Comunicación funcional entre canales de Ca2+ tipo l y canales de Ca2+ activados por reservorios y su regulación del tono vascular

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA COMUNICACIÓN FUNCIONAL ENTRE CANALES DE Ca2+ TIPO L y CANALES DE Ca2+ ACTIVADOS POR RESERVORIOS, Y SU REGULACIÓN DEL TONO VASCULAR Trabajo de investigación presentado por JAVIER ÁVILA MEDINA para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2017 Dr. Tarik Smani Hajami, Profesor Titular de la Universidad de Sevilla y Co-Investigador Responsable en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS) y Dr. Antonio Ordoñez Fernández, Catedrático de la Universidad de Sevilla y responsable del área de Fisiopatología Cardiovascular/Investigador Responsable en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). Certifican que: D. Javier Ávila Medina, Licenciado en Bioquímica, ha realizado bajo su supervisión y revisión, el trabajo titulado: “Comunicación funcional entre canales de Ca2+ tipo L y canales de Ca2+ activados por reservorios, y su regulación del tono vascular” que presenta para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Fdo. Dr. Tarik Smani Hajami Fdo. Dr. Antonio Ordóñez Fernández DIVULGACIÓN CIENTÍFICA Durante la elaboración de esta Tesis Doctoral, parte de los resultados, y otros, han dado lugar a publicaciones en revistas internacionales y comunicaciones en congresos. ARTICULOS EN REVISTAS PEER REVIEW Smani, T., Gallardo-Castillo, I., Avila-Medina, J., Jimenez-Navarro, MF., Ordoñez, A. y Hmadcha, A. “Impact of diabetes on cardiac and vascular disease: Role of calcium signaling.” Curr Med Chem. EN PRENSA (BSP-CMC-2016-H137-1). Avila-Medina, J., Calderon-Sanchez, E., Gonzalez-Rodriguez, P., Monje-Quiroga, F., Rosado, J. A., Castellano, A., . . . Smani, T. (2016). "Orai1 and TRPC1 Proteins Co-localize with CaV1.2 Channels to Form a Signal Complex in Vascular Smooth Muscle Cells." J Biol Chem 291(40): 21148-21159. Smani, T., Dominguez-Rodriguez, A., Callejo-Garcia, P., Rosado, J. A. y Avila-Medina, J. (2016). "Phospholipase A2 as a Molecular Determinant of Store-Operated Calcium Entry." Adv Exp Med Biol 898: 111-131. Rodriguez-Moyano, M., Diaz, I., Dionisio, N., Zhang, X., Avila-Medina, J., Calderon- Sanchez, E., . . . Smani, T. (2013). "Urotensin-II promotes vascular smooth muscle cell proliferation through store-operated calcium entry and EGFR transactivation." Cardiovasc Res 100(2): 297-306. ARTICULOS EN REVISION Díaz, I., Calderón-Sánchez, E., Toro, R., Sánchez de Rojas-de Pedro, E., Domínguez- Rodríguez, A., Ávila, J., . . . Smani, T. “miR-125a, miR-139 and miR-324 contribute to Urocortin protection against myocardial ischemia-reperfusion injury”. Sci Rep EN REVISIÓN Editorial. Domínguez-Rodríguez, A., Díaz, I., Sánchez de Rojas-de Pedro, E., Mayoral-Gonzalez, I., Calderón-Sánchez, E., Avila-Medina, J., . . . Ordóñez, A. “Urocortin-2 prevents the altered Ca2+ homeostasis during early adverse cardiac remodeling after ischemia and reperfusion”. EN REDACCIÓN. Calderón-Sánchez, E., Avila-Medina, J., Callejo-Garcia, P., Smani-Hajami, T. y Ordonez- Fernandez, A. “Endothelin-1 induced post ischemic microvascular obstruction. Role of SOC and L-type Ca2+ channels”. EN REDACCIÓN. ARTICULOS EN REVISTAS DE CONGRESOS Avila-Medina, J., Gonzalez, P., Rosado, J., Castellano-Orozco, A., Ordonez-Fernandez, A. y Smani, T. (2014). "Functional crosstalk between L-type Ca2+ and Orai1 channels and their regulation of vascular tone." Acta Physiologica 211: 93. Calderón-sánchez, E., Callejo-Garcia, P., Avila-Medina, J., Smani-Hajami, T. y Ordonez- Fernandez, A. (2014). "Role of store operated calcium and L-type calcium channels in coronary artery hypercontraction after ischemia and reperfusion process." Acta Physiologica 211: 88. Rodríguez-Moyano, M., Díaz-Carrasco, I., Dionisio, N., Ávila-Medina, J., Calderón-Sánchez, E., Rosado, J. A., . . . Smani, T. (2014). "Urotensin-II Induces Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Creb Phosporylation Through Store Operated Calcium Entry and EGFR Transactivation." Biophysical Journal 106(2): 318a. COMUNICACIONES A CONGRESOS Javier Ávila-Medina, Eva Calderón-Sánchez, Paula Callejo-García, Juan Antonio Rosado, Antonio Ordoñez-Fernández, Tarik Smani. (2016). “Orai1 and TRPC1 interact with CaV1.2 L-type Ca2+ channels in mouse and rat vascular smooth muscle cells”. XXXVIII Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas (SECF) . Zaragoza (Spain). Póster. Javier Ávila-Medina, Eva Calderón-Sánchez, Paula Callejo-García, Patricia González- Rodríguez, Juan Antonio Rosado, Antonio Castellano, Tarik Smani. (2015). “Vasoactive agonists enhance the interaction between Orai1 and CaV1.2 L-type Ca2+ channels in vascular smooth muscle cells”. RECI V – 5th Spanish Ion Channel Network Meeting . Barcelona (Spain). Póster. Javier Ávila-Medina, Patricia González, Juan Antonio Rosado, Antonio Castellano, Tarik Smani. (2014). “Functional crosstalk between L-type Ca2+ and Orai1 channels and their regulation of vascular tone”. Joint Meeting of Federation of European Physiological Societies (FEPS) & the Hungarian Physiological Society . Budapest (Hungary). Póster. EM Calderon-Sanchez, P Callejo-Garcia, J Avila-Medina, T Smani-Hajami, A Ordonez- Fernandez. (2014). “Role of store operated calcium and L-type calcium channels in coronary artery hypercontraction after ischemia and reperfusion process”. Joint Meeting of Federation of European Physiological Societies (FEPS) & the Hungarian Physiological Society . Budapest (Hungary). Póster. Ávila J, González P, Rosado JA, Castellano A, Ordóñez A, Smani T. “Role of L-type calcium and Orai1 channels regulation of vascular smooth muscle tone”. (2014). XXXVII Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas (SECF) . Granada (Spain). Póster. J.Ávila, P. González, A. Castellano, A. Ordóñez, T. Smani. (2013). “Functional communication between L-Type Ca2+ and Store Operated Ca2+ Channels and their regulation of vascular tone”. International Ionic Channels Meeting. New Horizons in Ionic Channels Research . Cuenca (Spain). Póster. J.Ávila, P. González, A. Castellano, A. Ordóñez, T. Smani. (2012). “The interplay between L-Type Ca2+ and Store Operated Ca2+ Channels and their regulation of vascular tone”. Federation of European Physiological Societies (FEPS) Congress . Santiago de Compostela (Spain). Póster. FINANCIACIÓN Este trabajo de investigación ha sido posible gracias a la financiación concedida en convocatorias púbicas competitivas de los siguientes proyectos de investigación: • Regulación de la entrada de calcio en células excitables y papel de proteínas Stim, Orai y TRP en la proliferación celular y en el remodelado vascular (2014- 2016). Ministerio de Economía y Competitividad (Plan Estatal). BFU2013- 45564-C2-2-P; 193.600,00€. Categoría: Investigador. IP: Tarik Smani Hajami. • Implicación de la Urocortina en la lesión de la microvasculatura coronaria tras angioplastia primaria y su influencia en el remodelado cardiaco (2012-2015). Junta de Andalucía, Conserjería de Salud y Bienestar Social. PI-0108-2012; 51.30,00€. Categoría: Investigador. IP: Eva María Calderón Sánchez. • Regulación de la entrada de calcio por STIM, Orai, y proteínas TRPC en células eléctricamente excitables (2010-2013). Ministerio de Ciencia e Innovación (Plan Nacional). BFU2010-21043-CO2-2; 145.200 €. Categoría: Investigador. IP: Tarik Smani Hajami. ÍNDICE I. ÍNDICE DE FIGURAS II. ÍNDICE DE TABLAS III. ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN ........................................................................... 1 1.1 Sistema vascular. ......................................................................... 3 1.1.1 Estructura de las arterias. .......................................................................... 3 1.1.2 Ultraestructura del músculo liso vascular. ................................................ 6 1.2 Función del músculo liso vascular. ............................................... 12 1.2.1 Contracción músculo liso vascular. .......................................................... 12 1.2.2 Acoplamiento excitación-contracción. .................................................... 14 1.3 Regulación del tono vascular. ...................................................... 16 1.3.1 Homeostasis del Ca2+ intracelular. ........................................................... 17 1.3.2 Mecanismos de sensibilización a Ca2+. .................................................... 22 1.3.3 Factores extrínsecos e intrínsecos y regulación del tono vascular. ......... 23 1.4 Canales iónicos y regulación del tono vascular ............................. 27 1.4.1 Canales K+ y Cl-. ........................................................................................ 28 1.4.2 Canales de Ca2+. ....................................................................................... 30 1.5 Entrada de Ca2+ regulada por reservorios o SOCE. ......................... 36 1.5.1 Componentes moleculares. ..................................................................... 37 1.5.2 Mecanismos de activación. ...................................................................... 41 1.5.3 Papel fisiopatológico de SOCE en el sistema vascular. ............................ 44 MAT. Y MÉTODOS ...................................................................... 47 2.1 Equipamiento.............................................................................. 49 2.1.1 Miógrafo multicanal. ............................................................................... 49 2.1.2 Sistema de microfluorometría de Ca2+. ................................................... 50 2.1.3 Microscopía. ............................................................................................ 52 2.1.4 Criostato. ................................................................................................. 53 2.2 Soluciones. .................................................................................. 53 2.2.1 Solución para registro de la contractilidad arterial. ................................ 53 2.2.2 Solución para aislamiento de CMLVs. ...................................................... 54 2.2.3 Solución para registro de la [Ca2+]i. .......................................................... 54 2.2.4 Soluciones Western Blot. ......................................................................... 55 2.2.5 Soluciones inmunofluorescencia. ............................................................ 56 2.3 Fármacología. ............................................................................. 57 2.4 Metodología. .............................................................................. 58 2.4.1 Modelo animal. ........................................................................................ 58 III. ABREVIATURAS [Ca2+]i: concentración de Ca2+ intracelular. 2APB: 2-aminoetoxi-difenil borato. 5-HT: Serotonina (5-hidroxitriptamina). 70K: KCl a 70 mM. AA: Ácido Araquidónico. Ach: acetilcolina. ADP: adenosin difosfato ( Adenosine Diphosphate ). Ang: angiotensina. APS: persulfato de amonio ( Ammonium Persulfate ). ARC: canal de Ca2+ regulado por el AA. ATP: adenosín trifosfato ( Adenosine Triphosphate ). BayK: BayK-8644. BK+Ca: canal de K+ sensible a Ca2+ de gran conductancia. Ca2+: Ion calcio. CAD: CRAC Activation Domain . Caf: cafeína. CaM: calmodulina. CaV: canal de Ca2+ dependiente de voltaje. CaV1.2KO: ratón knock-out del canal CaV1.2. CDI: inactivación dependiente de Ca2+ ( Ca2+ Dependent Inactivation ). cGMP: guanosina monofosfato cíclica ( cyclic Guanosine Monophosphate ). CICR: liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ ( Ca2+ Induce Ca2+ Release ). CIF: Ca2+ influx Factor . Cl-: Ion cloro. Cl-Ca: canal de Cldependiente de Ca2+. Cl-VOL: canal de Clregulado por volumen. CMLV: célula de músculo liso vascular. CPA: ácido ciclopiazónico ( Cyclopiazonic Acid ). Crom: cromakalim. Cx: conexina. DAG: diacilglicerol. DTT: ditiotreitol. ECC: entrada capacitativa de Ca2+. EGFR: receptor de factor de crecimiento epidérmico ( Epidermal Growth Factor Receptor ). ET-1: endotelina. FBS: suero fetal bovino ( Fetal Bovine Serum ). Gd3+: gadolinio. Gli: glibenclamida. GPCR: receptor acoplado a proteína G ( G Protein Coupled Receptor ). GSK: GSK-7975A. H2O: agua. H2Obd: agua bidestilada. ICRAC: corrientes de Ca2+ activadas por liberación de Ca2+ ( Ca2+ Release Activated Ca2+ ). ID: dominio inhibitorio de STIM ( Inhibitoy Domain ). IP3: inositol 1,4,5-trifosfato. IP3R: receptor de inositol 1,4,5-trifosfato o IP3. ISOC: corrientes a través de los canales regulados por los reservorios ( Store Operated Channel ). K+: Ion potasio. K+ATP: canal de K+ dependiente de ATP. K+IR: canal de K+ rectificador entrante. K+V: canal de K+ dependiente de voltaje. KCl: cloruro potásico. Ki: knock-in. KO: knock-out. La3+: lantanio. LTCC: canal de Ca2+ tipo L ( L-type Ca2+ Channel ). M.p.: membrana plasmática. MHC: cadena pesada de la miosina ( Myosin Heavy Chain ). MLC: cadena ligera de la miosina ( Myosin Light Chain ). MLCK: quinasa de la cadena ligera de la miosina ( Myosin Light Chain Kinase ). MLCP: fosfatasa de la cadena ligera de la miosina ( Myosin Light Chain Phosphatase ). Na+: Ion sodio. NCX1: intercambiador Na+/Ca2+. Nif: nifedipina. NO: óxido nítrico ( Nitric Oxide ). NSCC: canal catiónico no selectivo ( Non- Selective Cationic Channel ). OASF: Orai1-Activating Small Fragment. OCT: Optimum Cutting Temperature . PCC: coeficiente de correlación de Pearson ( Pearson´s Correlation Coefficient ). PCR: reacción en cadena de la polimerasa ( Polymerase Chain Reaction ). PDGF: factor de crecimiento derivado de plaquetas ( Platelet Derived Growth Factor ). Phe: fenilefrina. PKA: proteína quinasa A ( Protein kinase A ). PKC: proteína quinasa C ( Protein Kinase C ). PLA: Proximity Ligation Assay . PLC: fosfolipasa C. PMCA: ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática ( Plasma Membrane Ca2+ ATPase ). PSS 70K: solución salina fisiológica ( Physiological Salt Solution ) con KCl a 70 mM. PSS: solución salina fisiológica ( Physiological Salt Solution ). RE (ER): Retículo Endoplásmico ( Endoplasmic Reticulum ). ROCC: canal de Ca2+ regulado por receptor ( Receptor Operated Ca2+ Channel ). ROCE: entrada de Ca2+ regulada por receptor ( Receptor Operated Ca2+ Entry ). ROCK: Rho quinasa ( RhoA/Rho Kinase ). RS (SR): Retículo Sarcoplásmico ( Sarcoplasmic Reticulum ). RT-qPCR: PCR cuantitativa con retrotranscripción ( quantitative Reverse Transcription PCR ). RyR: receptor de rianodina. SAM: Sterile Alpha Motif . SARAF: factor regulador asociado a SOCE ( SOCE-Associated Regulatory Factor ). SCID: inmunodeficiencia combinada severa ( Severe Combined Immunodeficiency ). SD: solución de dispersión. SDS: dodecilsulfato sódico ( Sodium Dodecyl Sulfate ). SERCA: ATPasa de Ca2+ del retículo sarco/endoplásmico. ( Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase ). SHR: rata espontáneamente hipertensas ( Spontaneously Hipertensive Rat ). SOAR: STIM-Orai Activating Region . SOCC: canal de Ca2+ regulado por reservorios ( Store Operated Ca2+ Channel ). SOCE: entrada de Ca2+ regulada por reservorios ( Store Operated Ca2+ Entry ). STIM: Stromal Interaction Molecule . Tª: temperatura. TBS: Tris-Buffered Saline . TBS-T: TBS- Tween . TCA: tricloroacético. TG: tapsigargina. TRP: receptor de potencial transitorio ( Transient Receptor Potential ). TRPA: TRP Ankyrin . TRPC: TRP Canonical . TRPM: TRP Melastatin . TRPP: TRP Polycystin . TRPV: TRP Vanilloid . TTCC: canal de Ca2+ tipo T ( T-type Ca2+ Channel ). Val: valinomicina. VDCC: canal de Ca2+ voltaje dependiente ( Voltage Dependent Calcium Channel ). WT: wild type. α-SMA: α-actina de músculo liso (α - Smooth Muscle Actin ). INTRODUCCIÓN 3 INTRODUCCIÓN 1.1 Sistema vascular. La principal función del sistema vascular es transportar y distribuir las sustancias necesarias a todos los tejidos del cuerpo y eliminar los productos de desecho del organismo. También nos permite mantener la homeostasis de todos los tejidos del cuerpo, asegurar un funcionamiento óptimo y la supervivencia de todas las células. El sistema vascular está formado por una gran cantidad de vasos sanguíneos que pueden clasificarse de la siguiente manera: - Arterias elásticas: son arterias de conductancia que tienen grandes dimensiones y desempeñan la función de transportar sangre a altas presiones y velocidades, por lo que presentan paredes vasculares gruesas conteniendo una alta proporción de fibras elásticas en su túnica media. - Arterias musculares: son arterias de resistencia que tienen un calibre pequeño y la capacidad de regular el flujo sanguíneo en respuesta a las necesidades del organismo, ya que pueden modificar el diámetro interno rápidamente gracias a que poseen una importante capa muscular y menos fibras elásticas que las anteriores. Son los conductos que comunican con arteriolas y capilares. - Arteriolas: son las arterias de menor tamaño y se encargan de controlar y regular la cantidad de sangre que llega a los tejidos. Comunican directamente con los capilares. - Capilares: son los encargados de intercambiar los nutrientes y sustancias que circulan por la sangre con el fluido intersticial gracias a que poseen una pared muy fina y permeable. - Vénulas: se encargan de recoger la sangre de los capilares para conducirla a venas de mayor calibre. - Venas: su función principal es la de transportar de nuevo la sangre al corazón, además de funcionar como reservorios de sangre ya que poseen una gran distensibilidad. El estudio de la estructura del sistema vascular y su función ha sido, y seguirá siendo, muy importante para el entendimiento de la fisiología del organismo, sistemas, órganos, tejidos y células. Aunque se están conociendo cada vez más observaciones anatómicas del organismo, todavía se conoce poco a nivel molecular por lo que cualquier avance sobre las estructuras moleculares puede ayudarnos a entender mejor su función (Ratz, 2016). Por ese motivo, el objetivo de esta tesis se centrará en el análisis de la función del músculo liso vascular, la activación de la contracción, el proceso de relajación y el papel que juegan algunos tipos de canales iónicos en la regulación de la contracción y el tono vascular. 1.1.1 Estructura de las arterias. El sistema vascular, a pesar de las complejas diferencias que existen entre órganos y regiones, comparte una organización histológica común. La mayoría de los vasos sanguíneos contienen tres regiones histológicamente diferentes con distintos componentes celulares basándose en la función fisiológica que los vasos desempeñan como tejido. Cada 4 INTRODUCCIÓN región se denomina capa o túnica y anatómicamente se designan túnica adventicia, túnica media y túnica íntima. A nivel fisiológico, las arterias son más importantes debido a las funciones que desempeñan como veremos más adelante, por lo que nos centraremos en el estudio de éstas (Figura 1). . A. Capa adventicia. Es la capa más externa y funciona como soporte, ya que está compuesta de tejido conectivo principalmente y una capa de elastina denominada membrana elástica externa. No forma unidad con la estructura vascular, sin embargo, tiene un papel fisiológico importante ya que contiene el vasa vasorum y nervi vasorum con funciones nutricionales y de control, respectivamente. Además, interviene en los cambios en la conducta elástica y viscosa de la pared arterial a través de una regulación de la función muscular lisa (Fischer, 2008). B. Capa íntima. Es la capa más interna y cercana a la luz de los vasos por donde fluye la sangre. Contiene un revestimiento de epitelio simple compuesto por células endoteliales, llamado endotelio, una membrana basal y una capa de tejido elástico llamada lámina elástica interna compuesta por elastina. Es una capa continua de células que reviste la superficie interna de todos los vasos sanguíneos, por lo que suele ser el único tejido que tiene contacto con la sangre (Levick, 2013). Figura 1: Estructura de los vasos sanguíneos (arteria). Representación de la estructura de una arteria compuesta por 3 capas: túnica íntima, túnica media y túnica adventicia. Modificado de Enciclopedia británica, Inc (2008). 5 INTRODUCCIÓN C. Capa media. La túnica media contiene principalmente células de músculo liso y fibras de elastina, adoptando una disposición concéntrica y facilitando la difusión de sustancias. Esta capa es la más gruesa y tiende a ser más organizada en vasos de gran calibre, debido a su función de transportar grandes volúmenes de sangre a altas presiones. Gracias a su contenido en fibras elásticas, las arterias poseen alta distensibilidad, estirándose con facilidad en respuesta a leves incrementos de presión. Por este motivo, esta capa es la responsable de la vasoconstricción y vasodilatación en respuesta a estímulos regulando así el tono vascular (Levick, 2013). Las arterias elásticas y las arterias musculares de mayor tamaño poseen una túnica media muy estructurada, en cambio, las arterias musculares de pequeño o mediano tamaño, no presentan esta complejidad y poseen una túnica media prominente o relativamente gruesa en relación a la adventicia (Figura 2). En el sistema vascular podemos encontrar los dos tipos de músculo liso existentes: el unitario o visceral y el multiunitario. El primero está presente en vasos sanguíneos de pequeño calibre y se caracteriza por el acoplamiento eléctrico entre sus células por medio de uniones GAP, funcionando como un sincitio. El multiunitario, en cambio, está presente en vasos sanguíneos de mayor diámetro. Ambos tipos de músculo liso son involuntarios y están inervados por el sistema nervioso autónomo. De cualquier forma, las células del músculo liso de los vasos sanguíneos o células de músculo liso vascular (CMLVs), serán las encargadas en último término de la regulación del tono vascular. La contracción y relajación de las CMLVs a nivel arterial controla el diámetro luminal vascular y la presión arterial y, por consiguiente, el flujo sanguíneo, de manera que participan activamente en la fisiopatología cardiovascular, motivo por el que serán el principal objeto de estudio de este trabajo (Katz, 2005). Figura 2: Organización de las capas en distintos tipos arteriales. Organización de las distintas capas que componen las arterias elástica, muscular y las arteriolas. Modificado de (Molist y cols., 2011) . 12 INTRODUCCIÓN Existen dos rutas de extrusión de Ca2+ en la mitocondria, el intercambiador Na+/Ca2+ mitocondrial (NCXm) y el intercambiador H+/Ca2+ (Poburko y cols., 2004). Además, también se pueden encontrar transportadores de Ca2+ unidireccionales que permiten la entrada de este ion cuando la [Ca2+] en el espacio intermembranario alcanza niveles superiores a 3 μM (Gunter y cols., 1994). 1.2 Función del músculo liso vascular. Las CMLVs se encargan de proporcionar la integridad estructural a los vasos sanguíneos y de regular el tono vascular y la presión sanguínea. Las arterias normales tienen unas CMLVs con un fenotipo contráctil o quiescente, mientras que en las arterias que presentan alguna patología (arterioesclerosis, hipertensión, reestenosis…) este fenotipo cambia a uno sintético o proliferativo, precedido de múltiples cambios en la homeostasis de Ca2+ que contribuyen al remodelado vascular (Marchand y cols., 2012). El papel más importante del Ca2+ en las CMLVs en un fenotipo contráctil es participar en el acoplamiento excitación-contracción (EC), que será el proceso encargado de regular la contractilidad de las CMLVs. 1.2.1 Contracción músculo liso vascular. La contracción de las CMLVs depende de la formación de puentes cruzados entre los filamentos de miosina y los filamentos de actina, de manera que el deslizamiento de los filamentos delgados sobre los filamentos gruesos es lo que provoca el acortamiento celular y, por tanto, la contracción del músculo (Figura 9A). Esta contracción depende principalmente de la [Ca2+]i, que puede incrementarse debido a la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular o por la liberación de Ca2+ desde los reservorios (p.ej., RS). El Ca2+, ya en el medio intracelular, se une y activa a la CaM (une 4 iones Ca2+), formando un complejo Ca2+-CaM que activa directamente a la quinasa de la cadena ligera de la miosina (MLCK, Myosin Light Chain Kinase ). Esta quinasa será la que active directamente a la miosina mediante fosforilación de la cadena ligera reguladora (MLC20), gracias a la hidrólisis de ATP donador del grupo fosfato, provocando un cambio conformacional en la proteína (Figura 9B). De este modo, tendrá lugar la formación de los puentes cruzados entre ambos tipos de filamentos y la activación de la maquinaria contráctil (Somlyo y Somlyo, 2003). Así, en el músculo liso el interruptor que inicia el ciclo de puentes cruzados es la miosina y no la actina como ocurre en otros músculos (Aguilar y Mitchell, 2010). 13 INTRODUCCIÓN La relajación vascular tiene lugar cuando la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (MLCP, Myosin Light Chain Phosphatase ) promueve la desfosforilación de la cadena ligera de la miosina. Cuando la [Ca2+]i disminuye, la MLCK cesa su actividad y la MLCP la incrementa, eliminando el grupo fosfato de la miosina, lo que hace detener el ciclo de los puentes cruzados, produciéndose la relajación de la célula e induciendo la vasodilatación (Blaustein y cols., 2011). Mientras la cadena ligera de la miosina esté fosforilada, los puentes cruzados se mantienen y también la contracción, de forma que el grado de contracción de las CMLVs está regulado por un balance entre MLCK y MLCP (Figura 10). Si cuando los puentes cruzados están todavía acoplados se produce la desfosforilación de la cadena ligera de la miosina, el desacople de los mismo tiene lugar de forma lenta. Esto puede contribuir al mantenimiento de la contracción tónica y la fuerza del músculo liso con un mínimo consumo de energía en forma de ATP. Para este proceso se requiere Ca2+, ya que si la [Ca2+]i no se mantiene, los puentes cruzados formados previamente se desacoplarán (Blaustein y cols., 2011). Además, existen otros mecanismos independientes de Ca2+ que pueden alterar la maquinaria contráctil: la modificación de la actividad de MLCP (Martinez-Lemus y cols., Figura 9: Formación de puentes cruzados en la contracción del músculo liso. A. Puentes cruzados entre filamentos de actina y miosina que permite la contracción en músculo liso. Los filamentos de actina se anclan a los cuerpos o placas densas mientras que los filamentos de miosina se deslizan sobre éstos permitiendo el acortamiento celular. B. Iniciación de la formación de puentes cruzados. El complejo MLCK/CaM activo inducirá el cambio conformacional en la miosina activando la maquinaria contráctil. CaM: calmodulina; MLCK: quinasa de la cadena ligera de la miosina. Modificado de (Boron y Boulpaep, 2012). 14 INTRODUCCIÓN 2009), el remodelado dinámico de la actina del citoesqueleto (Cipolla y cols., 2002) y la eliminación de la regulación de los filamentos delgados (Tanaka y cols., 1990). 1.2.2 Acoplamiento excitación-contracción. La contracción del musculo liso vascular puede ser iniciada mediante estímulos eléctricos, químicos o mecánicos (Davis y Hill, 1999), de manera que se han propuesto tres mecanismos para explicar el acoplamiento excitación-contracción: acoplamiento electromecánico, acoplamiento farmacomecánico y el acoplamiento mecánico propiamente dicho. A. Acoplamiento electromecánico. Es un mecanismo que causa la contracción y relajación a través de potenciales de acción o cambios rítmicos en el potencial de membrana modulando el flujo de Ca2+ a través de canales de Ca2+ voltaje dependientes (VDCCs, Voltage Dependent Calcium Channels ). El potencial de membrana de las CMLVs en reposo está en torno a -40 a -60 mV, rango en el que la probabilidad de apertura de los VDCCs es alta, de manera que pequeñas variaciones en el potencial de membrana cambia el flujo de Ca2+ a través de estos canales drásticamente (Nelson y Quayle, 1995). La despolarización y/o potenciales de acción causan un incremento de la [Ca2+]i y disparan la contracción. La hiperpolarización de la membrana da origen a la relajación por disminución de la [Ca2+]i debido al cierre de los VDCCs (Somlyo y Somlyo, 1994). El potencial de membrana depende de la actividad de muchos mecanismos de transporte de iones activos y pasivos en la membrana celular, como ATPasas, canales de K+, canales Figura 10: Regulación de la contracción en CMLVs. El grado de contracción en las CMLVs está regulado por un balance entre MLCK y MLCP. Cuando aumenta la [Ca2+]i se activa la MLCK que fosforila la MLC, iniciando la formación de puentes cruzados y la contracción. Cuando la [Ca2+]i disminuye, la MLCP desfosforila la MLC y tiene lugar la vasodilatación. CaM: calmodulina; MLCK: quinasa de la cadena ligera de la miosina; MLCP: fosfatasa de la cadena ligera de la miosina; MHC: cadena pesada de la miosina; MLC: cadena ligera de la miosina. 15 INTRODUCCIÓN de Cl-… Sin embargo, el simple hecho de la despolarización no es suficiente para activar la contracción de las CMLVs y se necesita la liberación de Ca2+ del RS. Esto se consigue gracias a la modulación de la activación del RyR mediada por Ca2+, amplificando la señalización de este ion en un proceso similar al que tiene lugar en músculo esquelético o cardiaco que se conoce como liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ (CICR, Calcium Induce Calcium Release ) (Somlyo y Somlyo, 1994; Kotlikoff, 2003 ). Este Ca2+ libre en el citosol puede activar a su vez otros canales iónicos que den como resultado una hiperpolarización (canales de K+) o despolarización (canales de Cl-) (Smani y cols., 2001), que también pueden ser activados por la acción directa de hormonas o neurotransmisores o mediante la acción de segundos mensajeros (Somlyo y Somlyo, 1994), induciendo relajación o contracción respectivamente (Figura 11A). B. Acoplamiento farmacomecánico. Consiste en un mecanismo de contracción y relajación que no está mediado por cambios en el potencial de membrana. Este mecanismo se desencadena mediante la unión de diferentes agonistas (hormonas, neurotransmisores, péptidos…) a su receptor de membrana específico iniciando una cascada de señalización que induce la contracción o relajación. Esta ruta, por tanto, implica la activación de receptores de membrana acoplados a proteína G (GPCRs, G Protein Coupled Receptors ) y la consiguiente generación de segundos mensajeros como el inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) o el AMPc, entre otros. El mayor mecanismo de acoplamiento farmacomecánico es la liberación de Ca2+ mediante IP3 Figura 11: Acoplamiento excitación-contracción en CMLVs. A . Acoplamiento electromecánico. Pequeñas despolarizaciones de membrana pueden activar los VDCCs, provocando entrada de Ca2+. Este Ca2+ estimula los RyRs e induce la liberación de Ca2+ del RS, aumentando así la [Ca2+]i. B. Acoplamiento farmacomecánico. La activación de un GPCR mediante agonista induce la producción de IP3 y la liberación de Ca2+ del RS tras la activación de los IP3Rs. C. Acoplamiento mecánico. La activación de canales catiónicos no selectivos (NSCCs) mediante cambios en la tensión o aumento del volumen celular permite el influjo de Ca2+ y Na+, contribuyendo a la respuesta contráctil al inducir despolarización y activación de VDCCs. GPCR: receptor acoplado a proteína G; m.p.: membrana plasmática; IP3: inositol 1,4,5-trifosfato; IP3R: receptor de IP3; SOCC: canal de Ca2+ regulado por reservorios; VDCC: canal de Ca2+ dependiente de voltaje; RS: retículo sarcoplásmico; RyR; receptor de rianodina . 16 INTRODUCCIÓN generado en la cascada del fosfatidilinositol (Devine y cols., 1972; Somlyo y Somlyo, 1994) (Figura 11B). La activación de un GPCR mediante agonista promueve la liberación del factor soluble IP3 mediante la activación de fosfolipasa C (PLC), que hidroliza fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) produciendo IP3 y diacilglicerol (DAG). Este IP3 soluble difunde a la región del RS más cercana, donde se encuentran los IP3Rs que actúan como canales de liberación de Ca2+, mientras que el DAG permanece en la membrana desencadenando otras vías de señalización mediante la activación de moléculas como la proteína quinasa C (PKC, Protein Kinase C ) (Taylor y cols., 2004; Chalmers y cols., 2006). IP3, por tanto, libera Ca2+ del RS incrementando la concentración de este ion en el citoplasma celular y con ello, el tono vascular (Lin y cols., 2016). C. Acoplamiento mecánico. Por último, el acoplamiento mecánico es un mecanismo de contracción que implica una distorsión física de la membrana celular, activando cascadas de señalización de segundos mensajeros y la activación de canales iónicos, como los canales de receptor de potencial transitorio o TRP ( Transient Receptor Potential ), que se han propuesto como mecanosensores respondiendo a cualquier tensión, flujo o cambio en el volumen celular, contribuyendo a la respuesta contráctil (Sharif-Naeini y cols., 2008). Algunos canales TRP actúan como canales catiónicos no selectivos (NSCCs, Non Selective Cationic Channels ) de manera al ser activados permiten el flujo de Ca2+ y Na+ al interior celular, contribuyendo a la despolarización celular y activación de VDCCs (Figura 11C). 1.3 Regulación del tono vascular. La regulación de la actividad contráctil del músculo liso vascular en la circulación sistémica depende de una compleja interacción de estímulos vasodilatadores y vasoconstrictores producto de las hormonas circulantes, neurotransmisores, moléculas derivadas del endotelio y la presión sanguínea, que serán integrados por las CMLVs determinando la contractilidad de las mismas, el diámetro y la resistencia de los vasos. Los vasos sanguíneos presentan normalmente un estado basal de contracción parcial denominada tono basal, el cual puede verse modificado dependiendo de las necesidades del organismo y su demanda de sangre. Como ya hemos visto, la contracción del músculo liso vascular está estrechamente relacionada con el potencial de membrana, aumentando por despolarización e inhibiéndose mediante hiperpolarización (Haeusler, 1983). Cualquier factor que modifique el potencial de membrana va a afectar a la contractilidad del músculo liso, aunque también puede verse alterada por factores que afecten a las proteínas contráctiles o bien a la sensibilidad a Ca2+ de la unidad contráctil (Horowitz y cols., 1996). Sin embargo, debido a que la principal causa de la contracción es el aumento de [Ca2+]i nos centraremos 17 INTRODUCCIÓN principalmente en estudiar los mecanismos que se encargan de regular los niveles citoplasmáticos de este ion. 1.3.1 Homeostasis del Ca2+ intracelular. La [Ca2+]i en CMLVs está en torno a 100 - 300 nM, bastante menos concentrado que en el medio extracelular. Mantener el gradiente electroquímico de este ion supone un gasto energético importante para la célula, pero a cambio, ésta emplea el Ca2+ para multitud de procesos biológicos como la excitación, proliferación, transcripción y contracción. Por este motivo, la célula necesita regular los niveles de Ca2+ intracelular mediante diferentes factores y mecanismos situados a distintos niveles en la misma, por medio de la entrada/extrusión del ion desde el medio extracelular y/o la liberación/recaptación desde los reservorios (Marin y cols., 1999) (Figura 12). A. Entrada de Ca2+ desde el medio extracelular. El potencial de membrana es el primer determinante de los niveles de Ca2+ citoplasmático y el tono vascular, por medio de la activación de los VDCCs. La despolarización de la Figura 12: Mecanismos envueltos en la regulación de la homeostasis del Ca2+ en CMLVs. Un agonista, tras su unión a su GPCR, puede mediar la formación de DAG e IP3 en CMLVs. El DAG puede activar ROCCs permitiendo la entrada de Ca2+ en las células, mientras que el IP3 induce la liberacón de Ca2+ del RS a través de los IP3Rs. Este vaciado de los reservorios, incita la entrada de Ca2+ a través de los SOCCs. Algunos ligandos abren los ROCCs, canales no selectivos a Ca2+ e inducen despolarización. Esta despolarización de la m.p. activa los VDCCs y provoca el aumento de la [Ca2+]i, pudiendo disparar la liberación de Ca2+ a través de los RyRs gracias a la CICR. La [Ca2+]i global se mantiene en unos niveles basales bajos gracias a las ATPasas de Ca2+ del RS (SERCA) y de la m.p. (PMCA) y al intercambiador NCX1. m.p.: membrana plasmática; GPCR: receptor acoplado a proteina G; DAG: diacilglicerol; IPe: inositol 1,4,5-trifosfato; IP3R: receptor de IP3; RS: retículo sarcoplásmico; SOCC: canal de Ca2+ regulado por los reservorios; ROCC: canal de Ca2+ regulado por receptor; VDCC: canal de Ca2+ voltaje dependiente; RyR: receptor de rianodina; SERCA: ATPasa de Ca2+ del RE/RS; PMCA: ATPasa de Ca2+ de la m.p.; NCX1: intercambiador Na+/Ca2+. 18 INTRODUCCIÓN membrana abre estos canales e induce vasoconstricción, mientras que la hiperpolarización los cierra y origina vasodilatación (Hermsmeyer, 2013). Dentro de los VDCCs, como más adelante veremos más en detalle, existen varios subtipos, siendo los canales de Ca2+ tipo L (LTCCs, L-type Ca2+ Channels ) los más importantes en CMLVs. Estos canales son la principal entrada de Ca2+, sin embargo, no son los únicos canales de Ca2+ que contribuyen al aumento de [Ca2+]i, sino que también participan otros canales no dependientes de voltaje, destacando los canales de Ca2+ regulados por receptores (ROCCs, Receptor Operated Ca2+ Channels ) y los canales de Ca2+ regulados por reservorios (SOCCs, Store Operated Ca2+ Channels ). Tanto la entrada de Ca2+ regulada por reservorios (SOCE, Store Operated Calcium Entry ) como la entrada de Ca2+ regulada por receptores (ROCE, Receptor Operated Calcium Entry ) implican un proceso altamente dinámico y regulado mediante varias proteínas y canales iónicos que funcionan como complejos macromoleculares, algunos de los cuáles posteriormente intentaremos describir, a pesar de existir todavía gran controversia sobre los mismos (Marin y cols., 1999). B. Liberación de Ca2+ del RS. Los canales de liberación de Ca2+ del RS tienen un papel esencial en la homeostasis del Ca2+ y, por tanto, en la excitabilidad celular y la reactividad vascular en CMLVs. Los dos canales principales de liberación de Ca2+ en estas células son los receptores para rianodina y para IP3. Receptor de rianodina (RyR). El RyR está compuesto por varias subunidades de gran tamaño (500 KDa) constituyendo tetrámeros. En CMLVs se expresan tres isoformas distintas (RyR1, RyR2, RyR3). RyR1 y RyR2, se han identificado en células de músculo liso de la vena portal (Coussin y cols., 2000), sin embargo, RyR2 predomina en arterias de resistencia y pequeñas arterias (McCarron y cols., 2016). Estos receptores son activados farmacológicamente por cafeína (Zucchi y Ronca-Testoni, 1997), por rianodina a concentraciones menores de 10 µM (Guerrero-Hernandez y cols., 2002) o cuando los niveles de Ca2+ de RS exceden los valores fisiológicamente normales (McCarron y cols., 2016). Además, en reposo los RyRs pueden llevar a cabo liberaciones espontáneas de Ca2+, llamadas sparks , que incrementan las concentraciones de Ca2+ localmente (Nelson y cols., 1995). Varios estudios sugieren que, a pesar de no existir un acoplamiento con los VDCCs, y más concretamente con los LTCCs, éstos pueden modular indirectamente los RyRs, incrementando la [Ca2+]i y la carga de Ca2+ del RS, amplificando la señalización de Ca2+ (Essin y cols., 2007) en un mecanismo similar a la CICR que tiene lugar en músculo estriado o cardiaco (Hamilton, 2005). Por otro lado, en el músculo liso vascular, los RyRs participan en la excitabilidad de forma indirecta modulando la actividad de los canales iónicos de la membrana plasmática. Se ha 19 INTRODUCCIÓN descrito que la actividad de los RyRs puede despolarizar la membrana de CMLVs mediante la activación de canales de Clsensibles a Ca2+ (ClCa) (Saleh y Greenwood, 2005) o activar canales de K+ activados por Ca2+ (BKCa ) promoviendo hiperpolarización y relajación de músculo liso vascular (Perez y cols., 1999), lo que refleja la importancia del RyR, al menos de forma indirecta, en la regulación de la excitabilidad del músculo liso vascular. Receptor inositol trifosfato (IP3R). El IP3R es una proteína transmembrana que actúa como canal de Ca2+ activado por IP3. Pertenece a una familia de receptores-canal compuesto por cuatro subunidades con seis dominios transmembrana cada uno, presente no sólo en el RS, sino también en otros reservorios celulares, como el núcleo. Existen tres subtipos diferentes (IP3R1, IP3R2, and IP3R3) en mamíferos y todos se expresan en diferentes tipos de arterias, aunque presentan distribuciones diferentes dentro de las mismas, siendo el subtipo IP3R1 el más prevalente en CMLVs y los subtipos IP3R2 y IP3R3 en células endoteliales (Grayson y cols., 2004; Narayanan y cols., 2012). Los IP3Rs se regulan por IP3 y también por los niveles de Ca2+ citoplasmáticos (Grayson y cols., 2004). En muchas regiones de la célula, la membrana plasmática se aproxima al RS (alrededor de 15 nm de separación) facilitando la liberación de Ca2+ de los reservorios mediante agonistas, como la noradrenalina, endotelina-1 (ET-1) o serotonina (5-HT) (Berridge, 2008). La activación de un GPCR mediante agonista promueve la liberación de IP3 y el aumento del tono vascular mediante el acoplamiento farmacomecánico (ver apartado 1.2.2B), por lo que el IP3R tiene un papel crítico en la contracción celular además de otros procesos biológicos (Lin y cols., 2016). Recientemente se ha descrito que la señalización mediada por el IP3R puede contribuir a la patología vascular. Se ha demostrado que ratones hipertensos inducidos por angiotensina II o ratas espontáneamente hipertensas muestran una mayor expresión de IP3R1, asociándose con una mayor sensibilización a la liberación de Ca2+ inducida por IP3 y, por tanto, a una vasoconstricción incrementada en respuesta a agentes vasoactivos (Abou- Saleh y cols., 2013). Además, se ha descrito que defectos en la expresión o función de los IP3Rs pueden contribuir a una disfunción vascular durante la diabetes y la ateroesclerosis (Ghosh y cols., 2017). Por ese motivo, la liberación de Ca2+ del RS mediada por el IP3R también puede deteriorar la función del músculo liso vascular durante condiciones patológicas. C. Extrusión de Ca2+ citoplasmático. La [Ca2+]i está altamente regulada principalmente por dos bombas, SERCA, que se encarga de la recaptación de Ca2+ citoplasmático hacia el RS, y la ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática (PMCA, Plasma Membrane Ca2+ ATPase ), que se encarga de la extrusión de Ca2+ desde el citoplasma hacia el medio extracelular. Además, también es relevante la participación de intercambiadores iónicos como el de Na+/Ca2+ o NCX1 (Brini y Carafoli, 2011; Zhang y Kwan, 2016) (Figura 13), de manera que así se disminuyen los niveles de Ca2+ intracelulares previniendo la activación de procesos dependientes de Ca2+ como la apoptosis, entre otros. 20 INTRODUCCIÓN ATPasa de Ca2+ del RS (SERCA). La SERCA es el único transportador de Ca2+ activo en el RS y su principal función es la de mantener la homeostasis de Ca2+, necesario para distintas funciones metabólicas como la proliferación, crecimiento, apoptosis... En células musculares, la SERCA tiene además un papel dual, por un lado controla la cantidad de Ca2+ del RS que puede ser movilizado durante la contracción, y por otro, disminuye la [Ca2+]i para permitir la relajación muscular (Chemaly y cols., 2013). Debido a que existe un flujo de Ca2+ pequeño pero continuo a través de diferentes canales iónicos, la SERCA toma un papel relevante a la hora de mantener la [Ca2+]i a niveles bajos, introduciendo Ca2+ en el interior del RS en contra de gradiente (mantiene unas 10.000 veces el gradiente de concentración entre RS y citosol), convirtiendo a este reservorio en el principal almacén de Ca2+ en el músculo liso. Esto es posible gracias a que introduce 2 iones de Ca2+ por cada molécula de ATP hidrolizada (Grover y Samson, 1986) y tiene asociada las proteínas calsecuestrina y calreticulina que desde el interior del RS se unen con iones libres de Ca2+. Esta ATPasa puede estar regulada positivamente por la CaM quinasa y por la proteína fosfolamban (Grover y cols., 1997) e inhibidas por tapsigargina (TG) (Thastrup y cols., 1990) y por ácido ciclopiazónico (CPA, Cyclopiazonic Acid ) (Darby y cols., 1996). La SERCA pertenece a una familia de bombas iónicas tipo P y se han identificado hasta 14 isoformas diferentes, pertenecientes a tres familias (SERCA1, 2 y 3), específicas de especie, tipo celular y estado del desarrollo (Chemaly y cols., 2013). De todas ellas, se han Figura 13: Mecanismos de extrusión de Ca2+ citoplasmático. Los niveles de Ca2+ intracelular se mantienen a una concentración de 100 nM aprox. gracias a la extrusión de Ca2+ a través de la membrana plasmática mediante PMCA y NCX. Además, el Ca2+ es secuestrado en el RS mediante SERCA. Por medio de canales iónicos o la señalización inducida por la activación de un GPCR, la [Ca2+]i puede aumentar drásticamente, por lo que la acción de estos mecanismos de extrusión es muy importante. PMCA: ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática; SERCA: ATPasa de Ca2+ del RE/RS; PLC: fosfolipasa C; IP3: inositol 1,4,5-trifosfato; IP3R: receptor de IP3; NCX: intercambiador Na+/Ca2+; GPCR: receptor acoplado a proteína G. Modificado de (Vetter, 2012). 21 INTRODUCCIÓN detectado 5 isoformas en corazón y aorta de ratón (SERCA2a, -2b, -3a, -3b, and -3c). En aorta, la isoforma más abundante es la SERCA2a, que representa el 91% de la cantidad total de SERCA, aunque en CMLVs también se expresa SERCA2b y SERCA3b, pero en menor proporción. Esta proporción puede cambiar en patologías como la ateroesclerosis, diabetes o infarto cardiaco (Davies, 2015). ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática (PMCA). La PMCA es una ATPasa que intercambia un ion Ca2+ del interior celular por un ion H+ del medio extracelular, siendo compensado por la extrusión de H+ mediante el intercambiador H+/Na+ de la membrana plasmática. La PMCA está presente en todas las células eucariotas y es clave en el mantenimiento de la [Ca2+]i. Es regulada por quinasas, proteínas de señalización y la CaM, de forma que, cuando aumenta la [Ca2+]i se forma el complejo Ca2+- CaM promoviendo la activación de la bomba por fosforilación de su dominio autoinhibitorio, responsable del estado inactivo. Esta activación hace que la PCMA incremente hasta 10 veces la afinidad por el Ca2+ (Zhang y Muallem, 1992). La actividad de la PMCA también se ha implicado en la vasodilatación producida por donadores de óxido nítrico (NO, Nitric Oxide ) (Cogolludo y cols., 2001). Hay 4 isoformas de PMCA, codificadas por distintos genes y específicas de tejido. La PCMA1 y 4 se expresan en todos los tejidos, mientras que PCMA2 y 3 se expresan en algunos tipos de tejidos especializados (Brini y Carafoli, 2011). Se ha descrito la presencia de PCMA1 y 4 en células de músculo liso, siendo la isoforma 4 determinante para la progresión del ciclo celular en CMLVs (Afroze y cols., 2014), sugiriendo un papel para esta ATPasa en la regulación de la proliferación celular. Intercambiador Na+/Ca2+ (NCX1). El intercambiador Na+/Ca2+ (NCX1) es una proteína transportadora ubicada en la membrana plasmática que permite tanto la entrada como la salida de Ca2+, intercambiando 1 ion Ca2+ por 3 iones Na+, aprovechando la energía cedida por la entrada a favor de gradiente de los iones Na+. El intercambiador toma un papel relevante cuando la [Ca2+]i es superior a 1 µM, ya que disminuye los niveles de Ca2+ citoplasmáticos que pueden ser tóxicos y favorece la relajación vascular (Brini y Carafoli, 2011). Además de ser transportados, los iones Na+ y Ca2+ pueden regular la actividad del intercambiador, de manera que cuando se une Ca2+ a los sitios de unión en el lado citosólico, el intercambiador se activa, mientras que si se une Na+, el intercambiador se desactiva. Sin embargo, todavía se desconoce el papel fisiológico y los mecanismos moleculares de esta regulación. En algunas ocasiones, el funcionamiento del NCX1 puede ser reversible, dependiendo del gradiente electroquímico de los iones Na+ y Ca2+. Esto ocurre cuando, por ejemplo, disminuye la concentración de Na+ en el exterior o aumenta en el citosol (Matlib y cols., 1986; Rembold y cols., 1992) o cuando la liberación de Ca2+ del RS y otros canales iónicos están inhibidos. 28 INTRODUCCIÓN 1.4.1 Canales K+ y Cl-. A. Canales de K+. En CMLVs se han detectado varios tipos de canales de K+. Los canales de K+ dependientes de voltaje (Kv) se abren tras una despolarización de la membrana plasmática, permitiendo el flujo de iones K+ hacia el exterior y la consiguiente repolarización de la membrana hasta valores de reposo. Los cambios en la [Ca2+]i y la despolarización de la membrana también estimulan canales de K+ activados por Ca2+ (BK+Ca), que tienen un papel importante en el mantenimiento del potencial de membrana y de la respuesta miogénica. Los canales de K+ sensibles a ATP (K+ATP) que se abren cuando aumentan los niveles de adenosín difosfato (ADP, Adenosine Diphosphate ) debido al uso de ATP por el metabolismo celular. Por ello, los canales K+ATP destacan el vínculo funcional tan estrecho que existe entre el metabolismo celular y la excitabilidad de la membrana. Su bloqueo da como resultado una despolarización y vasoconstricción en diversos tipos de músculo liso vascular. Los canales de K+ con rectificación interna (K+IR), que se expresan en arterias de pequeño calibre, también contribuyen al mantenimiento del tono basal y al potencial de membrana Figura 18: Canales de K+ y tono vascular. Esquema de una CMLV y secciones representativas de una arteriola. La apertura de los canales de K+ facilita el eflujo de este ion, provocando hiperpolarización de la membrana, cierre de VDCCs y disminución de la [Ca2+]i, induciendo la vasodilatación. La inactivación de los canales induce el efecto contrario. VDCC: canal de Ca2+ dependiente de voltaje. Modificado de (Firth y cols., 2011) . 29 INTRODUCCIÓN de reposo. Su activación puede llegar a incrementar la concentración de K+ extracelular hasta 10-15 nM, dando como resultado una vasodilatación (Ko y cols., 2008). Todos estos canales de K+ responden a diferentes estímulos vasoconstrictores, a través de PKC, y vasodilatadores, a través de proteína quinasa A (PKA, Protein Kinase A ), por lo que tienen un papel muy importante en la regulación del tono vascular que podríamos resumir de manera esquematizada en la Figura 18 (Jackson, 2000). El deterioro de la función de estos canales se ha relacionado con numerosas condiciones patológicas que pueden inducir, en último término, vasoconstricción. B. Canales de Cl-. Se han detectado al menos dos tipos de canales de Cl- en CMLVs: los canales de Clsensibles a Ca2+ (Cl-Ca) y canales de Clsensibles a volumen (Cl-Vol). La activación de estos canales, ya sea debido al incremento de Ca2+ mediado por agonista o por el incremento del volumen/estrechamiento de la membrana respectivamente, provoca un flujo de Clhacia el exterior que despolariza la membrana e incrementa la probabilidad de apertura de los canales CaV, dando como resultado un influjo de Ca2+ (Figura 19). Figura 19: Canales de Cl- y tono vascular. Esquema de una CMLV y secciones representativas de una arteriola. La apertura de los canales de Clfacilita el eflujo de este ion, provocando despolarización de la membrana, apertura de VDCCs e incremento de la [Ca2+]i, induciendo vasoconstricción. La inactivación de los canales provoca hiperpolarización y cierre de los VDCCs, provocando vasodilatación. VDCC: canal de Ca2+ dependiente de voltaje. Modificado de (Jackson, 2000; Firth y cols., 2011) . 30 INTRODUCCIÓN La inactivación de los canales, provoca el efecto opuesto, por tanto, las corrientes de Clestán estrechamente relacionadas con la regulación de la contracción en CMLVs y relacionadas con procesos como la proliferación o la apoptosis (Jackson, 2000; Zhang y cols., 2013). 1.4.2 Canales de Ca2+. A. Canales de Ca2+ dependientes de voltaje o VDCCs. Los VDCCs se expresan ampliamente en células excitables, aunque también en células no excitables (Badou y cols., 2013), mostrando diversas propiedades electrofisiológicas y participando en diferentes funciones fisiológicas (Catterall, 2011). Estos canales median un flujo de entrada de Ca2+ en la célula tras su activación por estímulos despolarizantes o potenciales de acción, actuando como segundo mensajero e iniciando diferentes eventos en la célula. En músculo liso, la activación de los VDCCs inicia la contracción directamente mediante el incremento de la [Ca2+]i e indirectamente mediante la activación de la liberación de Ca2+ dependiente de Ca2+ a través de los RyRs en el RS (Ghosh y cols., 2017). La familia de VDCC, también llamados canales CaV, comprende 10 genes, por lo que existen muchos subtipos que median distintas corrientes de Ca2+ dependientes de voltaje, con diferentes propiedades fisiológicas, farmacológicas y reguladoras. Desde el punto de vista funcional, dependiendo del voltaje necesario para su activación, podemos distinguir los canales de bajo umbral de activación o TTCCs, que presentan unas corrientes más débiles y transitorias a potenciales más negativos; y los canales de alto umbral de activación, donde hay varios subtipos: canales de Ca2+ tipo L, N, P, Q y R. Canales de Ca2+ tipo L o CaV1. Los LTCCs o CaV1 están codificados por 4 de los 10 genes de la familia de VDCCs y se denominan CaV1.1, CaV1.2, CaV1.3 y CaV1.4. Se pueden diferenciar de los otros 6 por su sensibilidad selectiva a 3 tipos de antagonistas (dihidropiridinas, benzodiacepinas y fenilalquilaminas) y por su característica inactivación lenta de las corrientes de Ca2+ (Liao y cols., 2005). En esta tesis, nos centraremos en el estudio de los canales Cav1.2 ya que son los principales LTCCs ampliamente expresados en CMLVs. Los CaV1 son complejos de proteínas heterooligoméricas compuestas por una subunidad α1, que forma el poro de selectividad iónica, en asociación con subunidades accesorias β, α2δ y/o γ (Figura 20). 31 INTRODUCCIÓN Como hemos nombrado, la subunidad más importante de los canales CaV1 es la subunidad α1, ya que es la formadora del poro de selectividad iónica. La subunidad α1 está compuesta por 4 dominios (I-IV) con 6 segmentos transmembrana cada uno (S1-S6). Además de los extremos N- y C- terminal citoplasmáticos, también son intracelulares los bucles de unión entre dominios I-II, II-III y III-IV. En los canales CaV1.2, la subunidad α11.2 tiene una longitud aproximada entre 1870 y 2420 aminoácidos. El segmento S4 contiene 5 o 6 residuos cargados positivamente (argininas y lisinas), lo que le permite actuar como sensor de voltaje controlando la apertura de los VDCCs. La región de poro posee un filtro de selectividad que le confiere una alta selectividad por el ion Ca2+. Además, esta subunidad posee sitios de interacción con subunidades accesorias, sitios de unión de activadores y bloqueantes, a la proteína G y supuestos sitios de fosforilación (Lacinova, 2005) (Figura 21). Por tanto, esta subunidad es la que le confiere las principales propiedades funcionales a los LTCCs, incluyendo la capacidad de sensor de voltaje, la permeabilidad a Ca2+, la inactivación dependiente de Ca2+ y la inhibición mediante bloqueantes de canales de Ca2+. Figura 20: Estructura del LTCC. Complejo heterooligomérico de proteínas que conforman el canal CaV1. Está compuesto por una subunidad α1 principal en asociación con las subunidades accesorias γ, β y α2δ. Modificado de (Doan, 2010). 32 INTRODUCCIÓN El resto de subunidades accesorias en los LTCC (β, α2δ, γ), no desempeñan un papel principal en la función del canal, sin embargo, son importantes ya que pueden modular las propiedades biofísicas y fisiológicas del mismo. Además, se han relacionado con diversas patologías, ya que se ha descrito que el aumento de expresión de la subunidad β y α2δ, incrementa la expresión y función de los LTCCs, contribuyendo a una mayor vasoconstricción durante la hipertensión (Bannister y cols., 2012). Las propiedades estructurales de la subunidad α11.2 del LTCC, proporcionan a estos canales unas características necesarias para la contracción del músculo liso a potenciales fisiológicos. Estos canales muestran un umbral de activación en torno a -40 o -30 mV y se activan completamente a los 0 mV. La inactivación es claramente dependiente de voltaje, pero también muestra un componente dependiente del Ca2+ intracelular. En comparación con los canales de Ca2+ análogos en corazón, la activación dependiente de voltaje de los CaV1.2 de músculo liso presenta un desplazamiento a un umbral más hiperpolarizado, en torno a -15 mV. Estas propiedades de activación más hiperpolarizadas de los canales CaV1.2 en el músculo liso vascular permitiría la activación de los canales con leves despolarizaciones fisiológicas del potencial de membrana, generando así una tensión suficiente en los vasos para mantener el tono vascular, ya que si los potenciales de activación dependientes de voltaje de los LTCCs de músculo liso vascular fueran similares Figura 21: Dominios estructurales de la subunidad α1 del LTCC. La subunidad α1 está compuesta por 4 dominios (I - IV) con 6 segmentos transmembrana cada uno (S1 - S6). En el S4 de cada dominio se encuentra el sensor de voltaje ya que contiene residuos con carga positiva. Entre el S5 y S6 se encuentra la región del poro y filtro de selectividad. Los sitios de interacción con las subunidades accesorias β y α2δ están indicados. En esta subunidad se encuentran los múltiples sitios de regulación que posee el LTCC. Los dominios EF hand , “A”, “C” e “IQ”, representan secuencias peptídicas específicas relacionadas con la unión a CaM. “P” indica los sitios de fosforilación de caMKII y PKA. Modificado de (Bodi y cols., 2005). 33 INTRODUCCIÓN al de los canales CaV1.2 cardiacos o neuronales, la tensión que se generaría sería mínima (Liao y cols., 2004). Se ha demostrado que el canal CaV1.2 es de vital importancia para la función del músculo liso empleando un modelo de ratón knock-out condicional específico de tejido para el gen que codifica la subunidad α11.2 del canal LTCC (Moosmang y cols., 2005). Estos ratones morían a los 21 días de inducir la pérdida del gen y, por tanto, la expresión de un canal CaV1.2 funcional. Presentaban parálisis intestinal, disminución de la presión sanguínea, disminución de reactividad vascular, obstrucción urinaria, etc., lo que nos hace deducir que el canal CaV1.2 es crítico para la función contráctil de varios tipos de músculo liso (Moosmang y cols., 2003). En este sentido, se conoce que el flujo de Ca2+ que entra a través de los LTCC, especialmente los canales CaV1.2, es la principal vía por la que aumenta la [Ca2+]i en la célula induciendo la contracción, por lo que tienen una gran relevancia en la reactividad del músculo y el tono vascular. Es por ello que, para abordar determinadas patologías en clínica como la hipertensión, angina de pecho, cardiomiopatía hipertrófica, taquicardia…, se utilizan tratamientos que actúan sobre estos canales. Como hemos nombrado anteriormente, existen 3 clases de bloqueantes de canales de Ca2+, y todos pueden unirse a la subunidad α1 de los canales CaV1.2. Sin embargo, existe una respuesta muy variable en el bloqueo de canales CaV1.2 entre el tejido muscular cardiaco y liso. Estas diferencias se deben, además de a las distintas propiedades de los canales, a las estructuras moleculares que tienen lugar por splicing alternativo en ambos tejidos, lo que ha llevado a desarrollar nuevos bloqueantes con más selectividad y con menos efectos secundarios, como las dihidropiridinas de 2º y 3º generación con gran selectividad vascular y menos efecto inotrópico y activación simpática. Sin embargo, las respuestas en los pacientes siguen siendo muy variables (Liao y Soong, 2010), debido a la gran diferencia en la estructura y función que pueden presentar los canales CaV1.2 en distintos individuos. Por esto, existe la necesidad de abordar rutas alternativas de entrada de Ca2+ por otros canales iónicos y estudiar cómo se relacionan con los canales CaV1.2 para regular la función vascular. Entre las posibles interacciones que pueden existir entre los canales CaV1.2 y otras proteínas, destacan las que tienen lugar entre éstos y TRPC1, pudiendo formar complejos macromoleculares funcionales en los que TRPC1 actuaría como un regulador de los canales CaV1.2 mediante interacción directa o indirecta (Sabourin y cols., 2011). Por otro lado, interesantemente también se han relacionado los canales CaV1.2 con Orai1, componente principal de los SOCCs, indicando la posibilidad de que estos dos canales se encuentren estrechamente conectados, tanto espacial como funcionalmente, mostrando evidencias de nuevos mecanismos de regulación de la señalización de Ca2+ (Park y cols., 2010; Wang y cols., 2010). Canales de Ca2+ tipo T o CaV3. Las corrientes de Ca2+ a través de los TTCCs son corrientes de Ca2+ más débiles y transitorias, activándose por pequeñas despolarizaciones desde potenciales muy negativos (-70 a -60 mV) e inactivándose rápidamente. No son sensibles a dihidropiridinas como la 34 INTRODUCCIÓN nifedipina (a bajas concentraciones) y no se han purificado todavía subunidades accesorias como en los LTCCs. Existen 3 tipos de TTCCs (CaV3.1, CaV3.2, CaV3.3), siendo los tipos CaV3.1 y CaV3.2, los que se expresan principalmente en el sistema cardiovascular. El papel funcional de estos canales en las CMLVs todavía no está muy claro. Sin embargo, se conoce que los TTCCs no están implicados en la vasoconstricción, aunque sí parecen ser importantes en la regulación de la respuesta miogénica. Algunos estudios en ratones knock-out para canales CaV3.1 y CaV3.2 han descrito que no existían cambios en la presión arterial de los animales ni en las respuestas contráctiles registradas en arterias coronarias aisladas, aunque sí mostraban una relajación deficiente (Mangoni y cols., 2006; Chiang y cols., 2009). Mientras que CaV3.1/CaV3.3 parecía mediar la vasoconstricción inducida por presión en la respuesta miogénica, CaV3.2 contribuía a la regulación negativa o relajación de esta contractilidad modulando la activación de canales de K+ activados por Ca2+ (BKCa) (Harraz y cols., 2015). A pesar de ello, estos canales tienen una presencia más reducida en CMLVs de fenotipo contráctil, expresándose en mayor medida en células proliferantes (House y cols., 2008), asociándose con procesos patológicos y crecimiento celular, por lo que nos centraremos en la contribución de los canales CaV1.2 a la regulación del tono vascular. B. Canales de Ca2+ regulados por receptor o ROCCs. Son canales catiónicos no selectivos permeables a Ca2+, responsables de otra vía de entrada de Ca2+ desde el medio extracelular, independiente de nivel de Ca2+ contenido en los reservorios o el potencial de membrana. Pueden abrirse o cerrarse en respuesta a la unión de un ligando como el ATP, la acetilcolina, la noradrenalina o incluso derivados lipídicos (DAG o AA) permitiendo el paso de iones Ca2+ a través de ellos. Un ejemplo de estos canales en músculo liso vascular son los canales P2X, englobados dentro de la familia de los receptores purinérgicos, que se abren en respuesta a la unión de ATP extracelular (Large, 2002). Mientras los niveles de Ca2+ citoplasmáticos se mantengan elevados, los ROCCs se mantienen en estado inactivo, evitando así, el efecto nocivo por sobrecarga de Ca2+ en la célula (Large, 2002). C. Canales de Ca2+ regulados por los reservorios o SOCCs. Los SOCCs son canales de Ca2+ localizados en la membrana plasmática que se activan tras el vaciado de reservorios, como el RS, mediante mecanismos independientes de voltaje. La activación de estos canales provoca una entrada de Ca2+ en la célula desde el exterior, denominada entrada de Ca2+ regulada por los reservorios y por su siglas en inglés “SOCE” o entrada capacitativa de Ca2+ (ECC), como inicialmente describió Putney (Putney, 1986). Esta vía de entrada de Ca2+ adquirió una especial relevancia en células no excitables, ya que se demostró que era la principal ruta de entrada de Ca2+ en estas células. Sin embargo, actualmente podemos encontrar varias publicaciones que describen la presencia de estos canales también en células excitables (Correll y cols., 2015; Moccia y cols., 2015), incluyendo CMLVs recién aisladas o en cultivo primario tanto de arterias de resistencia como otras sistémicos (Smani y cols., 2004; Smani y cols., 2007; Smani y cols., 2008). 35 INTRODUCCIÓN Esta ruta de entrada de Ca2+ está implicada en el mantenimiento de la homeostasis del Ca2+ debido a su relación funcional con los reservorios intracelulares de Ca2+ (RS y mitocondria), por lo que, en CMLVs, SOCE puede regular muchas funciones celulares, como la contracción o la proliferación. A pesar de seguir en estudio desde hace muchos años, todavía existe controversia acerca de los mecanismos de activación de esta ruta, su papel fisiológico o todos los componentes moleculares que participan en la misma. En el apartado 1.5 detallaremos esta ruta y sus componentes en mayor profundidad. D. Otros canales catiónicos (canales TRP). La búsqueda de los componentes moleculares de SOCE, iniciada hace más de 20 años, condujo al descubrimiento de una nueva superfamilia de canales catiónicos, los canales TRP. Los mamíferos codifican 28 subunidades de proteínas TRP distintas, que se pueden agrupar en 6 subfamilias: TRPC (TRP Canonical ), TRPV (TRP Vanilloid ), TRPM (TRP Melastatin ), TRPA (TRP Ankyrin ), TRPML (TRP Mucolipin ) y TRPP (TRP Polycystin ) (Montell, 2005). Los canales TRP son, con frecuencia, descritos como canales catiónicos no selectivos o específicos, aunque esta definición no es del todo precisa. Algunos canales TRP son altamente selectivos al Ca2+, como TRPV5 o TRPV6 (Yue y cols., 2001), mientras que otros son más selectivos a iones monovalentes (Na+ y K+) y relativamente impermeables a Ca2+ u otros iones divalentes como TRPM4 (Nilius y cols., 2003) y TRPM5 (Prawitt y cols., 2003). Sin embargo, algunos canales son permeables tanto a cationes monovalentes como divalentes, como los canales TRPC1 (Strubing y cols., 2001). Aparte, algunas subfamilias poseen un dominio TRP, cuya función se desconoce, y múltiples sitios de interacción, elementos reguladores y dominios enzimáticos en los extremos intracelulares. En CMLVs se expresan varios canales TRP. Muchos estudios sugieren que los canales TRPC1, TRPC4 y TRPC5 pueden actuar como SOCCs en CMLVs, sin embargo, varios autores demostraron que SOCE puede tener lugar en ausencia de estos canales. Otros estudios han determinado que los canales TRPCs son necesarios para que tenga lugar SOCE en determinadas circunstancias, mientras que otros han descrito que Orai1 puede actuar como un componente regulador de los SOCCs compuestos por subunidades de TRPC1 o viceversa (Ambudkar y cols., 2007; Cheng y cols., 2011), quedando por resolver todavía la relación funcional que existe entre STIM1, Orai1 y TRPC1 durante SOCE. De cualquier forma, gracias a sus propiedades como canales catiónicos, los canales TRPCs contribuyen a la regulación del potencial de membrana, a la contracción y al mantenimiento del tono miogénico. Además, pueden participar en la señalización de receptores acoplados a proteína G modulando la actividad vasodilatadora y vasoconstrictora y la proliferación celular, por lo que una función alterada de estos canales puede relacionarse con enfermedades como la hipertensión arterial, daño de la neoíntima, edema pulmonar… (Earley y Brayden, 2015). 36 INTRODUCCIÓN 1.5 Entrada de Ca2+ regulada por reservorios o SOCE. Como ya hemos comentado anteriormente, SOCE fue descrita inicialmente por el Dr. Putney en el año 86 (Putney, 1986), a la que llamó ECC o entrada capacitativa de Ca2+, reflejando la idea de que el Ca2+ entraba en el citoplasma desde el exterior atravesando la membrana del RS, por lo que asumía que tendría que estar conectado directamente con el exterior. No fue hasta el año 95 cuando la ECC fue renombrada como SOCE, para referirse más explícitamente al modo de activación, el vaciado de los reservorios, y distinguirla de la entrada de Ca2+ regulada por voltaje, ligandos o receptores. Los primeros estudios electrofisiológicos acerca de SOCE se realizaron en mastocitos de rata en el año 92, en los que se descubrió que el vaciado de los reservorios de Ca2+ intracelulares, inducía la aparición de una corriente no conocida, pequeña y muy selectiva a Ca2+, que denominaron ICRAC o corrientes de Ca2+ activadas por liberación de Ca2+ (CRAC, Ca2+ Release Activated Ca2+ ) (Hoth y Penner, 1992). Sin embargo, las corrientes CRAC no serían las únicas corrientes activadas por el vaciado de los depósitos intracelulares, ya que pronto se describieron nuevas corrientes denominadas ISOC o corrientes SOCs ( Store Operated Channel ), que también dependían de los reservorios intracelulares y no del potencial de membrana, pero que presentaban propiedades electrofisiológicas diferentes a ICRAC, ya que eran corrientes catiónicas pero poco selectivas a Ca2+. Desde su descubrimiento, se necesitaron muchos años de investigación para descubrir los principales componentes moleculares de SOCE: las proteínas STIM1 ( Stromal Interaction Molecule 1 ) y Orai1 (Roos y cols., 2005; Vig y cols., 2006). Aunque en mamíferos podemos encontrar 2 proteínas STIM (STIM1 y STIM2) y 3 proteínas Orai (Orai1, Orai2 y Orai3), los isotipos que predominan en CMLVs son STIM1 y Orai1. STIM1 es un sensor de Ca2+ del RS que tras el vaciado del reservorio oligomeriza e interacciona con los SOCCs en la membrana plasmática, constituidos por varias subunidades de Orai1 (Lewis, 2007), activando así la entrada de Ca2+ (Figura 22). Otras proteínas propuestas como posibles SOCCs fueron los canales TRP (Montell, 2005), siendo el canal TRCP1 el principal candidato (Beech, 2005). Sin embargo, existe mucha controversia sobre la participación de los canales TRPCs en SOCE y han sido sugeridos como ROCCs (Gudermann y cols., 2004). 37 INTRODUCCIÓN Más tarde se supo que las corrientes CRAC estaban mediadas principalmente por Orai1 en células no excitables, ya que el silenciamiento de la expresión de esta proteína en estas células, reducía drásticamente estas corrientes de Ca2+ y SOCE. En cambio, las corrientes SOC son corrientes catiónicas poco selectivas para el Ca2+, propias de células excitables, que podrían ser mediadas por TRPC1, por complejos formados por TRPC1 y Orai1, o incluso por otros canales TRPC (Bolotina, 2008). Cada vez hay más publicaciones que sugieren la contribución de SOCE en el desarrollo y progresión de varias patologías, como veremos más adelante (Motiani y Trebak, 2012). 1.5.1 Componentes moleculares. A. STIM1. El gen que codifica para STIM1 se logró clonar en el año 1996 (Parker y cols., 1996), pero no se relacionó con la señalización de Ca2+ hasta más tarde. Gracias a los ARN de interferencia, STIM1 se identificó en 2005 como sensor de Ca2+ del RS y activador de SOCC en la membrana plasmática (Liou y cols., 2005; Roos y cols., 2005). Mediante un cribado en líneas celulares humanas, se describieron dos genes que codificaban para STIM, STIM1 y STIM2 (Liou y cols., 2005), a diferencia de lo que se identificó en células de Drosophila S2, que sólo poseían un gen para STIM (Roos y cols., 2005). STIM1 es un polipéptido (~685 aminoácidos) con un sólo segmento transmembrana. Inicialmente se describió como una fosfoproteína glicosilada expresada principalmente en Figura 22: Entrada de Ca2+ regulada por reservorios. Esquema representativo de SOCE. Cuando se produce el vaciado de los reservorios (RS), se induce la oligomerización de STIM1 y su interacción con Orai1, permitiendo que estos canales se abran y entre Ca2+ hacia el interior celular. RS: retículo sarcoplásmico. Modificado de (Prakriya y Lewis, 2015). 44 INTRODUCCIÓN Orai1 tiene lugar principalmente por el incremento de los niveles de Ca2+ citoplasmáticos, que induce el desacoplamiento de STIM1 (Deng y cols., 2009). Como ya hemos visto, STIM1 es capaz de activar e inactivar Orai1 sin la necesidad de proteínas adicionales in vitro . Sin embargo, esto no descarta la posibilidad de que el proceso sea modulado in vivo por otras proteínas accesorias o condiciones ambientales. Actualmente, se han aislado muchas proteínas de unión a STIM y Orai como CRACR2A, Homer, Filamina A, Golli, CaM, SARAF… (Lopez y cols., 2016). Estas proteínas, reguladoras o moduladoras, pueden controlar la actividad de los SOCCs, aunque todavía no se conocen con exactitud los mecanismos. Entre las mejor caracterizadas, destacamos la proteína reguladora CRACR2A. Es una proteína citosólica que contiene dominios EF hand , capaz de unirse directamente a STIM1 y a Orai1 formando un complejo ternario para estabilizar la interacción entre ambos (Srikanth y cols., 2010) y aumentar SOCE. Una vez que se reduce el aumento de la [Ca2+]i, el Ca2+ se une a los dominios EF hand de CRACR2A promoviendo su disociación de STIM1- Orai1, desestabilizándolo. Otras proteínas reguladoras de SOCE son Homer y SARAF ( SOCE-Associated Regulatory Factor ). Hay estudios que describen evidencias de una asociación directa o indirecta de la proteína citoplasmática Homer1 con STIM1, TRPC1 y Orai1, regulando la entrada de Ca2+ a través de estos canales y la agregación plaquetaria (Jardin y cols., 2012). Por otro lado, el factor regulador de SOCE, SARAF, una proteína localizada en la membrana del RS, es capaz de interaccionar con STIM1 regulando negativamente la activación de SOCE para prevenir de una sobrecarga de Ca2+ (Palty y cols., 2012). En definitiva, la activación e inactivación de SOCE es un proceso estrictamente regulado y en el que están implicadas multitud de proteínas. 1.5.3 Papel fisiopatológico de SOCE en el sistema vascular. La estrecha relación de SOCE con los niveles de Ca2+ del RS hacía pensar que la única función que tenía SOCE era rellenar los reservorios intracelulares tras el vaciado de los mismos por la unión de un agonista a su receptor. Sin embargo, el incremento mantenido de los niveles de Ca2+ citoplasmáticos que tiene lugar tras la entrada de Ca2+ por los SOCCs, hacía pensar que no sólo sirva para rellenar los reservorios, sino que también participaba en la regulación multitud de funciones celulares como regulación génica, proliferación, contracción, migración y diferenciación celular. Esto se ha comprobado en varios estudios con pacientes humanos o con ratones transgénicos con pérdida o ganancia de función de los genes de STIM1 u Orai1, en los que se han descritos graves defectos funcionales en el sistema inmune, muscular, vascular, etc. (Vandenberghe y cols., 2013). Fisiológicamente, en el músculo liso vascular, un GPCR estimulado por un agonista puede desencadenar la producción de IP3 mediante la PLC. Este IP3 induce la liberación de Ca2+ del RS a través de su receptor IP3R, siendo esta depleción de los reservorios de Ca2+ la señal que dispara la activación de los SOCCs. Además, como ya hemos nombrado anteriormente y podemos revisar en la Figura 25, SOCE puede ser activada farmacológicamente mediante 45 INTRODUCCIÓN inhibidores específicos de SERCA, como la TG o el CPA, que vacían los depósitos intracelulares de Ca2+ de forma pasiva sin la producción de segundos mensajeros. STIM1 y Orai1, componentes principales de SOCE, además de TRPC1, se expresan en células de la vasculatura y median esta entrada de Ca2+ tanto en células endoteliales como en CMLVs (Spinelli y Trebak, 2016). En nuestro grupo hemos descrito la participación de estos componentes en la vasoconstricción producida por agonistas, como la urotensina-II en arteria coronaria y aorta de rata (Dominguez-Rodriguez y cols., 2012; Rodriguez-Moyano y cols., 2013). También se ha descrito la participación de los SOCCs en la contracción producida por agonistas vasoconstrictores endógenos, como la ET-1 (Kawanabe y cols., 2006) o la 5-HT (Alapati y cols., 2007; Avila-Medina y cols., 2016) entre otros, en distintos tipos de arterias, ya que estos agonistas regulan la función vascular actuando sobre su GPCR que induce la producción de IP3 a través de la PLC y el vaciado de los reservorios intracelulares de Ca2+. Interesantemente, como hemos ido comentando anteriormente, hay evidencias que demuestran que TRPC1, Orai1 y CaV1.2 pueden interactuar con otras proteínas para formar complejos de señalización en CMLVs. TRPC1 puede interaccionar con Orai1 participando en la proliferación en aorta de rata (Rodriguez-Moyano y cols., 2013), con el canal BKCa (Kwan y cols., 2009) o incluso con el canal CaV1.2 participando en la regulación de la conducción cardiaca, actividad ventricular y contractilidad (Sabourin y cols., 2011). Por otra parte, Orai1 puede formar complejos heteromultiméricos con Orai3 para mediar una entrada de Ca2+ independiente de los reservorios y activada por AA dando lugar a corrientes IARC (Spinelli y Trebak, 2016), o con el canal de K+ activado por Ca2+ SK3 para regular la contracción inducida por agonista en músculo liso (Song y cols., 2015). Por lo tanto, teniendo en cuenta que la principal ruta de entrada de Ca2+ en CMLVs tiene lugar a través de los LTCCs, sería necesario estudiar cómo Orai1 y TRPC1 pueden influenciar a estos VDCCs en la señalización de Ca2+ para entender el papel fisiológico de los SOCCs en la contracción vascular. MATERIALES Y MÉTODOS 49 MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Equipamiento. 2.1.1 Miógrafo multicanal. El miógrafo nos permite la caracterización de las propiedades y funciones fisiológicas de distintos vasos sanguíneos in vitro . Este sistema es esencial para estudiar los efectos de distintas drogas o fármacos, así como de otros compuestos vasoactivos como péptidos o neurotransmisores, en arterias o venas, con unas condiciones muy similares a las fisiológicas, ya que éstas mantienen muchas de las características que poseen in vivo . A. Miógrafo de Mulvany. En este caso, se utilizó un miógrafo multicanal “Mulvany-Halpern 610 M” (JP Trading, Dinamarca), para realizar estudios in vitro de la función vascular en arterias de pequeño diámetro. Consta de 4 canales en los que cada unidad, hecha de aluminio, posee una cámara central de acero inoxidable con una capacidad de 8 ml. Los brazos, que servirán como soporte para el tejido, están unidos, por un lado, a un micrómetro y, por otro lado, a un transductor de fuerza (Figura 27). En cada unidad se puede controlar individualmente la entrada de gas y la succión, de manera que nos permitía mantener el tejido en condiciones fisiológicas (37 ºC, burbujeado con mezcla de 5% CO2 y 95% O2). Añadiendo los compuestos de interés directamente a la cámara, pudimos estudiar in vitro la contractilidad y reactividad de los vasos en condiciones isométricas. B. Software. Para registrar la medida de la fuerza isométrica se utilizó el software informático “Myodaq‐ 2.01” (Danish Myotechnologies, Dinamarca) y para el análisis de datos el software Figura 27: Miógrafo de Mulvany. A. Cada unidad del miógrafo contiene un micrómetro (derecha) y un transductor de fuerza (izquierda), conectados a unos soportes sobre los que se montarán los anillos arteriales. B. Cámara en la que se visualizan los soportes y el anillo montado en su interior. C. Detalle de los soportes, alambres, tornillos y anillo arterial montado. Modificado de (www.dmt.dk ). 50 MATERIALES Y MÉTODOS “Myodata-2.02” (Danish Myotechnologies, Dinamarca), de acuerdo con los protocolos previamente descritos (Mulvany y Halpern, 1977). 2.1.2 Sistema de microfluorometría de Ca2+. Para registrar la [Ca2+]i de CMLVs se emplearon técnicas microfluorométricas, con el FURA- 2 como sonda fluorescente. Este marcador fluorescente (Tsien y cols., 1985) actúa como quelante de Ca2+, ya que se une con varios grupos carboxilos (-COOH) con gran afinidad a este ion divalente y no a otros, ni tampoco a otros iones monovalentes (Grynkiewicz y cols., 1985) (Figura 28). Es altamente selectivo para el Ca2+ y casi insensible a pequeñas fluctuaciones en el rango fisiológico del pH. Su estructura deriva del potente quelante de Ca2+, EGTA ( Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N ′ ,N ′ -tetraacetic acid ). Hemos usado la forma esterificada del FURA-2, FURA-2 AM, que es permeable a través de la membrana plasmática de las células. Al penetrar en las células, las propias esterasas hidrolizan este fluoróforo quedando libre en el citosol pudiendo quelar el Ca2+ disponible. Cuando esta molécula es excitada, emite fluorescencia a una determinada longitud de onda (λ) con un máximo relativamente independiente de la concentración de calcio. El mayor rango dinámico para las señales de fluorescencia dependientes de Ca2+ se obtiene cuando el fluoróforo se excita a 340 nm, en la que la fluorescencia cambia de forma directamente proporcional al aumento de la [Ca2+]i, y 380nm, en la que la fluorescencia cambia de forma inversamente proporcional al aumento de la [Ca2+]i. La ratio de las intensidades de fluorescencia emitidas a 510 nm nos da una estimación de los cambios la [Ca2+]i (Figura 29). Usando la ratio de las intensidades de fluorescencia emitidas por la excitación a esas dos λ conseguimos minimizar el efecto de una distribución irregular del marcador fluorescente y el photobleaching, ya que deberían afectar a ambas medidas con la misma magnitud. Figura 28: FURA-2. Estructura química del FURA-2 que forma complejo con el Ca2+. 51 MATERIALES Y MÉTODOS A. Microscopio. La fluorescencia fue monitorizada usando un microscopio invertido “Nikon Eclipse TS-100“ equipado con un objetivo 20X flúor (0,75 NA). Este microscopio está equipado con un espejo dicroico de 510 nm y filtros de emisión para la misma longitud de onda, lo que nos permitió hacer incidir la luz, que proviene de una fuente de luz (monocromador), sobre las células y recolectar la fluorescencia emitida por la mismas. B. Cámara CCD. La imagen fue captada con una cámara CCD de 12 bits sensible a la luz acoplada al microscopio invertido (“Cooke PixelFly”, ASI, USA.). C. Monocromador. Para seleccionar las longitudes de onda necesarias para la excitación del FURA-2, 340 nm y 380 nm, utilizamos un monocromador, que no es más que dispositivo óptico que permite seleccionar y transmitir una estrecha banda de longitudes de onda, a partir de una fuente emisora (lámpara de xenón) que produce una amplia gama de longitudes de onda. D. Software. Para el análisis y control de las fluorescencias de emisión y excitación se usó el programa “InCyt Im2” (Intracellular Imaging Inc., UK) que permite registrar al mismo tiempo la fluorescencia emitida con las dos longitudes de onda de excitación y realizar el cociente o “ratio” entre ambas. Las células se excitaron a 340 y 380 nm y la longitud de onda emitida se recolectó a 510 nm. La estimación de los cambios en la [Ca2+]i se obtuvo a partir de la ratio (R) entre las señales de F340/F380 nm (Smani y cols., 2003). Figura 29: Espectro de fluorescencia FURA-2. Espectro de fluorescencia de excitación del FURA-2 a distintas concentraciones de Ca2+ libre. El mayor rango dinámico para las fluorescencias dependientes de Ca2+ se obtienen cuando excitamos a 340 nm y 380 nm. La emisión se recoge a 510 nm. Modificado de (www.thermofisher.com) . 52 MATERIALES Y MÉTODOS 2.1.3 Microscopía. A. Microscopía convencional. Microscopio óptico. Para la adquisición de imágenes de epifluorescencia se utilizó un microscopio invertido “IX71“ (Olympus , Tokio, Japón). Consiste en un sistema equipado para la adquisición de imágenes en campo claro, con y sin utilización de contraste interferencial de Nomarski , y de fluorescencia. El sistema está equipado con una lámpara halógena y una fuente de iluminación tipo LED “Precis Excite”, una cámara digital en color profesional para microscopia DP72, con resoluciones de hasta 4140 x 3096 y unos filtros para excitación en UV (entre 360 – 370 nm), en azul (entre 470 – 490 nm) y en verde (entre 530 – 550 nm). Para la adquisición empleamos dos objetivos principalmente, 20x (LUCPLFL20x/0.45) y 40x (LUCPLFL40x/0.60). Software. Para la adquisición de imágenes se utilizó un software de análisis de imagen intuitivo para aplicaciones biomédicas en microscopía ”CellSens, CELL-A”, integrando control de cámaras y microscopio monitorizado y adquisición de imágenes con autofocus, mediciones interactivas, edición… Para el procesado de las mismas, se empleó el software Image J, de libre distribución (National Institutes of Health, USA). B. Microscopía confocal. Microscopio confocal. Para la adquisición confocal directa de la fluorescencia en células o tejido, utilizamos un sistema espectral confocal y multifotónico “TCS SP2” (Leica). Este sistema permite crear un solo plano focal, así como toda una serie de planos (horizontales o verticales). Un corte único vertical o un barrido XZ, ofrece una vista lateral de la muestra. La recogida de una secuencia de cortes ópticos de la muestra como lote de imágenes y su posterior procesamiento digital presenta la ventaja de que este bloque de datos de varias dimensiones permite generar una imagen bidimensional calculada (proyección) o una representación reducida en 3 dimensiones de la muestra. El sistema TCS SP2 de Leica está equipado con un microscopio “DM IRE2” motorizado, una lámpara halógena y de mercurio y varios láseres: Diodo-azul 405 nm, Argón-Kriptón 458–514 nm, DPSS561 561nm, Helio-Neón 543 nm y Helio-Neón 633 nm. Para la adquisición se utilizó principalmente un objetivo de inmersión con un aumento de 63x (HCX Pl Apo CS 63×/1,3). 53 MATERIALES Y MÉTODOS Software. La adquisición de las imágenes se realizó utilizando la plataforma de software integrada, “LAS AF” ( Leica Application Suite ; Leica Microsystems, Alemania). Para el procesado de las mismas, se empleó el software Image J, de libre distribución (National Institutes of Health, USA). 2.1.4 Criostato. El criostato utilizado es un criostato clínico para cortes de gran calidad “CM1950” (Leica), que puede congelar hasta -35°C de Tª. En el laboratorio, las muestras se procesaban a una Tª entre -20°C y -25°C. Para realizar los cortes en criostato hemos utilizado OCT ( Optimum Cutting Temperature ; Sakura Finetek, USA), un medio sintético que favorece la realización de cortes en criostato a Tª muy bajas (-20 ºC). El OCT es una mezcla comercial de alcohol polivinílico, polietilenglicol y excipientes de composición reservada que nos permite la inclusión de la biopsia sin fijación previa, ya que a esa Tª se detienen los procesos biológicos de la muestra y la hace apta para estudios inmunohistoquímicos. Una vez obtenidos los cortes y adheridos sobre portaobjetos, el cambio de Tª (de -20º a Tª ambiente) provoca la desecación de los tejidos, manteniendo a las enzimas proteolíticas inactivas. Sin embargo, antes de comenzar con las tinciones inmunohistoquímicas es conveniente fijar los cortes histológicos con algún agente químico adecuado (acetona fría, vapores de formol, metanol…), a fin de evitar que se reinicie la actividad proteolítica. 2.2 Soluciones. 2.2.1 Solución para registro de la contractilidad arterial. Para el registro de la fuerza isométrica, se utilizó solución Krebs cuya composición se muestra en la Tabla 1. Tabla 1: composición de la solución de Krebs. Composición Concentración (mM) NaCl 118,5 KCl 4,7 CaCl2 2,5 NaHCO3 24,8 MgSO4 1,2 KH2PO4 1,2 Glucosa 5 60 MATERIALES Y MÉTODOS tampón rojo, conteniendo dNTPs, MgCl2 y amplificadores a concentraciones adecuadas que evitan la necesidad de realizar una optimización previa. Además, nos permite cargar directamente el producto de PCR en el gel de agarosa para llevar a cabo la electroforesis sin necesidad de añadir tampón de carga. Por lo tanto, tan sólo teníamos que añadir la muestra (1 µg ADN genómico), los oligonucleótidos específicos para los genes de CaV1.2 y recombinasa Cre (20 µM, ver Tabla 10), H2Obd y el tampón de reacción “MyTaq Red Reaction Buffer” (5x). Gen Etiqueta Oligo Secuencia Casa Comercial CaV1.2 (CACNA1C) VI4 5’ TGGCCCCTAAGCAATGA 3’ Sigma VI8 5’ AGGGGTGTTCAGAGCAA 3’ VI10 5’-CCCCAGCCAATAGAATGCCAAT-3’ Cre RF67 5’ CTCAGAGTGGAAGGCCTGCTT 3’ RF90 5’ CACACCATTCTTCAGCCACA 3’ SC135 5’ GGCGATCCCTGAACATGTCC 3’ Tabla 10: Oligonucleótidos utilizados en el genotipado de ratones CaV1.2KO. La tabla muestra los genes cuya expresión fue estudiada mediante PCR convencional utilizando los oligonucleótidos correspondientes, con su etiqueta y secuencia completa, adquiridos en Sigma. A los productos de la PCR convencional (condiciones en Figura 30) se les hizo una electroforesis en gel de agarosa al 1,5% a 120 V durante 40min y se observaron en un sistema de documentación de geles de agarosa “Bio Doc-it Imaging System” (UVP). 2.4.2 Registro de la contractilidad arterial. A. Extracción y preparación del tejido vascular. Las arterias, una vez extraídas, se colocaron en solución Krebs burbujeada con 5% CO2 y 95% O2 para mantener el pH a 7,4 y se limpiaron de tejido conectivo o adiposo. Posteriormente, se cortaron en anillos de unos 3 mm aproximadamente para proceder con los experimentos en el miógrafo, tras la previa eliminación mecánica del endotelio para centralizar el estudio en la capa de músculo liso. Figura 30: condiciones PCR convencional para el genotipado de ratones CaV1.2KO. 95ºC 1min 56ºC 15s Síntesis Desnaturalización Hibridación 95ºC 15s 72ºC 10s 4ºC ∞ X35 61 MATERIALES Y MÉTODOS B. Registro contractilidad arterial en miógrafo. Los anillos arteriales se montaron en el miógrafo usando unos alambres de acero inoxidables de unos de 40 μm de diámetro. Estos alambres se introdujeron a través de los anillos y se fijaron a los dos brazos existentes, uno de ellos unido, como hemos dicho anteriormente, a un dinamómetro y otro, a un transductor de fuerza; quedando sumergido el anillo en solución Krebs dentro de cada cámara del sistema. Los anillos aórticos de ratón, estando en condiciones fisiológicas (37 ºC y burbujeados con 5% CO2 y 95% O2), fueron llevados a una tensión basal de 2,5 mN y estabilizados durante, al menos, 1 h. En el caso de las arterias coronarias de rata, la tensión basal se determinó tras la normalización mediante software (ver (Dominguez-Rodriguez y cols., 2012)). El registro de la fuerza isométrica fue continuo y con una frecuencia de adquisición de 4 puntos por segundo. Los cambios de soluciones en cada cámara se realizaron de forma discontinua mediante la succión de la solución contenida con la ayuda de un equipo de vacío y la posterior administración de la nueva solución mediante una jeringa. Los fármacos usados en estos experimentos fueron administrados directamente a la cámara. Para evaluar la correcta eliminación funcional del endotelio y su integridad se utilizaron concentraciones crecientes de acetilcolina (hasta 10 μM) para observar la ausencia de dilatación tras la contracción producida por fenilefrina (1 μM). La respuesta contráctil o la reactividad de la arteria a un determinado estímulo se expresa como incrementos de fuerza o tensión, medida en milinewtons (mN). La contracción se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula, siendo la tensión final, la vasoconstricción que se alcanza tras el estímulo y la tensión basal , la tensión en situación de reposo obtenida tras el proceso de estabilización: 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝑚𝑁) = 𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛 𝑏𝑎𝑠𝑎𝑙 Como se indica en la mayoría de los experimentos, las respuestas de contracción frente a un estímulo fueron normalizadas a una primera contracción inducida por un estímulo despolarizante como una alta concentración de KCl (70K, 70 mM). Además, se expresaron como porcentaje de los casos control. 2.4.3 Aislamiento de CMLVs. A. Extracción y preparación del tejido vascular. Tras la extracción de la arteria, ésta se colocó en SD fría para limpiar todo el tejido conectivo o adyacente. Posteriormente, se cortó la arteria longitudinalmente para eliminar la capa íntima endotelial con la ayuda de una torunda de algodón y se troceó para proceder con la digestión enzimática del tejido. B. Digestión enzimática del tejido vascular y aislamiento de CMLVs. La arteria aorta se incubó con 1-2 mg/ml de elastasa (4 U/mg) y 4 mg/ml de colagenasa tipo I (125 U aprox./mg) (Sigma) en SD durante 1 h a 4 ºC y después, durante unos 14- 62 MATERIALES Y MÉTODOS 15 min a 37 ºC. Cuando el tejido mostraba signos de digestión, los restos se trasladaron a SD sin enzimas y se dispersaron mecánicamente con ayuda de unas pipetas de vidrio de distintos calibres con la punta pulida. Las CMLVs, ya listas para ser empleadas en los experimentos, podían distinguirse fácilmente por su tamaño y su forma fusiforme o elipsoidal típica de músculo liso (Figura 31). Para el aislamiento de CMLVs de arteria coronaria de rata, éstas se incubaron con 1 mg/ml de elastasa (4 U/mg) y 2 mg/ml de colagenasa tipo I (125 U aprox./mg) (Sigma) en SD durante 45 min a 4 ºC y después, durante unos 12 min a 37 ºC. 2.4.4 Registro de la [Ca2+]i. A. Incubación de CMLVs con FURA-2 AM. Las CMLVs aisladas se sembraron sobre cubres de pequeño tamaño en la misma SD y se dejaron adherir a la superficie de los mismos durante al menos 15 o 20 min Posteriormente, se añadieron 2 ml de SD conteniendo FURA-2 AM (Invitrogen), a una concentración de 2,5 µM, y CaCl2 a 0,5 µM durante 30 min a Tª ambiente. Transcurrido el tiempo de incubación, las células se lavaron con SD sin fluoróforo con 1 µM de CaCl2 y se mantuvieron a 4 ºC hasta el inicio de los experimentos. B. Medida de la [Ca2+]i. Como explicamos en el apartado 2.1.2, cuando excitamos las células a 340 nm, la fluorescencia emitida cambia proporcionalmente con el aumento de la [Ca2+]i, mientras que, a 380 nm, cambia de forma inversamente proporcional al aumento de la [Ca2+]i (Figura 32A). De esta forma, podemos determinar la ratio F340/380 (ratio = F340/F380) y las variaciones en la [Ca2+]i tras aplicar un estímulo concreto, ya que los cambios de la [Ca2+]i producidos se podrán estimar calculando la diferencia entre el pico máximo de la ratio después de Figura 31: CMLVs aisladas de aorta de ratón. 63 MATERIALES Y MÉTODOS añadir dicho estímulo y valor basal de la ratio antes de añadir el mismo (∆ratio) (Figura 32B), expresado en unidades arbitrarias. Los experimentos se hicieron con perfusión continua en PSS a Tª ambiente. Se utilizó PSS 70K con objeto de inducir una despolarización de la membrana plasmática de las células y comprobar los cambios en la [Ca2+]i que tenían lugar debido a la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular a través de los VDCCs. Los valores de ∆ratio fueron normalizados a la respuesta producida por 70K, cuando fue posible, y expresados como porcentaje de los casos control. Mediante software, a cada experimento le restamos la señal background , establecida fuera de foco, para evitar posibles artefactos que afecten a las fluorescencias y a la señal obtenida. 2.4.5 Transferencia de anticuerpos en anillos arteriales. A. Chariot como agente de transferencia. Para estudiar la implicación de algunas proteínas en la contracción intentamos inhibirlas funcionalmente mediante la transferencia de anticuerpos en anillos arteriales de aorta. Para ello, empleamos el método “Chariot” (Active Motif), una nueva técnica de transferencia que elimina muchos problemas que encontramos con otros procedimientos. Chariot es un péptido que forma enlaces no covalentes con otras macromoléculas, de manera que las estabiliza y evita su degradación durante el proceso de transferencia. Cuando se introduce en la célula, Chariot se degrada y deja la proteína completamente libre y activa, ya que es independiente de la vía endosomal, que puede afectar a la integridad de las moléculas durante la internalización. Figura 32: Fluorescencia medida a 340 y 380 nm. A. Intensidad de fluorescencia registrada a ambas longitudes de onda de excitación tras la aplicación de un estímulo. B. Ratio de las fluorescencias obtenidas (F340 / F380). La diferencia entre la ratio máxima obtenida y la ratio basal (∆ratio), nos permite estimar los cambios en la [Ca2+]i. Modificado de (González-Ramos y cols., 2013) . 64 MATERIALES Y MÉTODOS B. Extracción y preparación del tejido vascular. El tejido vascular utilizado para la transferencia con Chariot fue aorta de ratones C57BL/6. Una vez extraída la aorta torácica rápidamente, se colocó en SD fría con pH a 7,4 y se limpió de tejido conectivo o adiposo. Ésta se cortó en anillos de unos 3 mm aproximadamente para proceder con los experimentos de transferencia con Chariot. C. Transferencia de anillos arteriales de aorta. Para inhibir la función de la proteína Orai1 y estudiar su implicación en la contracción arterial, transferimos el anticuerpo monoclonal mouse anti-Orai1 (Novus Biologicals) con éste método (Giachini y cols., 2009; Dominguez-Rodriguez y cols., 2012). Para cada transferencia, se preparó una mezcla con 12 µl de Chariot diluidos en 100 µl de DMSO al 40% y 12 µl de anticuerpo diluidos en 100 µl de PBS, que se dejó incubar a Tª ambiente durante 30 min para que se formaran los complejos Chariot/Anticuerpo. Una vez formados los complejos, los anillos arteriales se traspasaron a una placa de cultivo con la mezcla (200 µl) y se añadió 400 µl de DMEM sin FBS ( Fetal Bovine Serum ), dejándose durante 1 h a 37 ºC y 5% CO2 en un incubador. Posteriormente, se añadieron 750 µl de DMEM, sin FBS, y se dejó incubar durante 2 h a 37 ºC y 5% CO2 (ver protocolo en Figura 33). Como control negativo, transferimos los anillos arteriales de aorta mediante el mismo protocolo utilizando únicamente el agente de transferencia Chariot, sin macromolécula. Los anillos transferidos fueron sometidos a registros de contractilidad en el miógrafo, siguiendo el protocolo descrito anteriormente, y procesados en el criostato para inmunohistofluorescencia, siguiendo el protocolo descrito más adelante. El anticuerpo anti-Orai1 fue empleado previamente en nuestro laboratorio, comprobando su especificidad (Dominguez-Rodriguez et al. 2012; Rodriguez-Moyano et al. 2013). Adicionalmente, transferimos anillos arteriales con anticuerpos contra TRPC1 ( mouse anti- TRPC1, Santa Cruz) y Orai3 ( rabbit anti-Orai3, Alomone), para estudiar el efecto sobre la contractilidad arterial. Figura 33: Protocolo resumido de la transferencia de anillos arteriales mediante Chariot. 65 MATERIALES Y MÉTODOS 2.4.6 Inmunofluorescencia. A. Inmunofluorescencia en CMLVs. Siembra de CMLVs en placas “µ-Slide VI 0,4”. Una vez aisladas las CMLVs, éstas se sembraron en una placa con 6 canales “µ-Slide VI 0,4” (IBIDI) de (Figura 34), que se utilizan para llevar a cabo de forma óptima experimentos de inmunofluorescencia con un número reducido de células y pequeños volúmenes de reactivos. Previamente, cada canal de la placa fue tratado con poli-L-lisina (Sigma) durante 5 min para favorecer la adhesión celular al fondo de la misma. Cada placa consta de 6 canales centrales de una capacidad de 30 µl con dos reservorios a cada lado de unos 60 µl. Esto nos permite simplificar los protocolos de inmunofluorescencia, conseguir una distribución celular homogénea y reducir los costes del experimento. Las soluciones se introducirán por uno de los reservorios y se succionarán por el otro, como se muestra en la Figura 35. Para la incubación de anticuerpos, se utilizaron 25 - 30 µl de solución, mientras que para el resto de pasos se usaron 150 µl de solución. Las células se sembraron en SD y se dejaron decantar durante 15 o 20 min. Una vez adheridas, se retiró la SD que fue sustituida por PSS y posteriormente, se aplicaron distintos fármacos o condiciones en función de los experimentos. Inmunocitofluorescencia. ➢ Inmunocitofluorescencia múltiple. Para analizar la localización subcelular de distintos canales, así como una posible colocalización entre los mismos, realizamos una inmunodetección múltiple. Para ello, las células se fijaron y permeabilizaron con metanol al 100% a -20 ºC durante 5 min, como se muestra en la Figura 36. Posteriormente, tras realizar 5 lavados de PBS durante 10 min, Figura 34: Placa de IBIDI “µ-Slide VI 0.4” con 6 canales. Figura 35: Metodología en placas de IBIDI “µ-Slide VI 0.4”. Figura representativa de la metodología seguida en los protocolos de inmunofluorescencia con las placas de IBIDI. 66 MATERIALES Y MÉTODOS se bloquearon las uniones inespecíficas con solución de bloqueo durante 30 min a Tª ambiente, y se procedió con la incubación de los anticuerpos primarios en estudio. Figura 36: Esquema del protocolo de inmunocitofluorescencia con las Placa de IBIDI “µ-Slide VI 0.4”. Se retiró la solución de bloqueo de cada canal y se incubaron con anticuerpos primarios a una concentración indicada en la misma solución, durante 2 h a Tª ambiente. Una vez transcurrido ese tiempo, se lavó 5 veces con PBS y se incubó con anticuerpos secundarios en solución de bloqueo durante 45 min a Tª ambiente en oscuridad. Por último, tras lavar 5 veces con PBS durante 10 min, se realizó una tinción con DAPI (Vector Labs; 1:1000 en PBS) durante 5 min a Tª ambiente para marcar los núcleos celulares. Una vez lavadas las muestras del colorante excedente, se añadió medio de montaje fluorescente (Dako, DAKO) y se visualizó en un microscopio invertido IX-71 (Olympus) (ver protocolo resumido en Figura 36). La inmudetección múltiple se realizó utilizando los anticuerpos primarios y secundarios indicados en la Tabla 11: Anticuerpos primarios Dilución Casa comercial Anticuerpos secundarios Dilución Casa comercial rabbit anti-CaV1.2 1:50 Alomone Alexa Fluor 488 goat antirabbit 1:400 Molecular Probes mouse anti-Orai1 1:100 Novus Biologicals Alexa Fluor 594 goat antimouse 1:400 Tabla 11: Anticuerpos primarios y secundarios utilizados para la inmudetección múltiple. Alternativamente, se realizaron experimentos controles con otros marcadores o anticuerpos. Como control negativo, se incubaron los anticuerpos secundarios junto con faloidina-Atto 633 (Sigma, 1:50), una endotoxina que marca únicamente la F-actina de las células; o bien con anticuerpo primario mouse anti-α-SMA (Sigma, 1:400), indicándonos la presencia de células de músculo liso. 67 MATERIALES Y MÉTODOS ➢ Fluorescencia In situ- PLA. Para estudiar la colocalización de los canales CaV1.2, TRPC1 y Orai1, utilizamos la tecnología in situ PLA ( Proximity Ligation Assay ) “Duolink in situ PLA red kit” (Sigma), un ensayo de ligación por proximidad in situ que nos permite detectar, visualizar y cuantificar la localización celular de interacciones de proteínas en un mismo experimento mediante fluorescencia y, por tanto, analizar la colocalización de canales de membrana, en este caso, que se expresan endógenamente. En este ensayo, las muestras se incuban con dos anticuerpos primarios que se unen a las proteínas a detectar (Figura 37A). Posteriormente, se incuban anticuerpos secundarios marcados con oligonucleótidos (sondas PLA) que se unirán al anticuerpo primario correspondiente (Figura 37B). La solución de ligación, que consta de dos oligonucleótidos y enzima ligasa, permitirá que éstos hibriden con las sondas PLA y se unan en un círculo cerrado si las proteínas están muy próximas (Figura 37C). Por último, se incuban las muestras con solución de amplificación, que consta de nucleótidos y oligonucleótidos marcados fluorescentemente junto con una enzima polimerasa. El extremo de una de las sondas PLA actuará como cebador para un producto de amplificación circular usando el círculo ligado como molde, generando así un producto concatemérico. Los oligonucleótidos marcados fluorescentemente se hibridarán con el amplicón, pudiéndose distinguir fácilmente como puntos fluorescentes (Figura 37D), de forma que pueden ser cuantificados y asignados a una localización subcelular específica mediante un microscopio de epifluorescencia o microscopio confocal. Por tanto, para llevar a cabo un experimento de PLA, necesitamos dos anticuerpos primarios que reconozcan dos epítopos distintos, además de los reactivos adicionales del “Duolink in situ PLA red kit” (Sigma), sondas PLA PLUS y MINUS, tampones de lavado y medio de montaje con DAPI. Las células sembradas en las placas de IBIDI fueron lavadas con PBS y fijadas con metanol 100% a -20 ºC durante 5 min después del tratamiento correspondiente. Después de lavar Figura 37: Protocolo resumido del ensayo in situ PLA. A. Los dos anticuerpos primarios se unen a las dos proteínas en estudio. B. Los anticuerpos secundarios marcados con sondas de oligonucleótidos específicas se unirán a su anticuerpo primario correspondiente. C. Se produce la hibridación de las sondas en un círculo cerrado si las proteínas se encuentran próximas entre sí. D. Se genera un producto de amplificación circular, usando el circulo ligado como molde, al que se unen oligonucleótidos marcados fluorescentemente. Modificado de ( www.Sigmaaldrich.com ). 68 MATERIALES Y MÉTODOS las células 5 veces con PBS durante 10 min, las uniones inespecíficas de las mismas se bloquearon durante 30 min a Tª ambiente con solución de bloqueo. Posteriormente, los miocitos se incubaron con anticuerpos primarios durante 2 h a Tª ambiente en solución de bloqueo. Para los experimentos control, utilizamos únicamente uno de los anticuerpos primarios, control negativo, y dos anticuerpos primarios que reconocen proteínas del citoesqueleto, control positivo. En los experimentos en los que estudiamos la interacción entre CaV1.2 y Orai1, utilizamos los anticuerpos indicados en la Tabla 12. Anticuerpos Dilución Casa comercial Control rabbit anti-CaV1.2 + mouse anti-Orai1 1:50 1:100 Alomone Novus Biologicals Control Negativo mouse anti-Orai1 1:100 Novus Biologicals Control Positivo rabbit anti-Vimentin + mouse anti-αSMA 1:100 1:400 Cell Signaling Sigma Tabla 12: Anticuerpos primarios y condiciones utilizados en el ensayo in situ PLA CaV1.2 - Orai1. Mientras que en los experimentos para ver la interacción entre CaV1.2 y TRPC1, los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: Anticuerpos Dilución Casa comercial Control rabbit anti-CaV1.2 + mouse anti-TRPC1 1:50 1:50 Alomone Santa Cruz Biotech . Control Negativo mouse anti-TRPC1 1:50 Santa Cruz Biotech . Control Positivo rabbit anti-Vimentin + mouse anti-αSMA 1:100 1:400 Cell Signaling Sigma Tabla 13: Anticuerpos primarios y condiciones utilizados en el ensayo PLA CaV1.2 - TRPC1. Después de eliminar los anticuerpos mediante tampón de lavado A, las células fueron marcadas con sondas (“Duolink PLA antirabbit PLUS” y “Duolink PLA antimouse MINUS”) durante 1 h a 37 ºC. Tras lavar con tampón de lavado A, incubamos con una solución de ligación durante 30 min a 37 ºC que contiene dos oligonucleótidos que hibridarán con las sondas sólo si las proteínas están a menos de 40 nm de separación. Posteriormente, lavamos con tampón de lavado A e incubamos con una solución de amplificación durante 100 min a 37 ºC, teniendo como resultado un amplicón concatemérico circular y marcado fluorescentemente en rojo. Por último, lavamos con el tampón de lavado B, dejamos secar las muestras y montamos las placas de IBIDI con “Duolink Mounting Medium” que incluye DAPI para teñir los núcleos. La señal fluorescente se visualizó en un microscopio confocal. 69 MATERIALES Y MÉTODOS Adquisición de imágenes en microscopio confocal. ➢ Inmunocitofluorescencia múltiple. Para establecer la localización subcelular y la presencia de colocalización entre los canales Orai1 y CaV1.2, se realizó un análisis cualitativo y cuantitativo. Se adquirieron imágenes en un microscopio confocal a intervalos de 0,4 - 0,5 μm con un objetivo de inmersión con un aumento de 63X (HCX Pl Apo CS 63×/1,3) y se obtuvo la proyección máxima de las mismas. A partir de esta imagen se calculó el coeficiente de correlación de Pearson (PCC, Pearson´s Correlation Coefficient ) o coeficiente de colocalización usando el plugin JACoP de análisis de imágenes dentro del programa Image J, que nos proporciona un valor numérico entre 0 y 1, siendo 0 no colocalización y 1 máxima colocalización. Valores superiores a 0,5 consideran que hay colocalización significativa (McDonald y Dunn, 2013). La adquisición de los marcadores fluorescentes fue la siguiente: DAPI (excitación a 405 nm, recogida entre 400-450nm), Alexa Fluor 488 nm (excitación a 488 nm, recogida 505- 546 nm) y Alexa Fluor 594 (excitación a 594 nm, recogida a 593-667 nm). Alternativamente, se utilizó la configuración Atto-633 (excitación a 633nm, recogida a 570- 645 nm). ➢ Fluorescencia In situ- Duolink. Los puntos rojos fluorescentes se visualizaron en un microscopio confocal. La adquisición se realizó tomando secciones en “Z” cada 0,5 µm con un objetivo de inmersión con un aumento de 63X (HCX Pl Apo CS 63×/1,3) para conseguir una proyección máxima de todas las imágenes (Image J) y poder analizarla con el software “Duolink ImageTool” (Sigma). Este software está especialmente diseñado para cuantificar o contar las señales PLA que obtenemos a partir de las imágenes adquiridas. Para distinguir las células del músculo liso, adquirimos las imágenes con contraste de fase y con DAPI, de forma que los núcleos puedan ser identificados fácilmente y el citoplasma estimado, permitiendo hacer estudios y análisis estadísticos en células aisladas. La adquisición de los marcadores fluorescentes fue la siguiente: DAPI (excitación a 405 nm, recogida entre 400-450nm) y reactivo rojo (excitado a 594nm, recogida entre 593- 667nm). Todas las figuras fueron procesadas y montadas con el software “ConfocalUniovi 1.5” (Image J). La deconvolución de las mismas se llevaron a cabo con un plugin de filtrado espectral de imágenes “Parallel Spectral Deconvolution” basado en un método generalizado “Tikhonov-reflexive” (Hansen y cols., 2006). B. Inmunofluorescencia de anillos arteriales. Cortes histológicos en criostato. Los anillos arteriales se introdujeron en OCT y, con ayuda de unas pastillas de CO2, se congelaron rápidamente para preservar el tejido previamente a la realización del estudio inmunohistoquímico. Se realizaron cortes en el criostato de 6 µM de grosor, manteniendo 76 MATERIALES Y MÉTODOS Para la comparación de medias entre dos grupos se utilizó la prueba t de Student , mientras que la comparación entre varios grupos se realizó mediante el análisis de varianzas ANOVA, seguido de un test de comparaciones múltiples de Tukey . Los datos se presentan como % de las medias ± error estándar y fueron normalizados cuando fue posible. Las diferencias se consideraron significativas cuando los valores de p < 0,05. OBJETIVOS 79 OBJETIVOS El principal objetivo de esta tesis ha sido caracterizar la comunicación entre canales de Ca2+ regulados por reservorios (SOCCs) y canales de Ca2+ tipo L (LTCCs), especialmente el subtipo CaV1.2, y su papel en la vasoconstricción inducida por agonistas. Englobado en este objetivo central, podemos destacar otros subojetivos: 1. Estudiar la implicación fisiológica de los SOCCs en la regulación del tono vascular. 2. Caracterizar el papel de los SOCCs en ratones CaV1.2KO. 3. Caracterizar la relación o comunicación existente entre canales CaV1.2 y SOCCs. 4. Determinar el papel de Orai1 y TRPC1 en la vasoconstricción y entrada de Ca2+ mediada por agonista. 5. Comprobar la distribución de los canales CaV1.2, Orai1 y TRPC1 en células de músculo liso vascular (CMLVs). RESULTADOS 83 RESULTADOS Este trabajo se centra en el estudio del papel de SOCE y los SOCCs en la contracción inducida por agonista y su interacción con los VDCCs, especialmente los LTCCs. Para estudiar la función contráctil en arteria aorta de ratón utilizamos como agonista la serotonina o 5-HT, una neurohormona que interacciona con receptores 5-HT acoplados a proteína G en CMLVs provocando la liberación de Ca2+ del RS mediante la señalización de IP3. Este vaciado de los RS induce la activación de los SOCCs y, por tanto, el aumento de la [Ca2+]i y la vasoconstricción (Figura 41). 4.1 Caracterización de la respuesta contráctil inducida por agonista en aorta. 4.1.1 Contracción inducida por agonista: papel de los LTCCs y los SOCCs. Antes de estudiar el papel de los SOCCs y los VDCCs, más concretamente los LTCCs, en la contracción inducida por 5-HT en aorta de ratón, quisimos comprobar que la denudación del endotelio se hacía correctamente sin comprometer la integridad funcional de la arteria, y asegurarnos de que la respuesta que inducía la 5-HT era debida únicamente a la capa de músculo liso. En la Figura 42 se observa cómo la contracción inducida por 5-HT (10 µM) en anillos arteriales de aorta de ratón en los que se ha eliminado el endotelio mecánicamente, se produce una menor relajación dependiente de endotelio a concentraciones crecientes de acetilcolina (Ach, Acetilcholine ), sin llegar a una relajación máxima. Figura 41: Esquema de la entrada de Ca2+ regulada por los reservorios. Fisiológicamente, la activación de un receptor acoplado a proteína G mediante un agonista (5-HT) puede provocar el vaciado de los reservorios intracelulares de Ca2+ y la activación de SOCE. Modificado de ( Chen y cols., 2013) . IP3: Inositol trifosfato. ER: Retículo endoplásmico. SOCC: Canal de Ca2+ regulado por los reservorios. 84 RESULTADOS Una vez comprobado que la denudación se realizaba correctamente, estudiamos la participación de los SOCCs y los LTCCs en la vasoconstricción inducida por 5-HT. Primero comprobamos la integridad de la arteria y la funcionalidad de los LTCCs aplicando un estímulo despolarizante como el KCl a alta concentración (70K, 70 mM) como se muestra en la Figura 43A. Posteriormente, en la misma arteria observamos que la 5-HT (10 µM) producía una vasoconstricción que dependía de los LTCCs, ya que la respuesta era sensible parcialmente Figura 42: Vasoconstricción inducida por 5-HT en anillos aórticos con y sin endotelio. A. Registros representativos del efecto de Ach, a concentraciones crecientes (0,1, 1 y 10 µM), sobre la vasoconstricción inducida por 5-HT (10 µM) en anillos aórticos a los se les ha realizado una denudación mecánica del endotelio (- Endot.; n = 3) y en anillos con endotelio intacto (+ Endot.; n = 3). B. Línea de tendencia de la relajación dependiente de endotelio que produce la Ach en anillos con y sin endotelio. El gráfico muestra valores medios de contracción en % ± error estándar, frente a las concentraciones de Ach utilizadas en escala logarítmica. “n” indica el número de anillos aórticos. **p<0,01 y ***p<0,001 vs +Endot. Figura 43 . Efecto de inhibidores de LTCCs y SOCCs sobre la contracción inducida por 5-HT en anillos aórticos. A. Registro representativo de la contracción inducida por un estímulo despolarizante como 70K y 5-HT (10 µM). La adición de nifedipina (Nif, 1 µM) produjo una inhibición parcial de la contracción inducida por 5-HT, que llegó a ser total tras la adición complementaria de GSK (10 µM). Otros inhibidores de SOCE como 2APB (50 µM) o ML-9 (25 µM), en sustitución de GSK, produjeron el mismo efecto relajante. B. Resumen de los datos de inhibición de la contracción inducida por 5-HT. La gráfica muestra valores medios de contracción en % ± error estándar. Nif, 34,08% ± 4,25; Nif + ML-9, 7,28% ± 7,28; Nif + 2APB, 0,87% ± 0,65: Nif + GSK 0,57% ± 0,57. n = 3-16 anillos aórticos. **p<0,01 y ***p<0,001 vs 5-HT. 85 RESULTADOS a la nifedipina, a concentraciones incluso superiores a las descritas en otras publicaciones (1 µM) (Egea-Guerrero y cols., 2015). La adición de inhibidores específicos de Orai1 (GSK- 7975A; GSK, 10 µM (Derler y cols., 2013)) o inespecíficos de SOCE (2APB, 50 µM o ML- 9, 25 µM; ver revisión (Tian y cols., 2016)), después de la aplicación de nifedipina, conseguían relajar por completo la contracción inducida por 5-HT (Figura 43B). Interesantemente, la previa administración de nifedipina no evitó que se produjera la contracción provocada por 5-HT (10 µM), mientras que la aplicación de 2APB (50 µM) o GSK (10 µM) consiguió relajar completamente la arteria (Figura 44). En los anillos arteriales en los que no se había aplicado previamente la nifedipina (control), el 2APB conseguía inhibir el efecto de la 5-HT, a diferencia de lo que ocurría con el inhibidor de los LTCCs aplicado post-estímulo (Figura 44), que sólo producía una relajación parcial. De igual forma, empleando otro agonista vasoconstrictor, la fenilefrina (Phe, 500 nM), se produjo una contracción en aorta en la que participaban los dos tipos de canales, ya que la adición de nifedipina (1 µM) para inhibir los LTCCs, y 2APB (75 µM) para bloquear los SOCCs, relajó por completo la contracción inducida por este agonista (Figura 45). Figura 44. Vasoconstricción inducida por 5-HT en anillos aórticos pretratados con nifedipina. A. Registros representativos y resumen de los datos de la contracción inducida por 5-HT (10 µM) en anillos aórticos control y anillos tratados previamente con nifedipina durante 10 minutos (Nif, 1 µM). La aplicación de nifedipina previa al estímulo produjo una inhibición parcial de la contracción, que llegó a ser total tras la adición complementaria de 2APB (50 µM). B. Resumen de los datos de la Inhibición con GSK (10 µM) de la contracción evocada por 5-HT en anillos pretratados con nifedipina. Los gráficos de barras muestran valores medios de contracción en % normalizados a la respuesta de 70K ± error estándar. Control: 5-HT, 100% ± 13,01; 2APB, 3,13% ± 2,40. Nif: 5-HT, 69,30% ± 8,45; 2APB, 0,18% ± 0,13; GSK, 3,20 ± 3,20. n = 3 - 16 anillos aórticos. *p<0,05 y ***p<0,001 entre grupos indicados. 92 RESULTADOS De igual forma, mediante Western Blot, se corroboró la expresión de la proteína, que fue eficientemente truncada en los ratones CaV1.2KO en comparación con los ratones WT (Figura 55). B. Respuesta funcional en ratones CaV1.2KO. Las Figura 56 y Figura 57 muestran que la contracción de la aorta y el incremento de la [Ca2+]i en CMLVs aisladas inducidos por 70K, eran significativamente menores en los ratones CaV1.2KO en comparación con los ratones WT, consistentemente con los resultados obtenidos al medir la expresión del ARNm y proteína del canal CaV1.2. Figura 54: Expresión de ARNm del canal CaV1.2 en ratones WT y CaV1.2KO. Diagrama de barras que muestra los valores (media ± error estándar) de expresión del ARNm del canal CaV1.2 en aorta de ratones WT y CaV1.2KO. El análisis se basó en el método ΔΔCt, normalizando a la expresión de βactina. WT: 1,00 ± 0,02; CaV1.2KO: 0,62 ± 0,02. n = 7 aortas en cada grupo. ***p<0,001 vs WT. Figura 55 : Expresión del canal CaV1.2 en ratones WT y CaV1.2KO. A. Western Blot representativo de las proteínas CaV1.2 y α-tubulina (α-tub) en aorta de ratones WT y CaV1.2KO. B. Niveles de expresión del canal CaV1.2 en ratones WT y CaV1.2KO. El gráfico de barras muestra valores medios normalizados a la expresión de la proteína α-tubulina ± error estándar. WT: 1,00 ± 0,10; CaV1.2KO: 0,59 ± 0,06. n = 4 aortas. **p<0,01 vs WT. 93 RESULTADOS En estos animales también comprobamos la integridad del RS mediante cafeína (Fernandez-Tenorio y cols., 2010), debido a que los estímulos que posteriormente íbamos a estudiar dependen de una liberación inicial de Ca2+ del RS mediante la señalización de IP3. Observamos que no existían diferencias ni en la contracción en anillos aórticos (Figura 56) ni en los cambios en la [Ca2+]i en CMLVs aisladas (Figura 57) inducidos por cafeína (10 mM) entre ratones WT y ratones CaV1.2KO, indicando que los niveles de Ca2+ del RS no se veían afectados en estos ratones. Figura 56: Vasoconstricción inducida por KCl y cafeína en anillos aórticos de ratones WT y CaV1.2KO. A. Registros representativos de la contracción inducida en ratones WT y CaV1.2KO por 70K y cafeína (Caf, 10 mM). B. Resumen de los datos de la respuesta contráctil inducida por 70K y cafeína en ratones WT y CaV1.2KO. El gráfico de barras muestra valores medios de contracción en % ± error estándar. WT: 70K, 100% ± 5,58; Caf, 100% ± 12,10. CaV1.2KO: 70K, 51,24% ± 3,17; Caf, 71% ± 18,68. n = 9 - 42 anillos aórticos. ***p<0,001 vs WT. Figura 57: Incrementos de la [Ca2+]i en CMLVs aisladas de ratones WT y CaV1.2KO. A. Registros representativos del incremento de la [Ca2+]i inducido por 70K y cafeína (Caf, 10 mM) en ratones WT y CaV1.2KO. B. Resumen de los datos de los cambios en la [Ca2+]i inducidos por 70K y cafeína. El gráfico de barras muestra los valores medios de ∆ratio en % ± error estándar. WT: 70K, 100% ± 8,77; Caf, 100% ± 14,23. CaV1.2KO: 70K, 22,92% ± 2,82; Caf, 99,88% ± 8,60. n = 190 - 1157 CMLVs aisladas de al menos 10 aortas diferentes en cada grupo. ***p<0,001 vs WT. 94 RESULTADOS C. Morfología arterial en ratones CaV1.2KO. Posteriormente analizamos si la falta de los canales CaV1.2 se asociaba con cambios estructurales y/o remodelado de las arterias en los ratones CaV1.2KO. La Figura 58 muestra que la disminución de expresión y funcionalidad de los canales CaV1.2 no implicaba la alteración de la estructura arterial. De hecho, la inmunofluorescencia realizada en cortes histológicos de aortas de ratones WT y ratones CaV1.2KO con anticuerpos mouse anti-α-SMA, para marcar la actina de músculo liso, y rabbit anti-vimentina, para marcar fibroblastos, reflejaba una morfología similar (Figura 58). 4.3.2 SOCE no compensa la perdida de función de los canales CaV1.2. A. Determinación de la expresión de los SOCCs. Para determinar si SOCE puede compensar esa disminución de la expresión y funcionalidad de los canales CaV1.2 en ratones CaV1.2KO, primero medimos los niveles de expresión de ARNm de Orai1 en ratones WT y CaV1.2KO. Esta proteína, como ya hemos explicado en la introducción, es el principal componente de los canales selectivos a Ca2+ o SOCCs y, por tanto, es un componente imprescindible de SOCE (Putney y cols., 2016). Mediante RT-qPCR, observamos que los niveles de ARNm de Orai1 en ratones CaV1.2KO no eran significativamente diferentes a los de los ratones WT, aunque sí apreciablemente superiores (Figura 59). Figura 58: Inmunohistofluorescencia de aorta de ratones WT y CaV1.2KO. Inmunohistofluorescencia de secciones de aorta de ratones WT (A) y ratones CaV1.2KO (B) reflejando una morfología histológica similar. Todas las secciones fueron incubadas con anticuerpos mouse anti-α-SMA y rabbit anti-vimentina, además de DAPI para teñir los núcleos. Adicionalmente, se muestran imágenes adquiridas en campo claro. Resultados similares se observaron en 4 aortas independientes. 95 RESULTADOS Tampoco se encontraron diferencias significativas a nivel de proteína, cuantificada mediante Western Blot, entre arterias de ratones WT y ratones CaV1.2KO (Figura 60), por lo que estos datos nos sugerían que SOCE no compensaba la falta de función de los LTCCs, ya que los niveles de expresión de los SOCCs (Orai1) eran similares en ambos ratones. B. Vasoconstricción atenuada pero mantenida en ratones CaV1.2KO. Como explicamos anteriormente, aunque no encontramos una compensación por la falta de LTCCs, queríamos estudiar cuál era la implicación de los SOCCs en la regulación del tono vascular en estos ratones CaV1.2KO, de manera que investigamos los efectos de la 5- HT la TG tanto en anillos aórticos como en CMLVs aórticas aisladas. Primero, realizamos los experimentos para medir la respuesta contráctil en anillos aórticos y, al igual que ocurría con la respuesta contráctil inducida por 70K, la vasoconstricción provocada por 5-HT (10 µM) y TG (10 µM) era significativamente más pequeña en anillos aórticos de ratones CaV1.2KO en comparación con ratones WT (Figura 61). Figura 59: Expresión de ARNm de Orai1 en ratones WT y CaV1.2KO. Niveles de expresión del ARNm de Orai1 en aorta de ratones WT y CaV1.2KO medidos mediante RT-qPCR. El análisis se basó en el método ΔΔ Ct, normalizando a la expresión de β -actina. El gráfico muestra valores medios ± error estándar. WT: 1,00 ± 0,10; CaV1.2KO: 1,33 ± 0,14. n = 3 - 5 aortas independientes. Figura 60: Expresión de Orai1 en ratones WT y CaV1.2KO. A. Western Blot representativo de las proteínas Orai1 y α-tubulina (α-tub) en aorta de ratones WT y CaV1.2KO. B. Niveles de expresión del Orai1 en ratones WT y CaV1.2KO. El gráfico de barras muestra valores medios normalizados a la expresión de α-tubulina ± error estándar. WT: 1,00 ± 0,11; CaV1.2KO: 1,24 ± 0,12. n = 3 - 4 aortas independientes. 96 RESULTADOS Estas contracciones en arterias de ratones CaV1.2KO eran, todavía, levemente sensibles a nifedipina (1 µM), debido seguramente a la presencia de canales CaV1.2 funcionales remanentes (Figura 61A y B). Además, se inhibían completamente mediante inhibidores de los SOCCs, ML-9 (25 µM) o 2APB (50 µM), como se puede ver en la Figura 61A y B, y se resume en la Figura 62. Figura 61: Vasoconstricción inducida por 5-HT y TG en anillos aórticos de ratones WT y CaV1.2KO. Registros representativos de la contracción inducida por 5-HT (10 µM) (A) y TG (10 µM) (B) en ratones CaV1.2KO en comparación ratones WT. La adición de nifedipina (Nif, 1 µM) produjo una inhibición parcial de la contracción en ambos casos, mientras que la adición complementaria de 2APB (50 µM) o ML-9 (50 µM) produjo una relajación completa de las arterias. Las flechas indican el momento de aplicación de los inhibidores. C. Resumen de los datos de contracción inducidos por 5-HT y TG en ratones WT y CaV1.2KO. Gráfico de barras que muestra valores medios de contracción en % ± error estándar. WT: 5-HT, 100% ± 11,23; TG, 100% ± 1,95. CaV1.2KO: 5-HT, 46,02% ± 6,42; TG, 66,23% ± 10,22. n = 11-22 anillos aórticos. *<p0,05 y ***p<0,001 vs. WT. 97 RESULTADOS C. Disminución del incremento de la [Ca2+]i en ratones CaV1.2KO. Posteriormente, para relacionar esta reducida respuesta contráctil observada en anillos aórticos de ratones CaV1.2KO con los movimientos intracelulares de Ca2+, realizamos experimentos para medir los incrementos de la [Ca2+]i en CMLVs aisladas de aorta. Observamos que la adición de 5-HT (10 µM) y TG (2 µM) evocaba, en estas células, un incremento de la [Ca2+]i significativamente menor en comparación con CMLVs aisladas de aortas de ratones WT (Figura 63). Como vimos en las Figura 56 y Figura 57 , la disminución de las respuestas inducidas por 5-HT y TG no podía deberse a diferencias en los niveles de Ca2+ almacenados en el RS, ya que los incrementos de la [Ca2+]i provocados por la cafeína no se veían afectados en ratones CaV1.2KO. Figura 62: Inhibición de la vasoconstricción inducida por 5-HT y TG en anillos aórticos de ratones CaV1.2ko. Inhibición de la contracción inducida por 5-HT (10 µM) (A) y TG (10 µM) (B) mediante inhibidores de LTCCs (Nifedipina; Nif, 1µM) y SOCCs (ML-9, 25-50 µM y 2APB, 50 µM) en ratones CaV1.2KO. Los gráficos de barras muestran valores medios de contracción en % ± error estándar. 5-HT: Nif, 64,16% ± 8,70; Nif + ML-9, 5,61% ± 5,61; Nif + 2APB, 1,34% ± 0,63. TG: Nif, 85,14% ± 4,15; Nif + ML-9, 4,42% ± 1,93; Nif + 2APB, 0,83% ± 0,83. n = 3 - 12 anillos aórticos. **p<0,01 y ***p<0,001 vs. contracción máxima. Figura 63: Incrementos de la [Ca2+]i inducidos por 5-HT y TG en CMLVs aisladas de ratones WT y CaV1.2KO. A, B. Registros representativos de los incrementos de la [Ca2+]i originados por 70K, 5-HT (10 µM) y TG (2µM) en ratones CaV1.2KO y ratones WT. C. Resumen de los datos de los cambios en la [Ca2+]i inducidos por 5-HT y TG. El gráfico de barras muestra valores medios de ∆ratio en % ± error estándar. WT: 5-HT, 100% ± 13,18; TG, 100% ± 8,17%. CaV1.2KO: 5-HT, 20,76% ± 3,94; TG, 26,83% ± 6,18. n = 190 - 640 CMLVs aisladas de al menos 10 aortas diferentes en cada grupo. ***p<0,001 vs WT. 98 RESULTADOS 4.4 Efecto de la modificación del potencial de membrana sobre la respuesta contráctil y el incremento de la [Ca2+]i inducido por 5-HT y TG. Juntos, todos estos datos demuestran que las respuestas que originan la 5-HT y la TG en músculo liso vascular implican una coactivación de los SOCCs y los LTCCs. Por este motivo, nos propusimos investigar si la modificación del potencial de membrana era relevante para las respuestas mediadas por agonistas y la activación de SOCE. 4.4.1 La hiperpolarización inducida por valinomicina atenúa la vasoconstricción y el aumento de la [Ca2+]i inducido por agonista y TG. Primero, examinamos el efecto de la valinomicina, un ionóforo de K+ que permite a este ion atravesar libremente la membrana celular por gradiente electroquímico (Tanner y Wellhausen, 1998). En la mayoría de las células, incluidas las CMLVs, debido a que el potencial de equilibrio del K+ es más negativo que el potencial de membrana en reposo, la valinomicina daría como resultado un eflujo de este ion hacia el exterior y, por tanto, hiperpolarización de la membrana. Esta hiperpolarización haría que los LTCCs estuvieran más inactivos. Como podemos observar en la Figura 64, el pretratamiento de anillos aórticos de ratón con valinomicina (500 nM) durante 15 minutos, redujo parcialmente la respuesta contráctil mediada por 70K, aunque no lo suficiente como para evitar una contundente vasoconstricción aórtica. Figura 64: La valinomicina atenúa la contracción inducida por KCl y cafeína en anillos aórticos de ratón. A. Registros representativos de la contracción inducida por 70K y cafeína (Caf, 10 mM) en anillos tratados 15 minutos con valinomicina (Val, 500 nM) y con vehículo (control). B. Resumen de los datos de contracción inducidos por 70K y cafeína. Gráfico de barras que muestra los valores medios de contracción en % normalizados a un primer estímulo ± error estándar. Control: 70K, 100% ± 2,52; Caf, 100% ± 3,92. Val: 70K, 82,56% ± 3,50; Caf, 28,16% ± 3,92. n = 7 - 14 anillos aórticos. ***p<0,001 vs control. 99 RESULTADOS Además, la contracción inducida por cafeína (10 mM) también se veía afectada. La disminución de la contracción tras un estímulo 70K, era previsible debido a la hiperpolarización y la inactivación de los LTCCs que provoca la valinomicina, sin embargo, el efecto de la cafeína necesita ser estudiado a nivel de CMLV aislada. Por ello, comprobamos los cambios de [Ca2+]i que se producen en presencia de este fármaco. Aplicamos la valinomicina (100 nM) durante 3 minutos antes del estímulo en CMLVs aisladas de aorta de ratón y observamos que, al igual que la vasoconstricción, el incremento de la [Ca2+]i se veía disminuido tras un estímulo de 70K. Sin embargo, cuando tratábamos las células con cafeína (10 mM), los cambios en la [Ca2+]i originados eran similares entre las CMLVs incubadas con valinomicina y con el vehículo (Figura 65). Una vez comprobado que el contenido de Ca2+ del RS no se veía afectado, decidimos estudiar qué ocurría con la activación de SOCE en la respuesta mediada por agonista y por TG cuando modificábamos el potencial de membrana. Tanto la vasoconstricción como el incremento de la [Ca2+]i inducidos por 5-HT (10 µM) fueron significativamente menores en anillos arteriales y CMLVs aisladas de aorta de ratón, respectivamente, incubadas previamente con valinomicina (Figura 66), en comparación con anillos aórticos y CMLVs aisladas tratados con el vehículo del fármaco. Figura 65: La valinomicina atenúa el incremento de la [Ca2+]i inducida por KCl, pero no por cafeína, en CMLVs aisladas de aorta de ratón. A. Registros representativos de los cambios de la [Ca2+]i inducidos por 70K y cafeína (Caf, 10 mM) en CMLVs incubadas con valinomicina (Val, 100 nM) o vehículo (control) durante 3 minutos. B. Resumen de los datos de los cambios en la [Ca2+]i inducidos por 70K y cafeína. El gráfico de barras muestra valores medios de ∆ratio en % normalizado a estímulo control previo ± error estándar. Control: 70K, 100% ± 6,68; Caf, 100% ± 6,86. Val: 70K, 55,21% ± 9,40; Caf, 92,34% ± 25,45. n = 72 - 76 CMLVs aisladas de 3 aortas diferentes. *p<0,05. 100 RESULTADOS De igual forma, las respuestas originadas por la administración de TG (10 µM) mostraban una disminución significativa en presencia de valinomicina (500 nM) en anillos aórticos en comparación con anillos control (Figura 67A). Además, el incremento de la [Ca2+]i provocado por TG (2 µM) en CMLVs aisladas preincubadas con el fármaco (Val, 100 nM) durante 3 minutos antes del estímulo, era mínimo si lo comparamos con CMLVs control (Figura 67B). Figura 66: La valinomicina disminuye la vasoconstricción en anillos aórticos y el incremento de la [Ca2+]i en CMLVs aisladas de aorta de ratón inducidos por 5-HT. A. Registros representativos y resumen de los datos de la contracción inducida por 5-HT (10 µM) en anillos tratados con valinomicina (Val, 500 nM) o con vehículo (control) durante 15 minutos. B. Registros representativos y resumen de los datos de los incrementos de la [Ca2+]i inducidos por 5-HT (10 µM) en CMLVs tratadas con valinomicina (Val, 100 nM) o vehículo (control) durante 3 minutos. Los gráficos de barras muestran valores medios en % normalizados a la respuesta inducida por 70K ± error estándar. Contracción: Control, 100% ± 10,62; Val, 35,10% ± 4,67. ∆ratio: Control, 100% ± 11,24; Val, 3,68% ± 0,63. n = 4 - 9 anillos aórticos y 89-93 CMLVs aisladas de aorta. **p<0,01 vs control. Figura 67: La valinomicina disminuye la vasoconstricción en anillos aórticos y el incremento de la [Ca2+]i en CMLVs aisladas de aorta de ratón inducidos por TG. A. Registros representativos y resumen de los datos de la contracción inducida por TG (10 µM) en anillos aórticos cuando se incuban con valinomicina (Val, 500 nM) o con vehículo (control) durante 15 minutos. B. Registros representativos y resumen de los datos de los incrementos de la [Ca2+]i inducidos por TG (2 µM) en CMLVs tratadas con valinomicina (Val, 100 nM) o vehículo (control) durante 3 minutos. Los gráficos de barras muestran valores medios en % normalizados a la respuesta inducida por 70K ± error estándar. Contracción: Control, 100% ± 16,07; Val, 5,57% ± 0,53. ∆ratio: Control, 100% ± 12,64; Val, 6,38% ± 1,95. n = 3 - 5 anillos aórticos y 90 - 114 CMLVs aisladas de aorta. **p<0,01 vs control. 101 RESULTADOS 4.4.2 La hiperpolarización inducida por cromakalim también atenúa la vasoconstricción y el aumento de la [Ca2+]i inducido por 5-HT. Para corroborar los experimentos obtenidos con la aplicación de valinomicina, nos planteamos utilizar otro fármaco con una acción más específica sobre la manipulación del potencial de membrana de las células. El cromakalim es un fármaco antihipertensivo que abre canales de K+ dependientes de ATP (K+ATP) (Smani y cols., 2002), provocando un eflujo de iones K+ hacia el exterior y con ello hiperpolarización. Esta hiperpolarización reduce la probabilidad de apertura del LTCC, disminuyendo la [Ca2+]i y, por tanto, tiene acción vasodilatadora sobre la arteria. De esta manera, podíamos modificar el potencial de membrana actuando específicamente sobre un tipo de canal únicamente, y no sobre la célula entera como ocurría con la valinomicina. Figura 68: El cromakalim atenúa la vasoconstricción inducida por 5-HT en anillos aórticos de ratón, pero no afecta a la producida por KCl o cafeína. A. Registros representativos y resumen de los datos de la vasoconstricción inducida por 5-HT (10 µM) en anillos incubados durante 15 minutos con vehículo (control), cromakalim (Crom, 20 µM) o glibenclamida junto con cromakalim (Gli/Crom, 3 µM Gli/ 20 µM Crom). B y C. Resumen de datos del efecto del cromakalim y glibenclamida sobre la contracción inducida por 70K (B) y por cafeína (Caf, 10 mM) (C). Los gráficos de barras muestran valores medios de contracción en % normalizados a 70K (A) o a un estímulo control previo (B y C) ± error estándar. Control: 5-HT, 100% ± 5,73; 70K, 100% ± 4,33; Caf, 100% ± 6,80. Crom: 5-HT, 44,59% ± 7,16; 70K, 90,09% ± 6,39; Caf, 80,44% ± 7,68. Gli/crom: 5-HT, 92,47% ± 0,72; 70K, 96,13% ± 5,00; Caf, 84,42% ± 16,32. n = 3 - 6 anillos aórticos. *p<0,05 entre grupos indicados y ***p<0,001 vs control. 108 RESULTADOS 4.5.2 Participación de TRPC1 en la contracción inducida por 5-HT. Algunos autores han sugerido la participación de otras proteínas en los SOCCs, como TRPC1, en células excitables (Ambudkar y cols., 2007), mientras que otros han descrito que SOCE depende únicamente de Orai1 y STIM1 en CMLVs de fenotipo proliferativo o sintético (Potier y cols., 2009). Por este motivo, decidimos explorar el efecto de la transferencia de anticuerpos contra Orai3 y TRPC1 sobre la vasoconstricción inducida por agonista en anillos aórticos de ratón. Coherentemente con estos últimos estudios, no encontramos diferencias significativas en la contracción producida por 5-HT (10 µM) entre anillos aórticos control y anillos aórticos transferidos con anti-Orai3 o anti-TRPC1 mediante Chariot (Figura 76), lo que nos indicaba que Orai3 y TRPC1 podrían no estar participando en la vasoconstricción inducida por 5-HT en aorta. A pesar de ello, en nuestro laboratorio tenemos evidencias de que TRPC1 pueden funcionar colaborativamente con canales Orai1 para formar canales SOCCs no selectivos y facilitar SOCE (Rodriguez-Moyano y cols., 2013), por lo que se necesitan más estudios para corroborar los resultados anteriores. 4.6 Distribución endógena de Orai1, TRPC1 y CaV1.2. 4.6.1 Distribución endógena de Orai1 y CaV1.2. Dados todos los resultados anteriores que nos sugerían una coactivación y una probable comunicación funcional entre los SOCCs, principalmente Orai1, y los canales CaV1.2 tras la estimulación con agonista, realizamos una primera aproximación para determinar la localización celular de dichas proteínas en CMLVs aisladas de aorta de ratón. En ensayos de inmucitofluorescencia observamos que Orai1 y CaV1.2 mostraban una localización celular similar y una distribución uniforme en la membrana plasmática, estando muy próximas entre sí (Figura 77A). Mediante el análisis del coeficiente de correlación de Pearson (PCC, Pearson’s Correlation Coefficient ), que estima la correlación entre dos proteínas marcadas fluorescentemente, se confirmó que existía una colocalización entre Figura 76: La transferencia de anticuerpo anti-Orai3 y anti-TRPC1 mediante Chariot no afecta a la vasoconstricción producida por 5-HT en anillos aórticos de ratón. Resumen de datos de la contracción inducida por 5-HT (10 µM) en anillos transferidos con anti-Orai3, anti-TRPC1 y anillos control. El gráfico de barras muestra valores medios de contracción en % normalizados a 70K ± error estándar. Control: 100% ± 5,81; anti- Orai3, 86,48% ± 10,08; anti-TRPC1, 98,56% ± 12,01. n = 3 - 16 anillos aórticos. 109 RESULTADOS CaV1.2 y Orai1 en aorta (Figura 77B) ya que el valor de PCC era mayor a 0,5 (McDonald y Dunn, 2013). Las mismas conclusiones se obtuvieron en CMLVs aisladas de coronaria de rata (Figura 77B). Esta colocalización no sólo existía en condiciones basales (control), sino que aumentaba cuando las CMLVs eran estimuladas durante 2-3 minutos con agonistas. Como se puede observar en la Figura 77C, el PCC calculado en imágenes de inmunofluorescencia de CMLVs aisladas de aorta de ratón aumentaba significativamente cuando éstas eran tratadas con agonistas fisiológicos utilizados anteriormente, como ET-1 (10 nM) o Phe (500 nM), y agonistas farmacológicos de SOCE como la TG (2 µM). En cambio, no se encontraban diferencias en el PCC con respecto a las células control cuando se aplicaba Figura 77: Distribución endógena y colocalización de Orai1 y CaV1.2 en CMLVs aisladas de aorta de ratón y coronaria de rata. A. Inmunocitofluorescencia representativa de CMLVs aórticas incubadas con mouse anti-Orai1 y rabbit anti- CaV1.2. El núcleo de las células fue marcado con DAPI. B. Resumen de los datos de colocalización entre Orai1/CaV1.2, calculados a partir de las imágenes de inmunofluorescencia, en CMLVs aórticas y de coronaria en condiciones basales control. C. Resumen de los datos de colocalización entre Orai1/CaV1.2 en CMLVs aórticas en control y tratadas con 5-HT (10 µM), ET-1 (10 nM), Phe (500 nM), TG (2 µM) o 70K durante 2-3 minutos. Los gráficos de barras muestran valores medios de PCC ± error estándar. Orai1/CaV1.2 aorta: control, 0,73 ± 0,01; 5-HT, 0,71 ± 0,02; Phe, 0,84 ± 0,01; ET-1, 0,83 ± 0,01; 70K, 0,76 ± 0,01. Orai1/CaV1.2 coronaria: 0,67 ± 0,05. Valores > 0,5 indican correlación positiva y colocalización. n = 14 - 27 CMLVs aisladas en 3 experimentos diferentes. Sin Ab: CMLVs incubadas sólo con anticuerpos secundarios. ***p<0,001 vs control. 110 RESULTADOS 70K. (Figura 77C). Como control negativo, incubamos las células únicamente con anticuerpos secundarios (sin Ab). 4.6.2 Colocalización de Orai1, CaV1.2 y TRPC1 en condiciones basales. Como hemos nombrado previamente, aunque los resultados mostrados con anterioridad no implicaban a TRPC1 en la respuesta mediada por agonista, estudios en nuestro laboratorio y de otros colaboradores han sugerido la interacción entre Orai1 y TRPC1 para formar SOCCs no selectivos (Rodriguez-Moyano y cols., 2013). Aparte, hay muchas evidencias acerca de los complejos de señalización en los que puede participar el canal CaV1.2 con otros canales para regular la [Ca2+]i en CMLVs (Kwan y cols., 2009; Song y cols., 2015; Spinelli y Trebak, 2016). Por todo ello, decidimos finalmente confirmar esa posible distribución tan próxima de Orai1, TRPC1 y CaV1.2 y su potencial interacción a la hora de regular el tono vascular, utilizando una técnica más específica, el Proximity Ligation Assay (PLA). El PLA nos permite detectar cuándo dos proteínas se encuentran a menos de 40 nm de separación. En esta técnica, si las células son incubadas con anticuerpos contra las proteínas de interés y éstas se localizan en regiones cercanas, se detectarán puntos rojos o señales PLA mediante inmunofluorescencia. De esta forma, cuando las CMLVs aisladas de aorta de ratón fueron incubadas con anticuerpos contra Orai1 y CaV1.2 en condiciones control, detectamos un gran número de señales PLA, no siendo así cuando la incubación se hizo únicamente con anti-Orai1 (control negativo, control -) (Figura 78). Como control positivo (control +), incubábamos las células con anticuerpos contra proteínas del citoesqueleto (anti-α-SMA y anti-vimentina), que forman parte de la maquinaria contráctil de la célula interaccionando a escala nanométrica (Ye y cols., 2014), pudiendo observarse casi un 90% más de señales PLA (Figura 78). Adicionalmente, se detectaron señales PLA cuando las CMLVs se incubaban con anticuerpos contra CaV1.2 y TRPC1 en condiciones control. Además, la incubación sólo con anti-TRPC1 (control -) o con anticuerpos contra proteínas del citoesqueleto (control +), manifestó el mismo resultado que en el experimento anterior (Figura 79). 4.6.3 Colocalización de Orai1, CaV1.2 y TRPC1 en presencia de agonistas. Interesantemente, cuando estimulamos durante 2 - 3 minutos las CMLVs aisladas con 5- HT (10 µM) o TG (2 µM) y se incubaban con anticuerpos contra CaV1.2 y Orai1, aumentaba significativamente el número de señales PLA detectadas mediante inmunofluorescencia. No ocurría lo mismo cuando las CMLVs se estimulaban con 70K, indicando que existía una mayor interacción entre estos dos canales sólo tras la estimulación con agonista (Figura 80). Este mismo efecto se repetía en CMLVs aisladas e incubadas con anticuerpos contra CaV1.2 y TRPC1, ya que tras la estimulación con 5-HT (10 µM) y TG (2 µM) también aumentaba la interacción entre estas dos proteínas, pero no con 70K (Figura 81). 111 RESULTADOS Todos estos datos sugieren que existe una interacción entre Orai1 o TRPC1 y CaV1.2 en condiciones basales, la cual aumenta tras la estimulación con agonista favoreciendo la comunicación funcional entre estos canales para promover una señalización de Ca2+ intracelular en CMLVs, responsable de la regulación del tono vascular. Figura 78: Orai1 y CaV1.2 colocalizan en CMLVs aisladas de aorta de ratón. A. Proximity Ligation Assay (PLA) realizado en CMLVs. Las células fueron incubadas con mouse anti-Orai1 y rabbit anti-CaV1.2 (control), con sólo anti-Orai1 como control negativo (control -) o con mouse anti-α-SMA y rabbit anti-vimentina como control positivo (control +). Los puntos o señales rojas fluorescentes indican si las proteínas están próximas entre sí (< 40nm distancia). Los núcleos fueron teñidos con DAPI. En el panel derecho se distinguen las CMLVs en campo claro. B. Resumen de datos de las señales PLA detectadas en CMLVs mediante inmunofluorescencia. El gráfico de barras muestra valores medios de señales PLA en % ± error estándar. Control, 14,42% ± 1,50; control +, 100% ± 25,88. n = 5 - 8 CMLVs aisladas en 3 experimentos. *p<0,05 vs control. 112 RESULTADOS Figura 79: TRPC1 y CaV1.2 colocalizan en CMLVs aisladas de aorta de ratón. A. Proximity Ligation Assay (PLA) realizado en CMLVs. Las células fueron incubadas con mouse anti-TRPC1 y rabbit anti-CaV1.2 (control), con anti-TRPC1 como control negativo (control -) o con mouse anti-α-SMA y rabbit anti-vimentina como control positivo (control +). Los puntos o señales rojas fluorescentes indican si las proteínas están próximas entre sí (< 40nm distancia). Los núcleos fueron teñidos con DAPI. En el panel derecho se distinguen las CMLVs en campo claro. B. Resumen de datos de las señales PLA detectadas en CMLVs mediante inmunofluorescencia. El gráfico de barras muestra valores medios de señales PLA en % ± error estándar. Control, 9,85% ± 1,53; control +, 100% ± 14,63. n = 7 - 10 CMLVs aisladas en 3 experimentos. ***p<0,001 vs control. 113 RESULTADOS Figura 80: Orai1 y CaV1.2 aumentan su colocalización en CMLVs aisladas de aorta de ratón tras estimulación con agonista. A. Proximity Ligation Assay (PLA) realizado en CMLVs. Las células fueron tratadas, o no (control), con 5-HT (10 µM), TG (2 µM) o 70K durante 2 – 3 minutos e incubadas con mouse anti-Orai1 y rabbit anti-CaV1.2. Los puntos o señales rojas fluorescentes indican si las proteínas están próximas entre sí (< 40nm distancia). Los núcleos fueron teñidos con DAPI. En el panel derecho se distinguen las CMLVs en campo claro. B. Resumen de datos de las señales PLA detectadas en CMLVs mediante inmunofluorescencia. El gráfico de barras muestra valores medios de señales PLA en % ± error estándar. Control, 14,42% ± 1,50; 5-HT, 21,60% ± 1,65; TG, 28,90% ± 3,81; 70K, 18,33% ± 2,45. n = 6 - 10 CMLVs aisladas en 3 experimentos. *p<0,05 vs control. 114 RESULTADOS Figura 81: TRPC1 y CaV1.2 aumentan su colocalización en CMLVs aisladas de aorta de ratón tras estimulación con agonista. A. Proximity Ligation Assay (PLA) realizado en CMLVs. Las células fueron tratadas, o no (control), con 5-HT (10 µM), TG (2 µM) o 70K durante 2 – 3 minutos e incubadas con mouse anti-TRPC1 y rabbit anti-CaV1.2. Los puntos o señales rojas fluorescentes indican si las proteínas están próximas entre sí (< 40nm distancia). Los núcleos fueron teñidos con DAPI. En el panel derecho se distinguen las CMLVs en campo claro. B. Resumen de datos de las señales PLA detectadas en CMLVs mediante inmunofluorescencia. El gráfico de barras muestra valores medios de señales PLA en % ± error estándar. Control, 9,85% ± 1,53; 5-HT, 19,98% ± 4,72; TG, 35,53% ± 8,78; 70K, 7,72% ± 2,76. n = 8 - 9 CMLVs aisladas en 3 experimentos. *p<0,05 vs control. DISCUSIÓN 117 DISCUSIÓN Actualmente, la contribución de los LTCCs y los SOCCs a la fisiopatología de las CMLVs está bastante aceptada, como hemos descrito en la introducción de esta memoria. Sin embargo, la relación funcional que existe entre ellos, todavía sigue siendo un campo por explorar. Existían indicios de una cierta coactivación de ambos canales de Ca2+ en respuesta a agentes vasoactivos; no obstante, no se había investigado previamente la distribución de las proteínas que forman los canales ni se había determinado la posible interacción que pudiera existir entre ellas. Los resultados presentados en esta tesis confirman el papel de los SOCCs en la regulación del tono vascular, revelando por primera vez una interacción funcional entre los canales CaV1.2 y Orai1, además de TRPC1, pudiendo servir para controlar estrechamente la Figura 82: Modelo esquemático que resume la coactivación de SOCCs y CaV1.2 tras la estimulación con agonista. Figura que propone el modelo de interacción entre SOCCs dependientes de TRPC1 y Orai1 y canales CaV1.2 tras la estimulación con un agonista. SOCC: canal de Ca2+ activado por reservorios; LTCC: canal de Ca2+ tipo L; GPCR: receptor acoplado a proteína G; m.p.: membrana plasmática; IP3: inositol 1,4,5-trifosfato; RS: retículo sarcoplásmico; TG: tapsigargina; SERCA: ATPasa de Ca2+ del RE/RS; Nif: nifedipina; 2APB, ML-9, Gd3 y GSK: inhibidores de SOCCs. 124 RESULTADOS 5.5 Repercusión de la manipulación del potencial de membrana sobre la respuesta contráctil. Los resultados anteriores nos indican que las respuestas originadas por 5-HT y TG en músculo liso vascular implican una coactivación de los SOCCs y LTCCs. Hay evidencias que sugieren que la activación de SOCE puede servir no sólo como una ruta importante para la entrada de Ca2+, sino también como un estímulo despolarizante para una activación secundaria de los LTCC en CMLVs (Bolotina, 2012; Molnar y cols., 2012; Narayanan y cols., 2012). Teniendo en cuenta esto y sabiendo que los canales de K+ son los principales reguladores del potencial de reposo de las CMLVs y los responsables del tono vascular (Nelson y Quayle, 1995), nos planteamos modificar el potencial de membrana con fármacos que alteran el flujo de este ion para observar si las respuestas a 5-HT y TG se veían alteradas. Nuestros datos muestran que la hiperpolarización inducida por fármacos atenúa la respuesta contráctil y de Ca2+ mediados por la activación de los SOCCs. Primero, usamos valinomicina, un ionóforo de K+ que provoca un eflujo de este ion hacia el exterior celular, induciendo la hiperpolarización de la membrana y la inactivación de los LTCCs (Zha y cols., 2014). Este hecho pudimos observarlo experimentalmente ya que la valinomicina atenúa significativamente la contracción y el aumento de la [Ca2+]i en aorta en respuesta a 70K. Hasta donde sabemos, algunos estudios han sugerido que la hiperpolarización debida a la activación de canales de K+ dependientes de Ca2+ (K+Ca) facilita la entrada de Ca2+ a través de canales catiónicos no selectivos, incluidos los SOCCs, en células como los condrocitos (Funabashi y cols., 2010). Sin embargo, en nuestros experimentos la hiperpolarización producida por valinomicina no originaba un incremento de SOCE, ya que las respuestas a 5-HT y TG se ven atenuadas en presencia de este fármaco, al no compensarse el efecto de activación secundaria de los LTCCs por estar inactivados. La valinomicina es conocida por llevar el potencial de membrana a valores cercanos al potencial de equilibrio de Nerst para el K+, que está en torno a -85 mV (Tanner y Wellhausen, 1998), es decir, se disminuye el potencial de membrana en torno a 20 o 25 mV. Se han realizado varios estudios con este ionóforo en distintos tipos celulares, empleando concentraciones del orden de micromolar o incluso milimolar (Platoshyn y cols., 2000; Pereira y cols., 2013). Sin embargo, en nuestro laboratorio, empleando concentraciones similares, las respuestas a agonistas se abolían casi por completo, incluso se comprometía drásticamente la vasoconstricción inducida por 70K. Este hecho quizás puede relacionarse con la capacidad de inducir apoptosis que posee este fármaco a altas concentraciones, como se ha descrito en algunos estudios en los que la administración de valinomicina (100 µM) en cultivos primarios de células de músculo liso de arteria pulmonar de rata o humano, producía una apoptosis de aproximadamente el 80% de las células tras 25 h de cultivo (Krick y cols., 2001). Por ese motivo, las concentraciones de valinomicina empleadas en este estudio no superan los 500 nM en anillos arteriales o 100 nM en CMLVs aisladas, rango en el que no se afectan drásticamente las respuestas a 70K o cafeína, que 125 DISCUSIÓN nos sirven para valorar la viabilidad celular y el correcto funcionamiento de la homeostasis celular. Para corroborar estos hallazgos, utilizamos otro fármaco con una acción más específica sobre un tipo de canal principalmente y no sobre la célula completa, el cromakalim. Este compuesto abre canales de K+ dependientes de ATP (K+ATP), provocando un eflujo de iones K+ hacia el exterior y la hiperpolarización de la membrana celular (Fransen y cols., 2012), lo cual reduce la probabilidad de apertura de los LTCCs. Se sabe que la adición de cromakalim reduce el potencial de membrana alrededor de 10 y 15 mV en CMLV (Nelson y Quayle, 1995; Chataigneau y cols., 1999), alejando así el umbral de activación de los canales LTCCs. A diferencia de lo que ocurría con la valinomicina, el cromakalim no afecta a la respuesta inducida por 70K en aorta, debido a que este fármaco desplaza la curva de activación de los LTCCs a valores más despolarizados, pero no afecta a la respuesta máxima ante un estímulo tan despolarizante como una alta concentración de KCl (Fransen y cols., 2012). Sin embargo, al igual que con la valinomicina, las respuestas a 5-HT y TG también se ven atenuadas en presencia de cromakalim. Interesantemente, la aplicación de glibenclamida, un antagonista selectivo de los canales K+ATP que bloquea el efecto de cromakalim (Daut y cols., 1990; Smani y cols., 2002), es capaz de revertir los efectos sobre la respuesta a 5- HT, sin tener repercusión alguna sobre las respuestas a 70K o cafeína, que tampoco se ve afectadas por cromakalim. Estos datos confirman que existe una contribución de los LTCCs en la respuesta a agonista y TG en aorta, y sugieren que en presencia de cromakalim y valinomicina, la activación de SOCE no es suficiente estímulo despolarizante para la activación secundaria de los LTCCs. Según vimos en la introducción, el potencial de membrana en reposo de las CMLVs está en torno a -60 mV y el umbral de activación de los canales CaV1.2 se sitúa a partir de los - 40 mV estas células. En comparación con los canales de Ca2+ análogos en corazón, la activación dependiente de voltaje de los CaV1.2 de músculo liso presenta un desplazamiento a un umbral más hiperpolarizado, lo que permite la activación de los canales con leves despolarizaciones fisiológicas del potencial de membrana, generando así una tensión suficiente en los vasos para mantener el tono vascular. Si desplazamos el potencial de membrana de las células a valores más negativos (hiperpolarización), esas leves despolarizaciones fisiológicas no llegarían a activar los LTCCs. Esto es lo que podría estar ocurriendo cuando aplicamos valinomicina y cromakalim, ya que la hiperpolarización de la membrana ocasionada por estos compuestos puede ser suficiente para que no se produzca la activación secundaria de los LTCCs tras la despolarización inducida por la activación de SOCE. Por otro lado, observamos que el agonista de los LTCCs BayK, que desplaza el umbral de activación de estos canales a potenciales más hiperpolarizados, aumenta las respuestas a agonistas. Similarmente, un estudio reciente ha demostrado que el vaciado del RS estimulaba SOCE, produciendo la despolarización y activación de los LTCCs en miometrio de rata (Noble y cols., 2014). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que las respuestas de los agonistas pueden ser atenuadas o potenciadas significativamente dependiendo de 126 RESULTADOS la probabilidad de apertura de los LTCCs, por lo que existe una activación secundaria de estos canales tras la activación de los SOCCs. 5.6 Activación o inactivación secundaria de los LTCCs. En el año 2010, se publicaron 2 trabajos independientes en células excitables que demostraron que la activación de la SOCE implica la translocación del sensor STIM1 hacia la membrana plasmática donde, por un lado, se asocia con Orai1 para iniciar SOCE y, por otro lado, inhibe los LTCCs (Park y cols., 2010; Wang y cols., 2010). Recientemente, en colaboración con otros grupos hemos verificado que tras el vaciado de los reservorios, STIM1 regula la entrada de Ca2+ a través de los LTCCs, de acuerdo con los estudios anteriores (Wang y cols., 2010), pero introduciendo un nuevo participante molecular, la proteína citosólica Homer, que estabiliza la interacción STIM1-CaV1.2 tras el vaciado de los reservorios (Dionisio y cols., 2015). Por otro lado, se demostró que la expresión temporal de las subunidades de canal CaV1.2 en células HEK daba como resultado un incremento significativo en SOCE inducida por TG, atribuida a una activación secundaria de los canales CaV1.2 inducida por el influjo catiónico vía SOCCs (Dionisio y cols., 2015). En consonancia con estos últimos resultados, los experimentos presentados en este trabajo aportan varios indicios que apoyan la coactivación de Orai1 y Cav1.2 después de un estímulo con agonistas. Por tanto, en conjunto, nuestros datos sugieren que tras el vaciado de los reservorios pueden promoverse dos mecanismos independientes implicados en la interacción de diferentes componentes de SOCE con CaV1.2 para controlar su actividad. Por un lado, el flujo de Ca2+ a través de SOCE promueve una activación secundaria de los LTCCs y, por otro, STIM1 modula la función del canal CaV1.2. Indiscutiblemente, se necesita investigar más acerca de esta regulación reciproca de los LTCCs mediante el vaciado de los reservorios. De hecho, la regulación dual de los LTCCs mediante el incremento de la [Ca2+]i se ha estudiado extensamente en células excitables, como se ha revisado recientemente (Hofmann y cols., 2014). Se conoce que el aumento de la [Ca2+]i promueve el proceso de inactivación dependiente de Ca2+ o CDI, un proceso bien conocido que se caracteriza por prevenir la sobrecarga de Ca2+ (Barrett y Tsien, 2008). En cambio, el incremento de la [Ca2+]i también puede estimular la facilitación dependiente de Ca2+ del canal CaV1.2 para potenciar el flujo de Ca2+, por ejemplo, durante el acoplamiento excitación-contracción en CMLVs (Saponara y cols., 2008). Hasta ahora, la regulación recíproca de STIM1 con los canales Orai1 y CaV1.2 se ha estudiado principalmente en el cambio fenotípico de músculo liso quiescente a proliferativo/migratorio o en líneas celulares, quedando por esclarecerse los mecanismos moleculares que participan. El principal impulsor del cambio fenotípico de CMLVs es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), que actúa sobre su receptor induciendo la liberación de Ca2+ del RS, siendo un importante activador de Orai1 en músculo liso. Además de su papel en la activación de Orai1, la oligomerización de STIM1 en regiones de aproximación entre membrana plasmática y RS también modula el influjo de Ca2+ a través de canales CaV1.2 e induce la internalización de los LTCCs en neuronas 127 DISCUSIÓN corticales de rata y células de músculo liso A7r5 (Park y cols., 2010; Wang y cols., 2010). Este mecanismo de inhibición, en cambio, no ha podido ser confirmado en CMLVs quiescentes (Takeda y cols., 2011), lo que puede reflejar distintos papeles para la proteína STIM1 en células proliferativas y en células contráctiles, el fenotipo celular en el que se ha centrado este trabajo. Aunque los trabajos publicados por los grupos de los Drs. Park y Wang indican una inhibición significativa de la actividad de los LTCCs tras el vaciado del RS, el grupo del Dr. Takeda muestra resultados opuestos. Las razones todavía no están claras, pero la posibilidad de que la expresión de STIM1 en células en cultivo primario y células frescas sea diferente, puede contribuir a las diferencias en la modulación de los LTCCs después de la liberación de Ca2+ desde el RS. De hecho, hay estudios que sugieren que STIM1 se expresa abundantemente en células en cultivo, pero se detectan niveles muy bajos en CMLVs aisladas en fresco (Berra-Romani y cols., 2008). Por otro lado, es posible que los LTCCs no se vean regulados por STIM1 después del vaciado de los reservorios en miocitos arteriales o que las diferencias en las condiciones experimentales puedan explicar las disparidades encontradas. Independientemente, los resultados del grupo del Dr. Takeda descartan un mecanismo de retroalimentación potencial por el cual la carga de Ca2+ del RS regula negativamente la actividad de los VDCCs en CMLVs. Por lo tanto, la relevancia fisiológica de regulación de STIM1 de los LTCCs en miocitos arteriales no está del todo clara. 5.7 Caracterización del papel de Orai1 y TRPC1 en la contracción inducida por 5-HT. 5.7.1 Orai1 participa en la vasoconstricción inducida por agonista. Conjuntamente con otros componentes moleculares de SOCE, se ha sugerido la implicación de Orai1 en enfermedades cardiovasculares tales como la hipertensión, proliferación de CMLVs o remodelado vascular (Giachini y cols., 2009; Zhang y cols., 2011; Rodriguez-Moyano y cols., 2013). Sin embargo, la implicación fisiológica de Orai1 en la contractilidad vascular no está clara. En este trabajo, mostramos por primera vez nuevas evidencias acerca de la contribución de Orai1 en la vasoconstricción inducida por agonista en presencia de Ca2+ extracelular, sin necesidad del vaciado previo de los reservorios. Interesantemente, la aplicación de 5-HT evoca una respuesta de contracción que se ve atenuada en anillos aórticos cuando se transfieren con anti-Orai1. En cambio, las respuestas a cafeína y a KCl a alta concentración no se ven afectadas, por lo que la transferencia del anticuerpo sólo afecta a la respuesta mediada por agonista y no a la contracción mediada por la liberación de Ca2+ del RS con cafeína o por despolarización y activación de los LTCCs. Considerando que la transferencia de anticuerpos en tejido es limitada, la disminución del efecto de un inhibidor de SOCE como 2APB en anillos transferidos con anti-Orai1 sobre la 128 RESULTADOS contracción producida por 5-HT confirma la disminución de la actividad de Orai1. Aunque nuestros datos no descartan la posible participación de otras proteínas en la formación de los SOCCs, estos resultados siguen la línea de otros artículos en los que se ha estudiado el papel de los canales Orai1 en CMLVs contráctiles. El grupo del Dr. Giachini demostró que el anticuerpo anti-Orai1 inhibía la contracción de la aorta en ratones hipertensos usando el protocolo de readición de Ca2+ (Giachini y cols., 2009). Por otro lado, en nuestro grupo hemos demostrado que las contracciones evocadas tanto por Urotensina II como por fenilefrina o lisofosfatidilcolina, se ven atenuadas en anillos arteriales de coronaria tras su transfección con siRNA de Orai1 (Dominguez-Rodriguez y cols., 2012). Cabe resaltar que en este caso se trataron los anillos durante 48 horas, mientras que los datos presentados en esta memoria corresponden a experimentos hechos el mismo día. 5.7.2 Papel de TRPC1 y Orai3 en la vasoconstricción inducida por agonista. Otras proteínas propuestas como posibles SOCCs fueron los canales TRP (Montell, 2005), en especial el canal TRPC1 (Beech, 2005). Sin embargo, existe mucha controversia sobre la participación de los canales TRPCs en SOCE, ya que algunos autores han apoyado su implicación en células excitables (Ambudkar y cols., 2007), mientras que otros han descrito que SOCE depende únicamente de Orai1 y STIM1 en CMLVs de fenotipo proliferativo o sintético, ya que el silenciamiento de la expresión de TRPC1 y otras isoformas como Orai2, Orai3, TRPC4 y TRPC6 no tenían efecto sobre esta ruta de entrada de Ca2+ (Potier y cols., 2009). Por este motivo, decidimos explorar el efecto de la transferencia de anticuerpos contra Orai3 y TRPC1 sobre la vasoconstricción inducida por agonista en anillos aórticos de ratón. En nuestros experimentos, no encontramos diferencias significativas en la contracción producida por 5-HT (10 µM) entre anillos aórticos control y anillos aórticos transferidos con anti-Orai3 o anti-TRPC1, lo que sugiere que Orai3 y TRPC1, en principio, no participan en la vasoconstricción inducida por 5-HT en aorta. Es cierto que hay que tomar en cuenta la poca eficiencia y la dificultad que implica la transferencia en tejidos de moléculas grandes como los anticuerpos, y que la unión del anticuerpo a su antígeno no implica necesariamente bloqueo de función. A pesar de ello, los canales TRP, especialmente la subfamilia TRPC, han sido propuestos en multitud de ocasiones como mediadores de SOCE en muchos tipos celulares, incluyendo células vasculares. Además, en nuestro laboratorio tenemos evidencias de que algunas isoformas, como TRPC1, pueden funcionar colaborativamente con canales Orai1 para formar canales SOCCs no selectivos y facilitar SOCE (Rodriguez-Moyano y cols., 2013). Por lo tanto, se necesitan más estudios para ver la relación que podría existir entre ellos y el papel fisiológico que tienen. 5.8 Distribución endógena de Orai1, TRPC1 y CaV1.2. La estricta regulación de la [Ca2+]i es de suma importancia para el desarrollo controlado del tono miogénico ya que un cambio relativamente pequeño en los niveles de Ca2+ citoplasmáticos (de <100 a 400 nM de Ca2+) es suficiente para abarcar desde una relajación 129 DISCUSIÓN completa a una contracción completa (Hill-Eubanks y cols., 2011). Por tanto, los complejos mecanismos reguladores controlan la dinámica local de Ca2+ dentro de las CMLVs para regular tanto los mecanismos contráctiles como los relajantes. Una manera lógica de conseguir esta regulación es disponer los componentes proteicos en microdominios contráctiles y relajantes espacialmente separados, agrupando y aislando los mecanismos moleculares necesarios dentro de un espacio extremadamente limitado. Con esta disposición, un incremento localizado en el Ca2+ intracelular puede ser suficiente para activar mecanismos independientes de contracción o de relajación, sin que interfieran entre ellos ni se produzca un incremento en la [Ca2+] global que pueda comprometer la viabilidad celular (Hill-Eubanks y cols., 2011). Gracias a las restricciones espaciales impuestas dentro de estos microdominios se consigue una fina regulación de la señalización de Ca2+ y del tono miogénico (Parekh, 2008). En este sentido, varios grupos han demostrado interacciones entre diferentes proteínas para formar complejos de señalización de SOCE como se discute en estos trabajos (Vaca, 2010; Berna-Erro y cols., 2012). Nuestros experimentos de inmunocitoquímica muestran que Orai1 y CaV1.2 presentan una localización subcelular similar y una distribución uniforme en la membrana plasmática de CMLVs, estando muy próximas entre sí. Gracias al cálculo del coeficiente de Pearson o PCC, confirmamos que existe una colocalización significativa entre ambos canales en aorta de ratón y en arteria coronaria de rata. Interesantemente, esta colocalización aumenta cuando las CMLVs aisladas de aorta de ratón se estimulan con agonistas como ET-1, Phe o TG, no siendo así cuando se aplica 70K. Estos datos sugieren que los canales Orai1 y CaV1.2 pueden distribuirse en regiones cercanas en la membrana plasmática de CMLVs lo que les permite interaccionar, al menos funcionalmente, cuando se induce SOCE. Recientemente, estudios independientes han demostrado que Orai1 se asociaba con otros canales, como Orai3, para formar canales de Ca2+ regulados por AA (ARC) (Mignen y cols., 2009), con TRPC1 para formar SOCCs no selectivos (Rodriguez-Moyano y cols., 2013; Desai y cols., 2015), o incluso con canales de K+ activados por pequeñas conductancias de Ca2+ (SK3) (Song y cols., 2015; Gueguinou y cols., 2016). Por otro lado, también hemos comentado la interacción que tiene lugar entre distintos componentes de SOCE con el canal CaV1.2 (Wang y cols., 2010; Dionisio y cols., 2015). Además, se ha descrito que TRPC1 puede formar complejos macromoleculares con el canal CaV1.2, participando en la regulación de la conducción cardiaca, actividad ventricular y contractilidad durante la cardiogénesis (Sabourin y cols., 2011). Teniendo en cuenta esto, y a raíz de nuestros resultados, quisimos corroborar la colocalización existente entre los canales CaV1.2 y Orai1 y determinar otras posibles interacciones con otros canales, como TRPC1, con el objeto de identificar complejos de señalización de SOCE en los que pudieran estar participando estas proteínas. Para ello, diseñamos experimentos utilizando una técnica de inmunofluorescencia más novedosa denominada in situ PLA, en los que demostramos por primera vez que Orai1, CaV1.2 y también TRPC1, expresados endógenamente en CMLVs, se distribuyen en regiones cercanas. Con esta tecnología, cuando dos proteínas se encuentran próximas entre sí, a 130 RESULTADOS una distancia menor a 40 nm de longitud, se pueden visualizar señales fluorescentes (Soderberg y cols., 2008). De esta manera, en nuestros datos se observa que no sólo existe una colocalización basal entre CaV1.2 y Orai1, sino que también existe entre CaV1.2 y TRPC1. Estas colocalizaciones aumentan cuando las CMLVs se incuban con agonistas que implican la activación de SOCE (5-HT a través de señalización IP3 y TG a través de la inhibición de SERCA), ya que el número de señales fluorescentes por PLA se ven incrementadas. En cambio, no se observa mayor número de señales PLA cuando se incuban las células con un estímulo despolarizante como 70K, lo que sugiere que el flujo de Ca2+ inducido por agonista puede ser debido principalmente a una interacción funcional o comunicación entre los SOCCs dependientes de TRPC1 y Orai1 y los canales CaV1.2 en CMLVs. Por lo tanto, aquí mostramos varias evidencias que demuestran que los componentes de SOCCs, Orai1 y TRPC1, forman un complejo macromolecular con CaV1.2 para regular la señalización de Ca2+ y el tono vascular. Si tenemos en cuenta que los SOCCs formados por Orai1 hexaméricos, recientemente cristalografiados (Hou y cols., 2012), pueden ser canales catiónicos no selectivos con propiedades biofísicas ligeramente diferentes a los canales CRAC o canales Orai1 tetraméricos clásicamente descritos (Thompson y Shuttleworth, 2013) y que existen evidencias descritas de que los canales TRPC1 pueden asociarse con Orai1 formando SOCCs no selectivos y facilitar SOCE (Ambudkar y cols., 2016; Gueguinou y cols., 2016), la existencia de complejos macromoleculares en los que Orai1, TRPC1 y CaV1.2 puedan interactuar funcionalmente apoya la idea de que el canal CaV1.2 pueda incrementar significativamente SOCE, gracias a una activación secundaria de los canales CaV1.2 inducida por el influjo catiónico y despolarización vía SOCCs (Bolotina, 2012; Molnar y cols., 2012; Dionisio y cols., 2015). 5.9 Papel fisiopatológico de SOCE. Como hemos introducido anteriormente, la capa más importante de los vasos sanguíneos es la túnica media, ya que es la responsable del mantenimiento y regulación del tono vascular, siendo las CMLVs, el tipo celular predominante. Varias enfermedades vasculares como la ateroesclerosis, hipertensión y reestenosis presentan alteraciones a nivel de CMLV, en las que normalmente se produce un cambio de fenotipo debido a procesos mecánicos o inflamatorios, pasando de un fenotipo contráctil a un fenotipo sintético, proliferativo y migratorio. Este tipo de células son las responsables del estrechamiento y el remodelado de los vasos característico en estas patologías (Liu y cols., 1989; Puato y cols., 2004; Orr y cols., 2010). Este tipo de enfermedades se asocia con contracciones arteriales mantenidas debido al flujo de Ca2+ transmembrana a través de canales iónicos en CMLVs, el cual modifica el flujo sanguíneo comprometiendo la función de distintos órganos. En este trabajo, demostramos que los SOCCs dependientes de Orai1 y TRPC1, activados por agonistas que implican la 131 DISCUSIÓN ruta de señalización de IP3, interaccionan con canales CaV1.2. Estos canales están localizados en regiones muy próximas o microdominios y su comunicación funcional se incrementa después de la estimulación con agonista, sugiriendo su importante papel en la modulación del diámetro arterial y, por lo tanto, en el control del flujo sanguíneo. Por lo tanto, esta interacción funcional entre los SOCCs y LTCCs puede ser una atractiva estrategia terapéutica para mejorar la regulación del tono vascular en estas enfermedades, ya que muchos de los componentes moleculares de esta ruta de entrada de Ca2+ se encuentran sobreexpresados en alguna patología vascular como veremos a continuación. La participación de SOCE no se limita a las CMLVs contráctiles, sino que se ha descrito que existe un aumento de este tipo de entrada de Ca2+ en CMLVs con fenotipo proliferativo o sintético, debido en parte, a un aumento de la expresión de STIM1 y Orai1 (Potier y cols., 2009). Esto sugiere que estos cambios adaptativos en la expresión y función de Orai1 y STIM1 podrían llevar a la modulación fenotípica que ocurre durante distintas patologías. La señalización de Ca2+ regula la función vascular, no sólo la contracción, sino también los cambios fenotípicos, la proliferación y migración de las CMLVs. Nuestro grupo ha corroborado la participación de SOCE en la vasoconstricción y proliferación inducida por Urotensina II en coronaria y aorta de rata, en la que STIM1, Orai1 y TRPC1 tienen un papel protagonista (Dominguez-Rodriguez y cols., 2012; Rodriguez-Moyano y cols., 2013), lo que refleja la interacción que puede existir entre STIM1 y Orai1 con estos canales TRP no selectivos para Ca2+. Mediante el silenciamiento de la expresión de estas proteínas con siRNAs e inhibidores farmacológicos, hemos demostrado la reducción de SOCE inducida por agonista y TG, limitando la proliferación de las CMLVs (Rodriguez-Moyano y cols., 2013). Otros grupos también han demostrado la participación de STIM, Orai1 y TRPC1 en SOCE (Takahashi y cols., 2007; Li y cols., 2008), relacionando estos componentes con la proliferación y migración celular, por lo que se demuestra que esta entrada de Ca2+ está implicada en procesos patológicos que impliquen una proliferación de CMLVs. Varios grupos han utilizado un modelo de angioplastia carotidea en rata in vivo para estudiar la proliferación y migración de las CMLVs. En ellos se ha observado que, tras la lesión arterial, existía una sobreexpresión de Orai1 y STIM1. Además, describieron que, silenciando ambas proteínas con vectores adenovirales, conseguían prevenir la sobreexpresión de ambos componentes de SOCE, reducir la proliferación de CMLVs y la formación de la neoíntima, al mismo tiempo que evitaban la activación de factores de transcripción como NFAT (Mancarella y cols., 2013). Actualmente, en nuestro laboratorio estamos desarrollando experimentos usando el modelo de angioplastia carotídea para determinar los componentes moleculares de SOCE involucrados en la formación de la neoíntima, incluyendo proteínas reguladoras de STIM1 como SARAF, además de estudiar la posible implicación de los SOCCs como mediadores de la señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor ), que regula la proliferación celular. Asimismo, se ha relacionado a STIM1 y Orai1 con patologías como la hipertensión. Algunos estudios describieron que en modelos de ratas espontáneamente hipertensas (SHR, Spontaneously Hipertensive Rats ), la contracción inducida por SOCE era mayor 132 RESULTADOS comparadas con ratas WT. Además, esta contracción se suprimía con inhibidores de SOCE como el 2APB y Gd3+ o se reducía mediante la aplicación de anticuerpos contra STIM1 y Orai1, llegando a igualar las diferencias entre SHR y ratas WT (Giachini y cols., 2009). Estos resultados se correlacionaron con una mayor expresión de estos componentes de SOCE a nivel de proteína y mRNA. Otros demostraron que la hipertensión pulmonar está relacionada con una sobreexpresión de STIM1 y Orai1 en CMLV de la arteria pulmonar (Ogawa y cols., 2012). Todo ello apoya la idea de STIM1 y Orai1 como dianas terapéuticas en enfermedades que cursan con oclusión vascular y la hipertensión. SOCE igualmente puede participar en procesos patológicos como la trombosis, que tiene lugar cuando hay una obstrucción del flujo sanguíneo debido a la agregación plaquetaria o coagulación sanguínea inducida por un estímulo o un daño severo. La activación y agregación plaquetaria tiene lugar por un aumento en la [Ca2+]i, que puede ser debido, al menos en parte, a una SOCE activada por diversos agonistas. Se han descrito altos niveles de expresión de STIM1 y Orai1, además de algunos canales TRP (Berna-Erro y cols., 2016), en estas células sugiriendo que esta entrada de Ca2+ tiene un papel importante en la función y regulación de las mismas. Por otra parte, la hipoxia es uno de los factores importantes que promueven angiogénesis. En estas condiciones, se ha observado una mayor proliferación de células endoteliales y CMLVs, debido al aumento de la transcripción de genes que codifican agonistas vasoactivos como la ET-1 o factores de crecimiento como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor ) y el factor de crecimiento derivado de PDGF, que pueden promover la activación de SOCE. Existen estudios que describen una entrada de Ca2+ mantenida en células endoteliales promovida por VEGF y sensible a inhibidores de SOCE como Synta66 (Li y cols., 2011a), implicando a este tipo de entrada de Ca2+ en procesos angiogenéticos. Aquí se ha demostrado que la señalización de Ca2+ regulada por los reservorios mediada por SOCCs es crucial en multitud de funciones celulares y tiene un papel fisiológico muy importante, estando implicada en diversas patologías. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos inhibidores de SOCE que sean altamente específicos tanto de tejido como de sus distintos componentes, parar poder entender con exactitud la implicación fisiopatológica de SOCE y para poder desarrollar nuevos tratamientos de enfermedades. 5.9.1 Perspectivas futuras. Desde su descubrimiento, hace casi 30 años, se ha progresado mucho en el estudio de SOCE. El descubrimiento de STIM1 y Orai1 indujo un rápido crecimiento de lo que conocemos hoy en día sobre las funciones fisiológicas y las consecuencias patológicas que puede tener la disfunción de esta ruta de entrada de Ca2+. Sin embargo, todavía se desconocen algunos aspectos sobre el mecanismo, como la estequiometría de la unión STIM1-Orai1, cómo se induce la apertura, qué factores regulan el proceso… Y, sobre todo, se desconocen aspectos acerca de la significancia fisiológica de los SOCCs y SOCE y especialmente de su importancia en enfermedades. Además, la heterogeneidad de los mismos ha complicado su entendimiento ya que no hay herramientas suficientes para 133 DISCUSIÓN hacer esta determinación ni tampoco se ha podido cuantificar la importancia relativa de TRPC1/Orai1 comparado con otros tipos de canales de Ca2+. Por eso, es necesario realizar más investigaciones acerca de la participación de estos canales a la fisiología celular y cómo interaccionan con otros canales de Ca2+ más importantes como los VDCC. Por todo esto, el descubrimiento de nuevos fármacos o pequeñas moléculas que actúen contra estos canales es de gran importancia para la investigación preclínica. Podemos encontrar antagonistas de canales de Ca2+, erróneamente llamados así ya que haría referencia a bloqueantes de todos los canales de Ca2+ o a la inexistencia de otros tipos de canales de Ca2+, que bloquean los LTCCs específicamente, reduciendo la contracción del músculo liso vascular y la resistencia periférica. Sin embargo, no se han desarrollado fármacos o pequeñas moléculas contra otros tipos de canales de Ca2+ como los SOCCs, que presumiblemente bloquearían el remodelado vascular, la reestenosis o la angiogénesis tumoral. Por tanto, es de gran interés el desarrollo de nuevas estrategias contra este tipo de canales, ya sea con bloqueantes específicos contra Orai1, TRPC1, etc., con tratamientos combinados con antagonistas de LTCCs o mediante pequeñas moléculas contra los heterómeros que forman estos canales desempeñando distintas funciones en diferentes tipos celulares. Existen nuevas moléculas que se postulan como antagonistas específicos de SOCE, como el Synta66 (van Kruchten y cols., 2012) o GSK-7975A (Derler y cols., 2013), sin embargo, todavía no se conoce el mecanismo de actuación de estos inhibidores o por qué pueden ser más potentes contra SOCE en un tipo celular más que en otro. El último compuesto fue desarrollado por la empresa GlaxoSmithKline, lo cual refleja la apuesta de la industria farmacéutica para encontrar inhibidores eficientes para esta vía de señalización.