se emplea un colorante como el azul de bromofenol. Procedimiento: Previamente a la carga de las muestras, en un tubo de eppendorf de 1,5 mL se pipeteó el volumen necesario de muestra para la Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 94 solución de sustrato de pNpp se añade y se incuba durante 1 hora dando coloración amarilla cuando son catalizados por la fosfatasa alcalina en la aldosterona conjugada. Inmediatamente tras la incubación se añade la solución de parada y la solución amarilla generada se lee a 405 nm mediante el refractómetro M-2000 Reader, Optic Ivymen® System, Clinicord, S.L. La cantidad de aldosterona de la señal es indirectamente proporcional a la cantidad de aldosterona en la muestra. Cálculos: La concentración de aldosterona se calcula a partir de los datos de DO obtenidos: 1. Se calcula el promedio neto de la densidad óptica (DO) de cada estándar y muestra restando al promedio de las uniones no especificas de la DO de cada estándar y muestra: Promedio neto DO= promedio DO – promedio DO uniones no específicas 2. Se calcula la unión de estándar como el porcentaje máximo de unión (Bo), usando la siguiente fórmula: Porcentaje de unión = DO neta/DO neta de estándares 3. Se traza una recta de calibrado del porcentaje de unión (B/Bo) frente a la concentración de aldosterona de los estándares. La concentración de aldosterona de los muestras es determinada por interpolación. Las muestras cuya concentración este fuera de la recta de calibrado se puede usar una dilución distinta para calcular su concentración de aldosterona. 4.6.3. Determinación de la presión arterial y la frecuencia cardíaca El día anterior al sacrificio se midió la presión arterial sistólica y diastólica, y la frecuencia cardiaca de las ratas madres mediante el método indirecto de oclusión de la cola (Gómez-Amores y cols., 2007). Las mediciones se realizaron usando un Medidor de presión 645 NIPREM (CIBERTEC, Barcelona,España). Las señales recogidas se trataron con un soporte Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 95 informático a través de un sistema de adquisición de datos acoplado al medidor de presión. Cada medición en cada animal se realizó 3-4 veces sucesivamente con el fin de calcular la media aritmética, que fue el valor utilizado. Una vez obtenidos los valores de la presión arterial sistolica y diástolica se calculó el valor de la presión arterial media mediante la siguiente formula: PAM = PAD + 1/3 (PAS-PAD) 4.7. MARCADORES DE LA FUNCIÓN RENAL 4.7.1. Cálculo de la función renal 4.7.1.1. Aclaramientos Una vez obtenidas las concentraciones de creatinina, sodio, potasio y selenio en suero y orina, se calcula el aclaramiento de creatinina, sodio, potasio y selenio usando la siguiente expresión: CL = Vo ∙ Co / (Cs ∙ 1440) Donde: CL = aclaramiento de creatinina, sodio, potasio y selenio (ml/min) Vo = volumen de orina recogido en 24 horas (ml) Co = concentración de creatinina, sodio, potasio y selenio en orina (mg/dl) Cs = concentración de creatinina, sodio, potasio y selenio en suero (mg/dl) Una vez obtenido los aclaramientos de sodio, potasio y selenio se relativizan con el aclaramiento de creatinina para obtener más información acerca del funcionamiento renal. 4.7.1.2. Excreción fraccional de sodio La excreción fraccional de sodio (EFNa), es la cantidad de sodio que se elimina del organismo a través de la orina comparada con la cantidad filtrada y reabsorbida por el riñón. Es uno de los factores que se utilizan para evaluar el origen de la insuficiencia renal, ya que ayuda a determinar si la reducción en la producción de orina se debe a una disminución del flujo sanguíneo al riñón (fallo prerrenal), los valores de EFNa son menores al 1% y indica situaciones Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 96 prerrenales y glomerulonefritis agudas. Mientras que cuando el daño es en el riñón en si (fallo renal) los valores EFNa son mayores al 1%, siendo habitual en la mayoría de las necrosis tubulares aguda, enfermedades renales crónica y tras la administración de diuréticos. Se obtiene mediante un cálculo basado en las concentraciones de sodio y creatinina en la sangre y en la orina a través de la siguiente fórmula: EFNa = (Na+ orina / Na+ plasma)/ (Cr orina/Cr plasma) x 100 4.7.1.3. Gradiente transtubular de potasio El gradiente transtubular de potasio (GTTK) es un índice para analizar la actividad renal en su balance de K+ en relación con el K+ presente en plasma y la osmolaridad en ambos medios. Permite valorar la presencia y actividad de la aldosterona en el túbulo distal. Se obtiene mediante la siguiente fórmula: GTTK= [K+ orina/ (Osm orina/Osm plama)]/ K+ plasma 4.7.1.4. Osmolaridad Para medir la osmolaridad de la orina, se separa de cada muestra una alícuota de 50 µl y se realiza la lectura empleando un osmómetro crioscópico Osmomat 30 (Alemania). 4.8. DETERMINACIÓN DE MARCADORES VASCULARES Se determinaron en suero los niveles de Caveolin-1 (Cav-1), CTGF (Factor de Crecimiento del Tejido Conectivo), tPAI-1 y VEGF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular) usando el MAPA MILLIPLEX RV1MAG-26K (Millipore Corporation, Missouri, EUA), basado en inmunoensayos en la superficie de microesferas codificadas con fluorescencia, siguiendo las especificaciones del fabricante (50 eventos por perla, muestra de 50 μl, Configuración de la puerta: 8000-15000, tiempo de espera 60 segundos, Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 97 melatonina conjunto de microesferas 34). La placa se leyó en el analizador LABScan 100 (Luminex Corporation, Texas, EE.UU.) con el software xPONENT para la obtención de los datos. Los valores medios para cada conjunto de muestras o estándares duplicados estaban dentro del 15% de la media. 4.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados se expresaron como la media ± error estándar de la media (ESM), siendo “n” el número de muestras utilizadas. Las medias mostradas se obtienen a partir de 8 datos. Para comparar las distintas variables objeto de nuestro estudio en los diferentes grupos experimentales, los datos se analizaron utilizando el análisis de varianza ANOVA en el programa (GraphPad Instat 3). Posteriormente, se utilizó el test de Tukey-Kramer para determinar las diferencias significativas entre las medias de los valores obtenidos para los cuatro grupos estudiados, considerándose diferencias estadísticamente significativa valores de p<0,05. Para expresar las diferencias estadísticamente significativas entre los diversos grupos experimentales en ratas se utilizó la siguiente simbología: Tabla 4.9. Significación utilizada Grupos p < 0.05 p < 0.01 p < 0.001 CI vs AI * ** *** CI vs CISe c cc ccc AI vs AISe a aa aaa CISe vs AISe ● ●● ●●● Materiales y métodos Paula Sobrino Calero 98 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 101 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. CONTROL NUTRICIONAL, MORFOLÓGICO Y METABÓLICO 5.1.1. Control nutricional y morfológico Al observar los resultados del control nutricional y morfológico, se puede comprobar que la ingesta sólida y calórica fue similar en los cuatros grupos experimentales, no encontrándose diferencias significativas en el incremento de peso ni en la longitud cráneo caudal de dichos animales. Respecto a la ingesta líquida fue significativamente menor en el grupo AI que en el grupo CI (Tabla 5.1.1). Parece ser que la vía de administración y la concentración de alcohol utilizada pueden ejercer efectos adversos en la función adrenal, la cual está fisiológicamente involucrada en el consumo de agua y en su absorción por el riñón (Rivier, 1996). Por ello, en el grupo experimental AI, los días de tratamiento en los que se inyectaron 3g/Kg/d de alcohol se alcanzaron alrededor de 200 mg/dl de alcohol en sangre lo cual ha producido que las ratas hayan ingerido menos cantidad de agua durante esos días en concreto, y así en el periodo experimental. Para conocer la distribución de la grasa corporal y posible obesidad visceral se han medido la circunferencia torácica y abdominal, así como la ratio entre ambas. La circunferencia abdominal en los grupos AI y CISe son significativamente mayores que el grupo CI, sin embargo la ratio entre la circunferencia abdominal y circunferencia torácica es significativamente mayor sólo en el grupo AI. A pesar de que las ratas expuestas a BD ingieren la misma cantidad de comida que las demás se favorece el almacenamiento de grasa a nivel visceral exclusivamente. En el grupo AI la grasa visceral es alta, produciéndose posiblemente esteatosis hepática en estos animales (Ojeda y cols., 2017b), otra causa más para generar un mal funcionamiento hepático (Tabla 5.1.2). Así, existen cambios metabólicos a nivel lipídico, sin embargo el efecto sumatorio de BD y la suplementación con Se no afecta a esta disposición de la grasa, manteniéndose estable la ratio entre la grasa visceral y subcutánea. El peso relativo, así como la concentración proteica en el corazón y el riñón fue similar en los cuatros grupos estudiados, así el consumo de alcohol agudo Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 102 y repetido, y la suplementación de Se utilizada no afectan al desarrollo macroscópico de estos tejidos. Tabla 5.1.1. Control nutricional y morfológico al final del periodo experimental. Parámetros CI AI CISe AISe Ingesta sólida (g/día) 13.10 ± 0.79 12.06 ± 0.67 13.58 ± 0.61 12.10 ± 0.61 Ingesta liquida (ml/día) 23.45 ± 1.0 20.42 ± 0.9 * 23.94 ± 1.1 21.7 ±1.0 Ingesta calórica (Kcal/día) 53.71 ± 3.22 49.44 ± 2.96 55.67 ± 3.34 46.37 ± 2.78 Incremento peso corporal (g/día) 5.38 ± 0,19 5.03 ± 0.27 5.34 ± 0.25 5.17 ± 0.23 Longitud Cráneo Caudal (cm) 16.78 ± 0.26 15.82 ± 0.32 16.7 ± 0.37 15.6 ± 0.18 Circunferencia Torácica (cm) 8.34 ± 0.23 8.5 ± 0.44 9 ± 0.35 8.7 ± 0.20 Circunferencia Abdominal (cm) 8.5 ± 0.22 9.45 ± 0.32 * 9.43 ± 0.22 C 8.84 ± 0.26 Ratio C. Abdominal / C. Torácica 1.02 ± 0.06 1.11 ± 0.06 * 1.04 ± 0.07 1.01 ± 0.06 Peso Relativo Corazón (%) 0.52 ± 0.024 0.52 ± 0.011 0.47 ± 0.009 0.50 ± 0.023 [Prot] Corazón (mg prot/ml) 9.82 ± 0.64 9.03 ± 0.67 8.34 ± 0.50 9.04 ± 0.73 Peso Relativo Riñón (%) 0.962 ± 0.033 0.984 ± 0.026 1.025 ± 0.035 1.014 ± 0.058 [Prot] Riñón (mg prot/ml) 15.32 ± 0.70 15.99 ± 1.07 15.39 ± 0.42 16.87 ± 0.73 Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CI vs AI: * p<0.05; CI vs CISe: c p<0.05. Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 103 5.1.2. Parámetros bioquímicos El consumo de alcohol tipo BD en las ratas produce cambios en sus perfiles bioquímicos. Como vemos en la tabla 5.1.2, determinados parámetros bioquímicos en suero como las enzimas hepáticas AST y ALT, así como su ratio, triglicéridos, colesterol, glucosa y bilirrubina total, se encuentran significativamente aumentados en el grupo AI respecto al grupo CI. La suplementación con Se a las ratas alcohólicas disminuye significativamente los niveles de AST y la ratio entre transaminasas con respecto a AI. Sin embargo, la AST, ALT, colesterol y glucosa siguen aumentados en el grupo AISe respecto al grupo CISe. El análisis de las concentraciones séricas de las enzimas aminotransferasa puede ser muy útil como índice de lesión hepatocelular. En los grupos alcohol, suplementados con Se y no suplementados, se observa un incremento significativo de la AST y ALT en comparación con los grupos controles, lo que indica que el patrón de consumo alcohólico tipo BD afecta la integridad hepática. La suplementación con Se es efectiva disminuyendo los niveles de AST, beneficiando los valores de la ratio entre transaminasas, usada como marcador de daño hepático (Sorbi y cols., 1999). Recientemente, se han encontrado datos similares en ensayos clínicos (Binder y cols., 2016), con un aumento en la relación AST/ALT, lo que refleja el daño de los hepatocitos después del consumo intensivo de alcohol en adolescentes. Se sabe que la mayoría de las enfermedades hepáticas cursan con un aumento de las transaminasas séricas, especialmente ALT, excepto en la hepatopatía alcohólica crónica en la que los niveles de AST duplican a los de ALT, con un aumento resultante en la ratio AST/ALT. La ratio aumentada está relacionada con el hecho de que el alcohol promueve un déficit de fosfato de piridoxal y conduce a una marcada toxicidad en las mitocondrias, la ubicación principal de la AST, lo que permite la liberación de esta enzima a la sangre (Sorbi y cols., 1999). Es importante remarcar que la suplementación con Se utilizada disminuye los niveles de AST, pero no de ALT, en el suero, disminuyendo esta ratio característica del consumo de alcohol. Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 110 Por ello, la suplementación con Se al aumentar la actividad GPx mejora la oxidación de proteínas (GC) y evita totalmente la peroxidacion lipídica (MDA), pudiéndose achacar la acción antioxidante de la suplementación casi en su totalidad a la GPx. Figura 5.3.1.1. Actividad de las enzimas antioxidantes SOD (A), CAT (B), GPx (C), GR (D) y niveles de GC (E) y MDA (F). Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CI vs AI: ** p<0.01, *** p<0.001; CI vs CISe: cc p<0.01; AI vs AISe: a p<0.05, aaa p<0.001; CISe vs AISe: • p<0.05. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 CI AI CISe AISe SOD (U/mg proteína) A ***, a 0 10 20 30 40 50 60 CI AI CISe AISe CAT (U/mg proteína) B **,aaa cc • 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CI AI CISe AISe GPx (U/mg proteína) C ***, aaa 0 2 4 6 8 10 12 14 CI AI CISe AISe GR (U/mg proteína) D ***, a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 CI AI CISe AISe GC (mol/mg proteína) E ***, aaa 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 CI AI CISe AISe MDA (mol/mg proteína) F Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 111 Figura 5.3.1.2. Representación esquemática de los eventos ocurridos en los sistemas de defensa antioxidante en el corazón en repuesta al consumo agudo de alcohol y a la suplementación con Se. Incremento o disminución de la actividad de las distintas enzimas antioxidantes y la oxidación de macromoléculas tras el consumo agudo de alcohol. Incremento o disminución de la actividad de las distintas enzimas antioxidantes y la oxidación de macromoléculas tras el consumo agudo de alcohol suplementado con Se. 5.3.2. Expresión de las enzimas antioxidantes GPx-1, GPx-3, GPx-4 y Sel P en el corazón Debido a la importancia que adquiere la GPx en la defensa antioxidante cardiaca tras el BD, se analizaron las expresiones de las isoformas cardiacas más importantes, GPx-1, GPx-3 y GPx-4, además de la expresión de la Sel P. Resaltar que la actividad GPx medida en el corazón, por la técnica usada corresponde a la acción de la GPx-1 y GPx-3. Tras la exposición a un consumo agudo de alcohol la expresión de las enzimas GPx-1 y GPx-4 disminuyeron significativamente, mientras que la expresión de las selenoproteínas GPx-3 y Sel P no se modificaron. La suplementación con Se al grupo alcohol aumentó significativamente la expresión de GPx-1 y GPx-4 incluso por encima de los valores controles. Sin O2O2- SOD H2O2 GPx H2OO2 CAT GSH GSSG GR Se OH- Oxida Proteínas (GC) Oxida lípidos (MDA) Alcohol Suplementación con Selenio Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 112 embargo, la GPx-3 y Sel P no aumentaron su expresión. El grupo control suplementado con Se presentó la expresión más alta de GPx-1, GPx-3 y GPx- 4, demostrando que la suplementación utilizada es eficaz en el tejido cardíaco pues el Se accede a él sin dificultades. Estudios previos han demostrado que existe una relación entre la disminución de la actividad GPx y la lesión cardiaca. En este estudio, la menor actividad GPx tras la exposición a BD depende de la GPx-1, pues la expresión de la GPx-3 no se ve afectada, de hecho, la enzima más sensible a los niveles de Se es la GPx-1 (Carreras y cols., 2015) debido a esto, su expresión tiene similitud con los depósitos tisulares de Se, deplecionados en este tejido. Aunque la GPx-3 se sintetiza principalmente en el riñón, también lo hace en el corazón, pulmón, hígado, ojos y tejido adiposo. GPx-3 juega un papel significativo en la protección a los cardiomiocitos del EO generado por la hiperglucemia (Iwata y cols., 2006). De hecho, se ha visto que la GPx-3 es necesaria para que actúe el antioxidante receptor activado por proliferador de peroxisomas γ (PPARγ), eficaz en la lucha contra el EO generado por la RI (Chung y cols., 2009). Quizás los niveles de GPx-3 se mantienen elevados en el corazón de las ratas expuestas a BD para defender a los miocitos del EO generado por el aumento de la glucosa encontrado (Tabla 5.1.2). La GPx-3 actúa principalmente en la matriz extracelular de los miocitos y parece jugar un papel muy importante en reducir H2O2 extracelular a nivel cardiaco (Hoffmann y cols., 2011). La menor expresión de la GPx-4 en las ratas expuestas alcohol no es solo consecuencia de la depleción de Se, pues esta selenoproteína presenta una mayor jerarquía respecto a los depósitos de Se, si no consecuencia especifica de la función protectora que esta ejerce sobre los fosfolípidos de la membrana celular y de orgánulos celulares contra el EO y, por lo tanto, de la mitocondria (Knopp y cols., 1999), principal orgánulo afectado en el corazón por el BD (Sorbi y cols., 1999). La mitocondria necesita GSH, cuyos transportadores se inhiben por el consumo de alcohol y, esta inhibición es la que se considera responsable de la disminución de GSH mitocondrial y, por lo tanto, de daño mitocondrial (Kanan y cols., 2004). Además, diversos estudios encontraron que la lesión mitocondrial fue el resultado primario de la lesión cardiomiocítica Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 113 causada por la disminución del nivel de Se en la sangre y se refleja en el daño de la membrana mitocondrial, en la generación de EROs y en la elevación de la oxidación de lípidos, que finalmente lleva a la apoptosis de los cardiomiocitos (Estevez y cols., 2014). Figura 5.3.2. Expresión de las enzimas antioxidantes GPx-1 (A), GPx-3 (B), GPx-4 (C) y Sel P (D). Wester blotting representativo de la expresión de estas selenoproteínas. Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CI vs AI: * p<0.05, *** p<0.001; CI vs CISe: cc p<0.01; AI vs AISe aaa p<0.001. ***, aaa cc 0 20 40 60 80 100 120 140 160 CI AI CISe AISe GPx-1 ( Unidades arbitrarias) A *,aaa cc 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CI AI CISe AISe GPx-4 ( Unidades arbitrarias) C 0 20 40 60 80 100 120 140 CI AI CISe AISe Sel P ( unidades arbitrarias) D β-actin SelP GPx1 GPx4GPx3 CI AI CISe AISe 42 21 23 57 kDa 25 cc 0 20 40 60 80 100 120 140 160 CI AI CISe AISe GPx-3 ( Unidades arbitrarias) B Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 114 La expresión de Sel P no se ha modificado significativamente en los cuatro grupos experimentales, así el alcohol no parece afectar a la síntesis de esta selenoproteína en el corazón, si bien es importante tener en cuenta que la Sel P, al igual que la GPx-3, son selenoproteínas plasmáticas transportadoras de Se de diferente origen, pues como se ha comentado anteriormente la GPx-3 es sintetizada en riñón y, la Sel P en el hígado mayoritariamente y ambas son liberadas al plasma donde ejercen su actividad antioxidante y podrían también estar llegando a este tejido desde el plasma. Se ha comprobado que la GPx-3 plasmática llega a las membranas basales endoteliales de diferentes tejidos para ejercer allí su acción aunque este efecto no se ha comprobado en el corazón (Burk y cols., 2011). La suplementación con Se a ratas expuestas a BD, acorde con la repleción de Se encontrada en el tejido cardíaco, aumenta la expresión de la GPx-1 y su actividad intracelular antioxidante, así como la de GPx-4 protegiendo principalmente a la mitocondria, orgánulo principalmente afectado por el consumo de alcohol. Posiblemente estos efectos repercutirán positivamente en el funcionamiento de este tejido tras el consumo agudo de alcohol. 5.3.3. Expresión de NF-κB p65 y caspasa 3 activada en el corazón El consumo agudo de alcohol aumenta significativamente la expresión cardiaca de NF-κB p65 respecto a las ratas controles indicando la activación de este complejo proteico que controla la transcripción del ADN jugando un papel clave en la regulación de la respuesta inmune y en la apoptosis. La suplementación con Se a las ratas expuestas a BD disminuye significativamente la expresión de esta proteína a valores controles. En el corazón de las ratas que consumen alcohol agudo se observa que existe un proceso inflamatorio deletorio ya que el nivel de NF-κB se encuentra muy elevado. Algo similar ocurre en el corazón de las ratas con síndrome metabólico e hipertensión (Serrano y cols., 2016). La activación del NF-kB tras dosis agudas de alcohol, ya ha sido comprobada por Umoh y cols (2014) demostrando que existe un incremento en la activación del factor NF-kB relacionado con el EO modulado por PI3K/AKT y de la apoptosis, Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 115 concretamente encontraron una mayor expresión de la actividad caspasa 3/7 y de la viabilidad celular en el tejido cardiaco. Figura 5.5.3. Expresión de NF-κB p65 y caspasa 3 activa en el corazón. Wester blotting representativo de la expresión de estas proteínas. Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CI vs AI: ** p<0.01, *** p<0.001; AI vs AISe aa p<0.01, aaa p<0.001. Imagen representativa de los resultados de expresión de las proteínas NF-ĸB p65 y caspasa-3 activa. Tras la suplementación los valores de NF-kB se estabilizan, coincidiendo con un aumento de la expresión de GPx-4, que aumenta la capacidad antioxidante a nivel de los fosfolípidos de membranas y de mitocondrias. Además se ha visto que la GPx-4 influye en las vías de señalización inflamatorias al inhibir la cascada NF-κB, lo que produce una inhibición de la producción de interleukinas y sus acciones (Forman y cols., 2002). Así, en general la disminución de la expresión de NF-κB mejora la respuesta cardiaca inflamatoria y el funcionamiento del corazón. Si bien es cierto que no en todos los tejidos existe esta relación inversa entre GPX-4 y NF-kB (Wullaert y cols., 2007; Greten y cols., 2004; Nomura y cols., 2000). **, aa 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CI AI CISe AISe NF-ĸB (Unidades arbitrarias) ***,aaa 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CI AI CISe AISe Caspasa-3 activa (Unidades arbitrarias) NFkB β-actin CI AI CISe AISe 42 65 kDa 19 17 Caspasa-3 activa Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 116 5.3.4. Funcionalidad cardíaca Con el fin de valorar si los cambios en el balance oxidativo inflamatorio y apoptóticos encontrados en el corazón tras el BD se relacionan funcionalmente con la regulación de la presión arterial, se analizaron la presión arterial sistólica (PAS), la presión arterial diastólica (PAD), la presión arterial media (PAM) y la frecuencia cardíaca (FC) de los cuatro grupos experimentales al final del tratamiento. La figura 4.4 muestra que el consumo agudo de alcohol tipo BD aumenta significativamente la PAS tanto en el grupo AI como AISe, respecto a sus respectivos grupos controles. Sin embargo, la PAS es significativamente menor en el grupo BD suplementado que en el no suplementado, aunque no la baja a valores controles. Esto indica que la suplementación ofrecida contribuye solo parcialmente a la mejora de este parámetro, y por tanto la menor oxidación lipídica y proteica a nivel cardiaco encontrada tras la suplementación no es la causa principal del incremento de PAS tras el consumo de alcohol. En el caso de la PAD y PAM, el consumo de alcohol en forma de BD provoca un aumento significativo de estos parámetros respecto al grupo control. La suplementacion con Se no afectó significativamente a estos parametros. Por lo que la accion del Se sobre la presión arterial parece estar mas relacionada con la PAS que con la PAD, y por lo tanto, con la funcionalidad cardíaca, más que con la resistencia periferica. Al analizar la FC observamos que el grupo AI presenta un aumento significativo de este parámetro respecto al grupo control, y en esta ocasión la suplementacion con Se si produce un significativo descenso de los latidos por minuto, incluso menores que los obtenidos en el grupo CSe, mostrando que el Se actuaría como un mecanismo compensatorio para disminuir la PAS, pues la PAS es el producto de volumen sistólico, FC y resistencia periférica total. Estudios previos demuestran que los efectos agudos del alcohol provocan debilitamiento de la capacidad del corazón para contraerse, es decir, efecto inotrópico negativo (Danziger y cols., 1991; Guarnieri y Lakatta 1990) y una disminución del volumen sistólico (Umoh y cols., 2014). Estos efectos también pueden implicar una FC irregular, a veces muy rápida, produciendo arritmia para compensar el menor volumen sistólico, durante la cual las aurículas se Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 117 contraen caóticamente fuera de la coordinación con sus ventrículos, conocidas como fibrilación auricular o, rara vez, muerte súbita cardíaca . Además, las anormalidades en la repolarización miocárdica y en la prolongación de la duración del potencial de acción son causas importantes para el desarrollo de la arritmias, en la que las corrientes de K+ mediadas por el canal de K+ desempeñan un papel importante (Zhang y cols., 2017), hecho que coincide con nuestro datos pues las ratas expuestas a BD presentan niveles de K+ disminuidos (Tabla 5.6.4) confirmando que las ratas expuestas a BD puede sufrir arritmias y presentan una mayor FC. Figura 5.3.4. Presión arterial sistólica (A), diastólica (B) y media (C) y frecuencia cardiaca (D). Los resultados obtenidos se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CI vs AI:* p<0.05, ** p<0.01, *** p < 0.001; AI vs AISe:a p<0.05, aaa p<0.001; CISe vs AISe: ●●● p < 0.001. La suplementación con Se disminuye la FC muy significativamente, así se podría relacionar la depleción de este nutriente con la desregulación de la FC y ***,aaa ••• 0 20 40 60 80 100 120 140 160 CI AI CISe AISe Presión Arterial Sistólica (mmHg) A * 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 CI AI CISe AISe Presión Arterial Diástolica (mmHg) B **,aaa ••• 300 320 340 360 380 400 420 440 460 CI AI CISe AISe Frecuencia cardiaca (Latidos/min) D ** 0 20 40 60 80 100 120 CI AI CISe AISe Presión Arterial Media (mmHg) C Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 118 la PAS. Esta acción del Se a nivel cardíaco no es nueva, pues se sabe que sus niveles normales son importantes para un buen funcionamiento cardíaco, ya que favorece el estatus antioxidante, disminuye la apoptosis, regula la expresión del factor NF-ĸB asociados a la supervivencia de los cardiomiocitos, es esencial para el correcto funcionamiento sistólico y actúa regulando los efectos de la bomba Na+/K+ ATPasa (Chen y cols., 2012; Tanguy y cols., 2012). En este punto, futuros estudios funcionales a nivel renal nos darán más información causal de los cambios en la PAS y PAD, pues este órgano está relacionado con la diuresis y la volemia y a través del SRAA con la resistencia periférica total (Pletcher y cols., 2005). Por otro lado, el BD afecta al funcionamiento vascular por diversos mecanismos, como se explicó ampliamente en la introducción (Apartado 2.2.3.2) pero además, en concreto encontraron que el consumo excesivo de alcohol en adultos jovenes, con una edad media de 25.2 años, se asocia significativamente con una mayor calcificacion coronaria, lo que sugiere la presencia de una posible ateroesclerosis coronaria, aumentando, en consecuencia, la resistencia periférica total. Así habria que valorar otros marcadores vasculares. 5.4. ESTUDIOS VASCULARES Con el fin de analizar la funcionalidad de los vasos sanguíneos tras la exposición repetida a BD, se estudió el balance oxidativo en suero, pues el EO es una de las causas más importantes de disfunción endotelial y cambios en la resistencia periférica total, y por tanto de la PAM (Liu y cols., 2017). Este estudio se centra en la actividad de la selenoproteina GPx y los productos de oxidación de lípidos y proteínas. El BD produce una disminución de la actividad GPx en suero (Figura 5.4.1.1) relacionado con los menores niveles de Se en este líquido respecto a las ratas control y con la existencia de oxidación lipídica en suero. La suplementación recupera la actividad de esta enzima antioxidante proporcionalmente a los niveles de Se sérico que también estaban aumentados y disminuye sólo parcialmente la oxidación de proteínas (Figura 5.4.1.2). La actividad GPx medida, se corresponde con la actividad de la GPx-3. Resultados y discusión Paula Sobrino Calero 119 Figura 5.4.1.1. Actividad de GPx en suero. Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CI vs AI: * p<0.05; AI vs AISe: aa p<0.01; CI vs CISe: cc p< 0.01; CISe vs AISe: • p< 0.05. En trabajos previos se ha demostrado que la otra selenoproteína principal transportadora de Se en suero (Sel P), sintetizada principalmente en hígado, no se ve afectada por el BD repetido (Ojeda y cols., 2017b), así que en este modelo experimental, la disminución de Se sérico afecta principalmente a la síntesis y actividad de la GPx-3. Esto es importante pues clínicamente se ha comprobado que niveles bajos de la actividad de GPx-3 y HDLc en suero son marcadores de riesgo de mortalidad en pacientes con problemas vasculares (Buijsse y cols., 2012). Así el Se parece disminuir en parte el riesgo cardiovascular asociado a EO sistémico y posible disfunción vascular. 5.4.1. Balance oxidativo en suero El consumo agudo de alcohol provocó un incremento significativo de la peroxidación lipídica en suero, aunque no afectó a las proteínas. La suplementación con Se disminuyó en parte esta peroxidación, pero no completamente a diferencia de lo que pasaba en el corazón. El consumo agudo de alcohol aumenta el EO sérico, dando lugar a disfunción endotelial e hipertensión. Nuestros datos coinciden con otra investigación en la cual encontraron un aumento de la presión arterial y disfunción en los vasos sanguíneos por distintos mecanismo como por el aumento de los niveles plasmáticos de sustancias que reaccionan con el acido tiobarbitúrico (Yogi y cols., 2012). La suplementación con Se disminuye *,aa cc • 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 CI AI CISe AISe GPx (U/mg proteína)