Estudio de asimetrías asociadas al huso mitótico de Saccharomyces cerevisiae: nuevos reguladores del posicionamiento del huso y la herencia no aleatoria de los centros organizadores de microtúbulos

Estudio de asimetrías asociadas al huso mitótico de Saccharomyces cerevisiae: nuevos reguladores del posicionamiento del huso y la herencia no aleatoria de los centros organizadores de microtúbulos Trabajo realizado por la Licenciada Laura Matellán Fernández en el Departamento de Genética de la Universidad de Sevilla y en el Departamento de Dinámica y Señalización Celular de CABIMER, para optar al título de Doctora por la Universidad de Sevilla. Doctorando: Director de la tesis: Tutor de la tesis: Laura Matellán Fernández Fernando Monje Casas Rosa María Luna Varo El trabajo de esta Tesis Doctoral ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2013-43718-P y BFU2016-76642-P) y fondos FEDER. Laura Matellán Fernández ha disfrutado de una beca predoctoral FPI (Formación Personal Investigador) del Ministerio de Economía y Competitividad. A mi padre, por compartir este sueño e ilusión. A mi madre, por su apoyo incondicional. A mi hermano, por su cruda realidad. Resumen La división celular asimétrica es un tipo particular de división en la que se generan dos células de distinto tamaño, contenido, función y/o destino. Este tipo de división es particularmente relevante durante los procesos de diferenciación celular, el desarrollo embrionario, la homeostasis de tejidos adultos o el envejecimiento. Durante una división asimétrica es esencial el establecimiento previo de un eje de polaridad a lo largo del cual se produce la distribución diferencial de moléculas y/u orgánulos entre las dos células resultantes, así como el posterior posicionamiento del huso mitótico respecto a dicho eje, con el fin de mantener, junto al reparto asimétrico de componentes celulares, la correcta segregación del material genómico entre ambas células. Durante esta Tesis Doctoral hemos utilizado la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae como modelo para estudiar las divisiones asimétricas. En este organismo, el punto de control de posicionamiento del huso (SPOC) es un mecanismo de vigilancia de enorme importancia que evita que las células con el huso mitótico mal posicionado salgan de mitosis. La proteína quinasa Kin4 juega un papel central en este punto de control del ciclo celular. En el marco de esta Tesis hemos realizado una búsqueda de proteínas que interaccionen con Kin4 de forma dependiente del estado de activación del SPOC, con el fin de encontrar nuevos reguladores del SPOC. Con este objetivo, hemos realizado una purificación de la proteína Kin4 por inmunoprecipitación en cultivos de levadura, tanto en condiciones de crecimiento normal como tras la activación del SPOC, y un análisis de las proteínas que coinmunoprecipitan con Kin4 en estas condiciones y que, por tanto, podrían regular su actividad y/o función. El estudio de estas proteínas nos permitirá ampliar nuestro conocimiento sobre la regulación del posicionamiento del huso mitótico y el funcionamiento del SPOC. Otro fenómeno de enorme interés asociado a ciertas divisiones asimétricas, desde levaduras a células madre de humanos, es la herencia diferencial de los centros organizadores de microtúbulos (MTOCs). En S. cerevisiae, los MTOCs muestran un patrón de herencia no aleatorio tras su duplicación. Así, mientras que el MTOC sintetizado de novo durante la mitosis es retenido en la célula madre, el MTOC preexistente es heredado por la célula hija. Durante esta Tesis, hemos demostrado que la actividad quinasa de la proteína Polo-quinasa Cdc5 es necesaria para el establecimiento de este patrón de herencia asimétrica no aleatorio de los MTOCs en levaduras de gemación, actuando como un “temporizador” molecular que regula espacial y temporalmente la distribución de determinantes claves de esta herencia en dichas estructuras. 7 Índice General 1. Introducción .......................................................................................................................................... 15 1.1. Control de la división celular por mitosis. ......................................................................................... 17 1.1.1. Generalidades del ciclo celular. ............................................................................................... 17 1.1.2. Regulación del ciclo celular en S. cerevisiae. .......................................................................... 19 1.1.3. Salida de mitosis y ruta MEN. .................................................................................................. 22 1.1.3.1. Localización de los componentes de la ruta MEN y regulación de la señalización. .......... 23 1.1.3.2. Homólogos de la ruta MEN en otros eucariotas. ............................................................... 27 1.1.4. Proteínas de la familia Polo quinasa: múltiples funciones de Cdc5. ........................................ 27 1.1.4.1. Regulación de la localización de Cdc5 durante el ciclo celular. ........................................ 28 1.1.4.2. Papel de Cdc5 en la regulación de la progresión del ciclo celular. ................................... 29 1.1.4.3. Regulación del huso mitótico y segregación cromosómica. .............................................. 30 1.1.4.4. Papel de Cdc5 tras el daño en el ADN y en otros checkpoints. ........................................ 31 1.2. División celular asimétrica. .............................................................................................................. 31 1.2.1. Orientación y posicionamiento del huso mitótico. .................................................................... 34 1.2.1.1. Mecanismos de posicionamiento del huso mitótico. ......................................................... 35 1.2.1.1.1. Ruta “temprana” dependiente de Kar9. ..................................................................... 35 1.2.1.1.2. Ruta “tardía” dependiente de dineína. ....................................................................... 38 1.2.1.2. Checkpoint de posicionamiento del huso mitótico: activación del SPOC y salida de mitosis en S. cerevisiae. ............................................................................................................................ 40 1.2.2. Distribución asimétrica de los MTOCs durante la división celular asimétrica. .......................... 45 1.2.2.1 Herencia no aleatoria de los SPBs en S. cerevisiae. ......................................................... 45 1.2.2.1.1. Estructura y biogénesis de los SPBs. ........................................................................ 45 1.2.2.1.2. Regulación de la herencia de los SPBs. .................................................................... 48 1.2.2.2. Herencia asimétrica de los centrosomas en eucariotas superiores. ................................. 52 1.3. Implicaciones de la distribución incorrecta de los MTOCs en cáncer, envejecimiento y neurodegeneración. ................................................................................................................................ 55 2. Objetivos................................................................................................................................................ 59 3. Resultados ............................................................................................................................................. 63 3.1. Búsqueda de nuevos reguladores de Kin4 y análisis de su función en el punto de control de posicionamiento del huso. ...................................................................................................................... 65 3.1.1. Estrategia para la activación condicional del punto de control de posicionamiento del huso (SPOC)............................................................................................................................................... 66 3.1.2. Inmunoprecipitación de Kin4 en condiciones normales y de activación del SPOC. ................. 70 3.1.3. Mrh1 interacciona con Kin4 independientemente del estado de activación del SPOC. ........... 74 3.1.4. La localización y expresión de Mrh1 se mantienen constantes a lo largo del ciclo celular y en células con el huso mal posicionado. ................................................................................................. 76 3.1.5. La ausencia del gen MRH1 y/o su parálogo YRO2 no afectan a la funcionalidad del SPOC. .. 79 3.1.6. La sobreexpresión de MRH1 provoca problemas en la viabilidad celular. ............................... 83 3.2. Estudio del papel de Cdc5 en el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los cuerpos polares del huso en Saccharomyces cerevisiae. .................................................................................... 87 3.2.1. La actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para el establecimiento de la herencia asimétrica de los SPBs. ....................................................................................................................................... 88 3.2.2. La distribución asimétrica de Spc72 y Kar9 depende de la actividad de Polo-quinasa. ........... 91 3.2.3. Cdc5 promueve el reclutamiento de Spc72 a los SPBs en la transición metafase-anafase. .... 97 8 3.2.4. Cdc5 actúa como un temporizador molecular implicado en el establecimiento del destino celular de los SPBs. ......................................................................................................................... 108 3.2.5. La ausencia de SPC72 o KAR9 conduce a una aleatorización de los cuerpos polares. ........ 114 3.2.6. La actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para la distribución conjunta de Spc72 y Kar9 en el mismo SPB. ..................................................................................................................................... 115 4. Discusión ............................................................................................................................................. 119 4.1. Nuevos reguladores de Kin4 y su papel en el punto de control de posicionamiento del huso. ...... 121 4.2. Papel de Cdc5 en el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los cuerpos polares del huso en Saccharomyces cerevisiae. .................................................................................................... 129 5. Conclusiones ...................................................................................................................................... 141 6. Materiales y métodos ......................................................................................................................... 145 6.1. Organismos modelo. ..................................................................................................................... 147 6.1.1. Estirpes de Escherichia coli. .................................................................................................. 147 6.1.2. Estirpes de Saccharomyces cerevisiae. ................................................................................. 147 6.2. Plásmidos. ..................................................................................................................................... 147 6.3. Reactivos químicos. ...................................................................................................................... 147 6.3.1. Antibióticos. ............................................................................................................................ 147 6.3.2. Drogas e inhibidores. ............................................................................................................. 148 6.3.3. Enzimas. ................................................................................................................................ 148 6.3.4. Tampones y soluciones. ......................................................................................................... 149 6.4. Medios de cultivo. .......................................................................................................................... 151 6.4.1. Medios de cultivo para bacterias. ........................................................................................... 151 6.4.2. Medios de cultivo para levaduras. .......................................................................................... 151 6.5. Conservación de cepas bacterianas y estirpes de levadura. ......................................................... 152 6.5.1. Conservación de cepas bacterianas. ..................................................................................... 152 6.5.2. Conservación de estirpes de levadura. .................................................................................. 153 6.6. Técnicas básicas de biología molecular. ....................................................................................... 153 6.6.1. Extracción de ácidos nucleicos. ............................................................................................. 153 6.6.1.1. Extracción de ADN plasmídico de Escherichia coli (miniprep). ....................................... 153 6.6.1.2. Extracción de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae. ........................................ 153 6.6.2. Deleción y etiquetado de genes. ............................................................................................ 154 6.6.3. Electroforesis de ADN. ........................................................................................................... 154 6.7. Obtención de cepas bacterianas y estirpes de levaduras. ............................................................. 155 6.7.1. Transformación de Escherichia coli........................................................................................ 155 6.7.2. Generación de estirpes de Saccharomyces cerevisiae mediante transformación. ................ 155 6.7.3. Generación de estirpes de Saccharomyces cerevisiae mediante cruces genéticos .............. 155 6.8. Ensayo de viabilidad celular en levaduras. .................................................................................... 156 6.9. Sincronización de cultivos de S. cerevisiae. .................................................................................. 156 6.10. Técnicas de microscopía. ............................................................................................................ 157 6.10.1. Análisis de proteínas fluorescentes en S. cerevisiae. .......................................................... 157 6.10.2. Inmunofluorescencia (IF). ..................................................................................................... 158 6.10.2.1. Preparación de esferoplastos. ...................................................................................... 158 9 6.10.2.2. Pre-absorción de anticuerpos para inmunofluorescencia. ............................................ 158 6.10.2.3. Inmunofluorescencia para la visualización de proteínas en S. cerevisiae. ................... 159 6.11. Extracción y análisis de proteínas. .............................................................................................. 160 6.11.1. Extracción de proteínas con ácido tricloroacético (TCA). ..................................................... 160 6.11.2. Extracción de proteínas con sosa (NaOH). .......................................................................... 161 6.11.3. Análisis de la expresión de proteínas mediante ensayos Western Blot. .............................. 161 6.11.4. Determinación de la concentración de proteínas. ................................................................ 162 6.11.5. Ensayo de inmunoprecipitación y purificación de Kin4. ........................................................ 162 6.11.6. Ensayos de co-inmunoprecipitación de proteínas. ............................................................... 164 6.11.7. Métodos de tinción de geles de acrilamida. ......................................................................... 165 6.11.7.1. Tinción fluorescente (SYPRO  Ruby Gel Stain). ......................................................... 165 6.11.7.2. Tinción Azul de Coomassie........................................................................................... 165 6.12. Tablas. ......................................................................................................................................... 166 7. Bibliografía .......................................................................................................................................... 169 Introducción 17 1.1. Control de la división celular por mitosis. 1.1.1. Generalidades del ciclo celular. El ciclo celular consiste en un conjunto ordenado de eventos que permiten la generación de dos células hijas a partir de una célula inicial. Este proceso resulta crucial para el desarrollo y crecimiento de los organismos pluricelulares. A lo largo del ciclo celular, la replicación del material genético, el crecimiento y la división celular deben estar perfectamente coordinados. Una desregulación de este proceso puede dar lugar al desarrollo de diversas patologías como el cáncer (Malumbres and Barbacid, 2009) o enfermedades neurodegenerativas (Yang et al., 2006). En eucariotas, el ciclo celular se divide en dos etapas principales: interfase y mitosis. Durante la interfase, o periodo de no división, se distinguen a su vez tres fases: G1, S y G2. En la fase S (“Synthesis”, Síntesis) tiene lugar la síntesis o replicación del ADN y la duplicación de los cromosomas. Esta etapa es precedida y seguida por dos periodos de crecimiento celular (G1 y G2, respectivamente). Durante G1, la célula se prepara para la síntesis del ADN. En G2, la célula continúa su crecimiento y comprueba que los procesos anteriores han ocurrido correctamente antes de entrar en mitosis. Durante la mitosis (fase M) tiene lugar la segregación del material genómico duplicado entre las dos células resultantes. Esta fase M finaliza cuando ambas células dividen el material citoplasmático y se separan físicamente en un proceso denominado citocinesis. Algunas células, en condiciones desfavorables o en presencia de señales inhibidoras, detienen su ciclo celular en fase G1 durante un tiempo ilimitado, entrando en un periodo de no división o estado de quiescencia denominado G0 (Morgan, 2007). La mitosis se divide en cuatro etapas diferenciadas en base a los sucesivos eventos cromosómicos: profase, metafase, anafase y telofase (Walczak, Cai and Khodjakov, 2010). En profase tiene lugar la condensación del ADN en forma de cromosomas, los cuales se anclan al huso mitótico, un haz bipolar de microtúbulos que emanan desde los centros organizadores de microtúbulos (MTOCs, “microtubule organizing centers”). Los MTOCs del huso reciben el nombre de centrosomas en células de eucariotas superiores y cuerpos polares del huso (SPBs, “spindle pole bodies”) en levaduras. Al inicio de mitosis, también tiene lugar la desintegración de la envoltura nuclear. Esto no ocurre, sin embargo, en todos los organismos eucarióticos. Así, la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae mantiene la envoltura nuclear durante todo el proceso de división, teniendo lugar lo que se conoce como una mitosis cerrada. En metafase, los cromosomas se alinean en el ecuador de la célula. A continuación, en anafase, tiene lugar la separación de las cromátidas hermanas hacia polos opuestos de la célula Introducción 18 gracias a la elongación del huso mitótico. Una vez distribuidos los cromosomas entre la célula madre y la célula hija, en telofase, el huso mitótico se desensambla, los cromosomas se descondensan y se reorganiza la envoltura nuclear (en los casos en los que previamente ha sido desensamblada) (Güttinger, Laurell and Kutay, 2009; Walczak, Cai and Khodjakov, 2010). Por último, ambas células resultantes separan su contenido citoplasmático en un proceso denominado citocinesis, generándose así dos células independientes. En células con división simétrica, el plano de división se establece en anafase en base a la posición del huso mitótico. Sin embargo, en células con división asimétrica como las de la levadura de gemación, dicho plano se preestablece durante la fase G1, antes de la duplicación de los SPBs, de forma perpendicular al eje que determinan la célula hija y la madre, que en el caso de las levaduras coincide con el cuello de gemación (Balasubramanian, Bi and Glotzer, 2004). Figura I1. Ciclo celular de Saccharomyces cerevisiae. La levadura de gemación S. cerevisiae se divide de forma asimétrica. Su ciclo celular consta de 4 fases diferenciadas: G1, S, G2 y mitosis (M). Tras la aparición de la gema como consecuencia del crecimiento polarizado de la célula madre, en fase S, se produce la replicación del ADN y la duplicación de los SPBs. La elongación del huso mitótico formado durante mitosis permite la correcta segregación de los cromosomas entre ambas células resultantes. Al final del ciclo celular, la separación del citoplasma entre ambas células a través del cuello de gemación (citocinesis) origina dos células de distinto tamaño y composición. Adaptado de (Finn, Lowndes and Grenon, 2012). La levadura de gemación S. cerevisiae constituye un organismo modelo idóneo para el estudio del ciclo celular y su regulación, gracias a su enorme versatilidad, a la secuenciación completa de su genoma y a la conservación durante la evolución de la mayor parte de los genes y mecanismos que intervienen durante el ciclo celular. S. Introducción 19 cerevisiae presenta un patrón de división asimétrico, caracterizado por la aparición de una gema que dará lugar a una célula hija como consecuencia del crecimiento polarizado de la célula madre (Amon, 1996) (Figura I1). Durante la mitosis cerrada de este organismo, los SPBs permanecen insertos en la membrana nuclear y la distribución del material genético tiene lugar dentro del núcleo (Güttinger, Laurell and Kutay, 2009). 1.1.2. Regulación del ciclo celular en S. cerevisiae. En células eucariotas, la progresión a lo largo del ciclo celular está regulada principalmente por una familia de quinasas muy conservadas en la evolución, las CDKs (“Cyclin-Dependent Kinases”, quinasas dependientes de ciclina), las cuales se asocian con distintas subunidades reguladores denominadas ciclinas (Morgan, 1997). Los niveles de CDKs permanecen prácticamente constantes a lo largo del ciclo, y las fluctuaciones en su actividad dependen principalmente de las oscilaciones en la aparición/destrucción de los distintos tipos de ciclinas que se asocian a ellas. En cada uno de los estadios del ciclo celular se expresa un tipo de ciclina diferente (ciclinas G1/S, ciclinas S o ciclinas mitóticas), dando lugar a la formación de distintos complejos CDK- ciclina. Cada complejo regula la progresión a través de las distintas fases del ciclo (Figura I2). La concentración de las ciclinas está regulada por cambios en la expresión de sus genes y su destrucción por proteólisis. En células animales se han descrito 9 CDKs distintas y 16 tipos de ciclinas, aunque no todas ellas están implicadas en el control del ciclo celular. En S. cerevisiae sólo existe una CDK, denominada Cdk1 o Cdc28, y dos tipos de ciclinas: ciclinas tipo N (Cln1, Cln2 y Cln3), presentes en fase G1, y ciclinas tipo B (Clb1-Clb6), expresadas en las fases S y M (Nurse, 1990; Norbury and Nurse, 1992; Nasmyth, 1996; Morgan, 1997; Johnson and Walker, 1999; Vermeulen, Van Bockstaele and Berneman, 2003). El complejo Cdc28-Clb2 es el que muestra una mayor actividad quinasa durante mitosis, y resulta esencial en la regulación de eventos como la condensación del ADN, el ensamblaje del huso mitótico y la segregación de los cromosomas (Grandin and Reed, 1993; Jin et al., 2008). La salida de mitosis y la posterior entrada en un nuevo ciclo celular requieren la inactivación de las CDKs mitóticas, así como la reversión del estado de fosforilación de los sustratos previamente fosforilados por estas quinasas (Sullivan and Morgan, 2007; Queralt and Uhlmann, 2008). En la mayor parte de los organismos eucarióticos, dicha inactivación de las CDKs tiene lugar durante la transición metafase-anafase y es llevada a cabo por el Complejo Promotor de Anafase/Ciclosoma (APC/C) junto con su activador Cdc20 (APC/CCdc20) (Figura I2). En el caso de las levaduras de gemación, sin embargo, Introducción 20 la degradación final de las CDKs mitóticas no se produce hasta telofase, gracias a la acción del complejo APC/C unido a la subunidad reguladora Cdh1 (APC/CCdh1) (Peters, 2002; Sullivan and Morgan, 2007). Por otro lado, la acumulación del inhibidor de CDKs Sic1 al final de mitosis también contribuye a la inactivación de las CDKs mitóticas (Toyn et al., 1997; Sullivan and Morgan, 2007). Finalmente, en la levadura de gemación, la entrada en un nuevo ciclo celular también requiere la degradación de la proteína Poloquinasa Cdc5, mediada por el complejo APC/CCdh1 (Shirayama et al., 1998; Visintin et al., 2008). Figura I2. Control de la progresión del ciclo celular por las ciclinas y el complejo APC/C en Saccharomyces cerevisiae. Las ciclinas G1/S permiten el inicio de un nuevo ciclo celular al final de G1. Estas ciclinas activan la expresión de las ciclinas de fase S, las cuales inician la duplicación del ADN, y se destruyen en la transición metafase-anafase. Las ciclinas mitóticas permiten la entrada en mitosis y el ensamblaje del huso. La completa activación de las ciclinas mitóticas en fase M conduce a la activación del complejo APC/C, el cual induce la separación de las cromátidas hermanas en la transición metafaseanafase y la destrucción de las ciclinas S y M. Esto provoca la inactivación de las CDKs, la salida de mitosis y la citocinesis. La actividad de APC/C se mantiene elevada en G1. Adaptado de (Morgan, 2007). En mamíferos, las fosfatasas PP1 y PP2A son importantes para la desfosforilación de los sustratos previamente fosforilados por las CDKs (Wurzenberger and Gerlich, 2011). En S. cerevisiae, esta función es llevada a cabo por la fosfatasa Cdc14, la cual es esencial para la salida de mitosis. Cdc14 es responsable de la desfosforilación, y por tanto la activación, del inhibidor Sic1, su factor de transcripción Swi5 y la subunidad activadora del APC/C Cdh1 (Stegmeier and Amon, 2004; Queralt and Uhlmann, 2008). La actividad de Cdc14 se regula principalmente mediante cambios en su unión al inhibidor Cfi1/Net1, que determinan la modificación de su localización celular. Así, Cdc14 se encuentra secuestrada en el nucléolo desde G1 hasta metafase. Durante anafase, sin embargo, esta fosfatasa es parcialmente liberada primero desde el nucléolo al núcleo, y más tarde hacia el citoplasma, donde desfosforila multitud de dianas Introducción 21 previamente fosforiladas por los complejos CDK-ciclinas mitóticas, conduciendo finalmente a la inhibición de su actividad quinasa y a la salida de mitosis (Visintin et al., 1998; Shou et al., 1999; Visintin, Hwang and Amon, 1999; Traverso et al., 2001). La liberación de Cdc14 está mediada por dos cascadas de señalización distintas: la ruta FEAR (“Cdc fourteen early anaphase release”), responsable de la liberación inicial parcial de Cdc14 desde el nucléolo al núcleo en anafase temprana, y la ruta MEN (“mitotic exit network”), la cual promueve la liberación total de Cdc14 hacia el citoplasma, promoviendo así la salida de mitosis (Stegmeier and Amon, 2004) (Figura I3). Figura I3. Regulación de la salida de mitosis y control de Cdc14. La liberación inicial de la fosfatasa Cdc14 desde el nucléolo al núcleo en la transición metafase-anafase está mediada por la ruta FEAR. La liberación total de Cdc14 al citoplasma en anafase tardía está mediada por la ruta MEN, lo cual conduce a la salida de mitosis. Adaptado de (Rock and Amon, 2009). Durante el ciclo celular es esencial mantener la fidelidad en la transmisión del material genómico entre las dos células resultantes con el fin de prevenir cariotipos aberrantes. Para ello, las células cuentan con diferentes mecanismos de vigilancia o checkpoints, responsables de bloquear o retrasar la progresión del ciclo cuando se detectan problemas que comprometan la viabilidad celular. En S. cerevisiae, los principales puntos de control son: el checkpoint de daño al ADN (DDC, “DNA damage checkpoint"), el cual se activa en presencia de daño en el ADN y bloquea o enlentece la progresión del ciclo celular con el fin de dar tiempo a la célula a reparar estos errores antes de entrar en mitosis (Harrison and Haber, 2006; Ciccia and Elledge, 2010; Ibrahim, 2015); el checkpoint de ensamblaje del huso mitótico (SAC, “spindle assembly checkpoint”), el cual actúa en la transición metafase-anafase e impide la separación de las cromátidas Introducción 22 hermanas hasta que todos los cinetocoros se encuentran unidos a microtúbulos que emanan de ambos polos del huso mitótico (biorientación cromosómica) (Lew and Burke, 2003; Musacchio and Salmon, 2007); y el checkpoint de posicionamiento del huso mitótico (SPOC, “spindle position checkpoint”), el cual promueve el bloqueo del ciclo celular en anafase cuando el huso mitótico está incorrectamente posicionado respecto al eje de polaridad que determinan la célula madre y la célula hija (Lew and Burke, 2003; Caydasi, Ibrahim and Pereira, 2010; Caydasi and Pereira, 2012; Ibrahim, 2015) (Figura I4). Remarcablemente, y si bien el DDC, el SAC y el SPOC se activan en diferentes estadios del ciclo celular y en respuesta a diferentes señales, todos estos checkpoints conducen a la inhibición de la ruta MEN y la salida de mitosis. Figura I4. Checkpoints implicados en la regulación de la salida de mitosis. En S. cerevisiae, el SAC actúa en la transición metafase-anafase y detecta uniones incorrectas entre los microtúbulos y los cinetocoros. El SPOC impide la salida de mitosis en anafase cuando el huso está mal posicionado. Adaptado de (Caydasi and Pereira, 2012). 1.1.3. Salida de mitosis y ruta MEN. La ruta MEN es indispensable para la liberación completa de la fosfatasa Cdc14 y su mantenimiento en el citoplasma y, por tanto, para la salida de mitosis en S. cerevisiae. Esta ruta, además, está implicada en otros procesos como el control de la orientación del huso mitótico, la regulación de la herencia de los SPBs en función de su edad y el inicio de la citocinesis (Segal, 2011; Hotz and Barral, 2014; Baro, Queralt and Monje- Casas, 2017). La cascada de señalización de la ruta MEN es iniciada por una pequeña GTPasa denominada Tem1 (Shirayama, Matsui and Toh-E, 1994; Jaspersen et al., 1998; Lee et al., 2001). La actividad de Tem1 está regulada negativamente por el complejo Bfa1- Bub2, el cual mantiene a la GTPasa en su forma inactiva (Tem1-GDP) hasta anafase (Pereira et al., 2000; Geymonat et al., 2002). Por otro lado, Tem1 es regulada Checkpoint anafase salida de FEAR metafase SAC SPOC entrada en mitosis célula hija (gema) SPB cuell od e gemación célula madre cromosomas microtúbulos mitosis MEN Introducción 23 positivamente por la proteína Lte1, la cual promueve su actividad en anafase una vez que el SPB donde se carga la GTPasa entra en la célula hija (Geymonat et al., 2009; Bertazzi, Kurtulmus and Pereira, 2011; Falk, Chan and Amon, 2011). La forma activa de Tem1 (Tem1-GTP) permite la activación secuencial de las quinasas Cdc15 y Dbf2 (Shirayama, Matsui and Toh-E, 1994; Toyn and Johnston, 1994; Asakawa et al., 2001; Luca et al., 2001; Mah, Jang and Deshaies, 2001). Dbf2, junto con su subunidad reguladora Mob1, fosforila a Cdc14 en residuos adyacentes a su secuencia de localización nuclear (NLS, “nuclear localization signal”), provocando de esta manera su liberación al citoplasma (Figura I5) (Grandin, de Almeida and Charbonneau, 1998; Mohl et al., 2009). Por otro lado, de forma paralela, Dbf2 fosforila distintas proteínas que desencadenan el inicio de la citocinesis (Meitinger et al., 2011). Recientemente, se ha propuesto que la activación de la ruta MEN requiere, por un lado, que el huso se encuentre correctamente posicionado y un SPB entre en la gema y, por otro lado, que se produzca un descenso inicial en la actividad de los complejos CDK mitóticos (Campbell, Zhou and Amon, 2019). Las células que presentan mutaciones en Tem1, Cdc15 o Dbf2-Mob1 son incapaces de salir de mitosis y permanecen bloqueadas en anafase tardía (células con gema grande), con Cdc14 secuestrado en el nucléolo y altos niveles de CDK-ciclinas mitóticas (Jaspersen et al., 1998; Lee et al., 2001). 1.1.3.1. Localización de los componentes de la ruta MEN y regulación de la señalización. Un aspecto clave en la regulación de la señalización de la ruta MEN consiste en el control de la localización subcelular de los distintos componentes de esta cascada. Tem1, Cdc15, Dbf2-Mob1, Cdc5, Bfa1 y Bub2 se localizan en la cara externa de los SPBs gracias a su interacción con Nud1, un componente estructural de los cuerpos polares (Cenamor et al., 1999; Gruneberg et al., 2000; Visintin and Amon, 2001; Valerio- Santiago and Monje-Casas, 2011). Adicionalmente, Bfa1 también se asocia con la proteína de la cara externa del SPB Spc72 (Gryaznova et al., 2016). De forma interesante, Tem1 y Bfa1-Bub2 se localizan asimétricamente, situándose preferentemente en el SPB que entra en la célula hija en anafase (dSPB, “daughter spindle pole body”) (Figura I5) (Bardin, Visintin and Amon, 2000; Pereira et al., 2000). Sin embargo, cuando el huso mitótico está mal posicionado y ambos SPBs se encuentran en el interior de la célula madre, Tem1 y el complejo Bfa1-Bub2 se distribuyen de forma simétrica entre ambos SPBs, debido a la fosforilación de Bfa1 por parte de la quinasa Kin4 (Molk et al., 2004; Caydasi and Pereira, 2009). Introducción 24 La localización de Tem1 en los SPBs, que depende de la presencia de Bfa1-Bub2 en estas estructuras, es esencial para que tenga lugar la salida de mitosis (Valerio-Santiago and Monje-Casas, 2011). En condiciones normales, Tem1 presenta una elevada dinamicidad en los SPBs, a diferencia del complejo Bfa1-Bub2 que se mantiene de forma más estable en dichas estructuras (Molk et al., 2004; Caydasi and Pereira, 2009; Monje-Casas and Amon, 2009). Se ha sugerido, además, que existe una pequeña fracción de Tem1 que se une a los SPBs de forma independiente al complejo Bfa1-Bub2. Esta fracción, más estable en los SPBs, se ha propuesto que es importante para la salida de mitosis (Caydasi et al., 2012). Como se ha comentado anteriormente, Tem1 se mantiene inhibida a lo largo del ciclo celular hasta anafase por el complejo Bfa1-Bub2, el cual actúa como una proteína activadora de su actividad GTPasa (GAP, “GTPase-activating protein”). En concreto, la actividad GAP de este complejo reside en Bub2, mientras que Bfa1 es la responsable de mediar la interacción entre Bub2 y Tem1 y de evitar la disociación de Tem1 de los nucleótidos de guanina (Geymonat et al., 2002, 2009; Ro, Song and Lee, 2002; Fraschini et al., 2006). Al inicio de anafase, la Polo-quinasa Cdc5 fosforila a Bfa1, provocando así la inactivación del complejo GAP y, por consiguiente, la activación de Tem1 (Hu et al., 2001; Geymonat et al., 2003). La actividad del complejo Bfa1-Bub2 está controlada, además, en base a la distribución asimétrica de dos proteínas: Kin4, que se localiza a lo largo del córtex de la célula madre y, transitoriamente, también en el SPB retenido en este compartimento (mSPB, “mother spindle pole body”), y Lte1, situada en el córtex de la gema (Höfken and Schiebel, 2002; Seshan, Bardin and Amon, 2002; D’Aquino et al., 2005; Pereira and Schiebel, 2005; Chan and Amon, 2010). En la célula madre, cuando el huso está mal posicionado, Kin4 fosforila directamente a Bfa1, activando el complejo Bfa1-Bub2 e impidiendo su inhibición por Cdc5 (D’Aquino et al., 2005; Pereira and Schiebel, 2005). A su vez, esta fosforilación genera un sitio de anclaje en Bfa1 para la proteína 14-3-3 Bmh1, lo que debilita la asociación específica de Bfa1 con Spc72 y acelera la dinamicidad del complejo Bfa1-Bub2 en los SPBs (Caydasi et al., 2014; Gryaznova et al., 2016). Por otro lado, en la célula hija, Lte1 excluye a Kin4, impidiendo la fosforilación de Bfa1 por esta quinasa y favoreciendo que Cdc5 inactive a Bfa1 (Hu et al., 2001; Bertazzi, Kurtulmus and Pereira, 2011; Falk, Chan and Amon, 2011). Esta separación espacial entre el activador Lte1 y el inhibidor Kin4 constituye un mecanismo esencial para activar la ruta MEN al final de mitosis (Figura I5) (Chan and Amon, 2010). Asimismo, la actividad del complejo GAP también depende de su distribución entre ambas células. Bfa1 y Bub2 se localizan en los SPBs de forma interdependiente, pero independiente de la presencia de Tem1 en los cuerpos polares (Pereira et al., 2000). La Introducción 25 localización asimétrica de este complejo en el SPB que entra en la célula hija durante anafase está mediada por la interacción entre los microtúbulos que emanan de este SPB y el córtex de la gema, así como por componentes del polarisoma (Monje-Casas and Amon, 2009). Recientemente, también se ha descrito que la propia hidrólisis del GTP promueve tanto la asimetría de Bfa1-Bub2 como de Tem1 (Scarfone et al., 2015). Asimismo, tanto Lte1 como la fosforilación de Bfa1 por Cdc5 contribuyen a dicha distribución diferencial (Pereira et al., 2001; Geymonat et al., 2002, 2003; Kim et al., 2012). Por último, se ha demostrado que la inactivación del complejo PP2ACdc55 al inicio de anafase, facilita la fosforilación de Bfa1 por Cdc5, lo cual también regula su localización asimétrica (Baro et al., 2013). La proteína Lte1 ejerce un papel doble para la completa activación de la ruta MEN: por un lado, restringe la localización de Kin4 en la célula madre y, por otro, activa directamente a Tem1. Lte1 tiene homología con proteínas intercambiadoras de nucleótidos de guanina (GEF, “guanine-nucleotide exchange factor”). Gracias a este dominio GEF, Lte1 activa directamente a Tem1, promoviendo así la salida de mitosis (J. E. Falk et al., 2016). En paralelo a la acción de Lte1, recientemente se ha demostrado que Ste20 (una PAK-quinasa) también actúa como un activador espacial de la salida de mitosis localizado en el compartimento de la célula hija y que promueve la actividad de MEN cuando uno de los polos del huso entra en la gema (Caydasi et al., 2017). Una vez que Tem1 está activa, promueve la carga de Cdc15 en los SPBs, lo cual también es imprescindible para la correcta regulación de MEN. Cdc15 fosforila a Nud1, lo que permite el reclutamiento del complejo Dbf2-Mob1 a los SPBs y su posterior activación (Rock and Amon, 2011; Rock et al., 2013). Asimismo, diversos estudios sugieren que la fosforilación de Cdc15 por CDK-Clb2 podría estar regulando su localización en los SPBs (Jaspersen and Morgan, 2000; König, Maekawa and Schiebel, 2010). El complejo CDK-Clb2 también fosforila a Mob1, provocando la inhibición del complejo Dbf2-Mob1 antes de anafase (Figura I5) (König, Maekawa and Schiebel, 2010; Campbell, Zhou and Amon, 2019). Por tanto, la fosforilación inhibitoria de Cdc15 y Mob1 por las CDKs mitóticas establece un bucle de retroalimentación negativa entre MEN y las CDKs que inhibe la ruta MEN e impide una salida de mitosis inapropiada antes de anafase (Campbell, Zhou and Amon, 2019). Finalmente, se ha descrito que tanto Cdc14 como la fosfatasa PP2A y su subunidad reguladora Cdc55 (PP2ACdc55) son capaces de desfosforilar y activar a Mob1 al final de anafase, lo cual conduce a la desfosforilación de Cdc14 al final de mitosis (Mohl et al., 2009; König, Maekawa and Schiebel, 2010; Baro et al., 2013). Introducción 32 La división asimétrica requiere una coordinación espacial muy estricta de tres procesos clave: la correcta segregación de los cromosomas, la distribución diferencial de moléculas y/o componentes celulares entre las dos células resultantes y la citocinesis. En la mayor parte de los organismos, la organización espacial de estos eventos está determinada por la polaridad pre-establecida en la célula antes de entrar en mitosis y el correcto posicionamiento y orientación del huso mitótico respecto al eje de polaridad. La coordinación entre la posición del huso y la separación de las células hijas durante la citocinesis es esencial para mantener la viabilidad celular (Siller and Doe, 2009; Moore and Cooper, 2010). En mamíferos, errores en el posicionamiento del huso durante la división asimétrica de células madre se han relacionado con la aparición y progresión de procesos tumorigénicos (Neumüller and Knoblich, 2009; Pease and Tirnauer, 2011). El huso mitótico consiste en una estructura bipolar muy dinámica compuesta principalmente por microtúbulos que emanan de los MTOCs localizados en ambos polos de la misma. En concreto, los MTOCs nuclean tres tipos de microtúbulos: microtúbulos cinetocóricos, que enganchan los cromosomas al huso; microtúbulos interpolares o nucleares, que forman un haz antiparalelo entre ambos polos del huso, estabilizándolo; y los microtúbulos astrales o citoplasmáticos (aMTs), los cuales emanan hacia el citoplasma y el córtex de la célula, facilitando el posicionamiento del huso. Cada microtúbulo está formado por el ensamblaje de subunidades de α- y β-tubulina, y presentan dos extremos con propiedades distintas: el extremo (-), que se encuentra cerca del MTOC y crece de forma lenta, y el extremo (+), localizado en la dirección opuesta y que crece de forma más dinámica, permitiendo la elongación de los MTs (Figura I7) (Fraschini, 2017). La interacción de los aMTs con el córtex es esencial para el correcto posicionamiento del huso mitótico (Pearson and Bloom, 2004; Barral and Liakopoulos, 2009). Figura I7. Tipos de microtúbulos que emanan de los MTOCs. Los MTOCs nuclean tres tipos de MTs: cinetocóricos, interpolares o nucleares y astrales o citoplasmáticos. En cada microtúbulo se distingue un polo u extremo (-), cercano al SPB, y en la dirección opuesta un extremo (+), por donde crecen los MTs en longitud. Adaptado de (Prosser and Pelletier, 2017). Introducción 33 El huso mitótico es una estructura inherentemente asimétrica, especialmente a nivel de los MTOCs. En cada ciclo celular, los MTOCs se duplican, dando lugar a un MTOC “viejo” (el preexistente) y otro “nuevo” (sintetizado de novo en cada ciclo), los cuales difieren en edad, composición y tamaño (Pelletier and Yamashita, 2012). En levaduras de gemación las asimetrías asociadas al huso mitótico y las diferencias moleculares entre ambos polos juegan un papel importante. Así, por ejemplo, cada uno de los polos del huso se asocia con diferentes reguladores del ciclo celular, lo cual es clave para el correcto control de la progresión del ciclo celular. Esta asimetría es especialmente relevante, por ejemplo, en la localización de los componentes de la ruta MEN (previamente descrita) (Barral and Liakopoulos, 2009). Sin embargo, las anteriores no son las únicas asimetrías observadas en el caso de los MTOCs. Así, y como se ha indicado anteriormente, un fenómeno extremadamente interesante asociado a los MTOCs es su herencia diferencial entre las dos células resultantes en determinados tipos de división celular asimétrica. S. cerevisiae representa uno de los ejemplos de división asimétrica más estudiados, junto con Drosophila y C. elegans. En levaduras de gemación, la célula madre se divide de manera polarizada, generando una célula hija de novo en forma de gema. En la transición G1-S, aparece una gema incipiente en uno de los polos de la célula madre, predeterminado durante la división anterior. En concreto, en el caso de las células haploides, la gema se forma en el sitio adyacente a la generada durante el ciclo previo (Bi and Park, 2012). El cuello de la gema especifica el futuro sitio de citocinesis, y está compuesto por filamentos de septinas que forman un anillo separando ambos compartimentos celulares (Bi and Park, 2012; Juanes and Piatti, 2016). El anillo de septina también actúa como barrera de difusión, regulando la distribución diferencial de componentes celulares entre la célula madre y la gema (Barral et al., 2000; Castillon et al., 2003; Luedeke et al., 2005). El crecimiento polarizado de la célula madre y el cuello de la gema determinan el eje de polaridad madre-hija, que permite la correcta organización del citoesqueleto y la orientación del huso mitótico en S. cerevisiae. En levaduras de gemación, la célula madre y la gema difieren tanto en tamaño como en edad replicativa. La célula madre envejece cada vez que da lugar a una gema, mientras que la célula hija recién generada mantiene todo su potencial replicativo (Henderson and Gottschling, 2008), actuando como el equivalente a una célula madre primitiva en levaduras (Yamashita and Fuller, 2008). Durante este fenómeno se segregan de forma asimétrica factores de envejecimiento, de forma que los elementos dañados o tóxicos se retienen preferentemente en la célula madre mientras que los componentes de nueva síntesis se distribuyen a la hija (Denoth Lippuner, Julou and Barral, 2014). Introducción 34 El estudio de las divisiones asimétricas en S. cerevisiae, dado el grado de conservación evolutiva de los mecanismos que las regulan, resulta de gran ayuda para poder conocer mejor cómo se regulan procesos tan importantes como la diferenciación celular, el desarrollo embrionario y el envejecimiento en humanos. 1.2.1. Orientación y posicionamiento del huso mitótico. El posicionamiento del huso mitótico puede determinar el tipo de división celular, simétrica o asimétrica, bien en función de las señales de polaridad intrínsecas a la propia célula o bien a través de la regulación de su orientación en respuesta a señales extrínsecas. En células con división simétrica, la posición del huso mitótico no está preestablecida, pero sí determina el sitio donde tiene lugar la citocinesis. Por el contrario, en células con división asimétrica, el plano de división está predeterminado desde el inicio del ciclo celular. Así, en S. cerevisiae la división tiene lugar en el cuello de gemación y, por lo tanto, el huso mitótico debe alinearse a lo largo del eje de polaridad que determinan la célula madre y la hija, y perpendicular al cuello de gemación (Pearson and Bloom, 2004; Markus, Kalutkiewicz and Lee, 2012). En todas las células con división asimétrica, la orientación y el posicionamiento del huso requieren la localización desigual de proteínas que interaccionan con el citoesqueleto, generando así las fuerzas polarizadas diferenciales necesarias para el correcto alineamiento del huso. En este sentido, los aMTs tienen un papel muy importante por su interacción con el córtex celular y la transmisión de las señales hacia el huso mitótico. En levaduras de gemación, el posicionamiento y orientación del huso mitótico se ha estudiado en profundidad y muchas de las proteínas clave están conservadas en la evolución. En S. cerevisiae, el correcto alineamiento del huso a lo largo del eje madrehija requiere el establecimiento previo de la polaridad celular en G1. Para ello es necesario, en primer lugar, la localización de la GTPasa Cdc42 en el sitio de la gema incipiente. La activación de Cdc42 organiza la nucleación de los cables de actina, los cuales se extienden desde la gema y el cuello de gemación hasta la célula madre, determinando el crecimiento polarizado de la célula hija (Pruyne and Bretscher, 2000). En eucariotas superiores, el posicionamiento del huso está determinado por la polaridad cortical, la cual se establece gracias al complejo Par (“partitioning defective complex”). Este complejo, altamente conservado en la evolución, está formado por tres proteínas: Par3 (Bazooka en Drosophila), Par6 y aPKC (“atypical protein kinase”; PKC3 en C. Introducción 35 elegans). El posicionamiento del huso dependiente del complejo Par está mediado a su vez por la localización polarizada de las proteínas de unión a proteína G (LGN-AGS3 en mamíferos, GPR 1/2 en C. elegans y Pins en Drosophila) y las proteínas asociadas NuMA (LIN5 en C. elegans, Mud en Drosophila y NuMA en mamíferos) (Knoblich, 2008; Neumüller and Knoblich, 2009; Siller and Doe, 2009; Morin and Bellaïche, 2011). 1.2.1.1. Mecanismos de posicionamiento del huso mitótico. Una vez establecido el eje de polaridad, el huso mitótico debe alinearse correctamente a lo largo del mismo. El posicionamiento y orientación del huso en S. cerevisiae se establece a través de dos rutas paralelas y redundantes: una ruta “temprana” dependiente del complejo Kar9-Bim1, que alinea el huso mitótico a lo largo del eje madre-hija en metafase; y una ruta “tardía” dependiente del complejo dineína-dinactina, que permite la elongación del huso hacia el interior de la célula hija durante anafase (Siller and Doe, 2009; Moore and Cooper, 2010; Markus, Kalutkiewicz and Lee, 2012). 1.2.1.1.1. Ruta “temprana” dependiente de Kar9. Uno de los primeros eventos en la orientación del huso mitótico es el transporte polarizado de los extremos (+) de los aMTs hacia la gema a través de los cables de actina. Esto permite el posicionamiento de uno de los SPBs en el cuello de la gema, mientras que el otro permanece retenido en la célula madre. La proteína Kar9, el homólogo de la proteína de mamíferos APC (“Adenomatous Polypopsis Coli”) en S. cerevisiae, ejerce un papel central en este proceso. Kar9 es reclutado al SPB preexistente a través de su interacción con la proteína de asociación a microtúbulos Bim1 (homólogo de EB1). El complejo Kar9-Bim1 se transloca al extremo (+) de los aMTs, donde Kar9 interacciona con Myo2, una miosina tipo V que actúa como un motor de microtúbulos que se mueve a lo largo de los cables de actina (Korinek et al., 2000; Lee et al., 2000; Yin et al., 2000; Lansbergen and Akhmanova, 2006). Kar9 actúa como una molécula de unión entre los aMTs, el córtex de la célula hija y los cables de actina. De esta forma, Myo2 provoca un transporte polarizado de Kar9, Bim1, y por tanto también de los aMTs a los que se asocian y del SPB del que emanan estos aMTs, hacia la célula hija (Figuras I8, I9) (Beach et al., 2000; Maekawa and Schiebel, 2004). Introducción 36 La localización de Kar9 en los extremos (+) de los aMTs resulta esencial para su correcta función. Esta proteína se carga en el SPB en G1, desde donde se transporta hacia los aMTs en fase S y G2. Esta transferencia de Kar9 a lo largo de los aMTs está mediada por la quinesina Kip2, en cooperación con las proteínas motoras Bim1 y Stu2 (homólogo de XMAP215) (Maekawa et al., 2003; Moore, D’Silva and Miller, 2006; Moore and Miller, 2007). Recientemente, se ha propuesto que la quinasa Snf1/AMPK está implicada en la ruta dependiente Kar9, promoviendo el posicionamiento del huso, aunque todavía se desconoce el mecanismo molecular exacto (Tripodi et al., 2018). Figura I8. Ruta de posicionamiento del huso dependiente de Kar9. La proteína Kar9 se carga de forma asimétrica en el SPB preexistente y es excluida del SPB nuevo por medio de la acción de Cdc28-Clb4. En el SPB viejo, Kar9 interacciona con Bim1 para desplazarse hacia el extremo (+) de los aMTs que emanan de este polo. Una vez allí, el complejo Kar9-Bim1 se une a Myo2, el cual se asocia a los cables de actina y viaja a lo largo de ellos hacia la gema, empujando a Kar9, los aMTs asociados y el SPB preexistente hacia la célula hija. Adaptado de (Fraschini et al., 2008). Figura I9. Interacción de los aMTs con el córtex durante el posicionamiento del huso mitótico. La ruta de Kar9 (A) y de la dineína (B) regulan el posicionamiento del huso al promover la interacción de los aMTs con el córtex de la gema. (A) Kar9 se acumula en el extremo (+) de los aMTs gracias a Bim1 y al transporte a lo largo de los aMTs por Kip2. El complejo Kar9-Bim1-aMT viaja por los cables de actina hacia el córtex de la gema gracias a Myo2. La organización de los filamentos de actina depende de la formina Bni1 y la proteína de unión a actina Bud6. (B) Por medio de Kip2, Bik1 se transporta hacia el extremo (+) de los aMTs, donde media la interacción de la dineína con los aMTs junto con Pac1. Num1 ancla el complejo dineína-dinactina al córtex de la gema. La dineína también es activada gracias al complejo Bud14-Glc7, junto con Kel1/Kel2, las cuales se asocian a la actina. Adaptado de (Lansbergen and Akhmanova, 2006). Introducción 37 Una vez que el huso mitótico se ha alineado a lo largo del eje célula madre-hija gracias a los cables de actina, los aMTs se acortan al unirse al córtex de la gema y del cuello de gemación (Kusch et al., 2002). Este anclaje de los aMTs requiere a Bud6, una proteína de unión a actina y forminas localizada en la gema y en el cuello (Figuras I8, I9) (Segal, Bloom and Reed, 2000). La despolimerización de los aMTs en el cuello de la gema está mediada por las proteínas Kip3 y Kar3 (Maddox et al., 2003; Gupta et al., 2006), mientras permanecen anclados a Bud6 (Segal, Bloom and Reed, 2000; Huisman et al., 2004). Todo ello conduce al posicionamiento final del huso metafásico y su transporte hacia el cuello de gemación. Un hecho fundamental para la orientación del huso mitótico a lo largo del eje madre-hija es la localización asimétrica de Kar9, cuya carga preferente en los aMTs que emanan del SPB preexistente (Liakopoulos et al., 2003) asegura que sea el SPB viejo el que preferentemente entra en la célula hija, mientras que el SPB de nueva generación queda retenido en la célula madre. Esta asimetría de Kar9 depende, en parte, del complejo Cdc28-Clb4, el cual fosforila a Kar9 directamente e impide que se una al SPB nuevo (Figura I8) (Liakopoulos et al., 2003; Maekawa et al., 2003; Maekawa and Schiebel, 2004; Grava et al., 2006; Moore and Miller, 2007). También es importante destacar el papel de componentes de la ruta MEN como la quinasa Dbf2 y la proteína Nud1 en el establecimiento de la asimetría de Kar9 hacia el SPB preexistente en metafase (Hotz et al., 2012). Asimismo, el SAC también interviene en la distribución asimétrica de Kar9, para lo cual requiere de la correcta actividad de Cdc28-Clb5 (Hotz, Lengefeld and Barral, 2012). Adicionalmente, de forma independiente a su fosforilación, Kar9 se sumoila por las ligasas de SUMO Siz1 y Siz2, lo que también contribuye a su localización asimétrica (Leisner et al., 2008; Meednu et al., 2008). Además de todos los factores anteriores, el correcto reclutamiento del complejo Kar9-Bim1 al SPB viejo también está mediado por la γ-tubulina (responsable de la nucleación de MTs desde el SPB) (Cuschieri, Miller and Vogel, 2006). Finalmente, también es importante destacar que otro factor fundamental para la asimetría de los aMTs y de Kar9 es la proteína Spc72, el receptor citoplasmático del complejo γ-tubulina en los SPBs, necesaria para la nucleación y estabilización de aMTs desde el SPB (Knop and Schiebel, 1998; Schiebel, 2000; Hoepfner et al., 2002). Así, la ausencia de Spc72 determina la generación de aMTs muy cortos e inestables, generando defectos en la orientación del huso mitótico a lo largo del eje madre-hija (Hoepfner et al., 2002). Además, la localización asimétrica de Spc72 al inicio de mitosis afecta a la distribución de Kar9, proporcionando al SPB viejo y al nuevo una capacidad diferencial de nuclear aMTs de forma temporal, mediando así la correcta orientación del huso mitótico (Juanes et al., 2013). Introducción 38 La distribución asimétrica de Kar9 facilita una organización diferencial de los aMTs entre ambos SPBs, confiriendo a cada SPB una capacidad nucleadora distinta (Lengefeld et al., 2018). Así, en metafase, los aMTs que emanan del SPB viejo son mucho más largos y estables en comparación con los aMTs adquiridos más tarde por el SPB nuevo, los cuales son más cortos y dinámicos (Shaw et al., 1997; Segal et al., 2000; Vogel et al., 2001; Grava et al., 2006; Juanes et al., 2013). De esta forma, el contacto entre el córtex de la gema y los aMTs que emanan del SPB preexistente, con Kar9 asociado, es mucho más frecuente, favoreciendo el transporte del SPB viejo hacia la gema. Mientras tanto, los aMTs que emanan del SPB nuevo, en los cuales no se localiza Kar9, son incapaces de reorientarse hacia la gema (Liakopoulos et al., 2003). Todo ello respalda la importancia de una regulación muy estrecha de Kar9 para asegurar su localización diferencial entre los SPBs y, por tanto, la asimetría de los aMTs y su función en la orientación del huso mitótico. 1.2.1.1.2. Ruta “tardía” dependiente de dineína. Una vez que el huso ha sido posicionado y orientado correctamente gracias a Kar9, la ruta dependiente de la dineína facilita posteriormente el empuje del huso hacia el interior de la gema durante la transición metafase-anafase. Adicionalmente, esta ruta contribuye a la elongación del huso en anafase al mediar la separación de ambos SPBs (Moore, Stuchell-Brereton and Cooper, 2009). Uno de los principales efectores de esta ruta es la proteína motora dineína, cuya cadena pesada es codificada por el gen DYN1 (o DHC1) (Eshel et al., 2006; Li et al., 2006). En metafase tardía, la dineína se carga preferentemente en el extremo (+) de los aMTs que emanan del SPB preexistente, gracias a la acción de la proteína de unión a microtúbulos Bik1 y a la quinesina Kip2 (Carvalho et al., 2004; Caudron et al., 2008). Además, las proteínas Pac1 y Ndl1 (homólogas de las proteínas de mamífero Lis1 y NdlEL, respectivamente) favorecen la retención de la dineína en los extremos (+) de los aMTs (Lee, Oberle and Cooper, 2003; Markus et al., 2011). Una vez que los aMTs contactan con el córtex de la célula, la dineína es descargada del extremo de los aMTs y se inmoviliza en el córtex gracias a su interacción con la proteína cortical Num1 (sin proteína homóloga en eucariotas superiores). Num1 se distribuye en forma de parches por todo el córtex tanto de la célula madre como de la gema (Heil-Chapdelaine, Oberle and Cooper, 2000; Markus and Lee, 2011). A continuación, la dineína es anclada en el córtex gracias al complejo de la dinactina, conduciendo así a su activación (Schroer, 2004). Una vez que la dineína está activada, empuja los aMTs y el SPB asociado a ellos hacia el córtex, provocando así el Introducción 39 movimiento y la elongación del huso mitótico hacia el interior de la célula hija (Sheeman et al., 2003). La dineína también puede ser activada por las proteínas fosfatasas Bud14 y Glc7, ambas localizadas en el córtex de la gema, las cuales se unen al citoesqueleto de actina por medio de Kel1/Kel2 (Figura I9, I10) (Knaus et al., 2005; Moore, Stuchell- Brereton and Cooper, 2009). Figura I10. Ruta de posicionamiento del huso dependiente de dineína. En anafase, la ruta dependiente del complejo dineína-dinactina y la proteína motora Kip2 es responsable del movimiento del huso mitótico hacia el interior de la gema y su elongación, gracias a la interacción con la proteína cortical Num1, localizada a lo largo del córtex de la célula madre y la hija. Adaptado de (Fraschini et al., 2008). Un factor importante para la función de la dineína es su localización primero asimétrica desde G1 hasta anafase temprana, y luego simétrica a medida que avanza la anafase y se produce la elongación del huso. Esta asimetría de la dineína está regulada tanto por Cdc28 como por otros factores corticales, que actúan en paralelo (Barral and Liakopoulos, 2009). En concreto, el complejo Cdc28-Clb2 impide la carga de dineína en el SPB nuevo retenido en la célula madre, favoreciendo su asociación asimétrica con el SPB preexistente y los aMTs que emanan de él (Grava et al., 2006). La quinesina Kip2 también contribuye a esta asimetría inicial (Carvalho et al., 2004). En metazoos, el posicionamiento del huso mitótico mediado por la dineína es esencial para la división asimétrica y los procesos de diferenciación celular. El acoplamiento entre la dineína y la polaridad cortical está mediada por las proteínas NuMA, las cuales son responsables de la asociación física entre el complejo dineína-dinactina y los reguladores de las proteínas G LGN3, GPR1/2 y Pins (Couwenbergs et al., 2007; Nguyen-Ngoc, Afshar and Gönczy, 2007). Introducción 40 1.2.1.2. Checkpoint de posicionamiento del huso mitótico: activación del SPOC y salida de mitosis en S. cerevisiae. Durante la división asimétrica de S. cerevisiae es muy importante la correcta orientación del huso mitótico a lo largo del eje célula madre-hija. En este organismo se ha descrito la existencia de un mecanismo de vigilancia denominado punto de control de posicionamiento del huso (SPOC; “spindle position checkpoint”) que retrasa la salida de mitosis inhibiendo la ruta MEN hasta que el huso esté correctamente alineado y uno de los núcleos entre en la célula hija. El SPOC permite la coordinación espacial y temporal entre la segregación cromosómica y la citocinesis (Fraschini et al., 2008; Caydasi, Ibrahim and Pereira, 2010; Caydasi and Pereira, 2012; Ibrahim, 2015; Geymonat and Segal, 2017). Cuando el SPOC no es funcional y no se retrasa la activación de MEN hasta que se consigue el correcto posicionamiento del huso, puede producirse una salida prematura de mitosis con ambos núcleos en la célula madre, generándose de este modo células poliploides y anucleadas tras la citocinesis. El principal efector del SPOC es la quinasa Kin4, que regula tanto la actividad como la localización del complejo Bfa1-Bub2 en los SPBs (D’Aquino et al., 2005; Pereira and Schiebel, 2005). Cuando el huso está mal posicionado, es necesario que dicho complejo GAP se una e inhiba a Tem1 (el principal efector de la ruta MEN) para impedir la salida de mitosis (Bardin, Visintin and Amon, 2000; Pereira et al., 2000). La ausencia de BFA1 o BUB2 impide el funcionamiento del SPOC y, por tanto, las células que carecen de estas proteínas son incapaces de frenar la progresión del ciclo celular en presencia de husos mal posicionados (Pereira et al., 2000; Wang, Hu and Elledge, 2000). Para la funcionalidad del SPOC es extremadamente importante una estrecha regulación de la localización de Kin4. En un ciclo celular normal, esta quinasa se distribuye a lo largo del córtex de la célula madre y en el cuello de la gema. Además, de forma transitoria, Kin4 también se localiza en anafase en el SPB retenido en la célula madre (D’Aquino et al., 2005; Pereira and Schiebel, 2005). Kin4 se ancla a los SPBs a través del componente de la placa externa Spc72 (Maekawa et al., 2007). Spc72 también sirve como anclaje de Bfa1 al SPB, y es necesario para la fosforilación de Bfa1 tanto por Cdc5 como por Kin4 (Gryaznova et al., 2016). Por el contrario, la carga de Kin4 en el dSPB es impedida por la proteína Lte1 (Bertazzi, Kurtulmus and Pereira, 2011; Falk, Chan and Amon, 2011). Cuando el huso mitótico está incorrectamente posicionado, y ambos polos del huso permanecen en el compartimento celular de la madre, Kin4 se asocia a ambos SPBs, lo cual juega un papel importante en el funcionamiento del SPOC (Pereira and Schiebel, Introducción 41 2005; Caydasi and Pereira, 2009; Chan and Amon, 2009). En estas situaciones en las que el huso está mal posicionado, Kin4 fosforila a Bfa1 en ambos SPBs, lo cual impide que Cdc5 a su vez fosforile, y por tanto inhiba, a Bfa1 (Hu et al., 2001; D’Aquino et al., 2005; Pereira and Schiebel, 2005; Maekawa et al., 2007; Caydasi and Pereira, 2009). Recientemente se ha descrito que el posicionamiento incorrecto del huso también determina que Bfa1 sea fosforilado adicionalmente por CDK, que actúa en paralelo junto con Kin4 para mantener el complejo GAP activo (Caydasi et al., 2017). Esta acción conjunta de Kin4 y CDK mantiene inactiva la ruta MEN y bloquea la salida de mitosis en anafase hasta que el huso se posiciona correctamente. Asimismo, y si bien el complejo Bfa1-Bub2 se localiza de forma simétrica en ambos SPBs cuando el huso está incorrectamente posicionado (Pereira et al., 2000; Molk et al., 2004; Monje-Casas and Amon, 2009), la fosforilación de este complejo GAP por Kin4 determina que muestre un menor tiempo de residencia en estas estructuras y, por tanto, que sus niveles en los SPBs sean más reducidos tras la activación del SPOC (Caydasi and Pereira, 2009; Monje-Casas and Amon, 2009). La dinámica de exclusión de Bfa1 de los SPBs se ve acentuada, a su vez, por la unión de la forma fosforilada de Bfa1 a Bmh1 (una proteína perteneciente a la familia 14-3-3). De hecho, se ha descrito que mutantes bmh1Δ mantienen la asimetría de Bfa1 incluso en presencia de husos mal posicionados y que, en consecuencia, poseen un SPOC deficiente (Caydasi et al., 2014). La acción conjunta de Kin4 y Bmh1 interrumpe específicamente la interacción entre Bfa1 y Spc72 (pero no su asociación con Nud1), lo que impide que Cdc5 fosforile a Bfa1 (Gryaznova et al., 2016). La dinámica de Bfa1 en los cuerpos polares del huso mal posicionado contribuye, a su vez, a la exclusión de Tem1 de los SPBs, cuya localización en estas estructuras depende de Bfa1-Bub2. Esto facilita adicionalmente que se mantenga el bloqueo en anafase y se evite la salida de mitosis, ya que la localización de Tem1 en los SPBs es un requisito para que se produzca la señalización de la ruta MEN (Valerio-Santiago and Monje-Casas, 2011). Finalmente, se ha propuesto que el aumento de la dinámica de exclusión del complejo Bfa1-Bub2 en los SPBs tras la activación del SPOC conduce a la aparición de una población de Bfa1 que inhibe por completo la actividad GTPasa de Tem1 en el citoplasma, favoreciendo así la acción del SPOC (Caydasi et al., 2012). Por tanto, y en resumen, la fosforilación de Bfa1 por Kin4 ejerce un papel doble sobre la regulación del SPOC y la inhibición de Tem1: por un lado, previene la fosforilación inhibitoria de Bfa1 por Cdc5 y, por otro lado, favorece la unión de Bmh1 a Bfa1, aumentando así la dinámica del complejo GAP entre los SPBs y el citoplasma (Figura I11). Introducción 48 proteínas, junto con Bbp1, están implicadas en la inserción del SPB en la membrana nuclear (Jaspersen and Winey, 2004; Cavanaugh and Jaspersen, 2017). El puente medio se corresponde con el sitio de ensamblaje del SPB nuevo y también participa en la nucleación de aMTs durante G1 y la cariogamia. Esta estructura está formada por las proteínas Kar1, Mps3, Cdc31 y Sfi1 (Jaspersen and Winey, 2004; Cavanaugh and Jaspersen, 2017). Asimismo, en respuesta a feromonas, el componente Spc72 se asocia a Kar1, translocándose desde la placa externa del SPB hacia el puente medio, donde facilita la nucleación de aMTs (Pereira et al., 1999). En cada ciclo celular, el único SPB que porta la célula madre en G1 se duplica una sola vez, dando lugar a dos SPBs (el preexistente y otro sintetizado de novo), que se mantienen insertos en la envoltura nuclear. Originalmente, la duplicación de los SPBs se ha considerado como un proceso conservativo (Adams and Kilmartin, 1999; Pereira et al., 2001; Winey and Bloom, 2012). Así, la proteína Spc42 preexistente se conserva en el SPB original, mientras que la de nueva síntesis se incorpora, preferentemente, en el SPB ensamblado de novo (Pereira et al., 2001). Sin embargo, estudios posteriores sugieren que el SPB es una estructura mucho más dinámica, en la cual hay intercambio de componentes entre ambos SPBs (Yoder et al., 2003; Menendez-Benito et al., 2013; Lengefeld et al., 2018). Así, se ha descrito que Spc110 (Yoder et al., 2003) y Cnm67 (Lengefeld et al., 2018) se duplican de forma semiconservativa. Ambos componentes se intercambian entre los dos SPBs durante su maduración, generando un equilibrio entre proteína nueva y vieja en ambos cuerpos polares. Además, Spc110 y Cnm67 se encuentran en cantidades similares en ambos SPBs (Lengefeld et al., 2018). Por el contrario, Nud1 (Lengefeld et al., 2017) y Spc72 (Lengefeld et al., 2018) se incorporan a los SPBs de forma conservativa. No obstante, una pequeña porción de proteína Spc72 nueva también se carga en el SPB preexistente. Además, recientemente se ha descrito que tanto Spc72 como Nud1 son poco dinámicos entre ambos SPBs, así como entre el citoplasma y los SPBs (Lengefeld et al., 2017, 2018). 1.2.2.1.2. Regulación de la herencia de los SPBs. Como se ha indicado, el proceso de duplicación de los SPBs determina la presencia de un SPB preexistente o viejo y un SPB nuevo, sintetizado de novo. Interesantemente, en S. cerevisiae, la edad de los SPBs especifica su propio destino en la célula, de tal forma que se establece un patrón de herencia asimétrica no aleatorio de estas estructuras. En este organismo, el SPB viejo se hereda por la célula hija, mientras que el cuerpo polar Introducción 49 nuevo es retenido en la célula madre (Figura I13) (Pereira et al., 2001). Esta herencia diferencial depende de la correcta orientación del huso mitótico en metafase gracias al reclutamiento asimétrico y específico de Kar9 en el SPB preexistente, que determina la orientación del SPB viejo hacia la gema (Liakopoulos et al., 2003). Consecuentemente, se ha descrito que los mutantes kar9Δ segregan los SPBs de forma aleatoria (Pereira et al., 2001; Hotz et al., 2012), lo que pone de manifiesto la importancia de la localización asimétrica de Kar9 como uno de los principales mecanismos implicados en el establecimiento del patrón de herencia de los SPBs en levaduras de gemación. Figura I13. Herencia asimétrica de los SPBs en S. cerevisiae. En levaduras de gemación, los SPBs se distribuyen de forma asimétrica y no aleatoria durante la división celular: el SPB viejo o preexistente es heredado por la célula hija, mientras que el SPB nuevo, sintetizado de novo en cada ciclo celular, es retenido en la célula madre. Otros dos factores claves en la regulación de la distribución diferencial de los SPBs son el componente de la placa externa Nud1 (ortólogo de centriolina) y la ruta MEN. Ambos controlan la especificación de la edad de los SPBs durante metafase y su herencia mediante la carga asimétrica de Kar9 en el SPB viejo (Hotz et al., 2012). En concreto, se ha descrito que la inactivación de Tem1, Cdc15 o Dbf2/Dbf20 conduce a problemas en la segregación correcta de los SPBs. Asimismo, los mutantes nud1-44 muestran graves defectos en el patrón de herencia de los SPBs, similares a los observados en mutantes kar9Δ. Sin embargo, Cdc14 no interviene en el establecimiento de la herencia asimétrica de estas estructuras. La ruta MEN y Nud1 especifican la identidad de los SPBs mediante la estabilización de la asimetría de Kar9 hacia el cuerpo polar viejo, la cual depende de la fosforilación directa de Kar9 por las quinasas Dbf2/Dbf20 durante metafase (Hotz et al., 2012). Como consecuencia de esta carga diferencial, el SPB viejo es heredado por la célula hija. De forma interesante, la ruta MEN también promueve la identidad y la edad de los SPBs durante el proceso de esporulación en levaduras de gemación (Renicke et al., 2017). Por otro lado, también se ha descrito que Clb5 y el SAC están implicados en la correcta herencia de los SPBs (Hotz, Lengefeld and Barral, 2012). De acuerdo con esto, la activación del SAC conduce a defectos en la segregación del Introducción 50 SPB preexistente hacia la célula hija. En el control de la distribución asimétrica de Kar9, el SAC actúa corriente arriba de la ruta MEN, garantizando su inhibición en metafase. Otra cascada de señalización implicada en la especificación de la edad de los SPBs es la recientemente denominada SPIN (“SPB Inheritance Network”) (Lengefeld et al., 2017) (Figura I14). Los principales efectores de esta ruta son la quinasa Swe1 (Wee1 en otros eucariotas), la quinasa Kin3 (también conocida como Nek2) y la acetiltransferasa NuA4 (Tip60 en otros eucariotas). Se ha descrito que la inactivación de Swe1 provoca la aleatorización de la segregación de los SPBs de nueva síntesis, pero no afecta a los cuerpos polares preexistentes. Asimismo, Kin3 está implicado junto con Swe1 en el linaje de los SPBs jóvenes. Sin embargo, NuA4 actúa en paralelo a Swe1 sobre los SPBs nuevos y en paralelo a Kin3 sobre los viejos (Lengefeld et al., 2017). Este modelo propone que, durante la fase G1, Swe1 fosforila a Nud1 en el SPB nuevo cuando este se convierte en el SPB preexistente al inicio del ciclo siguiente. A continuación, Swe1 se inactiva, por lo que el SPB nuevo que se ensambla más tarde en el ciclo no se fosforila y, por tanto, no posee la marca de identidad de edad. De esta manera, se asegura que, al inicio de la mitosis, sólo el SPB preexistente posee la marca de edad. A lo largo de las siguientes divisiones, Kin3 y NuA4 son las responsables de mantener esta señal de identidad. Estas proteínas reconocen la marca puesta por Swe1 y posteriormente modifican post-traduccionalmente tanto a Nud1 como a Spc72. En metafase, el SPIN permite el reclutamiento de Bfa1 hacia el SPB preexistente, lo cual media el reclutamiento de Kar9 hacia los aMTs que emanan de dicho cuerpo polar y permite la segregación del SPB viejo hacia la célula hija. Por lo tanto, el SPIN no regula tanto la asimetría de Kar9 como su carga específica en el SPB preexistente. De forma interesante, la ausencia tanto de BFA1 como de BUB2 genera un defecto en la herencia de los cuerpos polares, pero ambos genes actúan de manera independiente en este proceso, a diferencia de lo que ocurre en su papel como reguladores de la salida de mitosis (Lengefeld et al., 2017). Todos estos resultados destacan la importancia de las modificaciones post-traduccionales de los SPBs en la especificación de su edad y en la determinación de su destino en la célula, como si se tratara de un código intrínseco. Introducción 51 Figura I14. Regulación de la herencia asimétrica de los SPBs por el SPIN. (1) En G1, Swe1 marca al SPB ensamblado en el ciclo celular anterior como SPB preexistente según entra en su segundo ciclo celular. (2) Esto se produce gracias a la inactivación de Swe1 antes de que Nud1 se incorpore al SPB nuevo. (3) La marca de identidad establecida por Swe1 regula el reclutamiento de Bfa1-Bub2, el cual media la asociación de Kar9 con el SPB preexistente y, por tanto, su segregación hacia la gema. (4) La identidad de la edad del SPB se mantiene a continuación gracias a la acción de NuA4 y Kin3. Además de todos los factores anteriores, otro componente esencial en el establecimiento del patrón de herencia no aleatorio de los SPBs es el receptor citoplasmático del complejo γ-TuC, Spc72. El reclutamiento asimétrico de esta proteína en los SPBs regula la nucleación diferencial de aMTs entre el SPB viejo y el nuevo (Juanes et al., 2013). Se ha demostrado que la fusión del dominio de unión a γ-tubulina de Spc72 con el componente estructural Cnm67 fuerza la localización simétrica del complejo γ-TuC, lo que determina que los aMTs se nucleen por igual desde el SPB preexistente y el nuevo. Las células que expresan dicha fusión también aleatorizan la carga de Kar9 en los SPBs. Por tanto, la nucleación asimétrica temporal de aMTs mediada por el reclutamiento asimétrico de Spc72 a los SPBs representa un evento clave en el establecimiento de la relación entre la edad del cuerpo polar, la carga específica de Kar9 y el destino del SPB en la célula (Juanes et al., 2013). Finalmente, se ha comprobado que los componentes o drogas que alteran o provocan la despolimerización de los microtúbulos de la célula conducen a una aleatorización de los SPBs entre la célula madre y la gema (Pereira et al., 2001; Cepeda-García et al., Introducción 52 2010), lo cual resalta la importancia de los aMTs en la regulación de la distribución de los cuerpos polares. La compleja regulación del patrón de herencia no aleatoria de los SPBs en S. cerevisiae hace suponer que debe ser un proceso extremadamente importante para las células, si bien su función biológica, hasta recientemente, se desconocía por completo. 1.2.2.2. Herencia asimétrica de los centrosomas en eucariotas superiores. En metazoos, los centrosomas son los MTOCs encargados de nuclear los MTs desde ambos polos del huso mitótico. Cada centrosoma está compuesto por un par de centriolos rodeados de material pericentriolar, el cual contiene complejos de nucleación de microtúbulos (Yamashita, 2009; Pelletier and Yamashita, 2012; Wu and Akhmanova, 2017). Los centriolos son estructuras inherentemente asimétricas, que requieren más de un ciclo celular para madurar por completo, por lo que, de forma similar a los SPBs en S. cerevisiae, difieren tanto en morfología como en edad. Los centrosomas pueden distinguirse en función de la edad de sus centriolos. Así, el centrosoma viejo contiene un centriolo que ha pasado por más de un ciclo celular, y otro que se ensambla en la división que tiene lugar en el momento. Por otro lado, el centrosoma joven posee un centriolo formado en el ciclo celular previo y otro ensamblado de novo. Se ha descrito que los centrosomas viejos, con centriolos más maduros poseen una mayor capacidad de nuclear MTs (Yamashita, 2009; Pelletier and Yamashita, 2012; Wu and Akhmanova, 2017). De forma interesante, y al igual que ocurre en S. cerevisiae, en determinados tipos celulares que se dividen asimétricamente, los centrosomas se heredan diferencialmente en función de su edad entre ambas células resultantes. Remarcablemente, el patrón de herencia y el destino de los MTOCs y de las células que los heredan es diferente en función del tipo celular (Figura I15) (Yamashita, 2009; Inaba and Yamashita, 2012; Pelletier and Yamashita, 2012; Lerit, Smyth and Rusan, 2013). Introducción 53 Figura I15. Herencia de los centrosomas durante la división celular asimétrica de células animales. (A) Las GSCs de macho de Drosophila heredan el centrosoma viejo, al anclarse en el polo más cercano al nicho de células, el cual secreta factores de polaridad para especificar la identidad de las GSCs. El centrosoma más nuevo se segrega hacia la célula diferenciada en gonioblasto. (B) Las células neuronales precursoras del neocórtex de ratón heredan el centrosoma viejo, el cual se localiza cerca de la membrana basal, mientras que la célula diferenciada hereda el centrosoma nuevo. (C) Los neuroblastos de Drosophila heredan el centrosoma nuevo. Al inicio de cada ciclo celular, el centrosoma viejo se inactiva perdiendo su capacidad como MTOC, mientras que el centrosoma nuevo adquiere mayor capacidad de nucleación de MTs. Adaptado de (Pelletier and Yamashita, 2012). La distribución diferencial en función de la edad de los MTOCs en eucariotas superiores se describió por primera vez en las células madre de la línea germinal de macho (GSC, “germline stem cell”) en Drosophila (Yamashita et al., 2007). En estas células, el centrosoma más viejo nuclea más MTs que el nuevo, lo que contribuye a su anclaje a componentes proximales al nicho de células madre y, de esta manera, a su retención en la célula madre, que conserva la capacidad pluripotencial. Por otra parte, el centrosoma nuevo, con menor capacidad de nucleación de MTs, migra hacia el polo opuesto de la célula, segregando así hacia la célula hija diferenciada. Curiosamente, y a diferencia de lo anterior, las GSCs de la hembra de Drosophila retienen el centrosoma nuevo en la célula madre, mientras que el viejo se hereda por la célula con capacidad de diferenciación (Salzmann et al., 2014). Introducción 54 Otro ejemplo de distribución asimétrica de centrosomas es el de las células madre neurales (neuroblastos) de las larvas de Drosophila. Durante la división de estas células, el centrosoma más joven es heredado por el neuroblasto, que mantiene la capacidad de autorenovación (Conduit and Raff, 2010; Januschke et al., 2011). En neuroblastos de Drosophila, el centrosoma viejo, con una mayor actividad inicial como MTOC, se inactiva al comenzar el nuevo ciclo celular y se segrega hacia las células ganglionares, las cuales se diferenciarán posteriormente en células neuronales. Sin embargo, en interfase, el centriolo más joven, que incorpora la proteína centrobina (CNB), adquiere una mayor capacidad nucleadora de MTs tras la fosforilación de CNB por POLO quinasa, lo que determina la retención del centrosoma nuevo en el polo apical del neuroblasto (Rebollo et al., 2007; Rusan and Peifer, 2007; Rebollo, Roldán and Gonzalez, 2009; Januschke et al., 2013). La herencia asimétrica de los centrosomas en función de su edad también ha sido descrita en células madre neurales del ratón, específicamente en células gliales radiales (células neuronales precursoras del neocórtex) (Wang et al., 2009). Estas células madre heredan específicamente el centrosoma más maduro, mediante un mecanismo dependiente de la proteína Nineina, un componente del centriolo de primera generación. Finalmente, en células humanas también se ha demostrado la existencia de procesos de segregación asimétrica no aleatoria de los centrosomas. Así, en líneas celulares de neuroblastoma, el centrosoma más inmaduro es heredado por la célula hija, en cuyo córtex se localiza de forma asimétrica la proteína NuMA (implicada en polaridad celular), mientras que el centrosoma con el centriolo más antiguo migra hacia la otra célula hija (Izumi and Kaneko, 2012). A pesar de la descripción de todos los ejemplos anteriores de patrones de herencia asimétrica de MTOCs en múltiples tipos celulares, es importante señalar que todavía no está claro el mecanismo molecular preciso que regula la segregación diferencial de estas estructuras. En cualquier caso, la conservación del fenómeno de la herencia diferencial de los MTOCs, a pesar de no observarse durante la división de todas las células madre, sugiere la importancia de este proceso, especialmente en el desarrollo del sistema nervioso de los organismos. Introducción 55 1.3. Implicaciones de la distribución incorrecta de los MTOCs en cáncer, envejecimiento y neurodegeneración. Hasta hace poco, si bien se había sugerido que la distribución diferencial de los MTOCs podría ser importante en procesos como la autorrenovación de las células, la diferenciación y el envejecimiento, se desconocía las posibles implicaciones biológicas de la herencia incorrecta de estas estructuras durante las divisiones celulares asimétricas. Recientemente, en una investigación desarrollada en nuestro grupo, hemos demostrado que la herencia asimétrica de los SPBs en S. cerevisiae es necesaria para mantener el tiempo de vida media replicativa de las células (Manzano-López et al., 2019). En levaduras de gemación, la célula madre se divide un número limitado de veces (su tiempo de vida media replicativa), hasta que finalmente deja de hacerlo y muere. De forma interesante, durante el envejecimiento replicativo en S. cerevisiae, si bien se produce la senescencia progresiva de la célula madre, la edad de sus hijas se resetea tras cada división celular (Henderson and Gottschling, 2008). De forma pionera, nuestro estudio demuestra que la inversión constitutiva del patrón de herencia de los MTOCs tiene graves consecuencias sobre este proceso, dando lugar a un envejecimiento prematuro de las células (Manzano-López et al., 2019). En concreto, la herencia diferencial de los SPBs es fundamental para la distribución correcta de mitocondrias funcionales y la retención de los agregados de proteínas mal plegadas entre la célula madre y la hija (Manzano-López et al., 2019). Durante el envejecimiento, la célula madre retiene las proteínas dañadas y mal plegadas en forma de agregados (Zhou et al., 2014; Ruan et al., 2017), y esto requiere la migración del SPB viejo hacia la célula hija. En caso contrario, estos agregados de proteínas difunden hacia el interior de la gema (Manzano-López et al., 2019). Asimismo, la herencia asimétrica de los SPBs es necesaria para la distribución diferencial de las mitocondrias funcionales, las cuales se ha descrito en varios organismos (incluido humanos) que se asocian en cierta medida a los MTOCs (Knabe and Kuhn, 1996; Yaffe, Stuurman and Vale, 2003; Dalton and Carroll, 2013; Maccari et al., 2016). Apoyando nuestros resultados, y de forma similar a S. cerevisiae, también se ha descrito una relación funcional entre la orientación incorrecta de los centrosomas y el envejecimiento en GSCs de machos de Drosophila (Cheng et al., 2008). Así, durante el envejecimiento de las GSCs, se acumulan células madre con los centrosomas mal orientados con respecto al nicho, lo cual contribuye a un deterioro en la espermatogénesis en Drosophila con la edad. Diversos estudios han descrito que, además de orgánulos como Golgi y endosomas (de Anda et al., 2005) y componentes celulares como agregados de proteínas mal plegadas Introducción 56 (Johnston, Ward and Kopito, 1998; Rujano et al., 2006; Fuentealba et al., 2008; Bufalino, DeVeale and van der Kooy, 2013), otras moléculas como ARNs mensajeros específicos (Lambert and Nagy, 2002; Alliegro and Alliegro, 2005; Blower et al., 2007; Lécuyer et al., 2007; Lerit and Gavis, 2011) pueden asociarse a los MTOCs. Una segregación no aleatoria de estas estructuras, permitiría a estos componentes distribuirse de forma asimétrica entre las dos células resultantes de la división celular asimétrica, lo cual, a su vez, puede promover que las células adopten distintos destinos celulares o un potencial replicativo diferente. Los problemas durante el establecimiento de la distribución asimétrica de los centrosomas también podrían estar relacionados con procesos tumorogénicos. Así, mutaciones en el gen que codifica la proteína APC (el homólogo en humanos de Kar9), que se localiza en el centriolo más antiguo y regula la asimetría del huso mitótico en el epitelio intestinal de ratones (Quyn et al., 2010), se han asociado con la aparición de cáncer de colon en humanos (Thenappan et al., 2009). Por otro lado, también se ha establecido una relación entre la disfunción de los centrosomas y procesos tumorogénicos en Drosophila (Castellanos, Dominguez and Gonzalez, 2008). Específicamente, mutaciones en proteínas del centrosoma conducen a la aparición de tumores sólo en aquellas células neurales progenitoras que se dividen de forma asimétrica, sugiriendo la importancia de mantener el patrón de herencia de los centrosomas entre las células madre y las diferenciadas. Finalmente, la estricta regulación observada en la herencia de los centrosomas en diversos progenitores neurales sugiere un posible papel de la distribución no aleatoria de los MTOCs durante el desarrollo del cerebro. Así, es importante destacar que mutaciones en la proteína humana Cdk5Rap2 (homólogo de la proteína de Drosophila Cnn y de Spc72 en S. cerevisiae), necesaria para la determinación del destino celular durante la división de progenitores apicales en el neuroepitelio de ratón, causan microcefalia (trastorno en el que el cerebro y la cabeza son anormalmente pequeños), asociada a defectos en la función de los centrosomas (Buchman et al., 2010; Lizarraga et al., 2010). Asimismo, se ha establecido una relación entre diversos tipos de microcefalia y lisencefalia (pérdida de pliegues y surcos de la corteza cerebral) con problemas en la orientación del huso mitótico durante la división asimétrica de progenitores neurales, lo que sugiere un papel clave de este tipo de división en trastornos neurodegenerativos (Lizarraga et al., 2010; Lancaster and Knoblich, 2012; Barbelanne and Tsang, 2014; Faheem et al., 2015). Introducción 57 Todas las evidencias anteriores ponen de manifiesto la importancia del correcto control del establecimiento de patrones de herencia diferencial de los MTOCs durante la división asimétrica de células madre, y su relevancia para un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares que pueden determinar un envejecimiento celular prematuro o que estén detrás de distintas enfermedades tales como el cáncer o ciertos trastornos neurodegenerativos. Resultados 64 Resultados 65 3.1. Búsqueda de nuevos reguladores de Kin4 y análisis de su función en el punto de control de posicionamiento del huso. Durante la división celular por mitosis es esencial mantener la fidelidad en la transmisión del material genómico, para evitar que las células resultantes adquieran un cariotipo aberrante. Con este fin, las células cuentan con distintos mecanismos de vigilancia que controlan este proceso. Entre ellos, las células que se dividen de forma asimétrica, como ocurre con Saccharomyces cerevisiae, disponen de mecanismos que aseguran el correcto posicionamiento del huso mitótico a lo largo del eje de polaridad. En concreto, en la levadura de gemación, el punto de control de posicionamiento del huso (SPOC) impide la salida de mitosis cuando el huso no está bien posicionado en relación al eje que determinan la célula madre y la célula hija (Pereira and Yamashita, 2011). La proteína quinasa Kin4 tiene un papel clave en este proceso (D’Aquino et al., 2005; Pereira and Schiebel, 2005). En condiciones normales, Kin4 se localiza en el córtex de la célula madre durante la mayor parte del ciclo celular y, de forma transitoria durante anafase, también en el cuerpo polar del huso que es retenido en la célula madre (mSPB). Sin embargo, cuando el huso mitótico no está orientado correctamente y sus dos polos se encuentran dentro del compartimento celular de la madre, Kin4 se carga en ambos SPBs e inhibe la salida de mitosis al impedir la inactivación de Bfa1 y Bub2 (inhibidores de MEN) por Cdc5 y al mediar la exclusión de los SPBs de Tem1, la GTPasa que inicia la cascada de señalización de la ruta MEN (D’Aquino et al., 2005; Caydasi and Pereira, 2009; Valerio-Santiago and Monje-Casas, 2011). Por tanto, la regulación de la localización y la actividad de Kin4 es esencial para el correcto funcionamiento del SPOC. Si bien se han identificado distintas proteínas que colaboran con Kin4 en este checkpoint, todavía no se conocen en profundidad los mecanismos que actúan corriente arriba de esta quinasa para detectar el incorrecto posicionamiento del huso y transmitir la señal de activación del SPOC a Kin4. En aproximaciones experimentales previas, se han buscado proteínas que interactuasen con Kin4 en células en crecimiento exponencial (Bertazzi, Kurtulmus and Pereira, 2011). No obstante, en estas condiciones, el número de células que muestran husos mal posicionados y que, en consecuencia, activan el SPOC es extremadamente bajo. Para intentar clarificar los mecanismos moleculares que regulan la función de Kin4, al inicio de esta Tesis nos planteamos una aproximación distinta a dicho problema, realizando una búsqueda de proteínas cuya interacción con Kin4 dependa del estado de activación del SPOC. La identificación de nuevos componentes de este punto de control es fundamental para poder ampliar nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares que permiten a las células Resultados 66 detectar problemas en la orientación del huso mitótico y detener el ciclo celular hasta que el huso es finalmente posicionado de forma correcta. 3.1.1. Estrategia para la activación condicional del punto de control de posicionamiento del huso (SPOC). El posicionamiento del huso en S. cerevisiae está enormemente regulado y depende de la acción conjunta de dos rutas: la ruta dependiente de Kar9 y la dependiente de dineína. El primer mecanismo en actuar es la ruta dependiente de Kar9, la cual es responsable de la orientación del huso mitótico durante metafase. En etapas iniciales del ciclo, Kar9 es reclutado de forma asimétrica al SPB preexistente a través de su interacción con la proteína de asociación a microtúbulos Bim1. Desde esta localización, el complejo Kar9- Bim1 viaja a lo largo de los microtúbulos astrales (aMTs) que emanan del SPB preexistente en dirección a sus extremos (+). Una vez en los extremos (+) de los aMTs, Kar9 se asocia a la miosina tipo V Myo2, la cual se une a cables de actina y viaja a lo largo de ellos hacia la célula hija, tirando así de Kar9, y por tanto del SPB preexistente, en dirección a la gema. El segundo mecanismo, que actúa principalmente en anafase, depende de la dineína, la cual promueve la separación de ambos SPBs y la entrada del SPB preexistente hacia la célula hija, gracias a su interacción con la proteína cortical Num1 (Barral and Liakopoulos, 2009; Siller and Doe, 2009; Pereira and Yamashita, 2011). La eliminación de una de las dos rutas de posicionamiento del huso no tiene consecuencias graves en la viabilidad de las células; sin embargo, cuando ambas rutas son inactivadas, las células no pueden posicionar el huso y el SPOC se activa de forma constitutiva, lo cual resulta letal para las células (Miller and Rose, 1998). El primer objetivo planteado en el marco de esta Tesis Doctoral fue la identificación de proteínas que interaccionen con Kin4 y puedan estar regulando su localización o actividad. Con este fin, llevamos a cabo una inmunoprecipitación de Kin4, en condiciones tanto de activación como de no activación del SPOC, para analizar posteriormente las proteínas que eran purificadas junto a esta quinasa. Para ello, en primer lugar, generamos una estirpe en la que se añadió en el extremo 5’ del gen KIN4 la secuencia que codifica el epítopo yEGFP (“yeast Enhanced Green Fluorescent Protein”). Por otra parte, debido a la baja penetrancia y a la naturaleza transitoria de los defectos de posicionamiento del huso en células que carecen bien de Kar9 o de dineína, así como a la inviabilidad de las células cuando se inactivan ambas rutas, diseñamos un sistema para poder bloquear simultáneamente ambas rutas de posicionamiento del Resultados 67 huso, y por tanto activar el SPOC, de forma condicional en la estirpe anterior. En concreto, en las células que expresan la fusión KIN4-yEGFP, delecionamos en primer lugar el gen DYN1, que codifica la cadena pesada de la dineína. Adicionalmente, fusionamos en estas células el gen KAR9 a un degrón inducible por auxina (AID*-9myc; “Auxin inducible degron”), e introdujimos en las mismas el gen que codifica la E3 ligasa de plantas OsTIR1 bajo el control de un promotor constitutivo (Morawska and Ulrich, 2013). La adición de ácido 3-indolacético (IAA, auxina) hace que OsTir1 promueva la ubiquitinación de la fusión Kar9-AID*-9Myc y su degradación por el proteosoma (Gray et al., 2001; Dharmasiri, Dharmasiri and Estelle, 2005; Kepinski and Leyser, 2005; Teale, Paponov and Palme, 2006). Esta estirpe KIN4-yEGFP dyn1Δ KAR9-AID*-9MYC ADH1- OsTIR1-9MYC (denominada desde ahora estirpe dyn1Δ KAR9-AID) fue la finalmente empleada como herramienta para llevar a cabo la purificación e inmunoprecipitación de Kin4 en condiciones normales y de activación del SPOC, e identificar así las proteínas que se asocian a esta quinasa en ambas situaciones. Las células dyn1Δ KAR9-AID progresaban a lo largo del ciclo celular de forma similar a las células control y a células silvestres que no expresaban ninguna proteína marcada. Sin embargo, tras la adición de auxina, en el mutante dyn1Δ KAR9-AID podía observarse una acumulación de células en anafase y un ligero retraso en la salida de mitosis (Figura R1A, R1B), de acuerdo con la generación de problemas durante el posicionamiento del huso y, por tanto, con la activación del SPOC en estas células. La eficacia del sistema de depleción condicional de Kar9 gracias al degrón de auxina se comprobó mediante ensayos Western (WB, “Western blot”). Los ensayos WB de células dyn1Δ KAR9-AID que progresaban de forma sincrónica a lo largo del ciclo en presencia de auxina, mostraban niveles de expresión de Kar9 muy inferiores a los detectados en células a las que se añadía etanol en lugar de IAA. De hecho, 60 minutos tras la liberación del bloqueo en G1, la proteína era degradada hasta unos niveles indetectables por WB en células a las que se añadió auxina (Figura R1A, R1C). Finalmente, para verificar la inactivación de ambas rutas de posicionamiento del huso mitótico en el mutante dyn1Δ KAR9-AID tras la adición de IAA, analizamos el posicionamiento del huso mitótico con respecto al eje de polaridad madre-hija durante anafase mediante microscopía de inmunofluorescencia (IF). Normalmente, en anafase, el huso se encuentra posicionado de forma perpendicular al cuello de la gema y paralelo al eje que determinan la célula madre y la hija, de forma que cada una de estas células recibe la mitad del material genético duplicado (categoría “alineado”). Problemas con el posicionamiento del huso pueden determinar que esta estructura no se sitúe de forma paralela al eje madre-hija, de forma que ambas masas nucleares se encuentren en el Resultados 68 compartimento de la célula madre (categoría “no alineado”) (Caydasi and Pereira, 2012). Finalmente, hay situaciones en las que el huso mitótico sí se alinea a lo largo del eje madre-hija, pero ninguno de los núcleos es arrastrado hacia el interior de la gema, permaneciendo así ambos núcleos en la célula madre en anafase (categoría “alineado, mal posicionado”) (Figura R1D). En estos dos últimos casos se produce una activación del SPOC, que inhibe la salida de mitosis hasta que los husos se posicionan correctamente. Al analizar el posicionamiento del huso en el mutante dyn1Δ KAR9-AID en presencia de auxina, el 50% de las células mostraban un huso no alineado o alineado pero mal posicionado en el pico de células en anafase (minuto 90 tras la liberación de G1) (Figura R1E). Estos datos demuestran la inactivación condicional de las rutas de posicionamiento del huso en la estirpe dyn1Δ KAR9-AID y, por consiguiente, nuestra capacidad de inducir el SPOC e inhibir la salida de mitosis en estas células tras la adición de auxina. Resultados 69 Figura R1. Generación de un sistema en S. cerevisiae para la activación condicional del SPOC. (A- E) Células pADH1-OsTIR1-9MYC KIN4-yEGFP (F2584) y pADH1-OsTIR1-9MYC KIN4-yEGFP dyn1Δ KAR9-AID*-9MYC (F2558) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPAD. Al día siguiente, se diluyeron en YPAD a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml). A los 90 minutos del inicio de la sincronización, se añadieron 500 µM de auxina (+IAA) o etanol (+etOH, solvente donde se preparó la auxina) para inducir o no, respectivamente, la activación del degrón KAR9-AID*. Posteriormente, las células se liberaron a 26ºC en medio YPAD sin feromona y con 500 µM de auxina (+IAA) o etanol (+etOH). El experimento se repitió tres veces, obteniendo resultados similares (n=3), y se muestra un experimento representativo. (A) Diseño experimental. (B) Progresión del ciclo celular en base al análisis Resultados 70 por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico. Se indica el porcentaje de células en metafase y anafase. (C) Análisis WB de los niveles de expresión de Kar9-9Myc a los tiempos indicados tras la liberación de G1. Como control de carga se muestran los niveles de Pgk1 (3-fosfoglicerato quinasa). Adicionalmente, para demostrar la especificidad de la señal, se incluye una estirpe silvestre que no tiene marcada la proteína Kar9 con ningún epítopo. Finalmente, se muestran los niveles de expresión del regulador OsTir1-9myc a los tiempos indicados. (D) Imágenes representativas de células en anafase tardía con el huso alineado, alineado pero mal posicionado o no alineado. En cada caso, se muestra la morfología de la célula (contraste de fase, PH), del huso mitótico (tubulina, en verde) y del núcleo (DAPI, en azul), así como una imagen combinada de todas ellas (PH + Merged). (E) Estudio del posicionamiento del huso durante anafase (90 minutos tras la liberación de G1), indicando el porcentaje de células con el huso mitótico alineado (barras blancas), alineado pero mal posicionado (barras grises) o no alineado (barras negras), determinado en función de la posición del huso con respecto al eje madre-hija en células con dos núcleos completamente separados y la presencia de ambos núcleos sólo en la célula madre o en ambas células. Para cada estirpe, se analizaron entre 250 y 400 células en anafase. 3.1.2. Inmunoprecipitación de Kin4 en condiciones normales y de activación del SPOC. Una vez optimizado el sistema para inducir el SPOC de forma condicional, lo empleamos para llevar a cabo un ensayo de inmunoprecipitación de Kin4 con el objetivo de identificar nuevas proteínas que interaccionen con esta quinasa en función del estado de activación del SPOC. Antes de realizar la inmunoprecipitación, y en colaboración con la Dr. Ana María Rincón, realizamos distintos ensayos para determinar las condiciones óptimas de purificación de Kin4. Tras este estudio previo, la inmunoprecipitación de Kin4-yEGFP se llevó a cabo finalmente a partir de dos litros de cultivo, solubilizando los extractos celulares con Tritón TX100 al 0,5% y utilizando bolas de agarosas conjugadas con anticuerpo anti-GFP (Figura R2A), de acuerdo al protocolo detallado en la sección de materiales y métodos. La purificación de Kin4-yEGFP se realizó tanto a partir de un cultivo de células dyn1Δ KAR9-AID al que se añadía IAA para activar el SPOC, como a partir de un cultivo de células que sólo expresaban Kin4-yEGFP, pero que no portaban la deleción de DYN1 ni el degrón Kar9-AID*. Así, el análisis de los inmunoprecipitados obtenidos en cada caso nos permitiría, respectivamente, identificar proteínas que interaccionan con Kin4 en condiciones tanto de activación como de no activación del SPOC. Adicionalmente, realizamos el mismo proceso con células del tipo silvestre, para poder detectar proteínas que se unan a las bolas de agarosa de forma inespecífica. Los eluídos de proteínas que co-precipitaban junto con Kin4, en cada caso, se obtuvieron por duplicado. Uno de los eluídos se usó en cada caso para verificar la purificación de Kin4 y sus interactores. Estos extractos se separaron mediante electroforesis en geles de acrilamida/bisacrilamida, y se tiñeron posteriormente para visualizar las proteínas inmunoprecipitadas (Figura R2B). El segundo de los eluídos obtenido se utilizó para identificar directamente, por espectrometría de masas, las proteínas purificadas. Resultados 71 Figura R2. Inmunoprecipitación y estudio proteómico de Kin4-yEGFP en condiciones normales y de activación del SPOC. (A, B) Inmunoprecipitación (pull down) por afinidad a bolas de agarosa conjugadas con anticuerpo anti-yEGFP de la proteína Kin4 fusionada a dicho epítopo (Kin4-yEGFP) en células pADH1- OsTIR1-9MYC KIN4-yEGFP (F2584) y células pADH1-OsTIR1-9MYC KIN4-yEGFP dyn1Δ KAR9-AID*- 9MYC (F2558), partiendo de 2 litros de cultivo en medio YPAD suplementado con auxina (+IAA) a 26ºC. Como control negativo se usó la estirpe silvestre parental (F496). (A) Diseño experimental del ensayo de inmunoprecipitación de Kin4-yEGFP. (B) Gel en gradiente de acrilamida del 6-15% donde se separaron las proteínas de los eluídos del ensayo de inmunoprecipitación de Kin4-yEGFP (IP), e incluyendo los controles del total de proteínas solubilizadas (TOTAL) en cada una de las muestras analizadas, teñido con SYPRO® Ruby (izquierda) y con azul de Coomassie (derecha). El recuadro negro muestra la banda correspondiente a la proteína Kin4, tanto en condiciones normales como tras la activación del SPOC. Las flechas indican algunas de las bandas diferenciales entre las distintas condiciones. Resultados 72 Los resultados del análisis por espectrometría de masas nos permitieron identificar un total de 60 proteínas que se unían a Kin4 sólo cuando el SPOC estaba inactivado y otras 110 proteínas que co-precipitaban junto con esta quinasa en condiciones de activación del checkpoint. Finalmente, se detectaron 130 proteínas adicionales que interaccionaban con Kin4 independientemente del estado de activación del SPOC (Figura R3). Tras un análisis exhaustivo de los candidatos identificados, seleccionamos aquellas proteínas que se unían con mayor afinidad a Kin4-yEGFP y que se había descrito que podían tener alguna función en la regulación del ciclo celular o una localización similar a la de Kin4. En la tabla R1 se muestran las principales funciones biológicas de las proteínas de mayor interés. Figura R3. Identificación de interactores de Kin4. Número de proteínas obtenidas por espectrometría de masas en cada una de las condiciones en las que se realizó la inmunoprecipitación, basado en el número total de péptidos identificados y su porcentaje de cobertura relativo. Adicionalmente se muestran ejemplos representativos de cada condición. Tabla R1. Principales funciones biológicas de las proteínas que co-inmunoprecipitan junto con Kin4-yEGFP Regulación del SPOC Daño en el ADN Salida de mitosis Biosíntesis de membranas Posicionamiento del huso Ensamblaje de ribosomas Formación de microtúbulos Señalización celular y reguladores del ciclo Citoesqueleto de actina Gemación y septinas Componentes de SPB o del poro nuclear Metabolismo celular Es importante señalar que, junto con Kin4-yEGFP, co-inmunoprecipitamos las proteínas Lte1 y Bmh1 (Figura R3), las cuales han sido descritas anteriormente como interactores de Kin4 y reguladores del SPOC (Bertazzi, Kurtulmus and Pereira, 2011; Falk, Chan and Resultados 73 Amon, 2011; Caydasi et al., 2014), confirmando así el éxito de nuestra estrategia. Asimismo, se observó la presencia de componentes de los SPBs y del complejo del poro nuclear, especialmente en la condición de inducción del SPOC (Figura R3), lo cual está de acuerdo con la localización de Kin4 en los SPBs cuando el huso está mal posicionado (Caydasi and Pereira, 2009). Junto a las proteínas anteriores, se identificaron también un gran número de péptidos correspondientes a las proteínas Ras1 y Ras2, tanto en condiciones normales como tras la activación del SPOC (Figura R3). Esta asociación de Ras2 con Kin4 fue, además, verificada posteriormente mediante ensayos de co-inmunoprecipitación (Figura R4). Esta interacción es interesante, ya que, si bien se había descrito que Ras1 y Ras2 se asocian in vivo con la proteína Lte1, un interactor de Kin4 (Yoshida, Ichihashi and Toh- e, 2003; Bertazzi, Kurtulmus and Pereira, 2011), no se había demostrado experimentalmente que estas proteínas interaccionasen con esta quinasa. Figura R4. Ras2 interacciona físicamente con Kin4. Interacción de la proteína Kin4 con la proteína Ras2 mediante un ensayo de co-inmunoprecipitación (co-IP) utilizando bolas conjugadas con anticuerpo antiyEGFP a partir de extractos de cultivos asincrónicos en condiciones normales de células que expresaban simultáneamente Kin4-3HA y 3GFP-Ras2 (F2995). Como controles se usaron células que expresaban únicamente Kin4-3HA (F2993), células que sólo expresaban 3GFP-Ras2 (F2012) y células silvestres que no expresaban ninguna proteína marcada (F496). Adicionalmente, se incluyen geles que muestran el total de proteína Kin4-3HA y proteína 3GFP-Ras2 (TOTAL) presentes en cada una de las muestras analizadas. El asterisco (*) indica la presencia una banda inespecífica en las membranas hibridadas con el anticuerpo anti-HA a una altura aproximada de 120 kDa. El análisis se repitió dos veces con resultados similares (n=2), y se muestra un experimento representativo. Los resultados anteriores validan nuestra estrategia experimental, que no sólo confirma interacciones previamente descritas, sino que también nos ha permitido identificar posibles nuevos reguladores de Kin4 no descritos anteriormente, como es el caso de la proteína Ras2. Resultados 80 determinan las células madre e hija (Wang, Hu and Elledge, 2000; Lew and Burke, 2003; Caydasi and Pereira, 2012). Como se ha indicado anteriormente, en S. cerevisiae, la deleción de los genes que codifican la cadena pesada de la dineína (DYN1) o Kar9 dificulta la orientación del huso mitótico, especialmente a bajas temperaturas, lo que determina que la viabilidad de las células en estas condiciones dependa fuertemente del SPOC (Yeh et al., 1995; Hu et al., 2001; Tong et al., 2004; Pereira and Schiebel, 2005). Cuando este checkpoint no es funcional, las células con husos incorrectamente posicionados salen inapropiadamente de mitosis, lo que conduce a una pérdida de viabilidad de las mismas (Bardin, Visintin and Amon, 2000). Con el objetivo de analizar en detalle un posible papel de MRH1 en la funcionalidad del SPOC y la regulación de salida de mitosis, nos propusimos estudiar los efectos de la ausencia de Mrh1 en células que carecen de los genes DYN1 o KAR9. Así, en una primera aproximación, llevamos a cabo estudios de viabilidad celular mediante ensayos de gotas con células dyn1Δ mrh1Δ y kar9Δ mrh1Δ a distintas temperaturas (Figura R8A, R8B). Nuestros resultados indican, primero, que la ausencia de MRH1 no generaba problemas de viabilidad celular. Por otro lado, también sugieren que la falta de este gen no afectaba al posicionamiento del huso, ya que, a diferencia de las células dyn1Δ o kar9Δ, el mutante mrh1Δ no mostraba defectos de crecimiento a 12 ó 15ºC (Figura R8A, R8B). Finalmente, nuestros resultados indican que las células dyn1Δ mrh1Δ y kar9Δ mrh1Δ poseen un SPOC funcional, ya que no mostraban defectos en la viabilidad celular, incluso a bajas temperaturas, como ocurre cuando se deleciona, además de DYN1 y KAR9, los genes KIN4 o BFA1 (Figura R8A, R8B). Como se ha comentado anteriormente, MRH1 posee un parálogo denominado YRO2, que codifica una proteína que se localiza en la membrana plasmática en condiciones de estrés (e.g. presencia de ácido acético) (Keller et al., 2001; Takabatake, Kawazoe and Izawa, 2015), pero cuya función biológica es, sin embargo, desconocida. Con el fin de evaluar si YRO2 juega algún papel en la regulación del SPOC, bien sola o en combinación con la deleción de MRH1, decidimos estudiar los efectos de la deleción de YRO2 en nuestro análisis de viabilidad por ensayo de gotas. Nuestros resultados, sin embargo, muestran que las células yro2Δ y mrh1Δ yro2Δ no presentaban problemas de viabilidad celular a ninguna temperatura, excluyendo de este modo también que Yro2 pueda jugar un papel importante en el posicionamiento del huso mitótico o la funcionalidad del SPOC (Figura R8C). Resultados 81 Figura R8. La ausencia de MRH1 y/o su parálogo YRO2 no causa problemas de viabilidad celular. (A-C) Análisis de la viabilidad celular mediante test de gotas de las estirpes de levadura especificadas en cada panel. Todas las células se crecieron en placas de YPAD a partir de diluciones seriadas 1/10 de un cultivo líquido a una DO600nm = 0,5, y fueron incubadas a la temperatura indicada. (A) Comparación de la viabilidad celular de la estirpe silvestre (F496) y la de los mutantes dyn1Δ (F2096), bfa1Δ (F1114), dyn1Δ bfa1Δ (F3447), kin4Δ (F819), dyn1Δ kin4Δ (F3413), mrh1Δ (F3010) y dyn1Δ mrh1Δ (F3422). El análisis se repitió tres veces con resultados similares (n=3), y se muestra un experimento representativo. (B) Comparación de la viabilidad celular de la estirpe silvestre (F496) y la de los mutantes kar9Δ (F957), bfa1Δ (F1114), kar9Δ bfa1Δ (F2027), kin4Δ (F819), kar9Δ kin4Δ (F959), mrh1Δ (F3010) y kar9Δ mrh1Δ (F3472). El experimento se repitió dos veces con resultados similares (n=2), y se muestra un experimento representativo. (C) Comparación de la viabilidad celular de la estirpe silvestre (F496) y la de los mutantes kar9Δ (F957), bfa1Δ (F1114), kar9Δ bfa1Δ (F2027), kin4Δ (F819), kar9Δ kin4Δ (F959), mrh1Δ (F3010), kar9Δ mrh1Δ (F3472), yro2Δ (F3593), kar9Δ yro2Δ (F3555), yro2Δ mrh1Δ (F3502) y kar9Δ yro2Δ mrh1Δ (F3557). Las células que no poseen un SPOC funcional salen inapropiadamente del ciclo celular cuando orientan el huso mitótico incorrectamente. Esto da lugar a la aparición de células multinucleadas, anucleadas y regemadas, que finalmente son inviables (Bardin, Visintin and Amon, 2000; Nelson and Cooper, 2007; J. E. Falk et al., 2016). Aprovechando el Resultados 82 sistema anteriormente descrito para la inactivación condicional del SPOC, decidimos estudiar si la ausencia del gen MRH1 interfiere con el correcto funcionamiento de este checkpoint. Para ello, sincronizamos células dyn1Δ KAR9-AID mrh1Δ en G1 y las liberamos posteriormente en medio con IAA, con el fin de que entraran en el ciclo de forma sincrónica en condiciones de inducción del SPOC. Las células se incubaron a 16ºC durante 24 horas y cuantificamos el porcentaje de células multinucleadas, anucleadas y regemadas (todas ellas englobadas dentro de la categoría de células aberrantes) y de células con los núcleos segregados correctamente o bloqueadas con el huso mal posicionado (células no aberrantes) (Figura R9A, R9B). De acuerdo con lo descrito, la activación del SPOC en un mutante dyn1Δ KAR9-AID bloqueaba la salida de mitosis. Sin embargo, y de acuerdo con el papel fundamental de Kin4 en el SPOC, la ausencia de esta quinasa impedía a las células dyn1Δ KAR9-AID frenar la progresión del ciclo celular, de forma que salían inapropiadamente de mitosis, lo que daba lugar a la aparición de un elevado porcentaje de células multinucleadas o anucleadas. La deleción de MRH1 en el fondo mutante dyn1Δ KAR9-AID, sin embargo, no conducía a una acumulación apreciable de células aberrantes tras la activación del SPOC, lo que sugiere que este checkpoint es totalmente funcional en estas células, y capaz por tanto de impedir la salida de mitosis en células con el huso mal posicionado. Figura R9. La ausencia de MRH1 no afecta a la funcionalidad del SPOC. (A, B) Células pADH1-OsTIR1- 9MYC dyn1Δ KAR9-AID*-9MYC (F3233), y células que portaban adicionalmente deleciones de los genes KIN4 (kin4Δ, F3297) o MRH1 (mrh1Δ, F3234) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPAD. Al día siguiente, se diluyeron en YPAD a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml). Posteriormente, las células se liberaron en medio YPAD sin feromona y con 500 µM de auxina (+IAA) y se cultivaron durante 24h a 16ºC. (A) Imágenes representativas de células con un SPOC funcional (células sin gema, con gema o con el huso mitótico no alineado, todas ellas englobadas en la categoría de células no aberrantes) y de células en las que el SPOC no es funcional (células con dos gemas o regemadas, sin gema pero con varios núcleos (multinucleadas) o células sin núcleo o anucleadas, todas ellas englobadas dentro de la categoría de células aberrantes). Se muestra, en cada caso, una imagen combinada de la morfología celular (BF) junto con la morfología nuclear (en azul). (B) Porcentaje de células no aberrantes (barras blancas) y de células aberrantes (barras negras) en las estirpes indicadas, estimados tras 24h de crecimiento a 16ºC. Resultados 83 En resumen, el conjunto de observaciones anteriormente descritas sugiere que la ausencia del gen MRH1 o la de su parálogo YRO2, no interfiere con el correcto funcionamiento del SPOC y que, por tanto, Mrh1 no actúa como un regulador positivo de Kin4. 3.1.6. La sobreexpresión de MRH1 provoca problemas en la viabilidad celular. En un análisis a gran escala en S. cerevisiae se describió que la sobreexpresión del gen MRH1 conducía a una acumulación de células con gema grande y el contenido de ADN duplicado, lo que sugiere un retraso o bloqueo en fase G2 o M (Niu et al., 2008). Con el objetivo de profundizar en el análisis de un posible papel de Mrh1 en el control de la progresión del ciclo celular y la salida de mitosis, nos propusimos estudiar los efectos de su sobreexpresión sobre la viabilidad celular usando, de nuevo, ensayos de gotas. Para ello, utilizamos células en las que el gen MRH1 se encontraba bajo el control del promotor regulable pGAL1-10 (pGAL). El promotor pGAL se activa en presencia de galactosa y se reprime en presencia de glucosa en el medio de cultivo, mientras que su expresión no se ve modificada en presencia de rafinosa. Nuestros resultados demuestran que los niveles incrementados de Mrh1 conducían a un sutil defecto en la viabilidad de las células, que era ligeramente más acusado cuando la dinámica de los microtúbulos se veía perturbada por el crecimiento de las células a 37ºC (Figura R10A). A continuación, decidimos estudiar los efectos conjuntos de la sobreexpresión de MRH1 con la inactivación de alguna de las rutas de posicionamiento del huso mitótico (mutantes dyn1Δ o kar9Δ) o en células que carecían de un SPOC funcional (mutantes kin4Δ) (Figura R10B). De forma interesante, el defecto de crecimiento observado en células pGAL-MRH1 se veía incrementado cuando cualquiera de las rutas de posicionamiento del huso era inactivada, lo que podría explicarse en base, bien a un retraso en la progresión del ciclo celular, o a una salida inapropiada de mitosis. Apoyando la primera de las hipótesis, la viabilidad de estas células se veía aún más comprometida cuando carecían de un SPOC funcional debido a la deleción de KIN4 (Figura R10B). De igual forma, las células que sobreexpresaban MRH1 presentaban un defecto de crecimiento mayor cuando delecionabamos BFA1 (inhibidor de la ruta MEN) o LTE1 (activador de MEN) (Figura R10C), especialmente a 37ºC. Es interesante señalar que nuestros resultados también demuestran que los mutantes pGAL-MRH1 son criosensibles, viendo muy reducida su viabilidad cuando se inducía la sobreexpresión de MRH1 en células que crecían a 15ºC. Este defecto, de hecho, era Resultados 84 incluso más acusado que el mostrado por los mutantes dyn1Δ. Finalmente, además, la sobreexpresión de MRH1 conducía a la letalidad de las células crecidas a bajas temperaturas cuando se combinaba con la ausencia de reguladores de la salida de mitosis o proteínas motoras implicadas en el posicionamiento del huso (Figura R10B, R10C). Figura R10. La sobreexpresión de Mrh1 provoca problemas de viabilidad celular. (A) Células del tipo silvestre (F496) y células transformadas con el plásmido pF372, que porta una copia del gen MRH1 bajo el control del promotor del gen GAL1-10 (pGAL-MRH1, F3518), se cultivaron en medio mínimo suplementado con 2% de rafinosa a 26ºC hasta alcanzar una DO600nm ≈ 1. Diluciones seriadas 1/10 de los cultivos anteriores se sembraron en placas de medio mínimo con todos los requerimientos y con 2% glucosa (+Glucosa) o con 2% de galactosa (+Galactosa). Las placas se incubaron a las temperaturas indicadas en cada caso. (B, C) Análisis de la viabilidad celular de las estirpes especificadas en cada panel mediante tests Resultados 85 de gotas. Las células se crecieron en medio líquido YPARaf a 26ºC hasta alcanzar una DO600nm ≈ 1, y se sembraron diluciones seriadas 1/10 de los cultivos en placas de YPAD (+Glucosa) o YPAGal (+Galactosa), que se incubaron a las temperaturas indicadas. El experimento se repitió dos veces con resultados similares (n=2), y se muestra un experimento representativo. (B) Comparación de la viabilidad celular de la estirpe silvestre (F496) y la de los mutantes pGAL-MRH1 (F3518), dyn1Δ (F2096), pGAL-MRH1 dyn1Δ (F3567), kar9Δ (F957), pGAL-MRH1 kar9Δ (F3562), kin4Δ (F819) y pGAL-MRH1 kin4Δ (F3564). (C) Comparación de la viabilidad celular de la estirpe silvestre (F496) y la de los mutantes pGAL-MRH1 (F3518), bfa1Δ (F1114), pGAL-MRH1 bfa1Δ (F3602), lte1Δ (F549) y pGAL-MRH1 lte1Δ (F3604). En conjunto, estos resultados sugieren que Mrh1 podría estar implicado en la regulación del correcto posicionamiento del huso mitótico, y abren la posibilidad de que Mrh1 actúe como un mediador durante el proceso de activación del SPOC, transmitiendo, a través de su interacción con Kin4, las señales que detectan la incorrecta orientación del huso hacia la cascada de señalización que determina el bloqueo del ciclo celular en anafase hasta el correcto posicionamiento del mismo. Tras estos resultados tan prometedores, decidimos estudiar en mayor detalle cómo progresan a lo largo de un ciclo celular las células que sobreexpresaban MRH1, tanto en un fondo silvestre como en un fondo mutante kin4Δ. Para ello, las células se bloquearon en G1 con factor α y se liberaron en medio sin feromona para que entraran en el ciclo de manera sincrónica y en presencia de glucosa o galactosa. El análisis de la morfología del huso mitótico en estas células revelaba que las células con niveles incrementados de Mrh1 no mostraban un defecto aparente en la progresión del ciclo celular (datos no mostrados; Figura R11). Asimismo, la sobreexpresión de MRH1 tampoco generaba una acumulación de husos mal posicionados en anafase tardía (datos no mostrados). Finalmente, el estudio de la progresión del ciclo celular del mutante pGAL-MRH1 kin4Δ en presencia de galactosa tampoco revelaba un defecto de crecimiento adicional en comparación a lo observado en células kin4Δ. Si bien estos resultados no permiten explicar la pérdida de viabilidad de los mutantes que sobreexpresan Mrh1 en base a problemas en el posicionamiento del huso o de funcionalidad del SPOC, como apuntábamos anteriormente, sería necesaria no obstante una caracterización más exhaustiva de los efectos de los niveles incrementados de esta proteína. Así, es importante señalar que, como ocurre con Kin4 (Fernando Monje, comunicación personal), fuese necesario una sobreexpresión mucho mayor de la proteína (introduciendo copias adicionales de MRH1 bajo el control de pGAL) para observar un fenotipo evidente a un solo ciclo. Resultados 86 Figura R11. La sobreexpresión de Mrh1 no provoca problemas en la progresión del ciclo celular a un solo ciclo. Células de la estirpe pGAL-MRH1 kin4Δ (F3564), así como células de las estirpes kin4Δ (F819) y pGAL-MRH1 (F3518) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPARaf. Al día siguiente, los cultivos se diluyeron en YPAD (+Glucosa) o en YPAGal (+Galactosa) a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml). Posteriormente, las células se liberaron a 26ºC en YPAD (+Glucosa) o en YPAGal (+Galactosa) sin feromona. Las gráficas muestran la progresión del ciclo celular en base al análisis por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico. En cada caso, se indica el porcentaje de células en metafase y anafase. En resumen, las investigaciones realizadas en el marco de esta Tesis Doctoral nos han permitido identificar a la proteína Mrh1 como un nuevo interactor de la quinasa Kin4, que se asocia físicamente con ella en la membrana de la célula madre. Asimismo, nuestros datos preliminares sugieren que Mrh1 podría estar implicado en el control del SPOC, transmitiendo información posicional sobre el huso mitótico hasta Kin4, el efector de este mecanismo de vigilancia. Este trabajo, por tanto, abre la puerta por primera vez a una nueva función de Mrh1 en la regulación de la división celular por mitosis. Resultados 87 3.2. Estudio del papel de Cdc5 en el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los cuerpos polares del huso en Saccharomyces cerevisiae. La división celular asimétrica es un proceso altamente conservado, desde organismos unicelulares como las levaduras, hasta eucariotas superiores. Este tipo de división se caracteriza por la distribución diferencial de moléculas y/o componentes celulares entre las dos células hijas generadas, lo que permite, por ejemplo, que ambas muestren un destino celular distinto. Las divisiones asimétricas resultan esenciales durante el desarrollo y la diferenciación celular. Un factor clave para establecer esta asimetría durante la división celular es la orientación del huso mitótico, un haz bipolar de microtúbulos que emanan de los centros organizadores de microtúbulos (MTOCs), los cuales se localizan en ambos extremos de dicha estructura. En eucariotas superiores, los principales MTOCs que organizan el huso reciben el nombre de centrosomas, mientas que, en levaduras, se denominan cuerpos polares del huso (SPBs) (Kilmartin, 2014; Conduit, Wainman and Raff, 2015; Ito and Bettencourt-Dias, 2018). Estas estructuras se duplican en las primeras etapas del ciclo celular y, tras su duplicación, el MTOC preexistente (viejo) y el nuevamente generado (nuevo) difieren en composición, tamaño y edad (Pereira et al., 2001; Pelletier and Yamashita, 2012). De forma sorprendente, se ha descrito que en determinadas divisiones asimétricas el MTOC viejo y el nuevo se distribuyen asimétricamente entre la célula madre y la hija, mostrando un patrón de herencia no aleatorio (Pelletier and Yamashita, 2012; Reina and Gonzalez, 2014; Lengefeld and Barral, 2018). Este fenómeno fue originalmente descrito en S. cerevisiae, donde el SPB preexistente segrega hacia la célula hija, mientras que el ensamblado de novo es retenido en la célula madre (Pereira et al., 2001). Esta distribución de los centrosomas en función de la edad también ha sido descrita posteriormente en eucariotas superiores, incluyendo células de Drosophila, ratones y humanos (Wang et al., 2009; Conduit and Raff, 2010; Januschke et al., 2011; Izumi and Kaneko, 2012; Pelletier and Yamashita, 2012). A pesar de que se han identificado numerosas proteínas implicadas en este fenómeno, todavía no se conoce en profundidad ni el mecanismo molecular preciso que controla la segregación asimétrica de los MTOCs ni cómo las células distinguen la edad de estas estructuras. De forma interesante, se ha propuesto que la actividad quinasa de POLO, una familia de proteínas muy conservada desde levaduras hasta humanos (Archambault and Glover, 2009), ejerce un papel en el establecimiento de la asimetría de los centriolos entre la célula madre y la célula hija en neuroblastos de Drosophila (Januschke et al., 2013). Con el fin de profundizar en el mecanismo molecular por el cual POLO quinasa regula este Resultados 88 proceso, nos propusimos evaluar el papel de Cdc5, el homólogo de POLO en S. cerevisiae, en el establecimiento del patrón de herencia no aleatoria de los SPBs en levaduras de gemación. 3.2.1. La actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para el establecimiento de la herencia asimétrica de los SPBs. Durante la división celular de S. cerevisiae, los SPBs, una vez duplicados, se distribuyen de forma asimétrica en anafase, de tal manera que el SPB viejo (procedente de la mitosis anterior) es heredado preferentemente por la célula hija; mientras que el SPB nuevo (ensamblado de novo en cada ciclo) es retenido en la célula madre (Pereira et al., 2001). En base al papel descrito de POLO en el establecimiento de la asimetría de los centriolos en Drosophila (Januschke et al., 2013), y dada la localización de la proteína quinasa Cdc5 (el homólogo de POLO en levaduras de gemación) en los SPBs a lo largo de prácticamente todo el ciclo celular (Shirayama et al., 1998; Song et al., 2000; Botchkarev, Rossio and Yoshida, 2014), decidimos estudiar el posible papel de esta quinasa en el establecimiento del patrón de herencia de los cuerpos polares. Con este fin, analizamos, en primer lugar, la herencia de los SPBs en células que expresaban el alelo cdc5-as1, el cual codifica una proteína Cdc5 mutada cuya actividad quinasa puede ser inactivada condicionalmente con el inhibidor CMK-C1, un análogo no hidrolizable del ATP (Snead et al., 2007). Para estudiar la herencia asimétrica de los SPBs, utilizamos células que expresaban la proteína Spc110, un componente integral de los SPBs, fusionada con el epítopo fluorescente rojo dsRed. Este marcador se caracteriza por sus propiedades de plegamiento lento, ya que requiere, al menos, 42 minutos para plegarse completamente y poder emitir una señal fluorescente detectable (Yoder et al., 2003). Esta propiedad, junto con la rápida duplicación de las levaduras y la naturaleza semi-conservativa de duplicación del componente Spc110 en los SPBs (Yoder et al., 2003), determina una diferencia en la intensidad de la señal fluorescente emitida desde ambos SPBs que nos permite discriminar la edad de estas estructuras. Así, el SPB viejo o preexistente emite una señal fluorescente roja más intensa que el SPB nuevo, ya que este último incorpora mayoritariamente proteína Spc110-dsRed de nueva síntesis, que no posee suficiente tiempo para plegarse correctamente y que, por tanto, muestra una fluorescencia mucho más tenue (Baird, Zacharias and Tsien, 2000; Yoder et al., 2003; Moore, D’Silva and Miller, 2006) (Figura R12A). El estudio de la herencia de los SPBs mediante esta estrategia en un cultivo asincrónico en fase exponencial demostraba que, de acuerdo a lo previamente descrito (Pereira et al., Resultados 89 2001), el SPB viejo era heredado preferentemente por la célula hija, tanto en las células silvestres como en células cdc5-as1 en ausencia del inhibidor CMK-C1 (Figura R12B). Sin embargo, remarcablemente, la inhibición de la actividad quinasa de cdc5-as1, determinaba una distribución aleatoria de los SPBs entre la célula hija y la madre (Figura R12B). Figura R12. La actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para establecer la herencia asimétrica de los SPBs. (A, B) Análisis de la herencia de los SPBs en células del tipo silvestre (F2276) y células cdc5-as1 (F2865), ambas expresando versiones marcadas de Spc110 con dsRed y de Spc42 con GFP. Cultivos crecidos durante 36h en YPD con 300 µg/ml de adenina a 26ºC, se diluyeron a una DO600 = 1 en medio fresco, se crecieron durante 3h a 26ºC y se trataron (+CMK-C1) o no (+DMSO) con inhibidor CMK-C1 (10 mM) durante otras 3h. (A) Imágenes representativas en las que se muestra la localización de Spc110-dsRed (en rojo) y Spc42-GFP (en verde) en células con un patrón de herencia silvestre de los SPBs (SPB viejo heredado por la célula hija) o un patrón de herencia invertido (SPB viejo retenido en la célula madre). Adicionalmente, se muestra la morfología nuclear (DAPI, en azul) y celular (campo claro, BF), así como una imagen superpuesta de las anteriores (Merged). (B) Porcentaje de células con un patrón de herencia silvestre (barras blancas) o invertido (barras negras), determinado en función de la distribución asimétrica de Spc110-dsRed. Los datos finales representan la media de 3 experimentos independientes (n=3, 100 células/experimento). Las barras de error muestran la desviación estándar (SD). Se indica la significación estadística de acuerdo a un test de comparación múltiple Newman-Keuls. (C, D) Análisis de la herencia de los SPBs en células del tipo silvestre (F2071) y células cdc5-as1 (F2741), ambas expresando versiones marcadas de Spc42 con RFP y de Spc110 con GFP. Cultivos en fase estacionaria crecidos en YPD con Resultados 96 desde el inicio de mitosis, alcanzando su máxima modificación en metafase y recuperando su forma nativa en anafase. Sin embargo, cuando las células eran liberadas en medio con CMK-C1, y por tanto en ausencia de actividad quinasa de Cdc5, las células se detenían en anafase con unos niveles intermedios de fosforilación de Kar9 en comparación al control. Los resultados anteriores sugieren, de este modo, que la proteína Kar9 se modifica post-traduccionalmente de forma parcialmente dependiente de la actividad quinasa de Polo. Figura R16. La ausencia de actividad quinasa de Cdc5 impide la correcta modificación posttraduccional de Kar9. (A) Células expresando simultáneamente el alelo cdc5-as1 y la proteína Kar9-13Myc (F3964), se cultivaron en YPAD a 26ºC, se diluyeron a una DO600 = 1 en medio nuevo, se crecieron durante 3h a 26ºC y se trataron (+CMK-C1) o no (+DMSO) con inhibidor CMK-C1 (10 mM) durante otras 3h. Análisis WB de los niveles de Kar9-13Myc a los tiempos indicados en un cultivo asincrónico. Como control de carga, se evaluaron también los niveles de Pgk1. (B, C) Células de la misma estirpe que en (A) (F3964) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPAD. Al día siguiente, se diluyeron en YPAD nuevo a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml), añadiendo inhibidor CMK-C1 a una concentración final de 10 mM 2h tras la adición inicial de la feromona. Posteriormente, las células se liberaron a 26ºC en medio YPAD sin feromona y con (+CMK-C1) o sin (+DMSO) CMK-C1 (10 mM). (B) Progresión del ciclo celular en base al análisis por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico. Se indica el porcentaje de células en metafase y anafase. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) (n=3). (C) Análisis WB de los niveles de Kar9-13Myc a los tiempos indicados tras la liberación de G1 de células sincronizadas. Como control de carga, se evaluaron también los niveles de Pgk1. En conjunto, nuestros resultados sugieren que Cdc5 ejerce un doble papel en el establecimiento del destino de los cuerpos polares en S. cerevisiae, regulando tanto la distribución de Spc72 en los SPBs como la asociación diferencial de Kar9 con el SPB preexistente. Resultados 97 3.2.3. Cdc5 promueve el reclutamiento de Spc72 a los SPBs en la transición metafase-anafase. Con el fin de profundizar en el papel que ejerce Cdc5 en la regulación del reclutamiento de Spc72 a los cuerpos polares, nos propusimos analizar en detalle la localización de ambas proteínas a lo largo del ciclo celular. Para ello, bloqueamos en G1 con factor α células que expresaban simultáneamente las quimeras cdc5-as1-yEGFP y Spc72- mCherry, y las liberamos en un medio sin feromona para que progresaran por el ciclo celular de forma sincrónica, tanto en ausencia como en presencia de CMK-C1. En ausencia de este inhibidor, las células bloqueadas en G1 no mostraban señal de Cdc5- as1-yEGFP en el SPB preexistente, sólo observándose carga de esta proteína en el SPB viejo una vez alcanzada la fase S. Tras la duplicación de los SPBs, Cdc5-as1- yEGFP se localizaba también en el cuerpo polar nuevo, mostrando una distribución prácticamente simétrica de la quinasa en ambos SPBs hasta anafase tardía. Al final de mitosis, Cdc5-as1-yEGFP empezaba a desaparecer, en primer lugar, del cuerpo polar retenido en la célula madre, y posteriormente también del SPB de la célula hija (Figuras R17A- R17C). Es importante señalar que, con la intención de facilitar el estudio del papel de Cdc5-as1-yEGFP en la distribución asimétrica de los SPBs, en este trabajo sólo se ha analizado su distribución en estas estructuras. Sin embargo, Cdc5-as1-yEGFP también estaba presente tanto en el núcleo como en el cuello de la gema. A diferencia de lo observado para Cdc5-as1-yEGFP, Spc72-mCherry estaba localizado en el SPB preexistente ya en células bloqueadas en G1 en ausencia del inhibidor CMK-C1. Tras la entrada sincrónica de las células en el ciclo, y como se había descrito previamente (Juanes et al., 2013), Spc72-mCherry se localizaba en ambos SPBs de forma asimétrica en metafase y una vez que el huso mitótico estaba orientado en anafase temprana, mostrando una distribución preferente en el SPB orientado hacia la gema y siendo menor su carga en el SPB retenido en la célula madre. Posteriormente, sin embargo, la distribución de Spc72-mCherry se volvía cada vez más simétrica en ambos SPBs durante las últimas etapas de anafase y hasta producirse la salida de mitosis (Figuras R17A, R17B, R17D). Resultados 98 Figura R17. Análisis de la localización de Cdc5 y Spc72 a lo largo del ciclo celular. (A-G) Células expresando simultáneamente Cdc5-as1-yEGFP y Spc72-mCherry (F3053) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina. Al día siguiente, se diluyeron en medio fresco a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml), añadiendo inhibidor CMK-C1 a una concentración final de 10 mM 90 min tras la adición inicial de la feromona. Finalmente, las células se liberaron a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina sin feromona y con (+CMK-C1) o sin (+DMSO) CMK-C1 (10 mM). El experimento se repitió dos veces con resultados similares (n=2), y se muestra uno representativo. (A) Imágenes representativas en las que se muestra la localización de Cdc5-as1-yEGFP (en verde) y Spc72- mCherry (en rojo) en las fases del ciclo celular indicadas. Se incluyen adicionalmente imágenes de la morfología nuclear (DAPI, en azul) y celular (BF), así como una imagen superpuesta de las anteriores (Merged). (B, E) Progresión del ciclo celular en base al análisis por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico. Se indica el porcentaje de células en metafase y anafase. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) (n=3). (C,D,F,G) Porcentaje de células en las que no se observaba (No localizado, barras blancas) señal correspondiente a Cdc5-as1-yEGFP (C, F) o Spc72-mCherry (D, G) en cultivos no tratados (+DMSO) (C, D) o tratados (+CMK-C1) (F, G) con el inhibidor de Cdc5-as1, así como de células en los que dichas proteínas se localizaban en el SPB antes de su duplicación (1 SPB, barras ralladas). Una vez duplicados los SPBs, se indica adicionalmente el porcentaje de células que mostraban estas proteínas en ambos SPBs de forma simétrica (simétrico, barras negras), en ambos SPBs pero con una mayor acumulación en el SPB orientado hacia la célula hija (dSPB, barras grises oscuras) o en ambos SPBs pero con una distribución asimétrica hacia el SPB retenido en la célula madre (mSPB, barras grises claras). Los datos finales representan la media de 3 muestras (n=3, 50 células/muestra). Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Resultados 99 Una vez analizada en detalle la localización de Cdc5 y Spc72 a lo largo del ciclo celular, decidimos evaluar los posibles cambios en la distribución de estas proteínas en ausencia de actividad quinasa de Cdc5. Con este fin, células cdc5-as1-yEGFP Spc72- mCherry previamente bloqueadas en G1, fueron liberadas en un medio sin feromona y con el inhibidor CMK-C1 para que progresaran de forma sincrónica en ausencia de actividad quinasa de Cdc5. Nuestros resultados demuestran que el patrón de localización de Cdc5-as1-yEGFP no se alteraba al añadir el inhibidor CMK-C1, lo cual indica que la carga de esta proteína en los SPBs es independiente de su actividad quinasa (Figuras R17A, R17E, R17F). Es importante recordar que, como se ha descrito anteriormente, la inactivación de Polo-quinasa conduce a un bloqueo de las células en anafase tardía (Kitada et al., 1993), con Cdc5-as1-yEGFP presente en ambos SPBs (Figuras R17A, R17E, R17F). Por otro lado, también observamos que la falta de actividad Polo-quinasa no afectaba a la presencia de Spc72 en el cuerpo polar preexistente en células en G1, las cuales incorporaban este componente estructural de los SPBs en el ciclo celular previo (Figuras R17A, R17E, R17G). Sorprendentemente, sin embargo, la inhibición de la actividad quinasa de Cdc5 sí alteraba significativamente la distribución de Spc72 a medida que las células progresaban a lo largo del ciclo. Específicamente, en presencia del inhibidor CMK-C1, un porcentaje importante de células en metafase y anafase temprana mostraban carga de Spc72-mCherry en un solo SPB, que coincidía con el cuerpo polar orientado hacia la gema. Además, Spc72- mCherry no alcanzaba la distribución simétrica entre ambos SPBs observada en ausencia del inhibidor, a pesar de que las células se detenían en anafase tardía, mostrando una asociación preferente hacia el SPB orientado hacia la célula hija (Figuras R17E, R17G). Por tanto, nuestros resultados sugieren que la actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para la correcta carga de Spc72 en los SPBs y para su distribución simétrica en anafase tardía. Con el fin de evaluar en mayor profundidad el papel de Cdc5 en el reclutamiento de Spc72 a los cuerpos polares, y como aproximación complementaria a la anterior, realizamos una cuantificación de la intensidad de la señal fluorescente emitida por una fusión Spc72-mCherry en los SPBs en células que expresaban simultáneamente la proteína Cdc5-as1 marcada con yEGFP. En concreto, dichas células se bloquearon en G1 con factor α y se liberaron en medio sin feromona en ausencia o en presencia del inhibidor CMK-C1 para que progresaran de forma sincrónica a lo largo del ciclo con o sin actividad Polo-quinasa, respectivamente (Figuras R17B, R17E). La cuantificación de la cantidad total de Spc72-mCherry presente en ambos SPBs a lo largo del ciclo, indicaba que los niveles de proteína Spc72 reclutada tanto al SPB antiguo como al Resultados 100 nuevo eran significativamente menores en ausencia de la actividad quinasa de Cdc5. Este fenómeno era especialmente notable en la transición metafase-anafase (Figuras R18A-R18C). Nuestros datos sugieren, por tanto, que el reclutamiento de nueva proteína Spc72 a ambos SPBs se ve afectado por la inhibición de la actividad quinasa de Cdc5. Por otro lado, el cociente de la cantidad total de Spc72-mCherry entre el dSPB y el mSPB demostraba que, en presencia del inhibidor CMK-C1, la proteína Spc72 se distribuye de forma más asimétrica a lo largo de todo el ciclo celular, sin alcanzar la simetría observada en células en anafase tardía en ausencia de dicho inhibidor (Figura R18D), de acuerdo con nuestros resultados previos. Figura R18. La ausencia de actividad quinasa de Cdc5 impide un reclutamiento activo de Spc72 a los SPBs a lo largo del ciclo. (A-D) Células expresando simultáneamente Cdc5-as1-yEGFP y Spc72- mCherry (F3053) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina. Al día siguiente, se diluyeron en medio nuevo a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml), añadiendo inhibidor CMK-C1 a una concentración final de 10 mM 90 min tras la adición inicial de la feromona. Finalmente, las células se liberaron a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina sin feromona y con (+CMK-C1) o sin (+DMSO) CMK-C1 (10 mM). La progresión del ciclo celular en base al análisis por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico se muestra en las Figuras R17B y R17E. (A, B) Cuantificación de la intensidad media de fluorescencia total de Spc72-mCherry presente en el SPB preexistente (A) y en el SPB nuevo (B) a lo largo del ciclo, ambos en células tratadas (+CMK-C1, barras negras) o no (+DMSO, barras blancas) con el inhibidor de cdc5-as1. Las barras de error representan la SEM (n=50 células). (C) Gráfico de dispersión en el que se representa cada una de las medidas de intensidad total de fluorescencia de Spc72-mCherry presente en el dSPB y en el mSPB desde metafase hasta anafase (60 a 105 minutos tras la liberación de G1), tanto en células tratadas (CMK-C1) como no tratadas (DMSO) con el inhibidor de Resultados 101 cdc5-as1. Las barras rojas indican la media +/- SEM (n=50 células). Se indica la significación estadística de acuerdo a un test de comparación múltiple Newman-Keuls. (D) Gráfico de dispersión en el que se representa el cociente de la intensidad de fluorescencia de Spc72-mCherry presente en dSPB entre la estimada en el mSPB a los tiempos indicados tras la liberación de G1, tanto en células tratadas (+CMK-C1) como no tratadas (+DMSO) con el inhibidor de cdc5-as1. En este gráfico, cuanto más se aproxima el cociente anterior al valor 1 (indicado con líneas discontinuas azules) más simétrica es la localización de Spc72-mCherry en ambos SPBs de la célula. Los valores de dicho cociente >1 indican que Spc72-mCherry está localizado asimétricamente hacia el dSPB, mientras que los valores <1 representan las células en las que la proteína se encuentra preferentemente en el mSPB. El eje de ordenadas está partido en tres escalas distintas para facilitar la visualización de todas las medidas. Las barras rojas indican la media +/- SEM (n=50 células). En conjunto, nuestros datos indican que la falta de actividad quinasa de Cdc5 impide el reclutamiento activo de Spc72 a ambos SPBs, alterando de este modo el patrón de distribución normal de dicha proteína en estas estructuras. Dado que Cdc5 también está implicada en el mantenimiento de la asociación diferencial de Kar9 con el SPB preexistente, decidimos a continuación analizar en detalle la distribución de esta proteína a lo largo de un ciclo celular en ausencia de actividad Poloquinasa. Con este fin, bloqueamos células que expresaban simultáneamente Kar9- sfGFP y Spc42-mCherry (como marcador de cuerpo polar) en G1 con factor α, y las liberamos en un medio sin feromona para que progresaran por el ciclo celular de forma sincrónica, tanto en ausencia como en presencia del inhibidor CMK-C1. A diferencia de lo que ocurría con Spc72, Kar9-sfGFP mostraba la misma dinámica de localización a lo largo del ciclo, tanto en condiciones normales como tras inhibir la actividad quinasa de Cdc5 (Figura R19A-R19D). En ambas situaciones, Kar9-sfGFP se asociaba con el SPB preexistente desde etapas tempranas del ciclo celular y, a partir de metafase, viajaba a lo largo de los aMTs que emanaban de este SPB hacia la gema y el córtex de la célula hija. Estos datos sugieren, por tanto, que la inhibición de la actividad quinasa de Cdc5 no interfiere con el establecimiento de la asimetría de Kar9 a un solo ciclo. Resultados 102 Figura R19. Análisis de la localización de Kar9 a lo largo del ciclo celular. (A-D) Células expresando simultáneamente Kar9-sfGFP y Spc42-mCherry (como marcador de cuerpo polar) (F3780) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina. Al día siguiente, se diluyeron en medio fresco a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml), añadiendo inhibidor CMK-C1 a una concentración final de 10 mM 90 min tras la adición inicial de la feromona. Finalmente, las células se liberaron a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina sin feromona y con (+CMK-C1) o sin (+DMSO) CMK- C1 (10 mM). (A, C) Progresión del ciclo celular en base al análisis por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico. Se indica el porcentaje de células en metafase y anafase (n=3). (B, D) Porcentaje de células en las que Kar9-sfGFP se localizaba preferentemente hacia la gema o en el interior de la célula hija (barras negras) o presente en ambas células (barras blancas) en cultivos no tratados (+DMSO) (B) o tratados (+CMK-C1) (D) con el inhibidor de cdc5-as1 (n=100 células). De forma paralela a los ensayos anteriores, comprobamos adicionalmente si Cdc5 y Spc72 interaccionan in vivo, así como dónde y cómo tiene lugar esta interacción a lo largo del ciclo, mediante un ensayo de complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) (Sung and Huh, 2007). Para ello, expresamos simultáneamente Cdc5-as1 fusionada al extremo N-terminal de la proteína fluorescente Venus (Cdc5-as1-VN) y Spc72 fusionada al extremo C-terminal de Venus (Spc72-VC) en células que progresaban de forma sincrónica a lo largo del ciclo después de haber sido bloqueadas previamente en G1. La aparición de señal fluorescente en los cuerpos polares como consecuencia de la reconstitución de la proteína Venus permitía confirmar la interacción in vivo de Cdc5 y Spc72 en los SPBs, que además tenía lugar de forma independiente de la actividad quinasa de Cdc5 (Figura R20A, R20E). Un estudio detallado de la interacción por BiFC a lo largo del ciclo reveló que, a pesar de que Cdc5 y Spc72 colocalizaban en los SPBs desde fase S (antes incluso de producirse la separación de los SPBs), la interacción entre ambas proteínas no era evidente hasta que las células alcanzaban la transición metafase-anafase, observándose su máxima asociación en 0 30 60 90 120 150 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) % células Progresión del ciclo: (+DMSO) Anafase Metafase 0 30 60 90 120 150 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) % células Progresión del ciclo: (+CMK-C1) Anafase Metafase Localización de Kar-sfGFP (+DMSO) 0 30 45 60 75 90 105 120 135 150 0 20 40 60 80 100 Célula hija Ambas células Tiempo (min) % células 0 30 45 60 75 90 105 120 135 150 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) % células Localización de Kar-sfGFP (+CMK-C1) Célula hija Ambas células A B C D Resultados 103 anafase (Figuras R20B, R20C). Además, de forma interesante, nuestros resultados revelaban que la interacción entre Cdc5 y Spc72 tenía lugar preferentemente en el cuerpo polar orientado hacia la célula hija, de acuerdo con la distribución asimétrica de Spc72 en los SPBs. Sin embargo, esta asociación asimétrica en el SPB de la célula hija se mantenía durante más tiempo a lo largo del ciclo, observándose incluso cuando Spc72 ya se distribuía de forma simétrica en los cuerpos polares (Figura R20C). La inhibición de la actividad quinasa de Cdc5 no impedía la interacción de ambas proteínas, aunque el patrón de interacción cambiaba ligeramente. Así, en este caso, la asociación preferente de Cdc5 y Spc72 en el SPB orientado hacia la hija se perdía, observándose en su lugar un patrón de interacción aleatorio entre ambos SPBs, que perduraba durante todo el bloqueo en anafase (Figuras R20D, R20E). Nuestros resultados demuestran, por tanto, que la actividad quinasa de Cdc5 no es necesaria para su interacción con Spc72 en los SPBs, pero que su ausencia cambia el patrón de asociación de ambas proteínas. Figura R20. Análisis de la interacción entre Cdc5 y Spc72 a lo largo del ciclo celular mediante BiFC. (A-E) Células expresando simultáneamente fusiones de Cdc5-as1 y Spc72 con las regiones N- y C-terminal de la proteína fluorescente Venus, respectivamente (Cdc5-as1-VN y Spc72-VC; F3420), se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina. Al día siguiente, se diluyeron en medio fresco a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml), añadiendo inhibidor CMK-C1 a Resultados 104 una concentración final de 10 mM 90 min tras la adición inicial de la feromona. Finalmente, las células se liberaron a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina sin feromona y con (+CMK-C1) o sin (+DMSO) CMK- C1 (10 mM). El experimento se repitió dos veces con resultados similares (n=2), y se muestra uno representativo. (A) Imágenes representativas de Spc42-mCherry (en rojo), usado como marcador de los SPBs, y de la señal fluorescente Venus (que indica la interacción entre Cdc5-as1-VN y Spc72-VC, en verde), distinguiendo si dicha interacción es asimétrica hacia el dSPB (mayor intensidad de fluorescencia en el SPB orientado hacia la célula hija) o hacia el mSPB (mayor fluorescencia en el SPB retenido en la madre). Adicionalmente, se muestra la morfología nuclear (DAPI, en azul) y celular (BF), así como una imagen superpuesta de las anteriores (Merged). (B, D) Progresión del ciclo celular en base al análisis por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico. Se indica el porcentaje de células en metafase y anafase. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) (n=3, 100 células/muestra). (C, E) Porcentaje de células en las que no se detectaba señal fluorescente de BiFC (No localizado, barras blancas) en cultivos no tratados (+DMSO) (C) o tratados (+CMK-C1) (E) con el inhibidor de cdc5-as1, así como de células en las que se observaba señal fluorescente en el SPB antes de ser duplicados (1 SPB, barras ralladas). Tras la duplicación de los SPBs, se indica el porcentaje de células con señal de BiFC en ambos SPBs de forma simétrica (simétrico, barras negras), en ambos SPBs pero con una mayor acumulación en el SPB orientado hacia la célula hija (dSPB, barras grises oscuras) o en ambos SPBs pero con una distribución asimétrica hacia el SPB retenido en la célula madre (mSPB, barras grises claras) (n=100 células). Todos nuestros resultados sugieren que Cdc5 promueve el reclutamiento de Spc72 a los SPBS durante la transición metafase-anafase. Con el fin de evaluar más a fondo esta hipótesis, decidimos estudiar la distribución de Spc72 en los SPBs inhibiendo transitoriamente la actividad quinasa de Cdc5 en distintas etapas del ciclo celular. Así, en primer lugar, analizamos la localización de Spc72 en células que iniciaban el ciclo celular con actividad Cdc5 pero en las que, posteriormente, se inhibía la actividad de esta quinasa después de metafase. Para ello, células que expresaban simultáneamente Cdc5-as1-yEGFP y Spc72-mCherry, previamente sincronizadas en G1 con factor α, eran liberadas en medio sin feromona para, posteriormente, ser bloqueadas de nuevo en metafase gracias a la inactivación condicional de un alelo inducible por auxina de CDC20 (CDC20-AID (Muñoz-Barrera, Aguilar and Monje-Casas, 2015)), el gen que codifica el cofactor del complejo promotor de anafase (APC/C). Tras la reactivación de Cdc20 y la liberación del bloqueo en metafase, la adición del inhibidor CMK-C1 permitía que las células progresaran por el ciclo entrando de forma sincrónica en anafase en ausencia de actividad Polo-quinasa. En estas condiciones, la localización de Cdc5-as1- yEGFP no se veía afectada (Figuras R21A, R21B). Sin embargo, de acuerdo con la hipótesis de que Cdc5 regula la carga de Spc72 a los SPBs durante la transición metafase-anafase, la ausencia de actividad Polo-quinasa determinaba que se mantuviese la distribución asimétrica de Spc72-mCherry en anafase tardía, no produciéndose nuevo reclutamiento de esta proteína en los SPBs (Figuras R21A, R21C). Resultados 105 Figura R21. Localización de Cdc5-as1 y Spc72 durante el ciclo inhibiendo la actividad Polo-quinasa a partir de metafase. (A-C) Células expresando simultáneamente Cdc5-as1-yEGFP, Spc72-mCherry y el alelo condicional cdc20-AID (F3053) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina. Al día siguiente, se diluyeron en medio fresco a una DO600=0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml), añadiendo ácido 3-indolacético (IAA) a una concentración final de 500 µM, para empezar a inhibir el alelo cdc20-AID, 90 min tras la adición inicial de la feromona. Posteriormente, las células se liberaron a 26ºC en medio fresco sin feromona, con IAA (500 µM, +auxina) y sin DMSO (-DMSO) ni inhibidor de cdc5-as1 (-CMK-C1). A los 75 minutos tras la liberación de G1, se añadió inhibidor CMK-C1 (10 mM) a los cultivos (-CMK-C1) para empezar a inactivar el alelo cdc5-as1. Una vez completado el bloqueo en metafase (90 minutos tras la liberación de G1), las células se lavaron y se liberaron a 26ºC en medio nuevo sin IAA (-auxina) y sin (+DMSO) o con (+CMK-C1) inhibidor CMK-C1 (10 mM). El experimento se repitió tres veces con resultados similares (n=3), y se muestra uno representativo. (A) Progresión del ciclo celular en base al análisis por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico. Se indica el porcentaje de células en metafase y anafase. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) (n=3, 100 células/muestra). (B, C) Porcentaje de células en las que no se detectaba (No localizado, barras blancas) señal de Cdc5-as1-yEGFP (B) o Spc72-mCherry (C), así como de células en los que dichas proteínas se localizaban en el SPB antes de su duplicación (1 SPB, barras ralladas). Una vez duplicados los SPBs, se indica adicionalmente el porcentaje de células que mostraban ambas proteínas en ambos SPBs de forma simétrica (simétrico, barras negras), en ambos SPBs pero con una mayor acumulación en el SPB orientado hacia la célula hija (dSPB, barras grises oscuras) o en ambos SPBs pero con una distribución asimétrica hacia el SPB retenido en la célula madre (mSPB, barras grises claras). Los datos finales representan la media de 3 muestras (n=3, 50 células/muestra). Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Resultados 112 una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml). Posteriormente, las células se liberaron a 26ºC en medio nuevo sin feromona y sin (+DMSO) o con (+CMK-C1) inhibidor CMK-C1 (10 mM). El gráfico muestra el porcentaje de células con un patrón de herencia silvestre (barras blancas) o invertido (barras negras), determinado en función de la distribución asimétrica de Spc110-dsRed. El experimento se repitió tres veces con resultados similares (n=3, 100 células/experimento), y se muestra uno representativo. Spc72 es el receptor citoplasmático del complejo γ-tubulina, el cual es responsable de la nucleación de microtúbulos implicados en la orientación del huso mitótico y segregación correcta de los cuerpos polares (Schiebel, 2000; Hoepfner et al., 2002). Como se ha indicado anteriormente, nuestros resultados demuestran que Cdc5 promueve un reclutamiento eficiente de Spc72 a ambos SPBs, pero también que su actividad quinasa no es necesaria para el mantenimiento de dicha proteína en los cuerpos polares. Este hecho explica que el patrón de herencia de los SPBs no se vea modificado en un solo ciclo celular en ausencia de actividad Polo-quinasa, al ser el cuerpo polar preexistente el único que porta Spc72, y por tanto aquel que es capaz de nuclear aMTs de forma más eficiente y también el que muestra una mayor probabilidad de ser heredado por la célula hija. De este modo, Cdc5 actuaría como un “temporizador molecular” que retrasa la incorporación de nueva proteína Spc72 a los SPBs hasta la transición metafase-anafase, favoreciendo así la interacción de los microtúbulos que emanan del cuerpo polar preexistente con el córtex de la célula hija, restringiendo la capacidad del SPB nuevo de nuclear microtúbulos hasta metafase, y contribuyendo así al establecimiento del patrón de herencia no aleatoria de los cuerpos polares. Para corroborar esta hipótesis, sincronizamos células que expresaban el alelo cdc5-as1, Spc72-GFP y el marcador de edad del cuerpo polar Spc110-dsRed en G1 con factor α, liberándolas posteriormente en medio sin feromona pero en presencia de nocodazol, una droga despolimerizadora de microtúbulos que provoca un bloqueo en metafase como consecuencia de la activación del punto de control del ensamblaje del huso (Musacchio and Salmon, 2007). La eliminación del nocodazol del medio permite que los microtúbulos vuelven a polimerizar y las células progresen de nuevo a lo largo del ciclo tras el ensamblaje del huso mitótico y su correcto posicionamiento a lo largo del eje de polaridad madre-hija. Esta despolimerización temporal de los microtúbulos provoca, sin embargo, una aleatorización en el destino de los SPBs (Pereira et al., 2001) (Figuras R25A, R25B). De forma interesante, la inhibición de la actividad quinasa de Cdc5 durante todo el ciclo celular determinaba que el patrón de herencia normal de los SPBs no se aleatorizase tras la eliminación del nocodazol, observándose además que el SPB viejo era heredado en la mayor parte de los casos por la célula hija (Figuras R25D, R25E). Estos datos pueden explicarse fácilmente en base a nuestra hipótesis. Así, el bloqueo en metafase inducido por el nocodazol permite, en ausencia del inhibidor CMK- Resultados 113 C1, que Cdc5 reclute de forma activa a Spc72, lo que determina que se pierda la asociación preferente de Spc72 con el SPB preexistente (Figura R25C, R25F). De esta forma, una vez que se elimina el nocodazol, ambos SPBs adquieren la misma capacidad de nucleación de microtúbulos y, por tanto, muestran la misma probabilidad de que los microtúbulos que emanan de ellos sean capturados por el córtex de la célula hija, produciéndose la aleatorización de los cuerpos polares. Sin embargo, cuando la actividad quinasa de Cdc5 está inhibida, como hemos demostrado anteriormente, Spc72 no se recluta eficientemente en los SPBs, manteniendo por tanto su localización preferente y asimétrica en el SPB preexistente (Figura R25C, R25F). De este modo, al liberar las células del bloqueo en nocodazol y formar de nuevo el huso mitótico, sigue siendo el SPB viejo el que es capaz de nuclear microtúbulos de forma más eficiente y, por consiguiente, el que se distribuye hacia la célula hija. Figura R25. El destino de los SPBs no se aleatoriza tras un tratamiento con nocodazol en ausencia de actividad Cdc5. (A-F) Análisis de la herencia de los SPBs en células cdc5-as1 (F3705) que expresan simultáneamente Spc110-dsRed y Spc72-GFP. Las células se cultivaron 24h a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina, se diluyeron en medio nuevo a una DO600 = 0,2 y se sincronizaron en G1 con factor α (5 µg/ml). Posteriormente, las células se liberaron a 26ºC en medio nuevo sin feromona, con nocodazol (15 µg/ml, +nocodazol) y sin (+DMSO) o con (+CMK-C1) inhibidor CMK-C1 (10 mM). Transcurridos 90 minutos tras la liberación de G1, las células se lavaron y se liberaron en medio nuevo sin (+DMSO) o con (+CMK-C1) inhibidor CMK-C1 (10 mM). El experimento se repitió dos veces con resultados similares (n=2), y se muestra uno representativo. (A, D) Progresión del ciclo celular en base al análisis por IF de la morfología del núcleo y del huso mitótico. Se indica el porcentaje de células en metafase y anafase, así como el de células con los microtúbulos despolimerizados (No MTs). Las barras de error representan la SD (n=3, 100 células/muestra). (B, E) Análisis de la herencia de los SPBs, determinada en base a la distribución asimétrica de Spc110-dsRed. Los gráficos muestran el porcentaje de células con un patrón de herencia silvestre (cuadrados negros) o invertido (círculos grises). Los datos finales representan la media de 3 muestras (n=3, 50 células/muestra). (C, F) Porcentaje de células con una localización de Spc72-GFP simétrica entre ambos SPBs (simétrico, cuadrados negros), una mayor acumulación en el SPB orientado hacia la célula hija (dSPB, cuadros blancos) o una mayor acumulación en el SPB retenido en la célula madre (mSPB, círculos grises). Los datos finales representan la media de 3 muestras (n=3, 50 células/muestra). Resultados 114 3.2.5. La ausencia de SPC72 o KAR9 conduce a una aleatorización de los cuerpos polares. La proteína Kar9 tiene un papel fundamental en el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los cuerpos polares, de forma que su ausencia conduce a una aleatorización de los SPBs (Pereira et al., 2001; Moore, D’Silva and Miller, 2006). En base a este papel fundamental de Kar9, nos propusimos a continuación estudiar la interdependencia en la localización de Kar9 y Spc72 en los SPBs. El análisis de la localización de Spc72 en un mutante kar9Δ indicaba que, a pesar de que la herencia de los cuerpos polares se veía efectivamente aleatorizada, ni el reclutamiento de Spc72 a los SPBs ni a su asociación preferente con el SPB preexistente se veían afectados en ausencia de Kar9 (Figura R26A-R26C). Estos resultados concuerdan con el hecho de que Spc72 actúa corriente arriba de Kar9 en la segregación diferencial del SPB viejo hacia la célula hija (Juanes et al., 2013). De forma análoga, también analizamos la herencia de los cuerpos polares y la localización de Kar9 en un mutante spc72Δ, que es viable en el fondo genético W303 del que derivan las estirpes usadas en este trabajo (Hoepfner et al., 2002; Gryaznova et al., 2016). De acuerdo a lo esperado en base a su papel fundamental en la herencia de los SPBs, la ausencia del gen SPC72 provocaba, al igual que la falta de Kar9, una aleatorización del destino de los cuerpos polares (Figura R26D). Sin embargo, de forma interesante, en el mutante spc72Δ, la quimera Kar9-sfGFP no era detectada en las células (Figura R26E, R26F), lo cual indica que Spc72 facilita la carga de esta proteína en los SPBs y los aMTs. Por tanto, nuestros resultados demuestran un papel clave de Spc72 en la determinación del destino celular del SPB mediando el reclutamiento de Kar9 a los cuerpos polares y los aMTs. Resultados 115 Figura R26. La ausencia de SPC72 o KAR9 conduce a una aleatorización de los cuerpos polares. (A- F) Cultivos en fase estacionaria crecidos en YPD con 300 µg/ml de adenina a 26ºC se diluyeron a una DO600 = 1 en medio nuevo y se incubaron durante 6h a 26ºC. Los datos finales representan la media de 3 experimentos independientes (n=3, 100 células/experimento). Las barras de error indican la SD. Se indica la significación estadística de acuerdo a un test de comparación múltiple Newman-Keuls. (A-C) Análisis de la herencia de los SPBs y la localización de Spc72 en células del tipo silvestre (F3712) y células kar9Δ (F3774), ambas expresando Spc42-RFP y Spc72-GFP. Los gráficos muestran el porcentaje de células con un patrón de herencia silvestre (barras grises) o invertido (barras negras) de los SPBs, en función de la presencia de un punto rojo de Spc42-RFP (A), así como el de células con una localización silvestre (dSPB, barras grises) o invertida (mSPB, barras negras) de Spc72-GFP (B) y el de células con una distribución coincidente (barras blancas) u opuesta (barras negras) de ambas proteínas (C). Adicionalmente, en (A) y (B) se representa el porcentaje de células con el huso mal posicionado (barras blancas). (D-F) Análisis de la herencia de los SPBs y la localización de Kar9 en células del tipo silvestre (F3754) y células spc72Δ (F3836), ambas expresando Spc110-dsRed y Kar9-sfGFP. Los gráficos muestran el porcentaje de células con un patrón de herencia silvestre (barras grises) o invertido (barras negras) de los SPBs, en función de la distribución asimétrica de Spc110-dsRed, así como el porcentaje de células con el huso mal posicionado (barras blancas) (D). También se representa el porcentaje de células en las que no se observa Kar9-sfGFP (barras blancas), junto al de aquellas en las que Kar9-sfGFP se localiza en la célula hija (barras grises) o en la célula madre (barras negras) (E). Finalmente, se representa el porcentaje de células con una distribución coincidente (barras grises) u opuesta (barras negras) de Spc110 y Kar9 y el de células en las que no se observa Kar9 (barras blancas) (F). 3.2.6. La actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para la distribución conjunta de Spc72 y Kar9 en el mismo SPB. Finalmente, para profundizar en el papel de Cdc5 en el patrón de distribución asimétrica en S. cerevisiae, nos planteamos evaluar las posibles consecuencias de la falta de actividad Polo-quinasa en la co-distribución de Spc72 y Kar9 en el cuerpo polar viejo. Como se ha indicado anteriormente, si bien la ausencia de actividad quinasa de Cdc5 Resultados 116 no afectaba a la capacidad de Spc72 para asociarse al SPB viejo, sí que tenía un efecto negativo sobre la carga asimétrica de Kar9 hacia el cuerpo polar preexistente. Esto sugiere que Cdc5 regula tanto el reclutamiento de Spc72 a los SPBs como la asociación específica de Kar9 al SPB viejo. Sin embargo, nuestros resultados también demuestran que la distribución de Kar9 es más asimétrica que la de Spc72 en los SPBs. Por tanto, y dado que el reclutamiento de Kar9 a los SPBs depende de Spc72 (Figura R26E), esto sugiere que algún factor pueda regular y promover específicamente la asociación preferente de ambas proteínas con el cuerpo polar viejo. Con el fin de evaluar si la misma quinasa Cdc5 pudiera estar implicada en esta función, analizamos simultáneamente la localización de Spc72-mCherry y Kar9-GFP en un cultivo asincrónico en fase exponencial tras la adición del inhibidor CMK-C1. Nuestros resultados muestran que la ausencia de actividad quinasa de Cdc5 duplicaba el número de células con una distribución opuesta de Spc72 y Kar9 (Figuras R27A-R27C). Además, la inhibición de la actividad Polo-quinasa tenía un efecto mayor sobre el porcentaje de células que poseían una distribución incorrecta de Kar9 cuando Spc72 estaba localizado correctamente, que sobre el número de células con una localización invertida de Spc72 y Kar9 correctamente localizado (Figura R27C). Estos resultados sugieren que Cdc5 no sólo promueve la carga de Spc72 a los SPBs, sino que, a su vez, también regula la asociación de este γ-TuCR con Kar9. Resultados 117 Figura R27. La actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para la distribución conjunta de Spc72 y Kar9 en el mismo SPB. (A-C) Células expresando simultáneamente Kar9-GFP y Spc72-mCherry (F2351), así como otras que portaban adicionalmente el alelo cdc5-as1 (F2845) se cultivaron durante toda la noche a 26ºC en YPD con 300 µg/ml de adenina, se diluyeron a una DO600 = 1 en medio nuevo, se crecieron durante 3h a 26ºC y se trataron (+CMK-C1) o no (+DMSO) con inhibidor CMK-C1 (10 mM) durante otras 3h. (A) Imágenes representativas en las que se muestra una distribución coincidente u opuesta de Kar9-GFP (en verde) y Spc72-mCherry (en rojo). Adicionalmente, se distingue entre células en las que se observa una localización silvestre (acumulación preferente en la gema) o invertida (presencia en la célula madre) de ambas proteínas. Finalmente, se incluyen imágenes de la morfología nuclear (DAPI, en azul) y celular (BF), así como una imagen superpuesta de las anteriores (Merged). (B, C) Porcentaje de células con una distribución coincidente (barras blancas) u opuesta (barras negras) de Kar9-GFP y Spc72-mCherry en los SPBs (B), detallando en cada caso, asimismo, si dichas proteínas mostraban un patrón de localización silvestre o invertido (C). Los datos finales representan la media de 3 experimentos independientes (n=3, 100 células/experimento). Las barras de error indican la desviación estándar (SD). Se indica la significación estadística de acuerdo a un test de comparación múltiple Newman-Keuls. En base a todo el conjunto de resultados recogidos en este capítulo de la Tesis Doctoral, nuestras observaciones permiten proponer un modelo según el cual Cdc5 participa en el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los SPBs en S. cerevisiae funcionando como un temporizador molecular que favorece el reclutamiento temporal y secuencial de Spc72 a los SPBs, mientras que, adicionalmente, también regula la asociación especifica de Kar9 al SPB viejo, favoreciendo aún más la distribución asimétrica de Kar9 en estas estructuras. 4. Discusión Discusión 120 Discusión 121 4.1. Nuevos reguladores de Kin4 y su papel en el punto de control de posicionamiento del huso. El correcto posicionamiento del huso mitótico con respecto al eje de polaridad es esencial durante la división celular asimétrica (Siller and Doe, 2009). En S. cerevisiae, este proceso está regulado por dos rutas distintas. En primer lugar, la orientación y posicionamiento del huso metafásico con respecto al eje de polaridad y al cuello de gemación está mediado por la ruta dependiente de Kar9. Más tarde, en anafase, la proteína motora dineína es responsable de la elongación del huso y la correcta segregación de los núcleos entre las dos células resultantes (Barral and Liakopoulos, 2009; Siller and Doe, 2009). En el caso de que el posicionamiento del huso mitótico no se produzca correctamente y los dos núcleos, ya separados, se encuentren en la célula madre, las levaduras de gemación activan un mecanismo de vigilancia denominado el punto de control de posicionamiento del huso (SPOC). El SPOC detiene la progresión del ciclo celular y la salida de mitosis, inhibiendo la ruta MEN hasta que el huso se posicione correctamente y uno de los núcleos entre en la célula hija (Pereira and Yamashita, 2011; Caydasi and Pereira, 2012; Gryaznova et al., 2016; Jill Elaine Falk et al., 2016). El principal efector del SPOC es la quinasa Kin4, que fosforila a Bfa1 impidiendo así la fosforilación inhibitoria de esta proteína por Cdc5 y manteniendo activo el complejo GAP Bfa1-Bub2, el cual impide que la ruta MEN desencadene la salida de mitosis (D’Aquino et al., 2005; Pereira and Schiebel, 2005; Maekawa et al., 2007; Caydasi and Pereira, 2009). Si bien múltiples estudios han descrito diversos reguladores de Kin4 y del SPOC, todavía no se conoce en profundidad el mecanismo exacto que controla este checkpoint, ni cómo las células son capaces de detectar un posicionamiento incorrecto del huso mitótico y transmitir esta señal hasta Kin4 para detener el ciclo. En esta Tesis Doctoral hemos identificado la proteína Mrh1 como un nuevo interactor de Kin4, describiendo por primera vez la implicación de esta proteína en mitosis, y profundizando así nuestro conocimiento sobre la regulación del posicionamiento del huso mitótico durante el ciclo celular en S. cerevisiae. Con el objetivo de identificar nuevos interactores de Kin4 que puedan ser necesarios para la funcionalidad del SPOC, durante esta Tesis Doctoral hemos diseñado un sistema genético inducible para inactivar condicionalmente las dos rutas de posicionamiento del huso mitótico y, por tanto, favorecer una situación en la que la acumulación de células con el huso mal posicionado determina una activación constitutiva del SPOC. Gracias a este sistema, y mediante ensayos de co-inmunoprecipitación, hemos podido identificar a la proteína Mrh1 entre un elevado conjunto de nuevos factores potencialmente Discusión 128 GSCs (Pereira and Yamashita, 2011; Yuan et al., 2012). Por otro lado, durante la división asimétrica del embrión de C. elegans, se ha descrito que las proteínas de polaridad PAR son necesarias para el posicionamiento asimétrico del huso mitótico. Así, la proteína casein-quinasa CSNK-1 (localizada en el córtex de la célula) inhibe a la proteína PPK-1 permitiendo su acumulación asimétrica en la membrana plasmática, lo cual regula a su vez la distribución diferencial de los factores corticales LIN-5/GPR-1/2, implicados en el posicionamiento del huso y las fuerzas motoras de la dineína (Panbianco et al., 2008). También se han descrito evidencias de la existencia de mecanismos de control del posicionamiento del huso similares al SPOC y al COC en células de mamífero, especialmente en células epiteliales y células madre neurales e intestinales que se dividen asimétricamente. Sin embargo, estos mecanismos todavía no se conocen en profundidad a nivel molecular. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral podrían ayudar a esclarecer estos procesos en un futuro. En conjunto, los resultados obtenidos durante esta Tesis Doctoral nos han permitido identificar a la proteína Mrh1 como un nuevo interactor de la quinasa Kin4 y sugerir una nueva función de Mrh1 durante la división celular por mitosis, posiblemente participando en el control del posicionamiento y orientación del huso mitótico y la transmisión de estas señales al SPOC. Discusión 129 4.2. Papel de Cdc5 en el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los cuerpos polares del huso en Saccharomyces cerevisiae. Cdc5 es una proteína de S. cerevisiae que pertenece a la familia de proteínas Poloquinasa (Plks), altamente conservada desde levaduras hasta humanos. Las Plks son reguladores clave del ciclo celular en todos los organismos, ejerciendo múltiples funciones durante el ciclo. Las Plks están implicadas en la regulación de eventos como la entrada en mitosis, la segregación de los cromosomas y el mantenimiento de la integridad genómica, la organización de los MTOCs y la dinámica del huso mitótico, la salida de mitosis o la citocinesis (Lee et al., 2005; Archambault and Glover, 2009; Botchkarev and Haber, 2018). En esta Tesis Doctoral, hemos demostrado que Cdc5 también tiene un papel importante en el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los SPBs durante la división de S. cerevisiae. En determinadas células que se dividen asimétricamente, como es el caso de las levaduras de gemación, los MTOCs (SPBs y centrosomas) se distribuyen de forma no aleatoria entre ambas células resultantes de cada división (Pelletier and Yamashita, 2012; Lerit, Smyth and Rusan, 2013). En concreto, en S. cerevisiae, el SPB preexistente o viejo es heredado por la célula hija, mientras que el SPB nuevo es retenido en la madre (Pereira et al., 2001). Durante los últimos años, numerosos estudios han identificado diversos factores que intervienen en la regulación de esta herencia diferencial de los SPBs. Entre ellos, es especialmente importante el papel de distintos componentes de la maquinaria que permite el correcto posicionamiento del huso, y muy especialmente de la proteína Kar9, en este proceso. La distribución asimétrica de Kar9 entre ambos cuerpos polares es esencial para establecer la especificidad de los SPBs y la segregación diferencial de estas estructuras en función de su edad. La asociación específica de Kar9 con el SPB preexistente y el mantenimiento de esta asimetría dependen tanto de la ruta MEN (Hotz et al., 2012) como del SAC (Hotz, Lengefeld and Barral, 2012) y el SPIN (Lengefeld et al., 2017). Asimismo, los propios SPBs también ejercen un papel en la distribución diferencial de Kar9, y en la orientación del huso en función de su edad. En este sentido, se ha descrito que los componentes estructurales de la placa externa del SPB Nud1 (Hotz et al., 2012) y Spc72 (Juanes et al., 2013) son necesarios para el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los SPBs. Gracias a esta Tesis Doctoral hemos podido avanzar en el estudio de los mecanismos moleculares que regulan la herencia no aleatoria de los MTOCs del huso en levaduras de gemación. Nuestros resultados, concretamente, demuestran que la inhibición de la actividad quinasa de Cdc5 aleatoriza la segregación de los SPBs entre la madre y la gema. El estudio del papel que la Polo Discusión 130 quinasa juega en este proceso nos ha permitido proponer, además, que Cdc5 facilita la distribución asimétrica de los SPBs regulando la localización y actividad de dos proteínas clave: Spc72 y Kar9. Spc72 es un componente estructural de la placa externa del SPB que actúa como receptor del complejo γ-tubulina (γ-TuCR), mediando la nucleación de aMTs desde el cuerpo polar (Chen, Yin and Huffaker, 1998; Knop and Schiebel, 1998; Souès and Adams, 1998). La secuencia de esta proteína revela la presencia de un dominio de unión al PBD de Cdc5, así como dos sitios susceptibles de fosforilación por esta quinasa. De hecho, se ha demostrado que Spc72 es fosforilada por Cdc5 tanto in vivo como in vitro (Maekawa et al., 2007; Snead et al., 2007). Esta fosforilación tiene lugar específicamente en el contexto de los SPBs (Maekawa et al., 2007) y, además, es dependiente de ciclo celular, observándose sus mayores niveles en anafase tardía (Maekawa et al., 2007; Snead et al., 2007). Nuestros resultados indican que la inhibición del dominio catalítico de Cdc5 no impide su distribución en los SPBs, de acuerdo con estudios previos que ponían de manifiesto que para el reclutamiento de esta quinasa a los SPBs sólo es necesario un dominio PBD funcional (Song et al., 2000). Sin embargo, de forma interesante, en esta Tesis Doctoral hemos demostrado que la actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para un reclutamiento eficiente de nuevas moléculas de proteína Spc72 a los SPBs. Además, nuestros datos ponen de manifiesto que esta carga de Spc72 se promueve de forma específica a partir de la transición metafase-anafase. En G1, antes de que Cdc5 empiece a expresarse, el SPB preexistente ya posee proteína Spc72 en su cara externa, que es incorporada durante el ciclo celular previo. Una vez que los SPBs se duplican, Spc72 muestra una distribución asimétrica, acumulándose preferentemente en el SPB viejo orientado hacia la gema, hasta anafase (Juanes et al., 2013). Finalmente, en los últimos estadios de anafase, Spc72 se recluta en el SPB nuevo a unos niveles similares al cuerpo polar viejo, mostrando una localización simétrica entre ambos polos del huso. La distribución asimétrica inicial de Spc72 en los SPBs depende del fondo genético de las estirpes de levaduras estudiadas. Así, se ha observado que en las estirpes del fondo genético 15DaubA, Spc72 se carga diferencialmente en los SPBs en etapas tempranas de mitosis, con una mayor acumulación en el SPB preexistente (Juanes et al., 2013), al igual que ocurre en las estirpes pertenecientes al fondo genético W303 utilizadas en este Tesis Doctoral. Por el contrario, en células S288C, Spc72 se encuentra en cantidades similares en ambos SPBs justo después de su separación (Lengefeld et al., 2018). Esto sugiere que Spc72 puede estar regulado de forma distinta en función del fondo genético y el organismo. En este trabajo, por otro lado, hemos determinado que la proteína Polo-quinasa Cdc5 Discusión 131 regula, no solo la distribución asimétrica de Spc72 en las etapas iniciales del ciclo celular, sino también el reclutamiento de nueva proteína a ambos SPBs. La actividad de Cdc5 es necesaria durante la transición metafase-anafase para la carga de proteína tanto en el SPB viejo como en el nuevo y para que, por tanto, se alcance la simetría final de Spc72. Esta función de Cdc5 en el reclutamiento de Spc72 parece estar conservada evolutivamente, al observarse un papel similar de los homólogos de la Polo-quinasa en otras especies. Así, un estudio reciente ha demostrado que en la levadura Ogataea polymorpha, la depleción de la proteína Cdc5 conduce a una disminución en la cantidad de Spc72 cargado en los SPBs tanto en metafase como en anafase, mientras que su sobreexpresión causa una mayor acumulación de este componente en los cuerpos polares (Maekawa et al., 2017). A diferencia de S. cerevisiae, donde Spc72 muestra una asociación más estable con los SPBs, en O. polymorpha esta proteína se acumula en estas estructuras en etapas tempranas de la mitosis y se mantiene en niveles altos constantes en anafase, pero al salir del ciclo y en G1 estos niveles caen, deslocalizándose parte de la proteína (Maekawa et al., 2017). Si bien este estudio previo sugiere que Cdc5 es importante para el reclutamiento de Spc72 a los SPBs, en esta Tesis Doctoral profundizamos en esta función y demostramos, además, que la actividad quinasa de Cdc5 es específicamente necesaria para el control temporal de la carga de Spc72 a ambos SPBs. Este papel está apoyado por nuestros datos de BiFC que demuestran que Cdc5 interacciona in vivo con Spc72 en los SPBs preferentemente en la transición metafase-anafase, a pesar de que ambas proteínas colocalizan en los SPBs desde fase S y justo después de la separación de los cuerpos polares. Los datos de BiFC además son consistentes con la asociación de ambas proteínas mediante el PBD exclusivamente en mitosis (Snead et al., 2007). Más aún, esta interacción funcional entre Cdc5 y Spc72 está favorecida en el contexto del SPB viejo orientado hacia la hija, de acuerdo con la distribución asimétrica de Spc72. Spc72 es necesario para la nucleación y organización de los aMTs desde la placa externa del SPB a lo largo del ciclo, siendo el receptor del complejo γ-tubulina (Shaw et al., 1997; Knop and Schiebel, 1998; Pereira et al., 1999). A pesar de que cierta cantidad de proteína Spc72 recién sintetizada se incorpora tanto al SPB nuevo como al viejo ((Lengefeld et al., 2018) y nuestros resultados en esta Tesis), este γ-TuCR se carga mayoritariamente en los SPBs de manera conservativa, al igual que ocurre con Spc42 (Lengefeld et al., 2018). Debido a esto, el retraso en la incorporación de Spc72 al SPB nuevo hasta la transición metafase-anafase determina que dicho SPB posea una menor capacidad nucleadora de aMTs hasta etapas más tardías de mitosis. En esta situación, el SPB preexistente, con mayor cantidad de Spc72 y un complejo nucleador de aMTs Discusión 132 completamente maduro, emite más aMTs, lo que le confiere una ventaja funcional con respecto al SPB nuevo que determina un anclaje preferente del SPB viejo al córtex de la célula hija durante metafase (Juanes et al., 2013). De este modo, el reclutamiento asimétrico en los SPBs de Spc72 favorecido por Cdc5 media la asimetría de los aMTs que emanan de cada una de estas estructuras, confiriéndole una identidad y un destino diferente a cada SPB a lo largo del ciclo celular. Por otro lado, la distribución simétrica final de Spc72 impulsada por Cdc5 garantiza que, en el siguiente ciclo celular, cada célula posea un SPB preexistente con un complejo γ-tubulina totalmente funcional. La mayor nucleación de aMTs desde el SPB preexistente, de forma dependiente de la localización asimétrica de Spc72, está de acuerdo con estudios previos sobre la distribución de Tub4, un componente del complejo γ-tubulina (Knop and Schiebel, 1998; Lin, Neuner and Schiebel, 2015). Tub4 se encuentra en ambos SPBs, aunque inicialmente muestra una preferencia hacia el SPB preexistente. Posteriormente, una vez elongado el huso, Tub4 se localiza en ambos SPBs por igual (Juanes et al., 2013). Esta distribución es similar a la mostrada por Spc72, y de acuerdo con nuestro modelo, cabría esperar que pudiese depender también de la actividad quinasa de Cdc5, por lo que será objeto de estudio en el laboratorio en el futuro. Por otro lado, también sería interesante estudiar la dinámica de Stu2, una proteína de unión a los aMTs, implicada en la dinámica y nucleación de aMTs desde el SPB mediante su interacción con Spc72 (Chen, Yin and Huffaker, 1998; Kosco et al., 2001; Usui et al., 2003). Se ha descrito que Stu2 se une directamente al PBD de Cdc5 (Snead et al., 2007) y, además, se asocia con Kar9 (Miller, Cheng and Rose, 2000), por lo que podría estar implicada en la estabilidad y asimetría de los aMTs necesaria para la correcta segregación de los SPBs. Nuestros resultados, nos han permitido demostrar que Cdc5, además del reclutamiento de Spc72 a los SPBs, también juega un papel importante en la regulación de la función de Kar9 durante el establecimiento de la herencia no aleatoria de los SPBs. En concreto, nuestros resultados sugieren que la actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para mantener la carga específica de Kar9 en el SPB preexistente, contribuyendo de esta manera a la segregación de este cuerpo polar hacia la célula hija. Kar9 es una proteína clave en la regulación de la herencia diferencial de los SPBs entre la célula madre y la hija, que se ve facilitada por la distribución asimétrica de esta proteína en el SPB preexistente (Hotz et al., 2012; Juanes et al., 2013; Lengefeld et al., 2017). En S. cerevisiae, la localización asimétrica de Kar9 está controlada por procesos de fosforilación y sumoilación, los cuales median su reclutamiento, mantenimiento y descarga de los aMTs (Liakopoulos et al., 2003; Maekawa et al., 2003; Leisner et al., 2008; Hotz et al., 2012). La carga específica de Kar9 en el SPB preexistente permite Discusión 133 que los aMTs que emanan de este polo sean más estables y, además, facilita el anclaje de los mismos al córtex de la gema, favoreciendo así la segregación del SPB viejo hacia la célula hija. Nuestros datos sugieren que la actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para mantener la asimetría de Kar9 hacia el SPB preexistente a lo largo del ciclo celular y en las divisiones sucesivas. Así, Cdc5 podría mediar o promover modificaciones posttraduccionales de Kar9 a lo largo del ciclo que favorecieran su distribución asimétrica en los SPBs, de forma que la ausencia de actividad Polo-quinasa determinaría un defecto en la regulación post-traduccional de la proteína que se traduciría en errores en su localización y, por consiguiente, en la distribución asimétrica de los aMTs y su estabilidad. Otra posibilidad adicional, no excluyente con la anterior, es que Cdc5 pueda favorecer indirectamente la asociación de Kar9 con el SPB viejo gracias a la regulación de otros factores importantes para la distribución asimétrica de esta proteína. En este sentido, es importante mencionar que se ha descrito que los aMTs más largos orientados hacia la gema son capaces de reclutar mayor cantidad de Kar9, favoreciendo aún más la distribución asimétrica de esta proteína, y por consiguiente de los aMTs (Cepeda-García et al., 2010). Asimismo, la distribución asimétrica de Spc72 en los SPBs también favorece una capacidad nucleadora de aMTs mayor en el caso del SPB viejo que en el nuevo (Juanes et al., 2013). De forma interesante, nuestros resultados sobre el papel de Cdc5 en la regulación del reclutamiento secuencial de Spc72 a los SPBs indican que la actividad Polo-quinasa podría favorecer la carga de Kar9 específicamente en el SPB preexistente mediando la interacción de Spc72 y Kar9. En este sentido, es importante destacar que en este trabajo hemos demostrado que Spc72 es necesario para que Kar9 pueda cargarse tanto en los SPBs como en los aMTs y, además, mediante ensayos de BiFC, hemos verificado que la asociación preferente Cdc5 y Spc72 en el SPB preexistente orientado hacia la gema se ve comprometida en ausencia de actividad polo-quinasa. Estos datos están de acuerdo con la posibilidad de que Cdc5 medie la asociación de Kar9 a Spc72, favoreciendo así la carga asimétrica de Kar9 hacia el SPB viejo. El hecho de que nuestros datos indiquen adicionalmente que la ausencia de actividad Polo-quinasa determina un aumento del número de células en las que Spc72 y Kar9 se localizan en compartimentos celulares opuestos (hacia la célula madre o hacia la hija), también refuerza la hipótesis anterior. Finalmente, es importante señalar que todas estas evidencias ponen de manifiesto, de acuerdo con estudios previos (Juanes et al., 2013; Lengefeld et al., 2018), que la distribución asimétrica de Kar9 está regulada en parte por la naturaleza intrínseca de los propios SPBs que, de este modo, median así la propia especificación de su destino celular. Discusión 134 Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en conjunto durante este capítulo de la Tesis Doctoral, podemos proponer un modelo en el que Cdc5 está implicado en el establecimiento del patrón de herencia asimétrica de los SPBs actuando como un temporizador molecular que facilita la localización y la actividad tanto de Spc72 como de Kar9 durante el ciclo celular. De este modo, por un lado, la actividad quinasa de Polo regula el reclutamiento temporal y secuencial de Spc72 a los SPBs, mientras que también favorece de forma adicional la asociación específica de Kar9 al SPB viejo, contribuyendo así al mantenimiento de la distribución asimétrica de Kar9 entre ambos SPBs (Figura D1). El destino del cuerpo polar está determinado, en primer lugar, por la carga preferente de Spc72 en el SPB preexistente, lo cual permite que este SPB presente una capacidad nucleadora de aMTs mayor que el SPB nuevo. Además, estos aMTs que emanan del SPB preexistente son estabilizados gracias a la asociación específica de Kar9 con el cuerpo polar viejo, lo cual favorece su interacción con el córtex de la gema y, por consiguiente, la segregación del SPB prexistente hacia la célula hija (Juanes et al., 2013; Lengefeld et al., 2018). A pesar de que se ha demostrado la participación de cascadas de señalización tales como las rutas MEN y SPIN en la determinación del patrón de herencia de los SPBs a través de la regulación de la distribución asimétrica de Kar9 y de los aMTs (Hotz et al., 2012; Lengefeld et al., 2017), los componentes de estas rutas no median la especificación de la edad del SPB y su destino en base a la regulación del reclutamiento de Spc72, al menos en el fondo genético S288C (Lengefeld et al., 2018). Por tanto, nuestros datos resaltan la importancia fundamental de Cdc5 como regulador de la especificación de la identidad y destino de los SPBs durante mitosis, al actuar al mismo tiempo tanto sobre Spc72 como sobre Kar9. Adicionalmente, dado que la actividad Polo-quinasa es necesaria para la correcta asociación de Spc72 y Kar9, Cdc5 podría conferir la identidad del cuerpo polar modificando a Spc72 de tal manera que favorezca su interacción con Kar9. En el marco de esta Tesis Doctoral, hemos demostrado que la ausencia de SPC72 conduce a una aleatorización de la herencia de los SPBs. Este resultado es fácilmente explicable en base al papel de este componente estructural de los SPBs en la nucleación de aMTs. Estudios previos demuestran que la pérdida de Spc72 da lugar a unos aMTs mucho más cortos e inestables (Hoepfner et al., 2002), provocando así defectos en la orientación del huso mitótico, lo cual explicaría que el SPB nuevo pueda ser segregado incorrectamente hacia la célula hija. Asimismo, y de nuevo de acuerdo con nuestras observaciones, el hecho de que Spc72 sea necesario para la carga de Kar9 en los cuerpos polares y en los aMTs también contribuiría a explicar los problemas en la segregación del SPB viejo hacia la gema en ausencia de Spc72. Discusión 135 Figura D1. Modelo de regulación del establecimiento del patrón de herencia asimétrico de los SPBs por Cdc5 en S. cerevisiae. La actividad quinasa de Cdc5 es necesaria para el reclutamiento eficiente de Spc72 a los SPBs y para la asociación específica de Kar9 con el SPB preexistente, orientado hacia la gema. Estas asimetrías permiten la herencia no aleatoria del SPB viejo por la célula hija. La ausencia de actividad Polo-quinasa de Cdc5 conduce a defectos en el reclutamiento de Spc72 y en la distribución de Kar9, lo cual facilita la herencia aleatoria de los SPBs entre las dos células resultantes. Se ha descrito que la mutación de los dos sitios de Spc72 susceptibles de ser fosforilados por Cdc5 determina defectos en la unión de Spc72 con el PBD de Poloquinasa (Snead et al., 2007). Por tanto, será interesante estudiar en el futuro el efecto que tienen estas mutaciones en la herencia de los SPBs. Dado que la mutación de estos sitios en Spc72 impediría la fosforilación de esta proteína por Cdc5, nuestra predicción es que el fosfomutante de Spc72 debería mostrar defectos en su reclutamiento y distribución en los SPBs, al igual que ocurre en ausencia de la actividad Polo-quinasa. No obstante, también de acuerdo a nuestra hipótesis, es probable que la herencia de los SPBs no se viese tan afectada como tras la inhibición de la actividad de Cdc5. Dado el doble papel de esta quinasa en el establecimiento del patrón de segregación, regulando tanto a Spc72 como a Kar9, en este fosfomutante Kar9 podría seguir reclutándose al SPB viejo de forma eficiente. Además, la actividad quinasa de Cdc5 favorecería el mantenimiento de la asimetría de Kar9, contrarrestando así los defectos causados por la falta de fosforilación de Spc72. Finalmente, habría que tener en cuenta además que este fosfomutante muestra una unión residual a Cdc5 debido a la contribución de otros sitios de fosforilación de Spc72 y que, por otro lado, Cdc5 puede Discusión 136 asociarse con otros interactores de Spc72 (Snead et al., 2007), pudiendo ejercer adicionalmente una acción indirecta sobre la localización de esta proteína. Para reforzar nuestras conclusiones sobre el papel de la actividad quinasa de Cdc5 en el establecimiento del patrón de herencia de los SPBs, también sería interesante estudiar el efecto de mutaciones en el dominio PBD de Cdc5. Dicho dominio es necesario para la asociación de la Polo-quinasa con el SPB (Song et al., 2000; Park et al., 2008). Más aún, la interacción entre Spc72 y Cdc5 in vitro depende de un PBD funcional (Snead et al., 2007). Diversos estudios han descrito que los mutantes de Poloquinasa con un PBD no funcional son viables y que, además, en estas células Cdc5 no es capaz de localizarse en los SPBs (Chen and Weinreich, 2010; Ratsima et al., 2011). Por tanto, y de acuerdo con nuestra hipótesis, la predicción sería que estos mutantes deberían mostrar defectos en la herencia correcta de los SPBs similares a los obtenidos al bloquear químicamente la actividad quinasa de Polo. A pesar de que Cdc5 se sitúa en los dos SPBs inmediatamente tras su duplicación, nuestros resultados de BiFC muestran que su interacción con Spc72 está favorecida principalmente en el SPB orientado hacia la célula hija. Estos datos sugieren que deben existir otros factores que están participando junto con Polo-quinasa en la regulación de la localización asimétrica de Spc72 en los cuerpos polares, promoviendo la interacción preferente entre las dos proteínas en el SPB preexistente y, por tanto, facilitando la nucleación diferencial de aMTs y el destino del SPB hacia la célula hija. En este sentido, varios estudios previos han descrito que Spc72 es fosforilado en múltiples sitios, algunos de los cuales son independientes de la actividad de Cdc5, reforzando la idea de que puede existir otra proteína que fosforile a Spc72 y actúe de forma conjunta con Cdc5 regulando el reclutamiento de Spc72 a los SPBs (Snead et al., 2007; Maekawa et al., 2017). Un candidato posible es la quinasa Swe1, una proteína que participa en la especificación de la edad de los SPBs y su herencia no aleatoria, actuando específicamente en fase G1, etapa en la que marca al único SPB presente como el preexistente al empezar un nuevo ciclo celular (Lengefeld et al., 2017). Swe1 lleva a cabo esta función, en parte, mediante la fosforilación de Nud1, un componente de la placa externa del SPB que sirve como andamiaje para la unión de Spc72 al cuerpo polar (Lengefeld et al., 2017). Además, la interacción entre Spc72 y Nud1 está regulada a lo largo del ciclo mediante cambios en el estado de fosforilación de ambas proteínas, proceso en el que también está implicada la actividad quinasa de Polo (Gruneberg et al., 2000; Park et al., 2008; Lengefeld et al., 2017). De esta manera, la acción conjunta de Cdc5 y Swe1 podría favorecer la interacción entre Spc72, Cdc5 y Nud1 específicamente en el SPB preexistente y, por consiguiente, la asociación entre Spc72 Discusión 137 y Kar9 en este cuerpo polar, asegurando así una estricta regulación de la segregación de los SPBs. De acuerdo con esta idea, hemos observado que el patrón de interacción entre Polo-quinasa y Spc72 a lo largo del ciclo es similar al descrito previamente entre Nud1 y Swe1 (Lengefeld et al., 2017). Por otro lado, se ha descrito que Swe1 también es fosforilado por Polo-quinasa, lo que provoca su inhibición y degradación antes de la entrada en mitosis (Asano et al., 2005). Esta inactivación de Swe1 al inicio de mitosis asegura que el SPB nuevo no sea marcado como preexistente y que sólo el SPB viejo posea la marca de identidad que asegura la correcta herencia de estas estructuras (Lengefeld et al., 2017). Por tanto, también es posible que Cdc5 esté regulando la distribución diferencial de los SPBs adicionalmente mediante la inhibición de Swe1, manteniendo así la especificidad de los SPBs y facilitando que sólo uno de ellos sea identificado como el preexistente. Una vez establecida la marca de edad, Cdc5 favorecería el correcto reclutamiento de Spc72 y su asimetría inicial hacia el SPB marcado en G1 como preexistente por Swe1, favoreciendo en último término la correcta segregación del cuerpo polar viejo hacia la gema. El papel de Cdc5 en el establecimiento del patrón de herencia de los SPBs también podría estar regulado conjuntamente por la única CDK de S. cerevisiae, Cdc28. Se ha descrito que el complejo Cdc28-Clb4 está implicado en la asimetría de Kar9 mediante su fosforilación directa en el SPB retenido en la célula madre, favoreciendo específicamente la exclusión de Kar9 de esta estructura y su carga en el SPB preexistente (Liakopoulos et al., 2003; Maekawa et al., 2003; Maekawa and Schiebel, 2004; Moore and Miller, 2007). Además, distintos estudios han propuesto que ciertos sustratos de Cdc5 necesitan ser fosforilados previamente en su domino de unión a Polo, por medio de CDKs u otras quinasas, para poder ser fosforiladas posteriormente por la Polo-quinasa (Elia, Cantley and Yaffe, 2003). Estas evidencias sugieren que Cdc28- Clb4 podría fosforilar a Kar9, para que dicha proteína pueda ser posteriormente modificada post-traduccionalmente por Cdc5. La familia Polo-quinasa está altamente conservada durante la evolución, al igual que otras familias de proteínas que participan en la formación y dinámica del huso mitótico o en la biogénesis de los centrosomas, tales como las CDKs o la familia de Aurora quinasas. De igual forma, en determinadas divisiones asimétricas de organismos superiores también se han descrito patrones no aleatorios de herencia diferencial de los centrosomas. Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan estos procesos todavía no se conocen en profundidad, por lo que nuestros resultados podrían ser de ayuda para esclarecer estas cuestiones. De forma interesante, se ha propuesto que la actividad quinasa de POLO (el homólogo de Cdc5 en Drosophila) ejerce un papel en el Conclusiones 144 6. Materiales y métodos Materiales y métodos 146 Materiales y métodos 147 6.1. Organismos modelo. 6.1.1. Estirpes de Escherichia coli. Las cepas bacterianas usadas en esta Tesis Doctoral derivan de Escherichia coli DH5- α (f-endA1 gyrA96 hsdR17 ΔlacU169 f80lacZΔM15 recA1 relA1 supE44 thi1). 6.1.2. Estirpes de Saccharomyces cerevisiae. Todas las estirpes de levadura empleadas en este trabajo derivan del fondo genético W303 (ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1), y su genotipo concreto se detalla en la Tabla M1. 6.2. Plásmidos. Los plásmidos utilizados en esta Tesis se indican en la Tabla M2. Para la clonación y propagación de fragmentos de ADN se usaron de forma general los plásmidos de la serie pRS, descritos en (Sikorski and Hieter, 1989). La amplificación de fragmentos de ADN para el etiquetado o deleción de genes por recombinación homóloga se llevó a cabo usando los plásmidos descritos en (Longtine et al., 1998; Janke et al., 2004; Sheff and Thorn, 2004). Las estirpes utilizadas en los ensayos de BiFC fueron construidas a partir de los plásmidos descritos en (Sung and Huh, 2007). 6.3. Reactivos químicos. 6.3.1. Antibióticos.  Ampicilina (Amp, Sigma): antibiótico -lactámico que impide la síntesis de la pared celular de bacterias durante la división celular de E. coli. Se utilizó a una concentración de 100 g/ml para seleccionar bacterias portadoras de plásmidos con resistencia a este antibiótico.  Geneticina (G418, Phytotechnology Laboratories): antibiótico aminoglicosídico inhibidor de la síntesis de proteínas. Se utilizó a una concentración de 250 g/ml para seleccionar cepas de S. cerevisiae resistentes a este antibiótico. Materiales y métodos 148  Nourseotricina (clonNAT, Werner BioAgents): antibiótico aminoglucosídico procedente de Streptomyces noursei. Se usó a una concentración de 100 g/ml para seleccionar estirpes de S. cerevisiae portadoras de un gen de resistencia a nourseotricina. 6.3.2. Drogas e inhibidores.  Benomilo (Sigma): droga desestabilizadora de microtúbulos, usada en medio sólido a una concentración variable a partir de una solución stock de 10 mg/ml en DMSO.  CMK-C1: análogo del ATP que se une al sitio activo de la quinasa Cdc5-as1 inhibiendo su actividad. Se usó a una concentración de 5 M en medio líquido y a 10 µM en medio sólido (Snead et al., 2007).  Cóctel completo de inhibidores de proteasas (Complete Protease Inhibitor Cocktail, Roche): mezcla compuesta por inhibidores de proteasas de serina (tripsina y quimiotripsinas), cisteína y un amplio rango de metaloproteasas.  Ditiotreitol (DTT, Sigma): compuesto reductor de puentes disulfuro de proteínas que poseen grupos sulfhidrilos libres.  Factor alfa (factor α) (Sigma y ProteoGenix): feromona secretada por las cepas de sexo MATα de S. cerevisiae durante la conjugación. Se usó a una concentración final de 5 μg/ml en medio líquido (a partir de una solución stock de 5 mg/ml en DMSO) para bloquear las células MATa de levadura en fase G1.  Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma): inhibidor de proteasas de serina (tripsina y quimiotripsinas) y cisteína.  IAA (ácido 3 indol-acético, Sigma): auxina natural. Se usó a una concentración de 500 µM (disuelta en etanol) para degradar las proteínas fusionadas al epítopo AID.  Nocodazol (Sigma): agente despolimerizador de microtúbulos. Se usó en medio líquido a 15 g/ml a partir de una solución stock de 1,5 mg/ml en DMSO. 6.3.3. Enzimas.  Polimerasas termoestables de ADN: o GoTaq (Promega): ADN polimerasa usada principalmente para realizar PCRs de comprobación. Materiales y métodos 149 o Mytaq (Bioline): ADN polimerasa usada para realizar PCRs de comprobación. o ExTaq (Takara): ADN polimerasa de alta fidelidad y procesividad, capaz de amplificar fragmentos incluso de 20 kb. Debido a sus características, se usó principalmente para la obtención de fragmentos lineales de ADN para ser integrados en el ADN genómico de la levadura. o Velocity (Bioline): ADN polimerasa de amplificación rápida y alta fidelidad y procesividad, capaz de amplificar fragmentos de más de 5 kb y con regiones ricas en GC. Debido a sus características, se usó principalmente para la clonación de fragmentos y obtención de fragmentos lineales para ser integrados en el ADN genómico.  Enzimas de restricción (Takara/NEB): endonucleasas de ADN de doble cadena específicas de secuencia.  Ligasa de ADN del fago T4 (Roche): enzima encargada de catalizar la unión covalente de extremos lineales de ADN bicatenario.  Zimoliasa 20T y 100T (US Biological): mezcla de enzimas de Artrobacter luteus con capacidad de digerir la pared celular de S. cerevisiae. La zimoliasa 20T tiene una actividad lítica de 20000 U/g y la zimoliasa 100T de 100000 U/g. Ambas se prepararon a una concentración de 10 mg/ml en sorbitol 1 M.  Glusolasa (PerkinElmer): mezcla de enzimas de Helix pomatia con capacidad de digerir la pared celular de S. cerevisiae.  RNAasa A (Roche): endorribonucleasa específica de pirimidina que actúa sobre ARN de cadena sencilla.  Fosfatasa alcalina de ADN (Roche): glicoproteína dimérica de intestino bovino empleada para eliminar los grupos fosfatos de los extremos 5´ del ADN bicatenario. 6.3.4. Tampones y soluciones.  Tampón TE: 50 mM TrisHCl (pH = 7,5), 1 mM EDTA (pH = 8).  Tampón TAE: 0,04 M Tris-Acetato, 1 mM EDTA (pH = 8).  Tampón de rotura de ADN: para 100 ml: 2 ml Tritón TX100, 5 ml SDS 20%, 2 ml NaCl 5 M, 1 ml Tris 1 M (pH = 8), 200 l EDTA 0,5 M, 90 ml H2O MiliQ.  Solución TRAFO: 240 μl PEG al 50%, 36 μl acetato de litio 1 M, 10 μl esperma de salmón (2 mg/ml), 8-20 μl ADN, 66 μl H2O MiliQ por cada reacción de transformación de S. cerevisiae. Materiales y métodos 150  Solución I miniprep: 25 mM Tris-HCl, 50 mM glucosa, 10 mM EDTA (pH = 8).  Solución II miniprep: 200 mM NaOH, 1% SDS.  Solución III miniprep: para 100 ml: 25 g KAc, ajustar con ácido acético glacial hasta pH = 4,8, H2O MiliQ hasta 100 ml.  Tampón K2HPO4 1M: para 1 l: 174,18 g K2HPO4, H20 MiliQ hasta 1 l.  Tampón KH2PO4 1M: para 1 l: 136,09 g K2HPO4, H20 MiliQ hasta 1 l.  Tampón KPi 0,1M (pH = 6,4): para 1 l: 27,8 ml K2HPO4 1 M, 72,2 ml KH2PO4 1 M, H20 MiliQ hasta 1 l.  Tampón KPi 0,1M (pH = 6,6): para 1 l: 38,1 ml K2HPO4 1 M, 61,9 ml KH2PO4 1 M, H20 MiliQ hasta 1 l.  Tampón KPi 0,1M (pH = 7,4): para 1 l: 80,2 ml K2HPO4 1 M, 19,8 ml KH2PO4 1 M, H20 MiliQ hasta 1 l.  Sorbitol-citrato 1,2M: para 1 l: 17,42 g K2HPO4, 7 g ácido cítrico, 218,64 g sorbitol, H20 MiliQ hasta 1 l.  PBS 1x: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4.  PBS+T: PBS 1x suplementado con 0,1% Tween 20.  TBS 1x: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 25 mM Tris base (pH = 7,4).  TBS-T: TBS 1x suplementado con 0,1% Tween 20.  PBS-BSA: 0,04 M K2HPO4, 0,01 M KH2PO4, 0,15 M NaCl, 1% BSA, 0,1% azida sódica.  Tampón de rotura de proteínas: para 1 ml: 966,25 l tampón TE, 2,75 l DTT 1 M, 11 l PMSF 100 mM, 20 l cóctel de inhibidores de proteasas.  Tampón 3xSDS: para 50 ml: 18,75 ml Tris-HCl 0,5 M (pH = 6,8), 3 ml - mercaptoetanol, 15 ml glicerol, 4,5 g SDS, 0,025 g azul de bromofenol, H20 MiliQ hasta 50 ml.  Tampón de electroforesis de proteínas 5x: para 1 l: 15 g Tris Base, 72 g glicina, 25 ml SDS 20%, H2O MiliQ hasta 1 l.  Tampón de transferencia 5x: para 1 l: 15 g Tris Base, 72 g glicina, 5 ml SDS 20%, H2O MiliQ hasta 1 l.  Tampón PA: 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2 (pH = 9)  Ponceau S: para 300 ml: 1,4 g Ponceau S, 9 g TCA, 3 ml ácido acético, H2O MiliQ hasta 300 ml.  Coomassie: para 500 ml: 250 ml metanol, 50 ml ácido acético glacial, 1,25 g Coomassie Blue G-250 (Sigma), H20 MiliQ hasta 500 ml. Filtrar con papel Whatman antes de usar. Materiales y métodos 151  Solución de digestión (para inmunofluorescencia): 200 μl Sorbitol-Citrato 1,2 M, 20 μl glusolasa, 2 μl zimoliasa 100T.  Medio montaje con DAPI: para 100 ml: 100 mg p-fenildiamina, 400 µl K2HPO4 1 M, 100 l KH2PO4 1 M, 1,5 ml NaCl 1 M, 90 ml glicerol, 500 l DAPI 10 g/ml, ajustar (pH = 8), H2O MiliQ hasta 100 ml.  Tampón de lisis para inmunoprecipitación de proteínas: 50 mM Tris-HCl (pH = 7,4), 250 mM NaCl, 10% glicerol, 10 mM EDTA (pH = 8), 0,5 mM PMSF, 1 mM de DTT e inhibidores de proteasas 1x (COMPLETE EDTA FREE, Roche).  Tampón de solubilización TX100 0,5% para inmunoprecipitación de proteínas: 50 mM Tris-HCl (pH = 7,4), 250 mM NaCl, 10% glicerol, 10 mM EDTA (pH = 8), 0,5% Tritón TX100, 0,5 mM PMSF e inhibidores de proteasas 1x.  Tampón de lavado para inmunoprecipitación de proteínas: 50 mM Tris-HCl (pH = 7,4), 250 mM NaCl, 10% glicerol, 10 mM EDTA (pH = 8), 0,1% Tritón TX100, 0,5 mM PMSF e inhibidores de proteasas 1x. 6.4. Medios de cultivo. 6.4.1. Medios de cultivo para bacterias.  Medio rico LB (Luria-Bertani): 0,5% extracto de levadura, 1% bacto-triptona, 1% NaCl, disueltos en H2O MiliQ. El medio sólido se preparó añadiendo agar al 2%. Los medios se autoclavaron para su uso. 6.4.2. Medios de cultivo para levaduras. Todos los medios de cultivo se prepararon con H2O MiliQ y fueron autoclavados antes de su uso. Los medios sólidos contenían, además, agar al 2%. La composición de cada medio es la siguiente:  Medio rico YPAD: 1% extracto de levadura, 2% bacto-peptona, 2% glucosa, 20 mg/ml adenina.  Medio rico YPAGal: 1% extracto de levadura, 2% bacto-peptona, 2% galactosa, 20 mg/ml adenina.  Medio rico YPARaf: 1% extracto de levadura, 2% bacto-peptona, 2% rafinosa, 20 mg/ml adenina. Materiales y métodos 152  Medio rico YPARaf/Gal: 1% extracto de levadura, 2% bacto-peptona, 2% rafinosa, 2% galactosa, 20 mg/ml adenina.  Medio de lavado YP: 1% extracto de levadura, 2% bacto-peptona.  Medio mínimo S: 0,17% YNB (base nitrogenada de levadura), 0,5% sulfato amónico, 0,18% Drop-out mix (mezcla de requerimientos en las siguientes proporciones: alanina 1x, arginina 1x, asparragina 1x, ácido aspártico 1x, cisteína 1x, glutamina 1x, ácido glutámico 1x, glicina 1x, inositol 1x, isoleucina 1x, lisina 1x, fenilalanina 1x, prolina 1x, serina 1x, treonina 1x, tirosina 1x, valina 1x, adenina 0,25x).  Medio mínimo SD: 0,17% YNB (base nitrogenada de levadura), 0,5% sulfato amónico, 0,18% Drop-out mix, 2% glucosa.  Medio mínimo S-Gal: 0,17% YNB (base nitrogenada de levadura), 0,5% sulfato amónico, 0,18% Drop-out mix, 2% galactosa.  Medio mínimo S-Raf: 0,17% YNB (base nitrogenada de levadura), 0,5% sulfato amónico, 0,18% Drop-out mix, 2% rafinosa.  Medio mínimo S-Raf/Gal: 0,17% YNB (base nitrogenada de levadura), 0,5% sulfato amónico, 0,18% Drop-out mix, 2% rafinosa, 2% galactosa.  Medio mínimo SC: medio SD suplementado con los aminoácidos triptófano (0,002%), histidina (0,002%), leucina (0,012%), metionina (0,002%), lisina (0,003%) y con las bases nitrogenadas uracilo (0,002%) y adenina (0,002%).  Medio de esporulación SPO: 1% acetato potásico, 0,1% extracto de levadura, 0,05% glucosa, suplementado con 0,03% de mezcla de requerimientos y los aminoácidos triptófano (0,0005%), histidina (0,0005%), leucina (0,003%), metionina (0,0005%) y la base nitrogenada uracilo (0,0005%). 6.5. Conservación de cepas bacterianas y estirpes de levadura. 6.5.1. Conservación de cepas bacterianas. Para su conservación, las cepas bacterianas se cultivaban durante toda la noche en medio LB líquido suplementado con antibiótico (ampicilina o kanamicina, en función del gen de resistencia portado). Al día siguiente, las células se resuspendían en glicerol al 20% en viales de congelación y se mantenían a -80°C. Materiales y métodos 153 6.5.2. Conservación de estirpes de levadura. Para su conservación, las estirpes de levadura se guardaban a partir de biomasa crecida en placa. Dichas células se resuspendían en glicerol al 20% en viales de congelación y se almacenaban a -80°C. 6.6. Técnicas básicas de biología molecular. 6.6.1. Extracción de ácidos nucleicos. 6.6.1.1. Extracción de ADN plasmídico de Escherichia coli (miniprep). Para la extracción de ADN plasmídico de bacterias se empleó un método basado en la lisis alcalina. En detalle, se inoculaba una colonia de E. coli en 3 ml de medio LB con antibiótico durante toda la noche en agitación a 37°C. Posteriormente, se recogía el cultivo mediante centrifugación y las células se resuspendían en 100 µl de Solución I fría. A continuación, se añadían 200 µl de Solución II preparada en el momento, invirtiendo el tubo varias veces para provocar la lisis celular. Por último, se adicionaban 150 µl de Solución III fría, se mezclaba por inversión y se incubaba durante 5-10 minutos en hielo. Pasado este tiempo, la muestra se centrifugaba 15 minutos a 13000 g y 4°C, el sobrenadante se transfería a un tubo con 1 ml de etanol absoluto (Emsure) frío y se almacenaba a -20°C durante al menos 2 horas para precipitar el ADN. Una vez precipitada, la muestra se centrifugaba de nuevo 15 minutos a 13000 g y 4°C. El pellet se dejaba secar completamente y, a continuación, se resuspendía en agua MiliQ y se conservaba a -20°C. 6.6.1.2. Extracción de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae. Para la extracción de ADN genómico de levaduras se disolvía biomasa de la estirpe deseada en 500 l de tampón TE, se centrifugaba durante 1 minuto a 13000 g y el precipitado se resuspendía en 250 l de tampón de rotura de ADN, 250 l de fenolcloroformo (Sigma) y un volumen aproximadamente igual de bolas de vidrio (Sigma). Las muestras se agitaban a máxima velocidad en un vórtex durante 15-30 minutos a 4ºC y posteriormente se centrifugaban 15 minutos a 13000 g a temperatura ambiente, separándose así la fase acuosa de la fase fenólica. La fase acuosa se transfería a 1 ml de etanol absoluto frío y se incubaba a -20ºC durante al menos 2 horas para precipitar