Nuevas estrategias para el control de la enfermedad celíaca: caracterización de los péptidos imunogénicos del gluten y validación clínica de un biomarcador para el seguimiento del paciente celíaco

NUEVAS ESTRATEGIAS PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD CELÍACA: CARACTERIZACIÓN DE LOS PÉTIDOS IMUNOGÉNICOS DEL GLUTEN Y VALIDACIÓN CLÍNICA DE UN BIOMARCADOR PARA EL SEGUIMIENTO DEL PACIENTE CELÍACO. Ángela Ruiz Carnicer Sevilla 2020 DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA NUEVAS ESTRATEGIAS PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD CELÍACA: CARACTERIZACIÓN DE LOS PÉTIDOS IMUNOGÉNICOS DEL GLUTEN Y VALIDACIÓN CLÍNICA DE UN BIOMARCADOR PARA EL SEGUIMIENTO DEL PACIENTE CELÍACO. ÁNGELA RUIZ CARNICER SEVILLA, 2020 RESUMEN La enfermedad celiaca (EC) se define como una enteropatía inflamatoria crónica del intestino delgado causada por la ingesta de gluten en individuos genéticamente predispuestos. El término gluten hace referencia a las proteínas responsables de la cohesividad, viscosidad y elasticidad de la masa del trigo, la cebada, el centeno, la avena, y sus derivados. El gluten es una mezcla de dos grupos de proteínas las prolaminas (denominadas gliadinas en el trigo, hordenas en la cebada, secalinas en el centeno y aveninas en la avena) y las glutelinas (gluteninas para el trigo, y sus homlogas para cebada, centeno y avena). Dichas proteínas son resistentes a las enzimas digestivas y, por lo tanto, posterior a la ingestión de alimentos que contienen gluten, se generan péptidos inmunogénicos capaces de producir daño en la mucosa intestinal de los pacientes celíacos. Esta lesión se caracteriza, histológicamente, por un infiltrado de linfocitos a nivel intraepitelial y una hiperplasia de criptas con distintos grados de atrofia de las vellosidades intestinales. Clínicamente la EC presenta una gran variedad de síntomas, tanto gastrointestinales como extra-intestinales. Los síntomas clásicos incluyen diarrea crónica, esteatorrea, distensión abdominal, dolor, pérdida de peso y anemia. En niños además es común que presenten retraso en el crecimiento y baja estatura. Sin embargo, existen situaciones en las que las manifestaciones digestivas están ausentes u ocupan un segundo lugar. Estas formas atípicas incluyen manifestaciones que pueden ser orales, cutáneas, cardíaca, dermatológicas, neurológicas, articulares, hepáticas, endocrinas, ginecológicas, psiquiátricas y hematológicas. También es frecuente que aparezcan otras complicaciones graves como adenocarcinomas intestinales. En la actualidad, el único tratamiento disponible para los celíacos es el seguimiento de dieta sin gluten (DSG). Se ha demostrado que una estricta adherencia a la DSG es fundamental para eliminar los síntomas de la enfermedad, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida de los enfermos celíacos evitando complicaciones a corto-medio plazo de gran morbilidad y coste socio-sanitario (osteopenia-osteoporosis, enfermedades autoinmunes, desnutriciones intrauterinas, etc.). No obstante, numerosos estudios han sugerido que las transgresiones de la dieta tanto deliberadas como involuntarias son relativamente frecuentes. Entre las principales causas del incumplimiento se encuentran los condicionamientos de la vida social, el elevado coste de los productos dietéticos especiales o las dificultades tecnológicas para garantizar la ausencia de gluten en los alimentos complejos. La cantidad de gluten capaz de causar daño en la salud del celíaco es muy baja se ha descrito que el límite es inferior de 10 mg por día. Por lo tanto, es imposible evaluar la suma de todas las contaminaciones diarias individuales para saber si el celíaco ha excedido este umbral. Así pues, mientras que algunos pacientes logran una recuperación total de su enfermedad mediante el seguimiento de una DSG; hay celíacos que requieren un control periódico para conocer la eficacia del tratamiento; y otros muchos que darían la bienvenida a nuevos productos alimenticios que permitan una mayor flexibilidad en su dieta. En base a ello, el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de nuevas estrategias de control de la enfermedad celíaca, por un lado, mediante la caracterización de péptidos y epítopos inmunogénicos del gluten en distintas variedades de trigos comerciales; y por el otro, mediante la validación clínica de un biomarcador para el seguimiento de la dieta del paciente celíaco. El Capítulo 1 es una introducción general sobre la enfermedad celíaca. En el Capítulo 2 se exponen los antecedentes del tema y los objetivos principales de esta Tesis Doctoral. El Capítulo 3 comprende una revisión bibliográfica global sobre las patologías relacionadas con la ingesta de gluten, que son un grupo de desórdenes inmunológicos que se clasifican según los síntomas clínicos que producen y la respuesta inmune generada. La elevada prevalencia de estas enfermedades y los efectos nocivos de las proteínas del gluten para la salud representan un reto clínico y científico importante. En el capítulo 4, se caracterizan variantes de epítopos inmunogénicos del gluten en las α-gliadinas de la tribu Triticeae, tanto en especies diploides, como tetraploides y hexaploides de trigo. Estas gliadinas representan la fracción con mayor inmunogenicidad del gluten. Por ello, el estudio de la capacidad inmunoestimuladora de variantes de epítopos canónicos con sustituciones de aminoácidos, de manera que se elimine la toxicidad de estos epítopos, ofrece nuevas posibilidades en la generación de trigos con una toxicidad reducida. Dichas variedades ayudarían a minimizar la presencia de epítopos inmunogénicos en la harina de trigo, manteniendo las propiedades nutricionales y tecnológicas de este cereal. En el Capítulo 5 se ha llevado a cabo un ensayo clínico prospectivo con pacientes celíacos, que llevan más dos años a DSG, en el que se ha determinado la utilidad clínica de los péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) en orina como nuevo biomarcador para controlar la adherencia a la DSG correlacionándolo con parámetros clínicos e histológicos característicos de la enfermedad. Mediante este estudio, se ha demostrado que la ausencia repetida de GIP en orina permite verificar el correcto cumplimiento de la DSG a la vista de su relación con la ausencia de atrofia vellositaria, evitando la necesidad del uso de técnicas más invasivas para estudiar las posibles lesiones histológicas en el intestino del enfermo celíaco. En el Capítulo 6, se discuten los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, abordando su aplicación para el control y seguimiento de la DSG. Por último, en el Capítulo 7, se incluyen las conclusiones alcanzadas en esta Tesis Doctoral. Abreviaturas y símbolos Aa Aminoácido AcMo Anticuerpo monoclonal Anti-tTG Anti-transglutaminasa tisular AT Alergia al trigo CD4+ Proteína de superficie de los linfocitos T cooperadores DGP Péptidos desaminados de la gliadina DSG Dieta sin gluten EC Enfermedad celíaca GIP Péptidos inmunogénicos del gluten Gln Glutamina H Histidina HLA Antígeno leucositarios humanos IEL Linfocitos intraepiteliales IFN-ɣ Interferón gamma IL-15 Interleuquina PEP Prolin-endopeptidasa ppm Partes por millón P Prolina Q Glutamina R Arginina S Serina SGNC Sensibilidad al gluten no celíaca tTG Transglutaminasa tisular 33-mer Péptido de 33 aminoácidos 1 CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía inflamatoria crónica del intestino delgado mediada inmunológicamente que está causada por la ingesta de gluten en la dieta en individuos genéticamente predispuestos. Esta enfermedad se desarrolla al ingerir gluten, que es la mayor reserva proteica del trigo y otros cereales similares (Rubio-Tapia y Murray, 2010a; Ludvigsson et al., 2012; Singh et al., 2018). Originalmente se estableció que era una enfermedad del intestino delgado proximal que se caracterizaba por una mucosa intestinal anormal, asociada a una intolerancia permanente al gluten. Su retirada de la dieta da lugar a una remisión clínica y anatomopatológica. Esta definición se pudo hacer a partir de una serie de descubrimientos previos que van desde el establecimiento del papel del gluten por el Dr. Dicke en el año 1950 (Dicke, 1953) hasta los trabajos de Sakula y Shiner, que confirmaron la atrofia vellositaria (Sakula y Shiner, 1957), y los de Rubin et al. (1962) que demostraron que el gluten es el responsable de la lesión histológica. Posteriormente, la enfermedad se va conociendo mejor y se establece su carácter familiar y la base genética se añade a lo largo de la década de los 70 (Stokes et al., 1972; Keuning et al., 1976). Durante los últimos 20 años, la percepción de la EC ha pasado de ser una rara enteropatía, a ser una enfermedad multiorgánica muy frecuente, con una fuerte predisposición genética (Mustalahti et al., 2010). En el año 2012, ESPGHAN, a la vista de los nuevos conocimientos, estableció una nueva guía diagnóstica y definió de nuevo la EC como una enfermedad sistémica inmunomediada, provocada por el gluten y prolaminas relacionadas, en individuos genéticamente susceptibles que se caracteriza por la presencia de una combinación variable de: manifestaciones clínicas dependientes del gluten, anticuerpos específicos de la EC, haplotipos HLA DQ2 o DQ8 y enteropatía (Husby et al., 2012). Esta enfermedad presenta un amplio abanico de formas clínicas de expresión, con síntomas tanto intestinales como extraintestinales o incluso formas asintomáticas de la enfermedad. En la mayoría de los pacientes con EC, la enteropatía revierte bajo una dieta libre de gluten. Sin embargo, las transgresiones de la dieta, voluntarias o involuntarias, pueden implicar la no recuperación del intestino delgado y el mantenimiento de la sintomatología o, lo que es más grave, la aparición de una forma de EC que no responde a la dieta sin gluten que se conoce como EC refractaria, caracterizada por inflamación crónica y puede llevar asociada una alta tasa de incidencia de linfomas intestinales (Ludvigsson et al., 2012, Hadithi y Peña, 2010). 2 1.PATOGENIA El papel del gluten El gluten es una mezcla compleja de proteínas presentes en ciertos cereales como el trigo, la cebada, el centeno y la avena. Consiste en dos fracciones: una soluble en etanol, denominada prolamina, más concretamente gliadina, hordeína, secalina o avenina en función del cereal al que nos estemos refiriendo (trigo, cebada, centeno y avena respectivamente), y otra insoluble, que recibe el nombre de glutenina (Wieser, 1995; Sealey-Voyksner et al., 2010). Ambas contienen varias subunidades de proteínas que pueden ser separadas posteriormente mediante electroforesis. Las prolaminas están formadas por protenas monoméricas que pueden clasificarse como α-, -, ɣ-, ωgliadinas en el caso del trigo, mientras que las gluteninas se encuentran formando polímeros unidos mediante puentes de disulfuro intercatenarios. Estos enlaces deben ser reducidos para poder separar las subunidades constituyentes de las gluteninas, proteínas de alto peso molecular ("high molecular weight", HMW) y proteínas de bajo peso molecular ("low molecular weight", LMW) (Shewry et al., 1988; Shewry y Halford, 2002; Schalk et al., 2017) (Figura 1). Figura 1. Clasificación de las proteínas del gluten del trigo, la cebada, el centeno y la avena. Modificado según Schalk et al. (2017). Además de por su solubilidad o composición, las proteínas del gluten pueden ser clasificadas según su peso molecular en tres grupos. El primero, llamado HMW (moléculas de alto peso molecular), se compone de la subunidad de alto peso molecular de la glutenina del trigo y centeno y de la D-hordeína. El segundo grupo (MMW, peso molecular medio) está constitudo por las ω-gliadinas, ω5-secalinas y C-hordeínas. Finalmente, el grupo LMW (bajo peso molecular) está formado por α-gliadinas, -gliadinas, -secalinas (40 y 75k) y -hordeínas (Figura1) (Schalk et al., 2017) 3 Entre las principales proteínas de la dieta, el gluten es la única que contiene aproximadamente un 15% de residuos de prolina y un 35% de residuos de glutamina (Stern et al., 2001). El alto contenido en prolinas impide la proteolisis completa por las enzimas gástricas, pancreáticas e intestinales, de tal manera que se forman largos oligopéptidos inmunoreactivos en el intestino delgado. Al mismo tiempo, algunos residuos de glutamina de estos péptidos son desaminados catalíticamente por la enzima transglutaminasa tisular (tTG). Esta desaminación aumenta la inmunogenicidad de los péptidos debido a las interacciones de alta afinidad entre los residuos modificados y los bolsillos específicos en los sitios de unión al ligando de las moléculas HLA-DQ2 y HLADQ8 (Sollid y Khosla, 2011). (Figura 2). Figura 2. Esquema del mecanismo molecular de la enfermedad celiaca. Las enzimas gástricas y pancreáticas degradarían las proteínas del gluten salvo determinados péptidos resistentes a los enzimas del intestino. El paso de estos péptidos y la modificación por la transglutaminasa tisular, llevaría a la presentación de estos péptidos modificados como 4 antígenos a células T y las activaría. Este proceso genera una respuesta hipersensible contra todo lo asociado a estos péptidos tóxicos que acaba destruyendo las vellosidades intestinales. (modificado según Christophersen et al., 2019). La mayoría de las secuencias estimuladoras de células T descritas y estudiadas hasta la fecha pertenecen a la α-gliadina, aunque la inmunogenicidad de otros grupos proteicos ha sido confirmada mediante estudios in vivo (Ciclitira et al., 1984). La identificación de péptidos tóxicos, tales como el 33-mer de la fraccin α-2 gliadina (residuos 57-89), que contiene 6 epítopos de reconocimiento de las células T, ha proporcionado la luz sobre el mecanismo molecular de la intolerancia al gluten (Shan et al., 2002; Tye-Din et al., 2010). Desde entonces, gracias a estudios llevados a cabo tanto in silico como in vivo, se han identificado otros péptidos activadores de células T, algunos de los cuales se resumen en la tabla 1. (Tye-Din et al., 2010; Mitea et al., 2008; Sollid et al., 2012; Sollid et al., 2020). Tabla 1. Péptidos inmunogénicos identificados en distintas fracciones protéicas del gluten. Proteína Secuencia de aminoácido Referencia α-gliadina P F P Q P Q L P Y (Arentz-Hansen et al. 2000) P Y P Q P Q L P Y (Arentz-Hansen et al. 2002) P Q P Q L P Y P Q (Arentz-Hansen et al. 2000) F R P Q Q P Y P Q (Vader et al. 2002) Q G S F Q P S Q Q (van de Wal et al. 1998) Q G S F Q P S Q Q (Kooy-Winkelaar et al. 2011) Q G S V Q P Q Q L (Dorum et al.2014) Q Y S Q P Q Q P I (Dorum et al.2014) γ-gliadina P Q Q S F P Q Q Q (Sjöström et al. 1998) I Q P Q Q P A Q L (Qiao et al. 2005; Vader et al. 2002) Q Q P Q Q P Y P Q (Arentz-Hansen et al. 2002) S Q P Q Q Q F P Q (Arentz-Hansen et al. 2002) P Q P Q Q Q F P Q (Qiao et al. 2005) Q Q P Q Q P F P Q (Arentz-Hansen et al. 2002) P Q P Q Q P F C Q (Qiao and Sollid, 2019) L Q P Q Q P F P Q (Qiao and Sollid, 2019) Q Q P F P Q Q P Q (Arentz-Hansen et al. 2002) Q Q P Q Q P F P Q (Tollefsen et al. 2006) Q Q P Q Q P Y P Q (Tollefsen et al. 2006) P Q Q S F P Q Q Q (Kooy-Winkelaar et al. 2011) P Q Q S F P Q Q Q (Petersen et al. 2016) ω -gliadina P F P Q P Q Q P F (Tye-Din et al. 2010) P Q P Q Q P F P W (Tye-Din et al. 2010) LMW-glutenina P F S Q Q Q Q P V (Vader et al. 2002b) F S Q Q Q Q S P F (Stepniak et al., 2005; Vader et al., 2002) P F S Q Q Q Q P V (Bodd et al. 2012) HMW-glutenina Q G Y Y P T S P Q (van de Wal et al. 1999) Q G Y Y P T S P Q (Kooy-Winkelaar et al. 2011) Hordeína F S Q Q Q Q S P F (Stepniak et al. 2005; Vader et al. 2002) P F P Q P Q Q P F (Tye-Din et al. 2010; Vader et al. 2003) P Q P Q Q P F P Q (Vader et al. 2003) P I P Q Q P Q P Y (Tye-Din et al. 2010) 5 P Y P Q Q P Q P Y (Hardy et al., 2015b) Secalina P F P Q P Q Q P F (Tye-Din et al. 2010; Vader et al. 2003a) P Q P Q Q P F P Q (Vader et al. 2003a) P F P Q Q P Q Q I (Hardy et al., 2015b) Avenina P Y P Q Q Q Q P F (Arentz-Hansen et al. 2004; Vader et al. 2003a) P Y P Q Q Q Q P F (Arentz-Hansen et al. 2004; Vader et al. 2003a) P Y P Q Q Q Q P I (Hardy et al., 2015b) HMW-glutenina Q G Y Y P T S P Q (van de Wal et al. 1999) Q G Y Y P T S P Q (Kooy-Winkelaar et al. 2011) Los estudios que buscan incrementar nuestro conocimiento sobre las secuencias tóxicas de gliadina y guteninas, así como de los péptidos homólogos presentes en otros cereales tóxicos, tienen gran importancia para comprender muchos aspectos de la patogenia de la enfermedad celíaca. Respuesta inmunológica El modelo patogénico más ampliamente aceptado incluye alteraciones en la digestión alterada y el transporte transepitelial del gluten. La respuesta inmune inapropiada a las proteínas del gluten, observada en pacientes celíacos, incluye tanto la inmunidad innata (el gluten tiene un efecto tóxico directo sobre el epitelio intestinal, cuyo principal mediador es la interleucina (IL)-15) y la inmunidad adaptativa o específica (depende de la estimulación de las células T CD4+ reactivas al gluten) (Qiao et al., 2012; Sollid, 2013; Escudero-Hernández et al., 2016; Christophersen et al., 2019) (Figura 3). Figura 3. Respuestas inmunológicas frente al gluten en la enfermedad celiaca. Los péptidos de gluten inducen estrés en las células epiteliales intestinales (CEI), que sintetizan interleucina (IL)-15, junto con cambios que determinan la reprogramación de los linfocitos intraepiteliales (LIE). Los LIE expresan receptores NKG2D, que reconocen las moléculas de estrés, MICA, expresadas por los enterocitos; colaborando así en la destrucción del epitelio (respuesta innata). 6 Además, al llegar a la lámina propia, los péptidos son desaminados por la transglutaminasa tisular (TG2), aumentando la afinidad por las moléculas HLA-DQ expresadas por las células dendríticas (DC) y, con ello, la presentación de antígeno a los linfocitos T (respuesta adaptativa). Modificado según Escudero-Hernández et al., 2016. Algunos péptidos de gliadina, tales como p31-43 y p31-49 de la α-gliadina, los cuales no son reconocidos por las células T CD4+ en el contexto de las moléculas HLADQ2/8, han sido descritos con propiedades estimuladoras de la respuesta innata, los cuales actúan sobre las células epiteliales intestinales (CEI) y las células dendríticas. Estos péptidos son capeces de alterar la expresión génica y el transporte, además de generar situaciones de estrés que se manifiestan por la síntesis de IL-15. Dicha IL-15 activa al factor de transcripción NF-KB en las células adyacentes, lo que a su vez induce más producción de IL-15, así como la inducción de iNOS facilitándose un estrés oxidativo que retroalimenta la respuesta innata, la cual induce a su vez una señal de estrés en los enterocitos. La IL- 15 induce un comportamiento "NK-like" en los linfocitos intraepiteliales, dando lugar a una apoptosis enterocitaria y debilitamiento las "tightjunctions" entre los enterocitos que no han entrado en apoptosis. (Menard et al., 2012, Escudero-Hernández et al., 2016). La respuesta adaptativa se ve facilitada como consecuencia del incremento en la permeabilidad intestinal (apoptosis enterocitaria y debilitamiento de las "tightjunctions") ya que los péptidos inmunoadaptativos como el 33-mer pueden alcanzar la láminapropia, donde son desaminados por la enzima transglutaminasa tisular (TG2), la cual es el componente clave que explica la activación de la respuesta inmune adaptativa al gluten (Raki et al., 2006). La desaminación favorece la unión entre los péptidos y las moléculas HLA-DQ2 /DQ8 expresados en las células dendriticas. Estas células dendriticas realizan la presentación de antígenos específicos del gluten a las células T y, como consecuencia, se inicia una respuesta pro-inflamatoria caracterizada principalmente por la producción de interferón-ɣ (IFN- ɣ) que será finalmente responsable de la infiltración de linfocitos intraepiteliales, hiperplasía de las criptas y atrofia de las vellosidades, desencadenantes de todas las manifestaciones clínicas (Escudero-Hernández et al., 2016; Christophersen et al., 2019). Factores genéticos A pesar de que la modalidad de herencia de la EC aún es desconocida, se conoce desde hace tiempo que la genética participa en la susceptibilidad a la enfermedad. Los estudios sobre la prevalencia de la EC en familias afectadas y especialmente, aquellas en las que se comparan parejas de gemelos, has sido muy útiles para estimar la proporción en 7 la que los factores genéticos y ambientales contribuyen al desarrollo de este complejo trastorno. La base genética de la EC está ampliamente demostrada ya que mientras que la prevalencia de la EC se acerca al 1% en la población general, está aumentada al 10% entre los familiares de primer grado de un paciente celíaco (Sollid, 2002). Además, el ambiente parece tener también un efecto en el desarrollo de la EC, ya que los gemelos dicigóticos presentan una concordancia en el desarrollo de la EC del 16-20%, superior al 10% esperable entre hermanos no gemelos (Sollid, 2002). El hecho de que exista una concordancia en el desarrollo de la patología entre gemelos monocigotos (con el mismo acervo genético) del 75-86%, sitúa en dicho porcentaje la base genética de la EC, achacándose el porcentaje restante a factores ambientales como podrían ser la duración de la lactancia materna, la edad de introducción del gluten en la dieta o incluso la existencia de infecciones víricas y/o bacteriológicas concomitantes con la ingesta del gluten (Greco et al., 2002). La mayor porción del riesgo genético de desarrollar EC proviene de la presentica de ciertos alelos del Antígeno Leucocitario Humano (HLA, por sus siglas en inglés). La EC tiene un origen poligénico y multifactorial donde el heterodímero HLA-DQ2 (DQA1*05/DQB,1*02), y en menor medida el HLA-DQ8 (DQA1*03 /DQ131*0302), están presentes en la mayoría de los pacientes celíacos, permitiendo explicar hasta el 40% de la carga genética de la patología (Sollid, 2002; van Heel et al., 2007). Ambos heterodímeros juegan un papel central en la patogénesis de la EC al ser las moléculas encargadas de la presentación antigénica a través de las células presentadoras de antígeno (Donnelly et al., 2011). El heterodímero HLA-DQ2 está presente en más del 90% de los pacientes, pero se encuentra también entre el 20 y 30% de la población general, aunque sólo el 0,5-1% de ésta desarrolla la EC (Sollid, 2002). Por tanto, parece necesaria la implicación de numerosos loci de efecto menor. Así, los genes de posible susceptibilidad se engloban en numerosas regiones cromosómicas, como los clusters CELIAC 1, CELIAC 2, CELIAC 3 o CELIAC 4. Sin embargo, todos estos loci de susceptibilidad tendrían un efecto mucho menor y deberían actuar conjuntamente con el principal factor FILA-DQ2/DQ8. Factores ambientales Los estudios epidemiológicos han demostrado que los factores ambientales representan un papel importante en el desarrollo de la EC (Serena et al., 2015). Esto se ve corroborado por el rápido número de diagnósticos crecientes de EC, especialmente entre pacientes adultos (Catassi et al., 2014) y por la creciente incidencia de EC 8 refractaria, donde los individuos afectados no responden a la dieta libre de gluten (Malamut y Cellier, 2015). Durante varios años, se ha planteado la hipótesis de que la lactancia materna tiene un papel protector contra la aparición de EC a través de diferentes mecanismos (Akobeng y Heller, 2007). La administración inicial de gluten antes de los cuatro meses de edad se ha asociado con mayor riesgo de desarrollar la enfermedad, y la introducción del gluten con posterioridad a los siete meses se ha asociado con un riesgo menor. Sin embargo, la superposición de la introducción del gluten con la lactancia materna puede ser un factor protector importante para disminuir al mínimo el riesgo de la enfermedad celíaca. Se ha planteado la hipótesis de que las infecciones gastrointestinales repetidas aumentan el riesgo de EC (Chmielewska et al., 2015). Las infecciones pueden causar inflamación intestinal, lo que reduce la tolerancia al gluten en individuos genéticamente predispuestos (Bethune y Khosla, 2008). En los últimos años, los investigadores han comenzado a investigar si las alteraciones en la composición del microbioma pueden contribuir activamente a la pérdida de tolerancia al gluten (Krishnareddy, 2019; Serena et al., 2019). La determinación de los factores ambientales que influyen en la aparición de la enfermedad podría facilitar el desarrollo de estrategias para la prevención primaria de ésta. 2. EPIDEMIOLOGÍA A través de estudios sero-epidemiológicos realizados en diversos países europeos y Estados Unidos, se estima que la prevalencia actual de la EC está situada alrededor del 1% de la población, aunque la mayoría están sin diagnosticar. Por cada caso diagnosticado puede haber entre 7-11 casos no diagnosticados, por lo que está claramente infraestimada a nivel mundial (Catassi, 2005). Se observa, sin embargo, una tendencia a un mayor número de diagnósticos en las últimas décadas, debido no sólo a un mejor conocimiento de la enfermedad y a un mayor índice de sospecha, sino también a la disponibilidad de mejores marcadores serológicos, y a una mayor realización de biopsias duodenales, indicadas por diversos motivos. Además, la enfermedad es reconocida no sólo en países poblados por descendientes de europeos, sino también en Oriente Medio, Asia, Sudamérica y África del Norte (Ludvigsson y Murray, 2019). 9 3. MANIFESTACIONES CLÍNICAS La EC es una afección inmunológica que afecta a múltiples sistemas de órganos, por lo que las manifestaciones clínicas son múltiples en forma y número debido a la naturaleza multisistémica de la EC (Green et al., 2015). Las manifestaciones clínicas de la EC varían mucho con la edad. Los lactantes y los niños pequeños generalmente presentan diarrea, distensión abdominal y retraso del crecimiento. Sin embargo, también son comunes los vómitos, la irritabilidad, la anorexia y el estreñimiento. Los adolescentes suelen presentar manifestaciones extraintestinales, como talla baja, síntomas neurológicos o anemia (Stern et al., 2001; Riestra, 2008; Ludvigsson y Green, 2011). La presentación clásica en los adultos es la diarrea que puede estar acompañada por dolor o malestar abdominal. Las presentaciones silentes en los adultos (pacientes asintomáticos con serología positiva para la EC, altos niveles de linfocitos intraepiteliales en la biopsia intestinal y EC, frecuentemente, asociada con otras enfermedades tales como la diabetes mellitus tipo 1 o enfermedades autoinmunes tiroideas y hepáticas o síndrome de Down) incluyen la anemia ferropénica, la osteoporosis y el diagnóstico ocasional durante una endoscopia indicada por otras razones. En las últimas décadas ha habido un cambio progresivo en las manifestaciones clínicas, con menos pacientes, tanto adultos como niños, que presentan una forma clásica y diarreica. Esto, en los niños, se observa solo en los más pequeños, mientras que los problemas de crecimiento, los grupos de detección de riesgo y el dolor abdominal recurrente son los modos de presentación más comunes entre los niños. Entre los adultos, la diarrea es la presentación más común seguida de anemia. (Green et al., 2015). Una gran proporción de pacientes pueden tener síntomas durante un largo periodo de tiempo y haber sufrido hospitalizaciones e incluso procedimientos quirúrgicos antes del diagnóstico de EC. Así mismo, pueden aparecer trastornos en la esfera reproductiva (menorquia tardía, menopausia precoz, abortos, infertilidad, impotencia, recién nacidos de bajo peso), osteopenia, hipoesplenismo, adenocarcinoma del intestino delgado o hepatitis reactiva (hipertransaminasemia criptogenética) (Riestra, 2008; Ludvigsson y Green 2011). Algunos casos son diagnosticados debido a la mayor vigilancia que se hace de la enfermedad en las personas con antecedentes familiares y en las personas con síndrome de Down; así como en el síndrome de Turner o en la diabetes tipo 1. Las personas con EC tienen además mayor riesgo de enfermedades inmunológicas, comparadas con la población general. Los estudios de detección están indicados principalmente en los pacientes con distensión, síndrome de colon irritable, enfermedad tiroides, diarrea crónica de etiología desconocida fatiga crónica y 10 estreñimiento.La mayor parte de las personas con CD permanecen sin diagnosticar. (Ludvigsson y Green, 2011; Green et al., 2015). 4 DIAGNÓSTICO La EC puede ser difícil de reconocer debido a las variaciones en su presentación y la intensidad de los síntomas y signos, e incluso en muchos casos se puede desarrollar sin síntomas. Se ha estimado que sólo 1 de cada 3-7 pacientes adultos con EC son sintomáticos. Los síntomas clínicos de la EC pueden aparecer en la infancia, en la adolescencia o en la edad adulta. La EC sólo se desarrolla después de la introducción del gluten en la dieta del niño. Además, la dieta sin gluten (DSG) mejora o elimina los síntomas, normaliza los anticuerpos específicos de la enfermedad y los hallazgos histológicos. Por lo tanto, una dieta con cantidades normales de pan, pasta y otros alimentos que contengan gluten debe ser consumida hasta el final del proceso diagnóstico (Husby et al., 2012; Al-Bawardy et al., 2017). Importancia de la evaluación de HLA-DQ2 y HLA-DQ8 El alelo HLA-DQ2 se identifica en el 90% de los pacientes con EC y en el 5-7% HLADQ8. Una pequeña proporción de pacientes tiene un tipo genético alternativo que a menudo incorpora la mitad del par de genes que codifica DQ2; llamado DQ2.2. Debido a que esos alelos se hallan en el 30-40% de la población general (siendo el más común el HLA-DQ2) la ausencia de esos alelos es importante por su valor predictivo negativo (Sollid, 2002). La evaluación de HLA-DQ2/HLA-DQ8 desempeña un papel importante en la detección de casos en los que los individuos pertenecen a grupos en situación de riesgo para la EC (Liu et al., 2014). Estas personas incluyen, entre otros, familiares de primer grado de un caso confirmado y pacientes que padecen enfermedades que han demostrado estar asociadas con la EC. Un resultado negativo para HLA-DQ2/HLA-DQ8 significa muy baja probabilidad de desarrollo de la enfermedad, por lo tanto, no habría necesidad de analizar los anticuerpos séricos en pruebas posteriores (Husby et al., 2012). Pruebas serológicas Los análisis de anticuerpos más sensibles para el diagnóstico de EC son los de clase IgA: anticuerpos frente a péptidos desaminados de la gliadina (DGP), anticuerpos dirigidos contra la transglutaminasa ti (tTG) y anticuerpos anti-endomisio (EMA) (Hill, 2005; Wolf et al., 2017). Los anticuerpos anti-DGP son considerados menos sensibles 17 endoproteasas. Este péptido se identificó como el iniciador primario de la respuesta inflamatoria al gluten en pacientes con EC (Shan et al., 2002). Para cuantificar el potencial tóxico del gluten en alimentos, dos anticuerpos monoclonales (AcMo) G12 y A1, fueron obtenidos frente al péptidos inmunodominante 33-mer. La reactividad de estos anticuerpos se correlacionó con la inmunotoxicidad potencial de las proteínas analizadas y demostraron ser útiles en estudios sobre la desintoxicación enzimática del gluten. Estos anticuerpos mostraron una gran sensibilidad a los péptidos tóxicos (además del péptido de 33 meros) del trigo, centeno, cebada y variedades de avena (Morón et al., 2008a; Morón et al., 2008b). Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas sándwich (ELISA), basado en AcMo G12 y A1, dio resultados muy prometedores para el análisis de gluten en una gama de muestras. Este método tenía un límite de detección de 0,6 ppm de gluten, 1/3 de la concentración obtenida por otros métodos descritos hasta la fecha. De manera similar, se desarrolló una prueba rápida para determinar la concentración, cualitativa o semicualitativa, de gluten en alimentos sólidos, bebidas y en superficies utilizando dispositivos de flujo lateral (LFD) con estos AcMo (Comino et al., 2013; Halbmayr-Jech et al., 2012), así como un método ELISA competitivo, basado en el anticuerpo G12, para la detección de péptidos tóxicos de gluten en alimentos hidrolizados (Comino et al., 2013; Real et al., 2014). En base a estas metodologías, se han propuesto nuevas herramientas para monitorizar la DSG mediante la determinación de GIP en muestras humanas. Heces Los inmunoensayos con G12 AcMo mostraron que más del 30% de los péptidos de gliadina inmunorreactivos persistieron intactos después de la hidrólisis durante la digestión gastrointestinal simulada in vitro (Comino et al., 2012). En base a estos hallazgos, Comino et al. (2012) describió un método novedoso para controlar el DSG mediante la detección de GIP en heces mediante el uso del anticuerpo G12 [ 99]. Este estudio apoya la resistencia del 33-mer a la hidrólisis péptica-tripéptica-quimiotréptica in vitro; y, lo más significativo, se demostró que los epítopos tóxicos de gluten son medibles por AcMo en las heces de sujetos normales y pacientes con EC que reciben una dieta que contiene gluten. Se detectaron GIP en las heces de individuos sanos y pacientes con EC que recibieron dietas que contenían gluten, y GIP desapareció cuando se introdujo un DSG (Caminero et al., 2012). Con las dietas que contenían cantidades variables de gluten, la excreción de GIP fue proporcional a la cantidad ingerida. Estas pruebas también podrían detectar diferencias cuando, estando en DSG, los sujetos fueron desafiados con cantidades conocidas de gluten oral (Auricchio, 2012). 18 Comino et al. (2016) demostró la utilidad clínica de este nuevo método de medición de GIP fecal como marcador de adherencia a DSG. En un ensayo clínico multicéntrico examinó prospectivamente el cumplimiento de la DSG de niños y adultos celíacos. Además, la respuesta a DSG se evaluó mediante cuestionario dietético, serología celíaca y respuesta clínica. Se investigaron las correlaciones entre GIP fecal y los métodos tradicionales para monitorizar la DSG. La detección de GIP en heces reveló las limitaciones de los métodos tradicionales para controlar la DSG en pacientes celíacos. Un reciente estudio de Comino et al. (2019), evaluó la determinación de GIP en heces como marcador de adherencia a DSG en niños celíacos recién diagnosticados en un ensayo clínico prospectivo multicéntrico. Además, se comparó con los métodos tradicionales utilizados para evaluar la adherencia a DSG: revisión dietética del registro de alimentos de cuatro días y la serología celíaca (transglutaminasa tisular, tTG y anticuerpos peptídicos de gliadina desamidada, DGP). Se determinó, que la de GIP en heces pueden guiar el tratamiento de la enfermedad celíaca antes del diagnóstico y durante la evaluación de la adherencia a la dieta. Por lo tanto, el análisis de GIP en heces, es un método preciso y no invasivo que permite una evaluación directa y cuantitativa de la exposición al gluten poco después de la ingestión. Orina Una fracción proporcional del GIP absorbido en el tracto gastrointestinal llega a la circulación y se excreta en la orina (Ludvigsson y Green, 2011). La metodología propuesta por Moreno et al. (2017) basado en la prueba de gluten de orina puede ser útil en la práctica clínica como una herramienta de monitoreo para hacer un seguimiento del cumplimiento de la DSG. Los ensayos clínicos en orina basados en LFD se usan en muchas enfermedades. El acoplamiento de un lector a la LFD en orina de pacientes con EC podría proporcionar una medición cuantitativa de la infracción de la dieta, proporcionando ventajas significativas en el tratamiento de la DSG. Se ha demostrado una correlación positiva entre la cantidad de gluten ingerido y el GIP detectado en muestras de orina humana (Moreno et al., 2017). Se detectaron GIP en muestras de orina 6–48 h después de la ingesta de gluten. La metodología demostró el alto nivel de incumplimiento en pacientes con EC que supuestamente habían consumido DSG a largo plazo a través de la presencia de GIP. Estos resultados fueron consistentes con los informes que muestran que ~ 30% – 50% continúan con atrofia de la mucosa en pacientes con EC a pesar de seguir un DSG 19 (Matoori et al., 2013; Tio et al., 2012). Además, se demostró una correlación directa entre la ausencia de GIP en orina y la curación del epitelio intestinal intestinal (Figura 2) Además, el 100% de los pacientes adultos con mayor daño en el epitelio (Marsh II / III), según el análisis histológico, tenían GIP en orina. El desarrollo de un biosensor de resonancia altamente sensible para la detección de GIP en orina por Soler et al. (2016) demostró que la metodología de detección permite una cuantificación rápida de GIP en orina mediante el uso de G12 moAb, alcanzando un límite de detección de 0,33 ng/ml. Por lo tanto, los biosensores ofrecen ventajas significativas sobre las técnicas convencionales que permiten el análisis bioquímico con excelente reproducibilidad y alta sensibilidad en cuestión de minutos. REFERENCIAS Akobeng, A.K., Heller, R.F. (2007). Assessing the population impact of low rates of breast feeding on asthma, coeliac disease and obesity: the use of a new statistical method. Arch Dis Child;92(6):483–5. 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DIETA SIN GLUTEN Y PATOLOGÍAS ASOCIADAS AL GLUTEN 35 Gluten-free Diet and Gluten-related Disorders Isabel Comino, Ángela Ruiz-Carnicer, Carolina Sousa Department of Microbiology and Parasitology, University of Seville, Seville, Spain Nova Science Publishers (2017); 1:93-111 ISBN: 978-1-53610-386-1 36 CAPÍTULO 4. POTENCIAL INMUNOGÉNICO DE VARIANTES DE EPÍTOPOS DE α-GLIADINA DE ESPECIES DE TRIGOS 37 Celiac Immunogenic Potential of α-Gliadin Epitope Variants from Triticum and Aegilops Species Ángela Ruiz-Carnicer 1, Isabel Comino 1, Verónica Segura 1, Carmen V. Ozuna 2, María de Lourdes Moreno 1, Miguel Ángel López-Casado 3, María Isabel Torres 4, Francisco Barro 2 and Carolina Sousa 1 1Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, 41012 Sevilla, Spain.2Departamento de Mejora Genética Vegetal, Instituto de Agricultura Sostenible (IAS-CSIC) 14004 Córdoba, Spain. 3Departamento de Gastronterología pediátrica, Hospital Virgen de las Nieves,18014 post code Granada, Spain. 4Departamento de Biología Experimental, Campus Universitario Las Lagunillas, 23071 post code Jaén, Spain. Nutrients 2019; 11,220 nutrients Article Celiac Immunogenic Potential of α-Gliadin Epitope Variants from Triticum and Aegilops Species Ángela Ruiz-Carnicer 1, Isabel Comino 1, Verónica Segura 1, Carmen V. Ozuna 2, María de Lourdes Moreno 1, Miguel Ángel López-Casado 3, María Isabel Torres 4, Francisco Barro 2and Carolina Sousa 1,* 1 Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, 41012 Sevilla, Spain; [email protected] (Á.R.-C.); [email protected] (I.C.); [email protected] (V.S.); [email protected] (M.d.L.M.) 2Departamento de Mejora Genética Vegetal, Instituto de Agricultura Sostenible (IAS-CSIC), 14004 Córdoba, Spain; [email protected] (C.V.O.); [email protected] (F.B.) 3Departamento de Gastronterología pediátrica, Hospital Virgen de las Nieves, 18014 Granada, Spain; [email protected] 4Departamento de Biología Experimental, Campus Universitario Las Lagunillas, 23071 Jaén, Spain; [email protected] *Correspondence: [email protected]; Tel.: +34-954-556-452 Received: 28 December 2018; Accepted: 17 January 2019; Published: 22 January 2019   Abstract: The high global demand of wheat and its subsequent consumption arise from the physicochemical properties of bread dough and its contribution to the protein intake in the human diet. Gluten is the main structural complex of wheat proteins and subjects affected by celiac disease (CD) cannot tolerate gluten protein. Within gluten proteins, α -gliadins constitute the most immunogenic fraction since they contain the main T-cell stimulating epitopes (DQ2.5-glia- α 1, DQ2.5-glia- α 2, and DQ2.5-glia- α 3). In this work, the celiac immunotoxic potential of α -gliadins was studied within Triticeae: diploid, tetraploid, and hexaploid species. The abundance and immunostimulatory capacity of CD canonical epitopes and variants (with one or two mismatches) in all α -gliadin sequences were determined. The results showed that the canonical epitopes DQ2.5-glia- α 1 and DQ2.5-glia- α 3 were more frequent than DQ2.5-glia- α 2. A higher abundance of canonical DQ2.5-glia- α 1 epitope was found to be associated with genomes of the BBAADD, AA, and DD types; however, the abundance of DQ2.5-glia- α 3 epitope variants was very high in BBAADD and BBAA wheat despite their low abundance in the canonical epitope. The most abundant substitution was that of proline to serine, which was disposed mainly on the three canonical DQ2.5 domains on position 8. Interestingly, our results demonstrated that the natural introduction of Q to H at any position eliminates the toxicity of the three T-cell epitopes in the α -gliadins. The results provided a rational approach for the introduction of natural amino acid substitutions to eliminate the toxicity of three T-cell epitopes, while maintaining the technological properties of commercial wheats. Keywords: celiac disease; α -gliadin; 33-mer; DQ2.5-glia- α 1; DQ2.5-glia- α 2; DQ2.5-glia- α 3 epitopes; wheat species 1. Introduction Wheat is one of the most widely cultivated cereals in the world and constitutes a major source of energy, protein, and fiber in the diet. Increasing global demand for wheat and its subsequent consumption, with an annual production of about 750 million tons, is due to its unique viscoelastic properties for its inclusion in food products and to industrialization and westernization [ 1 – 3 ]. The wheat group has evolved through allopolyploidization, that is, through hybridization between Nutrients 2019,11, 220; doi:10.3390/nu11020220 www.mdpi.com/journal/nutrients Nutrients 2019,11, 220 2 of 13 species from the genera Aegilops and Triticum followed by genome doubling [ 4 ]. Genetic studies have provided valuable information regarding which wild cereal species are the relatives of modern domesticated cereals, and which geographical wild plant produced the domesticated forms that are used in food production today [ 5 ]. The diploid wild wheat that was first domesticated is thought to have been Triticum monococcum (A m A m ), which is still growing in some parts of the world both for animal feed and human consumption. Wheats with more than one genome are known as polyploid wheats. The AA genome of the tetraploid wheats is closely similar to that of T. urartu, and the BB genome is related to Aegilops speltoides (BB). The wild tetraploid, formed after the hybridization, was designated as Triticum turgidum ssp. dicoccoides (wild emmer; BBAA), and the first domesticated tetraploid was T. turgidum ssp. dicoccum (cultivated emmer; BBAA), from which, the cultivated T. turgidum ssp. durum has evolved. The hexaploid wheat, Triticum aestivum ssp. aestivum (BBAADD), consists of three genomes designated A, B, and D. The A and B genomes of hexaploid wheats come from the A and B genomes of tetraploid wheat. The hexaploid wheats resulted from the hybridization of cultivated emmer and a wild grass species identified as Aegilops tauschii (DD), followed by polyploid formation which gave rise to a new species that has three genomes designated BBAADD [ 6 , 7 ]. The main wheat species grown throughout the world is the hexaploid T. aestivum, usually called “common” or “bread” wheat. In terms of total production, the next variety in importance is the tetraploid durum or macaroni wheat (T. turgidum L. subsp. durum Desf.). This is adapted to hot dry climates and is widely used for the production of pasta. Common wheat species account for nearly 94% of the total production, with durum wheat representing 5%, and other wheat forms about 1% [6,8]. Although wheat has always been recognized as a fundamental food, this cereal cannot be tolerated by certain individuals since it is responsible for significant pathologies, called gluten-related disorders, such as celiac disease (CD), wheat allergy, non-celiac gluten sensitivity, gluten ataxia, and dermatitis herpetiformis [ 9 ]. CD is an immune-mediated systemic disorder elicited by the ingestion of gluten in genetically susceptible individuals. It affects around 1% of the global population and is based on a variable combination of intestinal and extra-intestinal signs and symptoms, celiac specific antibodies, HLA-DQ2/8 haplotypes, and enteropathy [ 9 – 11 ]. Gluten proteins are rich in proline and glutamine residues, which make them resistant to being fully digested in the gastrointestinal track. Partial digestion of gluten generates small peptides that provoke autoimmune disorders in celiac people. The most accepted model for explaining CD immunopathogenesis is the two-signal model [ 12 ] characterized by a first innate immune response followed by a secondary antigen-specific adaptive response. According to this model, certain peptides, such as the 19-mer gliadin peptide, trigger an innate immune response [ 13 ] mainly characterized by the production of interleukin 15 (IL-15) by epithelial cells. The result is the disruption of the epithelial barrier by increasing the permeability and inducing enterocyte apoptosis [ 14 ]. As a consequence, the immune-adaptive peptides, like the 33-mer, can now reach the lamina propria where they are deaminated by the tissue transglutaminase (tTG2). Such deamidation provides a negative charge to gliadin peptides and hence enhances their affinity to bind within the HLA-DQ2/8 bound, which is also the ‘susceptibility gene’ in CD, expressed on the surface of dendritic cells (DCs) [ 15 – 17 ]. DCs are therefore central in CD pathogenesis since they present a gluten antigen to T cells, [ 18 ] thereby driving progression of the pro-inflammatory antigen-specific adaptive immune response, which will turn into the symptomatology of the disease. Gluten is a complex mixture of storage proteins of cereals such as wheat, rye, barley, oats, and their hybrid derivatives. Gluten proteins have been classified according to their solubility [ 19 ]. In wheat , these proteins are defined as gliadins (soluble in 60–70% ethanol) and glutenins (only soluble under stronger conditions, i.e. acids, reducing agents and detergents, urea, etc.) [ 20 ]. According to their electrophoretic mobilities, gliadins are divided into three groups: α - and β -gliadins, γ -gliadins, and ω -gliadins [ 19 ], while the glutenins are divided into the high molecular weight (HMW) and the low molecular weight (LMW) glutenin subunits (GSs) [ 21 , 22 ]. Among the gliadins, the α -gliadins have the strongest immunogenicity [ 23 ], and four T-cell stimulatory epitopes have been identified as being responsible for eliciting the immunogenicity of α -gliadin. Two of these are the major epitopes Nutrients 2019,11, 220 3 of 13 and they are present in the 33-mer peptide, which is the main contributor to the immunogenicity of the gluten [ 24 ] and contains six copies of these two overlapping T-cell epitopes: three copies of the DQ2.5-glia- α 1 and three copies of the DQ2.5-glia- α 2. The other two T-cell stimulatory epitopes are minor epitopes: DQ2.5-glia- α 3 and DQ8-glia- α 1 [ 24 – 27 ]. However, natural substitutions of these canonical epitopes could also contribute to the toxicity of wheat [ 28 ], and it could suggest that the total CD immunogenicity of gluten protein is a result of the canonical epitopes and their variants, some of which are more abundant than the canonical epitopes themselves. Gluten can have different immunogenic potential sequences whose proportions in each species are also variable. For this reason, it is important to study the amino acid substitutions in the variants of these epitopes; interestingly, these variants could increase, reduce, or suppress the CD response. In earlier work, next-generation sequencing and Sanger sequencing of α -gliadins from diploid and polyploid wheats provided six types of α -gliadins with major differences in their frequencies. The canonical CD epitopes and their variants were identified in the different types of α -gliadins [ 29 ]. In the present study, we used the sequence data with one or two mismatches and canonical epitopes obtained in Ozuna et al. [ 29 ], and we have built upon the previous research by exploring the abundance of different DQ2.5-glia- α 1, DQ2.5-glia- α 2, and DQ2.5-glia- α 3 epitope variants per species in diploid and polyploid wheats. Moreover, the immunogenic potential of these epitope variants in wheat species was studied by testing their binding capacity to anti-33-mer monoclonal antibodies (moAbs) [ 30 , 31 ] and to induce T-cell proliferation. The anti-33-mer antibodies were able to detect the presence of gliadin 33-mer related epitopes in prolamins from wheat, barley, rye, and various oats varieties as well as in food samples and human samples to monitor gluten free diet (GFD) compliance and transgressions [ 32 ]. Our study showed that the canonical epitopes DQ2.5-glia- α 1 and DQ2.5-glia- α 3 were more frequent than DQ2.5-glia- α 2. The most abundant natural modification was found in the DQ2.5-glia- α 3 domain in all the sequences studied. However, this variant decreased its immunogenicity with respect to the canonical epitope. On the other hand, one of the most representative variants of DQ2.5-glia- α 2 (40%) showed an immunogenicity equivalent to the canonical epitope. Our results provide a rational approach for the introduction or selection of natural amino acid substitutions to eliminate the toxicity of three α -gliadin T-cell epitopes, while keeping the technological properties of the commercial wheats. 2. Materials and Methods 2.1. Catalogue and Abundance of CD Epitopes from Diploid, Tetraploid, and Hexaploid Wheat Varieties Canonical epitopes DQ2.5-glia- α 1 (PF/YPQPQLPY), DQ2.5-glia- α 2 (PQPQLPYPQ), and DQ2.5-glia- α 3 (FRPQQPYPQ) and variants with one or two mismatches provided by Ozuna et al. [ 29 ] were obtained from diploid, tetraploid, and hexaploid wheats (Figure 1). The frequency/abundance of each peptide in the sequences of the different wheats was studied in silico. The abundance of each epitope was calculated by multiplying the total number of epitopes found in a given gene by the frequency of that gene in the genome. These canonical CD epitopes and their most representative variants with one or two mismatches were synthesized as deaminated and non-deaminated 9-mer peptides. The peptides were supplied by Biomedal S.L. (Seville, Spain). Nutrients 2019,11, 220 4 of 13 Nutrients 2018, 10, x FOR PEER REVIEW 4 of 14 Figure 1. Schematic representation of 96 accessions from Triticum and Aegilops sp. showing their origin and breeding status. In total, there are thirty-five accessions of hexaploid wheats, thirty-seven accessions of tetraploid wheats, and twenty-four accessions of diploid wheats. AA, BB, and DD: diploids; BBAA: tetraploids; BBAADD: hexaploids (partially adapted from Ozuna and Barro) [3]. The frequency/abundance of each peptide in the sequences of the different wheats was studied in silico. The abundance of each epitope was calculated by multiplying the total number of epitopes found in a given gene by the frequency of that gene in the genome. These canonical CD epitopes and their most representative variants with one or two mismatches were synthesized as deaminated and non-deaminated 9-mer peptides. The peptides were supplied by Biomedal S.L. (Seville, Spain). 2.2. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Maxisorp microtitre plates (Nunc, Roskilde, Denmark) were coated with gliadin solution (Sigma, St Louis, MO, USA) and incubated overnight at 4 °C. The plates were washed with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.05% Tween 20 and blocked with PBS-bovine serum albumin (BSA) 3% for 1 h at room temperature (RT), and 33-mer peptide was used as standard. Serial dilutions of peptides were made, to each of which horseradish peroxidase (HRP)-conjugate with anti- 33-mer antibody (moAb) was added [32]. The samples were pre-incubated at RT for 1 h and then added to the wells. After 1 h of incubation at RT, the plates were washed and substrate solution (TMB, Sigma) was added. The reaction was stopped at 15 min with 1 M sulfuric acid and the absorbance at 450 nm was measured (microplate reader UVM340; Asys Hitech GmbH, Eugendorf, Austria). Two separate assays were performed, each with two repetitions. 2.3. Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Cultures Peripheral blood mononuclear cells from 18 child patients with active CD on a gluten-containing diet were isolated from 6 mL of heparinized blood by Histopaque gradient centrifugation and cultured at a density of 1×106 cells per milliliter in 96-multiwell culture plates in RPMI-1640 culture medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (GIBCO-Invitrogen Ltd), 1% penicillin-streptomycin, and 0.1% gentamicin (Sigma-Aldrich). After 48 h, PBMCs were incubated with different peptides (50 µg/mL). After 48 h of stimulation, the free supernatants were collected and stored at −80 °C until the interferon gamma (IFN-γ) analyses were carried out. 2.4. Cell Proliferation Analysis Figure 1. Schematic representation of 96 accessions from Triticum and Aegilops sp. showing their origin and breeding status. In total, there are thirty-five accessions of hexaploid wheats, thirty-seven accessions of tetraploid wheats, and twenty-four accessions of diploid wheats. AA, BB, and DD: diploids; BBAA: tetraploids; BBAADD: hexaploids (partially adapted from Ozuna and Barro) [3]. 2.2. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Maxisorp microtitre plates (Nunc, Roskilde, Denmark) were coated with gliadin solution (Sigma, St Louis, MO, USA) and incubated overnight at 4 ◦ C. The plates were washed with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.05% Tween 20 and blocked with PBS-bovine serum albumin (BSA) 3% for 1 h at room temperature (RT), and 33-mer peptide was used as standard. Serial dilutions of peptides were made, to each of which horseradish peroxidase (HRP)-conjugate with anti-33-mer antibody (moAb) was added [ 32 ]. The samples were pre-incubated at RT for 1 h and then added to the wells. After 1 h of incubation at RT, the plates were washed and substrate solution (TMB, Sigma) was added. The reaction was stopped at 15 min with 1 M sulfuric acid and the absorbance at 450 nm was measured (microplate reader UVM340; Asys Hitech GmbH, Eugendorf, Austria). Two separate assays were performed, each with two repetitions. 2.3. Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Cultures Peripheral blood mononuclear cells from 18 child patients with active CD on a gluten-containing diet were isolated from 6 mL of heparinized blood by Histopaque gradient centrifugation and cultured at a density of 1 × 10 6 cells per milliliter in 96-multiwell culture plates in RPMI-1640 culture medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (GIBCO-Invitrogen Ltd), 1% penicillin-streptomycin, and 0.1% gentamicin (Sigma-Aldrich). After 48 h, PBMCs were incubated with different peptides (50 µ g/mL). After 48 h of stimulation, the free supernatants were collected and stored at −80 ◦C until the interferon gamma (IFN-γ) analyses were carried out. 2.4. Cell Proliferation Analysis T-cell proliferation was determined after 48 h of incubation using the ELISA 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) cell proliferation test (Millipore Chemicon, Temecula, California, USA). The stimulation index (SI) value was calculated by dividing the mean absorbance at 450 nm after stimulation by the mean absorbance of T cells exposed to the culture medium alone (negative control). Nutrients 2019,11, 220 5 of 13 2.5. IFN-γProduction Supernatants from the PBMC culture were collected after 48 h and stored at 80 ◦ C for IFN- γ determination using a commercial ELISA kit in accordance with the manufacturer’s instructions (Thermo Scientific, Madrid, Spain). Standards were run on each plate. The sensitivity of the assay was <2 pg/mL. 2.6. Statistical Analysis of T Cells and IFN-γAssays Each experiment was carried out in duplicate on separate days. The data is expressed as mean and SD. All statistical analyses were performed with the STATGRAPHICS Centurion XVI program. The analysis of variance (ANOVA), followed by the Tukey test for mean multiple comparison, was used. In this study, pvalues lower than 0.05 (p< 0.05) were considered significant. 3. Results and Discussion 3.1. Relative Abundance of DQ2.5-Glia- α 1, DQ2.5-Glia- α 2, and DQ2.5-Glia- α 3 Domains and Their Variants in Triticum and Aegilops Species The complete repertoire of peptides involved in the pathogenesis of CD remains a daunting task due to the great heterogeneity of gluten proteins [ 23 , 26 ]. Several studies have demonstrated that peptides derived from α -gliadins induce the strongest T-cell responses in the vast majority of patients [ 23 , 33 – 35 ]. The α -gliadins can have different sequences and their proportions in each species are also variable. In the present study, we have explored the abundance of different DQ2.5-glia- α 1, DQ2.5-glia- α 2, and DQ2.5-glia- α 3 variants in 96 genotypes from diploid and polyploid wheats. Among these genotypes, 27 accessions were commercial lines and 69 were non-commercial lines (Figure 1). The DQ2.5-glia- α epitopes are located in the 33-mer region of α -gliadins (Figure 2a). Although seventy-eight variants were found for these three canonical epitopes across the Triticeae species [ 29 ], only the most representative variants (covered by >80 reads), encompassing one or two mismatches, were used for this study; of which 9 variants were from DQ2.5-glia- α 1, 10 from DQ2.5-glia- α 2, and 14 from DQ2.5-glia-α3 (Figure 2b). Nutrients 2018, 10, x FOR PEER REVIEW 5 of 14 T-cell proliferation was determined after 48 h of incubation using the ELISA 5-bromo-2- deoxyuridine (BrdU) cell proliferation test (Millipore Chemicon, Temecula, California, USA). The stimulation index (SI) value was calculated by dividing the mean absorbance at 450 nm after stimulation by the mean absorbance of T cells exposed to the culture medium alone (negative control). 2.5. IFN-γ Production Supernatants from the PBMC culture were collected after 48 h and stored at 80 °C for IFN- γ determination using a commercial ELISA kit in accordance with the manufacturer’s instructions (Thermo Scientific, Madrid, Spain). Standards were run on each plate. The sensitivity of the assay was <2 pg/mL. 2.6. Statistical Analysis of T Cells and IFN-γ Assays Each experiment was carried out in duplicate on separate days. The data is expressed as mean and SD. All statistical analyses were performed with the STATGRAPHICS Centurion XVI program. The analysis of variance (ANOVA), followed by the Tukey test for mean multiple comparison, was used. In this study, p values lower than 0.05 (p < 0.05) were considered significant. 3. Results and Discussion 3.1. Relative Abundance of DQ2.5-Glia-α1, DQ2.5-Glia-α2, and DQ2.5-Glia-α3 Domains and Their Variants in Triticum and Aegilops Species. The complete repertoire of peptides involved in the pathogenesis of CD remains a daunting task due to the great heterogeneity of gluten proteins [23,26]. Several studies have demonstrated that peptides derived from α-gliadins induce the strongest T-cell responses in the vast majority of patients [23,33–35]. The α-gliadins can have different sequences and their proportions in each species are also variable. In the present study, we have explored the abundance of different DQ2.5-glia-α1, DQ2.5- glia-α2, and DQ2.5-glia-α3 variants in 96 genotypes from diploid and polyploid wheats. Among these genotypes, 27 accessions were commercial lines and 69 were non-commercial lines (Figure 1). The DQ2.5-glia-α epitopes are located in the 33-mer region of α-gliadins (Figure 2a). Although seventy-eight variants were found for these three canonical epitopes across the Triticeae species [29], only the most representative variants (covered by >80 reads), encompassing one or two mismatches, were used for this study; of which 9 variants were from DQ2.5-glia-α1, 10 from DQ2.5-glia-α2, and 14 from DQ2.5-glia-α3 (Figure 2b). Figure 2. Celiac disease (CD) epitopes and variants derived from α-gliadin. (a) Location of canonical epitopes DQ-2.5-glia-α1, DQ-2.5-glia-α2, and DQ-2.5-glia-α3 into α-gliadin protein. (b) Variants of the canonical CD epitopes with one or two mismatches selected with more than 80 reads found in Triticum and Aegilops ssp. The mismatches are indicated in red. Figure 2. Celiac disease (CD) epitopes and variants derived from α -gliadin. ( a ) Location of canonical epitopes DQ-2.5-glia- α 1, DQ-2.5-glia- α 2, and DQ-2.5-glia- α 3 into α -gliadin protein. ( b ) Variants of the canonical CD epitopes with one or two mismatches selected with more than 80 reads found in Triticum and Aegilops ssp. The mismatches are indicated in red. In view of the total abundance of the different canonical epitopes, DQ2.5-glia- α 1 and DQ2.5-glia- α 3 were more abundant than DQ2.5-glia- α 2 (p< 0.05, Figure 3). There were no significant differences between the abundance of DQ2.5-glia- α 1 and DQ2.5-glia- α 3, however, we found higher variability of the DQ2.5-glia- α 1 canonical epitope in hexaploid wheats, since its abundance fluctuated Nutrients 2019,11, 220 12 of 13 11. Herrera, M.J.; Hermoso, M.A.; Quera, R. An update on the pathogenesis of celiac disease. Revista Medica de Chile 2009,137, 1617–1626. 12. Brandtzaeg, P. The changing immunological paradigm in coeliac disease. Immunol. Lett 2006 ,105, 127–139. [CrossRef] [PubMed] 13. 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Sollid, L.M.; Qiao, S.W.; Anderson, R.P.; Gianfrani, C.; Koning, F. Nomenclature and listing of celiac disease relevant gluten T-cell epitopes restricted by HLA-DQ molecules. Immunogenetics 2012 ,64, 455–460. [CrossRef] [PubMed] 27. Escarnot, E.; Gofflot, S.; Sinnaeve, G.; Dubois, B.; Bertin, P.; Mingeot, D. Reactivity of gluten proteins from spelt and bread wheat accessions towards A1 and G12 antibodies in the framework of celiac disease. Food Chem. 2018,268, 522–532. [CrossRef] [PubMed] 28. Dubois, B.; Bertin, P.; Muhovski, Y.; Escarnot, E.; Mingeot, D. Development of TaqMan probes targeting the four major celiac disease epitopes found in α -gliadin sequences of spelt (Triticum aestivum ssp. spelta) and bread wheat (Triticum aestivum ssp. aestivum). Plant Methods 2017,13, 1–14. [CrossRef] 29. Ozuna, C.V.; Iehisa, J.C.M.; Giménez, M.J.; Alvarez, J.B.; Sousa, C.; Barro, F. 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Monitoring of gluten-free diet compliance in celiac patients by assessment of gliadin 33-mer equivalent epitopes in feces. Am. J. Clin. Nutr. 2012,95, 670–677. [CrossRef] [PubMed] 33. ArentzHansen, H.; McAdam, S.N.; Molberg, Ø.; Fleckenstein, B.; Lundin, K.E.A.; Jørgensen, T.J.D.; Jung, G.; Roepstorff, P.; Sollid, L.M. Celiac lesion T cells recognize epitopes that cluster in regions of gliadins rich in proline residues. Gastroenterology 2002,123, 803–809. [CrossRef] 34. Vader, W.; Stepniak, D.; Kooy, Y.; Mearin, L.; Thompson, A.; van Rood, J.J.; Spaenij, L.; Koning, F. The HLA-DQ2 gene dose effect in celiac disease is directly related to the magnitude and breadth of gluten-specific T cell responses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003,100, 12390–12395. [CrossRef] [PubMed] 35. Ciccocioppo, R.; Di Sabatino, A.; Corazza, G.R. The immune recognition of gluten in coeliac disease. Clin. Exp. Immunol. 2005,140, 408–416. [CrossRef] [PubMed] 36. Payne, P.I.; Jackson, E.A.; Holt, L.M. 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Tetraploid and hexaploid wheat varieties reveal large differences in expression of alpha-gliadins from homoeologous Gli-2 loci. BMC Genom. 2009,10, 48. [CrossRef] 40. Kim, C.Y.; Quarsten, H.; Bergseng, E.; Khosla, C.; Sollid, L.M. Structural basis for HLA-DQ2-mediated presentation of gluten epitopes in celiac disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004 ,101, 4175–4179. [CrossRef] 41. Tye-Din, J.A.; Stewart, J.A.; Dromey, J.A.; Beissbarth, T.; Van Heel, D.A.; Tatham, A.; Henderson, K.; Mannering, S.I.; Gianfrani, C.; Jewell, D.P.; et al. Comprehensive, quantitative mapping of T cell epitopes in gluten in celiac disease. Sci. Transl. Med. 2010,2. [CrossRef] 42. Schumann, M.; Siegmund, B.; Schulzke, J.D.; Fromm, M. Celiac Disease: Role of the Epithelial Barrier. Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 2017,3, 150–162. [CrossRef] [PubMed] 43. Vartdal, F.; Johansen, B.H.; Friede, T.; Thorpe, C.J.; Stevanovi´c, S.; Eriksen, J.E.; Sletten, K.; Thorsby, E.; Rammensee, H.G.; Sollid, L.M. 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VALOR PREDICTIVO NEGATIVO DE LA AUSENCIA REPETIDA DE PÉPTIDOS INMUNOGÉNICOS DEL GLUTEN EN ORINA PARA LA PREDICCIÓN DE LA RECUPERACIÓN DE LA MUCOSA DE PACIENTES CELÍACOS TRATADOS 52 Negative predictive value of the repeated absence of gluten immunogenic peptides in the urine of treated celiac patients in predicting mucosal healing: new proposals for follow-up in celiac disease Ángela Ruiz-Carnicer,1 Marta Garzón-Benavides,2 Blanca Fombuena,2 Verónica Segura,1 Francisco García-Fernández,2 Salvador Sobrino-Rodríguez,2 Lourdes Gómez-Izquierdo,3 Marcos A Montes-Cano,4 Alfonso Rodríguez-Herrera,5 Raquel Millán,2 María C Rico,2 Carmen González-Naranjo,2 Juan M Bozada-García,6 Jacobo Díaz,7 Cristóbal Coronel- Rodríguez,8 Beatriz Espín,9 Manuel Romero-Gómez,2 Ángel Cebolla,10 Carolina Sousa,1 Isabel Comino,1 Federico Argüelles,11 and Ángeles Pizarro2 1Department of Microbiology and Parasitology, Faculty of Pharmacy, University of Seville, Seville, Spain; 2Digestive disease clinical unit, gastroenterology division, Virgen del Rocío Hospital, Seville, Spain; 3Pathology Service, Virgen del Rocío Hospital, Seville, Spain; 4Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), Seville, Spain. Associated professor, Faculty of Medicine, University of Seville, Seville, Spain; 5Saint Luke’s General Hospital, Kilkenny, Ireland; 6Endoscopy of Digestive Diseases Clinical Unit, Virgen del Rocío Hospital, Seville, Spain; 7Clinical Analysis Service, Hospital Universitario INGESA, Ceuta, Spain; 8Health Center Amante Laffón , Seville, Spain; 9Pediatric, Gastroenterology, Hepatology and Nutrition Section, Virgen del Rocio Children´s Hospital, Seville, Spain; 10Biomedal SL, Seville, Spain; and 11Digestive Diseases Clinical Unit, Virgen Macarena Hospital, Seville, Spain. Am J Clin Nutr 2020; 00:1–12. 53 CAPÍTULO 6. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN La eliminación del gluten de la dieta como único tratamiento para la enfermedad celíaca, ha impulsado la investigación y validación de nuevas técnicas de control menos invasivas y asequibles que mejoren la identificación y seguimiento de los pacientes celíacos que están expuestos regularmente al gluten (voluntaria o involuntariamente) mientras siguen una DSG. La permanente dieta libre de gluten que, si bien es muy eficaz, puede resultar a veces una tarea difícil debido a que los productos a base de trigo y otros cereales son de uso común en nuestra dieta diaria. Mientras que muchos pacientes logran una recuperación total de su enfermedad mediante el seguimiento de una dieta libre de gluten y consiguen mantenerla de manera estricta; hay pacientes que requieren un seguimiento periódico para conocer la eficacia del tratamiento, y otros muchos que darían la bienvenida a nuevos productos alimenticios que permitan una mayor flexibilidad de su dieta. Los trabajos presentados en esta Tesis Doctoral se centran en el desarrollo nuevas estrategias para el control de la enfermedad celíaca. La enfermedad celíaca es una enteropatía autoinmune crónica que aparece cuando individuos genéticamente susceptibles ingieren gluten derivado de trigo, cebada, centeno y algunas avenas, en la dieta. Los pacientes con un diagnóstico de enfermedad celíaca necesitan adoptar una dieta sin gluten de por vida (Ludvigsson et al., 2012). La dieta libre de gluten fue propuesta como tratamiento para la enfermedad celíaca, permitiéndose de esta manera la recuperación clínica y funcional de la mucosa del intestino y la desaparición de la sintomatología. De hecho, a día de hoy la dieta sin gluten ha demostrado ser segura y eficaz en la mayoría de los pacientes con enfermedad celíaca. No obstante, las dificultades para garantizar una correcta dieta sin gluten y las deficiencias en el espectro de herramientas disponibles para el control a largo plazo del paciente celíaco han impulsado la investigación de nuevas alternativas terapéuticas, sin embargo, hoy por hoy ninguna de ellas puede reemplazar la DSG. La ingestión de gluten se ha relacionado con una variedad de trastornos clínicos, los cuales han surgido gradualmente como un fenómeno epidemiológicamente relevante con una prevalencia global estimada de alrededor del 5%. Además de la enfermedad celíaca, está la alergia al trigo y la sensibilidad al gluten no celíaca, las cuales representan diferentes trastornos relacionados con el gluten (Elli et al., 2015). En esta tesis doctoral, se ha hecho una revisión de las diferencias y la superposición en la presentación clínica entre los trastornos relacionados con el gluten y un estudio global de la dieta libre de gluten. 54 La disponibilidad de anticuerpos frente a uno de los péptidos más inmunotóxicos del gluten de trigo (Morón et al., 2008a; 2008b), y el desarrollo de inmunoensayos para la detección del consumo inadvertido de gluten mediante la medición de GIP en muestras humanas (heces y orina), se han desarrollado en esta Tesis Doctoral nuevas estrategias de control de la enfermedad celíaca mediante dos enfoques alternativos. Uno de ellos estuvo centrado en la determinación del potencial inmunotóxico de péptidos derivados de α-gliadinas de variedades de trigo, los cuales inducen fuertes respuestas de las células T en la gran mayoría de los pacientes (Mitea et al., 2010; Sollid et al., 2012; Soler et al., 2016; Caio et al., 2019). Para demostrar esta hipótesis se ha usado variedades de la tribu Triticeae, concretamente especies de Triticum y Aegilops y se ha discutido su immunogenicidad obtenida mediante células T de pacientes celíacos. Por otro lado, se ha estudiado la abundancia de las variantes de los epítopos tóxicos en todas las secuencias de α-gliadinas y su reactividad mediante técnicas inmunológicas basadas en anticuerpos G12 y A1, con el fin de comprobar si había una correlación entre la reactividad de dichas variedades frente a estos anticuerpos y su inmunogenicidad. El segundo de los enfoques está orientado a la evaluación de la utilidad clínica de la determinación de GIP en orina como un biomarcador del cumplimiento de la DSG en pacientes celíacos. Además de correlacionar la detección de GIP en orina con los métodos tradicionales y probar su utilidad como predictor de la actividad histológica. Patologías asociadas al gluten El trigo, el arroz y el maíz son los cereales más consumidos. El trigo, es el más cultivado en el mundo debido a su adaptabilidad a diferentes ambientes y a su alto rendimiento, así como por las propiedades biomecánicas que presenta su masa. Los productos de trigo hacen contribuciones sustanciales a la ingesta dietética de energía y proteínas, y suministran fibra, minerales y vitaminas (Kasarda, 2013; Lundin, 2014). Sin embargo, también tienen impactos negativos en la salud humana, en relación con las alergias y las intolerancias. Estos trastornos están relacionados con la exposición al gluten, el principal complejo proteico estructural del trigo y otros cereales como el centeno, la cebada y la avena. Las diferentes patologías asociadas a la ingesta de cereales, así como el seguimiento de la dieta sin gluten, se han estudiado en el capítulo 3. La EC es un trastorno autoinmune desarrollado en individuos predispuestos genéticamente (HLA-DQ2/DQ8) y causado por una intolerancia permanente al gluten contenido en algunos cereales, como el trigo, el centeno, la cebada y algunas variedades de avena que conduce a una inflamación crónica del intestino delgado ( Jabri 55 y Sollid, 2006; Makharia et al., 2012; Ludvigsson et al., 2013. El diagnóstico de EC se basa en una combinación de hallazgos de la historia clínica del paciente, marcadores genéticos, anticuerpos serológicos específicos y análisis histopatológicos de las muestras duodenales. La prueba serológica preferida para la detección de EC en sujetos mayores de 2 años es el anticuerpo anti-transglutaminasa IgA (TTG) (van der Windt et al., 2010). El anticuerpo anti-endomisio (EMA) se puede utilizar como prueba confirmatoria en casos de diagnóstico incierto en poblaciones de alto riesgo (Leffer y Schuppan, 2010). Sin embargo, la prueba EMA es costosa y depende del operador debido a la interpretación del patrón inmunofluorescente. El péptido de gliadina desamidada (DGP) IgA e IgG, en sustitución de los anticuerpos anti-gliadina, se usan en combinación con TTG IgA en niños menores de 2 años (Husby et al., 2012). Los análisis histopatológicos generalmente se basan en la clasificación histológica de Marsh-Oberhuber que varía desde una mucosa normal (Marsh 0) hasta la aparición de infiltración linfocítica (Marsh 1), hiperplasia de la cripta (Marsh 2) y diferentes niveles de atrofia vellositaria (Marsh 3), aunque esta clasificación sigue siendo subjetiva. Se han propuesto clasificaciones más objetivas y prácticas en los últimos años, como la de Corazza y Villanacci o la de Ensari (Peña, 2015; Escudero-Hernández et al., 2016). Sin embargo, actualmente se sabe que las reacciones al gluten no se limitan a la EC, sino que ahora apreciamos la existencia de un espectro de trastornos relacionados con el gluten, donde se incluye la alergia al trigo (AT) y la sensibilidad al lgluten no celíaca (SGNC). La AT se define como una reacción inmunológica adversa mediada por IgE por proteínas de trigo, pero no a otros cereales. Dependiendo de la ruta de exposición a los alérgenos, la AT se clasifica en asma ocupacional (asma de panadero) y rinitis; alergia alimentaria (AA), que afecta la piel, el tracto gastrointestinal o el tracto respiratorio; anafilaxia inducida por ejercicio dependiente del trigo y urticaria de contacto. Los anticuerpos IgE juegan un papel central en la patogénesis de estas enfermedades. La SGNC ha sido reconocida como un nuevo síndrome relacionado con el gluten por la comunidad científica, pero el conocimiento sobre este síndrome todavía es incompleto con pocas certezas y muchos problemas sin resolver. Además de EC y AT, hay un tercer síndrome relacionado con el gluten en el que los mecanismos inmunológicos no están relacionados con la presencia de IgE, como en AT, o una respuesta inmune adaptativa caracterizada por la presencia de células T reactivas al gluten y anticuerpos dirigidos contra TTG o péptidos de gluten desaminados como en EC. Se cree que este síndrome, SGNC, surge de una respuesta inmune innata al gluten de la dieta no acoplada a una respuesta inmune adaptativa secundaria (Escudero- Hernández, 2016). Por lo tanto, el SGNC se considera un trastorno inmunomediado 56 caracterizado por una activación de la inmunidad innata, pero se necesitan más estudios para confirmar esto y determinar si la inmunidad adaptativa puede contribuir a su patogénesis. El tratamiento de los trastornos relacionados con el gluten se basa en la exclusión de los cereales que contienen gluten de la dieta. Se debe hacer un seguimiento de los pacientes con entrevistas dietéticas y serología como marcadores de EC para garantizar el cumplimiento de la dieta, pero ninguno de estos métodos ofrece una medida precisa del cumplimiento de la dieta. Por lo tanto, se han desarrollado nuevas herramientas basadas en la determinación de GIP en heces y orina para un mejor seguimiento del cumplimiento de la DSG de una manera menos subjetiva y no invasiva. Potencial inmunogénico de variantes de eptopo de α-gliadina El trigo es uno de los cereales más cultivados en el mundo y constituye una fuente importante de energía, proteínas y fibra en la dieta. La creciente demanda mundial de trigo y su posterior consumo, con una producción anual de alrededor de 750 millones de toneladas, se debe a sus propiedades viscoelásticas únicas para su inclusión en productos alimenticios y a la industrialización y occidentalización (Shewry y Hey, 2015; Ozuna y Barro, 2018). El trigo ha evolucionado a través de la alopoliploidización, es decir, a través de la hibridación entre especies de los géneros Aegilops y Triticum, seguido de la duplicación del genoma (Feldman y Levy, 2012). La principal especie de trigo que se cultiva en todo el mundo es el hexaploide T. aestivum, generalmente llamado trigo "común" o "pan". En términos de producción total, la siguiente variedad importante es el trigo duro tetraploide (T. turgidum L. subsp. Durum Desf.). Esto se adapta a climas secos y calientes y se usa ampliamente para la producción de pasta. Las especies de trigo común representan casi el 94% de la producción total, con el trigo duro representando el 5%, y otras formas de trigo alrededor del 1% (Petersen et al., 2006; Arzani et al., 2007). Aunque el trigo siempre ha sido reconocido como un alimento fundamental, ciertas personas no pueden tolerar este cereal, ya que es responsable de patologías significativas, llamadas trastornos relacionados con el gluten, como la EC, la AT, la SGNC, ataxia al gluten y dermatitis herpetiforme (Ludvigsson et al., 2013). Las proteínas del gluten son ricas en residuos de prolina y glutamina, lo que las hace resistentes a ser completamente digeridas en la vía gastrointestinal. La digestión parcial del gluten genera péptidos pequeños que provocan trastornos autoinmunes en personas celíacas. El 57 modelo más aceptado para explicar la inmunopatogénesis EC es el modelo de dos señales (Brandtzaeg, 2006) caracterizado por una primera respuesta inmune innata seguida de una respuesta adaptativa secundaria específica de antígeno. Según este modelo, ciertos péptidos, como el péptido de gliadina de 19 mer, desencadenan una respuesta inmune innata (Maiuri et al., 2003) caracterizada principalmente por la producción de IL-15 por las células epiteliales. El resultado es la ruptura de la barrera epitelial, al aumentar la permeabilidad e inducir la apoptosis de los enterocitos (Maiuri et al., 2000). Como consecuencia, los péptidos inmunoadaptativos, como el 33-mer, ahora pueden alcanzar la lámina propia donde son desaminados por la transglutaminasa tisular (tTG2). Tal desamidación proporciona una carga negativa a los péptidos de gliadina y, por lo tanto, aumenta su afinidad para unirse dentro del enlace HLA-DQ2 / 8, que también es el 'gen de susceptibilidad' en CD, expresado en la superficie de las células dendríticas (DC) (Qiao et al., 2004; Ráki et al., 2006; Tollefsen et al., 2006) Las DC son, por lo tanto, centrales en la patogénesis de la EC, ya que presentan un antígeno de gluten para las células T (Bernardo, 2013), lo que impulsa la progresión de la respuesta inmune adaptativa específica del antígeno proinflamatorio, que se convertirá en la sintomatología de la enfermedad. En trabajos anteriores, la secuenciación de próxima generación y la secuenciacin de Sanger de α-gliadinas de los trigos diploides y poliploides proporcionaron seis tipos de α-gliadinas con grandes diferencias en sus frecuencias. Los epítopos canónicos de CD y sus variantes se identificaron en los diferentes tipos de α-gliadinas (Ozuna et al., 2015). En el capítulo 4, utilizamos los datos de secuencia obtenidos en (Ozuna et al., 2015), y ahora nos hemos extendido explorando la abundancia de diferentes DQ2.5-glia-α1, DQ2.5-glia-α2 y DQ2.5-glia- variantes del eptopo α3 por especie en trigos diploides y poliploides. Además, de estudiar el potencial inmunogénico de estas variantes de epítopos en especies de trigo probando su capacidad de unión a anticuerpos monoclonales anti-33-mer (moAbs) e induciendo la proliferación de células T. Nuestro estudio mostró que los epítopos canónicos DQ2.5- glia-α1 y DQ2.5-glia-α3 fueron más frecuentes que DQ2.5-glia-α2. La modificacin natural más abundante se encontró en el dominio DQ2.5-glia-α3 en todas las secuencias estudiadas. Sin embargo, esta variante disminuyó su inmunogenicidad con respecto al epítopo canónico. Por otro lado, una de las variantes más representativas de DQ2.5- glia-α2 (40%) mostr una inmunogenicidad equivalente al eptopo cannico. Nuestros resultados proporcionaron un enfoque racional para la introducción o selección de sustituciones de aminoácidos naturales para eliminar la toxicidad de tres epítopos de células T de α-gliadina, manteniendo las propiedades tecnológicas del trigo comercial. 58 Los resultados obtenidos sobre el potencial inmunogénico de las α-gliadina supone un paso más en el conocimiento de las fracciones que pueden ser tóxicas para los pacientes celíacos. Esto podría ayudar, en un futuro, a la obtención variedades de trigo más saludables y con menor contenido en gluten tóxico para el colectivo celíaco. Este hecho resultaría de gran valor para los pacientes celíacos desde un punto de vista nutricional, permitiendo mejorar la calidad de vida de este colectivo. Validación clínica de un biomarcador para el seguimiento del paciente celíaco Un tercio de los pacientes con EC se exponen al gluten a pesar de los mejores esfuerzos para realizar modificaciones en la dieta (Barratt et al., 2011; Matoori et al., 2013; Commino et al., 2016; Moreno et al., 2017). Además, del 36% al 55% de los pacientes que confirman la adhesión completa a una DSG no logran la remisión histológica, posiblemente debido a lapsos involuntarios en su ingesta diaria de gluten (Hall et al., 2013; Tio et al., 2012; Stoven et al., 2012; Matoori et al., 2013). La prevalencia de atrofia vellositaria persistente ha cambiado con el tiempo, hay mayores tasas de recuperación en los últimos años. Las diferencias sociales asociadas con la atrofia persistente sugieren que el acceso a una DSG y / o educación sobre un DSG afecta la recuperación de la mucosa (Lebwohl et al., 2014). Actualmente, los métodos para evaluar la adherencia a la DSG comprenden un cuestionario dietético, serología o síntomas clínicos; sin embargo, ninguno de estos métodos genera una medida directa o precisa de la adherencia a la dieta. La biopsia del intestino delgado es el método "estándar de oro" para el diagnóstico de EC. Sin embargo, de acuerdo con la mayoría de las guías clínicas, su papel en el seguimiento de los pacientes se limita a los casos que involucran una falta de respuesta clínica o la recurrencia de los síntomas (Husby y Bai, 2019; Lähdeaho et al., 2011; Sharkey et al., 2013; Silvester et al., 2017; Ludvigsson et al., 2014). La validación de nuevas técnicas de diagnóstico menos invasivas y asequibles podría mejorar la identificación de los pacientes celíacos que están expuestos regularmente al gluten (voluntaria o involuntariamente) mientras siguen una DSG. Los anticuerpos monoclonales que pueden ayudar a detectar de manera sensible y específica los péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) se han utilizado en el desarrollo de inmunoensayos para la detección del consumo inadvertido de gluten mediante la medición de GIP en muestras humanas (heces y orina) (Comino et al., 2016; Moreno et al., 2017; Comino et al., 2012; Comino et al., 2019; Gerasimidis et al., 2018; Roca et al., 2019; Costa et al., 2019; Cebolla et al., 2018). En el capítulo 5 nuestro objetivo en este 65 Ozuna, C.V.; Barro, F. (2018). Characterization of gluten proteins and celiac disease-related immunogenic epitopes in the Triticeae: Cereal domestication and breeding contributed to decrease the content of gliadins and gluten. Mol. Breed, 38, 22. Ozuna, C.V.; Iehisa, J.C.M.; Giménez, M.J.; Alvarez, J.B.; Sousa, C.; Barro, F. (2015). Diversification of the celiac disease-gliadin complex in wheat: A 33-mer peptide with six overlapping epitopes, evolved following polyploidization. Plant J., 82, 794–805. Peña, A.S. (2015). What is the best histopathological classification for celiac disease? Does it matter? Gastroenterol Hepatol Bed Bench, 8(4), 239-243. Petersen, G.; Seberg, O.; Yde, M.; Berthelsen, K. (2006). Phylogenetic relationships of Triticum and Aegilops and evidence for the origin of the A, B, and D genomes of common wheat (Triticum aestivum). Mol. Phylogenet. Evol., 39, 70–82. Qiao, S.W.; Bergseng, E.; Molberg, O.; Xia, J.; Fleckenstein, B.; Khosla, C.; Sollid, L.M. (2004). Antigen Presentation to Celiac Lesion-Derived T Cells of a 33-Mer Gliadin Peptide Naturally Formed by Gastrointestinal Digestion. J. Immunol, 173, 1757–1762. Ráki, M.; Tollefsen, S.; Molberg, Ø.; Lundin, K.E.A.; Sollid, L.M.; Jahnsen, F.L. (2006). 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El tratamiento de los trastornos relacionados con el gluten se basa en la exclusión de la dieta de los cereales que contienen estas proteínas. Los pacientes con enfermedad celíaca deben someterse a una estricta dieta sin gluten para evitar complicaciones en su salud a corto y largo plazo. En contraste, en los pacientes con sensibilidad al gluten no celíaca la falta de adherencia a la dieta sólo condicionará recaídas sintomáticas. En el caso de los pacientes que padecen alergia al trigo solo se debe excluir este cereal. 3. El estudio de trigos de los géneros Triticum y Aegilops ha permitido determinar las sustituciones de aminoácidos naturales que eliminan la toxicidad de los principales epítopos capaces de estimular las células T de los pacientes celíacos, en la αgliadina. Se ha demostrado que la introducción natural del aminoácido glutamina (Q) por histidina (H) en cualquier posición elimina la imnunogenicidad del epítopo. 4. El estudio de las variantes de los epítopos canónicos de las α-gliadinas de los trigos analizados ha demostrado que los cambios de aminoácidos más representativos son prolina (P) por serina (S) y arginina (R) por P , comprobándose que en la mayoría de los casos no conduce a la eliminación del potencial inmunogénico de la variante de epítopo. 5. La determinación de GIP en orina ha puesto de manifiesto por primera vez que el 18% de los pacientes reduce el consumo de gluten previo a diagnóstico de EC. Por lo tanto, la medida de GIP podría ayudar a verificar que se ha consumido gluten antes de considerar un resultado negativo en serología e histología. 6. El ensayo clínico de validación de GIP en orina ha demostrado que entre el 60% y el 80% de los pacientes con lesiones histológicas severas (Marsh II-III) tuvieron serología negativa, fueron asintomáticos y decían tener buena adherencia a la DSG según CDAT. Sin embargo, el 95% de estos pacientes presentaron GIP en orina. 68 7. La validación clínica de la determinación de GIP en orina predice la ausencia de lesión histológica con un VPN del 97% y una sensibilidad del 94% mediante recogida de tres muestras de orina en el periodo de una semana. El uso de este biomarcador ha permitido establecer por primera vez un algoritmo de seguimiento del paciente celíaco evitando la utilización de técnicas invasivas.