Nanomedicina y cannabinoides: potencial uso en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares

1 TRABAJO DE FIN DE GRADO TRABAJO DE CARÁCTER EXPERIMENTAL GRADO EN FARMACIA NANOMEDICINA Y CANNABINOIDES: potencial uso en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares Alumna: Carla Gómez Peña Tutora: Dra. Lucía Martín Banderas Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Sevilla, julio 2023 2 RESUMEN Desde la antigüedad, la planta de Cannabis sativa L. o cáñamo indiano ha destacado por múltiples características, entre las que adquieren principal importancia las propiedades psicoactivas. A pesar de ser este el motivo principal por el cual hoy en día es ampliamente conocida a nivel mundial, el verdadero interés por parte de la comunidad científica despierta gracias al descubrimiento de sus propiedades medicinales. A lo largo de los años numerosos estudios han concluido que estas propiedades farmacológicas no se deben únicamente a la presencia de cannabinoides (CBD, THC, etc.) como principios activos, sino que, además, existen otras sustancias secundarias (terpenos o flavonoides) capaces de modificar el efecto farmacológico de los primeros. Entre estos componentes secundarios, destaca notablemente el -cariofileno. Este, al interaccionar con el Sistema Cannabinoide ha evidenciado poseer propiedades antiinflamatorias y analgésicas. Además, a esto se suma su capacidad para interactuar únicamente con los receptores cannabinoides tipo II, eximiendo por tanto las propiedades psicoactivas características de los receptores cannabinoides tipo I. La evidencia de sus beneficios farmacológicos unido a la demostrada actividad agonista CB2, ha llevado a poner el foco en la búsqueda de un sistema óptimo y seguro para la administración del compuesto en cuestión, que permita la llegada del mismo a los tejidos diana. Para ello, se ha hecho uso de la nanomedicina, una disciplina de la nanotecnología que permite vehicular los fármacos en estructuras nanométricas, capaces de acceder fácilmente al lugar de acción, lo que permite mejorar considerablemente la calidad de vida de los seres humanos. Concretamente en este trabajo de carácter experimental, se ha centrado en el uso de la nanomedicina para desarrollar un sistema eficaz de administración del -cariofileno como posible tratamiento de enfermedades cardiovasculares como la aterosclerosis. PALABRAS CLAVE: -cariofileno (-CFN), nanopartículas (NPs), receptor CB2 (CB2R), efecto séquito, actividad antiinflamatoria. 3 ABSTRACT Since ancient times, Cannabis sativa L. plant or indian hemp has been focus of attention because of many reasons, among them, the psychoactive properties. This is probably the main reason to be known worldwide. Nevertheless, the interest of the scientific community lies on its great therapeutic potential. Over years, many studies have demonstrated that the pharmacological properties are not only due to the presence of main cannabinoids (CBD, THC, etc.) but also because of the presence of secondary molecules (flavonoids or terpenes) able to modulate the pharmacological effect of the main cannabinoids. Among these secondary molecules, the terpene -caryophyllene recently received special attention because of its anti-inflammatory and analgesic effects. These effects are derived because of a selective interaction of this drug with the cannabinoid receptor type II. Moreover, this molecule does not exert psychoactive effects, which makes it more attractive. These evidences about its potential pharmacological benefits offer new potential pharmacological treatments for a wide variety of illness. Nevertheless, this molecule is a challenge, from a technological point of view, because it is a volatile and a really lipophilic molecule. For these reasons, the actual effort is to develop a suitable drug delivery system able to offer a suitable pharmacokinetic profile. In this sense, nanomedicine could be an alternative. It has been demonstrated that nano-drug delivery systems allow to transport and deliver drugs directly to the target. So, the objective of this work was to develop a suitable nanometric system for the effective administration of -caryophyllene, as a possible treatment for cardiovascular diseases such as atherosclerosis. KEYWORDS: -caryophyllene (-CFN), nanoparticles (NPs), CB2 receptor (CB2R), entourage effect, antiinflammatory activity. 4 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 5 1.1. CANNABIS MEDICINAL ....................................................................................... 5 1.2. ACTIVIDAD Y USO TERAPÉUTICO DEL CANNABIS .................................... 7 1.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA .................................................................................... 8 1.4. EFECTO SÉQUITO ............................................................................................... 10 1.5. PROPIEDADES Y MECANISMOS DE ACCIÓN. SISTEMA ENDOCANNABINOIDE......................................................................................... 11 1.6. -CARIOFILENO ................................................................................................... 13 1.7. NANOTECNOLOGÍA Y NANOMEDICINA ...................................................... 14 2. OBJETIVOS................................................................................................................................. 16 3. METODOLOGÍA ........................................................................................................................ 16 3.1. MATERIALES ........................................................................................................ 16 3.2. MÉTODOS .............................................................................................................. 17 3.2.1. Síntesis de nanopartículas de -CFN ......................................................... 17 3.2.1.1. Proceso de elaboración de Nanopartículas…………...……………….17 3.2.1.2. Cuantificación del -CFN por cromatografía………............................20 3.2.1.3. Eficacia de la encapsulación………………………………...………...20 3.2.2. Pruebas de congelación ............................................................................. 21 3.2.2.1. Pruebas de congelación con trehalosa………………………………..21 3.2.2.2. Pruebas de congelación con trehalosa y tensioactivos…………..……22 3.2.3. Pruebas de liofilización ................................................................................ 24 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................. 25 4.1. CARACTERÍSTICAS DE LAS NANOPARTÍCULAS ELABORADAS .......... 25 4.1.1. Tamaño, polidispersión de tamaños y carga eléctrica superficial ................ 25 4.1.2. Cuantificación del -CFN y Eficacia de la encapsulación .......................... 29 4.2. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE CONGELACIÓN ............................... 30 4.3. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE LIOFILIZACIÓN .............................. 33 5. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 35 6. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 36 5 1. INTRODUCCIÓN 1.1 CANNABIS MEDICINAL Cannabis sativa L. (Cannabaceae), también conocida como cáñamo indio es una planta herbácea, cultivada principalmente en Asia Central (India y China) desde la antigüedad (Bonini et al., 2018). Se trata de una especie que ha sido utilizada por el hombre durante muchos años, con una amplia variedad de objetivos: desde la elaboración de vestidos, cuerdas o papel a partir de las fibras de su tronco; hasta la utilización de sus semillas, bien como alimento o bien como fuente de aceite para crear jabones, pinturas y barnices (Ramos, 2003). Puede verse una imagen de la planta en la Figura 1. Figura 1. Planta de Cannabis sativa (Base de datos Fitoterapia, 2023) A pesar de los múltiples usos, fueron sus propiedades medicinales y psicoactivas las que despertaron gran interés, permitiendo su utilización en la actividad terapéutica. Estas se deben a unas sustancias denominadas cannabinoides que actúan sobre el Sistema Nervioso Central de aquellas personas que los inhalan o ingieren (Ramos, 2023). Así, desde su descubrimiento, el cannabis ha sido empleado en tratamientos tan diversos como el dolor, las convulsiones, los espasmos y el vómito (Casadiego Mesa et Lastra Bello, 2015). No obstante, fue el uso recreativo de la planta lo que le permitió alcanzar el verdadero auge, despertando el interés de la comunidad científica, quien se encargó del aislamiento y el análisis de sus componentes (Inzunza et Peña, 2019). Los preparados psicotrópicos obtenidos a partir del cannabis se conocen hoy en día con el nombre de marihuana o hachís, en función de las partes de la misma y los procesos utilizados para su obtención. La marihuana hace referencia a las flores desecadas y tallos que habitualmente 6 se fuman, mientras que el hachís describe a la resina concentrada que se obtiene a partir de las flores, la cual se puede ingerir (Fraguas-Sánchez et al., 2014). Es por estas propiedades psicoactivas, principalmente, por lo que hasta el año 2019 tanto el cannabis como su resina pertenecieron a la lista IV de Estupefacientes de la Convención Única de Viena de 1961, ocupando un espacio reservado únicamente para las sustancias más perjudiciales y con escaso valor médico reconocido. Sin embargo, las recomendaciones posteriores llevadas a cabo por la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre los beneficios médicos y terapéuticos y la revisión crítica sobre la planta elaborada por el comité de expertos en farmacodependencia (WHO, 2019), llevaron a la Comisión de Estupefacientes de la ONU a reconocer las propiedades terapéuticas del cannabis y por consiguiente, eliminarlo de la lista IV reclasificándolo nuevamente en la lista I de Estupefacientes de la Convención Única de Viena de 1961 (ONU, 2020). Así, la Agencia Europea del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS) recoge ahora que: “El Cannabis, la resina del cannabis y los extractos y tinturas de cannabis, se encuentran incluidos en la lista I de la citada Convención y están regulados por la citada Ley 17/1967, del 8 de abril”. Por lo tanto, son considerados estupefacientes estando exclusivamente limitada a fines médicos y científicos, su producción, fabricación, exportación, distribución, comercio, uso y posesión (AEMPS, 2023). No obstante, a pesar de las limitaciones y restricciones a ciertos ámbitos, el cannabis sigue siendo, con diferencia, la droga más consumida del mundo, habiendo aumentado su uso un 23% durante la última década. Al menos así lo recoge el Informe Mundial sobre las Drogas (2022) elaborado por La Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito (UNODC) (UNODC, 2022). Cierto es que, aunque el cannabis posea verdaderos beneficios, un uso irracional y continuado de la planta da lugar a dependencia, síndrome de abstinencia, déficit cognitivo y además, aumenta el riesgo de padecer enfermedades psiquiátricas (Rodríguez Carranza, 2012). Por esto, a pesar de ser la base de una industria global multimillonaria, el conocimiento científico y la investigación sobre esta hierba aún están rezagados en comparación con otros cultivos de alto valor (Booth et Bohlmann, 2019). Aunque en España, cada vez son más las empresas investigadoras que disponen de la autorización otorgada por la AEMPS, la cual, concede licencias para el cultivo de plantas de cáñamo con fines médicos y/o de investigación (AEMPS, 2023), todavía existen ciertas limitaciones sustanciales que requieren ser modificadas para que se pueda cultivar, producir, comercializar e investigar en condiciones de total legalidad (Kochen, 2022). De hecho, pese a la persistente lucha constante, el Parlamento español denegó nuevamente el pasado martes 21 de febrero la legalización integral del cannabis para uso terapéutico y recreativo (Proposición de Ley 122/00028, 2023). 7 1.2 ACTIVIDAD Y USO TERAPÉUTICO DEL CANNABIS Aunque actualmente, la marihuana sigue siendo motivo de debate, el uso médico de los cannabinoides está aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA). Los cannabinoides han demostrado tener, principalmente, cierta actividad terapéutica sobre desórdenes neurológicos y problemas cardiovasculares como son: trastornos de espasticidad asociada a esclerosis múltiple o lesiones de la médula espinal, epilepsia, trastornos convulsivos, síndrome de Tourette, alteraciones del movimiento, náuseas y vómitos en pacientes quimioterápicos antineoplásicos, anorexia-caquexia en pacientes con sida o cáncer... Además, ciertos estudios también han aportado datos relevantes sobre el uso de estos compuestos en el glaucoma o para el tratamiento del dolor (Silva et Carvalho, 2022). Si bien, es importante destacar que, aunque el cannabis puede aliviar los síntomas o ralentizar el avance de una enfermedad, investigaciones científicas no han demostrado un uso curativo (Bedrocan, 2022). El dronabinol y la nabilona fueron los primeros medicamentos cannabinoides aprobados por la FDA en la década de 1980. Ambos son formas sintéticas del tetrahidrocannabinol (THC) (Fundación CANNA, 2023). El dronabinol forma parte de algunos medicamentos comercializados a nivel europeo como son el Marinol® y el Syndros®. Su uso está aprobado para el tratamiento de náuseas y vómitos asociados a quimioterapia y para la anorexia asociada a la pérdida de peso en pacientes con SIDA. Por su parte, la nabilona, comercializada como Cesamet®, únicamente está aprobada para las náuseas y vómitos causados por la quimioterapia. Pese a su autorización y comercialización en varios países de Europa, ninguno de ellos está aún autorizado en España (Panorama Actual del Medicamento, 2023). En España está autorizado, por la AEMPS , el Sativex®, siendo legal su uso desde el año 2010. Se trata de un spray de aplicación en la mucosa oral que contiene dos extractos suaves de hoja y flor de C. sativa., estandarizados en Δ9-tetrahidrocannabinol (Δ9-THC) y cannabidiol (CBD). Su utilización, está únicamente restringida a la mejoría de los síntomas en pacientes con espasticidad moderada o grave debida a la esclerosis múltiple que no han respondido adecuadamente a otros tratamientos (Arana, 2019). Lo mismo ocurre con el Epidyolex®, tramitándose una autorización de comercialización válida en toda la UE casi una década más tarde, en 2019 (EMA, 2019). El CBD, comercializado en España bajo el nombre de Epidyolex® y presentado en forma de jarabe, ha sido autorizado como tratamiento complementario de convulsiones asociadas con el Síndrome de Lennox-Gastaut (SLG) o el Síndrome de Dravet (SD) en conjunto con clobazam, para pacientes a partir de los 2 años de edad (AEMPS, 2021). Dado que estas son enfermedades consideradas como raras, Epidyolex® ha sido reconocido por la Agencia Europea del Medicamento (EMA) como medicamento huérfano para estas patologías (Panorama Actual del Medicamento, 2023). 8 Es importante destacar que el acceso a todos estos medicamentos, presentes en la Figura 2, es extremadamente limitado, por motivos clínicos (falta de estudios que analicen eficacia en multitud de patologías), económicos (los precios son en algunos casos desorbitados) y legales (en la inmensa mayoría de los países del mundo el uso de estos productos no está permitido). Además, a esto también se le suman ciertas limitaciones farmacológicas (Fundación CANNA, 2023). MARINOL® CESAMET® SATIVEX® EPIDIOLEX® Figura 2. Medicamentos con cannabinoides o derivados de ellos en su composición (FDA.report, 2023) 1.3 COMPOSICIÓN QUÍMICA A pesar de las limitaciones, la investigación del cannabis ha ido creciendo a lo largo de los años, lo que ha permitido que hasta la actualidad se hayan aislado e identificado cerca de 400 compuestos naturales provenientes del metabolismo de C. sativa, de los cuales, al menos 60 presentan una estructura química de tipo cannabinoide (Callado, 2012). Estos también son conocidos con el nombre de fitocannabinoides y según el uso y contenido de los mismos, se puede clasificar el cannabis como tipo fibra (cáñamo o cáñamo industrial) o tipo droga (cannabis medicinal o marihuana) (Hurgobin et al., 2021). Los principales fitocannabinoides presentes en la planta son el TCH, el CBD, el cannabinol (CBN), el cannabigerol (CBG), la tetrahidrocannabivarina (THCV), el cannabicromeno (CBC) y sus respectivos ácidos (Papaseit et al., 2018). En la Figura 3 se describen todos los cannabinoides presentes en la planta, así como sus usos asociados. No obstante, el cannabis como medicamento a base de hierbas, es una mezcla compleja que además, presenta otros componentes como: fenoles no cannabinoides, flavonoides, terpenoides, alcoholes, aldehídos, n-alcanos, ésteres de cera, esteroides y alcaloides entre otros (Odieka et al., 2022). Dentro de los compuestos no cannabinoides los terpenos y flavonoides adquieren gran importancia. 15 aplicaciones, especialmente diagnósticas y terapéuticas (Lechuga, 2011). Desde el punto de vista farmacéutico, la nanotecnología ofrece múltiples posibilidades (i) permite vehiculizar tanto fármacos de bajo peso molecular, macromoléculas, péptidos, proteínas o material genético; (ii) permite la administración de fármacos de forma localizada o dirigida hacía un órgano diana; (iii) permite mejorar la biodisponibilidad oral, sostener su efecto en el tiempo; (iv) permite solubilizar fármacos para una administración intravascular; (v) permite mejorar la estabilidad de los agentes terapéuticos… (Martín-Banderas et al., 2013). Respecto al tamaño, aunque la FDA, EMA e ISO han publicado documentos relacionados con la nanotecnología, donde la limitación de tamaño se encuentra entre los 1-100 nm para el uso en “nanomedicina”, el Centro Común de Investigación y el Comité científico sobre Emergentes y Recién Identificados Riesgos Sanitarios de la Comisión Europea considera que esta definición debe ampliarse, pues en este campo se utilizan materiales a nanoescala de más de 100 nm. De este modo, las nanopartículas para aplicaciones médicas quedan definidas como partículas con un tamaño comprendido entre 1 y 1000 nm (documento FDA-2017-D-0759, 2022). Dado que la mayoría de los cannabinoides suelen presentar varias limitaciones a la hora de evaluar su uso clínico, el desarrollo de un sistema nanométrico para la administración oral de cannabinoides se presenta como alternativa novedosa y ventajosa frente a otros sistemas de administración convencionales (Martín-Banderas et al., 2013), lo que permitirá superar con éxito estos conflictos. En la práctica, esto significa que los cannabinoides pueden cargarse o conjugarse en NPs, ofreciendo la oportunidad de hacer llegar de manera efectiva las formulaciones del cannabis y cannabinoides a los sitios de acción. Así, la aplicación de la nanotecnología en medicina implica el empleo de NPs, no solo para potenciar la acción de medicamentos, sino también para mejorar el diagnóstico y la terapia de enfermedades y poder reducir los costes sanitarios (Onaivi et al., 2020). 16 2. OBJETIVOS El objetivo general del trabajo es desarrollar un sistema de liberación biocompatible y biodegradable que permita la vehiculización de un fitocannabinoide, más concretamente de un sesquiterpeno, -cariofileno, con potencial terapéutico en enfermedades cardiovasculares. Para ello se plantean los siguientes objetivos parciales: ▪ Sintetizar de NPs de PLGA que permite la vehiculización de una molécula volátil, como el -CFN. ▪ Caracterizar in vitro de las NPs elaboradas: tamaño, dispersión del tamaño y potencial Z. ▪ Desarrollar de un método RP-HPLC que permita estimar la cantidad encapsulada de fármaco presente en las nanopartículas y cuantificación de la misma. ▪ Poner a punto un proceso que permita el almacenamiento y conservación de las partículas obtenidas mediante procesos de congelación y/o liofilización. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 MATERIALES ▪ Reactivos - -Cariofileno (-CFN) (Ref. W225207sigma-Aldrich) - Copolímero de ácido láctico y glicólico pegilado (PLGA–PEG) (Sigma ref. 76460-1G) - Copolímero poliláctico-co-glicólico (PLGA) (Sigma ref. 754760-1G) - Acetona grado HPLC (PanReac) - Agua purificada (Millipore Milli-Q®) - Trehalosa (Sigma-Merk) - Pluronic® F-68 (BioChemica) - Alcohol Povilínico (PVA) (PanReac 7200) - Acetonitrilo (PanReac HPLC) - Metanol (PanReac HPLC) - Ácido acético (PanReac) - Nitrógeno líquido 17 ▪ Utensilios de laboratorio - Viales de vidrio de 15 mL. - Pipetas de 20, 200, 1000 l y 5 mL y sus correspondientes puntas. - Vaso de precipitado de 50 mL. - Espátula - Varillas agitadoras magnéticas - Pesamuestras - Tubos Amicon Ultracel de 100 kDa y capacidad 15 mL. - Tubos Eppendorf de 1,5 mL. - Viales opacos de topacio - Nitrógeno líquido ▪ Equipos - Agitador tipo vórtex (RS-Lab 11C) - Balanza de precisión. (LE225D-OCE) - Placa agitadora multiposición (IKA® RT 15) - Campana extractora - Varillas agitadoras magnéticas de pequeño tamaño - Centrifuga refrigeradora (Eppendorf 5804R) - Zetasizer Nano series: Nano ZS90 (Malvern Instruments) - RP-HPLC (LaChron Merck Hitachi) - Liofilizador (Telstar Cryodos -80) 3.2 MÉTODOS 3.2.1 Síntesis de nanopartículas de -CFN 3.2.1.1 Proceso de elaboración de nanopartículas La elaboración de nanopartículas de PLGA o PLGA-PEG cargadas con -CFN se llevó a cabo utilizando el método de nanoprecipitación previamente descrito (Iannitelli et al., 2011), incorporando algunas modificaciones. Para ello se propuso la encapsulación del terpeno, -CFN, en el polímero elegido, bien el poli(láctido-co-glicólido) o PLGA, o bien el polpoli(etilenglicol)-poli(láctido-co-glicólido), también conocido como PEG-PLGA. Este último no es más que el copolímero de PLGA acompañado de una cadena hidrófila de polietilenglicol (PEG). Véase la estructura química de 18 ambos polímeros en la Figura 8 y Figura 9 respectivamente. El copolímero aporta ventajas exitosas en cuanto a solubilidad y estabilidad, mientras que la incorporación final de la cadena de PEG ayuda a proporcionar cierta singularidad al compuesto en cuestión. Figura 8. Estructura química del PLGA. (Rosas et Pedraz, 2007) Figura 9. Estructura química del PEG (Quintanilla et al., 2017) A continuación, se detalla el proceso de elaboración de las NPs, para lo cual se necesitan dos fases (orgánica y acuosa): ▪ Fase orgánica: consiste en una solución de PLGA-PEG o PLGA en acetona a concentración de 50 mg/mL. La cantidad de polímero pesado se añade a la acetona y se disuelve con el vórtex. Posteriormente se añaden 15 μL de solución -CFN que supone un 97% p/p de carga -CFN respecto al polímero. ▪ Fase acuosa: consiste únicamente en agua Milli-Q® dispuesta en vasos de precipitado (4 mL por lote) que estará en agitación continua a temperatura ambiente. Método de producción de nanopartículas Para la elaboración de las NPs, es necesario mantener cada uno de los vasos de precipitados con los 4 mL de fase acuosa en agitación, para ello se utiliza la placa agitadora y una mosca magnética (aproximadamente 300 rpm). En el proceso de nanoprecipitación, el volumen correspondiente de fase orgánica se incorpora directamente sobre los 4 mL de agua Milli-Q® que forman la fase acuosa. Este proceso se realiza en un solo paso con ayuda de la pipeta correspondiente. A continuación, cada uno de los lotes, donde ya se incluyen ambas fases, se mantienen en agitación dentro de la campana extractora, a t.a y durante 20 min. Se pretende lograr la completa evaporación de la acetona. 19 En ese tiempo, se mide el tamaño de partícula y el potencial Z (PZ) con el Zetasizer®. Para ello, se emplea una cubeta Malvern a la que se añaden 100 μL de la suspensión de nanopartículas y 900 μL de agua Milli-Q® para que la muestra no esté tan concentrada. Pasados los 20 minutos y evaporada en su totalidad la acetona, se traspasada la formulación a un vial cerrado para evitar ahora, la evaporación del -CFN. Seguidamente se concentra y separan las NPs de la suspensión llevando a cabo una ultrafiltración en la centrífuga durante 20 minutos a 15º y 4.000 rcf, hasta conseguir un volumen final de NPs de 1500μL. Para ello se utilizan tubos Amicon. Finalmente, terminado el proceso de centrifugado, el bajonadante se transfiere a un vial cerrado y se congela a -20º para su posterior análisis. Por su parte, el concentrado de cada uno de los Amicon se recupera en un tubo Eppendorf, llevándose a un volumen final de 1.500 μL. Así se obtiene la suspensión de NPs deseada. En la Figura 10 se muestra un esquema del procedimiento seguido en la producción de las NPs para cada uno de los lotes trabajados. Figura 10. Modelo esquemático del procedimiento de elaboración de NPs cargadas Aunque el objetivo final es obtener nanopartículas de PLGA-PEG cargadas para evaluar la formulación, también se elaboraron NPs de PLGA-PEG sin fármaco y NPs con PLGA sin pegilar tanto blancas como cargadas, para poder estudiar la comparación entre ambas. 20 3.2.1.2 Cuantificación del fármaco por cromatografía Tras la elaboración de NPs de -CFN, interesa conocer cuál es la cantidad fármaco vehiculizado en las mismas. Para ello se utilizó la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en fase reversa (RP-HPLC). Este método se llevó a cabo en el equipo LaChron Merck Hitachi utilizando para el procedimiento una fase estacionaria, constituida por una columna C18 Atlantis® T3 (3 µm, 4.6 x 150 mm) y una fase móvil formada por el componente A: Metanol (MeOH); el componente B: Agua Milli-Q® acidificada con ácido acético hasta conseguir un pH de 4,5 y el componente C: Acetonitrilo (ACN). El método se puso a punto a partir de la experiencia del grupo de investigación CTS-480. Tras realizar varias pruebas para establecer los porcentajes exactos de cada uno de los componentes que forman la fase móvil, y obtener un pico simétrico bien definido a un tiempo de retención aceptable, se fijaron los siguientes proporciones para los componentes de la fase móvil: MeOH:ACN:H2O (50:40:10). Además, la cuantificación se llevó a cabo siguiendo unas condiciones determinadas, siendo la longitud de onda de 210 nm y la temperatura del horno 25ºC. Por su parte, la velocidad de flujo se estableció en 1 mL/min y el volumen de inyección en 5 μL, siendo el tiempo de corrida (run time) de 18 minutos. Finalmente, con el propósito de poder determinar la concentración de -CFN en las NPs producidas se elaboró una recta de calibrado. Para ello, primero se preparó una disolución madre de 1mg/mL en ACN. A partir de esta primera disolución se elaboraron diferentes disoluciones estándar de concentraciones conocidas (patrones): 12,5; 25; 50; 75; 150 y 300 μg/mL respectivamente. 3.2.1.3 Eficacia de la Encapsulación (EE) y Carga de fármaco (CF) Tras la preparación de cada uno de los estándares en sus correspondientes viales topacio, estos son introducidos en el RP-HPLC para su posterior medición. El equipo mencionado, tras realizar un análisis cromatográfico, obtendrá un cromatograma, donde aparecerán representados los picos de absorbancia frente al tiempo, cada uno perteneciente a una muestra en concreto. Los resultados obtenidos tras la medición del área bajo la curva de cada uno de los picos formados permiten elaborar una recta de calibrado que relaciona el área bajo la curva con la concentración de fármaco presente en la muestra. Así se puede obtener una ecuación que permite comparar ambos parámetros. 21 Tras la obtención de la mencionada recta y su correspondiente ecuación, el siguiente objetivo es llevar a cabo la medición de cada uno de los bajonandantes ya obtenidos previamente en el proceso de centrifugación. De este modo y gracias a la recta de calibrado, sería posible relacionar los valores de área bajo el pico resultantes tras la medición de estas muestras con valores de concentración. Así, se podría obtener la cantidad de fármaco no encapsulada, y por diferencia podría extraerse el valor atrapado dentro de la nanopartícula (NP). Para evaluar la capacidad de vehiculización de las NPs se emplearon dos parámetros, la eficacia de encapsulación (EE) y la carga de fármaco (CF). El primero de ellos define la cantidad de fármaco presente en la NPs con respecto a la cantidad inicial del mismo que se utilizó en la elaboración de estas. Así, conociendo los miligramos (mg) de fármaco encapsulado (obtenidos a partir de la concentración de este y volumen añadido del mismo) y los mg teóricos introducidos inicialmente en la NPS se puede calcular la EE. Por su parte, la CF define la cantidad de compuesto cargado por los mg de polímero utilizado y nos permite conocer realmente la cantidad de -CFN encapsulada. Las ecuaciones que expresan las siguientes definiciones son las siguientes: 𝑬𝑬 =𝒎𝒈 𝒅𝒆 𝒇á𝒓𝒎𝒂𝒄𝒐 𝒆𝒏𝒄𝒂𝒑𝒔𝒖𝒍𝒂𝒅𝒐 𝒎𝒈 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍𝒆𝒔 𝒅𝒆 𝒇á𝒓𝒎𝒂𝒄𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎 𝑪𝑭 =𝒎𝒈 𝒅𝒆 𝒇á𝒓𝒎𝒂𝒄𝒐 𝒆𝒏𝒄𝒂𝒑𝒔𝒖𝒍𝒂𝒅𝒐 𝒎𝒈 𝒅𝒆 𝒑𝒐𝒍í𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎 3.2.2 Pruebas de congelación El PLGA-PEG, polímero de la matriz que compone las NPs, es biodegradable y biocompatible, lo que significa que es capaz de hidrolizarse en agua. Por este motivo, se requiere de un proceso de almacenamiento que permita evitar esta degradación y por consiguiente, asegure la estabilidad de la NP en cuestión. Para ello, se llevaron a cabo varias pruebas de congelación a -20ºC utilizando distintos crioprotectores y a diferentes concentraciones. 3.2.2.1 Prueba de congelación con trehalosa En este procedimiento, se evalúan las proporciones polímero:trehalosa, 1:1; 1:3 y 1:5 respectivamente. Para ello, primero es necesario preparar una solución de trehalosa al 5% (p/v). Se pesan 2,5 mg del compuesto y se disuelven en 50 mL de agua. Esta solución se prepara en un falcon y tras su elaboración se conserva en la nevera hasta ser utilizada. 22 Teniendo en cuenta que, para cada muestra, la concentración final de NPs será de 4 mg/mL, siendo 1 mL el volumen final y por consiguiente 4 los mg de nanopartículas presentes en cada uno de los Eppendorf; se calcula el volumen de nanopartículas por muestra, siendo este de 160 μL por lote, los cuales se harán por duplicado. En base a esto y sabiendo, también, los μL de solución de trehalosa necesarios para cada condición, se calcula el volumen necesario de agua Milli-Q® para cada uno de los lotes preparados. Con el fin de evitar errores se elabora una tabla que recoja todos y cada uno de los cálculos (Tabla 1). Tabla 1. Condiciones para congelar NPs de -CFN 4 mg/mL con diferentes proporciones de polímero:trehalosa A la hora de elaborar cada uno de los lotes, primero se añaden los μL de agua Milli-Q® seguido del volumen correspondiente de la solución de trehalosa 5% (p/v). Posteriormente, se añaden el volumen de NPs, consiguiendo en cada Eppendorf un volumen final de 1 mL. Finalmente, todas las muestras son congeladas con nitrógeno líquido y conservadas a -20 ºC en el congelador. Para evaluar el efecto de la congelación con las diferentes proporciones de trehalosa, las muestras una vez descongeladas, se medirán en el Zetasizer Nano. El contenido de cada Eppendorf se traspasa directamente a una cubeta Malvern y se realizan las medias correspondientes para determinar el tamaño, el índice de polidispersión (PDI) y el PZ. Para concluir, se comparan las medidas obtenidas con las mediciones realizadas de las NPs recién producidas. 3.2.2.2. Prueba de congelación con trehalosa y tensioactivos En este caso, se pretende evaluar la resistencia de las NPs a la congelación utilizando el crioprotector trehalosa en combinación con dos tensioactivos, Pluronic® F-68 y PVA a diferentes concentraciones. Para llevar a cabo estas condiciones es necesario preparar a priori tres soluciones: una solución de trehalosa al 5% (p/v); una de Pluronic® F-68 al 1% (p/v) y otra de PVA al 0,5% (p/v). Vol. Concentrado NPs (µL) Proporción NP:trehalosa Trehalosa (mg) Vol. Sol. Trehalosa 5% (µL) Vol. Agua Milli-Q® (µL) 160 1:1 4 80 760 160 1:3 12 240 600 160 1:5 20 400 440 160 1 8 32 640 200 23 La elaboración de la solución de trehalosa se realiza en un falcon de 15 mL, donde se disolverán en agua Milli-Q® los 0,75 mg de trehalosa previamente pesados. Para preparar la solución de Pluronic® F-68 al 15(p/v) se pesan 0,05 mg de Pluronic® y se disuelven en agua Milli-Q® en un tubo de 5 mL. Por último, para la solución de PVA al 0,5 % (p/v) se utiliza un falcon de 15 m, donde serán disueltos en agua Milli-Q® 0,075mg de PVA. Todas las soluciones elaboradas se reservan en la nevera a una temperatura de 4ºC hasta su posterior utilización. El objetivo ahora es realizar una prueba de congelación con diferentes proporciones polímero:trehalosa:tensioactivo (p/p/p). Para ello, manteniendo la relación NPs:trehalosa 1:5, se añade el tensioactivo correspondiente en diferentes proporciones: 1. Congelación NPs:trehalosa:pluronic en proporción: 1:5:1.25. 2. Congelación NPs:trehalosa:PVA en las proporciones: 1:5:0.5 1:5:0.1 1:5:0.01 En este caso, se siguen los mismos pasos que en el método anterior y se elabora una tabla que recoge las condiciones experimentales (Tabla 2 y Tabla 3). Al igual que antes, sabiendo que para cada muestra, la concentración final de NPs es de 4 mg/ml, siendo 1 mL el volumen final y por consiguiente 4 los mg de NPs presentes en cada uno de los Eppendorf, el volumen de NPs será de 160 μL por lote, los cuales se harán nuevamente por duplicado. Además, teniendo en cuenta los μL de solución de trehalosa necesarios para cada condición, que según la condición NPs:trehalosa 1:5, serán 80 μL, se calcula el volumen necesario de agua Milli-Q® para cada uno de los lotes preparados. Finalmente, también se calculan los μL de tensioactivo necesario (Pluronic® F-68 o PVA) para cada condición. Tabla 2. Condiciones para congelar NPs:trehalosa:Pluronic en proporción 1:5:1.25 Tabla 3. Condiciones para congelar NPs:trehalosa:PVA en diferentes proporciones Vol. NPs (µL) Proporción NP:trehalosa:Pluronic Trehalosa (mg) Vol. Sol. Trehalosa 5% (µL) Pluronic (mg) Vol. Sol. Pluronic 1% (µL) Vol. Agua Milli-Q® (µL) Concentración final Pluronic 160 1:5:1.25 4 80 5 500 260 0.5% Vol. NPs (µL) Proporción NP:trehalosa:Pluronic Trehalosa (mg) Vol. Sol. Trehalosa 5% (µL) PVA (mg) Vol. Sol. Pluronic 1% (µL) Vol. Agua Milli-Q® (µL) Concentración final Pluronic 160 1:5:0.5 4 80 2 400 360 0.2% 160 1:5:0.1 4 80 0.4 80 680 0.04% 160 1:5:0.01 4 80 0.04 8 752 0.004% 24 A la hora de elaborar los lotes, se incorpora a cada Eppendorf de 1 mL, en el orden establecido, los μL de agua Milli-Q®, el volumen de solución de trehalosa 5% (pv), los microlitros de la solución de Pluronic® F-68 o PVA correspondiente y por último el concentrado de NPs para que en cada muestra queden 4 mg. Finalmente, todas las muestras son congeladas con nitrógeno líquido y conservadas a -20 ºC. Nuevamente, para evaluar el efecto de la congelación con las diferentes condiciones, las muestras descongeladas se medirán en el Zetasizer Nano, para determinar tamaño, PDI y PZ. Las medidas obtenidas serán comparadas con las mediciones realizadas de las NPs recién producidas para sacar conclusiones. 3.2.3 Pruebas de liofilización La liofilización es una técnica que permite la conservación de las muestras. Mediante una previa congelación de las mismas y la posterior aplicación de vacío, el agua es eliminada por sublimación, en presencia de calor circundante y bajas presiones, obteniendo de este modo una estructura seca que favorece la preservación de las mismas en el tiempo (Rodríguez Barona et al., 2016; Surco Laos et al., 2017). Véase una representación visual de los estados transitorios surgidos durante un proceso de liofilización en la Figura 11. Para llevar este método a cabo se utilizó el liofilizador disponible en el servicio de biología del CITIUS. Este proceso permitió hacer de la suspensión de NPs elaboradas con trehalosa y PVA un polvo compacto y sólido en forma de matriz seca, lo que supone entre otras cosas una ventaja característica, puesto que el producto resultante es más fácil de manejar y almacenar. Figura 11. Representación de los diferentes estados de las NPs tras ser sometidas a un proceso de liofilización (Yacasi Ramos, 2017) 31 A continuación, se resumen las diferentes condiciones experimentales ensayadas y los resultados obtenidos. - Criopreservación con trehalosa En la Tabla 5 se pueden observar los resultados obtenidos tras la congelación de las NPs. En este caso se emplean diferentes proporciones del crioprotector empleado para la congelación, con el fin de verificar cuál de las condiciones probadas es la que mejor mantiene la estabilidad de las NPs producidas anteriormente. Tabla 5. Resultados de tamaño tras congelación de NPs con trehalosa a diferentes proporciones (Siendo Df el diámetro final y Di el diámetro inicial) Tras observar los resultados obtenidos podeos concluir que en cualquiera de las condiciones probadas el tamaño de NPs disminuye con respecto al tamaño original. Para saber que las pruebas de congelación se han realizado correctamente y que por tanto, se mantiene la estabilidad de las NPs, el tamaño de estas se acepta una desviación en torno al 10% de la media. Es decir, teniendo en cuenta que el tamaño media de las NPs previamente elaboradas rozaba los 280 nm, el tamaño tras las pruebas de congelación debe situarse entre los 252-308 nm. Tal y como se observa en los resultados obtenidos, se puede afirmar que en ninguna de las condiciones estudiadas, donde se usa únicamente el crioprotector trehalosa a diferentes proporciones, el tamaño de las nanopartículas se mantiene dentro de este intervalo. De hecho, en ninguna de ellas, el diámetro consigue superar los 250 nm. Además, si ponemos el foco en el PDI, también podemos observar que existen ciertas variaciones significativas entre los lotes preparados para cada condición. El PDI debe oscilar entre 0 y 0,3 para que se considere una distribución de tamaño homogéneo. Por consiguiente, se concluye que para la mayoría de las situaciones ensayadas el diámetro final de las NPs se desvía casi o más de aproximadamente el 50% del tamaño original. Esta variación Polímero:trehalosa Df medio ± DE (nm ) PDI ± DE | Di – Df | (%) (1:1) 178 ± 24 0,054 ± 0,045 38 % (1:3) 111 ± 5 0,217 ± 0,149 61 % (1:5) 165 ± 69 0,095 ± 0,077 42 % (1:8) 72 ± 2 0,335 ± 0,063 75 % 32 tan significativa de tamaño unido a las oscilaciones del valor de PDI permite afirmar que las pruebas de congelación de NPs utilizando únicamente trehalosa, no aportan resultados favorables. - Criopreservación con trehalosa y tensioactivos Dado que ninguna de las condiciones anteriores reveló buenos resultados, se decidió repetir las mismas utilizando esta vez el crioprotector trehalosa acompañado de tensioactivos, siendo estos Pluronic® F-68 y PVA en diferentes proporciones basándonos en otros métodos de obtención de NPs que ha puesto a punto el grupo de investigación. En la Tabla 6 se pueden observar los resultados obtenidos tras la congelación de nanopartículas añadiendo el crioprotector trehalosa y el tensioactivo seleccionado. Tabla 6. Resultados de tamaño y PDI tras congelación de NPs con trehalosa y tensioactivos (Siendo Df el diámetro final y Di el diámetro inicial) En el primer caso, donde se utiliza trehalosa y Pluronic® F-68 como tensioactivo, el diámetro de las NPs tras las prueba de congelación sigue siendo menor al esperado. De este modo, se puede concluir que esta condición tampoco cumple lo buscado. Por su parte, en el caso del PVA, se han obtenido diferentes resultados en función de la proporción del mismo. Así pues, en aquellas NPs que presentan una mayor proporción de surfactante su tamaño tras la prueba de congelación ha resultado ser menor. Por su parte, al disminuir la concentración de tensioactivo el tamaño de la nanopartícula aumenta. De esta manera, a pesar de su amplio uso como surfactante en la síntesis de NPs de PLGA-PEG, las partículas preparadas con PVA a diferentes concentraciones presentan mejoras con respecto al tamaño frente a las NPs preparadas con Pluronic® F-68. En términos generales, se puede decir que el tamaño de partícula obtenido está directamente relacionado uno de los parámetros más importantes de los tensioactivos, el HLB. Hace tiempo se demostró que el tamaño medio de partícula disminuye cuando el valor de HLB del sistema aumenta (Bouchemal et al., 2014). Así, si tenemos en cuenta CONDICIÓN DE CONGELACIÓN Df medio ± DE (nm) PDI ± DE | Di – Df | (%) NPs:TH:Pluronic (1:5:1,25) 136 ± 6 0,253 ± 0,045 53 % NPs:TH:PVA (1:5:0,5) 179 ± 10 0,197 ± 0,143 37% NPs:TH:PVA (1:5:0,1) 286 ± 38 0,237 ± 0,154 0,2 % NPs:TH:PVA (1: 5:0,01) 352 ± 41 0,232 ± 0,215 23 % 33 que el Pluronic® F-68 presenta un HLB elevado (HLB=29) en comparación con el HLB del PVA (HLB=18) los datos obtenidos tendrían sentido. Pues, según el estudio, el tamaño medio de las primeras NPs debe ser inferior al tamaño medio de las NPs que están compuestas por PVA, tal y como se cumple en este caso. Además, como se puede observar en la Tabla 6 el tamaño promedio de las nanopartículas poliméricas disminuye conforme se aumenta la concentración de PVA. Esto significa que las partículas son más estables según aumente la concentración de PVA, y por consiguiente que la presencia del polímero en cuestión ayuda a evitar la aglomeración de las mismas. Por tanto, según los resultados obtenidos, se observa que la condición NPs:TH:PVA (1:5:0,1) a parte de cumplir con lo mencionado, también sitúa el tamaño medio de partícula en 286 ± 38 nm. Además, el coeficiente de variación (CV) es del 0,15%, lo que define que las diferencias de tamaño de los lotes preparados con esa condición son insignificantes. Por tanto, recordando que el tamaño óptimo tras la congelación debe situarse en torno a los 252-308 nm, se puede concluir que esta condición cumple de forma exitosa el objetivo. 4.1 RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE LIOFILIZACIÓN Tras los resultados de tamaño tan favorables obtenidos tras la congelación de NPs según la condición NPs:TH:PVA (1:5:0,1) se llevó a cabo el proceso de liofilización anteriormente descrito, con el objetivo de evaluar si ahora las partículas seguían manteniendo el tamaño deseado. Para ello, tras la obtención del diámetro y PDI, también se evaluó el porcentaje de desviación respecto al tamaño medio de NPs originales recién elaboradas y el tamaño resultantes de las mismas tras el proceso de congelación según condición más favorable ya descritas. Los Eppendorf con las NPs liofilizadas se resuspendieron en 1 mL de agua Milli-Q® y tras una posterior sonicación se utilizó de nuevo el Zetasizer Nano para medir el tamaño y el PDI. Los resultados obtenidos pueden observarse en la Tabla 7. Tabla 7. Comparación de tamaños, desviaciones de tamaño y PDI de NPs previa y posterior liofilización COMPARATIVA INICIAL FINAL Desviación Dmedio ± DE (nm ) PDI ± DE Dmedio ± DE (nm ) PDI ± DE | Di – Df | (%) NPs cargadas recién elaboradas vs. NPs liofilizadas 2856 ± 20 0,221 ± 0,13 387 ± 105 0,5 ± 0,1 35 % NPs congeladas vs. NPS liofilizadas 275 ± 9 0,201 ± 0,003 387 ± 105 0,5 ± 0,1 40 % 34 Según los resultados obtenidos, puede concluirse que las NPs liofilizadas no mantienen resultados próximos al diámetro inicial. Concretamente se aprecia una variación del 35 % del diámetro de las partículas liofilizadas frente diámetro de las mismas recién elaboradas (previa congelación). Por otro lado, también se aprecia una porcentaje de variación bastante significativo, del 40 % exactamente, de las partículas liofilizadas respecto a las NPs resultantes tras la congelación. En ambos casos, los porcentajes de desviación obtenidos son elevados. Pues si recordamos que, en general, se acepta una desviación máxima del 20% respecto al diámetro original, se puede considerar que, según los resultados obtenidos, las proporciones de NPs:trehalosa:PVA (1:5:0,1) no han sido óptimas para llevar a cabo un proceso de liofilización de NPs de -CFN. Esto implica por tanto, que aún hay que seguir trabajando para conseguir optimizar la formulación final. 35 5. CONCLUSIONES La elaboración de este trabajo experimental se centró en el estudio preliminar de sistemas de vehiculización de fármacos, concretamente NPs cargadas con -CFN. El objetivo principal fue crear una posible estrategia que permitiera la administración del compuesto de una manera óptima al organismo, permitiendo así que las propiedades fisicoquímicas del mismo se mantuvieran mayoritariamente intactas, pese a presentar ciertas dificultades en su manipulación por el hecho de ser una molécula volátil. A fin de conseguir el objetivo principal, se plantearon ciertos objetivos parciales sobre los cuales se obtuvieron resultados que ayudaron a la consolidación del veredicto final. Estos se exponen a continuación. ▪ El método de nanoprecipitación modificada propuesto para la encapsulación de -CFN resultó viable para la producción de NPs con un tamaño óptimo para su administración por varias vías, con un tamaño medio de 280 nm y una estrecha distribución del tamaño. ▪ Se ha puesto a punto un método RP-HPLC para cuantificar la cantidad de -CFN. Según los resultados obtenidos, se obtuvieron EE% superiores al 10% lo que indica una elevada carga de fármaco en el interior de las NPs. ▪ Las pruebas de congelación realizadas para valorar la estabilidad de las NPs elaboradas en ciertas condiciones resultaron ser insuficientes en el caso de utilizar únicamente trehalosa como crioprotector, puesto que el tamaño inicial de las partículas no se mantenía. Lo mismo ocurre al emplear trehalosa y el tensioactivo Pluronic® F-68. ▪ Por su parte, la utilización de trehalosa como crioprotector acompañada, en este caso, del tensioactivo PVA a una cierta concentración determinada si dio lugar a resultados bastantes favorables que mantenían el tamaño de partícula dentro de los límites. Lo que se verificó está condición como óptima para realizar la congelación. ▪ Las pruebas de liofilización realizadas posteriormente a la congelación de las NPs con la condición NPs:TH:PVA (1:5:0,1) mostraron no ser suficientes puesto que el tamaño de las NPs se desviaba del inicial en más de un 20%, límite generalmente aceptado. Si bien, es importante destacar que aunque el estudio se realizó en las mejores condiciones posibles y siguiendo todos los protocolos prestablecidos, sería necesario continuar con la investigación y realizar más ensayos que aporten resultados aún más firmes y concluyentes que permitan consolidar las bases de este trabajo. 36 6. 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