Redescripción de Trichuris ovis (Nematoda) (Abildgaard, 1795) parásito de Ovis aries (Linné, 1758) y Capra hircus...

77 Redescripción de Trichuris ovis (Nematoda) (Abildgaard, 1795) parásito de Ovis aries (Linné, 1758) y Capra hircus (Linné, 1758). Oliveros, R. & Cutillas, C. Departamento de Pa rasitologí a. Facultad de Farmacia. 41012 Sevi ll a. España. Received: 13.02.2003 Accepted: 15 . 12.2003 Resumen: Los estudios taxonómicos previos ll evados a cabo en el género Trichuris. confirman la s in on imi a de Trichuris avis (Abildgaard, 1795) y Trichuris glabulasa (Von L in stow, 1901), aceptándose como única especie válida a Trichuris avis (Abildgaard, 1795). Es por ello que hemos querido rea li zar una redescripción de esta especie parásita de ovinos, teniendo en cuenta las caracte rí sticas morfológicas y biométricas citadas hasta el momento en la bibliografía consultada, incluyendo aquellos datos isoenzimáricos y moleculares característicos para esta especie. Palabras clave: Trichuris avis, redescr ip ción Abstract: The synonymy of Trichuris avis (Abildgaard, 1795) and Trichuris glabulasa (Vo n Linstow, 1901), has been confirmed by previous studies, a nd Thchuris avis (Abi ld gaard, 1795) has been accepted as the unique valid species. A redescription of Trichuris avis has been carried out, attending to the morphological and biometricaJ characteristics cited by different authors. Futihermore, isoenzyma ti c and molecular data for T. ovis have been included. Key words: Trichuris avis, redescription 1. Introducción Los nematodes representan un grupo cosmopolita de organismos que ocupan prácticamente todo tipo de hábitat s. Muchas especies son parásitos obligados de animales y plantas, causando una gran variedad de problemas patológicos. La importancia económica de las infecciones por nematodes en la agricultura, veterinaria, así como en la medicina humana, ha dado lugar a un historial de investigación experimental muy amplio. Estas investigaciones, tradicionalmente, han tenido como principal objetivo el solucionar problemas tanto en la prevención de e nf ermedades, como en el tratamiento de los hospedadores infectados. Pero, para el desarrollo de vacunas, así como para el desarrollo de métodos de diagnóstico, es crucial tanto el conocimiento preciso de la Corresponding author: Dra. Cri stina Cutillas Departamento de Parasitología. Facultad de Fal mac i a. Prof. García Gonz ál ez s/ n. 4 101 2 Sevilla. España. Teléfono: +34 954 556773; Fa x: + 34 954 6281 62 E -m a il: [email protected] Revista Ibérica de Parasitología (2003),63(3 -4 ),77-83 identid ad de un parásito como el rango de variación en un grupo parásito en particul ar. Los helmintos representan un grupo caracterizado por una gran variabilidad fenotípica. En ocasiones muchos de los caracteres externos diferenciales desaparecen cuando entre ellos hay un estrecho parentesco, o al menos no han sido determinados, causando regularmente problemas taxonómicos. La morfología general externa de un parásito aporta la fuente más inmediata y evidente de comparación entre especies. Sin embargo, la influencia de los ho spedadores puede dar como resultado un gusano con distintas dimensiones morfológicas. La diferenciación entre los individuos de algunas especies de Trichuris resulta difícil y han sido muchos los autores que han tratado de discernir las especies de este género basándose en datos estrictamente morfológicos y biométricos. La caracterización específica del género Trichuris basada en criterios morfológicos y biométricos presenta serios problemas debido al © 2003 Sociedad Española de Parasitología (SEP) 78 Olivero, R. & Cutillas, c., Redescripción de Trichuris avis. solapamiento de los distintos parámetros utilizados con carácter diferencial. En la actualidad, estos estudios morfológicos y biométricos clásicos se han visto complementados con estudios de tipo genético y molecular (Oliveros et al., 2002). La aceptación como especies sinónimas de Trichuris ovis (Abildgaard, 1795) y Trichuris globulosa (Van Linstow, 1901) Y por lo tanto la consideración de Trichuris ovis como única especie válida (Oliveros et al., 2002), justifica la redescripción de esta especie englobando los datos morfológicos y biométricos obtenidos por diversos autores (Barus et al. , 1977; Barus et al., 1978; Tenora et al. , 1988; Spakulová, 1994), junto a los resultados genéticos y moleculares obtenidos por nuestro equipo (Cutillas et al., 1995; 1996; Oliveros et al. , 2000). 2. Redescripción Los datos biométricos expuestos en el presente trabajo han sido determinados teniendo en cuenta los resultados obtenidos por nuestro equipo (Cutillas et al., 1995) y su posterior comparación con los obtenidos por otros autores (Sprehn, 1927; Chandler, 1930; López Neyra, 1947; Noda, 1955; Skrjabin el al., 1957; Sarwar, 1959; Knight, 1971; Martínez Gómez et al ., 1973; Barus et al., 1977; Knight, 1984; Tenora et al., 1988; Rickard y Bishop, 1991; Spakulová, 1994; Lanfredi et al., 1995; Cutillas et al., 1995; Tenora et al ., 1997). 2. 1. Descripción morfológica de Trichuris ovis. Trichuris ovis es un nematode tricúrido parásito de Ovis aries y Capra hircus. Es un parásito cosmopolita, que se encuentra parasitando el ciego del hospedador. Presenta el cuerpo dividido en dos partes: una porción anterior, larga y delgada, donde se localizan bandas bacilares laterales, y una porción posterior conteniendo los órganos reproductores. La porción anterior del cuerpo es más de dos veces la longitud de la porción posterior. La cutícula aparece estriada transversalmente, existiendo una separación entre estrías de 0'004-0'058 mm. en la porción posterior del cuerpo, y de 0'006- 0'009 mm. en la porción anterior del cuerpo. a) Macho de Trichuris ovis Las características biométricas que definen a los machos de Trichuris ovis quedan reflejadas en la Tabla 1. Tabla 1. Datos biométricos obtenidos para Tr ichuris avis aislado de Ovis aries y Capra hircus. Todas las medidas están en mm. Rango Longitud total cuerpo 45-85 Diámetro del cuerpo 0'57-0'71 Longitud 9- 23 Porción posterior Diámetro 0'63 Porción anterior Longitud 25-65 Diámetro 0'17 Longitud espicular Longitud 4'48-6' 90 Diámetro 0'0 8 -0 ' 10 Separación estrías Porción posterior 0'004-0'058 Porción anterior 0' 00 6 -0 '0 09 Longitud canal eyaculador 5'40-10 '80 Rango Longitud total 32-87 Diámetro del cuerpo 0'07-0'09 Porción posterior 7 -21 Porción anterior 3 1- 71 El macho de Trichuris ovis presenta una longitud total de 45- 85 mm. por 0'57-0' 71 mm. de anchura. La longitud de la porción posterior del cuerpo es de 9-23 mm., con 0' 63 mm. de diámetro, y la porción anterior del cuerpo es de 25- 65 mm. de longitud por O' 17 mm. de diámetro. La parte posterior del cuerpo aparece curvada ventralmente. El canal eyaculador aparece como un órgano fuertemente muscular con una longitud de 5'40-10'80 mm. El ano y la apertura cloacal se localizan en el extremo posterior del cuerpo. La cloaca es pequeña, muscular y de forma redondeada, menos prominente que el canal eyaculador. La unión del conducto espermático y la vesícula seminal tiene lugar próximo a la unión del esófago y el intestino. El testículo aparece recto a lo largo del canal eyaculador y retorcido a lo largo de la vesícula seminal. La espícula es puntiaguda, con una longitud de 4'48-6'90 mm. y una anchura de 0 '8 -0' 10 mm. Olivero, R. & Cutillas, C., Redescripción de Trichuris avis. 79 Figura l. Distintos aspectos de la espícula y vaina espicular del macho de T avis. a. Detalle de las espinas en el bulbo; b y f. Vaina espicular tubular y cilíndrica; c y e. Vaina espicular con expansión esférica en el extremo distal; d. Detalle de las espinas en la zona tubular. Rodeando a la espícula, frecuentemente evaginada, se encuentra la vaina espicular (Fig. 1). La vaina espicular de los individuos de T avis aparece cubierta por tres tipos distintos de espinas, de distinta medida y forma. Esta vaina espicular puede presentarse bajo distintos aspectos: 1. Vaina espicular con una expansión esférica en el extremo distal que puede aparecer más o menos redondeada o acampanada. Cuando aparece totalmente evaginada, mide entre 0'98-1 '25 mm., y presenta una expansión distal. En esta zona, las espinas aparecen largas y densamente distribuidas (Fig. la). 2. En individuos de menor tamaño, esta vaina espicular aparece en forma tubular y cilíndrica (Fig. 1 b Y f), con espinas más regulares y triangulares, y menos densas. b) Hembra de Trichuris avis Las características biométricas que definen a las hembras de Trichuris avis quedan reflejadas en la Tabla 1. La longitud total de la hembra de Trichuris avis es de 32-87 mm. por un ancho máximo de 0'07-0'09 mm. La longitud de la porción anterior del cuerpo es de 31-71 mm. y de la porción posterior es de 7-21 mm. La vulva se abre cerca de la unión de la zona anterior y posterior del cuerpo, observándose una dilatación del cuerpo, y la cutícula aparece lisa y uniforme, perdiendo su peculiar estriación. La vagina es corta y musculosa, uniformemente curvada, con una expansión gradual de sus paredes en la zona posterior. La vulva aparece generalmente eveliida, (Fig. 2b Y 2d), aunque en ejemplares más pequeños y no totalmente maduros (formas jóvenes) en los que la vagina es más corta se ha observado que la vulva aparece no evertida, no formando prominencia sobre la superficie del cuerpo, apareciendo en estos casos redondeada y circular, rodeada por una cutícula lisa o con estriaciones transversales finas (Fig. 2a). Se sitúa a 0'09-0'19 mm. del extremo posterior del esófago y presenta espinas anchas en forma de papilas. Estas espinas no presentan un orden definido, ni formando hileras regulares como ocurre en la vaina espicular del macho. 2.2 Caracterización isaenzimática de Trichuris avis El estudio isoenzimático de la Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PD), Glucosa fosfato isomerasa (GPI), Lactato deshidrogenasa (LDH) y Malato deshidrogenasa (MDH) de Trichuris avis ha 80 Olivero, R. & Cutillas, C., Redescripción de Trichuris avis. e Figura 2.- Distintos aspectos de la vulva de la hembra de T. avis. a y c. Vulva no evertida; b y d. Vulva evertida. sido realizado por Cutillas et al . (1995); el estudio de la enzima Málico (ME) de Trichuris ovis ha sido realizado por Cutillas et al. (1996) y de la Superóxido dismutasa (SOD) por Oliveros et al. (1998) . El patrón isoenzimático observado tanto en machos como en hembras de T ovis ha demostrado la existencia de un patrón idéntico para los enzimas estudiados (G6PD: E. C. 1.1.1.49; GPl: E.C. 5.3.1.9; LDH: E. C. 1.1.1.27; MDH: E.C. 1.1.1.37; ME: E.C. 1.1.1.40; SOD: E.C.1.15.1.1) (Cutillas et al., 1995; 1996; Oliveros et al., 1998). Los estudios electroforéticos llevados a cabo por estos autores en distintos individuos de T ovis han demostrado la existencia de un único fenotipo basado en la presencia de una banda anódica simple de migración rápida en el patrón isoenzimático de la G6PD, ME Y GPI, mientras que la actividad de la SOD mostró un solo fenotipo, caracterizado por la presencia de dos bandas de migración anódica. Por otra parte, el patrón isoenzimático de la LDH y MDH para T ovis se caracterizó por la existencia de tres fenotipos distintos. 2.3 Caracterización molecular de Trichuris ovis El estudio molecular del ADN genómico de Trichuris ovis, mediante la amplificación por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) del Espaciador Interno Transcrito 2 (ITS2), ha sido descrito en Oliveros et al. (2000). El estudio molecular, del ITS2 del ADN genómico de T ovis, mediante la PCR, reveló un único producto de 454 nucleótidos aproximadamente (Oliveros et al., 2000) (Fig. 3). Este producto de PCR, fácilmente observable en un gel de agarosa, nos permite diferenciarlo de los productos obtenidos para otras especies de Trichuris, como T suis, que presenta un producto de PCR de mayor tamaño. Tras la secuenciación de este producto, se determinó que este tamaño se correspondía con 407 pares de bases pertenecientes al ITS2, más 47 pares de bases pertenecientes al final 5' del gen 28S del ADN ribosómico (ADNr). El estudio de secuencias del ITS2 en distintas especies del género Trichuris confirman el gran valor diagnóstico, observado en otras especies de nematodes, de este espaciador ribosómico, habiéndose encontrado enzimas de restricción características para cada una de las especies de Trichuris ensayadas (Oliveros et al., 2000). Así, en T ovis se ha observado que presenta sitio de restricción para la enzima Msp 1, en posiciones 119, 142 Y 339, originando fragmentos característicos para Olivero, R. & Cutillas, c., Redescripción de Trichuris avis. 81 M 603pb a. b. j ENZIMAS DE RESTRICCi ÓN 58 119 339 364 T. ovis (407 pb) c. Alu Msp Msp Figura 3. a. Producto de PCR (M: Marcador de peso molecular); b. secuencia consenso de nuc!eótidos del TTS2 para Trichuris avis; c. Enzimas de restricción específicas para T avis. La secuencia del ITS2 de T avis ha quedado depositada en el EMBL, GenBank (número de acceso: AJ238220). esta especie. Algo parecido ocurre con la enzima Alu 1, que corta en T avis en posiciones 58 y 364, dando lugar a fragmentos de restricción característicos (Fig. 3). 3. Discusión La identificación específica de muchos helmintos parásitos constituye un gran problema, bien porque sus ciclos de vida, a veces complejos, dan origen a una serie de formas larvarias y adultas distintas que complican el establecimiento de relaciones entre diferentes estados de desarrollo de las diversas especies, o bien, porque entre las muchas especies de nematodes descritas pueden existir sinonimias, debido a que reflejan la aceptación de una especie nueva sólo por el hecho de haber sido encontrada en un hospedador distinto al habitual. Este hecho ha sido sugerido por Knight (1984) para las especies del género Trichuris. Las técnicas isoenzimáticas han sido aplicadas satisfactoriamente para la identificación de géneros y cepas de muchos helmintos parásitos, incluyendo cestodes (McManus y Smyth, 1979; Fukumoto et al., 1987; Lymbery y Thompson, 1988; Andrews et al., 1989; Novak et al., 1989; Paggi et al ., 1991). Estudios más recientes combinan trabajos morfológicos y bioquímicos (De Vos et al., 1990; Reversat et al., 1991; Snábel et al ., 1994). La aplicación de técnicas electroforéticas al estudio del género Trichuris permitió a Hermoso et al. (1983) realizar un estudio comparativo de T suis y T avis por electroforesis de enzimas, evidenciándose claras diferencias en las propiedades electroforéticas en las enzimas de ambas especies. La comparación del patrón isoenzimático de T avis, T suis y T skrjabini (Hermoso et al., 1983; Cutillas et al., 1995; 1996; Oliveros et al., 1998) confirma la utilidad de esta técnica como herramienta diagnóstica en la diferenciación de las especies de Trichuris. Asimismo, el uso de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de secuencias del ADNr se ha llevado a cabo en un amplio rango de organismos, incluyendo trematodes (Adlard et al., 1993; Luton et al., 1992), cestodes (Gasser y Chilton, 1995) y nematodes (Campbell et al., 1995; Hoste et al., 1995) . El ADNr ha demostrado ser una herramienta de gran valor para definir marcadores en la identificación de parásitos. En estudios previos se ha demostrado la utilidad del ITS2 del ADNr en estudios de sistemática de diferentes familias de nematodes parásitos como Cloaciniidae (Chilton et al., 1995), Strongyliidae (Campbell et al., 1995; Hung et al., 1996), y Chabertidae (Romstad et al., 1997). Asimismo, recientes estudios realizados incluyendo el espaciador interno transcrito 1 (ITS 1) del ADNr indican la gran utilidad en taxonomía o el diagnóstico de nematodes, como ha sido demostrado en cestodes, trematodes e insectos (Bowles et al., 1995; Porter y Collins, 1991; Wesson et al., 1992; Morgan y Blair, 1995; Goggin y Newman, 1966; Luton et al., 1992; Kane y Rollinson, 1994). En 1989, Sugane et al. utilizaron el análisis mediante RFLP (fragmentos de restricción) para distinguir claramente entre los distintos tipos de larvas encontradas en la subfamilia Anisakinae (larva tipo I y tipo II). Este mismo año, Beh et al. utilizaron patrones de fragmentos de restricción para la identificación de especies de nematodes parásitos de ovejas como Haemanchus cantartus, Ostertagia circumcincta y Trichastrangylus calubrifarmis, observándose unas bandas que eran comunes a todas las especies, y otras que eran especie-específica, cuando la digestión se producía con Eco Rl, lo que confirma su utilidad diagnóstica. 82 Olivero, R. & Cutillas, C., Redescripción de Trichuris avis. En nuestro caso, los resultados obtenidos mediante amplificación y posterior secuenciación del ITS2 de T avis confirman el carácter diagnóstico de las técnicas moleculares en la diferenciación de especies del género Trichuris. Asimismo, las secuencias específicas obtenidas para las distintas especies de este género, nos ha permitido encontrar sitios específicos de reconocimiento para cada una de ellas. 4. Referencias Adlard, R.D.; Barker, C.S.; Blair, D. and Cribb, T. 1993. 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