Ecología evolutiva del polimorfismo estilar en narcissus papyraceus ker-gawl. (amaryllidaceae)

ECOLOGÍA EVOLUTIVA DEL POLIMORFISMO ESTILAR EN Narcissus papyraceus KERGAWL. (AMARYLLIDACEAE). EVOLUTIONARY ECOLOGY OF STYLAR POLYMORPHISM IN Narcissus papyraceus KER-GAWL. (AMARYLLIDACEAE). Tesis Doctoral Violeta Simón Porcar Mayo de 2013 Directores: Dr. Juan Arroyo y Dr. F. Xavier Picó Ecología evolutiva del polimorfismo estilar en Narcissus papyraceus Ker-Gawl. (Amaryllidaceae). Memoria que Violeta Simón Porcar, Licenciada en Biología, presenta para optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla a 15 de mayo de 2013. Juan Arroyo Marín, Catedrático del Departamento de Biología Vegetal y Ecología de la Universidad de Sevilla, y F. Xavier Picó Mercader, Científico Titular del Departamento de Biología Integrativa en la Estación Biológica de Doñana (CSIC), INFORMAN: Que esta memoria fue realizada bajo su dirección en el Departamento de Biología Vegetal y Ecología de la Universidad de Sevilla y en el Departamento de Biología Integrativa de la Estación Biológica de Doñana (CSIC). Ante lo cual, considerando que tiene la suficiente entidad para constituir un trabajo de Tesis Doctoral, autorizan su presentación ante el Consejo de Departamento y la Comisión de Doctorado. Y para que así conste, firman el presente documento en Sevilla a 15 de mayo de 2013. Fdo.: Juan Arroyo Marín Fdo.: F. Xavier Picó Mercader Este trabajo fue financiado por dos Proyectos del Plan Nacional de Investigación concedidos por los Ministerios de Ciencia e Innovación y Economía y Competitividad del Gobierno de España otorgados a Juan Arroyo (proyectos CGL-2006-13847-C02-01 y CGL-2009-12565) y por dos Proyectos de Excelencia del Gobierno de Andalucía otorgados a Juan Arroyo y F. Xavier Picó (proyecto PAIDI P07-RNM-02869 a J.A. y F.X.P, y proyecto P09-RNM-5280 a J.A.). La autora Violeta Simón Porcar fue financiada por una beca de Formación de Personal Investigador del Ministerio de Ciencia e Innovación de España (BES- 2008-005014). A mi madre A mi padre ÍNDICE Resumen General …………….……………………………………………………………………………… 15 General Abstract ………..…………………..……………………………………….………………………. 16 Capítulo 1. Introducción General Chapter 1. General Introduction La ecología evolutiva en el campo de la biología floral ………………...…........ 19 La heterostilia ………………………………………………………………………………..………... 20 La promoción de la fecundación cruzada………………………………..……………... 23 El dimorfismo estilar…………………………………………………............................………. 26 El polimorfismo estilar en Narcissus ……………………………………..…………..…… 27 El género Narcissus L……………………………………………………………..………..……... 30 El caso de Narcissus papyraceus Ker-Gawler………………………………………..… 31 Características de Narcissus papyraceus como modelo de estudio……….. 34 Objetivos de la Tesis Doctoral……………………………………..…………………………. 37 Estructura de la Tesis Doctoral……………………………………………………………..… 38 Referencias…………………………………………………………………………………..……….... 40 Capítulo 2. La autoincompatibilidad homomórfica y ovárica en Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae) se debe a una respuesta precigótica Chapter 2. Homomorphic ovarian self-incompatibility in Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae) is due to a pre-zygotic response Resumen…...………………………………………………….……………………..…………………… 55 Abstract…....…………………………..………………………………………..……….….…….……… 56 Introduction…….….…………………………………………………..………………………..……… 57 16 GENERAL ABSTRACT Narcissus papyraceus is a western Mediterranean geophyte having stylar dimorphism, a polymorphism similar to heterostyly but lacking both perfect sexual reciprocity between morphs and heteromorphic incompatibility system. However, as in heterostyly, evolutionary maintenance of stylar dimorphism depends on disassortative mating rates. Populations of N. papyraceus are dimorphic (with long- and short-styled morphs) in the center and south of its range, but monomorphic (with the long-styled morph) in its northern boundary. In order to find the causes of this geographical pattern, in this PhD thesis they are studied in detail (i) the incompatibility system of the species and (ii) the patterns of pollination and effective mating of floral morphs, and they are inferred (iii) the population demographic processes. It is find out that, given their fully homomorphic self-incompatibility system, pollination patterns are highly determinant of reproductive success of floral morphs. Higher sexual reciprocity within L-morph than within S-morph favors higher rates of assortative mating in the L-morph. In addition, the S-morph suffers depletion of female reproductive success under the action of short-tongued pollinators. The disadvantages of the S-morph are accentuated by possible historical demographic events in populations and the frequency-dependent selection, which may have doomed this morph to extinction in northern populations of the species’ distribution. CAPÍTULO 1 INTRODUCCIÓN GENERAL GENERAL INTRODUCTION 19 La ecología evolutiva en el campo de la biología floral La ecología evolutiva integra la biología evolutiva con la ecología, considerando los aspectos históricos y contemporáneos que influyen en los patrones de variación y el valor adaptativo de estos últimos (Fox et al. 2001, Mayhew 2006). Esta rama de la ciencia se fundamenta en el pilar central de la teoría darwinista de la evolución (Darwin 1859): los organismos se adaptan generación tras generación a su ambiente por medio de la selección natural. Así, tanto las interacciones intraespecíficas como las interespecíficas, y las de los organismos con las condiciones geográficas, climáticas o fisiográficas de su hábitat, pueden ser fuerzas selectivas directas o indirectas que determinen evolución fenotípica en los organismos implicados (Moore et al. 1997, Hairston et al. 2005, Svensson et al. 2005, Estes et al. 2013). Uno de los principales objetos de estudio de la ecología evolutiva en plantas son sus estrategias de reproducción. Desde la autogamia obligada de las flores cleistógamas hasta la alogamia necesaria de las plantas dioicas, las angiospermas presentan los más variados mecanismos para separar las funciones sexuales al nivel espacial y/o temporal. Así, la monoecia, la poligamia, la ginodioecia, la androdioecia, la heterodicogamia o la heterostilia, entre otros, permiten promover la fecundación cruzada y/o evitar la autointerferencia (Barrett 1998, 2002, Renner 2001). Aunque algunos de estos sistemas de reproducción habían sido descritos desde antiguo (Clusius 1583, Linnaeus 1735), no fue hasta la segunda mitad del siglo XIX cuando se inquirió sobre su significado adaptativo. Fue entonces cuando Charles Darwin (1809–1882) sentó las bases de la ecología evolutiva en el campo de la biología floral a través de sus obras Fertilisation of Orchids (1862a; título abreviado), The Effects of Cross 20 and Self-Fertilisation in the Vegetable Kingdom (1876) y The Different Forms of Flowers on Plants of the Same Species (1877). Posiblemente, Forms of Flowers ha sido la obra más influyente en el campo de la biología floral evolutiva hasta nuestros días (Pannell 2009), acaso porque coronando su propio trabajo experimental (1862b) y el de botánicos como Gray (1842), Hildebrand (1863, 1865, 1867), Delpino (1867) o Müller (1869), Darwin trató con especial interés y extensión la heterostilia. Desde entonces, este polimorfismo estilar, codificado supuestamente en algunos grupos de plantas por un supergen que segrega de forma mendeliana (Lewis & Jones 1992), ha recibido una gran atención como sistema modelo en estudios evolutivos (véanse las revisiones de Vuilleumier 1967, Ganders 1979, Barrett 1992 y Barrett & Shore 2008). La heterostilia La heterostilia consiste en la presencia de dos (distilia) o tres (tristilia) morfos florales dentro de una misma población que difieren de forma recíproca en la posición de sus órganos sexuales. Así, en el caso de la distilia, las anteras del morfo de estilo largo o longistilo (L de aquí en adelante) están a la misma altura que el estigma del morfo de estilo corto o brevistilo (S, del inglés short, de aquí en adelante), y viceversa (Figura 1). En el caso de la tristilia ocurre lo mismo con tres niveles y morfos florales (L, S y M, este último de longitud de estilo mediana). Comúnmente, el polimorfismo morfológico, llamado per se hercogamia recíproca (Webb & Lloyd 1986), se asocia con un sistema de incompatibilidad, llamado heteromórfico, que impide la fecundación propia y entre individuos del mismo morfo. Además, se asocian también 21 Figura 1. Morfos florales de una planta con distilia común. Morfo de estilo largo (L) y morfo de estilo corto (S) con el patrón teórico de transferencia de polen mediado por un polinizador entre los dos niveles recíprocos de órganos sexuales marcado con flechas. El mismo color en el estigma y las anteras indica compatibilidad fisiológica. Morfo L Morfo S 22 polimorfismos en otros caracteres secundarios, principalmente en la forma del estigma y de los granos de polen, llamados caracteres ancilares. El significado evolutivo de cada uno de estos componentes, su orden de aparición y su ligamiento han sido objeto de intenso estudio desde mediados del siglo XX, sin haberse llegado aún a una solución definitiva (véase revisión en Ornduff 1992). Darwin (1877; pág. 245) interpretó la heterostilia como un mecanismo de promoción de la fecundación cruzada, en el que los distintos morfos, aunque todos hermafroditas, se relacionan entre ellos “como los machos y hembras de las plantas dioicas o de los animales superiores”. El mecanismo debía ser, sin lugar a dudas, su adaptación a un transporte eficaz del polen por parte de los polinizadores entre los distintos niveles de órganos sexuales (Figura 1). Dicho esto, es importante notar que todas las especies heterostilas son polinizadas por animales. Además, la mayoría posee flores actinomorfas con un tubo floral bien desarrollado y un número limitado de estilos y estambres (Lloyd & Webb 1992a), cualidades que podrían favorecer la precisión en la transferencia del polen y por ende el buen funcionamiento de este polimorfismo y su estabilidad evolutiva. Darwin consideró que en la evolución de la heterostilia la hercogamia recíproca tenía que haber aparecido en primer lugar, seguida de los caracteres ancilares y la incompatibilidad heteromórfica. La incompatibilidad heteromórfica no era adaptativa en su opinión, puesto que debe conllevar la esterilidad de cada individuo con la mitad de la población, la de su mismo morfo. Con términos actuales, podríamos decir que dividiría el tamaño efectivo poblacional por la mitad sin comportar otras posibles ventajas, como la liberación del coste de una función sexual que ocurre en plantas dioicas (Bawa 1980). Por tanto, Darwin propuso que la incompatibilidad heteromórfica había aparecido como un subproducto de la 23 hercogamia recíproca y que los polimorfismos en el estigma y el polen debían jugar un papel importante en el reconocimiento y admisión del polen del morfo opuesto. Tras Darwin, otros investigadores han propuesto secuencias evolutivas para la aparición de los distintos caracteres de la heterostilia. Algunos autores han apoyado su secuencia de pasos, hercogamia recíproca seguida de autoincompatibilidad: Ernst (1936), Anderson (1973), Lloyd y Webb (1992b) y Richards (1998). Por el contrario, otros consideraron que el primer paso en la evolución de la heterostilia debía de haber sido la autoincompatibilidad heteromórfica: Crowe (1964), Baker (1966), Yeo (1975) y Charlesworth y Charlesworth (1979). Por su parte, Mather y de Winton (1941) propusieron que ambas características se habían adquirido simultáneamente. La promoción de la fecundación cruzada Tras el debate sobre el orden de aparición de las dos características principales de la heterostilia se esconde una pregunta de ecología funcional clave: ¿puede la hercogamia recíproca por sí sola facilitar la fecundación cruzada entre distintos morfos? Si la respuesta es afirmativa, el polimorfismo estilar podría ser estable sin necesidad de incompatibilidad heteromórfica, como Darwin propuso. En caso contrario, el polimorfismo habría de perderse recurrentemente y, por tanto, la aparición de la heterostilia podría haber resultado del camino inverso y ser dependiente de la incompatibilidad heteromórfica. La prevalencia de la fecundación cruzada entre distintos morfos sobre la fecundación cruzada dentro de un mismo morfo es requisito indispensable para la estabilidad de cualquier polimorfismo intrapoblacional. Los cruzamientos entre morfos son un mecanismo de selección negativamente dependiente de la frecuencia 24 (Fisher 1930), en el que el morfo menos común disfruta de la ventaja de tener un mayor número posible de parejas (Eckert et al. 1996, Gleiser et al. 2008, Shang et al. 2012). Así, los cruces entre morfos garantizan un equilibrio dinámico en la proporción de morfos en la población (Heuch 1979). Por el contrario, si los cruzamientos dentro de un morfo cualquiera prevalecen, este aumentaría su frecuencia en la población pudiendo llegar a dominarla y haciendo al otro desaparecer. Por tanto, los patrones de cruzamiento de los morfos determinan la frecuencia de los mismos en una población. Un caso extremo de prevalencia de los cruzamientos dentro de cada morfo llevaría a su aislamiento reproductor. Lloyd y Webb (1992b) modelaron la necesidad de prevalencia de los cruces entre morfos para el equilibrio del polimorfismo estilar en una población con las siguientes ecuaciones: Ec. 1 Ec. 2 Ec. 3 Ec. 4 Las ecuaciones 1 y 2 corresponden a condiciones en las que la fertilidad femenina está limitada por la cantidad o calidad de polen recibido, y las ecuaciones 3 y 4 a condiciones sin limitación por polen. En ellas, q representa el éxito reproductor, y los subíndices L y S representan los morfos de estilo largo y corto respectivamente, con el morfo materno en primer lugar. Para que se mantenga el polimorfismo, deben 25 Figura 2. Morfos florales de una planta con dimorfismo estilar. Morfo de estilo largo (L) y morfo de estilo corto (S) con el patrón teórico de transferencia de polen entre sus dos niveles de órganos sexuales marcado con flechas, que muestran una correspondencia imperfecta de alturas. El mismo color en el estigma y las anteras indica compatibilidad fisiológica entre individuos. Nótese que el verticilo inferior de anteras se sitúa ligeramente más arriba en el morfo S; este es el caso de Narcissus papyraceus. Morfo L Morfo S 32 alturas equivalentes en ambos morfos, aunque el verticilo inferior se sitúa ligeramente más elevado en el morfo S (Pérez-Barrales & Arroyo 2010). No existen diferencias en ningún otro rasgo floral ni vegetativo entre ambos morfos (pero véase Pérez-Barrales et al. 2007). Las poblaciones de N. papyraceus presentan una proporción de morfos florales que varía desde aproximadamente 1:1 hasta 1:0 para L:S (Arroyo et al. 2002). Es decir, virtualmente no existen poblaciones en las que domine el morfo S ni se ha encontrado una sola población monomórfica S. Por el contrario, el morfo L se encuentra presente en todas las poblaciones, las domina y llega a formar poblaciones monomórficas L. La proporción de morfos de las poblaciones no se distribuye al azar, sino que sigue un patrón geográfico. Las poblaciones más próximas al Estrecho de Gibraltar tienen proporciones iguales de ambos morfos (1L:1S). La frecuencia del morfo S se reduce conforme las poblaciones se alejan del Estrecho, llegando a desaparecer en las poblaciones del límite norte del área de distribución, en el valle del Guadalquivir, que son monomórficas L. Hacia el centro de Marruecos, el morfo S se mantiene en todas las poblaciones en pequeña proporción (Figura 5). El patrón geográfico de la proporción de morfos en N. papyraceus ha sido estudiado desde diversas perspectivas. En el primer trabajo en que el patrón fue exhaustivamente descrito (Arroyo et al. 2002) la proporción de morfo S se correlacionó positivamente con el tamaño poblacional. Estudios posteriores analizaron el papel de los polinizadores, el éxito reproductor femenino y los patrones de cruzamiento en la proporción de morfos en las poblaciones (Pérez-Barrales et al. 2007, Pérez-Barrales & Arroyo 2010, Santos-Gally et al. 2013b). Estos trabajos apoyaron la hipótesis del papel principal de los visitantes florales sobre la frecuencia de aparición del morfo S. En concreto, Pérez-Barrales et al. (2007) y Santos-Gally et al. (2013b) mostraron una correlación negativa entre la frecuencia del morfo S en las 33 Figura 4. Morfología de Narcissus papyraceus. (A) Detalles de la corona y los tépalos y (B) del tubo floral. (C) Agrupación típica de escapos de un mismo genotipo en el campo debido a la reproducción vegetativa por fragmentación de bulbos. (D) Morfos florales de estilo largo (L) y de estilo corto (S); tras la disección, faltan 1–2 anteras por verticilo. A B CD L S 34 poblaciones y la tasa de visitas de polinizadores de probóscide corta (sírfidos y abejas). Por su parte, Pérez-Barrales y Arroyo (2010) mostraron un menor éxito reproductor femenino del morfo S y mayores tasas de cruzamientos entre individuos del morfo L en el área natural monomórfica de la especie. La hipótesis propuesta por estos investigadores es que los polinizadores de probóscide corta reducen el éxito reproductor femenino del morfo S porque no alcanzan a polinizar su estigma a la vez que incrementan las tasas de cruzamiento entre individuos del morfo L, que tiene por tanto mayor éxito masculino y femenino. Así, los polinizadores de probóscide corta podrían determinar la menor frecuencia o la pérdida del morfo S en las poblaciones. Características de Narcissus papyraceus como modelo de estudio Narcissus papyraceus es una especie situada hacia la base de la filogenia del género (Graham & Barrett 2004, Santos-Gally et al. 2013a). Es una especie longeva; aunque se desconoce su tiempo de vida máximo o promedio, la primera reproducción sexual ocurre a partir del tercer o cuarto año (observaciones personales). Los individuos poseen varios escapos florales y hasta quince flores por inflorescencia. La reproducción vegetativa, por medio de la fragmentación de los bulbos, determina en ocasiones que los genotipos consten de grandes agrupaciones de escapos florales. Las flores son blancas y tienen el tubo floral estrecho (Figura 4). Su olor dulzón, determinado por una alta concentración de indol (Dobson et al. 1997), es característico y causa de los nombres vernáculos que la especie tiene en el sur de España. 35 Figura 5. Poblaciones de Narcissus papyraceus en la principal área de distribución de la especie, el margen occidental de la Cuenca Mediterránea, y sitios de estudio de esta Tesis Doctoral. 36 El área de distribución de N. papyraceus se extiende por toda la Cuenca Mediterránea. No obstante, aunque se conocen poblaciones en Argelia, Francia, Italia, Grecia y la antigua Yugoslavia, algunas de dudoso origen nativo (Blanchard 1990), la gran mayoría de las poblaciones de la especie se reparte entre el sur de España y el norte de Marruecos. Así, N. papyraceus tiene su principal área de distribución en la zona del Estrecho de Gibraltar, en la cual se centra la presente Tesis Doctoral (Figura 5). En esta zona, las poblaciones presentan un gradiente de densidad y tamaño poblacional decreciente con la distancia al Estrecho. En las provincias de Cádiz, en España, y de Sidi-Kacem, en Marruecos, se encuentran las mayores densidades poblacionales, con poblaciones de hasta varios miles de individuos distribuidas frecuentemente a menos de cinco kilómetros unas de otras. La mayoría de las poblaciones están a baja altitud, aunque algunas llegan a situarse hasta a 1200 m sobre el nivel del mar. Casi todas se localizan en hábitats muy perturbados, como pastos, cultivos y márgenes de caminos, ocupando suelos preferentemente arcillosos o limosos sobre sustratos rocosos de composición muy variada (Tabla S1). En el entorno del Estrecho de Gibraltar las poblaciones de N. papyraceus florecen entre diciembre y marzo en un gradiente latitudinal de sur a norte. La intensidad de floración de las poblaciones es muy dependiente de una alta precipitación otoñal e invernal. Las condiciones invernales durante su floración determinan un ambiente de polinización inestable, al que los individuos hacen frente con flores que duran hasta quince días en espera de la visita de un polinizador y una floración individual total que se prolonga hasta un mes, una estrategia típica de las plantas de floración invernal (Primack 1985). Al nivel de población, la floración puede durar hasta dos meses. Los visitantes florales de N. papyraceus son insectos generalistas que incluyen lepidópteros diurnos (géneros Pieris, Vanessa y Gonopteryx), 37 polillas diurnas o nocturnas (Macroglossum stellatarum y Autographa gamma principalmente), abejas solitarias (Anthophora, Andrena y Eucera), abejorros (Bombus), abejas sociales (Apis mellifera principalmente) y sírfidos (Eristalis, Merodon, Eupeodes y Syritta) (Pérez-Barrales et al. 2007, Santos-Gally et al. 2013b). Narcissus papyraceus es autoincompatible, pero tanto las polinizaciones entre plantas del mismo morfo como las polinizaciones entre plantas de morfos diferentes son igualmente viables (Arroyo et al. 2002, Santos-Gally et al. 2013b). Objetivos de la Tesis Doctoral A pesar de las varias aproximaciones con las que se había estudiado el patrón geográfico de la proporción de morfos en Narcissus papyraceus, la mayoría de las cuestiones implicadas permanecían sin una evidencia empírica directa y/o detallada. La presente Tesis Doctoral profundiza en el estudio de las causas de dicho patrón, gracias al empleo de métodos exhaustivos. En concreto, se estudian en detalle (i) el sistema de autoincompatibilidad de la especie; (ii) los procesos históricos demográficos de formación y cambio de las poblaciones; (iii) los patrones de transferencia de polen dentro de cada morfo y entre distintos morfos determinados por los polinizadores de probóscide larga y de probóscide corta en la especie; y (iv) los patrones de éxito reproductor de los morfos florales y de cruzamientos dentro de cada morfo y entre distintos morfos. Así, el objetivo de la Tesis Doctoral es dar respuesta a las siguientes preguntas: 38  ¿Existe una incompatibilidad heteromórfica críptica que pudiese afectar diferencialmente a los patrones de cruzamiento de los morfos en las poblaciones?  ¿Pueden la similitud genética de las poblaciones o procesos estocásticos, como la deriva genética, haber influido sobre las proporciones de morfos y la reversión al monomorfismo?  ¿Cuál es el papel efectivo de los distintos tipos de polinizadores en los patrones de cruzamiento y en el éxito reproductor de los morfos?  ¿Explican los patrones de cruzamiento en las poblaciones la estabilidad y/o pérdida del polimorfismo? De forma global, esta Tesis Doctoral persigue descubrir si el dimorfismo estilar es capaz de promover los cruzamientos entre individuos de distintos morfos y es por tanto una condición estable en N. papyraceus, y si es así, bajo qué circunstancias. Estructura de la Tesis Doctoral Para acometer el estudio de distintos elementos involucrados en el funcionamiento y la pérdida del dimorfismo estilar en las poblaciones de Narcissus papyraceus, la presente Tesis Doctoral posee cinco capítulos centrales con datos empíricos propios. En el segundo capítulo, La autoincompatibilidad homomórfica y ovárica en Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae) se debe a una respuesta precigótica, se estudia la naturaleza de la reacción de autoincompatibilidad de la especie con técnicas de microscopía de luz blanca y fluorescencia. Los objetivos de este capítulo son detectar posibles diferencias crípticas en el proceso de fecundación entre polinizaciones dentro de cada 39 morfo y entre distintos morfos, y describir el sitio exacto y el mecanismo de la autoincompatibilidad de la especie. En el tercer capítulo, Nuevos marcadores microsatélites para Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae) y amplificación en otras especies congéneres, se desarrollan marcadores moleculares microsatélites nucleares para su empleo en estudios ecológicos y poblacionales en N. papyraceus, y se investiga su posible aplicación en otras especies de Narcissus. En el cuarto capítulo, Genética de poblaciones y variación en la proporción de morfos florales en toda el área de distribución de la especie dimórfica estilar Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae), se estudian los patrones de variación y estructuración genética en poblaciones de N. papyraceus usando los microsatélites desarrollados en el capítulo tercero. El objetivo de este trabajo es conocer la posible influencia de procesos estocásticos como los cuellos de botella o los efectos fundadores en la proporción de morfos florales en las poblaciones. Además, se investiga la relación de estas características poblacionales con la variación climática territorial. En el quinto capítulo, Los insectos de probóscide larga promueven la transferencia de polen entre los morfos estilares de Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae), se investigan en detalle los patrones de polinización dentro de cada morfo y entre morfos que promueven los dos tipos distintos de polinizadores de N. papyraceus: de probóscide larga y de probóscide corta. Además, se estudian los patrones de remoción de polen y de autopolinización para tener un esquema completo de la interacción de los morfos florales con sus visitantes, e inquirir cuál puede ser el papel de los últimos en el mantenimiento del dimorfismo estilar en la naturaleza. En el sexto capítulo, Los cruzamientos entre morfos prevalecen en la especie dimórfica estilar sin reciprocidad sexual Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae), se investigan la fertilidad y el éxito de padreamiento de los morfos florales y los patrones de 40 cruzamiento dentro de cada morfo y entre morfos distintos para prever la estabilidad del dimorfismo estilar en N. papyraceus bajo diversas condiciones. Los datos se obtuvieron a partir de poblaciones experimentales fabricadas con individuos genotipados con los microsatélites desarrollados en el tercer capítulo, con distintas proporciones de morfos florales y localizadas en las áreas naturales dimórfica y monomórfica de la especie. Los cinco capítulos se encuentran estructurados en formato de artículo científico. Así, pueden leerse independientemente y en el orden deseado, aunque considero más adecuado el orden que siguen en la Tesis. Los capítulos están escritos en inglés por ser este el idioma estándar de comunicación en ciencia, aunque incluyen una traducción del Resumen al español. La Tesis termina con un séptimo capítulo de Discusión General en el que se integran todos los resultados y se discuten sus implicaciones en la ecología evolutiva del dimorfismo estilar, para terminar con las Conclusiones Generales de la Tesis Doctoral. Referencias Aedo C (2013) Amaryllidaceae. En: Castroviejo S, Aedo C, Laínz M, Muñoz- Garmendia F, Nieto-Feliner G, Paiva J, Benedí C (eds) Flora Ibérica: en prensa. Real Jardín Botánico, CSIC, Madrid. Anderson WR (1973) A morphological hypothesis for the origin of heterostyly in the Rubiaceae. Taxon 22: 537–542. Arroyo J, Barrett SCH (2000) Discovery of distyly in Narcissus (Amaryllidaceae). American Journal of Botany 87: 748–751. 41 Arroyo J, Barrett SCH, Hidalgo R, Cole WW (2002) Evolutionary maintenance of stigma-height dimorphism in Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae). 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(msnm) Edad (*) Litología (*) 1 34º12,6’ 4º08,4’ 401 Cuaternario Arenas y limos 2 33º51,0’ 4º52,2’ 905 Jurásico basal Dolomías 3 34º49,8’ 5º32,4’ 224 Oligoceno-Mioceno Arcillas y limos 4 35º43,2’ 5º44,4’ 55 Cuaternario Arenas, arcillas y carbonatos 5 33º57,0’ 5º34,2’ 299 Mioceno superior Arcillas 6 33º37,8’ 5º25,9’ 914 Jurásico basal Limos y arcillas con cantos 7 32º39,6’ 8º39,6’ 166 Cuaternario Limos arenosos 8 37º50,4’ 5º18,6’ 152 Cámbrico inferior Pizarras y calizas 9 37º28,2’ 4º21,0’ 783 Jurásico medio Calizas 10 37º45,6’ 5º34,8’ 331 Mioceno superior Calizas karstificadas y arcilla 11 36º45,0’ 3º25,8’ 495 Triásico inferior Cuarcitas y filitas 12 37º29,4’ 7º15,0’ 197 Carbonífero superior Pizarras y areniscas 13 37º13,2’ 6º26,4’ 34 Plioceno Arenas arcósicas 14 36º37,8’ 5º27,0’ 507 Eoceno-Oligoceno Calizas y margas 15 36º45,0’ 5º30,6’ 300 Triásico Arcillas con yesos 16 36º12,6’ 5º34,8’ 102 Mioceno inferior Arcillas (localmente sulfatos) 17 36º08,4’ 5º36,0’ 252 Cuaternario Arcillas (loc. sulfatos) y arenas 18 36º04,2’ 5º33,0’ 420 Cuaternario Arcillas, arenas y carbonatos 19 36º19,2’ 5º46,2’ 31 Mioceno inferior Areniscas silíceas 20 36º22,2’ 6º06,6’ 24 Mioceno superior Margas (loc. arenosas) 21 36º24,6’ 5º54,6’ 44 Mioceno inferior Arcillas (loc. sulfatos) 22 36º28,8’ 5º43,8’ 74 Cuaternario Arenas (loc. calcáreas) y arcillas 23 36º06,0’ 5º43,8’ 164 Cretácico superior Calizas y margas 24 36º40,2’ 5º13,2’ 962 Cretácico superior Calizas 25 36º28,8’ 5º17,4’ 366 Cretácico inferior Calizas 26 36º54,0’ 4º34,2’ 523 Mioceno inferior Areniscas y margas 27 37º14,4’ 8º02,4’ 209 Triásico sup.-Jurásico inf. Arcillas, sulfatos y carbonatos 28 37º15,0’ 8º06,0’ 314 Triásico sup.-Jurásico inf. Arcillas, sulfatos y carbonatos 29 37º06,0’ 7º51,0’ 199 Jurásico superior Calizas 30 37º14,4’ 6º14,4’ 12 Cuaternario Limos y arcillas 31 37º33,0’ 5º56,4’ 27 Cuaternario Gravas cuarcíticas (*) Información tomada de: cartografía geológica MAGNA (1:50.000) del Instituto Geológico y Minero de España, hojas 921, 941, 962, 980, 989, 1001, 1038, 1050, 1056, 1064, 1069, 1070, 1071, 1074 y 1077 (1975–1991); Carte Géologique du Maroc 1:1.000.000, Service Géologique du Maroc (1985); Carta Geológica de Portugal 1:500.000, Serviços Geológicos de Portugal (1992). CAPÍTULO 2 LA AUTOINCOMPATIBILIDAD HOMOMÓRFICA Y OVÁRICA EN Narcissus papyraceus (AMARYLLIDACEAE) SE DEBE A UNA RESPUESTA PRECIGÓTICA HOMOMORPHIC OVARIAN SELF-INCOMPATIBILITY IN Narcissus papyraceus (AMARYLLIDACEAE) IS DUE TO A PRE-ZYGOTIC RESPONSE V.I. Simón-Porcar, M. Herrero & J. Arroyo. Unpublished. 55 Resumen La autoincompatibilidad ovárica, que incluye reacciones pre- y postcigóticas, es un mecanismo complejo del que todavía desconocemos muchos detalles sobre su función y significado. La presencia conjunta de autoincompatibilidad ovárica homomórfica (no dialélica) y polimorfismo estilar es una rara combinación que el género Narcissus presenta. Por lo general, las especies polimórficas estilares presentan incompatibilidad heteromórfica (dialélica), la cual impide la fecundación entre individuos del mismo morfo y así ayuda a mantener la misma proporción de morfos florales en las poblaciones. Por lo tanto, estudiar la autoincompatibilidad de Narcissus es interesante tanto para intentar desentrañar la naturaleza de la reacción de rechazo como para evaluar posibles diferencias crípticas en el proceso de fertilización en polinizaciones entre individuos del mismo y de distinto morfo. Examinamos el sistema de reproducción de Narcissus papyraceus, una especie con dimorfismo estilar que tiene proporciones de morfos sesgadas en la mayoría de sus poblaciones. Para ello, se estudió el crecimiento del tubo polínico en el pistilo y la respuesta de los óvulos después de polinizaciones manuales controladas. El crecimiento de los tubos polínicos en los pistilos autopolinizados y en los pistilos polinizados por su mismo morfo o por el morfo opuesto fue en ambos morfos similar hasta la penetración del micropilo ovular, pero posteriormente un fallo precigótico pareció afectar a los gametofitos masculino y femenino en los pistilos autopolinizados. Una proporción de óvulos en estos pistilos mostró signos de colapso y los tubos polínicos se bloquearon o comportaron anormalmente antes de entrar en el saco embrionario. Una parte de los óvulos no penetrados también mostró signos de degeneración posiblemente debido a la falta de estimulación ovárica. No encontramos indicios concluyentes de funcionamiento diferencial entre las polinizaciones entre individuos 56 del mismo y de distinto morfo en ninguno de los dos morfos, lo que nos permite descartar posibles efectos del sistema de reproducción en Narcissus papyraceus como causa del sesgo en las proporciones de morfos en las poblaciones y confirmar el carácter excepcional del mecanismo de autoincompatibilidad en esta especie polimórfica. Palabras clave: Amaryllidaceae, crecimiento del tubo polínico, degeneración ovular, dimorfismo estilar, Narcissus, sistema de incompatibilidad. Abstract Ovarian self-incompatibility, which includes pre- and post-zygotic reactions, is a complex mechanism for which we still lack many details of its function and significance. The joint presence of homomorphic (i.e. non diallelic) ovarian selfincompatibility with stylar polymorphism is a rare combination that is found in the genus Narcissus. Usually, style-polymorphic species have heteromorphic (i.e. diallelic) incompatibility, which prevents fertilization between individuals of the same morph, thereby helping to maintain equal proportions of floral morphs in populations. Hence, self-incompatibility in Narcissus is of particular interest when attempting to unravel the nature of the rejection reaction and assess possible cryptic differences in the fertilization process in intra- and inter-morph crosses. We examined the breeding system of Narcissus papyraceus, a style-dimorphic species that has biased morph ratios in most of its populations. We studied pollen tube growth in the pistil and ovule fate after experimentally controlled hand pollinations. The growth of pollen tubes in selfs and intra- and inter-morph crosses was similar up to the point of micropyle 57 penetration in both morphs, but subsequently a pre-zygotic failure appeared to affect male and female gametophytes in selfed pistils. A proportion of ovules from selfpollinated flowers showed signs of collapse and self-pollen tubes were blocked or behaved abnormally before entering the embryo sac. Non-penetrated ovules also showed signs of degeneration possibly due to the failure of ovary stimulation. We did not find any conclusive signs of differential functioning between intra- and intermorph pollinations in any morph. These results enable us to rule out the possible effects of the breeding system in Narcissus papyraceus as a cause of morph-ratio biases and confirm the exceptional nature of the self-incompatibility mechanism in this polymorphic species. Keywords: Amaryllidaceae, incompatibility system, Narcissus, ovule degeneration, pollen tube growth, stylar dimorphism. Introduction Self-incompatibility has evolved repeatedly in hermaphroditic flowering plants as a means of avoiding self-fertilization and promoting cross-fertilization, and thereby increasing the genetic pool of the progeny (Charlesworth & Charlesworth 1987, Johnston 1992, Uyenoyama et al. 1993, Igic et al. 2008, Goldberg et al. 2010). Three major mechanisms of self-incompatibility that differ in the site of the rejection reaction and their genetic control have been described in flowering plants: homomorphic gametophytic, homomorphic sporophytic and heteromorphic sporophytic incompatibility (de Nettancourt 1977, Gibbs 1986, Dickinson et al. 1992, 64 examined a total of 205 ovules penetrated through the exostome out of a total of over 1000 ovules scrutinized in 18 pistils in paraffin preparations (Table S1). To evaluate whether fertilization had occurred or not, the same paraffin preparations were subjected to a third treatment following the observation of the pollen tube growth. The aniline blue stain was washed out and the microscope slides were stained with Gerlach staining (Safranin, Crystal-Violet and Light-Green; Gerlach 1969) to detect visible synergid cells, whose presence we interpreted as indicating a lack of syngamy, in ovules that had been previously recorded as penetrated by a pollen tube into the embryo sac. We explored a total of 56 ovules from 7 pistils of the three pollination treatments, which were harvested on the sixth and seventh days after pollination to ensure that the developmental status was as advanced as possible (Table S1). Statistical analysis We used Generalized Linear Models (GLMs) with a Gaussian distribution of errors to analyze the variation in the data taken in the squash preparations. The total number of ovules was analyzed as a function of floral morph and log transformed to adjust better to the normal distribution. The pollen tube length was not analyzed since the lack of variation and the small sample size in each combination of floral morph, pollination treatment and harvesting time rendered this process untenable. To examine possible differences in the growth rate of pollen tubes among pollination treatments, we analyzed separately for each harvesting day the variation in the number of pollen tubes at the base of the style as a function of pollination treatment by pooling data from both floral morphs. Pollen tubes entered massively into the 65 ovary from the third day after pollination onwards (see Results section) and so the computed variables (number of pollen tubes at the style base, penetrated ovules, degenerated ovules and penetrated-degenerated ovules) were analyzed as a function of the pollination treatment and floral morph, with data pooled from the third to the seventh day. We used the cosine of the variables number of penetrated ovules and total number of degenerated ovules to adjust better to the normal distribution. Bonferroni post hoc analyses were employed to assess differences among the three pollination treatments when this factor had a significant effect on the response variable. Data from paraffin preparations, i.e. micropyle penetration, nucellus penetration, embryo sac penetration, embryo sac degeneration, ovules with equivocal pollen tube penetration and presence of synergid cells, were analyzed with GLMs with binomial distribution of errors and with the pollination treatment as a single factor. Subsequently, we employed Bonferroni post hoc analyses as described above. All the analyses were performed with the package stats of the software R (R Core Team 2009). Results Immature stigmas had well-defined stigmatic papillae with neither secretion nor pollen adhesion (Figure 1a). S-morph stigmas matured massively by the third day after anthesis, by which time a secretion had covered the shapeless papillae, thereby allowing pollen adhesion (Figure 1b). This process occurred one day later in L- 66 morph stigmas (Figure 1c). Exceptionally cold weather on the last days of the experimental pollinations may have provoked the delay in stigma maturation. This may also have caused some pistils to exhibit a somewhat slower sequence of postpollination events. However, the results for these samples are highly unlikely to affect the observed overall sequence of post-pollination events, particularly since the time sequences for our species were similar to those reported for Narcissus triandrus by Sage et al. (1999). Figure 1. Stigma maturation in the long- (L-) and the short- (S-) styled morphs of Narcissus papyraceus. (a) Immature stigmatic papillae. (b) Mature stigmatic papillae. (c) Percentage of examined samples with mature stigmas harvested at different times after anthers dehiscence. 0% 20% 40% 60% 80% 100% 20h 30h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Mature stigmas L-morph S-morph c) a) b) 67 Figure 2. Pollination process in Narcissus papyraceus. (a) Pollen grains germinating at the stigma surface. (b) Pollen tubes traversing the stylar canal. (c) Pollen tube entering the ovule through the exostome. (d) Cross pollen tube traversing the micropyle and reaching the embryo sac of a compatible individual. es, embryo sac; ex, exostome; m, micropyle; n, nucellus. ex m n es a b c d 68 Table 1. Results of the Generalized Linear Models used to test the effect of pollination treatment, floral morph and their interaction over four variables scanned in squash preparations. (i, ii) Variables for the advance of the pollen tube. (iii, iv) Variables for the status of the ovules. Degrees of freedom (d.f.) and F-values for each variable and factor are given. Significance: **, P < 0.01; *, P < 0.05; ns, non significant. d.f. (i) Pollen tubes at the style base (ii) Penetrated ovules (iii) Degenerated ovules (iv) Penetrateddegenerated ovules Floral morph (M) 1 1.42 ns 4.12 * 0.21 ns 1.5 ns Pollination treatment (P) 2 1.51 ns 0.38 ns 1.14 ns 6.54 ** M x P 2 2.21 ns 1.32 ns 4.96 * 0.04 ns Error 59 69 Pollen performance in the style and ovule penetration Pollen grains germinated massively in mature stigmas 30 hours after pollination without any observable difference among pollination treatments or floral morphs (Figure 2a). Pollen tubes started to reach the base of the S-style earlier (30–48 h) than in the L-style (72 h; Figures 2b and 3). There were no significant differences from the third to the seventh day in the number of pollen tubes at the style base among floral morphs or pollination treatments (overall average ± SD: 21.6 ± 18.7; Table 1). Analysis of the differences in the number of pollen tubes at the style base among pollination treatments separatedly at each harvesting time only gave significantly Figure 3. Pollen tube growth in the style of the long- (L-) and the short- (S-) styled morphs of Narcissus papyraceus. Pollen tube length is expressed as the percentage of the style length. 0% 20% 40% 60% 80% 100% Progress of pollen tubes in the style L-morph S-morph 20h 30h 2d 3d 4d 5d 6d 7d 70 different results for the seventh day, when the number of pollen tubes for intramorph pollinations was significantly higher than for inter-morph pollinations (N = 17, d.f. = 2, F = 6.3, P = 0.01; Bonferroni post hoc). There were no differences in samples for other harvesting times (N = 4–13, d.f. = 1–2, F > 3.1, P > 0.11; GLM). Pollen tubes penetrated ovules from the third day onwards (Figure 2c) without differences among pollination treatments (Table 1). A marginally significant difference was found for the effect of floral morph on the number of penetrated ovules (Table 1) and in this case ovule penetration was lower in the L-morph than in the S-morph (averages ± SD: L-morph, 10.7 ± 10.3; S-morph, 19.6 ± 16.1). In the paraffin preparations (Figure 2d), 83% of ovules penetrated through the exostome were penetrated as far as the micropyle without differences among any of the three pollination treatments (Table 2a). However, the pollination treatment did affect nucellus and embryo sac penetrations (Figure 4a and Table 2a). Self-pollen tubes penetrated the nucellus in 39% of ovules and the embryo sac in 24% of ovules. For inter-morph pollinations, we observed pollen tubes within the nucellus and embryo sac in 66% and 61% of ovules, respectively, while in intra-morph crosses pollen tubes entered the nucellus and the embryo sac in 87% and 79% of ovules, respectively. The results of the Bonferroni post hoc analysis gave significant differences between the self-pollination treatment and both cross-pollination treatments for both variables (P < 0.01), but not between inter- and intra-morph pollinations (P > 0.07). The pollination treatment also had a significant effect on the proportion of ovules with abnormal pollen tube penetration (Table 2a), that is, the pollen tube penetrated the ovule via an anomalous path rather than through the micropyle (Figures 4b and 4c). In our samples, 11% of self-pollen tubes, 0% of intra-morph and 6% of inter- 71 Figure 4. Selfed ovules in Narcissus papyraceus. (a) Collapsed pollen tube in the micropyle. (b,c) Aberrant pollen tubes penetrating the ovule through the integuments. (d) Callose accumulation in synergid cells. (e,f) Pollen tube reaching a degenerated embryo sac with callosic or plasmolyzed walls. es, embryo sac; m, micropyle; n, nucellus. a b c d e f n es es es m m m n nn 72 morph pollen tubes had anomalous ovule penetrations. However, the results of the Bonferroni post hoc did not reveal any significant difference among the three treatments (P > 0.06). Table 2. Results of the Generalized Linear Models used to test the effect of pollination treatment over seven variables scanned in paraffin preparations. a) Variables scanned with aniline blue staining of ovules penetrated by pollen tubes through the exostome. b) Variable scanned with Gerlach staining of ovules penetrated by pollen tubes as far as the embryo sac. Degrees of freedom (d.f.) and F-values for each variable are given. Significance: ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05; ns, non significant. d.f./ d.f. error Variable F-value a) 2 / 204 Micropyle penetration 1.47 ns Nucellus penetration 15.29 *** Embryo sac penetration 22.32 *** Abnormal pollen tube penetration 4.03 * Embryo sac degeneration 25.35 *** b) 2 / 55 Synergid cells 5.67 ** 73 Figure 5. Selfpollinated ovule of Narcissus papyraceus penetrated by a pollen tube until the embryo sac that has not undergone syngamy and hence has visible synergid cells, seven days after pollination. Ovule response The ovaries in Narcissus papyraceus had an average (± SD) of 61 ± 11 ovules in both floral morphs (N = 78, d.f. = 1, F = 0.34, P = 0.56). The interaction of the factors floral morph and pollination treatment had a significant effect on the number of 80 Bateman AJ (1952) Trimorphism and self-incompatibility in Narcissus. Nature 170: 496–497. Bawa KS, Beach JH (1983) Self-incompatibility systems in the Rubiaceae of a tropical lowland wet forest. 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Palabras clave: Amaryllidaceae, amplificación cruzada, microsatélite, Narcissus papyraceus. Abstract Microsatellite loci from a genomic library of polymorphic species Narcissus papyraceus were optimized and characterized for studies of population genetics. Eleven markers that were successfully amplified showed polymorphism when tested on 50 individuals from two populations in South Spain and North Morocco. Overall the number of alleles per locus ranged between four and 15. Between seven and 10 loci successfully amplified in other eight Narcissus species. These markers will enable for 98 genetic diversity studies of N. papyraceus across its distribution range and conduct paternity analyses among individuals differing in flower morphology. Keywords: Amaryllidaceae, cross-amplification, microsatellite, Narcissus papyraceus. Introduction The genus Narcissus (Amaryllidaceae) is well known for its morphological diversity due to the vast amount of within- and among-species floral variation affecting both perianth and sex organs. Both polymorphisms make the genus a good model system to study floral evolution and stylar polymorphism (Barrett et al. 1996, Pérez-Barrales et al. 2006). The genus is circunmediterranean and the highest diversity is found in the Iberian Peninsula and Northwestern Africa. One of the most common species occurring in the core of the center of diversity of the genus (South Spain and North Morocco) is Narcissus papyraceus Ker-Gawler. The species is self-incompatible and exhibits stylar dimorphism and a differential geographic distribution of style-length morphs (Arroyo et al. 2002) and perianth traits (Pérez-Barrales et al. 2007, 2009). Here we characterize 11 new polymorphic microsatellite loci for N. papyraceus and their cross-amplification in other eight Narcissus species collected in the field. These markers will be used to assess the genetic differentiation and structure across the species’ distribution range, and conduct paternity analyses to investigate the ecological and genetic mechanisms underlying variation in stylar polymorphism. 99 Figure 1. Geographic location of sampling populations for Narcissus papyraceus and the other congeneric species of study in Spain and Morocco. 100 Table 1. Characteristics of 11 microsatellite loci of Narcissus papyraceus. GenBank accession numbers (below loci names), repeat motifs, forward (F) and reverse (R) primer sequences, allele size ranges and optimal annealing temperatures (Ta) are given. Locus (GenBank accession) Repeat motif Primer sequence (5’ to 3’) Product size (bp) Ta1 A5 (GU271106) AC23 F-CCACGATTCCAATATGAATTTG R-TATGCACACCTGGTATGTCAAG 238–298 58 A109 (GU271107) TA10CA14 F-GATTGTCAACAAGCATGATATG R-ATGTCGAGTGGATATGGTTATG 100–132 57 A116 (GU271108) CA26 F-GCCATGTTTTATGCCTGA R-ATCCTCACCGGAATCAAC 262–316 58 A121 (GU271109) GT27 F-GGGAGGACCCTAAATCAAGTA R-GCCTAATAAAGCTGCTATCCC 156–202 58 A131 (GU271110) GT11 F-AGCTCTCTGTGTGTGTTTCAC R-GGTGACCGTGTCAATTACAC 119–129 58 A134 (GU271111) GT22 F-ACCTCGCTTATGGGTGAG R-ATTTGATACTCGTGGATGGATA 276–306 58 B7 (GU271112) GA15 F-AACCGTTGTCTCCTCTCTATG R-TTCTCCCTCTCTCTTCATTTC 136–184 57 B104 (GU271113) GA16 F-CTGCTACACCATTAGAGACACC R-ACATCCACTGGTAACAAATCTG 156–176 59 B109 (GU271114) TC10 F-TTCCAACAAGATAACGAACCT R-AAACCGAACCTACACTAAGAGG 179–191 58 B112 (GU271115) TC18 F-CCATTCGACCACACCTACCT R-CCAAGCTCCAAATCTTCGTC 286–332 59 B131 (GU271116) GA24 F-AAACCCACCTTCAAACGA R-TGGAAACTTGTGCCCATAC 162–186 59 Notes: 1 Temperature of annealing (Ta) is given for non-labeled primers. 101 Methods and Results Microsatellite libraries were developed following Jones et al. (2002) by Genetic Identification Services (www.genetic-id-services.com). Extracted DNA (approximately 100 µg) was digested with different standard restriction enzymes. Fragments were ligated and cloned into an E. coli strain. After incubation, a total of 100 randomly-chosen recombinant clones were selected, purified and sequenced. Finally, primer pairs were designed for all 100 clones. After visual inspection of the sequences, we selected a total of 29 primer pairs. Overall fifty individuals from two populations were employed to test the amplification and polymorphism of primer pairs. Populations were located in South Spain (Cádiz; 36°8’ N, 5°35’ W; N = 35) and North Morocco (Ouezzane; 34°49’ N, 5°32’ W; N = 15; Figure 1). For primer testing, DNA was isolated from silica-dried leaf samples using a previously described protocol (Bernartzky & Tanksley 1986) without mercaptoethanol. Polymerase chain reactions were performed in 25 µl of reaction mixture containing 50 ng/µl of template genomic DNA, 1x PCR buffer, 1.5 mM MgCl, 1 mg/ml BSA, 0.034 µM forward primer, 0.25 µM reverse primer, 0.4 µM forward dye-labelled M13 primer, 0.05 mM each dNTP and 1.25 U Taq polymerase. Samples were incubated in a Touch-Down PCR in a Biometra TGradient Thermal Cycler, with an initial 5 min of denaturation at 94 ºC, 27 cycles at 94 ºC for 30 s, annealing at 67−43 ºC for 30 s (1 ºC decrease in each cycle), and extension at 72 ºC for 30 s, 17 cycles at 94 ºC for 30 s, 53 ºC for 30 s, 72 ºC for 30 s, and a final extension at 72 ºC for 10 min. Polymerase chain reaction products were analyzed on an ABI 3130×1 Genetic Analyzer and sized using GeneMapper v.4.0 (Applied Biosystems) and LIZ 500 size standard. Cross-amplification was conducted on two 102 field-collected samples of eight Narcissus species (Figure 1) following the same protocol described above. Table 2. Results of initial primer screening in two populations of Narcissus papyraceus. Sample size (N), number of alleles (na), observed heterozygosity (Ho), genetic diversity (Hs) and P-values for the Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) test are given for each marker and population. Locus Cádiz (Spain) Ouezzane (Morocco) N na Ho Hs HWE N na Ho Hs HWE A5 30 15 0.400 0.878 0.000† 15 14 0.933 0.882 0.378 A109 10 4 0.200 0.575 0.034† 14 12 0.214 0.883 0.000† A116 26 15 0.385 0.885 0.000† 11 7 0.091 0.806 0.000† A121 30 10 0.833 0.839 0.752 15 9 0.667 0.716 0.016† A131 31 4 0.161 0.506 0.003† 15 5 0.067 0.598 0.000† A134 34 13 0.912 0.731 0.466 15 7 0.733 0.591 0.031† B7 21 12 0.190 0.885 0.000† 11 7 0.273 0.570 0.002† B104 27 10 0.667 0.869 0.226 15 8 0.333 0.824 0.002† B109 15 4 0.400 0.436 0.013† 12 5 0.333 0.646 0.004† B112 26 10 0.308 0.482 0.000† 12 9 0.250 0.854 0.002† B131 31 8 0.710 0.724 0.000† 15 8 0.600 0.704 0.182 Notes: †Significant departure from HWE (P < 0.05). After excluding those that did not amplify or were monomorphic, we selected 11 primer pairs that showed polymorphism (Table 1). The number of observed alleles per locus (na), observed heterozygosity (Ho), genetic diversity (Hs) and tests for Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) were calculated using GENALEX 103 v.6.3 software (Peakall & Smouse 2006). Tests for linkage disequilibrium were performed using FSTAT v.2.9.3 software (Goudet 1995). The mean number of alleles per locus was 9.545 (range: 4–15) and 8.273 (range: 5–14) for the Spanish and Moroccan population, respectively (Table 2). On average, observed heterozygosity was 0.470 (range: 0.161–0.912) and 0.409 (range: 0.067–0.933) for the Spanish and Moroccan population, respectively (Table 2). Mean genetic diversity was 0.710 (range: 0.436–0.885) and 0.734 (range: 0.570–0.883) for the Spanish and Moroccan population, respectively (Table 2). A total of eight and nine microsatellite loci significantly departed from Hardy-Weinberg equilibrium for the Spanish and Moroccan population, respectively (Table 2). The species’ selfincompatible breeding system accounts for this result. None of the 11 microsatellite loci exhibited significant linkage disequilibrium (P > 0.002 in all cases; nominal level = 0.000909). Between seven and 10 microsatellite loci also amplified in the other Narcissus species (Table 3). 104 Table 3. Amplification of 12 microsatellite loci in eight Narcissus species. Plus and minus signs mean successful and unsuccessful amplifications, respectively. Notes: 1Geographical coordinates of populations: N. pseudonarcissus ssp. eugeniae: 40º29’ N, 1º35’ W; N. tazetta: 39º8’ N, 2º56’ E; N. assoanus: 36º51’ N, 3º29’ W; N. rupicola: 40º48’ N, 3º46’ W; N. cuatrecasasii: 36°41’ N, 5°22’ W; N. dubius: 41º37’ N, 2º1’ E; N. broussonetii: 29º39’ N, 9º26’ W; N. calcicola: 36º53’ N, 3º24’ W. 2This marker was monomorphic in N. papyraceus. Primer pairs: F- ACTTTGAGTTCCGCTTCAG and R-ACACCCTTTATGTTGAGTGC; motif: (CA13) GATATA (CA9); product size: 182 bp; temperature of annealing: 58 ºC. 3The population sampled of N. calcicola is highly isolated from the core range of the species in central Portugal. Locus Species1 N. pseudonarcissus ssp. eugeniae N. tazetta N. assoanus N. rupicola N. cuatrecasasii N. dubius N. broussonetii N. calcicola3 A5 + + + + + + + + A109 + - - - - + + - A116 - + - - - + + - A121 + + + + + + + + A131 + + + + + + + + A134 + + + + + + + + A1362 + - + + + + + + B7 + + + + + + + + B104 + + + + + + + + B109 + - - - + - - + B112 + + + - + + + + B131 - + - + + + + - 105 Conclusions These microsatellites will be adequate for genetic diversity studies across the species’ distribution range in the Iberian Peninsula and Northwestern Africa, separated by the Strait of Gibraltar. This region has proved to harbor a high biodiversity and biogeographical significance due to its complex history (Rodríguez-Sánchez et al. 2008). This will provide insights into the geographic structure of genetic diversity that reflects the evolutionary history of the species and the palaeogeographical setting of the region. Furthermore, the characteristics of these markers make them suitable to conduct paternity analysis among N. papyraceus individuals, which will permit to understand the dynamics of flower morphology evolution. Finally, the successful cross-amplification of these markers can allow study of similar questions on other Narcissus species. Acknowledgements The authors thank M. Todd of Genetic Identification Services (Chatsworth, CA, USA) for microsatellite development, R. Santos, A. de Castro, J. Ruiz, M. Serra, J.L. Silva, H. Amador, J.L. Simón, V. Fernández and D. Salvachúa for sample collection and the staff of the Molecular Ecology Lab of the Estación Biológica de Doñana for their assistance. This research was supported by grants of the Spanish Ministry of Science and Innovation (CGL2006-13847-C02-01) and Junta de Andalucía (P07- RNM-02869). V.I. Simón-Porcar, F.X. Picó & J. Arroyo. Unpublished. 113 Resumen Los modelos teóricos establecen que la selección natural y los patrones de cruzamiento determinan la proporción de morfos florales en poblaciones de plantas con polimorfismo estilar. No obstante, se ha propuesto que la historia demográfica inferida a partir de datos moleculares también puede explicar la variación en la proporción de morfos florales. En este estudio, empleamos microsatélites nucleares para valorar los patrones de variación genética en poblaciones de Narcissus papyraceus, una planta dimórfica estilar cuyas proporciones de morfos florales varían a lo largo de su área de distribución en el SW de la Cuenca Mediterránea. Basándonos en el concepto centro-margen, planteamos la hipótesis de que las poblaciones con mayor variación fenotípica en el centro de la distribución de la especie tendrán también una mayor diversidad genética. Las diversidades fenotípica y genética podrían decrecer conjuntamente hacia los bordes de la distribución de la especie, constreñidas por el efecto de eventos fundadores o cuellos de botella en condiciones ambientales subóptimas. De acuerdo con observaciones previas de las proporciones de morfos florales en la especie, encontramos la mayor frecuencia del morfo de estilo corto en las poblaciones centrales con un patrón decreciente hacia la periferia. El patrón geográfico en la proporción de morfos florales de las poblaciones no estuvo relacionado con su estructura genética. Las tasas de migración fueron relativamente altas, lo cual explicó la débil estructura genética geográfica de las poblaciones de N. papyraceus estudiadas. La diversidad genética y el tamaño efectivo poblacional fueron mayores en las poblaciones centrales isopléticas que en las poblaciones monomórficas del norte del área. Los menores tamaños efectivos poblacionales en el límite norte del área de distribución de la especie pueden atribuirse a una mayor 114 deriva genética como consecuencia de efectos fundadores o cuellos de botella, y podrían ser responsables de la pérdida de polimorfismo en estas poblaciones septentrionales. La combinación de datos moleculares y ecológicos, como correlaciones climáticas y el conocimiento sobre la biología de la polinización de la especie, proporciona la clave para una mejor comprensión de la ecología evolutiva de las plantas dimórficas estilares. Palabras clave: diversidad genética, estructura genética, heterostilia, patrón centromargen, tamaño efectivo poblacional, tasas de migración. Abstract Theoretical models state that natural selection and mating patterns account for floral morph ratio in style-polymorphic plant populations. However, it has been proposed that demographic history inferred from molecular data can also explain variation in floral morph ratio. In this study, we used nuclear microsatellites to assess genetic patterns of variation in populations of Narcissus papyraceus, a style-dimorphic plant whose floral morph ratios vary throughout its distribution range in the SW Mediterranean Basin. Based on the central-marginal concept we hypothesized that populations exhibiting higher phenotypic variation in the species’ core distribution should also have greater genetic diversity. Phenotypic and genetic diversity should both decline towards the edges of the species' range, constrained by the effect of 115 founder events or bottlenecks in sub-optimal environmental conditions. According to previous observations of floral morph ratios in this species, we found greater short-styled morph frequency in central populations with a declining pattern towards periphery. The geographic pattern in floral morph ratios in populations was not related to their genetic structure. Migration rates were relatively high, accounting for the overall weak geographical genetic structure of the studied N. papyraceus populations. Genetic diversity and effective population size were greater in central isoplethic than in northern monomorphic populations. The reduced effective population sizes at the northern edge of the plant’s range can be attributed to greater genetic drift as a consequence of either founder events or bottlenecks, and might be responsible for the loss of polymorphism in these northern populations. Furthermore, the combination of molecular and ecological data, such as climatic correlates and knowledge of the species’ pollination biology provides the key to a better understanding of the evolutionary ecology of style-dimorphic plants. Keywords: central-marginal pattern, effective population size, genetic diversity, genetic structure, heterostyly, migration rates. 116 Introduction Heterostylous and style-length morphs are phenotypic variants that differ in the position of their sex organs within the flower (Lewis & Jones 1992, Barrett 2002) and whose functional genetic basis has only just begun to be studied in detail (Labonne et al. 2008, Yoshida et al. 2011, Ushijima et al. 2012). Evolutionary models state that natural selection maintains heterostyly and stylar dimorphism in populations through enhanced disassortative mating (Lloyd & Webb 1992a, 1992b), a mechanism by which in flowers inter-morph mating is more frequent than intra-morph mating (Baker et al. 2000a, Barrett et al. 2000, Thompson et al. 2003, Cesaro & Thompson 2004). Disassortative mating is driven by pollen transfer in differentiated parts of the pollinator’s bodies, as well as by a heteromorphic incompatibility system (Barrett & Shore 2008) that only allows for cross-fecundation between floral morphs. Theoretically, populations in equilibrium are expected to have an even proportion of floral morphs (i.e. isoplethy) when mating is completely disassortative. However, the heteromorphic incompatibility system is not always present and crosses between individuals with the same floral morph are thus permitted (Dulberger 1964, Philipp & Schou 1981, Barrett et al. 1997, Baker et al. 2000b, Arroyo et al. 2002, Pérez- Barrales et al. 2006, Brys et al. 2008, Ferrero et al. 2012). In this case, an increase in assortative mating in one of the floral morphs can lead to biased floral morph ratios and, eventually, to the loss of polymorphism in the population (Cesaro & Thompson 2004, Pérez-Barrales & Arroyo 2010). Field studies have revealed that variation in floral morph ratios exists in many populations of style-polymorphic plants (Ganders 1979, Arroyo & Dafni 1995, Baker 117 et al. 2000b, van Rossum & Triest 2006). Beyond among-population differences in mating patterns, it has been shown that observed patterns of variation in floral morph ratios in populations can be accounted for by historical and contemporary demographic processes (Heuch 1980, Morgan & Barrett 1988, Husband & Barrett 1992a, 1992b, Eckert & Barrett 1995, Eckert et al. 1996, Kéry et al. 2003, Barrett & Shore 2008, Barrett et al. 2009, 2010, Zhou et al. 2012). For example, it is widely accepted that founder events or past bottlenecks can lead to the random loss of genetic variants (Nei et al. 1975). As a result, populations may undergo a considerable loss of neutral genetic diversity and a probable reduction in the allelic diversity of the loci responsible for floral morph variation (Barrett et al. 2009), which could seriously affect floral morph ratios in plant populations. In this sense, it has been suggested that the effects of frequency-dependent selection through disassortative mating on the maintenance of floral polymorphisms can strongly be weakened by demographic factors (Barrett et al. 2010). Hence, assessments inferred from neutral molecular markers of the role of population history and demographic processes in floral morph ratios variation will form an important part of studies dealing with among-population variation in floral polymorphism (Hodgins & Barrett 2007, Barrett et al. 2010, Zhou et al. 2012). The central-marginal concept forms part of one of the ecological scenarios that may considerably enhance the assessment of the effects of demographic factors on floral polymorphism. Under this hypothesis, ecological, demographic and genetic features of populations are expected to differ depending on their location (i.e. core vs. periphery) within species' distribution ranges (Eckert et al. 2008 and references therein). In particular, peripheral populations are likely to be more isolated and have smaller populations due to generally sub-optimal environmental (e.g. climatic) 118 conditions at range margins (Chase & Leibold 2003). These population features are usually associated with reduced genetic diversity (Soulé 1973, Lammi et al. 1999, Gapare & Aitken 2005, Mandák et al. 2005, Eckstein et al. 2006, Cornman & Arnold 2007, Pfeifer et al. 2009, Leonardi et al. 2012), mainly because of increasing genetic drift and decreasing gene flow between populations that occur at range edges. Furthermore, marginal plant populations have also been found to have less phenotypic variation (Agnew 1968, Grant & Antonovics 1978, Cronberg et al. 1997, Eckert et al. 2008, Paiaro et al. 2012), probably due to a lack of the genetic variation needed for trait variation (Paul et al. 2011). That being said, we hypothesize that if historical and demographic processes have played an important role in shaping centre-margin patterns of variation in floral morph ratios across a style-polymorphic species' range, genetic diversity and gene flow will be greater at the core of the species’ range and will decline towards its range margins. The main goal of this study was to examine the genetic features of the populations of the style-dimorphic plant Narcissus papyraceus as a means of disentangling possible demographic causes of variation in floral morph ratios. Previous work on this species has detected a centre-margin pattern of variation in floral morph ratios (Barrett et al. 1996, Arroyo et al. 2002, Santos-Gally et al. 2013), which has been associated with variability in assortative vs. disassortative mating rates caused by among-population variation in the visiting pollinator fauna (Pérez-Barrales et al. 2007, Pérez-Barrales & Arroyo 2010, Santos-Gally et al. 2013). Alternatively, founder events, bottlenecks and their consequent genetic drift might explain the decline of polymorphism in the perimeter areas of this plant’s range (Arroyo et al. 2002), a scenario that is still to be properly explored. Thus, the main hypothesis that we test here is that stochastic population processes determine the pattern of 119 population morph ratios across the range of the species. Nuclear microsatellite genotyping was used to analyze populations with different floral morph ratios throughout a substantial part of the N. papyraceus' distribution range in the SW Mediterranean Basin. Our specific objectives were (i) to estimate genetic diversity and genetic structure of N. papyraceus populations, (ii) to infer effective population size and migration rates among populations, (iii) to determine the relationship between genetic attributes of populations and variation in floral morph ratios, and (iv) to analyze the association between climatic variation across core and peripheral distribution areas and variation in floral morph ratios and genetic diversity. Materials and Methods Study species and source populations Narcissus papyraceus Ker-Gawler (Amaryllidaceae) is a long-lived geophyte common in SW Mediterranean Basin whose range is centred upon the Strait of Gibraltar (Figure 1). The flowering period ranges from December to March. Inflorescences last up to one month and sequentially display up to 15 flowers. The species is self-incompatible but completely within-morph compatible (Arroyo et al. 2002, Chapter 2). It is visited by a wide array of generalist pollinators such as hoverflies, solitary bees, butterflies and moths (Arroyo et al. 2002, Pérez-Barrales et al. 2007, Santos-Gally et al. 2013). Narcissus papyraceus is style-dimorphic with individuals exhibiting either long- (L-morph) or short-styled (S-morph) flowers. The two morphs differ in the position 120 of the style, which is either above or below the stamens whose position in the floral tube is mostly invariable (Arroyo et al. 2002). Populations of N. papyraceus vary in the proportion of L- and S-morphs. Around the Strait of Gibraltar, populations tend to be isoplethic (1:1 ratio of L- to S-morph individuals). In the Iberian Peninsula, the S- morph frequency decreases northwards and in the northern part of its range populations are monomorphic for the L-morph (Arroyo et al. 2002). In Morocco, on the other hand, the S-morph is maintained in L-biased populations (Santos-Gally et al. 2013). In winter 2008–2009, we selected a total of 31 N. papyraceus populations throughout the species’ range (Figure 1 and Table 1). In agreement with geographical criteria, populations were classified into six regions defined by rivers (e.g. Guadiana, Guadalquivir and Sebou) and mountain ranges (e.g. Baetic Mountains) on both sides of the Strait of Gibraltar (Figure 1). The names and codes of the six geographical regions (Figure 1) were: Central Morocco (CM), Northern Morocco (NM), Gibraltar Area (GI), Guadalquivir Basin (GB), Baetic Mountains (BM) and Algarve (AL). The number of populations sampled per region (N = 2–12) was determined by the abundance of the species within each region (Figure 1). We estimated population size by counting floral clumps. In large populations, floral clumps were counted across defined areas and extrapolated for the complete population. For each population, we estimated the morph ratio by visual determination of the floral morph of 25–213 randomly chosen flowers from different individuals, totaling 3,514 flowers. Individuals were separated from each 121 Figure 1. Map with the location of the 31 Narcissus papyraceus populations studied in six geographic regions. The study area is located within the square on the map. The proportion of L- (black) and S-morph (white) within each population is indicated. Region codes: CM, Central Morocco; NM, Northern Morocco; GI, Gibraltar Area; GB, Guadalquivir Basin; BM, Baetic Mountains; AL, Algarve. 128 Finally, we conducted SAR models to correlate climatic variables with each of the genetic diversity parameters of N. papyraceus populations. Results Population characteristics The 31 sampled N. papyraceus populations were located between 32º39,6’ N – 37º50,4’ N and 3º25,8’ W – 8º39,6’ W (Figure 1 and Table 1). Altitudes ranged between 12 and 962 m a.s.l. (Table 1). Weather records indicated that the annual mean temperatures and total annual precipitation were in the range 14.2–18.6 ºC and 339–862 mm, respectively (Table S1). Estimates of population size varied from a low of 25 to a high of 3,000 individuals (Table 1). S-morph frequency varied between 0 and 64% (Table 1). The highest proportions of S-morph individuals were found in populations from Morocco and the Gibraltar Area (Figure 1 and Table 1). Genetic diversity, differentiation and structure The percentage of polymorphic loci varied between 62.5 and 100% among N. papyraceus populations (among-population mean PL ± SD = 95.2 ± 8.3; Table S2). The mean number of alleles per locus (na) ranged between 2.9 and 11.8 among populations (mean na ± SD = 8.0 ± 1.9), genetic diversity (HS) between 0.33 and 0.81 (mean HS ± SD = 0.69 ± 0.08) and allelic richness (RS) between 1.7 and 3.2 (mean RS ± SD = 2.8 ± 0.3; Table S2). Private allelic richness (RP) was low in all populations, 129 varying between 0.03 and 0.27 (mean RP ± SD = 0.16 ± 0.06). Fixation indexes (FIS) were positive and ranged from 0.24 to 0.55 among populations with the exception of population 31, which had a coefficient of -0.33 (mean FIS ± SD = 0.37 ± 0.15; Table S2). The six geographical regions differed significantly for na and RS (F5,25 > 2.97, P < 0.031 in both cases). PL, HS and FIS did not vary significantly among geographical regions (P > 0.14 in all cases). For na, Moroccan and Gibraltar Area populations exhibited higher values than in the other regions (Table 2A). By contrast, differences in RS were less pronounced among geographical regions. For na and RS, the populations from Morocco and Algarve ranked as the most and least diverse, respectively (Table 2A). The three groups of floral morph ratio (monomorphic, anisoplethic and isoplethic) did not differ significantly for PL or FIS (P > 0.56 in both cases) but were significantly different for na, HS and RS (F2,30 > 3.82, P < 0.034 in all cases). The isoplethic and monomorphic groups of populations had the highest and lowest values for HS and RS, respectively (Table 2B). For na, the anisoplethic group of populations exhibited the highest value, while the isoplethic and monomorphic groups had the lowest values (Table 2B). Within the dimorphic populations in which L- and S-morph individuals were sampled, none of the genetic diversity parameters differed significantly between floral morphs (P > 0.11 in all comparisons). The Bayesian structuring method detected two genetic clusters. One group included all the Moroccan populations and the Iberian coastal populations 11 and 18 (the Moroccan cluster; Figure 2), while the second group consisted of the remaining Iberian populations (the Iberian cluster; Figure 2). This result was obtained with a non-admixture model when we supplied information of the prior individual 130 assignment to pre-defined populations. In all other cases, the analysis did not detect structured groups in the genetic data set. The two genetic clusters differed significantly for na, HS and RS (F1,30 > 4.41, P < 0.045 in all cases), the Moroccan cluster being more diverse than the Iberian cluster, but not for PL or FIS (P > 0.49 in both cases; Table 2C). AMOVAs showed that in all hierarchical models approximately 90% of the genetic variation occurred among individuals within populations (Table 3). Genetic differentiation among geographical regions (FRT = 0.025) and floral morph ratio groups (FRT = 0.001) was low but significant (Table 3A and 3B). Genetic differentiation among populations within geographical regions (FST = 0.105) and among populations within groups of floral morph ratio (FST = 0.100) was also significant (Table 3A and 3B). Albeit low, AMOVA also detected significant differences between genetic clusters (FRT = 0.019) and among populations within genetic clusters (FST = 0.109; Table 3C). Factorial Analysis of Correspondences (FCA) yielded three axes explaining 8.9%, 7.3% and 6.6% of the variance, respectively. The first axis clearly separated populations from Morocco and Algarve (Figure 2). In general, the consistency of the results obtained with FCA and Bayesian methods supported the idea that the geographical genetic structure of N. papyraceus is weak (Figure 2). The Mantel test did not detect isolation-by-distance with population pairwise genetic differences (P = 0.13), but found isolation-by-distance when using pairwise genetic differences among the six geographical regions (r = 0.47, P = 0.004). 131 Table 2. Mean (± SD) genetic diversity parameters of 31 Narcissus papyraceus populations grouped by (A) geographic region, (B) floral morph ratio group, and (C) genetic cluster estimated with STRUCTURE. Number of populations (N), percentage of polymorphic loci (PL), number of alleles per locus (na), genetic diversity (HS), allelic richness (RS) and the fixation index (FIS). Means with different letters differ significantly from one another (P < 0.05; Student-Newman-Keuls post hoc test). (A) Geographic regions N PL (%) na HS RS FIS Central Morocco 5 92.50 ± 6.85 9.72 ± 0.62 a 0.734 ± 0.035 3.00 ± 0.10 ab 0.33 ± 0.07 Northern Morocco 2 100.00 ± 0.00 10.35 ± 0.97 a 0.770 ± 0.056 3.10 ± 0.17 a 0.37 ± 0.11 Gibraltar Area 12 95.83 ± 6.15 8.25 ± 0.40 ab 0.707 ± 0.023 2.89 ± 0.07 ab 0.40 ± 0.05 Guadalquivir Basin 6 93.75 ± 15.31 6.92 ± 0.56 bc 0.642 ± 0.032 2.65 ± 0.10 ab 0.31 ± 0.06 Baetic Mountains 3 95.83 ± 7.22 7.03 ± 0.80 bc 0.677 ± 0.046 2.77 ± 0.14 ab 0.35 ± 0.09 Algarve 3 95.83 ± 7.22 5.23 ± 0.80 c 0.613 ± 0.046 2.53 ± 0.14 b 0.48 ± 0.09 (B) Floral morph ratio groups N PL (%) na HS RS FIS Monomorphic 9 93.06 ± 2.82 6.89 ± 0.55 b 0.638 ± 0.026 b 2.66 ± 0.08 b 0.33 ± 0.05 Anisoplethic 16 95.31 ± 2.11 9.75 ± 0.68 a 0.698 ± 0.019 ab 2.86 ± 0.06 ab 0.39 ± 0.04 Isoplethic 6 97.92 ± 3.45 7.88 ± 0.42 b 0.750 ± 0.031 a 3.00 ± 0.10 a 0.37 ± 0.06 (C) Genetic clusters N PL (%) na HS RS FIS Moroccan cluster 9 95.83 ± 2.82 9.57 ± 0.53 a 0.738 ± 0.027 a 2.99 ± 0.08 a 0.34 ± 0.05 Iberian cluster 22 94.89 ± 1.81 7.30 ± 0.34 b 0.671 ± 0.017 b 2.76 ± 0.05 b 0.38 ± 0.03 132 Figure 2. Genetic structure of the Narcissus papyraceus populations given by STRUCTURE and Factorial Analysis of Correspondences (FCA). Populations are represented along the first two axes of FCA with the percentage of explained variance in parenthesis. The dotted line separates Moroccan from Iberian populations independently of the genetic cluster. The Moroccan (grey) and Iberian (white) genetic clusters are indicated as the proportional population membership to each genetic cluster. 133 Table 3. Analyses of Molecular Variance (AMOVA) for 31 Narcissus papyraceus populations grouped by (A) geographic region, (B) floral morph ratio group and (C) genetic cluster estimated with STRUCTURE. (A) Geographic regions d.f. Variance components Fixation indices Among geographic regions 5 2.47 0.025*** Among populations within regions 25 8.02 0.105*** Among individuals within populations 481 43.00 0.480*** Within individuals 512 46.51 0.535*** (B) Floral morph ratio groups d.f. Variance components Fixation indices Among floral morph ratio groups 2 0.07 0.001* Among populations within groups 28 9.97 0.100*** Among individuals within populations 481 43.22 0.480*** Within individuals 512 46.74 0.533*** (C) Genetic clusters d.f. Variance components Fixation indices Among genetic clusters 1 1.91 0.019*** Among populations within clusters 29 8.94 0.109*** Among individuals within populations 481 42.88 0.481*** Within individuals 510 46.26 0.537*** Degrees of freedom (d.f.), variance components (%) and fixation indices for each level of hierarchical variation are given. Significance: ***, P < 0.001; *, P < 0.05. 134 Θ values and migration rates All Θ estimates obtained with MIGRATE differed significantly, based on the overlap of 95% CI between Θ values, among geographical regions, floral morph ratio groups and genetic clusters (Table 4). The only exception was the Θ values for Central and Northern Morocco. Populations from the Gibraltar Area and Algarve exhibited the highest and lowest Θ values, respectively (Table 4A). The Θ value from the Gibraltar Area was six-times higher than that from Algarve. The Θ value of isoplethic populations doubled that of the monomorphic populations (Table 4B). The Moroccan genetic cluster showed a higher Θ value than that of the Iberian cluster, although the difference was not as marked (Table 4C). Populations from the central Gibraltar Area received more migrants from other regions (Table 4A). On the other hand, the peripheral regions of Algarve and Central Morocco received few migrants from other regions (Table 4A). Populations from the Gibraltar Area and Baetic Mountains donated by far the most migrants to the rest of the regions (Table 4A). In general, there was a trend towards greater migration rates between adjacent geographical regions (Table S3). Among floral morph ratio groups, we also detected differential patterns of migration. Anisoplethic populations almost doubled the number of immigrants with respect to monomorphic and isoplethic populations (Table 4B). Differences in emigration rates were less pronounced among floral morph ratio groups, although monomorphic and isoplethic populations had the highest and the lowest emigration rates, respectively (Table 4B). The Moroccan and Iberian genetic clusters exchanged a similar number of migrants (Table 4C). 135 Table 4. Results from MIGRATE analyses of 31 Narcissus papyraceus populations grouped by (A) geographic region, (B) floral morph ratio group and (C) genetic cluster estimated using STRUCTURE. Θ values and net number of immigrants and emigrants from the fifth final consecutive simulation are given for each group of populations. The 95% CI are indicated in parenthesis. For each variable and group of populations, values with different letters differ significantly from one another given the overlap of their 95% CI. (A) Geographic regions Θ value Immigrants Emigrants Central Morocco 5.54 (5.23 – 5.87) b 5.02 (4.32 – 5.80) c 4.72 (4.04 – 5.51) c Northern Morocco 6.02 (5.43 – 6.70) b 8.75 (7.53 – 10.11) b 4.75 (4.00 – 5.58) c Gibraltar Area 7.21 (6.92 – 7.52) a 11.91 (10.95 – 12.95) a 13.68 (12.24 – 15.24) a Guadalquivir Basin 3.87 (3.66 – 4.09) c 8.76 (7.75 – 9.87) b 7.28 (6.34 – 8.31) b Baetic Mountains 1.59 (1.51 – 1.67) d 8.05 (7.06 – 9.13) b 11.84 (10.66 – 13.13) a Algarve 1.20 (1.13 – 1.28) e 5.67 (4.74 – 6.75) c 5.90 (5.05 – 6.85) bc (B) Morph ratio groups Θ value Immigrants Emigrants Monomorphic 4.69 (4.50 – 4.92) c 7.92 (7.48 – 8.39) c 13.58 (12.83 – 14.40) a Anisoplethic 9.29 (8.92 – 9.68) b 15.29 (14.51 – 16.20) a 10.05 (9.53 – 10.62) b Isoplethic 10.33 (9.74 – 10.98) a 8.94 (8.42 – 9.48) b 8.52 (8.06 – 9.06) c (C) Genetic clusters Θ value Immigrants Emigrants Moroccan cluster 10.29 (9.86 – 10.75) a 5.16 (4.92 – 5.41) a 4.34 (4.13 – 4.55) b Iberian cluster 8.45 (8.18 – 8.75) b 4.34 (4.14 – 4.55) b 5.16 (4.92 – 5.41) a 136 Spatial patterns Analysis of spatial patterns revealed significant spatial autocorrelation for the S- morph frequency. The S-morph frequency was significantly spatially autocorrelated within a range of 50 km (Moran’s I = 0.41, P < 0.05). By contrast, none of the genetic diversity parameters exhibited significant spatial autocorrelation (P > 0.05 in all cases). The Simultaneous Autoregressive Models (SAR) found significant positive relationships between S-morph frequency and genetic diversity parameters such as na and RS (Figure 3). HS was marginally positively correlated with S-morph frequency (Figure 3). The SAR model was not significant for the correlation between S-morph frequency and proportional membership to the Moroccan genetic cluster (P = 0.51). Partial Mantel tests did not find significant associations between S-morph frequency and genetic differences among populations (P = 0.15). Population size did not significantly correlate with S-morph frequency or with population genetic diversity parameters (P > 0.27 in all cases). Climatic effects SAR models found significant negative relationships between S-morph frequency and temperature range-related variables (P < 0.003 in all cases; Table 5) such as the mean diurnal range (i.e. the difference between maximum and minimum monthly temperatures), temperature seasonality (i.e. standard deviation of temperature records), the maximum temperature of the warmest month and the annual 137 Figure 3. Linear relationships between S-morph frequency and mean number of alleles per locus (na), genetic diversity (HS) and allelic richness (RS). Correlation coefficients and P-values are given. 144 Acknowledgements We would like to thank I. Máximo, D. Barranco and the staff of the Molecular Ecology Laboratory of the Estación Biológica de Doñana for their assistance in the laboratory. R. Santos, J.L. Silva, A. de Castro, J. Ruiz, M. Serra, H. Amador, J.L. Simón, V. Fernández-Pasquier and D. Salvachúa assisted with the sampling work. We are grateful to R. Peakall and T.R. Meagher for their assistance with the preparation of the database and comments on the text, respectively, and to M. Lockwood for the linguistic revision. The background map on Figure 1 was supplied by the University of Texas Libraries, The University of Texas at Austin. This research was supported by funding from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (grants CGL-2006-13847-C02-01 and CGL-2009-12565 to J.A.) and the Regional Government of Andalusia (PAIDI grants P07-RNM-02869 to J.A. and F.X.P and P09-RNM-5280 to J.A.). V.I.S.P. was supported by a fellowship from the Ministerio de Ciencia e Innovación of Spain (BES-2008-005014). References Agnew ADQ (1968) Variation and selection in an isolated series of populations of Lysimachia volkensii Engl. Evolution 22: 228–232. Arroyo J, Dafni A (1995) Variations in habitat season, flower traits and pollinators in dimorphic Narcissus tazetta L. (Amaryllidaceae) in Israel. 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En el Capítulo 5 queda manifiesto que los patrones de transferencia de polen mediados por insectos de probóscide larga se ajustan a la predicción de Baker et al. (2000a) a partir de la colocación de los órganos sexuales en la flor. Así, la extrapolación de estos resultados a un largo plazo implicaría que la transferencia de polen por parte de estos polinizadores de probóscide larga no mantendría el polimorfismo en las poblaciones por sí sola, como comúnmente se ha pensado. Sin embargo, un elemento podría compensar la ligera ventaja del morfo L dado el patrón de transferencia de polen por los polinizadores de probóscide larga: la alta deposición de polen propio (no compatible) que podría reducir su fecundidad por medio del descuento de óvulos debido al tipo de incompatibilidad de esta especie (Capítulo 2). Por tanto, la polinización por parte de los insectos de probóscide larga parece establecer un equilibrio en el éxito reproductor de ambos morfos estilares. Por el contrario, la perdida del morfo S parece ser inevitable bajo la acción de los polinizadores de probóscide corta, tanto en base a su patrón de transferencia de polen como a la deposición de polen propio en los estigmas. Así, los resultados del experimento de polinización son acordes con el patrón descubierto por Santos-Gally et al. (2013a), en el que la frecuencia de polinizadores de probóscide larga en las 257 poblaciones no se correlaciona con la frecuencia de morfo S, pero sí lo hace, negativamente, la frecuencia de polinizadores de probóscide corta. Habiendo descartado diferencias crípticas en el proceso de fecundación tras las polinizaciones entre individuos del mismo y de distintos morfos (Capítulo 2), los patrones de polinización (transferencia y deposición de polen propio) deberían ser los únicos determinantes de los patrones de cruzamiento en las poblaciones de N. papyraceus. La similitud del patrón de transferencia de polen por parte de los polinizadores de probóscide larga (Capítulo 5) con los resultados obtenidos independientemente en el experimento con análisis de paternidad (Capítulo 6) refleja esta correspondencia; en ambos estudios se obtuvieron altas tasas de cruzamientos entre distintos morfos y mayores tasas de cruzamientos entre individuos L que entre individuos S. A su vez, este paralelismo indica que, contrariamente a lo esperado, los cruzamientos ocurridos en el experimento de análisis de paternidad fueron mediados por polinizadores de probóscide larga tanto en el área dimórfica como en el área monomórfica de la especie. La alta fecundidad femenina del morfo S en el área monomórfica del experimento también denuncia la actuación de los polinizadores de probóscide larga en este área, lo cual contradice los patrones generales encontrados a partir de censos de polinizadores en la especie (Pérez-Barrales et al. 2007, Santos- Gally et al. 2013a). Poco se sabe acerca de cómo la variación climática interanual u otros elementos determinan la variabilidad demográfica en las comunidades de estos polinizadores. Para estudiarlo, sería necesaria la repetición continuada de censos de polinizadores con un registro exhaustivo de las condiciones ambientales. A pesar del paralelismo, las tasas de cruzamientos entre individuos L fueron aparentemente más altas en el experimento de transferencia de polen que en el de análisis de paternidad. El efecto de la autopolinización antes nombrado podría marcar esta diferencia o, independientemente, podría resultar de una competencia 258 polínica entre los distintos morfos dentro del pistilo. Para explorar esta última opción, sería interesante realizar polinizaciones mixtas controladas con polen de ambos morfos, imitando a las polinizaciones naturales, y llevando a cabo un análisis de paternidad posterior (cf. Sage et al. 1999). Finalmente, el desarrollo de la progenie procedente de distintos morfos maternos y tipos de cruzamientos (Capítulo 6) también podría afectar a la desviación de los patrones de éxito reproductor de los morfos de sus patrones de polinización, aparentemente en beneficio del morfo S y de los cruces entre individuos de distintos morfos. Así, los eventos postdispersivos también podrían operar a favor del mantenimiento del dimorfismo en las poblaciones. Obviando los vectores y los procesos de polinización implicados, en el experimento sobre los patrones de cruzamiento (Capítulo 6) es notable que en todas las poblaciones experimentales se cumplieron al menos las ecuaciones de Lloyd y Webb (1992a) para uno de los dos morfos. Además, en tres poblaciones (dos con la misma proporción de ambos morfos y otra con mayor proporción de S) se cumplieron las condiciones para los dos morfos. Tomados en su conjunto, los resultados de este capítulo indican la prevalencia de los cruzamientos entre morfos distintos y por tanto la posible estabilidad general del dimorfismo estilar en la especie. Sin embargo, dicha estabilidad podría encontrarse en un delicado equilibrio. La selección dependiente de la frecuencia puede jugar en contra de la persistencia del dimorfismo en las poblaciones de esta especie sin incompatibilidad heteromórfica. En tanto que en las especies con incompatibilidad heteromórfica existe una selección negativamente dependiente de la frecuencia que equilibra la proporción de morfos en la población, en las especies sin incompatibilidad heteromórfica puede ocurrir lo 259 Figura 1. Selección dependiente de la frecuencia de los morfos. Poblaciones con proporciones L:S de 1:1 (a, b), 2:1 (c, d), y 1:2 (e, f) en especies con incompatibilidad heteromórfica (a, c, e) y en N. papyraceus (b, d, f). Las flechas indican todos los cruzamientos recíprocos posibles al azar. Los colores indican progenie del morfo L (rojo), de ambos morfos (morado), o de morfo S, al menos predominantemente (azul). El grosor de las flechas indica la probabilidad teórica del cruzamiento de acuerdo a la reciprocidad sexual de los morfos implicados. Los gráficos circulares indican la frecuencia teórica al azar de cada tipo de cruce (en grande) y la extraída como promedio en las poblaciones experimentales con desviaciones significativas de los cruzamientos al azar del Capítulo 6 (en pequeño; no hubo poblaciones L-dominantes con desviaciones del azar). a) b) c) d) e) f) L L S S S S L L L L S S L L L S S S L L L L S S L L L S S S L L S S S S 260 contrario. Mientras que los individuos del morfo poco común se cruzan con los del morfo más frecuente, estos últimos pueden cruzarse entre sí y aumentar por tanto su frecuencia hasta fijarse en la población, por lo que acontecería una selección positivamente dependiente de la frecuencia (Figura 1). Aunque en el Capítulo 6 se observó esta selección positiva tanto en las poblaciones experimentales con morfo L dominante como en las poblaciones experimentales con morfo S dominante, la menor reciprocidad sexual entre los individuos del morfo S podría reducir en cierta medida la selección positiva en este morfo. En tal contexto, es fácil descifrar la importancia del papel de los procesos estocásticos poblacionales (Capítulo 4) en la reversión al monomorfismo, pues estos procesos podrían determinar tanto ligeras desviaciones de la proporción 1:1 de morfos florales como la pérdida total de un genotipo poco frecuente. La pérdida del morfo S En síntesis, los resultados de la Tesis Doctoral indican que varias causas no excluyentes han podido determinar la menor frecuencia o pérdida recurrente del morfo S en muchas de las poblaciones de Narcissus papyraceus (Figura 2). En primer lugar, aunque el dimorfismo parece estar garantizado bajo la acción de polinizadores de probóscide larga (Figura 2a), sin el efecto de la deposición de polen propio en los estigmas L por parte de estos polinizadores el morfo L podría tener una ventaja reproductora (Figura 2b). Por su parte, el efecto de los polinizadores de probóscide corta debe suponer la pérdida directa del morfo S (Figura 2c). La presencia de polinizadores de probóscide corta en una población ha de reducir forzosamente el éxito reproductor femenino del morfo S. No obstante, la reversión al …………………… 261 Figura 2. Escenario de pérdida del morfo S a partir de una proporción inicial 1:1 de morfos L:S. El orden de los mecanismos implicados puede variar. e) Deriva genética, pérdida de los genotipos menos frecuentes c) Menor fecundidad del morfo S d) Selección dependiente de la frecuencia, menor probabilidad de cruzamientos S S que L L L S a) Mismo éxito reproductor y prevalencia de los cruzamientos entre distintos morfos L S L S L S S L L b) Ruptura del equilibrio en la polinización: mayor probabilidad de cruzamientos LxL Polinizador de probóscide larga Polinizador de probóscide corta 262 monomorfismo L en las poblaciones podría no requerir que estos visitantes florales de probóscide corta fuesen dominantes en exceso, pues se ha visto que una ligera desventaja para un morfo puede terminar comportando su pérdida en la población por el efecto de la selección dependiente de la frecuencia (Figura 2d). Esta selección actuaría especialmente en contra del morfo S por su menor reciprocidad sexual, que dificulta los cruces S×S en comparación con los cruces L×L. Además, factores demográficos desestabilizadores en la formación de las poblaciones (e.g. efectos fundadores, cuellos de botella) y la deriva genética pueden también favorecer la reversión al monomorfismo (Figura 2e). Se ha sugerido que la base genética de los morfos florales podría favorecer la pérdida del morfo S en las poblaciones (Arroyo & Dafni 1995). El modelo de herencia de un locus dialélico propuesto por Dulberger (1964) para Narcissus tazetta, según el cual el morfo L es homocigoto recesivo (ss) y el morfo S tiene el alelo dominante (Ss; con inexistencia virtual del genotipo SS), es el mismo que el sistema mendeliano propuesto para algunas plantas distilas (véase la revisión de Lewis & Jones 1992). En estas, los cruces entre morfos distintos (ss × Ss) obligados por el sistema de incompatibilidad heteromórfico dan lugar a una progenie 1:1 de genotipos ss : Ss; manteniendo el equilibrio de la proporción de morfos en la población generación tras generación. En ausencia de la incompatibilidad heteromórfica, los cruces ss × ss (entre individuos de morfo L) dan lugar a progenie ss (morfo L), mientras que los cruces Ss × Ss (entre individuos de morfo S) dan lugar a progenie 1SS : 2Ss : 1ss (morfos S y L). Esta idea sugiere que el morfo S tiene una desventaja, puesto que no podría establecer poblaciones monomórficas. No obstante, es notable que una pequeña tasa de cruzamientos entre individuos del morfo S llevaría al genotipo SS a aumentar en la población con el paso de las generaciones, reduciendo la desventaja del morfo S. Además, el carácter dominante del alelo que 263 supuestamente determina este morfo también debería reducir dicha desventaja en cuanto aconteciesen cruces SS × ss. Richards (1997, 1998) sugirió que el genotipo SS era letal, lo cual impediría las ventajas explicadas, pero su afirmación no posee evidencia empírica (Shore & Barrett 1985, Eckert & Barrett 1993). Así pues, el papel de la base genética de los morfos florales en su frecuencia de aparición debe ser muy secundario, por la falta de incompatibilidad ligada al morfo. No obstante, sería necesario estudiar a fondo esta base genética y los posibles efectos directos (longitud estilar) e indirectos (desarrollo de la progenie, Capítulo 6) que puedan afectar al éxito de los morfos. La aplicación del modelo evolutivo de la heterostilia de Lloyd y Webb al género Narcissus Esta Tesis Doctoral se enmarca en un programa de investigación encaminado a probar el modelo de Lloyd y Webb (1992a, b; Figura 3) de la evolución de la heterostilia en el género Narcissus. Los resultados han demostrado que el dimorfismo estilar en Narcissus papyraceus puede, en la medida en que su limitada reciprocidad le permite, promover cruzamientos entre distintos morfos. La independencia de este hecho de la existencia de un sistema de incompatibilidad heteromórfico apoya el modelo de Lloyd y Webb. No obstante, la aplicación de todos los puntos de dicho modelo a Narcissus debería matizarse. 264 Debe tenerse en cuenta que el modelo evolutivo de Lloyd y Webb fue desarrollado, en lo que se refiere a la incompatibilidad, para sistemas heteromórficos. El modelo expresa, como lo hiciese Darwin en 1877, que la incompatibilidad heteromórfica no puede seleccionarse antes que la hercogamia recíproca porque por sí sola implica que la mitad de las polinizaciones cruzadas son incompatibles, y por tanto reduce el éxito reproductor. Por consiguiente, su propuesta de sucesión de eventos (hercogamia recíproca seguida por incompatibilidad) no sería obligada en las especies polimórficas con un sistema de incompatibilidad homomórfico (circunscritas a los géneros Narcissus, Anchusa y a algunas otras Boraginaceae), donde todas las polinizaciones cruzadas son compatibles independientemente de los morfos implicados, supuestamente debido a la existencia de muchos alelos que gobiernan el sistema de incompatibilidad (Lloyd & Webb 1992a; pág. 197). Lloyd y Webb (1992a; pág. 202) aceptaron que la fuerza de la selección a favor de la polinización cruzada dependería de la secuencia en la que habían aparecido los principales rasgos de las especies heterostilas, y que si los antepasados hubiesen sido autoincompatibles, la selección contra la autopolinización probablemente habría tenido un papel mucho más importante en la aparición de la heterostilia que el que ellos le habían asignado. La autopolinización (o en general, la interferencia sexual) limita el éxito masculino y femenino reduciendo la liberación de polen propio y la recepción de polen ajeno, por lo cual se considera una fuerza selectiva importante en la evolución floral (Barrett 2002) que conduce a la selección gradual de fenotipos hercógamos (Karron et al. 1997, Stone & Motten 2002, Herlihy & Eckert 2007, Larrinaga et al. 2009, Navarro et al. 2012, Luo & Widmer 2013, pero véase Medrano et al. 2005). Suele también asumirse que la evitación de la autofecundación es la principal fuerza selectiva promotora de la autoincompatibilidad (Charlesworth & Charlesworth 1987). 265 Figura 3. Modelo evolutivo de Lloyd y Webb (1992 a, b) de la evolución de la heterostilia. Las dos primeras transiciones responden a mutaciones morfológicas sencillas y discretas seleccionadas para la promoción de la fecundación cruzada. La tercera transición (aparición de la incompatibilidad heteromórfica) responde a un cambio gradual en la reacción polen-pistilo seleccionado para evitar la autopolinización y potenciar así el efecto de la hercogamia recíproca. Hercogamia de aproximación Dimorfismo estilar Heterostilia Hercogamia recíproca 272 papyraceus (véanse la figura 3 en Philipp & Schou 1981 y la figura 2 en Ferrero et al. 2009 y 2011), y que en algunas especies de Lithodora y Glandora hay poblaciones tanto con dimorfismo estilar como con heterostilia, fruto de una variación gradual (Ferrero et al. 2011; véanse también Thompson et al. 2012, Haddadchi 2013). Además, es interesante observar que una variación continua en la longitud del estilo, desde la hercogamia reversa (estigma situado bajo las anteras) hasta la de aproximación, ocurre en otra especie de la misma subfamilia Boraginoideae, Mertensia fusiformis (Forrest et al. 2011). Consideración final Para terminar, es importante reseñar de nuevo la validez de algunos de los principales puntos del modelo evolutivo de Lloyd y Webb (1992a, b) en el género Narcissus. Aunque la incompatibilidad homomórfica podría haber sido previa a la aparición del dimorfismo estilar y la selección en contra de la autointerferencia podría haber tenido un papel en su aparición, la promoción de la polinización cruzada podría haber seleccionado de forma importante la posición de los órganos sexuales a continuación. Por ejemplo, el movimiento hacia arriba del verticilo inferior de anteras en el morfo S de N. papyraceus y de otros Narcissus dimórficos estilares y la selección de fenotipos heterostilos y tristilos en las especies derivadas N. albimarginatus y N. triandrus, mejoran claramente la reciprocidad entre morfos florales de las especies dimórficas (Pérez-Barrales et al. 2006). Además, como Lloyd y Webb modelaron siguiendo las ideas de Darwin, la prevalencia de los cruzamientos entre individuos de distintos 273 morfos es necesaria para el mantenimiento del polimorfismo en las poblaciones. El papel selectivo de los polinizadores es también importante, pues además de mediar precisamente dicha polinización cruzada entre morfos florales, pueden determinar fuertemente la pérdida de polimorfismo, como esta Tesis Doctoral ha demostrado. Referencias Ågren J, Ericson L (1996) Population structure and morphspecific fitness differences in tristylous Lythrum salicaria. Evolution 50: 126–139. Arroyo J, Dafni A (1995) Variations in habitat season, flower traits and pollinators in dimorphic Narcissus tazetta L. (Amaryllidaceae) in Israel. New Phytologist 129: 135–145. Arroyo J, Barrett SCH, Hidalgo R, Cole WW (2002) Evolutionary maintenance of stigma-height dimorphism in Narcissus papyraceus (Amaryllidaceae). American Journal of Botany 89: 1242–1249. 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Thus, selfpollination in Narcissus papyraceus results in visible ovule discounting, as suggested on the basis of prior hand-pollination experiments. 3- The nuclear microsatellites developed for Narcissus papyraceus are highly variable and therefore useful for studies of population genetics and paternity analysis. They are transferable to other species of Narcissus, so they could be employed to address new ecological evolutionary questions in the genus, also beyond stylar polymorphism (e.g. intrapopulation genetic structure, pollination and dispersal distances). 290 4- The geographic pattern of floral morph ratios in Narcissus papyraceus populations is not associated with the genetic relatedness of populations, although it is with their genetic diversity and effective population size. Founder events or bottlenecks and genetic drift derived from them may have influenced the loss of polymorphism. 5- Due to the different reciprocity of sexual organs of morphs in Narcissus papyraceus, the pattern of pollen transfer mediated by long-tongued pollinators rise to high rates of pollen deposition in crosses L×L, L×S and S×L, and low rates of pollen deposition in crosses S×S. The L-morph reproductive advantage given this pattern may be offset by high non-compatible self-pollen deposition. Thus, the interaction of long-tongued pollinators with flowers of this species implies a balance in the reproductive success of both morphs. 6- The short-tongued pollinators are ineffective because they remove large amounts of pollen from the anthers but deposit a limited number of grains on the stigmas of the L-morph and virtually no grains on the stigmas of S-morph. The female reproductive success of S-morph must be zero under the action of these floral visitors, given also the amount of non-compatible self-pollen that they deposit on their stigmas. 291 7- The pattern of effective fertilisation between floral morphs, inferred from microsatellite-based paternity analysis in experimental populations in the dimorphic and monomorphic areas of the species’ distribution range, reflected the performance of long-tongued pollinators in both areas. This pattern indicated the prevalence of disassortative mating in most populations. 8- In accordance with the theory of frequency-dependent selection, individuals of the less common morph on experimental populations were crossed over more frequently to the dominant morph, whereas the latter individuals were crossed over each other. This result indicates that small deviations from a 1:1 ratio of morphs may be accentuated with time and therefore stylar dimorphism could be maintained in populations in a fragile equilibrium. 9- The loss of the S-morph in populations in the northern margin range of Narcissus papyraceus must have been determined by its reproductive disadvantage under the action of short-tongued pollinators, powered by destabilizing demographic events in the formation of populations and crossing patterns determined by sexual reciprocity and the frequency of morphs in the absence of heteromorphic incompatibility. 292 10- Results of pollen transfer patterns indicate that stylar dimorphism can promote disassortative mating, which supports Darwin's (1877) and Lloyd and Webb's (1992) hypothesis. However, the uniqueness of ovarian self-incompatibility system in stylar-polymorphic Narcissus was not considered by these evolutionary models of heterostyly, and could have implications for the evolution of stylar dimorphism in the genus. 296 AGRADECIMIENTOS De pequeña me enamoré de la naturaleza en mi pueblo, Cobatillas, y en concreto de los “bichitos” y las plantas. Qué mejor premio para mí que haber tenido la oportunidad de hacer esta tesis después de tantos años de estudio. Quiero agradecer a mucha gente el haber llegado hasta aquí, empezando por Juan. Gracias Juan por toda tu ayuda y por la confianza que has depositado en mí desde aquel primer día en que nos conocimos en Madrid hasta el día de mi defensa. Ha sido para mí un inestimable apoyo a lo largo de estos años. A Xavi, muchas gracias por haberte embarcado en esto con todas sus consecuencias, por tus ánimos en los primeros tiempos del laboratorio y por todos tus buenos consejos y meticulosas correcciones. A ambos, muchas gracias por todo lo que me habéis enseñado. He tenido mucha suerte de poder contar con dos directores tan complementarios y de tanta calidad. Ojalá haya sabido asimilar una pequeña parte de las cualidades científicas de cada uno. Agradezco también a todos los miembros del tribunal: Montse Arista, Clara Castellanos, Hans Jacquemyn, Marcos Méndez, Mario Vallejo, Rafa Albaladejo, Marisa Buide y Alfredo Valido, el haber aceptado evaluar este trabajo. A Rocío Pérez 297 y John Thompson, muchas gracias por sus informes favorables para optar a la mención de Doctorado Internacional. A María Herrero y Thomas Meagher les agradezco haberme ofrecido tanto su calidad científica como humana en mis estancias en Zaragoza y St. Andrews. Fueron dos temporadas muy agradables y en las que aprendí mucho. A Peter Gibbs le agradezco sus también agradables e instructivas conversaciones sobre la autoincompatibilidad mientras tomábamos té o fish and chips en Market Street. A Rod Peakall le agradezco el haber posibilitado tal aventura como fue el embarcarme hacia las (casi) antípodas, y por haberme introducido en el uso del GeneMapper. A Eva, Liz, Thomas, Mari Carmen, Reyes, Erica, Walid, Juan, Sonia, Peter, Paris… gracias por hacer mejores mis estancias. Gracias a los grupos EVOCA y ECOFLOR por apostar por los jóvenes investigadores, y por tantos emails y reuniones llenos de conocimiento. Gracias a la Universidad de Sevilla y a la Estación Biológica de Doñana por haberme albergado, ofrecido recursos y puesto en contacto con tantos profesores e investigadores de nivel. Poca gente puede tener dos sitios entre los que pivotar, y menos que sean dos tan buenos. Esa ha sido mi suerte. A toda la gente que me ha facilitado el trabajo de campo: la gente de la Finca de la Alcaidesa, el Parque de los Alcornocales y la Sierra de Hornachuelos, la Universidad de Tetuán, Salvador Talavera, Paco Vera; o me ha ofrecido su