Caracterización de los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) de los adipocitos blancos de rata

DEPTO. FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA FACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD DE SEVILLA Avda. Sánchez Pizjuán, 4 E-41009 SEVILLAESPAÑA D. Rafael Jesús Montoro Laseca, Profesor Contratado Doctor del Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Universidad de Sevilla, CERTIFICA: Que Doña María Ortego Domínguez ha realizado bajo su dirección en dicho Depaiiamento, el trabajo titulado "Caracterización de los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) de los adipocitos blancos de rata", que presenta para optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla. Sevilla, a 22 de febrero de 2022. ,<,���vu. Llr' ro ,_.:._: HS11...LOGIA MÉDICA Y BIOFÍSICA i=AC':l JI TAO DE MEDICINA Agradecimientos Nunca he podido sentirme científica. Y a mi edad, me da un poco de vergüenza seguir considerándome estudiante, pero las circunstancias se han desarrollado de tal modo, que es lo que soy. Si tuviera que describir mi experiencia como doctoranda, diría que he sido como una monja lega en un convento. Podré compartir los espacios y aparatos con mis compañeros, me sentaré a la mesa con ellos a comer y se supone que todos seguimos el fin de mejorar el mundo a través del conocimiento, pero en el fondo, sabemos que no somos iguales. El veto a la participación en los actos importantes, el examen continuo a mi vocación y el hecho de que mi presencia sólo fuera notoria a la entrada y a la salida del lugar se encargan de recordármelo. He recibido muchos comentarios por decidir hacer esto. Desde los más prudentes, “loca”, a los más descarnados, “imbécil”. Pero a pesar de todo y de todos, debo agradecer a Rafael Jesús Montoro Laseca, mi director de tesis, acabar aceptándome y guiarme. Gracias por permitir a mi curiosidad desarrollarse y observar de ti qué es la “buena ciencia”, la que se hace por aprender y no por las loas. Me enseñaste pacientemente a cuestionar cada uno de mis logros y a valorar más la gravedad de mis errores que la ingente cantidad de éstos, a la par que me dejaste comentar mis teorías. Desconfío de aquellos que dicen que en los laboratorios pequeños es más difícil la generación de ideas revolucionarias. Obviamente no puedo dejar de mencionar el desgaste a su economía que han representado estos 9 años de relación laboral. Yo no tuve postdocs en mi laboratorio como tal, pero sí que vinieron a que yo les enseñara algo de electrofisiología (osadía de mí), dos postdoc ajenos que llenaron nuestro zulo de luz. Moltes gràcies Mireia por no tomarme por loca en aquel congreso de Granada y hacer que pudiéramos escribir algo bonito. Además, están todos estos años hablando y aconsejándome. Aún sigo conservando en mis álbumes de Spotify uno que guardaste en Favoritos, “Un dia no sé com” de Oques Grasses. No lo he escuchado nunca, pero me enternece recordar tu presencia allí conmigo y las tardes registrando. Gracias Juan Antonio. Eres el ejemplo vivo de que este sistema necesita ser quemado hasta los cimientos y echarles sal a las cenizas, al estilo romano. Eres un excelente investigador y un magnífico profesional en lo que te dediques, no agaches la cabeza nunca. A Eva, Pilar y Juancho. Por vuestros consejos y vuestra franca ayuda, siempre con las puertas abiertas. A Santi, porque extraño tu sinceridad y el modo metódico y calculado con el que te movías. Gracias por hacerme creer que desde el barro también se llega a la Ivy. A Alejandro (Pequeño Padawan I) y Laura (Pequeña Padawan II), quiero deciros que no os agobiéis, poquito a poco y con esfuerzo lo lograréis. José Luis, estuvimos poco tiempo juntos, pero vi que eras una persona con los objetivos muy claros en la vida. A Antonio y todos mis físicos, aunque no os acordéis la mayoría de mí. Eli, Ana, Rita, Leti, José Antonio (mi héroe favorito ♥). Y a las nuevas promesas, mis “sangre sucia” favoritos, sois muy grandes, José Antonio, Carlinhos y los Minion de turno. Envidia de grupo y de gente buena trabajando ahí (y de mazmorra, eso también). A Lucía y su gente, todos los que han pasado por allí, Rocío, Mario, Julio y Andrea. Gracias por echarme una mano cuando ha sido necesario y esas charlas de comedor que me dan la vida. Saravanan, thank you so much for your support and your kindness, you´re the greatest partner! A la gente de Mª Luz y a ella no los he tratado demasiado, excepto a Jesús. Me hubiera encantado verte más allá de la cueva. Pero no olvido que siempre que he tenido que pediros algo, me ayudabais con una sonrisa y sin comentarios. A Mari, por todas esas horas en cultivos y todo lo que aprendí de ti, no sólo de metodología, sino sobre la vida. A Itziar e Ignacio, mi consuelo y mi guía en el animalario. Echaré de menos, los viernes, estar contándote mis penas mientras disecciono una rata, muchacho. Durante la carrera conocí a personas excelentes, que también han ayudado a forjar la persona que soy. A Ali, Coj, Cristins, Lale, Choc, Chunga, Ferni, Laura, Ana y Juancho, por todas esas horas soñando con ser unos profesionales. A Lidia, María, Laura y Pilar, gracias porque años después, seguimos reencontrándonos y riendo como si una hora después, fuéramos a entrar en prácticas. A Blanca, gracias por ser y existir. Eres un ser de luz, cuya fuerza desconoce pero que, como diría Lorca: a un caballo encabritado soy capaz de poner de rodillas con la fuerza de mi dedo meñique. A Silvia, Miriam y Alejandra. Tantos años juntas y ahí seguís, creciendo juntas y permitiéndome disfrutar de vuestra compañía y amistad. Gracias por celebrar mis éxitos y llorado mis fracasos como si fueran vuestros. A mi Compadre, por todos estos años de lucha conmigo. Son demasiados momentos que requerirían una tetralogía, pero no agradezco suficiente a Dios que formes parte de mi vida. A Juanjo, Pepa, Carmen y Juan Francisco. Por ser “los hombros de gigantes” famosos de los que hablaba Newton, maestros. Vuestra marca en mí, en los planos personal y profesional, permanecerán de por vida. Y finalmente, pero esencial, a mis padres y mis hermanos (Idoia, Tati), porque no sólo me han mantenido económicamente durante estos años de investigación sin un tono de reproche, sino que me han alentado a ir más allá y a ignorar los comentarios de aquellos que decían que mejor abandonase. A mis padres y hermanos Del salón en el ángulo oscuro, de su dueña tal vez olvidada, silenciosa y cubierta de polvo, veíase el arpa. ¡Cuánta nota dormía en sus cuerdas, como el pájaro duerme en las ramas, esperando la mano de nieve que sabe arrancarlas! ¡Ay!, pensé; ¡cuántas veces el genio así duerme en el fondo del alma, y una voz como Lázaro espera que le diga «Levántate y anda»! Rimas (1871) - Gustavo Adolfo Bécquer Pues ahora, yo no me atrevo a enseñar – que fuera en mí muy desmedida presunción –; y el escribir, mayor talento que el mío requiere y muy grande consideración. Así lo dice San Cipriano: «Gravi consideratione indigent, quae scribimus». Lo que sólo he deseado es estudiar para ignorar menos: que, según San Agustín, unas cosas se aprenden para hacer y otras para sólo saber: «Discimus quaedam, ut sciamus; quaedam, ut faciamus». Respuesta a Sor Filotea de la Cruz (1691) - Sor Juana Inés de la Cruz A fuerza de golpes, fuerte, y a fuerza de sol, bruñido, con una ambición de muerte despedaza un pan reñido. Cada nuevo día es más raíz, menos criatura, que escucha bajo sus pies la voz de la sepultura. Y como raíz se hunde en la tierra lentamente para que la tierra inunde de paz y panes su frente. El niño yuntero (1937) - Miguel Hernández VII Índice AGRADECIMIENTOS GLOSARIO DE ABREVIATURAS 1 RESUMEN 8 INTRODUCCIÓN 11 1. Tejido adiposo 12 1.1. Tejido adiposo marrón (BAT). 13 1.2. Tejido adiposo blanco (WAT). 14 1.2.1. Regulación metabólica. 16 1.2.2. Patologías asociadas con el tejido adiposo. 19 2. Insulina 20 2.1. Descripción. 20 2.2. Mecanismo de acción. 23 3. Canales iónicos 25 3.1. Perspectiva histórica. 25 3.2. Clasificación y estados conformacionales. 27 3.3. Canales de K+ dependientes de voltaje (KV). 30 3.4. Regulación de canales iónicos por insulina. 32 3.5. Canales iónicos y adipocitos. 34 OBJETIVOS 38 MATERIALES Y MÉTODOS 40 1. Cultivo celular 41 1.1. Obtención del tejido. 41 1.2. Tratamiento y dispersión enzimática. 41 1.3. Tratamiento del vidrio con poli-L-lisina. 42 1.4. Contaje de células. 42 2. Soluciones 43 VIII 2.1. Soluciones para el cultivo y su preparación. 43 2.1.1. Solución de dispersión 1x. 43 2.1.2. Solución de digestión. 43 2.1.3. Solución de eritrólisis. 44 2.1.4. Solución de poli-L-lisina. 44 2.1.5. Medio de cultivo. 44 2.1.6. Preparación de insulina. 44 2.2. Soluciones de registro. 45 2.2.1. Solución externa. 45 2.2.2. Soluciones internas. 46 2.2.3. Disolución de drogas. 46 2.3. Procedimiento de cambio de soluciones durante los experimentos. 47 3. Registro electrofisiológicos 48 3.1. Descripción general. 48 3.2. Dispositivos experimentales. 49 3.2.1. Dispositivos óptico-mecánicos. 49 3.2.2. Dispositivos electrónicos. 50 3.2.3. Dispositivos complementarios. 52 3.3. Protocolos de registro y análisis de datos. 52 3.3.1. Activación de las corrientes. 53 3.3.2. Análisis de la conductancia. 54 3.3.3. Desactivación. 54 3.3.4. Inactivación dependiente de voltaje. 55 3.3.5. Inactivación dependiente de tiempo. 55 3.3.6. Desinactivación. 55 3.4. Análisis estadístico. 56 4. Imagen 56 4.1. Inmunofluorescencia. 56 4.1.1. Protocolo. 57 4.1.2. Composición de soluciones. 58 4.2. Microscopía confocal. 59 4.2.1. Descripción. 59 4.2.2. Características del equipo utilizado. 60 4.2.3. Análisis de imágenes. 60 Información suplementaria de Materiales y Métodos 61 Aparatos y programas 61 Componentes de las soluciones y bloqueantes. 63 Anticuerpos 65 IX RESULTADOS 66 BLOQUE I: PROPIEDADES BIOFÍSICAS 67 1. Los adipocitos presentan morfologías diferentes. 68 2. La concentración de insulina afecta a las propiedades pasivas de los adipocitos blancos. 70 3. Las células con 10 µ UI presentan menores corrientes y densidades de corriente, que con 100 µ UI. 73 4. Activación de las corrientes. 75 4.1. La conductancia de las células presenta distintas fases. 75 4.2. Los parámetros de activación no difieren entre las concentraciones de insulina. 76 5. La desactivación se ajusta de forma biexponencial en ambas concentraciones de insulina y presenta diferentes formas. 79 6. Se distinguen varios tipos de inactivación dependiente de voltaje, cuya proporción cambia entre las distintas concentraciones de insulina. 83 7. La inactivación dependiente de tiempo en células cultivadas en baja insulina es más rápida que en células cultivadas con alta insulina. 87 8. Desinactivación de los canales en baja y alta insulina. 94 9. Cuando se aplica un holding potential de -100 mV, puede aparecer una corriente hacia dentro o inward current. 97 BLOQUE II: CARACTERIZACIÓN FARMACOLÓGICA DE LOS CANALES 99 1. Los cambios de flujo afectan a algunas propiedades de los adipocitos. 100 1.1. Cambios en la amplitud. 100 1.2. Cambios en la capacidad eléctrica de las células. 102 2. La inhibición por TEA presenta dos fases y es muy similar entre ambas concentraciones de insulina. 105 3. La margatoxina (MgTX) en ambas concentraciones de insulina, presenta resultados similares a 1 nM, pero no a 10 nM. 107 Glosario de abreviaturas 5 NIDDM No insulin-dependent diabetes mellitus Diabetes mellitus no dependiente de insulina NPY Neuropeptide Y Neuropéptido Y NSCC Non-selective cation channels Canales catiónicos no selectivos PAP-1 5-(4-Phenoxybutoxy)psoralen 5-(4-fenoxibutoxi)psoraleno PaTX-1 Phrixotoxin-1 Frixotoxina-1 PBS Phosphate Buffer Solution Solución de tampón fosfato PFA Paraformaldehyde Paraformaldehído PGC1a PPARg coactivator 1 Coactivador 1 de PPARg PI3K Phosphoinositide 3-kinase Fosfoinosítido-3-quinasa PIP2 Phosphatidylinositol 4,5- bisphosphate Fosfatidilinositol-4,5-bifosfato PIP3 Phosphatidylinositol-3,4,5- triphosphate Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato PKA Phosphokinase type A Fosfoquinasa A PKC Phosphokinase type C Fosfoquinasa C PMT Photomultiplier tube Tubo fotomultiplicador POMC Proopiomelanocortin Proopiomelanocortina PPARg Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma Receptor tipo g activado por proliferador de peroxisoma Psora-4 4-(4-Phenylbutoxy)-7H-furo[3,2- g][1]benzopyran-7-one 4-(4-fenilbutoxi)-7H-furo[3,2- g][1]benzopiran-7-ona RE Retículo endoplasmático RIA Radioimmunoassay Radioinmunoensayo ROI Region of Interest Región de interés RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction Transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa SD Standar Deviation Desviación estándar SERCA Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase ATPasa de retículo endoplasmático/sarcoplásmico regulada por calcio SHC Src homology 2 domaincontaining protein Dominio homólogo tipo 2 de la oncoproteína Src SI International System of Units Sistema Internacional de Medidas Glosario de abreviaturas 6 STREX Stress-regulated exon Exón regulado por estrés SUR Sulfonylurea receptor Receptor de sulfonilurea TEA Tetraethylammonium Tetraetilamonio TRAAK TWIK-related arachidonic acid activated K+ channel Canal de potasio relacionado con TWIK activado por ácido araquidónico TREK TWIK-related K+ channel Canal de potasio relacionado con TWIK Trizma® 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3- propanediol 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3- propanodiol TRP Transient Receptor Potential Receptor con potencial transitorio TRPA1 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily A, type 1 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia A, tipo 1 TRPC1 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily C, type 1 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia C, tipo 1 TRPC5 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily C, type 5 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia C, tipo 5 TRPC6 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily C, type 6 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia C, tipo 6 TRPM2 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily M, type 2 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia M, tipo 2 TRPM5 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily M, type 5 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia M, tipo 5 TRPM8 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily M, type 8 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia M, tipo 8 TRPV1 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily V, type 1 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia V, tipo 1 TRPV2 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily V, type 2 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia V, tipo 2 Glosario de abreviaturas 7 TRPV4 Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily V, type 4 Receptor con potencial transitorio catiónico, subfamilia V, tipo 4 TTX Tetrodotoxin Tetrodotoxina TWIK Tandem of P-domains in a weak inward rectifying K+ channel Canal de potasio con débil rectificación hacia adentro y tándem de dominios P UCP-1 Uncoupling protein-1 Proteína desacoplante tipo 1, termogenina UCP-4 Uncoupling protein-4 Proteína desacoplante tipo 4 UI Unidades Internacionales VIP Vasoactive intestinal peptide Péptido intestinal vasoactivo VMH Ventromedial hypothalamus Núcleo ventromedial del hipotálamo VRAC Volume-Regulated Anion Channel Canal aniónico regulado por volumen VSD Voltage sensor domain Dominio sensor de voltaje VSOR Volume-sensitive outwardly rectifying Canal rectificador hacia afuera sensible a volumen WAT White adipose tissue Tejido adiposo blanco WT Wild-type Silvestre 8 RESUMEN Resumen 9 Los adipocitos blancos son células que participan en el metabolismo energético, mediante el almacenamiento de energía y la secreción, entre otras moléculas, de adipoquinas, que participan en la regulación metabólica. Su actividad está altamente regulada por hormonas como la noradrenalina e insulina, inductoras de los procesos de lipólisis y lipogénesis, respectivamente. En patologías como la obesidad, se sabe que los niveles basales de insulina son superiores a los de un estado normal. Anteriormente se han encontrado corrientes de potasio en los adipocitos, modulables tanto por insulina como noradrenalina, pero apenas se conoce el mecanismo de acción de esta regulación. Este trabajo se centra en la caracterización de los canales de K+ dependientes de voltaje y el efecto sobre ellos de dos concentraciones distintas de insulina, 10 y 100 µUI/ml, estudiándose las propiedades biofísicas de las corrientes, el perfil farmacológico y la expresión de canales mediante inmunofluorescencia. Los resultados muestran que las células cultivadas con baja insulina son de menor tamaño, aunque poseen una resistencia de membrana parecida a las de alta insulina. Del mismo modo, en presencia de 10 µUI poseen corrientes y densidades de corrientes menores. Para ambas concentraciones de insulina se da una activación de la conductancia con varias fases con valores de V1/2 y k similares entre ellos. La desactivación revela dos taus, en torno a 6 y 18 ms, indistintamente de la insulina aplicada. Al estudiar la inactivación dependiente de voltaje se advierten tres tipos de comportamiento, en los cuales el porcentaje de células se reparte de forma distinta según la concentración de insulina, siendo los parámetros de V1/2 y k de inactivación parecidos entre ellas. Mediante protocolos de 10 s se ha encontrado que la inactivación dependiente de tiempo presenta dos taus y que es más rápida en las células cultivadas en 10 µUI. El proceso de desinactivación también muestra dos taus, siendo igualmente más rápida en células cultivadas con baja insulina. Al utilizar un holding potential de -100 mV se encuentra en el 36.9 y 38.4% de las células de 10 y 100 µUI respectivamente, manifiestan una corriente hacia dentro o inward current. La aplicación de TEA reveló una doble fase con unas IC50 de 0.54 µM y 1.69 mM (en baja insulina) y 3.95 µM y 2 mM (en alta insulina). La primera fase obliga a la descripción de un nuevo canal ultrasensible al TEA, o alguna configuración no descrita de los canales conocidos. La IC50 de la segunda fase puede indicar una alta participación del canal KV2.1 en las corrientes. El uso de MgTX (1 y 10 nM) y Psora-4, indica la participación del canal KV1.3 en ambas concentraciones de insulina, de KV1.5 en baja insulina y de heterotetrámeros de la familia Kv1 en alta insulina. La inhibición por IbTX señala la expresión de KCa1.1. El bloqueo con GxTX-1E estableció cómo los canales de la familia KV2 representan aproximadamente un 80% de las corrientes, siendo la primera vez que esta participación es referida. La realización de pruebas de inmunofluorescencia mostró cómo en ambas concentraciones de insulina la mayoría de canales se expresaban en las células, pero no se puede conocer en qué proporción se localizan en el la membrana plasmática. En el citoplasma destaca la presencia de acúmulos de canales, interpretados como posibles vesículas de transporte, cuyo número se corresponde en ocasiones con los resultados obtenidos con los bloqueantes antes indicados. Resumen 10 En conclusión, la concentración crónica de insulina en adipocitos blancos de rata puede alterar las propiedades biofísicas de las corrientes de potasio, así como la expresión de determinados canales KV. Palabras clave: adipocitos, voltage-clamp, KV1.3, KV1.5, KV2.1, insulina, obesidad. 11 INTRODUCCIÓN Introducción 12 1. Tejido adiposo El tejido adiposo es un tejido conjuntivo especializado en la homeostasis energética (Ross & Pawlina, 2015). Está constituido por células llamadas adipocitos, las cuales son capaces de almacenar triglicéridos como forma de energía, pero además, regulan el metabolismo energético mediante la secreción de moléculas que actúan de forma autocrina, paracrina y endocrina, lo que lleva a considerarlo un órgano endocrino (Kershaw & Flier, 2004). Además, el tejido adiposo ejerce funciones de aislamiento térmico y amortiguador mecánico, como sucede en las cuencas de los ojos o las palmas de las manos (Renold & Cahill, 1965). Además de los adipocitos, los cuales constituyen sólo el 25% de las células del tejido, éste puede contener otros tipos celulares encontrados en la fracción del estroma vascular, tales como macrófagos, fibroblastos, pericitos, células endoteliales y células precursoras de adipocitos (Frühbeck, 2008). El origen de los adipocitos es mesenquimal, pasando desde células madres a adipoblastos o lipoblastos, preadipocitos y finalmente, adipocitos maduros (Renold & Cahill, 1965; Koutnikova & Auwerx, 2001). No fue hasta mediados del siglo XX cuando el tejido adiposo fue considerado algo más que un reservorio de grasa, dándosele importancia como órgano clave en el metabolismo energético, de la mano de H.E. Wertheimer (Wertheimer & Shapiro, 1948), quien estableció por primera vez una relación entre regulación de la grasa corporal y la captación de glucosa, y Franz X. Hausberg, el cuál describió la inervación del tejido adiposo y el fenotipo inflamatorio en animales obesos (Renold & Cahill, 1965). El color del tejido adiposo varía de blanco (WAT) a marrón (BAT), dependiendo del tipo de adipocitos que sean predominantes: blancos o marrones. Las cantidades relativas de estos subtipos de tejido están determinadas genéticamente y dependen de muchos factores (principalmente edad, sexo, temperatura ambiental y estado nutricional) (Fantuzzi & Mazzone, 2007). Es un tejdo localizado en depósitos distribuidos por todo el organismo, constiuyendo el 20% del peso del individuo. Se diferencia principalmente en dos grandes disposiciones, subcutáneo y visceral. El subcutáneo se encuentra debajo de la dermis, mientras que el visceral, tiene una ubicación muy variable, como ilustra la figura 1. Entre ambos, subcutáneo y visceral, existen diferencias metabólicas relevantes, como son su capacidad adipogénica o su sensibilidad a hormonas (Ibrahim, 2010). Introducción 13 Figura 1. Distribución del tejido adiposo subcutáneo y visceral. En azul, zonas ricas en adipocitos blancos, en marrón, áreas donde se encuentran preferentemente adipocitos marrones y en naranja, lugares donde pueden encontrarse adipocitos blancos y adipocitos beige. Tomado de Zhang et al., 2018. 1.1. Tejido adiposo marrón (BAT). También se denomina tejido adiposo multilocular, debido a que los adipocitos marrones contienen muchas gotas de grasa de pequeño tamaño en su citoplasma, como se observa en la figura 2 Las células son poligonales o elipsoides con un diámetro entre 15-50 µm, y un núcleo excéntrico redondeado (Fantuzzi & Mazzone, 2007). Este tejido fue descubierto en animales que hibernan, aunque posteriormente se descubrió que los recién nacidos de nuestra especie también poseen una extensa porción interescapular que disminuye con la edad. Posee una rica irrigación sanguínea, de color rojo, lo que hace que, junto a un gran número de citocromos C, de color verde, adquiera su característico tono pardo/marrón, (Renold & Cahill, 1965). En dichas mitocondrias destaca la expresión de la proteína UCP-1 (uncoupling protein-1) o termogenina en la membrana interna (Ross & Pawlina, 2015). Esta proteína es un dímero de 33 kDa, parecida a la ATP-translocasa, pero donde la energía liberada al generarse el gradiente de protones se disipa en forma de calor. Esta vía se activa cuando la temperatura corporal empieza a descender. En respuesta a esta caída, la activación simpática origina la liberación de triglicéridos y una mayor expresión de UCP-1 (Stryer et al., 2007). Introducción 14 Figura 2. Tejido adiposo de rata. La tinción fue hecha con hematoxilina-eosina y vista con objetivo 40X, donde se observa, a la izquierda, células pertenecientes al tejido adiposo blanco (WAT) y a la derecha del tejido adiposo marrón (BAT). Modificado de Radin et al., 2009. En los últimos años es destacable el interés en las células llamadas “beige”, las cuales serían un subtipo intermedio en una conversión de adipocitos blancos a marrones (Rosenwald et al., 2013). Estas células conservarían características de ambos tipos celulares, como puede ser la presencia de una sola gota de grasa, como los adipocitos blancos, a la vez que un gran número de mitocondrias expresando UCP-1, como los adipocitos marrones (El Hadi et al., 2019). La conversión (“pardeamiento”) puede ser inducida a través de la exposición del animal durante un lapso de tiempo a bajas temperaturas, o también de manera in vitro mediante la aplicación de rosiglitazona, un inductor de PPARg, el cual acaba provocando un aumento de la expresión de UCP-1 (Maurer et al., 2021). Esta conversión es una de las estrategias farmacológicas contra la obesidad de mayor estudio en la actualidad, pero de muy difícil abordaje ya que, como muestra la figura 3, son muchos los factores que pueden estar implicados en esta transdiferenciación, entre las que se incluyen, hormonas tiroideas, prostaglandinas y factores neurales como la melatonina (Montanari et al., 2017; Maurer et al., 2021). 1.2. Tejido adiposo blanco (WAT). Llamado también tejido adiposo unilocular, debido a que sus células tienen una gran gota de grasa que ocupa prácticamente todo el citoplasma (figura 2). Sus células son esféricas cuando están aisladas, con un tamaño que oscila entre 30-160 o 20-100 µm, dependiendo de su localización, subcutánea o visceral. El núcleo se encuentra excéntrico y aplanado, lo que da una imagen denominada “de anillo de sello” al microscopio (Fantuzzi & Mazzone, 2007). Introducción 21 La estructura fue determinada en 1969 (Adams et al., 1969) mediante cristalografía de rayos X por Dorothy Crowfoot Hodking, quién había recibido el premio Nobel de Química en 1964 (Santulli et al., 2018). El monómero de insulina es una proteína pequeña (alrededor de 5.8 kDa) con dos cadenas polipeptídicas, A (21 aminoácidos) y B (30 aminoácidos), unidas entre sí por dos puentes disulfuro. A su vez, la cadena A tiene un puente disulfuro intracatenario. A concentraciones superiores a micromolar, se forman dímeros, y por encima de 40 mM (como en los gránulos donde se almacena), hexámeros, consistentes en 3 dímeros coordinados por un átomo de Zn2+ (Fu et al., 2012). La síntesis se produce en islotes de Langerhans del páncreas, concretamente en el citoplasma de las células b, en forma de precursor inactivo de una sola cadena peptídica de 110 aminoácidos, la preproinsulina, cuya estructura se muestra en la figura 6. Esta molécula presenta una secuencia señal en el extremo N-terminal que determina su traslocación al RE (retículo endoplasmático). Allí, se elimina proteolíticamente dicha secuencia señal, plegándose para adquirir una estructura tridimensional que permite la formación de los tres puentes disulfuro entre las cadenas. Esta nueva molécula se llama proinsulina y será llevada al aparato de Golgi (AG). Allí, se almacena en gránulos de secreción junto a la IAPP o amilina y otras moléculas péptidicas secretadas por las mismas células b pancreáticas. Ante un estímulo, la proinsulina de los gránulos se escinde gracias a proteasas activas para generar insulina madura por una parte y el péptido C por otra (Nelson & Cox, 2009; Fu et al., 2012). Figura 6. Estructura de la insulina. En azul, péptido señal de traslocación al RE. En blanco, péptido C; verde, cadena A y rojo, cadena B. Se representan las mutaciones más representativas. RM: mutación recesiva; T2D, diabetes tipo 2; MODY, comienzo tardío de la diabetes juvenil; NDM. Tomado de Liu et al., 2018. Introducción 22 El estímulo para la secreción de la insulina es principalmente un aumento de la concentración de glucosa sérica, pero no el único, como indica la figura 7. Un aumento de aminoácidos, ácidos grasos, determinadas hormonas gastrointestinales (GI), como son VIP (péptido vasoactivo intestinal) o GLP-1 (péptido similar al glucagón tipo 1) son conocidos factores inductores de la secreción de esta hormona (Baumgard et al., 2016). Así, cuando los niveles de glucosa, aminoácidos o ácidos grasos son altos, el catabolismo de éstos en la célula b eleva la concentración de ATP intracelular, lo que provoca el cierre de los canales de KATP (Kir 6.2 junto a una subunidad accesoria SUR) situados en la membrana plasmática, provocando de ese modo una despolarización. En respuesta al cambio en el potencial de membrana, se abren canales de calcio regulados por voltaje, CaV, lo que permite la entrada de calcio hacia el interior celular. La concentración de calcio se hace suficientemente elevada para provocar la maduración de la insulina en el AG y la exocitosis de las vesículas de insulina. Cuando el estímulo es a través de CCK (colecistoquinina) y Ach, la elevación del calcio se consigue mediante la vía de PKC-IP3, mientras que en el caso de las hormonas GI se activa la ruta de la PKA, mediante una proteína G acoplada a una adenilato ciclasa (Skelin Klemen et al., 2017). Figura 7. Rutas intracelulares de la célula b implicadas en la secreción de insulina. Las abreviaturas hacen referencia a: Ac-Coa, acetil-CoA, Ach, acetilcolina; ANT, transportador de nucléotidos adenina; ATP, adenosina-1,3,5.trifosfato; cAMP, adenosina monofosfato cíclico; CCK, colecistoquinina; CPT, carnitina palmitoiltrasnfereasa; EPAC2, proteína intercambiadora directamente activada por AMPc tipo 2, ETC, cadena transpotadora de electrones; FFA, ácidos grasos libres; GDH, glutamato deshidrogenasa; Gi, proteína G inhibidora; GIP, polipéptido inhibidor gástrico; GK, glucoquinasa, GLP-1, péptido similar al glucagón tipo 1, GLUT1-3, transportador de glucosa tipos 1-3; Gs, proteína G activadora; LC-CoA, acil-coA de cadena Introducción 23 larga; MCFs, factores metabólicos acoplados; MPC, transportador de piruvato mitocondrial; NADH, nicotinamida adenina dinucléotido reducida; NADPH, nicotinamida adenina dinucléotido fosfato reducida; PC, piruvato carboxilasa, PDH, piruvato deshidrogenasa; PKA, fosfoquinasa A, PYY, péptido Y; TCA cycle, ciclo de los ácido tricarboxílicos; VDCC, canal catiónico dependiente de voltaje; VIP, péptido vasoactivo intestinal; Δψ, cambio en el potencial de membrana. Tomado de Parnis & Rutter, 2019. Es importante indicar que las células b son consideradas células excitables. Para conseguir una despolarización tal que se produzca la liberación de los gránulos con la hormona hay implicados una serie de canales, además del mencionado KATP (Ashcroft et al., 1984) y que pueden variar según si se trata de células humanas o de roedor. Algunos ejemplos son el KV2.1(Herrington et al., 2006; Yoshida et al., 2010), BK (Houamed et al., 2010), TRPV1(Akiba et al., 2004), TRPV4, NaV1.7 y diferentes tipos de canales CaV de todas las subfamilias (L, T, P/Q y R) (Skelin Klemen et al., 2017; Jacobson & Shyng, 2020). La medida de esta hormona, así como de los niveles glucémicos en sangre fue conseguido gracias al desarrollo de la técnica de radioinmunoensayo (RIA) en 1961 por parte de Rosalyn S. Yallow y Solomon Berson. Por ello, a Yallow le fue otorgado el Premio Nobel de Medicina en 1977, junto a Roger C. Guillemin y Andrzej V. Schally (descubridores de los neuropéptidos). La insulina se ha medido tradicionalmente en unidades internacionales (UI) por ml, una unidad basada en la eficacia de la hormona para alcanzar unos niveles de glucemia concretos, pero el Sistema Internacional de medidas (SI) recomienda que se dé en pmol/l. Así, se considera que 1 µUI/ml equivale a 6 pmol/l (Knopp et al., 2019). Los niveles de insulina normales en sangre se sitúan en torno a 10.7 µUI/ml de insulina a nivel basal (Lerner & Porte, 1972) y 78.7 µUI/ml en su pico máximo (2.73 ng/ml) a los 5 minutos de la ingesta de 25 g de glucosa (Horwitz et al., 1975). 2.2. Mecanismo de acción. La insulina es inductor de complejas rutas de señalización (Siddle, 2011), mencionadas en la figura 8. El receptor de insulina (IR) es un receptor tirosina quinasa. Consta de un dímero de dos unidades idénticas. Cada una de ellas posee una subunidad a (extracelular) y b (intracelular, con un segmento transmembrana) unidas entre sí por puentes disulfuro. La unión de las subunidades a a una molécula de insulina inicia la ruta de señalización, al acercar a su vez a las subunidades b, las cuales son las que contienen el dominio catalítico del receptor. Así, se da una autofosforilación cruzada de residuos, los cuales actúan entonces como sitios de unión para proteínas como el substrato del receptor de insulina (IRS). Una vez fosforilados, las moléculas IRS actúan como proteínas adaptadoras, uniéndose a ellas proteínas con un dominio SH2, como las proteínas SHC (Stryer et al., 2007). A través de esta se activa la vías MAPK, inductora de genes de proliferación y diferenciación celular (Bost et al., 2005). Por otra parte, gracias a su dominio SH2 se puede activar también la PI3K (Beretta et al., 2015), la cual procede a la conversión de PIP2 a PIP3 y de ahí, el inicio de las vías Akt y mTOR (Cai et al., 2016), implicadas en los procesos anabólicos Introducción 24 e inhibiendo a su vez los catabólicos. Paralelamente a la activación de las rutas, se aumentan la expresión de genes de factores implicados en ellos (Cai et al., 2021). Figura 8. Principales funciones de la insulina a través de sus rutas. MEK/ERK, quinasa de la quinasa activada por mitógeno/kinasa regulada por señales intracelulares; mTORC1, complejo de diana de rapamicina en mamíferos tipo 1; NOX4, NADPH oxidasa tipo 4; PI3K/AKT, fosfoinositol-3-quinasa/ proto-oncogen viral de timoma de ratón AKR; PTEN, fosfatidilinositol-3- quinasa 3-fosfatasa; SHC, proteína transformante que contiene un dominio de homología Src tipo 2. Tomado de Kolb et al., 2020. La diabetes es la enfermedad relacionada con la insulina más importante. Según datos de la International Diabetes Federation (IFD), fue padecida por un 10.5% de la población mundial entre 18-79 años en 2021 (Sun et al., 2021). Se da en dos manifestaciones clínicas: diabetes tipo I, también llamada diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) y la diabetes tipo II o diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM). La diabetes tipo I, está caracterizada por la destrucción autoinmune de las células b pancreáticas y la consecuente incapacidad de producir insulina. Requiere de administración periódica de insulina y un estricto control en el consumo de glucosa. La diabetes tipo II suele ser de aparición más tardía, presenta una relación bastante estudiada con la obesidad (Kahn et al., 2006; Burhans et al., 2018) y aunque en un principio la secreción de hormona es normal o incluso más alta, los tejidos no responden a ella, debido a una desensibilización de los receptores (Stryer et al., 2007; Nelson & Cox, 2009). Introducción 25 3. Canales iónicos 3.1. Perspectiva histórica. Los canales iónicos constituían en 2016 el 19% de las posibles dianas farmacológicas proteicas en humano. Hacia ellos iba dirigida el 18% de las moléculas pequeñas estudiadas entonces, de las cuales aproximadamente el 2.8% habían sido aprobadas por la FDA (Santos et al., 2016). No obstante, se han necesitado muchos años para llegar a entender el papel fundamental de los canales iónicos en la fisiología. Un breve resumen sobre la historia de la electrofisiología puede ser consultada en el esquema de la figura 9 (adaptado de Muley et al., 2009). Los orígenes pueden localizarse en 1660, cuando Jan Swammerdan realizó una disección completa de extremidades de rana dejando el nervio intacto, intentando experimentos de excitación que finalmente pondría a punto Galvani, Más de un siglo después, Luigi Galvani publicó en 1791 “De Viribus Electricitatis in Motu Musculari Commentariuon”, donde relata los experimentos realizados junto a su mujer, Lucia Galeazzi y su sobrino, Giovanni Aldini, en los que vio que al hacer atravesar una corriente eléctrica por un nervio provocaba la contracción de ciertos músculos, estableciendo además una correlación entre intensidad de la estimulación y magnitud de la contracción. Basándose en estos resultados, postuló la teoría de la “electricidad animal” (Muley et al., 2009). En 1902 se produjo un salto cualitativo en la electrofisiología cuando Julius Bernstein (Hille, 2001) enunció la hipótesis de la membrana, en la cual la célula estaría rodeada de una membrana permeable a iones K+. Los iones estarían más concentrados en el interior celular que en el exterior, lo que provocaría un movimiento de estos hacia fuera de la célula, causando así un potencial negativo en el interior celular. En 1937, John Z. Young, basándose en los estudios anatómicos de Leonard W. Williams de 1909, propuso el uso del axón gigante del calamar (Loligo pealeii) dado su enorme diámetro, como herramienta en el estudio de potenciales celulares (Carmeliet, 2019). Usando este axón, Kenneth Cole y Howard J. Curtis describieron la técnica de voltageclamp en 1939, en la cual es posible mantener constante el potencial eléctrico del interior celular, permitiendo medir el cambio de dicho potencial producido por un flujo de iones que podía ser manipulado por el experimentador (Muley et al., 2009). En 1952, Bernard Katz, Alan L. Hodgkin y Andrew F. Huxley sentaron las bases del potencial de acción como el movimiento de iones Na+ y K+ a través de la membrana, sugiriendo la existencia de unos “poros” específicos (futuros canales) en la membrana, los cuales tendrían permeabilidades distintas según los iones (Muley et al., 2009; Verkhratsky & Parpura, 2014). Por el desarrollo matemático de este proceso, en 1963 Hodgkin y Huxley recibirían el Premio Nobel de Fisiología o Medicina, junto a John Eccles, quién correlacionó corrientes iónicas y comunicación sináptica. En 1970 se concedió de nuevo un Premio Nobel de Fisiología o Medicina en el campo de la electrofisiología, esta vez para Julius Axelrod, Ulf Van Euler Introducción 26 Figura 9. Línea temporal de la historia de la electrofisiología. Adaptado de Muley et al., 2009. Introducción 27 y Bernard Katz por sus estudios en sinapsis, de noradrenalina en los dos primeros casos y acetilcolina en el segundo. Ese mismo año, Stephen Hladky y Denis A. Haydon utilizaron por primera vez gramidicina para estudiar corrientes iónicas, naciendo la técnica de parche perforado (Muley et al., 2009). En 1976 se produjo otro hito relevante, ya que Erwin Neher y Bert Sakmann publicaron el trabajo en el cual registran la corriente de los canales localizados en un pequeño parche de membrana (Neher & Sakmann, 1976). Cinco años más tarde publicarían una mejora esencial añadida a esta técnica, el gigasello (Hamill et al., 1981), el cual reduce el ruido y permite un mejor registro de las corrientes. Entre 1984 y 1988 se secuenciarían diversos canales, como los nicotínicos y sodio dependientes de voltaje (1984), calcio dependientes de voltaje (1987) y Shaker, un canal de potasio de mosca (1987) (Muley et al., 2009). Debido a sus trabajos sobre el patch-clamp, Neher y Sakmann recibirían el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1991. Aparte de los canales dependientes de voltaje, en 1997, en el laboratorio de David Julius se describió y aisló un canal sensible a capsaicina, el TRPV1(Caterina et al., 1997). El grupo de Roderick MacKinnon logró en 1998 cristalizar por primera vez un canal de potasio de bacterias, KcsA (Muley et al., 2009), lo que le llevó en 2003 a la obtención del Nobel de Química junto a Peter Agre, descubridor de las aquaporinas. El estudio de los canales implicados en la mecanotransducción experimentó un momento relevante cuando Ardem Patapoutian describió en 2010 los canales Piezo 1 y Piezo 2 (Coste et al., 2010). En 2021, Patapoutian recibe el Premio Nobel de Fisiología o Medicina, junto a Julius por sus descubrimientos en las rutas del dolor y la mecanorrecepción. 3.2. Clasificación y estados conformacionales. La constitución de la membrana plasmática, con su estructura de bicapa de fosfolípidos impide la permeabilidad a los iones. Inicialmente se pensaba que los iones sólo podían atravesar la membrana lipídica uniéndose de manera reversible a un transportador. Pero la rapidez con la que se ejecuta el potencial de acción hizo pensar en la necesidad de moléculas que, actuando como poros, permitieran el paso de los iones a través de la membrana. Los canales iónicos son macromoléculas (>240 kDa) constituidas por varias subunidades peptídicas, que permiten el paso de iones por difusión. Un solo canal puede conducir de 1 a 100 millones de iones por segundo (Blaustein et al., 2012). Hay un tipo de canales, constitutivamente abiertos pero selectivos a determinados iones, que permiten el establecimiento del potencial de membrana de reposo, denominados canales leakage o de fuga. Destacan los canales leakage de K+ (Goldstein et al., 2001) y Na+ (Cochet-Bissuel et al., 2014). Lo demás canales tienen dos características que definen su funcionalidad (Hille, 2001): Introducción 28 • Apertura por estimulación. Los canales no suelen estar permanentemente abiertos, sino que esta apertura requiere de estímulos que desencadenen un cambio conformacional que permite o impida el flujo de los iones. Estos estímulos pueden ser principalmente de tres tipos: - Estímulos eléctricos: la asimetría de concentración de iones a ambos de lados de la membrana genera una diferencia de potencial eléctrico entre la cara interna y externa de la membrana, el llamado potencial de membrana. La alteración de dicho potencial conlleva la apertura o o cierre de determinados canales, llamados dependientes de voltaje (figura 10). Figura 10. Cambios conformacionales en los canales dependientes de voltaje. Tomada de Hinard et al., 2016. - Estímulos químicos: generándose los canales activados por ligando que al unirse al canal determina que se abra o cierre. - Estímulos mecánicos: en los que cambios mecánicos, tales como distensión o comprensión, pueden activar a determinados canales denominados mecanosensibles. Introducción 29 • Permeabilidad selectiva. Debido al llamado filtro de selectividad, una zona estrecha del poro de determinado tamaño y forma que actúa como “filtro” molecular y restringe el paso a determinados iones (Blaustein et al., 2012). Los canales iónicos se encuentran en la membrana de todo tipo de células, sean procariotas o eucariotas. Sus funciones conocidas abarcan desde controlar el potencial de membrana, generar señales eléctricas, disparar los mecanismos de generación de segundos mensajeros y controlar el volumen celular. Figura 11. Modelo cinético de Hodgkin-Huxley para el canal de sodio. C1, C2 y C3 hacen referencia a los estados cerrados del canal, O al estado abierto, P al canal colapsado e I al estado inactivo. Tomada de Sperelakis, 2012. Los cambios conformacionales que sufre el canal determinan la funcionalidad de éste, explicado de una manera simple por el modelo de la figura 10. Un cambio en el potencial de membrana provoca que el canal, que tenía el poro cerrado, se abra permitiendo que el flujo de iones fluya a través de éste. Hodgkin y Huxley modelaron matemáticamente este proceso, denominado activación, en los canales de sodio (Hodgkin & Huxley, 1952a). Determinaron que la conductancia viene determinada por tres partículas cargadas m (figura 11), las cuales dependiendo de los cambios en el campo eléctrico se moverán ocupando cada una un sitio concreto del canal. La probabilidad de que esto ocurra para las tres simultáneamente será m3 (oscilando m entre 0 y 1), y ésta será la probabilidad de que el canal se encuentre abierto. Para el canal de potasio sin embargo, son cuatro las partículas implicada en la activación, Introducción 30 llamadas n, y la probabilidad de que todas ocupen su sitio, n4 (Sperelakis, 2012). El proceso inverso, de cierre del poro, se denomina desactivación. Si el canal permanece mucho tiempo abierto se producirá un cierre de la llamada “compuerta de inactivación” o “I-gate” en inglés, ilustrado en la figura 10 mediante una “bola y cadena”, lo que causará el cese de permeabilidad de los canales, proceso denominado inactivación. En el modelo de Hodgkin-Huxley, como expone la figura 11, esto viene determinado por una partícula h, cuyo valor establece la probabilidad de que un sitio concreto sea ocupado, moviendo la compuerta de inactivación. La probabilidad de que ese sitio esté ocupado es baja a un potencial de membrana de reposo (compuerta de inactivación abierta) y alta con la despolarización. Esta compuerta h existe en el modelo cinético del canal de sodio pero no en el de potasio (Sperelakis, 2012). Así, las conductancias de los canales de Na+ y de K+ viene determinada por las ecuaciones expresadas en la figura 12. !!" = ! # !"$#ℎ !$= ! # $&% Figura 12. Ecuaciones que determinan la conductancia de los canales de sodio y potasio. gNa y gK hacen referencia a la conductancia para los iones de sosio y potasio respectivamente, ! " !"#$#! " # a las conductancias máximas para estos iones, m y h a la probabilidad cambio de las partículas de activación e inactivación del canal de Na+ y n a la de las partículas de activación de los canales de K+. Además de la inactivación aquí representada de “bola y cadena”, donde un extremo citoplasmático impide el paso de iones, existe otro tipo de inactivación más lento, en canales de potasio, llamada “de tipo C”, donde los implicados en el cierre son aminoácidos del poro (López-Barneo et al., 1993). Transcurrido un tiempo en el potencial de reposo de la célula, la compuerta de inactivación puede volver a su estado original, dándose una recuperación de la inactivación o desinactivación y volviendo así al estado inicial del canal. 3.3. Canales de K+ dependientes de voltaje (KV). Dentro de los tipos de canales dependientes de voltajes, los que conducen selectivamente potasio constituyen el grupo más abundante, con más de 80 genes encontrados en mamíferos. Los tipos funcionales más importantes se muestran en la figura 13. Introducción 37 Canal Comentario Referencia TRPA1 Un agonista, el cinamaldehído, reduce la grasa visceral en animales alimentados con dieta rica en grasa y aumenta la expresión de UCP-1 (Tamura et al., 2012) TRPC1 TRPC5 Implicados en la producción de adiponectina (Sukumar et al., 2012) TRPM2 El KO reduce la inflamación del tejido adiposo, es resistente a la obesidad y está sensibilizado a insulina (Zhang, Zhang, Young et al., 2012) TRPM5 El KO reduce su peso respecto a control y tiene menos preferencia por la sacarosa (Glendinning et al., 2012) TRPM8 Activación del canal aumentando la expresión de UCP-1 en BAT (Zhu et al., 2012) TRPV1 El KO es resistente a obesidad en animales alimentados con dieta rica en grasa, menor peso corporal (Zhang et al., 2007; Motter & Ahern, 2008) TRPV2 Expresión muy relacionada con UCP- 1 en BAT (Sun, Uchida et al., 2016; Sun, Uchida & Tominaga, 2016) TRPV4 Control de genes proinflamatorios y de metabolismo, impide la termogénesis (Ye et al., 2012) Tabla 2. Relación de algunos canales TRP expresados en adipocitos. Modificada de Vasconcelos et al., 2016. Con todo ello, parece que los canales iónicos están implicados en procesos de proliferación y diferenciación celular de las células adiposas. Además, se regulan por hormonas clave en el metabolismo, por lo que su estudio resulta interesante para entender la funcionalidad de estas células, así como su afectación en situaciones patológicas. 38 OBJETIVOS Objetivos 39 Dado el papel de los canales de potasio en el adipocito, tal como se ha reseñado en la Introducción, los objetivos planteados en este trabajo de Tesis Doctoral son: 1. Caracterización biofísica de las corrientes de potasio en adipocitos viscerales del epidídimo de rata. 2. Estudio del perfil farmacológico de estas corrientes para intentar conocer los canales implicados en las corrientes. 3. Comparación de las propiedades biofísicas y farmacológicas en adipocitos cultivados con baja insulina (10 µUI/ml) y alta insulina (100 µUI/ml) las cuales se aproximan a las situaciones de un individuo en estado sano y obeso. 4. Localización de los posibles canales responsables de las corrientes mediante inmunofluorescencia. 40 MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 41 En este apartado se explicará cómo se llevaron a cabo las distintas técnicas empleadas, así como algunos detalles de composición de las soluciones utilizadas. La relación de marcas y referencias de los productos empleados pueden consultarse en la información suplementaria al final de esta sección. 1. Cultivo celular 1.1. Obtención del tejido. Para la realización de este trabajo se han usado ratas albinas macho (Rattus norvergicus, cepa Wistar) de entre 6 y 7 semanas, con acceso a comida y agua ad libitum. Dichos animales fueron criados en las instalaciones del Animalario de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla. Los procedimientos se adecuaron a lo acordado por el Comité Ético de dicha Universidad. Se realizó la eutanasia de los animales mediante asfixia con CO2. A continuación, se procedió a la apertura de la cavidad pélvico-abdominal. Para ello, una vez separada la piel del animal del peritoneo, se secciona la membrana peritoneal dejando accesibles los testículos en la zona abdominal inferior. A continuación, se seccionan los panículos adiposos que rodean a los epidídimos de ambos testículos, situados en la zona posterosuperior de éstos (figura 15). El tejido recién extraído fue colocado en un recipiente con una disolución de dispersión cuya composición se expone en la sección 2.1.1. Figura 15. Disección de testículos de rata. A. Imagen del plano frontal de la rata, donde se observan cómo los panículos adiposos de los testículos, señalados con flechas verdes, asoman claramente. B. Los testículos seccionados y aislados, donde se observa claramente el gran tamaño de los panículos. 1.2. Tratamiento y dispersión enzimática. El tejido fue situado en un recipiente con solución de digestión (apartado 2.1.2) y sometido a un corte que lo fragmenta en pequeños trozos de 1 a 2 mm. Estos trozos se mantuvieron en el baño termostático a 37ºC durante 30 minutos, a una agitación Materiales y Métodos 42 constante de 80-90 movimientos por minuto. Transcurrido ese tiempo, el producto de la digestión se pasó a través de un filtro de 100 µm, y el filtrado se recogió en un tubo de centrifuga donde se diluye en solución de dispersión sin enzima. Este tubo se sometió a una centrifugación de 1500 rpm (400xg) durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante de la centrifugación, donde se encuentran flotando una capa de adipocitos maduros (fat cake), se separó en otro tubo de centrifuga. El pellet de la primera centrifugación fue resuspendido en 1 ml de solución de eritrólisis (composición en apartado 2.1.3) durante 6 minutos a 37ºC. Seguidamente se diluyó en la solución de dispersión y se centrifugó en las mismas condiciones que en la primera ocasión. Se excluye entonces el sobrenadante y se resuspende el pellet en 1 ml de medio de cultivo (composición en anexo 2.1.5), para proceder al contaje de células mediante una cámara de Neubauer. Se realiza entonces la siembra en placas de Petri, dejando en cada placa aproximadamente 250000 células. Asimismo, se añade a cada placa entre 10-12 gotas de los adipocitos maduros reservados en la primera centrifugación. En cada placa se han puesto previamente entre 6 y 8 cristales pretratados con poli-L-lisina de unos 7 x 3 mm, obtenidos del corte de cubreobjetos. Las placas son colocadas en un incubador, a 37ºC, con una atmósfera del 5% de CO2, y un 95% de humedad relativa. Pasadas 6 horas desde la finalización del cultivo, se mueven los cubreobjetos a unas placas nuevas con medio fresco, trasladando asimismo los adipocitos maduros flotantes. Esto permite retirar del cultivo las células muertas y eritrocitos que se depositan en el fondo de las placas. A partir de este momento el medio de cultivo se cambia cada 48 horas. Los experimentos se efectúan entre el 4º y 12º día después de la preparación del cultivo. También se realiza un cambio a placas nuevas, al llegar el cultivo al séptimo día, en este caso, para quitar los fibroblastos y adipocitos que se han formado en el plástico de la placa de Petri y que contribuirían a acidificar el medio, según se comenta en la Discusión. 1.3. Tratamiento del vidrio con poli-L-lisina. Para que las células crezcan sobre un sustrato han de colocarse en una superficie tratada en ese sentido. En este trabajo, se usaron cubreobjetos rectangulares de aproximadamente 7 x 3 mm de tamaño, cortados manualmente con una punta de diamante, bañados en alcohol absoluto, flameados uno a uno y sumergidos en una solución de poli-L-lisina 0.1 mg/ml (composición en apartado 2.1.4) durante 16 horas. Dichos cubreobjetos son lavados a continuación en una solución de agua destilada, seguida de NaCl 0.9% y finalmente en agua destilada de nuevo. Una vez secados en posición vertical en la campana de flujo, los cubreobjetos son guardados a 4ºC en placas de Petri. 1.4. Contaje de células. El contaje de las células, para analizar la evolución por días de cultivo, se realizó con un microscopio invertido de epifluorescencia el cual tenía acoplada una cámara. El Materiales y Métodos 43 objetivo utilizado fue 10x (UPlanFI 10x/0.3 NA). para ver el campo más ampliado, el objetivo empleado fue 20x (LCPlanFI 20x/0.4 NA). El programa de adquisición de las imágenes era el de la cámara de adquisición (DP Controller, de Olympus). Se realizaron 8 fotos cada día, en 4 regiones de dos cubres distintos, en general tras haber terminado de realizar registros en ellos. Para realizar el contaje de células se utilizó el software Fiji (Schindelin et al., 2012), implementando el plugin “Cell Counter” contenido en el programa. 2. Soluciones 2.1. Soluciones para el cultivo y su preparación. Todas las soluciones fueron preparadas en agua ultrapura tipo MilliQ. 2.1.1. Solución de dispersión 1x. Componente Concentración final (mM) HEPES 10 NaCl 140 KCl 5 CaCl2 1 Glucosa 5 Tabla 3. Solución de dispersión 1x. HEPES hace referencia a ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina- N´-(2-etanolsulfónico). Originalmente esta solución se prepara como 5x y es diluida hasta 1x. A dicha solución 1x se le añade albúmina bovina sérica (BSA) al 3% (3 g en 100 ml). Se le ajuste el pH a 7.4 con NaOH y se hacer pasar por un filtro de 0.2 µm. 2.1.2. Solución de digestión. Partiendo de la solución anterior, se le añade colagenasa tipo II a una concentración de 0.5 mg/ml. Materiales y Métodos 44 2.1.3. Solución de eritrólisis. Componente Concentración (mM) NH4Cl 155 K2HPO4 5.7 EDTA 0.1 Tabla 4. Solución de eritrólisis. EDTA hace referencia a ácido etilendiaminotetracético. El pH de esta solución es corregido a 7.4 con KOH y a continuación filtrada con un filtro de 0.2 µm. La solución se alícuota en viales de 1 ml y se conserva hasta seis meses a 4ºC. 2.1.4. Solución de poli-L-lisina. Se prepara una solución 0.15 M Trizma® 8.5 (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3- propanodiol) a la que se le añade la poli-L-lisina (peso molecular mayor de 300 kDa) a una concentración de 0.1 mg/ml. A continuación, se filtra a través de un filtro de 0.2 µm. La solución se guarda a 4ºC hasta seis meses y es desechada cada vez que se utiliza. 2.1.5. Medio de cultivo. El medio de cultivo se compone de DMEM (medio modificado de Dulbecco) con bicarbonato como tampón, suplementando con 10% de suero bovino neonatal (NCS o NBCS), 1% solución penicilina-estreptomicina y 1% de L-Glutamina. La insulina, de origen bovino, es añadida para alcanzar concentraciones de 10 o 100 µUI/ml. En el resto del texto, se hará referencia a 10 µUI o 100 µUI por simplificar. 2.1.6. Preparación de insulina. La insulina es un péptido que requiere de pH ácido para su disolución. Por ello, sabiendo las UI/mg que contiene cada lote, la insulina bovina es resuspendida en ácido acético glacial pH=2 para alcanzar una concentración de 50 UI/ml. A esta solución se le llama stock 1. A continuación, se prepara el stock 2, diluyendo el stock 1 en agua para lograr una concentración de 1 UI/ml. Finalmente, a partir de este stock 2 se prepara una disolución de 100 mUI/ml, que es llamada stock 3. Este será el stock del que se partirá para añadir al medio de cultivo. Materiales y Métodos 45 Se sabe que la insulina en solución se adhiere a los plásticos de los envases que la contiene (Goebel-Stengel et al., 2011; Ley et al., 2014), pudiendo disminuir la concentración real en solución, sobre todo si la concentración es menor a 100 mUI/ml, donde se llega a perder hasta un 20% de la concentración (Thompson et al., 2012). Por ello, todos los tubos que vayan a contener stock 3 (100 mUI/ml) son sometidos a un proceso de saturación. Consiste en que una vez fabricada la solución y repartida en los correspondientes tubos, todos son sometidos a agitación en el vórtex durante 1 minuto, para que el contenido se reparta por todas las paredes del tubo. A continuación, la solución es dejada reposar en los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente y posteriormente, desechada. Se prepara de nuevo stock 3 (100 mUI/ml) y se reparte entre estos viales cuyas paredes ya han sido tratadas. Todos los stocks son guardados a 4ºC durante un máximo de tres meses. 2.2. Soluciones de registro. 2.2.1. Solución externa. Componente Concentración (mM) HEPES 10 NaCl 145 KCl 2.7 CaCl2 2.5 MgCl2 1 Glucosa 5 Tabla 5. Solución externa utilizada durante los experimentos. El pH de la solución es ajustado a 7.35 mediante NaOH. La osmolalidad se mantiene en el rango de 290-295 mOsm/kg. Materiales y Métodos 46 2.2.2. Soluciones internas. Componente Concentración (mM) Interna normal Interna con calcio Glutamato potásico 90 90 KCl 55 50.5 MgCl2 2 2 HEPES 10 10 EGTA 5 5 CaCl2 - 4.43 Tabla 6. Soluciones internas utilizadas en los experimentos. EGTA hace referencia a ácido etilenglicol-bis-(2-aminoaciléter)-N,N,N´,N´-tetracético. El pH de la solución es ajustado a 7.25 usando KOH. La osmolalidad de la solución se mantiene en el rango de 290-295 mOsm/kg, procurando que sus valores se igualen lo máximo posible a la solución externa, lo que se comprueba mediante un osmómetro (Wescor, mod. 5500). En el caso de la solución con calcio en la solución interna, la cantidad de calcio aplicada es tal que la concentración de calcio libre calculada sea 1 µM. Las estimaciones fueron realizadas usando el programa Maxchelator (Bers et al., 2010). 2.2.3. Disolución de drogas. Todas las drogas, excepto el Psora-4, fueron disueltas en agua MilliQ, para hacer stocks cuya concentración resultara 1000 veces superior a la que fuera a utilizarse en los experimentos. Luego fueron añadidas a la solución externa hasta alcanzar la concentración referida en Resultados. En el caso del Psora-4 fué disuelto en DMSO haciendo un stock de 5 mM (stock 1), que posteriormente fue diluido en agua MilliQ para conseguir una concentración de 100 µM (stock 2). Este stock 2 fue el utilizado en los experimentos correspondientes. Los stocks de la droga fueron almacenados a 4ºC en un envase opaco y los experimentos con esta droga fueron realizados en oscuridad. En el caso de TEA 10 y 50 mM, fueron preparadas en solución externa sustituyendo equimolarmente TEA-Cl por NaCl. Materiales y Métodos 53 Figura 19. Esquema de los distintos protocolos desarrollados en los experimentos. A. Protocolo de I/V. B. Protocolo de desactivación. C. Protocolo de inactivación dependiente de voltaje. D. Protocolo de inactivación dependiente de tiempo. E. Protocolo de desinactivación. 3.3.1. Activación de las corrientes. Desde el holding potential, se dieron pulsos sucesivos de 250 ms de duración, desde -60 hasta +80 mV, con incrementos de 10 mV, con intervalos de 1.5 segundos entre los pulsos. Un esquema del protocolo se presenta en la figura 19A. Los datos de amplitud se midieron en el máximo, para generar las curvas corriente-voltaje (curvas I/V). En algunos casos la corriente se normaliza con respecto a la capacidad de la célula (en pF), obteniéndose la densidad de corriente por unidad de superficie de membrana. Cuando se estudia la inhibición de las corrientes, al aplicar determinadas drogas a las células, el porcentaje de inhibición ya sea a +20 mV o +60 mV, es calculado según la ecuación 1: '&ℎ()(*(ó& = '&'()*'+ − ',*'-" '&'()*'+ Ecuación 1. Cálculo de inhibición por drogas. Materiales y Métodos 54 3.3.2. Análisis de la conductancia. La obtención de las curvas G/V de activación se realizó mediante el cálculo la derivada de la curva I/V. La conductancia denominada chord conductance (Hodgkin & Huxley, 1952b), o conductancia de cuerda se puede obtener mediante la ecuación 2: ' = - . .− /$ 0 · 2 Ecuación 2. Ecuación que define la chord conductance. Vp representa el voltaje aplicado, I la corriente obtenida, G representa la conductancia. y EK el potencial de Nernst para el potasio, en este caso, -102.3 mV. Y así, si se tiene una relación lineal entre el voltaje y la corriente obtenida, como puede ser al caso de un canal aislado, esta ecuación sería la adecuada para obtener la conductancia, G. Esta relación no es lineal en el caso de un registro de célula completa, donde sucede la una rectificación, que determina un aumento de la pendiente, debido al mayor número de canales que se van activando, hasta alcanzar un voltaje, para el cuál se haya producido la activación de todos los canales de la membrana, y a partir de ese voltaje, el aumento de la corriente sea proporcional a la diferencia Vp-EK, y G constante. La pendiente de la relación corriente-voltaje se puede obtener mediante la derivada de la curva I/V, lo que se ha denominado slope conductance, o conductancia de la pendiente, relacionando estos valores con el voltaje al que fueron obtenidos. A partir de ahí, se obtiene la curva normalizada para el valor de máxima conductancia. Esta curva se puede ajustar a una ecuación de Boltzmann, en la forma: 2 2/"0 =1 1 + 5 1!/#21 3 Ecuación 3. Ecuación de Boltzmann. G representa la conductancia para cada voltaje, siendo Gmax, el valor más alto obtenido., V representa el voltaje aplicado, V1/2 el voltaje al cual se alcanza la mitad de conductancia máxima y k la pendiente en el punto medio de la curva. 3.3.3. Desactivación. El esquema del protocolo de pulsos generado para el estudio de la desactivación se presenta en el panel 19B. Desde un holding potential de -70 mV se dio un prepulso de 100 ms a +60 mV, para activar a todos los canales, para luego ir a potenciales desde +20 mV a -120 mV, con decrementos de 10 mV, durante 200 ms. El intervalo entre protocolos fue de 1.5 s. Materiales y Métodos 55 Las corrientes generadas durante esos 200 ms se ajustaron mediante funciones biexponenciales para obtener las taus de desactivación y el peso de cada componente. Las funciones se extrapolaron al tiempo exacto donde se produce el cambio de voltaje desde +60 mV al voltaje al que se estudia la desactivación, para medir la corriente en ese momento y realizar las correspondientes curvas I/V. 3.3.4. Inactivación dependiente de voltaje. La medición de esta propiedad se realizó siguiendo el protocolo mostrado en la figura 19C. Los prepulsos fueron desde -120 a +60 mV en incrementos de 10 mV, de 500 ms de duración, seguidos de un pulso a +60 ms de 500 ms de duración, con intervalos de 45 segundos entre los pulsos. Con este protocolo los canales se van inactivando durante el prepulso, con lo que la corriente en el pulso a +60 mV se va haciendo menor. La amplitud de la corriente normalizada a la máxima obtenida, fueron representadas respecto al voltaje del prepulso, obteniéndose así las curvas de inactivación dependiente de voltaje o h-infinito. Dichas curvas se ajustan a una ecuación de Boltzmann, siendo en este caso V1/2 el voltaje al cual la mitad de los canales se encuentran inactivados. 3.3.5. Inactivación dependiente de tiempo. Para estudiar esta propiedad se dieron pulsos de 10 s a -20, +20 y +60 mV, cada 45 segundos, según se representa en la figura 19D. La disminución de la corriente durante ese tiempo se ajustó mediante una función biexponencial para así calcular las taus de inactivación y el peso de cada uno de los componentes. 3.3.6. Desinactivación. Para estudiar la desinactivación o recuperación de la inactivación, se dió un prepulso a +20 mV durante 10 segundos, y se volvió al holding potential de -70 mV durante un tiempo variable (de 20 ms a 20 segundos), para dar un segundo pulso a +20 mV de 200 ms. El tiempo entre protocolos fue de 85 segundos. Un esquema se presenta en la figura 19E. La desinactivación se expresó como la evolución en el tiempo del cociente entre la amplitud de la corriente generada en los pulsos y el prepulso inicial. Como en los casos anteriores, esta evolución se ajustó a una función biexponencial de la que podemos obtener tanto las taus de desinactivación, como los componentes de cada t. Materiales y Métodos 56 3.4. Análisis estadístico. El programa Origin fue utilizado para el análisis de las diferencias entre los distintos resultados obtenidos para las distintas variables. Se siguieron las consiceraciones expuestas en la figura 20. Figura 20. Diagrama de flujo en el análisis estadístico. A. En el caso de ser muestras independientes. B. En el caso de ser muestras pareadas. La obtención de un valor de significación (p) mayor a 0.05 en las pruebas de normalidad significó que la variable seguía una distribución normal. En caso contrario, se rechazó dicha condición. En el resto de tests, los niveles de significación probados fueron de 0.05, 0.01 y 0.001. Se compararon los grupos siempre de dos en dos. Los resultados se expresan en este trabajo como media ± error estándar de la media (EEM), siendo n el número de células en una determinada condición. Los experimentos fueron realizados en al menos, dos cultivos diferentes. 4. Imagen 4.1. Inmunofluorescencia. Mediante inmunofluorescencia se quiso estudiar la expresión de los canales iónicos en la membrana celular. Las células usadas para inmunofluorescencia procedían de los Materiales y Métodos 57 mismos cultivos que las células donde se realizaron experimentos de electrofisiología. Las pruebas se realizaron principalmente al quinto día de cultivo. 4.1.1. Protocolo. 1) Fijación. Dependiendo de la localización del epítopo del anticuerpo, las células fueron fijadas utilizando una solución de PFA 2% durante 10 minutos (epítopo extracelular) o para epítopos intracelulares se utilizó metanol frío 80% durante 2 minutos y luego metanol frío 100% durante otros 2 minutos. Esto es así excepto para anti-KV3.3, que se fijó usando PFA 2%. 2) Lavado de las células con solución PBS 1X. Se realizaron 3 lavados, de 5 minutos cada uno, en agitación muy suave. 3) Permeabilización. Cuando se estudiaron epítopos intracelulares, se utilizó una solución permeabilizadora (ver apartado 4.1.2) durante 10 minutos. En el caso de anticuerpos con epítopos extracelulares este paso se omitió. 4) Bloqueo. Se aplicó la solución de bloqueo (ver apartado 4.1.2) durante 30 minutos. 5) Incubación con anticuerpo primario. La incubación se hizo durante 2 horas a temperatura ambiente, en una cámara húmeda oscura. La solución con anticuerpo (cuya composición fue igual para el anticuerpo primario que para el secundario) fue colocada sobre el cubreobjetos con las células, que a su vez estaba depositado sobre una moneda (cubierta con celofan) en la disposición mostrada en la figura 21. Figura 21. Montaje de la cámara húmeda. En el fondo de la cámara se disponen dos papeles mojados, para mantener la humedad. La tapa superior, también cubierta con papel de alumnio, se dispone entonces cerrando el compartimento y se cierrra el habitáculo con Parafilm. Materiales y Métodos 58 La concentración de cada anticuerpo y las características de éstos se indican en el Anexo III. 6) Lavado. Se realizaron 3 lavados, de 5 minutos cada uno, donde la composición de la solución varía según la localización del epítopo del anticuerpo y se indica en el apartado 4.1.2. 7) Incubación del anticuerpo secundario. La incubación se hizo durante 1 hora a temperatura ambiente, en una cámara húmeda oscura, siguiendo el mismo esquema de disposición que con el anticuerpo primario. Las características de cada anticuerpo y las concentraciones empleadas pueden ser consultadas en el Anexo III. 8) Lavado del anticuerpo. Se hicieron 3 lavados, de 5 minutos cada uno, con solución PBS 1X en todos los casos. 9) Montaje con medio Fluoromont G®, que contenía DAPI para teñir a los núcleos celulares. 4.1.2. Composición de soluciones. La solución común independientemente del epítopo de los anticuerpos probados fue: • PBS 1X. Los componentes son 84.9 mM Na2HPO4, 15.1 mM NaH2PO4. El pH obtenido está en torno a 7.6 y se deja así para preparar solución de fijación con PFA, mientras que se ajusta a 7.35 para los lavados. Si el epítopo era extracelular las soluciones fueron: • Fijación: PBS 1X + PFA 2%. • Solución de bloqueo: PBS 1X + BSA 3%. • Solución de anticuerpo: PBS 1X + BSA 3% + Anticuerpo según la concentración deseada. • Solución de lavado: la misma que de bloqueo. Si el epítopo era intracelular las soluciones fueron: • Fijación: metanol frío al 80% y metanol 100%. • Solución permeabilizadora: PBS 1X + Tritón X 0.1%. • Solución de bloqueo: PBS 1X + Tritón X 0.05% + BSA 3%. • Solución de anticuerpos: PBS 1X+ Tritón X 0.05% + BSA 3% + Anticuerpo según la concentración deseada. • Solución de lavado: La misma que de bloqueo. Materiales y Métodos 59 4.2. Microscopía confocal. 4.2.1. Descripción. Para la realización de los experimentos de inmunofluorescencia se utilizó un microscopio confocal Zeiss situado en las instalaciones de los Servicios Generales de Investigación de la Universidad de Sevilla, en el CITIUS. Para calcular la resolución espacial del sistema se ha aplicado el criterio de Rayleigh adaptado a microscopía confocal, según el cuál (Jerome & Price, 2018): 67 ( 9(:;<&*(<7$í&($<7<79(:;(&!>(6 ) =70.47 ∙ D4/565ó( EF Ecuación 4. Criterio de Rayleigh para microscopía confocal. l hace referencia a la longitud de onda de la luz de emisión y NA a la apertura numérica del objetivo. Además, ha sido aplicado el teorema de Nyquist para favorecer al máximo la resolución de las imágenes. El teorema dice que la frecuencia de muestreo de un objeto debe tener un intervalo al menos de 2 a 2.5 veces inferior a su tamaño. Una frecuencia menor podría impedir una buena resolución mientras que una mayor no añadiría información (Jerome & Price, 2018). Dado el límite analógico impuesto por el criterio de Rayleigh, los tamaños de pixeles elegidos fueron al menos 2.5 veces menores que éste. Los valores estimados según el teorema de Nyquist teniendo en cuenta los fluoróforos elegidos pueden ser consultados en la tabla 7. Fluoróforo Objetivo Criterio de Rayleigh (nm) Teorema de Nyquist (nm) Alexa Fluor® 555 20x 290 116-180 63x aceite 165.7 66.3-82.9 Alexa Fluor® 647 20x 332.5 133-166.3 63x aceite 190 76-95 DAPI 20x 235 94-117.5 63x aceite 134.3 53.7-67.1 Tabla 7. Valores de criterio de Rayleigh y teorema de Nyquist según los fluoróforos empleados. Materiales y Métodos 60 4.2.2. Características del equipo utilizado. A continuación, se mencionan los parámetros utilizados en la adquisición de las imágenes: • Láseres: Diodo (lexcitación: 405 nm), Argón multilínea (lexcitación: 458, 488, 514 nm), DPSS ((lexcitación: 561 nm) y HeNe ((lexcitación: 633 nm). • Objetivos: Plan-Apochromat 20x M27 (NA: 0.8) y Plan-Apochromat 63x oil DIC M27 (NA: 1.40) • Espejos dicroicos: MBS 405, 488/561 y 488/561/633 • Pinhole: 1 Airy • PMT: 900-1000 V • Adquisición de las imágenes: Smartest, de manera secuencial, donde cada fluoroforo es excitado en tracks separados, usando el menor número de estos posibles. • Average: la muestra es escaneada 4 veces y se muestra la intensidad media. • Zoom variable. • Velocidad de adquisición: 0.9-3.2 µs/píxel. • Número de píxeles por imagen: generalmente (3440 x 3440) o (2500 x 2500) para el objetivo de 20x y (1912 x 1912) o (1500 x 1500) para el objetivo de 63x aceite. 8 bits. 4.2.3. Análisis de imágenes. Las imágenes fueron adquiridas con el software Zen 2012, del microscopio Zeiss, e importadas en formato LSM. Para el análisis de las imágenes se utilizó el programa Fiji (Schindelin et al., 2012). La proporción de células marcadas se estudió en imágenes adquiridas con objetivo 20x, implementando el plugin “Cell Counter” contenido en el programa Fiji. Para realizar el contaje de las partículas, se limitó el ROI (Region of Interest) al citoplasma celular, excluyéndose las gotas lipídicas y la zona de los núcleos. A continuación, una vez conocidos los parámetros de área e intensidad, fue aplicado un umbral (threshold) igual a la media + 1SD de la intensidad, obteniéndose una imagen binaria. Seguidamente usando el comando “Analysis Particles” se estableció un rango de 0.01 µm2 en adelante, y se procedió al contaje de partículas. Con respecto a la elección del umbral, se dudó entre usar la media + 1 SD o la media + 2SD. Con 1 SD las áreas se acercan bien al número de zonas que tienen suficiente intensidad, mientras que con 2 SD se pierden muchas de estas zonas. La representación de figuras de este análisis se hizo a través del programa Origin. Materiales y Métodos 61 Información suplementaria de Materiales y Métodos Aparatos y programas A continuación, se indicarán los aparatos y programas utilizados en las diferentes técnicas. Algunos son empleados en más de una técnica, pero serán mencionados una sola vez por simplificar. Aplicación Producto Compañía Modelo Cultivo Cámara de Neubauer Paul Marienfeld GmbH & Co.KG 064011 Campana de flujo laminar FASTER S.r.l BIO-48 Centrífuga Eppendorf AG 5810R Báscula Mettler-Toledo S.A.E. PJ360 Báscula de precisión Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG Entris Baño termostático Bunsen S.A. BTG-1 pHmetro Crison pH Basic 20 Incubador Heraeus HERAcell Electrofisiología Amplificador HEKA Elektronik GmbH EPC-10 USB Cámara microscopio epifluorescencia Olympus Optical CO (Europe) GmbH DP-70 Cámara microscopio invertido Sony Group Corporation DXC-101P Estirador de pipetas List-Medical L/M-3P-A Jaula de Faraday Fabricación artesanal Mesa antivibratoria TMC Micro-g 61- 541-01 Microforja NARISHIGE Group MF-830 Micromanipulador Eppendorf AG 5171 Microscopio invertido Carl Zeiss AG Axiovert 35 Microscopio epifluorescencia Olympus Optical CO (Europe) GmbH IX50 Osmómetro Wescor, Inc 5500 Materiales y Métodos 62 Sistema de aporte de soluciones Fabricación artesanal, gravimétrico Imagen Agitador orbital Boeckel + Co (GmbH + Co) KG OS 20 Microscopio confocal Carl Zeiss AG LSM 7 DUO Placa calefactora Raypa AG-2 Tabla 1-suplementaria. Reseña de aparatos empleados. Aplicación Producto Compañía Versión Electrofisiología DP Controller Olympus Optical CO (Europe), GmbH 1.2.1.108 Origin OriginLab Corporation. 9.0.0 PatchMaster HEKA Elektronik GmbH V2x90.1 Imagen Fiji Image J, NIH Image J 1.53f51 Zen 2012 Carl Zeiss AG 8.1.0.484 Tabla 2-suplementaria. Softwares empleados en el análisis de los experimentos. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 69 de adipocitos registrados en cada día de cultivo. Esta evolución manifiesta de manera indirecta la maduración del cultivo. Figura 23. Distribución de los tipos morfológicos en las células registradas. A. Porcentaje de células registradas por día con baja insulina. B Igual que A en alta insulina. C. Número de células registradas en baja insulina. D. Igual que C en alta insulina. Los datos expresados en la figura 23, aún representando la realidad de lo realizado, se deben a la elección de células por parte del investigador, por lo que para conocer la evolución real de los tres tipos celulares a lo largo del cultivo, se realizó en dos cultivos, un recuento de todas las células por día de cultivo. El número de células contadas fue de 6948 con baja insulina y de 10.827 en alta insulina. La proporción entre los tipos celulares se mantuvo a lo largo del cultivo, siendo el grupo M1 el más abundante en ambas concentraciones de insulina. En el caso de 10 µUI (figura 24A) a partir del sexto día, dichas M1 redujeron su porcentaje ligeramente a la vez que las M2 y M3 los aumentaron. En 100 µUI (figura 24B), las proporciones de los tres grupos permanecieron estables, aunque el porcentaje de células M1 fue menor que con baja insulina. Sin embargo, contando el número de células de cada tipo (figura 24C y 24D), en baja insulina se observa un aumento en todos los grupos morfológicos hasta el sexto día, mientras que en alta insulina, se parte de un mayor número de células de todos los tipos mofológicos, alcanzándose el máximo antes (al cuarto día), y manteniéndose hasta el sexto día. A partir del séptimo día, en ambas concentraciones de insulina ocurrió una reducción del número de los tres tipos Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 70 morfológicos. Resulta interesante que, el número máximo de células de tipo M1 alcanzado fue similar en ambas concentraciones de insulina. Figura 24. Distribución diaria del número de células contabilizadas y tipos morfológicos encontrados en 10 y 100 µUI de insulina. A. Distribución del número de células registradas. B. Proporción de los tipos morfológicos registrados. C. Distribución de células contadas. D. Proporción de los tipos morfológicos contados. El contaje fue realizado en dos cultivos, utilizando 4 areas distintas, en dos cubres disintos, cada día. Los cambios en el número de células, comparados con la estabilidad en la proporción diaria de cada grupo morfológico estarían en contra de la conversión entre los tipos morfológicos, ya que, de haberla, por ejemplo, de M3 a M1, un decremento de las primeras iría acompañado por un incremento de las segundas, hecho que no sucede. Esta cierta independencia entre los tipos también se infiere de la estabilidad de los porcentajes de cada tipo celular a lo largo del cultivo (paneles 24A y 24B). Esto puede ser debido a la existencia de tres tipos distintos de adipocitos (Raajendiran et al., 2019), los cuales parecen tener funcionalidades diferentes dentro del tejido adiposo dados sus perfiles metabólicos y endocrinos. 2. La concentración de insulina afecta a las propiedades pasivas de los adipocitos blancos. Este laboratorio ya había señalado que la insulina inducía un aumento de la densidad de canales de potasio y la diferenciación hacia adipocitos en los cultivos (Ramírez- Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 71 Ponce et al., 2002). Por ello, una de las primeras pruebas realizadas fue comprobar si la concentración de insulina podría modular el tamaño de los adipocitos. La capacidad específica de las membranas es una propiedad que se asume constante, asumiéndose 1 µF por cm2 de superficie (Curtis & Cole, 1937; Hodgkin et al., 1952). Como reflejan las figuras 25A y 25B, las células presentan gran variabilidad de valores, y un tamaño medio menor con baja insulina, (45.06 ± 0.99 pF, n=360) respecto a alta insulina (67.93 ± 1.63 pF, n=320), resultando esta diferencia significativa (p<0.001, U-Mann Whitney). Este incremento en el tamaño ocurrió en una proporción parecida en los tres tipos morfológicos. Otra propiedad pasiva estudiada fue la resistencia de membrana, cuyos valores se representan en histogramas de los paneles 25C y 25D. La media de dicha propiedad fue similar entre las concentraciones de insulina, 0.42 ± 0.09 GW (10 µUI, n= 360) respecto a 0.42 ± 0.11 GW (100 µUI, n=320). No obstante, se observa que, en baja insulina (panel 25C) las células se concentran en torno a 0.4 GW con una distribución más o menos simétrica, mientras que en alta insulina (figura 24D) los valores se encuentran más dispersos, no observándose un agrupamiento claro. Contrariamente a lo que se podía esperar (Sperelakis, 2012), las células con valores de capacidad mayores no presentaron resistencias de membrana menores en ninguna concentración de insulina, como señalan los paneles 25E y 25F, sino que hay una gran variabilidad. Tampoco hubo diferencia de resistencia de membrana entre los tres grupos morfológicos. La resistencia de membrana es inversamente proporcional a las corrientes de fuga o leakage de las células. De este modo, se puede medir la resistencia específica de las células (resistencia de membrana por unidad de capacidad) para comprobar si las corrientes de fuga cambian dependiendo de la insulina. Se obtuvo que, en 10 µUI las células tuvieron una resistencia específica mayor (10.90 ± 0.35 MW/pF, n=360) que en 100 µUI (7.36 ± 0.29 MW/pF, n=320), siendo las medias significativamente diferentes entre sí (p<0.01, U-Mann Whitney). De lo anterior se deduce que la densidad de canales de fuga es menor en las células cultivadas con 10 µUI. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 72 Figura 25. Efecto de la insulina en la capacidad y resistencia de membrana de los adipocitos. A y B. Histograma de la capacidad con 10 100 µUI de insulina, respectivamente. C. y D. Histograma de la resistencia de membrana con 10 y 100 µUI de insulina, respectivamente. E. Correlación entre la capacidad y la resistencia de membrana de las células en presencia de 10 µUI. F. Lo mismo que en E, para 10 y 100 µUI superpuestas. Cada punto representa una célula independiente. En el caso de A. y C, n=360; para B y D, n=320. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 73 3. Las células con 10 µUI presentan menores corrientes y densidades de corriente, que con 100 µUI. Se había mostrado anteriormente (Ramirez-Ponce et al., 2002) que en presencia de insulina en el cultivo, las células poseían mayores corrientes que en cultivos sin la hormona. En este trabajo, se ha querido estudiar el efecto de dos concentraciones de la hormona que pudieran simular los estados basales de individuos con un peso normal e individuos obesos. En las figuras 26A y 26B se presentan los registros de dos células típicas en ambas concentraciones de insulina, donde se puede apreciar la diferente amplitud que se suele registrar. El umbral de activación de las corrientes, en las células con 10 µUI (figura 26C) presentaron unos valores más positivos (-20.78 ± 0.33 mV, n=360) que aquellas con 100 µUI (-22.28 ± 0.37 mV, n=320), siendo esta diferencia significativa (p<0.01, U-Mann Whitney). Como señala la gráfica I/V de la figura 26C, las corrientes son menores con 10 µUI, siendo significativa estadísticamente la diferencia en el rango de -10 a +80 mV (p<0.001, U-Mann Whitney). Por ejemplo, a +60 mV, las células con baja insulina presentaron unas corrientes medias de 1.80 ± 0.06 nA (n= 360) respecto a las de alta insulina, de 3.25 ± 0.12 nA (n= 320). Analizando la densidad de corriente (figura 26D), igualmente con 10 µUI las células manifestaron valores menores, obteniéndose una diferencia significativa en el rango de 0 a +80 mV (p<0.001, U-Mann Whitney). Tomando de nuevo +60 mV, se obtiene que la densidad de corriente media con baja insulina fue de 40.39 ± 1.08 pA/pF (n=360) frente a 49.27 ± 1.49 pA/pF (n=320) con alta insulina. La diferencia en la densidad de corriente entre las dos concentraciones de insulina fue menor que en las corrientes totales. Esto es debido al aumento de superficie (y por tanto de capacidad) que ocurre en alta insulina, según se ha comentado antes. No obstante, el aumento de corriente, no depende sólo del aumento de superficie, como se puede observar en los paneles 26E y 26F, donde para un mismo tamaño celular, se pueden un amplio rango de corrientes. Multiplicándose el valor de la corriente por la resistencia de membrana, se obtienen los milivoltios que el potencial de membrana se desplazaría como respuesta a esa corriente. En este caso, al ser las corrientes hacia afuera, la respuesta sería un potencial más negativo. Si se toma la corriente a -20 mV, dado que es el valor más cercano al potencial de membrana del adipocito (Ramirez-Ponce et al., 1990), se obtuvo que con baja insulina los desplazamientos de voltaje serían menores (16.29 ± 1.09 mV, n=360) que con alta insulina (25.92 ± 1.66 mV, n=320) siendo esta diferencia significativa (p<0.001, U-Mann Whitney). Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 74 Figura 26. Efecto de la concentración de insulina en la amplitud y densidad de las corrientes. A. Registros de una célula cultivada en 10 µUI de insulina. B. En 100 µUI de insulina. C. Gráfica I/V de la amplitud media de las corrientes con ambas concentraciones de insulina. D. Densidad de corriente media en 10 y 100 µUI. E. Correlación entre la corriente de las células a +60 mV y la capacidad de éstas, en 10 µUI. F. Lo mismo que E, para 10 y 100 µUI superpuestas. Las flechas indican la capacidad media de las células en cada tipo de insulina. Cada punto representa una célula independiente. En C. y D. se indica la media ± EEM de 10 µUI de insulina (n=360) y 100 µUI de insulina (n=320). *** indica significancia estadística de p<0.001, calculada mediante el test de U-Mann Whitney. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 75 4. Activación de las corrientes. 4.1. La conductancia de las células presenta distintas fases. Para estudiar la conductancia de las corrientes se utilizaron los mismos registros que para hacer las gráficas I/V. A partir de dichas gráficas, fue calculada la slope conductance, según se ha explicado en el apartado de Materiales y Métodos, para trazar las curvas G/V. Un ejemplo representativo de curva G/V, se muestra en la figura 27A. Se observa que desde -60 a +50 mV se pueden ajustar los puntos a una sigmoide, cuyo V1/2 de activación es -9.35 mV y pendiente (k) de 11.04 mV/e-fold, con una bondad del ajuste, con chi2, de 0.996. Desde +60 a +80 mV hay una disminución de la conductancia, la cual podría ser originada por una saturación de los canales, como sucede con algunos canales de K+ (Friederich et al., 2003; Yeung et al., 2005). No obstante, al fijarse detalladamente en la curva se advierte que no pasa por algunos puntos como pueden ser -30 ó +10 mV. Reanalizando los puntos de la gráfica, se observa que en el intervalo de -60 a +50 mV, podrían existir dos fases sigmoideas (figura 27B), representadas en colores rosa (V1/2 = -12.95 mV, k = 8.05 mV/e-fold) y verde (V1/2 = +16.9 mV, k = 5.80 mV/e-fold) y con unos ajustes incluso algo mejores (chi2 de 0.997 y 0.996 para la primera y segunda fase, respectivamente). Si se representan en una simulación estas nuevas sigmoides de forma independiente (figura 27C) se distingue mejor la diferencia de V1/2 y k entre ellas. Si se suman estas sigmoides como muestra la figura 27D la nueva curva resultante perdería la forma de cada una de las fases que la constituyen y podría asumirse que se trata de una única sigmoide, cuyos parámetros (V1/2 = -7.39 mV y k =11.68 mV/e-fold) se asemejan a los obtenidos en la figura 27A. No se puede descartar por tanto la posible existencia de varias fases dentro de una curva G/V, sobre todo cuando a partir de un cierto voltaje la pendiente no sigue disminuyendo o incluso aumenta. La presencia de una primera fase sigmoidea fue confirmada en la práctica totalidad de las células, situándose el máximo de la curva en valores que iban de –10 a +30 mV. La existencia de una segunda fase con forma sigmoidea como la mostrada en el panel 27B fue más excepcional, apareciendo en el 21.4% de las células con baja insulina y el 26.9% con alta insulina. En el resto de las células, esta segunda fase adoptó formas distintas que no podían ser ajustadas a ningún tipo de función. Por ello, se decidió estudiar el comportamiento de las primeras fases de las curvas G/V, las cuales eran las más fiables de ajustar mediante una ecuación de Boltzmann y estaban presentes en todas las células. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 76 Figura 27. La activación de las corrientes puede presentar varias fases. A. Curva G/V de una célula con ajuste de una sigmoide en la fase de subida B. La misma célula anterior, con un ajuste de dos fases, señaladas en rosa y verde. C. Representación de las dos fases señaladas en B. D. Suma de las sigmoides mostradas en C. En todos los casos, las líneas continuas representan ajustes realizados mediante la ecuación de Boltzmann. 4.2. Los parámetros de activación no difieren entre las concentraciones de insulina. Los V1/2 de activación de las células fueron muy variables, tanto en baja como en alta insulina, como muestran los histogramas de la figura 28. Con un bin de 0.5 mV, con 10 µUI (panel 28A) se pudieron distinguir siete picos (-6.4, -10.25, -12.25, -13.75, -17.25, - 19.25 y -21.25 mV), con un valor similar a otros siete picos encontrados en 100 µUI (panel 28B) (-5.75, -9.75, -12.25, -14.75, -16.1, -18.5 y -20.25 mV). Asimismo, al analizar las k de las G/V con un bin de 0.5 mV/ e-fold, se diferenciaron con baja insulina (panel 28C) dos picos en el histograma (5.8 y 6.8 mV/e-fold) mientras que con alta insulina (figura 28D) se encontraron tres (5.8, 6.8 y 7.8 mV/e-fold). Tomadas en su conjunto, ni las medias de V1/2 de activación ni las k fueron significativamente diferentes entre baja (V1/2 = -13.97 ± 0.34 mV y k= 6.25 ± 0.09 mV/e-fold, n=276) y alta insulina (V1/2 = -14.73 ± 0.31 mV y k= 6.26 ± 0.09 mV/e-fold, n=264). Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 77 Figura 28. Distribución de los valores de V1/2 de activación y k en presencia de distintas concentraciones de insulina. A. Histograma de V1/2 de activación de células con 10 µUI de insulina. B. Igual en 100 µUI de insulina. C y D. Histograma de k de células con 10 y D. 100 µUI de insulina, respectivamente. Para 10 µUI, n=276 y para 100 µUI, n=264. Como se ha comentado anteriormente, el máximo al que puede llegar la primera fase de las curvas de conductancia oscilaba de -10 a +30 mV. No obstante, más del 70% de las células tuvo su máximo en valores de 0 ó +10 mV, en proporciones muy similares en ambas concentraciones de insulina (figura 29A). La variabilidad en el máximo de la curva de activación puede ser debida a tres factores: cambios en el umbral, en los V1/2 y/o en las pendientes (k) de las curvas G/V. Tanto los V1/2 (figura 29B) como las k (figura 29C) presentan una gran dispersión en sus valores, aunque se puede apreciar que, en la evolución de las medias, cuanto más positiva es la V1/2, más positivo es el máximo alcanzado en la primera fase. Asimismo, cuanto mayor es el valor de k (lo que implica una menor pendiente), más positivo es el máximo. En la tabla 8, se pueden encontrar los valores de estas medias, así como el del voltaje de activación, que también es más positivo, cuanto más positivo es el máximo de la primera fase. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 78 Figura 29. Valor máximo de activación de la primera fase. A. Distribución del máximo en ambas concentraciones de insulina. B. Relación entre el máximo de activación y el V1/2. C. Relación entre el máximo de activación y el valor de k, de la primera fase de activación. Cada punto representa una célula independiente. Para 10 µUI, n=276 y para 100 µUI, n=264. Máximo activación (mV) Insulina ( µ UI/ml) Umbral (mV) V1/2 activación (mV) k (mV/e-fold) n -10 10 -24.44 ± 1.76 -22.87 ± 1.02 4.00 ± 0.69 9 100 -29.23 ± 1.78 -25.92 ± 1.06 4.90 ± 0.45 13 0 10 -23.85 ± 0.58 -18.29 ± 0.38 5.29 ± 0.12 96 100 -24.32 ± 0.52 -18.19 ± 0.27 5.48 ± 0.12 81 +10 10 -20.28 ± 0.50*** -12.65 ± 0.37* 6.34 ± 0.09 107 100 -22.84 ± 0.52 -13.53 ± 0.26 6.35 ± 0.11 116 +20 10 -20.54 ± 0.78 -9.03 ± 0.55 7.63 ± 0.14 56 100 -22.22 ± 0.95 -10.14 ± 0.56 7.37 ± 0.19 46 +30 10 -21.25 ± 3.50 -4.39 ± 1.65 9.58 ± 0.45 8 100 -23.75 ± 2.63 -5.48 ± 2.13 8.91 ± 0.71 8 Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 85 grupos, sí destaca como la proporción de células de tipo A-tardía fue mayor en células cultivadas con baja insulina (44.6% en 10 µUI frente a 24.2% en 100 µUI), mientras que con alta insulina resulta más abundante el tipo C de inactivación (9.5% para 10 µUI y 24.2% para 100 µUI). Los parámetros de V1/2 de inactivación y pendiente (k), de los distintos tipos se exponen en la tabla 10. Las mayores diferencias se generan entre el V1/2 de los subgrupos temprana y tardía, tanto en el tipo A, como en el tipo B. Entre concentraciones de insulina, únicamente es destacable la diferencia en el porcentaje de inactivación dependiente de voltaje, siendo esta diferencia mayor en células del tipo A. Un fenómeno muy interesante que se puede apreciar en las gráficas de h-infinito, es que a veces presentan la llamada “curvatura en U”, clara por ejemplo en las figuras 33A, B, C y E. Esta curva es una disminución de la inactivación a voltajes más positivos, lo que hace que la gráfica se “levante” de manera que dibuja una forma de U. Así, la mayor inactivación se da en voltajes intermedios más que en voltajes altos (Cheng, Azer et al., 2011). El valor de esta curvatura se calcula como el cociente entre el porcentaje de inactivación a +60 mV y el porcentaje máximo alcanzado por la inactivación, dándose en porcentaje, considerándose que existe la curvatura si se supera el 5%. Es reseñable la diferencia en la proporción de células que presentan esta característica entre las dos concentraciones de insulina: 47.95% de las células cultivadas con baja insulina frente a 80.30% de las células cultivadas con alta insulina. Se estudió si existía relación entre la curvatura en U medida en la inactivación dependiente de voltaje y la segunda fase de activación de la curva G/V, dado que ambos fenómenos ocurren a voltajes bastante positivos. La amplitud de esta segunda fase, se midió, como el cociente entre la máxima corriente alcanzada y el máximo de la primera fase. Así un cociente de 1.2, implica una fase que representa el 20 %, de la activación total. Se midió entonces la curvatura en U, según se ha mencionado antes, en el voltaje en el que se había obtenido la máxima activación. La segunda fase de la G/V fue proporcionalmente mayor que la curvatura en U tanto en 10 µUI (27.15 ± 2.71 y 18.94 ± 2.94%, para uno y otro fenómeno, n=22, p<0.05, U-Mann Whitney) como en 100 µUI (25.41 ± 3.06 y 13.16 ± 1.34%, n=32, p<0.01, U-Mann Whitney). Debido a lo anterior, parte de la segunda fase de la G/V, podría estar originada por la disminución en inactivación, que genera la curvatura en U, no obstante, no existe una buena correlación entre la amplitud de ambos fenómenos. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 86 Tipo de h-inf Insulina ( µ UI/ml) V1/2 inactivación (mV) k(mV/e-fold) Inactivación máxima (%) Recuperación curvatura U (%) Células con curvatura U (%) n A-temprana 10 -27.90 ± 0.72 6.54 ± 0.31 71.84 ± 5.71* 56.60 ± 40.72 20.00 10 100 -26.42 ± 0.47 6.45 ± 0.27 55.48 ± 4.56 24.79 ± 3.37 87.50 16 A-tardía 10 -21.98 ± 0.57 6.16 ± 0.12 65.36 ± 2.99†† 26.91 ± 2.57 45.45 33 100 -21.40 ± 0.38 5.97 ± 0.18 47.86 ± 4.65 19.73 ± 2.45 93.75 16 B-temprana 10 -32.49 ± 1.11 6.06 ± 0.24 71.70 ± 5.74 38.70 ± 6.58 54.55 11 100 -31.59 ± 0.91 6.14 ± 0.27 63.00 ± 8.83 26.27 ± 4.59 71.43 7 B-tardía 10 -22.06 ± 0.66 5.74 ± 0.29 59.17 ± 6.68 13.39 ± 1.83 38.46 13 100 -23.69 ± 0.79 5.39 ± 0.37 58.15 ± 6.74 19.38 ± 2.44 54.55 11 C (primera fase) 10 -81.73 ± 6.09 3.21 ± 1.09 8.94 ± 2.19 - - 7 100 -78.28 ± 5.03 5.03 ± 0.63 7.19 ± 2.01 - - 16 C (segunda fase) 10 -23.93 ± 1.28 5.49 ± 0.57 47.31 ± 9.73 6.13 ± 3.00 85.71 7 100 -23.18 ± 1.94 6.05 ± 0.35 39.91 ± 5.48 10.96 ± 1.69 81.25 16 Tabla 10. Parámetros de la inactivación dependiente de voltaje en presencia de baja y alta insulina. Los datos se representan como media ± EEM, n indica el número de células. * y † denotan significancia estadística respecto a la otra concentración de insulina, calculada mediante U- Mann Whitney y T-Student, respectivamente. Así: *, (p<0.05); †† (p<0.01). Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 87 Examinando la influencia de los grupos morfológicos descritos en el apartado 1 en las diferentes características de la inactivación dependiente de tiempo (figura 34), se obtuvo que, aunque no había diferencia entre estos en 10 µUI de insulina (panel 34A), sí la había de forma estadísticamente significativa, en 100 µUI, aumentando de M1 a M3 (panel 34B). Figura 34. Máxima inactivación dependiente de voltaje en los tres grupos morfológicos. A. En baja insulina. En alta insulina. El número que aparece en cada barra indica el n de los grupos. † denota significancia estadística calculada mediante T-Student. Así: †(p<0.05) y ††† (p<0.001). 7. La inactivación dependiente de tiempo en células cultivadas en baja insulina es más rápida que en células cultivadas con alta insulina. Para estudiar la inactivación dependiente de tiempo se dieron pulsos despolarizantes a tres voltajes distintos (-20, +20 y +60 mV) durante 10 segundos, los cuales permiten la inactivación casi total de las corrientes. La evolución temporal de las corrientes se ajustó mediante funciones biexponenciales. Cuando uno de los componentes de dicho ajuste era menor del 5% se consideró a la caída monoexponencial. Un ejemplo típico de registro en cada concentración de insulina se puede observar en la figura 35. Figura 35. Inactivación dependiente de tiempo. A. En 10 µUI de insulina. B. En 100 µUI de insulina. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 88 La distribución de estas taus obtenidas a +20 mV y +60 mV se representan en las figuras 36 y 38 respectivamente. Así, se refleja como a +20 mV, en baja insulina (panel 36A) el histograma de las t1 presenta cuatro picos (0.087, 0.137, 0.212 y 0.337 s), mientras que con alta insulina (panel 36B) la distribución de esta tau contiene dos picos, (0.162 y 0.737 s). En el caso de la t2, las células en 10 µUI (panel 36C) muestran tres picos (1.37, 2.37 y 3.37 s) frente a los tres picos que presentan las células con 100 µUI como se observa en el panel 36D (0.875, 1.87, 2.62 s). A este voltaje se distingue como, globalmente, las t1 de 10 µUI tienen una media significativamente más rápida que en 100 µUI (0.22 ± 0.02 s, n=59 y 0.36 ± 0.05 s, n=41, respectivamente; p<0.05, U-Mann Whitney), al contrario que las t2, ligeramente superiores para 10 µUI (3.45 ± 0.25 s, n=42) con respecto a 100 µUI (2.68 ± 0.22, n=57) siendo diferentes también (p<0.01, U-Mann Whitney). Figura 36. Distribución de taus de inactivación a +20 mV en distintas concentraciones de insulina. A. Histograma de t1 de células cultivadas en 10 µUI de insulina (n=60) B. Lo mismo en 100 µUI de insulina (n=41). C y D. Histograma de t2 de células cultivadas en 10 (n=42) y 100 µUI de insulina (n=57), respectivamente. Aunque los registros se intentaron ajustar mediante funciones biexponenciales, en algunos casos el programa generaba dos taus iguales, es decir un ajuste monoexponencial. Así, a +20 mV, con 10 µUI, el 40.54% de las células presentan sólo la t1, rápida, frente a 100 µUI, donde el porcentaje se reduce al 4.89%. Por otra parte, Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 89 en el mismo voltaje, con baja concentración de insulina, el 13.33% de las células tuvieron sólo t2, lenta, respecto al 31.58% de las células en esta circunstancia con alta concentración de insulina. Dado que en algunos canales se han descrito dos e incluso 3 taus de la inactivación dependientes de tiempo, se quiso analizar si las taus que se presentaban aisladas, eran distintas de las que se presentaban acompañadas de otra tau. Si eran distintas, en el caso de otras dos taus acompañadas en un ajuste podrían representar un canal con dos taus de inactivación. Por otro lado, si la tau que se presentaba aislada, coincidía con alguna de las taus acompañadas, éstas podrían representar dos canales, más que un canal con dos taus de inactivación. La separación de t1 y t2, según si se presentaron solas o en compañía de otra tau se muestra en la figura 37. Con baja insulina se obtuvo que la t1 presentada sola (panel 37A) tenía una media de 0.159 ± 0.04 s (n=20), mientras que cuando dicha t1 se acompañaba de otra tau, (panel 37C), su valor era de 0.256 ± 0.02 s (n=39), siendo significativa la diferencia (p<0.001, U-Mann Whitney). Cuando ambas t1 (las que se presentan solas y las que no) se representan superpuestas (panel 37C), se observa como las t1 aisladas forman el primer pico de la distribución general. Analizando el mismo problema con t2 en 100 µUI, se encuentra que la media de las t2 que aparecen aisladas (2.79 ± 0.30 s, n=18) (panel 37B), no se diferencia (U-Mann Whitney) de las t2 que aparecen con otra tau 2 (2.63 ± 0.29 s, n=39), (panel 37D). Como se observa en el panel 37F, esto se debe a que el grupo de las t2 aisladas, se integran en la distribución de las t2 acompañadas. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 90 Figura 37. Valores de las taus de inactivación dependiente del tiempo, según se presenten solas o acompañadas por otra tau. A, C y E. Distribución de t1 única, acompañada y con ambas distribuciones superpuestas. B, D y F. Distribución de t2 única, acompañada y con ambas distribuciones superpuestas. t1 se presenta en células cultivadas en 10 µUI de insulina, n = 21. t2 se presenta en células en 100 µUI de insulina, n= 39. Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 91 Por otra parte, en la figura 38, a +60 mV, en células de 10 µUI se observa que las t1 (panel 37A) presentan 3 picos en su distribución (0.052, 0.157, 0.297 s) frente a las células de 100 µUI (panel 38B), que presentan cuatro picos mucho menos definidos (0.157, 0.227, 0.367 y 0.472 s). Por otra parte, el estudio de las t2 las células con baja insulina (panel 38C) muestran 3 picos (2.85, 4.35 y 6.75 s) en contraste con los dos picos poco claros de las células de alta insulina que refleja el panel 38D (2.55 y 3.45 s). Como sucedía en el caso anterior, la media de las t1 es más rápida en baja insulina (0.261 ± 0.03 s, n=57) que en con alta (0.39 ± 0.04 s, n=43), siendo significativa la diferencia (p<0.01, U-Mann Whitney) mientras que las t2 presentan valores más lentos en células de 10 µUI (4.43 ± 0.29 s, n=47), que en 100 µUI (3.33 ± 0.18 s, n=55), resultando también significativa dicha diferencia (p<0.001, U-Mann Whitney). Figura 38. Distribución de taus de inactivación a +60 mV en distintas concentraciones de insulina. A y B. Histograma de t1 de células cultivadas en 10 (n=59) y 100 (n=43) µUI de insulina respectivamente. C y D. Histograma de t2 en células cultivadas en 10 (n=46) y 100 (n=55) µUI de insulina, respectivamente. A este voltaje sucede un hecho similar al que ocurría a +20 mV, donde existen células donde únicamente aparece una de las dos taus o ambas. Así, con 10 µUI, el 29.82% de las células únicamente presentan t1, rápida, frente al 0% de células con 100 µUI. Por otra parte, el 14.89% de las células de baja insulina tienen sólo t2, lenta, respecto al 21.8% de las células de alta insulina. El valor de las t1 de 10 µUI aisladas (0.17 ± Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 92 0.05 s, n=17) es significativamente menor (p<0.001, U-Mann Whitney) que cuando las taus se presentan acompañadas (0.32 ± 0.04 s, n=40). Contrariamente, las t2 de 100 µUI no son diferentes (U-Mann Whitney) si se presentan solas (3.46 ± 0.31 s, n=12) o acompañadas de otra tau (3.29 ± 0.21 s, n=43). Además del valor de las dos taus, rápida y lenta, es importante conocer la proporción de cada una de ellas en la corriente, para conocer la función exponencial. Como ilustran la figura 39A y 39B el peso del componente A1, que multiplica en la función a la t1, es significativamente mayor (p<0.001, U-Mann Whitney) en las células de 10 µUI que en las de 100 µUI, tanto a +20 mV (66.57 ± 4.09% frente a 36.55 ± 3.96%, n=65 y n=59, respectivamente, figura 39A) como a +60 mV (64.03 ± 4.05% frente a 34.07 ± 3.49%, n=64 y n=55, respectivamente, figura 39B). Por tanto, parece que la mayor rapidez en la inactivación dependiente del tiempo en las células en 10 µUI, se debe a una mayor proporción de t1 (más aún de manera aislada) y a que ésta es más rápida en esta concentración, según se ha expuesto antes. Por otro lado, la mayor lentitud en 100 µUI, se debería, sobre todo a que la t2, representa un mayor peso (A2), en esta concentración, que en la figura 39A y 39B, viene expresado por la disminución de A1, pues entre ambas suman el 100 % de la corriente. En un trabajo previo (Pérez-Verdaguer et al., 2018) se utilizó como medida de la inactivación el porcentaje de la caída de corriente al final de un pulso de 250 ms respecto al pico de corriente. Esa duración de pulso se aproxima al rango temporal de la t1 y por ello se decidió comprobar si dicho porcentaje de inactivación a 250 ms podría tener alguna correlación con el valor de la t1 (figura 39). Como se muestra, tanto en 10 µUI (panel 39C) como en 100 µUI (panel 39D) no hay demasiada correlación entre estos parámetros, aunque hay una tendencia a que porcentajes de inactivación menores se dan con taus de mayor duración. Por otro lado, si se correlaciona el porcentaje de inactivación a 250 ms frente al peso del componente A1 se obtiene que con baja insulina (panel 39E), el mayor peso del componente, se asocia a un porcentaje de inactivación mayor (coeficiente de correlación de Pearson, r = 0.919). En alta insulina (panel 39F), la correlación no es tan buena (r = 0.709). Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 93 Figura 39. Participación del componente A1 de la función exponencial de la inactivación dependiente del tiempo, en el porcentaje de inactivación observado en pulsos de 250 ms. A y B. Comparación del peso del componente A1 a +20 mV y +60 mV, respectivamente, en ambas concentraciones de insulina. El número incluido en las barras representa n. C y D. Correlación entre el porcentaje de inactivación durante 250 ms frente a la t1 en células con baja y alta insulina, respectivamente. E. Correlación entre el porcentaje de inactivación a +60 mV durante 250 ms frente al peso de A1 en células con baja insulina. F. Igual en alta insulina. Las líneas azules indican el ajuste a una función lineal. En A y B, *** denota estadísticamente significativo con p<0.001 calculada mediante U-Mann Whitney. En C a F, cada punto representa una célula. Por otra parte, se hizo una correlación entre el porcentaje de inactivación durante los 500 ms del pulso del h-infinito, dado a +60 mV desde un prepulso de -70 mV, con la Resultados. Bloque I: Propiedades biofísicas 94 máxima inactivación obtenida dependiente del voltaje (figura 40). Se obtuvo que en ambas concentraciones de insulina (paneles 40A y 40B), ambas inactivaciones (voltaje y tiempo dependientes) presentan una correlación muy alta con valores del coeficiente de Pearson superiores a 0.9. Por otro lado, si se correlaciona la inactivación dependiente de tiempo a +60 mV, no con la máxima inactivación dependiente de voltaje, sino con la obtenida con el prepulso a +60 mV (paneles 40C y 40D, la correlación es aún mayor y muy cercana a 1, por lo que parecería que la inactivación dependiente de volaje, juega un papel muy importante en la inactivación dependiente de tiempo, incluído el efecto de la curvatura en U, cuando ésta ocurre. Figura 40. Relación de la inactivación dependiente de tiempo y de voltaje. A y B. Correlación del porcentaje de inactivación en a 500 ms a +60 mV frente al máximo de inactivación dependiente de voltaje en presencia de 10 µUI y 100 µUI de insulina, respectivamente. C y D. Correlación del porcentaje de inactivación en a 500 ms a +60 mV frente a la inactivación dependiente de voltaje, con un prepulso a +60 mV con baja y alta insulina, respectivamente. Cada punto representa una célula. Las líneas azules y moradas indican el ajuste a una función lineal. En las gráficas se indica el coeficiente de correlación de Pearson, r, de cada ajuste. 8. Desinactivación de los canales en baja y alta insulina. El último proceso biofísico que se estudió fue la deinactivación. El protocolo consistió en un pulso de 10 s a +20 mV, seguido de pulsos de 250 ms al mismo voltaje, a distintos tiempos desde la finalización del primero, para estudiar la recuperación en el tiempo de la corriente. Esta recuperación sigue una forma exponencial que de nuevo, Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 101 Además de estos experimentos con cambios de flujo, se hicieron otros experimentos controles en células en 10 µUI de insulina, para estudiar el posible rundown o disminución de la amplitud de la corriente, al sustituir la solución de la pipeta el medio intracelular (Hattori et al., 2003). En ellos, se dieron protocolos I/V cada dos minutos, hasta un total de 16 minutos, en ausencia de fármaco o cambio de flujo (figura 44). Como se puede observar, la pérdida de corriente a los 16 minutos fue a +20 mV del 4.98 ± 2.23% y a +60 mV del 1.63 ± 1.86% (n=28), aunque los cambios ocurrieron sobre todo en los primeros 8 minutos. No hubo diferencias significativas entre voltajes (T-Student para muestras pareadas). Como se puede apreciar, la media del efecto a este tiempo es significativamente menor que la sufrida cuando se dan cambios en el flujo (tabla 11), indicando que estos últimos son debidos a algo distinto al posible rundown de la corriente, aunque pueden formar parte de los cambios observados. Hay que mencionar, que en el caso de los experimentos de flujo y de todos los demás presentados en esta memoria, se esperó a que la amplitud de las corrientes fuese estable, lo que sucedió generalmente en el rango de 6 a 8 minutos. Figura 44. Cambios en la amplitud de la corriente en ausencia de droga ni cambios de flujo. A y B. Distribución media de pérdida en la amplitud de la corriente a +20 mV y a +60 mV, respectivamente. Se representa la media ± EEM de 28 células cultivadas con 10 µUI de insulina. Debido al efecto producido por el cambio de flujo, los porcentajes de inhibición obtenidos con cada una de las drogas tienen un cierto grado de incertidumbre. En la figura 45A se representa una célula con canales KvX, los cuales se inhibirían de manera reversible por el flujo y canales KvY, bloqueados de manera selectiva por una droga. En este caso, el efecto bloqueante obtenido estaría sobreestimado, ya que, además de perderse la corriente de los canles sensibles a la droga, también se perdería la de los canales sensibles al flujo. Para saber el efecto real de la droga sobre KvY habría que restar del efecto inhibitorio medido, el efecto del flujo sobre KvX. Sin embargo, también podría suceder la situación que ilustra la figura 45B, donde una célula posee canales KvX sensibles a flujos pero que también lo son a la droga. Entonces, no habría que restar nada al valor de inhibición obtenido con la droga. Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 102 Figura 45. El cambio de flujo puede producir un error en la medida del efecto de un bloqueante. A. Al aplicar una droga, no sólo se bloquean los canales sensibles a ella, sino también los sensibles al flujo. B. En el otro extremo, todos los canales que bloquea la droga, son sensibles al cambio de flujo. Para cada droga, el comportamiento de las células puede localizarse entre uno y otro extremo, por lo que siempre será indicado de qué forma se ha obtenido cada efecto indicado. 1.2. Cambios en la capacidad eléctrica de las células. Como se comentó en Materiales y Métodos, el amplificador EPC-10 permite una monitorización constante de la capacidad de la membrana celular. Se apreciaron cambios en la capacidad celular en los experimentos de farmacología, por lo que se quiso conocer en qué medida se podían deber también a los cambios de flujo, o incluso simplemente al hecho de estar la célula siendo registrada. En experimentos realizados sin cambio de flujo, como los expresados en la figura 46, hubo una pequeña, pero progresiva pérdida de capacidad que a los 16 minutos era del 2.43 ± 0.67% (n=28). Parece que la capacidad desciende en dos fases, alcanzando una meseta a los 8 minutos y otra a los 14 minutos. Como sucedía con la corriente, el rango de efecto fue variable, desde disminuir un 7.89% a aumentar un 6.65%. Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 103 Figura 46. Cambios en la capacidad eléctrica con el tiempo de registro. Pérdidas de capacidad de las mismas células que la figura 44. Se conoce que los adipocitos poseen en su membrana una gran cantidad de caveolas (Pilch & Liu, 2011). Es posible que estas caveolas puedan sufrir procesos de endocitosis-exocitosis (Fagerholm et al., 2009), subyacentes a los cambios mostrados. Y en las caveolas se ha demostrado la presencia de canales (Maguy et al., 2006; Pérez-Verdaguer et al., 2018). Debido a lo anterior, los cambios de capacidad también introducen un grado de incertidumbre en los datos obtenidos para el efecto de los distintos bloqueantes. La figura 47A muestra una posibilidad en la que una célula presenta canales fuera de las caveolas, KvY, sensibles a un fármaco, mientras que dentro de la caveola se encuentran canales KvZ, no sensibles. Al realizar el experimento, además del efecto inhibitorio de la droga, habría un efecto de reducción de la corriente si los canales que estaban dentro de la caveola han sido endocitados. En este caso, habría que restarle al efecto obtenido, la capacidad perdida para obtener el efecto real inhibitorio. Otra situación se muestra en la figura 47B, donde los canales sensibles a la droga, KvY, se encuentran en las caveolas, mientras que fuera habría otros canales, KvZ, insensibles a la droga. Tras la aplicación del fármaco, los canales localizados en el interior de las caveolas son bloqueados y posteriormente endocitados. En este caso, no se debería restar del efecto inhibitorio obtenido, la pérdida de capacidad. Otra posibilidad es que la aplicación de la droga origine un aumento de la capacidad (por aumento de la exocitosis) y en ese caso habría que sumar el porcentaje de aumento de la capacidad al porcentaje de inhibición de la corriente, pero esto se da en muy pocas ocasiones y de hecho, se tiene en cuenta si ocurre en una célula determinada, como se comentará más adelante. Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 104 Figura 47. El cambio de flujo produce una alteración en los valores de la capacidad celular. A. Al someter a la célula al efecto del flujo, se puede provocar que determinados canales como los KVZ sean endocitados, por lo que habría que reducir el efecto de esta pérdida de capacidad al bloqueo. B. En este caso los canales que son endocitados son también sensible a la droga (KVY), por lo que no habría que sustraer el efecto del flujo. Según se ha comentado, en los valores de pérdida de corriente anteriormente tabulados, puede influir esta pérdida de capacidad, que también ocurre. En concreto, en la tabla 12, se muestran los cambios de capacidad registrados mientras se realizaban los experimentos de la tabla 11. No se indican dos voltajes, porque la pérdida se registra de forma común para todos los voltajes de un protocolo. Insulina ( µ UI/mL) % pérdida de capacidad flujo=0 mL/h % pérdida de capacidad a flujo=5 mL/h % pérdida de capacidad a flujo=60 mL/h 10 3.63 ± 1.16 (6) 4.86 ± 1.62 (7) 2.79 ± 0.91 (6) 100 5.99 ± 0.39 (5) 5.56 ± 1.29 (5) 3.93 ± 2.08 (6) Tabla 12. Porcentaje de capacidad perdida por el cambio de flujo en las diferentes situaciones. Se expresa la media ± EEM. Entre paréntesis se indica el n de cada experimento. Con las tablas 11 y 12, se obtiene la tabla 13, en la que aparece el efecto en la amplitud de las corrientes que podemos atribuir al cambio de flujo en la camara de Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 105 registro, aislándolo del efecto paralelo en la capacidad. En cada célula, se tendrá en cuenta los valores de esta tabla y el cambio específico que ocurra es esa célula durante el experimento. Como no podemos conocer qué proporción de canales se encuentra en las caveolas, el efecto de los fármacos será reflejado de dos maneras: el obtenido restándole el efecto del flujo y también, teniendo en cuenta el cambio de capacidad específico de cada célula. Voltaje (mV) Insulina ( µ UI/ml) % pérdida de corriente, corregido por la capacidad, a flujo=0 ml/h % pérdida de corriente, corregido por la capacidad, a flujo=5 ml/h % pérdida de corriente, corregido por la capacidad, a flujo=60 ml/h +20 10 10.84 ± 1.22 (6) 9.61 ± 1.51 (7) 3.58 ± 2.29 (6) 100 11.46 ± 2.55 (5) 6.22 ± 3.69 (5) 0.33 ± 4.54 (6) +60 10 6.94 ± 0.77 (6) 5.33 ± 2.30 (7) 2.22 ± 2.05 (6) 100 5.36 ± 1.74 (5) 2.49 ± 2.54 (5) -0.20 ± 3.10 (6) Tabla 13. Corriente perdida por el cambio de flujo en los diferentes métodos teniendo en cuenta la pérdida de capacidad. Se expresa la media ± EEM. Entre paréntesis se indica el n de cada experimento. En la reversibilidad de los fármacos, se considerará reversible cuando la diferencia de amplitud de corriente entre el control y el lavado no supere el 10%, teniendo en cuenta el porcentaje de variación de la capacidad. 2. La inhibición por TEA presenta dos fases y es muy similar entre ambas concentraciones de insulina. El tetraetilamonio (TEA) es un inhibidor inespecífico clásico de canales de potasio (Stühmer et al., 1989). El efecto de esta droga en el tejido adiposo ha sido estudiado a 5 mM (Ramısrez-Ponce et al., 1996) y 50 mM (Ramirez-Ponce et al., 2002). En este último trabajo se trazó una curva dosis-respuesta de adipocitos cultivados en 100 µUI de insulina, y el valor de IC50 obtenido fue 2.35 mM. En esta tesis, se ha estudiado el efecto de esta droga, para un rango amplio de concentraciones, en ambas concentraciones de insulina. Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 106 Figura 48. Curva dosis-respuesta del TEA a +60 mV en presencia de 10 y 100 µUI de insulina. A. Curva con valores del efecto medido. B. Curva de valores, habiéndose sustraído el efecto del flujo. C. Curva de valores sustrayendo el efecto del flujo y de la capacidad de cada célula. En esta última pueden aislarse dos fases, en ambas concentraciones de insulina. El n de cada concentración de droga probada varió entre 4 y 25. La curva dosis-respuesta, a +60 mV, se muestra en la figura 48. Se observa que en los efectos obtenidos en 10 µUI de insulina (panel 48A) se produce un salto entre 100 nM y 1 µM, pudiéndose trazar una única curva desde 1 µM a 50 mM. Sin embargo, en 100 µUI de insulina, pueden trazarse dos curvas, una desde 10 nM a 100 µM y otra desde 10 µM a 50 mM. Cuando es sustraído el efecto del flujo (panel 48B), sigue existiendo un salto en 10 µUI. Por otra parte, en alta insulina, la primera curva se reduce considerablemente, siendo ajustable la curva que va de 10 µM a 50 mM. Finalmente, teniendo en cuenta el efecto del flujo y la capacidad (panel 48C), se obtienen dos curvas claras en ambas concentraciones de insulina, desde 10 nM a 100 µM y de 10 µM a 50 mM La primera, representa una IC50 casi diez veces mayor en 10 µUI (0.54 ± 0.20 µM) que en 100 µUI de insulina (3.95 µM ± 0.99 µM). No se encuentran en la literatura sensibilidades tan altas a esta droga en canales dependientes de voltaje, considerándose la familia KV3 como de las más sensibles, con IC50 en torno a los 100 µM (De Miera et al., 1992; Rettig et al., 1992). La segunda fase que abarca desde 10 µM a 50 mM, posee valores algo inferiores de IC50 en baja insulina respecto a la alta, concretamente 1.69 ± 0.31 mM y 2.00 ± 0.17 mM. Dicho valor se aproxima a lo encontrado para el canal KV2.1 (Patel et al., 1997) y KV2.2 (Schmalz et al., 1998). Se advierte además que hay un porcentaje de corriente Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 107 resistente a TEA 50 mM, en torno al 20%, que podría corresponder con canales como KV1.2 (Colinas et al., 2008), KV1.5 (Grissmer et al., 1994) o KV4.3 (Hopkins, 1998). Figura 49. Efecto y reversibilidad del TEA a +20 mV en baja y alta insulina. A y B. En 10 µUI de insulina. C y D. En 100 µUI de insulina. Cada ejemplo corresponde a una célula distinta. Respecto a la dependencia del voltaje del efecto, en células cultivadas con baja insulina sólo hubo una diferencia significativa entre los efectos a +20 mV y +60 mV en la aplicación de 1 µM (p<0.05, T-Student para muestras pareadas). En células cultivadas con alta insulina la única dosis a la que hubo diferencia significativa fue 50 mM (p<0.001, T-Student para muestras pareadas). En este sentido, con pulsos a +20 mV, la primera fase de la curva dosis-respuesta tuvo valores de IC50 de 0.11 ± 1.30 µM y 7.75 ± 0.53 µM para 10 y 100 µUI, respectivamente. Por otra parte, la segunda fase presentó valores de IC50 de 1.71 ± 0.14 mM para baja insulina y de 1.85 ± 0.07 mM para alta insulina. Una muestra de registros con esta droga en ambas concentraciones de insulina se muestra en la figura 49, en presencia de 10 µM (paneles 49A y 49C), y 10 mM TEA (paneles 49B y 49D). 3. La margatoxina (MgTX) en ambas concentraciones de insulina, presenta resultados similares a 1 nM, pero no a 10 nM. La margatoxina (MgTX) es un péptido de 39 aminoácidos purificado en 1993 a partir del veneno del escorpión americano Centruroides margaritatus (Garcia-Calvo et al., Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 108 1993). En ese trabajo, se destaca que la afinidad de la droga es principalmente hacia el KV1.3 (30 pM) y KV1.6 (5 nM). Sin embargo, también KV1.1 y KV1.2 son sensibles a esta droga, con IC50 de 1.72 nM y 6.35 pM, respectivamente (Bartok et al., 2014). Figura 50. Efecto de la MgTX 1 nM, a +20 mV en 100 µUI de insulina. A. Efecto inicial medido. B. Efecto tras restar el efecto del flujo. C. Restando el efecto del flujo y la capacidad. El n fue 12. En el caso de los adipocitos, la aplicación de la droga busca revelar el porcentaje de KV1.3 responsable de las corrientes, ya que se sabe que es uno de los canales presentes en la célula y con funciones relevantes en el metabolismo celular (Xu et al., 2004; Pérez-Verdaguer et al., 2018). Anteriormente fue aplicada a concentraciones de 10 y 100 nM, obteniéndose a +60 mV resultados en torno al 15% en ambos casos, (Pérez-Verdaguer et al., 2018). El efecto de la droga en las corrientes de los adipocitos se muestra en el panel A de la figura 50. En el panel 50B considerando el efecto del flujo y en el 50C, considerando, además, el posible efecto del cambio de la capacidad en cada célula. En este último panel se distinguen diferentes zonas. Una con valores francamente negativos, que pueden corresponder a células que no tengan canales sensibles ni a la droga ni al flujo, y que, por tanto, deberían encontrarse en valores cercanos al 0 % (pero se les ha restado el efecto del flujo). Otra zona, con valores cercanos al 0%, que pueden ser células que, aún teniendo canales sensibles al flujo, no lo tienen a la droga, y al Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 109 sustraerles el efecto del flujo y la capacidad, el efecto es cercano al 0%. La determinación del rango de esa zona se realizó tomando los valores de dicha población aislada y calculando la desviación estándar (SD), en este caso del 2.198%. Cogiendo el doble de la SD, a ambos lados del 0%, según el concepto de desviación estándar, se abarcaría el 95% de los valores del grupo. En este caso, se consideraría que del -4.4% al 4.4%, no hay en realidad efecto. Por encima del límite superior (4.4%), se considera que hay efecto causado por la droga. MgTX 1 nM MgTX 10 nM Voltaje (mV) Insulina ( µ UI/ml) % inhibición con flujo % inhibición con flujo y capacidad n % inhibición con flujo % inhibición con flujo y capacidad n +20 10 13.16 ± 3.12 12.89 ± 2.75 5 15.11 ± 2.49 14.59 ± 2.28 11 100 10.31 ± 2.51 10.63 ± 6.27 5 33.73 ± 9.03 27.50 ± 7.54 12 +60 10 17.43 ± 2.39 17.15 ± 1.96* 5 14.83 ± 2.71 14.32 ± 2.48 11 100 8.29 ± 2.44 8.61 ± 9.71 5 26.00 ± 6.18 19.78 ± 4.51 12 Tabla 14. Efecto de la MgTX a 1 y 10 nM, en las distintas concentraciones de insulina. Se expresa la media ± EEM. * denota significanción estadística de p<0.05, calculada mediante U- Mann Whitney, con el otro par de insulina. Tomando estas consideraciones, se obtiene que al aplicar MgTX 1 nM, sólo el 35.7% (5 de 14) y el 41.7% (5 de 12) de las células cultivadas con 10 y 100 µUI de insulina fueron sensibles a la droga. Al subir la concentración a MgTX 10 nM, los porcentajes aumentaron, siendo sensibles el 55% (11 de 20) de las células con baja insulina y el 70.6% (12 de 17) de las células con alta insulina. Al desconocer la localización de los canales afectados por la droga (si es dentro o fuera de una caveola endocitada), se expone en la tabla 14 el cálculo de los efectos considerando únicamente el flujo y, por otro lado, considerando también, la capacidad perdida por cada célula. En células cultivadas con baja insulina, a +20 mV, 1 nM de MgTX produjo un bloqueo de las corrientes, considerando flujo y capacidad, del 12.89 ± 2.75%. Incrementando diez veces la dosis (10 nM) el efecto es muy similar, 14.59 ± 2.27%. En presencia de alta insulina, al mismo voltaje, la MgTX causó una inhibición de las corrientes del 10.63 ± 6.27% y 27.50 ± 7.54% para 1 nM y 10 nM, respectivamente. El efecto de 1 nM, a pesar de ser algo menor que con 10 µUI de insulina, no resulta estadísticamente significativa (T-Student). El efecto de 10 nM es claramente superior en 100 µUI de insulina, sin embargo, esta diferencia tampoco resulta significativamente distinta (T- Student). Esto se debe, sobre todo, a un rango de efecto muy grande en esta situación, del 5.71 al 80.3%. Es interesante mencionar que en esta concentración de insulina las células con efectos mayores del 20% tuvieron una inactivación mayor del 30% en un pulso de 250 ms, con taus en el rango de 52 a 238.6 ms. En cualquier Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 110 caso, este efecto del 27% es bastante superior al obtenido con baja insulina, lo que lleva a plantear la posible existencia de heterotetrámeros en alta insulina, o bien a la presencia de otros canales sensibles a la droga, como son el KV1.1. Ejemplos representativos de todas las condiciones se muestran en la figura 51. Para esta droga, el bloqueo a +60 mV fue similar, ya que solamente apareció algo de dependencia del voltaje en el efecto de MgTX 10 nM en células cultivadas en 100 µUI (p<0.05, prueba de los rangos con signo de Wilcoxon). La MgTX 1 nM causó una inhibición de las corrientes del 17.15 ± 1.96% y de 8.61 ± 0.97% para baja y alta insulina respectivamente, siendo significativa dicha diferencia (p<0.05, U-Mann Whitney). En el caso de MgTX 10 nM, el bloqueo fue de 14.32 ± 2.48% y 19.78 ± 4.51 para 10 y 100 µUI respectivamente, no siendo significativa la diferencia (U-Mann Whitney). . Figura 51. Efecto y reversibilidad de la MgTX a +20 mV. A y B. Ejemplos de inhibición por MgTX 1 nM y 10 nM en células de 10 µUI de insulina. C y D. Igual en células de 100 µUI. 4. El Psora-4 presenta un efecto ligeramente superior en células cultivadas con baja insulina. El 4-(4-fenilbutoxi)-7H-furo[3,2-g][1]benzopiran-7-ona más conocido como Psora-4, es una molécula pequeña, diseñada en 2004 a partir de un psoraleno, el 5- metoxipsoraleno (5-MOP) (Vennekamp et al., 2004). Su síntesis buscaba lograr un inhibidor de KV1.3 muy específico (IC50 de 2.9 nM), aunque el KV1.5 posee también una afinidad bastante alta, 7.7 nM. A pesar de esto, la afinidad por KV1.3 sigue siendo Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 117 Figura 55. Efecto de GxTX-1E en 100 µUI. A. Ejemplo del efecto a 2 nM. B. Ejemplo del efecto a 20 nM. En ambos casos, los ejemplos corresponden a pulsos de +60 mV. Resulta interesante mencionar cómo 20 nM GxTX-1E puede generar distintos efectos a bajos voltajes, lo que se muestra en la figura 56. En unos casos, que han sido denominados tipo A, el bloqueo que se producía permite ver una corriente hacia dentro o tipo inward, hasta aproximadamente +40 mV (panel 56A). Las células de este grupo, no se han incluido en la tabla 18, pues no sepuede saber el porcentaje de bloqueo que ha conseguido la droga, al resultar en una corriente inward. En otros casos, denominados tipo B, aún siendo el bloqueo muy grande a voltajes bajos, permite la aparición de la corriente al mismo voltaje o con un desplazamiento de 10 mV (cuadro inserto en el panel 56B). Por último, en los casos que hemos denominado de tipo C, la aparición de la corriente en presencia de la droga, no se produce hasta aproximadamente 40 mV más positivos que la corriente inicial (cuadro inserto en el panel 56C). La proporción de bloqueos de tipo A, B y C, se muestra en el panel 56E, en negro y rojo, para 10 y 100 µUI, respectivamente. Destaca el tipo A como más abundante (46.2% de las células con baja insulina y 61.1% de las células con alta insulina). Por otra parte, con 2 nM GxTX-1E el bloqueo presentó siempre una forma parecida que se muestra en el panel 56D. Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 118 Figura 56. Efectos de GxTX-1E 20 nM, vistos en las curvas I/V. A. Ejemplo con corriente hacia adentro. B. Célula con gran inhibición de la corriente, pero umbral cercano al control. C. Célula con umbral de activación 50 mV más positivo que el control. D. Ejemplo de curva I/V en una célula con GxTX-1E 2 nM. E. Porcentaje de células de cada tipo de inhibición (A, B o C) de GxTX-1E 20 nM en ambas concentraciones de insulina. En cada barra se indica el n de cada grupo, incluído en la barra. Los insertos en cada caso permiten visualizar mejor el efecto a voltajes bajos. En los casos de A-C se trata de ejemplos de células cultivadas con alta insulina, mientras que D es un ejemplo en baja insulina. Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 119 7.1. La aplicación GxTX-1E favorece la obtención de corrientes de tipo inward. Como se ha comentado antes con la aplicación de GxTX-1E 20 nM se observó una corriente inward en 6 de 13 células en 10 µUI de insulina y en 11 de 18 células en 100 µUI de insulina. En el bloque anterior se expuso, cómo se obtenía una corriente inward, al establecer un holding potential de -100 mV. No obstante, sin ninguna droga y con un holding potential de -70 mV el 8.3% de células con baja insulina y el 9.4% de células con alta insulina mostraban este tipo de corriente. Además, en alta insulina, hubo un aumento de la amplitud del pico máximo de la corriente inward pasando de - 23.65 ± 2.99 pA a -63.77 ± 12.18 pA, siendo significativa la diferencia (p<0.05, T- Student). Figura 57. La GxTX-1E permite revelar la presencia de una corriente inward. A. Ejemplo de I/V de una célula en la que al aplicarse GxTX-1E 20 nM aparece una corriente inward. B. Registros obtenidos de la misma célula a +20 mV. C. Ejemplo de I/V de una célula en que se observa la aplicación de GxTX-1E 20 nM con distintos holdings potentials. D. Registros obtenidos de la misma célula que C a +30 mV. En ambos casos se trata de células cultivadas en 100 µUI. Al potencial de -70 mV, en presencia de 20 nM GxTX-1E, las corrientes inward se observan en un porcentaje superior incluso que a -100 mV sin droga, y además se pueden analizar con mayor detalle, como se en la figura 57. En la gráfica I/V se pueden observar dos fases como las que se presentan en el panel 57A, una desde -40 a 0 mV y otra desde aquí, en general de mayor amplitud, y que termina en +30 o + 40 Resultados. Bloque II: Caracterización farmacológica de los canales 120 mV, debido a que es contrabalanceada por la corriente de potasio activada. En el panel 57B se ilustra el registro de la corriente en su pico máximo, a +20 mV. En 3 células cultivadas en 100 µUI de insulina en las que se obtuvo inward y se probaron holding potentials de -70 y -90 mV, la amplitud del pico máximo pasó de - 80.9 ± 26.21 a -224.23 ± 79.61 pA, respectivamente, no siendo estadísticamente significativa la diferencia entre ambos (T-Student). Un ejemplo de estas corrientes se muestra en los paneles 567C y 57D. Desde el potencial de -90 mV, además de aumentar la amplitud de las dos fases anteriormente descritas, se obtuvo una tercera entre -60 y -40 mV (panel 57C). Estas dos fases desde -60 a -40 mV y desde -40 hacia adelante se pueden observar también en células sin bloqueo por GxTX-1E, registradas desde un potencial de -100 mV, mencionadas en el bloque anterior. La tercera fase no se puede obtener sin bloquear las corrientes de potasio, pues en los voltajes en los que se desarrolla, la corriente outward es superior a la inward. Para estudiar la participación de canales de calcio dependientes de voltaje (CaV) en la corriente inward se hicieron dos tipos de experimentos, en presencia de GxTX-1E 20 nM. En el primero se aumentó la concentración de calcio desde 2.5 a 10 mM (sustituyendo equimolarmente por NaCl) y no se obtuvo ningún efecto claro de incremento de la corriente. En el segundo, en este caso, con una solución interna con 10 mM Na, se sustituyó el calcio externo por 10 mM Ba y tampoco se obtuvo ninguna diferencia clara. De estos experimentos se deduce que el calcio no parece participar en esta corriente inward, a pesar de presentar las corrientes una morfología muy parecida a la generada por los canales de CaV de tipo L. 121 Bloque III: Caracterización mediante anticuerpos de los canales Resultados. Bloque III: Caracterización mediante anticuerpos de los canales 122 1. La expresión es similar entre los distintos canales y concentraciones de insulina. Para conocer el porcentaje de células que expresaba un determinado canal se utilizó la técnica de inmunofluorescencia mediante microscopía confocal, según se ha descrito en Materiales y Métodos. El resumen de las características de los anticuerpos utilizados puede ser consultadas en el Anexo III. Para los canales KV1.3, KV1.5, KV2.1 y KV4.2 fueron probados más de un tipo de anticuerpo. Los detalles de los anticuerpos descartados se pueden consultar en la tabla 19. En los utilizados, además de la intensidad de la señal, se tuvo en cuenta la calidad de los controles negativos. Como ejemplo, se muestran en la figura 58 los casos de anti-KV1.1 (panel 58A) y anti-KV1.2 (panel 58C) y sus respectivas muestras sin anticuerpo primario (paneles 58B y 58D). Canal Compañía Referencia catálogo Causa descarte KV1.3 Alomone APC-101 Señal muy débil Neuromab 75-009 Señal muy débil, inespecífica Santa Cruz Biotechnology sc-398855 Señal muy débil, inespecífica KV1.5 Alomone APC-150 Señal inespecífica KV2.1 Neuromab 75-159 Señal muy débil KV4.2 Santa Cruz Biotechnology sc-390571 No hay señal Tabla 19. Anticuerpos descartados durante las pruebas de inmunofluorescencia. Resultados. Bloque III: Caracterización mediante anticuerpos de los canales 123 Figura 58. Visualización del marcaje con anticuerpos usando un objetivo 20x. A. Células marcadas con anti-KV1.1. B. Células marcadas sin primario. C. Células marcadas con anti- KV1.2. D. Células marcadas sin primario. A y B corresponden a células cultivadas en 10 µUI mientras que C y D son células cultivadas en 100 µUI de insulina. El anticuerpo secundario fue Alexa Fluor® 555. En azul, aparecen los núcleos marcados con DAPI. La barra indica 50 µm. El contaje de células marcadas se hizo en imágenes obtenidas con un objetivo de 20x. Para ello se tuvieron en cuenta al menos 2 cultivos diferentes, pudiéndose analizar más de una imagen del mismo cultivo y teniendo vistas como mínimo, 50 células. El n al que se hará referencia a continuación indica el número de cultivos estudiados. El porcentaje de expresión de cada canal se muestra en la figura 59. Así, se observa como en 10 µUI los canales más expresados fueron KV1.5 (96.99 ± 1.05%, n=2), KV2.2 (93.52 ± 1.99%, n=2) y KV3.3 (87.12 ± 12.89%, n=4) y los que menos KV1.4 (47.80 ± 3.18%, n=2) y KV4.2 (53.16 ± 4.19%, n=3). Por otra parte, en células cultivadas en 100 µUI los más abundantes fueron el KCa1.1 (95.24 ± 4.76%, n=3), KV2.2 (94.78 ± 1.55%, n=2) y KV2.1 (94.74 ± 2.96%, n=3) y los que menos se expresan coinciden con la otra concentración de insulina, KV1.4 (52.89 ± 5.53%, n=2) y KV4.2 (70.71 ± 8.19%, n=3). Resultados. Bloque III: Caracterización mediante anticuerpos de los canales 124 Los porcentajes de expresión no resultaron estadísticamente diferentes entre las concentraciones de insulina. Figura 59. Porcentaje de células que expresan los distintos canales en ambas concentraciones de insulina. El contaje se hizo al menos en dos cultivos y contando al menos 50 células. 2. Se distinguen acúmulos en el citoplasma cuyo número varía según el canal identificado. Como se ha visto en la figura 59, la expresión es bastante alta en casi todos los canales. Resulta destacable la similitud del patrón de expresión, independientemente de la concentración de insulina utilizada en el cultivo. Dentro de un mismo campo la intensidad de la señal difiere entre las células, siendo a veces prácticamente imperceptible, mientras que en otras es claramente visible. Se observa marcaje tanto en citoplasma como cerca de la en membrana, siendo imposible distinguir ésta última. Sobresale la presencia de determinados acúmulos (o clusters) en el citoplasma. A veces se alternan zonas con y sin señal. La zona más cercana a las gotas de grasa, especialmente si estas son de pequeño tamaño, también suelen tener una señal más intensa. La presencia de DAPI en el medio de montaje ha permitido revelar la existencia de más de un núcleo en algunos adipocitos, frecuentemente de tipo M2 o M3 Aunque la concentración de anticuerpo utilizada a veces puede parecer alta, tanto con anti-KV1.4 como anti-KV4.2 necesitaron niveles de láser cercanos al 100% para obtener una señal óptima, mientras que para el resto de los canales el rango utilizado fue del 0.5 al 5%. Resultados. Bloque III: Caracterización mediante anticuerpos de los canales 125 En la figura 60 se muestra la señal obtenida de anticuerpos contra KV1.3 (panel 60A), KV1.5 (panel 60B) y KV2.1 (panel 60C). En el primer caso, se advierte en la ampliación (panel 60D), una zona con mayor intensidad de marcaje, cercana a la membrana plasmática, pero como se comentó en Materiales y Método, no podemos saber la distanci a la misma. En esta célula se aprecian dos núcleos. En los panels 60E y 60F (KV1.5 y KV2.1), se aprecia como la señal aparece en clusters o pequeñas vesículas, y que en algunos casos parecen rodear a las vesículas lipídicas (panel 59F). Este patrón de distribución en acúmulos, que aparece para todos los canales, ha sido mostrado anteriormente en el marcaje de KV1.3 (Li, Wang & Desir et al., 2006; Pérez-Verdaguer et al., 2018) y KV2.1(Scannevin et al., 1996; Bishop et al., 2015). Figura 60. Expresión de distintos canales en los adipocitos, visualizada con objetivo de aceite 63x. A. Célula marcada con anti-KV1.3. B. Célula marcada con anti-KV1.5. C. Célula marcada con anti-KV2.1. Los cuadrados amarillos indican zonas, que se muestran ampliadas en D, E y F. Todos los ejemplos son células cultivadas con 100 µUI de insulina. En A y B el anticuerpo secundario utilizado fue Alexa Fluor® 555, mientras que en C fue Alexa Fluor® 647. En azul, el marcaje de los núcleos usando DAPI. La barra indica 10 µm, en A-C y 5 µm en D-F. Ejemplos de imágenes obtenidas con otros anticuerpos que presentaron una buena señal se muestra en la figura 61. En el caso de KV2.2 (panel 61A), de nuevo se pueden observar en su ampliación (panel 61D), algunos acúmulos que están al menos muy próximos a la membrana plasmática. El marcaje de KV3.3 (paneles 61B y 61E) y KCa1.1 (paneles 61C y 61F) muestran, por otro lado, ejemplos de alternancia en las zonas de citoplasma marcadas. Resultados. Bloque III: Caracterización mediante anticuerpos de los canales 126 Figura 61. Expresión de distintos canales en los adipocitos, con objetivo de aceite 63x. A. Célula marcada con anti-KV2.2, B. Célula marcada con anti-KV3.3. C. Célula marcada con anti- KCa1.1. Los cuadrados amarillos indican las zonas que se muestran ampliadas en D, E y F. Todos los ejemplos son células cultivadas con 10 µUI de insulina. En A y C el anticuerpo secundario utilizado fue Alexa Fluor® 555, mientras que en B fue Alexa Fluor® 647. En azul, marcaje de núcleos usando DAPI. La barra indica, 10 µm en A-C, y 5 µm en D-F. Pero la membrana plasmática tiene un grosor de unos 4 nm, y la resolución del objetivo empleado de 63x, con una apertura numérica de 1.4, es de 166 y 190 nm, dependiendo del fluoróforo utilizado (según se indica en Material y Métodos) por lo que nuestra resolución está lejos de poder conocer la proximidad de los acúmulos a la membrana plasmática o a la membrana de las vesículas. Siguiendo el análisis del laboratorio de Trimmer (Bishop et al., 2015), se hizo una medida del coeficiente de variación, CV, (desviación estándar/media) de la intensidad de la señal en los pixeles. Así, las células que tuvieran mayores zonas con acúmulos de canal deberían mostrar mayores valores de CV que las que no lo tuvieran (Bishop et al., 2015). Las medidas se realizaron en imágenes adquiridas con el objetivo de aceite 63x, sin utilizar el área de las gotas de grasa que presentara el citoplasma celular. Para KV1.4 y KV4.2 no se presentan medidas ya que la debilidad de la señal impidió adquirir fotos con el objetivo mencionado. Los resultados del CV medio se muestran en la figura 62. Como se puede apreciar, el patrón de señal fue bastante uniforme en ambas concentraciones de insulina. Únicamente hubo diferencias significativas entre éstas al estudiar el CV de KV1.1 (p<0.01, T-Student), KV1.2 (p<0.05, U-Mann Whitney) y KV1.3 (p<0.05, T-Student), aunque los valores fueron también altos en KV2.1 y KV3.3. Discusión 133 Bloque I- Propiedades biofísicas 1. Morfología celular. Desde el punto de vista morfológico se han encontrado tres tipos de células, como reflejan las figuras 22, 23 y 24. La clasificación de distintos tipos de adipocitos blancos, concretamente en el epidídimo, no es nueva (Björntorp et al., 1979). Sin embargo, recientemente se ha relacionado estos subtipos con un origen diferencial desde las células precursoras de adipocitos (APC, por sus siglas en inglés), donde según su respuesta a la estimulación por forskolina (Min et al., 2019) se han distinguido dos tipos de APC. En las mismas células precursoras, la presencia o ausencia de moléculas CD34 concretas en la membrana (Raajendiran et al., 2019), determinaban tres tipos de adipocitos distintos. Esta variabilidad ha sido incluso confirmada mediante la generación de líneas inmortales de preadipocitos, las cuales presentaban tres subtipos diferentes basados en sus características genéticas y metabólicas (Lee et al., 2019). De cualquier modo, no sólo los adipocitos blancos presentan subtipos, también se ha encontrado este fenómeno en los adipocitos marrones (Karlina et al., 2021). Estos antecedentes apoyan la idea planteada a partir de la figura 24 de que los tipos M1, M2 y M3 son adipocitos diferentes entre sí, y que no resultan de la maduración de un tipo hacia otro. Respecto al desarrollo temporal del cultivo, no se distingue demasiado de otros casos (Shimizu et al., 2006). Es destacable el hecho de que, en las figuras 24C y 24D el número máximo total de células que logran los cultivos sea similar independientemente de la concentración de insulina. Aunque podría pensarse que se debe a una inhibición por contacto, en el caso de la línea inmortal de los adipocitos, 3T3-L1, esta inhibición es requisito necesario para una mayor diferenciación posterior de las células (Guo et al., 2009), suceso que aquí no sucede porque a pesar de que el número de células va menguando, los distintos tipos morfológicos se mantienen. Sin embargo, una acidificación del medio de cultivo con el paso de los días por la expulsión de lactato e inhibición de la bomba H+-ATPasa, como sucede con líneas cancerígenas (Montcourrier et al., 1997) sí podría causar una reducción en la cantidad de células. Se sabe que la expulsión de ácidos grasos al exterior por parte de los adipocitos acidifica el medio externo (Meisner & Tenney, 1977; Civelek et al., 1996), lo que causa una inhibición de captación de glucosa, lipogénesis y secreción de leptina (Teta et al., 2003). Esta disfuncionalidad anabólica generada por la acidosis se confirmó en células 3T3-F442A, a las cuales el bajo pH les impide su conversión a 3T3-L1 (Kuri-Harcuch & Green, 1981). El pH en las células puede ser sensado, por los canales ASIC (Boscardin et al., 2016), los cuales no se han descrito en adipocitos. Pero no son los únicos canales sensibles a pH (Holzer, 2009), ya que miembros de la familia TRPV, tales como TRPV1 (Zhang et al., 2007; Dhaka et al., 2009), TRPV4 (Suzuki et al., 2003; Ye et al., 2012) y TRPC5 (Semtner et al., 2007; Sukumar et al., 2012), así como canales KV como el KV1.5 (Trapani and Korn, 2003; Pérez-Verdaguer et al., 2018) y KV1.3 (Xu et al., 2004; Somodi et al., 2008), todos ellos presentes en adipocitos, son capaces de sensar cambios de pH y modularse por estos. Además, en el caso del Discusión 134 KV1.3, su papel en la apoptosis es conocido además de por su presencia en las mitocondrias (Kovach et al., 2016), por su implicación en el llamado eje KV1.3- caveolina-mitocondria (Capera, Pérez-Verdaguer, Peruzzo et al., 2021), donde una mutación el dominio CBD del KV1.3 por el que se une a la caveolina o una deficiencia de ésta, provoca un aumento de apoptosis celular. En este sentido, la acidificación externa es un factor desencadenante de la apoptosis en líneas cancerígenas (Yeo et al., 2004) y neutrófilos (Cao et al., 2015). No sólo eso, sino que la acumulación de glucosa externa, proceso que ya se ha comentado que puede suceder en adipocitos sometidos a bajo pH (Teta et al., 2003), puede general un mal funcionamiento de las mitocondrias y con ello, de nuevo, inducción a la muerte celular (Trudeau et al., 2011). Por último, hay que tener en cuenta que las células diferenciadas son más susceptibles de apoptosis que las indiferenciadas (Papineau et al., 2003). De hecho, en individuos obesos la tasa de células pro-apoptóticas es mayor que en individuos sanos, lo que conlleva a la inducción de un fenotipo inflamatorio por reclutamiento de macrófagos (Alkhouri et al., 2010). El mayor número de gotas de grasa en las células denominadas M3 podría llevar a pensar que éstas se tratasen de adipocitos marrones, o incluso de tipo beige, los cuales fueron descubiertos precisamente en el epidídimo (Petrovic et al., 2010). Sin embargo, por estudios posteriores se determinó que el tejido graso que rodea a las gónadas es el que menor porcentaje de células adiposas marrones contiene (Zhang et al., 2018), y además, no se dan las condiciones de inducción a tejido de tipo marrón o beige (Maurer et al., 2021), como son el frío o la presencia de drogas inductoras de PPARg, p.ej. la rosiglitazona. Sí es cierto que en determinadas condiciones, con temperaturas superiores a 30ºC y dieta rica en grasas y carbohidratos, los adipocitos marrones adquieren características morfológicas más típicas de los blancos, aún conservando la expresión de UCP1 (de Jong et al., 2019). 2. Propiedades pasivas. Las figuras 25A y B muestra que la membrana de las células cultivadas con alta insulina presenta mayor capacidad eléctrica. El hecho de que la insulina favorece el crecimiento de las células fue algo demostrado por este laboratorio (Ramirez-Ponce et al., 2002), donde se observó que las células cultivadas con insulina eran más grandes y con mayor densidad de corriente que las que no la tenían. Esto es debido al papel como factor proliferativo, de crecimiento y supervivencia de esta hormona, más aún en el adipocito, donde su rol es esencial (Czech et al., 2013). A pesar de los tamaños mayores, la resistencia de membrana fue similar entre concentraciones de insulina, como indican los paneles 25C y 25D. El cálculo de la resistencia específica (resistencia membrana/capacitancia) revela, que ésta es menor en células cultivadas con alta insulina y dicho valor, conlleva una mayor densidad de canales de fuga. Podría pensarse pues, que esta resistencia de membrana se mantiene con distintos tamaños, mediante el cambio en la densidad de canales de fuga. La regulación de estos canales por insulina está poco estudiada, pero se sabe que en pacientes con hiperinsulinismo congénito la expresión y localización de estos canales se encuentra alterada, en especial TWIK-1 (Adams, 2011). Discusión 135 En un trabajo anterior de este grupo (Pérez-Verdaguer et al., 2018) se mostró como las células cultivadas con 10 y 100 µUI de insulina presentaban valores medios de capacidad en torno a 35 y 45 pF, respectivamente. Esta diferencia respecto a lo obtenido en la tesis presente, así como otras que se irán comentando a lo largo de esta Discusión puede ser debida al cambio de suero en ambos trabajos. Mientras que en el artículo referido de 2018 se usaba suero bovino fetal (FBS), en esta tesis se cambia a suero bovino neonatal (NCS). El papel del suero fue estudiado en adipocitos marrones (de Jong et al., 2018), donde mostró resultados opuestos a los encontrados en adipocitos blancos (de Jong et al., 2018). En los adipocitos marrones el crecimiento era favorecido con FBS, pero los cultivos de adipocitos blancos con NCS tienen mayor número de células y la presencia de retracción del tejido se retrasa (datos no publicados). Las causas de estas diferencias pueden buscarse en el propio perfil bioquímico de cada uno de los sueros (Cheever et al., 2017; comunicación personal de Thermo Fisher Scientific), donde entre otros, destaca la diferencia de concentración en glucosa, triglicéridos y colesterol entre ambos sueros, así como de osmolaridad. En cuanto a la glucosa es conocida su regulación sobre canales KATP (Ashcroft et al., 1984), pero también es capaz de modular canales de K+ fuera del páncreas, como sucede en el cuerpo carotídeo (Pardal & López-Barneo, 2002) o neuronas del bulbo olfatorio (Tucker et al., 2013), donde la concentración externa de glucosa regula al KV1.3, uno de los canales presentes en el adipocito (Xu et al., 2003; Li, Wang & Desir et al., 2006). Además, en la diabetes, los canales presentes en el corazón también sufren modificaciones (Ozturk et al., 2021). En el caso de los ácidos grasos (Elinder & Liin, 2017) y el colesterol (Levitan et al., 2010) su papel regulatorio en canales iónicos ha sido ampliamente estudiado, pudiendo su identidad y concentración alterar la composición de las membranas lipídicas, y por ello, las propiedades biofísicas de los canales (Martens et al., 2001). Entre los componentes de la membrana es reseñable el fosfatidil-inositol-4,5-bifosfato, PIP2, un fosfolípido localizable en la bicapa interna de la membrana y precursor de segundos mensajeros que regulan entre otros (Kruse et al., 2012) al KV2.1 (Delgado-Ramírez et al., 2018). La osmolalidad es un factor estudiado sobre todo a nivel hipotalámico (Verbalis, 2007), donde destaca su acción sobre TRPV1 (Sudbury et al., 2010) y TRPV4 (Janas et al., 2016), siendo en éste último estudiada su regulación por hipoosmolaridad en adipocitos (Sanchez et al., 2016). Pero la osmolaridad no sólo regula canales TRP, sino también dependientes de voltaje, como sucede en espermatozoides (Barfield et al., 2005) y hepatocitos (Lan et al., 2005). En adipocitos (Ortego et al., 2014) las corrientes también se alteran con los cambios de osmolaridad, pudiendo un cambio de ésta alterar la captación de glucosa o favorecer la resistencia a insulina (Gual et al., 2003). 3. Amplitud de las corrientes. El aumento de corrientes debido a la presencia de insulina en el medio se comprobó en el año 2002 por este mismo grupo (Ramirez-Ponce et al., 2002) y se confirma en los resultados expuestos en la figura 26, donde las células cultivadas con alta insulina Discusión 136 poseen corrientes de mayor amplitud. Junto a esto hay un aumento en la densidad de corriente, aunque sea menor que lo visto en términos de corriente absoluta. Esto puede ser debido a que, como se observa en las correlaciones de las figuras 26E y 26F, estas células tengan mayores corrientes, en parte debido a su mayor tamaño, habiendo una enorme dispersión de valores. La regulación transcripcional es una función importante de la insulina (O’Brien & Granner, 1996; Siddle, 2011; White & Kahn, 2021). La inducción de expresión de determinados canales es un tema estudiado en podocitos, donde la insulina de forma crónica es capaz de aumentar la expresión de TRPC6 y de forma aguda modularlo (Kim et al., 2012). Dicho canal, aunque escaso, ha sido encontrado también en adipocitos (Bishnoi et al., 2013; Wang, Jaynes et al., 2020). En células mesangiales se vio también que la exposición durante 48 horas a 100 nM (14.4 mUI/ ml) aumentaba la expresión y actividad de canales BK (Foutz et al., 2008). En la línea de neuroblastoma SH-SY5Y, una concentración menor, 10 nM (1.44 mUI/ml) también genera un aumento de la expresión en este caso, de TRPV1 (Lilja et al., 2007). A su vez, en cardiomiocitos, animales KO de receptores de insulina tienen disminuida la expresión de determinados canales y con ello una reducción de las corrientes (Lopez-Izquierdo et al., 2014). Aplicada de forma aguda, la insulina de 1 a 100 nM (de 0.14 a 14.4 mUI/ml) genera una hiperpolarización del potencial de membrana, asumido como un aumento de la conductancia de canales de KV debido a que el efecto se anula en presencia de bario (Berweck et al., 1993). En las células principales de los túbulos colectores de la nefrona, la insulina 100 nM, también de forma aguda, aumenta la probabilidad de apertura de Kir4.1 y Kir4.1/ Kir5.1 (Zaika et al., 2016). El mecanismo de acción de la insulina sobre sus efectores se ejerce mediante la activación o inhibición de determinadas quinasas (Siddle, 2011). Hay proteínas como la bomba Na+/K+, la cual, aún desconociéndose el mecanismo exacto, en presencia de insulina aumenta la expresión de determinadas subunidades (Sweeney & Klip, 1998). Además, la actividad se ve incrementada, presumiblemente por un aumento de la concentración de sodio citoplasmática (Resh et al., 1980; Lytton, 1985). Los canales de potasio son muy sensibles a las fosforilaciones por las quinasas que se pueden activar en la ruta de la insulina (Davis et al., 2001). Estas fosforilaciones están asociadas comúnmente con una inhibición de las corrientes (Cerda & Trimmer, 2010), como sucede con KV1.4 y KV1.5 (Nitabach et al., 2002) o con KV1.3 (Bowlby et al., 1997; Fadool et al., 2000). El caso de KV1.3 es especialmente interesante, ya que uno de los lugares donde está más sobreexpresado, el bulbo olfatorio, es considerado sensor de insulina y glucosa del cuerpo (Tucker et al., 2011, 2013). El knockout (KO) de dicho canal genera ratones resistentes a la obesidad inducida mediante dieta rica en grasas (Tucker et al., 2012). Pero en otras ocasiones la fosforilación de los canales implica su potenciación, como sucede con el propio KV1.3 (Chung & Schlichter, 1997), donde poniendo ATP en la solución interna, las corrientes aumentan debido a la activación de la fosfoquinasa C (PKC). De hecho, no sólo se pueden potenciar los KV, también se da el caso de potenciación en KATP (Hu, Duan et al., 1996) y TRPV1 (Bhave et al., 2003; Studer & Discusión 137 McNaughton, 2010), ambos canales muy relacionados con el adipocito, ya que están implicados respectivamente en la captación de glucosa (Miki et al., 2002) y la adipogénesis (Zhang et al., 2007). Una de las rutas que en condiciones normales inhibe la insulina es la vía de la fosfoquinasa A (PKA) a través de Akt , la cual además se encuentra alterada en condiciones de obesidad (Choi et al., 2010). La PKA es una de las quinasas que se activa a través de receptores adrenérgicos. La noradrenalina inhibe de manera reversible las corrientes de potasio del adipocito blanco (Ramirez- Ponce et al., 1998), mientras que el isoproterenol, análogo de la noradrenalina, aumenta las corrientes de KV1.2 en el cardiomiocito (Huang et al., 1994). No obstante, la insulina aplicada de forma aguda potencia corrientes de calcio vía PKA (Maier et al., 1999). Que un efecto sea inhibidor o activador podría depender, además, de las subunidades accesorias que los canales de potasio posean (Vacher & Trimmer, 2011), como sucede con el KV1.5, que con la subunidad b1.2 ve inhibida su corriente por la fosforilación (Williams et al., 2002), mientras que con b1.3 la ve aumentada (Kwak et al., 1999a). También pueden ocurrir fosforilaciones en las propias subunidades accesorias (Vacher & Trimmer, 2011) como es el caso de la subunidad KCNE1 o minK, donde las fosforilaciones modulan su actividad (Blumenthal & Kaczmarek, 1992; Lo & Numann, 1998). Dado que la insulina promueve y modula la expresión de gran cantidad de genes, puede favorecer la expresión de determinadas subunidades que originen una potenciación o inhibición de las corrientes. Así, por ejemplo, la expresión de una chaperona concreta, la KChap produce un aumento de la conductancia de canales como el KV1.3, KV4.3, KV2.1 y KV2.2 (Wible et al., 1998; Kuryshev et al., 2000), a la vez que disminuye la de KV1.2 y KV1.5. La subunidad mKvβ3.2, anteriormente llamada mKvβ4 (Fink et al., 1996) aumenta la corriente en KV2.2, pero no en KV2.1. Por otra parte, la coexpresión con KCNE4 inhibe la densidad de corriente de KV2.1, sea sólo o con alguna subunidad silente (David et al., 2015) y de los canales KV1.1 y KV1.3 (Grunnet et al., 2003), debido en el último caso a que dificulta la expresión, transporte a la membrana y la activación del canal (Solé et al., 2009). 4. Activación de las corrientes. La conductancia de las corrientes presenta un patrón complejo de estudiar, con dos fases de las que la primera, puede formarse por la suma de varias subfases como se muestra en la figura 27. Esta morfología de dos fases no es nueva, ya que se ha encontrado en nódulos de Ranvier de rana (Dubois, 1981a), células ciliadas (Wong et al., 2004; Holt et al., 2007) o neuronas nociceptivas (Zhang et al., 2010). Como se expone en Resultados, sólo el 25% aproximadamente de las curvas G/V en ambas concentraciones de insulina presentan segundas fases ajustables a una fase sigmoidea. En el resto, la conductancia puede tener una subida abrupta, como sucede en los conos y bastones (Gayet-Primo et al., 2018) o el KV1.2 WT y quimérico de MacKinnon (Tao & MacKinnon, 2008). También se dan casos como el KCa1.1, el cual Discusión 138 en solitario posee una única fase, pero en presencia de varias subunidades g, se presentan varias fases (Gonzalez-Perez et al., 2014). Por otro lado en las células registradas, suele ocurrir una saturación de las corrientes (figura 27B), como la que se observa en la familia KV3 (Shaw) (Rettig et al., 1992), en KV1.4 y KV1.1/KV1.4 (Ruppersberg et al., 1990) o en KV1.3, ya sea expresado de forma heteróloga (Stühmer et al., 1989; Vicente et al., 2006) o en linfocitos (Cahalan et al., 1985). De cualquier modo, dado los voltajes bastante positivos a los que se da esta segunda fase, no puede descartarse la idea de que se trate de otro canal que en las condiciones de registro normales necesite una alta despolarización para activarse, como es el caso de KCa1.1 (Barrett et al., 1982; Yan & Aldrich, 2012) o el TRPV1 (Matta & Ahern, 2007), cuya existencia está comprobada en adipocitos. Con relación a la V1/2 de activación, en la figura 28, se muestran distintos picos, que se vieron confirmados al reducir el bin a 0.4 mV o ampliarlo a 1 mV, aunque en este último caso, con 10 µUI, algunos picos se fundían entre sí, hecho que no sucedía en las células de alta insulina. En la figura 29 se muestra la correlación entre los valores de V1/2 y el máximo de conductancia. Se aprecia que, aún existiendo una enorme variabilidad, las células que presentaban el voltaje máximo al que llega la conductancia con un valor más positivo, mostraban también valores de V1/2 más positivos y k mayores. La existencia de los distintos picos podría deberse a los distintos canales de K+ que se pueden encontrar en los adipocitos, según se ha visto con la farmacología y la inmunofluorescencia, pero también al grado de fosforilación o desfosforilación de los canales, los cuales hagan desplazar el V1/2. Esto sucede, por ejemplo con el KV2.1 (Park et al., 2006; Bishop et al., 2015) donde se observa que las desfosforilaciones, bien con ionomicina o fosfatasa alcalina, hacen más negativo el V1/2 de activación. A su vez, la fosforilación en KV1.3 desplaza el V1/2 a voltajes más positivos (Chung & Schlichter, 1997). No obstante, lo anterior, y dado la coincidencia de los valores de los picos en baja y alta insulina, siendo dos poblaciones de células completamente distintas, es plausible que los picos de los histogramas representen el predominio de cierto canal en algunas células, y por tanto de su V1/2 de activación. De hecho, la magnitud de los picos, aunque se sitúen en los mismos o muy parecidos valores de V1/2, cambian entre las dos concentraciones de insulina, lo que podría manifestar cambios en la expresión relativa de los canales para estas concentraciones de insulina. Si se toma, por el contrario, toda la distribución, en cada concentración de insulina, como una única distribución gaussiana, ni las medias de V1/2 de activación ni las k fueron significativamente diferentes entre baja (V1/2 = -13.9 ± 0.3 mV y k=6.3 ± 0.1 mV/e-fold, n=276) y alta insulina (V1/2 = -14.7 ± 0.3 mV y k=6.3 ± 0.1 mV/e-fold, n=264). Dichos valores, cercanos a -15 mV, pueden asignarse a KV1.5 (Snyders et al., 1993; Grissmer et al., 1994), si se pensara que los adipocitos tienen un único canal y no un abanico de canales que se expresan con una distribución concreta en cada célula. El problema con la asignación de un valor de V1/2 a un canal concreto, según lo que aparece en la literatura, es que los valores referenciados dependen en gran medida del método con el que se calculen. El modo más usual de calcular este parámetro es, Discusión 139 sabiendo de forma teórica o experimental el potencial del reversión (Erev) del potasio, aplicar en cada uno de los voltajes la conductancia de cuerda (chord-conductance): (Hodgkin & Huxley, 1952b), G=I/(V-Erev), siendo G la conductancia, I la corriente medida, V el voltaje aplicado en cada ocasión y Erev el potencial de reversión. El otro método de cálculo, el de medida de las corrientes de cola, se basa en la medida al comienzo de la corriente de cierre de los canales, considerando ésta proporcional a la que había cuando todos los canales estaban abiertos (Zagotta et al., 1994). Este problema puede ser ilustrado con dos canales, KV1.3 y KV2.1, en artículos donde ambos se están expresando en sistemas heterólogos. Para el primer caso, se obtiene mediante el método de las colas, un valor de V1/2 de -26 mV (Grissmer et al., 1994). Sin embargo, el mismo canal, pero haciéndose la medida con el método de la conductancia de cuerda arroja valores de -25.2 mV (Stühmer et al., 1989) y -11.3 mV (Vicente et al., 2006). En el segundo caso, KV2.1, usando el método de las corrientes de cola se distinguen tres valores bastante diferentes entre sí: -2.8 mV (Kurata et al., 2002), +1.1 mV (Bishop et al., 2015) y +21.5 mV (Peltola et al., 2011). Sin embargo, usando el método de la conductancia de cuerda el valor hallado es de +16.4 mV (Park et al., 2006). Es decir, no sólo difieren los valores de V1/2 entre métodos de medida, sino incluso con el mismo método. La elección del sistema de expresión es también muy importante, como expone Uebele VN et al. en una tabla donde compara la expresión de KV1.5 + Kvb1.2 en distintos sistemas (Uebele et al., 1996). Respecto a KV1.3 se advierte la diferencia de valores de V1/2 que muestran los canales entre HEK293 y Xenopus (Vicente et al., 2006). Además, el V1/2 es un factor muy modulable por subunidades accesorias, como sucede con el KV1.5, donde se ha visto que Kvb1.3 (Uebele et al., 1998), Kvb2.1 (Uebele et al., 1996) y Kvb3 (England et al., 1995) desplazan su V1/2 a valores más negativos. De igual modo sucede con el BK, aún en ausencia de Ca2+ interno, su V1/2 se ve desplazado a valores más negativos con las subunidades accesorias g o LRRC (Yan & Aldrich, 2012). En dicho canal sin embargo, la presencia de subunidades b4 (Shelley et al., 2013) desplaza el V1/2 a valores más positivos. Otra complicación surge de la posibilidad de heterotetramerizar de los canles (Ruppersberg et al., 1990). Estas uniones pueden hacer que el V1/2 del canal resultante posea un V1/2 intermedio entre cualquiera de los miembros del complejo, como sucede con KV1.1/KV1.2 (Hopkins, Allen et al., 1994), KV1.3/KV1.5 (Vicente et al., 2006) y KV4.2/KV4.3 (Guo et al., 2002). Un tipo especial de heterotetrámero, es el que sucede entre los miembros de la familia Kv2 con las familias KV5, KV6, KV8 y KV9, llamadas silentes (Bocksteins & Snyders, 2012; Bocksteins, 2016). En general, la presencia de estas subunidades desplaza el V1/2 a voltajes más negativos, como sucede con el KV2.1/KV6.1 (Kramer et al., 1998), KV2.1/KV9.1 (Richardson & Kaczmarek, 2000) y KV2.1/KV9.3 (Patel et al., 1997); pero también puede desplazarlo a voltajes más positivos, como pasa en KV2.1/KV5.1 (Kramer et al., 1998) o KV2.2/KV8.1 (Salinas, De Weille et al., 1997). Por último, los experimentos fueron realizados en distintas épocas de año, por lo que la temperatura de registro pudo variar entre verano e invierno, aún con la climatización Discusión 140 de la habitación de registro. La temperatura puede alterar el V1/2 de los canales, no sólo del TRPV1, sino de otros como el KV2.1 y KV4.3 (Yang & Zheng, 2014), y aumentar el ruido que aparece en los histogramas. 5. Desactivación. El proceso de desactivación de los canales, expuesto en las figuras 30 a 32 reveló unos resultados interesantes. La mayoría las células presentó una corriente cuyo potencial de reversión era más positivo que el teórico, grupo que ha sido denominado tipo Ia. Este desplazamiento en el potencial podría ser debida a los canales responsables de la presencia de una corriente inward, como la visualizada en la figura 43. Además, es posible que durante la aplicación del prepulso, a +60 mV, se acumule una gran cantidad de potasio expulsado desde los canales en un pequeño espacio restringido, como pueden ser las caveolas de los adipocitos, lo que haría aumentar de manera local la concentración de este ion y podría desplazar a voltajes más positivos el potencial de reversión del K+, como se ha sugerido en el espacio del nódulo de Ranvier (Dubois, 1981b) o en las caveolas de los cardiomiocitos (Volk et al., 1991). En el caso de las células de tipo Ib, prácticamente inexistentes en células con 100 µUI de insulina, la cantidad de canales capaces de provocar una corriente inward sería muy escasa o inexistente y la entrada de corriente que se observa sería la debida únicamente a canales de potasio, dado que el cruce en abscisas se está dando cerca del potencial de reversión de este ión. Por último, el tipo II, en las que no se logró una corriente inward, ni a un potencial de -120 mV, estuvo constituido casi exclusivamente por células cultivadas en alta insulina (tabla 9). El mecanismo a nivel estructural de cómo sucede este proceso sigue siendo hoy motivo de discusión (Jensen et al., 2012). Al igual que con la activación el principal problema para poder comparar nuestros resultados con los existentes en la literatura es el método por el cual se calculan las curvas G/V, aquí sucede algo similar. No hay un protocolo unificado y cada trabajo puede mostrar sus constantes de desactivación a un voltaje distinto. Incluso al mismo voltaje, cambios probablemente en el sistema de expresión hacen que, por ejemplo, para KV1.5, a -40 mV, se encuentren taus de 63 ms (Kwak et al., 1999a), 10.7 ms (Zhang et al., 2001) y 8.9 y 45 ms (Arias et al., 2007). Es usual que estas corrientes se presenten ajustadas de manera monoexponencial, no obstante, como se expone en las figuras 31 y 32, en el caso de los adipocitos fue más conveniente el ajuste biexponencial. Esto sucede también en las células ciliadas (Nenov et al., 1998; Wong et al., 2004) y en células musculares lisas de coronaria de conejo (Volk et al., 1991). Entre las razones de un ajuste biexponencial está la presencia más de un canal (Chinn, 1993) o que el mismo canal posea distintas secuencias de desactivación (Bennett et al., 1985). Una de las características descriptivas más relevantes del KV1.5 es su dificultad de cambiar el sentido de la corriente antes potenciales hiperpolarizantes, lo que Snyders denomina “strongly outward” (Snyders et al., 1993). En el caso de los adipocitos, para Discusión 141 las células tipo II, la rectificación es tan fuerte que no se cruzó el nivel de 0 corriente. Esta incapacidad también podría ser debida a la presencia del intercambiador Na+/Ca2+ (DiPolo & Beaugé, 2006), llamado NCX, el cual en condiciones fisiológicas permite la salida de un ion de Ca2+ por cada tres iones Na+ que entran, pero que en condiciones concretas, como son potenciales de membrana por debajo de -40 mV o situaciones donde la concentración de los iones está alterada, es capaz de funcionar de manera reversa, originando una corriente outward. Dicho modo ha sido visto en adipocitos (Bentley, 2013). También es posible que haya canales de tipo ERG, los cuales se caracterizan por tener una desinactivación más rápida que la desactivación y por tanto generar corrientes outward muy llamativas (Wimmers et al., 2002), aunque dichos canales no han sido descritos en adipocitos. Obviando los subtipos de desactivación vistas en el adipocito, se podría resumir que a -50 mV, la t1 y t2 corresponderían a 6 y 18 ms, respectivamente. Aunque ya se ha hablado de la dispersión de valores debido al voltaje de cada trabajo, la t2 podría recordar al valor de KV1.3 a -50 mV de 14.6 ms (Choi et al., 1999), pero otros como 25.6 ms a -40 mV (Yang et al., 2018) o 39.6 ms a -60 mV (Grissmer et al., 1994) se muestran claramente más alejados. En el caso de KV1.5 se encuentran valores más parecidos a los vistos en adipocitos en la t1, como son 8 ms a -50 mV (England et al., 1995), así como 9.8 y 13.7 ms a -50 y -40 mV, respectivamente (Uebele et al., 1998), ambos valores muy alejados de otros como 23 ms a -60 mV (Grissmer et al., 1994), que coincide por otra parte, con la t2 encontrada en nuestro trabajo. En la familia KV2, y respecto a KV2.1, se dan casos de ajustes biexponenciales, como los que arrojan valores de 17 y 119 ms para t1 y t2 respectivamente, a -40 mV (McCrossan et al., 2009) y 16.6 y 92.2 ms a -30 mV (David et al., 2015), aunque ajustando de manera monoexponencial se ha publicado una tau parecida a la t2 adipocítica, como es 11 ms a -50 mV (Kerschensteiner & Stocker, 1999). Para KV2.2 también se encuentra un caso de ajuste biexponencial, con taus de 28.3 y 117.1 ms a -30 mV (Bishop et al., 2015). De existir canales de calcio en el adipocito, estos justificarían cierta aceleración de las taus respecto a lo encontrado en la bibliografía, dado que dichos canales poseen taus rápidas del rango de menos de 1 ms y taus lentas que coinciden con los valores de la t1 presentada aquí (Randall & Tsien, 1997; Limpitikul et al., 2016). Por otra parte, la coexpresión con subunidades regulatorias como son MinK y MiRP producen un enlentecimiento en las taus de desactivación del KV2.1 (McCrossan et al., 2009), como sucede con KV2.1/KV9.3 (Patel et al., 1997; Kerschensteiner and Stocker, 1999) y KV2.1/KV5.1, KV2.1/KV6.1 (Kramer et al., 1998) y KV2.1/KV8.1 (Chiara et al., 1999). Aunque también se puede dar el caso de que la subunidad no afecte a esta propiedad, como sucede con KCNE4 o KCNE5, las cuales sólo alteran al heterotetrámero KV2.1/KV6.4, pero no al homómero de KV2.1 (David et al., 2015). Discusión 142 6. Inactivación dependiente de voltaje. En la inactivación dependiente de voltaje, se han encontrado tres tipos de inactivaciones (figura 33), atendiendo a lo que sucede en el rango de voltaje de -120 a -50 mV aproximadamente. En el tipo A no hay inactivación, en el tipo B hay alguna inactivación y finalmente en el tipo C, hay una inactivación clara, ajustable mediante una sigmoide. En los tipos A y B, se distinguen dos subtipos, en base a dónde tiene su V1/2, una segunda fase que se desarrolla entre -50 y 0 mV. El caso más frecuente en las células con baja insulina fue el denominado A-tardío, mientras que el tipo C es más frecuente en las células en alta insulina. El tipo B, similar entre concentraciones de insulina, recuerda a la inactivación encontrada en osteoclastos (Arkett et al., 1992). La mayor diferencia encontrada entre las células cultivadas en las diferentes concentraciones de insulina no es en el V1/2 ni la k de inactivación, sino el porcentaje máximo de inactivación producida por el protocolo, tal y como muestra la tabla 10. Como sucedía con las propiedades anteriores, el protocolo aplicado en cada trabajo es diferente, pero los resultados en este caso al menos son más uniformes. Así, para KV1.3 se encuentran valores de V1/2 de inactivación de -44.7 mV (Pongs et al., 1999), - 33 mV (Douglass et al., 1990) y -50.8 mV (Papp et al., 2009). Estos valores se acercan a los de la segunda fase de los tipos A y B tempranos, con valores de V1/2 en torno a - 30 mV. Por otra parte, KV1.5 posee valores algo más positivos: -25 mV (Snyders et al., 1993) y -28.3 mV (Martens et al., 2001), como también pasa con los valores de KV2.1, que alcanzan los -25.2 mV (Shi et al., 1994), -30.1 mV (Kramer et al., 1998) y -26.2 mV (Nakahira et al., 1996). Ambos canales, se acercan bastante a lo encontrado en las fases A y B tardías, así como la segunda fase del tipo C, con V1/2 en torno a -25 mV. En el caso del KV2.2, los valores hallados son tan dispares que impiden aproximarlo a ningún grupo: -16.3 mV (Schmalz et al., 1998), +17.1 mV (Dong et al., 2013) y -30.8 mV (Bishop et al., 2015). Entendemos que es probable que sea la proporción de canales expresados por una célula, la responsable del comportamiento de su inactivación dependiente de voltaje, dentro de alguno de los subtipos encontrados. Como se ha dicho anteriormente, el tipo C es el más abundante en las células cultivada con alta insulina. La presencia de inactivaciones dependientes de voltaje con dos fases no es exclusiva de adipocitos blancos. Pappone ya describió cómo en adipocitos marrones sucedía (Wilson & Pappone, 1999). También se han encontrado este tipo de inactivación en células de Deiter (Nenov et al., 1998), miocitos uterinos (Wang et al., 1998), neuronas dorsales ganglionares (Bocksteins et al., 2009) y células madres neurales (Schaarschmidt et al., 2009). El causante de la primera fase constituye un enigma, ya que de tratarse de un canal de potasio, podría tratarse de KV1.2 (Tao & MacKinnon, 2008) o uno de muy rápida inactivación (IA), como los descritos en neuronas dorsales ganglionares (Na Phuket & Covarrubias, 2009). No obstante, en el primer caso, el valor es discutible debido a los trabajos que cifran el V1/2 del KV1.2 (o RCK5) en valores más cercanos a -40 mV (Stühmer et al., 1989; Hopkins, Allen et al., 1994), y en el segundo caso, no se ha advertido que las células que tienen el tipo C de h-infinito posean una inactivación dependiente de tiempo en 250 ms significativamente diferente a las de los otros