Estudio de la interacción entre macrociclos tipo calixareno y ADN

1 Facultad de Farmacia – Universidad de Sevilla ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN ENTRE MACROCICLOS TIPO CALIXARENO Y ADN Ana Muñoz Wic 2 3 Departamento de Química Física Facultad de Química – Universidad de Sevilla Trabajo Fin de grado – Grado en Farmacia ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN ENTRE MACROCICLOS TIPO CALIXARENO Y ADN Trabajo Fin de Grado de tipo Experimental. Área de Química Física de la Facultad de Química. Tutora de trabajo: Prof. Pilar López Cornejo Ana Muñoz Wic Sevilla, Julio 2017 4 5 1.RESUMEN Gracias a la posibilidad de diseñar y fabricar diferentes tipos de vectores, según las características del sistema a transportar y a la capacidad para condensar el ADN; los calixarenos se pueden convertir en una de las principales herramientas para los procesos de transfección, dejando atrás los problemas que conllevan los vectores virales y no virales como los lípidos catiónicos y polímeros. Se ha comprobado su calidad como portador artificial a través de estudios de absorbancia, fluorescencia, discroísmo circular, melting, viscosidad, AFM, y citotoxidad; de manera que se verifican sus capacidades de interacción y compactación con el polinucleótido. PALABRAS CLAVE: calixareno, ADN, nanotransportador, intercalación. 6 ÍNDICE 1. RESUMEN……………………………………………………………………………………………………….. 5 2. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………. 7 3. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………….. 12 4. PARTE EXPERIMENTAL………………………………………………………………………………….. 13 4.1 MATERIALES…………………………………………………………………………………………….. 13 4.2 MÉTODOS……………………………………………………………………………………………….. 13 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………………………. 16 5.1Medidas de fluorescencia…………………………………………………………………………. 16 5.2 Viscosidad……………………………………………………………………………………………….. 19 5.3 Dicroísmo circular……………………………………………………………………………………. 20 5.4 Melting……………………………………………………………………………………………………. 24 5.5 AFM………………………………………………………………………………………………………… 25 5.6 Citotoxicidad…………………………………………………………………………….……………… 26 6. CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………….……. 27 7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………………. 28 7 2. INTRODUCCIÓN Según estudios realizados in vitro e in vivo, el ADN desnudo y el ARN muestran una capacidad muy pobre para transfectar células, debido a una serie de barreras que tienen que atravesar y su descomposición por nucleasas en medios biológicos (Dominska and Dykxhoorn 2010). Uno de los mayores retos en terapia génica es encontrar portadores de genes seguros y eficientes. En la última década se ha dedicado mucho esfuerzo a ampliar la gama de compuestos capaces de compactar, proteger, transportar y suministrar ácidos nucleicos a la célula para que exprese las proteínas adecuadas (Junquera and Aicart 2014; Thomas et al. 2003). En un principio los virus fueron la opción lógica para liberar los genes en el lugar correcto. Los virus recombinantes se construyeron sustituyendo los genes esenciales para la fase de replicación de sus ciclos de vida con los genes terapéuticos de interés (Ortiz Mellet et al. 2011). Sin embargo, el uso de vectores virales sigue acompañado de algunos riesgos no despreciables, tales como respuestas inmunes adversas violentas y genotoxicidad (Srinivas et al. 2009). Esto es debido al hecho de que, al igual que los virus han evolucionado para infectar células, el sistema inmunológico se ha desarrollado para rechazar lo que percibe como la invasión de patógenos (Ortiz Mellet et al. 2011). Además, su uso presenta limitaciones como la complejidad y alto coste que requieren los procesos de preparación, la producción suele ser en cantidades bastante escasas, las dimensiones restringidas de los filamentos de ácido nucleico que pueden ser transportados por ellos o la posible y comprometida biodisponibilidad debido al gran tamaño molecular que poseen (Mintzer and Simanek 2009). Teniendo en cuenta las limitaciones y riesgos inherentes existentes en el uso de estos vectores, se ha dirigido mucho la atención al diseño de portadores artificiales (no virales) para la liberación génica (Nayak and Herzog 2010) basados, inicialmente, en la utilización de lípidos catiónicos y, posteriormente, en la de polímeros catiónicos, dendrímeros, ciclodextrinas y nanopartículas (Li and Huang 8 2007; Mintzer and Simanek 2009). Estos vectores no virales presentan algunas ventajas frente a los virales, tales como la capacidad de compactar una mayor cantidad de ADN, el no desencadenar una respuesta inmune y tener una producción más barata (Muñoz-Úbeda et al. 2012). Entre ellos, el desarrollo en el uso de lípidos catiónicos (Hirko et al. 2003; Martin et al. 2005; 2006) y en el de polímeros (Esmaeilzadeh Gharehdaghi et al. 2014; De Smedt et al. 2000) ha sido particularmente exitoso. Sus complejos con el ADN, llamados lipoplexos y poliplejos respectivamente, muestran una alta eficiencia de transfección in vitro, una inmunogenicidad débil y una capacidad para transportar grandes cantidades de información genética (Mintzer and Simanek 2009). Sin embargo, el uso de estos sistemas también presentan algunos problemas como es el caso del pobre control estructural que presentan sus complejos con el ADN (Safinya 2001), que son generalmente estructuras grandes, infinitas y polidispersas. Además, los lípidos catiónicos presentan toxicidad moderada-alta y su asociación con las proteínas de suero promueve fagocitosis (Caracciolo et al. 2010; Di Cola et al. 2016). Todo esto hace que el desarrollo de nuevas moléculas y formulaciones capaces de entregar ácidos nucleicos en las células con mayor eficiencia y seguridad todavía esté aún en curso (Gallego-Yerga et al. 2015). En los últimos años se ha propuesto un gran número de vectores génicos basados en bloques de construcción supramoleculares. Uno de los grupos más importantes está basado en la unión de moléculas macrocíclicas tales como ciclodextrinas, fullerenos, calixarenos (CA) y pilarenos (Aoyama 2004; Ortiz Mellet et al. 2010). Los calixarenos (ver fig.1) son una clase de oligómeros cíclicos formados a través de una condensación de fenol-formaldehído. Tienen forma de "copa" con un borde superior e inferior definido y un anillo central (Mcmahon et al. 2003). 9 Figura 1. Estructura del 5,7-(9H-fluoren-2-il) metileneamino)-11,23-di-tert-butil- 25,27-dietoxicarbonilmetileneoxi-26-28-dihidroxicalix[4]arene Los primeros prototipos explotaron la atracción entre los grupos fosfatos del ADN y los cationes permanentes sobre los calixarenos. Posteriormente se desarrollaron ligandos más sofisticados que utilizaron los enlaces de hidrógeno, πstacking, la coordinación metálica y el carácter hidrófobo para reconocer la forma y el estado de carga de los ácidos nucleicos (Peters and Schrader 2016a). Los calixarenos presentan la peculiaridad de contener en la misma molécula compartimentos hidrofóbicos e hidrofílicos. Las cavidades hidrofóbicas les dan capacidad para atrapar moléculas más pequeñas. Los bencenos que forman esta cavidad pueden estar funcionalizados con grupos iónicos, ya sea en el borde superior o en el borde inferior del armazón del calixareno, aportándole el carácter hidrofílico (Lindman and Dias 2008a). Esta característica mejora significativamente la capacidad de condensación del ácido nucleico y la eficiencia de transfección de los nanocomplejos supramoleculares resultantes (Martinez et al. 2013). 16 penicilina/estreptomicina) y RPE-1 (RPMI/F12 + 10% FSB + 1% penicilina/estreptomicina). 5.RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 Medidas de Fluorescencia El calixareno estudiado está funcionalizado con anillos aromáticos que lo convierten en moléculas fluorescentes. Esta característica nos facilita el trabajo, en el sentido de que no es necesaria la adición de ninguna otra especie para obtener información acerca del complejo calixareno/ADN. La fig.3 muestra la variación que experimenta la intensidad de emisión del calixareno, medida a 318nm, a distintas relaciones molares [calixareno]/[ADN]. Se observan dos tendencias contrarias. A valores pequeños de X, tiene lugar una disminución de la intensidad de emisión. A partir de un determinado valor de X, aproximadamente X=5x10⁻ᶟ, la intensidad de emisión comienza a aumentar hasta alcanzar un valor aproximadamente constante. La intensidad del calixareno disminuye, en un principio, al añadir ADN al medio. La emisión del calixareno estudiada es debida a la excitación de los dos grupos aromáticos policíclicos (fluorenos) que posee. Estos grupos son planos, por lo que es posible que se intercalen entre los pares de bases del polinucleótido. Este hecho puede provocar una disminución de emisión de los mismos al cambiar las características del medio en el que se encuentran los fluorenos. Sin embargo, al aumentar el valor de X, la intensidad de emisión vuelve a aumentar. Esto puede ser debido al hecho de que se forman dímeros de calixareno (ver fig.4) al aumentar su concentración en el medio. La formación de dímeros del calixareno usado en este trabajo había sido previamente observado por otros autores (Supian et al. 2010). Por otro lado, este comportamiento también se podría explicar si asumimos que la adición de más calixareno al medio provoca la interacción de estas moléculas con las de calixarenos que en un principio se encontraban intercaladas en el ADN. 17 Figura 3. Intensidad de emisión de la solución calixareno/ADN a distintos valores de X. Figura 4. Comportamiento del ADN en presencia del calixareno. Para comprobar este hecho, se ha representado la intensidad de emisión relativa del calixareno, a concentración de calixareno fija, frente a la concentración de ADN (ver fig 5). Los resultados muestran dos tendencias bien diferenciadas. X 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 IE / u.a. 340 360 380 400 420 440 460 480 18 Un sistema de este tipo se podría describir mediante el uso del modelo de dos estados: En el que se pueden encontrar distintos tipos de calixarenos, los cuales emiten de maneras distintas. Para un sistema de este tipo, se puede deducir la siguiente expresión, en la que se incluye la variación que experimenta la intensidad total del sistema en función de la concentración de polinucleótido: 𝐼 𝐼0= (𝐼 𝐼0)𝑊+𝐾1(𝐼 𝐼0)1𝐾2[𝐴𝐷𝑁]+𝐾1𝐾2(𝐼 𝐼0)2 1+𝐾1[𝐴𝐷𝑁]+𝐾1𝐾2[𝐴𝐷𝑁]2 (1) Se llevó a cabo un ajuste multiparamétrico a partir del cual se obtuvieron las constantes de equilibrio K1 y K2. Los valores obtenidos fueron: K₁ =2.8x10⁻⁵M⁻₁, y K₂ =219M⁻₁. Estos valores se han obtenido del ajuste (ver figura 4) a la ecuación de pseudofase cuadrática (ver esta ecuación 1). La gráfica corresponde al mejor ajuste haciendo una ecuación bicuadrática de pseudofase: 19 Figura 4. Representación de las diferentes intensidades según la concentración de ADN. Los puntos representan los valores experimentales y la línea el mejor ajuste obtenido haciendo uso de la ecuación 1. 5.2 Medidas de viscosidad A partir de medidas de viscosidad se puede obtener información acerca del tipo de interacción que puede darse entre un ligando y receptor. Así, un proceso de intercalación provoca un aumento de la viscosidad, debido al incremento de la anchura del ADN. Por el contrario, la unión de un ligando en los surcos del ADN induce una constancia o disminución de este parámetro (Beccia et al. 2012; Grueso et al. 2012; Suh and Chaires 1995). El incremento de la viscosidad podría también observarse si tiene lugar una separación de las hebras. Según los resultados de la fig.5, se observan de nuevo dos tendencias contrarias. Además, el cambio ocurre a valores de X muy cercanos a los de la fluorescencia. La viscosidad aumenta cuando se añaden pequeñas cantidades de calixareno a la disolución de ADN, hasta un máximo que se alcanza a valores próximos a X=3.33x10-3. Este aumento de viscosidad en los resultados indica, por tanto, que la interacción del calixareno con el ADN tiene lugar según un proceso de intercalación de los grupos aromáticos planos de fluoreno entre los pares de bases [ADN]/M 0,000 0,001 0,002 0,003 I / Io 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 20 nitrogenadas del polinucleótido. La interacción del ADN con este calixareno es fuerte ya que a concentraciones muy pequeñas presenta grandes cambios. A partir de ese valor de X (3.33x10-3) la viscosidad pasa a ser constante si se sigue aumentando la concentración de calixareno. Este comportamiento sugiere que tiene lugar una estabilización del sistema debido a que, a altas concentraciones del macrociclo, estos forman dímeros, hasta llegar a formar agregados si la concentración sigue aumentando. Un comportamiento de este tipo debilita la interacción calixareno/ADN. En este caso, el polinucleótido adoptaría una nueva conformación más similar a la correspondiente a su situación original, y de ahí esta constancia. X 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 t/s 1,050 1,055 1,060 1,065 1,070 1,075 1,080 1,085 Figura 5. Variación de la viscosidad en función del valor de X. Corresponde a un aumento de los datos obtenidos Para confirmar si estos resultados son debido a que ocurre un cambio conformacional en la estructura del ADN, pasamos a realizar medidas de dicroísmo circular. 21 5.3 Espectros de Dicroísmo Circular (DC) Se trata de una técnica usada para monitorizar los cambios estructurales en la conformación del ADN. En la fig.6 se observa el aspecto que presenta el espectro de ADN en su conformación B, que muestra las características del espectro de DC en la región UV (220-320nm). La banda negativa está relacionada con el giro de la estructura, apareciendo un pico a aproximadamente 248nm. La banda positiva representa el apilamiento de los pares bases, apareciendo un pico a aproximadamente una longitud de onda igual a 280nm. Estas bandas se deben a las interacciones πstacking entre las bases y a la estructura helicoidal del polinucleótido que proporciona un ambiente asimétrico para las bases (Neidle 2002) nm 220 240 260 280 300 320 340 360 obs/mdeg -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 Figura 6. Espectro de ADN (5x10-5M) de dicroísmo circular En la fig.7 vemos cómo las alteraciones estructurales del ADN causadas por las interacciones del calixareno pueden cambiar su espectro de DC. Se observa un primer descenso, o disminución de la elipticidad, del espectro de ADN cuando se añade pequeñas cantidades de calixareno al medio. Esta variación puede deberse a que ocurre una compactación parcial del polinucleótido, es decir, al interaccionar el calixareno mediante intercalación con el ADN éste sufre un cambio en su conformación quizás envolviendo al calixareno. Se habla de una compactación 22 parcial y no total ya que no desaparece en ningún momento ninguna de las dos bandas características del espectro del polinucleótido. Además, se observa cómo a pequeñas concentraciones de calixareno la banda: - Se desplaza hacia la derecha, hacia longitudes de onda más altas. Este comportamiento indica la separación de la doble hebra del polinucleótido, es decir, el ADN sufre una desnaturalización parcial. /nm 220 240 260 280 300 320 obs/mdeg -4 -2 0 2 4 adn X=0.0002 X=0.002 X=0.006 X=0.09 X= 0.19 Figura 7. Espectro de dicroísmo circular a distintos valores de X. Para ver estos cambios más detalladamente, puede verse en la fig.8 los cambios del pico de la banda negativa según varía el valor de X, donde se aprecia primero una disminución, y después un cambio de tendencia, volviendo a recuperar un valor de elipticidad parecido al inicial que se mantiene constante. En la fig.9 se recogen los valores de elipticidad de la banda positiva al variar X, donde también se aprecian una disminución y un posterior aumento del valor de elipticidad hasta quedar constante (en este caso el valor de la elipticidad en la constancia difiere del valor que presente el ADN sin calixareno). 23 X 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 obs/mdeg -3,6 -3,4 -3,2 -3,0 -2,8 -2,6 Figura 8. Variación de a 248nm a distintos valores de X X 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 obs/mdeg 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 Figura 9. Variación de la banda positiva a 280nm a distintos valores de X 24 5.5 Medidas de melting El estudio de la desnaturalización de las disoluciones de ADN a través de la adición de calor, ofrece información sobre cambios conformacionales en el polinucleótido, así como información sobre la fuerza y el carácter de la interacción ADN/ligando (calixareno en este caso). La temperatura melting se determinó como el promedio de las temperaturas iniciales y finales del proceso de desnaturalización. Se observó una disminución de la temperatura de melting al aumentar la cantidad de calixareno en el medio y, a partir de un determinado valor del parámetro X, se obtuvo un aumento de dicho valor de temperatura (ver fig.10). Se observan de nuevo dos tendencias diferentes: una primera disminución de Tm al aumentar el valor de la relación molar X de 0 a 3.30x10⁻ᶟ, lo que implica una rotura de enlaces de hidrógeno entre los pares de bases que lleva a la desestabilización de la doble hebra. Esto facilita la compactación del ADN ya que las interacciones hidrófobas están más favorecidas en el caso de una sola hebra. La mayor compactación que sufre el ADN coincide con el punto más bajo de la gráfica. La segunda tendencia es un aumento posterior para mayores proporciones de [calixareno]/[ADN], que como sucedía con las medidas de viscosidad. Este aumento observado a partir de un determinado valor de [calixareno], el cual corresponde a un valor de X de aproximadamente 3.30x10⁻ᶟ, se relaciona con un fenómeno de estabilización del ADN debido, quizás, a la formación de dímeros (o agregados en general) entre las distintas moléculas de calixareno. Figura 10. Variación de temperatura melting en función de la concentración de calixareno. [calixareno]/M 0,00 6,00e-3 1,00e-1 Tmelting/ºC 73,5 74,0 74,5 75,0 75,5 76,0 76,5 25 5.6 AFM Se han realizado fotografías de muestras de ADN en ausencia y presencia de distintas cantidades de calixareno. En la Fig.11 (A) se observa la estructura alargada del polinucleótido. Conforme se añade más cantidad de calixareno se observa un cambio estructural del ADN correspondiente a una disminución en el alargamiento de la estructura, esto es, a una compactación parcial del mismo (ver imagen B). A partir de una relación X=3x10-3 (ver imagen C) se observa de nuevo un alargamiento del ácido nucleico, además de un acercamiento entre las hebras del mismo. El ADN no muestra la misma dispersión que la que presentaba cuando se encontraba desnudo, es decir, en ausencia de calixareno (ver imagen A). Este comportamiento puede deberse a la tendencia que presenta el calixareno a formar dímeros, … (en definitiva, estructuras de autoensamblaje), entre ellas debido a la existencia de interacciones de tipo π-stacking entre los anillos aromáticos que conforman la estructura, como se muestra en la imagen E. La interacción entre las moléculas de calixareno que se encuentran intercaladas en las distintas hebras de polinucleótido provoca el acercamiento de éstas, disminuyendo la dispersión de las mismas. En la fig. 4 se muestra un ejemplo de cómo sería este comportamiento. Estos resultados confirman los obtenidos a partir del uso de otras técnicas. Figura 11. Imágenes de AFM de ADN desnudo (A) y del sistema calixareno/ADN (B-E) a distintos valores de la relación molar X (B: X=8x10-4; C: X=3x10-3; D y E: X=1x10-2). 32 -Supian FL, Richardson TH, Deasy M, Kelleher F, Ward JP, McKee V. Interaction between Langmuir and Langmuir?Blodgett Films of Two Calix[4]arenes with Aqueous Copper and Lithium Ions. Langmuir [Internet]. 2010 Jul 6 [cited 2017 Jun 14];26(13):10906–12. Available from: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la100808r -Thomas CE, Ehrhardt A, Kay MA. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. [Internet]. 2003 May [cited 2017 May 18];4(5):346– 58. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12728277 Editorial Board. J. Control. Release. 2006;116(2).