Regulación de la biosíntesis de carotenoides mediada por inositoles polifosfato

Trabajo de fin de grado Regulación de la biosíntesis de carotenoides mediada por inositoles polifosfato Grado en Bioquímica por la Universidad de Sevilla y la Universidad de Málaga. Departamento de Biología Molecular y Bioquímica Vegetal Autor Tutoría Rodrigo Bedera Dra. Inmaculada Couso Sevilla, 10 de Junio de 2022 1. RESUMEN ............................................................................................................................................................. 1 2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................................. 2 2.1. IMPORTANCIA DE LOS CAROTENOIDES EN ORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS .................... 3 2.1.1. BIOSÍNTESIS DE CAROTENOIDES EN C. REINHARDTII ................................................................... 4 2.1.2. REGULACIÓN DE LA BIOSÍNTESIS DE CAROTENOIDES .................................................................. 5 2.2. INOSITOLES POLIFOSFATO Y SU RELACIÓN CON TOR ................................................................... 7 2.2.1 BIOSÍNTESIS Y FUNCIONES DE LOS INOSITOLES POLIFOSFATO ..................................................... 8 2.2.2 MUTANTE VIP1-1: DEFICIENCIA EN INOSITOLES PIROFOSFATO Y CONSECUENCIAS DESCRITAS ..... 10 3. OBJETIVO ........................................................................................................................................................... 11 4. METODOLOGÍA .............................................................................................................................................. 11 4.1 CEPAS DE C. REINHARDTII Y SU CULTIVO ............................................................................................ 11 4.1.1 CEPAS ................................................................................................................................... 11 4.1.2 MEDIOS DE CULTIVO ............................................................................................................... 12 4.1.3 TÉCNICAS Y CONDICIONES DE CULTIVO .................................................................................... 12 4.2 TÉCNICAS EXPERIMENTALES Y DE BIOLOGÍA MOLECULAR ...................................................... 13 4.2.1 MEDIDAS ESPECTOFOTOMÉTRICAS.......................................................................................... 13 4.2.2 EXTRACCIÓN DE CAROTENOIDES ............................................................................................. 13 4.2.3 LISIS CELULAR Y EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS .......................................................................... 13 4.2.4 SDS-PAGE. TRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS A MEMBRANA E INMUNOBLOT .............................. 14 4.2.5 EXTRACCIÓN DE METABOLITOS ............................................................................................... 15 4.3 NORMALIZACIÓN Y REPRESENTACIÓN DE LOS DATOS ................................................................ 15 5. RESULTADOS ................................................................................................................................................. 16 5.1 VIP1-1 PRESENTA HIPERSENSIBILIDAD A RAPAMICINA ................................................................ 16 5.2 VIP1-1 ES MÁS SENSIBLE AL ESTRÉS POR AUSENCIA DE NITRÓGENO ............................... 17 5.3 ACUMULACIÓN DE CAROTENOIDES EN VIP1-1 .................................................................................. 18 5.4 LA INHIBICIÓN DE LA BIOSÍNTESIS DE CAROTENOIDES INCREMENTA MÁS LA AUTOFAGIA EN VIP1-1 QUE EN WT ...................................................................................................................... 21 5.5 PERFIL METABÓLICO DE VIP1-1 EN ALTA LUZ. .................................................................................. 22 6. DISCUSIÓN ........................................................................................................................................................ 25 7. CONCLUSIONES ........................................................................................................................................... 27 8. REFERENCIAS ................................................................................................................................................ 27 1 1. RESUMEN Los carotenoides son compuestos orgánicos de creciente interés biotecnológico, y en este sentido las microalgas son candidatas muy interesantes para su producción, pero los mecanismos que controlan la regulación de la biosíntesis de carotenoides no se han elucidado todavía completamente. Por otro lado, a los inositoles polifosfato se les ha atribuído recientemente un papel en la partición del carbono en Chlamydomonas reinhardtii1. En nuestros estudios empleamos el mutante vip1-1, deficiente en inositoles polifosfato, para investigar la posible implicación de estas moléculas en la regulación de la biosíntesis de carotenoides. De esta forma, detectamos una activación del ciclo de las xantofilas, que puede bien ser producto de la modulación directa de los inositoles polifosfato o bien estar provocado indirectamente por un mayor estrés oxidativo. Además, nuestros resultados sugieren que la ruta de las pentosas fosfato y en el ciclo de Krebs podrían ser nuevas dianas de la modulación ejercida por estas moléculas, lo que resultaría de interés para una supuesta ingeniería metabólica. Por tanto, este trabajo propone nuevas dianas de los inositoles polifosfato, que podrán ser investigadas en profundidad en estudios venideros. Summary The carotenoides are organic compounds of growing biotechnological interest, and the microalgae are interesting candidates for its production, but the mechanisms that govern the biosynthesys of carotenoids remain uncompletely elucidated yet. On the other hand, inositol polyphosphates have recently been assigned a function in carbon partitioning in Chlamydomonas reinhardtii1. In our studies we used the mutant vip1-1, defficient in inositol polyphosphates, to investigate the implication these molecules might have in carotenoids biosynthesis. This way, we detected an activation of the xanthophyll cycle, which might be product of direct modulation performed by inositol polyphosphates, or might be caused indirectly by oxidative stress. Furthermore, our findings suggested the Krebs cycle and the pentoses phosphate cycle might be new targets of the inositol polyphosphates modulation, which could be of interest regarding a potential metabolic engineering. Therefore, this work proposes new targets of the inositol polyphosphates which could be further investigated in forthcoming studies. 2 2. INTRODUCCIÓN La mitigación del CO2 es uno de los mayores retos que los gobiernos han enfrentado en la última década. Tanto es así que la Unión Europea ha propuesto como objetivo una reducción del 40% de sus emisiones para 2030 en su último marco legislativo sobre el Clima y la Energía, y pretende ser neutral con respecto a estas emisiones para el año 2050 (https://ec.europa.eu/clima/policies/strategies). En este sentido, la captura biológica del carbono y su regulación molecular es un proceso clásicamente estudiado que necesita ser revisado para ayudar a reducir la emisión neta de CO2 a la atmósfera. Las rutas del flujo del carbono fotosintético que lo dirigen hacia la formación de moléculas de reserva o hacia su metabolismo (lo que conocemos como la partición del carbono) son de interés tanto científico como agronómico, puesto que los cambios en estas rutas afectan a distintas propiedades tanto a nivel celular como a nivel del organismo. Recientemente, el uso de microorganismos fotosintéticos ha cobrado especial relevancia para el estudio, captación de carbono y biosíntesis de distintos compuestos de interés. Así, en consonancia con las medidas comentadas, estos organismos ofrecen una alternativa sostenible para la producción de compuestos como los biofueles, las poliaminas o los carotenoides2–4. En este contexto, el alga unicelular verde Chlamydomonas reinhardtii cobra especial relevancia por haber sido ampliamente utilizada como organismo modelo en estudios sobre fotosíntesis5–8, biología molecular9–13 y biosíntesis de carotenoides14–16, entre otros muchos campos. La publicación de su genoma nuclear completo17 amplió aún más las posibilidades que ya ofrecía este organismo, y desde entonces se han realizado estudios de análisis ómicos que han aumentado nuestro conocimiento sobre su biología18–20 3 2.1. Importancia de los carotenoides en organismos fotosintéticos Los carotenoides son moléculas esenciales para todos los organismos fotosintéticos, gracias a sus propiedades fotoprotectoras y antioxidantes21, así como estructurales22. Los carotenoides se clasifican en dos grupos: los carotenos y las xantofilas. Su principal diferencia consiste en la presencia de grupos funcionales oxigenados en las xantofilas, de los que carecen los llamados carotenos, que sólo tienen una estructura hidrocarbonada. Estos compuestos están presentes en las antenas de los fotosistemas I y II (PSI, PSII)23. En especial, las xantofilas como la violaxantina o la zeaxantina desempeñan un papel importante en el control sobre la energía lumínica asimilada. De esta forma, ciertos carotenoides como la zeaxantina son capaces de recibir energía de clorofila a excitada, evitando posibles daños oxidativos24. Sin embargo, su utilidad no sólo queda restringida a funciones antioxidantes. Se ha observado que los carotenoides son importantes para la estructura de los fotosistemas25. Así, dependiendo de las condiciones, la fluidez de las membranas cloroplásticas puede ser modificada por la composición de carotenoides, alterando su termoestabilidad y sus propiedades difusivas, entre otras26. En consonancia con estas funciones descritas, se ha hallado que defectos en la síntesis de carotenoides en C. reinhardtii tienen como consecuencia una activación de la autofagia, proceso relacionado con el reciclaje de componentes celulares dañados27, aunque inicialmente esto ha sido atribuído a un incremento de los daños oxidativos. Además de las funciones mencionadas en organismos fotosintéticos, los carotenoides están cobrando importancia en el sector alimenticio gracias a sus propiedades, beneficiosas para la salud. Se han atribuído a estos pigmentos efectos protectores contra algunos tipos de cáncer y enfermedades cardiovasculares, y su escasez en la dieta puede provocar enfermedades como la ceguera nocturna28. El crecimiento de los carotenoides en dicho sector ha provocado especial interés en optimizar los métodos de producción de carotenoides para su comercialización. Dunaliella salina tiene gran potencial para la producción de β-caroteno, debido a que acumula hasta un 13% de β-caroteno en peso seco y que presenta la capacidad de crecer en aguas 4 con gran salinidad29. Por otro lado, en cultivos optimizados de Chlorella saccharophila se han obtenido altos niveles de zeaxantina (11,2 mg g-1 peso seco) y β-caroteno (4,98 mg g-1 peso seco)30. A pesar de que Chlamydomonas reinhardtii no se encuentra entre las microalgas más adecuadas para la producción de carotenoides, la posibilidad de manipularla genéticamente y su uso extendido en los laboratorios la convierte en un buen organismo para el estudio y modificación de la ruta de carotenogénesis. Así, es de gran interés la investigación sobre métodos para potenciar la producción de carotenoides, y aprovechar esa información para mejorar la carotenogénesis en C. reinhardtii o en otras microalgas más eficientes. 2.1.1. Biosíntesis de carotenoides en C. reinhardtii La ruta de biosíntesis de carotenoides (Fig.1) comienza con la activación de una molécula de isopreno (5C), dando lugar a dos isómeros: isopentenil difosfato y dimetilalil difosfato. A través de reacciones sucesivas, 6 isopentenil difosfato y 2 dimetilalil difosfato se condensan en una molécula de fitoeno (40C), reconocido como el primer carotenoide de la ruta. Este fitoeno es transformado en licopeno (40C) a través de reacciones catalizadas por diversas enzimas, entre la que se encuentra la fitoeno desaturasa (PDS)21,31. A partir del fitoeno, la ruta biosintética diverge hacia el α-caroteno, que podrá ser transformado en luteína y loroxantina; y hacia el β-caroteno, precursor de los componentes del ciclo de las xantofilas (zeaxantina, anteraxantina y violaxantina). La zeaxantina puede convertirse en anteraxantina, y ésta en violaxantina, a través de reacciones de epoxidación catalizadas por la zeaxantina epoxidasa (ZEP). Estas reacciones son reversibles, de forma que la violaxantina puede transformarse de vuelta en zeaxantina por acción de la violaxantina de-epoxidasa (VDE). La violaxantina también puede dar lugar a neoxantina. En C. reinhardtii, los carotenoides más abundantes son β-caroteno, violaxantina, neoxantina, luteina y loroxantina21. Sin embargo, en condiciones de estrés lumínico, se produce una reordenación de las proporciones de carotenoides, a través de la 5 activación del ciclo de las xantofilas. Mediante reacciones de des-epoxidación reversibles, parte de la violaxantina es convertida en zeaxantina. A la zeaxantina se le ha atribuido la capacidad de neutralizar especies reactivas de oxígeno32. Además, la energía del estado mínimo excitado de singlete de la zeaxantina es menor que la de la clorofila a33, lo que permite a este compuesto actuar como un agente fotoprotector, al recibir el exceso de energía de la clorofila a y disiparla en forma de calor24,34. 2.1.2. Regulación de la biosíntesis de carotenoides Los carotenoides son moléculas de gran importancia biotecnológica, gracias a sus aplicaciones en farmacia, nutracéutica, cosméticos y ganadería, entre otros campos3,35,36. En años recientes, se ha empezado a prestar atención a las microalgas como fuente de producción de estos compuestos gracias a su rápido crecimiento y a la versatilidad metabólica, lo que suscita aún más interés en descubrir los mecanismos de regulación que gobiernan la biosíntesis de carotenoides37. Si bien se han dedicado grandes esfuerzos a conocer la importancia de las distintas especies de carotenoides en la fotosíntesis y la fotoprotección, también es de gran relevancia desvelar la señalización que hace posible los cambios en la biosíntesis previamente mencionados. Pese a las investigaciones dedicadas a ello, los mecanismos de regulación de la carotenogénesis no están totalmente elucidados. La fitoeno sintasa (PSY) es considerada como la enzima más limitante de esta biosíntesis, debido a su posición como punto de entrada del carbono en esta ruta biosintética. Cazzonelli y Pogson38 explican cómo en algunas plantas como Arabidopsis sólo existe un gen codificante de esta enzima, meintras que en otras como Zea mays o Triticum aestivum existen dos o más homólogos, con función redundante pero expresados en distintos tejidos. Adicionalmente, la expresión del gen codificante de PSY se encuentra sujeta a distintos estímulos como ácido abscísico, sequía o fotoperiodo. En otro estudio39 se descubrió una regulación postraduccional del gen a manos del regulador ORANGE en Arabidopsis thaliana. Se describió que ORANGE y PSY interaccionan físicamente en los plastos, y una sobreexpresión de ORANGE provoca un aumento de la cantidad de PSY activa. 6 Figura 1. Ruta de biosíntesis de carotenoides en C. reinhardtii. Junto a cada flecha se encuentra la actividad enzimática responsable de la reacción. En negrita se muestran los carotenoides que más se acumulan en células vegetativas. IDI (isopentenil-difosfato delta-isomerasa), GGPS (geranilgeranil-difosfato sintasa), PSY (fitoeno sintasa), PDS (fitoeno desaturasa), Z-ISO (ζ-isomerasa), ZDS (ζ-caroteno desaturasa), CRTISO (carotenoide isomerasa), LCYB (licopeno β-ciclasa), LCYE (licopeno ε-ciclasa), CYP97C3 (caroteno ε-hidroxilasa), CYP97A5 (caroteno βhidroxilasa), LSY (loroxantina sintasa), CHYB (caroteno β-hidroxilasa), ZEP (zeaxantina epoxidasa), VDE (violaxantina de-epoxidasa), NSY (neoxantina sintasa) (adaptado de Lohr, 2009)21. 13 correspondiente, (TAP para control, TAP -N para hambre de nitrógeno), se resuspendieron en dicho medio. En la extracción de carotenoides, los cultivos fueron mantenidos en agitación a 25ºC en luz continua. La alta luz corresponde a 1000 Em2s-1 durante 24 h, mientras que el norflurazón se aplicó como se describe en “medios de cultivo” durante 24 h. En los cultivos para la extracción de metabolitos, el estrés por alta luz corresponde a 1000 Em2s-1 durante 24 h. En este caso, se suministró aireación con CO2 al 1%, y la biomasa fue liofilizada para su posterior tratamiento. 4.2 Técnicas experimentales y de biología molecular 4.2.1 Medidas espectofotométricas Las medidas fueron tomadas con Amersham Biosciences Ultrospec 3100 Pro. Para la curva de crecimiento, los inóculos iniciales presentaron una OD750 de: 0,239 (WT TAP), 0,248 (WT TAP -N), 0,217 (vip1-1 TAP) y 0,205 (vip1-1 TAP -N). Las medidas fueron realizadas durante 3 días, hasta obtener una OD750 final de 2,160 (WT TAP), 0,578 (WT TAP -N), 2,265 (vip1-1 TAP) y 0,428 (vip1-1 TAP -N). Para valores de absorbancia superiores a 0,9 las muestras fueron diluidas convenientemente. 4.2.2 Extracción de carotenoides Para la extracción de carotenoides se emplearon 3 réplicas biológicas de cada condición. Los inóculos fueron centrifugados a 6000 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en 0,5 mL de TAP. Tras ello se aplicó un choque térmico a 90ºC durante 3 minutos y se añadieron 2 mL de acetona. La extracción se realizó durante 15 minutos a 8000 rpm. Se descartó el pellet, y el sobrenadante (acetona) fue evaporado en atmósfera de nitrógeno. Los carotenoides fueron cuantificados mediante HPLC-diode array. 4.2.3 Lisis celular y extracción de proteínas Los inóculos fueron centrifugados a 6000 rpm durante 5 minutos. Tras descartar el sobrenadante, se realiza un lavado con tampón tris-HCl 50 mM pH 7,5. Tras volver a centrifugar se resuspende en el mismo tampón y se congelan a -80ºC durante 2 h. 14 Transcurrido ese tiempo se descongelan y se vuelven a congelar. Para extraer las proteínas, se centrifugó durante 20 minutos a 13000 rpm. 4.2.4 SDS-PAGE. Transferencia de proteínas a membrana e inmunoblot Se cargaron 20 µg de proteína de cada muestra y 4 µL de tampón de carga 4x en 25 µL de volumen final para cada carril, tras someter a las muestras a un choque térmico de 65ºC durante 5 minutos. El gel se preparó al 15% de acrilamida con SDS. La electroforesis se realizó empleando el sistema mini-PROTEAN (BioRad) a un voltaje constante de 170 V. Tras la electroforesis, se transfirió la proteína a una membrana de PVDF de 0,45 µm (Immobilon-P de Millipore) previamente activada con metanol durante 30 s en agitación. La transferencia se llevó a cabo utilizando el sistena de transferencia semihúmedo Invitrogen Power Blotter (Thermo Fisher Scientific), con tampón de transferencia y 3 capas de papel Whatman a ambos lados del gel y la membrana de PVDF, a una intensidad de corriente constante de 25 A durante 40 minutos. Se continuó con un bloqueo de membrana en 5 mL de leche en polvo desgrasada (AppliChem) al 5% durante 45 minutos en agitación. Posteriormente, tras 3 lavados en agitación durante 10 minutos con tampón PBS y Tween 20 al 0,1%, se realizó la incubación con el anticuerpo primario (Rabbit anti-ATG8 de Agrisera) en leche desgrasada al 5% a una concentración de 1:2000, en cámara fría durante toda la noche. Una vez incubado, se lavó 3 veces más y se incubó 45 minutos en agitación con el anticuerpo secundario en leche 5% a concentración 1:10000. El revelado fue realizado tras incubar 5 minutos en oscuridad con Luminata Cresciendo (Millipore), en Amersham Imager 680. El control de carga se realizó tiñendo el gel con azul de Coomassie (Brilliant Blue R- 250 de BioRad) durante 45 minutos en agitación, tratando con solución de-staining (50% H2O 40% metanol 10% acético glacial) durante 30 minutos y finalmente con H2Od durante la noche. 15 4.2.5 Extracción de metabolitos Se realizaron 3 réplicas técnicas y 3 réplicas biológicas de cada condición, tal y como se explica en “técnicas de cultivo”. Se realizó la extracción usando 1 mL de cloroformo-metanol 3:7 con perlas de vidrio de 0,5 mm, en Mini Beadbeater (BioSpec), y centrifugando a 13000 rpm 5 minutos, recuperando el sobrenadante. Esto fue repetido todas las veces necesarias. Posteriormente se añadió agua miliQ en proporción 1:1 y se volvió a centrifugar con las mismas condiciones, recuperando el sobrenadante. El sobrenadante fue secado en Speed Vac DNA130 durante la noche. El pellet formado fue resuspendido y centrifugado con las mismas condiciones, y se recuperó el sobrenadante para análisis por HPLC-MS. 4.3 Normalización y representación de los datos Los resultados obtenidos del análisis de carotenoides y metabolitos fueron normalizados por gramo de peso seco para cada réplica biológica. Para ello, se filtraron 5 mL, en filtros previamente pesados, provenientes de una estufa de 70ºC para evitar variaciones de peso por humedad. Los filtros fueron lavados con 15 mL de formato de amonio 0,5 M para retirar las sales, y se guardaron en estufa durante 24 h hasta su pesaje. En el caso del inmunoblot, las muestras de proteínas fueron cuantificadas mediante el método Bradford. Para ello se empleó una recta patrón elaborada a partir de concentraciones conocidas de BSA, añadiendo 1 mL de reactivo Bradford a 1 µL de muestra proteica. El análisis de los datos metabólicos y de carotenoides fue realizado mediante RStudio 4.1.1. La representación de los datos de carotenoides fue elaborada mediante Microsoft Excel (Microsoft Corporation, 2018), mientras que la representación de los datos de carotenoides fue elaborada mediante Rstudio 4.1.1. La significancia de los datos fue evaluada empleando la t de Student, comprobada la normalidad de los datos. 16 5. RESULTADOS 5.1 vip1-1 presenta hipersensibilidad a rapamicina Previamente se ha descrito la hipersensibilidad que presenta el mutante de Chlamydomonas reinhardtii vip1-1 a rapamicina (RAP). Debido a eventos de ordenación del genoma, frecuentes en Chlamydomonas60, procedimos a comprobar la integridad de la cepa silvestre y de vip1-1. Para ello, realizamos una evaluación del crecimiento del mutante vip1-1 en comparación a la cepa silvestre (WT) y al mutante vip1-1 complementado, en ausencia (Fig.4a) o presencia de RAP (Fig.4b). En medio de cultivo TAP sin RAP, tanto WT como vip1-1 y el mutante complementado crecieron de forma similar. Al añadir al medio RAP, observamos que el crecimiento de todas las cepas se ve comprometido, pero vip1-1 en especial presenta mayores dificultades. Transcurridos 10 días estas dificultades se mantienen en vip1-1 y, de nuevo, el mutante complementado iguala el crecimiento del WT (Fig.4c). Por tanto, el fenotipo de hipersensibilidad de vip1-1 se mantiene y podemos utilizarlo como nuestro objeto de estudio. Figura 4. Crecimiento de Chlamydomonas reinhardtii silvestre (WT), vip1-1 y vip1-1 complementado (Complement). Entre las muestras de cada columna y la siguiente se realizó una dilución 1/5. A) Crecimiento de dos réplicas biológicas de cada variante en medio TAP con agar al 1,2%. B) Crecimiento de dos réplicas biológicas de cada variante en medio de cultivo TAP con agar 1,2% y rapamicina 500 nM. C) Crecimiento de b) transcurridos 10 días desde la siembra. A B C 17 5.2 vip1-1 es más sensible al estrés por ausencia de nitrógeno Tal y como se ha comentado con anterioridad, el estrés por falta de nitrógeno puede resultar una condición interesante para potenciar la biosíntesis de carotenoides en Chlamydomonas reinhardtii15. Por ello, tras comprobar la integridad y el crecimiento de las variantes WT y vip1-1, analizamos el crecimiento en hambre de N de estos organismos a lo largo del tiempo. Debido al gran impacto que la ausencia de nitrógeno tiene en la célula, no es posible su crecimiento desde inóculos muy diluidos. Por ello, los inóculos fueron cultivados, centrifugados y resuspendidos en sus correspondientes medios (TAP para control, TAP -N para ausencia de nitrógeno), a una OD750 de aproximadamente 0,22. Los datos obtenidos indican un cierto retraso en el crecimiento de vip1-1 en medio de cultivo sin nitrógeno aunque no muy significativo (Fig.5). En los medios de cultivo control (TAP), vip1-1 inicialmente mostró un crecimiento más lento probablemente por una fase de latencia del cultivo más larga que la del silvestre, aunque a lo largo de la cinética del experimento logra igualar el número de células de la estirpe WT (Fig.5). En el caso de las condiciones de estrés tanto vip1-1 como el WT muestran un retardo en el crecimiento muy acusado. Además, es especialmente evidente en el caso de vip1-1 que solamente dobla su concentración después de 48h de exposición al estrés nutricional. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 010 20 30 40 50 60 DO 750 nm Tiempo (h) Curva de crecimiento de WT y vip1-1 en hambre de nitrógeno WT control WT -N vip1-1 control vip1-1 -N 18 Figura 5. Curva de crecimiento del WT y del mutante vip1-1 en medio de cultivo con y sin nitrógeno. El WT se representa con (•) en medio control y (•) en medio sin nitrógeno. vip1-1 se representa con ( ) en medio control y ( ) en medio sin nitrógeno. 5.3 Acumulación de carotenoides en vip1-1 Teniendo en cuenta el fenotipo de crecimiento que encontramos en condiciones de carencia de N en vip1-1 y de que previamente habíamos encontrado una acumulación de lípidos en este mutante en las mismas condiciones1, procedimos a evaluar el perfil de los carotenoides en nuestro mutante vip1-1 en comparación con WT. Se ha descrito que en microalgas las mismas condiciones de estrés que determinan la presencia de cuerpos lipídicos inducen la síntesis de carotenoides61, por lo que es probable que las rutas que regulan estos procesos sean las mismas. En este sentido, pretendimos ver si la carotenogénesis esta alterada en nuestro mutante, dado que presenta acumulación exacerbadad de TAGs, para poder establecer un nuevo mecanismo regulador de esta ruta biosintética que estuviera mediado por los inositoles polifosfato. En primer lugar, se realizó un experimento en luz estándar (50 Em2s-1), empleando como condición un tratamiento con norflurazón (NF) durante 24 h. El norflurazón es un inhibidor de la fitoeno desaturasa (PDS), enzima que actúa sobre el fitoeno en una de las primeras etapas de la ruta de carotenogénesis. De esta forma, al limitar la entrada de carbono en la ruta pretendimos identificar posibles diferencias en la reordenación de los carotenoides ya sintetizados entre el WT y vip1-1. De forma significativa, variaron las mismas especies químicas para ambas variantes de C. reinhardtii: violaxantina, anteraxantina, zeaxantina y α-caroteno (Fig.6a). Atendiendo a las diferencias entre el fenotipo WT y el mutante vip1-1, es interesante comentar que no existen diferencias significativas en luz estándar entre los controles del WT y vip1-1 en ningún carotenoide. Sin embargo, cuando tratamos a las células con NF, sí se manifiestan diferencias significativas entre el silvestre y el mutante. La violaxantina y el β-caroteno se acumulan menos en vip1-1 que en WT bajo efecto de NF. En cambio, la zeaxantina se acumula en mayor medida en el mutante. Esto indica 19 un incremento de la activación del ciclo de las xantofilas en vip1-1, donde los carotenoides violaxantina y β-caroteno son convertidos en zeaxantina. Tras comprobar que el mutante vip1-1 tiene tendencia a acumular más zeaxantina que WT decidimos comprobar la acumulación de carotenoides en WT y vip1-1 en condiciones de alta luz (1000 Em2s-1). La alta irradiancia es un estímulo que activa el ciclo de las xantofilas aumentando la proporción de zeaxantina, debido a sus propiedades fotoprotectoras32. De todos los carotenoides cuantificados en estas condiciones, vip1-1 demostró acumular menos violaxantina y más zeaxantina que el WT de forma significativa (Fig.6b), mostrando de nuevo una activación más fuerte del ciclo de las xantofilas. Un parámetro empleado a menudo para medir el estado del ciclo de las xantofilas es el estado de de-epoxidación, expresado como 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎𝑥𝑎𝑛𝑡𝑖𝑛𝑎 + 𝑧𝑒𝑎𝑥𝑎𝑛𝑡𝑖𝑛𝑎 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎𝑥𝑎𝑛𝑡𝑖𝑛𝑎 + 𝑧𝑒𝑎𝑥𝑎𝑛𝑡𝑖𝑛𝑎 + 𝑣𝑖𝑜𝑙𝑎𝑥𝑎𝑛𝑡𝑖𝑛𝑎. El estado de de-epoxidación de la estirpe silvestre y de vip1-1 fue calculado en cada situación, y se recoge en la Tabla II. En todos los casos vip1-1 mostró un mayor estado de de-epoxidación del ciclo de las xantofilas. Tabla II. Estado de de-epoxidación de WT y vip1-1, en condiciones control, bajo estrés por norflurazón (NF) y en alta luz (HL). Estado de de-epoxidación Control NF HL WT 0.2448 0.4955 0.6874 vip1-1 0.3194 0.7183 0.7878 20 Figura 6. Acumulación de carotenoides en WT y vip1-1, en presencia de NF o alta luz. Se representa el WT control ( ), y en el tratameinto con NF o alta luz ( ); vip1-1 en control ( ), y en el tratamiento correspondiente con ( ). Los valores obtenidos están normalizados por gramo de peso seco para cada réplica. Las diferencias significativas se marcan con 1, 2 o 3 asteriscos (p-valor inferior a 0,05, 0,01 o 0,001 respectivamente).A) Niveles de carotenoides en WT y vip1-1, en 0 100 200 300 400 500 600 violaxanthin anteraxanthin lutein zeaxanthin α-carotene β-carotene loroxanthin mg/L Carotenoides Contenido de carotenoides bajo estrés por NF WT control WT NF vip1-1 control vip1-1 NF 0 100 200 300 400 500 600 700 800 violaxantina anteraxantina luteina zeaxantina α-caroteno β-caroteno mg/L Carotenoides Contenido de carotenoides en alta luz WT control WT HL vip1-1 control vip1-1 HL A B * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 21 condiciones control (TAP) y en presencia del inhibidor norflurazón (TAP + NF). B) Niveles de carotenoides en WT y vip1-1 en luz control y alta luz. 5.4 La inhibición de la biosíntesis de carotenoides incrementa más la autofagia en vip1-1 que en WT Los carotenoides son compuestos de gran importancia para la estabilidad y la fotoprotección del cloroplasto en C. reinhardtii. De hecho, problemas en la biosíntesis de carotenoides provocan un aumento en el proceso de reciclaje celular llamado autofagia27. Por este motivo, llevamos a cabo una medida de actividad autofágica empleando como marcador la proteína ATG8 en un inmunoblot, cuyos resultados se muestran en la Fig.7. ATG8 es una proteína que se procesa por la cistein-proteasa llamada ATG4 que libera uno de sus extremos para que se produzca la conjugación de ATG8 (lipidación). Esto ocurre cuando el proceso se activa y el autofagosoma comienza a formarse en el citosol62. La aparición de las formas lipidadas de ATG8 son el indicativo de que este proceso se está activando en las células y de que por tanto debe existir un estrés que esté inactivando a la quinasa TOR, principal regulador de este proceso. Teniendo en cuenta que en condiciones de inhibición de la biosíntesis de carotenoides se había determinado previamente una activación de la autofagia27; en este punto realizamos la siguiente aproximación para poder establecer si los inositoles polifosfato están implicados en la regulación de este proceso. Para ello, monitorizamos por inmunoblot la proteína ATG8 en muestras de WT y vip1-1 tratadas con hambre de N y con el inhibidor NF. Los resultados indicaron que la autofagia medida en el WT es mayor que en vip1-1 en condiciones de hambre de N, pero el mutante vip1-1 mostró mayores niveles que el silvestre cuando la biosíntesis de carotenoides fue inhibida mediante NF. Esta desregulación en la activación de la autofagia es indicativo de una posible regulación mediada por las moléculas inositoles, que puede o no estar relacionada con la actividad TOR y que será uno de los siguientes pasos a investigar. 22 Figura 7. Western blot de la proteína ATG8 para WT y vip1-1 en condiciones control, hambre de N (TAP -N) y en presencia de norflurazón (NF) durante 24 h. Se muestran bajo las bandas la carga de proteína de cada carril, empleando la tinción de azul de Coomassie. Las muestras son: 1) WT control 2) WT en hambre de N 3) WT tras 24 h bajo efecto de NF 4) vip1-1 control 5) vip1-1 en hambre de N 6) vip1-1 tras 24 h bajo efecto de NF. El NF se empleó a una concentración de 20 µM. 5.5 Perfil metabólico de vip1-1 en alta luz. En vistas a las diferencias comentadas con respecto a los carotenoides y al efecto del NF en la autofagia, decidimos realizar un estudio metabólico general de vip1-1 en condiciones de baja y alta luz, con la intención de encontrar pistas sobre la alteración metabólica que sufre el mutante en alta luz y su posible conexión con el metabolismo del carbono. Como resultado, detectamos distintas áreas del metabolismo celular afectadas en vip1-1. En primer lugar observamos una desregulación del α-cetoglutarato y del oxaloacetato, ambos intermediarios del ciclo de Krebs (Fig.8a). Para ambas moléculas, el irradiar con alta luz provocó comportamientos opuestos en las variantes, puesto que en el silvestre los niveles de oxaloacetato y α-cetoglutarato descencieron mientras que en vip1-1 sus niveles se vieron aumentados. El ciclo de Krebs dota de disponibilidad de 29 27. Pérez-Pérez, M. E., Couso, I. & Crespo, J. L. 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Agradecimientos: A la Dra. Mercedes García y el Dr. Francisco J. Romero por acogerme en su laboratorio; a María Morales, Elena García y Christina Arvanitidou por su ayuda; y en especial, a la Dra. Inmaculada Couso por su paciencia y sus enseñanzas