Estudio del estado de madurez y la aptitud enológica en uva mediante análisis de imagen hiperespectral

ESTUDIO DEL ESTADO DE MADUREZ Y LA APTITUD ENOLÓGICA EN UVA MEDIANTE ANÁLISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL Julio Nogales Bueno Área de Nutrición y Bromatología. Facultad de Farmacia c/ P. García González 2. 41012 SEVILLA (Spain). Tel. (34) 954 55 67 61 Fax (34) 954 55 70 17 La tesis titulada “Estudio del estado de madurez y la aptitud enológica en uva mediante análisis de imagen hiperespectral”, presentada por el Ingeniero Químico D. Julio Nogales Bueno para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Área de Nutrición y Bromatología del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal (Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla), bajo la dirección de los Doctores D. Francisco José Heredia Mira, Catedrático de la Universidad de Sevilla y D. José Miguel Hernández Hierro, Profesor Ayudante Doctor de la Universidad de Sevilla. Considerando que se han alcanzado los objetivos inicialmente previstos, y que el trabajo reúne los requisitos necesarios, autorizan su presentación. En Sevilla, a 20 de diciembre de 2016. Fdo. Francisco José Heredia Mira Fdo. José Miguel Hernández Hierro Directores de la Tesis Fdo. Julio Nogales Bueno Agradecimientos Podría agradecer todas las ayudas, apoyos, ánimos, gestos de amistad, cariño, amor y un largo etcétera que me han permitido llegar a este momento de una pieza, pero no considero adecuado que los agradecimientos superen en extensión al resto de este documento. Por tanto, no tengo más remedio que resumir, aún a sabiendas de que no os podré nombrar a todos ni hacer justicia a los que nombre. Es de recibo comenzar agradeciendo a los directores. Esta costumbre me impide resaltar lo mucho que os agradezco vuestra inapreciable guía durante estos cuatro años al no poder situaros en un lugar más privilegiado de lo que es habitual. Muchas gracias Paco por acogerme en el seno de tu familia investigadora, que otros llaman grupo, y por tu generosidad y facilidad a la hora de transmitir conocimientos y habilidades. Muchas gracias José Miguel por enseñarme a investigar y por ser amigo antes que director. Deberías aparecer en más partes de estos agradecimientos, pero sé que no te gusta acaparar. Muchas gracias a todos los que habéis sido parte indispensable de este trabajo. Muchas gracias Paco Rodríguez por ser un modelo a seguir perfecto, un amigo inestimable y por tu continua ayuda durante este tiempo. Y muchas gracias Berta, buena amiga y compañera, gran parte de este trabajo también te corresponde. También tenéis gran culpa de lo que aquí queda recogido el resto de habitantes del laboratorio. Muchas gracias Ana por tu sonrisa perenne y por tu inagotable fuente de incondicional amistad, muchas gracias María José por soportar y ser partícipe de las continuas bromas que hacen más llevadero el día a día, muchas gracias Paula por tu carácter afable y las tardes de pádel–beer y muchas gracias al resto de vosotros, Fran, Belén, María Jesús, Sandra, Carla, María Luisa, Lourdes, Félix, Dolores, Antonio, Isabel, Rocío Fernández y Rocío Álvarez por ser las increíbles personas que sois. Y para finalizar con la parte académica, muchas gracias a la gran cantidad de personas y entidades que me han ayudado de una forma o de otra a realizar esta tesis. Muchas gracias al Consejo Regulador de la D.O. Condado de Huelva, a la Cooperativa vitivinícola Nuestra Señora del Socorro y a Bodegas Roda por el aporte de muestras y a los alumnos que me han ayudado en su recolección y procesado. Thank you very much Hugh por guiarme de una forma tan eficaz durante mi estancia en Dublín. Pocas personas con tu posición académica son capaces de dedicarle tanto tiempo a un estudiante como a un investigador consagrado, y tú eres una de ellas. No puedo olvidarme de la familia que se elige. Muchas gracias a todos los grandes amigos y amigas que están a las duras y a las maduras no solo durante estos cuatro años, sino desde siempre. Especial mención a Alberto que me ha acompañado desde párvulo hasta ahora y a Ignacio, Bauti, Juanlu, Ismael, Alberto Gutiérrez, Burgos y a “Las niñas”. Todo esto no habría sido posible sin las desconexiones semanales por las calles de Guadalcanal. Muchas gracias también a mi FAMILIA, tanto la que aún permanece como la que no, tanto la sanguínea como la putativa. Sois muchos de los que me acuerdo como para poder siquiera nombraros todos. Muchas gracias Ana, Manolo y Antonio Manuel por acogerme en vuestro hogar desde el primer día que me atreví a llamar a la puerta como si de repente os hubiera brotado de una de vuestras macetas un nuevo hijo o hermano de uno noventa. Esto ha ayudado mucho a la consecución de mis objetivos profesionales aunque no sea fácil de expresar en unas pocas líneas. Muchas gracias Guadi por ser otro de mis referentes. Creo que he sabido captar parte de tu decisión, valentía y arrojo para atreverme a afrontar cosas que a priori parecen inalcanzables. Muchas gracias Fati por tu cariño y constante apoyo, me has llevado de la mano toda mi vida, incluso cuando me matriculé en la carrera o cuando hice mi primera entrevista de trabajo. Muchas gracias a ambas por ser los ejemplos a seguir perfectos, esos que te obligan a seguir trabajando a diario porque nunca terminas de alcanzarlos. Muchas gracias también por el regalo de hacerme tío, esos pequeños te quitan las penas con sus pequeñas sonrisas. Muchas gracias Papá y Mamá. Sin vosotros sí que no hubiera sido nada posible, y no solo por el motivo obvio. Muchas gracias por vuestro continuo trabajo para conseguir la mejor educación para vuestros hijos. Muchas gracias por vuestro incondicional amor, cariño, apoyo, responsabilidad, honestidad,… sentimientos y valores entre los que hemos crecido y que hemos respirado hasta hacerlos nuestros. Y muchas gracias Ana. Me has acompañado durante toda mi formación universitaria, has celebrado mis escasos éxitos y suavizado mis continuas derrotas, has creído en mí y me has apoyado. Has mostrado una paciencia infinita para soportar los kilómetros que nos separan semana tras semana y has soportado mis momentos de agobio Muchas gracias por estar ahí siempre. Eres la coautora de mi vida. Muchas gracias Este trabajo ha sido realizado con el apoyo institucional del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España con el proyecto “Evaluación de la madurez fenólica de la uva, y de su contribución a la estabilización del color de vinos tintos, por técnicas ópticas de análisis de imagen” (AGL2011-30254-C02-02), del que el doctor Francisco José Heredia Mira es el investigador principal, y la Beca Predoctoral (BES-2012-060192) asociada a dicho proyecto. Parte de este trabajo ha sido desarrollado también con el apoyo del Ministerio de Economía y Competitividad con la ayuda para la realización de una estancia breve en Dublín de tres meses (EEBB-I-15-09193), gracias a la cual ha sido posible optar a la Mención Internacional del Título de Doctor. A mis padres, Julio y Juani. 1.2 Objetivos ................................................................................................................ 90 1.3 Parte experimental ................................................................................................ 91 1.4 Conclusiones .......................................................................................................... 93 BLOQUE II .............................................................................................................. 95 CAPÍTULO 2: DETERMINACIÓN DE LA MADUREZ TECNOLÓGICA EN UVA Y CONCENTRACIÓN DE FENOLES TOTALES EN HOLLEJO DE UVA POR ANÁLISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL .............................................. 97 2.1 Antecedentes .......................................................................................................... 97 2.2 Objetivos ................................................................................................................ 98 2.3 Parte experimental ................................................................................................ 98 2.4 Conclusiones ........................................................................................................ 100 CAPÍTULO 3: ANALISIS DE VECTORES CARACTERÍSTICOS EN ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO CERCANO PARA LA ESTIMACIÓN DE MADUREZ TECNOLÓGICA EN UVA TINTA Y CONCENTRACIÓN DE FENOLES TOTALES EN HOLLEJO DE UVA TINTA …………………………………………………………………………………103 3.1 Antecedentes ........................................................................................................ 103 3.2 Objetivos .............................................................................................................. 105 3.3 Parte experimental .............................................................................................. 105 3.4 Conclusiones ........................................................................................................ 107 CAPÍTULO 4: USO DE ANALISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL EN EL INFRARROJO CERCANO PARA LA ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO DE ANTOCIANOS EN UVA DURANTE LA MADURACIÓN .................................. 109 4.1 Antecedentes ........................................................................................................ 109 4.2 Objetivos .............................................................................................................. 110 4.3 Parte experimental .............................................................................................. 110 4.4 Conclusiones ........................................................................................................ 112 BLOQUE III ........................................................................................................... 113 CAPÍTULO 5: APLICACIÓN DEL ANALISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL EN EL INFRARROJO CERCANO A LA ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO EXTRAIBLE DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN UVA TINTA ......................................................................................................................... 115 5.1 Antecedentes ........................................................................................................ 115 5.2 Objetivos .............................................................................................................. 116 5.3 Parte experimental .............................................................................................. 117 5.4 Conclusiones ........................................................................................................ 118 CAPÍTULO 6: ESTUDIO DE EXTRACTABILIDAD DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN SEMILLA DE UVA MEDIANTE ESPECTROSCOPÍA ATR– FTIR Y RAMAN ........................................................................................................ 121 6.1 Antecedentes ........................................................................................................ 121 6.2 Objetivos .............................................................................................................. 122 6.3 Parte experimental .............................................................................................. 123 6.4 Conclusiones ........................................................................................................ 125 CAPÍTULO 7: RELACIÓN ENTRE ESPECTROSCOPÍA ATR–FTIR Y RAMAN CON LA EXTRACTABILIDAD DE COMPUESTOS FENÓLICOS Y OTROS ATRIBUTOS DE INTERÉS EN HOLLEJO DE UVA ........................... 127 7.1 Antecedentes ........................................................................................................ 127 7.2 Objetivos .............................................................................................................. 128 7.3 Parte experimental .............................................................................................. 129 7.4 Conclusiones ........................................................................................................ 132 CAPÍTULO 8: INFLUENCIA DE LA ADICIÓN DE EXTRACTO DE SEMILLA DE UVA BLANCA EN LA EXTRACCIÓN DE ANTOCIANOS EN HOLLEJO DE UVA PREVIAMENTE CARACTERIZADOS MEDIANTE ANÁLISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL. .................................................... 133 8.1 Antecedentes ........................................................................................................ 133 8.2 Objetivos .............................................................................................................. 134 8.3 Parte experimental .............................................................................................. 134 8.4 Conclusiones ........................................................................................................ 136 CONCLUSIONES GENERALES ........................................................................ 139 REFERENCIAS ..................................................................................................... 145 1 PRODUCCIÓN CIENTÍFICA La estructura de esta memoria sigue la modalidad “Conjunto de Trabajos”, recogida en el Artículo 9 de la Normativa Reguladora de Tesis Doctoral de la Universidad de Sevilla (Bous nº 3 de 23 de mayo de 2012), a partir de la siguiente producción científica: Artículos:  Nogales Bueno, Julio; Hernández Hierro, José Miguel; Rodríguez Pulido, Francisco José; Heredia Mira, Francisco José: Comparative study on the use of anthocyanin profile, color image analysis and near infrared hyperspectral imaging as tools to discriminate between four autochthonous red grape cultivars from La Rioja (Spain). En: Talanta 2015. Vol. 131. Pag. 412−416, ISSN 0039−9140.  Nogales Bueno, Julio; Hernández Hierro, José Miguel; Rodríguez Pulido, Francisco José; Heredia Mira, Francisco José: Determination of technological maturity of grapes and total phenolic compounds of grape skins in red and white cultivars during ripening by near infrared hyperspectral image: a preliminary approach. En: Food Chemistry 2014. Vol. 152. Pag. 586−591, ISSN 0308−8146.  Nogales Bueno, Julio; Ayala, Fernando; Hernández Hierro, José Miguel; Rodríguez Pulido, Francisco José; Echávarri, José Federico; Heredia Mira, Francisco José: Simplified method for the screening of technological maturity of red grape and total phenolic compounds of red grape skin: application of the characteristic vector method to near-infrared spectra. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol. 63 2015. Pag. 4284−4290, ISSN 4284−4290.  Hernández Hierro, José Miguel; Nogales Bueno, Julio; Rodríguez Pulido, Francisco José; Heredia Mira, Francisco José: Feasibility study on the use of near-infrared hyperspectral imaging for the screening of anthocyanins in intact grapes during ripening. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013. Vol. 61. Pag. 9804-9809, ISSN 0021-8561.  Nogales Bueno, Julio; Baca Bocanegra, Berta; Rodríguez Pulido, Francisco José; Heredia Mira, Francisco José; Hernández Hierro, José Miguel: Use of near infrared hyperspectral tools for the screening of extractable polyphenols in red grape skins. En: Food Chemistry 2015. Vol. 172. Pag. 559-564, ISSN 0308−8146. 2  Nogales Bueno, Julio; Baca Bocanegra, Berta; Rooney, Abigail; Hernández Hierro, José Miguel; Byrne, Hugh J.; Heredia Mira, Francisco José: Study of phenolic extractability in grape seeds by means of ATR–FTIR and Raman spectroscopy. Enviado a Food Chemistry, ISSN 0308–8146 (en revision).  Nogales Bueno, Julio; Baca Bocanegra, Berta; Rooney, Abigail; Hernández Hierro, José Miguel; Heredia Mira, Francisco José; Byrne, Hugh J.: Linking ATR-FTIR and Raman features to phenolic extractability and other attributes in grape skin. Enviado a Talanta, ISSN 0039–9140 (en revision).  Nogales Bueno, Julio; Baca Bocanegra, Berta; Jara Palacios, María José; Hernández Hierro, José Miguel; Heredia Mira, Francisco José: Evaluation of the influence of white grape seed extracts as copigment sources on the anthocyanin extraction from grape skins previously classified by near infrared hyperspectral tools. En: Food Chemistry 2017. Pag. 1685-1690, ISSN 0308−8146. Capítulo de Libro  Nogales Bueno, Julio; Baca-Bocanegra, Berta; Rodríguez Pulido, Francisco José; González-Miret Martín, María Lourdes; Heredia Mira, Francisco José; Hernández Hierro, José Miguel: Hyperspectral imaging − A novel green chemistry technology for the oenological and viticultural sectors. En: Prathamesh Gorawala y Srushti Mandhatri (Eds.) Agricultural research updates. Nova Science Publishers, Inc. Vol. 12. Pag. 45−56. 2015. ISBN 978−1−63483−968−6. Patente  Patente de dispositivo de medición discreta por reflectancia de NIR multibanda del índice glucoacídico en uva para vinificación. Patente de invención, Propiedad industrial. Número publicación: ES2554396. RESUMEN 5 RESUMEN La calidad del vino depende en gran medida de las características de la uva en el momento de la vendimia. Tradicionalmente el control de la variedad, el estado de maduración, la composición fenólica o la facilidad de cesión de estos compuestos al vino se ha realizado mediante métodos de análisis físico–químicos, que pueden resultar complejos y tediosos. Durante las últimas décadas ha comenzado el desarrollo de técnicas espectroscópicas que permiten estimar de forma rápida, no destructiva y respetuosa con el medio ambiente parámetros de interés agronómico. Entre estos métodos destacan los relacionados con la imagen hiperespectral, basados en la información espectral y espacial de la muestra. En el presente trabajo se ha utilizado el análisis de imagen hiperespectral en la región del infrarrojo cercano para la caracterización de uvas y el desarrollo de diferentes metodologías que permitan evaluar su estado de maduración y aptitud enológica. Se ha comprobado la capacidad que el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano tiene para discriminar entre distintas variedades de uva consiguiendo resultados comparables con los obtenidos mediante la caracterización química de las muestras. Así mismo, se han desarrollado modelos para la estimación de parámetros de interés enológico a partir de análisis de imagen hiperespectral con resultados satisfactorios. Han sido modelados parámetros enológicos como la acidez total, el pH y la concentración de azúcares en el mosto de uva, y la concentración de fenoles totales y de antocianos en el hollejo, los cuales tienen gran importancia en la vinificación. Además, la comparación con espectros reconstruidos mediante análisis de vectores característicos ha demostrado que esta técnica permite reducir, en gran medida, la cantidad de información espectral necesaria para el desarrollo de modelos de calibración. Igualmente, se han propuesto modelos de predicción del contenido extraíble de antocianos, flavanoles y fenoles totales en hollejo de uva que permiten estimar de forma rápida la facilidad de cesión de estos compuestos desde las partes sólidas de la uva. Así mismo, utilizando espectroscopía en el infrarrojo medio por transformada de Fourier y espectroscopía Raman se han caracterizado espectralmente muestras de material no extraíble de hollejo y de semilla de uva (residuo sólido resultante tras la extracción de los compuestos fenólicos) y se han relacionado las características espectrales más importantes con la facilidad de extracción de compuestos fenólicos. De esta forma, se ha podido confirmar la relación existente entre la extractabilidad de compuestos fenólicos en hollejo y semilla de uva con la composición de su pared celular. 6 Por último, se ha evaluado el efecto que tiene la adición de extractos de semilla de uva blanca en la extracción de compuestos antociánicos del hollejo de uva tinta. La semilla de uva contiene copigmentos que mejoran las características colorimétricas del vino tinto, sin embargo, es posible que la presencia de estos copigmentos pueda alterar el equilibrio de extracción de los compuestos antociánicos del hollejo de uva. En el presente trabajo se ha comprobado que la adición de copigmentos provenientes de semillas de uva blanca no reduce la cantidad de antocianos extraídos en hollejo de uva durante la etapa de maceración. 7 ABSTRACT Wine quality mainly depends on the characteristics of harvested grapes. Traditionally, variety control, grape maturity, phenolic composition or phenolic compounds extractability are determined by physical and chemical analyses which are usually time consuming. During the past several decades, spectroscopic techniques have grown significantly as technology improved. This growth has allowed developing fast, non-destructive and green chemistry methods for the screening of different parameters of value for agriculture. Among them, hyperspectral imaging methods provide special and spectral information of the sample. In this work, near infrared hyperspectral imaging has been applied for the spectral characterisation of grapes. Afterwards, this spectral data has been used for the development of different methods for the evaluation of grape maturity and oenological capability. The ability of near infrared hyperspectral imaging for discriminating among different grape varieties has been checked. This technique shows similar results than traditional techniques, such as chromatographic analysis, for this purpose. Furthermore, hyperspectral imaging has been applied to grapes in order to develop different calibration models for the screening of several parameters linked to wine sector (i.e., sugar concentration, titratable acidity and pH of grape must, and total phenolic and anthocyanic compounds in grape skin). Moreover, characteristic vector analysis has been applied in order to reduce the amount of spectral data which is necessary for the calibration model development. In addition, calibration models have been developed for the screening of extractable content of anthocyanins, flavanols and total phenolic compounds in grape skins. These models allow knowing how easily phenolic compounds are released from grape seed and skin to wine. In order to provide more information in this respect, Fourier transform infrared and Raman spectroscopy have been applied to grape seed and skin non–extracted material (solid residue obtained after exhaustive phenolic extraction). The main spectral features have been linked to phenolic extractability and it has been confirmed that grape seed and skin phenolic extractability is closely linked to the cell wall composition. Finally, the effect that copigments coming from white grape seeds has on the anthocyanin extraction from red grape skins has been evaluated. Grape seed contains copigments that can improve or stabilize wine colour, however, they might hamper the extraction equilibrium of anthocyanins compounds. In this work it has been proven that the addition of copigments coming from white grape seeds has not reduce the amount of extracted anthocyanins from red grape skin. INTRODUCCIÓN 14 que a color se refiere, aunque no son de despreciar, pues intervienen en la coloración tinta de las uvas o de los vinos por fenómenos de copigmentación con los antocianos (Hidalgo Togores, 2010). La pulpa es la parte más voluminosa de la uva, representando un 75 a 85% del peso de esta. Está formada por grandes células en cuyas vacuolas se acumula el mosto, representando las partes solidas menos del 1% del total de la pulpa. Está compuesta por dos capas, el mesocarpio y el endocarpio, con un grosor total de unas 25 a 30 células qué crecen durante la maduración de la baya. El agua es el componente mayoritario de la pulpa (más del 80%). Tiene la importante misión de hacer de solvente para el resto de componentes de la uva. Los siguientes compuestos más importantes son los azúcares, con concentraciones medias de entre 150 y 250 g/L que se van alcanzando a lo largo de la maduración del fruto. Los azúcares mayoritarios son la glucosa y la fructosa, existiendo en el envero el doble del primero que del segundo, mientras que en la maduración se encuentran en cantidades prácticamente iguales. Junto con los azúcares, los ácidos orgánicos son compuestos de gran importancia en la pulpa, llegando a alcanzarse concentraciones de 3 a 7 g/L. En cuanto a materias minerales, el potasio es el catión más importante, representando más del 50% de las cenizas. Además también se pueden encontrar en cantidades significativas calcio y magnesio y por último otros elementos minoritarios como el hierro y el sodio. Los polifenoles que contiene la pulpa son fundamentalmente del tipo no flavonoides, siendo los ácidos cinámicos y benzoicos los más abundantes. No suelen encontrarse en la pulpa polifenoles de tipo flavonoide excepto trazas de flavanoles muy poco polimerizados y en las variedades tintoreras de pulpa coloreada, antocianos responsables del color rojo característico (Hidalgo Togores, 2010). En la capa más interna de la pulpa (endocarpio) se encuentran las pepitas o semillas. Estas constituyen los elementos de la vid encargados de perpetuar la especie por vía sexual, por lo que la principal función de la baya es alcanzar la maduración de sus semillas, objetivo que se suele alcanzar durante el envero del fruto. Por lo tanto, se podría decir que la madurez de las uvas se debe a un exceso de sustancias de reserva acumuladas en la pulpa y no utilizadas por las pepitas. Así, uvas con mayor número de semillas presentan una pulpa menos madura. El número de semillas presentes en una baya puede ir desde ninguna a 4, alcanzando hasta el 6% del peso total de la baya. Los principales componentes de las semillas de uva son: agua (25.0 a 45.0%), carbohidratos (34.0 a 36.0%), aceites (13.0 a 20.0%), compuestos fenólicos (4.0 a 6.0%), compuestos nitrogenados (4.0 a 6.5%), minerales (2.0 a 4.0%) y ácidos grasos (1.0%). Siendo los aceites y los compuestos fenólicos los de mayor interés debido a sus propiedades beneficiosas para la LA UVA 15 salud (Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, et al., 2006). Los compuestos fenólicos más importantes en la semilla de uva son los flavanoles, apareciendo tanto en forma de monómeros (+)- catequina, (-)-epicatequina o 3-galato de epicatequina, como de oligómeros y polímeros compuestos de distintas subunidades monoméricas (Ristic y Iland, 2005). 2.2 Compuestos fenólicos en uva En la uva, al igual que en otros muchos frutos, existe una gran variedad de sustancias fenólicas. Estos compuestos se encuentran repartidos por todo el fruto, tanto en semillas como hollejos y pulpa, y pasarán directamente al vino (Waterhouse, 2002). Se conocen como compuestos fenólicos aquéllos que tienen en su estructura al menos un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilo (por ejemplo ácido caféico). Dentro de esta gran familia de compuestos, la mayoría tienen múltiples anillos fenólicos en su estructura por lo que, en general, se conocen como polifenoles (por ejemplo (+)-catequina o ácido elágico). Además, tradicionalmente, se han denominado como taninos los compuestos presentes en mezclas complejas de fenoles de alto peso molecular provenientes de extractos naturales de plantas. Las familias más importantes de compuestos fenólicos presentes en uva y vino son flavonoides y no flavonoides (Cheynier, Moutounet y Sarni-Machado, 2003): 2.2.1 Flavonoides Se denominan flavonoides todos los compuestos fenólicos que comparten la estructura que se muestra en la Figura 1, un esqueleto de base de 15 átomos de carbono (C6-C3-C6) de tipo 2- fenil benzopirona. Esta estructura contiene varios anillos aromáticos con grupos hidroxilo, por lo que estos compuestos son polifenoles. Figura 1. Estructura base de los flavonoides (2-fenil-1,4-benzopirona). Esta familia está dividida en varias subclases que se distinguen por el grado de oxidación de su núcleo de pirano (anillo C). En la uva se pueden encontrar flavanoles, flavonoles y INTRODUCCIÓN 16 antocianos. En cantidades relativamente menores están presentes también otros grupos como los dihidroflavonoles (flavononoles), y, en las hojas de la vid, las flavonas. Grupo Estructura Flavanoles Flavonoles Flavonas Flavanonas Antocianidinas Figura 2. Estructura básica de los principales grupos de flavonoides encontrados en uva 2.2.1.1 Flavanoles Los flavanoles o flavan-3-oles son los flavonoides más abundantes en la uva. Se localizan principalmente en las semillas, aunque también se encuentran en los hollejos y se han encontrado trazas en pulpa. Lo más frecuente es encontrarlos formando polímeros y oligómeros en la piel y semillas del fruto. Los polímeros y oligómeros son habitualmente denominados LA UVA 17 taninos. Generalmente, los contenidos globales, al igual que el grado de polimerización, varían de una cepa a otra y según las condiciones de cultivo. Los principales flavanoles que pueden encontrarse en la uva en forma de monómeros son la (+)-catequina y su isómero la (-)-epicatequina. Este último puede encontrarse además en forma de éster gálico (3-galato de epicatequina). También pueden encontrarse, aunque solo en ciertas variedades la galocatequina, el 3-galato de catequina y el 3-galato de galocatequina (Cheynier, et al., 2003). 2.2.1.2 Flavonoles Los flavonoles se encuentran únicamente en el hollejo y su principal función es proteger al fruto de la radiación solar. De esta forma, cuando la exposición solar es mayor, la concentración de estos compuestos se incrementa. Aparecen tanto en variedades blancas como en tintas, con concentraciones totales similares aunque con cambios composicionales en los compuestos individuales. Los cuatro principales flavonoles que pueden encontrarse en uva son kaempferol, quercetina, miricetina e isoramnetol. Se pueden encontrar en forma glucosilada (más abundante), pero se encuentran igualmente cantidades importantes de glucurónidos. Otros azúcares a los que pueden aparecer unidos los flavonoles son galactosa, xilosa y arabinosa (Cheynier, et al., 2003). 2.2.1.3 Antocianos Los antocianos o antocianinas (del griego anthos flor y kyanos azul) son los principales responsables de la coloración de la uva y el vino tinto y representan una parte importante de los flavonoides de la baya. Se localizan en el hollejo y, para las variedades tintoreras, también en la pulpa. En la célula se localizan en los antocianoplastos, orgánulos especializados para su generación y almacenamiento. Antocianidina R R’ Cianidina OH H Delfinidina OH OH Peonidina OCH3 H Petunidina OCH3 OH Malvidina OCH3 OCH3 Figura 3. Estructura de las antocianidinas presentes en uva INTRODUCCIÓN 18 Se denominan antocianidinas a las formas agliconas de los antocianos. Las principales antocianidinas que aparecen en uva están descritas en la Figura 3. Las diferencias entre ellas se limitan a los distintos niveles de hidroxilación y metilación del catión flavilio. Además, los distintos azúcares y ácidos que esterifican a las antocianidinas y la posición donde aparece el enlace glucosídico permiten distinguir las diferentes familias de antocianos. La glucosa es el principal azúcar que aparece unido a las antocianidinas en uva, comúnmente en la posición 3 del anillo C. Los principales ácidos que esterifican el azúcar son el ácido acético, el ácido pcumárico y el ácido cafeico. Teniendo esto en cuenta, los antocianos presentes en uva pueden agruparse según se encuentren acilados o no acilados y dentro de los acilados, según cual sea el ácido que esterifique al azúcar (acetatos, cumaroatos o cafeoatos) (Cheynier, et al., 2003). 2.2.2 No flavonoides Se denominan no flavonoides el resto de compuestos fenólicos que no poseen la estructura 2-fenil-benzopirona. En este grupo están comprendidos los ácidos fenólicos, divididos en ácidos hidroxibenzóicos y ácidos hidroxicinámicos, y otros derivados fenólicos como los estilbenos (resveratrol), los fenoles volátiles y algunos compuestos heterogéneos (lignanos y cumarinas). En uva son más comunes los ácidos hidroxicinámicos, que se encuentran en las vacuolas de las células del hollejo y la pulpa bajo la forma de ésteres tartáricos. Estos son los ácidos cafeoil tartárico (caftárico), p-cumaroil tartárico (cutárico) y feruloil tartárico (fertárico). La forma natural es la trans (E) pero los isómeros cis (Z) también existen aunque en pequeña cantidad. Además, los ácidos hidroxicinámicos, concretamente los ácidos p-cumárico y caféico, están muy implicados en la acilación de los sustitutos glucósidos de los antocianos. En cuanto a ácidos benzoicos, la uva contiene principalmente ácido gálico, presente bajo forma de éster de flavanoles. Este ácido puede alcanzar concentraciones superiores a 100 mg/L en vino tinto (Cheynier, et al., 2003). 2.3 Madurez tecnológica y madurez fenólica La madurez tecnológica y la madurez fenólica de la uva tienen especial importancia en la decisión del momento de la vendimia. Tradicionalmente, la madurez tecnológica ha sido la que más influencia ha tenido debido a la facilidad y rapidez con la que se determina. Sin embargo, en los últimos tiempos ha ido ganando importancia el concepto de madurez fenólica. La madurez tecnológica se da cuando se alcanza un equilibrio entre la concentración de azúcares y la acidez de la pulpa que permite obtener unas características adecuadas en el vino: una suficiente graduación alcohólica y un pH adecuado. Una vez superado este estadio de LA UVA 19 madurez tecnológica, la concentración de azúcares aumenta en demasía pudiéndose obtener caldos con demasiada graduación y con pH elevado (Meléndez, et al., 2013; Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, et al., 2006). El mercado enológico es un mercado muy competitivo, con gran variedad de productos y donde, para conseguir ventas y por tanto beneficios, es necesario producir un vino de elevada calidad. Si se cosecha la uva en el momento óptimo de madurez tecnológica se puede llegar a obtener un vino con una correcta graduación alcohólica y pH. Sin embargo, es necesario tener en cuenta y controlar la madurez fenólica de la uva cosechada para hablar de un vino de calidad. La madurez fenólica está muy relacionada con el sabor, el aroma (a través de los compuestos fenólicos precursores de aromas) y el color del vino. Sucede cuando existe una relación proporcionada entre los compuestos fenólicos que aportan color, sabor y aroma y los compuestos fenólicos astringentes presentes en la uva (Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, et al., 2006; Zamora, 2003). Estos compuestos astringentes son principalmente flavanoles. Consecuentemente, es de gran interés el poder determinar la madurez fenólica de la uva para poder estimar el potencial del vino en cuanto a color, composición fenólica y, en menor medida, compuestos fenólicos precursores de aromas. Se han desarrollado múltiples métodos para determinar cuantitativamente este parámetro que se basan en realizar extracciones de las uvas mediante maceración con distintos disolventes y posteriores determinaciones cromatográficas o espectrofotométricas de los extractos, algo que normalmente es lento y necesita de gran cantidad de trabajo. 2.4 Extractabilidad de los compuestos fenólicos Uno de los factores más influyentes en la calidad futura de un vino es la madurez fenólica de la uva de la que procede (Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, et al., 2006). Este factor muestra la cantidad de compuestos fenólicos presentes en los hollejos, las semillas o en el mosto que forman parte de la masa de vendimia. Sin embargo, no solo es importante conocer la cantidad total de compuestos fenólicos presente en la uva, sino también la cantidad de estos que son extraídos de la uva para formar parte del vino producido, es decir, el contenido extraíble de compuestos fenólicos. La extractabilidad de los compuestos fenólicos, o relación entre contenido extraíble y contenido total, depende en gran medida del grado de madurez de la uva. Uvas más maduras presentan una mayor degradación en las paredes celulares de sus tejidos y, por tanto, una mayor extractabilidad (Bautista-Ortín, Jiménez-Pascual, Busse-Valverde, López- Roca, Ros-García y Gómez-Plaza, 2013; Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, et al., 2006). Varios estudios relacionan la extractabilidad de compuestos fenólicos con el grado de madurez de la uva o con parámetros íntimamente ligados a la madurez. En hollejo de uva, el INTRODUCCIÓN 20 contenido extraíble de fenoles totales, antocianos y flavanoles aumenta con el contenido en sólidos solubles totales en el mosto, es decir con el grado de madurez de la uva (Fournand, Vicens, Sidhoum, Souquet, Moutounet y Cheynier, 2006; Torchio, Cagnasso, Gerbi y Rolle, 2010; Zouid, Siret, Jourjon, Mehinagic y Rolle, 2013). También se han relacionado estos contenidos extraíbles directamente con las distintas etapas de maduración de la uva (envero, maduración y sobremaduración) (Canals, Llaudy, Valls, Canals y Zamora, 2005; Fournand, et al., 2006; Hernández-Hierro, Quijada-Morín, Rivas-Gonzalo, Rivas-Gonzalo y Escribano- Bailón, 2012), y con las condiciones durante la etapa de maceración de la masa de vendimia (González-Manzano, Rivas-Gonzalo y Santos-Buelga, 2004). A lo largo del proceso de maduración de la uva, se produce una disminución de material en la pared celular, galactosa, celulosa y manosa, acompañado por un descenso del grado de esterificación de los polisacáridos pécticos o pectinas. Estos factores tienen gran influencia en la extractabilidad de compuestos fenólicos desde las partes solidas de la uva, siempre teniendo en cuenta que otros parámetros fisiológicos como el espesor del hollejo o tamaño de las semillas pueden también influir de forma significativa (Bautista-Ortín, et al., 2013; Ortega-Regules, Ros-García, Bautista-Ortín, López-Roca y Gómez-Plaza, 2008). Otro aspecto a tener en cuenta, en cuanto a la extractabilidad de compuestos fenólicos del hollejo de uva, es la existencia de diferente material celular en las distintas capas que forman el hollejo, además de las distintas cantidades de compuestos fenólicos que se pueden encontrar en cada capa. En la cutícula no se almacenan compuestos fenólicos, estos se encuentran en las dos capas interiores del hollejo, siendo más ricas las células de la hipodermis más cercanas a la epidermis (Hidalgo Togores, 2010). Por tanto, la extractabilidad de los compuestos fenólicos depende de la eficiencia de la etapa de estrujado, donde se provoca la rotura de las bayas para liberar el mosto (Asselin y Delteil, 2003). En la actualidad, y de forma industrial, ya se añaden enzimas a la masa de vendimia con el objetivo de favorecer o acelerar la degradación de la pared celular de los hollejos y aumentar la cantidad de color extraído (antocianos). Esta práctica también afecta a otras partes de la uva, aumentando la cantidad extraída de compuestos como los flavanoles o taninos. Estos compuestos aumentan la estructura o cuerpo del vino, pero también pueden producir efectos no deseados, como aumentos de astringencia y amargor de la bebida (Bautista-Ortín, et al., 2013). Es necesario, por tanto, entender en profundidad los procesos implicados en la degradación de la pared celular de los tejidos de la uva y poder estimar con anterioridad las cantidades de las distintas familias de compuestos fenólicos que la uva va a ceder al vino. TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 21 3 TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS La radiación electromagnética está formada por ondas que se propagan por el espacio a gran velocidad y están constituidas por campos eléctricos y magnéticos perpendiculares entre sí. Cuando la radiación incide sobre la materia, la interacción entre la radiación electromagnética y la materia puede ser muy diversa (absorción, transmisión, reflexión o dispersión). La característica común de las técnicas espectroscópicas es el uso de la interacción muestra‒ radiación electromagnética como vehículo para el análisis. En el caso de aplicaciones agroalimentarias, la muestra puede tener una gran variabilidad en estado de agregación, tamaño, forma, textura, etc., mientras que la radiación electromagnética usada también puede pertenecer a distintas zonas del espectro electromagnético. Por tanto, el análisis de muestras agroalimentarias mediante técnicas espectroscópicas tiene numerosas variantes en función de las características de las muestras analizadas y de la radiación electromagnética usada. Entre las técnicas espectroscópicas, aquellas que tienen en cuenta las interacciones radiación materia a nivel molecular son de gran utilidad. Si se prescinde de la energía de los núcleos, las moléculas poseen tres clases de energía interna: energía de los electrones, energía de vibración y energía de rotación. Todas ellas están cuantizadas, de modo que solamente son posibles determinados niveles energéticos, es decir, determinadas transiciones electrónicas escogidas, así como determinadas frecuencias de vibración y de rotación. Por absorción de radiación electromagnética se puede producir una excitación de las moléculas, es decir, una transición a un estado de energía más alta. La existencia de niveles energéticos discretos tiene como consecuencia la absorción de radiación a determinadas longitudes de onda o su inversa, frecuencias. Para la energía interna de una molécula se cumple, por tanto: ∆𝐸𝑚𝑜𝑙 =∆𝐸𝑒𝑙+∆𝐸𝑣𝑖𝑏+∆𝐸𝑟𝑜𝑡 Ec. 1 Cada nivel energético está caracterizado por un determinado número cuántico y por la región del espectro a la que pertenecen las radiaciones que originan las transiciones entre niveles. Cuando la absorción de radiación provoca un cambio en el nivel rotacional de la molécula, el salto energético es relativamente pequeño. La absorción se da a una frecuencia relativamente baja y a una longitud de onda alta. Los espectros de rotación aparecen en la región de las microondas y del infrarrojo lejano (espectroscopía rotacional). Si la absorción de luz provoca un cambio en el nivel vibracional de la molécula, el salto energético se da a una mayor frecuencia o menor longitud de onda, situándose este en las regiones del infrarrojo medio o cercano (espectroscopía vibracional). Por último, si la absorción de luz provoca un cambio en el nivel electrónico donde se encuentran los electrones de enlace, se obtienen los mayores saltos INTRODUCCIÓN 22 energéticos, con alta frecuencia y baja longitud de onda. En este caso la absorción aparece en la región visible o ultravioleta (Christen y Beltrán, 1977). Figura 4. Niveles energéticos del enlace. Entre las técnicas espectroscópicas más útiles para el estudio de muestras agroalimentarias están las englobadas en el término espectroscopía vibracional. Este término engloba a la espectroscopía Raman y a la espectroscopía de infrarrojo que además puede dividirse en dos técnicas claramente diferenciadas según la región del infrarrojo que utilicen (infrarrojo cercano o medio). La espectroscopía vibracional analiza las vibraciones que se producen en los enlaces de las moléculas que conforman una muestra. Cada molécula puede tener varios modos vibracionales distintos y cada modo puede cambiar en uno o más niveles vibracionales. En muestras complejas, como las que aparecen en agroalimentación, se encuentran gran variedad de moléculas poliatómicas, por lo que la espectroscopía vibracional permite obtener huellas espectrales del compuesto o muestra analizada (Byrne, Ostrowska, Nawaz, Dorney, Meade, Bonnier, et al., 2014). La espectroscopía Raman y de infrarrojo son en realidad dos técnicas complementarias. Para que un enlace molecular genere una absorción de energía en la región del infrarrojo se necesita que se produzca un cambio en el momento dipolar permanente del enlace. Sin embargo, para que se produzca el fenómeno de dispersión de Raman es necesario que cambie la polarizabilidad (momento dipolar inducido) del enlace como resultado de esta dispersión energética. Se puede demostrar que siempre que la molécula tenga centro de simetría, cualquier vibración que sea activa en Raman no lo puede ser en el infrarrojo. Esta es la llamada regla de exclusión mutua TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 23 (Peña y Muntaner, 1989). Esto implica que, en la mayoría de los casos, un único modo vibracional solo pueda ser activo para espectroscopía infrarroja o para espectroscopía Raman. Por tanto, la espectroscopía vibracional puede aportar información de una muestra desde dos puntos de vista diferentes y complementarios (Byrne, Sockalingum y Stone, 2011; Christen, et al., 1977). 3.1 Espectrofotometría de absorción en el ultravioleta–visible Esta técnica analítica permite cuantificar la absorción de radiación ultravioleta o visible por sustancias químicas líquidas o en disolución para después relacionar la cantidad de radiación absorbida con la concentración de determinados componentes de la muestra. Los compuestos que absorben radiación en la región de ultravioleta y visible se denominan cromóforos, especies químicas que presentan espectros relativamente específicos en estas regiones. No obstante, la posición e intensidad de los picos de absorción que aparecen en estos espectros pueden servir únicamente como orientación en la identificación de compuestos. El disolvente, pequeños cambios estructurales o la conjugación entre dos o más cromóforos pueden ocasionar cambios en los máximos de absorción (Sogorb Sánchez y Vilanova Gisbert, 2006). Los equipos utilizados para realizar estas medidas se denominan espectrofotómetros de absorción y están formados por los siguientes componentes:  Una fuente de iluminación que emite la radiación que posteriormente interactúa con la muestra. Comúnmente se utilizan fuentes incandescentes con filamento de wolframio para emisión de luz visible y lámparas de arco rellenas de deuterio para la emisión de luz ultravioleta.  Un sistema monocromador que permite separar la radiación en estrechas bandas, ya sea antes o después de la interacción con la muestra.  Un compartimento para alojar la muestra, situado de forma que el haz de luz pueda atravesar la muestra que se sitúe en él. En este compartimento se colocan celdas o cubetas apropiadas para medir en la región del espectro utilizada.  Un sistema para la detección de la radiación que ha atravesado la muestra. Los detectores convierten la radiación electromagnética recibida en una pequeña corriente eléctrica que es medida una vez amplificada.  Sistemas de registro de señal o almacenamiento de datos. INTRODUCCIÓN 30 Figura 7. Diagrama esquemático de un interferómetro de Michelson. En este tipo de equipos, la luz proveniente de la muestra puede guiarse de forma muy eficiente hacia el detector debido a que no es necesaria la utilización de una rejilla que seleccione la longitud de onda que llega al detector en cada momento. Por tanto pueden medirse todas las longitudes de onda de forma simultánea. Esto ayuda además a mejorar la relación señal‒ruido con respecto al ruido térmico. Por último, estos equipos permiten obtener espectros con una alta resolución de una forma más rápida que en los equipos dispersivos. Estas ventajas han provocado que la espectroscopía de transformada de Fourier en el infrarrojo haya sido ampliamente usada en detrimento de la espectroscopía de difracción (Siesler, Ozaky, Kawata y Heise, 2002). 3.3 Espectroscopía Raman El efecto Raman fue teorizado y demostrado por C. V. Raman en 1928 (Raman y Krishnan, 1928) basándose en el ya aceptado efecto de dispersión inelástica de la radiación de rayos X. Raman demostró que además de la dispersión elástica (Rayleigh o Mie), en la cual la radiación dispersada no sufre cambios de energía, la radiación electromagnética puede ser dispersada de forma inelástica, es decir, con variación energética. Estos cambios energéticos están asociados a TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 31 cambios en los estados vibracionales de los enlaces. Como resultado del descubrimiento de esta radiación surgió una nueva forma de espectroscopía, la espectroscopía Raman, que complementa a la espectroscopía en el infrarrojo. Una molécula puede absorber un fotón si la energía de este coindice con la diferencia energética entre dos niveles cuánticos. Sin embargo, la colisión entre fotón y molécula también puede dispersar el fotón independientemente de la energía de este. La mayoría de los fotones dispersados no sufren ningún cambio en su frecuencia y energía (dispersión elástica), pero una pequeña fracción intercambia energía con la molécula durante la colisión (dispersión inelástica), produciéndose así el llamado efecto Raman. La dispersión inelástica puede provocar aumentos o disminuciones de la energía del enlace que generan, respectivamente, líneas Stokes o anti‒ Stokes en el espectro Raman. Estas variaciones energéticas son debidas a cambios en los estados vibracionales o rotacionales de los enlaces presentes en la molécula, por lo que los desplazamientos energéticos de los fotones dispersados frente a los fotones incidentes son medidas directas de los distintos modos vibracionales o rotacionales de la molécula. Debido a que a temperatura ambiente muy pocas moléculas se encuentran en un estado vibracional excitado, la probabilidad de que un fotón interaccione con una molécula que se encuentre en estado excitado es mucho menor que la probabilidad de que lo haga con una molécula en estado energético fundamental. Es por esto que la intensidad de las señales Raman tipo Stokes es mucho mayor que la de las señales tipo anti‒Stokes. Figura 8. Representación esquemática de los estados energéticos por los que pasa una molécula durante las dispersiones de Rayleigh y Raman en comparación con la absorción fundamental en el infrarrojo. INTRODUCCIÓN 32 Mientras que las absorciones medidas por la espectroscopía de infrarrojo están provocadas por transiciones vibracionales con energías confinadas en la región infrarroja del espectro, el efecto Raman, al ser provocado por una dispersión energética, puede aparecer en cualquier región del espectro electromagnético. Por tanto, la espectroscopía Raman es una técnica extremadamente versátil ya que puede ser llevada a cabo excitando en las regiones UV, visible o infrarrojo cercano. Otra gran ventaja de la espectroscopía Raman frente a la espectroscopía en el infrarrojo radica en el hecho de que la molécula de agua es prácticamente pasiva frente el efecto Raman. Por tanto, los espectros Raman no están dominados por las bandas pertenecientes al agua, como ocurre en el infrarrojo. Esto es de gran utilidad a la hora de medir muestras biológicas. La espectroscopía Raman ha evolucionado de la mano del desarrollo tecnológico. La aparición del láser aportó una fuente de luz monocromática con gran intensidad lumínica que permitió superar el problema de la poca intensidad del efecto Raman. Además el desarrollo de láseres que emiten en el infrarrojo evitó los problemas de fluorescencia que provocan las fuentes que emiten en las regiones ultravioleta y visible. La aparición de los interferómetros permitió construir equipos FT‒Raman que se beneficiaban de las mismas ventajas que los espectroscopios FT‒IR. Sin embargo, estos sistemas tenían baja sensibilidad. Posteriormente, los detectores CCD (charge–coupled device) permitieron volver a equipos dispersivos, superando así los problemas de sensibilidad. Finalmente, el uso de filtros de banda estrecha, sistemas multicanales de detección de señal y el desarrollo de la tecnología led ha permitido que la espectroscopía Raman se establezca como una herramienta de laboratorio, relativamente asequible a nivel económico, que rivaliza con la espectroscopía de infrarrojo convencional (Byrne, et al., 2011). COLORIMETRÍA TRIESTÍMULO 33 4 COLORIMETRÍA TRIESTÍMULO El color es la respuesta mental al estímulo que una radiación luminosa visible produce en la retina, y que el nervio óptico transmite al cerebro. Es un concepto psicofísico al implicar un fenómeno físico (la radiación electromagnética visible) y un fenómeno psíquico (interpretación por parte del cerebro de las señales que los receptores de la retina reciben). No es, por tanto, una propiedad intrínseca del objeto que refleja o transmite la radiación electromagnética, pues cambios en la fuente de iluminación o en el observador bastan para modificar el estímulo producido. Depende, de la distribución espectral de la radiación incidente, de la capacidad del objeto para transformarla y de la fisiología del observador. Se conoce como luz, o radiación luminosa a cualquier radiación electromagnética que tenga la capacidad de estimular el sistema visual humano. La interacción entre la luz y un objeto provoca la absorción de parte de esta energía por algunas de las moléculas que forman parte del objeto, mientras que el resto de la energía es transmitida o reflejada. La luz que llega al observador será una mezcla de las radiaciones no absorbidas por ese objeto. Los receptores capaces de ser estimulados por la radiación lumínica no absorbida por el objeto se encuentran en la retina y se denominan conos. Existen tres tipos de conos diferenciados entre sí por la longitud de onda a la que se estimulan. Uno lo hace con radiaciones correspondientes a la región del verde, otro con las del rojo y otros con las del azul. A partir de las señales de esos tres tipos de conos el cerebro es capaz de interpretar todos los colores. El estímulo cromático está compuesto por tres sensaciones bien diferenciadas: tono, luminosidad y saturación, que definen cualquier color. El tono o matiz, es un atributo cualitativo y nos permite clasificar los colores en rojizos, azulados, etc. Está relacionado con las diferencias de absorbancia de la energía radiante a diferentes longitudes de onda. La luminosidad o brillo es la característica que permite clasificar un color como claro u oscuro y considerarlo dentro de la escala de grises, entre el negro y el blanco. Es una medida relativa entre la luz reflejada y absorbida. Finalmente, la pureza o saturación determina para cada matiz su grado de diferencia frente al gris del mismo brillo. La colorimetría estudia la especificación numérica del color de un estímulo visual definido físicamente de manera que: estímulos con la misma especificación y bajo las mismas condiciones de observación aparecen iguales para un observador con visión normal de los colores, estímulos que aparecen iguales poseen la misma especificación y los números que comprende la especificación son funciones continuas de los parámetros físicos que definen la distribución de energía radiante espectral del estímulo. INTRODUCCIÓN 34 El color queda definido por tres componentes (uno por cono) denominados valores triestímulo que representan la respuesta de cada uno de los conos envía al cerebro ante un estímulo luminoso. Cada fuente de luz tiene un espectro de emisión (representación de la cantidad de luz emitida a cada longitud de onda) característico y ninguna fuente de luz es equienergética, es decir no existe ninguna fuente que emita la misma cantidad de luz en todas y cada una de las longitudes de onda que constituyen el espectro visible. Con el objetivo de estandarizar las coordenadas de color y facilitar el intercambio y comparación de datos entre laboratorios, la Comisión Internacional de la Iluminación (CIE) recomienda, para colorimetría general, utilizar unos estándares en la fuente de iluminación y también en el observador. Como fuente de iluminación propone distribuciones espectrales relativas (iluminantes) para varios tipos de fuentes, siendo el iluminante D65 el que la CIE recomienda en la mayoría de los casos. El iluminante D65 está relacionado con la radiación que emite un cuerpo negro a la temperatura de 6500 K, cuya luz emitida sería parecida a la luz de un día con el cielo totalmente cubierto. Como observador estándar, la CIE recomienda el observador de 10º, que recoge las funciones de igualación de color (series de valores triestímulo espectrales de cada estímulo monocromático en un determinado sistema de estímulos primarios) para un campo visual de 10º. La CIE ha propuesto distintos sistemas de representación del color buscando uno que refleje la sensación visual percibida por el observador. De todos los propuestos, el espacio de Color CIE 1976 L*a*b* (CIELAB) es el más empleado en la actualidad y es recomendado por la CIE. . Figura 9. Espacio de Color CIE 1976–(L*a*b*). COLORIMETRÍA TRIESTÍMULO 35 El espacio CIELAB es un espacio esférico (Figura 9) donde 𝐿∗ representa la claridad, 𝑎∗ y 𝑏∗ son las coordenadas colorimétricas, 𝐶𝑎𝑏 ∗ el croma y ℎ𝑎𝑏 el tono. La claridad presenta valores desde 0 a 100, de más oscuro a más claro, englobando la escala de grises para valores nulos de cromaticidad. El tono es el ángulo de la circunferencia y está comprendido entre 0º y 360º, y el croma es la distancia entre el eje de la luminosidad y el estímulo en cuestión 4.1 Análisis colorimétrico de imágenes digitales El uso de cámaras digitales para la medida del color se ha desarrollado y extendido rápidamente en los últimos años debido a la calidad de las imágenes que pueden ser obtenidas mediante el uso de estos dispositivos. La cámara digital permite cuantificar no solo el color de los objetos mediante una fotografía, sino también su forma, tamaño y textura (Zheng y Sun, 2008). Sin embargo, el uso de la cámara digital para la evaluación del color tiene limitaciones. Estos dispositivos utilizan el espacio de color RGB, el cual depende del dispositivo con el que se adquiera o donde se muestre la imagen, con lo que la reproducibilidad de las medidas es limitada. Además, la falta de linealidad entre los valores RGB y los valores triestímulo hace que la transformación entre ambos sistemas no sea inmediata. Para solventar las limitaciones que suponen la dependencia del dispositivo, algunos autores realizan las medidas manteniendo constantes las condiciones de medida (Du y Sun, 2008; Foca, Masino, Antonelli y Ulrici, 2011). Sin embargo, lo más adecuado es transformar los datos obtenidos en el espacio de color RGB a un espacio de color uniforme como es el CIELAB. Para hacer esto, es necesario caracterizar la cámara mediante el uso de materiales de referencia, con valores triestímulo conocidos, que permiten realizar la transformación de un sistema a otro mediante ajustes por mínimos cuadrados, interpolación frente a una tabla de datos o mediante el uso de redes neuronales (F. J. Rodríguez-Pulido, 2013). CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA 37 5 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA La cromatografía se define como el conjunto de técnicas utilizadas para la separación de los componentes de una mezcla sobre la base de su diferente movilidad en un medio poroso (fase estacionaria) cuando son arrastrados por un fluido (fase móvil o eluyente) (Sogorb Sánchez, et al., 2006). La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) ha surgido mediante la evolución sufrida durante los últimos 50 años por los sistemas de cromatografía líquida (Sogorb Sánchez, et al., 2006). Inicialmente, las columnas de cromatografía líquida tenían una longitud de varias decenas de centímetros, un diámetro interno de entre 10 y 50 mm y un relleno de entre 100 y 200 µm como fase estacionaria. Mediante bombas peristálticas y con la ayuda de la gravedad se hacía pasar la fase móvil a través de estas comunas alcanzando un flujo máximo de 0.5mL/min. Los intentos de alcanzar flujos mayores mediante aumentos de presión generaban perdidas de eficiencia y rápidos deterioros de los equipos. Pronto se encontró que disminuciones en el tamaño de partícula y mejoras en su empaquetamiento producían un aumento en la cantidad de centros activos separadores, resultando en mejoras en la eficiencia de separación. De esta forma se pudo reducir el tamaño de las columnas sin menoscabar la separación conseguida. Estas nuevas columnas necesitaban una mayor presión para operar a flujos aceptables, por lo que se substituyó el vidrio por metal, y tenían una menor capacidad de carga, es decir, aceptaban menor cantidad de muestra para analizar. Por consiguiente, fue necesario el desarrollo de detectores capaces de registrar señales originadas por muy pequeñas cantidades de electrolito. 5.1 Componentes de un equipo HPLC Los componentes básicos e imprescindibles que conforman un equipo HPLC son: bomba impulsora de disolvente, sistema de inyección de muestras, columna y sistema de registro. Además, todos estos componentes están comunicados entre sí, controlados y sincronizados mediante un sistema informático (Sogorb Sánchez, et al., 2006). 5.1.1 Bombas La bomba es el sistema encargado de impulsar la fase móvil. Absorbe el disolvente del recipiente contenedor, normalmente una botella, por una tubería de teflón de varios mm de diámetro y lo desplaza presurizado por todo el sistema a través de un tubo capilar de acero de entre 0.1 y 0.25 mm de diámetro. Normalmente se dispone de varias bombas (cada una de las INTRODUCCIÓN 38 cuales puede tener más de una línea) para poder hacer cambios en la composición de la fase móvil. Existen dos tipos de bomba, la bomba de desplazamiento positivo y la bomba de pistón con movimiento de vaivén. La bomba de pistón con movimiento de vaivén puede mantener el flujo por tiempo indefinido; por el contrario las bombas de desplazamiento positivo deben ser rellenadas cada vez que se agota el volumen de la jeringa. 5.1.2 Inyectores El inyector es el dispositivo encargado de introducir la muestra en la corriente de fase móvil que fluye desde la bomba hacia la columna. El mayor requisito que debe cumplir es el de inyectar la muestra en el sistema sin alterar significativamente el flujo. Existen principalmente dos tipos de inyectores: manuales y automáticos. Lo manuales han sido montados en equipos hasta principios de siglo por lo que aún pueden encontrarse fácilmente. Requieren la presencia física del operador en el momento del inicio del cromatograma, lo que es un gran inconveniente que derivó en el desarrollo de inyectores automáticos. Los inyectores automáticos incorporan bandejas de muestras donde pueden almacenarse viales preparados para la inyección, siendo posible analizar un gran número de muestras sin intervención directa del operador. Además, su uso mejora notablemente la precisión y reproducibilidad de los procesos. En este caso es el equipo el que se encarga de tomar un volumen fijado de muestra e introducirlo en el flujo. 5.1.3 Columnas Las columnas analíticas de HPLC son cilindros de acero de entre 10 y 25 cm de longitud y 4–5 mm de diámetro interno. La fase estacionaria se halla en el interior de los cilindros, siendo lo más común fases estacionarias en fase reversa a base de sílice químicamente modificada mediante la inclusión de cadenas de hidrocarburos. Pueden encontrarse columnas con cadenas constituidas por 8 y por 18 átomos de carbono (C8 y C18 respectivamente) siendo más usadas estas últimas. El tamaño de partícula de la fase estacionaria oscila entre 2 y 10 μm, dimensiones que se consideran el mejor compromiso entre capacidad, consumo de fase móvil, velocidad de elución y resolución. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA 39 5.1.4 Fases móviles Existe una gran variedad en cuanto a fases móviles dependiendo de las características de los analitos que componen la muestra. Para muestras con composición polifenólica usualmente se usa como fase móvil un gradiente binario, formado por un solvente polar acidificado y otro menos polar. Los modificadores orgánicos que más comúnmente se utilizan en las fases móviles son el acetonitrilo y el metanol. Habitualmente se acidifican las fases móviles para reducir la cola de los picos cromatográficos. Los acidificadores más frecuentes son el ácido acético, el ácido fórmico y el ácido trifluoroacético, siendo este último menos corrosivo y permitiendo mejorar la reproducibilidad de los tiempos de retención de antocianos (Lopes-da-Silva, de Pascual-Teresa, Rivas-Gonzalo y Santos-Buelga, 2002). 5.1.5 Detectores El detector es un dispositivo electrónico que registra una propiedad físico–química del material eluido por la columna en función del tiempo. Los detectores actuales tienen sensibilidades del orden de nanogramos. El sistema de detección más habitual en HPLC es la detección ultravioleta/visible (UV–Vis), utilizando fotodiodos matriciales como sensores. Sin embargo, también se usan sistemas de detección por fluorescencia o electroquímica cuando la absorbancia de los compuestos en UV– Vis es muy baja. No obstante, la detección mediante espectrómetro de masas ha progresado mucho en las dos últimas décadas por ser el detector más sensible, selectivo y universal de los existentes. INTRODUCCIÓN 46 Transformada de Fourier: el uso del interferómetro en espectroscopía implica la adquisición de datos a periodos regulares en el tiempo, por lo que se obtiene una señal en el dominio del tiempo. De esta forma se consigue una mayor velocidad de adquisición de datos que usando medios convencionales (espectroscopía de difracción). Sin embargo, el dominio del tiempo no es fácilmente interpretable, y es necesaria una herramienta que transforme la señal al dominio de las frecuencias, es decir, al dominio donde los datos aparecen ordenados según la frecuencia. En el dominio del tiempo aparece un conjunto de series superpuestas entre sí. Cada serie en el tiempo se corresponde con un pico del espectro en el dominio de las frecuencias. Las características de cada una de las series que aparecen en el dominio del tiempo pueden relacionarse con las características del pico al que se corresponden en el dominio de las frecuencias. Así, la intensidad inicial de la serie se corresponde con el área del pico, la frecuencia de oscilación de la señal en el dominio del tiempo con la posición del pico (frecuencia) y la velocidad de declive de la señal con la anchura del pico. La aplicación de la transformada de Fourier a una señal en el dominio del tiempo permite conseguir dos señales en el dominio de las frecuencias, el espectro real y el espectro imaginario. 𝐹(𝜔)=𝑅𝐿(𝜔)−𝑖𝐼𝑀(𝜔) Ec. 11 donde 𝐹es la transformada de Fourier, 𝜔 la frecuencia, 𝑖 la raíz cuadrada de ‒1 y 𝑅𝐿 e 𝐼𝑀 las partes reales e imaginarias de la transformada, respectivamente. Las partes reales e imaginarias son obtenidas, respectivamente, realizando una transformada en coseno y seno de los datos en el dominio del tiempo: 𝑅𝐿(𝑛)=∑𝑓(𝑚)cos⁡(𝑛𝑚 𝑀) 𝑀−1 𝑚=0 Ec. 12 𝐼𝑀(𝑛) =∑𝑓(𝑚)sin⁡(𝑛𝑚 𝑀) 𝑀−1 𝑚=0 Ec. 13 donde 𝑀 es el número de puntos presentes en los datos originales, 𝑚 se refiere a cada punto individual en los datos originales y 𝑛 es un punto cualquiera de la transformada. Análisis de vectores característicos: una característica común a todas las técnicas espectroscópicas es la gran cantidad de datos que recogen. En estos datos se puede encontrar información más y menos relevante, por lo que la aplicación de una técnica que permita identificar la información más importante dentro de un conjunto de datos es de gran interés. El análisis de vectores característicos permite hacer esta identificación. QUIMIOMETRÍA 47 Los espectros de las muestras, 𝑋𝑖, se pueden considerar como una familia de curvas o vectores de 𝑟 dimensiones con estructura de espacio vectorial. Por lo tanto, se puede encontrar un conjunto de 𝑟 vectores linealmente independientes que formen una base de dicho espacio vectorial. En la práctica, se demuestra que el número de vectores necesarios para explicar la mayor parte de las curvas es mucho menor que el número de elementos originariamente necesarios para representar la familia de curvas experimentales. El análisis de vectores característicos permite determinar el número y la forma de una serie de curvas básicas, llamadas vectores característicos, cuya combinación lineal representa, ajustándose al máximo, la familia de curvas empíricas de partida. Los escalares que acompañan a cada uno de los vectores característicos serán las componentes de la familia de curvas respecto de ese conjunto de vectores. Un tratamiento matemático del método consiste en lo siguiente (Lebart, Morineau y Fénelon, 1985; Simonds, 1963): Los diferentes conjuntos de datos, 𝑋𝑖, se obtienen para 𝑟 valores de la variable 𝑥. Para cada medida experimental 𝑖, los 𝑟 valores de 𝑋𝑖 constituyen un vector fila de datos de 𝑟 columnas. Para 𝑛 conjuntos de datos, los vectores pueden ordenarse para formar una matriz de datos de 𝑛 filas y 𝑟 columnas. Como consecuencia de la teoría general del método es posible encontrar una serie de vectores característicos tales que, cuando son sumados en proporciones apropiadas al vector medio de datos, representan, con una buena aproximación, cualquiera de los 𝑛 vectores originales. Si se calcula la matriz de varianza‒covarianza ⁡𝑆, de la matriz original de 𝑛×𝑟 datos de los vectores, los vectores característicos que se obtienen de esta matriz corresponden a las soluciones de la ecuación matricial: 𝑆−𝐿𝐼=0 Ec. 14 donde 𝐿 es la matriz diagonal de las raíces propias e 𝐼 es la matriz unitaria de 𝑟×𝑟. Los vectores característicos son series de 𝑟 números que forman una base del subespacio vectorial formado por todos los vectores de datos. Las respuestas para cada valor 𝑋𝑖 vienen dadas, matemáticamente, por las ecuaciones: INTRODUCCIÓN 48 𝑋1=𝑋1+𝑀1𝑉11+𝑀2𝑉21+𝑀3𝑉31+⋯+𝑀𝑝𝑉𝑝1 𝑋2=𝑋2+𝑀1𝑉12+𝑀2𝑉22+𝑀3𝑉32+⋯+𝑀𝑝𝑉𝑝2 𝑋𝑟=𝑋𝑟+𝑀2𝑉1𝑟+𝑀2𝑉2𝑟+𝑀3𝑉3𝑟+⋯+𝑀𝑝𝑉𝑝𝑟 Ec. 15 donde 𝑋𝑖 son las componentes del vector media, 𝑉1𝑖, 𝑉2𝑖, … 𝑉𝑝𝑖 son las componentes los respectivos vectores característicos con 𝑝≤𝑟 y 𝑀𝑗 son los coeficientes escalares, las proporciones en que deben sumarse los vectores característicos al vector media para obtener los vectores de datos originales. Los vectores característicos 𝑉𝑝 están unívocamente determinados por la familia de vectores de datos, y son suficientes para obtener todos los vectores de datos pertenecientes a la familia original de la cual han sido derivados. Sin embargo, los valores de los coeficientes 𝑀𝑗 varían de un vector de datos a otro. Por lo tanto, los coeficientes 𝑀𝑗 especifican completamente cada vector de datos, es decir son sus coordenadas respecto a la base encontrada. La potencia de este método nace del hecho de que, usando unos pocos vectores característicos, puede reconstruirse un gran número de vectores de la familia de curvas original, con una aproximación suficientemente buena. El principal inconveniente de esta metodología es que a la hora de realizar el proceso de validación es necesario recalcular los valores de los coeficientes 𝑀𝑗 para los espectros presentes en el set de validación. Para resolver este problema, tras calcular los vectores característicos, se obtienen las expresiones que permiten calcular los coeficientes 𝑀𝑗. Estas expresiones son función de los datos obtenidos (absorbancias o reflectancias) para un número de valores de la variable 𝑥 (longitudes de onda) igual al número de vectores característicos utilizados para hacer la reconstrucción. Una vez obtenidas estas expresiones, es posible obtener los coeficientes 𝑀𝑗 para todos los vectores usados en la calibración y en el posterior proceso de validación. De esta forma se cumple uno de los requisitos más importantes de la metodología, validar los modelos desarrollados con muestras diferentes a las utilizadas para su desarrollo. Finalmente, para comprobar la bondad de la reconstrucción realizada mediante el método de vectores característicos es conveniente calcular algún indicador de precisión como puede ser el error cuadrático medio. Este error permite obtener el error promedio de todos los valores de la variable 𝑥 de los espectros originales frente a los espectros reconstruidos. QUIMIOMETRÍA 49 6.2 Análisis cualitativos utilizados 6.2.1 Análisis discriminante lineal (LDA) El análisis discriminante es un método de clasificación supervisada que crea un modelo predictivo para determinar la pertenencia de una muestra a un grupo. El modelo está compuesto por una función discriminante (o, para más de dos grupos o categorías, un conjunto de funciones discriminantes 𝑞−1) basada en combinaciones lineales de las variables predictoras que proporcionan la mejor discriminación posible entre los grupos. Las funciones se generan a partir de un conjunto de casos para los que se conoce el grupo de pertenencia; posteriormente, las funciones pueden ser aplicadas a nuevos casos que dispongan de datos para las variables predictoras pero de los que se desconozca el grupo de pertenencia. El análisis discriminante es una técnica estadística capaz de determinar qué variables permiten diferenciar a los grupos y cuántas de estas variables son necesarias para alcanzar la mejor clasificación posible. La pertenencia a los grupos, conocida de antemano, se utiliza como variable dependiente (una variable categórica con tantos valores discretos como grupos). Las variables en las que se supone que se diferencian los grupos se utilizan como variables independientes o variables discriminantes. Estas variables deben ser cuantitativas continuas, o al menos, admitir un tratamiento numérico con significado. El análisis discriminante aprovecha las relaciones existentes entre las variables independientes para maximizar la capacidad de discriminación. No todas las variables independientes de las que se parte para realizar un análisis discriminante influyen en la misma medida en el resultado final. Debido a esto, existen distintos algoritmos para seleccionar las variables independientes usadas en el análisis discriminante: algoritmos de selección de variables hacia adelante, eliminación hacia atrás y de regresión por pasos.  Los algoritmos de selección hacia adelante comienzan eligiendo la variable que más discrimina entre las 𝑞 categorías. A continuación seleccionan la segunda más discriminante y así sucesivamente. Cuando ninguna de las variables que quedan por elegir discrimina de forma significativa entre los grupos analizados el algoritmo finaliza y no se seleccionan más variables.  Los algoritmos de eliminación hacia atrás proceden de forma inversa. Se comienza suponiendo que todas las variables son necesarias para discriminar y se elimina la menos discriminante entre los grupos analizados y así sucesivamente. Cuando todas las variables no eliminadas discriminan significativamente entre los grupos analizados el algoritmo finaliza. INTRODUCCIÓN 50  Los algoritmos de regresión por pasos utilizan una combinación de los dos algoritmos anteriores. Permiten la posibilidad de rectificar, eliminando del conjunto seleccionado una variable introducida en el conjunto de discriminación en un paso anterior o introduciendo en dicho conjunto una variable previamente eliminada. Para construir el modelo, es necesario asignar los objetos del conjunto de entrenamiento a una categoría dada. Para ello, se añade una variable categórica a la matriz de datos conteniendo tantas categorías como sean necesarias. El análisis discriminante estima los coeficientes 𝑎1,𝑎2,…,𝑎𝑚, de la función discriminante lineal, 𝑓: 𝑓=𝑎1𝑥1+𝑎2𝑥2+⋯+𝑎𝑚𝑥𝑚 Ec. 16 que es capaz de predecir la pertenencia de los objetos a una u otra categoría. Por encima de un cierto valor de 𝑓, el objeto queda clasificado en una determinada categoría, y por debajo de dicho valor en otra. Si existen tres categorías, es necesario construir dos funciones discriminantes 𝑓1 y 𝑓2 que separan las distintas categorías entre sí, en general 𝑞−1 funciones, siendo 𝑞 el número de categorías. Las funciones discriminantes se construyen de una en una, buscando las direcciones del espacio que maximizan la expresión: 𝜆′=𝑆𝐶𝐷 𝑆𝐶𝐼 Ec. 17 donde 𝑆𝐶𝐷 es la suma de los cuadrados de las distancias euclídeas entre los objetos que pertenecen a distintas categorías, en la dirección que índica la función discriminante, y 𝑆𝐶𝐼 la suma de los cuadrados de las distancias euclídeas entre los objetos pertenecientes a la misma categoría, también en la dirección de la función discriminante. A partir de 𝑞 categorías se obtienen 𝑞−1 funciones discriminantes, en orden decreciente de su valor de 𝜆′, y manteniendo la ortogonalidad entre ellas. Por tanto, la primera función discriminante es la dirección del espacio en la que los grupos se ven más separados entre sí, y a la vez más compactos internamente. Análogamente, la segunda función discriminante es la dirección del espacio que, siendo ortogonal a la primera, cumple con el mismo criterio. La función 𝜆′ no está acotada, por lo que varía solamente con el número de objetos y con la separación entre ellos. Por ello, en lugar de maximizar 𝜆′, se suele minimizar la lambda de Wilks (𝜆𝑊), que se define como: 𝜆𝑊=1 1+𝜆′=𝑆𝐶𝐼 𝑆𝐶𝐼+𝑆𝐶𝐷 Ec. 18 QUIMIOMETRÍA 51 La lambda de Wilks tiene valores entre 0 y 1. Categorías con una separación nítida, dan valores de 𝜆𝑊 cercanos a 0, mientras que categorías ampliamente solapadas dan valores cercanos a la unidad. El análisis discriminante lineal permite además establecer una serie de curvas circulares alrededor del centroide de cada categoría. Todos los puntos situados en una misma curva tienen idéntica probabilidad de pertenecer a la categoría en cuestión. La probabilidad decrece por igual en todas las direcciones del espacio, siendo alta para puntos situados cerca del centroide de la categoría considerada, y baja para puntos alejados. Sin embargo, no es habitual su uso, evaluándose la bondad del modelo por medio del porcentaje de casos correctamente clasificados en las diferentes modalidades de validación existentes (interna, cruzada, una muestra fuera o externa) (Ramis-Ramos y García-Álvarez-Coque, 1999). 6.2.2 Agrupamiento mediante el algoritmo de K–medias El agrupamiento mediante el algoritmo de K–medias es uno de los métodos no supervisados más simples para la clasificación de muestras en un número de grupos a determinar por el usuario. Este método, agrupa las muestras de acuerdo a su grado de similitud. Analiza las variables independientes y forma grupos con características similares en cuanto a estas variables. El número de grupos (𝑘) debe ser elegido a priori por el usuario, quien debe de disponer de la información necesaria para realizar esta elección. Inicialmente, el algoritmo define 𝑘 centroides maximizando la distancia que separa unos de otros. Seguidamente, cada punto perteneciente al set de datos es asignado al grupo del centroide más próximo. Cuando todos los puntos han sido asignados a un grupo, los centroides son recalculados como los baricentros de los grupos creados previamente. Tras esto, vuelven a reasignarse todos los puntos al grupo cuyo centroide es más cercano y se recalculan los centroides. El proceso se repite hasta que el cálculo de los centroides arroja unos resultados suficientemente similares a los del paso anterior dando por finalizado el proceso iterativo (MacQueen, 1967). 6.2.3 Análisis de componentes principales (PCA) El análisis de componentes principales (PCA), es un método de análisis quimiométrico cualitativo habitual en análisis multivariante. Mediante reconocimiento de pautas, el objetivo es reducir el número de variables iniciales, sin perder información y así poder observar estructuras y tendencias en las muestras. El PCA (Deane, 1992) consiste en: INTRODUCCIÓN 52  Estimar la dimensionalidad real de los datos de las muestras estudiadas; y reducir esta dimensionalidad manteniendo la información relevante del sistema.  Calcular un nuevo sistema de coordenadas, para lo que se buscan las direcciones que expliquen la máxima variabilidad en los datos de las muestras. Estos nuevos ejes se denominan componentes principales (PCs). Así el primer componente principal es la dirección que explica la máxima variabilidad de los datos de las muestras; el segundo, se escoge de forma que sea perpendicular al primero, y que explique la máxima variabilidad de los datos de las muestras una vez restada la explicada por el primer componente principal y así sucesivamente.  Definir estos nuevos ejes matemáticamente, mediante cargas o pesos (loadings) que son los cosenos de los ángulos que forman cada uno de estos nuevos ejes con los antiguos, y las puntuaciones (scores) que son las coordenadas en estos nuevos ejes, de tal forma que: Espectro de la muestra = (score 1) (loading 1) + (score 2) (loading 2) +… …+ ruido espectral (E ~ residual) Los componentes principales se pueden interpretar geométricamente de tal forma que el espectro medido a 𝐽 longitudes de onda, constituye un conjunto de 𝐽 variables que puede ser descrito como un vector. Se puede construir un espacio de 𝐽 dimensiones, de tal manera, que cada dimensión corresponda a una de las longitudes de onda, y se pueda representar el mismo objeto como un punto en ese nuevo espacio. Si tenemos 𝑀 muestras, se pueden representar como 𝑀 puntos en el espacio de 𝐽 dimensiones. El objetivo del PCA es hallar las direcciones en que están agrupados los ⁡𝑀 puntos de los objetos en el espacio de 𝐽 dimensiones, y reducir el sistema inicial 𝐽 dimensional a uno 𝐴 dimensional, con 𝐴<𝐽 manteniendo la información relevante del sistema. Geométricamente es un cambio de ejes, representando esas muestras en un sistema de coordenadas con un número inferior de ejes al utilizado inicialmente. Figura 10. Descomposición de un conjunto de espectros mediante análisis de componentes principales. QUIMIOMETRÍA 53 Otra propiedad muy importante de los PCs es la ortogonalidad. El método busca las direcciones ortogonales que expliquen la máxima variabilidad de los datos de las muestras, utilizando estas direcciones como nuevos ejes de coordenadas o PCs. Resumiendo, el PCA se utiliza para reducir el número de variables originales correlacionadas, a un número de variables no correlacionadas en un nuevo sistema de ejes ortogonales denominados PCs. El método para el procesado de datos o escalado será un centrado de datos, el valor medio corresponde al centro del modelo y los valores de todas las variables se refieren a ese centro. La detección de espectros fuera de la población (outliers) se lleva a cabo utilizando la distancia de Mahalanobis (𝐻). Se establece la diferencia espectral de una muestra respecto a la media espectral del conjunto de muestras (𝐻), tomando como valor límite 𝐻=3, de forma que aquellos espectros cuya distancia 𝐻 sea superior a 3.0 se desechan. Las muestras con los datos espectrales originales se ordenan de acuerdo con la distancia de Mahalanobis (𝐻) obtenida anteriormente, esto resulta muy útil en procesos posteriores a la hora de construir los grupos de validación cruzada, de manera que los subgrupos resulten homogéneos. También mediante este proceso de análisis de componentes principales se puede observar qué muestras resultan espectralmente diferentes, sin rebasar el valor de 𝐻=3, con objeto de decidir su inclusión en el conjunto de calibración. Mediante este análisis de componentes principales se puede determinar si una nueva muestra está dentro del espacio determinado por el conjunto de calibración cuantitativa mediante la distancia de Mahalanobis (𝐻) con valor límite de 3, antes de realizar una medida cuantitativa. Aquellas muestras que no pertenezcan al espacio espectral no deben ser predichas, se debe realizar un análisis de referencia y guardar el espectro para una posible ampliación del modelo. Durante el análisis de muestras es importante registrar la distancia de Mahalanobis a la muestra vecina (𝑁𝐻). Usando el valor de 𝑁𝐻 pueden crearse subgrupos de muestras con características espectrales similares dentro del conjunto global de muestras. Este parámetro tiene gran interés cuando se dispone de un set de muestras demasiado amplio. Un valor de 𝑁𝐻=0.6 suele ser el elegido para crear los subgrupos. Seguidamente, una muestra de cada subgrupo es elegida para representar a este. De esta manera puede conseguirse un submuestreo representativo del set global de muestras (Infrasoft International LLC, 2000). INTRODUCCIÓN 54 6.3 Análisis cuantitativos utilizados 6.3.1 Regresión por mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS) La regresión por mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS) es un método de análisis quimiométrico cuantitativo habitual en análisis multivariante. Se basa en que la información contenida en las variables medidas se puede concentrar en un número menor de variables sin pérdida de información relevante. La regresión se realiza con estas nuevas variables, no con los datos originales, simplificando el modelo de calibración y la interpretación de los resultados (Brereton, 2003). El método PLS de calibración es útil para resolver problemas de calibración que contienen un número elevado de variables y relativamente pocas muestras basándose en una reducción de variables. Éste es el caso de técnicas espectroscópicas, como la espectroscopía en el infrarrojo cercano, infrarrojo medio o Raman. Las nuevas variables creadas, denominadas variables latentes, factores o componentes, son combinación lineal de las variables originales. Durante la etapa de calibración, el algoritmo PLS utiliza tanto la información contenida en la matriz de los datos espectroscópicos (matriz 𝑋), como la información contenida en la matriz de datos de referencia (matriz 𝑌); teniendo en cuenta ambas informaciones, el método reduce el impacto de grandes pero irrelevantes variaciones en la matriz 𝑋 en el calibrado, se busca además la máxima variabilidad en la matriz 𝑋 y la mayor correlación con la matriz 𝑌 (Hüskuldsson, 1996). Además, PLS realiza la regresión en un espacio ortogonal, evitando los problemas derivados de la colinealidad entre las variables, el centrado de los datos se realiza en las matrices 𝑋 e 𝑌. QUIMIOMETRÍA 55 Figura 11. Esquema general de obtención de modelos PLS. En la Figura 11 se observa la descomposición de la matriz espectral y la que contiene los parámetros a modelar (𝑋 e 𝑌) mediante PLS, siendo 𝑇, matriz de los scores, el nexo común entre ambas. Las matrices 𝑃 y 𝑄 representan los loadings, mientras que las matrices 𝐸 y 𝐹 representan los errores o residuales de la descomposición de las diferentes matrices. El número de muestras corresponde a 𝑀; 𝐴 es el número de variables latentes obtenidas y 𝑁 indica el número de parámetros a modelar (Brereton, 2003; Vandeginste et al., 1998). En la matriz ⁡𝑌, el número de columnas (𝑁) representa el número de parámetros a modelar, si 𝑁=1 se estaría modelando para un único parámetro, dando lugar al denominado PLS 1. Sin embargo si 𝑁 toma un valor distinto a la unidad se estarían modelando varios parámetros de forma simultánea, dando lugar al denominado PLS 2. En esta memoria se ha elegido el método MPLS (Modified Partial Least Squares), un PLS modificado. La modificación reside en que los residuales de los espectros a cada longitud de onda (obtenidos después de calcular cada factor, variable latente o componente) se estandarizan, es decir, se dividen por la desviación estándar de los residuales a cada longitud de onda, antes de calcular el siguiente factor o variable latente; lo que hace a este algoritmo más estable y preciso que un PLS normal (Infrasoft International LLC, 2000). Al modelar uno a uno los parámetros se trata de una modificación de un algoritmo PLS 1. MATERIALES Y MÉTODOS 62 producción a partir de la que se elaboran vinos vigorosos, con gran textura, cuerpo y color. Por último, aunque algo más corta en sabor, la variedad Mazuelo produce vinos ricos en taninos, alta acidez y un color bastante estable, ideal para combinarse con variedades más suaves y con menos color (Denominación de Origen Calificada Rioja, 2016; ICEX, 2014). 1.1 Muestreo Se realizaron distintos muestreos para los diferentes estudios que componen esta memoria tratando de seguir una metodología constante y común a la hora de recolectar las muestras. Siguiendo una modificación del método de muestreo realizado por Bergqvist, Dokoozlian y Ebisuda (2001), la toma de muestras se realizó de la siguiente forma: en cada parcela se eligieron y marcaron cuatro hileras de viñas separadas entre sí y de los límites de la parcela por al menos tres hileras más. De esta forma se pretende cubrir la mayor parte de cada viñedo para recoger la posible heterogeneidad entre distintas zonas. Solo se tomó un grano de uva por cada planta, teniendo la precaución de tomar de distintas partes del racimo (zonas inferior, superior y media) y cortando el pedicelo para evitar procesos oxidativos tras el muestreo. Con el objetivo de evitar la recogida de muestras poco representativas solo se recogió uva a partir de la quinta vid en cada hilera. Para reducir la influencia de la orientación solar, el muestreo se realizó en las zonas de solana y umbría de cada hilera (Figura 12). Figura 12. Representación del proceso de muestreo. La Figura 13 muestra algunas de las parcelas donde se realizaron los muestreos así como el detalle de un racimo de uva de la variedad Tempranillo durante el proceso del envero. MUESTRAS 63 Figura 13. Algunas de las parcelas donde se realizaron los muestreos y detalle de un racimo de uva de la variedad Tempranillo durante el proceso del envero. Las condiciones particulares de cada muestreo varían en función del estudio al que las muestras estén destinadas. A continuación se describe con detalle las particularidades de los muestreos realizados para los distintos estudios recogidos en esta memoria. 1.1.1 Muestreo para estudio de clasificación de variedades de uva tinta Este muestreo fue realizado por personal de Bodegas RODA (La Rioja, España). Se muestrearon 5 parcelas pertenecientes a la D.O.Ca. Rioja donde se cultivan las variedades tintas Tempranillo (en dos parcelas), Mazuelo, Garnacha y Graciano. Siguiendo la metodología descrita, el muestreo se realizó para dos estadios distintos de maduración: uva madura y uva sobremadura en la campaña de vendimia de 2012. De entre las uvas muestreadas (aproximadamente 1 kg) se seleccionaron aleatoriamente 5 uvas para cada parcela y estadio de madurez, de forma que finalmente se obtuvieron 20 uvas de la variedad Tempranillo y 10 uvas de las variedades Mazuelo, Garnacha y Graciano. Las muestras fueron inmediatamente congeladas a ‒20 ºC hasta la realización de los correspondientes análisis. MATERIALES Y MÉTODOS 64 1.1.2 Muestreo para los estudios de maduración Se realizó un muestreo de las variedades Zalema (blanca), Tempranillo y Syrah (tintas) en cuatro parcelas pertenecientes a la D.O. Condado de Huelva durante la campaña de 2012. Las muestras fueron recolectadas, siguiendo la metodología descrita, dos veces por semana desde mediados de julio hasta principios de septiembre, obteniéndose así muestras con una amplia diversidad en lo que a nivel de maduración se refiere. Esas mismas muestras fueron utilizadas para los análisis del estado de maduración oficiales para el Consejo Regulador de la D.O Condado de Huelva. Debido a las diferentes fechas en que las distintas parcelas fueron vendimiadas, se recolectó diferente número de muestras para cada variedad: 19 muestras para cada parcela de la variedad Zalema, 17 para la parcela de la variedad Syrah y 16 para la parcela de la variedad Tempranillo. Cada muestra recolectada se dividió en tres submuestras y seguidamente fueron almacenadas a ‒20 ºC hasta la realización de los correspondientes análisis. 1.1.3 Muestreos para los estudios de extractabilidad Se muestrearon dos parcelas pertenecientes a la D.O Condado de Huelva donde se cultivan las variedades de uva tinta Tempranillo y Syrah. Se realizaron muestreos de ambas parcelas en el momento de la vendimia de los años 2014 y 2015. En cada campaña se recolectaron 100 bayas de cada variedad siguiendo la metodología descrita. Las muestras fueron refrigeradas y transportadas al laboratorio donde fueron atemperadas, realizándose de forma inmediata el análisis de imagen hiperespectral según la metodología que se describe en la siguiente sección de esta memoria (2.1 Análisis de imagen hiperespectral). Posteriormente, se extrajeron los hollejos y semillas de cada uva, se pesaron, realizándose de forma análoga el análisis de imagen hiperespectral de las semillas. Finalmente, las muestras de hollejos y semillas se almacenaron a ‒20 ºC hasta la realización de los correspondientes análisis. TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 65 2 TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 2.1 Análisis de imagen hiperespectral 2.1.1 Material y equipos - Cámara Xenics® XEVA–USB InGaAs (320 x 256 pixeles). - Espectrógrafo Specim ImSpector N17E Enhanced. - Lámparas halógenas wolframio‒yodo 70 W (PRILUX®). - Estándar de reflectancia difusa Spectralon®. - Ordenador Pentium IV – 2.66 Hz. Windows XP. - Software SpectralDAQ v. 3.62. (Spectral Imaging Ltd., Oulu, Finlandia) . 2.1.2 Adquisición de imágenes hiperespectrales Para la adquisición de los datos hiperespectrales, se ha usado un sistema de imagen hiperespectral (Infaimon S.L., Barcelona, España) compuesto por fuente de iluminación, escáner, sistema óptico, espectrógrafo, cámara y ordenador. La Figura 14 muestra un esquema del montaje de este sistema para la adquisición de datos hiperespectrales. La cámara hiperespectral es el equipo compuesto por las partes d, e, f y g de la Figura 14 y proporciona una imagen que contiene, para cada píxel, el espectro en la región de infrarrojo cercano (NIR) desde 900 a 1700 nm con una resolución de 3.25 nm. La muestra, una vez atemperada, se sitúa en la parte inferior del equipo, sobre una bandeja de polietileno (b). Una estructura (a) sujeta al equipo y a las fuentes de iluminación (c), dirigidas hacia la muestra con un ángulo de incidencia de 45º. De esta forma se consigue disminuir la componente especular de la reflectancia y maximizar la componente difusa. Las fuentes de iluminación deben permanecer encendidas durante al menos 10 minutos antes del comienzo de las medidas para su correcto funcionamiento y estabilización. La luz reflejada por la muestra llega a un escáner (d) que permite recoger diferentes zonas espaciales de la muestra con la ayuda de un espejo giratorio. El haz de luz reflejado por el espejo se dirige en cada momento a través del sistema óptico (e), donde una lente focaliza la luz sobre el espectrógrafo (f) y ésta se descompone según las diferentes longitudes de onda. La cámara (g), que cuenta con un sensor lineal del tipo InGaAs, recoge estos datos y los envía al sistema informático (h). El sistema informático MATERIALES Y MÉTODOS 66 compone el hipercubo, es decir, el archivo con la información espacial (𝑥 e 𝑦) y espectral (𝜆) de la muestra. Figura 14. Representación esquemática de la cámara hiperespectral utilizada. Las imágenes son registradas usando una frecuencia de adquisición de líneas (frames) de 50 Hz y un tiempo de exposición de 9 ms. Todo el sistema está gobernado por el software SpectralDAQ v. 3.62, (Spectral Imaging Ltd., Oulu, Finlandia). Los archivos recogidos contienen las reflectancias absolutas de cada píxel. Para relativizarlos y poder comparar las medidas entre distintas fechas, e incluso entre diferentes equipos, se realiza una calibración de la reflectancia de doble punto. Esta calibración se realiza gracias a la adquisición de la imagen hiperespectral de un blanco de referencia (Spectralon®, NH, EEUU.) y de la corriente oscura del equipo. A cada una de las imágenes tomadas se le aplica el siguiente algoritmo, pixel a pixel, para pasar de reflectancias absolutas a reflectancias relativas: 𝑅= 𝑆−𝐷 𝑊−𝐷 Ec. 28 Siendo 𝑅 la reflectancia corregida o relativa y 𝑆, 𝑊 y 𝐷 las reflectancias absolutas de la muestra, del blanco de referencia y de la corriente oscura respectivamente. TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 67 2.1.3 Segmentación de las imágenes hiperespectrales En la mayoría de los casos, los hipercubos generados en análisis de imagen hiperespectral contienen tanto información de interés, o perteneciente a la muestra, como información no relevante. Es posible seleccionar manualmente las zonas de cada hipercubo que contienen información de interés con el objetivo de tener en cuenta únicamente los datos espectrales de estas zonas. Sin embargo, sería un proceso tedioso para casos en los que se mide un gran número de muestras, como es el caso de los estudios recogidos en la presente memoria. La selección de las zonas que contienen información de interés puede automatizarse mediante algoritmos informáticos, lo que se conoce como segmentación. Para segmentar las imágenes hiperespectrales se han utilizado modificaciones de los métodos descritos en F.J. Rodríguez-Pulido, et al. (2014) y en Hernández-Hierro, Nogales-Bueno, Rodríguez-Pulido y Heredia (2013). Mediante análisis discriminante lineal por pasos hacia adelante se seleccionaron las longitudes de onda que tienen más poder discriminante para diferenciar entre el fondo y la muestra, y se calcularon la función o funciones discriminantes. Seguidamente, estas funciones fueron implementadas en Matlab® R2012b (The Math Works, 2012, MA, EEUU) , mediante un algoritmo que permitió la automatización de la segmentación de las imágenes. Este algoritmo tiene como objetivo clasificar cada píxel de la imagen hiperespectral en dos clases (muestra o no muestra) usando los valores de reflectancia de las longitudes de onda seleccionadas. Finalmente el algoritmo calcula, para cada imagen, el espectro de reflectancia medio de los píxeles clasificados como muestra, le aplica la transformación 𝑙𝑜𝑔⁡(1/𝑅) y combina todos los espectros obtenidos en una matriz espectral. Las particularidades de cada algoritmo de segmentación se recogerán en cada uno de los estudios realizados. 2.2 Espectroscopía de infrarrojo mediante transformada de Fourier con reflexión total atenuada (ATR‒FTIR) 2.2.1 Material y equipos - Espectrómetro Spotligh 400 FTIR Perkin Elmer®. - Detector High‒quality MCT (mercurio, cadmio y teluro) de amplio intervalo espectral. - Accesorio para medidas de reflectancia total atenuada (ATR). - Software Spectrum 10TM. MATERIALES Y MÉTODOS 68 2.2.2 Medidas ATR‒FTIR La adquisición de espectros ATR‒FTIR se realizó utilizando el espectrómetro Perkin Elmer® (MA, EEUU) Spotlight 400N junto con el accesorio universal para medir reflectancia total atenuada (ATR). Este accesorio aporta una superficie de medida plana de diamante sobre la que es posible comprimir la muestra para asegurar una correcta superficie de contacto durante la medida. Usando este accesorio el haz infrarrojo se proyecta en el diamante, el cual tiene un elevado índice de refracción. El haz se refleja en la cara interna del cristal y crea una onda evanescente que penetra en la muestra y es amortiguada, dejando de existir tras recorrer una distancia del orden de unas pocas longitudes de onda. Al estar la muestra en íntimo contacto con el cristal, la onda evanescente interacciona con ella produciéndose la absorción de parte de la energía de dicha onda mientras que otra parte es reflejada y conducida al detector, proporcionando información sobre la composición química de la muestra. Se trata de un método muy versátil que permite la medida de muestras líquidas y sólidas sin prácticamente preparación de las mismas. De esta forma, el accesorio ATR permite que la interacción entre la radiación electromagnética y la muestra no sea puntual, si no que se distribuya por toda la superficie de contacto (Figura 15). Figura 15. Esquema del accesorio para medir reflexión total atenuada. El equipo cuenta con un detector High‒quality MCT basado en semiconductores a base de mercurio, cadmio y teluro, modificando el dopaje del mismo para ampliar su intervalo de sensibilidad, pudiendo medir desde 580 cm-1 a 7800 cm-1. Sin embargo, el intervalo de medida más utilizado es desde 600 a 4000 cm-1, donde el detector tiene una mayor sensibilidad y donde aparecen la mayoría de las absorciones debidas a vibraciones fundamentales de los enlaces más comunes en muestras biológicas. Para la realización de los estudios descritos en la presente memoria, los espectros se obtuvieron realizando 32 medidas en el intervalo comprendido entre 600 y 4000 cm-1, con una TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 69 resolución espectral de 1 cm-1. Las muestras fueron fijadas en el accesorio ATR controlando que la presión aplicada fuera la misma para todas ellas. Además, se midió el espectro de fondo (aire) y el equipo lo sustrajo de forma automática de todas las medidas. 2.3 Espectroscopía Raman 2.3.1 Material y equipos - Espectrómetro Horiba® Jobin–Yvon LabRAM HR800. - Detector CCD de intervalo dinámico de 16 bits, refrigerado a –70 ºC. - Láser de alta eficacia Horiba® de 785 nm y 300 mW. - Microscopio dual. - Objetivos ×100 y ×100 Water immersion Olympus®. - Software LabSpec 6 Horiba®. 2.3.2 Medidas Raman La adquisición de espectros Raman se realizó utilizando el espectrómetro Horiba® (CA, EEUU) Jobin–Yvon LabRAM HR800. Este equipo cuenta con un microscopio dual que permite seleccionar las distintas zonas de medida y enfocar correctamente la radiación de excitación sobre la muestra. En todos los casos se usó un objetivo ×100 Olympus® (Tokio, Japón), aunque para la medida de hollejos se usó la variante Water immersion, capaz de medir muestras sumergidas en agua. Como fuente de iluminación se usó un láser Horiba® de 785 nm y 300 mW de una alta eficacia en el infrarrojo cercano. Este láser es menos energético que aquellos que emiten en visible, y por tanto produce emisiones Raman menos intensas. Sin embargo, a diferencia de los láseres que emiten en visible, la excitación en el infrarrojo cercano genera un efecto de fluorescencia casi nulo, con lo que los espectros adquiridos usando esta excitación aparecen mejor resueltos. Además, la baja energía del láser reduce el riesgo de destrucción de la muestra por sobrecalentamiento. La calibración espectral del equipo se realiza para la línea a 520.7 cm-1 correspondiente a un modo vibracional del silicio activo en Raman, usando el Material Estándar de Referencia Nº 2243 del National Institute of Standars (CO, EEUU). La adquisición de espectros se realizó en el intervalo espectral desde 400 a 3500 cm-1 con una resolución de ~0.9 a 1.6 cm-1 utilizando el detector CCD de intervalo dinámico de 16 bits, refrigerado a –70 ºC mediante efecto Peltier. MATERIALES Y MÉTODOS 70 2.4 Análisis de imagen digital en la región visible 2.4.1 Material y equipos - Cabina de iluminación controlada DigiEye® VeriVide Ltd. - Cámara Nikon® D80 de 10.2 megapíxeles. - Objetivo Nikkor® 35 mm f/2D. - Carta de color DigiTizer VeriVide Ltd. 2.4.2 Adquisición de imágenes Para la adquisición de imágenes digitales en el visible se utilizó el sistema DigiEye®, que usa una cámara digital calibrada (Luo, Cui y Li, 2001). Este sistema cuenta con una cabina de iluminación (VeriVide Ltd., Leicester, Reino Unido) diseñada para iluminar las muestras de forma adecuada, una cámara Nikon® D80 (Tokio, Japón) con un objetivo de 35 mm. Además, para calibrar la cámara se utilizó la carta de color DigiTizer de VeriVide Ltd. que permite caracterizar la respuesta, relacionando la señal RGB con el espacio de color CIELAB. La cabina está equipada con dos tubos fluorescentes emuladores del iluminante D65 y ofrecen unas condiciones de iluminación estables tras el paso de los 10 minutos necesarios para su correcto funcionamiento y estabilización. Tras realizar la calibración de la cámara, las muestras se situaron en el interior de la cabina de iluminación, sobre la bandeja portamuestras y se adquirieron las imágenes. Los datos fueron procesados usando el software Matlab® R2012b. Para obtener las coordenadas CIELAB a partir del espacio de color RGB se usó el software DigiFood® (Heredia, González-Miret, Álvarez y Ramírez, 2006). ANÁLISIS QUÍMICO 71 3 ANÁLISIS QUÍMICO 3.1 Madurez tecnológica 3.1.1 Material y reactivos  Agua desionizada (Milli‒Q, Merck Millipore®) (Darmstadt, Germany).  Hidróxido sódico 1 M (J.T. BAKER®, Ref.7098) (PA, EEUU).  pH–metro CRISON® GLP 21+ (Barcelona, España).  Tampones pH–metría 4.01, 7.00 y 9.21 CRISON® (Barcelona, España).  Refractómetro portátil Análisis Vínicos RHW‒25/Brix ATC (Ciudad Real, España).  Balanza analítica METTLER TOLEDO CLASSIC AB204–S (Barcelona, España).  Matraces aforados de 500 mL y 1 L.  Micropipetas Eppendorf® (Hamburgo, Alemania) de intervalo de volumen 0.1‒1 mL y 1‒10 mL. 3.1.2 Procedimiento analítico La determinación de la madurez tecnológica se realizó a través de los parámetros acidez total, contenido en solidos solubles y pH del mosto de la uva siguiendo los métodos descritos por la Organisation Internationale de la Vigne et du Vin (OIV, 1990). Se molturó uva para obtener aproximadamente 0.5 L de mosto, volumen suficiente para realizar todas las determinaciones mencionadas. 3.2 Composición fenólica 3.2.1 Material y reactivos  Metanol (J.T. BAKER®, Ref.8402) (PA, EEUU).  Ácido clorhídrico 12M (Panreac®, Ref.132176.1611) (Barcelona, España).  Agua desionizada (Milli‒Q, Merck Millipore®) (Darmstadt, Germany).  Etanol absoluto (Panreac®, Ref.361086.1612) (Barcelona, España).  Ácido tartárico (L+) (Panreac®, Ref.141066) (Barcelona, España). MATERIALES Y MÉTODOS 78 espectros NIR, coordenadas colorimétricas y perfiles cromatográficos de las muestras. Finalmente, también se realizó una fusión de datos de segundo nivel con el objetivo de mejorar el poder discriminatorio del análisis. Se ha usado el software SPSS 22.0 (SPSS, 2015, Inc., IL, EEUU) para realizar estos análisis, utilizando la modalidad de análisis por pasos. Esta selecciona las variables más significativas para la discriminación entre las diferentes categorías usando el estadístico 𝐹 para evaluar la significancia del cambio en la Lambda de Wilk al añadir o eliminar una variable. La capacidad de predicción se estimó considerando el porcentaje de muestras correctamente clasificadas por los discriminantes calculados usando un proceso de validación dejando una muestra fuera (leave‒one‒out). 4.5 Agrupamiento mediante el algoritmo de K–medias Este análisis tiene como objetivo agrupar muestras en un número de grupos, de acuerdo al grado de similitud existente entre las muestras según un conjunto de variables independientes. En la presente memoria se utilizó este método para agrupar muestras de hollejo y semilla de uva en 3 grupos con distintos niveles de contenidos extraíbles de compuestos fenólicos. El análisis se desarrolló utilizando el software Statistica v.8.0. Para iniciar el análisis se seleccionaron los centros iniciales de cada grupo de forma que las distancias iniciales entre cada grupo fueran máximas. El algoritmo iterativo continúa asignando cada muestra al grupo cuyo centro sea el más cercano y recalculando los centros al finalizar la asignación. El algoritmo finaliza cuando el reparto de la población de muestras entre los distintos grupos se repite. 4.6 Análisis de la varianza (ANOVA) En general, el propósito del Análisis de la Varianza (ANOVA) es encontrar diferencias significativas entre las medias de los grupos formados (Norman, Streiner y Tarrés, 1996). En la presente memoria se ha utilizado el ANOVA con el objetivo de conocer si hay diferencias significativas entre las medias en varias matrices de datos. Se ha utilizado el software Statistica v.8.0 aplicando el test post hoc de Tukey para detectar que grupos son significativamente diferentes, en cuanto a sus valores medios. Se estableció un nivel de significación estadística de 𝛼=0.05 en todos los análisis en los que se realizó este test. OBJETIVOS GENERALES 81 OBJETIVOS GENERALES El objetivo general de este trabajo es estudiar la madurez y la aptitud enológica de la uva de vinificación mediante técnicas espectroscópicas de análisis. Se plantea la caracterización espectral de muestras de uva y la discriminación entre distintas variedades, así como el desarrollo de métodos no destructivos para la predicción de parámetros relacionados con la madurez del fruto y la extractabilidad de compuestos fenólicos en hollejo y semilla de uva. En concreto se han planteado los siguientes objetivos específicos:  Comparar el perfil de compuestos antociánicos, el análisis de imagen digital en visible y el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano como herramientas para discriminar entre distintas variedades de uva tinta.  Desarrollar métodos no destructivos y respetuosos con el medio ambiente mediante análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano para la estimación de los principales parámetros implicados en la madurez tecnológica de la uva (acidez total, pH y concentración de azúcar en el mosto), así como la concentración de fenoles totales y de antocianos en el hollejo.  Comprobar la viabilidad del análisis de vectores característicos como técnica de reducción de datos aplicada a espectros de uva en el infrarrojo cercano.  Desarrollar métodos para la estimación de los contenidos extraíbles de las principales familias de compuestos fenólicos en hollejo de uva tinta mediante análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano.  Estudiar mediante espectroscopía en el infrarrojo medio y Raman la relación existente entre la composición del material no extraíble y la extractabilidad de las principales familias de compuestos fenólicos en hollejo y semilla de uva tinta apta para vinificación.  Conocer el efecto que tiene la adición de extractos de semilla de uva como fuente de copigmentos en la extracción de compuestos antociánicos en hollejo de uva tinta. 83 GENERAL OBJECTIVES The main aim of this work is to study the maturity and the oenological capability of grapes by means of spectroscopic tools. Spectral characterization of grape samples has been carried out in order to classify grape samples according to their variety and develop nondestructive methodologies to predict different parameters related to grape maturity and phenolic compound extractability. In particular, the following specific aims have been proposed:  To compare chromatographic, digital image and hyperspectral imaging analysis as tools to discriminate between different red grape varieties.  To develop nondestructive and green chemistry methods by means of near infrared hyperspectral imaging for the screening of the principal parameters which compose phenolic and technological maturity (i.e. pH, total acidity and sugar concentration of grape must and anthocyanins and total phenols of grape skin).  To check the feasibility of using characteristic vector analysis as tool to reduce the amount of data in near infrared grape spectra.  To develop near infrared hyperspectral methods for the screening of the extractable content of anthocyanins, flavanols and total phenolic compounds in grape skins.  To analyse Fourier transform infrared and Raman spectra of grape seed and skin non extractable material in order to relate their more important features to phenolic extractability levels.  To evaluate the influence of white grape seed extracts as copigment sources on the anthocyanin extraction from red grape skin. RESULTADOS Y DISCUSIÓN BLOQUE I BLOQUE II CAPÍTULO 2 97 2 CAPÍTULO 2: DETERMINACIÓN DE LA MADUREZ TECNOLÓGICA EN UVA Y CONCENTRACIÓN DE FENOLES TOTALES EN HOLLEJO DE UVA POR ANÁLISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL Nogales Bueno, Julio; Hernández Hierro, José Miguel; Rodríguez Pulido, Francisco José; Heredia Mira, Francisco José: Determination of technological maturity of grapes and total phenolic compounds of grape skins in red and white cultivars during ripening by near infrared hyperspectral image: a preliminary approach. En: Food Chemistry 2014. Vol. 152. Pag. 586−591, ISSN 0308−8146. 2.1 Antecedentes La fecha de recogida de la cosecha de uva, o fecha de la vendimia, es un factor clave para el sector vitivinícola ya que tiene una gran influencia en la calidad del vino que se va a producir. Entre los factores que influyen en la elección de la fecha adecuada para la vendimia tienen gran importancia la madurez tecnológica y la madurez fenólica del fruto. La madurez tecnológica se determina a través del contenido en solidos solubles totales, o concentración de azúcares, el pH y la acidez total del mosto de la uva, mientras que la madurez fenólica está relacionada con los contenidos de compuestos fenólicos presentes mayoritariamente en las partes sólidas del fruto (hollejo y semillas) (Meléndez, et al., 2013; Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, et al., 2006). Tradicionalmente, los controles de maduración de la uva realizados en bodega durante cada campaña se han desarrollado mediante el uso de análisis físicos y químicos, como densimetrías o refractometrías para la determinación de la concentración de azúcares en mosto, volumetrías para la determinación de su acidez total, análisis cromatográficos para conocer los perfiles fenólicos de las distintas partes de la uva o espectrofotométricos para conocer los contenidos fenólicos totales. La mayoría de estos métodos son lentos y conllevan la destrucción de la muestra, por lo que sería de interés reemplazarlos por métodos más rápidos y no destructivos que permitieran hacer un número más elevado de determinaciones en menos tiempo utilizando las mismas muestras para los diferentes análisis. La espectroscopía en el infrarrojo cercano (NIRS) es una técnica no destructiva que ha sido utilizada con buenos resultados para desarrollar métodos que puedan reemplazar las técnicas tradicionales de análisis en uva (Raul Ferrer-Gallego, Hernández-Hierro, Rivas-Gonzalo y Escribano-Bailón, 2011). Además, el análisis de imagen hiperespectral ha sido utilizado con el mismo objetivo en matrices tan diversas como pueden ser frutas o productos cárnicos (Baiano, BLOQUE II 98 et al., 2012; Barbin, et al., 2013; Fernandes, Oliveira, Moura, Oliveira, Falco, Correia, et al., 2011). Por tanto, el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano, una técnica multiparamétrica, no destructiva y respetuosa con el medio ambiente, podría ser una alternativa válida para sustituir a algunos de los métodos tradicionales de análisis en el sector vitivinícola. 2.2 Objetivos El objetivo general de este trabajo es el desarrollo de métodos no destructivos, respetuosos con el medio ambiente y más rápidos que los tradicionales mediante análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano para la estimación de los principales parámetros que conforman la madurez tecnológica y fenólica de la uva (acidez total, pH y concentración de azúcares en el mosto, y contenido en fenoles totales en el hollejo del fruto). Los objetivos concretos planteados fueron:  Determinar diferentes parámetros relacionados con la madurez tecnológica de la uva a lo largo del proceso de maduración.  Determinar la composición fenólica total del hollejo de uva durante el proceso de maduración.  Desarrollar diferentes modelos de calibración utilizando distintos pretratamientos espectrales y seleccionando aquel que resulte más adecuado para la predicción de los parámetros de madurez tecnológica y fenólica estudiados.  Comprobar la validez de los modelos de calibración desarrollados mediante la predicción de los parámetros estudiados en un set de validación externa de muestras.  Comparar entre sí la capacidad predictora de los distintos modelos de calibración desarrollados para uva blanca, uva tinta y un modelo global para uva blanca y tinta conjuntamente. 2.3 Parte experimental Las muestras usadas en este estudio fueron recolectadas dos veces por semana durante todo el periodo de maduración de la campaña de 2012 en cuatro parcelas pertenecientes a la Denominación de Origen Condado de Huelva. Se recolectaron muestras de 3 variedades distintas (una blanca en dos tipos de suelo y dos tintas) desde mediados de julio hasta principios de septiembre, obteniéndose un total de 114 muestras de la variedad de uva blanca Zalema, 51 muestras de la variedad Syrah y 48 muestras de la variedad Tempranillo. Cada una de estas muestras se dividió en dos submuetras. Una se utilizó para la determinación de los parámetros de interés enológico, en lo que sigue parámetros de referencia, concentración de azúcares, pH y acidez total del mosto de la uva y contenido en fenoles totales CAPÍTULO 2 99 del hollejo de uva. Estas determinaciones se realizaron mediante los métodos tradicionalmente usados en bodega a tal efecto (OIV, 1990; Singleton, et al., 1965). De forma paralela también se adquirieron imágenes hiperespectrales de cada una de las submuestras restantes siguiendo el procedimiento descrito por Hernández-Hierro, et al. (2013). Se obtuvo el espectro de absorbancias aparentes en el infrarrojo cercano promedio para cada muestra y se inició el proceso quimiométrico para el desarrollo de los distintos modelos de predicción. Se seleccionó de forma aleatoria un tercio de las muestras que se reservaron para la realización de una posterior validación externa de los modelos. Con los dos tercios restantes se inició el proceso de calibración. De forma previa al análisis cuantitativo se pretrataron los espectros presentes en el set de calibración con una tipificación de la absorbancia (SNV) y una segunda derivada y se aplicó un análisis de componentes principales (PCA). Con esta técnica no supervisada de reconocimiento de pautas, se buscó información sobre la matriz espectral, identificando posibles outliers espectrales, estudiando la distribución de las muestras en el espacio recién creado, observando las posibles separaciones en diferentes grupos espectrales y utilizando esta información para la creación de los grupos usados en el posterior proceso de validación cruzada (Brereton, 2003; Shenk, et al., 1995). Los 15 primeros componentes principales explicaban un 99% de la variabilidad espectral, encontrando en dicho espacio un único outlier espectral, una muestra de la variedad Zalema cuya distancia hasta el espectro medio del set de muestras (distancia 𝐻 de Mahalanobis) era mayor de 3 unidades. En este análisis, se puede observar en el primer componente principal una separación de las muestras espectrales según pertenecieran a uvas de variedad blanca o tinta, mientras que en el segundo componente se vio reflejado el grado de maduración de las muestras. Los modelos de calibración fueron desarrollados aplicando el método de regresión por mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS) utilizando tanto la matriz de espectros (variables independientes) como los datos de referencia o variables dependientes, determinados para esas muestras (la concentración de azúcares, el pH y la acidez total del mosto de la uva y el contenido en fenoles totales del hollejo de uva). Con el objetivo de optimizar los modelos de predicción, se aplicaron diferentes pretratamientos espectrales a los espectros originales. Se seleccionaron los modelos desarrollados con aquellos pretratamientos que permitían obtener un menor error estándar en validación cruzada, siendo estos modelos los sometidos al proceso de validación externa. Para esta validación se evaluaron los modelos obtenidos con el método MPLS mediante el cálculo de los parámetros de referencia predichos para todas las muestras pertenecientes al set de validación. Tras esto, se calculó el error obtenido en cada predicción con respecto a los valores de referencia determinados por medios convencionales y se calculó el error estándar en validación externa a partir de los errores individuales, siempre y cuando los BLOQUE II 100 valores de referencia determinados analíticamente no se encontraran fuera del intervalo de aplicabilidad de los modelos. En el caso de la acidez total, dos muestras mostraron unos valores fuera del intervalo de aplicabilidad de la ecuación obtenida y no se tuvieron en cuenta para el cálculo del error estándar en validación externa de este modelo. Un aspecto interesante de los modelos desarrollados fue que la predicción obtenida para las muestras de uva tinta era mejor que la obtenida en uva blanca para cualquiera de los parámetros de referencia tenidos en cuenta. Debido a esto se decidió repetir todo el proceso de calibración para dos sets de muestras distintos, uno con las pertenecientes a las variedades tintas y otro con las muestras de la variedad blanca Zalema. Todo el proceso descrito se repitió para estos dos nuevos sets de muestras: se reservó un tercio de las muestras para la posterior validación externa, se aplicó un PCA a las muestras de forma previa a la calibración para buscar outliers espectrales y ordenar las muestras según la distancia 𝐻 para la creación de los grupos para la validación cruzada, se realizaron las calibraciones por medio de regresiones MPLS y se realizaron las validaciones externas de cada modelo obteniendo los distintos errores estándares de predicción en validación externa. Los modelos desarrollados para las muestras de uva tinta resultaron tener un mayor poder predictivo que aquellos desarrollados para uva blanca, teniendo estos últimos menor poder predictivo que los modelos calculados inicialmente para todas las muestras en conjunto (excepto para acidez total). El menor error obtenido por los modelos desarrollados para muestras de uva tinta puede ser debido a la menor variabilidad espectral que presentaron los espectros de estas muestras con respecto a las muestras de uva blanca. Los sets de muestras con una reducida variabilidad espectral pueden generar modelos de calibración con una mejor capacidad predictora a expensas de una menor aplicabilidad (Shenk, et al., 1995). 2.4 Conclusiones  El análisis de imagen hiperespectral es una técnica válida para obtener las características espectrales de muestras de uva en la zona del infrarrojo cercano.  La obtención de distintos modelos para predecir los parámetros de referencia estudiados (acidez total, concentración de azúcares y pH en mosto y concentración de fenoles totales en hollejo de uva) a partir de datos hiperespectrales produce resultados satisfactorios.  El análisis de imagen hiperespectral puede considerarse una técnica adecuada para estimar la concentración de azúcares, acidez total y pH en el mosto de uva y la concentración de fenoles totales en hollejo de uva y por tanto para controlar de CAPÍTULO 2 101 forma rápida el estado de madurez tecnológica en uva y la concentración de fenoles totales en hollejo de uva.  Debe realizarse un estudio más completo para que los modelos de calibración ganen en robustez, añadiendo a los sets utilizados muestras de distintas campañas, variedades de uva y zonas geográficas. CAPÍTULO 3 103 3 CAPÍTULO 3: ANALISIS DE VECTORES CARACTERÍSTICOS EN ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO CERCANO PARA LA ESTIMACIÓN DE MADUREZ TECNOLÓGICA EN UVA TINTA Y CONCENTRACIÓN DE FENOLES TOTALES EN HOLLEJO DE UVA TINTA Nogales Bueno, Julio; Ayala, Fernando; Hernández Hierro, José Miguel; Rodríguez Pulido, Francisco José; Echávarri, José Federico; Heredia Mira, Francisco José: Simplified method for the screening of technological maturity of red grape and total phenolic compounds of red grape skin: application of the characteristic vector method to near-infrared spectra. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol. 63 2015. Pag. 4284−4290, ISSN 4284−4290. 3.1 Antecedentes Son conocidas las ventajas que el análisis de imagen hiperespectral tiene respecto a las técnicas tradicionales usadas en la industria agroalimentaria, y concretamente en el sector vitivinícola, para la determinación de los distintos parámetros de interés de cada sector. Debido a esto, el desarrollo de métodos de análisis basados en imagen hiperespectral ha sufrido un fuerte impulso en la última década (Gowen, O'Donnell, Cullen, Downey y Frias, 2007; Qin, Chao, Kim, Lu y Burks, 2013; Wu y Sun, 2013), llegando incluso al planteamiento de aplicaciones pensadas para su uso en líneas de producción, o aplicaciones on–line (Garcia- Allende, Conde, Mirapeix, Cobo y Lopez-Higuera, 2010; Gou, et al., 2013). Sin embargo, entre las desventajas de esta técnica se encuentran la gran cantidad de datos que genera, lo que implica un gran coste computacional, y el elevado coste de los sistemas de análisis de imagen hiperespectral, características que ralentizan el avance en este campo. Es por esto que una de las líneas de estudio más importantes en relación con el análisis de imagen hiperespectral es la identificación de longitudes de onda o pequeñas regiones del espectro electromagnético que tengan gran importancia en las aplicaciones estudiadas. A partir de estas longitudes de onda de interés pueden desarrollarse dispositivos de análisis de imagen que trabajen con menor cantidad datos, los llamados sistemas de análisis de imagen multiespectral. Estos sistemas son menos complejos que los hiperespectrales y, por tanto, más económicos, recogen imágenes con menor resolución espacial y espectral y permiten una adquisición y tratamiento de datos más rápidos, posibilitando así el uso de esta tecnología en línea (Qin, et al., 2013). Existen varias alternativas para la identificación de las longitudes de onda que contienen información de interés. Las principales metodologías que suelen usarse en imagen BLOQUE II 110 4.2 Objetivos El objetivo general de este trabajo ha sido evaluar el potencial del análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano para la estimación de la concentración de compuestos antociánicos en hollejo de uva a lo largo de la maduración del fruto. Los objetivos concretos planteados fueron:  Determinar la composición antociánica del hollejo de uva durante el proceso de maduración.  Desarrollar diferentes modelos de calibración, con distintos pretratamientos espectrales, seleccionando aquel que resulte más adecuado para la predicción de los compuestos antociánicos del hollejo de uva.  Comprobar la validez de los modelos de calibración desarrollados mediante la predicción de los parámetros estudiados en un set de validación externa de muestras.  Identificar y describir las zonas del infrarrojo cercano que más influencia tienen en los modelos de calibración desarrollados. 4.3 Parte experimental Este estudio se ha llevado a cabo utilizando muestras de uva de las variedades tintas Syrah y Tempranillo, recolectadas en dos parcelas pertenecientes a la Denominación de Origen Condado de Huelva durante la campaña de maduración de 2012. Estas variedades de uva tinta son las más cultivadas en la región debido a su adecuada adaptación a las condiciones climáticas que se dan en ella. Se recolectaron un total de 99 muestras de uva durante el periodo comprendido entre el envero y la sobremaduración del fruto. Cada una de ellas fue dividida en dos submuestras y congeladas a −20 ºC hasta la realización de los correspondientes análisis cromatográficos y de imagen hiperespectral. Para la realización del análisis cromatográfico las muestras fueron atemperadas, se separaron los hollejos de la pulpa y se sometieron a un proceso de extracción exhaustiva utilizando metanol ácido (0.1% de HCl 12M). Una alícuota de cada extracto fue evaporada, reconstruida con agua desionizada, filtrada y diluida 1:2 con HCl 0.1 M para la realización del correspondiente análisis cromatográfico, siguiendo una modificación del método descrito por García-Marino, et al. (2010) como se describe en detalle en (Hernández-Hierro, et al., 2013). Se identificaron hasta 15 compuestos antociánicos que fueron agrupados en dos variables para su uso como referencia en el proceso de calibrado: antocianos totales y antocianos no acilados, pudiendo obtenerse la concentración de compuestos acilados por diferencia. Durante el periodo de maduración estudiado, las concentraciones obtenidas para antocianos totales estuvieron comprendidas entre 0 y 23.8 mg/g de hollejo con una desviación estándar de 5.6 mg/g de hollejo CAPÍTULO 4 111 expresados como equivalentes de malvidina‒3‒O‒glucósido, mientras que en el mismo periodo los compuestos antociánicos no acilados oscilaron entre 0 y 16.9 mg/g de hollejo con una desviación estándar de 3.9 mg/g de hollejo expresados como equivalentes de malvidina‒3‒O‒ glucósido. Cada una de las submuestras restantes, tras ser descongelada y atemperada, fue sometida a un análisis de imagen hiperespectral, recogiendo sus espectros de reflectancia en la región del espectro electromagnético comprendida entre 900 y 1700 nm con una resolución espectral de 3.25 nm. Posteriormente, cada imagen fue sometida a una calibración de doble punto, para ello se adquirieron imágenes de un material de referencia y de la corriente de oscuridad del equipo, señal que recoge el detector cuando no recibe luz. Para la adquisición de las imágenes hiperespectrales, las muestras se situaron sobre una bandeja de polietileno, la cual facilitó el proceso de segmentado debido a las grandes diferencias espectrales existentes entre el soporte y las muestras. Esta segmentación se realizó mediante análisis discriminante y permitió seleccionar las partes de las imágenes pertenecientes a uva y, así, desechar el resto. Además solo el intervalo espectral comprendido entre 950 y 1650 nm fue almacenado debido a la reducida eficiencia del detector en los límites de su zona de medida. Seguidamente, se obtuvo un espectro medio para cada una de las imágenes adquiridas y se transformó este a absorbancias aparentes (𝑙𝑜𝑔1/𝑅). La matriz espectral obtenida se dividió en dos sets de muestras, uno de ellos, con dos tercios de las muestras espectrales, se dedicó al desarrollo de los modelos de calibración para la predicción de las variables de referencia, mientras que el tercio restante de muestras espectrales se reservó para la posterior validación externa de los modelos generados. Las muestras alojadas en el set de calibración fueron pretratadas mediante una tipificación de la absorbancia (SNV) y una segunda derivada de forma previa a la aplicación de un análisis de componentes principales (PCA). Este análisis cualitativo no supervisado crea un nuevo espacio donde se ordenan las muestras, permitiendo identificar los posibles outliers espectrales y crear distintos grupos de muestras homogéneos entre sí, aunque heterogéneos internamente, para el posterior proceso de validación cruzada que tendrá lugar durante la calibración. En el espacio recién creado se encontraba representada el 99% de la variabilidad espectral del set de calibración usando 11 componentes principales. No se encontró ningún outlier espectral, ni tendencia apreciable que permitiera separar las muestras de ambas variedades en función del espectro. Sin embargo, sí se encontró influencia del estado de maduración de las muestras en el espectro de estas. Seguidamente se realizó el proceso de calibración mediante regresión por mínimos cuadrados parciales modificada (MPLS). Para esta calibración se utilizaron como variables independientes los espectros de las muestras sin pretratar y como variables dependientes los parámetros de referencia previamente obtenidos, es decir, la concentración de antocianos totales BLOQUE II 112 o la concentración total de antocianos no acilados. Se probaron distintos pretratamientos espectrales para mejorar la capacidad de predicción de los modelos generados y se seleccionaron los que menor error estándar de validación cruzada generaban. Los dos modelos seleccionados (uno para cada parámetro de referencia) fueron posteriormente evaluados utilizando el set de muestras reservado para el proceso de validación externa. Una de las muestras fue descartada para la validación de los modelos por presentar valores de referencia fuera de los intervalos de aplicabilidad del mismo. A partir de este proceso de validación externa se obtuvieron los errores estándares de predicción en validación externa para la predicción de antocianos totales y antocianos no acilados en hollejo de uva intacta de las variedades Syrah y Tempranillo. Los errores obtenidos fueron del orden de 3 mg/g de hollejo expresados como equivalentes de malvidina‒3‒O‒glucósido. Errores adecuados para la determinación, a modo exploratorio, de los parámetros estudiados. Cabe destacar que durante el proceso de calibrado, el algoritmo MPLS realiza una reducción de variables mediante el cálculo de unas variables latentes o factores PLS. Esta reducción de variables es realizada de forma que los primeros factores o variables latentes contengan la mayor información para la predicción de las muestras. Se comprobó que existen ciertas zonas de los factores PLS que tienen mayor influencia en la predicción de la concentración de antocianos que otras. En concreto, las regiones cercanas a 1150 y 1400 nm mostraron importantes contribuciones a los modelos. Estas zonas espectrales se corresponden con sobretonos y bandas de combinación de las vibraciones fundamentales de los enlaces –CH y –OH. 4.4 Conclusiones  El análisis de imagen hiperespectral es una técnica válida para obtener las características espectrales de muestras de uva tinta en la zona del infrarrojo cercano, pudiéndose generar a partir de estos espectros modelos de calibración de parámetros de interés en estas muestras.  Es posible predecir, de forma satisfactoria, el contenido en antocianos totales y en antocianos no acilados presentes en hollejo de uva a partir del espectro en la región del infrarrojo cercano del fruto adquirido de forma no destructiva.  Existen ciertas zonas del espectro en el infrarrojo cercano que tienen una mayor influencia en la predicción de la concentración de antocianos en hollejo de uva.  Debe realizarse un completo estudio para que los modelos de calibración ganen en robustez, añadiendo a los sets utilizados muestras de distintas campañas, variedades de uva y zonas geográficas. BLOQUE III CAPÍTULO 5 115 5 CAPÍTULO 5: APLICACIÓN DEL ANALISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL EN EL INFRARROJO CERCANO A LA ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO EXTRAIBLE DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN UVA TINTA Nogales Bueno, Julio; Baca Bocanegra, Berta; Rodríguez Pulido, Francisco José; Heredia Mira, Francisco José; Hernández Hierro, José Miguel: Use of near infrared hyperspectral tools for the screening of extractable polyphenols in red grape skins. En: Food Chemistry 2015. Vol. 172. Pag.559-564, ISSN 0308−8146. 5.1 Antecedentes La cantidad de compuestos fenólicos que contiene la uva tinta en un estado óptimo de maduración es de aproximadamente 4 g/kg. Durante el proceso de vinificación, parte de estos compuestos fenólicos pasan al vino, bien por transferencia directa del mosto o por extracción de los compuestos fenólicos presentes en las partes sólidas de la uva durante la maceración (Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, et al., 2006). La facilidad de extracción de los compuestos fenólicos al vino, o extractabilidad, está íntimamente ligada al estado de madurez del fruto, siendo los frutos más maduros los que presentan una mayor degradación de la pared celular, lo que facilita la liberación de los compuestos fenólicos formados en las vacuolas celulares (Bautista-Ortín, et al., 2013; Hernández-Hierro, Quijada-Morín, Martínez-Lapuente, Guadalupe, Ayestarán, Rivas-Gonzalo, et al., 2014; Quijada-Morín, Hernández-Hierro, Rivas-Gonzalo y Escribano-Bailón, 2015). En consecuencia, no solo es necesario conocer la cantidad total de compuestos fenólicos que contiene una determinada muestra o lote de uva, si no también conocer la cantidad de estos compuestos que pasarán a formar parte del vino. Existe una gran heterogeneidad entre muestras de una misma fase fisiológica en cuanto a maduración, contenido fenólico total y contenido fenólico extraíble, debida a factores como la variedad de uva, la relación volumétrica entre el hollejo y la baya, la región de cultivo, el clima u otras condiciones agronómicas, incluso, es frecuente encontrar heterogeneidad entre muestras pertenecientes al mismo cultivo (Crozier, et al., 2006). Debido a lo anterior, son necesarios métodos de análisis que permitan una determinación ágil y eficaz de estos parámetros. Entre los compuestos fenólicos de la uva pueden encontrarse tanto flavonoides como no flavonoides. La mayoría de los flavonoides presentes en uva tinta se encuentran en el hollejo y las semillas del fruto, por lo que su extracción al vino se produce durante la etapa de BLOQUE III 116 maceración. Entre estos compuestos, los flavanoles son los más abundantes y juegan un papel importante en las características sensoriales del vino, pudiéndole aportar amargor, astringencia o cuerpo. Además, aumentan y estabilizan su color actuando como cofactores del proceso de copigmentación de los antocianos. Los antocianos son los compuestos flavonoides responsables del característico color del vino tinto, son transferidos desde los hollejos al mosto durante la etapa de maceración (Waterhouse, 2002). Los compuestos no flavonoides presentes en el vino tinto, procedentes de la uva, son derivados de ácidos hidroxicinámicos y benzoicos, aportando así, entre otras cosas, carácter ácido al vino (Jackson, 2000). Por último, los compuestos fenólicos, flavonoides y no flavonoides, influyen positivamente en la actividad antioxidante del vino (Rice-Evans, et al., 1997). Para conocer la cantidad de compuestos fenólicos que pasan del hollejo de uva al vino, o contenido extraíble de compuestos fenólicos, es necesario separar los hollejos de la pulpa, realizar maceraciones simuladas de estos hollejos y analizar los extractos resultantes mediante métodos espectrofotométricos o cromatográficos. En definitiva, es necesario realizar un proceso largo, destructivo y no respetuoso con el medio ambiente, el cual sería interesante sustituir por nuevos métodos que mejoraran estos aspectos. Como ya se ha dicho, el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano ha demostrado ser un método válido para la predicción de parámetros de interés en uva, por lo que es un candidato válido para el desarrollo de estos métodos. 5.2 Objetivos El objetivo principal de este capítulo ha sido el desarrollo de métodos rápidos y no destructivos para la estimación de los contenidos extraíbles de antocianos, flavanoles y fenoles totales en hollejo de uva tinta mediante análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano. Concretamente, los objetivos planteados fueron:  Determinar el contenido extraíble de antocianos, flavanoles y fenoles totales en hollejo de uva tinta apta para vendimia.  Caracterizar espectralmente muestras de uva tinta y realizar una selección de muestras espectralmente heterogéneas.  Desarrollar modelos de calibración a partir de análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano para la estimación de los contenidos extraíbles de antocianos, flavanoles y fenoles totales en hollejo de uva tinta.  Comprobar la validez de los modelos de calibración desarrollados mediante la predicción de dichos parámetros en un set de validación externa de muestras. CAPÍTULO 5 117  Evaluar la heterogeneidad existente en contenidos fenólicos extraíbles en un mismo estado fisiológico. 5.3 Parte experimental Para la realización de este estudio se utilizaron muestras de uva tinta de las variedades Syrah y Tempranillo recolectadas en el momento de la vendimia en la campaña 2013. Se recolectaron aleatoriamente 100 bayas de cada variedad en dos parcelas pertenecientes a la Denominación de Origen Condado de Huelva. Las muestras fueron refrigeradas y llevadas al laboratorio, donde, de forma inmediata, se atemperaron y se sometieron a un análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano. Las imágenes de cada una de las muestras se calibraron respecto a un patrón de referencia y la corriente oscura del equipo, y se almacenó el espectro medio de cada baya (950−1650 nm). A este conjunto de espectros se le aplicó un pretratamiento, para reducir los efectos de dispersión de la luz (SNV y segunda derivada), y un análisis de componentes principales (PCA), el cual permitió conocer la estructura espectral de la matriz. Teniendo en cuenta 5 componentes principales se consiguió explicar el 90% de la variabilidad espectral de los datos originales y se encontraron 3 outliers espectrales los cuales dejaron de formar parte del conjunto de muestras estudiado. Con las restantes muestras, ordenadas en este espacio pentadimensional de acuerdo a su distancia de Mahalanobis (𝐻), se realizó un proceso de selección de muestras, se agruparon todas las muestras que tuvieran una distancia de Mahalanobis a la muestra vecina (𝑁𝐻) menor que 0.6, obteniéndose 34 grupos distintos. Se seleccionó una muestra de cada uno de los grupos obteniéndose así un set de 34 muestras en el cual estaba representada toda la variabilidad espectral del conjunto original de 197 muestras. Seguidamente, se seleccionó otra muestra de cada uno de los grupos (solo fue posible hacerlo en 21 de estos grupos debido a que en 13 únicamente había una muestra), creándose así otro set de muestras representativas. Estos sets de muestras fueron utilizados, respectivamente, para realizar el calibrado y la validación externa de los modelos desarrollados. Los parámetros de referencia a predecir fueron los contenidos extraíbles de antocianos, flavanoles y fenoles totales en hollejo de uva. De forma previa a la realización de los calibrados, se determinaron estos parámetros para las 34 muestras alojadas en el set de calibración. Los hollejos fueron macerados durante tres días en vino sintético, una disolución en base acuosa con un 12.5% de etanol, 4 g/L de ácido tartárico y un pH de 3.6. Seguidamente, se determinaron las concentraciones de los parámetros de referencia en los extractos resultantes. La determinación de antocianos se realizó mediante análisis cromatográfico, siguiendo una modificación del método descrito por García-Marino, et al. (2010) como se describe en Hernández-Hierro, et al. (2013). Para la determinación de flavanoles se utilizó el método espectrofotométrico descrito BLOQUE III 118 por Vivas, et al. (1994), el cual mide la reacción entre el reactivo 4‒ (dimetilamino)cinamaldehído (DMACA) y los compuestos flavanólicos de la muestra, mientras que la determinación de los fenoles totales presentes en los extractos se utilizó el también método espectrofotométrico de Folin−Ciocalteu (Singleton, et al., 1965). Una vez obtenidos los parámetros de referencia, se realizaron las calibraciones mediante regresión por mínimos cuadrados parciales modificada (MPLS) utilizando los espectros alojados en el set de calibración y los datos de referencia anteriormente mencionados. Se probaron distintos pretratamientos espectrales para optimizar el error estándar de calibración que se obtiene en el proceso de validación cruzada (SECV) y se seleccionó el modelo que menor error generaba para cada uno de los parámetros de referencia. Tras esto se realizó la validación externa de los modelos usando las muestras seleccionadas para tal efecto. De forma previa habían sido determinados los parámetros de referencia, pertenecientes a estas muestras, siguiendo la metodología descrita anteriormente. Como resultado del proceso de validación, se obtuvo el error estándar de predicción (SEP) en validación externa para cada modelo. Se consiguió predecir los contenidos extraíbles de antocianos, flavanoles y fenoles totales en las muestras alojadas en el set de validación con unos errores de predicción del orden de entre 0.5 y 1 mg/g de hollejo dependiendo del parámetro. Por último, los métodos desarrollados se utilizaron para predecir los contenidos extraíbles de antocianos, flavanoles y fenoles totales en todas las muestras (197), sin tener en cuenta los outliers espectrales. Se obtuvo una gran heterogeneidad en los resultados y se comprobó que estos seguían distribuciones normales. Esto confirma que existe heterogeneidad en cuanto a los contenidos extraíbles de compuestos fenólicos pudiéndose atribuir a la diferencia de maduración entre muestras pertenecientes a un mismo punto de muestreo. Además, se comprueba que los compuestos fenólicos son más fácilmente extraíbles para las muestras de la variedad Tempranillo que para las de la variedad Syrah, lo que podría deberse a diferencias en el estado de maduración en el momento de la vendimia entre ambas variedades, siendo las uvas de Tempranillo las que tienen un mayor nivel de madurez, una mayor degradación de la pared celular y, por tanto, producen una mayor cesión de compuestos fenólicos al vino. 5.4 Conclusiones  El análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano puede considerarse una técnica válida para estimar el contenido extraíble de compuestos fenólicos (flavanoles, antocianos y fenoles totales) procedentes de hollejo de uva tinta.  La selección de muestras espectrales mediante análisis de componentes principales permite reducir el número de muestras necesarias para realizar modelos de CAPÍTULO 5 119 calibración manteniendo la heterogeneidad espectral existente en el set de muestras de partida.  Existe heterogeneidad en cuanto al contenido extraíble de compuestos fenólicos dentro de un mismo punto de muestreo atribuible a diferencias de maduración y/o degradación de la pared celular del hollejo.  La metodología desarrollada permite clasificar muestras de acuerdo a su contenido extraíble de compuestos fenólicos de forma no destructiva que podrán ser utilizadas posteriormente para la realización de otros análisis.  Existe diferencia en cuanto a facilidad de extracción de los compuestos fenólicos entre las variedades de uva tinta Tempranillo y Syrah en una misma fecha, lo que puede atribuirse a diferencias en la velocidad de maduración y/o degradación de la pared celular del hollejo entre ambas variedades. BLOQUE III 126  La espectroscopía Raman proporciona datos de interés en el estudio de la estructura de la pared celular de la semilla de uva.  Los resultados obtenidos utilizando espectroscopía de infrarrojo han sido confirmados mediante espectroscopía Raman. Dispersiones Raman asociadas a componentes de la pared celular muestran relación con la extractabilidad de compuestos fenólicos. CAPÍTULO 7 127 7 CAPÍTULO 7: RELACIÓN ENTRE ESPECTROSCOPÍA ATR–FTIR Y RAMAN CON LA EXTRACTABILIDAD DE COMPUESTOS FENÓLICOS Y OTROS ATRIBUTOS DE INTERÉS EN HOLLEJO DE UVA Nogales Bueno, Julio; Baca Bocanegra, Berta; Rooney, Abigail; Hernández Hierro, José Miguel; Heredia Mira, Francisco José; Byrne, Hugh J.: Linking ATR-FTIR and Raman features to phenolic extractability and other attributes in grape skin. Enviado a Talanta, ISSN 0039– 9140 (en revisión). 7.1 Antecedentes En la presente memoria se ha estudiado ampliamente la composición fenólica del hollejo de uva, haciéndose hincapié, en el Capítulo 5, en la importancia que tiene la facilidad con la que estos compuestos son cedidos al vino durante la vinificación. Los compuestos fenólicos presentes en el hollejo de uva aportan al vino cualidades organolépticas de gran importancia, de las cuales depende directamente su calidad (Crozier, et al., 2006; Rice-Evans, et al., 1997; Waterhouse, 2002). Es bien conocido que la extractabilidad de compuestos fenólicos en hollejo de uva depende significativamente de la madurez del fruto. A medida que aumenta el nivel de maduración de la uva, la degradación de la pared celular de los tejidos de la baya también es mayor y hay una mayor facilidad para que los compuestos fenólicos atraviesen o sean liberados por estas paredes celulares (Hernández-Hierro, et al., 2014; Ortega-Regules, Romero-Cascales, Ros-García, López-Roca y Gómez-Plaza, 2006; Quijada-Morín, et al., 2015; Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, et al., 2006). Se han correlacionado aumentos en el contenido de azúcar del mosto de la uva (indicador de madurez del fruto) con descensos en la cantidad de material en la pared celular del hollejo, galactosa, celulosa y manosa acompañado por una reducción del grado de esterificación de los polisacáridos pécticos o pectinas (Ortega-Regules, et al., 2008). Otro factor importante a la hora de estudiar la extractabilidad de compuestos fenólicos en hollejo de uva es que este presenta distintas capas de células anatómicamente distinguibles entre sí. Es necesario conocer como la estructura y composición de la pared celular cambia entre las distintas capas para entender las diferencias en extractabilidad que se puedan encontrar. La capa más externa, llamada cutícula, no contiene polifenoles y está compuesta principalmente por ácidos grasos hidroxilados, llamados cutinas, y cubierta por una capa de ceras hidrófobas. Seguidamente se encuentra la epidermis formada por una o dos capas de células dispuestas BLOQUE III 128 regularmente y por último la hipodermis, la capa más cercana a la pulpa y donde se encuentran la mayoría de los compuestos fenólicos presentes en el hollejo (Hidalgo Togores, 2010; Pinelo, et al., 2006). Por tanto, durante el proceso de vinificación, la etapa de estrujado tiene una gran influencia en la extractabilidad de compuestos fenólicos del hollejo de uva ya que un estrujado poco eficiente no generara suficiente contacto entre el mosto y la capa interna del hollejo de la uva (Asselin, et al., 2003). La composición de la pared celular del hollejo de uva ha sido relacionada con la extractabilidad de compuestos fenólicos (principalmente antocianos) utilizando espectroscopía en el infrarrojo medio (Femenia, Sánchez, Simal y Rosselló, 1998; Hernández-Hierro, et al., 2014). En estos estudios se relacionaron las características espectrales que aparecen en esta región del espectro con el grado de esterificación de las pectinas. Además, la composición de la pared celular de otras frutas ha sido ampliamente estudiada utilizando tanto espectroscopía en el infrarrojo como espectroscopía Raman (Gierlinger, Keplinger y Harrington, 2012; Kyomugasho, Christiaens, Shpigelman, Van Loey y Hendrickx, 2015). Ambas técnicas, que conforman la llamada espectroscopía vibracional, estudian las vibraciones que se dan en los enlaces moleculares desde dos puntos de vista complementarios. Mientras que las absorciones en el infrarrojo están asociadas a transiciones vibracionales que provocan cambios en el momento dipolar permanente del enlace, las dispersiones Raman solo se dan cuando el enlace sufre un cambio de polarizabilidad (momento dipolar inducido) debido a su transición vibracional (Byrne, et al., 2011; Peña, et al., 1989). Es, por tanto, de interés estudiar la relación existente entre la composición de la pared celular del hollejo de uva y la extractabilidad de compuestos fenólicos en estos hollejos mediante espectroscopía vibracional. 7.2 Objetivos En este trabajo se ha utilizado espectroscopía en el infrarrojo medio y Raman para estudiar la relación existente entre la composición de la pared celular y la extractabilidad de fenoles totales, flavanoles y antocianos en hollejo de uva tinta. Concretamente, los objetivos planteados fueron:  Agrupar muestras de uva tinta según la extractabilidad de fenoles totales, flavanoles y antocianos que presenten sus hollejos.  Caracterizar espectralmente muestras de material no extraíble de hollejo de uva tinta usando espectroscopía de infrarrojo mediante transformada de Fourier.  Vincular las características espectrales más importantes de las superficies externas e internas del hollejo con vibraciones fundamentales de enlaces presentes en las muestras. CAPÍTULO 7 129  Caracterizar espectralmente muestras de material no extraíble de hollejo de uva tinta usando espectroscopía Raman distinguiendo entre superficie externa e interna del hollejo.  Vincular las características espectrales más importantes de las superficies externas e internas del hollejo con vibraciones fundamentales de enlaces presentes en las muestras.  Estudiar la relación existente entre las diferentes características espectrales encontradas en el material no extraíble de los hollejos y los niveles de extractabilidad de fenoles totales, flavanoles y antocianos. 7.3 Parte experimental Este estudio se ha desarrollado utilizando la misma selección de muestras que se usó en el Capítulo 5. De forma breve, se recolectaron 200 uvas de las variedades Syrah y Tempranillo en el momento de la vendimia, se adquirieron los espectros medios de cada muestra mediante análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano y se aplicó un análisis de componentes principales (PCA) a la matriz formada por estos 200 espectros. Teniendo en cuenta la distancia de Mahalanobis a muestra vecina (𝑁𝐻), se crearon 34 grupos, agrupando entre sí las muestras con distancias 𝑁𝐻 menores a 0.6 y se seleccionó aleatoriamente una muestra de cada uno de estos grupos, obteniéndose un set de 34 muestras espectralmente representativo del conjunto de muestras recolectado. Cada una de las muestras seleccionadas fue sometida a una extracción en vino sintético durante un periodo de tres días, tras el cual se retiraron y se congelaron los sobrenadantes. El residuo sólido resultante fue liofilizado y sometido a una extracción exhaustiva en una disolución de metanol ácido (0.1% de HCl 12M). De nuevo, los sobrenadantes se alamcenaron a -20 ºC y el material no extraíble resultante se liofilizó y almacenó en desecador hasta la realización de las medidas espectrales. Para cada uno de los extractos obtenidos, ya fueran en vino sintético o en metanol, se determinaron los fenoles totales, los flavanoles y los antocianos extraídos. Los fenoles totales se determinaron siguiendo el método espectrofotométrico de Folin‒Ciocalteu (Singleton, et al., 1965) y los flavanoles mediante el método descrito por Vivas, et al. (1994). Para la determinación de los antocianos fue necesario evaporar previamente una alícuota del sobrenadante en fase metanólica y reconstituirla posteriormente con agua desionizada. La determinación de antocianos se realizó siguiendo una modificación del método cromatográfico descrito por García-Marino, et al. (2010). A partir de los contenidos en fenoles totales, flavanoles y antocianos de ambos sobrenadantes pudo calcularse la extractabilidad de estos compuestos para todas las muestras como la relación porcentual entre lo extraído en vino sintético y el total extraído como suma de ambos procesos. BLOQUE III 130 Seguidamente se realizó un agrupamiento de las muestras mediante el algoritmo de las K-medias a partir de la extractabilidad de fenoles totales, flavanoles y antocianos en 3 grupos que englobaban, respectivamente, las muestras con bajos, medios y altos niveles de extractabilidad para las tres variables tenidas en cuenta. En lo que sigue, las muestras permanecieron divididas en estas tres categorías. El material no extraíble obtenido tras las extracciones de los hollejos se analizó mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier utilizando un accesorio de reflexión total atenuada (ATR–FTIR). Se realizaron 6 medidas por muestra en la región del infrarrojo comprendida entre 600 y 4000 cm-1 (17000 y 2500 nm), adquiriendo 3 medidas en la superficie externa y otras 3 en la interna de cada muestra. Todos los espectros fueron pretratados mediante una corrección de los efectos multiplicativos de la dispersión (MSC). Posteriormente, se calculó el espectro medio para cada una de las superficies de cada muestra como el promedio de los 3 espectros adquiridos y se construyó la matriz espectral conteniendo los datos de infrarrojo. Se aplicó un PCA a esta matriz espectral el cual permitió identificar 3 outliers espectrales, tres espectros pertenecientes a superficies externas de las muestras que tenían una distancia de Mahalanobis (𝐻) a la media espectral del conjunto de muestras mayor de 3 unidades. Estas muestras fueron suprimidas de la matriz espectral y no se tuvieron en cuenta para el tratamiento de los datos de infrarrojo. El PCA permitió explicar el 99% de la variabilidad espectral del set de datos utilizando únicamente 6 componentes principales. Entre estos componentes principales, el primero, que explicaba un 93.82% de la variabilidad espectral, permitía separar completamente las muestras espectrales de ambas superficies del hollejo entre sí. Los espectros pertenecientes a la superficie interior de las muestras generaron puntuaciones negativas en este componente principal, mientras que los pertenecientes a la superficie exterior de las muestras generaban puntuaciones positivas. Por tanto, el 93.82% de la variabilidad espectral de las muestras es atribuible principalmente a las diferentes superficies medidas, confirmándose así lo diferentes que son entre sí la capa externa e interna del hollejo, algo apreciable cuando se observan los espectros a simple vista. Además, se comprobó que el peso (loading) del primer componente principal mostraba características remarcables en regiones espectrales donde típicamente aparecen las absorciones debidas a vibraciones fundamentales de enlaces presentes en tejidos bilógicos. Concretamente, estas características aparecen en zonas donde, según la bibliografía, aparecen las absorciones debidas a vibraciones fundamentales de enlaces presentes en pectinas, monosacáridos, polisacáridos, lípidos o ceras, siendo todos ellos componentes del hollejo de uva (Fasoli, Dell’Anna, Dal Santo, Balestrini, Sanson, Pezzotti, et al., 2016; Heredia-Guerrero, et al., 2014). En este peso están incluidas las características espectrales de las superficies externa e interna de las muestras. De hecho, se comprobó que el peso del primer componente principal representa la CAPÍTULO 7 131 diferencia entre ambas superficies, siendo muy similar al vector que se obtiene mediante la diferencia entre las medias espectrales de ambas superficies (peso ≈ media superficies externas – media superficies internas). Por tanto, los máximos y mínimos que aparecen en el peso del primer componente principal son responsables de las diferencias existentes entre la superficie externa del hollejo, cutícula, y la superficie interna, hipodermis. El estudio pormenorizado de asignación de estos valores extremos presentes en el peso indicó que la proporción de polisacáridos es mayor en la superficie interna del hollejo, que el material alifático (cutina, cutano y ceras), como era de esperar, solo está presente en la superficie externa del hollejo y que el grado de esterificación de las pectinas es aparentemente mayor en la superficie externa del hollejo. En definitiva, la mayor presencia de polisacáridos y la menor esterificación de las pectinas que presenta la hipodermis puede hacer que la extractabilidad de compuestos fenólicos sea mayor en esta capa que en la capa externa recubierta de materiales hidrófobos. En el PCA no se encontraron tendencias entre las muestras de distintas variedades o con distintos niveles de extractabilidad. Para determinar si algunas de las características que presentan los espectros tenían relación con el nivel de extractabilidad de compuestos fenólicos de las distintas muestras se realizó un análisis de la varianza (ANOVA). Para la realización de este análisis se utilizaron como variables dependientes las alturas de los diferentes picos que aparecen en los espectros, es decir, la intensidad de cada uno de los máximos correspondientes a absorciones debidas a vibraciones fundamentales de los enlaces presentes en las muestras. Se tuvieron en cuenta, respectivamente, 10 y 8 picos para los espectros de las superficies externas e internas del material no extraíble de hollejo de uva. No se encontraron diferencias significativas para ninguno de los picos pertenecientes a los espectros de la superficie externa del hollejo. Sin embargo, sí se encontraron diferencias significativas (𝑝 < 0.05) entre las muestras con baja extractabilidad y el resto para 3 picos pertenecientes a la cara interna de las muestras. Estos picos están relacionados con la presencia de polisacáridos y con el grado de esterificación de las pectinas (Fasoli, et al., 2016; Heredia-Guerrero, et al., 2014). Por lo que estos resultados reafirman que la cantidad de polisacáridos y el grado de esterificación de las pectinas influyen significativamente en la extractabilidad de compuestos fenólicos en hollejo de uva. No obstante, esta evidencia solo ha podido encontrarse en la superficie interna del hollejo, probablemente debido a las características de la cara externa, la cutícula, con ausencia de compuestos fenólicos. Para confirmar y consolidar los resultados obtenidos mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier, se adquirieron los espectros Raman de algunas de las muestras de material no extraíble de hollejo de uva. Para realizar estas medidas se seleccionaron muestras de diferentes variedades y con diferentes niveles de extractabilidad de compuestos fenólicos. Los espectros Raman se adquirieron excitando las muestras con un láser a 785 nm y recogiendo el BLOQUE III 132 espectro obtenido desde 400 a 3500 cm-1. Para reducir los fenómenos de fluorescencia, las medidas fueron adquiridas bajo inmersión en agua. Se adquirieron tres espectros en cada superficie de las muestras que, seguidamente, se sometieron a una eliminación de la línea base, pudiéndose detectar 6 máximos o picos pertenecientes a dispersiones Raman. Se midieron las alturas de estos picos y se usaron como variables para realizar un PCA. De nuevo, las diferencias espectrales entre ambas superficies del hollejo de uva se pusieron de manifiesto mediante este análisis, aunque de forma menos acusada que en el caso de los espectros en el infrarrojo. En este caso, fueron los dos primeros componentes principales los que contenían la variabilidad espectral en la que se engloban las diferencias entre ambas superficies. Además se aplicó una análisis ANOVA para comprobar si había diferencias significativas (𝑝 < 0.05) en los distintos picos que explicaran los distintos niveles de extractabilidad de las muestras. De nuevo se encontraron diferencias significativas para los espectros pertenecientes a la superficie interna del material no extraíble del hollejo para 3 de los picos analizados, los cuales son debidos a dispersiones Raman de enlaces presentes en celulosa y otros polisacáridos así como en anillos aromáticos de compuestos fenólicos. Con lo que se confirma la influencia en la extractabilidad de compuestos fenólicos de la presencia de polisacáridos en la muestra, principalmente en la superficie interna del hollejo. 7.4 Conclusiones  La espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier ha probado ser una técnica efectiva y fiable para relacionar las características espectrales más importantes con el nivel de extractabilidad de fenoles totales, flavanoles y antocianos en hollejo de uva.  La espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier permite identificar las diferencias estructurales existentes entre las superficies externas e internas del hollejo de uva.  El análisis de los datos obtenidos mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier permite confirmar que la extractabilidad de compuestos fenólicos está influenciada por la concentración de polisacáridos así como por el grado de esterificación de las pectinas.  La espectroscopía Raman confirma estos resultados, ya que se han encontrado diferencias significativas entre los distintos niveles de extractabilidad de compuestos fenólicos relacionados con la concentración de polisacáridos.  Se han encontrado grandes diferencias espectrales entre ambas superficies del hollejo de uva en ambas técnicas. CAPÍTULO 8 133 8 CAPÍTULO 8: INFLUENCIA DE LA ADICIÓN DE EXTRACTO DE SEMILLA DE UVA BLANCA EN LA EXTRACCIÓN DE ANTOCIANOS EN HOLLEJO DE UVA PREVIAMENTE CARACTERIZADOS MEDIANTE ANÁLISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL. Nogales Bueno, Julio; Baca Bocanegra, Berta; Jara Palacios, María José; Hernández Hierro, José Miguel; Heredia Mira, Francisco José: Evaluation of the influence of white grape seed extracts as copigment sources on the anthocyanin extraction from grape skins previously classified by near infrared hyperspectral tools. En: Food Chemistry 2017. Pag. 1685-1690, ISSN 0308−8146. 8.1 Antecedentes El color del vino depende fundamentalmente de la concentración de antocianos disueltos en él. Durante el proceso de vinificación, parte de los antocianos presentes en el hollejo de uva pasan al vino confiriéndole su característico color. Sin embargo, pueden producirse modificaciones en el color del vino debidas a distintas variables como puede ser la acidez del vino, la concentración de SO2 o la concentración de copigmentos presente (Ribéreau-Gayon, Glories, Maujean y Dubourdieu, 2006). Entre estas variables tanto la acidez como la concentración de SO2 suelen estar fijadas por consideraciones de origen tecnológico o sensorial, sin embargo, el contenido en copigmentos puede ser modificado con el objetivo de modular el color del vino. Actualmente, el proceso de copigmentación se encuentra bien descrito. Consiste en la formación, en disolución, de asociaciones moleculares o complejos entre pigmentos y otros compuestos orgánicos no coloreados. Como resultado, se producen incrementos de la absorción o desplazamientos de la longitud de onda a la que se produce la máxima absorción de la disolución (Boulton, 2001). Se han realizado numerosos estudios que demuestran que la adición de copigmentos al vino produce mejoras en sus características cromáticas y en la estabilización de este color (González-Manzano, Dueñas, Rivas-Gonzalo, Escribano-Bailón y Santos-Buelga, 2009; Gordillo, Rodríguez-Pulido, González-Miret, Quijada-Morín, Rivas-Gonzalo, García- Estévez, et al., 2015). Entre estos copigmentos, los flavanoles presentan un buen potencial para la copigmentación (Gordillo, Rodríguez-Pulido, Escudero-Gilete, González-Miret y Heredia, 2012). Por tanto, algunos subproductos de vinificación, ricos en compuestos flavanólicos, como BLOQUE III 134 puede ser las semillas de uva blanca, son potenciales fuentes de aporte de copigmentos para usar en vinificación. Sin embargo, la adición de copigmentos con el objetivo de mejorar o estabilizar el color del vino puede tener también una serie de inconvenientes. El copigmento puede aportar excesivo amargor o astringencia al vino. Además, es posible que la matriz en la que se añade el copigmento absorba pigmentos antociánicos o incluso que la presencia del copigmento en la disolución pueda perjudicar el equilibrio de extracción de antocianos durante la vinificación, consiguiéndose así un efecto contrario al deseado. Por esto, es de gran interés estudiar el efecto que tiene la adición de copigmentos sobre la extracción de los compuestos antociánicos del hollejo de uva. 8.2 Objetivos El principal objetivo de este estudio ha sido conocer el efecto que tiene la adición de extractos de semilla de uva como fuente de copigmentos en la extracción de compuestos antociánicos en hollejo de uva tinta. Concretamente, los objetivos planteados fueron:  Confirmar el potencial del análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano para la estimación del contenido extraíble de compuestos antociánicos en hollejo de uva.  Identificar muestras de uva con bajo contenido extraíble de compuestos antociánicos, susceptibles de la aplicación de medidas para la mejora del color de un hipotético vino producido a partir de ellas.  Obtener y caracterizar extractos de semilla de uva blanca, subproductos de vinificación, para su uso como fuentes de copigmentos.  Evaluar la influencia de la adición de extractos de semilla de uva blanca como fuente de copigmentos en la extracción de antocianos en hollejo de uva con diferente contenido extraíble predicho. 8.3 Parte experimental Las muestras utilizadas en el presente estudio forman parte de las descritas en el Capítulo 5 de la presente memoria. Se recolectaron 200 muestras de las variedades tintas Syrah y Tempranillo, de las cuales, tras una selección mediante análisis de imagen hiperespectral, solo se utilizaron 34 muestras para realizar la calibración de los modelos y 21 para la posterior validación. CAPÍTULO 8 135 Las muestras pertenecen al mismo espacio espectral que las que fueron utilizadas para el modelado, con lo que es válido aplicar el modelo a estas muestras para predecir el contenido extraíble de antocianos. Una vez conocido el contenido extraíble predicho de antocianos, las muestras de cada variedad fueron ordenadas de menor a mayor contenido extraíble predicho de antocianos y se separaron en tres grupos, bajo, medio o alto contenido extraíble predicho. Finalmente se seleccionaron aleatoriamente 2 muestras de cada grupo, obteniéndose un total de 12 muestras (2 variedades  3 grupos  2 muestras). Seguidamente, cada uno de los hollejos seleccionados se dividió en tres partes aproximadamente iguales, y se maceraron de forma individual durante un periodo de 3 días en vino sintético, manteniendo constante la relación de volumen de disolvente respecto al peso de muestra. Para estudiar la influencia que pudieran tener los copigmentos provenientes de semilla de uva blanca en la extracción de antocianos en hollejo de uva tinta, cada una de las extracciones realizadas con cada parte de hollejo se llevó a cabo en presencia de una concentración distinta de copigmentos provenientes de semilla de uva blanca. Se usó la concentración de fenoles totales para controlar la concentración de copigmentos en el vino sintético elaborado, utilizando concentraciones de 0, 0.1 y 0.2 g/L, expresados como equivalentes de ácido gálico, para realizar las respectivas extracciones de cada hollejo. Para conseguir estas concentraciones de copigmento, de forma previa se maceraron semillas de uva blanca en el vino sintético durante tres días. Estas semillas habían sido previamente caracterizadas por M. José Jara-Palacios, Gordillo, González-Miret, Hernanz, Escudero-Gilete y Heredia (2014), con lo que es conocida la cantidad y tipología de los copigmentos utilizados, siendo la mayoría de ellos flavanoles. Cada uno de los sobrenadantes obtenidos de las extracciones realizadas a los hollejos fue analizado mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) para determinar la cantidad de antocianos extraída, siguiendo una modificación del método descrito por García-Marino, et al. (2010). Se identificaron hasta 15 antocianos que, tanto de forma individual como por familias, fueron utilizados para la realización de dos objetivos: comprobar, mediante análisis de imagen hiperespectral, la bondad del modelo utilizado para la predicción del contenido extraíble de antocianos totales en las muestras y comprobar si la presencia de copigmentos interfiere en la extracción de antocianos en estas muestras. Para comprobar la bondad del modelo de calibración desarrollado en el Capítulo 5 para predecir el contenido extraíble de antocianos en hollejo de uva se utilizaron únicamente las submuestras maceradas en vino sintético con ausencia de copigmentos. De esta forma se reprodujeron, en la medida de lo posible, las condiciones utilizadas para el modelado. Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) utilizando los contenidos extraíbles obtenidos mediante