Activación de las células glómicas por hipoxia y lactato: el cuerpo carotídeo como sensor metabólico.

! ! Instituto de Biomedicina de Sevilla Facultad de Medicina Departamento de Fisiología Médica y Biofísica TESIS DOCTORAL Activación de las células glómicas por hipoxia y lactato. El cuerpo carotídeo como sensor metabólico. Hortensia Torres Torrelo Sevilla, 2018 ! ! Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral han sido publicados en las revistas científicas que se indica más abajo. Como los textos originales no se han utilizado de forma literal, no se ha considerado necesario solicitar permiso para reproducirlos traducidos al español. Artículos científicos publicados: Arias-Mayenco I, González-Rodríguez P, Torres-Torrelo H, Gao L, Fernández-Agüera MC, Bonilla-Henao V, Ortega-Sáenz P & López-Barneo J. (2018). Acute O2 sensing: role of coenzyme QH2/Q ratio and mitochondrial ROS compartmentalization. Cell Metab 28, 145- 158. Torres-Torrelo H, Ortega-Sáenz P, Macías D, Omura M, Zhou T, Matsunami H, Johnson RS, Mombaerts P & López-Barneo J. (2018). The role of Olfr78 in the breathing circuit of mice. Nature 561, 33-40. ! ! ! AGRADECIMIENTOS Agradezco a mis directores de Tesis los Drs. José López Barneo y Patricia Ortega Sáenz, su enseñanzas, su apoyo y dedicación en este proyecto. El trabajo que se describe, realizado con metodología muy diferentes, ha sido posible gracias a la participación fundamental de Ignacio Arias Mayenco y Lin Gao. Agradecer también a todo mi grupo de investigación “El laboratorio 101” del IBIS. Esta Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a una beca predoctoral del programa FPI del Ministerio de economía y competitividad, a ayudas del Plan Nacional al grupo de investigación y a un proyecto europeo ERC. ! ! iii! ÍNDICE INTRODUCCIÓN…………………………………………………………..... 1 1. Sistema homeostático sensor agudo de oxígeno……………….…………… 3 2. Fisiología del cuerpo carotídeo…………………………………………....... 4 2.1. Aspectos generales sobre la estructura y función del cuerpo carotídeo…………………………………………………………………….. 4 2.2. Modelo de membrana de quimiotransducción…………………………. 6 3. Hipótesis actuales sobre el “sensor de oxígeno” del cuerpo carotídeo…........ 8 3.1 Hipótesis mitocondrial………………………………………………….. 8 3.2. El receptor Olfr78 como sensor de hipoxia del cuerpo carotídeo…….... 16 3.2.1. Receptor Olfr78 e hipoxia………………………………………. 16 3.2.2. Receptor Olfr78 y lactato……………………………………….. 17 4. Metabolismo del lactato; importancia biológica……………………………. 18 4.1. Producción y función de lactato……………………………………….. 18 4.2. Lactato y regulación de la respiración…………………………………. 22 4.2.1. Lactato e hipoxia……………………………………………....... 22 OBJETIVOS………………………………………………………………….. 25 MATERIALES Y MÉTODOS……………………………….……………… 29 1. Generación, mantenimiento y manipulación de los animales de experimentación……………………………………………………………….. 31 1.1. Generación de los diferentes modelos de ratón knockout: TH-NDUFS2, ESR-NDUFS2 y Olfr78…………………………………………………….. 31 1.2. Mantenimiento y tratamiento de los modelos de ratones knockout…..... 32 1.3. Experimentos realizados en animales in vivo.......................................... 33 1.3.1. Medida de la concentración de lactato en sangre……………….. 33 1.3.2. Medida de la función respiratoria mediante pletismografía…….. 33 2. Preparaciones celulares……………………………………………………... 36 2.1. Rodajas de cuerpo carotídeo……………………………………........... 36 2.2. Células dispersas de cuerpo carotídeo.………………………………… 36 3. Técnicas bioquímicas y de biología molecular in vitro................................... 37 3.1. Medición de la actividad del complejo I mitocondrial………………… 37 3.2. PCR estándar..……………………………………………………......... 37 3.3. Análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa…………… 39 4. Inmunohistoquímica de fluorescencia en rodajas de cuerpo carotídeo……... 39 5. Experimentos funcionales in vitro…………………………………………... 40 5.1. Técnicas electrofisiológicas..…………………………………………... 40 5.1.1. Técnica de amperometría………………………………………. 40 5.1.2. Técnica de patch-clamp.……………………………………….. 43 5.2. Técnicas microfluorimétricas.…………………………………………. 46 5.2.1. Equipamiento de registro microfluorimetrico…………………... 46 ! iv! 5.2.2. Medida de cambios en la concentración citosólica de distintas especies.…………………………………… …………………………. 48 6. Soluciones de registro………………………………………………………. 50 7. Análisis estadístico de los datos…………………………………………….. 52 RESULTADOS……………………………………………………………….. 53 1. Inhibición de la respuesta aguda a hipoxia en quimiorreceptores arteriales periféricos tras la ablación inducible del gen Ndufs2 en ratones adultos……… 55 1.1. Ratones ESR-NDUFS2. Tratamiento y evolución de la línea…………. 55 1.2. Pérdida gradual, sistémica y celular, de la respuesta a hipoxia en paralelo con la inhibición de la función del complejo mitocondrial I en ratones ESR-NDUFS2.……………………………………………………… 55 1.2.1. Análisis de la función del complejo mitocondrial I.……………... 56 1.2.2. Respuesta ventilatoria a hipoxia..……………....……………....... 57 1.2.3. Propiedades funcionales de las células glómicas de ratones controles y ESR-NDUFS2..……………....……………....…………….. 57 1.2.3.1. Respuesta secretora a hipoxia en rodajas de cuerpo carotideo..……………....……………....……………....……….. 57 1.2.3.2. Cambios en la concentración de calcio intracelular……. 60 1.2.3.3. Caracterización electrofisiológica de las células glómicas del modelo de ratón ESR-NDUFS2………………….. 60 1.3. La deficiencia inducida de Ndufs2 inhibe la señalización del complejo mitocondrial I durante hipoxia en las células glómicas del cuerpo carotideo. 63 1.3.1. Incremento de NADH durante hipoxia en el complejo mitocondrial I…………..……………....……………....……………..... 65 1.3.2. Efecto de la regeneración de NAD+ sobre la respuesta a hipoxia aguda..……………....……………....……………....……………........... 68 1.3.2.1. Tratamiento agudo con regeneradores de NAD+………. 68 1.3.2.2. Tratamiento crónico con regeneradores de NAD+ en células controles………………………………………………… 70 1.3.2.3. Tratamiento crónico con regeneradores de NAD+ en células ESR-NDUFS2………………………………………….. 73 1.3.3. Incremento de los niveles de ROS en el espacio intermembrana durante hipoxia…………………………………………………………. 76 1.3.3.1. Estado de oxidación basal en las células glómicas de ratones ESR-NDUFS2………………………………………….. 76 1.3.3.2. Incremento de ROS de espacio intermembrana durante hipoxia………………………………………………………….. 77 1.3.3.3. Efecto del H2O2 sobre los parámetros electrofisiológicos de las células glómica..................................... 79 1.4. La modulación de la actividad de la succinato deshidrogenasa (MCII) afecta a la respuesta aguda a hipoxia de células glómicas de cuerpo carotideo..……………....……………....……………....……………............. 80 ! v! 2. Papel de receptor olfatorio atípico Olfr78 en la respuesta aguda a la hipoxia en los quimiorreceptores arteriales..……………....……………....……………. 83 2.1. Estudio de los ratones Olfr78. Tratamiento y evolución de la línea……. 83 2.2. Validación del modelo Olfr78..……………....……………....………… 84 2.3. Respuesta a hipoxia en ratones Olfr78..……………....……………....... 86 2.3.1. Respuesta ventilatoria a hipoxia aguda..……………....………… 86 2.3.2. Respuesta a hipoxia en las células glómicas de ratones Olfr78…. 89 2.3.2.1. Respuesta secretora a hipoxia en rodajas de cuerpo carotídeo……………………………………………………….. 89 2.3.2.2. Cambios en la concentración de calcio intracelular en respuesta a hipoxia..……………....……………....……………. 89 2.4. Respuesta a lactato en las células glómicas del cuerpo carotídeo de ratones Olfr78..……………....……………....……………....……………... 91 2.4.1. Respuesta secretora a lactato en rodajas de cuerpo carotideo…… 91 2.4.2. Incremento de calcio intracelular en respuesta a lactato en células glómicas de ratones Olfr78..……………....……………....……………. 91 3. Estimulación de las células glómicas por lactato..……………....…………... 92 3.1. Incremento de la concentración de lactato en sangre en respuesta a hipoxia aguda. .……………....……………....……………....…………….... 93 3.2. Activación de las células glómicas por lactato.……………....………… 94 3.2.1. Efectos del lactato sobre el potencial de membrana y las corrientes de potasio de las células glómicas .……………....…………. 97 3.3. Mecanismos moleculares involucrados en la activación por lactato en las células glómicas….……………....……………....……………....……… 98 3.3.1. Efecto del lactato sobre el pH intra y extracelular………………. 99 3.3.2. Incremento de NADH intracelular inducido por lactato………… 100 3.4. La modulación del ratio NADH/NAD+ afecta a la respuesta a lactato de células glómicas de cuerpo carotideo..……………....……………................ 102 3.4.1. Efecto de la regeneración de NAD+ en la respuesta a lactato……. 102 3.4.2. Efecto sumatorio de la hipoxia y el lactato sobre la actividad de las células glómicas.……………....……………....……………............. 104 DISCUSIÓN..……………....……………....……………....…………….......... 107 1. Modelo de señalización mitocondrial dependiente del CMI en respuesta a hipoxia aguda.……………....……………....……………....……………........... 109 1.1. La activación del cuerpo carotídeo en respuesta a hipoxia depende del CMI………………………………………………………………………….. 109 1.2. NADH y ROS, moléculas señalizadoras en respuesta a hipoxia……….. 111 1.3. Respuesta a hipoxia con regeneración química de NAD+……………… 114 1.4. Ratio CoQH2/CoQH y respuesta aguda a hipoxia en las células glómicas.……………....……………....……………..................................... 115 2. Papel del receptor Olfr78 en la respuesta aguda a la hipoxia.………………. 117 ! vi! 3. Metabolismo sistémico del lactato; importancia biológica y detección por el cuerpo carotídeo….……………....……………....……………....……………... 119 CONCLUSIONES.……………....……………....……………....…………….. 123 BIBLIOGRAFÍA.……………....……………....……………....……………... 129 ! vii! ÍNDICE FIGURAS Figura 1. Estructura y organización del cuerpo carotídeo...……….…………… 6 Figura 2. Respuesta a hipoxia aguda en células glómicas…………….……....... 7 Figura 3. Efecto de los inhibidores mitocondriales sobre la respuesta a hipoxia de las células glómicas..……….………..……….………..……….……………. 10 Figura 4. Análisis de la expresión de Ndufs2 en tejidos catecolaminérgicos del sistema nervioso periférico de ratones TH-NDUFS2...……….………….…….. 11 Figura 5. Abolición de la respuesta ventilatoria a hipoxia en ratones THNDUFS2...……….………..……….………..……….………..……….……….. 11 Figura 6. Abolición de la respuesta a hipoxia en células glómicas de ratones TH-NDUFS2..……….………..……….………..……….………..……….…… 12 Figura 7. Abolición de la inhibición por hipoxia de los canales de potasio en células glómicas de ratones TH-NDUFS2..……….………..……….…………. 13 Figura 8. Abolición del incremento de las moléculas señalizadoras (NADH y ROS) en células glómicas de ratones TH-NDUFS2 durante hipoxia………….. 14 Figura 9. Modelo de sensibilidad a la hipoxia aguda en los quimiorreceptores arteriales...……….………..……….………..……….………..……….……….. 15 Figura 10. Pérdida selectiva de la respuesta a hipoxia en animales completos Olfr78...……….………..……….………..……….………..……….…………... 17 Figura 11. Pérdida de la respuesta a hipoxia en el nervio del seno de cuerpo carotídeo de ratones Olfr78..……….………..……..……….………..…………. 17 Figura 12. El lactato activa el receptor Olfr78 durante hipoxia...……….……… 18 Figura 13. Metabolismo de lactato..……….………..……….…………………. 21 Figura 14. Tratamiento de los ratones ESR-NDUFS2..……….……………….. 32 Figura 15. Diseño experimental de la medida de la concentración de lactato en sangre..……….………..……….………..……….………..……….…………… 33 Figura 16. Equipamiento de pletismografía ..……….………..……….………... 34 Figura 17. Incremento de la frecuencia respiratoria de un animal control en respuesta a hipoxia e hipercapnia..……….………..……….………..……….… 35 Figura 18. Equipamiento de amperometría..……….………..……….…………. 42 Figura 19. Actividad secretora típica de una célula de cuerpo carotídeo ante un estímulo hipóxico...……….………..……….…………………………………... 43 Figura 20. Equipamiento de patch-clamp...……….………..……….………….. 44 Figura 21. Equipamiento de microfluorimetría...……….………..……….……. 47 Figura 22. Pérdida de la actividad del CMI tras el tratamiento con TMX en ratones ESR-NDUFS2...……….………..……….………..……….…………… 56 Figura 23. Curso temporal de la pérdida de la respuesta ventilatoria a hipoxia en ratones ESR-NDUFS2..……….………..……….………..……….………… 58 Figura 24. Respuesta secretora a hipoxia, hipercapnia y alto potasio de las células glómicas en rodajas de cuerpo carotídeo de ratones controles y ESRNDUFS2……....................................................................................................... 59 ! viii! Figura 25. Pérdida del incremento de calcio intracelular en células glómicas de ratones ESR-NDUFS2..……….………..……….………..……….……………. 61 Figura 26. Propiedades electrofisiológicas de las células glómicas controles y ESR-NDUFS2...……….………..……….………..……….………..……….….. 62 Figura 27. Corrientes de Ca2+ y K+ voltaje-dependientes de las células glómicas de ratones controles y ESR-NDUFS2...……….……………………... 64 Figura 28. La deficiencia inducida de Ndufs2 inhibe la señalización del MCI durante la hipoxia aguda..……….………..……….………..……….…………. 66 Figura 29. Inhibición de la acumulación de NADH inducido por rotenona en células con déficit inducido de Ndufs2...……….………..……….………..…… 67 Figura 30. Respuesta gradual de NADH a distintos niveles de presión de oxígeno..……….………..……….………..……….………..……….…………. 67 Figura 31. Agentes regeneradores de NAD+...……….………..……….………. 68 Figura 32. Regeneración aguda de NAD+ y capacidad de respuesta a la hipoxia de las células glómicas de ratones controles y deficientes en Ndufs2…………. 69 Figura 33. Mantenimiento del incremento de NADH en respuesta a hipoxia en células glómicas del cuerpo carotídeo de ratones controles incubadas crónicamente con regeneradores de electrones (NAD+)...……….…………….. 71 Figura 34. Propiedades electrofisiológicas de las células glómicas controles tratadas crónicamente con αKB..……….………..……….………..……….….. 72 Figura 35. Corrientes de Ca2+ y K+ voltaje-dependientes de las células glómicas controles y tratadas con 2,5 mM αKB crónicamente..……….………. 73 Figura 36. La pérdida de la respuesta a hipoxia, medida con NAD(P)H, en las células glómicas ESR-NDUFS2 no es recuperada por los regeneradores de aceptores de electrones NAD+...……….………..……….……………………... 74 Figura 37. El dimetil succinato (DMSus), subtrato del CMII, favorece la activación de la cadena de transporte de electrones mitocondrial……………… 75 Figura 38. La pérdida de la respuesta a hipoxia, medida con FURA, en las células glómicas deficiente en Ndufs2 no es recuperada por los regeneradores de aceptores de electrones NAD+ y la incubación con DMSuc………………… 76 Figura 39. Nivel de oxidación basal de las células glómicas de ratones controles y ESR-NDUFS2……………………………………………………… 77 Figura 40. El déficit inducido de Ndufs2 inhibe la señalización de ROS del complejo mitocondrial I durante hipoxia en las células glómicas del cuerpo carotideo...……….………..……….………..……….………………………….. 78 Figura 41. Modulación por DMM de las respuestas celulares a la hipoxia…….. 81 Figura 42. Activación de la CTE por DMSuc...……….………..……….……… 82 Figura 43. Genotipo de los modelos animales Olfr78 (FRA y JAX)…………… 84 Figura 44. Ausencia de ARNm Olfr78 en los ratones knockout Olfr78-FRA….. 85 Figura 45. Detección inmunohistoquímica de proteína fluorescente verde (GFP) y tirosina hidroxilasa (TH) en rodajas de cuerpo carotídeo……………... 85 Figura 46. Respuesta ventilatoria a hipoxia e hipercapnia de ratones controles y deficientes para Olfr78 (FRA)..……….………..……….……………………. 86 ! ix! Figura 47. Análisis de la respuesta ventilatoria de ratones controles y Olfr78 FRA..……….………..……….………..……….………..……….……………... 87 Figura 48. Análisis de la respuesta ventilatoria de ratones controles y Olfr78 JAX...……….………..……….………..……….………..……….……………. 88 Figura 49. Respuestas secretoras a la hipoxia en células glomicas de ratones Olfr78...……….………..……….………..……….………..……….…………. 90 Figura 50. Aumento de la concentración de Ca2+ intracelular de las células glómicas de ratones controles y Olfr78 en respuesta a hipoxia………………… 90 Figura 51. Respuesta secretora de las células glómicas de ratones controles y Olfr78 (FRA) a 5 mM lactato..……….………..……….………..……….……. 91 Figura 52. Aumento de la concentración de Ca2+ intracelular de las células glómicas de ratones controles y Olfr78 en respuesta a 5mM lactato…………… 92 Figura 53. Niveles de lactato en sangre en función de la presión parcial de oxígeno en el aire inspirado...……….………..……….………..……….……… 93 Figura 54. Las células del cuerpo carotideo (registradas en rodajas de tejido) son activadas por un incremento de lactato extracelular..……………………… 94 Figura 55. Respuesta secretora inducida por distintas concentraciones de lactato extracelular de células glómicas en rodajas cuerpo carotídeo………….. 95 Figura 56. Las células glómicas aisladas son activadas por un incremento de lactato extracelular...……….………..……….………..……….……………… 96 Figura 57. Dependencia de calcio extracelular para la activación por lactato de las células glómicas...……….………..……….………..……….……………… 97 Figura 58. El lactato induce una despolarización del potencial de membrana en las células glómicas...……….………..……….………..……….………………. 98 Figura 59. Caracterización electrofisiológica de la respuesta a lactato………… 99 Figura 60. El incremento de lactato no modifica el pH intracelular ni extracelular en células glómicas del CC……………………………………….. 100 Figura 61. Incremento de NADH en respuesta a lactato………………………. 101 Figura 62. Respuesta gradual de NADH a diferentes concentraciones de lactato...……….………..……….………..……….………..……….…………. 101 Figura 63. Inhibición de la respuesta a lactato por piruvato…………………… 103 Figura 64. Activación de las células glómicas por piruvato…………………… 104 Figura 65. Potenciación de la respuesta a lactato de NADH por hipoxia……… 105 Figura 66. Potenciación de la respuesta secretora a hipoxia por lactato………. 106 Figura 67. Modelo de la sensibilidad a hipoxia aguda en la CTE de las células glómicas del cuerpo carotídeo………………………………………………… 113 Figura 68. Modelo del CMI como señalizador de la respuesta a hipoxia en el cuerpo carotídeo …..……….………..……….………..……….……………… 117 Figura 69. Efecto sumatorio de lactato e hipoxia en las células quimiosensitivas del cuerpo carotídeo.………..……….………..……….……. 122 ! ! xi! ÍNDICE TABLAS Tabla 1. Secuencia de los cebadores empleados para el genotipado de los ratones por PCR………………………………………………………………… 39 Tabla 2. Soluciones y mezclas de gases de registro……………………………. 51 Tabla 3A. Composición de la solución interna para registro de patch-clamp en células glómicas dispersas de cuerpo carotídeo………………….……………… 51 Tabla 3B. Composición de la solución externa para registro de patch-clamp en células glómicas dispersas de cuerpo carotídeo ………………………………… 52 Tabla 4. Propiedades electrofisiológicas de las células glómicas controles y ESR-NDUFS2…………………………………………………………………. 62 Tabla 5. Propiedades electrofisiológicas de las células glómicas controles y las células dializadas con H2O2.…………………………………………………… 79 Tabla 6. Propiedades electrofisiológicas de las células glómicas controles y las células dializadas con succinato……………………………………………….. 82 ! Introducción 3 INTRODUCCIÓN El oxígeno (O2) es un elemento esencial para la vida de los organismos que usan el metabolismo celular aeróbico como fuente de energía. Actúa como aceptor final de electrones en la cadena de transporte de electrones (CTE), haciendo posible la síntesis de adenosín trifosfato (ATP) mediante la fosforilación oxidativa en la mitocondria. La falta de O2 (hipoxia), aunque sea de manera focalizada y transitoria, puede dañar gravemente los tejidos. Por este motivo, el organismo dispone de mecanismos encargados de detectar la deficiencia de O2 y generar respuestas adaptativas para disminuir los efectos deletéreos de la hipoxia. Existen dos tipos de respuesta adaptativas a hipoxia según el tiempo de exposición a una disminución de O2: aguda y crónica (López-Barneo et al., 2001). Cuando la hipoxia se produce de manera puntual y aguda, o durante los primeros minutos de exposición a una hipoxia prolongada, se activan una serie de mecanismos de adaptación rápidos. Estos mecanismos incluyen reflejos respiratorios y cardiovasculares, como la hiperventilación y la activación simpática que, en pocos segundos, incrementan la captación de O2 y aceleran su distribución a los tejidos a través del sistema circulatorio, especialmente al cerebro y corazón. Si la exposición a hipoxia se mantiene durante horas o días (lo que se denomina hipoxia crónica) se activan mecanismos más lentos que implican la regulación de la expresión génica por factores de transcripción inducibles por hipoxia (hypoxia inducible factors, HIFs). Estos factores inducen la expresión de genes que favorecen, entre otras, la angiogénesis y la eritropoyesis para la distribución y transporte de O2 a los tejidos e incrementan la producción de ATP por vía glucolítica (Semenza, 2012; Ratcliffe, 2013). Esta Tesis Doctoral se centra en el estudio de los mecanismos adaptativos que se ponen en marcha en respuesta a la hipoxia aguda. 1. Sistema homeostático sensor agudo de oxígeno Las respuestas adaptativas a la hipoxia aguda dependen de un conjunto de órganos que forman el sistema homeostático sensor de O2 y que contienen células neurosecretoras o musculares lisas capaces de detectar cambios en los niveles de O2. Entre los diversos componentes del sistema homeostático de O2 destacan las células de musculo liso de arterias pulmonares y sistémicas, los cuerpos neuroepiteliales del pulmón, las células cromafines de la médula adrenal (MA) y las células neurosecretoras de los quimiorreceptores arteriales periféricos (cuerpos carotídeos y aórticos) (Weir et al., 2005). Introducción 4 Las células de músculo liso de la arteria pulmonar son capaces de detectar variaciones en la presión parcial de oxígeno (PO2) y contraerse en condiciones de hipoxia. Este fenómeno se denomina vasoconstricción pulmonar hipóxica (VPH) y tiene como objetivo derivar el flujo sanguíneo hacia zonas del pulmón mejor ventiladas. Por el contrario, en las arterias sistémicas se produce una vasodilatación en respuesta a hipoxia para favorecer el aporte de oxígeno al tejido hipóxico (Weir y Archer, 1995; Franco-Obregón y López-Barneo, 1996). Los cuerpos neuroepiteliales están compuestos por grupos de células neuroendocrinas situadas en el epitelio de los bronquiolos, donde detectan cambios en la concentración de O2 del aire inspirado. Ante una disminución de O2, las células neuroendocrinas liberan aminas y péptidos, que activan las fibras aferentes, que mandan la información al sistema nervioso central y regulan los parámetros respiratorios para la obtención de más O2 (Jonz y Nurse, 2012). La MA es uno de los órganos endocrinos que forma parte de las glándulas suprarrenales, localizadas en la parte superior de cada riñón. Se compone de células neurosecretoras, denominadas células cromafines, que actúan como quimiosensores polimodales, que responden, entre otros estímulos, a una disminución de los niveles de O2 en sangre secretando catecolaminas al torrente circulatorio, fundamentalmente adrenalina y noradrenalina (Muñoz-Cabello et al., 2005; Livermore et al., 2011). Esta elevación de catecolaminas en sangre es responsable de parte de las adaptaciones cardiovasculares que se producen durante una hipoxia aguda. Dentro del sistema homeostático sensor de O2 destacan los quimiorreceptores arteriales localizados junto a las arterias aórtica y carótida. Los cuerpos aórticos son estructuras paraganglionares que se distribuyen de forma irregular por las ramas derivadas del nervio vago; están en torno a los arcos aórticos, cerca de las arterias carótida y subclavia. Los quimiorreceptores periféricos más importantes en mamíferos superiores y en el hombre son los cuerpos carotídeos (CC), localizados en las bifurcaciones de las arterias carótidas, y de ellos dependen los reflejos respiratorios (respuesta ventilatoria a hipoxia; RVH) y cardiovasculares (incremento del gasto cardiaco) necesarios para la adaptación aguda a la hipoxia (López-Barneo et al., 2001; Livermore et al., 2011). 2. Fisiología del cuerpo carotídeo 2.1. Aspectos generales sobre la estructura y función del cuerpo carotídeo El CC es un sensor polimodal capaz de detectar cambios de presión arterial de O2 (PaO2) y de dióxido de carbono (PaCO2), siendo activado por hipoxia e hipercapnia Introducción 5 respectivamente (de Castro, 1928; Heymans et al., 1930; Eyzaguirre et al., 1965). Además, se activa también en respuesta a otros estímulos como hipoglucemia (Pardal y López-Barneo, 2002; García-Fernández et al., 2007; Fitzgerald et al., 2009) o acidosis (Eyzaguirre y Koyano, 1965). Los CC se localizan bilateralmente en las bifurcaciones de las arterias carótidas (Figura 1 A). Es un órgano muy irrigado, ya que dispone de abundantes vasos sanguíneos entretejidos en su parénquima, y presenta una tasa de consumo de O2 muy alta (Daly et al., 1954; Starlinger y Lubbers, 1976). El CC deriva embriológicamente de la cresta neural (Le Douarin, 1986; Jiang et al., 2000; Pardal et al., 2007). Desde el CC parten fibras aferentes que son conducidas al sistema nervioso central a través del nervio del seno carotídeo, que es una rama del nervio glosofaríngeo o par craneal IX. También recibe inervación eferente compuesta fundamentalmente de fibras simpáticas postganglionares procedentes del ganglio cervical superior (GCS) (Fidone y González, 1986). Histológicamente está constituido principalmente por dos tipos de células (tipo I y II) que se agrupan formando agregados celulares llamados glomérulos (Figura 1 B). Las células tipo I, también denominadas células glómicas o células principales, son de tipo neuronal, tienen una forma más o menos esférica, de unos 10 µm de diámetro, y son las más numerosas en el CC (López-Barneo et al., 2009) (Figura 1 B y C). Estas células se caracterizan por presentar un alto número de mitocondrias en el citoplasma y vesículas de núcleo denso que contienen distintos neurotransmisores como ATP, acetilcolina, dopamina y varios neuropéptidos (Nurse y Piskuric, 2013). Además, tienen un alto contenido en dopamina, por lo que presentan una elevada expresión de la enzima tirosina hidroxilasa (TH), y se pueden marcar fácilmente con un anticuerpo anti-TH que permite identificarlas por inmunohistoquímica. Las células glómicas son los elementos sensores de O2 del CC (ver más adelante) y establecen uniones sinápticas con terminaciones nerviosas aferentes (“sinapsis quimiosensora”) que terminan en el centro respiratorio y en otras estructuras centrales, como el núcleo del trato solitario y en un área de la médula llamada rotral ventrolateral medulla. Desde estas áreas centrales se regulan, respectivamente, la frecuencia y el volumen respiratorio (de Castro, 1926, 1928; Eyzaguirre, 1961) y el tono del sistema nervioso simpático (Guyenet, 2000). Las células tipo II o sustentaculares son de tipo glial. Son más pequeñas y alargadas que las células tipo I y se localizan en la periferia de los glomérulos rodeando a las células tipo I con sus elongaciones citoplásmáticas (Figura 1 B y C). Las células tipo II expresan marcadores de células gliales como la glial acidic fibrilary protein, por lo que Introducción 6 tradicionalmente se ha pensado que su función era meramente de soporte de las células tipo I. Sin embargo, recientemente se ha descrito que las células tipo II, o una subpoblación de ellas, son células madres del sistema nervioso periférico (SNP) que contribuyen al crecimiento del CC en condiciones de hipoxia crónica (Pardal et al., 2007). Figura 1. Estructura y organización del cuerpo carotídeo. (A) Fotografía de una bifurcación carotidea humana después de limpiarla de tejido conectivo y grasa permitiendo ver el CC (flecha). Escala: 1 cm. Bifurcación extraída de un donante de 42 años de edad. Modificado de Ortega-Sáenz et al., (2013). (B) Representación esquemática de las células que componen los glomérulos del CC. Modificado de Pardal et al., (2009). (C) Microfotografía electrónica ilustrando los dos tipos de células principales del CC de ratón; tipo I (coloreadas en rojo) envueltas por las células tipo II (en azul). El aumento (esquina superior derecha) muestra la abundancia de mitocondrias y vesículas secretoras en las células tipo I. 2.2. Modelo de membrana de quimiotransducción Las células glómicas son elementos neurosecretores que, al detectar una disminución de la PaO2 u otros estímulos, liberan neurotransmisores por exocitosis, lo que a su vez activa fibras nerviosas que estimulan a los centros respiratorios o vegetativos del tronco del encéfalo. Esta función sensorial de las células glómicas se debe a que son excitables, ya que poseen canales voltaje-dependientes de Na+, Ca2+ y K+ (Duchen et al., 1988; López-Barneo et al., 1988; Ureña et al., 1994). El proceso de quimiotransducción que se activa en las células glómicas en respuesta a hipoxia se basa en la inhibición de canales de K+, entre los que se han descrito tanto canales de K+ dependientes de voltaje (López-Barneo et al., 1988) como canales de fuga o leakage (Delpiano y Hescheler, 1989; Buckler, 1997) (Figura 2 A). La inhibición de canales de K+ produce la despolarización del potencial de membrana, que conlleva a la apertura de los canales de Ca2+ dependientes de potencial y a la entrada de calcio extracelular (Fishman et al., 1985; Ureña et al., 1994) (Figura 2 B). El incremento de calcio citosólico produce fusión de vesículas con la membrana plasmática y liberación de neurotransmisores Introducción 7 (López-Barneo, 1993; Buckler y Vaughan-Jones, 1994; Ureña et al., 1994) (Figura 2 C). Los neurotransmisores activan a las fibras nerviosas que transmiten la información hasta los centros respiratorios del tronco del encéfalo para activar la respuesta ventilatoria a hipoxia. Estos hallazgos permitieron establecer el modelo de membrana de quimiotransducción (Figura 2 D), donde las células glómicas actúan como elementos presinápticos capaces de detectar una disminución de O2. Figura 2. Respuesta a hipoxia aguda en células glómicas. (A) Corrientes de membranas registradas con la configuración de parche perforado durante un protocolo de despolarización de rampa. Nótese la reversible inhibición de la corriente de entrada y de las corrientes voltaje dependientes de potasio en las dos ocasiones que la célula fue expuesta a hipoxia (h1 y h2) (PO2 ∼ 10 mmHg). Los registros de control (c) y recuperación (r) se obtuvieron en condición de normoxia (PO2 ∼ 145 mmHg). (B y C) Incremento de calcio (B) y respuesta secretora (C) en función de la tensión de O2. En el gráfico de la dosis dependencia de calcio hay un registro representativo del incremento de calcio citosólico dependiente de calcio extracelular durante hipoxia. En el grafico C hay un registro representativo de amperometría de la típica respuesta a hipoxia de una célula glómica. (Los datos del gráfico B proceden de Ureña et al., (1994); los de los gráficos A y C de Montoro et al., (1996) y Ortega-Sáenz et al., (2006). (D) Modelo de membrana de quimiotransducción mediado por las células glómicas, modificado de López-Barneo et al., (2003). Introducción 8 A pesar de que el modelo de membrana de quimiotransducción se encuentra ampliamente aceptado en el campo de la detección de hipoxia aguda, se desconoce cuál es el mecanismo que usan las células quimiorreceptoras para detectar la disminución de O2 en sangre (o en medio extracelular) y cuál o cuáles son las moléculas que señalizan a los canales de K+ de la membrana plasmática para inhibirlos. 3. Hipótesis actuales sobre el “sensor de oxígeno” del cuerpo carotídeo Durante las últimas décadas se han propuesto distintas hipótesis para describir el sensor de oxígeno de las células glómicas del CC (López-Barneo et al., 2016). En este apartado se resume brevemente aquellas que se consideran especialmente relevantes para los estudios llevados a cabo en esta Tesis Doctoral. 3.1. Hipótesis mitocondrial Clásicamente se han considerado a las mitocondrias como candidatas para detectar la disminución de O2 en las células glómicas del CC, basándose en que es el orgánulo donde se produce un mayor consumo de oxígeno, y dada la exquisita sensibilidad del CC a los inhibidores de la CTE mitocondrial. Se ha descrito que al bloquear distintos complejos mitocondriales hay una activación de las células glómicas de forma similar a la hipoxia aguda, indicando una comunicación entre las mitocondrias y los canales de la membrana plasmática (Mills y Jobsis, 1972; Mulligan y Lahiri, 1982; Ortega-Sáenz et al., 2003). Además de las dos premisas anteriores, las mitocondrias son candidatas porque existen parámetros mitocondriales, como el potencial de membrana mitocondrial o la autofluorescencia de NADH, que son muy sensibles a cambios de los niveles de PO2 (Duchen y Biscoe, 1992b, a). Apoyando esta hipótesis se propuso que el incremento de Ca2+ intracelular, que se producía en las células glómicas en respuesta a hipoxia, se debía a la liberación de Ca2+ almacenado en las mitocondrias (Duchen y Biscoe, 1992b). Sin embargo, pronto se demostró que, como se describió en el apartado anterior, el aumento de Ca2+ citosólico se debe a una entrada de Ca2+ extracelular, debida a la apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (Figura 2 B) (Ureña et al., 1994). El otro inconveniente de esta propuesta es que la CTE de la mayoría de las células se inhibe cuando los niveles de PO2 alcanzan valores cercanos a la anoxia (PO2 ∼ 1-2 mmHg) y las células glómicas del CC son muchos más sensibles a hipoxia, siendo activadas incluso cuando los niveles de PaO2 están por debajo de 60 mmHg. Para tratar de explicar este comportamiento del CC, se propuso la existencia de mitocondrias con una isoforma especial de citocromo c oxidasa o complejo Introducción 9 mitocondrial IV (CMIV) con baja afinidad por oxígeno (Mills y Jobsis, 1972). Sin embargo, en su formulación inicial se consideraba que esta forma especial de CMIV se localizaba en las células tipo II (Mills y Jobsis, 1972) que posteriormente se ha mostrado que no son quimiosensitivas. Solo en fecha reciente se han descrito características moleculares especiales del CMIV de las células glómicas en comparación con otras células neuronales del mismo origen embriológico (Gao et al., 2017). Una nueva perspectiva que señala a la mitocondria como orgánulo necesario para detectar la hipoxia en el CC se hizo evidente gracias a experimentos de nuestro grupo, donde se comparó la secreción de dopamina en rodajas de CC durante hipoxia con o sin la presencia de inhibidores de los distintos complejos mitocondriales (Ortega-Sáenz et al., 2003). Los resultados obtenidos demostraron que la secreción, inducida en rodajas de CC por los inhibidores de los complejos mitocondrial II, III y IV, incrementó cuando se expuso de forma concomitante a hipoxia. En la Figura 3 A se muestra un ejemplo representativo del efecto aditivo de la hipoxia y el cianuro, inhibidor del CMIV. Sin embargo, la exposición a dosis saturantes de rotenona, inhibidor del complejo mitocondrial I (CMI), abolió la respuesta secretora inducida por la hipoxia en rodajas de CC (Figura 3 B). La rotenona es capaz de inhibir al CMI uniéndose al sitio de unión de la ubiquinona. No obstante, el uso de DPI, inhibidor del CMI que actúa en un sitio diferente al de la rotenona, no fue capaz de bloquear la respuesta a hipoxia. Como se ilustra en la Figura 3 C, de todos los inhibidores mitocondriales utilizados, solo la rotenona fue capaz de abolir la respuesta a hipoxia, sugiriendo que el sitio de unión a ubiquinona en el CMI tiene un papel importante para detectar la disminución de O2 por las células glómicas. Para comprobar si el sitio de unión a ubiquinona del CMI es necesario para la respuesta a hipoxia mediada por el CC, se generó en nuestro laboratorio un modelo de ratón genéticamente modificado con una ablación embrionaria en células catecolaminérgicas del gen Ndufs2, el cual codifica una proteína de 49-kDa, que contribuye al sitio de unión de ubiquinona del CMI (Figura 4); (Kashani-Poor et al., 2001; Baradaran et al., 2013; Fernández-Agüera et al., 2015). A este modelo se le denominará TH-NDUFS2. El sitio de unión a ubiquinona, es donde tiene lugar la transferencia de electrones desde el centro sulfoférrico (Fe-S) a la ubiquinona, que es el último paso en la reacción de la NADH/ubiquinona oxidoreductasa. Este último grupo Fe-S, que se denomina N2, cede electrones a la ubiquinona (CoQ), para producir ubiquinol (CoQH2) (Baradaran et al., 2013; Hirst, 2013). Introducción 10 Figura 3. Efecto de los inhibidores mitocondriales sobre la respuesta a hipoxia de las células glómicas. (A) Registro amperométrico representativo de la potenciación de la respuesta a hipoxia de las células glómicas en presencia de cianuro (izquierda). Nótese el incremento de pendiente de la secreción acumulada cuando se aplica la hipoxia en presencia de cianuro (derecha). (B) Registro amperométrico representativo de la inhibición de la respuesta a hipoxia de las células glómicas en presencia de rotenona (izquierda). Nótese la disminución de la pendiente de la secreción acumulada cuando se aplica la hipoxia en presencia de rotenona (derecha). (C) Cuantificación de la tasa de secreción en rodajas de CC en normoxia (barras blancas) y en hipoxia (barras negras); y el efecto de aplicar inhibidores de los complejos mitocondriales IV, III, II y I en ambas condiciones. (CN), antimicina A (ant A), myxotiazol (myxo), tenoil trifluoro acetona (TTFA), y rotenona (rot), hipoxia (hpx). Nótese que no hay efecto sumatorio al aplicar rotenona e hipoxia juntos. Modificado de Ortega- Sáenz et al., (2003). Introducción 11 Figura 4. Análisis de la expresión de Ndufs2 en tejidos catecolaminérgicos del sistema nervioso periférico de ratones TH-NDUFS2. Cantidad relativa de ARNm del gen Ndufs2 en cuerpo carotídeo (CC; A), ganglio cervical superior (GCS; B) y médula adrenal (MA; C). u.r.unidades relativas. * p<0,05. Modificado de Fernández-Agüera et al., (2015). A nivel sistémico, los ratones TH-NDUFS2 presentaban una respiración aparentemente normal, pero tenían abolido el reflejo ventilatorio a hipoxia aguda (Fernández- Agüera et al., 2015) (Figura 5). Figura 5. Abolición de la respuesta ventilatoria a hipoxia en ratones TH-NDUFS2. (A y B) Registros representativos del cambio de la frecuencia ventilatoria de un ratón control (A, izq) y THNDUFS2 (B, izq) durante normoxia (21% de O2) y en hipoxia aguda (10% de O2). Cuantificación del incremento de la frecuencia respiratoria durante hipoxia aguda en el grupo de ratones estudiados (drch). Nótese que la frecuencia respiratoria no varía entre periodos de normoxia e hipoxia en los ratones TH-NDUFS2. ** p<0,01. Modificado de Fernández-Agüera et al., (2015). Introducción 18 en respuesta a hipoxia, y que la unión de lactato con el receptor Olfr78 produce la activación del nervio del seno carotídeo en ratones controles, estando abolida dicha respuesta en ratones knockout para Olfr78 (Figura 12 A); (Chang et al., 2015). Se ha sugerido que durante una disminución de O2 hay un incremento de lactato en sangre que estimula al receptor Olfr78 de la membrana plasmática de las células glómicas desencadenando la liberación de neurotransmisores y la respuesta a hipoxia aguda a nivel sistémico (ver esquema Figura 12 B). Figura 12. El lactato activa el receptor Olfr78 durante hipoxia. (A) Gráfico del incremento de la frecuencia de disparo durante un aumento de lactato extracelular en el nervio del seno carotídeo de animales controles (+/+, rojo) y no en ratones knockout para Olfr78 (-/-, azul). (B) Modelo propuesto por Chang et al., (2015) para detectar la hipoxia en las células glómicas del CC. Ambos gráficos han sido modificados de Chang et al., (2015). La hipótesis propuesta por Chang et al., (2015) contrastaba con los resultados descritos previamente por nuestro grupo de investigación, sugiriendo que las mitocondrias son orgánulos esenciales para la respuesta a hipoxia mediada por las células glómicas del CC. Además, se ha demostrado en varios laboratorios que la respuesta celular a la hipoxia es autónoma; se observa en células dispersas superfundidas continuamente por solución extracelular libre de lactato. Dado su fuerte contraste con los datos previos de nuestro grupo, la comprobación de la hipótesis del lactato y de su activación del CC mediada por el Olfr78 ha sido uno de los objetivos de esta Tesis Doctoral. 4. Metabolismo del lactato; importancia biológica 4.1. Producción y función de lactato El ácido láctico o ácido 2-hidroxipropanoico, es un ácido carboxílico de tres carbonos Introducción 19 (C3H6O3) con un peso molecular de 89 g/mol. Fue descubierto por Scheele en el siglo dieciocho y posteriormente Pasteur (1858) describió la fermentación láctica en levaduras en condiciones anaeróbicas. Varias décadas después, los estudios de Fletcher demostraron la presencia de lactato en el músculo esquelético de rana durante anaerobiosis (Fletcher, 1907). En 1922 Hill y Meyerhof recibieron el premio Nobel por descubrir que durante el ejercicio intenso la glucosa se transforma en ácido láctico para obtener energía rápidamente sin utilizar la fosforilación oxidativa mitocondrial (Hill, 1914; Meyerhof, 1920; Hill y Lupton, 1923). Debido a estas observaciones el lactato se ha relacionado clásicamente con el estado de anaerobiosis. El dogma tradicional del metabolismo glucolítico, diseñado en base a los acontecimientos históricos descritos en el párrafo anterior, es que el producto final de la glucólisis depende de la disponibilidad de O2: en condiciones aeróbicas el resultado de la glucólisis es el piruvato (que se transporta a la mitocondria), mientras que en condiciones anaeróbicas el producto final es el lactato. Actualmente se conoce que el producto final de la glucólisis, independientemente de la PO2, es fundamentalmente el lactato (Richardson et al., 1998; Rogatzki et al., 2015; Bendahan et al., 2017). La función del lactato intracelular, es actuar como metabolito de unión entre la glucólisis, que ocurre en el citosol, y la fosforilación oxidativa, que tiene lugar en la mitocondria (Brooks et al., 1984; Brooks, 2002, 2009, 2018). El paso del lactato desde el citosol hasta la mitocondria se produce gracias al transportador monocarboxílico de lactato tipo 1 (MCT1) localizado en el espacio intermembrana unido a la membrana interna mitocondrial (Hashimoto et al., 2006). En la mitocondria el lactato se convierte en piruvato, que puede catabolizarse en el ciclo de Krebs o servir para la producción de oxalacetato. El lactato es por lo tanto un sustrato mitocondrial y tiene un papel principal en la homeostasis del ATP celular (Figura 13 A). A nivel sistémico, el lactato se ha considerado un biomarcador de estrés, un producto de desecho como consecuencia de la hipoxia, uno de los causantes de la fatiga muscular y un agente productor de daños tisulares por la acidosis láctica. Sin embargo, actualmente se conoce que participa en al menos tres funciones de vital importancia: 1. El lactato como fuente de energía. Experimentos con isótopos radiactivos de carbono han demostrado que el lactato, en vez de la glucosa, es la principal fuente de energía para muchos tejidos salvo para el cerebro. El lactato es transportado en el torrente sanguíneo para suministrar energía en función de la demanda metabólica (Stanley et al., 1985; Mazzeo et al., 1986; Bergman et al., 1999; Hui et al., 2017; Martínez-Reyes y Chandel, 2017). Introducción 20 2. El lactato como precursor gluconeogénico. Se ha descrito que los niveles de lactato regulan la concentración de glucosa en sangre (Bergman et al., 2000; Emhoff et al., 2013; Hui et al., 2017; Martínez-Reyes y Chandel, 2017). 3. El lactato como “lactohormona”. El lactato es una molécula señalizadora autocrina, paracrina y endocrina que participa en la interacción entre órganos, tejidos y células (Brooks, 2002; Hashimoto et al., 2007; Brooks, 2009; Barros, 2013; Nalbandian y Takeda, 2016; Hui et al., 2017). El lactato sanguíneo actúa como precursor para obtener energía en función de la demanda energética tisular (Hui et al., 2017). Para satisfacer estas necesidades metabólicas se han descrito 2 tipos celulares en función de su metabolismo láctico (Brooks, 2018). Las células productoras de lactato, son aquellas donde predomina el metabolismo glucolítico, producen mayor concentración de lactato y se encargan de exportarlo hacia el espacio extracelular; y las células consumidoras, son aquellas donde predomina el metabolismo oxidativo y utilizan el lactato para obtener energía a nivel mitocondrial, usando la CTE (Brooks, 2018) (Figura 13 B). El flujo de lactato desde las células productoras a las células consumidoras puede ser de manera directa célula-célula o a través del torrente circulatorio (Figura 13 B). El transporte transmembranario de lactato se lleva a cabo gracias a transportadores monocarboxílicos de lactato/ piruvato (MCT), que permiten el paso de lactato a través de las membranas celulares cotransportandolo con un protón (Roth y Brooks, 1990; García et al., 1994; Dubouchaud et al., 2000). El transporte es bidireccional (García et al., 1994; Price et al., 1998), permitiendo a los tejidos elegir entre la liberación y la captación de lactato dependiendo de los niveles de lactato intracelulares, del gradiente de protones y del estado redox de las células (Brook, 2018). Las distintas isoformas de estos transportadores se encuentran en numerosos tipos celulares y tejidos, incluso en el cerebro y pueden intercambiar lactato rápidamente (McClelland et al., 2003; Pellerin et al., 2005; Hashimoto et al., 2008). Hasta la fecha se han caracterizado 4 isoformas: MCT1, MCT2, MCT3 y MCT4. El MCT1, que se expresa mayoritariamente en el corazón y en el músculo esquelético, introduce el ácido láctico en la célula para que actúe como combustible en el metabolismo oxidativo. También se expresa en el hígado y en el riñón donde el lactato actúa como precursor gluconeogénico (McCullagh et al., 1996; Halestrap et al., 1997; Halestrap y Price, 1999). Además, se ha descrito que el MCT1 está presente en la membrana interna mitocondrial para facilitar la unión entre el metabolismo glucolítico y el oxidativo (Hashimoto et al., 2006). MCT2, es el transportador de mayor afinidad (Broer et al., 1999) y puede captar fácilmente el lactato para la gluconeogénesis en el hígado y riñón donde es la Introducción 21 isoforma más expresada en algunas especies (Jackson, 1997; Halestrap y Meredith, 2004). El MCT2 también es el más expresado en neuronas para facilitar la absorción de lactato producido por los astrocitos (Pierre y Pellerin, 2005; Bergersen, 2007). La expresión del transportador MCT3 está limitada la membrana basal del epitelio pigmentado de la retina y al epitelio del plexo coroideo (Philp et al., 1998; Yoon y Philp, 1998), mientras que el transportador MCT4 se expresa principalmente en células glucolíticas tales como en fibras del músculo liso (Wilson et al., 1998; Kadenbach y Huttemann, 2015), y se induce en otras células bajo condiciones de hipoxia (Ullah et al., 2006). Figura 13. Metabolismo de lactato (A) El lactato como un vehículo de unión entre el metabolismo glucolítico y oxidativo (respiración mitocondrial) que ocurre continuamente bajo condiciones aeróbicas. Las uniones entre las rutas productores y consumidores de lactato existen en numerosas células, tejidos y órganos. Modificado de Brooks, (1984) y Brooks, (2018). (B) Representación de la interacción mediada por lactato entre células. Hay un intercambio de lactato directo o a través del torrente circulatorio entre las células productoras y consumidoras de lactato. Este intercambio depende de la concentración de lactato y del gradiente de protones. Aunque ambos tipos células llevan a cabo la glucólisis y la fosforilación oxidativa la concentraciones de lactato es mayor en la células productoras (glucolíticas) que en las consumidoras. Modificado de Brooks, (1984) y Brooks, (2018). Introducción 22 4.2. Lactato y regulación de la respiración Los parámetros respiratorios varían como un mecanismo de adaptación ante distintos estímulos. El ejercicio y la hipoxia son circunstancias que activan una respuesta hiperventilatoria y en ambos casos hay un incremento de la concentración de lactato en sangre; sin embargo, la PaO2 es distinta: durante hipoxia hay una disminución de la PaO2 y en el ejercicio moderado no hay cambios significativos de la PaO2 si se realiza a nivel del mar. No obstante, se desconoce cuál es la función biológica del incremento de lactato en ambas condiciones y cuál es su contribución a la respuesta hiperventilatoria adaptativa (Lee et al., 1996; Fregosi, 1998; Hardarson et al., 1998; Chang et al., 2015; San-Millan y Brooks, 2018). La mayor dificultad para esclarecer la contribución del lactato a la respuesta hiperventilatoria es separar el efecto de lactato de la acidez láctica o de la hipoxia, ya que tanto una disminución del pH como la disminución de PaO2 activan el CC que media la respuesta hiperventilatoria. De hecho, se ha descrito que el ácido láctico produce un incremento de la frecuencia ventilatoria en ratas (Lee et al., 1996), pero puede deberse a que la disminución del pH también activa el CC (Eyzaguirre et al., 1965) y los quimiorreceptores centrales, promoviendo la hiperventilación. No obstante, hay circunstancias donde se produce un incremento de lactato sin ir acompañado de una disminución del pH (Zilva, 1978; Ribas, 2010; Brooks, 2018) o de hipoxia (Gladden, 2001; Brooks, 2003; Ribas, 2010). Se ha descrito que el lactato, per se, en circunstancias controladas de pH, PaCO2, PaO2, produce un aumento de la frecuencia ventilatoria (Hardarson et al., 1998). La detección de lactato podría sumarse a la regulación compensatoria activada durante el ejercicio para promover la hiperventiación (Fregosi, 1998), por lo que consideramos interesante estudiar el efecto de lactato en la activación de CC bajo condiciones de normoxia y controlando el pH extracelular. 4.2.1. Lactato e hipoxia La concentración de lactato en sangre aumenta durante la hipoxia crónica en condiciones de reposo en individuos que viven en grandes altitudes. Las mayores concentraciones de lactato se obtienen en los primeros minutos de exposición a hipoxia (Reeves et al., 1992). El aumento de la concentración de lactato se debe a que durante los primeros minutos en hipoxia se activa el sistema simpático que facilita su aumento activando la fosforilasa e incrementando la velocidad de las bombas Na+-K+, que parecen estar unidas a enzimas glucolíticas (LDH) favoreciendo la producción de lactato. Además, la activación del sistema simpático produce vasoconstricción en el hígado, riñones y músculos inactivos disminuyendo el reciclado de lactato (Brooks et al., 1998; Ribas, 2010). A medida que la Introducción 23 exposición a hipoxia se hace más crónica, disminuye la respuesta simpática y la concentración de lactato simultáneamente (Brooks et al., 1998). El papel del lactato en la respuesta adaptativa a hipoxia ha sido muy estudiado. Se conoce que el lactato actúa como vasodilatador mejorando el abastecimiento del O2 a los tejidos antes una lesión (Mori et al., 1998; Trabold et al., 2003), así que es probable que durante hipoxia tenga la misma función. Además, hay estudios que tratan de esclarecer la implicación del lactato en la respuesta respiratoria a hipoxia mediada por el CC sin llegar a resultados concluyentes (Kirsch y D'Alecy, 1983). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! OBJETIVOS! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Objetivos* ! 27! OBJETIVOS El objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido avanzar en el conocimiento del mecanismo de quimiotransducción en respuesta a hipoxia en las células glómicas del CC. Este es un proceso biológico básico cuyo estudio inició nuestro grupo hace 30 años y que en fecha reciente, debido a la generación de un modelo de ratón knockout embrionario para la subunidad Ndufs2 de CMI (ratón TH-NDUFS2), ha progresado notablemente (ver “Introducción”). El modelo de deleción embrionaria del gen Ndufs2 tiene algunas limitaciones metabólicas, por lo que se desarrolló el modelo de knockout condicional para la deleción del gen Ndufs2 en el adulto (ratón ESR-NDUFS2). En esta Tesis Doctoral se estudia con detalle la respuesta aguda a la hipoxia por las células del CC en el ratón ESR-NDUFS2. Además, se ha re-analizado el papel del Olfr78 en la respuesta a hipoxia aguda y a lactato. Finalmente, se ha investigado si el CC es capaz de detectar los cambios fisiológicos en los niveles de lactato extracelular. Los objetivos específicos del trabajo fueron los siguientes: 1. Caracterizar los cambios en la respuesta a hipoxia sistémica y celular en ratones knockout ESR-NDUFS2, en paralelo a la disminución gradual de la actividad del CMI tras el tratamiento con TMX. 2. Confirmar que el incremento de NADH y ROS durante hipoxia en células glómicas promueve la activación del CC, y estudiar la importancia del ratio NADH/NAD+ en la capacidad de responder a hipoxia de las células. 3. Estudiar la importancia de la acumulación de quinona reducida durante la hipoxia en la producción de los agentes señalizadores (NADH y ROS) por el CMI. 4. Comprobar si el receptor olfatorio Olfr78 es esencial para activar el CC durante hipoxia y si dicha molécula es realmente un receptor funcional de lactato. 5. Investigar si el CC se activa por lactato extracelular y la naturaleza de los mecanismos responsables. 6. Estudiar el significado e impacto fisiológico de la activación del CC por lactato. Materiales y Métodos 34 cámaras están selladas salvo por un pequeño orificio de fuga, necesario para permitir la salida de gases a un flujo idéntico al de entrada (flujo salida 1 L/min) y evitar de esta forma cambios de presión dentro de la cámara de pletismografía. Las cámaras tienen acoplados sensores, que son capaces de medir pequeños cambios de presión que se producen en su interior causados por movimientos o por la respiración de los animales. Los datos de presión recogidos por estos sensores son enviados al amplificador y este produce una señal de flujo (mL/s; ver panel de la derecha de la Figura 16). La frecuencia de muestreo de los cambios de presión fue de 500 Hz. Se utilizó el software de análisis del programa iox2 (EMKA Technologies) para obtener los diferentes parámetros respiratorios a partir del registro del flujo y se almacenaron en una tabla los valores, tomándose un valor cada 2s. Además, una de las cámara tiene acoplados sensores de concentración de O2 y CO2 (oxy 3690 MP, GHM Messtechnik, y NS:MCO, Cibertec) que mandan la señal obtenida, con una frecuencia de muestreo de 10000 Hz, al amplificador y luego estas señales son digitalizadas y grabadas, sin filtrar. Solo se almacenó un valor de O2 y CO2 cada 2 segundos (Figura 16). Figura 16. Equipamiento de pletismografía. La imagen ilustra las dos cámaras de registro usadas para realizar una plestismografía de animal completo. Las cámaras están conectadas por tubos a las mezclas de los distintos gases y cada una tiene un sensor de presión independiente. Las concentraciones de O2 y CO2 son monotorizadas por sensores conectados a una de las cámaras. Los datos recogidos por estos sensores son digitalizados gracias al programa iox2. Modificado de Ortega- Sáenz et al., (2018). El protocolo experimental al que fueron sometidos los diferentes animales se ilustra en Materiales y Métodos 35 la Figura 17 y constaba de dos ciclos de normoxia/hipoxia, en los que la hipoxia se mantuvo durante 5 minutos al 10% O2 (trazo azul, Figura 17), seguidos de un ciclo de hipercapnia donde se mantuvo 1 min la concentración de CO2 al 5% (trazo rojo, Figura 17). Los valores de frecuencia respiratoria obtenidos en las distintas condiciones experimentales se muestran en el panel superior de la Figura 17 (punteado azul, Figura 17). Para cuantificar la frecuencia respiratoria basal (en normoxia) se tomaron todos los puntos registrados 5 minutos antes de la exposición a hipoxia o a hipercapnia y 5 minutos tras la recuperación. Para cuantificar la frecuencia respiratoria en hipoxia se tomaron los puntos registrados durante los 5 minutos que el animal estuvo expuesto a 10% O2. Por último, para cuantificar la frecuencia respiratoria en hipercapnia se tomaron los puntos registrados durante el minuto que el animal estuvo expuesto a 4-5 % CO2. El software iox2 incluye un sistema automático para diferenciar entre los cambios de presión debidos a la respiración rítmica y los relacionados con el movimiento irregular de los animales como olfatear, suspirar, etc. La tasa de éxito se obtiene del análisis de un número determinado de respiraciones consecutivas, si todas ellas tienen una cinética similar se obtiene una tasa de éxito del 100%, cuanto menos parecidas sean, menor es la tasa de éxito y más probabilidad es que sean debidas a movimientos del animal. En nuestro laboratorio solo utilizamos para analizar los datos obtenidos con una tasa de éxito del 100%. Figura 17. Incremento de la frecuencia respiratoria de un animal control en respuesta a hipoxia e hipercapnia. Registro representativo de cómo aumenta la frecuencia respiratoria de un animal cuando disminuye la presión de O2 desde 21% hasta 10% (trazo azul) o cuando se aumenta la concentración de CO2 desde 0,04% hasta 5% (trazo rojo). Materiales y Métodos 36 2. Preparaciones celulares Tras el sacrificio de los ratones se extrajeron las bifurcaciones de las arterias carótidas y se disecaron los CC, los cuales se procesaron de forma diferente en función del tipo de experimento a realizar. En esta Tesis Doctoral se utilizaron rodajas de CC para registrar por amperometría la actividad secretora en respuesta a distintos estímulos, así como para la medida de la producción de ROS. Las células dispersas se utilizaron para las medidas microfluorimétricas así como para los registros de corrientes iónicas y potencial de membrana con la técnica de patch clamp. 2.1. Rodajas de cuerpo carotídeo Las rodajas de CC se realizaron siguiendo el procedimiento previamente descrito (Pardal et al., 2000; Piruat et al., 2004; Ortega-Sáenz et al., 2018). Tras sacrificar a los animales se extrajeron las bifurcaciones y se diseccionaron los CC en una solución fría de Tyrode 0 calcio (148 mM NaCl, 2 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucosa, pH 7.4). Los CC se incluyeron en agarosa de bajo punto de fusión (SeaKem GTG, Lonza) al 1% en PBS a una temperatura de 42 ºC, se solidificó el bloque de agarosa en hielo, se pegaron en la cámara del vibratomo (VT 1200S, Leica) y se cubrieron con solución Tyrode 0 calcio para cortar los CC en rodajas de 150 µm de grosor. Las rodajas se incubaron durante 5 minutos en el baño a 37 ºC con agitación suave en 3 ml de solución enzimática (0,27 mg/ml de tripsina I (Sigma), 0,6 mg/ml de colagenasa tipo II (Sigma), 1,25 U/ml de elastasa porcina (Calbiochem) y 0,05 mM de CaCl2 en PBS a pH 7,4). A continuación, se retiró la solución de enzimática, se lavaron las rodajas 2 veces con PBS frío, se añadieron 2 ml de medio de cultivo completo (30% DMEM/F12 sin glutamina y 60% DMEM sin glucosa, ni piruvato sódico) (Gibco), 10% FBS (Biowhittaker), penicilina (100U/ml) /estreptomicina (10µg/ml) (Biowhittaker), 2 mM L-glutamina (Biowhittaker), 84 U/L insulina (Actrapid), eritropoyetina (0,2 U/ml) y se incubaron a 37ºC y 5% CO2. Las rodajas se registraron desde las 24h después de terminado el cultivo. 2.2. Células dispersas de cuerpo carotídeo Las células del CC se dispersaron siguiendo el procedimiento descrito detalladamente en el capítulo metodológico de Muñoz-Cabello et al., (2018). Se extrajeron los CC y se incubaron en 3 ml de solución enzimática (ver “apartado 2.1”) durante 20 minutos en el incubador a 37ºC y 5% CO2 para llevar a cabo la digestión enzimática. A continuación, los CC se estiraron mecánicamente en el microscopio con 2 agujas estériles para ayudar a la Materiales y Métodos 37 disgregación del tejido y se incubaron en las mismas condiciones durante 5 minutos más. Para parar la reacción enzimática se añadió medio de cultivo completo (ver “apartado 2.1”). Se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos y el pellet obtenido se resuspendió en medio completo. Se sembraron las células sobre cubres tratados con poli-L-lisina (Sigma). El medio de cultivo utilizado para las células dispersas es el mismo que el descrito para las rodajas (ver “apartado 2.1”) pero sin añadir EPO. Las células dispersas se incubaron a 37 ºC y 5% CO2 y se registraron al día siguiente. 3. Técnicas bioquímicas y de biología molecular in vitro Tras el sacrificio de los ratones los tejidos de interés se extrajeron, se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80ºC en los casos que fue necesario. Estos tejidos se utilizaron posteriormente para llevar a cabo experimentos con técnicas de bioquímica y biología molecular. 3.1. Medición de la actividad del complejo I mitocondrial El ensayo de la actividad del CMI, de los ratones de experimentación, se llevó a cabo en mitocondrias aisladas del riñón. La extracción y medición de la actividad del CMI en un espectrofotómetro se basó en procedimientos previamente descritos (Birch-Machin y Turnbull, 2001; Fernández-Vizarra et al., 2002; Díaz-Castro et al., 2012). Las mitocondrias se congelaron y descongelaron rápidamente 3 veces pasándolas de N2 líquido a un baño a 30 ºC para fragmentar las mitocondrias y hacer accesibles los complejos de la CTE. La medida de la actividad del CMI se basa en la reducción de la absorbancia del NADH al ser oxidado a NAD+ por el CMI. En este ensayo se emplearon 10-20 µg de extracto mitocondrial y se llevó a cabo a 30 ºC en presencia de ubiquinona 0,13 mM (Sigma), NADH 0,13 mM (Roche) y antimicina A 3,6 µM (Sigma). La absorbancia se midió cada 10 segundos, durante 2 minutos, a 340 nm de longitud de onda en el espectrofotómetro (DU730, BeckmanCoulter). A continuación, se añadió rotenona 5 µM (Sigma) y se volvió a medir. La actividad del CMI se determinó a partir de la diferencia en la tasa de disminución de la absorbancia de NADH antes y después de la adición de rotenona. La actividad de CMI se normalizó con la cantidad de proteína, determinada mediante un ensayo de Bradford (Bio-Rad). 3.2. PCR estándar El genotipado de los ratones se realizó mediante PCR convencional a partir de una muestra de tejido de deditos recogidos a los 10 días postnatales. Se extrajo ADN genómico de Materiales y Métodos 38 esta muestra mediante digestión con 150 µl de tampón “PCR Direct” (Viagen Biotech) y 0,3 µg/µl de proteinasa K durante 2 h 45 min a 800 rpm y 57ºC. Se inactivó la proteinasa K durante 45 min a 85ºC. Para identificar los alelos Ndufs2+ (143 pb), y Ndufs2flox (355 pb) se amplificaron secuencias específicas con los cebadores Fx51 y Fx31 y el alelo Ndufs2- (550 pb) con Fx51 y FRT1. Las mezclas de la reacción para las distintas PCRs fueron las siguientes: para los alelos Ndufs2+ y Ndufs2flox las mezclas contenían 2 µl de ADN molde, 10 µl de agua libre de nucleasas, 1 µl de los cebadores específicos y 9 µl de la mezcla Dream taq (DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)). La mezcla de la reacción para la PCR de alelo Ndufs2- contenían 2 µl de ADN molde, 5 µl de tampón 10x, MgCl2 2,5 mM, 0,2 mM de cada desoxirribonucleótido (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 38,7 µl de agua libre de nucleasas, 1 µl de los cebadores específicos y 1,5 U de la Taq polimerasa (Bioline). El gen de la recombinasa Cre expresado bajo el promotor del gen Th se amplificó con los cebadores TH3´, TH5´y Cre UD, la ausencia de esta recombinasa amplificaba una banda de 300 pb y la presencia de 400 pb. El gen de la recombinasa Cre se amplificó con los cebadores Cre lo y Cre up, la presencia de esta recombinasa tenía un valor de 750 pb. Las mezclas de la reacción para las distintas PCRs contenían 2 µl de ADN molde, 10 µl de agua libre de nucleasas, 1 µl de los cebadores específicos para cada una de ellas y 9 µl de la mezcla Dream taq (DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)). Los alelos Olfr78+ (673 pb) y Olfr78tm1Moml (670 pb) se amplificaron con los cebadores SF7, SF8 y SF4, SF8, respectivamente. Para confirmar la presencia del alelo Olfr78tm1Moml se llevó a cabo el genotipado de la proteína GFP con los cebadores M1345, M1346 y M1343. Con M1345 y M1346 se amplificó la ausencia GFP (494 pb) y con M1345 y M1343 se amplificó la sobrexpresión de GFP (388 pb). Las mezclas de las PCRs contenían 2 µl de ADN, 7 µl de agua libre de nucleasas, 0,5 µl de los cebadores específicos y 15 µl de la mezcla Dream taq (DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)). El stock de todos los cebadores específicos es de 20 µM, sus secuencias se muestran en la siguiente tabla. Materiales y Métodos 39 Nombre Secuencia (5’-3’) Fx51 ATAAGAGTGGATAGGATGTTT Fx31 CATTTCTCCCTTCCCGTC FRT1 AGTGGCAGAACAATAGAGTGATCCAGGG TH-3’ CTTTCCTTCCTTTATTGAGAT TH-5’ CACCCTGACCCAAGCACT Cre UD GATACCTGGCCTGGTCTG Cre lo ACGGGCACTGTGTCCAG Cre up TGTTCAGGGATCGCCAG SF7 CTCATTGGTCTGTCAGTGG SF8 GATACACATAAGCCTTCCTG SF4 TGGAGCCCGTCAGTATCGGC M1345 GGGAGCGCCTAGTATCCAGAC M1346 TCTTGGGCATTGTGGATGTGG M1343 GGTCAGCTTGCCGTAGGTGG Tabla 1. Secuencia de los cebadores empleados para el genotipado de los ratones por PCR. 3.3. Análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa Para extraer ARN, se homogeneizó el CC, el GCS y la MA con el politrón (Pro Scientific) y se empleó el kit RNeasy micro (Qiagen). El ARN obtenido se cuantificó en el espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Para el análisis de la expresión génica en CC, dado su pequeño tamaño, fue necesario agrupar los CC de 3-4 ratones como una sola muestra y realizar una preamplificación previa a la retrotranscripción. Para ello se empleó el WT Expression kit (Ambion) según el manual del fabricante. Se retrotranscribieron 0,5 µg de ARN con el QuantiTec Reverse Transcription kit (Qiagen), según el protocolo del fabricante, para obtener ADNc. Las reacciones de PCR cuantitativa de CC, GCS y MA se realizaron con 20 µl de ADNc. Se emplearon el reactivo TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) y sondas TaqMan (Applied Biosystems) para la amplificación del ADNc de interés. Estas reacciones se llevaron a cabo en un termociclador 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). El nivel de expresión del gen de estudio se analizó mediante cuantificación relativa (ΔΔCt) empleando el gen de la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh) como gen housekeeping. 4. Inmunohistoquímica de fluorescencia en rodajas de cuerpo carotídeo Las rodajas de los ratones Olfr78, registradas previamente con amperometría, se fijaron durante 20 minutos con paraformaldehído (PFA) 4% en PBS, pH 7,4 (Sigma) y posteriormente se almacenaron a 4ºC en una solución de azida sódica al 0,5% en PBS. Las rodajas se permeabilizaron en PBS con Tritón 0,1% (Tritón X100 0,1% (Sigma) en PBS) y se Materiales y Métodos 40 incubaron con solución de bloqueo (suero fetal bovino (FBS) 10% y BSA 1mg/ml en PBS- Tritón 0,1%) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para detectar la proteína TH se incubó con el anticuerpo policlonal de tirosina hidroxilasa (TH) (conejo anti-TH, Novus Biologicals, 1:2500) durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente, para detectar la presencia de la proteína GFP se incubó con el anticuerpo anti-GFP (conejo IgG anti-GFP, Aves Labs, 1:500). La señal se detectó utilizando el anticuerpo secundario fluorescente Alexa568 (anticonejo, Invitrogen, 1:500). Finalmente, los núcleos se tiñeron con DAPI 1 µg/ml en PBS durante 10 minutos (Sigma, 1:1000). Para sellar las rodajas se utilizó medio de fluorescencia (Dako). 5. Experimentos funcionales in vitro Tras la preparación de las rodajas de CC o de las células glómicas aisladas se llevó a cabo el estudio in vitro del CC con distintas técnicas de registros electrofisiológicas y microfluorimétricas. 5.1. Técnicas electrofisiológicas 5.1.1. Técnica de amperometría La técnica de amperometría permite registrar la actividad secretora de las células mediante el uso de un electrodo de fibra de carbono polarizado al potencial de oxidoreducción de la molécula que se desea detectar. Con esta técnica, se registraron las catecolaminas (especialmente dopamina) liberada por las células glómicas en rodajas de CC expuestas a diferentes estímulos como hipoxia, hipercapnia, lactato y alto potasio (ver apartado 6 “Soluciones de registro”). • Equipamiento de registro de amperometría La fibra de carbono se fabricó con una fibra sintética de grafito, de 10 µm de diámetro (AMOCO), que se insertó en un tubo de polietileno (Portex) y el extremo del tubo se calentó para fundirlo con la fibra de carbono y conseguir su aislamiento eléctrico. El otro extremo del tubo de polietileno se insertó en un capilar de vidrio (Kimax-51, Kimble products) y esta unión se selló con Sylgard (Sigma). El capilar de vidrio permite la conexión de la fibra con el electrodo de plata del head-stage del amplificador. Antes de comenzar el registro, el electrodo con la fibra, se rellenó con una solución 3M KCl para permitir la conducción de la corriente entre la fibra y el electrodo de plata del head-stage. Para detectar la liberación de dopamina Materiales y Métodos 41 de las células glómicas en las rodajas del CC ante distintos estímulos, la fibra se polarizó a un voltaje de +750 mV, que es el valor de potencial al cual se produce la oxidación de la dopamina. La polarización de la fibra se llevó a cabo mediante un generador de voltaje (npi Electronics, GMBH) conectado al amplificador (EPC-8, HEKA Electronics). Los electrones liberados por la oxidación de la dopamina, al entrar en contacto con la fibra de carbono, son transferidos a esta y generan una corriente que fluye por el electrodo hacia el preamplificador o head-stage donde es amplificada mediante un amplificador operacional configurado como convertidor corriente/voltaje. Esta señal se filtró con un filtro de paso bajo con una frecuencia de corte de 100 Hz y se digitalizó mediante un convertidor analógico-digital (ITC-16, Instrutech Corporation). Los datos se adquirieron con el programa Pulse 8 (HEKA Electronics) y se analizaron con el programa Igor Pro (Wavemetrics) (Figura 18 A). La corriente generada por la oxidación de toda la dopamina liberada tras la fusión de una única vesícula da lugar a una espiga amperométrica (Figura 18 B y C). La magnitud de la corriente generada es proporcional al número de moléculas oxidadas definidas por la siguiente ecuación: ∫ It dt = Q = n F N Donde It es la corriente y Q es la carga (calculada como la integral en el tiempo de la corriente amperométrica) a la superficie del electrodo sensor; n es el número de electrones transferidos por cada molécula oxidada (por ejemplo, 2 electrones en el caso de la dopamina), F es la constante de Faraday (96.500 culombios/mol) y N es el número de moles del neurotransmisor oxidado. • Análisis de la señal amperométrica Para cuantificar la respuesta secretora inducida por distintos estímulos, se calcularon distintos parámetros utilizando el programa Igor Pro Carbon (WaveMetrics). La tasa de secreción (fentocoulombios (fC)/ min) se calculó sumando la carga de todas las espigas amperométricas registradas durante el último minuto de exposición al estímulo. La frecuencia de espigas es el número de espigas evocadas durante el último minuto de la exposición al estímulo. La secreción acumulada (en picocoulombios (pC)) se calculó como la suma de la integral en el tiempo de espigas sucesivas (señal verde en la Figura 19). También se calculó el porcentaje de células que respondieron a cada estímulo. Para ello, sólo se incluyeron aquellas Materiales y Métodos 42 células que respondieron a alto potasio y se consideró que una célula respondía al estímulo si su secreción aumentó al menos el doble de la secreción basal. Figura 18. Equipamiento de amperometría. (A) Esquema representativo del equipamiento de amperometría. La fotografía bajo el microscopio muestra el electrodo con la fibra de carbono posicionada cerca de las células glómicas del CC. (B) Dibujo esquemático de la liberación de dopamina de una célula glómica registrada con la técnica de amperometría. (C) Espiga amperométrica registrada como resultado de la fusión de una vesícula. Figura modificada de Ortega-Sáenz et al., (2018). Materiales y Métodos 43 Figura 19. Actividad secretora típica de una célula del cuerpo carotídeo ante un estímulo hipóxico. En el panel inferior se muestra en verde la secreción acumulada. 5.1.2. Técnica de patch-clamp Para caracterizar las propiedades electrofisiológicas de las células glómicas aisladas se utilizó la técnica de patch-clamp adaptada a nuestro laboratorio (Hamill et al., 1981; Ganfornina y López-Barneo, 1991; Ortega-Sáenz et al., 2010; Fernández-Agüera et al., 2015; Muñoz-Cabello et al., 2018). Esta técnica consiste en establecer una unión de alta resistencia, del orden de gigaohmios, entre la punta de una micropipeta de vidrio y la membrana de la célula. De esta forma se puede controlar el potencial de la membrana plasmática y registrar los cambios en las corrientes iónicas (modo voltage-clamp) o bien, registrar los cambios producidos en el potencial de membrana (Vm) generados al aplicar distintos estímulos (modo current-clamp). Las distintas configuraciones de la técnica de patch-clamp están descritas en numerosas publicaciones previas (Hamill et al., 1981; Muñoz-Cabello et al., 2018; Ortega- Sáenz et al., 2018). En el presente trabajo se utilizaron las configuraciones de whole-cell y de parche perforado. En la primera, una vez formado el sello de alta resistencia, se aplicó un pulso de succión para romper el parche de membrana celular en contacto con la micropipeta. De esta forma se accedió al interior de la célula, que se dializó con la solución interna contenida en la micropipeta de registro, que es distinta en función del tipo de corriente macroscópica que se quiera registrar (ver Tabla 3 A en el apartado 6). En la configuración de parche perforado se añadió Anfotericina B a la solución interna. Esta sustancia es un ionóforo capaz de abrir poros en el parche de membrana por el que pasan los iones, el agua y moléculas de diámetro menor a ~200 Da (Linley, 2013), evitando la diálisis de macromoléculas citosólicas. La receta para obtener la solución interna más Anfotericina B se muestra en el apartado 6 “Tabla 3 A”. Además de variar la composición de la solución interna según la configuración y el tipo de corriente, también hay que modificar las soluciones Materiales y Métodos 50 reversible. RoGFP es una proteína GFP modificada genéticamente, tiene dos cisteínas en posición 147 y 204 cercanas al grupo cromóforo que forman un puente disulfuro susceptible de ser oxidado o reducido variando así la conformación de la proteína. Este cambio conformacional produce un cambio de intensidad de emisión cuando la sonda fluorescente es excitada previamente con la longitud de onda adecuada. El indicador roGFP se excitó a 400 y 480 nm y la fluorescencia emitida se detectó a 525 nm. Para la transducción se utilizaron vectores adenovirales con la construcción para roGFP (ViraQuest Inc), dirigidas al citosol (VQAd ro-GFP stock 1x1012 pts/ml) y espacio intermembrana (VQAd CMV GDFro-GFP stock 1x1012 pts/ml). Para simplificar en este trabajo nos referiremos como cito-roGFP e EIM-roGFP, respectivamente. Los experimentos se llevaron a cabo en rodajas de CC. Los cultivos se infectaron y se registraron a las 48 horas de la transducción. Los niveles máximos de oxidación y reducción se determinaron añadiendo H2O2 0,1 mM y ditiotreitol (DTT) 1 mM, respectivamente y midiendo su emisión con la sonda cito-roGFP. Los cambios en la producción de ROS del espacio intermembrana mitocondrial se expresaron como cambios relativos a partir del ratio de emisión a 400/480. 6. Soluciones de registro Para llevar a cabo los distintos registros in vitro, tanto las rodajas de CC como las células glómicas dispersas fueron perfundidas con distintas soluciones externas, todas con una osmolaridad de 300 mOsm/Kg y un pH de 7,4: que fue ajustado burbujeando con 5% CO2 en el caso de las soluciones externa que tenía el bicarbonato sódico como tampón o con sales (NaOH o HCl) en el caso de la solución externa con tampón HEPES. Para hacer los experimentos de dosis dependencia de O2 se utilizaron botellas con distintos porcentajes de O2: Normoxia 145 mmHg de O2; 12% O2, 85 mmHg de O2; 6% O2, 45 mmHg de O2; 3% O2, 25 mmHg de O2 e hipoxia, (0% de O2) 45 mmHg de O2 (tabla 2). Para el registro intracelular con la técnica de patch-clamp se utilizaron distintas soluciones intracelulares y extracelulares en función de la configuración utilizada (Whole-cell o parche perforado) así como del tipo de macrocorrientes que se quisiera registrar (Tablas 3). En cada experimento, el pH de la solución interna se ajustó a 7,2 y la osmolalidad fue aproximadamente de 285 mOsm/kg. Para los experimentos con 10 o 20 mM de succinato potásico en la solución intracelular de registro con parche perforado se intercambió estequiométricamente dicha concentraciones con las de sulfato potásico. La comprobación del estado fisiológico de las células glómicas, en las técnicas de amperometría y medición microfluorimétrica de calcio intracelular, se realizó Materiales y Métodos 51 despolarizándolas con la solución de alto potasio. Las distintas concentraciones de lactato se obtuvieron cambiando estequiométricamente el cloruro sódico por L-lactato sódico. Los experimentos realizados para conocer el efecto de 2,5 de α-KB, 10 mM de piruvato sódico, 5 mM de dimetil-succinato y 5 mM de dimetil-malonato en la respuesta a hipoxia o en los parámetros fisiológicos de las células glómicas, se llevaron a cabo añadiendo los distintos compuestos a la solución de registro. En los casos donde las concentraciones añadidas fueron mayores que 5 mM se hicieron sustituyendo estequiométricamente su concentración por las de NaCl. Para los experimentos crónicos de α-KB y piruvato, las células fueron incubadas durante la noche con 2,5 mM de α-KB o 10 mM de piruvato sódico a 37ºC en el incubador de 5% de CO2. Los experimentos al día siguiente se realizaron añadiendo 2,5 mM de α-KB o 10 mM de piruvato sódico a la solución externa control de registro (Normoxia, Tabla 2). Normoxia Hipoxia 3%O2 6%O2 12%O2 lactato Hipercapnia potasio NaCl 117 117 117 117 117 87 117 81,5 KCl 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 40 NaHCO3 23 23 23 23 23 23 23 23 MgCl2 1 1 1 1 1 1 1 1 CaCl2 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Glucosa 5 5 5 5 5 5 5 5 Sacarosa 5 5 5 5 5 5 5 5 L-Lactato 0 0 0 0 0 20 0 0 %CO2 5 5 5 5 5 5 20 5 %N2 75 95 90 88 84 75 60 75 20% O2 20 0 3 6 12 20 20 20 Tabla 2. Soluciones y mezclas de gases de registro. Las soluciones están expresadas en mM y los gases en %. Lactato: hace referencia a lactato sódico Solución interna Whole-cell Parche perforado INa, ICa IK IK CsCl 110 - K2SO4 70 Gluconato potásico - 80 KCl 30 KCl - 50 HEPES 10 CsF 30 - EGTA 1 HEPES 10 10 MgCl2 2 EGTA 10 5 Anfotericina B (𝛍𝐠/𝐦𝐥) 240 MgCl2 - 1 ATP-Mg 4 4 Tabla 3A. Composición de la solución interna para registro de patch-clamp en células glómicas dispersas de cuerpo carotídeo. Las concentraciones están expresadas en mM salvo la Anfotericina B (µg/ml). Materiales y Métodos 52 Solución externa INa, ICa IK NaCl 140 120 BaCl2 10 - CaCl2 2,5 2,5 KCl 2,5 4,5 NaHCO3 - 23 HEPES 10 - MgCl2 1 1 Glucosa 5 5 Sacarosa 5 5 Tabla 3B. Composición de la solución externa para registro de patch-clamp en células glómicas dispersas de cuerpo carotídeo. Las concentraciones están expresadas en mM. 7. Análisis estadístico de los datos Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media. La comparación de dos grupos independientes se realizó mediante el test t de Student. Para comparar más de dos grupos independientes se realizó el análisis de la varianza (ANOVA) y a continuación los tests post hoc de Tukey o de Student-Newman-Keuls. Los datos que no se ajustaron a una distribución normal se analizaron con el test no paramétrico U-Mann Witney. Las diferencias entre los grupos estudiados se consideraron estadísticamente significativas cuando el valor de p fue menor de 0,05. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! RESULTADOS! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Resultados ! 55! RESULTADOS 1. Inhibición de la respuesta aguda a hipoxia en quimiorreceptores arteriales periféricos tras la ablación inducible del gen Ndufs2 en ratones adultos 1.1. Ratones ESR-NDUFS2. Tratamiento y evolución de la línea Los ratones ESR-NDUFS2 aparecieron en las camadas en proporción mendeliana y no presentaron ningún rasgo que permitiese distinguirlos de los controles en la etapa postnatal ni durante el tratamiento con TMX. En este trabajo se compararon animales ESR-NDUFS2 (flox/-; Cre/+ o Cre/Cre) con animales controles (+/+ o flox/+; sin Cre) de la misma camada. En el estudio histológico del CC se observó que tanto el volumen del CC como el número de células TH+ eran similares entre los animales controles y los animales con déficit inducido de Ndufs2. Sin embargo, tras finalizar el tratamiento con TMX, los animales ESR-NDUFS2 comenzaron a deteriorarse en comparación con los controles, mostrando una disminución de peso y una notable cifosis; produciéndose la muerte de los mutantes a partir de la cuarta semana tras finalizar la exposición a TMX (Fernández-Agüera et al., 2015). Por este motivo, los estudios experimentales en los ratones de la línea ESR-NDUFS2 se realizaron con animales de unos 4 meses de edad (ver Figura 14 de “Métodos”). Aunque esto no se estudió con detalle, la muerte de los ratones ESR-NDUFS2 posiblemente se debió a un fracaso de órganos vitales por la falta generalizada de función del CMI. 1.2. Pérdida gradual de las respuestas a hipoxia, sistémica y celular, en paralelo con la disminución de la función del complejo mitocondrial I en ratones ESR-NDUFS2 Los resultados previos de nuestro laboratorio en ratones TH-NDUFS2 mostraban que la deleción embrionaria del gen Ndufs2 abole selectivamente la respuesta a hipoxia de las células glómicas del CC. Para comprobar si la pérdida de la sensibilidad a hipoxia es dependiente de la actividad de CMI y descartar la posibilidad de que fuese debida a una adaptación producida durante el desarrollo embrionario ante dicha deleción, se diseñó un modelo de ratón donde se induce la ablación del gen Ndufs2 en la etapa adulta del animal mediante la administración de una dieta con TMX (Fernández-Agüera et al., 2015), (ver “Introducción” y “Métodos”). Este modelo nos permitió estudiar en paralelo el lavado de la proteína NDUFS2 y la pérdida gradual de respuesta a hipoxia aguda tanto a nivel sistémico, en el animal completo, como a nivel celular, en las células glómicas del CC. Resultados ! 56! 1.2.1. Análisis de la función del complejo mitocondrial I El gen Ndufs2 codifica la subunidad NDUFS2 de 49KDa, localizada en el bolsillo catalítico del CMI, donde se ceden los electrones a la ubiquinona para convertirla en ubiquinol (ver “Introducción”). Se ha descrito previamente que en el modelo ESR-NDUFS2, no se ensambla el CMI debido a la mutación de esta subunidad y como consecuencia, tampoco se registra la actividad del CMI medida en mitocondrias aisladas de riñón y corazón (Fernández-Agüera et al., 2015). Se realizaron experimentos para comprobar cómo afectaba la ablación inducida del gen Ndufs2 a la actividad del CMI durante el tratamiento con TMX. Para ello, la medida de actividad del CMI se realizó justo antes de iniciar el tratamiento con TMX, que desde ahora llamaremos punto pre-TMX, 7-10 días tras terminar el tratamiento, que denominaremos post- TMX y finalmente entre 21-28 días post-TMX, que en adelante llamaremos punto final (ver Figura 22 A). Los resultados obtenidos mostraron que la actividad de CMI disminuyó tras el tratamiento con TMX en los animales ESR-NDUFS2 (puntos verdes, Figura 22 B). Figura 22. Pérdida de la actividad del CMI tras el tratamiento con TMX en ratones ESRNDUFS2. (A) Diseño experimental. Los animales de dos meses de edad fueron tratados durante 30 días con dieta con tamoxifeno (TMX; negro); posteriormente los experimentos fueron realizados entre la tercera y la cuarta semana tras terminar el tratamiento (EXP; azul). Las flechas indican los puntos donde se realizaron las medidas del curso temporal. (B) Medida de la actividad del CMI (en nmol/min/mg) en extractos mitocondriales de riñón de ratones control (azul) y ESR-NDUFS2 (verde) en los diferentes puntos del curso temporal (control: pre-TMX, 977 ± 99, post-TMX 1003 ± 62 y final, 1005 ± 106 y ESR-NDUFS2: pre-TMX, 770 ± 77, post-TMX 182 ± 19 y final 144 ± 25. n=5/grupo). Los datos representan la media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,001 de los valores en cada punto comparado con los valores en situación control. Resultados ! 57! 1.2.2. Respuesta ventilatoria a hipoxia aguda Una vez caracterizado el curso temporal de la perdida de actividad del CMI se estudió si ésta se producía en paralelo a la inhibición selectiva de la respuesta ventilatoria a hipoxia aguda en los animales con deleción de Ndufs2 en la vida adulta. Para ello, parejas de ratones controles y ESR-NDUFS2 de la misma camada se sometieron a pletismografía (ver “Métodos”) y se analizó la frecuencia respiratoria en condiciones de normoxia y las variaciones de dicha frecuencia ante hipoxia (10% O2 durante 5 minutos) e hipercapnia (4-5% CO2 durante 1 minuto) en los cuatro puntos del curso temporal estudiados (pre-TMX, 4-7 días post-TMX, 10-14 días post-TMX y final). Los ratones controles mostraron un incremento reversible y significativo de frecuencia respiratoria en respuesta a hipoxia e hipercapnia, en los cuatros puntos estudiados (Figura 23 A-D, puntos azules). Sin embargo, en ratones ESRNDUFS2 la RVH se fue aboliendo gradualmente tras finalizar el tratamiento con TMX llegando a perderse completamente en el punto final (Figura 23, A-D, puntos verdes). No obstante, en este punto final, los ratones ESR-NDUFS2 fueron capaces de hiperventilar reversiblemente durante su exposición a hipercapnia como se puede ver en los registros representativos de la Figura 23 (paneles E-F) y como demuestra la cuantificación de la frecuencia respiratoria ante los estímulos de hipoxia e hipercapnia en animales controles y ESR-NDUFS2 (Figura 23 G). Estos datos sugieren que la pérdida sistémica gradual de la respuesta a hipoxia de los ratones ESR-NDUFS2 es dependiente del lavado de la proteína NDUFS2 tras el tratamiento con TMX. 1.2.3. Propiedades funcionales de las células glómicas de ratones controles y ESRNDUFS2 Con objeto de mostrar si la supresión de la RVH en los ratones ESR-NDUFS2 se debe al lavado inespecífico de la proteína NDUFS2 en diferentes tejidos o a alteraciones funcionales de las células glómicas debido a la deleción de este gen, se analizaron las propiedades electrofisiológicas de dichas células, así como la capacidad de estas células de responder a hipoxia, estudiando distintas etapas de la ruta de quimiotransducción de la activación en hipoxia en los ratones ESR-NDUFS2 (ver “Introducción”). 1.2.3.1. Respuesta secretora a hipoxia en rodajas de cuerpo carotideo La respuesta neurosecretora a hipoxia en rodaja de CC fue registrada con la técnica de amperometría, con la que se monitoriza la secreción cuántica de dopamina por exocitosis (ver Resultados ! 58! Figura 23. Curso temporal de la pérdida de la respuesta ventilatoria a hipoxia en ratones ESRNDUFS2. (A-C) Registros pletismográficos representativos del cambio en la frecuencia respiratoria durante hipoxia en ratones controles (azul) y en ESR-NDUFS2 (verde) en los puntos pre-TMX, 4-7 días post-TMX y final. (D) Medida del porcentaje del incremento de la respuesta respiratoria a hipoxia en ratones controles y ratones ESR-NDUFS2 (Controles: 9 ratones en pre-TMX; 7 ratones en 4-7 días post-TMX; 5 ratones en 10-14 días post-TMX y 6 ratones en punto final. Ratones ESR-NDUFS2: 10 ratones en pre-TMX; 9 ratones en 4-7 días post-TMX; 6 ratones en 10-14 días post-TMX y 7 ratones en punto final). (E-F) Registros pletismográficos representativos de los cambios de la frecuencia respiratoria en respuesta a hipoxia e hipercapnia en animales controles (E) y ESR-NDUFS2 (F) en punto final. Nótese que la frecuencia respiratoria no varía entre los periodos de normoxia e hipoxia en el animal ESR-NDUFS2. (G) Cuantificación de la frecuencia respiratoria de ratones controles y ESRNDUFS2 en normoxia, hipoxia e hipercapnia (Control: normoxia 165,72 ± 4,70 resp/min; hipoxia 270,98 ± 10,41 resp/min; e hipercapnia 268,55 ± 7,59 resp/min en 6 ratones y ESR-NDUFS2: normoxia 180,90 ± 16,57 resp/min; hipoxia 188,36 ± 16,44 resp/min; e hipercapnia 268,77 ± 17,94 resp/min en 10 ratones). Los datos representan la media ± SEM. * p< 0,05; ** p< 0,001 comparado con control; $ p < 0,05 comparado con 4-7 días post-TMX. Resultados ! 59! “Métodos”). Los registros representativos que se ilustran en la Figura 24 A mostraron que en “punto final”, las rodajas de CC de ratones controles manifestaban una potente respuesta secretora en exposiciones tanto a hipoxia aguda, como a hipercapnia o a la despolarización con alto potasio (panel izquierdo). Sin embargo, en las rodajas de CC de los ratones ESRNDUFS2 se encontraba abolida selectivamente la respuesta a hipoxia, aunque fueron capaces de responder a otros estímulos como alto potasio o hipercapnia (Figura 24 A, derecha). Además, la tasa de secreción en respuesta a hipoxia se cuantificó en los tres puntos temporales del tratamiento con TMX como se ilustra en la Figura 24 B. Figura 24. Respuesta secretora a hipoxia, hipercapnia y alto potasio de células glómicas en rodajas de cuerpo carotídeo de ratones controles y ESR-NDUFS2. (A) Registros amperométricos representativos de la respuesta secretora frente a diferentes estímulos obtenidos de células glómicas en rodajas de CC de ratones controles (azul) y ESR-NDUFS2 (verde). Entre ambos registros se muestra un dibujo esquemático de la liberación de dopamina en una célula glómica registrada con la técnica de amperometría. (B) Cuantificación de la tasa de secreción inducida por hipoxia en rodajas de CC de ratones controles (azul) y en ratones ESR-NDUFS2 (verde) en los diferentes puntos del curso temporal (Control: pre-TMX, 2012 ± 372 fC/min en 11/5 registros/cultivos; post-TMX 1556 ± 259 fC/min en 10/4 registros/cultivos y final 2071 ± 452 fC/min en 11/7 registros/cultivo. ESR-NDUFS2: pre-TMX, 2183 ± 388 fC/min en 8/4 registros/cultivos, post-TMX 375 ± 75 fC/min en 16/5 registros/cultivos y final 326 ± 106 fC/min en 7/4 registros/cultivo). Los datos representan la media ± SEM. ** p < 0,001 comparado con control. Resultados ! 66! por otros autores (Duchen y Biscoe, 1992b; Buckler y Turner, 2013). Esta relación es además similar a la que existe entre la actividad ventilatoria y los niveles de PaO2 en sangre en animales intactos (Rhoades y Bell, 2012). Figura 28. La deficiencia inducida de Ndufs2 inhibe la señalización del MCI durante la hipoxia aguda. (A) Promedio de la autofluorescencia basal de NADH en células glómicas de ratones controles (azul), ESR-NDUFS2 (verde) y TH-NDUFS2 (marrón). (control: 190,13 ± 0,03 u.a. de 59/12 células/ratones; ESR-NDUFS2: 335,69 ± 23,71 u.a. en 34/4 células/ratones y TH-NDUFS2: 526,09 ± 30,62 u.a. en 60/5 células/ratones). (B) Registros representativos de cambios de NADH en respuesta a hipoxia en células controles y en células ESR-NDUFS2 (C) Porcentaje de células que incrementan el NADH bajo una condición de hipoxia en ratones controles y ESR-NDUFS2 (control: 59/12 células/ratones y ESR-NDUFS2: 34/4 células/ratones). Nótese que ninguna de las células del animal ESR-NDUFS2 registradas (n=34) responde a hipoxia. (D) Cuantificación del incremento de autofluorescencia de NADH inducida por hipoxia en células controles y en células ESR-NDUFS2 (control: 36,48 ± 4,29 u.a. en 51/12 células/ratones y ESR-NDUFS2: 0 u.a. en 34/4 células/ratones). Los datos representan la media ± SEM. u.a., unidades arbitrarias. Resultados ! 67! Figura 29. Inhibición de la acumulación de NADH inducido por rotenona en células con déficit inducido de Ndufs2. (A) Registros representativos de la señal de NADH acumulada en respuesta a hipoxia y a rotenona (1 µM) en células glómicas de ratones controles (arriba) y en células de ratones ESR-NDUFS2 (abajo). (B) Porcentaje de células que tuvieron un incremento de NADH en respuesta a hipoxia y a rotenona en ratones controles y ESR-NDUFS2 (control, azul: 13/6 células/ratones; y ESRNDUFS2, verde: 24/6 células/ratones). (C) Cuantificación del incremento de NADH inducido por hipoxia o rotenona en animales controles o en animales ESR-NDUFS2 (control: hipoxia 40,6 ± 11,7 u.a. en 11/6 células/ratones; rotenona 68,5 ± 13,5 u.a. en 12/6 células/ratones y ESR-NDUFS2: hipoxia 11,2 ± 1,9 u.a. en 7/6 células/ratones; rotenona 12,7 ± 2,2 u.a. en 11/6 células/ratones). Los datos representan la media ± SEM. u.a. unidades arbitrarias. *p<0,05; **p<0,001. Figura 30. Respuesta gradual de NADH a distintos niveles de presión de oxígeno. (A) Registro representativo del cambio de la autofluorescencia de NADH en células glómicas a distintos niveles de hipoxia (PO2 ~ 12,5 mmHg) y 3% de O2 (PO2 ~ 27,5 mmHg) en la cámara de registro. (B) Cuantificación de la relación entre la amplitud de la señal de NADH (eje Y) y los distintos niveles de O2 (eje X) en células glómicas de ratones controles. Nivel de PO2: Basal o 145 mmHg (O u.a. en 46/13 células/ratones); 90 mmHg o 12% O2 (3,7 ± 1,9 u.a. en 10/2 células/ratones), 45 mmHg o 6% O2 (11,0 ± 1,5 u.a. en 16/2 células/ratones); 27.5 mmHg o 3% O2 (17,6 ± 1,9 u.a. en 45/13 células/ratones); 12,5 mmHg o hipoxia (23,16 ± 3,6 u.a. en 46/13 células/ ratones). La curva hiperbólica está trazada a ojo. Los datos representan la media ± SEM. u.a. unidades arbitrarias. Resultados ! 68! 1.3.2. Efecto de la regeneración de NAD+ sobre la respuesta a hipoxia aguda Como se describió en el apartado anterior, aunque los niveles de NADH basales del animal ESR-NDUFS2 son más bajos que los del modelo embrionario, éstos están elevados con respecto a los de los animales controles. Para descartar que la falta de respuesta a hipoxia pudiera deberse a unos niveles aun altos del ratio NADH/NAD+ decidimos modificar dicho ratio utilizando agentes aceptores de electrones, para ver si estos eran capaces de recuperar la respuesta a hipoxia en los modelos animales con deleción de Ndufs2. Los agentes empleados fueron α-cetobutirato (αKB) y piruvato, los cuales son convertidos, respectivamente, a αhidroxibutirato (αHB) y a lactato, por la LDH y otras deshidrogenasas en el espacio intracelular (Figura 31). Estas reacciones consumen NADH y regeneran el NAD+ requeridos para la función de las deshidrogenasas del ciclo de Krebs (Sullivan et al., 2015). Estos agentes se administraron tanto de forma aguda como crónica. Figura 31. Agentes regeneradores de NAD+. Reacciones enzimáticas de piruvato y a-cetobutirato (αKB) como regeneradores de NAD+. 1.3.2.1. Tratamiento agudo con regeneradores de NAD+ En primer lugar, las células glómicas aisladas fueron expuestas de forma aguda, durante 5 min, a αKB y a piruvato y se midió la autofluorescencia de NADH para comprobar su capacidad para regenerar NAD+. Los resultados que obtuvimos mostraron que tanto en las células glómicas de los ratones controles como en las de los ratones deficientes de Ndufs2 (TH-NDUS2 y ESR-NDUFS2), hubo una rápida disminución de los niveles de NADH basales en presencia de αKB y de piruvato. Esta disminución fue significativamente mayor en el caso de las células glómicas con déficit en Ndufs2 que en las células controles, llegando los niveles basales de NADH de las células con déficit de Ndufs2 a valores similares al registrado en los ratones controles en normoxia (Figura 32 A y B). Además, se registraron los cambios de NADH inducidos por hipoxia en presencia de αKB y piruvato, tanto en células glómicas controles como en células con déficit de Ndufs2. El incremento reversible de NADH en respuesta a hipoxia se mantuvo inalterado en células de animales controles (Figura 32 A), sin embargo, la bajada de los niveles basales de NADH inducida por estos agentes no permitió recuperar la respuesta a hipoxia en las células glómicas deficientes para el gen Ndufs2 (Figura a-cetobutyrato (aKB) a-hidroxibutirato (aHB) A piruvato lactato LDH NADH NAD+ O O O- OH O O- LDH/HBDH NADH NAD+ O O O- OH O O- Resultados ! 69! 32 A y C). No obstante, la respuesta a hipoxia de las células glómicas controles fue significativamente menor en presencia de αKB que cuando estaban expuesta a solución control o con piruvato (Figura 32 A y C); esto puede deberse a que el αKB se metaboliza a αHB consumiendo NADH, sin embargo, el piruvato puede metabolizarse a lactato y consumir NADH o entrar en el ciclo de Krebs y favorecer la producción de NADH (Sullivan et al., 2015) (ver “Discusión”). Figura 32. Regeneración aguda de NAD+ y capacidad de respuesta a la hipoxia de las células glómicas de ratones controles y deficientes en Ndufs2. (A) Registros representativos que ilustran la disminución de los niveles basales de NADH tras la exposición aguda a 10 mM piruvato (izquierda) y 2,5 mM αKB (derecha) en células glómicas de ratones controles (arriba), ESR-NDUFS2 (abajo, izquierda) y TH-NDUFS2 (abajo, derecha). Nótese como el aumento reversible de la fluorescencia de NADH en respuesta a la hipoxia se mantuvo en el caso de las células glómicas controles y no se recuperó en las células glómicas de ratones deficientes para Ndfus2. (B) Cuantificación de la disminución en los niveles basales de NADH producidos por la incubación aguda de células glómicas de ratones controles (azul), ESR-NDUFS2 (verde) y TH-NDUFS2 (marrón) con 10 mM piruvato y 2,5 mM αKB. Tras añadir piruvato (controles: 59,18 ± 13,48 u.a. en 20/6 células/ratones; ESR-NDUFS2: 133,81 ± 14,49 u.a. en 20/3 células/ratones y TH-NDUFS2: 123,59 ± 10,21 u.a. en 43/3 células/ratones) y tras añadir αKB (controles: 43,60 ± 5,07 u.a. en 18/6 células/ratones; ESRNDUFS2: 108,37 ± 10,99 u.a. en 19/3 células/ratones y TH-NDUFS2: 117,10 ± 9,75 u.a. en 44/3 células/ratones). (C) Incremento de NADH durante hipoxia en distintas soluciones. Solución control (control: 36,86 ± 4,29 u.a. en 51/12 células/ratones; ESR-NDUFS2: 0 u.a. en 34/4 células/ratones y TH-NDUFS2: 0 u.a. en 60/5 células/ratones), Solución con piruvato (control: 29,30 ± 6,34 u.a. en 20/6 células/ratones; ESR-NDUFS2: 0 u.a. en 20/3 células/ratones y TH-NDUFS2: 0 u.a. en 43/3 células/ratones) y solución con 2,5 mM αKB (control: 10,11± 1,87 u.a. en 15/6 células/ratones; ESRNDUFS2: 0 u.a. de 19/3 células/ratones y TH-NDUFS2: 0 u.a. en 44/3 células/ratones). u.a., unidades arbitrarias. Los datos representan la media ± SEM. ** p <0,001. Resultados ! 70! 1.3.2.2. Tratamiento crónico con regeneradores de NAD+ en células glómicas controles El tratamiento agudo de células deficientes en Ndufs2 con aceptores de electrones lograba disminuir notablemente los niveles de NADH, como se describió anteriormente, hasta alcanzar niveles próximos a los basales registrados en células controles. No obstante, esta disminución aguda de NADH, no fue capaz de recuperar la respuesta a hipoxia. Para disminuir aún más el ratio NADH/NAD+ y mantenerlo bajo durante un tiempo antes de exponer las células glómicas deficientes en Ndufs2 a hipoxia aguda, se cultivaron crónicamente las células glómicas controles aisladas (durante la noche) con 2,5 mM αKB. Antes de realizar los experimentos en células de animales ESR-NDUFS2, se comprobó que la incubación crónica con αKB y piruvato no afecta al estado del cultivo y por tanto a la respuesta aguda a hipoxia de animales controles. En la Figura 33 se muestran registros representativos del incremento de NADH en respuesta a hipoxia de células glómicas controles incubadas durante la noche en medio de cultivo control (A, panel superior), conteniendo 10 mM piruvato (A, panel central) o αKB 2,5 mM (A, panel inferior). Como se puede observar en las cuantificaciones, el número de células que respondían con un incremento de NADH cuando fueron expuestas a hipoxia aguda no variaba en función de haber estado o no incubada con los distintos agentes durante toda la noche (Figura 33 A y B). Sin embargo, aunque el número de células capaces de responder a hipoxia no cambió, la amplitud de la respuesta a hipoxia fue más pequeña en las células que habían sido tratadas crónicamente con αKB (Figura 33 C), de forma similar a los resultados obtenidos previamente en exposiciones agudas a este agente. Los resultados anteriores mostraban que el incremento de NADH durante hipoxia era significativamente distinto en las células glómicas controles expuestas de forma aguda y crónicamente con 2,5 mM αKB, por lo que estudiamos si se producían variaciones en las propiedades electrofisiológicas (Figura 34) o en las corrientes macroscópicas (Figura 35) de las células glómicas tras el tratamiento crónico con este regenerador de NAD+. Para el registro de las propiedades electrofisiológicas usamos la técnica de patch-clamp en la configuración de parche perforado aplicando el protocolo de rampa en whole-cell (Figura 34); (ver “Métodos”). Los resultados obtenidos mostraron que no había diferencias significativas en la mayoría de los parámetros como la resistencia de entrada, el potencial de membrana y la magnitud de la corriente a -10 mV. Sin embargo, se registró que el potencial de reversión era significativamente más negativo en células que habían sido tratadas crónicamente con αkB que en células controles (Figura 34). Este parámetro está vinculado a la sensibilidad o el umbral de apertura de los canales de potasio, cuanto más negativo sea el umbral de reversión Resultados ! 71! más sensible son los canales voltaje-dependiente de potasio a abrirse e hiperpolarizar las células. Estas modificaciones en la dependencia de potencial de los canales de potasio parecen un efecto inespecífico del αkB sin consecuencia funcional relevante. Figura 33. Mantenimiento del incremento de NADH en respuesta a hipoxia en células glómicas del cuerpo carotídeo de ratones controles incubadas crónicamente con regeneradores de electrones (NAD+). (A) Registros representativos del incremento en la autofluorescencia de NADH inducido por la hipoxia en células glómicas controles incubadas durante la noche en solución control (arriba), en solución con piruvato 10 mM (centro) o en solución con 2,5 mM αKB (abajo). (B) Porcentaje de células glómicas que mostraron un aumento de la fluorescencia de NADH durante hipoxia y que habían sido incubada crónicamente en solución de control (59/12 células/ratones registrados), en 10 mM piruvato (36/3 células/ratones registrados), o en solución con 2,5 mM αKB (17/3 células/ratones registrados). (C) Cuantificación del aumento de NADH inducido por hipoxia en células glómicas controles sensibles a hipoxia incubadas crónicamente en solución control (36,86 ± 4,29 u.a. en 51/12 células/ratones), en solución con piruvato (31,93 ± 5,06 u.a. en 30/3 células/ratones), o en solución que contiene αKB (10,19 ± 1,23 u.a. en 12/3 células/ratones). u.a., unidades arbitrarias. Los datos representan la media ± SEM. ** p <0,001. El registro de las corrientes macroscópicas voltaje-dependiente de calcio y de potasio en células tratadas crónicamente con αKB se realizó utilizando la técnica de patch-clamp, en la configuración de whole-cell usando un protocolo de pulsos despolarizantes en voltageclamp (ver “Métodos”). Se observó que únicamente se producían cambios significativos Resultados ! 72! respecto a células incubadas en medio control en la amplitud de las corrientes de K+ y Ca2+ a potenciales muy positivos (~30-50 mV, para las corrientes de K+ y ~0-20 mV, para las corrientes de Ca2+) (Figura 35). Figura 34. Propiedades electrofisiológicas de las células glómicas controles tratadas crónicamente con αKB. (A, arriba) Protocolo de rampa de voltaje aplicado a las células glómicas para estudiar las corrientes con la técnica de parche perforado. (A, abajo) Corrientes registradas en células controles (azul) y tratadas crónicamente con 2,5 mM αKB (morado). (B) En la tabla los datos se presentan como los valores medios ± error estándar; el número de células registradas se muestran entre paréntesis. *p<0,05. Por tanto, se puede concluir que la incubación crónica con αKB produce únicamente cambios sutiles en las propiedades electrofisiológicas de las células glómicas que no explican el menor incremento en los niveles de NADH en respuesta a hipoxia aguda que observamos tras la incubación con este agente, pensamos que estas alteraciones pueden estar relacionadas con cambios a nivel metabólico inducidos por la incubación crónica y no como consecuencia de un mal funcionamiento celular. Por este motivo decidimos estudiar el efecto de la incubación crónica con αKB en células glómicas deficientes en Ndufs2. Resultados ! 73! Figura 35. Corrientes de Ca2+ y K+ voltaje-dependientes de las células glómicas controles y tratadas con 2,5 mM αKB crónicamente. Relación entre la densidad de corriente (pA/pF) de calcio (A) y de potasio (B) y el potencial de membrana (mV) en células glómicas controles y tratadas con 2,5 mM αKB. Corrientes de calcio (control: 14/7 células/ratones e incubadas con αKB: 7/2 células/ratones) y corriente de potasio (control: 18/9 células/ratones e incubadas con αKB:16/8 células/ratones). Los datos representan la media ± SEM. * p <0,05. 1.3.2.3. Tratamiento crónico con regeneradores de NAD+ en células glómicas ESRNDUFS2 Las células glómicas (control y deficientes en Ndufs2) que fueron tratadas crónicamente con 2,5 mM αKB mostraron una disminución de los niveles basales de NADH, siendo particularmente evidente en las células glómicas de los ratones ESR-NDUFS2 (ver línea discontinua en la Figura 36 A), donde los niveles basales de NADH fueron incluso inferiores a los de las células de ratones controles sin tratamiento con αKB. Sin embargo, incluso con bajos niveles basales de NADH, las células con un CMI no funcional, mostraron una abolición completa del incremento reversible NADH inducido por hipoxia característico de células controles (Figura 36 B y C). Para confirmar que la abolición de la respuesta a hipoxia en células glómicas con déficit inducido de Ndufs2 se debe a la falta de funcionalidad del CMI y no a un mal funcionamiento de la CTE se incubaron las células con dimetil succinato (DMSus), substrato del CMII que favorece la activación de la CTE vía CMII-CMIV (ver Figura 37 A). Los resultados mostraron que incluso tras la incubación crónica de las células glómicas de ratones ESR-NDUFS2 con αKB, que disminuye los niveles basales de NADH, y con DMSuc, que activa la CTE, la respuesta a hipoxia de estas células no se recuperó (Figura 37 B y C). Resultados ! 74! Figura 36. La pérdida de la respuesta a hipoxia, medida con NADH, en las células glómicas ESR-NDUFS2 no es recuperada por los regeneradores de aceptores de electrones NAD+. (A) Cuantificación de los niveles basales de NADH en células glómicas de los tres modelos de ratones (indicado con distintos colores) incubados durante la noche en solución de control (los datos de los niveles basales de NADH son los mismo que los de la Figura 28 A, se muestra para comparar) o en solución con 2,5 mM αKB (control: 88,69 ± 8,98 u.a. en 17/3 células/ratones; ESR-NDUFS2: 154,23 ± 25,64 u.a. en 12/3 células/ratones; TH-NDUFS2: 222,27 ± 30,48 u.a. en 22/3 células/ratones) Nótese que los niveles de NADH en las células de ratones ESR-NDUFS2 incubados en 2,5 mM αKB (línea discontinua) estaban por debajo de los niveles medidos de células glómicas controles sin incubar (B) Registro representativo de los cambios de la autofluorescencia NADH inducidos por hipoxia en células glómicas de ratones ESR-NDUFS2 después de estar incubados crónicamente con αKB. (C) Porcentaje de células que mostraron un incremento de autofluorescencia de NADH durante hipoxia en células glómicas de ratones control y ratones ESR-NDUFS2 (control: 59/12 células/ratones; ESRNDUFS2: incubados en solución de control 34/4 células/ratones, con solución con αKB 12/3 células/ratones). Nótese que ninguna célula de ratones ESR-NDUFS2 responde a hipoxia. u.a., unidades arbitrarias. Los datos representan la media ± SEM. * p <0,05 ** p <0,001. Además de estudiar como afectaba la incubación con aceptores de electrones a la respuesta a hipoxia medida como incremento de NADH, una de las especies señalizadoras de la respuesta a hipoxia en células glómicas, se estudió si esta incubación afecta a la activación de las células glómicas midiendo el incremento de calcio intracelular. La medida del incremento de calcio intracelular registrado en células glómicas ESR-NDUFS2 aisladas e incubadas crónicamente con αKB, mostraba que el aumento de Ca2+ citosólico en respuesta a hipoxia se mantuvo abolido (Figura 38 A, izquierda); tampoco se rescató la capacidad de responder a hipoxia de estas células cuando se incubaron conjuntamente con αKB y DMSuc (Figura 38 A, derecha). La cuantificación de los experimentos demuestra que la respuesta a hipoxia en las células ESR-NDUFS2 estaba abolida en las tres condiciones de estudio: con solución control, con αKB, y con αKB y DMSuc juntos. Además, aunque la amplitud de la respuesta a hipercapnia fue menor cuando las células se incubaron con αKB y DMSuc juntos, Resultados ! 75! todas las células fueron capaces de responder a hipercapnia en las 3 condiciones, demostrando que la señalización de calcio no se veía afectada en estas células tras la incubación crónica con αKB o con αKB y DMSuc juntos. Estos hallazgos apoyan nuestra propuesta de que la actividad de MCI es esencial para la señalización de hipoxia aguda por quimiorreceptores periféricos y que, en células deficientes en CMI, la regeneración de aceptores de electrones y la administración exógena de sustratos permeables del CMII (DMSuc), que re-activa la CTE, no recupera la respuesta a la hipoxia en células glómicas aisladas de ratones ESR-NDUFS2. Figura 37. El dimetil succinato (DMSus), subtrato del CMII, favorece la activación de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. (A)Esquema de una cadena de transporte mitocondrial en ratones ESR-NDUFS2 donde el CMI no se ensambla y como creemos que afecta un incremento del sustrato del CMII añadiendo DMSuc. (B) Registro representativo de los cambios de la autofluorescencia NADH inducidos por hipoxia en células glómicas de ratones ESR-NDUFS2 después de estar incubados durante la noche con αKB y dimetil succinato (DMSuc). (C) Porcentaje de células que mostraron un incremento de autofluorescencia de NADH durante hipoxia en células glómicas de ratones control y ratones ESR-NDUFS2 (control: 59/12 células/ratones y ESR-NDUFS2: incubados en solución control en 34/4 células/ratones y con solución con αKB + DMSuc en 19/3 células/ratones). Resultados ! 82! succinato. No obstante,parece que existe una tendencia a que la resistencia de entrada de las células dializadas con succinato sea mayor. Con este conjunto de resultado podemos afirmar que un elevado ratio de CoQH2/CoQ es esencial para la capacidad de responder a hipoxia aguda en las células glómicas del CC (ver “Discusión”). Figura 42. Activación de la CTE por DMSuc. (A) Registro representativo de amperometría donde se muestra el aumento de la respuesta secretora a hipoxia en las células glómica en rodajas tratadas con dimetilsuccinato 5 mM (DMSuc). (B) Gráfico del aumento en la tasa de secreción inducida por hipoxia en soluciones control y en presencia de DMSuc en 10 experimentos independientes. (C) La tasa de secreción promedio durante la hipoxia de células glómicas en solución control y tratadas con DMSuc (control: 2429 ± 784 fC/min en 12/7 registros/cultivos y DMSuc: 4759 ± 1046 fC/min en 12/7 registros/cultivos). Los datos representan la media ± SEM. * p <0,05. Tabla 6. Propiedades electrofisiológicas de las células glómicas controles y las células dializadas con succinato. Los datos se presentan como los valores medios ± error estándar; el número de células registradas se muestran entre paréntesis. Los resultados descritos en este primer apartado de la Tesis confirman que la pérdida selectiva a nivel sistémico y celular de la respuesta a hipoxia en los ratones ESR-NDUFS2 depende de la perdida de actividad del CMI, ya que ocurre en paralelo a la pérdida de actividad del CMI tras el tratamiento con TMX. Además, apoyan la importancia de las moléculas NADH y ROS como moléculas señalizadoras de la respuesta a hipoxia en las Resultados ! 83! células glómicas. Finalmente, los experimentos basados en la modulación de la actividad del CMII, y por tanto la producción de quinona reducida, confirman la importancia del ratio CoQH2/CoQ en la capacidad de responder a hipoxia de las células glómicas del CC (ver más detalles en “Discusión”). 2. Papel de receptor olfatorio atípico Olfr78 en la respuesta aguda a la hipoxia de los quimiorreceptores arteriales En paralelo a nuestra propuesta, donde sugerimos que el CMI es necesario para la respuesta ante una disminución de oxígeno en las células glómicas (Fernández-Agüera et al., 2015), se publicó un artículo donde se propuso que el receptor olfatorio Olfr78, un receptor atípico altamente expresado en el CC, es esencial para detectar la hipoxia aguda en las células glómicas (Chang et al., 2015). Estos autores sugieren que los cambios en los niveles de oxígeno en sangre no son detectados directamente por las células glómicas, sino indirectamente a través de un metabolito, el lactato, cuya producción está regulada por la disponibilidad de oxígeno. Chang y colaboradores proponen que durante la hipoxia hay un incremento de lactato en sangre que estimula al receptor Olfr78 de la membrana plasmática de las células glómicas desencadenando la liberación de neurotransmisores y la respuesta sistémica a hipoxia aguda. Estos autores han descrito que la eliminación de la expresión del gen Olfr78, da lugar a animales que no presentan respuesta hiperventilatoria a hipoxia (Chang et al., 2015); (ver “Introducción”). Para corroborar la hipótesis, que contrasta frontalmente con nuestra propuesta descrita en el apartado primero de la Tesis, se puso en marcha un proyecto de colaboración multinacional en el que se estudió la respuesta a hipoxia, sistémica y celular, en el modelo de animal knockout para el Olfr78. 2.1. Estudio de los ratones Olfr78. Tratamiento y evolución de la línea El estudio sobre el papel del receptor Olfr78 en los quimioreceptores arteriales del CC se ha llevado a cabo en dos modelos de animales disponibles donde el gen Olfr78 estaba mutado: ratones "FRA” y ratones “JAX”. Ambas cepas fueron expandidas en Sevilla a partir de parentales heterocigotos (+/-) de diferente procedencia: los ratones FRA, fueron cedidos por el laboratorio del Dr. Peter Mombaerts en Frankfurt, pero habían sido expandidos previamente en su laboratorio. Por el contrario, los ratones JAX, fueron expandidos en Sevilla directamente a partir de heterocigotos que procedían directamente de “The Jackson Laboratory” (ver “Métodos”). Estas cepas no coincidieron cronológicamente (primero estudiamos la cepa FRA y luego la JAX), ni fueron estabuladas en el mismo animalario; de Resultados ! 84! esta forma evitamos la interacción y posibles cruces entre ambas cepas. 2.2. Validación del modelo Olfr78 Para corroborar que el receptor atípico Olfr78 estaba mutado en nuestros modelos de ratones se utilizaron distintas técnicas. En primer lugar, se llevó a cabo el genotipado de los ratones de ambas líneas (FRA y JAX), utilizando la técnica de PCR convencional con el protocolo apropiado explicado en el apartado de metodología (ver “Métodos”). Con esta técnica se comprobó si los ratones no estaban modificados genéticamente (ratones controles, +/+) o si el plásmido de sustitución, compuesto por una secuencia que codifica para GFPIRES-TauLacz (Figura 43 A), estaba presente en un alelo (animales heterocigotos, +/-) o en los dos alelos (animales knockout, -/-) del gen Olfr78 (Figura 43 B). Figura 43. Genotipo de los modelos animales Olfr78 (FRA y JAX). (A) Esquema de los dos tipos de alelos: control (verde) y plásmido de sustitución de Olfr78 (morado). Olfr78: región que codifica para Olfr78 sin modificación; GFP: proteína fluorescente verde; IRES: sitio interno de entrada al ribosoma; taulacZ: fusión de tau bovino con β-galactosidasa. Las flechas indican la posición y orientación de los cebadores de PCR utilizados para el genotipado. (B) Genotipado del ADN genómico de los dedos de ratones controles (+/+) y homocigotos (-/-) por PCR. El par de cebadores de PCR "CONTROL" amplifica el alelo de Olfr78 no modificado; el par de cebadores de PCR "GFP" amplifica las secuencias internas de GFP; y el par de cebadores de PCR "MUT" amplifica el alelo Olfr78 mutado. Posteriormente, con la técnica de PCR cuantitativa (PCRq) (ver “Métodos”), se comparó los niveles de expresión del ARNm del gen Olfr78 en CC, CGS y MA entre los ratones controles y los ratones mutantes Olfr78-FRA. Como era esperable, el nivel de ARNm de Olfr78 descendió significativamente en el CC, el GCS y la MA de los ratones knockout para el Olfr78 (-/-) frente a los ratones controles (+/+) (Figura 44). Gracias a que en los animales knockout para el gen Olfr78 parte de la región codificante ha sido sustituida por el fragmento GFP-Ires-tauLacZ, es posible detectar la expresión de la proteína fluorescente verde en los tejidos de animales knockout parael Olfr78 que expresan el receptor Olfr78 (Figura 43). La expresión de la proteína GFP en animales -/- H2O +/+ H2O H2O -/-+/+ -/-+/+ MUT GFPCONTROL B Olfr78 GFP IRES taulacZ CONTROL MUTGFP Olfr78 Control A Resultados ! 85! Figura 44. Ausencia de ARNm Olfr78 en los ratones knockout Olfr78-FRA. Cantidad relativa de ARNm Olfr78, comparado con el housekeeping Gapdh, en médula adrenal (MA), ganglio cervical superior (GCS) y cuerpo carotídeo (CC) de ratones controles (verde), heterocigotos (gris) y knockout (morado). N= 3-5/grupo. u.r. unidades relativas. Los datos representan la media ± SEM. Olfr78-/- fue utilizado para corroborar el genotipo de las rodajas registradas con amperometría. Se realizaron estudios inmunohistológico usando anticuerpos contra la GFP y contra la tiroxina hidroxilasa (TH) (ver “Métodos”). Los resultados corroboraron el genotipo de los ratones Olfr78 (-/-) que mostraron una fluorescencia de GFP en células TH+ del CC (Figura 45, paneles inferiores) a diferencia de las rodajas de ratones controles (Figura 45, paneles superiores). Figura 45. Detección inmunohistoquímica de proteína fluorescente verde (GFP) y tirosina hidroxilasa (TH) en rodajas de cuerpo carotídeo. Las tres imágenes superiores (GFP, TH y GFP/TH/DAPI, respectivamente) corresponde con rodajas de CC de ratones controles y las tres inferiores con rodajas de ratones knockout para Olfr78. Nótese que los ratones knockout para Olfr78 son GFP+ y que esta proteína se expresa en células TH+. 1,20 0,60 0 MA GCS CC Control (+/+) Olfr78 (-/-) Olfr78 (+/-) ARNm (u.r.) Resultados ! 86! 2.3. Respuestas a hipoxia en ratones Olfr78 Tras comprobar que el receptor atípico Olfr78 estaba altamente expresado en CC y que disponíamos de un modelo de ratón donde el gen Olfr78 estaba mutado, procedimos a realizar los distintos experimentos, tanto a nivel sistémico como a nivel celular, para analizar la respuesta de estos animales ante una disminución aguda de la tensión de oxígeno. 2.3.1. Respuesta ventilatoria a hipoxia aguda En primer lugar, siguiendo el mismo protocolo que en el modelo ESR-NDUFS2, se estudió el efecto de la mutación de Olfr78 sobre la respuesta ventilatoria aguda a hipoxia (RVH) y a hipercapnia. Para ello, parejas de ratones controles y ratones knockout para Olfr78 (de la cepa FRA o de JAX) de la misma camada se sometieron a pletismografía. Con esta técnica analizamos la frecuencia respiratoria en condiciones de normoxia y su incremento ante hipoxia (10% O2 durante 5 minutos) e hipercapnia (4-5% CO2 durante un minuto) (ver “Métodos”). Tanto los ratones controles como los dos modelos de ratones knockout para Olfr78 mostraron un incremento reversible y significativo del número de respiraciones por minuto en respuesta a hipoxia e hipercapnia (Figura 46; Figuras 47 y 48). Figura 46. Respuesta ventilatoria a hipoxia e hipercapnia de ratones controles y deficientes para Olfr78 (FRA). Registros pletismográficos representativos de los cambios en frecuencia respiratoria de ratones controles (A) y Olfr78-FRA (B) en respuesta a hipoxia y a hipercapnia. El tiempo de exposición de hipoxia e hipercapnia se muestra con un cuadrado gris. Además, comparamos la cinética del incremento de la frecuencia respiratoria y la amplitud de la respuesta ventilatoria a hipoxia y a hipercapnia entre animales controles y deficientes para Olfr78 (FRA). Las cuantificaciones de los registros mostraron que no había Resultados ! 87! diferencia significativa en la respuesta respiratoria a hipoxia e hipercapnia entre los ratones knockout para Olrf78 y los ratones controles de la misma camada (Figura 47). Figura 47.!Análisis de la respuesta ventilatoria de ratones controles y Olfr78 FRA. (A-B) Registros pletismográficos (frecuencia respiratoria medida respecto al tiempo) de la respuesta respiratoria a hipoxia (A) e hipercapnia (B) realizados en ratones controles (verde, n = 10) y Olfr78- FRA (morado, n = 10). Cada punto de dato corresponde con la frecuencia respiratoria de ese punto temporal y se representa como la media de los diez ratones ± SEM. Las tensiones de oxígeno (% O2) y dióxido de carbono (% CO2) están indicadas en la parte inferior de las Figuras. (C) Media de la frecuencia respiratoria durante control, hipoxia e hipercapnia en 10 ratones controles (164 ± 6 resp/min; 203 ± 4 resp/min y 271 ± 14 resp/min, respectivamente) en comparación con sus compañeros de camada Olfr78 FRA (147 ± 5 resp/min; 219 ± 7,5 resp/min y 254 ± 12 resp/min, respectivamente). Los datos se dan como media ± SEM. * p <0,001. resp: respiraciones Estos resultados demuestran que el receptor Olfr78, no es necesario para desencadenar la respuesta ventilatoria a hipoxia, lo que contrasta notablemente con los resultados publicados por Chang et al., (2015), quienes han descrito una abolición completa de la respuesta ventilatoria a la hipoxia en ratones knockout para Olfr78. Para descartar que posibles cambios en el fondo genético de la cepa de ratones "FRA", como consecuencia de su estabulación y expansión en Frankfurt pudieran haber alterado sus respuestas fisiológicas a la hipoxia, se utilizó una nueva cepa de animales recién generados por los laboratorios Jackson y enviados directamente a Sevilla. En esta nueva cepa, “JAX” repetimos los experimentos y Resultados ! 88! observamos que sus frecuencias respiratorias basales eran similares a las registrada anteriormente en el modelo FRA. Además, los ratones deficientes para Olfr78 (JAX) presentaban una clara respuesta a hipoxia y a hipercapnia no diferenciable de la de los ratones controles de su camada. El análisis comparativo de la cinética y la amplitud de la respuesta a hipoxia e hipercapnia de los ratones Olfr78 (JAX) se ilustra en la Figura 48. Como se puede comprobar no se observaron diferencias significativas entre los animales control y los animales knockout para Olfr78 de la misma camada procedentes directamente del laboratorio Jackson. Figura 48.!Análisis de la respuesta ventilatoria de ratones controles y Olfr78 JAX. (A-B) Registros pletismográficos (frecuencia respiratoria medida respecto al tiempo) de la respuesta respiratoria a hipoxia (A) e hipercapnia (B) realizados en ratones controles (gris, n= 10 para hipoxia y n= 7 para hipercapnia) y de ratones Olfr78-JAX (azul, n = 10 para hipoxia y n = 7 para hipercapnia). (C) Media de la frecuencia respiratoria durante control, hipoxia e hipercapnia en ratones controles (174 ± 9,5 resp/min; 239 ± 10 resp/min y 276 ± 13 resp/min, respectivamente) en comparación con sus compañeros de camada Olfr78 JAX (165 ± 4 resp/min; 239 ± 5,5 resp/min y 273 ± 16 resp/min, respectivamente). Los datos se dan como media ± SEM. * p <0,001. resp: respiraciones. Con estos resultados podemos concluir que el receptor Olfr78 no es necesario para activar la respuesta respiratoria adaptativa a la hipoxia aguda en el animal completo. Resultados ! 89! 2.3.2. Respuesta a hipoxia en las células glómicas de ratones Olfr78 Con objeto de comprobar si el CC de los ratones knockout para Olfr78 era capaz de responder a hipoxia, se llevaron a cabo experimentos registrando la actividad secretora de las células glómicas en rodajas de CC y el incremento de calcio citosólico en células glómicas dispersas. 2.3.2.1. Respuesta secretora a hipoxia en rodajas de cuerpo carotideo La respuesta neurosecretora a hipoxia fue registrada con amperometría en rodaja de CC (ver “Métodos”). Los experimentos se llevaron a cabo cuando los ratones tenían dos meses de edad, tras comprobar con pletismografía que respondían con un aumento de la frecuencia respiratoria a hipoxia aguda (Figura 47 y 48). Los resultados mostraron que tanto las rodajas de CC de ratones controles como las de los ratones Olfr78 (FRA y JAX Olfr78-/-) respondían con un aumento en la secreción de dopamina cuando fueron expuestas a hipoxia, hipercapnia y a potasio (Figura 49 A-C) y que no hubo diferencias significativas entre la tasa de secreción de los diferentes grupos ante los distintos estímulos (Figura 49 D). 2.3.2.2. Cambios en la concentración de calcio intracelular en respuesta a la hipoxia Para comprobar la activación de las células glómicas deficientes en Olfr78, se estudió también el incremento de calcio citosólico en respuesta a hipoxia aguda característico de células glómicas controles. Los resultados mostraron que tanto las células glómicas de ratones controles (Figura 50 A) como las de ratones knockout para Olfr78 (Figura 50 B) respondieron con un incremento de calcio intracelular en respuesta a hipoxia aguda. Incluso siendo menor el incremento de calcio durante alto potasio en células knockout para Olfr78, la capacidad para responder a hipoxia no se vio afectada (Figura 50 C). Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que el receptor Olfr78 no es necesario para activar la respuesta sistémica ni celular a hipoxia aguda mediada por el CC (ver “Discusión). Resultados ! 90! Figura 49. Respuestas secretoras a hipoxia en rodaja de CC de ratones Olfr78. (A-C) Registros amperométricos representativos en células de ratones controles FRA (A, verde), Olfr78 FRA (B, morado) y Olfr78 JAX (C, azul). (D) Cuantificación de la tasa la secreción en rodajas de CC controles y Olfr78 (FRA y JAX) en estado basal (Control FRA: 94 ± 31 fC/min en 9 ratones; Olfr78 FRA: 23 ± 7 fC/min en 7 ratones; Control JAX: 50 ± 26 fC/min en 7 ratones; y Olfr78 JAX: 67 ± 31 fC/min en 6 ratones) y en hipoxia (Control FRA: 3269 ± 444 fC/min en 9 ratones; Olfr78 FRA: 3279 ± 352 fC/min fC/min en 7 ratones; Control JAX: 2652 ± 713 fC/min en 7 ratones; y Olfr78 JAX: 2373 ± 423 fC/min en 6 ratones). Nótese que no hay diferencia significativa comparando la tasa de secreción de los 4 grupos entre sí en cada condición. Los datos se dan como media ± SEM. Figura 50. Aumento Ca2+ intracelular en ratones controles y Olfr78 en respuesta a hipoxia. (A- B) Registros representativos de los cambios en la [Ca2+]in en células controles (A, verde) y Olfr78 (B, morado). (C) Cuantificación del incremento de calcio en células controles (verde) y knockout Olfr78 (morado) inducido por alto K+ e hipoxia. (controles: K+: 0,81 ± 0,07 u.a. en 27/5 células/ratones e hipoxia: 0,20 ± 0,02 u.a. en 17/5 células/ratones y Olfr78-KO: K+: 0,63 ± 0,06 u.a. en 32/5 células/ratones; hipoxia: 0,16 ± 0,01 u.a. en 25/5 células/ratones). Los datos se dan como media ± SEM. * p <0,05 u.a. unidades arbitrarias. Resultados ! 91! 2.4. Respuesta a lactato en las células glómicas del cuerpo carotídeo de ratones Olfr78 En el modelo propuesto, Chang et al. (2015) sugieren que la hipoxia induce un incremento de lactato tanto a nivel de CC como a nivel sistémico y que este lactato activa a las células glómicas de forma endocrina y paracrina a través de su unión con el receptor Olfr78, desencadenando un incremento de calcio intracelular y la secreción de neurotransmisores. Este modelo está basado en experimentos in vitro usando CC completos y midiendo la actividad eléctrica del nervio de seno carotídeo, donde la estimulación del CC con 30 mM lactato produce un incremento en la actividad eléctrica del nervio del seno que desaparece en los ratones knockout para Olfr78 (ver “Introducción”); (ver Chang et al., 2015). Con el fin de comprobar si el lactato provocaba una activación a nivel de CC, y si esta estaba mediada por el receptor olfatorio Olfr78, se realizaron experimentos en rodajas de CC y en células glómicas aisladas de ratones controles y knockout para Olfr78. 2.4.1. Respuesta secretora a lactato en rodajas de cuerpo carotideo La respuesta neurosecretora a un incremento de lactato se registró con amperometría en rodaja de CC (ver “Métodos”) de animales adultos control y knockout para Olfr78. Los resultados mostraron que tanto las rodajas de CC de ratones controles como las de los ratones Olfr78 respondían con aumento de secreción de dopamina cuando fueron expuestas a lactato (Figura 51). Figura 51. Respuesta secretora de las células glómicas de ratones controles y Olfr78 (FRA) a 5 mM lactato. Registros amperométricos representativos de rodajas de CC de ratones controles FRA (A, verde) y Olfr78 FRA (B, morado). Nótese que ambos muestran un incremento de respuesta secretora similar. 2.4.2. Incremento de calcio intracelular en respuesta a lactato en células glómicas de ratones Olfr78 Posteriormente, se midió el incremento de calcio intracelular en respuesta a lactato y 1 min 2pA Olfr78 (FRA) lactato (5 mM) 1 min 2pA lactato (5 mM) Control (FRA) 0.6 0.4 0.8 1.0 1.2 1.4 A K+ lactato (5 mM) 1 min Control (FRA) Ca2+ citosólico (340/380 ratio) Olfr78 (FRA) K+ 0.6 0.4 0.8 1.0 1.2 1.4 lactato (5 mM) 1 min (340/380 ratio) lactato % respecto a K+ 0 10 20 30 B C Resultados ! 98! Figura 58. El lactato induce una despolarización del potencial de membrana en las células glómicas. Registro representativo de la despolarización del potencial de membrana de una célula glómica en respuesta a lactato. Este registro se ha reproducido en 8/6 células/ratones. A continuación estudiamos el efecto del lactato sobre las corrientes iónicas registradas en células glómicas utilizando la configuración de parche perforado aplicando un protocolo de rampa en voltage-clamp (Figura 59 A, arriba); (ver “Métodos”). Este protocolo permite registrar tanto los canales background, como los canales voltaje dependientes de potasio, y medir el umbral de activación de estos últimos. El análisis de los registros electrofisiológicos demostró la existencia de dos tipos de células glómicas en función de su respuesta a lactato. En un tipo, el lactato produce un desplazamiento a la derecha del umbral de activación de los canales de potasio dependientes de potencial (ver flechas en la Figura 59 A) y una inhibición de la corriente macroscópica (Figura 59 A), lo que explica la despolarización inducida por lactato. En el segundo tipo, se distinguen tres fenómenos en respuesta a lactato: i) un aumento de la corriente de entrada (holding current) a potenciales de reposo (ver cuadrado en la Figura 59 B); ii) un cambio hacia valores más negativos del umbral de activación de los canales de potasio dependiente de potencial; y iii) un aumento de la amplitud de la corriente voltaje dependiente de potasio. El papel de estos dos tipos celulares en la respuesta a lactato mediada por el CC es todavía desconocido (ver “Discusión”). 3.3. Mecanismos moleculares involucrados en la activación por lactato de las células glómicas Una vez demostrado que el CC es capaz de activarse en respuesta a lactato se analizaron los mecanismos moleculares que subyacen a dicha activación. Resultados ! 99! Figura 59. Caracterización electrofisiológica de la respuesta a lactato. (A) Arriba: esquema del protocolo de rampa utilizado para los registros. Abajo: registro representativo del tipo celular donde se inhibe la corriente macroscópica de potasio (12 células de las 23 registradas). (B) Registro representativo del tipo celular donde se incrementa la corriente de potasio (11 células de las 23 registradas). En el cuadrado: amplificación de las corrientes background. Control: azul, Lactato: rojo y Recuperación en gris. 3.3.1. Efecto del lactato sobre el pH intra y extracelular Durante años se ha considerado que la lactatemia conlleva una disminución del pH de la sangre que, entre otras acciones, es responsable de la fatiga muscular producida durante el ejercicio (Fletcher, 1907; Hill, 1914; Hill y Lupton, 1923). Teniendo en cuenta que el CC es un sensor polimodal que se activa también en respuesta a la acidosis (Eyzaguirre y Koyano, 1965), decidimos estudiar si esta es la causa de la activación de las células glómicas en respuesta a lactato. Para evitar la acidificación del medio se utilizaron soluciones donde el lactato sódico sustituyó estequiométricamente al cloruro sódico y se comprobó que las distintas concentraciones de lactato en la solución de registro extracelular no provocaban una disminución del pH (Figura 60 A). Por otra parte, el lactato se encuentra fisiológicamente como anión y es cotransportado a través de la membrana celular con un protón (Dubouchaud et al., 2000; García et al., 1994; Roth y Brooks, 1990). Este transporte es bidireccional y se lleva a cabo por la familia de transportadores MCTs, permitiendo que los tejidos elegir entre liberación y captación de lactato en función de su concentración y el gradiente de pH (García et al., 1994; Price et al., 1998); (ver “Introducción”). Es posible que al incrementar las concentraciones de lactato en el medio extracelular este sea transportado al interior de la célula y produzca una acidificación del pH intracelular que pudiera explicar la activación de las células glómicas por lactato. La medición del pH intracelular en células glómicas dispersas con microfluorimetría (ver “Métodos”) muestra que el pH intracelular no se ve afectado por la concentración de lactato Resultados ! 100! extracelular, sin embargo, si se acidifican al exponerlas a hipercapnia por activación de la anhidrasa carbónica intracelular (Figura 60 B). Figura 60. El incremento de lactato no modifica el pH extracelular ni intracelular en células glómicas de CC. (A) Medición del pH de la solución externa de registro con diferente concentración de lactato. Nótese que no existen diferencias significativas. (B) Registro representativo de la variación de pH intracelular a distintas concentraciones de lactato. Nótese que no varía cuando le aplicamos lactato, pero si cuando se le aplica hipercapnia. u.a. unidades arbitrarias. 3.3.2. Incremento de NADH intracelular inducido por lactato El lactato intracelular se convierte a piruvato por la LDH produciendo NADH (Gutmann y Wahlefeld, 1974) (ver “Introducción”). Se conoce que en respuesta a hipoxia hay una acumulación de NADH que contribuye a la activación de las células glómicas (Fernández-Agüera et al., 2015); (ver “Introducción”). Por lo que estudiamos si hay un incremento de NADH durante la exposición a lactato y comparamos la señal de NADH obtenida con la registrada en hipoxia. Estos experimentos se llevaron a cabo usando la técnica de autofluorescencia de NADH en células glómicas aisladas (ver “Métodos”). Los resultados que obtuvimos mostraron que la hipoxia y el lactato producen un incremento similar de NADH en las células glómicas (Figura 61 A y B), aunque tienen cinéticas diferentes. El tiempo en el que se alcanza la mitad del incremento máximo de NADH (t1/2) es menor durante la aplicación de lactato que durante la exposición a hipoxia (Figura 61 C). Estos resultados indican que el incremento de NADH durante la exposición a lactato (5 mM) es más rápido que en hipoxia, aunque la señal sea de una amplitud similar. Para estudiar si el incremento de NADH es proporcional a los cambios en la concentración de lactato se llevó a cabo estudio de “dosis dependencia”. Los resultados mostraron un incremento gradual de la autofluorescencia de NADH a medida que aumentaban los niveles de lactato extracelularmente (Figura 62). Resultados ! 101! Figura 61. Incremento de NADH en respuesta a lactato. (A) Registros representativos de cambios de NADH en respuesta a hipoxia y a lactato en células glómicas. (B) Promedio del incremento de autofluorescencia de NADH en células glómicas durante hipoxia y lactato. (hipoxia: 68,09 ± 8,57 u.a. y lactato: 81,23 ± 10,86 u.a. en 22/6 células/cultivos). (C) Promedio del T1/2 durante hipoxia y lactato en células glómicas. (hipoxia: 0,71 s y lactato: 0,57 s en 22/6 células/cultivos). Los datos representan la media ± SEM. u.a., unidades arbitrarias. Figura 62. Respuesta gradual de NADH a diferentes concentraciones de lactato. (A) Cuantificación del incremento inducido por distintas concentraciones de lactato (2,5 mM lactato: 27,30 ± 4,46 u.a.; 5 mM lactato: 38,48 ± 4,72 u.a.; 10 mM lactato: 48,23 ± 6,49 u.a.; 15 mM lactato: 42,61 ± 5,28 u.a.; 20 mM lactato: 51,64 ± 6,48 u.a. en 33/7 células/cultivos). La línea de ajuste (roja) está trazada a ojo. Los datos representan la media ± SEM. u.a. unidades arbitrarias. Resultados ! 102! 3.4. La modulación del ratio NADH/NAD+ afecta a la respuesta a lactato de las células glómicas de cuerpo carotideo Para determinar si la señal de NADH registrada durante la exposición a lactato se correlaciona con la secreción inducida por lactato en el CC, se llevaron a cabo varios experimentos donde se modificó el ratio NADH/NAD+ y se comprobó su efecto sobre la tasa de secreción inducida en rodajas de CC. 3.4.1. Efecto de la regeneración de NAD+ en la respuesta a lactato El piruvato es un agente regenerador de NAD+ porque, gracias a la LDH, se convierte a lactato consumiendo NADH. Para confirmar que la señal de NADH que registramos tras la exposición a lactato se debe a esa reacción mediada por la LDH aplicamos lactato y piruvato simultáneamente. El incremento de NADH en respuesta a lactato se inhibió reversiblemente en presencia de 10 mM piruvato (Figura 63 A). Un mismo efecto inhibitorio del piruvato se observó en registros de actividad secretora inducida por lactato (Figura 63 B y C). En algunos casos la inhibición producida por piruvato fue completa (Figura 64 B), pero en otros casos después de la inhibición se observó un incremento de la tasa de secreción durante la exposición a piruvato (Figura 63 C), lo que sugiere que el piruvato podría producir un incremento retardado en los niveles intracelulares de NADH. De hecho, los registros de autofluorescencia en las células glómicas indican que el piruvato produce un pequeño incremento retardado de NADH cuando se aplica durante varios minutos (Figura 64 A), lo que, como se indicó anteriormente, podría explicar el incremento de la tasa de secreción observado al final de la incubación con piruvato (Figura 64 B). La activación retardada de las células glómicas por piruvato podría ser la consecuencia de la activación del ciclo de Krebs o de un incremento de lactato intracelular que promoviese a su vez la secreción celular. No obstante, en esta Tesis Doctoral no se estudia la acción de piruvato ya que se empleó normalmente como herramienta farmacológica a dosis muy superiores a las que se encuentran normalmente en el plasma. Resultados ! 103! Figura 63. Inhibición de la respuesta a lactato por piruvato. (A) Registro representativo de NADH donde se muestra una inhibición reversible del incremento del NADH durante la exposición a lactato por piruvato. (B-C) Registro representativo de amperometría donde se muestra una inhibición de la tasa de secreción durante la exposición a lactato por piruvato completa (B) y parcial (C). u.a. unidades arbitrarias. Resultados ! 104! Figura 64. Activación de las células glómicas por piruvato. (A) Registro representativo del incremento de NADH de las células glómicas durante la exposición a piruvato. (B) Registro representativo del incremento de la tasa de secreción durante la exposición a piruvato. u.a. unidades arbitrarias. 3.4.2. Efecto sumatorio de la hipoxia y el lactato sobre la actividad de las células glómicas Para confirmar la posible acción potenciadora del lactato sobre otras respuestas de las células glómicas se analizó el efecto de aplicar hipoxia y lactato simultáneamente, basándonos en que ambos estímulos producen un incremento de NADH (Figura 61). Los resultados mostraron que la exposición de células glómicas a hipoxia durante el tratamiento con lactato provocó una potenciación reversible de la señal de la autofluorescencia de NADH (Figura 65). Resultados ! 105! Figura 65. Potenciación de la respuesta a lactato de NADH por hipoxia. (A) Registro representativo que muestra los cambios de NADH en células glómicas dispersas durante la exposición a hipoxia y lactato. La señal hipóxica de NADH potencia reversiblemente la respuesta a lactato. (B) Cuantificación del aumento de la fluorescencia de NADH durante la hipoxia e hipoxia más lactato (hipoxia: 13,37 ± 1,35 u.a. e hipoxia más lactato: 27,25 ± 4,42 u.a. en 5/5 células/ratones). u.a., unidades arbitrarias. Los datos representan la media ± SEM. * p <0.05. Finalmente se estudió si el incremento del ratio NADH/NAD+ observado cuando se aplica lactato e hipoxia juntos se traduce en una potenciación de la respuesta a hipoxia en presencia de lactato extracelular. Los resultados obtenidos mostraron que la tasa de secreción a hipoxia aumentó significativamente y de forma reversible cuando las rodajas fueron expuestas a hipoxia durante el tratamiento con lactato (Figura 66 A-C). No obstante, llamó nuestra atención que esta potenciación de la respuesta a hipoxia fue visible incluso en rodajas de CC que no respondían a lactato (Figura 66 B), y también en aquellas donde ambos estímulos se aplicaron simultáneamente (Figura 66 C). El efecto de potenciación producido por el lactato sobre la hipoxia puede ser importante a nivel de la respuesta fisiológica adaptativa a hipoxia aguda, situación fisiológica que se ve acompañada de un incremento transitorio en las concentraciones de lactato en sangre (ver “Discusión”). Resultados ! 106! Figura 66. Potenciación de la respuesta secretora a hipoxia por lactato. (A-C) Registros representativos de amperometría donde se muestra una potenciación de la respuesta secretora a hipoxia y lactato juntos. (D) Cuantificación de la tasa de secreción promedio durante la hipoxia e hipoxia más lactato en células glómicas (hipoxia: 2752 ± 526 fC/min e hipoxia más lactato: 4228 ± 543 fC/min en 20/10 registros/cultivos). Los datos representan la media ± SEM. * p <0.05. Por lo tanto, podemos afirmar que el incremento de lactato durante hipoxia tiene un efecto sumatorio en la activación del CC observado a nivel de secreción dopaminérgica. Además, los resultados demuestran que la tasa de secreción está relacionada directamente con el ratio NADH/NAD+. Sugerimos que durante hipoxia el incremento de lactato en sangre ocurre para potenciar la activación del CC (ver “Discusión”). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! DISCUSIÓN! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Discusión ! 114! durante hipoxia en células ESR-NDUFS2, cuya fuente pueden ser otros complejos mitocondriales (Liu et al., 2002; Waypa et al., 2013) o deberse a que la proteína Ndufs2 no se ha lavado completamente (Kim et al., 2012), no es suficiente para activar el CC ante una disminución de PO2. Estas observaciones indican que es necesario una elevada producción de ROS-EIM y de NADH a nivel del CMI para señalizar los canales de la membrana plasmática (Figura 68). Se ha descrito que el incremento de ROS inhibe los canales de membrana de potasio e induce la VPH (Waypa et al., 2001; Fernández-Agüera et al., 2015). Apoyando estos hallazgos mostramos que las células glómicas dializadas con H2O2, un agente oxidante, sufren un aumento de la resistencia de entrada celular, similar a el registrado en hipoxia. El incremento de la resistencia de entrada puede explicar la despolarización que se observa en hipoxia por una inhibición de los canales de fuga de potasio. Además, se conoce que existe un sistema similar, basado en la regulación redox de canales de K+, para describir la sensibilidad a hipoxia de los miocitos de la arteria pulmonar (Archer et al., 2010; Waypa et al., 2010). En concreto, se ha señalado al CMIII como el responsable de desencadenar el proceso de VPH (Waypa et al., 2013). Estos recientes hallazgos ponen de manifiesto que la pérdida selectiva de la respuesta a hipoxia observada en animales con déficit embrionario del gen Ndufs2 no fue por una adaptación compensatoria génica durante el desarrollo embrionario o por el alto nivel basal de NADH y ROS, si no por la falta de funcionalidad del CMI. 1.3. Respuesta a hipoxia con regeneración química de NAD+ Como se indicó anteriormente, los niveles de NADH basales de las células glómicas con déficit inducido de Ndufs2 son mayores que los de las células glómicas control, lo que podría provocar la inhibición del metabolismo mitocondrial (Birsoy et al., 2015; Sullivan et al., 2015) y explicar la falta de respuesta a hipoxia celular y sistémica en este modelo animal (ESR-NDUFS2). El presente trabajo muestra que es posible disminuir los niveles basales de NADH en las células glómicas aplicando regeneradores de NAD+ tanto de forma aguda como crónicamente. Para ello, hemos utilizado piruvato o α-cetobutirato (αKB). Nuestros resultados demuestran que ambos agentes secuestran NADH, tanto en células controles como en células con déficit en Ndufs2, y que el αKB tiene mayor eficiencia que el piruvato debido a su conversión a αHB no metabolizable (Sullivan et al., 2015). El piruvato puede metabolizarse a lactato y regenerar NAD+, o entrar en el ciclo de Krebs y favorecer la producción de NADH, Discusión ! 115! que posteriormente es utilizado por el CMI para activar la CTE (Sullivan et al., 2015). La disminución de los niveles basales de NADH no afectó a la capacidad de las células glómicas controles para responder a hipoxia, aunque la amplitud del incremento de NADH en presencia de αKB es menor. No obstante, a pesar de que el ratio de NADH/NAD+ disminuyó significativamente en las células deficientes en Ndufs2 tratadas agudamente con ambos agentes, no se recuperó la respuesta a hipoxia. Esta respuesta se mantuvo abolida cuando las células ESR-NDUFS2 se incubaron crónicamente con αKB, aunque en esta condición los niveles basales de NADH llegaron casi a los valores registrados en las células controles. Las células de los ratones ESR-NDUF2 tienen un CMI disfuncional (Figura 67 B), lo que podría ralentizar la CTE y afectar a la capacidad de las células glómicas para ser activadas por hipoxia. El dimetil succinato (DMSuc), sustrato del CMII, favorece la activación de la CTE vía CMII-CMIV. La incubación crónica y simultánea con αKB, que disminuye los niveles basales de NADH, y DMSuc, que activa la CTE vía CMII, no fue capaz de recuperar la capacidad de responder a hipoxia en las células glómicas de los ratones ESRNDUFS2, enfatizando la importancia del CMI para promover la respuesta a hipoxia. En conjunto estos resultados sugieren que el nivel de NADH basal no es el responsable de la pérdida de la respuesta a hipoxia descrita en las células glómicas con déficit embrionario en Ndufs2. 1.4. Ratio CoQH2/CoQH y respuesta aguda a hipoxia en las células glómicas El CMI no se ensambla en las células glómicas de ratones ESR-NDUFS2 y por ello pierden su actividad oxidoreductasa, aunque mantienen la mayor parte de sus propiedades funcionales, incluida la síntesis de ATP y la capacidad para responder a otros estímulos como la hipoglucemia y la hipercapnia (Fernández-Agüera et al., 2015), demostrando que el CC es muy resistente a la disfunción del CMI. En contraste con estos resultados, los ratones con mutación génica en el CMII, sufren una marcada muerte celular a nivel de CC (Díaz-Castro et al., 2012), sugiriendo que la ruta CMII-CMIV, es esencial para la supervivencia de las células glómicas (Fernández-Agüera et al., 2015). Nuestro grupo ha descrito la existencia de características metabólicas especiales de las células glómicas que las diferencia de otros tejidos como GCS, con idéntico origen embrionario pero incapaces de responder a hipoxia aguda (Ortega-Sáenz et al., 2016; Gao et al., 2017): I) El CMIV de las células glómicas presenta unas peculiaridades moleculares que probablemente incrementen su sensibilidad a la disminución de O2 (Gao et al., 2017); II) Las células glómicas tienen altos niveles de la piruvato carboxilasa y de biotina, ambos necesarios para la producción de oxalacetato, que es Discusión ! 116! un sustrato importante para incrementar el número de moléculas en el ciclo de Krebs (anaplerosis) (Ortega-Sáenz et al., 2016; Gao et al., 2017); III) Las células quimiosensitivas del CC presenta una alta concentración de succinato (Fernández-Agüera et al., 2015), indicando que la resistencia de las células glómicas a la disfunción del CMI se debe a que su metabolismo oxidativo depende fundamentalmente del CMII. Todas estas características metabólicas sugieren que las células glómicas pueden tener un metabolismo activo cuyo objetivo principal es mantener elevado el ratio de quinona reducida versus quinona oxidada (CoQH2/CoQ) (Fernández-Agüera et al., 2015; Ortega-Sáenz et al., 2016; Gao et al., 2017). Se ha descrito, además, que en la mitocondrial el alto nivel de succinato y de CoQH2 combinados inducen el transporte inverso de electrones en el CMI, lo que lleva a un incremento de ROS y NADH en el sitio FMN (Krishnamoorthy y Hinkle, 1988; Pryde y Hirst, 2011; Chouchani et al., 2014; para una revisión detallada ver Murphy, (2009)); y que este fenómeno es bloqueado por rotenona (Lambert y Brand, 2004; Ortega-Sáenz et al., 2013). Estos datos sugieren que durante la hipoxia el valor de CoQH2 se ve incrementado rápidamente por un enlentecimiento de la CTE debido a la falta del aceptor final de electrones. La acumulación del CoQH2 en hipoxia promueve la producción de ROS y NADH en el CMI (Figura 67 C y Figura 68), el incremento de ambas moléculas podrían actuar señalizando a los canales de la membrana plasmática para la activación de las células glómicas durante hipoxia. La importancia del ratio CoQH2/CoQ para la capacidad de las células glómicas de responder a hipoxia ha sido demostrada modulando la actividad del CMII con DMSuc, un sustrato del CMII que potencia la respuesta a hipoxia; y con dimetil malonato (DMM), un inhibidor competitivo del CMII, que inhibe la activación de las células glómicas en hipoxia. Curiosamente, se ha demostrado que altos niveles de succinato y la reversión del CMI participan en varios procesos fisiopatológicos relevantes como el daño post-isquémico al corazón (Chouchani et al., 2014) o el cambio al fenotipo pro-inflamatorio en macrófagos (Tannahill et al., 2013; Mills et al., 2016). Además, el nivel de quinona reducida actúa como sensor para ajustar la estabilidad de formación de supercomplejos mitocondriales (Guaras et al., 2016). En este contexto, la detección de hipoxia aguda por las células quimiosensitivas del CC debe verse como el resultado de una adaptación metabólica característica y específica de dichas células. Éstas presentan un CMIV diferente molecularmente que podría ser más sensible a O2, un alto nivel de succcinato y un metabolismo oxidativo que favorecen el elevado ratio CoQH2/CoQ. Todo ello facilita que en hipoxia se produzca un enlentecimiento de la CTE, lo que conlleva a una acumulación de CoQH2, al enlentecimiento o reversión del Discusión ! 117! CMI y al incremento de los niveles de NADH y ROS. Estas dos moléculas actuarían como señalizadoras inhibiendo los canales de K+ de la membrana plasmática y produciendo la despolarización, entrada de calcio extracelular y liberación de neurotransmisores (Figura 68). Figura 68. Modelo del CMI como señalizador de la respuesta a hipoxia en el cuerpo carotídeo. CoQ: quinona oxidada; CoQH2: quinona reducida. 2. Papel del receptor Olfr78 en la respuesta aguda a la hipoxia En paralelo con la publicación del modelo de Fernández-Agüera et al., (2015), discutido en el apartado anterior, Chang et al., (2105) han sugerido un modelo alternativo basado en que el receptor olfatorio Olfr78, que se expresa atípicamente en el CC y en otros tejidos, es esencial para detectar la hipoxia aguda en las células glómicas del CC. Estos autores han propuesto que el receptor se activa por lactato, un metabolito cuya concentración en sangre está regulada por la disponibilidad de oxígeno a nivel sistémico. Durante la hipoxia el incremento de lactato que se une al receptor Olfr78 activa al CC dando lugar a la RVH sistémica (Chang et al., 2015). Es importante señalar que el receptor atípico Olfr78 se expresa en tejidos que no son sensibles a hipoxia como el bulbo raquídeo (Conzelmann et al., 2000) varios ganglios simpáticos y parasimpáticos (Weber et al., 2002), riñón (Pluznick et al., 2013) y colon Discusión ! 118! (Fleischer et al., 2015), por lo que su función no tiene por qué estar vinculada con la detección de la disminución de PO2. Nuestros experimentos no han podido reproducir las observaciones de Chang et al., (2015) ya que los ratones knockout para Olfr78 estudiados (dos cepas con diferente origen) hiperventilan en respuesta a hipoxia aguda, siendo la cinética de activación de la respuesta respiratoria similar a la de los ratones controles. Los estudios a nivel celular, registrando secreción dopaminérgica en rodajas del CC o monitorizando el calcio intracelular en células glómicas dispersas, mostraron que las células glómicas procedente de ratones knockout para el gen Olfr78 se activan en respuesta a hipoxia igual que las células controles. Es importante destacar, que estas preparaciones de cultivos primarios de CC son más específicas para estudiar la respuesta a hipoxia en CC que la técnica de registro de frecuencia de disparo en el nervio del seno de CC utilizada por Chang et al., (2015). Además, los experimentos se realizaron con solución extracelular de registro sin lactato, y en el caso de las células glómicas dispersas no pudo haber una activación mediada por lactato de forma autocrina o paracrina ya que las células se encuentran aisladas y el flujo de la solución de registro es demasiado alto como para permitir la acumulación de lactato suficiente para activar a la célula glómica. En paralelo a los experimentos discutidos en el párrafo anterior, hemos demostrado que efectivamente el CC es capaz de activarse en respuesta a un incremento de lactato extracelular. Sin embargo, la activación del CC por lactato no requiere del receptor Olfr78, ya que las células glómicas de animales deficientes en Olfr78 respondieron a lactato igual que las células procedentes de animales control. Estos resultados se ven apoyados por dos publicaciones recientes que muestran que el lactato es un ligando de baja afinidad para Olfr78 (Aisenberg et al., 2016; Zhou et al., 2016). La activación del CC por lactato se discute en el siguiente apartado. Los resultados mostrados en esta Tesis Doctoral descartan la hipótesis propuesta por Chang et al., (2015), quienes atribuyen al receptor Olfr78 un papel esencial para la detección de hipoxia aguda mediada por el CC, ya que demostramos que los ratones KO para Olfr78 son capaces de responder a hipoxia aguda a nivel sistémico y celular. Tampoco podemos confirmar que el lactato sea un ligando para el receptor Olfr78, ya que las células glómicas de los ratones KO para Olfr78 se activan igual que las controles por el incremento de lactato extracelular. Discusión ! 119! 3. Metabolismo sistémico del lactato; importancia biológica y detección por el cuerpo carotídeo De ser considerado una sustancia tóxica o un producto de deshecho el lactato ha pasado a ser reconocido actualmente como un metabolito importante a nivel fisiológico actuando como nutriente generador de ATP, como precursor gluconeogénico y como molécula señalizadora (Brooks, 2018). En esta Tesis Doctoral hemos estudiamos la contribución del lactato a la activación de las células glómicas bajo condiciones controladas de pH y PO2, con el objetivo de esclarecer su papel en la modulación de los parámetros respiratorios. El ejercicio moderado a nivel del mar produce un incremento de lactato y una acumulación de protones (disminución de pH) en sangre arterial (Sahlin et al., 1976; Bangsbo et al., 1993), aunque la PaO2 no varia o lo hace de forma poco significativa (Bendahan et al., 2017). No obstante, es bien conocido que el ejercicio físico produce una potente respuesta hiperventilatoria. Aunque se ha discutido en la literatura, la contribución del lactato al incremento de la frecuencia ventilatoria durante el ejercicio no está establecida (Lee et al., 1996; Fregosi, 1998; Hardarson et al., 1998; Chang et al., 2015; San-Millan y Brooks, 2018). La mayor dificultad para esclarecer el papel del lactato en la respuesta respiratoria durante el ejercicio radica en la separación del efecto del lactato del de la acidez láctica. Se conoce que el ácido láctico produce un incremento de la frecuencia ventilatoria en ratas (Lee et al., 1996), lo que posiblemente se debe a que la disminución del pH plasmático activa los CC (Eyzaguirre y Koyano, 1965) y los quimiorreceptores centrales que promueven la respuesta respiratoria. No obstante, existen estudios donde se muestra que el lactato per se, en circunstancias controladas de pH, PaCO2, PaO2, produce un aumento de la frecuencia ventilatoria (Fregosi, 1998; Hardarson et al., 1998), aunque no se describe el mecanismo de esta hiperventilación presumiblemente inducida por lactato. En este trabajo hemos estudiado la activación del CC por lactato en condiciones de normoxia y con control del pH extracelular para determinar si el metabolito efectivamente activa el CC y esclarecer su contribución a la respuesta ventilatoria sistémica. Se ha descrito que 30 mM lactato activa el nervio del seno carotídeo (Chang et al., 2015) sin embargo, fisiológicamente no es común encontrar esos valores a nivel arterial. Nuestros experimentos muestran por primera vez que concentraciones fisiológicas de lactato pueden activar el CC de manera dosis-dependiente, que la ruta de activación en respuesta a lactato concluye con una entrada de calcio extracelular y la liberación de dopamina y que además, esta activación no es debida a un cambio de pH extracelular ni a modificaciones Discusión ! 120! medibles de pH intracelular. Estos datos demuestran que el lactato per se y no una disminución del pH es el responsable de activar el CC durante un incremento de lactato extracelular. La amplitud de la respuesta a 10 mM lactato es similar a la registrada durante hipoxia tanto en rodajas de CC como en células glómicas dispersas. Sin embargo, a nivel de secreción, no todas las células son capaces de responder a ambos estímulos durante el mismo registro, de hecho, solo el 65% de las células que respondieron a hipoxia tenían la capacidad para secretar dopamina cuando aplicamos 10 mM lactato, indicando que el CC es más sensible a la disminución de la PaO2 que a esa concentración de lactato. Por el contrario, el número de células glómicas activadas por lactato, midiendo el incremento de calcio intracelular, es similar al número de células que responden a hipoxia. Estas diferencias cuantitativas podrían deberse a que los registros de calcio se realizan en células glómicas aisladas donde el contacto del lactato extracelular con la célula es más directo que en las preparaciones de rodajas de CC usadas para medir la actividad secretora. Como se ha descrito anteriormente, la activación de las células glómicas en hipoxia se asocia con un incremento de ROS y NAHD (Fernández-Agüera et al., 2015). Resultados preliminares, no mostrados en este trabajo, indican que el lactato produce un incremento de ROS-EIM. Además, mostramos que, al igual que la hipoxia, la exposición a lactato induce en las células glómicas un incremento de NADH que es “dosis-dependiente”. La acumulación de NADH durante lactato se inhibe al aplicar piruvato. Este hecho sugiere que el lactato se transporta al interior celular a través de los MCTs y se convierte en piruvato por la acción de la LDH produciendo NADH (Gutmann y Wahlefeld, 1974). El piruvato inhibe esta respuesta ya que es un competidor para el transporte de lactato a través de MCTs (García et al., 1994) y porque una vez en el interior de la célula desplaza la reacción catalizada por la LDH en dirección opuesta. Desde el punto de vista cinético, el incremento de NADH producido por lactato es más rápido que el que se registra en respuesta a hipoxia. Esta observación sugiere que la señal de NADH inducida por la lactato es casi inmediata (se produce tan pronto el lactato entra en el citosol) mientras que la acumulación de NADH durante la exposición a hipoxia es el resultado de un enlentecimiento de la CTE, donde participan numerosos complejos proteicos (Fernández-Agüera et al., 2015) y su medida requiere que el NADH intramitocondrial se equilibre con el citosólico por la lanzadera malato/oxalacetato. Tanto el lactato como la hipoxia producen una despolarización y una entrada de calcio extracelular, sin embargo, a nivel electrofisiológico distinguimos dos tipos de células según su respuesta a lactato: las células que activan sus corrientes macroscópicas de K+ y otras Discusión ! 121! donde se inhiben. Aquellas células donde se inhiben las corrientes de K+ en respuesta a lactato, tienen una respuesta similar a la descrita en el modelo de quimiotransducción aceptado de hipoxia. Es posible que estos dos tipos de células glómicas en función de la respuesta electrofisiológica a lactato reflejen los dos tipos de células descritas en la literatura en función de su metabolismo de lactato, las células productoras y las células consumidoras de lactato (Brooks, 2018); (ver “Introducción”). Actualmente no podemos explicar el significado biológico de aquellas células donde se ve un incremento de la corriente voltaje dependiente de potasio. Los resultados de esta Tesis Doctoral demuestran que el incremento de lactato extracelular en normoxia y con condiciones controladas de pH produce la activación dosisdependiente del CC. Esta activación está mediada por un incremento de NADH, una entrada de calcio y liberación de neurotransmisores. La activación del CC por lactato podría contribuir a la respuesta hiperventilatoria con el objetivo de incrementar los valores de O2 fisiológicos y favorecer la obtención de energía a través del metabolismo oxidativo. Además, la expulsión de CO2 durante la hiperventilación podría contribuir a controlar la disminución de pH que suele acompañar al incremento de lactato. Como ocurre con el ejercicio físico, se ha descrito que existe un incremento de lactato transitorio durante la exposición aguda a hipoxia (Reeves et al., 1992), aunque se desconoce su papel funcional. Nuestros resultados demuestran el incremento de la concentración de lactato en sangre tras 5 minutos de exposición a hipoxia en ratones silvestres y que además este aumento de lactato ocurre de forma inversamente proporcional a la disminución de los niveles de oxígeno. Los experimentos realizados in vitro, tanto en rodajas de CC como en células glómicas dispersas, muestran que existe una potenciación de la respuesta a hipoxia en presencia de lactato, tanto a nivel de NADH como a nivel de secreción dopaminérgica (Figura 69). El incremento de lactato sanguíneo durante la exposición a hipoxia aguda podría contribuir facilitando y potenciando la respuesta adaptativa a hipoxia. Se ha descrito que a nivel celular el lactato alimenta el ciclo de Krebs para incrementar el metabolismo oxidativo (Hui et al., 2017), y a nivel sistémico mejora el flujo sanguíneo y el abastecimiento de oxígeno en tejidos de cicatrización (Ribas, 2010), por lo que podría ser que el lactato producido durante una situación de hipoxia a nivel celular promueva el metabolismo oxidativo y a nivel sistémico facilite la respuesta del CC. Finalmente, teniendo en cuenta que en animales sin CC no se incrementan los niveles de lactato en sangre tras el ejercicio (Macías et al., 2018), podría ser interesante estudiar en el futuro si la activación del CC, y el incremento del tono simpático derivado de dicha activación, Discusión ! 122! contribuyen al incremento de lactato en el musculo durante hipoxia y el ejercicio. Figura 69. Efecto sumatorio de lactato e hipoxia en las células quimiosensitivas del cuerpo carotídeo. Ambos estímulos producen un incremento de NADH que contribuye a potenciar la respuesta secretora a hipoxia. En resumen, nuestros resultados sugieren que el CC es un sensor metabólico, capaz de integrar múltiples estímulos como la hipoxia, la hipoglucemia, la hipercapnia, la disminución del pH y el incremento de lactato, para facilitar una respuesta compensatoria sistémica. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! CONCLUSIONES! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !