Aceite de orujo de oliva refinado. Nueva materia prima para formulaciones dermatológicas

i ! ! ! ! ! ! ACEITE!DE!ORUJO!DE!OLIVA!REFINADO.!! NUEVA!MATERIA!PRIMA!PARA! FORMULACIONES!DERMATOLÓGICAS! ! ! ! ! ! Tesis!Doctoral!realizada!por:! Carla!Andrea!Sánchez!Gutiérrez! Sevilla,!2017! FACULTAD!DE!FARMACIA! DEPARTAMENTO!DE!FARMACIA!Y!TECNOLOGÍA!FARMACÉUTICA! ii ! ! ! ! ! ! iii ! ! ! ! ! ! Memoria!presentada!por!Doña!Carla!Andrea!Sánchez!Gutiérrez! para!optar!al!Grado!de!Doctor!en!Farmacia!por!la!Universidad!de! Sevilla.! ! ! ! Fdo.:!Carla!Andrea!Sánchez!Gutiérrez! ! Vº!Bº!Las!directoras!de!la!Tesis!Doctoral! ! ! ! ! Fdo.:!Prof.!Dra.!Mª!Jesús!Lucero!Muñoz!!!!!!!!!!!Fdo.:!Dra.!Mª!Victoria!Ruiz!Méndez! Prof.!Titular!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Científica!Titular!! Facultad!de!Farmacia!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Instituto!de!la!Grasa.!CSIC! Universidad!de!Sevilla! FACULTAD!DE!FARMACIA! DEPARTAMENTO!DE!FARMACIA!Y!TECNOLOGÍA!FARMACÉUTICA! iv ! ! v ! ! ! MARIA!JESÚS!LUCERO!MUÑOZ,!Profesora!Titular!de!la!Facultad!de! Farmacia! de! la! Universidad! de! Sevilla,! y! MARÍA! VICTORIA! RUIZ! MÉNDEZ,!Científica!Titular!del!Consejo!Superior!de!Investigaciones! Científicas!(CSIC)!de!Sevilla! ! CERTIFICAN:! Que!la!memoria!para!optar!al!grado!de!Doctor,!realizada!por!la! Licenciada! Dña.! Carla! Andrea! Sánchez! Gutiérrez,! cuyo! título! es! “Aceite! de! orujo! de! oliva! refinado.! Nueva! materia! prima! para! formulaciones! dermatológicas”,! ha! sido! realizada! bajo! nuestra! dirección! y,! reúne! los! requisitos! necesarios! para! su! defensa! y! calificación.!! ! Para!que!conste!firmamos!el!presente!en!Sevilla,!a!!marzo!de! dos!mil!diecisiete.! ! ! ! Mª!Jesús!Lucero!Muñoz!!!Mª!Victoria!Ruiz!Méndez! FACULTAD!DE!FARMACIA! DEPARTAMENTO!DE!FARMACIA!Y!TECNOLOGÍA!FARMACÉUTICA! vi ! ! vii ! ! ! Dª! María! Luisa! González! Rodríguez,!Profesora! Titular! de! Universidad! y! Directora! del! Departamento! de! Farmacia! y! Tecnología! Farmacéutica! de! la! Facultad! de! Farmacia! de! la! Universidad!de!Sevilla,! ! CERTIFICA:! Que!la!Tesis!Doctoral!elaborada!por!la!Licenciada!en!Farmacia! Dª! Carla! Andrea! Sánchez! Gutiérrez,! ha! sido! dirigida! por! la! Dra.! María! Jesús! Lucero! Muñoz! y! la! Dra.! María! Victoria! Ruiz! Méndez,! habiéndose!realizado!en!el!Departamento!de!Farmacia!y!Tecnología! Farmacéutica,!cumpliendo!todas!las!normas!vigentes.! ! Para!que!conste,!y!a!petición!de!la!interesada,!firmo!el!presente! en!Sevilla,!a!marzo!de!dos!mil!diecisiete.! ! ! ! ! Dª!María!Luisa!González!Rodríguez! FACULTAD!DE!FARMACIA! DEPARTAMENTO!DE!FARMACIA!Y!TECNOLOGÍA!FARMACÉUTICA! viii ! ! ! ix AGRADECIMIENTOS! ! Quisiera! agradecer! de! todo! corazón! por! el! desarrollo! de! esta! Tesis!Doctoral! A!mis! directoras! de! Tesis!la!Dra.!Mª! Jesús! Lucero! Muñoz! y! la! Dra.! Mª! Victoria!Ruiz! Méndez! por! haber! confiado! en! mi,! sus! consejos! y! sobre! todo,! porque! con! ellas! he! crecido! no! solo! profesionalmente!sino!también!como!persona,!aportándome!cada! una!de!ellas!unos!valores,!con!los!cuales!he!aprendido!a!afrontar!los! obstáculos!de!la!vida!y!confiar!en!que!puedo!conseguir!todos!mis! objetivos.!! A!la!Dra.!Mª!Rosa!Jiménez-Castellanos!Ballesteros!por!haberse! involucrado!en!esta! Tesis,!por!su!ayuda!durante!toda!esta!etapa,! por! escucharme,! aconsejarme! y! darme! fuerzas! para! afrontar! los! duros!momentos.! A!mis!compañeros!de!laboratorio!tanto!del!Instituto!de!la!Grasa! (CSIC)!en!especial!a!Irene,!Pablo!y!Arturo!como!del!departamento! de!Farmacia!y!Tecnología!Farmacéutica!de!la!Facultad!de!Farmacia,! en! especial! a! Paloma!y! César,! por! escucharme,! apoyarme! y! compartir!risas!y!alegrías.!! A! las! empresas! Oleícola! El! Tejar! ! SCA,! Gattefossé,! Evonic! Industries,! Industrial! Química! y! Clariant! International! por! facilitarme!las!muestras!e!ingredientes!necesarios!para!el!desarrollo! de!las!fórmulas!de!esta!Tesis.! INTRODUCCIÓN GENERAL 4 (110.000! toneladas)! o! Túnez! (100.000! toneladas).! La! producción! media! mundial! desde! la! campaña!de! 2010! asciende! a! 2.708.900! toneladas,! de! las! cuales! 1.275.100! se! produjeron! en! España,! es! decir,!el!62,2%!del!total.! En!la!campaña!2016-2017!la!producción!nacional!de!aceituna!de! mesa!fue!de!745.040!toneladas!(Agencia!de!Información!y!Control! Alimentarios,! AICA),! alcanzando! en! Andalucía! un! total! de! 590.595,15! toneladas,! lo! que! supone! el! 79%! de! la! producción! nacional.!En!este!sentido,!Sevilla!con!451.700!toneladas,!seguida!de! Córdoba!con!82.660!y!Málaga!con!49.939,!fueron!las!provincias!con! mayor!producción.! En!la!actualidad,!de!todos!los!procesos!del!olivar!y!del!aceite,!el! único!residuo!que!no!se!aprovecha!es!la!aceituna!no!recogida.!El! resto!de!subproductos!(hojín,!alperujo,!alpechín,!hueso!y!orujos)!se! reutiliza!para!algún!fin.!! El! hojín,! restos! de! hojas! y! ramas! finas,! se! genera! como! resultado!de!la!limpieza!de!la!aceituna!antes!de!su!procesado.!Se!ha! utilizado! tradicionalmente! para! alimentación! animal! y,! más! recientemente,! para! producir! “compost”! (abono! natural! para! la! tierra)! junto! con! otros! residuos! orgánicos.! Sin! embargo,! en! una! buena! parte! de! los! casos! constituye! un! residuo! del! que! su! productor! se! tiene! que! deshacer.! Actualmente,! se! está! promoviendo!su!uso!en!plantas!de!generación!eléctrica!a!partir!de! biomasa,!si!bien!su!contenido!en!humedad,!en!torno!al!40%!supone! INTRODUCCIÓN GENERAL 5 un! inconveniente! para! su! uso! energético.! Su! poder! calorífico! se! encuentra!en!torno!a!4.378!kcal/kg!de!materia!seca!(Comas,!2012).! Las! hojas! de! olivo!se! consideran! como! una! materia! prima! barata.!Históricamente,!se!han!utilizado!como!un!remedio!popular! para!combatir!enfermedades,!como!la!malaria!(Khalil!y!col.,!2014).! Más! recientemente,! García! y! col.! (2000)! demostraron! que! el! extracto! de! hoja! de! olivo!tiene! la! capacidad! de! bajar! la! presión! arterial!en!animales!y!aumentar!el!flujo!sanguíneo!en!las!arterias! coronarias,! aliviar! la! arrítmia! y! prevenir! espasmos! musculares! intestinales.! ! Micol! y! col.! (2005)! señalan! la! actividad! antiviral! del! extracto! obtenido! de! las! hojas! del! olivo,! Bouaziz! y! col.! (2008)! evidencian! sus! efectos! antioxidantes! y! Furneri! y! col.! (2002)! su! actividad!antimicrobiana.!! El!alperujo!es!un!subproducto!de!las!almazaras!que!se!genera! durante!la!extracción!de!aceite!de!oliva!por!el!sistema!de!dos!fases.! Se!define!como!todo!aquello!que!resta!de!la!aceituna!molturada!si! se! elimina! el! aceite! de! oliva! (Ministerio! de! Medio! Ambiente! y! Medio! Rural! Marino).! Presenta! una! parte! sólida,! el! orujo,! y! otra! líquida,! el! alpechín,! las! cuales! pueden! ser! separadas! para! su! aprovechamiento!o!bien!se!pueden!utilizar!directamente!(Nunes!y! col.,! 2016).! En! el! caso! del! aprovechamiento! del! alperujo,! este! puede!ser!empleado!en!alimentación!animal.!Otras!alternativas,!a! la! solución! del! problema! que! plantea! el! alperujo,! son! su! uso! en! técnicas!de!cogeneración!energética!o!como!fertilizante!de!suelos! INTRODUCCIÓN GENERAL 6 agrícolas!tras!su!conversión!en!“compost”.!La!normativa!a!la!que! está!sujeta! la! producción! de! alperujo! es! tanto!comunitaria! como! nacional!(Reglamento!834/07!y!el!889/08;!Real!Decreto!824/2005,! de!8!de!julio;!Orden,!de!20!de!julio!de!2007).!Otro!aprovechamiento! interesante!del!alperujo!es!la!producción!de!bioplásticos!(Cerrone,! 2011).!Así,!por!ejemplo,!los!polihidroxi-alcanoatos!(PHAs)!se!usan! como!material!para!fabricar!envases!de!productos!farmacéuticos,! para! la! obtención! de! microcápsulas! o! nanocápsulas,!o! por! su! utilidad! en! ingeniería! tisular! (Ramos! Comerzana! y! Monteoliva! Sanchez,!2000).!! El!alpechín!se!caracteriza!por!ser!un!líquido!acuoso,!maloliente,! poco! biodegradable! y! muy! contaminante,! tanto! por! su! elevada! carga!orgánica!como!por!su!contenido!graso.!Está!compuesto!por!el! agua!de!constitución!de!la!aceituna,!el!agua!adicionada!de!lavado!y! un!porcentaje!variable!de!sólido.!Actualmente!y!tras!su!depuración! se! le! está! dando! utilidad! como! fuente! de! calor! y! electricidad! (Comisión!Europea,!CORDIS),!como!fertilizante!(Pozzi!y!col.,!2010).! También! pude! emplearse! para! obtener! levaduras! y! como! componente! en! la! elaboración! de! biocombustibles! (Grupo! Prof.! Jiménez-Sanchidrián).! El!hueso!generado!en!los!procesos!de!obtención!de!aceite!de! oliva!es!un!combustible!muy!adecuado!para!usos!térmicos,!debido! a!su!reducida!humedad!y!elevado!poder!calorífico.!Por!otra!parte,! Fernández-Bolaños! y! col.! (1990)! lo! proponen! como! fuente! de! INTRODUCCIÓN GENERAL 7 material!lignocelulósico.!El!hueso,!como!subproducto!del!proceso! de!elaboración!del!aceite!de!oliva,!también!puede!destinarse!a!usos! cosméticos,!al!poder!ser!empleado!en!la!elaboración!de!productos! exfoliantes! destinados! a! la! regeneración! celular! de! la! piel! por! eliminación!de! las! capas! superficiales! compuestas! por! células! muertas.!También!se!ha!propuesto!su!uso!para!eliminar!el!hierro! del!agua!usando!filtros!de!hueso!de!aceituna!(Alami,!2010).! El! orujo!es! el! residuo! sólido! obtenido! durante! el! proceso! de! extracción! mecánica! del! aceite! de! oliva! virgen! extra! (EVOO,! se! corresponde! con! la! denominación! en! inglés).! Esta! constituido! principalmente! del! residuo! sólido! de! la! pulpa,! la! piel! y! el! hueso,! semilla! de! las! aceitunas,! el! aceite! retenido! en! dichos! residuos! sólidos! y! agua! (Alba! Mendoza,! 1995;! Sánchez-Moral! y! RuizMéndez,!2006).!! Rodrigues! y! col.! (2015),! realizaron! una! excelente! revisión! del! aprovechamiento! de! estos! subproductos! para! la! obtención! de! compuestos! bioactivos! ! de! interés! en! el! cuidado! de! la! piel! y! cosméticos.! Con!respecto!al!aceite,!actualmente!hay!dos!tipos!de!aceites!de! orujo! de! oliva! (OPOC)!en! el! mercado,! dependiendo! del! procedimiento!utilizado!en!su!extracción,!es!decir,!centrifugación!o! extracción!(Sánchez-Moral!y!Ruiz-Méndez,!2006).!! Los! procedimientos! de! extracción! pueden! ser! químicos! y! mecánicos.! El! proceso! tradicional! de! extracción! del! OPOC! es! INTRODUCCIÓN GENERAL 8 utilizando! hexano,! un! hidrocarburo! ligero! derivado! del! petróleo,! inmiscible! con! agua.! ! Sin! embargo,! si! los! OPOCs! se! extraen! siguiendo! el! método! tradicional! tiene! dos! inconvenientes! importantes.! El! primero,! que! los! aceites! extraídos! tienen! una! mayor! cantidad! de! fosfolípidos,! ceras! y! una! gran! cantidad! de! compuestos! anómalos,! tales! como! jabones! y! esteres! etílicos.! En! segundo!lugar,!es!necesario!realizar!un!secado!posterior!del!orujo!a! muy! altas! temperaturas,! por! lo! que,! debido! a! estas! condiciones! drásticas,! los! OPOCs! obtenidos! contienen! altas! cantidades! de! hidrocarburos!aromáticos!policíclicos!no!usuales!(León-Camacho!y! col.,!2003).! Con!objeto!de!prevenir!y/o!reducir!la!presencia!de!todos!estos! componentes! en! los! OPOCs,! Artacho! (1994)! propuso! un! método! alternativo!al!uso!del!solvente,!el!cual!también!previene!el!secado! del! orujo.! Este! método! alternativo! consiste! en! una! segunda! centrifugación,! después! de! la! separación! inicial! de! EVOO.! La! principal!ventaja!resultante!de!esta!extracción!mecánica!es!que!el! OPOC! contiene! altas! cantidades! de! compuestos! bioactivos! y! funcionales!de!enorme!interés!farmacéutico!y!cosmético.!Además,! estos!OPOCs!presentan!mínimas!cantidades!de!PAHs!y!fosfolípidos,! dado!que!no!se!usan!en!el!proceso!de!producción,!ni!solventes,!ni! etapa!de!secado!posterior.! En!los!últimos!años,!el!interés!del!aceite!de!orujo!de!oliva!ha! crecido!enormemente!debido!a!que,!además!de!poseer!todos!los! INTRODUCCIÓN GENERAL 9 componentes! funcionales! del! EVOO,! contiene! una! mayor! concentración! de! algunos! componentes! bioactivos! presentes! en! menor! cantidad! y! que! poseen! interesantes! propiedades! para! la! salud! (Pérez-Camino! y! Cert,! 1999).! Entre! ellos! cabe! destacar,! de! mayor!a!menor!concentración:!! a) Triacilgliceroles.!Componente!principal!(>!95%).! b) Ácidos!grasos.!Oleico,!usado!en!formulaciones!farmacéuticas! y! cosméticas;! y! linoleico! y! linolénico,! implicados! en! procesos! metabólicos!de!la!piel,!promotores!de!la!formación!de!ceramidas! (Rabionet! y! col.,! 2014)! y! de! la! actividad! de! las! vitaminas! A! y! E! (Rabasco!y!González,!2000).! c) Ácidos!triterpénicos.!Destacando!maslínico!y!oleanólico!con! actividades! antimicrobiana! y! antihiperglucémica! (Horiuchi! y! col.,! 2007;! Sato! y! col.,! 2007)! y! actividades! antitumorales! y! antiinflamatorias!(Márquez-Martín!y!col.,!2006;!Braga!y!col.,!2007;! Martín! y! col.,! 2007;!Sun! y! col.,! 2015).!Ya! que! éstos! últimos! compuestos! se! encuentran! en! la! piel! de! la! aceituna,! no! se! presentan!en!cantidades!apreciables!en!el!EVOO!(Pérez-Camino!y! Cert,!1999).! d) Materia!insaponificable.!Está!constituida!por:!! a. Escualeno.! Es! uno! de! los! mejores! emolientes! naturales! que!posee! propiedades! antioxidantes! debido! a! su! estructura! isopreno! (Reddy! y! Couvreur,! 2009)! y,! además,! incrementa! la! hidratación! de! la! piel,! disminuyendo! la! pérdida! de! INTRODUCCIÓN GENERAL 10 agua!(Huang!y!col.,!2009).!! b. Alcoholes! alifáticos.! Impiden! la! liberación! de! varios! mediadores!inflamatorios!(Fernández-Arche!y!col.,!2009).! c. Esteroles! y! alcoholes! terpénicos,! entre! ellos! el! eritrodiol! y!el! uvaol.! Tienen! efectos! positivos! en! los! procesos! inflamatorios!(Márquez-Martín!y!col.,!2006).!! Sin!embargo,!debido!a!la!alta!acidez!del!OPOC,!éste!no!puede! ser!utilizado!como!tal!en!el!campo!farmacéutico.!Esta!es!la!razón! por! la! que! tiene! que! someterse! a! un! proceso! de! refinado! para! eliminar!los!componentes!menores!o!compuestos!que!afectan!a!la! estabilidad! del! aceite! (De! Greyt! y! Kellens,! 2000),! intentando! al! mismo! tiempo! que! haya! las! pérdidas! más! pequeñas! de! los! compuestos!bioactivos!(Ruiz-Méndez!y!col,!2013).!! Existen!dos!tipos!de!refinado:!el!químico!(Q)!y!el!físico!(F).!en!la! actualidad,!el!proceso!de!refinado!químico!es!el!método!común!de! refinado! de! los! OPOCs.! Se! lleva! a! cabo! en! varias! etapas:! desgomado,! neutralización,! winterización,! decoloración! y! desodorización! (Antonopoulos! y! col.,! 2006).! El! principal! inconveniente!del!refinado!químico!es!la!etapa!de!neutralización!ya! que!al!ser!necesario!usar!sosa!caustica,!ésta!elimina,!además!de!los! ácidos! grasos! libres,! los! compuestos! bioactivos,! como! ácidos! triterpénicos,!presentes!en!el!aceite!(Servege,!1983).! Es! por! ello! que,! Ruiz-Méndez! y! col.! ! (2010)! propusieron! los! procedimientos! de! refinado! físicos! ya! que! las! pérdidas! de! INTRODUCCIÓN GENERAL 11 compuestos! bioactivos! son! mínimas.! En! el! refinado! físico,! los! aceites! vegetales! pueden! ser! neutralizados! por! destilación! de! ácidos! grasos! libres! a! altas! temperaturas,! bajas! presiones! y! con! corriente! de! vapor.! Esto! permite! mantener! en! el! aceite! desodorizado!(OPOD)!los!compuestos!bioactivos!de!baja!volatilidad! y! de! ese! modo! obtener! aceite! con! gran! interés! farmacéutico! y! cosmético.! Sin! embargo,! el! refinado! físico! solo! se! puede! aplicar! después!de!la!extracción!mecánica,!debido!a!que!el!OPOC!obtenido! por!extracción!química!tiene!alto!contenido!en!clorofila,!fosfátidos,! carotenos!y!otros!contaminantes,!los!cuales!no!se!pueden!eliminar! por!simples!medios!físicos!(Amelotti,!1987).! ! Enfermedades!inflamatorias!crónicas!de!la!piel! Las!enfermedades!inflamatorias!crónicas!de!la!piel!constituyen! un! grupo! importante! de! afecciones! dermatológicas,! siendo! de! naturaleza! y! características! muy! diferentes.! Las! que! más! prevalencia! tienen! en! la! población! son:! la! psoriasis,! la! dermatitis! atópica,!la!dermatitis!seborreica,!la!xerosis!y!la!dermatitis!alérgica! de!contacto.!! !!!La! psoriasis!es! una! enfermedad! común! de! la! piel,! crónica,! recidivante!y!caracterizada!por!la!participación!predominante!de!la! piel,!las!uñas!y!las!articulaciones!(El-Gharabawy!y!col.,!2017).!!Se! considera! una! enfermedad! inflamatoria! crónica,! mediada! por! el! sistema!inmunitario!de!la!piel,!si!bien!estudios!recientes!sobre!su! INTRODUCCIÓN GENERAL 12 fisiopatología! han! desplazado! la! idea! de! que! la! psoriasis! es! una! "enfermedad! de! la! piel"! por! la! de! una! "enfermedad! sistémica! mediada!por!células!T"!(El-Gharabawy!y!col.,!2017).!Presenta!una! prevalencia! del! 0,2-2%! dependiendo! de! la!población! de! origen! (Parisi! et! al.,! 2013),! aceptándose! una! serie! de! factores! de! riesgo! como:!antecedentes!familiares!y!ambientales,!tabaquismo,!estrés,! obesidad!y!consumo!de!alcohol!(Huerta!et!al.,!2007).!Los!síntomas! que! presentan! varían! desde! la! aparición! de! pocas! escamas! dispersas! de! color! rojo! hasta! placas! en! casi! toda! la! superficie! corporal.!El!grado!de!gravedad!depende!de!factores!hereditarios!y! ambientales,! y! puede! empeorar! progresivamente! con! la! edad! (Lebwohl,! 2003).! La! psoriasis! causa! considerable!discapacidad! psicosocial! y! tiene! un! gran! impacto! en! la! calidad! de! vida! de! los! pacientes! (Feldman! y! col.,! 1997;! Rapp! y! col.,! 1999),! asociándose! incluso! con! enfermedades! depresivas,! cardiovasculares! y! una! artritis! seronegativa! conocida! como! artritis! psoriásica! (Griffiths! y! Barker,! 2007).! Por! todo! ello,! el! costo! es! alto! tanto! para! los! pacientes! como! para! los! sistemas! de! salud! (Javitz! y! col.,! 2002),! haciéndose! incluso! eco! de! ello! muy! recientemente! la! prensa! (Emergen!Andalucía,!2016).!! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN GENERAL 13 ! !!! ! ! ! ! Figura!1.-!Ejemplo!de!psoriasis! ! !La! dermatitis! atópica!(DA)! (también! conocida! como! eczema! atópico)!es!una!enfermedad!inflamatoria!crónica!de!la!piel!que!se! caracteriza!por!prurito!intenso!y!lesiones!eczematosas!recurrentes! (Levy! et! al.,! 2015).! Aunque! a! menudo! comienza! en! la! infancia! y! afecta!a!2!de!cada!10!niños,!también!es!muy!frecuente!en!adultos.! Es!la!principal!carga!de!salud!no!mortal!atribuible!a!enfermedades! de! la! piel,! ya! que! inflige! una! carga! psicosocial! sustancial! en! los! pacientes!y!en!sus!familiares,!y!aumenta!el!riesgo!de!alergia!a!los! alimentos,!asma,!rinitis!alérgica,!otras!enfermedades!inflamatorias! inmunitarias! y! trastornos! de! salud! mental! (Weidinger! y! Novak,! 2016).! La! etiopatogenia! de! la! DA! no! es! del! todo! conocida! (Engebretsen! y! col.,! 2016).! Además! de! factores! genéticos,! los! de! estrés! exógenos! de! la! piel! pueden! comprometer! la! función! de! barrera! de! la!piel! y! aumentar! el! riesgo! de! DA.! Por! ejemplo,! las! condiciones! climáticas! tales! como! baja! humedad! ambiental,! baja! temperatura! y! una! reducción! de! la! radiación! ultravioleta! (UV)! afectan!negativamente!a!la!barrera!cutánea!y!aumentan!el!riesgo! INTRODUCCIÓN GENERAL 20 aprovechar-todo-lo-que-genera.html! (Consultado! en! febrero! 2017).! Comisión!Europea.!Servicio!de!Información!Comunitario!sobre! Investigación! y! Desarrollo! (CORDIS).! Los! alpechines:! de! residuo! a! combustible! en! beneficio! de! las! economías! rurales.! http://cordis.europa.eu/news/rcn/122198_es.html! (Consultado! en! febrero!2017).! Consejo! Oleícola! Internacional.! Cifras! Aceites! de! Oliva.! http://www.internationaloliveoil.org/estaticos/view/100-missionstatement?lang=es_ES!(Consultado!en!febrero!2017).! De!Greyt!W,!Kellens!M!(2000).!Refining!Practice.!In:!Hamm!W,! Hamilton!RJ!(Edit)!Edible!oil!Processing.!Sheffield!academic!press,! England,!pp.!90-105.! El-Gharabawy!RM,!Ahmed!AS,!Al-Najjar!AH!(2017).!Mechanism! of! action! and! effect! of! immune-modulating! agents! in! the! Treatment!of!psoriasis.!Biomed!Pharmacother.,!85:!141-147.!! Emergen!Andalucía,!Sociedad!Española!de!Médicos!de!Atención! Primaria!(2016).!Diario!de!Sevilla,!31!de!Diciembre,!pp.!46-47.! Engebretsen!KA,!Johansen!JD,!Kezic!S,!Linneberg!A,!Thyssen!JP! (2016).!The!effect!of!environmental!humidity!and!temperature!on! skin!barrier!function!and!dermatitis.!J!Eur!Acad!Dermatol!Venereol.,!! 3:!223-249.! Engebretsen!KA,!Bager!P,!Wohlfahrt!J,!Skov!L,!Zachariae!C,!Nybo! Andersen!AM,!Melbye!M,!Thyssen!JP!(2017).!Prevalence!of!atopic! INTRODUCCIÓN GENERAL 21 dermatitis! in! infants! by! domestic! water! hardness! and! season! of! birth.!In!press!DOI:!10.1016/j.jaci.2016.11.021! Feldman! SR,! Fleischer! AB,! Reboussin! DM,! Rapp! SR,! Bradham! DD,!Exum!ML,!Clark!AR!(1997).!The!economic!impact!of!psoriasis! increases!with!psoriasis!severity.!J!Am!Acad!Dermatol,!37:!564-569.! Fernández-Arche!A,!Márquez-Martín!A,!de!la!Puerta!Vázquez!R,! Perona! J,! Terencio! C,! Pérez-Camino! C,! Ruiz-Gutiérrez! V! (2009).! Long-chain! fatty! alcohols! from! pomace! olive! oil! modulate! the! release! of! proinflammatory! mediators.! J! Nutr! Biochem,! 20:! 155162.! Fernández-Bolaños!J,!Guillen!R.,!Heredia!A,!Jiménez!A,!Sánchez! C! (1990).! El! hueso! de! aceituna! como! fuente! de! material! lignocelulósico.!Alimentación,!Equipos!y!Tecnología,!9!(5):!109-115.! Furneri!PM,!Marino!A,!Uccella!ASN,!Bisignano!G!(2002).!In!vitro! antimycoplasmal!activity!of!oleuropein.!Int!J!Antimicrob!Agents,!20:! 293-!296.! Garcia! OB,! Castillo! J,! Lorente! J,! Ortuno! A.,! Del! Rio! JA! (2000).! Antioxidant!activity!of!phenolics!extracted!from!Olea!europaea!L.! leaves.!Food!Chem,!68:!457--462.! Garmhausen!D,!Hagemann!T,!Bieber!T,!Dimitriou!I,!Fimmers!R,! Diepgen!T,!Novaket!N!(2013).!Characterization!of!different!courses! of!atopic!dermatitis!in!adolescent!and!adult!patients.!Allergy,!68:! 498–506.! Griffiths! CEM,! Barker! JNWN! (2007).! Pathogenesis! and! clinical! INTRODUCCIÓN GENERAL 22 features!of!psoriasis.!Lancet,!370:!263–71.! Honda!T,! Egawa!G,!Grabbe! S,!Kabashima!K!(2013).! Update! of! immune! events! in! the! murine! contact! hypersensitivity! model:! toward! the! understanding! of! allergic! contact! dermatitis.! J! Invest! Dermatol,!133!(2):!303-315.! Horiuchi!K,!Shiota!S,!Hatano!T,!Yoshida!T,!Kuroda!T,!Tsuchiya!T! (2007).!Antimicrobial!activity!of!oleanolic!acid!from!Salvia!officinalis! and!related!compounds!on!vancomycin-resistant!enterococci!(VRE).! Biol!Pharm!Bull,!30:!1147-1149.! Huang!ZR,!Lin!YK,!Fang!JY!(2009).!Biological!and!pharmacological! activities! of! squalene!and! related! compounds:! potential! uses! in! cosmetic!dermatology.!Molecules,!14:!540-554.! Huerta! C,! Rivero! E,! Rodríguez! LAG! (2007)! Incidence! and! risk! factors!for!psoriasis!in!the!general!population.!Arch!Dermatol,!143! (12):!1559-1565.! Javitz! HS,! Ward! MM,! Farber! E,! Nail! L,! Vallow! SG! (2002).! The! direct!cost!of!care!for!psoriasis!and!psoriatic!arthritis!in!the!United! States.!J!Investig!Dermatol,!46:!850–860.! Kawasaki! Y,! Kawana! S! (2014).! Efficacy! and! safety! of! a! topical! carbon! suspension! photoenhancer! adjunctive! to! intense! pulsed! light!treatment!for!pigmented!lesions!in!Japanese!patients:!A!pilot! study.!Laser!Ther,!23:!13–19.! Khalil! MMH,! Ismail! EH,! El-Baghdady! KZ,! Mohamed! D! (2014).! Green!synthesis!of!silver!nanoparticles!using!olive!leaf!extract!and! INTRODUCCIÓN GENERAL 23 its!antibacterial!activity.!Arab!J!Chem,!7:!1131–1139.! Kostner! L,! Anzengruber! F,! Guillod! C,! Recher! M,! SchmidGrendelmeier! P,! Alexander! A,! Navarini! SA! (2017).! Allergic! Contact!Dermatitis.!Immunol!Allergy!Clin!North!Am,!37!(1):!141152.! Lebwohl!M!(2003).!Psoriasis.!Lancet,!361:!1197–204.! León-Camacho! M,! Viera-Alcaide! I,! Ruiz-Méndez! MV! (2003).! Elimination! of! polycyclic! aromatic! hydrocarbons! by! bleaching! of! olive!pomace!oil.!Eur!J!Lipid!Sci!Technol,!105:!9-16.! Levy! LL,! Urban! J,! King! BA! (2015).! Treatment! of! recalcitrant! atopic! dermatitis! with! the! oral! Janus! kinase! inhibitor! tofacitinib! citrate.!J!Am!Acad!Dermatol,!73!(3):!395-399.! Márquez-Martín! A,! De! la! Puerta! R,! Fernández-Arche! A,! RuizGutiérrez!V,!Yaqoob!P!(2006).!Modulation!of!cytokine!secretion!by! pentacyclic!triterpenes!from!olive!pomace!oil!human!mononuclear! cells.!Cytokine,!36:!211-217.! Martín!R,!Carvalho!J,!Ibeas!E,!Hernández!M,! Ruiz-Gutiérrez!V,! Nieto! ML! (2007).! Acidic! triterpenes! compromise! growth! and! survival! of! astrocytoma! cell! lines! by! regulating! reactive! oxygen! species!accumulation.!Cáncer!Research,!67:!3741-3751.! Micol! V,! Caturla! N,! Pérez-Fons! L,! Más! V,! Pérez! L,! Estepa! A! (2005).!The!olive!leaf!extract!exhibits!antiviral!activity!against!viral! haemorrhagic!septicaemia!rhabdovirus!(VHSV).!Antiviral!Research,!! 66:!129–136.! INTRODUCCIÓN GENERAL 24 Ministerio! de! Medio! Ambiente! y! Medio! Rural! y! Marino.! Inventario! de! tecnologías! disponibles! en! España! para! la! lucha! contra! la! desertización.! Utilización! de! alperujo! como! enmienda! para! la! recuperación! de! los! suelos.! http://www.mapama.gob.es! /es/desarrollorural/temas/politica-forestal/0904712280144da2_tc! m7-19613.pdf!(Consultado!en!febrero!2017).! Nunes! MA,! Pimentel! FB,! Costa! AS,! Alves! RC,! Oliveira! MBP! (2016).! Olive! by-products! for! functional! and! food! applications:! Challenging!opportunities!to!face!environmental!constraints.!Innov! Food!Sci!Emerg!Technol,!35:!139-148.! Orden! de! 20! de! julio! de! 2007,! por! la! que! se! regula! la! Acreditación!Ambiental!de!Calidad!del!Compost.!BOJA!nº!156!p.!31.! http://www.juntadeandalucia.es/boja/2007/156/fasciculo1.pdf! (Consultado!en!febrero!2017).! Parisi!R,!Symmons!DPM,!Griffiths!ChEM,!Darren!M.!Ashcroft!DM! (2013).! Global! Epidemiology! of! Psoriasis:! A! Systematic! Review! of! Incidence!and!Prevalence.!J!Invest!Dermatol,!133:!377–385.! Pérez-Camino!MC,!Cert!A!(1999).!Quantitative!determination!of! hydroxy!pentacyclic!triterpene!acids!in!vegetable!oils.!J!Agric!Food! Chem,!47:!1558–1562.! Plewig! G,! Jansen! T! (2008).! Seborrheic! dermatitis.! In:! Wolff! K,! Goldsmith! LA,! Katz! SI,! Gilchrest! BA,! Paller! AS,! Leffell! DJ! (Edit)! Fitzpatrick’s!dermatology!in!general!medicine.!7th!ed,!McGraw-Hill,! New!York,!pp.!219–225.! INTRODUCCIÓN GENERAL 25 Pozzi!MT,!Filippín!AJ,!Matías!C,!Hammann!A!(2010).!Posibilidad! de! uso! del! Alpechín! en! Fertilización! de! Tierras! Agrícolas.! Información!Tecnológica,!21:!117-123.!! Rabasco! A,! González! M! (2000).! Lipids! in! pharmaceutical! and! cosmetic!preparations.!Grasas!Aceites,!51:!74-96.! Rabionet!M,!Gorgas!K,!Sandhoff!R!(2014).!Ceramide!synthesis!in! the!epidermis.!BBA-Mol!Cell!Biol!L!J,!1841:!422-434.! Ramos!Comerzana!A,!Monteoliva!Sanchez!M!(2000).!Potencial! biofarmacéutico! de! los! residuos! de! la! industria! oleícola.! Ars! Pharmaceutica,!41:!129-136.!! Ramos-e-Silva! M,! Sampaio! AL,! Carneiro! S! (2014).! Red! face! revisited:!Endogenous! dermatitis! in! the! form! of!atopic!dermatitis! and!seborrheic!dermatitis.!Clin!Dermatol,!32:!109–115.! Rapp! SR,! Feldman! SR,! Exum! ML,! Fleischer! AB,! Reboussin! DM! (1999).!Psoriasis!causes!as!much!disability!as!other!major!medical! diseases.!J!Am!Acad!Dermatol,!41:!401–407.!! Rawlings!AV,!Matts!PJ,!Anderson!CD,!M.S.!Roberts!MS!(2008).! Skin! biology,! xerosis,! barrier! repair! and! measurement.! Drug! Discovery!Today:!Disease!Mechanisms,!5:!128-136.! Real! Decreto! 824/2005,! de! 8! de! julio,! sobre! productos! fertilizantes.! (BOE! nº! 171,! de! 19! de! Julio! 2005).! https://www.boe.es/boe/dias/2005/07/19/pdfs/A2559225669.pdf (Consultado!en!febrero!2017).! INTRODUCCIÓN GENERAL 26 Reddy!LH,!Couvreur!P!(2009).!Squalene:!A!natural!triterpene!for! use!in!disease!management!and!therapy.!Advanced!Drug!Delivery! Reviews,!61:!1412-1426.! Reglamento!Europeo!(CE)!nº!889/2008!de!la!Comisión!de!5!de! septiembre! de! 2008! por! el! que! se! establecen! disposiciones! de! aplicación!del!Reglamento!Europeo!(CE)!nº!834/2007!del!Consejo! sobre! producción! y! etiquetado! de! los! productos! ecológicos,! con! respecto! a! la! producción! ecológica,! su! etiquetado! y! su! control.! Diario!Oficial!de!la!Unión!Europea.!http://www.mapama.gob.es/es! /alimentacion/temas/laagricultura-ecologica/R(CE)889-2008_tcm7220467.pdf!(Consultado!en!febrero!2017).! Rodrigues! F,! Pimentel! FB,! Oliveira! MBP! (2015).! Olive! byproducts:! Challenge! application! in! cosmetic! industry.! Ind! Crops! Prod,!70:!116-124.! Ruiz-Méndez! MV,! Dobarganes! MC,! Sánchez-Moral! P! (2010).! Edible!olive!pomace!oil!concentrated!in!triterpenic!acids,!procedure! of!physical!refining!utilized!for!obtainment!thereof!and!recovery!of! functional!components!present!in!the!crude!oil.!Patent!ES!2332977! (A1).! Ruiz-Méndez! MV,! Aguirre-González! MR,! Marmesat! S! (2013).! Olive! Oil! Refining! Process.! In:! Aparicio,! R.,! Harwood,! J.! (Eds.),! Handbook!of!Olive!Oil.!Springer,!New!York,!pp.!715-738.! Sánchez-Moral!P,! Ruiz-Méndez! MV! (2006).! Production! of! pomace!olive!oil.!Grasas!Aceites,!57:!47–55.! INTRODUCCIÓN GENERAL 27 Sato!H,! Genet!C,!Strehle!A,!Thomas!C,!Lobstein!A,!Wagner! A,! Mioskowski! C,! Auwerx! J,! Saladin! R! (2007).! Anti-hyperglycemic! activity! of! a! TGR5! agonist! isolated! from! Olea! europaea.! Biochem! Biophys!Res!Commun,!362:!793-798.! Servege!A!(1983).!Difficulties!in!physical!refining!of!olive!oil!due! to! presence! of! triterpene! oleanolic! acid.! J! Am! Oil! Chem! Soc,!60:! 584-587.! Sun!M,!Tang!Y,!Ding!T,!Liu!M,!Wang!X!(2015).!Investigation!of! cytochrome!P450!inhibitory!properties!of!maslinic!acid,!a!bioactive! compound! from! Olea! europaea! L.,! and! its! structure–activity! relationship.!Phytomedicine,!22:!56-65.! Thambyayah! M,! Amuthan! A.! (2015).! Infantile! seborrheic! dermatitis:!A!pediatric!siddha!medicine!treatise.!Clin!Dermatol,!33:! 355–361.! Thyssen!JP,!Elias!PM!(2012).!Xerosis!is!latitude!dependent!and! affects! the! propensity! to! develop! atopic! disease.! J! Allergy!Clin! Immunol,!130:!820-821.! Thyssen! JP,! Zirwas! MJ,! Elias! MP! (2015).! Potential! role! of! reduced! environmental! UV! exposure! as! a! driver! of! the! current! epidemic! of! atopic! dermatitis.! J! Allergy!Clin! Immunol,! 136:! 11631169.! Valentine!J,!Belum!VR,!Duran!J,!Ciccolini!K,!Schindler!K,!Wu!S,! Lacouture!ME!(2015).!Incidence!and!risk!of!xerosis!with!targeted! anticancer!therapies.!J!Am!Acad!Dermatol,!72!(4):!656-667.! INTRODUCCIÓN GENERAL 28 Weidinger! S,! Novak! N! (2016).! Atopic! dermatitis.! Lancet,!387:! 1109-1122.! ! ! ! ! OBJETIVOS 29 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! OBJETIVOS! ! ! ! CAPÍTULO I 36 ! !! CAPÍTULO I 37 I.1. INTRODUCCIÓN! La! caracterización! reológica! de! los! aceites! es! de! gran! importancia! para! poder! ampliar! su! ámbito! de! aplicación.! La! reología!es!la!ciencia!que!estudia!la!deformación!y!el!flujo!de!los! materiales! y! describe! la! relación! entre! los! parámetros! fuerza,! deformación!y!tiempo!(Barnes!y!col.,!1989).!Así,!con!los!estudios!en! cizalla!oscilatoria!se!puede!determinar!la!región!viscoelástica!lineal! de!la!muestra,!lo!cual!es!necesario!para!asegurar!las!condiciones!no! destructivas!de! la! muestra! y,! con! ello! mediante! barridos! de! frecuencia,! poder! separar! las! componentes! elástica! y! viscosa! de! este!tipo!de!fluidos.!Además,!realizando!los!estudios!reológicos!en! cizalla!rotacional!se!pueden!obtener!información!de!la!viscosidad!y! del! comportamiento! de! flujo! del! material.! A! partir! de! las! representaciones! gráficas! de! las! curvas! de! flujo! o! de! viscosidad! (esfuerzo! de! cizalla! (Pa)! versus!velocidad! de! cizalla! (1/s)! o! viscosidad!(Pa.s)!versus!velocidad!de!cizalla!(1/s))!se!pueden!aplicar! modelos! matemático! teóricos! que! proporcionan!parámetros! que! identifican! el! comportamiento! reológico! de! los! materiales! (Schramm,!1994).! La! caracterización! reológica! de! los! aceites! vegetales! es! necesaria! para! su! aplicación! en! diferentes! sectores.! Así! por! ejemplo,!es!de!destacar,!dentro!del!campo!de!la!Bromatología,!los! estudios!de!las!grasas!sólidas!y!de!cristalización!del!aceite!de!palma! con!respecto!a!la!temperatura!(De!Graef!y!col.,!2008)!o!la!absorción! CAPÍTULO I 38 de! aceite! durante! el! proceso! de! fritura! (Maskan,! 2003;! Santos!y! col.,!2004;!Kim!y!col.,!2010;).!Pero!también,!son!importantes!para! usos!no!alimenticios,!tal!como!en!biocombustibles!biodegradables! (Doll! y! col.,! 2008),! y! en! el! campo! farmacéutico! para! el! diseño,! desarrollo,! optimización! y! control! de! calidad! de! nuevas! formulaciones!(Jiménez-Kairuz!y!col.,!2002;!Chouaibi!y!col.,!2012).!!! El! aceite! de! oliva! es! el! zumo! extraído! por! medios! mecánicos,! que! separan! las! diferentes! partes! que! conforman! su! estructura:! sólido! (orujo),! aceite! y! agua! de! vegetación.! El! aceite! obtenido!a! partir! del! residuo! sólido,! constituido! principalmente! por! pulpa,! cáscara,!semilla!y!el!olivo,!se!llama!aceite!de!orujo!de!oliva.!El!aceite! de! orujo! se! almacena! en! grandes! tanques,! donde! su! deterioro! aumenta!con!el!tiempo!de!almacenamiento!(Ramos!Hinojosa!y!Ruiz! Méndez,!2004).! Actualmente,!existen!dos!tipos!de!aceites!de!orujo!de!oliva!en!el! mercado,! dependiendo! del! procedimiento! utilizado! en! su! extracción,!es!decir,!si!es!por!centrifugación!o!por!extracción!con! disolvente! (Sánchez-Moral! y! Ruiz-Méndez,! 2006).! El! interés! generado!por!este!aceite!está!creciendo!gradualmente!por!su!valor! económico! y! porque! contiene! todos! los! compuestos! funcionales! presentes!en!el!aceite!de!oliva!virgen!(Rodríguez-Rodríguez!y!col.,! 2009;! Valero! Muñoz! y! col.,! 2014).! Algunos! de! los! componentes! menores! del! aceite! de! oliva! están! presentes! incluso! en! concentraciones! más! altas! en! el! de! orujo,! tal! es! el! caso! de! los! CAPÍTULO I 39 triterpénicos!(Pérez-Camino!y!Cert,!1999)!con!aplicación!directa!en! sectores! tan! diversos! como! el! de! Alimentación,! Cosmética! y! Farmacia.!! ! I.2. OBJETIVO! Dado!que!no!se!han!encontrado!referencias!bibliográficas!sobre! este! tipo! de! caracterización! física! del! aceite! de! orujo! de! oliva,! el! objetivo!de!este!Capítulo!se!centró!en!la!caracterización!química!y! reológica!del!aceite!de!orujo!de!oliva!crudo,!extraído!por!medios! mecánicos!y!químicos.! ! I.3. MATERIALES!Y!MÉTODOS! I.3.1. Materiales! Los! aceites! de! orujo! de! oliva! (OPOC)! objeto! de! estudio! se! obtuvieron!durante!el!período!de!cosecha!2012/2013:! -!5!muestras!obtenidas!por!centrifugación!(febrero,!abril,!julio!y! diciembre!de!2012!y!marzo!de!2013).! -!5!muestras!obtenidas!por!extracción!con!disolventes!(febrero,! abril,!julio!y!diciembre!de!2012!y!marzo!de!2013).!! También! se! utilizaron! los! siguientes! reactivos! y! solventes! de! calidad! analítica:! acetona,! acetonitrilo! de! grado! HPLC,! dietil! éter,! etanol!e!hidróxido!sódico!(Panreac!SA,!Barcelona,!España).! ! ! CAPÍTULO I 40 I.3.2. Métodos! I.3.2.1. Caracterización!química! La! acidez! y! la! composición! de! los! triglicéridos! (TAG)! se! determinaron!por!triplicado!siguiendo!los!métodos!del!Reglamento! CEE!Nº!2568/91!(Regulación!Europea!(EU)!Nº!1348/2013).! ! I.3.2.2. Caracterización!reológica! Los!ensayos!reológicos!se!realizaron!mediante!un!reómetro!de! estrés!controlado!(AR-2000,!TA!Instruments,!New!Castle,!USA)!y!un! sensor!con!geometría!plana!de!60!mm!de!diámetro!y!superficie!lisa.! La! temperatura! del! ensayo! se! mantuvo! constante! mediante! una! placa! Peltier! (25±0.1°C).! Los! OPOC! se! sometieron! a! un! protocolo! experimental! que! se! inició! con! el! estudio! en! cizalla! oscilatoria! dinámica.! En! primer! lugar,! se! determinó! la! región! viscoelástica! lineal! a! través! de! los! barridos! de! estrés! oscilatorio! a! 1! Hz! de! frecuencia! y! con! un! porcentaje! de! tolerancia! del! 1%! y! tiempo! máximo! de! adquisición! de! datos! de! 120! s.! Así! se! determinó! un! estrés!oscilatorio,!dentro!de!la!zona!plateau,!y!el!estrés!crítico!(τc)! por!encima!del!cual!se!pierden!las!condiciones!no!destructivas!y,! por!tanto,!la!muestra!se!deforma!reológicamente.!A!continuación,! se! llevó! a! cabo! un! barrido! de! frecuencia,! al! esfuerzo! oscilatorio! seleccionado,!en!el!rango!de!0.01!a!628.3!rad.s-1.!El!análisis!de!los! resultados!se!basó!en!el!perfil!de!las!componentes!elástica!(G')!y! viscosa!(G''),!también!llamadas!módulos!de!almacenamiento!y!de! CAPÍTULO I 41 pérdida,!respectivamente.!! Por! otra! parte,! se! realizaron! los! ensayos! en! cizalla! rotaciones! para! obtener! las! curvas! de! flujo! y/o! de! viscosidad! y! así! poder! identificar!y!cuantificar!el!comportamiento!de!flujo!de!los!aceites.! Las! curvas! se! ajustaron! a! los! diferentes! modelos! teóricos! reológicos,!en!concreto! a!los!de! Ostwald-De!Waele!o!Power!Law! (Ecuación.!I.1)!y!Herschel-Bulkley!(Ecuación.!I.2)!(Schramm,!1994).! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!τ!=!K.γn!!!!!!!!!!!!!!!!!!Ecuación!I.1! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!τ!=!τ0!+K.γn!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Ecuación!I.2! Donde! τ!es! el! esfuerzo! de! cizalla,! τ0!representa! el! esfuerzo! umbral!plástico,!K!es!el!índice!de!consistencia!y!n!es!el!índice!de! flujo! (n=1! para! los! fluidos! Newtonianos! y! n≠1! para! fluidos! noNewtonianos,!los!cuales!serán!pseudoplásticos!si!n<1!y!dilatantes!si! n>1).!! En! todos! los! ensayos,! cada! medida! se! realizó! por! triplicado,! dando!su!validez!cuando!las!curvas!eran!superponibles.! ! I.3.2.3. Análisis!del!perfil!de!textura!(TPA)! Las!propiedades!de!textura!de!los!OPOC!se!determinaron!con!el! analizador! de! textura! TA.XT2i! (Stable! Micro! Systems! Ltd.,! Surrey,! Reino! Unido)! controlado! mediante! un! software.! El! protocolo! de! trabajo!comienza!aplicando!una!compresión!uniaxial!generada!por! una!célula!de!carga!de!5!kg,!con!el!fin!de!insertar!una!sonda!cónica! (HDP/SR,!Stable!Micro!Systems)!en!el!receptor!complementario!de! CAPÍTULO I 42 la!misma!que!contenía!8!±!0.1!g!de!cada!uno!de!aceites.!La!sonda!se! colocó!a!una!altura!de!17!mm!y,!en!el!momento!de!contactar!con!la! muestra!dentro!del!receptor,!penetró!a!una!velocidad!de!2!mms-1.! A!partir!de!las!gráficas!fuerza-distancia!o!fuerza-tiempo!obtenidas,! se!determinaron!la!firmeza!(fuerza!máxima!requerida!para!evacuar! el! contenido! del! receptor! y! que! se! acoplen! las! dos! parte! de! la! sonda),! cohesividad! (área! bajo! la! curva! positiva! que! refleja! el! trabajo! requerido! para! deformar! el! producto! durante! la! penetración!de!la!sonda)!y!adhesividad!(área!bajo!la!curva!negativa! que! recoge! el! trabajo! necesario! para! superar! las! fuerzas! de! atracción!entre!las!superficie!del!aceite!y!de!la!sonda)!(Lucero!y!col.,! 2011).! ! I.4. RESULTADOS!Y!DISCUSIÓN! I.4.1. Características!químicas!de!los!aceite!de!orujo!de!oliva! Los! aceites! vegetales! están! constituidos! principalmente! por! TAG,!en!concentraciones!de!prácticamente!el!99%.!La!composición! y! distribución! de! los! ácidos! grasos! en! las! estructuras! de! los! TAG! influyen!en!el!comportamiento!tecnológico!de!las!grasas!y!de!los! aceites.! La! Tabla! I.1! muestra! la! acidez! y! la! composición! de! triglicéridos! expresada! en! el! número! de! carbonos! equivalente! (ECN)! de! los! OPOC! extraídos! por! medios! tanto! mecánicos! como! químicos.! Como! era! de! esperar,! la! acidez! aumentó! con! el! tiempo! de! CAPÍTULO I 43 almacenamiento! (Ramos! Hinojosa! y! Ruiz! Méndez,! 2004),! aunque! sorprendentemente,!las!muestras!del!12!de!diciembre!mostraron! menor!acidez!que!las!del!13!de!marzo.! Los! OPOC! extraídos! por! disolvente! presentaron! mayor! proporción!de!TAG!de!ácidos!grasos!insaturados,!como!LLL,!OLnL,! LOL,! PLO! y! POL! (P,! palmítico;! Po,! palmitoleico;! S,! esteárico;! O,! oleico;!L,!linoleico;!Ln,!linolénico;!y!A,!araquídico),!mientras!que!los! OPOC!extraídos!por!centrifugación!mostraron!mayores!contenidos! de!OOO,!siendo!el!incremento!promedio!del!6.9%.!Sin!embargo,!de! febrero!a!marzo,!se!produjo!un!aumento!gradual!del!contenido!de! OOO,! siendo! el! incremento! del! 9.7%! en! las! muestras! de! OPOC! extraídas!por!medios!mecánicos!y,!aún!más,!en!los!OPOC!extraídos! con!disolvente!(13.5%).!De!acuerdo!con!Fuentes!de!Mendoza!y!col.,! (2013),! estas! diferencias! pueden! atribuirse! a! la! madurez! de! la! aceituna.! Sus! hallazgos! indican! diferencias! significativas! en! la! composición!de!ácidos!grasos!con!la!madurez!de!los!frutos,!con!una! clara! tendencia! a! aumentar! la! concentración! de! ácidos! grasos! monoinsaturados! totales! (MUFA)! con! el! índice! de! madurez! y,! al! mismo!tiempo,!una!tendencia!a!la!disminución!de!los!contenidos! en!ácidos!grasos!poliinsaturados!totales!(PUFA).! ! ! ! ! CAPÍTULO I 44 Tabla! I.1.-!Acidez! (%!de! ácido! oléico)! y! composición! de! triglicéridos! (%,! TAG)! de! las! muestras!de!aceite!de!orujo!de!oliva!durante!todo!el!período!de!cosecha!2012/2013!(P,! palmítico;! Po,! palmitoleico;! S,! esteárico;! O,! oleico;! L,! linoleico;! Ln,! linolénico;! y! A,! araquídico).! OPOC! Febrero!12! Abril!12! Julio!12! Diciembre!12! Marzo!13! Extracción!mecánica! Acidez!(%)! 2.41! 6.33! 11.76! 2.81! 6.08! LLL*! 0.36! 0.42! 0.66! 0.36! 0.46! OLnL! 0.33! 0.30! 0.40! 0.25! 0.28! PLnL! 0.06! 0.14! 0.21! 0.12! 0.12! LOL+OLnO! 2.80! 2.94! 2.13! 1.86! 2.39! PLL! 1.94! 1.91! 1.98! 1.87! 1.84! PLnO! 0.47! 0.47! 0.49! 0.55! 0.47! LOL! 15.33! 15.59! 11.97! 11.46! 13.98! PLO! 5.31! 5.57! 5.37! 5.01! 5.04! OOO! 43.72! 44.00! 42.40! 45.71! 47.97! SLO+POO! 20.16! 19.51! 23.52! 22.96! 18.30! POL! 2.07! 2.00! 2.87! 2.60! 1.64! SOO! 6.25! 6.09! 6.49! 6.00! 6.54! SLS+POS! 1.19! 1.08! 1.51! 1.24! 0.97! Extracción!química! ! ! ! ! Acidez!(%)! 6.31! 11.83! 12.49! 6.03! 20.70! LLL! 0.74! 0.79! 0.85! 0.69! 0.91! OLnL! 0.33! 0.39! 0.40! 0.41! 0.51! PLnL! 0.10! 0.17! 0.14! 0.02! 0.22! LOL+OLnO! 3.78! 3.77! 3.20! 2.95! 2.23! PLL! 2.17! 2.11! 2.04! 2.02! 1.56! PLnO! 0.48! 0.44! 0.49! 0.50! 0.57! LOL! 15.32! 15.54! 13.86! 12.88! 11.15! PLO! 6.92! 6.44! 6.09! 6.12! 4.07! OOO! 39.55! 40.62! 41.27! 42.00! 44.91! SLO+POO! 21.21! 20.41! 21.93! 22.85! 22.97! POL! 2.62! 2.33! 2.64! 2.87! 2.74! SOO! 5.58! 5.82! 5.83! 5.47! 6.62! SLS+POS! 1.20! 1.16! 1.27! 1.21! 1.54! CAPÍTULO I 45 I.4.2. Caracterizaciones! reológica! y! de! textura! de! los! ! aceites! de!orujo!de!oliva! La!Figura!I.1!muestra!los!resultados!obtenidos!en!el!ensayo!de! cizalla! oscilatoria! de! los! OPOC.! El! barrido! de! esfuerzo! oscilatorio! está! diseñado! para! determinar! la! región! viscoelástica!lineal! en! donde! los! módulos! de! almacenamiento! (G’)! y! de! pérdida! (G’’)! tienen! que! tener! una! zona! plateau!con! valores! constantes! e! independientes!de!la!tensión!oscilatoria!aplicada!a!la!frecuencia!de! 1! Hz! (Pérez-Camino! y! Cert,! 1999).! Después! de! seleccionar! un! esfuerzo! oscilatorio! de! 0.03! Pa! en! esta! región,! se! realizaron! los! consiguientes! barridos! de! frecuencia.! En! todas! los! OPOC,! las! componentes! elásticas! (G’)! y! viscosas! (G’’)! aumentaron! con! la! frecuencia! aplicada! en! el! rango! ensayado,! siendo! G’’! siempre! superior! a! G’.! Por! lo! tanto,! todos! los! OPOC! fueron! fluidos! viscoelásticos! con! predominio! de! la! componente! viscosa.! Sin! embargo,! hubo! una! excepción! en! los! OPOC! extraídos! por! centrifugación.! En! concreto,! la! muestra! recogida! el! 12! de! julio! presenta!una!componente!elástica!(G’),!que!estaba!por!encima!de! la!viscosa!(G’’).!Esta!muestra,!además,!mostró!un!punto!de!corte!de! las! curvas! (conocido! como! punto! de! reticulación),! a! un! valor! de! frecuencia!de!1.909!rad/s!y!de!G’=G’’!de!1.925!Pa,!a!partir!del!cual! comenzó!el!predominio!de!G’’.!! CAPÍTULO I 52 Lucero! MJ,! Claro! C,! Casas! M,! Jiménez-Castellanos! MR! (2011).! Rheological! and! mechanical! properties! of! hydrophilic! dispersions! using!a!new!hydrophobically!modified!polymer!and!Igepal®!CO520.! Carbohydr!Polym.,!86:!891-896.! Maskan!M!(2003).!Change!in!colour!and!rheological!behaviour! of!sunflower!seed!oil!during!frying!and!after!adsorbent!treatment! of!used!oil.!Eur!Food!ResTechnol.,!218:!20–25.! Pérez-Camino!MC,!Cert!A!(1999).!Quantitative!determination!of! hydroxy!pentacyclic!triterpene!acids!in!vegetable!oils.!J!Agric!Food! Chem.,!47:!1558–1562.! Ramos!Hinojosa!AE,!Ruiz!Méndez!M!(2004).!Orujos!de!dos!fases! almacenados!en!balsas.!Grasas!Aceites,!55:!251–!258.! Regulación! Europea! Europa! (EU)! Nº! 1348/2013! amending! Regulación!Europea!(EEC)!Nº!2568/91!on!the!characteristics!of!olive! oil!and!olive!residue!oil!and!on!the!relevant!methods!of!analysis.! Off.!J.!Eur.!Union,!2013,!L338,!31–67.! Rodríguez-Rodríguez! R,! Herrera! MD,! de! Sotomayor! MA,! RuizGutiérrez! V! (2009).! Effects! of! pomace! olive! oil-enriched! diets! on! endothelial! function! of! small! mesenteric! arteries! from! spontaneously!hypertensive!rats.!Br!J!Nutr.,!102:!1435–1444.! Sánchez-Moral! P,! Ruiz-Méndez! MV! (2006).! Production! of! pomace!olive!oil.!Grasas!Aceites,!57:!47–55.! Santos! JC,! Santos! IM,! Conceiçao! MM,! Porto! SL,! Trindade! M,! Souza!A,!Araujo!A!(2004).!Thermoanalytical,!kinetic!and!rheological! CAPÍTULO I 53 parameters!of!commercial!edible!vegetable!oils.!J!Therm!Anal!Cal.,! 75:!419–428.! Schramm! G! (1994).! In:! A! practical! Approach! to! Rheology! and! Rheometry.!vol.!1,!Haake,!Karlsruhe,!Germany,!pp.!1–291.! Valero!Muñoz! M,! Martín!Fernández!B,!Ballesteros!S,!Quintela! JC,!Lahera!V,!Las!Heras!N!(2014).!Protective!effect!of!a!pomace!olive! oil! concentrated! in! triterpenic! acids! in! alterations! related! to! hypertension!in!rats:!Mechanisms!involved.!Mol!Nutr!Food!Res.,!58:! 376–383.! CAPÍTULO II 55 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! CAPÍTULO)II! ! ! ! INFLUENCIA!DE!LOS!PROCESOS!DE!REFINADO!SOBRE!LA! COMPOSICIÓN!CUANTITATIVA!DE!COMPUESTOS!BIOACTIVOS,! REOLOGÍA!Y!TEXTURA!DEL!ACEITE!DE!ORUJO!DE!OLIVA!PARA! FORMULACIONES!DERMATOLÓGICAS! ! European!Journal!of!Lipid!Science!and!Technology.! In!press,!DOI:!10.1002/ejlt.201600408! C.A.!Sánchez-Gutiérrez,!M.V!Ruiz-Méndez,!M.R.!Jiménez-! Castellanos!Ballesteros!and!M.J.!Lucero!! ! CAPÍTULO II 56 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! CAPÍTULO II 57 II.1. INTRODUCCIÓN! La!aceituna,!fruto!del!olivo,!se!somete!a!procesos!de!extracción! mecánica!con!el!fin!de!separar!los!diferentes!componentes!que!la! constituyen:! fruto,! residuo! sólido! (denominado! orujo),! aceite! de! oliva! virgen! extra! (EVOO)! y! agua! vegetal.! Desde! muy! antiguo,! el! EVOO!se!ha!usado!como!producto!natural!en!formulaciones!tanto! para!el!cuidado!de!la!piel!como!en!Cosmética!(Draelos,!2011).!Por! el!contrario,!el!aceite!crudo!obtenido!del!orujo!de!la!oliva!(OPOC)!o! bien! se! descarta! o,! como! mucho,! se! usa! en! otros! campos! tecnológicos.!Sin!embargo,!en!los!últimos!años,!el!interés!de!este! aceite!ha!crecido!enormemente!debido!a!que,!además!de!poseer! todos!los!componentes!funcionales!del!EVOO,!contiene!una!mayor! concentración!de! algunos! compuestos! menores! (Pérez-Camino! y! Cert,!1999).!! De!entre!ellos!cabe!destacar,!de!mayor!a!menor!concentración:!! Ø Triacilgliceroles!como!componente!principal!(>!95%).!! Ø Ácidos! grasos.! El! oleico! que! es! usado! en! formulaciones! farmacéuticas!y!cosméticas!y! los! ácidos! linoléico! y!linolénico!que! influyen! en! los! procesos! metabólicos! de! la! piel,! promueven! la! formación!de!ceramidas!(Rabionet!y!col.,!2014)!y!la!actividad!de!las! vitaminas!A!y!E!(Rabasco!y!González,!2000).! Ø Ácidos! triterpénicos,! en! particular! el! maslínico! y! el! oleanólico,! ya! que! poseen! actividades! antitumorales,! antiinflamatorias!y!bactericidas!(Sun!y!col.,!2015).! CAPÍTULO II 58 Ø Materia!insaponificable!constituida!por!el!escualeno!que!es! usado! como! emoliente! para! mantener! la! piel! suave! y,! además,! tiene! propiedades! antioxidantes! debido! a! su! estructura! isopreno! (Reddy! y! Couvreur,! 2009).! Los! alcoholes! alifáticos! reducen! la! liberación!de!varios!mediadores!inflamatorios!(Fernández-Arche!y! col.,! 2009);! y! finalmente,! los! esteroles! y! alcoholes! terpénicos! (eritrodiol! y! uvaol)! con! efectos! positivos! en! los! procesos! inflamatorios!(Márquez-Martín!y!col.,!2006).!! Para! obtener! el! aceite! de! orujo! de! oliva! (OPOC)! se! usan! procedimientos!de!extracción!mecánicos!y!químicos.!En!el!capítulo! anterior!de!esta!Tesis!Doctoral!(Sánchez-Gutiérrez!y!col.,!2015)!se! demostró! que! la! extracción! mecánica! proporcionó! un! mayor! porcentaje! de! los! compuestos! principales! (triacilgliceroles).! Sin! embargo,! debido! a! la! alta! acidez! del! OPOC,! éste! no! puede! ser! utilizado!como!materia!prima!en!el!campo!farmacéutico.!Esta!es!la! razón! por! la! que! el! OPOC! tiene! que! someterse! a! un! proceso! posterior! de! refinado,! intentando! al! mismo! tiempo! que! haya! las! mínimas!pérdidas!de!los!compuestos!bioactivos!(Ruiz-Méndez!y!col,! 2013).!! Existen! dos! tipos! de! refinado:! químico! (Q)!y! físico! (F),! ambos! con! diferentes! etapas.! El! método! más! común! de! refinación! del! aceite!es!mediante!una!reacción!con!una!solución!alcalina,!ya!que! se! neutralizan! los! ácidos! grasos! libres! (refinado! químico).! RuizMéndez! y! col.! (2010)! demostraron! que,! con! los! procedimientos! CAPÍTULO II 59 físicos,!las!pérdidas!de!compuestos!bioactivos!(ácidos!triterpénicos! en!el!OPOC)!eran!muy!pequeñas.!En!el!refinado!físico,!los!aceites! vegetales!pueden!ser!neutralizados!por!destilación!de!ácidos!grasos! libres! a! altas! temperaturas,! bajas! presiones! y! con! corriente! de! vapor.!Sin!embargo,!el!refinado!físico!sólo!se!puede!aplicar!después! de! la! extracción! mecánica,! debido! a! que! el! OPOC! obtenido! por! extracción!química!tiene!un!alto!contenido!en!clorofila,!fosfátidos,! carotenos!y!otros!contaminantes,!los!cuales!no!se!pueden!eliminar! por!simples!medios!físicos!(Amelotti,!1987).! ! II.2. OBJETIVO! En!este!Capítulo!se!ha!llevado!a!cabo!el!estudio!de!la!influencia! que! tienen! tres! procesos! de! refinado! distintos! (químico,! físico! clásico!y!físico!por!destilación!molecular!a!diferentes!temperaturas)! sobre!la!composición!de!los!compuestos!bioactivos!de!dos!tipos!de! aceite!de!orujo!de!oliva,!uno!procedente!de!extracción!mecánica!y! otra!de!extracción!química.!Tras!la!determinación!analítica!de!los! compuestos! bioactivos! se! llevó! a! cabo! la! selección! del! mejor! método!de!refinado.!Además,!se!realizaron!los!análisis!reológico!y! de!textura!de!los!aceites!obtenidos!con!el!fin!de!su!caracterización! mecánica!para!uso!en!aplicaciones!dermatológicas.! ! CAPÍTULO II 60 II.3. MATERIALES!Y!MÉTODOS! II.3.1. Materiales! Se! utilizaron! como! materias! primas! tres! aceites! de! orujo! de! oliva!crudo!(OPOC),!de!la!campaña!2012-2013!(Figura!II.1),!y!se!han! denominado!de!la!siguiente!manera:!OPOC!C,!aceite!de!orujo!de! oliva! obtenido! por! extracción! química,! y! OPOC! MA! y! OPOC! MB,! aceites!de!orujo!de!oliva!obtenidos!por!extracción!mecánica.!Para! su! refinado,! OPOC! C! y! OPOC! MA! se! sometieron! a! un! proceso! químico!obteniendo!un!desodorizado,!OPOD!CC!and!OPOD!MAC,! respectivamente.! Por! otra! parte,! OPOC! MA! y! OPOC! MB! se! sometieron!a!un!proceso!de!refinado!físico!clásico!y!refinado!físico! por! destilación! molecular! a! diferentes! temperaturas,! respectivamente,!obteniendo!los!correspondientes!desodorizados,! OPOD! MAP! y! OPOD! MBP.! Todos! los! procesos! de! refinado! se! llevaron!a!cabo!a!escala!laboratorio.! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura! II.1-! Procesos! de! extracción! y! refinado! del! aceite! de! orujo! de! oliva! obtenido!del!orujo.! CAPÍTULO II 61 Se! utilizaron! los! siguientes! reactivos! y! solventes! de! calidad! analítica:! acetona,! acetonitrilo! (grado! HPLC),! ácido! acético,! ácido! fosfórico,! ácido! sulfúrico,! cloroformo,! diclorometano,! dietil! éter,! etanol,! etil! acetato,! fenolftaleína,! hexano,! hidróxido! potásico,! hidróxido!sódico,!isopropil!éter,!metanol,!metilato!sódico!y!piridina!! (Panreac! S.A.! Barcelona,! España).! Hexametil! disiloxano,! trimetil! clorosilano,!y!Sudán!I!(Sigma-Aldrich.!Alemania).!Filtros!de!dicalite! (Bélgica)!y!Tonsil!supreme!114!FF!(Süd-Chemie,!España).!! Los! compuestos! estándar! fueron:! ácido! betulínico,! 5-αcholestan-3-ol,! lauril! araquidato! metil! heptadecanoato! y! nheicosanol!(Sigma-Aldrich!SA,!USA)!y!escualeno!(Merck,!Alemania).! ! II.3.2. Métodos! II.3.2.1. Proceso!de!refinado!químico! Este!método!de!refinado!se!llevó!a!cabo!siguiendo!un!protocolo! con!los!pasos!que!se!describen!seguidamente:! Desgomado:!Se!pesó!500!g!de!OPOC!C,!o!en!su!caso!OPOC!MA,! en! un! vaso! al! que! se! añadió! 0.3%! en! peso! de! aceite! de! ácido! fosfórico.! La! mezcla! se! mantuvo! en! agitación! durante! 30! min! a! 25°C,!con!el!fin!de!precipitar!los!fosfolípidos!en!el!medio!ácido.! Neutralización:! Sin! separar! las! gomas,! se! añadió! la! cantidad! suficiente! de! NaOH! (24°! Be),! además! de! un! exceso! del! 10%.! La! incorporación! se! hizo! a! 40°C! incrementando! ésta! hasta! 80°C.! La! mezcla! se! mantuvo! en! agitación! a! esta! temperatura! durante! 20! CAPÍTULO II 68 bastante! correlacionadas,! pero! esta! relación! no! es! normalmente! perfecta.! Las!propiedades!de!textura!de!los!diferentes!aceites,!OPOCs!y! OPODs,! se! determinaron! en! un! analizador! de! textura! TA.XT2i! (Stable! Micro! Systems! Ltd.,! Surrey,! Reino! Unido),! controlado! mediante! un! software,! y! con! una! sonda! cónica! (HDP/SR,! Stable! Micro!Systems)!con!su!receptor!complementario.!De!esta!manera! se! pudo! medir! la! facilidad! con! la! cual! un! producto! puede! ser! aplicado!en! una!capa!delgada! y!uniforme.! El!texturómetro!aplicó! una!compresión!uniaxial,!con!una!célula!de!carga!de!5!kg,!a!través! de!la!sonda!para!deformar!8!±!0.1!g!de!cada!uno!de!los!aceites!que! contenía!el!receptor!de!la!misma.!Durante!el!ensayo,!la!fuerza!se! incrementaba! hasta! el! punto! de! máxima! profundidad! que! es! cuando!la!sonda!penetra!completamente!en!su!receptor.!El!valor! de!la!fuerza!máxima!(Fmax)!se!tomó!como!el!valor!de!la!firmeza.! Cuanto!más!firme!es!la!muestra!mayor!será!el!área!bajo!la!curva! positiva,!la!cual!representa!la!cohesividad!o!fuerzas!requeridas!para! realizar! el! proceso! de! ruptura! de! los! enlaces! generados! en! el! interior!de!los!aceites.!Por!su!parte,!las!propiedades!de!adhesividad! de!los!aceites!se!determinaron!durante!el!movimiento!de!retirada! de! la! sonda,! cuantificándose! por! el! área! bajo! la! curva! negativa! (Aname,!2016).! ! CAPÍTULO II 69 II.4. RESULTADOS!y!DISCUSiÓN! II.4.1. Caracterización! química! de! OPOCs! y! OPODs! obtenidos! por!los!procesos!de!refinado!químico!y!físico.! Como!se!mencionó!anteriormente,!los!OPOCs!fueron!refinados! para! eliminar! los! componentes! secundarios! no! deseados! de! los! aceites,!al!tiempo!que!se!pretendió!causar!las!mínimas!pérdidas!de! los!compuestos!bioactivos!(Ruiz-Méndez!!y!col.,!2013).!La!Tabla!II.1! muestra! los! resultados! de! las! determinaciones! analíticas! de! los! aceites! de! orujo! crudos! obtenidos! por! las! extracciones! química! (OPOC! C)! y! mecánica! (OPOC! MA)! y! de! los! aceites! de! orujo! desodorizados! ! obtenidos! por! el! proceso! de! refinado! químico! (OPOD! CC! y! OPOD! MAC).! La! Tabla! II.! 2!incluye! los! resultados! correspondientes! para! los! aceites! de! orujo! obtenidos! por! extracción! mecánica! (OPOC! MA! y! OPOC! MB)! y! para! los! aceites! desodorizados!obtenidos!por!el!proceso!de!refinado!físico!(OPOD! MAP!y!OPOD!MBP).! Acidez! y! ácidos! triterpénicos.! En! relación! con! la! acidez,! se! pudieron! apreciar! dos! aspectos! importantes.! En! primer! lugar,! se! observó!que!el!aceite!obtenido!por!extracción!mecánica!(OPOC!MA! y! OPOC! MB)! tuvo! menor! acidez! que! el! obtenido! por! extracción! química! (OPOC! C).! Por! lo! tanto,! parece! ser!que! el! proceso! de! centrifugación!fue!más!adecuado!que!el!proceso!de!extracción!con! disolvente.! Esto! se! puede! atribuir! a! dos! causas:! la! extracción! es! secuencial,!por!tanto,!por!centrifugación!se!obtiene!el!aceite!que! CAPÍTULO II 70 está! suelto! en! la! masa,! compuesto! en! su!mayoría! por! triacilgliceroles.! A! continuación! el! aceite! retenido! en! la! masa! se! extrae!con!disolvente.!Para!ello!se!requiere!un!secado!preliminar! bajo!condiciones!drásticas,!produciendo!reacciones!de!oxidación!e! hidrólisis! y! ! provocando! así! el! incremento! de! los! ácidos! grasos! libres.! Por! lo! que! el! aceite! residual! extractado,! presenta! además! más!compuestos!minoritarios!y!de!degradación.! En!segundo!lugar,!se!apreció!que!la!temperatura!del!proceso!de! refinado!influyó!de!forma!importante!en!la!acidez.!Así,!se!observó! que! al! usar! altas! temperaturas,! como! en! el!caso! del! refinado! químico! (220°C)! y! el! refinado! físico! clásico! (250°C),! la! acidez! disminuyó! considerablemente! frente! a! las! temperaturas! seleccionadas!en!el!refinado!por!destilación!molecular.! Sin! embargo,! estas! altas! temperaturas! tuvieron,! además,! un! impacto! significativo! en! la! concentración! de! compuestos! bioactivos.!Así,!en!el!caso!del!refinado!químico,!los!ácidos!grasos! libres!y!los!ácidos!triterpénicos!se!eliminaron!por!saponificación!y!la! acidez! se! redujo!por! debajo! de! <0,1%,! pese! a! que! la! calidad! del! aceite! se! degradó,! debido! a! la! desaparición! de! los! ácidos! triterpénicos.!Un!comportamiento!similar!se!observó!en!el!caso!del! refinado!físico!clásico!(Tabla!II.2).!Por!el!contrario,!los!aceites!que!se! sometieron!a!la!destilación!molecular!tuvieron!menor!pérdida!de! acidez,! pero! retuvieron! una! mayor! cantidad! de! compuestos! bioactivos!antiinflamatorios!(ácidos!triterpénicos)!(Tabla!II.2).!! ! CAPÍTULO II 71 Tabla! II.1.-! Determinaciones!analíticas!de!los!aceite!de!orujo!crudos!obtenidos! por! extracciones! química! (OPOC! C)! o! mecánica! (OPOC! MA)! y! de! los! aceites! desodorizados!obtenidos!por!el!proceso!de!refinado!químico!(OPOD!CC!y!OPOD!! MAC)! ! Extracción! mecánica!y! refinación! física!clásica!! Extracción!mecánica!y!! refinación!por!destilación!molecular! ! OPOC! MA! OPOD! MAP! OPOC!MB! OPOD140!! MBP! OPOD165! MBP! OPOD190!! MBP! OPOD215! MBP! Acidez!(%)! 6.89! 0.12! 11.76! 17.00! 6.30! 2.75! 2.15! Ácidos! triterpénicos! (mg/Kg)! 11141! 49! 38300! 8275! 7619! 9856! 8458! Ácido!oleanólico! 5027! 29! 12400! 4681! 4450! 5450! 4310! Ácido!maslínico! 6114! 20! 25900! 3594! 3169! 4406! 4148! Esteres!alquílicos! (%)! 1.21! 0.00! 2.67! 1.60! 0.18! 0.03! 0.02! Ceras!(mg/kg)! 1798! 2374! 4633! 7782! 8806! 8827! 8866! Fracción! insaponificable!(%)! 2.14! 0.85! 3.57! 3.37! 3.05! 2.80! 2.35! Escualeno!(mg/kg)! 6175! 232! 4516! 2355! 2061! 310! 85! Alcoholes! alifáticos! (mg/kg)! 5263! 2220! 6595! 6546! 7690! 5465! 6954! Esteroles!(mg/kg)! 3406! 2646! 3979! 3851! 4284! 4131! 4359! • Colesterol!(%)! 0.24! 0.24! 0.24! 0.24! 0.24! 0.24! 0.20! • Campesterol! 3,20! 3,18! 3.07! 4.03! 4.67! 4.73! 4.67! • Estigmasterol! 1,29! 2,01! 1.43! 1.39! 1.36! 1.26! 1.25! • Clerosterol! 1.42! 1.83! 1.34! 1.50! 1.41! 1.22! 1.95! • β-Sitosterol! 88.04! 87.47! 88.49! 87.71! 87.90! 88.03! 86.62! • Sitostenol! 2.36! 2.34! 2.05! 2.04! 1.90! 2.01! 2.46! • 5-Avenasterol! 0.43! 0.33! 0.39! 0.40! 0.19! 0.20! 0.31! • 5,24Estigmastadienol! 2.18! 2.02! 2.12! 2.08! 1.75! 1.78! 2.02! • Δ-7Estigmastenol! 0.46! 0.29! 0.38! 0.45! 0.41! 0.39! 0.39! • Δ-7-Avenasterol! 0.37! 0.27! 0.28! 0.17! 0.18! 0.16! 0.15! Alcoholes! triterpénicos! (mg/kg)! 582! 238! 435! 838! 1221! 1298! 1393! CAPÍTULO II 72 El! hecho! de! que! la! acidez! no! haya! disminuido! tanto! pudo! atribuirse! a! que! no! se! introdujo! una! corriente! de! vapor! en! el! destilador!molecular!para!eliminar!los!ácidos!grasos!libres.! ! Tabla!II.2.-!Determinaciones!analíticas!de!los!aceites!de!orujo!crudos!obtenidos! por!extracción!mecánica!(OPOC!MA!y!OPOC!MB)!y!de!los!aceites!desodorizados! obtenidos!por!el!proceso!de!refinado!físico!(OPOD!MAP!y!OPOD!MBP).! ! ! Extracción!química!y! refinación!química! Extracción!mecánica!y! refinación!química! ! OPOC!C!! OPOD!CC! OPOC!MA! OPOD! MAC! Acidez!(%)! 20.70! 0.08! 6,89! 0,075! Ácidos!triterpénicos!(mg/Kg)! !5121! !! !11171! !! Ácido!oleanólico! 4342! 0! 5027! 0! Ácido!maslínico! 779! 0! 6114! 0! Esteres!alquílicos!(%)! 3.69! 0.02! 1,21! 0,42! Ceras!(mg/kg)! 3510! 5172! 1798! 2348! Fracción!insaponificable!(%)! 2.64! 2.43! 2,14! 1,51! Escualeno!(mg/kg)! 5048! 3747! 6175! 4567! Alcoholes!alifáticos!(mg/kg)! 5784! 4744! 5263! 3081! Esteroles!(mg/kg)! 5435!! !3065! !3406! 2252! • Colesterol!(%)! 0.24! 0.24! 0.24! 0,24! • Campesterol! 3.20! 3.54! 3,20! 2,81! • Estigmasterol! 1.23! 1.59! 1,29! 0,86! • Clerosterol! 0.94! 1.34! 1.42! 1,79! • β-Sitosterol! 87.71! 84.48! 88.04! 88.11! • Sitostenol! 1.26! 2.17! 2.36! 2,97! • 5-Avenasterol! 3.98! 3.60! 0.43! !0.38! • 5,24-Estigmastadienol! 0.83! 1.94! 2.18! 2.06! • Δ-7-Estigmastenol! 0.38! 0.89! 0,46! 0,45! • Δ-7-Avenasterol! 0.23! 0.21! 0,37! 0,33! Alcoholes!triterpénicos!(mg/kg)! 568! 511! 582! 376! CAPÍTULO II 73 Esteres!alquílicos.!Como!se!muestra!en!las!Tablas!II.1!y!II.2,!las! concentraciones! de! ésteres! alquílicos! en! todos! los! procesos! de! refinado!disminuyeron.!Sin!embargo,!hay!que!señalar!que!éstos!son! compuestos!no!bioactivos!que!aparecen!debido!a!la!fermentación! de!la!materia! vegetal!en!los! tanques! durante!el!almacenamiento! del!aceite!de!orujo!de!oliva!(Ruiz-Méndez!y!Ramos!Hinojosa,!2003).! Coincidiendo!con!lo!ya!reseñado!por!Yuan!y!col.!(2005),!el!aumento! de! la! temperatura! del! proceso! de! refinado! provocó! una! disminución! de! los! ésteres! de! alquilo.! Los! aceites! sometidos! a! la! destilación! molecular! mostraron! bajas! concentraciones! de! estos! componentes,!debido!a!que!son!volátiles!a!temperaturas!>!165°C.! Ceras.! En! general,! la! presencia! de! ésteres! de! cadena! larga,! como!es!el! caso! de!las!ceras,! en!aceites!vegetales! se! utiliza!para! determinar! la! pureza! y! la! clasificación! de! los! distintos! grados! del! aceite!de!oliva!(Regulación!Europea!(EU)!Nº!1348/2013).!Como!se! puede! apreciar! en! las! Tablas! II.1! y! II.2,! el! contenido! de! ceras! aumentó! durante! los! procesos! de! refinado! químico! y! físico.! De! acuerdo! con! Tubaileh! y! col.! (2002),! esto! puede! ser! debido! a! reacciones!de!esterificación!entre!ácidos!grasos!libres!y!alcoholes! alifáticos! presentes! en! el! aceite! a! las! temperaturas! de! la! desodorización.!Así,! cuando! esta! temperatura! aumentó,! el! contenido!de!ceras!se!incrementó,!como!se!observa!a!partir!de!los! aceites!obtenidos!por!destilación!molecular.! Materia!insaponificable.!Está!compuesta!por!mezcla!compleja! CAPÍTULO II 74 de!sustancias!distintas!de!los!glicéridos.!Sus!principales!compuestos! bioactivos! del! aceite! de! orujo! de! oliva! son:! el! escualeno,! los! esteroles!y!los!alcoholes!triterpénicos,!eritrodiol!y!uvaol!(MárquezMartín!y!col.,!2006).!Como!se!muestra!en!las! Tablas!II.1!y!II.2,!el! porcentaje!de!materia!insaponificable!disminuyó!con!el!proceso!de! refinado.!Esto!podría!atribuirse!principalmente!a!la!eliminación!del! escualeno!por!destilación!en!la!desodorización.!Sin!embargo,!en!la! destilación!molecular,!se!recogió!una!concentración!significativa!de! escualeno!en!algunos!destilados!de!desodorización!(OPOD140!MBP! a!OPOD215!MBP).!Una!posibilidad!es,!como!indican!Bondioli!y!col.! (1993),! agregar! escualeno! a! nuestro! aceite,! enriqueciendo! la! concentración!de!este!compuesto!bioactivo.! Las!Tablas!II.1!y!II.2!informan!de!las!diferentes!concentraciones! obtenidas! de! los! esteroles! característicos! del! aceite! de! orujo! de! oliva.!De!acuerdo!con!Verleyen!y!col.!(2002),!la!eliminación!parcial! de! esteroles! durante! el! proceso! de! refinado! depende! en! gran! medida! de! las! condiciones! aplicadas! en! las! diversas! etapas! del! proceso.! Así,! con! el! refinado! químico! y! refinado! físico! clásico,! la! concentración! de! estos! compuestos! bioactivos! disminuyó! (40%! y! 20%,!respectivamente);!por!el!contrario,!aumentó!ligeramente!en! la! destilación! molecular.! Un! comportamiento! similar! puede! observarse!con!los!alcoholes!triterpénicos.! !!Teniendo! en! cuenta! todo! lo! anteriormente! expuesto,! los! procesos!de!refinado!físico,!especialmente!la!destilación!molecular,! CAPÍTULO II 75 contribuyen!a!un!mejor!rendimiento!de!los!compuestos!bioactivos! estudiados,! los! cuales! pueden! usarse! en! formulaciones! dermatológicas!por!sus!actividades!terapéuticas.!Además,!de!todos! los!aceites!obtenidos!por!destilación!molecular,!se!eligió!OPOD190! MBP!por!ser!el!único!que!mostró!simultáneamente!baja!acidez!y! menor! pérdida! de! compuestos! bioactivos.! Por! ello,! se! consideró! oportuno! comparar! los! resultados! de! ! composición! de! bioactivos! obtenidos!para!OPOD190!MBP!por!destilación!molecular!respecto!a! los! correspondientes! del! EVOO,! al! ser,! como! ya! indicamos,! una! materia! prima! ampliamente! utilizada! en! formulaciones! dermatológicas.!! Se!aprecia!en!la!Tabla!II.3,!que!aunque!OPOD190!MBP!mostró! mayor! acidez! que! EVOO,! sigue! siendo! adecuada! para! su! uso! dermofarmacéutico! ya! que,! tras! realizar! un! análisis! de! varios! aceites! cosméticos! comercializados! (por! ejemplo:! aceite! de! almendras! dulces! de! Marnys®!o! aceite! de! almendras! dulces! de! Acofarma®),! se! comprobó! que! la! acidez! de! esos! aceites! estuvo! entorno! al! 2%.! En! definitiva,! se! confirmó! que! nuestro! aceite! de! orujo!de!oliva,!objeto!de!estudio,!contenía!mayores!cantidades!de! todos!los!compuestos!bioactivos!que!el!EVOO,!excepto!en!el!caso! del!escualeno.! ! ! ! ! CAPÍTULO II 76 Tabla!II.3.-!Estudio!comparativo!de!la!composición!del!aceite!de!orujo!de!oliva! obtenido! por! extracción! mecánica! y! destilación! molecular! (OPOD190! MBP)! respecto!al!aceite!de!oliva!virgen!extra!(EVOO).! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! II.4.2. Caracterización!reológica! La!Figura!II.3!muestra!la!caracterización!reológica!de!los!aceites! tras!extracción!química!y!mecánica!(OPOC!C!y!OPOC!MA),!así!como! tras!su!refinado!químico!(OPOD!CC!y!OPOD!MAC).!La!Figura!II.3A! recoge! el! barrido! de! frecuencia! oscilatoria! para! el! estudio! de! la! viscoelasticidad.! En! todos! los! casos! se! observó! que! G’! y! G’’! dependen!de!la!frecuencia!aplicada.!Además,!existe!un!predominio! de! la! componente! viscosa! en! todos! los! OPOC! y! OPOD.! Es! de! destacar! que! G’! sólo! fue! estable! a! frecuencias! inferiores! a! 5-10! !! OPOD190!MBP! EVOO! Acidez!(%)! 2.75! <!0.8! Ácidos!triterpénicos!(mg/Kg)! 9856! 90!-!190! Ácido!oleanólico! 5450! 30-80! Ácido!maslínico! 4406! 60!-!110! Esteres!alquílicos!(%)! 0.03! -! Ceras!(mg/kg)! 8827! <!250! Fracción!insaponificable!(%)! 2.80! 0.4!–!2! Escualeno!(mg/kg)! 310! 9000! Alcoholes!alifáticos!(mg/kg)! 5465! 350! Esteroles!(mg/kg)! 4131! 1500! Alcoholes!triterpénicos!(mg/kg)! 1298! <!100! CAPÍTULO II 77 rad.s-1,!indicando!la!poca!influencia!de!la!componente!elástica!en!el! comportamiento! viscoelástico.! Al! mismo! tiempo,! se! observó! una! separación! importante! entre! los! perfiles! entre! G’’! y! G’,! lo! que! corrobora! el! gran! predominio! del! comportamiento! viscoso.! Solamente! OPOD! CC! evidencia! poca! diferencia! entre! las! dos! componentes! (G’’! y! G’),! que! incluso! se! invirtieron! a! frecuencias! inferiores!a!0.1!rad.s-1,!lo!que!indica!que!G’!tiene!mayor!repercusión! en!la!estructura!interna!de!este!aceite.! La!Figura!II.3B!recoge!las!curvas!de!flujo!de!OPOC!C,!OPOC!MA,! OPOD! CC! y! OPOD! MAC.! Todos! los! aceites! se! comportan! como! fluidos!no-Newtonianos!con!flujo!pseudoplásticos!(shear-thinning).! Por! su! parte,! la! Figura! II.4!compara! el! comportamiento! reológico! de! los! aceites! obtenidos! por!refinado!químico!respecto! de! los! obtenidos! por! refinado! físico! clásico! (OPOD! MAC! y! OPOD! MAP).!Para!todos!los!aceites,!la!componente!viscosa!(G’’)!aumentó! con!la!frecuencia!aplicada!(Figura!II.4A).!Por!lo!tanto,!OPOD!MAC!y! OPOD! MAP! fueron! fluidos! viscoelásticos! con! predominio! de! la! componente!viscosa,!similar!al!OPOC!MA.!Además,!se!aprecia!que! OPOD! MAP! mostró! valores! progresivamente! más! bajos! de! G’! respecto!a!OPOD!MAC.! El! comportamiento! de! fluidez! se! puede! observar! en! la! Figura! II.4B,!la! cual!recoge!a!través! de!las! curvas!de!flujo! que!todos! los! aceites!son!fluidos!no-Newtonianos!con!flujo!pseudoplástico.! ! ! CAPÍTULO II 84 para!separar!el!aceite!de!las!paredes!del!recipiente!que!lo!contiene.! Los!resultados!de!TPA!(Tabla!II.5)!indicaron!que!los!procesos!de! refinado! influyen! en! estos! parámetros.! Así! y! tras! el! proceso! de! refinado!químico!para!obtener!los!aceites!desodorizados!(OPOD!CC! y! OPOD! MAC)! se! obtuvieron! valores! similares.! La! comparación! entre!los!procesos!de!refinados!químico!y!físico!clásico,!OPOD!MAC! y! MAP! OPOD,! evidenció! unos! valores! más! bajos! en! todos! los! parámetros,! lo! que! indicó! la! mayor! influencia! del! refinado! físico! clásico.!En!el!caso!de!la!destilación!molecular!y!teniendo!en!cuenta! todas!las!temperaturas,!los!cambios!en!los!valores!de!textura!son! menos!marcados!que!en!el!caso!del!refinado!físico!clásico.! En!resumen,!OPOD!CC!y!OPOD!MAC!se!caracterizaron!por!una! baja!firmeza!y!cohesividad,!lo!que!indicó!que!son!fluidos!y!de!alta! capacidad! de! extensibilidad.! Al! mismo! tiempo,! tuvieron! poca! adhesividad!lo!que!presupone!que!se!retirarán!de!la!piel!fácilmente! si!no!se!hace!un!buen!masaje!sobre!ella!para!que!penetren.!!OPOD! MAP!presenta!las!mismas!características!de!textura.!Por!su!parte,!la! destilación! molecular! proporciona! una! batería! de! OPOD! con! características!óptimas!de!textura!respecto!a!la!fluidez!y!capacidad! de!extensibilidad,!lo!que!de!nuevo!presupone!que!se!retirarán!de!la! piel!fácilmente!si!no!se!hace!un!buen!masaje!sobre!ella!para!que! penetren.! ! ! CAPÍTULO II 85 Tabla!II.5.-!Parámetros!obtenidos!en!el!análisis!del!perfil!de!textura!(TPA)!de!los! aceites!de!orujo!de!oliva!crudos!y!desodorizados!estudiados.! ! ! II.5. CONCLUSIONES! La!temperatura!y,!en!general,!las!condiciones!de!trabajo!de!los! procesos! de! refinado! tuvieron! efectos! importantes! sobre! el! contenido!de!los!compuestos!bioactivos.!Los!procesos!de!refinado! físico,!especialmente!la!destilación!molecular,!contribuyeron!a!un! mejor! rendimiento! en! estos! compuestos.! Además,! de! todos! los! aceites! obtenidos! por! destilación! molecular,! se! eligió! OPOD190! MBP! por! ser! el! único! que! tuvo! simultáneamente! baja! acidez! y! menor!pérdida!de!compuestos!bioactivos.!Sin!embargo,!este!aceite! !! Firmeza!!!!! (N)! Cohesividad! (N.s)! Adhesividad! !!!(N.s)! Refinación!química!! OPOC!C! 0.28! 0.22! 0.04! OPOD!CC! 0.29! 0.28! 0.07! OPOC!MA! 0.42! 0.26! 0.05! OPOD!MAC! 0.30! 0.24! 0.04! Refinación!física! OPOC!MA! 0.42! 0.26! 0.05! OPOD!MAP! 0.17! 0.16! 0.01! OPOC!MB! 0.71! 0.37! 0.16! OPOD140!MBP! 0.54! 0.34! 0.13! OPOD165!MBP! 0.36! 0.26! 0.07! OPOD190!MBP! 0.43! 0.30! 0.09! OPOD215!MBP! 0.54! 0.32! 0.12! CAPÍTULO II 86 mostró! mayor! acidez! que! el! aceite! de! oliva! virgen! extra,! aunque! también!mayores!cantidades!de!todos!los!compuestos!bioactivos,! excepto!del!escualeno.! Después!del!proceso!de!refinado,!los!aceites!de!orujo!de!oliva!se! ajustaron!mejor!al!modelo!reológico!de!Power!Law.!La!pérdida!de! plasticidad! puede! ser! justificada! debido! a! la! eliminación! de! los! componentes!menores!durante!el!proceso.!En!el!OPOC!sometido!a! refinado!por!destilación!molecular,!la!viscosidad!disminuyó!con!el! aumento!de!la!temperatura!de!desodorización!y!con!la!reducción! en!la!cantidad!de!ácidos!grasos!libres,!afectando!así,!a!la!naturaleza! de! las! muestras.! Los! parámetros! de! firmeza,! cohesividad! y! adhesividad!del!análisis!del!perfil!de!textura!evidenciaron!que,!en! general,!todos!los!OPODs!tienen!alta!fluidez!y!extensibilidad,!pero! una!baja!adhesividad.!! A!la!vista!de!los!resultados!obtenidos,!se!puede!concluir!que!la! destilación! molecular! fue! el! mejor! proceso! de! refinado.! Sin! embargo,!es!necesario!mejorar!las!condiciones!de!trabajo!con!el!fin! de! reducir! la! acidez! y! lograr! menores! pérdidas,! si! es! posible,! de! compuestos!bioactivos.!Por!tanto,!se!deben!realizar!otros!estudios! modificando!las!condiciones!de!trabajo!de!la!destilación!molecular! y!utilizando!otros!nuevos!procesos!de!refinación!física.! ! ! CAPÍTULO II 87 II.6. REFERENCIAS! Amelotti!G!(1987).!Effects!of!the!interesterification!for!physical! refining!of!some!olive!oils.!Riv!Ital!Sostanze!Grasse,!64:!223-226.! Aname! Instrumentación! Científica.! http://analisisdetextura.! blogspot.com.es/search/label/An%C3%A1lisis%20de%20Textura.! (Consultado!en!mayo!2016).! Bondioli! P,! Mariani! C,! Lanzani! A,! Fedeli! E,! Muller! A! (1993).! Squalene! recovery! from! olive! oil! deodorizer! distillates.! J! Am! Oil! Chem!Soc.,!70:!763-766.! Cedeño! González! FO,! Prieto! González! MM,! Bada! Gancedo! JC,! Alonso!Suárez!R!(1999).!Estudio!de!la!densidad!y!de!la!viscosidad!de! algunos!ácidos!grasos!puros.!Grasas!Aceites,!50:!359-368.! Draelos! ZD! (2011).Cosmetic! dermatology:! products! and! procedures!John!Wiley!and!Sons,!Oxford.! Fernández-Arche!A,!Márquez-Martín!A,!de!la!Puerta!Vázquez!R,! Perona! J,! Terencio! C,! Pérez-Camino! C,! Ruiz-Gutiérrez! V! (2009).! Long-chain! fatty! alcohols! from! pomace! olive! oil! modulate! the! release! of! proinflammatory! mediators.! J! Nutr! Biochem.,! 20:! 155162.! Márquez-Martín! A,! De! la! Puerta! R,! Fernández-Arche! A,! RuizGutiérrez!V,!Yaqoob!P!(2006).!Modulation!of!cytokine!secretion!by! pentacyclic!triterpenes!from!olive!pomace!oil!human!mononuclear! cells.!Cytokine,!36:!211-217.! Pérez-Camino!MC,!Cert!A!(1999).!Quantitative!determination!of! CAPÍTULO II 88 hydroxypentacyclic!triterpene!acids!in!vegetable!oils.!J!Agric!Food! Chem,!47:!1558-1562.! Rabasco! A,! González! M! (2000).! Lipids! in! pharmaceutical! and! cosmetic!preparations.!Grasas!Aceites,!51:!74-96.! Rabionet!M,!Gorgas!K,!Sandhoff!R!(2014).!Ceramide!synthesis!in! the!epidermis.!BBA-Mol!Cell!Biol!L,!1841:!422-434.! Reddy!LH,!Couvreur!P!(2009).!Squalene:!A!natural!triterpene!for! use!in!disease!management!and!therapy.!Adv!Drug!Deliver!Rev,!61:! 1412-1426.! Regulation! Europee! (EU)! Nº! 1348/2013! amending! Regulation! Europee! (EEC)! Nº! 2568/91! on! the! characteristics! of! olive!oil! and! olive-residue!oil!and!on!the!relevant!methods!of!analysis.!Off!J!Eur! Union.,!L!338,!31-67.! Ruiz-Méndez! MV,! Aguirre-González! MR,! Marmesat! S! (2013).! Olive! Oil! Refining! Process.! In:! Aparicio,! R.,! Harwood,! J.! (Eds.),! Handbook!of!Olive!Oil.!Springer!US,!pp.!715-738.! Ruiz-Méndez!MV,!Ramos!Hinojosa!AE!(2003).!Fatty!acid!esters! with!short!chain!alcohols!in!two!phase!olive!pomace!oils.!Eur!J!Lipid! Sci!Tech.,!105:!346-350.! Ruiz-Méndez! MV,! Dobarganes! MC,! Sánchez! Moral! P! (2010).! Edible!olive!pomace!oil!concentrated!in!triterpenic!acids,!procedure! of!physical!refining!utilized!for!obtainment!thereof!and!recovery!of! functional!components!present!in!the!crude!oil.!Patent!ES!2332977! (A1).! CAPÍTULO II 89 Sánchez-Gutiérrez! CA,! Casas! M,! Lucero! MJ,! Ruiz-Méndez! MV! (2015).!Physico-chemical!and!rheological!characterization!of!olivepomace!oils.!Eur!J!Lipid!Sci!Tech.,!117:!87-91.! Standard! Method! UNE! 55004! (2001).! Quantitative! determination! of! unsaponifiable! matter.! AENOR! (Asociación! Española!de!Normalización!y!Racionalización).!Madrid.! Sun!M,!Tang!Y,!Ding!T,!Liu!M,!Wang!X!(2015).!Investigation!of! cytochrome!P450!inhibitory!properties!of!maslinic!acid,!a!bioactive! compound! from! Olea! europaea! L.,! and! its! structure! activity! relationship.!Phytomed.,!22:!56-65.! Tubaileh! RM,! Garrido-Fernández! A,!Ruiz! Méndez! MV,! LeónCamacho! M,! Graciani-Constante! E! (2002).! Effects! of! deodorization/physical!refining!variables!in!wax!and!fatty!alcohols! content!of!refined!olive!oil.!J!Am!Oil!Chem!Soc.,!79:!67-71.!! UNE-EN! ISO! 5492! (2010).! Análisis! sensorial.! Vocabulario.! (ISO! 5492:2008).! AENOR.! (Asociación! Española! de! Normalización! y! Racionalización).!Madrid.! Verleyen!T,!Sosinska!U,!Verhé!R,!Dewettinck!K,!Huyghebaert!A,! De!Greyt!W!(2002).!Influence!of!the!vegetable!oil!refining!process! on!free!and!esterified!sterols.!!J!Am!Oil!Chem!Soc.,!79:!947-953.! Yuan! W,! Hansen! AC,! Zhang! Q! (2005).! Vapor! pressure! and! normal! boiling! point! predictions! for! pure! methyl! esters! and! biodiesel!fuels.!Fuel.,!84:!943-950.!! ! CAPÍTULO III 91 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! CAPÍTULO)III! ! ! ! INFLUENCIA!DE!LAS!CONDICIONES!DE!LOS!PROCESOS!DE! REFINADO!FÍSICO!PARA!EL!ENRIQUECIMIENTO!DE!LOS! COMPUESTOS!BIOACTIVOS!DEL!ACEITE!DE!ORUJO!DE!OLIVA.! ! ! ! ! ! ! ! CAPÍTULO III 92 ! ! CAPÍTULO III 93 III.1. INTRODUCCIÓN! El! orujo! es! el! residuo! sólido! obtenido! durante! el! proceso! de! extracción!mecánica!del!aceite!de!oliva!virgen!extra!(EVOO).!Está! constituido!principalmente!de!un!residuo!sólido!procedente!de!la! pulpa,!de!la!piel,!del!hueso,!o!semilla!de!las!aceitunas,!del!aceite! retenido! en! dichos! residuos! sólidos! y! de! agua! (Sánchez-Moral! y! Ruiz-Méndez,!2006).!! El!proceso!tradicional!de!extracción!del!aceite!de!orujo!de!oliva! (OPOC)! se! realiza! utilizando! hexano,! un! hidrocarburo! ligero! derivado!del!petróleo,!inmiscible!con!agua.!!Sin!embargo,!si!OPOCs! se! extraen! siguiendo! este! método! tienen! dos! importantes! desventajas.! La! primera,! que! los! aceites! obtenidos! tienen! una! mayor! cantidad! de! fosfolípidos,! ceras! y! una! gran! cantidad! de! compuestos! anómalos,! tales! como! jabones! y! esteres! etílicos.! En! segundo!lugar,!es!necesario!realizar!un!posterior!secado!del!orujo!a! muy! altas! temperaturas,! por! lo! que! debido! a! estas! drásticas! condiciones,! los! OPOCs! obtenidos! contienen! altas! cantidades! de! hidrocarburos!aromáticos!policíclicos!no!usuales!(León-Camacho!y! col.,!2003).! Con!objeto!de!prevenir!y/o!reducir!la!presencia!de!todos!estos! componentes! en! los! OPOCs,! Artacho! (1994)! propuso! un! método! alternativo!al!uso!del!solvente,!el!cual!también!evita!el!secado!del! orujo.! Este! método! alternativo! consiste! en! una! segunda! centrifugación,! después! de! la! separación! inicial! de! EVOO.! La! CAPÍTULO III 100 ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura! III.2.-!Destilador! en! película! descendiente! perteneciente! a! la! empresa! “Oleícola!El!Tejar,!SCA”.! ! III.3.2.3. Determinaciones!analíticas! Las! determinaciones! analíticas! de! compuestos! bioactivos! se! realizaron! sobre! los! aceites! crudos! (OPOCs),! aceites! decolorados! (OPOBs)! y! aceites! desodorizados! (OPODs)! obtenidos! en! los! diferentes! procesos! de! refinado.! Para! ello,! se! siguieron! los! procedimientos! descritos! en! el! Aparado! II.3.2.3! Materiales! y! Métodos!del!Capítulo!II.! ! III.3.2.4. Estudios!reológicos! Los! estudios! reológicos! se! llevaron! a! cabo! de! acuerdo,! igualmente,! con! lo! descrito! en! el! Apartado! II.3.2.4! Materiales! y! Métodos!del!Capítulo!II.! En!relación!a!los!ajustes!a!modelos!reológicos!teóricos,!además! CAPÍTULO III 101 de!la!ecuación!de!Power!Law,!descrita!en!detalle!en!el!Apartado! II.3.2.4!Materiales!y!Métodos!del!Capítulo!II,!se!utilizó!otro!modelo! reológico,! el! modelo! de! Bingham.! Su! ecuación! describe! el! comportamiento! de! esfuerzo! de! cizalla! /! velocidad! de! cizalla! de! muchos!materiales!shear-thinning!a!bajas!velocidades!de!cizalla.!A! menudo!se!utiliza!para!obtener!un!valor!de!tensión!elástica!para!el! material!(Ecuación!III.1):! !!!τ!=!τ0+!ηy.!γ!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Ecuación!III.1! Donde!τ!es!el!esfuerzo!de!cizalla,!τ0!es! el! esfuerzo! umbral! de! plasticidad,! o! la! tensión! correspondiente! a! la! transición! de! la! deformación!elástica!a!plástica,!y!ηγ!es!la!viscosidad!aparente!a!una! velocidad!de!cizalla!determinada!(TA!Instruments).! El!error!estándar!con!valor!más!bajo!se!aplicó!para!la!elección! del!mejor!ajuste!al!modelo!reológico!teórico.! ! III.3.2.5. Análisis!de!los!perfiles!de!textura!(TPA)! Los!perfiles!de!textura!de!los!diferentes!aceites!se!determinaron! según!el!procedimiento!recogido!en!el!Apartado!II.3.2.5.!Materiales! y!Métodos!del!Capítulo!II.! ! III.4. RESULTADOS!y!DISCUSIÓN! III.4.1. Caracterización!química!de!los!aceites!de!orujo!de!oliva! refinados!por!diferentes!procesos!físicos! Tras! las! conclusiones! del! Capítulo! anterior,! se! modificaron! las! CAPÍTULO III 102 condiciones!de!trabajo!de!la!destilación!molecular!(A)!para!obtener! aceites! con! baja! acidez! y! pérdidas! mínimas! de! los! compuestos! bioactivos.! La! Tabla! III.1! muestra! los! resultados! de! las! determinaciones! analíticas! de! OPOC! obtenido! por! extracción! mecánica! (OPOC! A),! decolorado! (OPOB! A)! y! desodorizado! por! destilación!molecular!a!diferentes!temperaturas!(OPOD!AMD).! Como! se! pudo! observar,! el! aumento! de! la! temperatura!de! 190°C!a!265°C,!provocó!que!la!acidez!disminuyera!de!4.38%!a!1.5%.! Además,! y! de! acuerdo! con! el! Capítulo! anterior,! el! contenido! de! compuestos!bioactivos!disminuyó!en!general!con!el!aumento!de!la! temperatura!de!desodorización.!Por! consiguiente,!la!temperatura! del! proceso! de! refinado! disminuyó! considerablemente! la! acidez,! pero! también! degradó! la! calidad! del! aceite.! Estos! resultados! llevaron! a! la! necesidad! de! usar! corriente! de! vapor! con! el! fin! de! equilibrar!este!problema.!Fue!entonces!cuando!se!decidió!llevar!a! cabo! un! nuevo! refinado! físico! a! escala! industrial,! denominado! destilación!en!película!descendente!(Falling!Film,!FF).!Este!proceso! conlleva!numerosas!etapas!de!destilación!e!introduce!también!una! etapa!de!flujo!de!vapor.!Además,!con!el!fin!de!comparar!la!acidez!y! el!contenido!de!compuestos!bioactivos!de!este!nuevo!aceite!(OPOD! BFF),!el!OPOB!B!también!se!sometió!a!destilación!molecular!(OPOD! BMD).!! ! ! ! CAPÍTULO III 103 Tabla! III.1.-! Determinaciones! analíticas! del! aceite! de! orujo! de! oliva! crudo! obtenido! por! extracción! mecánica! (OPOC! A),! aceite! decolorado! (OPOB! A)! y! aceites! desodorizados! obtenidos! por! destilación! molecular! (OPOD! AMD)! a! diferentes!temperaturas!(190,!215,!240!y!265°C).! ! Tabla! III.2.-! Determinaciones! analíticas! del! aceite! de! orujo! de! oliva! crudo! obtenido!por! extracción!mecánica!(OPOC! B),!y! aceites!decolorado!(OPOB! B)!y! desodorizados! obtenidos! por! destilación! molecular! (OPOD! BMD)! y! por! destilación!en!película!descendente!(OPOD!BFF).! ! OPOC! A! OPOB! A! OPOD190! AMD! OPOD215! AMD! OPOD240! AMD! OPOD265! AMD! Acidez!(%)! 5.72! 5.93! 4.38! 3.08! 2.15! 1.50! Ácidos!triterpénicos!(mg/Kg)! 7289! 4900! 5700! 5600! 5900! 5500! Ácido!oleanolico! 4143! 3600! 3400! 3500! 3500! 3300! Ácido!maslínico! 3146! 1300! 2300! 2100! 2400! 2200! Esteres!alquílicos!(%)! 0.47! 0.46! 0.25! 0.17! 0.12! 0.06! Ceras!(mg/kg)! 794! 1113! 1167! 1159! 1173! 1008! Fracción!insaponificable!(%)! 2.52! 1.99! 1.35! 1.23! 1.75! 0.66! Escualeno!(mg/kg)! 2137! 1600! 1500! 1300! 900! 500! Alcoholes!alifáticos!(mg/kg)! 4907! 4308! 3021! 3851! 3341! 3450! Esteroles!(mg/kg)! 3386! 3143! 3529! 3982! 1602! 2555! Alcoholes!triterpénicos!!(mg/kg)! 527! 537! 269! 297! 104! 244! ! OPOC!B! OPOB!B! OPOD!BMD! OPOD!BFF! Acidez!(%)! 30.25! 6.04! 0.42! 0.46! Ácidos!triterpénicos!(mg/Kg)! 2900! 3200! 500! 2700! Ácido!oleanolico! 2200! 2100! 300! 2000! Ácido!maslínico! 700! 1100! 200! 700! Esteres!alquílicos!(%)! 6.00! 1.3! -! -! Ceras!(mg/kg)! 4627! 4364! 4291! 4845! Fracción!insaponificable!(%)! 5.75! 2.04! 1.44! 4.26! Escualeno!(mg/kg)! 25900! 6700! 180! 2600! Alcoholes!alifáticos!(mg/kg)! 10721! 6798! 3234! 3661! Esteroles!(mg/kg)! 3638! 3149! 1755! 3110! Alcoholes!triterpénicos!!(mg/kg)! 194! 341! 313! 337! CAPÍTULO III 104 Así,!la!Tabla!III.2!muestra!los!resultados!de!las!determinaciones! analíticas!del!aceite!de!orujo!de!oliva!crudo!(OPOC!B),!y!los!aceites! decolorados! (OPOB! B)! y! desodorizados! por! destilación! molecular! (OPOD! BMD)! y! por! destilación! en! película! descendente! (OPOD! BFF).!! Acidez!y!ácidos!triterpénicos.!En!relación!a!ambos!procesos!de! destilación,!la!acidez!disminuyó!enormemente!respecto!a!OPOC!B!y! OPOB!B.!Sin!embargo,!la!calidad!de!OPOD!BMD!disminuyó,!desde! un! punto! de! vista! farmacéutico,! porque! los!ácidos! triterpénicos! fueron! eliminados.! Por! el! contrario,! OPOD! BFF! mostró! pérdidas! mínimas! de! estos! compuestos! bioactivos! antiinflamatorios! respecto!a!OPOC!B!y!OPOB!B!(Tabla!III.2).!Esto!podría!atribuirse!a!la! necesidad! de! utilizar! un! vacío! mayor! en! la! destilación! molecular! que!en!la!destilación!en!película!descendente,!debido!a!que!no!se! utiliza!corriente!de!vapor!que!ayude!a!la!destilación!de!los!ácidos! grasos!!libres!presentes!en!el!aceite.! Esteres! alquílicos.! En!ambos! procesos!de! refinación!física,!los! ésteres!alquílicos!se!eliminaron!debido!a!que!estos!compuestos!son! volátiles!a!temperaturas!por!encima!de!165°C!(Yuan!y!col.,!2005).! Este! hecho! es! de! destacar! por! su! importancia! ya! que! son! compuestos!no!bioactivos.!Se!ha!comprobado!que!su!presencia!se! debe! a! la! fermentación! de! materia! vegetal! durante! el! almacenamiento!de!aceite!de!orujo!de!oliva!en!los!tanques!(RuizMéndez!y!Ramos!Hinojosa,!2003).! CAPÍTULO III 105 Ceras.!El!contenido!de!las!ceras!aumentó!durante!la!destilación! en!película!descendente!(Tabla!III.2).!Esto!sugirió!que!se!producían! reacciones! de! esterificación! entre! los! ácidos! grasos! libres! y! los! alcoholes!alifáticos!presentes!en!el!aceite,!según!lo!reseñado!por! Tubaileh!y!col.!(2002).! Materia! insaponificable.! Ya! se! he! mencionado! que! esta! fracción!se!compone!de!escualeno,!esteroles,!alcoholes!alifáticos!y! alcoholes! triterpénicos:! eritrodiol! y! uvaol! (Márquez-Martín! y!col.,! 2006).!Como!se!muestra!en!la!Tabla!III.2,!el!porcentaje!de!materia! insaponificable!disminuyó!con!el!proceso!de!destilación!molecular! (OPOD!BMD).!Esto!podría!atribuirse!principalmente!a!la!eliminación! del!escualeno!y!a!una!eliminación!parcial!de!los!fitoesteroles.!Por!el! contrario,!el!porcentaje!de!materia!insaponificable!aumentó!con!la! destilación! en! película! descendente! (OPOD! BFF)! debido! a! condiciones! de! trabajo! utilizadas! que! fueron! más! suaves! al! usar! corriente!de!vapor.! La!Tabla!III.2! muestra,! además,!las!concentraciones! obtenidas! para!los!diferentes!esteroles!característicos!del!aceite!de!orujo!de! oliva.!De!acuerdo!con!Verleyen!y!col.!(2002),!la!eliminación!parcial! de! los! esteroles! durante! el! proceso! de! refinado,! depende! de! las! condiciones!de!trabajo!en!sus!distintas!etapas.!Así,!con!el!refinado! por! destilación! molecular,! la! concentración! de! estos! compuestos! bioactivos! disminuyó! un! 44%! (de! 3149! a! 1755! mg/Kg),! mientras! que!con!la!destilación!en!película!descendente!solo!disminuyó!un! CAPÍTULO III 106 1.24%!(de!3149!a!3110!mg/Kg).!Un!comportamiento!similar!pudo! observarse!en!el!caso!de!los!alcoholes!alifáticos!y!triterpénicos.! !Teniendo! en! cuenta! todo! lo! anteriormente! indicado,! el! aceite! obtenido! por! refinado! en! destilación! en! película! descendente! alcanzó! las! especificaciones! requeridas! de! forma! más! eficaz! que! con!la!destilación!molecular,!al!contribuir!a!un!rendimiento!mayor! de!los!compuestos!bioactivos.!Por!lo!tanto,!este!aceite!es!la!mejor! opción! para! ser! utilizado! en! la! industria! alimentaria,! cosmética! y! farmacéutica.! ! III.4.2. Caracterización!reológica! La!Figura!III.3!muestra!el!comportamiento!reológico!de!OPOD! BMD!y!OPOD!BFF!(OPOD!obtenidos!por!destilación!molecular!y!por! destilación!en!película!descendente,!respectivamente).! En!ambos!casos! se! observó!(Figura!III.3A)!que,! tras!realizar!el! barrido!de!frecuencia!oscilatoria,!las!componentes!G’!(elástica)!y!G’’! (viscosa)! fueron! dependientes! de! la! frecuencia! aplicada,! aunque! con!predominio!viscoso!(G’’).!Sin!embargo,!la!elasticidad!de!OPOD! BFF! se! comenzó! a! registrar! a! mayor! frecuencia! oscilatoria! que! OPOD! BMD,! lo! que! indica! una! mayor! influencia! elástica! en! el! comportamiento! viscoelástico! de! este! aceite.! La! Figura! III.3B! muestra! las! curvas! de! flujo! de! OPOD! BMD! y! OPOD! BFF.! Ambos! aceites! se! comportaron! como! fluidos! no-Newtonianos! y! con! comportamiento!pseudoplástico.!! CAPÍTULO III 107 La!Tabla!III.3!recoge!los!parámetros!obtenidos!tras!el!ajuste!de! los! datos! a! los! modelos! teóricos! reológicos.! Así,! OPOD! BMD! se! ajustó! al! modelo! de! Bingham,! indicando! un! comportamiento! plástico! inicial! y! Newtoniano! posterior.! Así,! el! esfuerzo! umbral! ó! límite! de! fluidez! (τ0)! señaló! que! es! necesario! aplicar! una! fuerza! mínima! de! 0.052! Pa! para! que! el! aceite! comience! a! fluir! a! continuación!como!un!fluido!newtoniano.!El!valor!de!viscosidad!(η)! fue!muy!pequeño.! Por!otra!parte,!OPOD!BFF!se!ajustó!mejor!al!modelo!de!Power! Law,!lo!que!indicó!un!comportamiento!de!flujo!no-Newtoniano!y! pseudoplástico.!El!valor!del!índice!de!flujo!(n)!fue!cercano!a!1,!por! lo!que!estaba!muy!próximo!a!un!fluido!Newtonianos.!El!índice!de! consistencia!(K),!para!este!tipo!de!fluidos,!está!relacionado!con!la! viscosidad!del!aceite.!Por!ello,!se!pudo!deducir!que!OPOD!BFF!fue! más!viscoso!que!el!OPOD!BMD.! Pese! a! estos! resultados! aparentemente! diferentes,! es! importante!mencionar!que!ambos!aceites!tuvieron!características! similares!en!la!fluidez.!Por!lo!tanto,!los!procesos!de!refinado!físico! estudiado! no! influyeron! sustancialmente! a! las! características! reológicas!de!los!aceites!obtenidos.! ! ! ! ! ! CAPÍTULO III 108 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura! III.3.-! Caracterización! reológica! de! los! aceites! de! orujo! de! oliva! desodorizados!por!destilación!molecular!(OPOD!BMD)!y!destilación!en!película! descendente!(OPOD!BFF).!A)!Barrido!de!frecuencia!oscilatoria.!B)!Curvas!de!flujo.! ! ! ! ! 0,01000 0,1000 1,000 10,00 100,0 ang. frequency (rad/s) 1,000E-6 1,000E-5 1,000E-4 1,000E-3 0,01000 0,1000 1,000 10,00 100,0 G' (Pa) 1,000E-6 1,000E-5 1,000E-4 1,000E-3 0,01000 0,1000 1,000 10,00 100,0 G'' (Pa) OPOD MD OPOD FF 0,01000 0,1000 1,000 10,00 100,0 1000 10000 shear rate (1/s) 0,01000 0,1000 1,000 10,00 100,0 1000 shear stress (Pa) OPOD MD OPOD FF CAPÍTULO III 109 Tabla! III.3.! Parámetros! obtenidos! con! el! modelo! Bingham! y! el! de! Power! Law! para!aceites!de!orujo!de!oliva!desodorizado!obtenidos!por!destilación!molecular! B!y!destilación!en!película!descendente!(OPOD!BMD!y!OPOD!BFF).! ! ! III.4.3. Análisis!de!los!perfiles!de!textura!(TPA)! La!Figura!III.4!muestra!los!resultados!de!TPA!de!OPOD!BMD!y! OPOD!BFF,!indicando!que!el!valor! de!firmeza!de! OPOD!BMD!fue! mayor!que!OPOD!BFF;!si!bien,!ambos!aceites!presentaron!valores! similares!de!cohesividad!y!adhesividad.!Estos!resultados!señalaron! que! OPOD! BMD! y! OPOD! BFF! fueron! muy! fluidos! y! fácilmente! extensibles.! Modelo!de!Bingham!! τ 0!(Pa)! η !(Pa.s)! SE! OPOD!BMD! 0.052! 0.068! 1.090! Modelo!Power!law! K!(Pa·s)! n! SE! OPOD!BFF! 0.153! 0.908! 1.632! CAPÍTULO IV 117 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! CAPÍTULO)IV! ! ! ! ACEITE!DE!ORUJO!DE!OLIVA.!UNA!NUEVA!MATERIA!PRIMA! PARA!EL!DISEÑO!Y!DESARROLLO!DE!FORMULACIONES! DERMATOLÓGICAS!PARA!EL!TRATAMIENTO!DE!ENFERMEDADES! INFLAMATORIAS!CRÓNICAS!DE!LA!PIEL! ! ! ! CAPÍTULO IV 118 ! ! ! CAPÍTULO IV 119 IV.1. INTRODUCCIÓN! Las! enfermedades! inflamatorias! crónicas! de! la! piel! comprenden! un! grupo! importante! de! alteraciones! dermatológicas,! siendo! de! naturaleza! y! características! muy! diferentes.! Entre! las! más!importantes! por! su! prevalencia! en! la! población!se!pueden!citar!a!la!dermatitis!atópica,!la! xerosis,!la! psoriasis,!la!dermatitis!seborréica!y!las!dermatitis!de!contacto.! La!dermatitis!atópica!(DA)!se!diagnostica!entre!el!10!y!el!30%! de!la!población!pediátrica!y!entre!el!1!y!el!3%!de!la!población! adulta.! El! prurito,! una! característica! principal! de! la! DA,! es! a! menudo! severo! y! da! lugar! a! mediciones! de! la! calidad! de! vida! similares!a!las!observadas!con!el!dolor!crónico!(Levy!y!col.,!2015).! La!Xerosis,!o!piel!extremadamente!seca,!es!también!un!trastorno! cutáneo! común! entre! la! población! general,! sobre! todo! tiene! mayor! incidencia! en! las! personas! mayores! (más! de! 75! años).! También! existen! casos! en! los! pacientes! tratados! con! terapias! contra! el! cáncer! (Valentine! y! col.,!2015).! La! psoriasis! es! una! enfermedad! inflamatoria! crónica,! potencialmente! desfigurante,! mediada!por!el!sistema!inmune!de!la!piel,!con!una!prevalencia! del!0.2! al!2%,! dependiendo!del! !origen!de! la!población! (Tsoi!y! col.,! 2012;! Parisi! y! col.,! 2013).! La! dermatitis! seborreica! es! una! enfermedad!inflamatoria!crónica!que!afecta,!aproximadamente,! a! los! adultos! jóvenes! entre! el! 3! y! el! 5%.! Los! hombres! son! frecuentemente! más! afectados! que! las! mujeres.! Se! ha! CAPÍTULO IV 120 demostrado!que!los!agentes!tópicos!que!reducen!la!inflamación! son! eficaces! en! el! tratamiento! de! la! dermatitis! seborreica! (Ramos! y! col.,! 2014;! Balighi! y! col.,! 2016).! Por! último,! la! dermatitis! alérgica! de! contacto! se! considera! una! respuesta! de! hipersensibilidad!de!tipo!retardado,!que!afecta!al!15-20%!de!la! población!general!en!todo!el!mundo!(Honda!y!col.,!2013;!Kostner! y! col.,! 2017).! Por! lo! tanto,! todas! estas! alteraciones! afectan! al! estado!y!apariencia!de!la!piel!y,!por!ello,!a!la!calidad!de!vida!de! los! pacientes! durante! años,! creando! un! serio! problema! socioeconómico.! Cicerale! y! col.! (2012)! demostraron,! en! estudios! con! seres! humanos!y! animales,!que! los!compuestos! fenólicos!del! aceite!de! oliva!virgen!extra!(EVOO)!tenían!efectos!biológicos!potencialmente! beneficiosos! debido! a! sus! actividades! antimicrobianas,! antioxidantes!y!antiinflamatorias.!Sin!embargo,!en!los!últimos!años,! el! interés! por! el! aceite! de! orujo! de! oliva! (OPO)! está! creciendo! debido! a! su! composición! química.! Esto! se! debe! a! que! contiene! todos!los!compuestos!funcionales!de!EVOO,!pero!con!una!mayor! concentración!de! algunos! componentes! minoritarios! y! que,! además,! poseen! propiedades! interesantes! (Pérez-Camino! y! Cert,! 1999).!Así!se!puede!resaltar:!a)!El!escualeno!(ESC),!gran!emoliente! natural!que,!además,!posee!propiedades!antioxidantes,!debido!a!su! estructura! derivada! del! isopreno,! y! aumenta! la! hidratación! de! la! piel! debido! a! la! reducción! de! la! pérdida! de! agua! (Huang! y! col.,! CAPÍTULO IV 121 2009;!Reddy!y!Couvreur,!2009);!b)!Los!ácidos!triterpénicos!(AcTP),! en! particular! el! oleanólico! y! el! maslínico,! presentan! actividades! antimicrobiana,! antihiperglucémica! (Márquez! y! col.,! 2007;! Sato! y! col.,!2007),!antiinflamatoria!y!antitumoral!(Márquez-Martín!y!col.,! 2006;! Braga! y! col.,! 2007;! Martín! y! col.,! 2007).! Ambos! son! componentes!naturales!de!la!piel!de!las!aceitunas,!por!lo!que!estos! compuestos! bioactivos! no! están! en! cantidades! apreciables! en! el! EVOO! (Pérez-Camino! y! Cert,! 1999);! c)! El! Hidroxitirosol! (HT)! tiene! actividades! antimicrobiana,! antioxidante! y! antiinflamatoria! (Cicerale!y!col.,!2012).! Conservar! los! compuestos! bioactivos! del! OPO! durante! el! proceso!de!obtención!es!un!paso!crítico!para!asegurar!su!actividad! biológica!y!consiguiente!valor!farmacéutico,!como!ya!se!describió! en! los! Capítulos! anteriores.! La! selección! de! los! mejores! procesos! para! obtener! el! OPO! se! realizó! en! base! a! las! determinaciones! analíticas!de!los!bioactivos!por!cromatografía!de!gases.!Se!concluyó! que! el! aceite! obtenido! por! destilación! en! película! descendente! (OPOD!FF)!presentó!el!contenido!mayor!en!bioactivos,!seguido!del! aceite!obtenido!por!destilación!molecular!(OPOD!MD).!Por!lo!tanto,! éstos!se!han!elegidos!como!materias!primas!para!la!elaboración!de! las!formulaciones!dermatológicas.! ! IV.2. OBJETIVO! El!objetivo!de!este!Capítulo!fue!el!diseño!y!desarrollo!galénico! CAPÍTULO IV 122 de!dos!formulaciones!dermatológicas,!una!en!forma!de!aceite!seco! y! otra! como! emulsión! O/A.! Además,! se! estudió! su! estabilidad! fisicoquímica! y! se! compararon,! entre! sí,! las! formulaciones! dermatológicas!elaboradas!con!los!dos!aceites:!OPOD!MD!y!OPOD! FF.! Al! mismo! tiempo,! se! realizó! la! caracterización! reológica! y! el! análisis! del! perfil! de! textura.! La! liberación! de! los! compuestos! bioactivos! se! llevó! a! cabo! para! determinar! la! concentración! y! velocidad!a!la!que!se!produce!este!proceso!para!cada!compuesto! bioactivo!en!cada!formulación.!En!definitiva,!no!es!más!que!poder! conocer! cuándo! y! con! qué! cinética! se! va! a! ejercer!el! efecto! dermatológico.!Finalmente,!se!aplicaron!las!Directrices!ICH!para!los! estudios!de!estabilidad!hasta!90!días,!incluyendo!reología,!análisis! de!perfiles!de!textura!y!concentración!de!compuestos!bioactivos,! con!el!fin!de!elegir!las!mejores!formulaciones!para!el!tratamiento! de!enfermedades!inflamatorias!crónicas!de!la!piel.! ! IV.3. MATERIALES!Y!MÉTODOS! IV.3.1. Materiales! OPOD! MD! y! OPOD! FF! se! utilizaron! como! activos! cosméticos! para! las! formulaciones! dermatológicas! ensayadas.! Se! añadieron! otros!ingredientes,!con!distintas!funciones,!con!el!fin!de!obtener!los! productos! cosméticos! perseguidos! en! este! estudio.! Así,! se! agregaron:!Emullium®!Mellifera!(lote!157743,!Gattefossé,!España),! Emolid®! CC! (lote! 1509026,! Industrial! Química! Lasem,! España),! CAPÍTULO IV 123 Tegosoft®! AC! (lote! D714C01069,! Evonic! Industries,! Alemania),! Vitamina! E! (lote! 151465J1,! Acofarma,! España)! y! Nipaguard®! SCE! (lote!DEG4342025,!Clariant!International,!Alemania).! También! se! utilizaron,! para! las! determinaciones! analíticas,! diferentes! reactivos! y! disolventes! con! grado! HPLC:! acetona,! acetonitrilo,!ácido!acético,!ácido!fórmico,!hexano!y!metanol.!Todos! suministrados!por!VWR!Chemicals!(Barcelona,!España).! ! IV.3.2. Métodos! IV.3.2.1. Diseño! y! desarrollo! de! formulaciones! dermatológicas! La! composición! porcentual! de! la! formulación! final! se! ha! decidido! considerarla! confidencial! ya! que! podría! ser! objeto! de! comercialización!y,!por!tanto,!habría! que!tratarla!como!todos!los! productos!cosméticos!puestos!en!el!mercado.!Sólo!se!tendrá!que! dar!a!conocer!cuando!se!registren!en!el!Portal!de!Notificación!de! Productos! Cosméticos! (CPNP),! que! es! un! sistema! gratuito! de! notificación! en! línea! creado! para! la! aplicación! del! Reglamento! Europeo! (CE)! nº! 1223/2009! sobre! productos! cosméticos.! En! el! Anexo! II! del! CPNP! existen! diferentes! formulaciones! marco,! las! cuales!enumeran! la!categoría,!la!función!de!los!ingredientes!y!su! concentración!máxima!en!el!producto!cosmético;!al!mismo!tiempo,! proporciona!la!información!cualitativa!y!la!cuantitativa!cuando!un! producto! cosmético! no! está! compuesto! o! sólo! parcialmente! CAPÍTULO IV 124 compuesto!por!dicha!formulación.! La# denominación# INCI# es# la# nomenclatura# común# que# deberá# usarse¶&la&denominación&de&los&ingredientes&en&el&etiquetado& de# los# productos# cosméticos.# La# abreviatura# “INCI”# (International# Nomenclature!Cosmetic!Ingredient,!Nomenclatura!internacional!de! ingredientes)de)cosméticos))corresponde)a)una)nueva)terminología) elaborada!por!COLIPA!en!respuesta!a!la!necesidad!de!un!sistema! verdaderamente!internacional.!! ! Aceites!secos! OPOD!MD!y!OPOD!FF!se!utilizaron!por!contener!los!compuestos! bioactivos!y!como!ingredientes!mayoritarios!de!sus!formulaciones! respectivas.! Emolid®! CC! (denominación! INCI:! Coco! caprylate/caprate)! y! Tegosoft®! AC! (denominación! INCI:! Isoamyl! cocoate)!son!ésteres!de!cadena!corta!y!se!usaron!para!disminuir!la! viscosidad! y! sensación! grasa! del! aceite! cuando! se! aplica! sobre! la! piel!y!así!obtener!el!denominado!aceite!seco.!Vitamina!E!(nombre! INCI:! Tocopheryl! acetate)! y! Nipaguard®! SCE! (denominación! INCI:! Sorbitan! Caprylate,! (and)! Propanediol! (and)! Benzoic! Acid)! se! incorporaron!como!antioxidante!y!conservante,!respectivamente.! ! ! ! ! CAPÍTULO IV 125 Número!fórmula!Marco:!1.10!-!2011! ACEITE!PARA!LA!PIEL! ! Ingredientes! ! !! !!!!!!!!!!Niveles!máximos!(%!p/p)! Etanol!(alcohol,!alcohol!denat.)!!!!!90! Siliconas,!también!las!volátiles! (cyclopentasiloxane,!dimethicone)! ! ! 30! Humectantes!(glycerin)!!!!!!20! Extractos!de!plantas!(rosemary,!camomile)!! ! 10! Emulsificantes!y!surfactants!aniónicos,!anfotéricos! !y!no!iónicos!(steareth-2,!steareth-4)!!!!10! Espesantes!(dextrin!palmitate)!!!!!!!5! Parfum!!!!!!!!!!!5! Otros!ingredientes! (antioxidantes,!colorantes,!aqua)!! ! ! !5! Conservantes!y!antimicrobianos! ! !!!!!!!!!!!!!1,5! Colorantes!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!1! Aceites!(vegetales!o!minerales)!!!!!!!q.s.!100! ! Las! diferentes! formulaciones! se! han! elaborado! mezclando! todos!los!ingredientes,!a!temperatura!ambiente,!con!un!Silverson! (Modelo! L4RT)! a! 2500! rpm! durante! 30! minutos,! hasta! completa! homogeneización.! Los! aceites! secos! obtenidos! para! aplicación! sobre!la!piel!se!denominaron!O!OPOD!MD!(cuyo!aceite!base!fue!el! CAPÍTULO IV 132 tres! vasos! de! disolución! de! 200! ml! (USP! XXXIX,! Apparatus! II.! Erweka,!Alemania).!El!medio!de!disolución!estuvo!compuesto!por! agua! purificada! y! polisorbato! 80! (2%! v/v)! y! la! temperatura! del! ensayo!fue!de!37°C.!El!espacio!entre!el!dispositivo!y!la!paleta!fue!de! 3!cm!y!la!velocidad!de!rotación!de!100!rpm.!El!ensayo!duró!24!h!y! se!tomaron!muestras!manualmente!a!las!0.25,!0.5,!1,!2,!4,!6,!8,!10!y! 24! h.! La! determinación! de! la! concentración! de! los! compuestos! bioactivos!se!llevó!a!cabo!como!se!describe!en!este!mismo!Capítulo! en!la!sección!IV.3.2.4.! Los!datos!de!liberación!presentaron,!en!general,!un!buen!ajuste! a! la! ecuación! de! Higuchi! (Higuchi,! 1961)! (Ecuación.! IV.3),! que! se! aplicó!para!valores!de!Mt/M∞!≤!0.6.!! !! !! =𝐾𝑡! !! ! ! Ecuación!IV.3! Donde!Mt!/!M∞!es!la!fracción!liberada!del!compuesto!bioactivo! a!tiempo!t;!K!es!la!constante!cinética!de!Higuchi!y!t!es!el!tiempo!de! liberación.! ! IV.3.2.6. Estudio!de!estabilidad! El! estudio! de! estabilidad! de! las! formulaciones! estudiadas! se! llevó!a!cabo!durante!3!meses!(90!días),!envasándolas!en!frascos!de! vidrio!opaco!y!protegidos!de!la!luz,!tal!y!como!describe!la!ICH!Q1A! (R2)!(Normativa!ICH,!2003).!Los!envases!de!100!ml!se!almacenaron! en!cámaras!climáticas!a!las!temperaturas!de!5,!25!y!40°C.!Las!tomas! de! muestra! se! realizaron! a! los! tiempos! 0,! 30,! 60! y! 90! días,! CAPÍTULO IV 133 estudiándose!tanto!las!propiedades!reológicas!y!el!análisis!de!perfil! de!textura!como!el!contenido!de!compuestos!bioactivos.! ! IV.4. RESULTADOS!y!DISCUSIÓN! IV.4.1. Caracterización!reológica! La! Figura! IV.1! muestra! el! comportamiento! reológico! de! todas! las!formulaciones!(O!OPOD!MD,!O!OPOD!FF,!E!OPOD!MD!y!E!OPOD! FF).! La! Figura! IV.1A! presenta! el! barrido! de! frecuencia! oscilatoria! para!el!estudio!de!la!viscoelasticidad!de!los!aceites!secos!(O!OPOD! MD! y! O! OPOD! FF).! El! O! OPOD! MD! se! mostró! como! un! fluido! viscoso,!mientras!el!O!OPOD!FF!lo!hizo!como!un!fluido!viscoelástico,! presentando!un!predominio!de!la!componente!viscosa!(G'')!sobre!la! elástica!(G')!y!un!punto!de!reticulación!a!partir!de!100!rad.s-1.!En!el! caso! de! las! emulsiones! O/A! (E! OPOD! MD! y! E! OPOD! FF)! (Figura! IV.1B),! G'! y! G´´! fueron! dependientes! de! la! frecuencia! aplicada,! predominando!la!componente!elástica!(G')!sobre!la!viscosa!(G''),!lo! que!indica!que!son!fluidos!altamente!estructurados!y!alcanzando!la! estructura!de!gel!reológico!a!frecuencias!altas.!El!barrido!de!estrés! oscilatorio!mostró!que!E!OPOD!MD!tuvo!un!valor!crítico!de!15.89! Pa! mientras! que! E! OPOD! FF! lo! fue! a! 6.32! Pa,! indicativo! de! una! mayor! estructuración! que,! además,! se! reflejó! en! el! correspondiente!barrido!de!frecuencia.! La!Figura!IV.1C!muestra!las!curvas!de!flujo!de!O!OPOD!MD!y!O! OPOD!FF.!Claramente!se!observa!que!ambos!aceites!son!fluidos!no-! CAPÍTULO IV 134 Newtonianos! con! un! comportamiento! de! flujo! pseudoplástico.! El! mejor! ajuste! a! los! modelos! teóricos! fue! al! de! Power! Law! (Tabla! IV.1),!corroborando!así!el!flujo!antes!mencionado.!Si!bien,!al!estar! el! índice! de! flujo! (n)! cercano! a! la! unidad,! denota! que! su! comportamiento! reológico! es! casi! como! el! de! los! fluidos! Newtonianos.!Por!su!parte,!el!índice!de!consistencia!(K),!parámetro! relacionado!con!la!viscosidad!del!aceite,!señaló!que!ambos!aceites! secos!fueron!muy!poco!viscosos!y!con!valores!muy!similares.!! !La! Figura! IV.1D! muestra! las! curvas! de! viscosidad! de! las! emulsiones!O/A!E!OPOD!MD!y!E!OPOD!FF,!ajustándose!al!modelo! de!Carreau!(Tabla!IV.1).!Este!modelo!es!característico!de!los!fluidos! estructurados!que,!además,!fluyen!como!pseudoplásticos.!Así,!los! parámetros!obtenidos!indicaron!que!las!η0!son!mucho!mayores!(del! orden!a!105)!que!las!η∞!(del!orden!a!10-1!y!10-2!respectivamente).! Además,! mostraron! una! importante! estructura! interna! como! consecuencia!de!su!elevado!tiempo!de!relajación!(λ).!Pese!a!ello,! son! fluidos! viscoelásticos! con! comportamiento! pseudoplástico! (shear-thinning)!ya!que!el!índice!de!flujo!(n)!es!inferior!a!la!unidad.! CAPÍTULO IV 135 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura!IV.!1.-.!Caracterización!reológica!de!las!fórmulas!estudiadas.!A)!Barrido!de! frecuencia! oscilatoria! (O! OPOD! MD! y! O! OPOD! FF).! B)! Barrido! de! frecuencia! oscilatoria!(E!OPOD!MD!y!E!OPOD!FF).!C)!Curvas!de!flujo!(O!OPOD!MD!y!O!OPOD! FF).!D)!Curvas!de!viscosidad!(E!OPOD!MD!y!E!OPOD!FF).! CAPÍTULO IV 136 Tabla! IV.! 1.-! Parámetros! obtenidos! en! el! ajuste! a! los! modelos! Power! Law! y! Carreau!para!las!formulaciones!O!OPOD!MD,!O!OPOD!FF,!E!OPOD!MD!y!E!OPOD! FF!(aceites!secos!y!emulsiones!O/A!respectivamente).!(K,!índice!de!consistencia;! η 0,!viscosidad! a! velocidad! de! cizalla! cero;! η∞ ,!viscosidad! a! velocidad! de! cizalla! infinita;! λ ,!tiempo!de!relajación;!n,!índice!de!flujo;!SE,!error!estándar).! ! IV.4.2. Análisis!de!los!perfiles!de!textura!(TPA)! La!Tabla!IV.2!muestra!los!resultados!del!TPA.!Así,!O!OPOD!MD!y!O! OPOD!FF!mostraron!valores!de!firmeza!diferentes,!siendo!más!altos!en!el! primer! aceite.! La! cohesividad! fue! similar! en! los! dos! casos,! mientras! la! adhesividad! se! mostró! distinta.! Por! su! parte,! los! valores! de! los! tres! parámetros! del! TPA! fueron!superiores! para! la! emulsión! E! OPOD! MD! respecto!a!la!E!OPOD!FF.! ! ! ! ! ! Modelo!de! Power!law! K!(Pa·s)! n! SE! O!OPOD!MD! 0.05859! 0.9978! 0.9244! O!OPOD!FF! 0.05999! 0.9961! 0.7225! Modelo!de! Carreau! η0!(Pa·s)! η∞(Pa·s)! λ!(s)! n! SE! E!OPOD!MD! 2.36·105! 0.232! 22230! 0.9001! 13.01! E!OPOD!FF! 3.43·105! 0.046! 19260! 0.9377! 6.06! CAPÍTULO IV 137 Tabla! IV.! 2.-Parámetros! obtenidos! en! el! análisis! del! perfil! de! textura! de! las! formulaciones!estudiadas!de!aceites!secos!y!emulsiones!O/A.!! ! Las!diferencias!observadas!entre!el!TPA!de!los!aceites!secos!y!el!de!las! emulsiones! O/A! se! relacionaron! claramente! con! los! parámetros! reológicos! obtenidos;! es! decir,! las! formulaciones! más! cohesivas! y! con! mayor!firmeza!son!las!que!poseen!una!estructura!interna!más!coherente! y! de! mayor! capacidad! elástica.! En! cualquier! caso,! las! formulaciones! estudiadas!son!muy!fluidas!y!fácilmente!extensibles.! ! IV.4.3. Estudio!de!liberación!de!los!compuestos!bioactivos! Los! perfiles! de! liberación! de! las! sustancias! bioactivas! de! las! formulaciones!estudiadas!(Figura!IV.2)!mostraron,!como!cabría!esperar,! una!liberación!más!rápida!para!los!aceites!secos!que!para!las!emulsiones! O/A.!Así,!en! el! primer!caso!se!liberó!un!99%! de! todos! los!compuestos! bioactivos! a! las! 24! h,! mientras! que! las! emulsiones! O/A,! en! el! mismo! tiempo,!liberaron!entre!90-91%!de!ESC,!90-93%!de!AcTP!y!90-95%!de!HT.! En! todos! los! ensayos! se! determinaron! desviaciones! estándares! muy! pequeñas.!! ! ! Firmeza!(N)! Cohesividad!(N.s)! Adhesividad!(N.s)! O!OPOD!MD! 0.059! 2.79! 0.00825! O!OPOD!FF! 0.013! 2.78! 0.01107! E!OPOD!MD! 0.761! 14.87! 1.248! E!OPOD!FF! 0.460! 9.71! 0.572! CAPÍTULO IV 138 Estos! perfiles! de! liberación! se! justificaron! teniendo! en! cuenta! la! solubilidad!en!agua!de!los!componentes!bioactivos,!siendo!de!mayor!a! menor!para!el!HT,!seguido!por!el!AcTP!y!finalizando!con!el!ESC.! Los!datos!de!liberación!presentaron,!en!general,!un!buen!ajuste!a!la! ecuación!de!Higuchi!(Tabla!IV.3).!Como!se!puede!observar,!la!constante! de!Higuchi!(k)!fue!mayor!en!el!caso!de!las!formulaciones!que!utilizaban!el! OPOD!FF!como!base.!Por!otro!lado,!los!aceites!presentan!una!mayor!k! respecto! a! las! emulsiones! O/A,! indicando! que! su! liberación! es! más! rápida.! Las! características! reológicas! de! las! formulaciones! estudiadas! ayudaron! a! justificar! sus! perfiles! de! liberación.! Así,! la! capacidad! viscoelástica! de! las! emulsiones!O/A!ocasionó! un! enlentecimiento!en! la! liberación!de!los!compuestos!bioactivos!y!más!aún!cuando,!además,!la!E! OPOD!FF!tenía!estructura!de!gel!reológico.!Por!su!parte,!los!aceites!secos! que! se! comportaron! como! fluidos! viscosos,! liberaron! los! activos! más! rápidamente.! Por! otra! parte,! todas! las! formulaciones! tuvieron! poca! viscosidad,!por!lo!que!la!textura!final!de!las!mismas!no!afectó!al!proceso! de!liberación.!En!definitiva,!la!estructura!interna!de!los!sistemas!físicos! elaborados! influyó! en! la! capacidad! de! liberación! de! las! formulaciones! ensayadas.!! ! ! ! ! ! CAPÍTULO IV 139 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura! IV.! 2.-! Perfiles! de! liberación! de! los! compuestos! bioactivos! de! las! formulaciones!estudiadas.!! 0! 50! 100! 0! 10! 20! Liberación! bioactivos!(%)! Tiempo!(horas)! E!OPOD!FF! ESC! AcTP! HT! 0! 50! 100! 0! 10! 20! Liberación! bioactivos!(%)! Tiempo!(horas)! E!OPOD!MD! ESC! AcTP! HT! 0! 50! 100! 0! 10! 20! Liberación! bioactivos!(%)! Tiempo!(horas)! O!OPOD!MD! ESC! AcTP! HT! 0! 50! 100! 0! 10! 20! Liberación! bioactivos!(%)! Tiempo!(horas)! O!OPOD!FF! ESC! AcTP! HT! CAPÍTULO IV 140 Tabla!IV.3.!Parámetros!obtenidos!al!aplicar!la!ecuación!de!Higuchi!en!el!estudio! de!liberación!de!compuestos!bioactivos!(k,!constante!de!Higuchi;!r2,!coeficiente! de!determinación).! ! ! IV.4.4. !Estudios!de!estabilidad! Los!estudios!de!estabilidad!de!los!aceites!secos!y!las!emulsiones!O/A! mostraron! su! estabilidad! física! a! todos! los! tiempos! y! temperaturas! estudiadas.!Sin!embargo,!las!emulsiones!almacenadas!durante!30!días!a! 40°C! sufrieron! un! cremado,! pero! que! pudieron! ser! reconstituidas! por! simple!agitación!(Figura.!IV.3).! ! ! ! ! ! ! ! ! HIGUCHI! ! K! r2! K! r2! K! r2! ! ESC! AcTP! HT! O!OPOD!MD! 5.80! 0.98! 5.80! 0.96! 6.24! 0.99! O!OPOD!FF! 5.93! 0.98! 6.37! 0.99! 6.54! 0.99! E!OPOD!MD! 5.38! 0.95! 5.48! 0.99! 6.06! 0.99! E!OPOD!FF! 5.77! 0.99! 5.79! 0.99! 6.27! 0.99! CAPÍTULO IV 141 ! ! ! ! ! ! ! ! Figura!IV.!3.-!Apariencia!de!las!emulsiones!O/A!almacenadas!durante!24!h!y!30! días!a!40°C.! ! IV.4.4.1. Estabilidad!reológica! La!Figura!IV.4!muestra!la!estabilidad!reológica!a!tiempo!0,!30,!60! y!90!días!(25°C)!de!los!aceites!secos!(O!OPOD!MD!y!O!OPOD!FF),! tanto! en! lo! que! se! refiere! a! las! curvas! de! barrido! de! frecuencia! oscilatoria!(Figuras!IV.4A!y!IV.4B)!como!a!las!curvas!de!flujo!(Figuras! IV.4C!y!IV.4D).!De!nuevo,!las!curvas!de!flujo!se!ajustaron!al!modelo! de!Power!Law!(Tabla!IV.4).! La!Figura!IV.5!muestra!la!estabilidad!reológica!a!tiempo!0,!30,!60! 24!Horas! 30!Días! 30!Días!con!agitación!