Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA

Tesis Doctoral Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA Jesús Ángel Pérez Cabello Sevilla, marzo 2024 Directora: Cintia Roodveldt Director: David Pozo Pérez 3 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA ÍNDICE 5 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA Índice 1. Resumen ........................................................................................... 11 2. Introducción ..................................................................................... 15 2.1. Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) ............................................... 15 2.1.1. Epidemiología, sintomatología y cuadro clínico ........................... 15 2.1.2. Fisiopatología: Contexto genético, molecular y celular ............... 20 2.1.2.1. Genes Implicados en ELA ............................................................. 21 2.1.2.1.1. SOD1 (Superoxide Dismutase 1) ............................................ 21 2.1.2.1.2. C9orf72 (Chromosome 9 open Reading Frame 72) .............. 22 2.1.2.1.3. FUS (Fused in Sarcoma) ......................................................... 23 2.1.2.1.4. TARDBP (Transactive Response DNA Binding Protein) ...... 24 2.1.2.1.5. Genes implicados con menor frecuencia ............................. 25 2.1.2.2. Mecanismos moleculares implicados en ELA............................. 26 2.1.2.2.1. Neuroinflamación .................................................................... 27 2.1.2.3. Componentes celulares ................................................................ 31 2.1.2.3.1. Microglía .................................................................................. 32 2.2. Señalización por quinasas en neurodegeneración e inflamación ……………………………………………………………………………….38 2.2.1. Conceptos generales sobre proteínas quinasas........................... 38 2.2.2. Señalización por proteínas quinasas, su papel en enfermedades neurodegenerativas e inflamación ............................................................... 39 2.2.2.1. GSK-3α/β (Glycogen synthase kinase 3) ............................. 40 2.2.2.2. TBK1 (TANK-binding kinase 1) ............................................ 41 2.2.2.3. RIPK1 (Receptor-Interacting Kinase 1) ................................ 42 2.2.2.4. ROCK1/2 (Rho-Kinase 1/2).................................................... 42 2.2.2.5. EPHA4 (EPH receptor A4) ..................................................... 43 2.2.3. MAPK/MAK/MRK Overlapping Kinase (MOK). Caracterización, funciones y localización celular .................................................................... 44 2.3. Familia de proteínas BET: Brd4 ...................................................... 46 2.3.1. Brd4: estructura y mecanismos generales .................................... 46 2.3.2. Papel de Brd4 en diversas patologías ............................................ 49 2.3.2.1. Brd4 y sus mecanismos en la respuesta inmunitaria, neuroinflamación y enfermedades neurodegenerativas ......................... 50 4. Materiales y métodos ....................................................................... 61 6 Índice 4.1. Mantenimiento y tratamientos de los cultivos de líneas celulares ……………………………………………………………………………….61 4.2. Generación de clones SIM-A9 MOK-KO ......................................... 62 4.3. Preparación y tratamiento de agregados de TDP-43 .................... 62 4.4. Generación de medios condicionados por líneas microgliales SIM-A9.......................................................................................................... 63 4.5. Aislamiento y mantenimiento de cultivo de motoneuronas primarias de embriones de ratón .............................................................. 63 4.6. Ensayos de medios condicionados por líneas microgliales SIM- A9 sobre cultivos de motoneuronas primarias ........................................ 67 4.7. Aislamiento de microglía primaria de neonatos de ratón ............ 67 4.8. Generación de cultivos organotípicos y tratamientos .................. 69 4.9. Determinación de viabilidad por ensayo de MTT de líneas celulares NSC-34 ........................................................................................ 69 4.10. Ensayos de viabilidad de motoneuronas primarias de embriones de ratón con medios condicionados de microglía por microscopía de cribado de alta eficiencia ................................................ 70 4.11. Inmunofluorescencia de cultivos celulares ............................... 71 4.12. Inmunohistoquímica (IHC) ........................................................... 72 4.13. Inmunofluorescencia de cultivos organotípicos ....................... 72 4.14. Determinación de citoquinas mediante ELISA .......................... 73 4.15. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ................................. 73 4.16. Purificación de ADN ChIP ............................................................ 75 4.17. Caracterización mediante electroforesis en gel de agarosa de los productos de la sonicación (ChIP) ...................................................... 76 4.18. Extracción de ARN ....................................................................... 76 4.19. Retrotranscripción ....................................................................... 77 4.20. PCR cuantitativa (qPCR) .............................................................. 77 4.21. PCR convencional ........................................................................ 78 4.22. Transfección de líneas SIM-A9 para medición de citoquinas intracelulares por citometría de flujo ........................................................ 79 4.23. Determinación de citoquinas intracelulares por citometría de flujo …………………………………………………………………………….79 4.24. Western blot .................................................................................. 80 4.25. Aislamiento de microglía de ratones adultos ............................ 81 7 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA 4.26. Administración de C13 y monitorización de los animales SOD1G93A ...................................................................................................... 82 4.27. Preparación de lisados celulares e inmunoprecipitación de proteínas fosforiladas ................................................................................ 82 4.28. LC-MS/MS e identificación de proteínas .................................... 83 4.29. Secuenciación del transcriptoma completo por clonación al azar (RNA-Seq) ............................................................................................ 84 4.30. Procesamiento de datos de RNA-Seq y mRNA-Seq .................. 85 4.31. Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Ontología génica (GO), enriquecimiento de vías e Ingenuity Pathway Analysis (IPA) …………………………………………………………………………….86 4.32. Marcaje S4U y análisis de SLAM-Seq ......................................... 86 4.33. Muestras humanas ....................................................................... 87 4.34. Modelos animales ......................................................................... 87 4.35. Análisis de imágenes mediante inmunohistoquímica .............. 88 4.36. Análisis de imágenes mediante inmunofluorescencia ............. 88 4.37. Alineamiento de secuencias de ADN .......................................... 89 4.38. Análisis estadístico ...................................................................... 89 5. Resultados ........................................................................................ 95 5.1. Relación entre agregados de TDP-43 y mecanismos regulatorios mediados por MOK en microglía .................................................................. 95 5.2. Relevancia e implicación de MOK en la señalización de IFN tipo-I en microglía .................................................................................................. 100 5.3. Modulación por MOK de la respuesta inmune mediante la regulación de los niveles de pBrd4Ser492 y su unión a cromatina en microglía ....................................................................................................... 115 5.4. El eje regulatorio bpMOK-pBrd4Ser492 está alterado en animales SOD1G93A ....................................................................................................... 120 5.5. Los niveles celulares de MOK están alterados en ELA .............. 122 5.6. MOK como posible diana terapéutica en ELA ............................. 125 6. Discusión ........................................................................................ 131 7. Conclusiones ................................................................................. 143 8. Bibliografía ..................................................................................... 147 9. Abreviaturas ................................................................................... 173 9 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA RESUMEN 16 Introducción aparición de los primeros síntomas, donde pacientes con ELA familiar (ELA-F, pacientes con algún familiar que haya padecido la enfermedad anteriormente) suelen presentarlos con precocidad en un rango que comienza a los 40 años, mientras que pacientes que padecen ELA esporádica (ELA-E, pacientes sin antecedentes familiares conocidos que hayan padecido la patología aparentemente) presentan los primeros síntomas a los 58-63 años de media (Beghi et al., 2011). Con la evidencia científica actual, los casos familiares representan en torno al 5-10% del total de pacientes, siendo el 90-95% restante casos esporádicos (Suzuki et al., 2023) (Fig. 1). La ELA es una enfermedad con origen en una región focalizada y que, con el transcurso del tiempo, se va expandiendo por el resto de las regiones motoras del organismo de forma que, en el momento de la aparición de los síntomas, la expansión del daño es considerable. Por lo general, los síntomas suelen aparecer en las extremidades superiores, aunque no son raros los casos donde el inicio se da en las extremidades inferiores (Feldman et al., 2022). Además de la debilidad y espasmos musculares generalizados, también se observan disfagias, disartrias y disneas; aunque los músculos involuntarios por lo general no se ven afectados hasta etapas finales de la patología (Taylor et al., 2016). Con todo ello, actualmente, la ELA se considera una enfermedad neurodegenerativa multisistémica cuyos primeros síntomas suelen originarse en las extremidades y que progresivamente se va extendiendo por el resto de músculos del organismo (Masrori & Van Damme, 2020). En consecuencia, cerca del 50% de los pacientes sufren manifestaciones sintomatológicas más allá de problemas musculares de algún grado, y en torno al 15% pueden sufrir otras enfermedades como la demencia frontotemporal (DFT), e incluso más de un 35% de los pacientes presentan cambios leves en su comportamiento, alteraciones cognitivas o dificultades en la capacidad para hablar (Ahmed et al., 2020). Con todo ello, el resultado es una amalgama heterogénea de patrones sintomatológicos en el desarrollo de la enfermedad a pesar de tener un final común. En etapas terminales de la patología, donde los sistemas musculares encargados de la respiración terminan fallando, los pacientes suelen ser sometidos a ventilación asistida mediante traqueotomía (Kiper et al., 2023). Finalmente, los pacientes terminan por alcanzar un estado de total inmovilidad 17 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA materializado en una parálisis facial y oculomotora total de los músculos voluntarios (Kiper et al., 2023; Suzuki et al., 2023). Generalmente, el diagnóstico de la enfermedad suele confirmarse tras un año de la aparición de los primeros síntomas (Suzuki et al., 2023), siendo éste un proceso lento debido en parte al tiempo que transcurre hasta el primer contacto con un profesional que dé comienzo al diagnóstico, o debido a la gran heterogeneidad que esta neuropatía puede presentar de un paciente a otro, lo que aumenta el tiempo sustancialmente. Asimismo, hay que destacar que el diagnóstico de la ELA es de carácter clínico, no existiendo ninguna prueba diagnóstica específica (Falcão de Campos et al., 2021). En este proceso de valoración se realizan numerosas pruebas con el fin de descartar del diagnóstico otras neuropatías cuyos síntomas son coincidentes con los de la ELA, como pueden ser exámenes neurológicos o de electrodiagnóstico, imagen por resonancia magnética (MRI), o también seguir el criterio de diagnóstico de “El Escorial” o el actualizado “Gold Coast Criteria” (Feldman et al., 2022; Genge & Chio, 2023). Aunque se han valorado y estudiado numerosos factores de riesgo como el tabaco, el alcohol, la actividad física intensa o la actividad laboral estresante, no existe una clara relación de causa, siendo una enfermedad extendida entre todos los grupos étnicos del mundo, aunque sí presenta variabilidad geográfica de los diferentes genes implicados (Chapman et al., 2023; Mejzini et al., 2019; Suzuki et al., 2023). Como se ha destacado anteriormente, la aparición de la enfermedad es más frecuente en pacientes con un historial familiar relacionado con ELA y de mayor edad, siendo de facto éstos los escasos factores de riesgo claramente identificados (Bagyinszky et al., 2023; Talbott et al., 2016) (Fig. 1). Aun así, por ejemplo, se han descrito que los genotipos UNC13A y la repetición expandida en el gen de la ataxina-2 (ATXN2) pueden ser factores que incrementen la probabilidad de sufrir ELA-E, entre otros (Amado & Davidson, 2021; Goutman et al., 2022; Willemse et al., 2023). Llamativamente, los hombres suelen sufrir la enfermedad de manera esporádica con mayor incidencia que las mujeres, en torno a 1,3 hombres por cada mujer, siendo éste otro factor de riesgo (Ingre et al., 2015). La aparición y diagnóstico suele ser más temprana en hombres, mostrando además características clínicas 18 Introducción relativamente diferentes. Por ejemplo, las mujeres suelen presentar un origen de la enfermedad de tipo bulbar, mientras que en los hombres suele originarse en regiones espinales del SNC. Sin embargo, el género no tiene efecto en el tiempo de supervivencia (McCombe & Henderson, 2010). El entendimiento de la ELA pasa por una mezcla compleja de factores, tanto genéticos como ambientales, donde el deterioro y senescencia de las motoneuronas es el punto común debido a diferentes mecanismos, como el metabolismo anormal de glutamato, estrés oxidativo y disfunción mitocondrial, respuestas inflamatorias u otras proteinopatías (Caballero-Hernandez et al., 2016; Masi et al., 2022; Moujalled et al., 2021; Suzuki et al., 2023). Desgraciadamente, la falta de tratamiento eficaz ante esta patología repercute en un periodo de supervivencia corto desde el momento del diagnóstico, como se ha resaltado anteriormente (Kim et al., 2020; Kiper et al., 2023). Dichos tratamientos están centrados principalmente en el manejo de la sintomatología, fisioterapia y asistencia respiratoria en etapas finales. A pesar de ser descrita por primera vez hace unos 160 años, y habiéndose realizado numerosos ensayos en modelos animales preclínicos en las dos últimas décadas (L. Chen et al., 2023), en la actualidad los únicos medicamentos aprobados para el tratamiento de la ELA son el Riluzol, la Edaravona, y más recientemente, el Fenilbutirato de sodio y Taurursodiol, aunque solo tienen un modesto beneficio, retrasando el avance de la enfermedad unos pocos meses (Paganoni et al., 2020; Suzuki et al., 2023) (Fig. 1). Se conoce muy poco del mecanismo molecular de acción del primero, a pesar de ser el principal tratamiento contra la ELA desde 1995 (Jaiswal, 2019; Saitoh & Takahashi, 2020). Este medicamento alivia la toxicidad glutamatérgica sufrida por las neuronas y que provoca su muerte (Saitoh & Takahashi, 2020). De igual manera, escaso es el conocimiento sobre el mecanismo de acción de la Edaravona, cuyo efecto reduce la aparición de radicales libres de oxígeno gracias a su actividad antioxidante (Jaiswal, 2019). El Fenilbutirato de sodio y Taurursodiol, aprobados como nueva opción de tratamiento para la ELA por la FDA (del inglés, Food and Drugs Administration) en 2022, han ganado relevancia gracias a la identificación de su capacidad para inhibir la apoptosis neuronal, ya que se espera que su acción combinada reduzca el estrés oxidativo en mitocondrias y 19 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA el retículo endoplasmático (Paganoni et al., 2020; Tzeplaeff et al., 2023). Aun así, los efectos reportados hasta el momento por las diferentes terapias no son significativos en cuanto al curso de la enfermedad, mostrando un beneficio muy pobre. Fig. 1. Recopilatorio de los factores de riesgo, medicamentos, genes asociados y origen de los pacientes afectados por la ELA. ELA: Esclerosis lateral amiotrófica, SOD1: Superóxido dismutasa, C9orf72: Chromosome 9 open Reading Frame 72, FUS: Fused in sarcoma, TARDBP: Transactive Response DNA Binding Protein, ASOs: oligonucleótidos antisentido. Imagen generada mediante Biorender.com En vista de este contexto, es necesario mejorar los conocimientos sobre la etiología y los mecanismos patogénicos de la enfermedad, además de estudiar el perfil genético y molecular de cada paciente, permitiendo así entender el origen de los síntomas con el fin de alcanzar un tratamiento clínico eficaz y personalizado para cada escenario (Fang et al., 2022). Hacia esa dirección avanzan los estudios preclínicos de Korobeynikov y colaboradores, donde un diagnóstico temprano y preciso de la genética tras cada paciente (en concreto, la mutación FUSP525L) permitiría generar una medicina a la carta mediante el uso de oligonucleótidos antisentido (ASOs, del inglés antisense 20 Introducción oligonucleotides) contra la proteína mutada (Korobeynikov et al., 2022). También bajo esta misma estrategia encontramos el Tofersen, medicamento recientemente aprobado por la FDA y cuya aprobación también ha sido recomendada por la Agencia Europea del Medicamento (EMA, 2024), que consiste también en ASOs pero contra el ARN mensajero de SOD1, permitiendo una reducción significativa, aunque modesta, de los niveles de SOD1 –tanto de la forma nativa como de la mutada– en fluidos de pacientes de ELA-F SOD1 (Blair, 2023; Saini & Chawla, 2023). Desde 1996, cerca de 40 ensayos clínicos con más de un centenar de participantes cada uno han sido realizados con medicamentos potencialmente beneficiosos para el tratamiento de la ELA, aunque muy pocos con relativo éxito; como es el caso de los ya citados (Shefner et al., 2022). En la actualidad, la propia selección y criba de pacientes juega un papel vital a la hora de obtener conclusiones de dichos ensayos, por lo que se usan criterios de inclusión o exclusión restrictivos, como puede ser el tiempo entre los primeros síntomas y el inicio del tratamiento experimental, que permiten extraer la mayor cantidad de información útil posible (Fang et al., 2022; Shefner et al., 2022). En este momento existen numerosos ensayos clínicos en marcha, donde se busca desde una mejor monitorización de los síntomas, seguimiento y bienestar de los pacientes (NCT05276349), hasta la búsqueda de nuevos biomarcadores por imagen (NCT02567136), pasando por conocer mejor las variantes genéticas de los pacientes y qué impacto puede tener (NCT04819555), o el desarrollo de nuevos medicamentos (NCT04654689). 2.1.2. Fisiopatología: Contexto genético, molecular y celular Si bien la ELA conlleva un marcado componente genético, los numerosos genes y polimorfismos que predisponen la enfermedad son actualmente bastante desconocidos y requieren aún de estudio, lo que no facilita un conocimiento adecuado de los mecanismos patológicos involucrados (Caballero-Hernández et al., 2016; Sironi et al., 2023). La excesiva variabilidad entre pacientes y la dificultad de generar modelos preclínicos fiables que ejemplifiquen y permitan trasladar correctamente los mecanismos de la enfermedad y de dichos resultados a un contexto clínico beneficioso, sigue 21 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA siendo uno de los principales retos que conlleva esta patología (Ahmed et al., 2020). Por este motivo, el estudio minucioso de la detección y caracterización de los componentes implicados (a nivel genético, molecular y celular) juegan un papel vital a la hora de entender los diferentes mecanismos que pueden originar y desarrollar la enfermedad. 2.1.2.1. Genes Implicados en ELA Numerosos genes han sido identificados como potenciales mediadores en esta neuropatía, por lo general, participando con una ganancia de función en la mayoría de los casos y su pérdida o ambas en otros (Siddique N, 2002). Aunque se han identificado más de 50 genes relacionados con la muerte de las neuronas motoras y la ELA, destacan los genes SOD1, C9orf72, TARDBP y FUS por su frecuencia de aparición en pacientes (Mejzini et al., 2019; Suzuki et al., 2023) (Fig. 1). 2.1.2.1.1. SOD1 (Superoxide Dismutase 1) En 1993 se identificó el primer gen asociado a ELA, cuyo producto origina la superóxido dismutasa 1 (SOD1), una proteína de 153 aminoácidos expresada en todos los tejidos cuya función principal es la de proteger a las células del estrés oxidativo mediante la actividad catalítica de transformación de aniones superóxido a oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno (Amado & Davidson, 2021; S. J. Kaur et al., 2016). Las mutaciones en SOD1, del cual se conocen hasta la fecha cerca de 220 mutaciones o variantes con implicación en ELA, están presentes en torno al 20% de los casos de ELA-F y al 1 ó 2% de los casos de ELA-E, aunque ambos son clínicamente indistinguibles sin ayuda del historial familiar (Zou et al., 2017). Curiosamente, sí que existe una correlación entre el avance y desarrollo de la enfermedad y la mutación portada en el gen (Bagyinszky et al., 2023). La más estudiada es la mutación humana SOD1G93A (Gurney et al., 1994), la cual es usada en ratones transgénicos (SOD1G93A) como el principal modelo preclínico de la enfermedad, ya que agrupa muchas similitudes sintomatológicas de la patología humana (L. Chen et al., 2023; Sironi et al., 2023). Por otro lado, las mutaciones en SOD1 como A4V muestran una sintomatología agresiva, que comienza con una debilidad muscular de las extremidades y músculos bulbares que deja una esperanza de vida de 2 años de media a los pacientes (S. J. Kaur et al., 2016). En general, 22 Introducción todas estas mutaciones suelen provocar el mal plegado de la proteína, poniendo en compromiso su estabilidad y función, lo que resulta en la oligomerización y agregación de la misma o incluso la formación de agregados de tipo amiloide (Broom et al., 2015; L. Q. Wang et al., 2022). Como resultado, se termina generando daño mitocondrial, estrés oxidativo, desregulación de los niveles de citoquinas y afectación de la homeostasis interna del calcio, entre otros, lo que finalmente perturba a las comunicaciones glía-motoneurona, traduciéndose en la muerte de las mismas (Bagyinszky et al., 2023). 2.1.2.1.2. C9orf72 (Chromosome 9 open Reading Frame 72) En el año 2011 tomó gran relevancia el gen C9orf72 debido a su identificación como gen asociado a la ELA y por ser el producto génico que más frecuentemente se encuentra alterado en esta enfermedad, estando presente en el 40% y en el 5% de los casos familiares y esporádicos, respectivamente (Meijboom & Brown, 2022). Destacablemente, también es la mayor causa genética en DFT, aunque en esta última no está limitada sólo al SNC, sino que también se expresa en sistema nervioso periférico, médula ósea o bazo (McCauley & Baloh, 2019). Brevemente, las mutaciones en este gen consisten en la repetición del hexanucleótido (GGGGCC) que, por lo general, suele estar presente en un número inferior a las 24 copias en personas sanas, pero que puede llegar a miles en pacientes de ELA debido a su expansión y repetición (Dejesus-Hernandez et al., 2012). A partir de este gen, se dan tres variantes por splicing alternativo (V1, V2 y V3) que posteriormente se traducen en proteínas, donde la primera y tercera variante portan la expansión repetida del hexanucleótido antes de su eliminación como intrones (Meijboom & Brown, 2022). En condiciones normales, estas proteínas resultantes en sus tres variantes poseen función en el tráfico de vesículas y generación de lisosomas que se da en motoneuronas (Shi, 2018). Sin embargo, debido a la repetición masiva del hexanucleótido en neuronas, éste termina por alterar su propia transcripción, secuestrando proteínas de unión a ARN y alterando el metabolismo general de ARN, conllevando adicionalmente la ausencia de su propia expresión. Esto a su vez, promueve la agregación y generación de focos de los transcritos generados o de la misma proteína aberrante que porta la repetición del dipéptido, 23 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA provocando finalmente respuestas inmunes anormales, como la liberación de citoquinas con resultado proinflamatorio, lo que genera a su vez neurodegeneración (Goutman et al., 2022). Así es el caso, por ejemplo, en modelos preclínicos de ratón, donde la eliminación de C9orf72 en macrófagos y microglía causa la acumulación de lisosomas, además de un estado de activación que conlleva el aumento de la liberación de citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-1β (O’Rourke, 2016). 2.1.2.1.3. FUS (Fused in Sarcoma) Otro gen de relevancia para la aparición de ELA es FUS (del inglés Fused in Sarcoma, también conocido como “translocado en liposarcoma”) (Meijboom & Brown, 2022). En 2009, se demostró que mutaciones en este gen suele provocar la aparición de síntomas descritos en ELA en pacientes jóvenes de alrededor de 45 años, con un avance y progresión de la enfermedad relativamente rápido (Mejzini et al., 2019). Por lo general, está presente en un 4% de los casos de herencia familiar y en un 1% de los casos esporádicos de la enfermedad (Fang et al., 2022). El resultado de las mutaciones sufridas en este gen, del cual se conocen en la actualidad más de 120 variantes implicadas en ELA, provoca que su función como proteína de unión a ARN se vea comprometida, generando por tanto su agregación y su deslocalización celular (Mejzini et al., 2019). Dicha proteína, cuya localización nativa es el núcleo celular, se encuentra implicada en mecanismos de reparación de ADN por recombinación homóloga durante la rotura de doble cadena o la unión de extremos no homólogos (Amado & Davidson, 2021; Peters et al., 2015). Sin embargo, también tiene gran importancia en mecanismos relacionados con el metabolismo, procesamiento, transporte y estabilidad de ARN, miARN y ARN no codificante (Amado & Davidson, 2021). De esta forma, es frecuente encontrar en pacientes que células del SNC, como células gliales o neuronas, tengan alteradas la región C- terminal de la proteína –encargada de su localización nuclear–, generando deslocalización hacia el citoplasma (Korobeynikov et al., 2022; Scekic‐Zahirovic et al., 2016). Cabe resaltar que, aunque se ha observado con estudios in vivo que, debido a la pérdida de función y su deslocalización al citoplasma provoca toxicidad para las neuronas, también se ha demostrado que una ganancia de 24 Introducción función podría favorecer una muerte celular, por lo que si el efecto se debe a ganancia, pérdida o ambas, sigue siendo tema de debate, al igual que para la mayoría de genes implicados en ELA (Kim et al., 2020). 2.1.2.1.4. TARDBP (Transactive Response DNA Binding Protein) El gen TARDBP (del inglés Transactive Response DNA Binding Protein) codifica para la proteína TDP-43, la cual es una molécula con capacidad de unión a ADN y ARN, que en 2006 se descubrió como uno de los elementos característicos de la ELA por su agregación citoplasmática aberrante en neuronas y células gliales en casi todos los pacientes (Arai et al., 2006; M. Neumann et al., 2006). Las más de 50 mutaciones de TARDBP identificadas en el marco de la ELA, se localizan en el 5% y 1% de los orígenes familiares y esporádicos, respectivamente (Meijboom & Brown, 2022). A pesar de no presentar siempre mutaciones en el gen, los agregados hiperfosforilados y ubiquitinados de dicha proteína se han encontrado en el citoplasma de neuronas afectadas en casi la totalidad de los casos diagnosticados de la neuropatía, por lo que sus funciones como regulador en el metabolismo, splicing y transporte del ARN se verían afectados (Amado & Davidson, 2021; Masrori & Van Damme, 2020; Peters et al., 2015). Además, tanto la reducción o eliminación de TDP-43 –que aleja a la proteína de sus funciones normales– como su sobreexpresión en modelos preclínicos causan marcos patológicos característicos de la ELA, lo cual coloca a TDP-43 como un elemento principal del eje en la convergencia y origen de la enfermedad (Brown et al 2022; Meijboom & Brown, 2022; Taylor et al., 2016). El hecho de que su sobreexpresión y acumulación citoplasmática en neuronas recapitule el fenotipo neurodegenerativo en ratones sugiere para TDP-43 una ganancia de función tóxica, por ejemplo, sensibilizando a las neuronas a futuros estímulos de estrés. Otro efecto asociado a la acumulación citoplásmica de la proteína es la reducción de los niveles de TDP-43 nuclear, cuyos mecanismos no están del todo dilucidados (Meijboom & Brown, 2022; Wood et al., 2021). Sin embargo, se acepta que los propios agregados de TDP-43 pueden secuestrar a la forma nativa de la proteína, generando una pérdida de función de la misma en el núcleo celular (Chou et al., 2018). Paralelamente, la 25 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA acumulación de TDP-43 citoplásmica y la formación de agregados de la proteína, genera consecuentemente una ganancia de función tóxica, que además se acompaña de la pérdida de función nativa de TDP-43 (Keating et al., 2022; Wood et al., 2021). Por otro lado, rara vez se encuentran en pacientes de ELA agregados de TDP- 43 junto a los de FUS o SOD1, sugiriendo que las vías celulares por la que se dan ambos fenómenos son distintas, y quizás alternativas, a pesar de tener roles y funciones parecidos en la célula (Jeon et al., 2019; Vance et al., 2009; Zeineddine et al., 2017). En resumen, aunque existe un gran consenso acerca de la importancia de esta proteína en el marco patológico de la ELA, los mecanismos que generan toxicidad y disfunción celular, tanto mediante ganancia como pérdida de función, siguen siendo objeto de estudio. 2.1.2.1.5. Genes implicados con menor frecuencia Como se han destacado anteriormente, existen numerosos genes con implicación en ELA, entre los que también podemos recalcar por su frecuencia a TBK1 (Gerbino et al., 2020), UNC13A (Suzuki et al., 2023) y ATXN2 (Amado & Davidson, 2021). La primera proteína, (del inglés TANK-Binding Kinase 1), juega un papel notable en la regulación de la autofagia, la inmunidad innata, la apoptosis y la neuroinflamación mediante la producción de interferón (IFN) de tipo-I y la activación de la vía NF-κB e interleuquinas proinflamatorias (Kim et al., 2020; Oakes et al., 2017). TBK1 ha sido identificado en varios estudios, tanto en ELA-F como ELA-E (Cirulli, 2015; Freischmidt et al., 2015). Por otro lado, la desaparición de TDP-43 nuclear que se observa de manera concomitante a la formación de agregados de TDP-43 citoplásmicos, genera grandes cambios en el splicing alternativo de UNC13A, mostrando la implicación de este último en ELA y su posible regulación por TDP-43 (Ma et al., 2022). UNC13A está implicado en el transporte de vesículas, siendo numerosos los estudios que le atribuyen un importante papel en la rapidez de progresión y en el tiempo de supervivencia de la enfermedad tomando en cuenta la diversidad que ofrecen sus polimorfismos (Vidal-Taboada et al., 2015). 32 Introducción modulación del sistema inmune y la inflamación, si su propia homeostasis celular se ve alterada, su sensibilidad a los estímulos exógenos o provenientes del sistema inmune se incrementa (Masrori et al., 2022). Por ejemplo, la reducción de los niveles de C9orf72 en neuronas aumenta los receptores de glutamato que presentan dichas células en las membranas, sensibilizando a estas neuronas y presentando, por tanto, una mayor predisposición a la excitotoxicidad por glutamato extracelular (Shi, 2018). Además, la microglía puede incrementar la liberación de glutamato en los terminales sinápticos, a la par que dificultar la retirada de glutamato extracelular mediante la liberación de mediadores inflamatorios (Armada-Moreira et al., 2020). Sumado a este contexto, las células encargadas de la limpieza extracelular en el SNC, como son los astrocitos, pueden fallar en la correcta eliminación de glutamato y restos celulares, generando con ello más daño neuronal por excitotoxicidad, que a su vez retroalimenta las propias señales de factores neurotóxicos liberados por las mismas neuronas, activando más a astrocitos y microglía (Kwon & Koh, 2020; Provenzano et al., 2023). Por otro lado, los oligodendrocitos son células generadoras de mielina que rodean los axones de las neuronas con extensiones de su propia membrana plasmática, permitiendo una actuación rápida sobre éstas, facilitando la transmisión de impulsos nerviosos y el mantenimiento de la homeostasis neuronal. En una situación en la que se generan mediadores proinflamatorios de manera crónica, las células precursoras de los oligodendrocitos, sensibles a estos mediadores, ven interrumpida su maduración y, por tanto, la renovación de las mismas (Festa et al., 2023; Peferoen et al., 2014). 2.1.2.3.1. Microglía Las células de microglía son los macrófagos residentes en el SNC y constituyen la principal célula inmunocompetente en este tejido, jugando un papel relevante en el comienzo y la progresión de la ELA (Geloso et al., 2017). Todo ello convierte a estos macrófagos en el primer eslabón en la respuesta inmunológica ante una lesión en el cerebro (Guo et al., 2022). Cada vez más estudios apuntan a que la neuroinflamación que suele acompañar a la neurodegeneración, marcada fundamentalmente por la activación de microglía, 33 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA tendría un papel importante en la muerte precoz de las neuronas motoras (Amado & Davidson, 2021). Existe un considerable consenso en atribuir a la microglía un origen hematopoyético, cuya migración al cerebro sucede en etapas muy tempranas del desarrollo, antes de la formación de la barrera hematoencefálica (Ginhoux et al., 2010; Guo et al., 2022; Paolicelli et al., 2022), teniendo un papel sustancial en el desarrollo correcto de las neuronas en mamíferos desde etapas embrionarias y adultas (Angelim et al., 2018). A pesar de ello, su ausencia no provoca anomalías aparentes en la arquitectura neuronal del cerebro en etapas embrionarias en ratas, aunque sí presentan una leve alteración en el número de oligodendrocitos (Patkar et al., 2021). La microglía es abundante (siendo en torno al 10% del total de células del SNC) y está distribuida uniformemente en individuos sanos, con funciones en la regulación del número de neuronas, la maduración de oligodendrocitos, promoviendo y madurando la sinapsis, o controlando el exceso de dicha actividad, entre otras (Brites & Vaz, 2014; You et al., 2023) (Fig. 2). Por lo general, en personas sanas presenta una forma ramificada en el soma y con prolongaciones móviles, características que se trasforman hacia una forma más redondeada, hinchada y ameboide, con numerosos y cortos apéndices cuando se detecta una perturbación en la homeostasis (Kwon & Koh, 2020; Paolicelli et al., 2022). Sin embargo, estos cambios morfológicos no conllevan ninguna función determinada que permita clasificar a priori los estados de la microglía. Asimismo, tienen capacidad de comunicación tanto con las células residentes del SNC como con las células inmunes periféricas que se infiltran, lo que añade complejidad y diversidad a la red de comunicación posible que se pueda establecer (Paolicelli et al., 2022). Al producirse daño en el tejido del SNC o una infección, la microglía se activa, definiéndose clásicamente dos fenotipos opuestos. Uno de ellos, denominado M2, caracterizado por la regeneración de tejidos y neuroprotección, ha sido descrito durante las etapas más tempranas del desarrollo de la ELA en modelos animales (Guo et al., 2022). Este fenotipo se debe principalmente a la influencia de mediadores antiinflamatorios, como el factor de crecimiento 34 Introducción transformante beta (TFG-β), IL-4, IL-13 e inmunorreguladores como IL-10, y al factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF). A su vez, esta reacción provoca la liberación del factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) por las propias células microgliales con fenotipo M2 (Colonna & Butovsky, 2017). Paralelamente, células T reguladoras y Th2 infiltradas en el SNC y microglía con fenotipo M2 regularían negativamente las señales tóxicas de estos mismos tipos celulares en condiciones no patológicas (Beers et al., 2011; González & Pacheco, 2014). Es de resaltar que, con el progreso de la enfermedad y la cronificación en la emisión de señales de daño por parte de las neuronas, el fenotipo de las células gliales e inmunes cambiaría a una versión opuesta (Guo et al., 2022; B. Liao et al., 2012). Ejemplos descritos de este fenómeno son los efectos sobre la respuesta de la microglía causados por la sobreexpresión de SOD1 mutante (Kim et al., 2020; Xiao et al., 2007), la presencia de TDP-43 extracelular (Zhao et al., 2015), o de agregados solubles extracelulares de TDP-43 (Leal-Lasarte et al., 2017) –que actuarían como DAMPs, patrones moleculares asociados a daño celular–. Es de interés resaltar que esta activación microglial puede ser inducida por una variedad de ligandos de TLRs y otras moléculas proinflamatorias (Colonna & Butovsky, 2017). En este proceso, la microglía vira a un fenotipo proinflamatorio y citotóxico, que históricamente se ha conocido por fenotipo M1 (Kwon & Koh, 2020). Esta neuroinflamación se materializa generalmente por las vías de las MAPK quinasas, NF-κB e inflamasoma NLRP3 (Masrori & Van Damme, 2020), que promueven la generación de los actores moleculares implicados en este cambio fenotípico. Entre ellos, se encuentran citoquinas proinflamatorias como IL-1β, IL-6, el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), interferón gamma (IFNγ) y quimioquinas, cuya producción sostenida en el tiempo y sumada a la ocasional incapacidad para eliminar el daño por los astrocitos o la propia astrogliosis, generará una mayor neurodegeneración (Guo et al., 2022; Paolicelli et al., 2022). Paralelamente, la piroptosis depende de la activación de la vía de la caspasa-1 por inflamasomas, que resulta en un aumento de los niveles de IL-1β, IL-18 y el 35 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA efector piroptótico gasdermina D, mecanismo que se encuentra activado en la corteza motora de modelos preclínicos de ratón y pacientes de ELA, siendo este un factor recurrente en la neurodegeneración (Van Schoor et al., 2022). Aunque numerosas funciones pueden ser beneficiosas para la salud neuronal, otras como la producción sostenida de especies reactivas de oxígeno (ROS) o de óxido nítrico (NO) y la eliminación de apéndices sinápticos terminan por tener un efecto perjudicial sobre las neuronas (Block et al., 2007; Xiao et al., 2007; You et al., 2023). Fig. 2. La microglía en la neurodegeneración presenta alteradas sus funciones de regulación de la homeostasis en el SNC. En condiciones fisiológicas, la microglía ejecuta funciones de mantenimiento como la plasticidad y remodelación de la sinapsis neuronal, la maduración de oligodendrocitos o la limpieza del medio extracelular. Sin embargo, la alteración de sus funciones normales de la homeostasis y la acumulación de señales proinflamatorias o DAMPs, provocan un cambio en la microglía hacia fenotipos patológicos y un estado de microgliosis, lo que se materializa en la generación de más mediadores proinflamatorios, liberando factores que transforman a los astrocitos hacia un estado reactivo y tóxico, o promoviendo la muerte neuronal, concluyendo en una situación generalizada de neurodegeneración. Adaptado de (You et al., 2023). 36 Introducción Es de destacar que, tanto los fenotipos M1 y M2 están involucrados en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas, indicando la importancia que tiene el equilibrio entre ambos fenotipos para mantener la homeostasis en el SNC (Song & Suk, 2017). En este sentido, células de microglía aisladas de ratones SOD1G93A en un estadio temprano de la enfermedad muestran niveles altos de marcadores M2 junto a bajos niveles de citoquinas proinflamatorias en comparación a ratones en estadio tardío de la enfermedad, en los que por el contrario se observan marcadores M1 junto a niveles elevados de mediadores proinflamatorios, señalando un perfil neurotóxico (B. Liao et al., 2012). En este contexto en el que la homeostasis se perturba, estudios de RNA-Seq a nivel de célula única han permitido observar en modelos preclínicos murinos que una fracción de células de microglía modifica su fenotipo hacia un estado denominado DAM (del inglés disease-associated microglia) o MGnD (del inglés microglial neurodegenerative phenotype) (Keren-Shaul et al., 2017; Krasemann et al., 2017). Este estado caracteriza a la microglía por la regulación negativa de genes con implicación en la homeostasis y una regulación positiva de genes implicados en el metabolismo de lípidos, vías lisosomales y fagocitosis (Xie et al., 2022). Esta subpoblación microglial se ha descrito inicialmente en modelos preclínicos de Alzheimer, aunque se han encontrado perfiles transcripcionales similares en modelos murinos de ELA (Chiu et al., 2013; Hickman, 2013; Keren-Shaul et al., 2017). Por lo general, se suele describir como un proceso en dos fases, donde en primera instancia una subpoblación de la microglía deriva hacia un estado intermedio independiente del mecanismo del receptor TREM2, caracterizándose por una reducción en la expresión de genes del mantenimiento de la homeostasis, como son Cx3cr1 o P2ry12/13. Paralelamente, aumenta la expresión de ciertos genes como Clec7a, ApoE, Axl, Spp1, B2m y Trem2, entre otros (Keren-Shaul et al., 2017; Paolicelli et al., 2022). El receptor TREM2 es vital para que la microglía sea capaz de sufrir una transición DAM, ya que sin su actividad se pierde la capacidad para responder a estímulos que, en condiciones normales, promueven dicha transición y quedan atrapadas en un estado de permanente de homeostasis (Mazaheri et al., 2017; McQuade et al., 2020). 37 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA La segunda fase está promovida por la expresión de Trem2, donde se ve incrementada la expresión de genes del metabolismo de lípidos y de la fagocitosis, como son Cst7, Lpl y CD9 (Keren-Shaul et al., 2017). Como resultado, se obtiene un perfil de genes característicos y que sirven de marca diferencial para determinar subpoblaciones con fenotipo DAM en la microglía (Deczkowska et al., 2018). De interés son los resultados de Jauregui y colaboradores, que reportaron recientemente que existe una elevada expresión de algunos de los marcadores del fenotipo DAM en médulas espinales de pacientes de ELA, como son CD33 o TREM2 (Jauregui et al., 2023) En la actualidad, se reconoce que los conceptos M1 y M2 acerca de los fenotipos de la microglía son una simplificación basada en perfiles extremos y que no reflejan fielmente el estado inflamatorio real de las células en cada momento (Paolicelli et al., 2022; Xie et al., 2022). Los últimos estudios muestran que verdaderamente no existe una dicotomía inamovible, sino que la microglía se mueve en un contexto dinámico y diverso, con una influencia muy significativa del ambiente donde conviven distintas subpoblaciones o perfiles moleculares diferentes de la microglía (Paolicelli et al., 2022). Esto conlleva que el espectro fenotípico de la microglía sea considerablemente amplio, representando numerosas funciones efectoras que pueden tener reflejo en la variedad de subtipos y etapas de desarrollo de la ELA (Tam et al., 2019; Xie et al., 2022). Este complejo escenario lleva a razonar que la activación microglial conducente a un estado inflamatorio ocurre en etapas muy tempranas de la patología, observándose además experimentalmente que los animales SOD1G93A carentes de microglía o con la eliminación de SOD1, ven extendida su vida media, además de un progreso de la enfermedad ralentizado a pesar de portar la mutación (Boillée et al., 2006; Martínez-Muriana et al., 2016). Jara y colaboradores observaron en modelos preclínicos murinos de ELA que se produce un temprano incremento de células MCP1+ en la corteza motora, muy posiblemente microglía activada dada la morfología y los marcadores detectados (Jara et al., 2017). Por consiguiente, la idea de que esta neuroinflamación es prematura respecto a la sintomatología, se ve asimismo reforzada, dado que los tratamientos usados en neurodegeneración no tienen 38 Introducción capacidad de regenerar o reducir el daño, incluso si estos son aplicados antes del cuadro sintomatológico (Guo et al., 2022). Por todo ello, el manejo inteligente de los fenotipos de microglía gana interés como medida terapéutica frente a terapias antiinflamatorias convencionales, que tendrían en el contexto de la ELA unas expectativas limitadas (Song & Suk, 2017). 2.2. Señalización por quinasas en neurodegeneración e inflamación 2.2.1. Conceptos generales sobre proteínas quinasas Conocidos los protagonistas en los procesos de neurodegeneración e inflamación existentes en diversas neuropatías, es también de vital interés identificar qué lenguaje molecular usan en términos de comunicación y señalización. Desentrañar cómo las células microgliales, motoneuronas y el resto de las células implicadas se comunican puede potencialmente ofrecer un elevado número de dianas terapéuticas y/o biomarcadores de diagnóstico y pronóstico de gran interés para el manejo clínico de la ELA. Siendo las vías de las MAP quinasas (MAPK, del inglés mitogen-activated protein kinase) una de las rutas de señalización intracelular más importantes, y participando este tipo de enzimas en numerosas vías de señalización, resulta de gran relevancia ver qué papel pueden jugar en el rol de la neuroinflamación y degeneración sobre las células afectadas. Éstas, junto a las fosfatasas, han sido relacionadas con numerosas enfermedades, desde inflamaciones crónicas, a cáncer o a trastornos del SNC (da Costa et al., 2023; S. H. Lee & Suk, 2017). Del total del genoma humano, las quinasas constituyen una gran proporción de las fosfotransferasas, implicadas no solo en inflamación, sino en todo tipo de respuestas celulares relacionadas con el crecimiento, el metabolismo, la supervivencia, etc. (Gunosewoyo, 2017). Las proteínas quinasas, cuya actividad enzimática es la fosforilación de proteínas, se clasifican tomando en consideración a los residuos que fosforilan en las proteínas: principalmente encontramos un gran grupo formado por las quinasas que fosforilan residuos de tirosinas (tirosina quinasas), y otro gran grupo formado por quinasas de serina/treonina (serina-treonina quinasas) que fosforilan residuos del mismo 39 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA nombre. Curiosamente, también existen proteínas quinasas menos frecuentes que fosforilan sobre los tres residuos, presentando una actividad dual (S. H. Lee & Suk, 2017). 2.2.2. Señalización por proteínas quinasas, su papel en enfermedades neurodegenerativas e inflamación Las quinasas, como reguladores protagonistas presentes virtualmente en todas las vías de señalización de las células, se ofrecen como uno de los candidatos favoritos en la desregulación, en la aparición y el desarrollo de la neuroinflamación, que finalmente conlleva la muerte de las neuronas motoras ocurrida en ELA. Como veremos a continuación, existe una variedad de proteínas quinasas que han sido relacionadas con alteraciones del sistema inmune en el contexto de la ELA, y que por tanto les dota de alto interés a la hora de estudiar su posible eficacia como nuevas dianas terapéuticas en modelos preclínicos o en ensayos clínicos (García-García et al., 2021) (Fig. 3). Aunque la mayoría de los principios activos aprobados por la FDA como medicamentos en lo que se refiere a la inhibición de la actividad quinasa se utilizan en el tratamiento del cáncer, cada vez existen más ensayos clínicos basados en la administración de moléculas pequeñas (small molecules) con capacidad de inhibir proteínas quinasas de interés en neurodegeneración, además de ser aptas para atravesar la barrera hematoencefálica (García- García et al., 2021; Roskoski, 2023). Es por todo ello que identificar y contar con este tipo de herramientas y dianas, descubrir nuevas interacciones y moléculas desde la investigación, arroja en el contexto de la ELA información útil para elucidar los mecanismos moleculares subyacentes en el desarrollo y origen de la inflamación neurotóxica y, eventualmente, establecer el desarrollo de tratamientos basados en las nuevas dianas terapéuticas identificadas. 40 Introducción Fig. 3. Mecanismos de las principales quinasas de señalización implicadas en ELA en la generación de la neuroinflamación en SNC. Resumen de los mecanismos modulados por las quinasas RIPK1, TBK1, EPHA4, ROCK1/2 y GSK-3α/β y que juegan un papel en neuroinflamación, además de la hipótesis acerca de la implicación de MOK. Imagen generada mediante Biorender.com 2.2.2.1. GSK-3α/β (Glycogen synthase kinase 3) A pesar de ser descrita inicialmente como la quinasa que fosforila a la glucógeno sintasa, inactivándola con ello y procediendo de ahí su nombre, actualmente se conocen más de 50 proteínas que actúan como sustrato de GSK-3. En mamíferos, esta serina/treonina quinasa presenta dos isoformas, una de 51 kDa denominada GSK-3α y una segunda llamada GSK-3β de 47 kDa la cual se encuentra muy expresada en el sistema nervioso. De hecho, existen evidencias de que su alteración puede provocar desórdenes como el cáncer, el Alzheimer o el Párkinson (Demuro et al., 2021). Varios estudios muestran un aumento de los niveles de la isoforma β, tanto nativa como fosforilada, en el córtex frontal e hipocampo de pacientes de ELA (Choi et al., 2020; Kihira et al., 2009; W. Yang et al., 2008), por lo que se conjetura que podría afectar a las funciones de TDP-43 y SOD1. Del mismo 41 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA modo, se ha correlacionado en pacientes de ELA un aumento y acumulación de TDP-43 fosforilado junto a mayores niveles de expresión de GSK-3β, convirtiéndolo en un potencial marcador de la evolución de la enfermedad (Sreedharan et al., 2015). Asimismo, en modelos preclínicos de ratón transgénico de TDP-43A315T se ha observado que el tratamiento con el inhibidor competitivo de GSK-3β, tideglusib, posee un efecto neuroprotector tanto in vitro como in vivo, además de disminuir los niveles de TDP-43 fosforilados en la médula espinal de los ratones (Martínez-González et al., 2021). Por otro lado, el uso de sales de litio, tratamiento mayoritario para el trastorno bipolar, inhibe la actividad de GSK-3α/β reduciendo la fosforilación de los distintos sustratos de la quinasa, siendo éste un tratamiento cada vez más frecuente en ensayos clínicos de diferentes neuropatías (Gunosewoyo, 2017; King et al., 2015; Leeds et al., 2014). 2.2.2.2. TBK1 (TANK-binding kinase 1) Como ya se ha destacado anteriormente, las mutaciones en TBK1 juegan un papel en la evolución de la ELA, siendo ésta una proteína quinasa de residuos de serina/treonina con numerosas funciones, destacando principalmente la regulación de la autofagocitosis, mitofagia y la mediación de la inflamación de IFN de tipo-I (Kim et al., 2020). Gracias a dos estudios independientes realizados por Cirulli y Freischmidt, y sus respectivos colaboradores, se identificaron mediante secuenciación diferentes mutaciones en la secuencia de TBK1 asociadas directamente con la ELA (Cirulli, 2015; Freischmidt et al., 2015). Asimismo, dada su relevancia en mecanismos de autofagia, varios estudios indican que su pérdida provoca un incremento en la acumulación citosólica de agregados de SOD1 en motoneuronas de modelos preclínicos de ELA, lo cual contribuiría al desarrollo de la neurodegeneración y una aparición temprana de los síntomas (Gerbino et al., 2020; Kiriyama & Nochi, 2015). Este mecanismo, que puede venir dado por mutaciones que disminuyen la transcripción de TBK1 o bien por generación de una versión truncada en el sitio activo de la proteína, termina provocando la acumulación de agregados proteicos dada la falta de autofagia (Oakes et al., 2017). A pesar de no ser diana de ningún tratamiento o ensayo clínico hasta la fecha, sí que se tiene en cuenta como posible biomarcador en el caso de las 48 Introducción Filippakopoulos, 2015). Por lo general, la acetilación de histonas se asocia a genes cuya transcripción está activa, siendo este uno de los principales factores a la hora de determinar la unión de Brd4 a cromatina, por lo que suele encontrarse frecuentemente en regiones promotoras o enhancers de genes al realizar técnicas de ChIP-Seq (Dhalluin et al., 1999). Se conoce que la unión de Brd4 a las regiones promotoras resulta en el reclutamiento de una gran cantidad de actores moleculares que facilitan y promueven la cinética transcripcional, tales como la propia maquinaria o los denominados super-enhancers (C. Wang et al., 2019). Junto a Brd4 interaccionan una gran cantidad de elementos a la hora de regular su actividad como modulador de la transcripción. En este sentido, son de vital importancia en la regulación de Brd4 las modificaciones post-traduccionales que éste puede sufrir, entre las que se incluyen las fosforilaciones, hidroxilaciones, ubiquitinaciones o isomerizaciones, regulando así su estabilidad, abundancia y actividad que, al verse alteradas generalmente promoverán la aparición de cáncer (Liang et al., 2021; Y.-F. Tan, 2021). Entre éstas, destaca principalmente la fosforilación en el residuo Ser492 de Brd4, que estaría mediado por la caseína quinasa II (CK2), la cual es responsable de permitir la activación de Brd4 y promover la unión estable a cromatina y el reclutamiento, entre otros, de p53 en su actividad como supresor de tumores (Korb et al., 2015; Wu, 2013). Llamativamente, la actividad de la fosfatasa 2A (PP2A) genera un interruptor molecular mediante el estado de fosforilación de Brd4, siendo esta dualidad CK2/PP2A crítica en la regulación de la activación de Brd4 (Chiang, 2016). Desgraciadamente, poco se conoce acerca de los reguladores aguas arriba para Brd4 aparte de los nombrados, siendo éste un interesante nicho en la investigación de nuevas dianas con un alto potencial terapéutico. Respecto a sus mecanismos, Brd4 recluta a P-TEFb (del inglés positive transcription elongation factor), un factor de transcripción que induce la fosforilación de la ARN polimerasa II, y posteriormente a la maquinaria de elongación. A su vez, gracias de nuevo a P-TEFb se produce la fosforilación e inhibición del factor negativo de elongación (NELF), promoviendo así la 49 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA transcripción (Ali et al., 2022). En este escenario, Brd4 juega un papel en la transcripción regulando la interacción con un gran complejo de mediadores que actúan como co-activadores, conformado por unas 30 subunidades diferentes. Asimismo, gracias a la formación de este complejo mediador se da la interacción de Brd4 con las formas activas de P-TEFb: CDK9 y la ciclina T1, reclutándolo hacia la cromatina (Bhagwat et al., 2016; Moon et al., 2005). Es de destacar, que mientras el dominio BD2 de Brd4 interacciona y reconoce a la ciclina T1 en la región promotora de los genes, promoviendo y manteniendo la elongación de la transcripción, paralelamente la región CTM interacciona con CDK9, que a su vez gracias a su actividad quinasa es la encargada de fosforilar a la polimerasa, además de inhibir a los reguladores negativos (Q. Zhou et al., 2012). 2.3.2. Papel de Brd4 en diversas patologías Brd4 ha sido relacionada con numerosas enfermedades en las que una desregulación y disfunción de la misma lleva a un marco patológico, como ocurre en la oncogénesis. Así sucede con MYC, un protooncogén entre cuyas funciones se encuentran la regulación del ciclo celular, la apoptosis o la transformación celular (Dang, 2012), y junto al que se ha relacionado Brd4 en metástasis, ya que este último mantiene la expresión activa de MYC y otros genes relacionados (C. Y. Lin, 2015). El mal funcionamiento de Brd4 se debería a la deslocalización de la secuencia de aminoácidos de su región C-terminal, provocando cambios estructurales terciarios en Brd4 que comprometen la interacción proteína-proteína (Ali et al., 2022). De igual manera, al ser Brd4 un regulador de la remodelación de cromatina, mantiene la cromatina y nucleosomas compactados en condiciones normales. Por ello, su sobreexpresión en próstata provoca un aumento en la accesibilidad de la cromatina gracias al desplazamiento de nucleosomas y co-activando al receptor andrógeno; situación que suele derivar en un marco de cáncer de próstata (Urbanucci et al., 2017). El punto común de este contexto patológico es la expresión errática de Brd4 y su activación constitutiva, por lo que en los últimos años el desarrollo de medicamentos con capacidad para inhibir su actividad ha ganado gran importancia en el tratamiento contra este lector epigenético. Entre los 50 Introducción inhibidores más destacables podemos encontrar a I-BET151, I-BET762, PFI-1, OTX015 y JQ1 (Jarausch et al., 2022; C. Y. Wang & Filippakopoulos, 2015). Éstos, por lo general, se basan en la capacidad de unión a los dominios BD de Brd4, de forma que estos compuestos mimetizan la unión de las lisinas acetiladas con los bolsillos de BD, inhibiendo también a otros miembros de la familia BET. Por otro lado, existen inhibidores de Brd4 que promueven su degradación mediante el proteasoma, los llamados PROTAC (del inglés Proteolysis-Targeting Chimeras). En esta categoría encontramos inhibidores como dBET1, BETd-246 o MZ1 (Winter, 2016). Existe un tercer grupo que se basa en la inhibición por especificidad hacia los dominios BD, ya que la evidencia cada vez más resalta las diferencias funcionales entre ambos dominios. En esta categoría encontramos a GSK778, el cual reconoce e inhibe específicamente a BD1, mientras que ABBV-744 o GSK046 tienen como objetivo al segundo bromodominio (Faivre et al., 2020; Martella et al., 2023). Aunque los citados inhibidores son muy eficaces y específicos para la familia de proteínas BET, es necesario investigar nuevos medicamentos que aumenten la ventana terapéutica en la que son útiles en un marco clínico. Asimismo, otro interesante enfoque poco estudiado es el desarrollo de fármacos que tengan como diana dominios diferentes a BD, como serían el ET o CTM, los cuales poseen funciones indistintamente vitales e importantes que permitirían ampliar el rango de herramientas en esta línea de tratamientos (Liang et al., 2021). 2.3.2.1. Brd4 y sus mecanismos en la respuesta inmunitaria, neuroinflamación y enfermedades neurodegenerativas Las proteínas de la familia BET juegan un papel muy significativo en las respuestas inflamatorias mediante la promoción y activación directa de la transcripción de citoquinas proinflamatorias y otros mediadores (N. Wang et al., 2021). Aunque al suceder el daño, esta respuesta inflamatoria asiste y facilita la defensa y la reparación de las heridas del tejido, su cronificación puede llevar a enfermedades inflamatorias, como se ha destacado anteriormente (G. Y. Chen & Nuñez, 2010). Dada su relación con la producción de citoquinas, Brd4 gana interés en el contexto de enfermedades autoinflamatorias y del SNC como posible diana para reducir los efectos de esta respuesta inmune. Como se ha 51 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA adelantado en el apartado anterior, se han realizado numerosos avances con los inhibidores de la familia BET en casos de inflamación, con resultados muy positivos en modelos preclínicos. Por ejemplo, Nicodeme y colaboradores realizaron un estudio muy significativo en el que, usando inhibidores de la familia BET, observaron la reducción de mediadores proinflamatorios en macrófagos activados in vivo, además de detectar una protección contra el shock letal producido por LPS. Curiosamente, el uso del inhibidor no solo impidió la transcripción de un subconjunto de genes mediadores de la inflamación, sino que además la mayoría de genes restantes apenas vieron alterada su expresión, indicando una inhibición selectiva de genes inflamatorios en este tipo celular (Nicodeme et al., 2010). Recientemente, Baek y colaboradores han observado resultados similares en líneas microgliales, poniendo de manifiesto una importante inhibición de genes inflamatorios dependientes de Brd4 bajo estímulos por LPS en combinación con sus inhibidores, además de ver alterada su motilidad y capacidad de atracción hasta las zonas dañadas (Baek et al., 2021). Bajo este contexto, los inhibidores de BET regulan negativamente a citoquinas proinflamatorias como son IL-17 o GM-CSF, mientras que aumentan la producción de mediadores antiinflamatorios como LAG3, IL-10 o EGR2 en linfocitos T colaboradores (DeMars et al., 2018). Desde otro enfoque, se ha observado una función de Brd4 como modulador del splicing alternativo del ARN de genes inflamatorios clave, como IFRD1 o XBP1 (del inglés Interferon-related Developmental Regulator 1 y X-Box Binding Protein 1, respectivamente), frente a una infección vírica por vías aéreas (Mann et al., 2023). En la práctica, se han realizado estudios relevantes acerca del papel de Brd4 en enfermedades del SNC, observándose un importante beneficio funcional del uso de inhibidores de la familia BET en modelos de isquemia cerebral, tanto en el alcance de los infartos como en los déficits sufridos por las neuronas, gracias a la regulación inflamatoria y de vías NF-κB (DeMars et al., 2019; Y. Zhou et al., 2019). Este efecto estaría facilitado por la reducción de mediadores proinflamatorios cerebrales como TNFα, CCL2, CXCL1 o CXCL10. De hecho, en modelo isquémico de rata, y tras 24 horas de daño, los animales tratados con el inhibidor JQ1 mostraban un menor déficit neurológico y magnitud del 52 Introducción infarto, además de una atenuación en la expresión de mediadores proinflamatorios como IL-1β, IL-6 o TNFα (L. Liu et al., 2021). Es interesante destacar que, en modelos preclínicos se ha observado cómo JQ1 reduce significativamente los niveles de NF-κB p65 en el núcleo, aumentando los del inhibidor IκB en dicho contexto (Y. Zhou et al., 2019). Por mecanismos alternativos mediante el eje MAPK-Mnk1/2-eIF4E, y gracias a ratones knockout condicionales de Brd4, se ha demostrado el papel de Brd4 en la respuesta inmune innata, ya que dichos animales ganaban una resistencia a estímulos por LPS a la vez que eran más susceptibles a infecciones bacterianas. Los macrófagos de estos animales veían reducida significativamente la expresión de genes de la respuesta inflamatoria mediada por TLRs, tales como citoquinas, además de un aumento de los niveles del inhibidor de la vía NF-κB, IκBα, mediante el citado eje (Bao et al., 2017). Como se ha mencionado anteriormente, al ocurrir un daño y generarse una respuesta inflamatoria, dicha respuesta inmune puede aumentar las consecuencias de un daño secundario más allá del deterioro original. Terapias dirigidas contra la familia BET reducen drásticamente los niveles de moduladores proinflamatorios y el reclutamiento de células inmunes al tejido lesionado 3 días tras el daño en la médula espinal de ratón, aunque sin beneficio en la contención del área dañada o recuperación de las funciones motoras (Rudman et al., 2018; J. Wang et al., 2019). Curiosamente, el tratamiento con JQ1 mantenido en el tiempo, unos 28 días tras el daño, ayuda en la reducción de la activación de microglía y del resto de macrófagos (Sánchez-Ventura et al., 2019). Por otro lado, también se ha encontrado beneficio en el uso de estos inhibidores en patologías como la esclerosis múltiple (EM) y el Alzheimer. En modelos de ratón de EM se ha observado que el uso de I-BET-762 inhibe la capacidad de los linfocitos T colaboradores para inducir la neuroinflamación en fases tempranas de la enfermedad (Bandukwala et al., 2012) mientras que otros inhibidores, como I-BET151 reducen la aparición de los primeros síntomas (Barrett et al., 2014). Chen y colaboradores ponen a Brd4 en la diana para el tratamiento de la EM gracias a la aplicación de un compuesto dirigido al dominio BD1, logrando una reducción de la expresión de transcritos de 53 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA citoquinas proinflamatorias en modelos murinos (X. Chen et al., 2024). Asimismo, en modelos de ratón de Alzheimer se ha observado, además de los efectos antiinflamatorios ya citados de JQ1, una reducción de la fosforilación de la proteína tau en el córtex frontal e hipocampo de dichos animales (Magistri et al., 2016). En estudios recientes, se ha comenzado a poner en valor el uso de inhibidores de la familia BET como herramienta molecular para la ELA. Así, por ejemplo, se ha encontrado que la acumulación nuclear peptídica debida a la repetición del hexanucleótido, en concreto por la repetición de residuos arginina, provoca un efecto tóxico en modelos C9orf72 (Mizielinska et al., 2014; Wen et al., 2014). Este fenómeno tóxico se ve reducido mediante el tratamiento con JQ1 e I-BET- 762 en líneas celulares expuestas a estos péptidos, provocando la relocalización citoplásmica de los polipéptidos, con un efecto protector. Sin embargo, este mecanismo no se ha observado en células gliales o neuronales (M. Chen et al., 2024). Desde el punto de vista de ELA, se ha observado que el uso de ciertas estrategias que conlleven un aumento en la expresión de C9orf72 nativo resultan beneficiosas en dicho contexto neuropatológico (Bennett et al., 2020; Meijboom & Brown, 2022). Con esta idea, Zeier y sus colaboradores mostraron que dicho aumento era posible usando inhibidores de BET en motoneuronas del modelo C9/ALS (Zeier et al., 2015). Recientemente, se ha observado que el inhibidor de Brd4, PFI-1, induce en el modelo C9/ALS las variantes transcritas mutantes de C9orf72, facilitando la formación de agregados de ARN nucleares y evitando con ello la acumulación de agregados peptídicos mediante el secuestro de ARN portando la repetición del hexanucleótido, con un efecto neuroprotector (Quezada et al., 2021). 54 55 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA OBJETIVOS 56 57 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA 3. Objetivos Los objetivos de esta tesis doctoral son: ❖ Identificar si la quinasa MOK juega un papel en la modulación de las respuestas inflamatorias desencadenadas en el modelo de agregación de TDP-43 y estimulación proinflamatoria, así como evaluar el efecto del compuesto C13 en cultivos primarios de microglía. ❖ Caracterizar el fenotipo inmunológico inducido por estimulación proinflamatoria de células microgliales bajo la inhibición o ablación de MOK. ❖ Conocer vías de señalización moduladas por MOK de los que forma parte como regulador en la respuesta inmune en microglía. ❖ Estudiar el impacto de MOK en los niveles de pBrd4Ser492 y de unión de Brd4 a promotores de citoquinas, en la respuesta inflamatoria de microglía. ❖ Analizar el eje bpMOK-pBrd4Ser492 y encontrar posibles alteraciones bajo estímulos inflamatorios en cultivos organotípicos de médulas espinales de animales SOD1 frente a animales silvestres. ❖ Identificar si MOK se encuentra alterado en tejido del SNC, en modelos preclínicos de ratón y pacientes de ELA. ❖ Evaluar el impacto de la administración de C13 in vivo en ratones SOD1G93A en el transcurso de la enfermedad y determinar los efectos en el desarrollo de la neuroinflamación. 64 Materiales y métodos se fragmentaron en 3 ó 4 porciones para facilitar la digestión. Las médulas espinales fragmentadas fueron depositadas en un tubo con medio salino casero frío para preservar la mayor viabilidad posible mientras se procesan el resto de las médulas. Fig. 4. Procedimiento del procedimiento de disección y aislamiento de médulas espinales a partir de embriones de ratón. Una vez inmovilizado el embrión con agujas y dejando a la vista la parte dorsal, se realiza una escisión rostro-caudal que permite la visualización directa de la médula (A y B). Posteriormente con ayuda de pinzas se va liberando la médula del resto del cuerpo (C, D y E) hasta liberarla completamente, retirando finalmente las meninges (F). Una vez todas las médulas espinales fueron extraídas y fragmentadas, se realizaron dos lavados con medio salino y seguidamente se realizó un paso de tripsina-EDTA 0,25% diluida diez veces en medio salino (concentración final 0,025%) durante 10 minutos con agitación cada 2 minutos a 37 °C. Tras esta incubación, las médulas fueron trasferidas a un nuevo tubo que contiene 800 µL de medio L15 suplementado (20 mM D-glucosa, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina, 1% de suplemento N2 (Thermo Fisher) y 2% HS) y 100 µL de albumina sérica bovina (BSA) al 4% en PBS a las que seguidamente se les añadió 100 µL de ADNasa (200 U total). Tras ello, se agitaron los tubos vigorosamente con la mano durante 2 minutos y posteriormente se aspiró y expulsó todo el contenido de los tubos con la pipeta 65 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA P1000 cuatro veces, tras lo cual se dejó decantar los fragmentos de médula no homogenizados por 2 minutos. Pasado este tiempo, se transfirió a un tubo nuevo la suspensión homogénea de células disociadas para repetir un nuevo paso de disgregación enzimática con ADNasa de los fragmentos no digeridos. Para ello, a los fragmentos sin disociar se les añadió nuevamente 900 µL de L15 suplementado como se ha descrito anteriormente y 100 µL BSA al 4%, pero esta vez con 40 U de ADNasa, sin repetir el paso de agitación y pipeteando nueve veces los fragmentos restantes. Se transfirió de nuevo el volumen que contiene la suspensión celular y este paso se repitió en caso de no lograrse la digestión completa de los fragmentos de médulas espinales. Posteriormente, bajo la suspensión celular se depositó un volumen de 4 mL de BSA al 4% en PBS, generando un gradiente BSA-suspensión celular, el cual al centrifugar a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente permitió limpiar la suspensión celular y generar un pellet, que seguidamente fue resuspendido en 1 mL de L15 suplementado una vez aspirado el sobrenadante. Finalmente, este volumen de suspensión celular se depositó cuidadosamente sobre 4 mL del gradiente de separación formado por una dilución 1:8 de OptiPrep (D1556, StemCell) en medio DMEM no suplementado (31053-028, Sigma-Aldrich). Posteriormente se procedió a centrifugar a 520 x g durante 10 minutos reduciendo la aceleración y deceleración a 4 y 3 puntos sobre 10, respectivamente, y a temperatura ambiente. Tras este paso, se recuperó la interfase enriquecida en motoneuronas formada entre el gradiente OptiPrep y el sobrenadante del medio superior como ejemplifica la figura (Fig. 5). 66 Materiales y métodos Fig. 5. Separación para el aislamiento de motoneuronas primarias tras centrifugación en gradiente de densidad. Tras el paso de centrifugación, las motoneuronas, de mayor tamaño y menor densidad que el resto de células, no son capaces de superar el gradiente y quedan formando una interfase de apariencia blanquecina rica en este tipo celular. Las células no neuronales son capaces de sobrepasar este gradiente y formar un pellet al final del tubo. La suspensión celular se diluyó hasta la concentración necesaria para los experimentos en medio Neurobasal (21103049, Gibco) suplementado con 5% HS, 2% de suplemento B-27 (17504044, Gibco), 0,5 mM L-glutamina, 50 µM βmercaptoetanol (Thermo Fisher), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) (PeproTech), 10 ng/mL de factor neurotrófico ciliar (CNTF) (PeproTech), 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) (PeproTech) y 10 ng/mL de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (PeproTech). 24 horas tras la siembra, se realizó un cambio de medio al 50% añadiendo medio Neurobasal fresco suplementado como se ha descrito, además del inhibidor de crecimiento citarabina (Thermo Fisher) 2 µM final, evitando la proliferación de otros tipos celulares no neuronales. Tras 24 horas de la adición de la citarabina, se procedió a un nuevo cambio de medio al 100% por nuevo Neurobasal fresco suplementado para retirar los restos del inhibidor. Para la siembra de las motoneuronas y obtener una correcta generación de apéndices neuríticos y una adherencia efectiva, es necesario el previo tratamiento de las placas de cultivo. Para ello, las placas fueron tratadas antes 67 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA de sembrar con 35 µg/mL de poli-DL-ornitina (Sigma-Aldrich) diluida en una solución de 150 mM tetraborato sódico y 150 mM ácido bórico a pH 8.3 durante al menos 4 horas. Tras este primer tratamiento de las placas, el volumen fue aspirado y los pocillos lavados 3 veces con agua bidestilada estéril y se dejó secar completamente antes del segundo tratamiento. Tras este paso, se añadieron 3,8 µg/mL de laminina (Sigma-Aldrich) diluida en L15 sin suplementar y se incubó durante al menos 1 hora a 37 °C, volumen el cual fue retirado justo antes de sembrar las motoneuronas sin dejar secar. Para comprobar la pureza de los cultivos de motoneuronas primarias y la eficiencia del protocolo, se realizó inmunofluorescencia con el anticuerpo anti- ISLET1 (#38866, SAB) (Tabla 3) específico para un factor de transcripción presente sólo en motoneuronas en etapas embrionarias. 4.6. Ensayos de medios condicionados por líneas microgliales SIM-A9 sobre cultivos de motoneuronas primarias Se tomaron cultivos primarios de motoneuronas puras tras 5 días en cultivo a los que se les realizó un cambio de medio completo por un 50% de medio Neurobasal suplementado y fresco con una concentración 2X de factores tróficos (BDNF, CNTF, GDNF y HGF) y 50% medio condicionado por líneas microgliales SIM-A9 anteriormente descrito. 4.7. Aislamiento de microglía primaria de neonatos de ratón Para los cultivos de microglía primaria puros se tomaron de 12 a 16 neonatos de 1-3 días de edad de la cepa C57BL/6 (Centro de Experimentación Animal Óscar Pintado, Universidad de Sevilla, Sevilla, España). Tras el sacrificio, se tomaron los encéfalos y se les eliminó el cerebelo, bulbo olfatorio y las meninges con pinzas sobre HBSS frío (Thermo Fisher) (Fig. 6). Seguidamente, se procedió a la digestión de los cerebros con tripsina-EDTA 0,25% durante 15 minutos a 37 °C. La reacción fue detenida añadiendo un volumen igual de DMEM-F12 (Sigma-Aldrich) suplementado con 10% FBS, 2 mM de L- glutamina, 10 mM de aminoácidos no esenciales (Gibco), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 100 U/mL de ADNasa y agitando unos minutos hasta la eliminación de grandes fragmentos de cerebro. La suspensión resultante fue transferida a un tubo nuevo a través de un filtro con 68 Materiales y métodos tamaño de poro de 70 µm para evitar el paso de fragmentos sin digerir. Posteriormente se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos. Dicho pellet, conformado por una suspensión mixta de células gliales, fue resuspendido en medio DMEM-F12 suplementado como se ha descrito (sin ADNasa) y sembrado en cuatro placas de seis pocillos previamente tratadas durante 2 horas con 100 µg/mL de poli-D-lisina. Se realizó cambio de medio por medio completo fresco 2 veces por semana. Fig. 6. Disección realizada sobre cerebros de ratones neonatos para la preparación de cultivos de microglía primaria. Una vez extraído el encéfalo, se colocó sobre HBSS frío, y mediante el instrumental adecuado se retiró el cerebelo, bulbos olfatorios y las meninges, dejando el cerebro totalmente limpio. Tras la formación de una monocapa de células gliales mixtas confluyente que cubriese la totalidad del pocillo, aproximadamente 4 semanas tras la siembra, se procedió a aislar células microgliales del cultivo mixto. Para ello, se retiraron y guardaron los sobrenadantes y se realizó un lavado con DMEM sin suplementar, posteriormente se realizó un paso de tripsinización suave al 0,015% durante 20-45 minutos a 37 °C hasta lograr retirar el resto de las células no microgliales, como astrocitos u oligodendrocitos. Posteriormente se aspiró el sobrenadante de células desprendidas y se realizó un lavado con PBS. Seguidamente se añadió acutasa (StemPro) y se incubó 15 minutos a 37 °C. Finalmente se procedió a levantar las células de los pocillos con ayuda de un rascador para transferir la suspensión celular a un tubo y se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos. El pellet fue resuspendido en el medio guardado 69 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA previamente junto a un 50% de medio fresco y sembradas en placas de 12 pocillos a una densidad de 120.000 células por pocillo durante 72 horas antes de realizar cualquier tratamiento. 4.8. Generación de cultivos organotípicos y tratamientos Los cultivos organotípicos fueron generados a partir de regiones lumbares de médulas espinales de ratones macho de 4 semanas de edad de la cepa C57BL/6. Tras anestesiar, los ratones fueron perfundidos con 10 mL de PBS seguido de 10 mL de buffer de extracción KREBS frío (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgCl2, 2,1 mM CaCl2, 72 mM NaHCO3, 1,8 g/L D-glucosa, 0,1 M HEPES, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina). Tras ello, las secciones lumbares de las médulas espinales fueron escindidas del cuerpo y depositadas en KREBS frío. Las médulas se colocaron en agarosa al 4% a 37 °C y se cortaron en secciones transversales de 250 μm con una cuchilla vibratoria (VT1000S, Leica Biosystems, Nussloch, Alemania) a 75 Hz y a una velocidad de 0,1 mm/segundo. Los cortes se mantuvieron en cultivo con un medio compuesto por 50% (v/v) de Medio Mínimo Esencial (MEM) (Sigma-Aldrich) suplementado con 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 25% de HS, 2 mM de L-glutamina, y 25% de HBSS suplementado con 25,6 mg/mL de glucosa con un pH final de 7.2. Los cortes se mantuvieron a 37 °C en atmósfera de 5% de CO2 y saturación de humedad. Los cultivos se dejaron estabilizar los primeros cuatro días, y posteriormente el medio cambiado cada 3 días. Tras una semana, se realizaron los estímulos con LPS o control como se ha descrito durante 16 horas. Tras este periodo, se guardaron los sobrenadantes como se ha descrito para posteriormente confirmar la correcta estimulación por ELISA de la interleuquina IL-6. Tras los ensayos y confirmadas las respuestas a los estímulos, se procedió a realizar inmunofluorescencias a los cortes como se describe más adelante. 4.9. Determinación de viabilidad por ensayo de MTT de líneas celulares NSC-34 Para valorar la viabilidad celular de la línea NSC-34 se utilizó el kit de proliferación celular basado en la reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5,-difenil tetrazolio (MTT) (#11465007001, Roche) el cual permite medir 70 Materiales y métodos la transformación de la sal de tetrazolio a MTT gracias al metabolismo de las células activas. Siguiendo las indicaciones del fabricante, se sembraron 1,5×104 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer como se ha indicado. Tras finalizar el estímulo requerido por los experimentos, se procedió a añadir 10 µL del reactivo salino marcador a cada pocillo y se dejó incubar a 37 °C durante 4 horas para permitir la generación de MTT. Tras esta incubación se añadieron 100 µL del reactivo de solubilización y se procedió a una nueva incubación a 37 °C durante 16 horas. Tras este tiempo, el color púrpura generado fue analizado en un lector de microplacas Varioskan (Themo Fisher) a una longitud de onda entre 550 y 600 nm formando una relación directamente proporcional de la viabilidad celular respecto a la generación de color y tomando los controles experimentales como el 100% de viabilidad celular. 4.10. Ensayos de viabilidad de motoneuronas primarias de embriones de ratón con medios condicionados de microglía por microscopía de cribado de alta eficiencia Se realizaron ensayos de viabilidad celular usando el kit de valoración de viabilidad LIVE/DEAD (Invitrogen) por fluorescencia en un microscopio de cribado de alto rendimiento. Este kit tiñe las células vivas gracias a la actividad esterasa por la que las células son capaces de metabolizar el precursor no fluorescente de la calceína y generar color verde. Por otro lado, la membrana plasmática de las células necróticas se vuelve permeable y permite el paso del homodímero de etidio 1 el cual se une a ácidos nucleicos generando color rojo. Se sembraron motoneuronas primarias de ratón en placas de 96 pocillos (Nunc) compatibles con el equipo de visualización a una densidad de 1,5×104 por pocillo. Al terminar los tiempos de estimulación con medios condicionados sobre las motoneuronas y siguiendo las recomendaciones del fabricante, se retiró el medio de cultivo y se añadieron a cada pocillo los reactivos colorantes del kit diluidos en PBS para ser incubados durante 5 minutos a 37 °C. Pasado el tiempo de incubación, se tomaron 16 campos de imágenes por cada pocillo con el microscopio de escrutinio masivo confocal IMAGEXPRESS MICRO SYSTEM 71 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA (Molecular Devices) a longitudes de onda de excitación/emisión de 494/517 nm para el verde y 528/617 nm para el rojo. Los resultados de las imágenes fueron analizados mediante el programa MetaExpress, el cual permite contabilizar el número de células muertas (marcadas en rojo) presentes en un área determinada del pocillo. 4.11. Inmunofluorescencia de cultivos celulares Para los ensayos de inmunofluorescencia, se utilizaron células SIM-A9, cultivos de microglía primaria puros o motoneuronas primarias obtenidos como se ha descrito anteriormente, excepto que, en este caso, los cultivos se sembraron en cubreobjetos de vidrio pretratados como corresponde a cada tipo celular primario. Para el proceso de inmunomarcaje, tras terminar los tiempos requeridos por los experimentos, los cultivos se fijaron en PBS frío que contenía un 4% de paraformaldehído (Sigma-Aldrich) durante 20 minutos a 4 °C, que luego se lavaron con PBS antes de ser permeabilizados y los sitios inespecíficos bloqueados con una solución de bloqueo que contenía un 0,5% (v/v) de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) y un 3% de BSA en PBS (buffer de bloqueo) durante 1 hora a 4 °C. Tras este tiempo, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con los diferentes anticuerpos primarios (Tabla 3) diluidos en buffer de bloqueo. Tras lavar con PBS, las células se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad con su correspondiente anticuerpo secundario conjugado a fluoróforo (Tabla 4) diluido en buffer de bloqueo nuevamente. Después de 3 lavados con PBS, los núcleos se tiñeron con 1 µg/mL de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich) en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente para la correcta contra tinción de los núcleos. Finalmente, los cubreobjetos se depositaron sobre un portaobjetos en el que previamente había sido colocada una gota de medio de montaje (H- 1000, VectaShield). Las imágenes de fluorescencia se capturaron con un microscopio de epifluorescencia (DM6000B; Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) o un microscopio de escaneo láser confocal (Confocal Lase Scanning Microscope TCS SP5; Leica Microsystems). Las imágenes de fluorescencia se tomaron a una magnificación de 63X en 10 campos elegidos al azar. 72 Materiales y métodos 4.12. Inmunohistoquímica (IHC) Tanto los ensayos de inmunohistoquímica (IHC) como los análisis posteriores fueron realizados bajo doble ciego. Fragmentos previamente fijados de la región lumbar de las médulas espinales de ratones TgTDP43 o ratones silvestres y cortes de pacientes diagnosticados con ELA-E o pacientes sanos, fueron embebidos en parafina y seccionados en rodajas de 10 µm de grosor. Tras desparafinar, los cortes fueron incubados en buffer de citrato 1X (#C9999, Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a 95 °C para desenmascarar los epítopos. Seguidamente, se realizó una incubación con 3% de H2O2 (p/v) para inhibir la actividad peroxidasa endógena. Tras ello, los cortes fueron incubados con 1% de BSA para bloquear lugares inespecíficos durante una hora a temperatura ambiente. Tras este tiempo, se realizó la incubación con el anticuerpo primario anti-bpMOK (pThr159+pTyr161, #SPC-1030, StressMarq) (Tabla 3) durante toda la noche. Tras la incubación, las muestras fueron lavadas con PBS e incubadas con el anticuerpo secundario biotinilado apropiado y seguidamente incubadas con el complejo avidina-biotina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Vectastain ABC-HRP Kit, Peroxidase-Rabbit IgG, Vector Laboratories, EE. UU.). Finalmente, los cortes fueron tratados con el sustrato cromógeno diaminobencidina-niquel (DAB-nickel, Vector Laboratories) y visualizadas bajo un microscopio Leica DM6000B con el que se tomaron imágenes a una magnificación 40X. 4.13. Inmunofluorescencia de cultivos organotípicos El protocolo de inmunofluorescencia de cultivos organotípicos fue similar al aplicado para inmunofluorescencia de cultivos celulares, pero con ligeros cambios. Tras los tiempos de estimulación pertinentes, los cultivos organotípicos se fijaron durante 3 horas a 4 °C, tiempo tras el cual se bloquearon con 5% de suero de burro y 0,5% (v/v) de Triton X-100. Tras ello, se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes (Tabla 3) diluidos en el mismo buffer de bloqueo. Tras este tiempo, se realizaron 3 lavados con PBS con 0,2% de Tween-20 y se incubaron con el anticuerpo secundario fluorescente apropiado (Tabla 4) diluido en PBS con 1% de suero de burro y 0,5% de Triton X-100 por 2 horas en oscuridad y a temperatura ambiente. Los núcleos celulares fueron teñidos con DAPI diluido en PBS durante 15 minutos a 73 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA temperatura ambiente, montados en portaobjetos como se ha descrito para las inmunofluorescencias de cultivos celulares y visualizados en un microscopio confocal como se ha referenciado. 4.14. Determinación de citoquinas mediante ELISA Los cultivos de microglía primaria o células SIM-A9 fueron estimulados como se describió anteriormente. Tras el tiempo estimado para cada citoquina o experimento, los sobrenadantes de cultivo recolectados se centrifugaron a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C, se recuperaron los sobrenadantes libres de células y se almacenaron a -20 °C hasta la determinación de citoquinas. Los niveles de IL-6 (#555240), TNFα (#555268) e IFNβ (#559603) se determinaron con el kit correspondiente de ELISA BD OptEIA™ para ratón (BD Biosciences). Para la cuantificación de IL-1α (#DY400-05) se utilizó el kit de DuoSet®. Todas las cuantificaciones de citoquinas se realizaron siguiendo los protocolos del fabricante y se utilizó un lector de placas Varioskan para realizar las mediciones. 4.15. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) Los clones de SIM-A9 control y MOK-KO fueron sembrados en placas de Petri de 100 mm de diámetro hasta alcanzar el 80% de confluencia para cada condición experimental. Tras realizar las estimulaciones experimentales, a los cultivos se le añadió formaldehído (Sigma-Aldrich) a una concentración final del 1% en buffer de crosslinking (Tabla 5) para fijar las uniones proteína-ADN durante 10 minutos a 37 °C. Tras este tiempo, se procedió a detener la reacción añadiendo glicina (Sigma-Aldrich) a una concentración final 125 mM durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró el sobrenadante y se realizaron 2 lavados con PBS frío. Tras retirar el PBS del último lavado, se añadieron nuevamente 2 mL de PBS frío suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (cOmplete Mini cocktail, #11836170001, Merck y 1 mM PMSF, #A0999, PanReac AppliChem), procediendo inmediatamente al rascado y traspaso a un tubo para su posterior centrifugación a 3.300 x g durante 5 minutos a 4 °C. Tras centrifugar, se procedió a lisar el contenido celular con 2,5 mL de buffer de lisis 1 (Tabla 5) (suplementado nuevamente con el cóctel de inhibidores de proteasas) e incubando esta suspensión durante 80 Materiales y métodos 4.24. Western blot Para los ensayos de Western blot se sembraron las células en placas de 24 pocillos a una densidad de 2×105 por pocillo con las líneas de SIM-A9 y se trataron 24 horas tras la siembra según las condiciones experimentales requeridas. Después de la incubación pertinente, las células se lavaron una vez con PBS frío y tras retirarlo se provocó la lisis celular sobre hielo con buffer RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl pH 7.4, 0,25% deoxicolato sódico, 10% glicerol, 0,1% dodecilsulfato sódico (SDS), 1% IGEPAL CA-630) complementado con inhibidores de proteasas (cOmplete Mini cocktail y PMSF) e inhibidores de fosfatasas (PhosSTOP, #04906845001, Roche). Con ayuda de la pipeta, aspirando y expulsando el volumen de buffer de lisis, se recogió del pocillo todo el volumen con el contenido celular lisado en un tubo y se incubó 5 minutos a 37 °C. Posteriormente, se incubó en hielo durante 20 minutos con agitación leve cada 5 minutos y después se centrifugaron las muestras a 12.000 x g por 5 minutos a 4 °C. Se recuperó el sobrenadante y se almacenó a -20 °C hasta su uso. La concentración de proteínas se determinó usando el kit Micro BCA™ Protein Assay (Thermo Fisher) y un lector de placas Varioskan. Conociendo la concentración de proteína total en la muestra, se tomaron volúmenes (20 µL aproximadamente) y concentraciones comparables de proteína (40-50 µg aproximadamente), conteniendo buffer de carga y 50 mM de ditiotreitol (DTT). Las muestras se sometieron a 95 °C durante 10 minutos para provocar la desnaturalización de las proteínas antes de ser cargadas a un gel de poliacrilamida del 12, 10 ó 7% con SDS (SDS-PAGE). Las muestras fueron sometidas a electroforesis a 180 V durante el tiempo necesario para que las proteínas de interés se resuelvan convenientemente con ayuda del marcador de peso molecular como referencia (#1610374, Bio-Rad). Tras este tiempo, todas las muestras fueron transferidas electroforéticamente a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) o nitrocelulosa mediante transferencia húmeda o semi-húmeda, respectivamente. Tras transferir las proteínas a la correspondiente membrana, se procedió a bloquear los sitios inespecíficos de unión para anticuerpo de las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación con ayuda de una solución de bloqueo formada por 5% de leche desnatada en polvo o 5% de BSA, en 81 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA solución salina tamponada con Tris (TBS) y 0,1% de Tween 20 (TBST). Tras el proceso de bloqueo, se realizaron 3 lavados de 10 minutos con TBST y seguidamente se incubaron las membranas con los respectivos anticuerpos primarios necesarios diluidos en TBST y 1,5% de BSA o TBST y 1% de leche desnatada (Tabla 3), durante 16 horas a 4 °C en agitación. Posteriormente, las membranas fueron lavadas de nuevo 3 veces con TBST por 10 minutos cada uno para después ser incubadas con el anticuerpo secundario correspondiente diluido en TBST y 1,5% de BSA o TBST y 1% de leche desnatada (Tabla 4) durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Nuevamente se realizaron 3 lavados en TBST y finalmente se detectó la unión de los anticuerpos con ayuda del kit de revelado por quimioluminiscencia (WBKLS0500, Merck) cuya señal fue capturada gracias al equipo ChemiDoc™ MP System (Bio-Rad). Las imágenes obtenidas fueron analizadas y cuantificadas por densitometría con el programa Image Lab™, y la expresión relativa de las muestras fue normalizada a su respectivo control de carga endógeno. Como control endógeno se utilizaron los anticuerpos contra los genes constitutivos GAPDH y α-tubulina (Tabla 3). 4.25. Aislamiento de microglía de ratones adultos Para el aislamiento de microglía a partir de médulas espinales de ratones adultos se tomaron animales con 14 semanas de edad, tanto WT como SOD1G93A, a los que se les extrajo la médula espinal tras ser anestesiados y posteriormente perfundidos. Éstas fueron fragmentadas en porciones de 2-3 mm y depositadas sobre HBSS frío. Posteriormente, las médulas fueron digeridas enzimáticamente con tripsina-EDTA 0,25% durante 10 minutos a 37 °C. Tras este tiempo, la reacción enzimática fue detenida añadiendo medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) suplementado con 10% de FBS. Finalmente, los restos medulares fueron disociados mecánicamente mediante pipeteo y pasando la solución generada por un filtro de 70 µm, que posteriormente se centrifugó a 250 x g durante 10 minutos a 4 °C para formar un pellet celular. Para eliminar restos de mielina, el pellet celular fue resuspendido con 2 mL Percoll isotónico al 70% (#1644, Sigma-Aldrich) al que posteriormente se le depositó con cuidado encima una capa de 3 mL Percoll al 35% en PBS y una capa final de 2 mL PBS. Este gradiente discontinuo fue centrifugado a 850 x g 82 Materiales y métodos durante 35 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron tomadas de la interfase y lavadas con PBS, centrifugadas y finalmente resuspendidas en RPMI 1640 suplementado con 2% de FBS para los ensayos de citometría. 4.26. Administración de C13 y monitorización de los animales SOD1G93A Cada ratón fue inyectado intraperitonealmente en días alternos con un total de 100 µL con 20 µg de C13 en PBS o 2% de DMSO como vehículo. El tratamiento tuvo una duración de 3 semanas, teniendo comienzo en la semana 11 de edad de los ratones. A los ratones se les realizaron pruebas en Rotarod y sus masas corporales fueron pesadas dos veces por semana. 4.27. Preparación de lisados celulares e inmunoprecipitación de proteínas fosforiladas Tras el tratamiento de células de microglía primaria con los agregados de TDP- 43 o Sham, como se ha descrito anteriormente, se recogieron y guardaron los sobrenadantes. Tras 2 lavados con PBS, las células se lisaron con tampón de lisis no desnaturalizante NP-40 (#FNN0021, Invitrogen) suplementado con el cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas ya citado, y se siguió el protocolo anterior para la generación de lisados celulares. Previamente a la inmunoprecipitación, se generaron los complejos beads-anticuerpo. Para ello se incubó Protein A Dynabeads (#10001D, Invitrogen) con 2 μg de anticuerpo anti-fosfo-Ser/Thr (#ab17464, Abcam) durante 1 hora a temperatura ambiente en rotación, produciéndose la generación de los complejos gracias al buffer de BS3 (bis(sulfosuccinimidil)suberato) (#21580, Thermo-Fisher). Tras este tiempo, se añadieron los complejos beads-anticuerpo a los lisados celulares y se incubaron bajo rotación durante 1 hora a temperatura ambiente para producir la inmunoprecipitación. Finalmente, tras lavar, la elución se llevó a cabo con una solución de glicina 50 mM (pH 2.8) y el pH del eluido resultante se equilibró con PBS para el posterior análisis por cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). 83 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA 4.28. LC-MS/MS e identificación de proteínas Los eluidos resultantes de la inmunoprecipitación, se sometieron a precipitación con ácido tricloroacético (TCA) y acetona cuyo resultado se resuspendió en una solución de RapiGest al 0,2% en bicarbonato amónico 50 mM. Se añadió DTT a una concentración final de 5 mM y se incubó durante 30 minutos a 60 °C. A continuación, se añadió cloroacetamida a una concentración final de 10 mM y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. Seguidamente se realizó una digestión con tripsina durante una noche a 37 °C en una proporción de 1:40 de tripsina:proteína. Al día siguiente, la tripsina se inactivó con ácido fórmico y se añadió acetonitrilo hasta una concentración final del 2%. El volumen de inyección fue de 10 μL por serie. Los análisis LC-MS/MS se realizaron en un sistema TOF (5600 Plus, Sciex) de triple cuadrupolo equipado con una fuente de nano electrospray acoplada a un nanoHPLC Eksigent. Se utilizó el programa Analyst TF 1.7 para el control del equipo y la adquisición y procesamiento de datos. En primer lugar, los péptidos se cargaron en una "columna trampa" (Acclaim PepMap 100 C18, 5 μm, 100 Å, 100 μm id × 20 mm, Thermo Fisher) de forma isocrática en una solución de ácido fórmico al 0,1% y 2% de acetonitrilo (v/v) a un flujo de 3 μL/min durante 10 minutos. A continuación, se eluyeron en una columna analítica de fase inversa (Acclaim PepMap 100 C18, 3 μm, 100 Å, 75 μm id × 150 mm, Thermo Fisher) acoplada a un "emisor PicoTip" (F360-20-10-N-20_C12, New Objective). Los péptidos se eluyeron con un gradiente lineal de 2-35% (v/v) de disolvente B durante 60 minutos a un flujo de 300 nL/minuto. Los disolventes A y B fueron ácido fórmico al 0,1% (v/v) y acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% (v/v), respectivamente. El voltaje de la fuente se seleccionó a 2600 V y la temperatura del calentador se mantuvo a 100 °C. El gas 1 fue seleccionado a 15 psi, el gas 2 a cero y el gas cortina a 25 psi. Para la identificación de proteínas, la adquisición se llevó a cabo con un método dependiente de datos (DDA) consistente en un TOF-MS con una ventana de barrido de 400-1250 m/z, tiempo de acumulación de 250 ms, seguido de 50 MS/MS con una ventana de barrido de 230-1500 m/z, tiempo de acumulación de 65 ms y un tiempo de ciclo total de 3,54 segundos. 84 Materiales y métodos Para la identificación de proteínas, se utilizó el programa ProteinPilot (v5.0.1, Sciex) con el método Paragon, con tripsina como enzima y yodoacetamida (IAA) como agente alquilante de cisteínas utilizando el proteoma de referencia del ratón (Mus musculus) descargado de uniprot.org (02/2021) en formato FASTA, fusionado con los contaminantes Sciex. Se realizó un análisis de falsos positivos y las proteínas con FDR (False Discovery Rate) inferior al 1%. 4.29. Secuenciación del transcriptoma completo por clonación al azar (RNA-Seq) Los análisis de RNA-Seq fueron realizados por la Unidad de Genómica de CABIMER (Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicinar Regenerativa). Se tomaron cultivos celulares de SIM-A9 silvestres y MOK-KO a los que se les retiró el sobrenadante y se les realizaron 2 lavados con PBS, tras los que se realizó la extracción de ARN mediante RNeasy Mini Kit (#74104, Qiagen) siguiendo las indicaciones del fabricante. Las muestras de ARN fueron cuantificadas mediante Qubit RNA HS Assay Kit y tanto el tamaño de las muestras como la integridad de las mismas fue analizado con el sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent). La calidad del ARN fue calificada de “excelente” y la integridad estimada para todas las muestras oscilaba entre 9,7 y 10,0. Tras la eliminación del ARN ribosómico, siguiendo las indicaciones del fabricante se generó la biblioteca de ADN complementario (ADNc) con especificidad de hebra (strand-specific) mediante Stranded TOTAL RNA prep Ligation junto a RIBO-ZERO PLUS kit (Illumina). Tras la amplificación mediante PCR, se realizaron todos los controles de calidad necesarios. La librería generada se normalizó usando Qubit y el control de calidad se realizó de nuevo con Bioanalyzer 2100. Todas las librerías fueron mezcladas en proporciones equimolares a una concentración de 1,2 nM aproximadamente. Esta mezcla de librerías fue desnaturalizada y seguidamente diluida previamente antes de ser sometida a secuenciación. La secuenciación de extremos pareados se realizó utilizando NovaSeq6000 SP y 2x50bp (Illumina), generando un recuento de lecturas brutas de >68 millones de lecturas por muestra. La calidad de la secuenciación, que fue evaluada con el software BaseSpace Hub (Illumina), fue de 89,8% >Q30 y >106 Gb de profundidad y considerada como alta. 85 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA Para el caso de los análisis de RNA-Seq mensajeros (mRNA-Seq) de cultivos de microglía primaria, el procedimiento fue similar al descrito, pero con los siguientes cambios. El ARN mensajero fue purificado mediante partículas recubiertas de Poly-dT y la librería generada con TruSeq Stranded mRNA kit (Illumina). Tras la amplificación de la librería por PCR y la realización de los controles de calidad necesarios, las librerías fueron mezcladas en proporciones equimolares y diluidas a unos 1,4 pM. La secuenciación por pares se realizó con NextSeq 500 Mid Output y 2x75pb (Illumina), generando un recuento de más de 24 millones de lecturas por muestra. La calidad de la secuenciación se evaluó con el software BaseSpace Onsite (v. 3.22.91.158, Illumina) resultando en una calidad alta (88% >Q30 y >24 Gb de profundidad). 4.30. Procesamiento de datos de RNA-Seq y mRNA-Seq Se generaron datos de secuenciación de RNA-Seq a partir de cuatro tratamientos celulares con 3 réplicas biológicas cada uno (12 muestras en total), utilizando el método de extremos emparejados de Illumina. Los archivos fastq de extremos emparejados totales se utilizaron para el análisis de RNA- Seq mediante el flujo de trabajo: FastQC-Trimmomatic-STARFeatureCounts- DESeq2. La versión 2.7.9a de STAR aligner fue usada para realizar el alineamiento y mapeo del genoma de referencia, la cual era la última versión de la base de datos de genoma de ratón publicado en ENSEMBL (Mus musculus). Para la extracción de todos los recuentos de las lecturas en bruto de cada una de las muestras se utilizó el paquete de R Rsubread (v. 2.0.1.) con el módulo Counts. Seguidamente se utilizaron dichos datos para realizar análisis de expresión diferencial mediante el paquete DESeq2 (v. 1.32.0.) en R, cuyo análisis de resultados fue analizado por Bencos Research Solutions Pvt. Ltd (Thane, Maharashtra 400615, IN). Los datos de secuenciación de mRNA-Seq se generaron a partir de dos tratamientos celulares con 3 réplicas biológicas cada uno (6 muestras en total), como se ha descrito con anterioridad, pero con los siguientes cambios: Los archivos Fastq se generaron con el protocolo FASTQ Toolkit (v1.0.0, Illumina) con filtrado, recorte y des-multiplexado de datos. El genoma de referencia fue Mus musculus (UCSC mm10). Se utilizó Cufflinks Assembly & DE, BaseSpace Workflow (v. 2.1.0, Illumina) para realizar el análisis de expresión diferencial. 86 Materiales y métodos 4.31. Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Ontología génica (GO), enriquecimiento de vías e Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Para cada grupo de comparación de la línea celular SIM-A9 (WT, WT+LPS, MOK-KO, MOK-KO+LPS), se realizaron análisis de ontología génica y enriquecimiento de vías utilizando el paquete de R PathfindR (v1.6.2). Todos los genes expresados diferencialmente (DEGs) obtenidos tras aplicar el filtro de valores Log2 Fold Change >2 ó <-2 junto con un valor p < 0,05 se utilizaron como entrada para realizar el enriquecimiento para las siguientes categorías: GO Proceso Biológico, GO Componente Celular, GO Función Molecular y KEGG Pathway con análisis realizados por Bencos Research Solutions Pvt. Ltd. (Thane, Maharashtra, India). Se aplicó el Ingenuity Pathway Analysis (IPA) a los DEGs definidos anteriormente. 4.32. Marcaje S4U y análisis de SLAM-Seq Tras el pretratamiento con 10 μg/mL de polimixina B, las células de la línea SIM-A9 en cultivo se incubaron con 10 µM de C13 (o DMSO) durante 1 hora. A continuación, se añadió una décima parte del volumen de medio sin suero que contenía TDP-43 o agregados señuelo (5 μg/mL final) y se incubó durante 2,5 horas. Tras ello, se añadió 4-tiouridina (S4U, Cayman Chemical, #16373) a una concentración final de 100 μM (concentración a la cual hemos observado que mantiene el 80% de la viabilidad de las células mediante ensayo MTT a las 2 horas) y se incubó durante otros 90 minutos en condiciones de oscuridad. Tras lavar con PBS, se extrajo el ARN total con easy-BLUE (iNtRON Biotechnology) y se protegió de la luz durante el procedimiento para evitar la unión de puentes disulfuro (S-S). Se utilizaron 5 μg de ARN para las modificaciones SLAM-seq. La yodoacetamida (Sigma I1149) fue conjugada con 4SU en un buffer fosfato 50 mM pH 8.0 en DMSO/H2O (1:1). La reacción se detuvo con DTT y el ARN se reprecipitó con etanol y NaOAc. Las librerías se prepararon utilizando Quantseq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). El análisis SLAM-Seq se realizó de forma similar a la descrita anteriormente por Neumann (T. Neumann et al., 2019). 87 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA 4.33. Muestras humanas Las muestras de la médula espinal humana se obtuvieron gracias a la donación voluntaria del Banco de Cerebros de la Región de Murcia (BCRM) por pacientes diagnosticados de ELA esporádica. Como control se usaron pacientes sin antecedentes de enfermedades neurológicas donadas nuevamente por el BCRM y de edades equivalentes. La recolección de muestras en el BCRM cumplió con los estándares éticos institucionales: IMIB- Arrixaca e ISCIII National Biobank Network Review Boards aprobaron el protocolo (anonimización/custodia/conservación en muestras de control y custodia/conservación de las muestras de pacientes) necesarias para la aprobación del ensayo clínico (NCT00855400, EudraCT 2006-00309612), así como la declaración de Helsinki de 1964 y sus modificaciones posteriores o normas éticas comparables. Antes de la extracción de la médula espinal, se realizó exploración in situ para detectar posibles malformaciones anatómicas. Se incluyeron segmentos en serie transversales de 1,0 cm en parafina, se cortaron a 7 μm y se montaron en 10 series paralelas para inmunohistoquímica. 4.34. Modelos animales Los ensayos con ratones transgénicos de TDP-43 se realizaron con ratones Prp-TDP43A315T, el cual es un modelo de ELA y DFT previamente descrito en la bibliografía (Chennampally et al., 2021). Como control se utilizaron ratones silvestres de edades similares. De estos ratones se obtuvieron cortes de médula espinal, tanto lumbar como sacra a los que se realizó inmunohistoquímica como se ha descrito. También se utilizó el modelo de ELA de ratón transgénico B6SJL-TgN (SOD1- G93A) 1Gur/J (Jackson Laboratory, EE. UU.) que porta el gen humano de SOD1 con la mutación puntual G93A. Estos animales fueron emparejados a ratones silvestre sin la mutación como control y fueron mantenidos en las instalaciones de la unidad de recursos biológicos de CABIMER, en ciclos de 12 horas de luz y oscuridad, en cajas de 4 a 8 animales con temperatura (22 °C) y humedad constante (60%), y con alimentación y agua ad libitum. Todos los animales usados en la experimentación fueron genotipados para asegurar la mutación en SOD1 y el número de copias. Al momento del destete, los ratones 88 Materiales y métodos fueron marcados en la oreja y separados en cajas según sexo. El tejido retirado en el marcaje fue utilizado para genotipar mediante RT-qPCR. Los animales fueron anestesiados intraperitonealmente con una mezcla de ketamina (100 mg/kg de la masa del ratón) y xilazina (10 mg/kg de la masa del ratón). Todos los experimentos se realizaron bajo los protocolos institucionales aprobados por CABIMER para el cuidado y uso de animales de laboratorio, con comités éticos nº 25-2010 y 02-2016 y cumplieron con la legislación nacional y de la Unión Europea (RD 53/2013 y Directiva UE 2010/63) para la protección de los animales utilizados con fines científicos. 4.35. Análisis de imágenes mediante inmunohistoquímica Para el análisis de las cortes de médula espinal de ratones TgTDP43 o control y de pacientes ELA-E o sanos tras la tinción por inmunohistoquímica como se ha descrito, se usó el programa ImageJ. Con este fin, se tomaron un promedio de 8 campos de cada médula espinal con una magnificación 40X a las que se les realizó una deconvolución que permitiese separar los marcajes siguiendo un vector hematoxilina-diaminobencidina (H-DAB). Se definió el umbral mínimo que discierne el ruido de fondo de la señal para todas las imágenes de cada experimento, seleccionando 5 regiones al azar de 4 campos diferentes sin células. Tras ello, se analizó el tamaño celular y la intensidad de señal de todas las células presentes en cada imagen analizada (al menos 50 células por condición experimental que presentasen un núcleo visible y diferenciado) expresando la intensidad de señal en unidades arbitrarias (AU) y en µm2 el área. En el caso de las imágenes correspondientes a pacientes de ELA, las poco frecuentes células de mayor tamaño correspondientes a un área mayor a 110 µm2 fueron excluidas del análisis. 4.36. Análisis de imágenes mediante inmunofluorescencia Las imágenes de inmunofluorescencia de cultivos organotípicos fueron analizadas con el software Metamorph Offline (versión 7.5.1.0, MDS Analytical Technologies). Para ello, se tomaron 10 imágenes RGB de cada condición experimental que se procesaron para separar las señales y convertirlas en canales diferentes y monocromáticos para posteriormente transformarlas 89 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA aritméticamente en imágenes de 16 bits. Finalmente, se analizó la intensidad de cada señal respecto al ruido de fondo de las imágenes. 4.37. Alineamiento de secuencias de ADN El alineamiento de secuencias para comprobar los cambios introducidos mediante ingeniería CRISPR/Cas9 en células SIM-A9 se realizó mediante la herramienta online Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/). 4.38. Análisis estadístico Los datos se presentan como medias ± S.E.M. de N experimentos independientes, a menos que se indique lo contrario. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey, o la prueba t-Student en el programa GraphPad Prism (v.8), con una o dos colas, según se indica en la leyenda de la figura correspondiente. Los valores de p iguales o inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Tabla 3. Lista de anticuerpos primarios usados. Anticuerpo Huésped Fabricante Referencia Aplicación Dilución Anti-fosfo-Ser/Thr Conejo Abcam Ab17464 Co-IP 1:100 Anti-MOK Conejo Abbexa Abx129598 WB, IHC 1:1000 Anti-bpMOK (pThr159+pTyr161) Conejo StressMarq Biosciences SPC-1030 IF, FC, IHC, WB 1:250 Anti-Brd4 Conejo Bethyl A301-985A100 WB, ChIP 1:1000 Anti-fosfo-Brd4 (Ser492) Conejo Millipore ABE1451 IF, WB 1:500 Anti-IgG no inmunógena Conejo Sigma-Aldrich I5006 ChIP, Co-IP 1:1000 Anti-GAPDH Ratón Millipore MAB-374 WB 1:2500 Anti-α-tubulina Ratón Sigma-Aldrich T6199 WB 1:6500 Anti-IL-18 Conejo Mybiosource MBS559603 WB 1:1000 Anti-p65 Conejo Cell Signaling 3034 WB 1:1000 Anti-fosfo-p65 Conejo Thermo Scientific PA5-17782 WB 1:1000 Anti-histona H2A.X Conejo Abcam Ab11175 ChIP 1:1000 Anti-FLAG, APC conjugado Ratón Abcam Ab72569 FC 1:40 Anti-IL-6, PE conjugado Rata BD Biosciences AB_395267 FC 1:40 96 Resultados Fig. 7. C13 promueve cambios en la transcripción temprana en células microgliales en el modelo de agregación de TDP-43 (parte I). A. Diagrama de Venn mostrando el total de genes diferencialmente expresados (DEG) resultante de SLAM-Seq de células SIM-A9 tras la estimulación con 5 µg/mL de agregados de TDP-43 o Sham durante 4 horas y previo tratamiento de una hora con 10 µM de C13 o su vehículo (DMSO). Los resultados mostrados son correspondientes a 3 experimentos independientes (N = 3). Para las comparaciones “C13+Sham vs. Sham” y “C13+TDP43 vs. C13+Sham” se tomó un valor de p ajustado menor de 0,05 (pAdj. <0,05), mientras que para las comparaciones “TDP43 vs. Sham” y “C13+TDP43 vs. TDP43” fue menor de 0,1 (pAdj. <0,1). Las listas de DEGs “Regulados por MOK” y “No regulados por MOK” fueron generadas con los genes que sufrían cambios bajo la exposición a 97 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA agregados de TDP-43. B, Inferior. Diagrama de Venn mostrando el número de DEGs identificados por Slam-Seq en cultivos de SIM-A9 estimulados como se ha descrito (N = 3). Para las condiciones mostradas, “C13+Sham vs. Sham” y “C13+TDP43 vs. TDP43” se tuvieron en cuenta genes con un p ajustado menor de 0,05 (pAdj. <0,05) o menor de 0,10 (pAdj. <0,10), respectivamente. B, Superior. Predicción de redes basadas en los dos sets de datos indicados mediante GeneMANIA, donde los rótulos azules corresponden a DEGs y las rojas a genes inferidos. De manera interesante, dicha inhibición mostró un significativo cambio en los genes diferencialmente expresados (DEGs), además de verse afectadas las redes de interacción estimadas bajo el contexto de estimulación generado por los agregados de TDP-43 frente a Sham (Fig. 7). Es llamativo que en torno al 45% de los DEGs revelados bajo la estimulación de los agregados de TDP-43 dejan de expresarse diferencialmente ante el tratamiento por C13, insinuando una participación de MOK en los procesos microgliales suscitados por los agregados de TDP-43 (Fig. 8). Esta regulación diferencial en la expresión génica entre ambas comparaciones indica un efecto de C13 y la consecuente inhibición de MOK en el perfil transcripcional de las células microgliales tras la exposición a dichos agregados de TDP-43. 98 Resultados Fig. 8. C13 promueve cambios en la transcripción temprana de células microgliales en el modelo de agregación de TDP-43 (parte II). A. Representación mediante mapa de calor (heatmap) de los perfiles de expresión relativos de los tratamientos “TDP43 vs. Sham” y “C13+TDP43 vs. TDP43”, tomando un p ajustado menor de 0,05 (pAdj. <0,05) en ambos casos. B. Gráfico de volcán (volcano plot) representando a los DEGs de las comparaciones “C13+Sham vs. Sham” y “C13+TDP43 vs. TDP43” (pAdj. <0,05). Para ambas figuras, las estimulaciones corresponden a las descritas en la figura anterior (N = 3). Tras ello, para detectar posibles proteínas cuyo estado de fosforilación pudiera estar regulado por la quinasa MOK en un contexto de ELA, se procedió a realizar una co-inmunoprecipitación de proteínas fosforiladas en residuos de serina/treonina utilizando un anticuerpo anti-fosfo-Ser/Thr. Para ello, se tomaron células de microglía primaria sometidas a estimulación con 5 µg/mL de agregados de TDP-43 durante 24 horas y pretratados o no con 10 µM del inhibidor de MOK o su vehículo, como se ha descrito anteriormente. Una vez se obtuvieron los eluidos inmunoprecipitados a partir de las células lisadas, las muestras fueron sometidas a cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), lo que permitió identificar una serie de proteínas, algunas de ellas exclusivamente en la ausencia del inhibidor de 99 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA MOK (Fig. 9A). Entre ellas, la apolipoproteína 7a (Apol7a), la proteína de choque térmico 1L de 70 kDa (HSPA1L), desmoplaquina (DSP) y Brd4, teniendo esta última un creciente interés e implicación en procesos inflamatorios en microglía revisados en apartados anteriores (DeMars et al., 2018; H. Wang et al., 2018; J. Wang et al., 2019). Para identificar y cerciorar la participación de Brd4 en el contexto de inmunomodulación y activación de microglía de nuestro modelo, nuevamente bajo la estimulación de dichos agregados de TDP-43 o Sham durante 16 horas, se realizó un pretratamiento durante 1 hora con 10 µM del inhibidor específico de la familia de proteínas BET, JQ1 (H. Wang et al., 2018) o DMSO (usado como vehículo), valorándose posteriormente mediante ELISA los niveles de TNFα extracelulares secretados por la microglía primaria (Fig. 9B). Con ello, se observa que efectivamente la liberación de citoquinas propiciada por los agregados de TDP-43 se ve indudablemente suprimida bajo la inhibición de Brd4 por JQ1 en células primarias de microglía, revelando la implicación del lector epigenético en este modelo de ELA. Recapitulando y teniendo en cuenta todos estos resultados, se observan indicios de que MOK juega un papel en la modulación de las respuestas inflamatorias microgliales inducidas por la agregación de TDP-43 y que, posiblemente, regula la fosforilación de ciertas proteínas, entre ellas Brd4, con un significativo rol en la respuesta inmune. 100 Resultados Fig. 9. Identificación de Brd4 como posible diana regulada por MOK a través de su estado de fosforilación. A. Proteínas identificadas y esquematización del análisis por LCMS/MS de los eluidos obtenidos mediante ensayos de co-inmunoprecipitación con anti-fosfo- Ser/Thr (Tabla 3) a partir de lisados de microglía primaria expuesta a 5 μg/mL de agregados de TDP-43, pretratados durante 1 hora con 10 μM de C13 o DMSO (vehículo). B. Determinación de los niveles de TNFα mediante ELISA a partir de microglía primaria expuesta a 5 μg/mL de agregados de TDP-43 (TDP43) o agregados Sham durante 16 horas, pretratados durante 1 hora con 10 μM de (+)-JQ1 o su vehículo. Los valores mostrados se normalizaron respecto al control Sham, siendo estas medias ± D.E. correspondiente a 2 experimentos independientes (N = 2). 5.2. Relevancia e implicación de MOK en la señalización de IFN tipo-I en microglía Dado que la exposición de células microgliales a los agregados de TDP-43 descritos en el contexto patológico de ELA ha mostrado activar a NLRP3 vía inflamasoma (Deora et al., 2020; Leal-Lasarte et al., 2017; Zhao et al., 2015), se procedió a valorar el impacto que puede tener la inhibición de MOK en dicha activación. Coherentemente, en microglía primaria los niveles de citoquinas dependientes del inflamasoma, como son IL-1β o IL-18, se ven significativamente reducidos frente al estímulo de agregados de TDP-43 cuando se realiza un pretratamiento con el inhibidor de MOK, observado por ELISA y por Western blot, respectivamente (Fig. 10). 101 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA Fig. 10. Los agregados de TDP-43 disparan la respuesta inflamatoria, que se ve atenuada por la aplicación de C13 en microglía primaria. Determinación por ELISA (N = 3) (A) y Western blot (N = 2) (B) de citoquinas liberadas al medio por células de microglía primaria estimuladas con 5 µg/mL de agregados de TDP-43 o Sham durante 16 horas, previo tratamiento por una hora con el inhibidor C13 o su vehículo (DMSO). Inmunomarcaje realizado con el anticuerpo anti-IL-18 (Tabla 3). Los datos mostrados para la figura A son medias ± S.E.M. y el test estadístico usado t-Student, no pareado y de una cola (**p < 0,01, NS = No significativo). La imagen B es representativa de 2 experimentos. Con la misma idea, se procedió a comprobar el posible papel de MOK en la modulación de la respuesta inflamatoria general en microglía frente a LPS, valorando la liberación de citoquinas en condiciones de tratamiento con C13. Para ello, se tomaron células de microglía primaria que fueron pretratadas con C13 o DMSO, como se ha descrito con anterioridad, y posteriormente estimuladas o no con 1 µg/mL de LPS a diferentes tiempos (4 horas en el caso de TNFα o 16 horas en el caso de IL-6 e IL-1β), y en cuyos sobrenadantes se determinaron las diferentes citoquinas mediante ELISA. Como resultado, todas las citoquinas sufrieron una reducción significativa en sus niveles extracelulares bajo la estimulación con LPS cuando se realiza un tratamiento previo con C13 (Fig. 11A). Paralelamente, se obtuvieron resultados similares en la línea celular SIM-A9 en cuanto a la secreción de TNFα frente al mismo estímulo (Fig. 11B), en las que además se observaron mediante Western blot los niveles de p65 fosforilado en la Ser536 (p-p65) en dichas condiciones experimentales, observándose un incremento de p-p65 que no se replica cuando sea realiza el pretratamiento con C13, indicando la alteración de la vía NF-κB (Fig. 11C). 102 Resultados Posteriormente, para valorar los cambios transcripcionales ocurridos al realizar el tratamiento con C13, en nuevamente un contexto inflamatorio promovido por LPS, se tomaron células primarias de microglía a las que se les sometió a dicho estímulo por 5 horas, en presencia o no de pretratamiento con C13. Tras la extracción de ARN, se procedió a realizar un RNA-Seq, el cual reveló 158 DEGs. Con dichos genes se utilizó un análisis basado en Ingenuity Pathway Analysis (IPA) que permitió revelar y predecir reguladores maestros de la expresión génica. Gracias a este análisis se revelaron interesantes genes reguladores aguas arriba de MOK que se encontraban inhibidos, como PML, IRF1/3/7 o STAT1, mientras que otros como CEBPB, NFE2L2 y STAT3, aparecen activados en bajo el tratamiento con el inhibidor de MOK (Fig. 11D). Fig. 11. La estimulación por LPS dispara la respuesta inmune, se ve atenuada por C13 y revela reguladores maestros mediante RNA-Seq en células microgliales. A. Determinación de las citoquinas proinflamatorias TNFα, IL-6 e IL-1β mediante ELISA (N = 4) en sobrenadantes de células de microglía primarias estimuladas o no con 1 µg/mL de LPS durante 5 (TNFα) ó 16 horas (IL-6 e IL-1β) previo tratamiento con C13 (10 µM) durante 1 hora. Se realizó un análisis de varianzas mediante el test de ANOVA unidireccional seguido por una prueba post-hoc de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y NS = no significativo. B. Determinación por ELISA de TNFα a partir de sobrenadantes de la línea celular SIM-A9 bajo las mismas condiciones experimentales que en el apartado (A) (N = 5). C. Cuantificación de bandas por densitometría (izquierda) e imagen representativa de Western blot (derecha) obtenidos de lisados celulares de SIM-A9, tratados o no con 1 µg/mL de LPS durante 5 horas, previo tratamiento con 10 µM de C13. Los datos representan medias ± S.E.M. normalizados respecto al control no tratado y el test estadístico usado t-Student, no pareado y de una cola (*p < 0,05, NS = No significativo) (N = 4). Inmunomarcaje realizado con los anticuerpos anti-p-p65 y anti-p65 (Tabla 3). D. Reguladores maestros de MOK con mejor puntuación de predicción mediante IPA a partir de 103 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA los 158 DEGs revelados mediante RNA-Seq respecto a las condiciones “C13 vs. Vehículo” (pAdj. <0,05) en microglía primaria estimulada con LPS por 5 horas (N = 3). Los p-valores de cada superposición se muestran entre paréntesis para cada regulador. Para indagar en el papel y participación de la quinasa MOK en la respuesta inflamatoria llevada a cabo por microglía, se generaron mediante ingeniería CRISPR/Cas9 células microgliales de la línea SIM-A9 knockout para MOK (MOK-KO) y su correspondiente versión silvestre control (WT). Tanto el clon WT como los 2 clones knockout para MOK (referidos aquí como MOK-KO o KO-A7) fueron tratados y analizados como se ha descrito anteriormente en líneas SIM-A9 silvestres o cultivos primarios de microglía, a excepción de la secuenciación. En primer lugar, se secuenciaron los 3 clones (WT, MOK-KO y KO-A7) para cotejar y confirmar los cambios realizados a nivel de secuencias genómicas respecto a las secuencias de MOK genómico publicadas en bases de datos (Fig. 12A). Los resultados muestran la adición de una citosina localizada en el exón 5 del gen (Cromosoma 12: 110.815.136) en homocigosis que rompe la pauta de lectura normal de la proteína. Paralelamente, se analizó la expresión de MOK mediante Western blot y RT-qPCR (Fig. 12B y C). Por Western blot se observó en células WT una banda para MOK de aproximadamente 65 kDa de tamaño aparente –coincidiendo con lo reportado para tejido nervioso murino (T. Chen et al., 2013)– que no se observa en las células knockout. 104 Resultados Fig. 12. Caracterización de los clones obtenidos por CRISPR/Cas9. A. Alineamiento múltiple mediante la herramienta online Multialin de las secuencias de los clones y del ADN genómico de MOK de referencia. Se observa la adición de una citosina en el cromosoma 12:110.815.136. Para la secuenciación se utilizaron los oligonucleótidos “MOK_Geno” (Tabla 6). Comprobación mediante Western blot (B, izquierda) y RT-qPCR (B, derecha y C) de la expresión de MOK en los modelos de SIM-A9 silvestre (WT) y dos clones knockout para MOK generados por CRISPR/Cas9, MOK-KO (B) y KO-A7 (C). El inmunomarcaje de Western blot se realizó con el anticuerpo anti-MOK, revelando una banda de tamaño aparente esperado de 65 kDa (Tabla 3). El test estadístico realizado fue t-test, no pareado y de dos colas (***p < 0,001). Paralelamente, se midió y determinó la expresión de citoquinas ante el estímulo por LPS y se observó un decremento de la secreción de citoquinas como IL-6, TNFα, IFNβ e IL-1α en los clones KO de MOK, valorado por RT-qPCR y ELISA (Fig. 13). 105 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA Fig. 13. Caracterización del fenotipo inflamatorio de los clones MOK knockout. A. Cuantificación por RT-qPCR de los niveles de los transcritos de diferentes citoquinas proinflamatorias (IL-6, IFNβ e IL-1α) de células de SIM-A9 WT y MOK-KO estimuladas o no con 1 µg/mL de LPS durante 5 horas (N ≥ 3). Los datos muestran los valores de nivel de cambio (fold-change) relativos a condiciones de estimulación “control” no mostradas. ##p < 0,01, ###p < 0,001, NS = no significativo, respecto a la condición no estimulada. Se realizó un análisis de varianzas mediante el test de ANOVA unidireccional seguido por una prueba post-hoc de Tukey de los datos. B. Determinación mediante ELISA de varias citoquinas proinflamatorias (IL- 6, TNFα, IFNβ e IL-1α) de sobrenadantes de células SIM-A9 WT y MOK-KO estimuladas o no con 1 µg/mL de LPS durante 5 ó 16 horas para IL-1α (N ≥ 3). Se realizó un análisis de varianzas mediante el test de ANOVA unidireccional seguido por una prueba post-hoc de Tukey para destacar diferencias significativas. C. Determinación por RT-qPCR del transcrito de TNFα (izquierda) y por ELISA de citoquinas TNFα e IFNβ (derecha) de cultivos celulares de SIM-A9 WT y KO-A7 estimulados o no con 1 µg/mL de LPS durante 5 horas (N = 4). Se realizó un análisis de varianzas mediante el test de ANOVA unidireccional seguido por una prueba post-hoc de Tukey para desvelar diferencias significativas entre condiciones. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y NS = no significativo. Los resultados para dichas citoquinas, que fueron similares a los descritos anteriormente usando el inhibidor C13 en microglía primaria y la línea SIM-A9 (Fig. 11A y B), fueron a su vez replicados mediante citometría de citoquinas intracelulares (Fig. 14A). Para rescatar el fenotipo inflamatorio ante estímulos 112 Resultados BMOK-KO LPS WT LPS MOK-KO Ctrl WT Ctrl 113 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA Fig. 17. El clon MOK-KO muestra un perfil transcriptómico alterado frente a estímulos inflamatorios (parte II). A. Análisis por GO del total de DEGs implicados en procesos biológicos por su enriquecimiento, obtenidos mediante RNA-Seq bajo las condiciones experimentales descritas en la figura anterior (Fig. 16). Los términos mostrados surgen de la comparación de las condiciones experimentales “WT LPS vs. MOK-KO LPS”. Entre paréntesis se indica el p-valor de los resultados principales con al menos 3 genes regulados positiva o negativamente. B. Heatmap mostrando el agrupamiento de 100 DEGs codificantes identificados en la comparación “WT LPS vs. MOK-KO LPS” (consistente en el 80% de los principales genes regulados negativamente y el 20% de los principales genes regulados positivamente, con el fin de mantener la proporcionalidad de los DEGs significativos revelados). C. Representación del fold-change (valores de cambio) de los 15 términos principales obtenidos por GO de procesos biológicos y vías KEGG (del inglés Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) mediante el paquete PathfindR de R Studio. Para dicha representación se tomaron todos los DEGs restantes tras aplicar una criba de los fold-change de Log2 de ±2 junto a un pAdj <0,05 en las comparaciones “WT Ctrl vs. MOK-KO Ctrl” o “WT LPS vs. MOKKO LPS”. Así, teniendo en cuenta los DEGs en la comparación de las condiciones de células WT o MOK-KO en presencia de LPS, se evidenció un enriquecimiento en términos relacionados con “respuesta antiviral”, “inmunidad innata” y “regulación positiva de la NF-κB” respecto a los controles (Fig. 18). Dicho análisis también resaltó rutas canónicas diferencialmente reguladas con implicación en “neuroinflamación”, “piroptosis” y “TREM1”. Fig. 18. El clon MOK-KO muestra un perfil transcriptómico alterado frente a estímulos inflamatorios (parte III). A. Principales términos enriquecidos de procesos biológicos por ontología génica en la comparación “WT Ctrl vs. WT LPS” de los 985 DEGs codificantes no compartidos entre ambos grupos (827 + 158). Entre paréntesis se muestra el fold-enrichment de cada término, basado en el p-valor y con al menos 3 genes regulados positiva o negativamente. B. 10 principales vías canónicas obtenidas mediante análisis IPA en base al pvalor, mostrado entre paréntesis, y que se encuentran diferencialmente reguladas en la comparación “WT-LPS vs. MOK-KO LPS” (pAdj < e-5). 114 Resultados En último lugar, gracias al análisis basado en IPA entre WT y MOK-KO en las condiciones con LPS, salen a la luz varios genes activados de interés en respuesta inmune como CITED2 y TRIM24, o inhibidos como IRF1, 3 y 7, STAT1 o BHLHE40, siendo algunos reguladores transcripcionales maestros comunes a los encontrados en los experimentos de microglía primaria descritos anteriormente con C13 (Fig. 11D y Fig. 19A). Consecuentemente, los niveles de expresión de IRF7, conocido y establecido regulador transcripcional de la vía de señalización IFN tipo-I, fueron determinados mediante RT-qPCR mostrando un coherente incremento de su expresión en células WT bajo el estímulo con LPS, a diferencia de lo observado en MOK-KO (Fig. 19B). Resumidamente, estos resultados en conjunto demuestran una implicación de MOK en la activación microglial y la respuesta inflamatoria modulada por las vías STAT1 y NF-κB, siendo un factor crítico en la inducción de IRF7/3 e IFN tipo-I y respuesta antiviral. Fig. 19. El clon MOK-KO muestra un perfil transcriptómico alterado frente a estímulos inflamatorios (parte IV). A. Diez principales reguladores de expresión maestros inferidos mediante análisis IPA a partir de los DEGs codificantes de la comparativa “WT vs. MOK-KO” tras la estimulación con LPS. Puntuaciones Z (Z-score) positivas indican activación y puntuaciones negativas reflejan inhibición. Los resultados provienen de todos los genes que se encontraron regulados diferencialmente en el análisis RNA-Seq DESeq2 en cualquier comparación con pAdj <e-5. El p-valor de superposición se encuentra indicado entre paréntesis. B. Determinación por RT-qPCR de la expresión del transcrito de IRF7 en células SIM-A9 WT y MOK-KO estimuladas o no con 1 µg/mL de LPS durante 5 horas. Los datos representan el foldchange respecto a la normalización con la condición WT Control (N = 4). Se realizó un análisis de varianzas mediante el test de ANOVA unidireccional seguido por una prueba post-hoc de Tukey. Los datos mostrados consisten en medias ± S.E.M. (**p < 0,01, NS = no significativo). 115 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA 5.3. Modulación por MOK de la respuesta inmune mediante la regulación de los niveles de pBrd4Ser492 y su unión a cromatina en microglía En base a los resultados obtenidos en la inmunoprecipitación de proteínas fosforiladas en residuos de Ser/Thr seguido de LC-MS/MS (Fig. 9A), MOK emerge como posible regulador, bien de forma directa o indirectamente, del estado de fosforilación de varias proteínas. Entre ellas, destaca un miembro de la familia de proteínas BET revisado anteriormente, Brd4, al cual se le ha atribuido recientemente gran importancia en mecanismos inflamatorios y en enfermedades neurodegenerativas (Bao et al., 2017; J. Wang et al., 2019; N. Wang et al., 2021). Para verificar si este lector epigenético está involucrado en nuestro modelo de microglía primaria y línea celular microglial como modulador de la respuesta inflamatoria inducida por LPS, se tomaron cultivos primarios de microglía o células SIM-A9 y se estimularon por 5 horas con LPS tras el previo tratamiento con 10 µM del inhibidor (+)-JQ1 o su vehículo (DMSO) durante 1 hora. Tras los tiempos pertinentes, se valoraron mediante ELISA los distintos niveles de citoquinas proinflamatorias de los sobrenadantes, en concreto IL-6 y TNFα, que mostraron una reducción drástica de los mediadores de la inflamación analizados bajo la presencia del inhibidor (+)-JQ1, confirmando la implicación de Brd4 en la respuesta inflamatoria en nuestro modelo, además de la eficacia de su inhibidor (Fig. 20). Fig. 20. Confirmación de la modulación de Brd4 en la respuesta inflamatoria observada en microglía. Cuantificación mediante ELISA de sobrenadantes provenientes de microglía primaria (A) o células microgliales SIM-A9 (B) estimulados o no con 1 µg/mL de LPS durante 5 horas previo tratamiento durante una hora con 10 µM del inhibidor de Brd4, (+)-JQ1, o su vehículo, DMSO (N = 3). Para destacar diferencias significativas se realizó un test de ANOVA unidireccional seguido por una prueba post-hoc de Tukey (**p < 0,01, ***p < 0,001). 116 Resultados Seguidamente, para corroborar y validar los datos por co-inmunoprecipitación de proteínas fosforiladas en residuos de Ser/Thr y del análisis por LC-MS/MS bajo el efecto o no de C13, se tomaron células de la línea SIM-A9 sometidas a LPS durante 5 horas previo tratamiento con el inhibidor C13, como se ha descrito anteriormente. Mediante Western blot, se observó una reducción de la forma fosforilada del lector epigenético, pBrd4Ser492, en condiciones de tratamiento con C13 (Fig. 21A). Con la misma idea, se realizaron inmunofluorescencias contra pBrd4Ser492 en cultivos de microglía primaria bajo la influencia o no de LPS durante 4 horas, e igual que anteriormente, la influencia del pretratamiento con C13 por 1 hora (Fig. 21B y C). Tras realizar la cuantificación de las imágenes, se observó un aumento en los niveles nucleares de Brd4 fosforilado en las células WT estimuladas con LPS, consecuente con una regulación positiva de la inflamación. Por el contrario, la administración de C13 provocaba una reducción de dichos niveles de pBrd4Ser492, mostrando una alteración de la actividad de este lector epigenético. Fig. 21. Los niveles de pBrd4Ser492 se ven alterados por la influencia de C13 en un contexto inflamatorio. A. Western blot de lisados celulares de cultivos de SIM-A9 estimulados con 1 µg/mL de LPS por 5 horas previo tratamiento con 10 µM de C13 o su vehículo (DMSO), 117 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA como se ha descrito anteriormente. Para el inmunomarcaje se utilizaron los anticuerpos anti-α- tubulina y anti-fosfo-Brd4 (Ser492) (Tabla 3). La imagen es representativa de 2 experimentos independientes. B y C. Imágenes obtenidas por inmunofluorescencia confocal (C) a partir de cultivos primarios de microglía estimulados durante 4 horas con 1 µg/mL de LPS previo tratamiento durante 1 hora con 10 µM de C13 o su vehículo (DMSO), y la correspondiente cuantificación de la intensidad de la señal obtenida de las imágenes (B). Para el marcaje fluorescente se utilizó el anticuerpo primario anti-fosfo-Brd4 (Ser492) (verde) y DAPI (azul) para la contra tinción de los núcleos. Los datos e imágenes mostrados corresponden a un experimento, donde se analizaron 20 imágenes por condición, y es representativo de dos experimentos independientes. Para destacar diferencias significativas se realizó una t-Student, no pareada y de una cola (*p < 0,05 y ***p < 0,001). La escala de tamaño mostrada corresponde a 100 µm. Coherentemente, estos resultados van en la misma línea que los observados en los modelos de SIM-A9 MOK-KO y WT, donde mediante Western blot e inmunofluorescencia y bajo el estímulo de LPS se refleja la reducción de pBrd4Ser492 respecto a Brd4 total (Fig. 22A y B). Similarmente, los niveles de pBrd4Ser492 aumentan de nuevo en los núcleos de las células WT estimuladas con LPS, observándose una reducción en los niveles en MOK-KO bajo la misma estimulación (Fig. 22C y D). Todos estos resultados en conjunto destacan con consistente firmeza el papel regulador que la quinasa MOK tiene sobre Brd4 a nivel nuclear y su activación bajo un contexto inflamatorio. Fig. 22. Los niveles de pBrd4Ser492 se ven alterados por la carencia de MOK en un contexto inflamatorio. A y B. Cuantificaciones (A) e imagen representativa del Western blot 118 Resultados (B) de lisados provenientes de cultivos celulares de la línea SIM-A9 WT y MOK-KO, estimulados o no con 1 µg/mL de LPS durante 1 hora. Inmunomarcaje realizado con anti-fosfo- Brd4 (Ser492) y anti-Brd4, normalizados respecto a la señal de Brd4 o α-tubulina, respectivamente. Los datos mostrados corresponden a 3 experimentos independientes, cuyas diferencias fueron resaltadas mediante t-Student, no pareada y de una cola (*p < 0,05 y NS = no significativo). C y D. Cuantificación (C) e imágenes representativas obtenidas mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal (D) a partir de cultivos de SIM-A9 WT y MOK-KO, estimulados o no con 1 µg/mL de LPS durante 1 hora. En verde, se muestra la señal de pBrd4Ser492 (anti-fosfo-Brd4 (Ser492) (Tabla 3)) y en azul DAPI para la contra tinción de los núcleos. Las imágenes son representativas de 3 experimentos independientes (N = 3). Para el análisis de los datos se utilizó t-Student, no pareada y de dos colas (*p < 0,05 y NS = no significativo). La escala de tamaño mostrada corresponde a 10 µm. La intensidad de color de la primera fila de imágenes ha sido incrementada un 50% para mejorar su visualización. En consecuencia y en vista de los resultados obtenidos, para detectar la posible modulación de MOK sobre Brd4 en su función regulatoria mediante la unión a promotores de genes de citoquinas de interés, que en anteriores resultados han mostrado estar reguladas por MOK en la respuesta de microglía a LPS (IL-6, TNF, IFNβ) (Fig. 13), se realizó inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR cuantitativa (ChIP-qPCR). Para ello, cultivos SIM- A9 WT y MOK-KO fueron estimulados o no con LPS durante 1 hora, tiempo suficiente para que se produzca la unión del lector epigenético a las regiones promotoras de las citoquinas (Fig. 23). Como se esperaba, Brd4 reflejó un enriquecimiento en las células SIM-A9 WT en las regiones promotoras de los genes il6, tnfα e ifnβ tras el estímulo con LPS. Sin embargo, este efecto se vio reducido cuando se estudió en el clon MOK-KO, siendo el incremento provocado por LPS no significativo, e incluso igualando el enriquecimiento de la región promotora a las condiciones control, como en los casos de il6 e ifnβ. Fig. 23. Valoración de la unión de Brd4 a las regiones promotoras de las citoquinas proinflamatorias IL-6, IFNβ y TNFα mediante ChIP-qPCR. Los datos mostrados corresponden al porcentaje de enriquecimiento con los anticuerpos anti-Brd4 y anti-IgG (Tabla 119 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA 3) a las correspondientes regiones promotoras respecto a la condición no inmunoprecipitada (input). Las muestras provienen de cromatina aislada de células SIM-A9 WT o MOK-KO tratadas o no con 1 µg/mL de LPS durante 1 hora. Los datos mostrados corresponden a medias ± S.E.M. de 4 experimentos independientes (N = 4) (*p < 0,05, **p < 0,01, NS = no significativo). Para obtener diferencias significativas entre los grupos se utilizó t-Student, no pareada y de una cola. Adicionalmente, la aplicación del inhibidor de Brd4 y su control (-)-JQ1 –un enantiómero del inhibidor que es usado como control inactivo ya que no exhibe interacciones significativas con los miembros de la familia BET–, provocó una esperada reducción significativa de la unión de Brd4 a las regiones promotoras de las citoquinas estudiadas en células WT, efecto similar al observado para las células MOK-KO (Fig. 24A). Esto demuestra la especificidad de la unión de Brd4 medida en los ensayos. En consonancia, la valoración de los sobrenadantes mediante ELISA refleja una reducción en la liberación de estas citoquinas proinflamatorias (Fig. 24B). Estos resultados muestran de manera consistente un papel de la quinasa MOK en la regulación positiva de genes proinflamatorios y de IFN tipo-I inducida por LPS mediante la modulación de Brd4. Además, en conjunto, los resultados parecen indicar la existencia de terceros mecanismos moduladores independientes de la unión de Brd4 a las regiones promotoras, pero que sí estarían mediados por la quinasa MOK y contribuyen en la regulación positiva de ciertas citoquinas en las respuestas inflamatorias protagonizadas por microglía. 120 Resultados Fig. 24. Efecto de (+)-JQ1 en la unión de Brd4 a las regiones promotoras de citoquinas proinflamatorias. A. Resultados de ChIP-qPCR de cultivos celulares SIM-A9 WT tratados con 1 µg/mL de LPS durante 1 hora previo tratamiento por 1 hora con 10 µM del inhibidor o su control ((+)-JQ1 y (-)-JQ1). Los datos representan valores relativos en porcentaje respecto a la condición no inmunoprecipitada (input) de la unión de Brd4 a las regiones promotoras de las citoquinas citadas. Los datos mostrados corresponden al porcentaje de enriquecimiento con los anticuerpos anti-Brd4 y anti-IgG (Tabla 3). B. Determinación mediante ELISA de citoquinas de sobrenadantes de cultivos celulares de SIM-A9 WT o MOK-KO tratadas con 1 µg/mL de LPS durante 4 horas previo tratamiento durante 1 hora con el inhibidor de Brd4. En ambos casos, los resultados corresponden a medias ± S.E.M. de 3 experimentos independientes (N = 3) (*p < 0,05, ***p < 0,001, NS = no significativo). Para extraer diferencias significativas entre las condiciones se utilizó t-Student, no pareada y de una cola (A) o ANOVA unidireccional seguido por una prueba post-hoc de Tukey (B). 5.4. El eje regulatorio bpMOK-pBrd4Ser492 está alterado en animales SOD1G93A Dados los resultados obtenidos que muestran una alteración de Brd4 modulada por MOK, se procedió a estudiar el estado del eje bpMOK-pBrd4Ser492 en respuesta a LPS en el contexto de la ELA, para lo que se utilizó el modelo preclínico de SOD1G93A, extensamente estudiado y reconocido (Deora et al., 2020; Gerbino et al., 2020; Gois et al., 2020; Krasemann et al., 2017), caracterizado además por presentar alteraciones a nivel de TDP-43 (Cai et al., 2015; Jeon et al., 2019; Pasetto et al., 2017; Shan et al., 2009). Con este modelo se generaron cultivos organotípicos de médulas espinales de ratones 121 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA pre-sintomáticos, de unas 5 semanas de edad, tanto en animales SOD1G93A como silvestres, en los cuales se estudiaron posibles cambios en los niveles de la forma activa de la quinasa, MOK bifosforilada (bpMOK) en los residuos Treonina159 y Tirosina161, frente a estímulos inflamatorios por LPS durante 16 horas. Mediante inmunofluorescencia y captura de imágenes por microscopía confocal, se observó que los niveles de bpMOK nucleares en animales WT no sufrían cambios significativos ante estímulos por LPS. Sin embargo, los animales transgénicos SOD1G93A mostraban un significativo incremento de los niveles de bpMOK cuando los cultivos organotípicos se sometían al mismo estimulo inflamatorio (Fig. 25A). Fig. 25. El eje bpMOK-pBrd4Ser492 está alterado en ratones SOD1G93A. A y B. Conjunto de imágenes representativas obtenidas mediante microscopía confocal (derecha) del cultivo organotípico de ratones silvestres o transgénicos de 5 semanas de edad, estimulados o no con 1 μg/mL LPS durante 16 horas. Para el inmunomarcaje se utilizó anti-bpMOK (A) o anti-fosfo- Brd4 (Ser492) (B) (Tabla 3), y DAPI para la contra tinción de los núcleos. La cuantificación de la señal nuclear (izquierda) de cada proteína fue normalizada respecto al control sin estimular de cada experimento (N = 3). El test estadístico usado fue, para ambos experimentos, t- Student, no pareada y de dos colas (*p < 0,05, NS = no significativo). La escala marcada corresponde a un tamaño de 25 µm. 128 Resultados 129 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA DISCUSIÓN 131 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA 6. Discusión Aunque desde su descubrimiento se ha asociado a diferentes trastornos o enfermedades (T. Chen et al., 2013; Huang et al., 2019), no ha sido hasta años recientes que la proteína quinasa MOK se ha relacionado e identificado en un contexto neuropatológico de ELA y de activación microglial (Leal-Lasarte et al., 2017), atribuyéndole una función en la inmunidad o en el SNC. En este sentido, cada vez más estudios destacan el papel que la superfamilia de las MAPKs (a la cual pertenece MOK) y las vías en las que participan integrando señales de diferente naturaleza como diana interesante en el estudio en ELA (Gomes, 2024; Sahana & Zhang, 2021). Con todo ello, la presente investigación amplía el conocimiento acerca del alcance e implicación que tiene esta Ser/Thr quinasa; descubriendo a MOK tanto como mediador en la respuesta inflamatoria en microglía, como su papel modulador de Brd4, además de la alteración del eje de esta quinasa en el contexto de la ELA o su uso como prometedora diana terapéutica. Hasta la fecha, no se han descrito dianas de MOK o reguladores aguas arriba, ni tampoco vías de señalización con implicación directa de la quinasa, más allá de su posible papel como modulador negativo del crecimiento ciliar mediante la vía mTOR en células renales epiteliales y de la apoptosis mediante la vía de señalización de caspasas en mejillones (An et al., 2022; Broekhuis et al., 2014). En sintonía con lo vislumbrado previamente por nuestro grupo (Leal-Lasarte et al., 2017), los análisis por SLAM-Seq del perfil transcripcional temprano de células microgliales frente a la exposición a agregados de TDP-43 y la inhibición o no de MOK, revelan el significativo papel de esta quinasa en este modelo. Los numerosos genes movilizados y diferencialmente expresados, tanto positiva como negativamente, en dicho contexto de ELA bajo la inhibición de MOK, invita a especular con un papel relevante de esta proteína (Fig. 7 y Fig. 8). Entre estos DEGs identificados, podemos encontrar genes interesantes con papel en la regulación inmune, cuyo perfil transcriptómico en células de microglía está alterado. Por ejemplo: Naip2, gen que ha sido descrito formando parte del complejo del inflamasoma, por tener un rol en la respuesta inflamatoria frente a bacterias o la piroptosis (Kofoed et al., 2012); otro miembro de la familia de las MAP quinasas, como MAPK14, que se ha descrito como 132 Discusión activador de numerosas citoquinas proinflamatorias (Lo et al., 2014); además de una Ser/Thr fosfatasa como es PPP5c, con funciones en diversas vías de señalización de respuesta a estrés además de encontrarse alterada en Alzheimer (Amable et al., 2011; F. Liu et al., 2005). En nuestro modelo de agregación de TDP-43 en microglía, observamos que la inhibición de MOK por C13 (Garske et al., 2011) provoca la reducción de la producción de diversas citoquinas proinflamatorias en células microgliales primarias que han sido identificadas en pacientes de ELA (K. Kaur et al., 2022; Wei et al., 2023; Yamamuro-Tanabe et al., 2023) (Fig. 10). Similarmente, la respuesta inflamatoria inducida por LPS, incluida la activación de la vía NF-kB (Buss et al., 2012), también se ve coartada bajo la inhibición de la citada quinasa, indicando un claro papel mediador de MOK en la respuesta de este tipo celular (Fig. 11). En vista del aparente papel e implicación de MOK en la respuesta inflamatoria de microglía y de las diferentes vías de señalización observado en los resultados, se generaron clones knockout de MOK (MOK-KO) sobre la línea microglial SIM-A9 (Fig. 12). Coherentemente, se obtuvieron resultados similares en las líneas MOK-KO en comparación a lo observado usando el inhibidor de la quinasa, tanto en los niveles de citoquinas proinflamatorias liberadas como en sus transcritos (Fig. 13). Asimismo, este efecto en la reducción de citoquinas proinflamatorias se observó además a nivel intracelular mediante citometría de flujo; fenotipo que se vio revertido al sobreexpresar la versión silvestre de la quinasa en células MOK-KO. Sin embargo, este efecto no se observó en las condiciones donde la sobreexpresión de MOK recombinante se llevó a cabo con una versión sin actividad quinasa de MOK (MOK-KD), indicando que la modulación que realiza MOK sobre el sistema inmune es, en gran medida, debido a su actividad fosforiladora (Fig. 14). De igual manera, los análisis transcriptómicos por RNA-Seq predijeron interesantes reguladores maestros aguas arriba de MOK. Consecuentemente, la ausencia de la quinasa, tanto en los clones knockout para MOK como en el modelo con C13, ven reducidos los niveles de conocidos componentes reguladores de la respuesta inmune innata y adaptativa como son STAT1, 133 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA IRF3, IRF7 o IRF1 (Fig. 11D y Fig. 19). La regulación negativa de estos elementos precede a una consecuente disminución de la respuesta inflamatoria y de IFN de tipo-I/antiviral, coherente con la menor liberación de mediadores proinflamatorios observada en nuestros experimentos (Hu et al., 2022; Ji et al., 2023; Mogensen, 2019; X. Yang et al., 2022). En la misma línea de ideas, el tratamiento con C13 en microglía primaria revela la activación de ciertos factores con descrita actividad antiinflamatoria como STAT3, NFE2L2 o CEBPB. Aunque no coincidentes en el RNA-Seq de los knockout, se ha reportado a STAT3 ejerciendo un papel antiinflamatorio (Ji et al., 2023), además de observarse en mecanismos con el mismo fin en conjunto a C/EBPβ (Muromoto et al., 2022). La primera, tras estimular la transcripción de la segunda mediante la unión a su región promotora, promueve la transición de los macrófagos al fenotipo antiinflamatorio clásicamente llamado M2 (Chang et al., 2023), además de estimular la actuación del inhibidor NFKBIZ (IκB-ζ), regulando negativamente la vía NF-κB (Muromoto et al., 2022). Adicionalmente, NFE2L2 (también conocido como NRF2) es un actor ampliamente conocido y descrito en señales antiinflamatorias con implicación en trastornos neurodegenerativos, como por ejemplo ocurre en el eje regulatorio KEAP1- NRF2 (Uruno & Yamamoto, 2023), siendo este factor de transcripción un regulador negativo de citoquinas proinflamatorias como IL-6 o TNFα (Cuadrado, 2022). Por otro lado, observando los resultados por RNA-Seq de los clones knockout para MOK (Fig. 19), la ausencia de la quinasa predice la activación de factores como CITED2, una interesante molécula con capacidad de suprimir el fenotipo polarizado proinflamatorio de macrófagos, además de reprimir un gran conjunto de genes que promueven la inflamación, como HF1α o STAT5 (Kim et al., 2020; Zafar et al., 2023). En la misma línea, TRIM24 es un gen entre cuyas funciones se encuentra también la polarización de los macrófagos hacia un fenotipo M2 mediante STAT6 y mediadores como IL-10 o IFNβ1 (Hui et al., 2023; Yu et al., 2019). Por el contrario, el factor de transcripción BHLHE40 aparece inhibido en el modelo MOK-KO, el cual ha sido reportado consistentemente como un agente activador de la respuesta inmune en linfocitos y por actuar directamente sobre genes proinflamatorios (Cook et al., 2020; Zafar et al., 2021), además de 134 Discusión tener un emergente papel como actor en enfermedades autoinmunes y con implicación en el SNC (M. J. Cho et al., 2023; C. C. Lin et al., 2016). Cabe destacar que BHLHE40 ha sido además recientemente descrito tomando un papel regulador en los fenotipos de microglía DAM o MGnD (Krasemann et al., 2017). En la misma línea, NONO actúa como cofactor junto a PRDM1 en la regulación de IL-6 en células dendríticas derivadas de monocitos (K. Lee et al., 2020). Además, poniendo atención en el total de DEGs revelados en la comparativa entre la línea MOK-KO y silvestre mediante RNA-Seq, y analizando mediante agrupación los procesos biológicos por ontología génica (GO), destaca el enriquecimiento en mecanismos inflamatorios, como la activación de la microglía, la regulación negativa de la respuesta inmune innata, la regulación de la producción de IFN tanto α como β, la vía NF-κB y otros mediadores de la inflamación o la respuesta antiviral. Asimismo, mediante predicción por IPA destacan vías canónicas entre MOK-KO y WT con un papel en la piroptosis o en la señalización de la neuroinflamación. También es digno de mención la aparición de la vía de señalización mediada por TREM1, cuya inhibición reduce la polarización hacia el fenotipo M1 y el reclutamiento de neutrófilos, además de regularse negativamente la activación de vías inflamatorias mediante NLRP3 y NF-κB (Li et al., 2019; Natale et al., 2019; Xu et al., 2021). Curiosamente, la eliminación de TREM1 reduce la capacidad de responder a estímulos mediante TLR4 en macrófagos, a la vez que aumenta la producción de SOD1 (Natale et al., 2019). Consecuentemente, se han reportado niveles altos de TREM1 en médulas espinales dañadas de ratón (Li et al., 2019). Con ello, de interés es la cada vez mayor implicación de los miembros de la familia TREM, principalmente TREM1/2, en enfermedades neurodegenerativas e inflamatorias, ya que su papel en la inmunidad innata y la regulación de la transición hacia el fenotipo DAM de la microglía ofrecen nuevos mecanismos con alto interés terapéutico (Pelham & Agrawal, 2014; Xie et al., 2022) (Fig. 17 y Fig. 18). Resumidamente, estos resultados ponen de manifiesto que MOK participa significativamente en la neuroinflamación, estando involucrada en la regulación de la inmunidad innata mediante distintas vías, siendo la respuesta inflamatoria 135 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA y la de IFN tipo-I/antiviral sus dos mecanismos principales. Esta respuesta de la microglía mediada por MOK es además potencialmente neurotóxica, ya que cuando dicho fenómeno es promovido por la exposición de medios condicionados por microglía estimulada con LPS en motoneuronas primarias se ve mitigado en ausencia de la quinasa (Fig. 15). Mediante este trabajo, una vez identificado y definido la influencia que posee la quinasa MOK en la modulación del sistema inmune y la represión que conlleva su ausencia o la inhibición de la actividad fosforiladora, se estudiaron posibles dianas moleculares aguas abajo de MOK. De esta forma, se logró identificar en nuestro modelo celular de microglía frente a agregados de TDP-43, mediante co-inmunoprecipitación seguida de LC-MS/MS, varias proteínas candidatas a poseer un estado de fosforilación modulado por MOK en un contexto de ELA (Fig. 9). Así, por ejemplo, se identificaron proteínas como Apol7a, perteneciente a la familia de apolipoproteínas L cuya expresión parece estar modulada por citoquinas inflamatorias como IFNβ (Uzureau et al., 2016); desmoplaquina, proteína perteneciente al citoesqueleto con relevancia en numerosas cardiopatías y enfermedades pulmonares (He et al., 2023) y HSPA1L, cuyos polimorfismos han sido relacionados con numerosas enfermedades (Huusko et al., 2018; Takahashi et al., 2017). Sin embargo, es el lector epigenético Brd4 el que despertó mayor interés pues, como se ha desarrollado con anterioridad, ha sido involucrado en numerosos mecanismos celulares entre los que destacan especialmente el cáncer, la regulación del ciclo celular, la apoptosis o la modulación del sistema inmune (Bao et al., 2017; Sun et al., 2023). A pesar de su relevancia y de los numerosos estudios publicados acerca de los genes dependientes de Brd4 y que ésta misma proteína modula, los agentes corrientes arriba que regulan su propia actividad han sido poco estudiados hasta el momento. Como se referenció anteriormente, se ha demostrado que la caseína quinasa II (CK2) regula la actividad del lector epigenético mediante la fosforilación del residuo Ser492, pero existe escasa información acerca de otros posibles moduladores (Wu, 2013). Este hecho enaltece el interés en encontrar nuevos moduladores de Brd4 que permitan obtener más eslabones en la cadena regulatoria de la 136 Discusión respuesta inflamatoria y que tengan interés desde un punto de vista clínico en enfermedades neuroinflamatorias. De esta forma, los puntos en común que relacionan a Brd4 con la modulación del sistema inmune, nuestros resultados que muestran el papel de MOK en dicha regulación, y sumado a los resultados obtenidos por co-IP y LC-MS/MS, todo invita a elucubrar que uno de los mecanismos por los que la quinasa MOK regula la respuesta inmune sea a través del estado de fosforilación y activación de la bromo-proteína, bien directamente o mediante la modulación de terceros actores como CK2. Inequívocamente, nuestros resultados indican una relación directa en un contexto inflamatorio inducido por LPS como se observa a nivel nuclear, en la que la ausencia de la actividad de MOK en nuestros modelos, bien dado por el efecto de C13 o en los clones knockout, conlleva una reducción de la presencia de la forma fosforilada de Brd4. Esta relación explica la reducción observada en la liberación de citoquinas proinflamatorias determinada en nuestro modelo microglial frente a la estimulación con LPS (Fig. 11A y B, y Fig. 13), hecho que se corrobora con el decremento de la unión de Brd4 a las regiones promotoras de dichos mediadores de la inflamación (Fig. 23 y Fig. 24). Este enclave modulatorio podría ser una interesante diana terapéutica para la reducción de la toxicidad provocada por la neuroinflamación mediada por Brd4, como ya proponen algunos autores para distintas enfermedades con afección del SNC y componentes inflamatorios (Rudman et al., 2018; Y. F. Tan et al., 2020; J. Wang et al., 2019; Y. Zhou et al., 2019; Zhu et al., 2023). Curiosamente, en presencia de LPS el sustancial decremento de la unión de Brd4 a las regiones promotoras de genes proinflamatorios conducido por la ausencia de MOK, como es el caso para il6 e ifnβ, no es trasladable con la misma magnitud al caso de tnfα, donde es posible explicar esta menor respuesta mediante otros mecanismos que no impliquen la unión directa de Brd4 a dichas regiones. A pesar de ello, las vías activadas serían también dependientes de Brd4 y MOK, dado los resultados obtenidos por la determinación de citoquinas en presencia de los respectivos inhibidores. Entre los mecanismos descritos que pudiesen estar modulando la expresión de esta citoquina proinflamatoria de manera dependiente de Brd4, se encuentra la vía 137 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA NF-κB y su inhibición mediante la modulación del ARN mensajero de IkBα (Bao et al., 2017; Zhu et al., 2023). Adicionalmente, IRF1 también ha sido relacionado como un importante co-activador de las señales inflamatorias y de migración microglial junto a Brd4, coherentemente con lo mostrado en los resultados por RNA-Seq del presente estudio (Baek et al., 2021). Dado el papel mostrado por MOK en nuestro modelo celular de ELA bajo la agregación de TDP-43, y al papel descrito para Brd4 en la modulación del sistema inmune cuya regulación está alterada en nuestro modelo microglial y afectada por la quinasa MOK, los indicios mostraban que el eje regulatorio bpMOK-pBrd4Ser492 en la respuesta inflamatoria podría estar afectado en un contexto neurodegenerativo como la ELA. Para investigar esa relación, se prepararon cultivos organotípicos provenientes de médulas espinales de ratones silvestres y transgénicos SOD1G93A antes de evidenciar los primeros síntomas de la enfermedad (5 semanas de edad) (Fig. 25). En contraposición a lo observado para los animales silvestres, el importante aumento en los niveles de bpMOK para los animales SOD1 tras la estimulación con LPS se vio correlacionar con una reducción en los niveles de pBrd4Ser492, indicando una desregulación en el eje bpMOK-pBrd4Ser492, tal vez debido a una saturación de la vía. Asimismo, células de microglía aisladas a partir de médula espinal de animales SOD1G93A mostraron un enriquecimiento de niveles altos de la forma activa de MOK, bpMOK, respecto a los controles silvestres (Fig. 27). Destacablemente, los resultados histológicos de médulas espinales, tanto en pacientes de ELA-E como en animales del modelo TDP-43, manifestaban un aumento significativo de bpMOK en las etapas avanzadas de la enfermedad. Estos resultados permiten proponer a MOK como una atractiva diana terapéutica, pudiendo actuar como un punto de regulación crítico de la neuroinflamación. Es de resaltar que, a pesar de que a animales SOD1G93A a los que se les administró el compuesto C13 durante un tiempo limitado no redujeron su pérdida motora, sí que vieron ralentizada la pérdida de peso inducida por el avance de la enfermedad durante una ventana de tiempo posterior a la finalización del tratamiento (Fig. 28), lo cual es un fenómeno que puede ofrecer posibles beneficios clínicos (Patin et al., 2016; Shao et al., 2023). Teniendo en cuenta que el modelo SOD1 presenta un desarrollo de la 144 Conclusiones ❖ La microglía aislada de médulas espinales de ratones SOD1 en etapas sintomáticas tempranas presenta altos niveles de bpMOK. ❖ La administración recurrente de C13 durante un periodo de tiempo limitado en animales SOD1G93A a partir del estadio pre-sintomático reduce la activación de la microglía, los niveles de pBrd4Ser492 en la corteza motora y modifica el transcurso de la enfermedad. 145 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA BIBLIOGRAFÍA 147 Mecanismos modulatorios de MOK en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía en ELA 8. Bibliografía Ahmed, R. M., Devenney, E. M., Strikwerda-Brown, C., Hodges, J. R., Piguet, O. & Kiernan, M. C. (2020). Phenotypic variability in ALS-FTD and effect on survival. Neurology, 94(19), E2005–E2013. https://doi.org/10.1212/WNL.0000000000009398 Ali, H. A., Li, Y., Bilal, A. H. 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