Aprovechamiento de subproductos de vinificación. Evaluación del potencial biológico de la semilla de uva

Aprovechamiento de subproductos de vinificación. Evaluación del potencial biológico de la semilla de uva. Trabajo de Fin de Grado Marina Martos Garrido Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Aprovechamiento de subproductos de vinificación. Evaluación del potencial biológico de la semilla de uva. Trabajo de Fin de Grado Marina Martos Garrido Aprovechamiento de subproductos de vinificación. Evaluación del potencial biológico El Trabajo de Fin de Grado vinificación. Evaluación del potencial biológico de la semilla de uva” alumna del Grado en Farmacia Nutrición y Bromatología del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal (Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla) bajo Luisa Escudero Gilete , Profesora En Sevilla, a 15 de Junio de 2016 El Trabajo de Fin de Grado Experimental titulado “Aprovechamiento de subproductos de vinificación. Evaluación del potencial biológico de la semilla de uva” , presentado por la alumna del Grado en Farmacia Marina Martos Garrido , ha sido realizado en el Á Nutrición y Bromatología del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal (Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla) bajo la dirección de , Profesora Titular de la Universidad de Sevilla. En Sevilla, a 15 de Junio de 2016 “Aprovechamiento de subproductos de , presentado por la , ha sido realizado en el Á rea de Nutrición y Bromatología del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y dirección de Dña. María RESUMEN Las semillas procedentes de subproductos de vinificación de Pedro Ximénez pueden ser aprovechadas por su contenido en compuestos fenólicos y por sus propiedades bioactivas. En este estudio se ha evaluado el contenido medio en fenoles totales de los extractos de semillas mediante el método de Folin Ciocalteau (49,54 mg ácido gálico/ g semilla) y su capacidad antioxidante mediante los métodos ABTS y FRAP (498,26 y 249,83 μmol de Trolox (TE) por gramo de semilla, respectivamente). Los resultados obtenidos indican que estas semillas son una buena fuente natural de compuestos fenólicos y antioxidantes. Por otro lado, se ha evaluado el efecto de añadir estas semillas en avanzado estado de maduración a la vinificación en tinto de Syrah (S1: adición de 450 gr, S2: adición de 900 gr), concretamente desde el inicio de la vinificación hasta el descube (una vez terminada la fermentación alcohólica). El comportamiento de la evolución del contenido fenólico ha sido diferente en los vinos con adición de semillas respecto al vino testigo (S0: sin adición de semillas). El vino con adición de 900 g (S2) presentó el mayor contenido en fenoles totales (2.541,00 mg/L) al final del proceso de vinificación, cuando el vino ya está estabilizado. En cuanto a la capacidad antioxidante, el vino con adición de 450 g de semillas (S1) obtuvo mejores resultados en los ensayos de ABTS y FRAP (1,73 μmol TE/mL y 0,87 μmol TE/mL) que el vino (S2). En ambos casos, la adición de semillas produjo en los vinos un aumento significativo de la capacidad antioxidante con respecto al vino testigo (S0). Este estudio forma parte de un proyecto, donde además de la capacidad antioxidante se están evaluando otros parámetros que permitirán valorar el potencial biofuncional que aportan las semillas como coadyuvantes en el proceso de vinificación, con objeto de aprovechar este subproducto y mejorar la calidad de los vinos de las regiones de clima cálido. PALABRAS CLAVE: semillas, compuestos fenólicos, capacidad antioxidante, vinificación, clima cálido ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 9 1.1. Vid y uva ........................................................................................................................ 9 1.2. La vinificación .............................................................................................................. 11 1.3. Polifenoles ................................................................................................................... 12 1.4. Capacidad antioxidante de los polifenoles ................................................................. 13 1.5. Potencial biofuncional de subproductos de vinificación ............................................ 14 2. Objetivos ............................................................................................................................. 15 3. Material y métodos ............................................................................................................. 17 3.1. Muestras...................................................................................................................... 17 3.2. Preparación de las muestras de semillas .................................................................... 18 3.3. Materiales y reactivos ................................................................................................. 18 3.4. Determinación de fenoles totales: Método de Folin-Ciocalteau ................................ 19 3.4.1. Fundamentos....................................................................................................... 19 3.4.2. Procedimiento ..................................................................................................... 19 3.5. Estudio de la capacidad antioxidante: Método ABTS ................................................. 20 3.5.1. Fundamento ........................................................................................................ 20 3.5.2. Procedimiento ..................................................................................................... 20 3.6. Estudio de la capacidad antioxidante: Método FRAP ................................................. 21 3.6.1. Fundamento ........................................................................................................ 21 3.6.2. Procedimiento ..................................................................................................... 22 3.7. Análisis estadístico ...................................................................................................... 23 4. Resultados y discusión ........................................................................................................ 23 4.1. Análisis de semillas ...................................................................................................... 23 4.2. Análisis de vinos .......................................................................................................... 24 4.2.1. Fenoles totales .................................................................................................... 24 4.2.2. Capacidad antioxidante ....................................................................................... 25 5. Conclusiones........................................................................................................................ 29 6. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 31 9 1. INTRODUCCIÓN La vinificación en blanco genera una gran cantidad de residuos especialmente en las regiones de alta producción. La acumulación de estos residuos supone un problema medioambiental importante, para solucionarlo, tradicionalmente los subproductos de la vinificación son enviados a destilerías para la obtención de etanol o bien son utilizados como fertilizantes o biomasa. Pero para ello, requieren un tratamiento previo, lo cual representa un coste económico importante para la industria vitivinícola y solo una pequeña porción de estos residuos son reutilizados (Fontana y cols., 2013; Jara-Palacios y cols., 2014; Bordiga, 2015; Teixeira y cols., 2014). En línea con el movimiento que existe desde hace algunos años dirigido hacia un desarrollo más sostenible, resulta muy interesante la búsqueda de soluciones alternativas para la reutilización y revalorización de los subproductos de la vinificación (Bordiga, 2015). El principal subproducto de la industria vitivinícola es el orujo de uva, constituido por semillas, hollejos, raspones y restos de pulpa. El orujo de uva, se propone como una buena fuente de compuestos biofuncionales que pueden ser empleados para varios propósitos en la industria farmacéutica, alimentaria, nutracéutica y química. 1.1. Vid y uva La vid es una planta termófila cultivada en las zonas templadas de prácticamente todo el mundo. Es un arbusto caducifolio que pertenece a la familia de las Vitáceas y al género Vitis L. La especie Vitis vinifera L., conocida como la vid europea, agrupa la mayoría de las variedades cultivadas, ya que presenta las mejores cualidades para la producción de vino (Jarapalacios y cols., 2015). La uva es el fruto de la vid, y de forma general se clasifica como uva blanca o uva tinta, diferenciándose en la presencia o no de antocianos, compuestos responsables de la coloración de la piel u hollejo de la uva tinta. Se organizan en racimos, en los cuales se distinguen dos partes: parte leñosa o raspón y los frutos o bayas, unidos al raspón mediante los pedicelos. El raspón presenta una alta concentración de polifenoles y agua, y una baja concentración de azucares. En la baya o fruto se distinguen principalmente tres partes: la pulpa, la semilla y el hollejo ( Figura 1. Partes de la uva ). La pulpa es la parte que ocupa más volumen y contiene principalmente agua y azúcares, y además contiene ácidos orgánicos, minerales y una pequeña parte de compuestos fenólicos, principalmente ácidos fenólicos. La semilla es la parte dura de la baya especialmente rica en ácidos grasos insaturados (ácido oleico y linoleico, 10-12%) y 16 17 3. Material y métodos 3.1. Muestras Las muestras utilizadas para realizar los diferentes ensayos incluidos en este trabajo se describen a continuación. En primer lugar, semillas obtenidas a partir de muestras de orujo de la campaña 2014 en el Condado de Huelva de la finca “La Aurora”. Las semillas pertenecen a la variedad de uva Pedro Ximénez (PX), que se vendimia con un elevado nivel de maduración. Las semillas fueron separadas de los hollejos y raspones, y congeladas. En segundo lugar, se utilizaron muestras de vino tinto de la variedad Syrah de la campaña 2015 proporcionadas por la “Cooperativa Nuestra Señora del Socorro” (Rociana del Condado, España) y amparada por D.O. Condado de Huelva. Las muestras fueron obtenidas en diferentes momentos de la vinificación y de tres depósitos de acero inoxidable de 50L cada uno. Una vez recogidas las muestras de vino, se transportaron al laboratorio y fueron congeladas. El contenido de los depósitos correspondía a los siguientes ensayos: − S0. Vino testigo. Vinificación en tinto a partir de uva de la variedad Syrah − S1. Vinificación en tinto a partir de uva de la variedad Syrah y adición de 450 gr de semillas procedentes de orujo de vinificación de PX − S2. Vinificación en tinto a partir de uva de la variedad Syrah y adición de 900 gr de semillas procedentes de orujo de vinificación de PX Las semillas fueron añadidas desde el primer momento de la vinificación al mosto y se retiraron en el descube, tras la fermentación alcohólica. De todas las muestras recogidas, se seleccionaron para el análisis las correspondientes a las etapas de descube (DC), previa a la fermentación maloláctica (PF), durante la fermentación maloláctica (ML), y durante la estabilización del vino (TR, V1, V2) ( Tabla 3 ). Tabla 3. Fecha y etapa de vinificación a la que corresponde cada muestra DC 25/08/2015 Descube PF 07/09/2015 Prefermentación maloláctica ML 21/09/2015 Fermentación maloláctica TR 01/10/2015 Vino estable. Trasiego V1 11/11/2015 Vino estable V2 19/01/2016 Vino estable Etapas de vinificación 18 3.2. Preparación de las muestras de semillas • Liofilización y molienda Las muestras fueron secadas para eliminar el agua. El secado se realizó mediante liofilización durante 24 horas. Posteriormente éstas fueron molidas para obtener un polvo fino y homogéneo. La molienda se realizó con un molino de pulverizado modelo IKA A11-B (IKA ®, Staufen, Alemania), reproduciendo los tiempos de molturado (5 x 10 segundos). • Extracción Para la extracción de los compuestos fenólicos se tomaron 6 tubos Falcom, cada uno con aproximadamente 1 gramo de muestra liofilizada y molida, y se añadieron 5 mL de metanol al 75% a cada uno. La mezcla se agitó durante toda la noche en un agitador magnético modelo Vortex IKA Genios 3 (IKA ®, Staufen, Alemania) y a la mañana siguiente se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante obtenido (extracto líquido) se recogió y el residuo sólido se sometió tres veces más a agitación magnética durante 45 minutos y a centrifugación. Finalmente los sobrenadantes se combinaron y el extracto líquido obtenido se congeló a -20 °C hasta su posterior análisis. 3.3. Materiales y reactivos − Espectrofotómetro UV-Vis Agilent ® 8453 − Agitador Vortex IKA Genios 3 (IKA®, Staufen, Alemania) − pH-metro CRISON GLP 21 (Crison Instruments, S.A., Barcelona, España) − Cubeta de vidrio de 10 mm de camino óptico − Cubetas desechables de plástico de 10 mm de camino óptico − Micropipetas Eppendorf − Matraces aforados de 10, 25, 50, 100, 500, 1000 mL − Ácido gálico (Sigma-Aldrich, Madrid, España) − Reactivo Folin-Ciolcalteau (Panreac, Barcelona, España) − Carbonato de sodio (Sigma-Aldrich, Madrid, España) − Trolox (ácido 6-hidroi-2, 5, 7, 8-tetrametilcroman-2-carboxílico) Sigma-Aldrich (Madrid, España) − ABTS (ácido 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) Sigma-Aldrich (Madrid, España) − Tampón fosfato salino (PBS) 19 − Persulfato de potasio (Panreac, Barcelona, España) − Cloruro de sodio (Sigma-Aldrich, Madrid, España) − Cloruro de potasio (Sigma-Aldrich, Madrid, España) − Fosfato sódico (Panreac, Barcelona, España) − Diluciones de referencia de pH 4.00, 7.00, 9.00 y disolución de mantenimiento del electrodo del pH-metro (KCl, 3 M) (Merck, Darmstadt, Germany) − Solución HCl 40 mM − TPTZ (2, 4, 6-tripiridil-s-triazina) (Sigma-Aldrich, Madrid, España) − Tricloruro de hierro (Panreac, Barcelona, España) − Acetato de sodio trihidratado (Sigma-Aldrich, Madrid, España) − Ácido acético (Panreac, Barcelona, España) 3.4. Determinación de fenoles totales: Método de Folin-Ciocalteau 3.4.1. Fundamentos Los compuestos fenólicos se oxidan por el reactivo Folín-Ciocalteu, el cual está formado por una mezcla de ácido fosfotúngstico (H 3 HW 12 O 40 ) y ácido fosfomolíbdico (H 3 PMo 12 O 40 ) que se reduce en una mezcla de óxidos azules de tungsteno (W 8 O 23 ) y de molibdeno (Mo 8 O 23 ). Se produce una coloración azul con un máximo de absorbancia a 765 nm, que es proporcional a la cantidad de fenoles totales. 3.4.2. Procedimiento El método se llevó a cabo según el protocolo de Singleton y Rossi (1965), con algunas modificaciones. Se realizó una recta de calibrado a partir de 7 disoluciones patrón de ácido gálico de distintas concentraciones (0-1000 mg/L). Se tomaron 0.25 mL de cada disolución patrón de ácido gálico y se depositaron en un matraz de 25 mL. Se añadió agua destilada, se agitó y, seguidamente, se añadieron 1.25 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu y 3.75 mL de disolución de carbonato sódico al 20%. Se mezcló todo, se enrasó con agua destilada y la disolución se dejó reposar durante dos horas a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia de cada disolución a 765 nm y en cubeta de 10 mm. Cada disolución se analizó por triplicado. Para el análisis de las muestras (con una dilución previa adecuada) se procedió igual que para las disoluciones patrón. La recta de calibrado se construyó representando la absorbancia frente a la concentración. El valor de la absorbancia obtenido para cada muestra se llevó a la recta de 20 calibrado y, por interpolación, se calculó la cantidad de fenoles totales expresada en miligramos de ácido gálico por litro (mg/L); y, posteriormente, se calculó la cantidad de fenoles totales expresada como miligramos de ácido gálico por gramo de materia seca (mg/g), teniendo en cuenta el peso de muestra utilizado para la extracción. 3.5. Estudio de la capacidad antioxidante: Método ABTS 3.5.1. Fundamento El método ABTS mide la capacidad de los compuestos antioxidantes para captar el radical coloreado ABTS •+ , en un medio acuoso, convirtiéndolo en un producto decolorado. Se basa en la generación del radical catiónico ABTS •+ por la oxidación de su precursor el ácido 2,2’-azinobis(3-etilbenziltiazolina)sulfónico (ABTS) con persulfato potásico. Este radical, de coloración verde-azulada, es estable hasta 16 horas a baja temperatura y se caracteriza por su absorción a 734 nm. A este radical formado se añade el patrón antioxidante Trolox o la muestra y se mide el descenso de absorbancia producido, ya que la coloración desaparece al ser reducido el radical mediante antioxidantes. 3.5.2. Procedimiento Se ha seguido el procedimiento descrito por Re y cols. (1999) con ligeras modificaciones. Se preparó una disolución madre de ABTS 7 mM en agua milliQ®. Para formar el catión radical, se preparó una disolución de persulfato potásico (2.45 mM), usando como disolvente la disolución madre de ABTS. Esta disolución se almacenó a temperatura ambiente durante 16 horas en ausencia de luz para la completa reacción del ABTS y el persulfato. Para preparar el reactivo de trabajo, la disolución fue diluida con tampón fosfato salino (PBS) a pH 7.4 hasta obtener una absorbancia de 0.7 ± 0.02 a 734 nm. Para la medida de las muestras, se añadió inicialmente 2 mL del reactivo (blanco) en una cubeta, y se midió su absorbancia a 734 nm. A continuación, se agregaron 50 µL de la muestra y se agitó en vórtex durante 30 segundos. Después de 6 minutos de incubación a temperatura ambiente, se realizó la lectura de la absorbancia nuevamente a 734 nm. Cada muestra fue analizada en varias concentraciones, realizando 4 diluciones de cada una (1/100, 1/200, 1/400, 1/800). Todas las muestras se analizaron por duplicado. Para obtener la recta de calibrado, se preparó una disolución madre de Trolox (1mM), y a partir de ésta se prepararon 6 disoluciones patrón de distinta concentración (0.031-1 mM). 21 Para la medida de la actividad antioxidante de estas disoluciones se procedió de la misma forma que con las muestras ( Figura 3 ). Figura 3. Cubetas con las disoluciones patrón a distinta concentración y el reactivo ABTS. La recta de calibrado se obtuvo representando la absorbancia frente a la concentración de las distintas disoluciones del patrón Trolox, y se calculó la pendiente de la recta. A continuación se representó la cantidad de muestra analizada frente a la absorbancia medida, obteniéndose así la pendiente de la recta de la muestra, que finalmente fue comparada con la pendiente obtenida para el patrón Trolox. Los resultados se expresan como actividad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC: Trolox-equivalent antioxidant capacity, mmoles de Trolox con la misma actividad antioxidante que 100 g de muestra seca o mL de vino). 3.6. Estudio de la capacidad antioxidante: Método FRAP 3.6.1. Fundamento El método FRAP se basa en la capacidad que presentan los compuestos antioxidantes para donar electrones y reducir el ión férrico a ferroso en medio acuoso. Para ello se provoca una reacción por la adición del compuesto TPTZ (2,4,6 tripiridyl-s-triazina), que a pH ácido (pH=3.6) se une al ión ferroso formando un compuesto de color azul que presenta un máximo de absorción a 593 nm. Fe (III) – TPTZ + ANTIOXIDANTE  Fe (II) - TPTZ (amarillo) (azul) 3.6.2. Procedim iento Se ha seguido el procedimiento descrito por modificaciones. Diariamente se preparó el reactivo de trabajo, que consistió en una mezcla de tampón a cetato 300 mM (pH=3.6), TPTZ 1 20 mM en una proporción 10/1/1 (v/v/v). Para la medida del blanco se añadió 3 mL de este reactivo en una cubeta, y se midió su absorbancia a 593 nm. Posteriormente se agregaron 100 µ L de la muestra y se agitó en vórtex durante 30 segundos. De incubación se realizó la lectura de la absorbancia a 593 nm, a la que se restó el valor del blanco. Cada muestra fue analiz Para construir la recta de calibrado, se preparó (1mM), y a partir de ésta, se prepararon (0.031-1 mM). Para la medida de la actividad antioxidante de las disoluciones patrón se procedió de la misma forma que con las muestras. Figura 4 La recta de calibrado se obtuvo representando la absorbancia frente a la concentrac ión de las disoluciones del patrón Trolox, y se calculó la pendiente de la recta. A continuación, se representó la cantidad de muestra analizada frente a la absorbancia medida, obteniéndose así la pendiente de la recta de la muestra, que finalmente fue com pendiente obtenida para el patrón Trolox. antioxidante equivalente de Trolox de Trolox con la misma actividad antioxidante que 100 g de muestra 22 iento Se ha seguido el procedimiento descrito por Benzie y Strain (1996) con ligeras modificaciones. Diariamente se preparó el reactivo de trabajo, que consistió en una mezcla de cetato 300 mM (pH=3.6), TPTZ 1 0 mM en HCl 40 mM, y tricloruro férrico 20 mM en una proporción 10/1/1 (v/v/v). Para la medida del blanco se añadió 3 mL de este reactivo en una cubeta, y se midió su absorbancia a 593 nm. Posteriormente se agregaron 100 L de la muestra y se agitó en vórtex durante 30 segundos. De spués de 6 minutos de incubación se realizó la lectura de la absorbancia a 593 nm, a la que se restó el valor del blanco. Cada muestra fue analiz ada en varias concentraciones (4 diluciones) y por du Para construir la recta de calibrado, se preparó una disolución madre de Trolox (1mM), y a partir de ésta, se prepararon 6 disoluciones patrón de d istinta concentración mM). Para la medida de la actividad antioxidante de las disoluciones patrón se procedió de la misma forma que con las muestras. ( Figura 4 ) 4 . Cubetas con las disoluciones patrón a distinta concentración, y el reactivo FRAP La recta de calibrado se obtuvo representando la absorbancia frente a la ión de las disoluciones del patrón Trolox, y se calculó la pendiente de la recta. A continuación, se representó la cantidad de muestra analizada frente a la absorbancia medida, obteniéndose así la pendiente de la recta de la muestra, que finalmente fue com pendiente obtenida para el patrón Trolox. Los resultados se expresan como actividad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC: Trolox-equivalent antioxidant capacity de Trolox con la misma actividad antioxidante que 100 g de muestra seca o mL de vino (1996) con ligeras modificaciones. Diariamente se preparó el reactivo de trabajo, que consistió en una mezcla de 0 mM en HCl 40 mM, y tricloruro férrico (FeCl 3 6H 2 O) 20 mM en una proporción 10/1/1 (v/v/v). Para la medida del blanco se añadió 3 mL de este reactivo en una cubeta, y se midió su absorbancia a 593 nm. Posteriormente se agregaron 100 spués de 6 minutos de incubación se realizó la lectura de la absorbancia a 593 nm, a la que se restó el valor del ada en varias concentraciones (4 diluciones) y por du plicado. una disolución madre de Trolox istinta concentración mM). Para la medida de la actividad antioxidante de las disoluciones patrón se La recta de calibrado se obtuvo representando la absorbancia frente a la ión de las disoluciones del patrón Trolox, y se calculó la pendiente de la recta. A continuación, se representó la cantidad de muestra analizada frente a la absorbancia medida, obteniéndose así la pendiente de la recta de la muestra, que finalmente fue com parada con la Los resultados se expresan como actividad capacity , milimoles o mL de vino ). 23 3.7. Análisis estadístico El tratamiento de los datos se ha realizado con el paquete estadístico Statistica® v 8.0 (Statsoft, Inc., Tulsa, OK, USA, 2007). Se ha aplicado el Análisis Múltiple de la Varianza para establecer la existencia o no de diferencias significativas entre grupos (S0, S1 y S2), mediante el análisis de las medias de cada uno de los grupos. ANOVA es un análisis univariante (para una sola variable), mientras que MANOVA es multivariante (para más de una variable) (Norman y Streiner, 1996). 4. Resultados y discusión 4.1. Análisis de semillas Mediante el método Folin-Ciocalteau se determinó la cantidad de fenoles totales (FT) en los extractos de semilla expresada como miligramos de ácido gálico por gramo de materia seca (mg/g). La media de los seis extractos analizados fue 49,54 mg/g semilla. A continuación, se evaluó la capacidad antioxidante por el método TEAC, por el cual se obtienen las pendientes de pérdida de absorbancia de ABTS •+ en función del volumen de muestra utilizado, y se compararon con la obtenida con el patrón Trolox. Los resultados se expresan en micromoles de Trolox/g de producto seco. El resultado, tras el análisis de las seis muestras, fue 498,54 μmoles TE/g. Por otro lado, también se evaluó la capacidad antioxidante por el método FRAP, por el cual se obtuvieron pendientes de ganancia de absorbancia en función del volumen de muestra utilizado, y se compararon con la obtenida con el patrón Trolox. El resultado, expresado en micromoles de Trolox/g de producto seco, fue 249,83 μmoles TE/g. En la Tabla 4 se muestran los resultados de los análisis de las muestras de semillas. Tabla 4. Resultados ensayos para semillas. Cada valor representa la media (n=6) ± desviación estándar Variables Semillas Fenoles Totales (mg/g de semilla) 49,54 ± 5,47 ABTS (μmoles TE/ g de semilla) 498,26 ± 89,16 FRAP (μmoles TE/ g de semilla) 249,83 ± 62,69 24 La cantidad de fenoles obtenida supone alrededor del un 5% del peso total de la semilla, este resultado es similar al observado por Jara-Palacios y cols. (2014) en semillas de la variedad Zalema, con niveles de FT en torno a 65 mg/g de peso seco, aunque los valores de actividad antioxidante para los ensayos de ABTS y FRAP fueron más elevados (966,4 μmol/g y 386,1 μmol/g respectivamente). En otro estudio realizado de la variedad Malbec y con un disolvente de extracción diferente (etanol:agua, 50:50), se obtuvieron valores menores para los fenoles totales (42,2 mg/g) (Antonelli, 2015). No obstante, la comparación de resultados es difícil, ya que el contenido fenólico depende de variables tales como la variedad de uva o el estado de maduración de la semilla, entre otras. 4.2. Análisis de vinos 4.2.1. Fenoles totales Mediante el método Folin-Ciocalteau se determinó la cantidad de fenoles totales en las diferentes muestras de vino. Para cada etapa se analizaron muestras de los tres ensayos. Los resultados vienen expresados en miligramos de ácido gálico por mL de vino. En la Figura 5 se puede observar que en la primera etapa (DC), los vinos correspondientes a los tres ensayos desarrollados presentan concentraciones similares de fenoles totales (S0: 1.967,08 mg/L; S1: 1.951,81mg/L; S2: 1.880,44 mg/L). En la etapa previa a la fermentación maloláctica (PF), la concentración de fenoles totales en los vinos de los ensayos S1 y S2 experimenta una subida, y el vino testigo (S0) se mantiene con un ligero ascenso, no obstante, no se aprecian diferencias significativas (p<0,05). Durante la fermentación maloláctica (ML) los vinos S1 y S2 descienden y vuelven a presentar valores similares al primera etapa tras el descube (DC) (S1: 1.811,35 mg/L; S2: 1.984,61 mg/L) y en este punto es el vino del ensayo testigo (S0) el que presenta valores superiores (2.381,98 mg/L). En las etapas sucesivas, al comenzar la estabilización del vino, los valores medios de FT de los tres ensayos estudiados van aumentando, pero en la etapa final el vino con adición de 450 gr de semillas (S1) experimenta un importante descenso de los FT, situándose en valores menores a los iniciales (1.755,08 mg/L). El vino del ensayo al que se le adiciona una doble cantidad de semillas (S2) es el que presenta mayor concentración de FT (2.541,00 mg/L) en el último punto de muestreo (V2), en el que el vino se considera totalmente estable. En un estudio similar sobre el efecto de la adición de semillas hidrolizadas en el perfil fenólico y cromático de los vinos, se obtuvieron resultados parecidos tras la adición de 250g y 500g de éstas semillas durante la vinificación: tras el descube el vino control tenía mayor contenido en fenoles totales (S0:2.734 mg/L, S1: 2.266 mg/L, S2: 2.073 mg/L), sin embargo, 25 tras 150 días, el que obtuvo mayor cantidad de polifenoles totales fue el vino al que se le adicionaron la mitad de semillas (S0:2.009 mg/L, S1:2.735 mg/L, S2:2.066 mg/L) (Cejudo- Bastante y cols.,2016). Figura 5. Media ± desviación estándar de fenoles totales. S0: depósito testigo; S1: deposito con 450g de semilla; S2: depósito con 900g de semilla. Valores en las barras del mismo punto de muestreo con diferente letra son significativamente diferentes (p<0,05). 4.2.2. Capacidad antioxidante Se evaluó la capacidad antioxidante por el método TEAC, se obtuvieron las pendientes de pérdida de absorbancia de ABTS •+ en función del volumen de muestra usado, y se compararon con la obtenida con el patrón Trolox. Los resultados vienen expresados en micromoles de Trolox/mL de vino ( Figura 6 ). Según los resultados obtenidos, tras el descube (DC), el vino elaborado con adición de mayor cantidad de semillas (S2) tiene la mayor capacidad antioxidante (1,63 μmol TE/mL). En la Figura 6 se observa que en el vino testigo (S0) los niveles de capacidad antioxidante se mantienen estables a lo largo de todo el proceso de vinificación. En el caso de los vinos aa a a aa a a a a a a a a a aa a 0,00 500,00 1000,00 1500,00 2000,00 2500,00 3000,00 3500,00 4000,00 4500,00 DC PF ML TR V1 V2 Etapa de vinificación Fenoles totales (mg/mL) S0 S1 S2 32 Jara-Palacios M, Hernanz D, Cifuentes-Gomez T, Escudero-Gilete M, Heredia F, Spencer J. 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