Implicación de los micrornas en la obtención de células productoras de insulina a partir de células troncales pluripotentes

Dirigida por: Dr. Abdelkrim Hmadcha Dr. Bernat Soria Escoms IMPLICACIÓN DE LOS MICRORNAS EN LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA A PARTIR DE CÉLULAS TRONCALES PLURIPOTENTES CABIMER Memoria del trabajo de investigación presentada por D. Emilio Javier López Beas para optar al grado de Doctor. Sevilla, 2017 Dr. Bernat Soria Escoms, Director del Departamento de Células Troncales del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER) y Dr. Abdelkrim Hmadcha, Investigador del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), CERTIFICAN QUE: El trabajo de investigación presentado por D. Emilio Javier López Beas titulado “Implicación de los microRNAs en la obtención de células productoras de insulina a partir de células troncales pluripotentes” ha sido realizado bajo su supervisión y dirección en el Departamento de Células Troncales de CABIMER, y reúne los requisitos de originalidad y calidad científica necesarios para ser defendido ante un tribunal con el fin de optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Y para que así conste y a efectos oportunos, firman el presente informe en Sevilla a 21 de Julio de 2016. VºBº de los directores del trabajo. Dr. Bernat Soria Escoms Dr. Abdelkrim Hmadcha Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Regeneración y Terapia Celular del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER) y con la ayuda de un contrato para la formación de Personal Investigador de la Fundación Progreso y Salud (FPS). Durante el periodo del contrato de formación se han publicado los siguientes trabajos: ARTÍCULOS PUBLICADOS López-Beas, J.; Soria, B.; Hmadcha, A. MicroRNAs modulate differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing β-like cells and contribute to maturation. Manuscrito en preparación Pezzolla, D.; López-Beas, J.; Lachaud, CC.; Domínguez-Rodríguez, A.; Smani, T.; Hmadcha, A.; Soria, B. 2015. Resveratrol ameliorates the maturation process of β-cell-like cells obtained from an optimized differentiation protocol of human embryonic stem cells. PLoS One. 10:e0119904. Lachaud, CC.; Lopez-Beas, J.; Soria, B.; Hmadcha, A. Cell Death & Disease. 2014. EGF-induced adipose tissue mesothelial cells undergo functional vascular smooth muscle differentiation. Cell Death Dis. 5:e1304. CAPÍTULOS DE LIBRO Soria, B.; Pezzolla, D.; López, J.; Rojas, A.; Hmadcha, A. 2013. Principles of Tissue Engineering. Generation of Pancreatic Islets from Stem Cells. 41:837-47. CONGRESOS Reunión Anual del Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM). Barcelona, España. 2017. Comunicación oral. “Generating an Advanced Therapy Medicinal Product (CAB-001) using the CABIMER Differentiation Protocol” López-Beas, J.; Vakilian, M.; Capilla-González, V.; Aguilera, Y.; Escacena, N.; Tejedo, JR.; Bedoya, FJ.; Martín, F.; Soria, B.; Hmadcha, A. Reunión anual del Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM). Barcelona, España. 2016. Póster: "In-vitro differentiation of insulinproducing cells from human embryonic stem cells: The cabimer protocol". Hmadcha, A.; LópezBeas, J.; Pezzolla, D.; Salguero-Aranda, C.; Tejedo, J.; Bedoya, FJ.; Martin, F.; Soria, B. Reunión anual de la Red de Terapia celular (TerCel). Sevilla, España. 2016. Póster: “Producing mature insulin-producing cells from human pluripotent stem cells as a cell-based medicinal product”. Pascual, S.; Vakilian, M.; López-Beas, J.; Mellado, N.; Aguilera, Y.; Escacena, N.; Jiménez, V.; Gálvez, M.; Soria, B.; Hmadcha, A. International Society for Stem Cell Research (ISSCR): Annual International Meeting. Estocolmo, Suecia. 2015. Póster: “microRNAs modulate differentiation in mouse and human embryonic stem cells into insulin-producing cells and contribute to maturation". López-Beas, J.; Lachaud, CC.; Aguilera, Y.; Mellado, N.; Hmadcha, A.; Soria, B. Reunión anual de la Red de Terapia celular (TerCel). Sevilla, España. 2015. Póster: “MicroRNAs modulate differentiation in human embryonic stem cells into insulin producing β-like cells and contribute to maturation”. López-Beas, J.; Lachaud, CC.; Aguilera, Y.; Mellado, N.; Hmadcha, A.; Soria, B. Reunión anual del Grupo de Trabajo de Islotes Pancreáticos de la Sociedad Española de Diabetes (SED). Madrid, España. 2014. Comunicación oral: "Los microRNAs modulan la diferenciación de las células troncales embrionarias hacia células productoras de insulina". López-Beas, J.; Soria, B.; Hmadcha, A. The European Summer School on Stem Cells & Regenerative Medicine. Hydra, Grecia. 2014. Póster: "microRNAs modulate differentiation in mouse and human embryonic stem cells into insulin-producing cells and contributes to maturation". López-Beas, J.; Pezzolla, D.; Aguilera, Y.; Mellado, N.; Hmadcha, A.; Soria, B. "No tengo ningún talento en especial, sólo soy apasionadamente curioso". Albert Einstein A mi familia y mis dos estrellas del cielo, que siempre iluminan mi camino, Teodora y Manuel. Agradecimientos Esta tesis doctoral no hubiera sido posible sin el impulso de todas aquellas personas que me han ayudado personalmente en el desarrollo de un trabajo de esta índole, comenzando por sus directores, los doctores Abdelkrim Hmadcha y Bernat Soria, quienes confiaron en mí y me dieron la oportunidad de realizar uno de los retos más importantes de mi vida en el Departamento de Regeneración y Terapia Celular del CABIMER. Agradecer a Karim su dedicación y estímulo, además de sus siempre acertados consejos y de mantener siempre abierta la puerta para ayudar en todo lo posible y al doctor Tarik Smani, tutor del programa de doctorado, por su vinculación e interés. A todos los integrantes del grupo, por su paciencia, sobre todo en los inicios cuando necesité su estrecha colaboración para ampliar mis conocimientos y aptitudes en el laboratorio y poder valerme por mi mismo. Nuria y Yolanda, por vuestra fundamental labor en este grupo y la inestimable ayuda que nos proporcionáis, siempre dispuestas a colaborar con nuestro trabajo. Mis dos compañeras de fatigas durante mucho tiempo, a un lado Daniela que fue marcando el camino para que todo me fuera un poco más fácil y que nos alegraba los días con su mano especial en la repostería y ese tiramisú que nunca olvidaremos y al otro Natalia, dispuesta siempre a colaborar en todo lo que esté en su mano y que desprende un halo de constancia y esfuerzo que contagia a quien la rodea. Christian por compartir su amplio conocimiento conmigo que me ha hecho aprender y mejorar con acertadas sugerencias, y con esos “ingenios” que nos hacen la vida un poco más fácil en el laboratorio. Las últimas y grandes incorporaciones al grupo con Vivian que ha transmitido optimismo y positividad desde su llegada, y que con su experiencia me ha ayudado mucho en la recta final del trabajo para culminarlo de la mejor forma posible, Sandra que aunque por menos tiempo del que nos habría gustado, CONTENIDO iv 3.1. BIOÉTICA Y EXPERIMENTACIÓN ANIMAL 75 3.1.1. OBTENCIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS A PARTIR DE TEJIDOS DE ORIGEN MURINO 75 3.2. CULTIVO CELULAR 76 3.2.1. LÍNEAS CELULARES CULTIVADAS Y CONDICIONES DE CULTIVO 76 3.2.2. PROTOCOLO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR 78 3.3. ANÁLISIS FUNCIONAL DE LOS MIRNAS 81 3.3.1. OBTENCIÓN DE LOS MIRNAS: POOL DE MIRNAS Y MIRNAS SINTÉTICOS 81 3.3.2. TRANSFECCIÓN DE LOS MIRNAS 82 3.4. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 84 3.4.1. EXTRACCIÓN DEL RNA 84 3.4.2. RETROTRANSCRIPCIÓN O TRANSCRIPCIÓN INVERSA 85 3.4.3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA CON TRANSCRIPTASA INVERSA (RTPCR) 86 3.4.4. PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL (QPCR) 89 3.4.5. MICROARRAY DE EXPRESIÓN GÉNICA DE MIRNAS 92 3.4.6. HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH) DE MIRNAS 94 3.4.7. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS 95 3.4.8. ELECTROFORESIS EN SDS-PAGE 96 3.4.9. TRANSFERENCIA E INMUNODETECCIÓN DE LAS PROTEÍNAS: WESTERN BLOT (WB) 96 3.4.10. INMUNOFLUORESCENCIA (IF) 98 3.4.11. ENSAYO POR INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA) 99 3.4.12. FOSFATASA ALCALINA 99 3.5. MICROSCOPÍA 100 3.6. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO 100 3.6.1. ANÁLISIS PREDICTIVO DE DIANAS DE MIRNAS 101 3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 103 4. RESULTADOS 105 4.1. CARACTERIZACIÓN DE LÍNEAS CELULARES PLURIPOTENTES 107 4.2. EL PÁNCREAS Y LAS PEQUEÑAS MOLÉCULAS DE NCRNA 110 4.2.1. LAS PEQUEÑAS MOLÉCULAS DE NCRNA EN LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES 110 4.2.2. EXPRESIÓN DE LOS MIRNAS CARACTERÍSTICOS DEL PÁNCREAS 117 4.3. ANÁLISIS DE MIRNAS EN LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES 120 4.3.1. DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES HACIA CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA 120 4.3.2. PERFIL DE EXPRESIÓN DE LOS MIRNAS EN LAS CTES 126 4.3.3. LOS MIRNAS Y LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES 131 4.3.4. LOS MIRNAS Y LOS ISLOTES PANCREÁTICOS 134 CONTENIDO v 4.4. LOS MIRNAS Y LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA A PARTIR DE CTES 142 4.4.1. SELECCIÓN DE LOS MIRNAS PANCREÁTICOS CANDIDATOS 142 4.4.2. MECANISMOS DE INDUCCIÓN Y SUPRESIÓN DE LOS MIRNAS PANCREÁTICOS EN LAS CTES 146 4.4.3. EFECTO DE LA INDUCCIÓN DE LOS MIRNAS PANCREÁTICOS 149 5. DISCUSIÓN 161 5.1. POTENCIAL REGULADOR DEL POOL DE PEQUEÑAS MOLÉCULAS DE NCRNA PANCREÁTICAS EN LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES MURINAS 164 5.2. LOS MIRNAS PANCREÁTICOS 171 5.3. IMPLICACIÓN DE LOS MIRNAS EN LAS CÉLULAS BETA PANCREÁTICAS 175 5.4. LOS MIRNAS Y LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES: IMPLICACIÓN EN LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA 179 5.5. UTILIDAD DE LOS MIRNAS EN LA DIFERENCIACIÓN PANCREÁTICA DE LAS CTES 189 6. CONCLUSIONES 201 7. BIBLIOGRAFÍA 205 vii RESUMEN La diabetes mellitus es un desorden metabólico que aparece cuando el páncreas no produce insulina suficiente o cuando el organismo no utiliza eficazmente la insulina dando lugar a la incapacidad para mantener la normoglucemia, desencadenando una situación de hiperglucemia crónica que produce daños a corto y largo plazo en muchos órganos y sistemas del organismo. Un aspecto central en el desarrollo de la diabetes es la reducción en el número de células beta pancreáticas que son las encargadas de producir insulina. Las limitaciones del tratamiento actual de la diabetes han estimulado la búsqueda de terapias que permitan restaurar la masa celular beta perdida para conseguir alcanzar la normoglucemia. La diferenciación de las células troncales pluripotentes hacia células productoras de insulina permitiría disponer de una fuente inagotable de células para una terapia alternativa. Sin embargo, los métodos disponibles hasta el momento presentan varios inconvenientes como son un bajo rendimiento, una difícil reproducibilidad y baja eficacia con la generación de células con un fenotipo inmaduro. Nuestro grupo fue pionero en demostrar que las células troncales embrionarias (CTEs) murinas pueden diferenciarse in vitro hacia células productoras de insulina y revertir in vivo la glucemia en modelos murinos diabéticos, estudios posteriores han demostrado que los protocolos de diferenciación in vitro pueden ser optimizados mediante el uso de diversos factores de crecimiento para aumentar la eficacia y eficiencia, consiguiendo células beta pancreáticas maduras funcionales en cantidad suficiente para una posible terapia celular. Sin embargo, las etapas de maduración son susceptibles de mejoras y además los factores necesarios para el proceso de diferenciación son extremadamente caros, esto ha suscitado un gran interés por la investigación de los microRNAs (miRNAs) como factores clave en la diferenciación que podrían sustituirlos. viii La propuesta en este trabajo de investigación gira en torno a una mejora de la eficacia y eficiencia del proceso de diferenciación de las células troncales pluripotentes hacia células productoras de insulina, mediante un mecanismo regulador innovador ejercido por pequeñas moléculas de RNAs no codificantes como son los miRNAs, de forma que podrán constituir herramientas moleculares útiles en la manipulación de las CTEs. En nuestro trabajo, identificamos el perfil de expresión específico de miRNAs en las células troncales pluripotentes (Familia miR-302) y durante el proceso de diferenciación para obtener células productoras de insulina (miR-7, -375, -373, -15a/b, -16, -148a y -29b), así como aquellos miRNAs con una expresión preferente en los islotes pancreáticos, entre los que destacan miR-7 y -375, que varios trabajos sitúan como dos de los miRNAs más abundantes en páncreas, necesarios para un correcto desarrollo pancreático. Los resultados obtenidos revelan que miR-7 posee un importante papel en la obtención de células productoras de insulina a partir de células troncales, mejorando la sensibilidad de las células obtenidas a la liberación de insulina dependiente de los estímulos de glucosa. En conclusión, la generación de células productoras de insulina mediante miRNAs específicos en ausencia de factores de crecimiento resulta por el momento una meta lejana de alcanzar. Sin embargo, la mejora en los procesos de maduración para obtener células completamente funcionales mediante la combinación de factores de crecimiento y miRNAs es prometedora, aunque constituye un enfoque que se enfrenta a múltiples desafíos. Los próximos años revelaran el potencial real de los miRNAs como nuevas herramientas para la prevención y el tratamiento de la diabetes, revolucionando muchos de los actuales modelos en ciencias biomédicas. ABREVIATURAS ABREVIATURAS xi Ab Antibody (Anticuerpo) ABCA1 ATP binding cassette subfamily A member 1 (Miembro 1 de la subfamilia A de casetes de union a ATP) ACTB Actin, beta (Beta actina) Acvr2a Activin receptor type-2A (Receptor de Activina tipo 2A) ADA American diabetes association (Asociación americana de diabetes) ADP Adenosine diphosphate (Adenosín difosfato) Ago Proteína argonauta Ago2 proteína argonauta-2 AKT Serine/threonine kinase 1 (Serina/treonina quinasa 1) AMY2A5 Amylase 2a5 (Amilasa) ANOVA Analysis of variance (Análisis de variación) AP Alkaline phosphatase (Fosfatasa alcalina) APC Adenomatous polyposis coli ATP Adenosine triphosphate (Adenosín trifosfato) AU Arbitrary units (Unidades arbitrarias) BCL2 B cell leukemia/lymphoma 2 (Linfoma de células B 2) bFGF Basic fibroblast growth factor (Factor de crecimiento fibroblástico básico) BHLHE22 Basic helix-loop-helix family, member e22 (Miembro e22 de la familia hélice-bucle-hélice básica) BMP Bone morphogenic protein (Proteína morfogénica ósea) BMP2 Bone morphogenic protein-2 (Proteína morfogénica ósea-2) BMP4 Bone morphogenic protein-4 (Proteína morfogénica ósea-4) BSA Bovine serum albumin (Albúmina sérica bovina) CALB1 Calbindin 1 (Calbindina 1) Cap-5' Caperuza 5' CAV2 Caveolin 2 (Caveolina 2) CCDC18 Coiled-coil domain containing 18 CDKs Cyclin-dependent kinases (Quinasas dependientes de ciclinas) cDNA DNA complementario CIBERDEM Centro de investigación biomédica en red de diabetes y enfermedades metabólicas CIE-10 Clasificación internacional de enfermedades c-MYC Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog (Homólogo del oncogen viral Avian Myelocytomatosis) CRYBB2 Crystallin beta B2 (Cristalina beta B2) Ct Cycle threshold (Ciclo umbral) CTAs Células troncales adultas CTEs Células troncales embrionarias CTNNB Catenin, beta (Beta catenina) CTRB1 Chymotrypsinogen B1 (Quimiotripsinógeno B1) DD-CTEs Diferenciacion dirigida de células troncales embrionarias DGCR8 DiGeorge syndrome critical region gene 8 (Región crítica del gen 8 del síndrome DiGeorge) DMEM Dulbecco's modified eagle médium (Medio Eagle modificado de Dulbecco) DMEM/F12 Dulbecco's modified eagle medium: Nutrient mixture F-12 (Medio Eagle modificado de Dulbecco: Mezcla de nutrientes F-12) DMG Diabetes mellitus gestacional DMID Diabetes mellitus insulindependiente ABREVIATURAS xii DMNID Diabetes mellitus no insulindependiente DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxiribonucleico) DNAJC3 DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member C3 (Miembro C3 de la familia de proteínas de DNA de choque térmico) DSH Dishevelled EBs Embryoid bodies (Cuerpos embrionarios) EDC 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) hidrocloruro de carbodiimida) EDG Endothelial differentiation gene (Gen de diferenciación endotelial) ESCC Embryonic stem cell-cicle (Ciclo celular de células troncales) EVP Enfermedad vascular periférica FBS Fetal bovine serum (Suero fetal bovino) FDA Food and drug administration (Agencia de alimentos y medicamentos) FED Federación española de diabetes FGF Fibroblast growth factor (Factor de crecimiento fibroblástico) FID Federación internacional de diabetes FLK1 Fetal Liver Kinase 1 (Quinasa 1 de hígado fetal) FOXA2 Forkhead box A2 FRZ Frizzled GCG Glucagon GCNT2 Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2, I-branching enzyme GDFs Growth differentiation factors (Factores de crecimiento y diferenciación) GFF Glass fiber filter (Filtro de fibra de vidrio) GLUT2 Solute carrier family 2 member 2 (Miembro 2 de la familia de transportadores de soluto) GSC Goosecoid GSIS Glucose-stimulated insulin secretion (Secreción de insulina estimulada por glucosa) GSK3β Glycogen synthase kinase 3 beta (Glucógeno sintasa quinasa-3 beta) HbA1c Hemoglobina glicosilada HGF Hepatocyte growth factor (Factor de crecimiento de hepatocitos) hiPSC Human induced pluripotent stem cells (Células troncales pluripotentes inducidas humanas) HLA Human Leukocyte Antigen (Antígenos leucocitarios humanos) HMG High-Mobility Group (Grupo de alta movilidad) HNF1β HNF1 homeobox B HNF4α Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (Factor de hepatocito nuclear 4 alfa) hrbFGF Recombinant human basic fibroblast growth factor (Factor de crecimiento fibroblástico básico humano recombinante) IAPP Islet amyloid polypeptide (Polipéptido amieloide de los islotes) ICAs Islet cell antibodies (Anticuerpos Antiislotes Pancreáticos) IF Inmunofluorescencia IFG Impaired fasting glycemia (Glicemia alterada en ayunas) IGF1R Insulin-Like Growth Factor 1 Receptor (Receptor del factor de crecimiento similar a la insulin tipo 1) IGT Impaired glucose tolerance (Intolerancia a la glucosa) IND International nomenclature of diseases (Nomenclatura internacional de enfermedades) INS Insulina INS-I Insulina-I INSIG1 Insulin induced gene 1 (Gen 1 inducido por insulina) ABREVIATURAS xiii IRS2 Insulin receptor substrate 2 (Receptor de sustrato de insulina 2) ISH In situ hybridization (Hibridación in situ) ISL1 ISL LIM homeobox 1 ITS Insulina-Transferrina-Selenio JAZF1 JAZF zinc finger 1 LEF Lymphoid enhancer-binding factor (Factor potenciador linfoide) LIF Leukemia inhibitory factor (Factor inhibitorio de leucemia) lncRNA Long non-coding RNA (RNA largo no codificante) MAFA MAF bZIP transcription factor A (Factor de transcripción A MAF bZIP) MAP4K4 Mitogen-activated protein kinase 4 (Proteína quinasa activada por mitógenos tipo 4) MCI Masa Celular Interna MCL1 Myeloid cell leukemia 1 (Célula de leucemia mieloide tipo 1) MCT1 Solute carrier family 16 member 1 (Miembro 1 de la familia 16 de transportadores de monocarboxilato) MEC Matriz extracelular miRISC miRNA-induced silencing complex (Complejo de silenciamiento inducido por miRNA) miRNAs microRNAs MIST1 Basic helix-loop-helix family, member a15 (Miembro a15 de la familia hélice-bucle-hélice básica) M-MLV RT Moloney murine leukemia Virus reverse transcriptase (Transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina Moloney) MODY Maturity-onset diabetes of the young (Diabetes del adulto de inicio en la juventud) mRNA Ácido ribonucleico mensajero mTOR Mammalian target of rapamycin (Diana de rapamicina en mamífero) MTPN Myotrophin (Miotrofina) NB Técnica de Northern Blotting ncRNA Non-codgin RNA (RNA no codificante) NDDG National Diabetes Data Group (Grupo nacional de datos de diabetes) NEUROD1 Neurogenic Differentiation Factor (Factor de diferenciación neurogénico) NEUROG3 Neurogenin 3 (Neurogenina 3) NFκβ Nuclear factor kappa-B (Factor nuclear kappa-B) NKX2.2 NK2 homeobox 2 NKX6.1 NK6 homeobox 1 OC-2 One cut homeobox 2 OCT4 Octamer-binding transcription factor 4 (Factor de transcripción-4 de unión a octámero) OMS Organización mundial de la salud ORF Open reading frame (Marco de lectura abierto) PAK6 p21 (RAC1) activated kinase 6 (Quinada activada por p21 tipo 6) PAX4 Paired box 4 (Caja emparejada de genes-4) PAX6 Paired box 6 (Caja emparejada de genes-6) pb Pares de bases PBS Phosphate buffered saline (Tampón fosfato salino) PCR Polymerase chain reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa) PDFG Platelet-derived growth factor (Factor de crecimiento derivado de plaquetas) PDK1 Pyruvate dehydrogenase kinase-1 (Quinasa dependiente de fosfoinositol-1) PDX1 Pancreatic and duodenal homeobox 1 (Factor homebox tipo 1 pancreático y duodenal) PGCs Primordial germ cells (Células germinales primordiales) PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase (Fosfoinositol 3-quinasa) INTRODUCCIÓN 4 complicaciones similares a largo plazo (ceguera, fallo renal, amputación del pie diabético, etc.) (Sordi et al., 2008). Las limitaciones del tratamiento actual de la diabetes han estimulado la búsqueda de terapias que permitan restaurar la masa celular beta perdida para conseguir alcanzar la normoglucemia. El trasplante alógenico de islotes pancreáticos procedentes de donantes cadáver por el protocolo de Edmonton (Shapiro et al., 2006) ha demostrado que la terapia celular funciona, de forma que el trasplante de células productoras de insulina a pacientes diabéticos normaliza la glucemia entre 1 y 5 años. Sin embargo, este tratamiento tiene unas limitaciones como son la carencia de suficientes donantes y la necesidad de inmunosupresión (Sutherland et al., 2001; Shapiro et al., 2006). La diferenciación de las células pluripotentes hacia células productoras de insulina permitiría disponer de una fuente inagotable de células. Por lo tanto, será fundamental conseguir un aumento en la eficacia y eficiencia del proceso de diferenciación de células pluripotentes hacia células productoras de insulina, junto con la mejora del proceso y su uso en modelos animales. Las células troncales embrionarias (CTEs) murinas pueden diferenciarse hacia células productoras de insulina (León-Quinto et al., 2004; Soria et al., 2000). Estudios posteriores han demostrado que el protocolo de diferenciación in vitro puede optimizarse (Vaca et al., 2006) e incluso aplicarse a células troncales embrionarias humanas (D’Amour et al., 2005, 2006; Rezania et al., 2014; Pagliuca et al., 2014; Pezzolla et al., 2015). Sin embargo, los métodos disponibles hasta el momento presentan varios inconvenientes como son un bajo rendimiento, una difícil reproducibilidad y baja eficacia con la generación de células con un fenotipo inmaduro. Los procedimientos descritos con las CTEs tienen una eficacia y una eficiencia bajas, es un procedimiento poco eficaz porque el fenotipo al que se llega no es el de una célula beta pancreática madura y es poco eficiente por que el rendimiento en términos de biomasa es bajo. INTRODUCCIÓN 5 1.2. Diabetes Mellitus El termino diabetes describe un trastorno metabólico de etiología múltiple caracterizado por hiperglucemia crónica con alteraciones del metabolismo de carbohidratos, grasas y proteínas como consecuencia de defectos en la secreción de insulina, la acción de la insulina o ambos. Los efectos de la diabetes incluyen daños a largo plazo que producen la disfunción e insuficiencia de varios órganos y puede presentarse con síntomas característicos como sed, poliuria, distorsión de la visión y pérdida de peso, pudiendo desarrollar en sus formas más severas, cetoacidosis o un estado hiperosmolar no cetónico y dar lugar a estupor, coma y en ausencia de tratamiento eficaz, la muerte. A menudo los síntomas no son graves o pueden estar ausentes y por consiguiente el grado de hiperglucemia suficiente para ocasionar cambios patológicos y funcionales puede estar presente durante un largo tiempo antes de realizarse el diagnóstico. Los efectos a largo plazo de la diabetes, incluyen el desarrollo progresivo de complicaciones especificas microvasculares (lesiones de los vasos sanguíneos pequeños) y macrovasculares (lesiones de vasos sanguíneos más grandes). Varios procesos patogénicos están implicados en el desarrollo de diabetes, esto incluye procesos los cuales destruyen las células beta pancreáticas del páncreas con la consiguiente insuficiencia de insulina. Las anomalías en carbohidratos, grasas y el metabolismo de proteínas se deben a la acción deficiente de la insulina en los tejidos diana resultante por la disminución en la sensibilidad y/o falta de insulina. 1.2.1. Clasificación de la diabetes La primera clasificación ampliamente aceptada de la diabetes fue publicado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1979 (National Diabetes Data Group, 1979). El Comité de Expertos propuso entonces como clases principales de diabetes la Diabetes mellitus insulindependiente (DMID) y Diabetes mellitus no insulindependiente (DMNID), que sería modificada posteriormente en 1985 (WHO Study Group, 1985) como tipo 1 y tipo 2, respectivamente. Otros tipos como la intolerancia a la glucosa (IGT) o la diabetes INTRODUCCIÓN 6 mellitus gestacional (DMG) fueron reflejados en la posterior Nomenclatura Internacional de Enfermedades (IND) en 1991 y en la décima revisión de la Clasificación Internacional de Enfermedades (CIE-10) en 1992. En 1997 (Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 2003), los criterios de clasificación y diagnóstico de la diabetes elaborados por el Grupo Nacional de Datos de Diabetes (NDDG) y recomendados por la OMS, han sido revisados por el Comité de Expertos para el diagnóstico y clasificación de la diabetes de la Asociación Americana de Diabetes (ADA), con el objetivo de plantear una nueva clasificación, dejando de lado el criterio terapéutico y teniendo en cuenta la etiología de la enfermedad. La clasificación previa agrupaba bajo el término diabetes, aquellas alteraciones que difieren en su patogénesis, evolución natural, respuesta terapéutica y prevención. A esto se agregan distintos factores genéticos y del medio ambiente que conducen a formas de diabetes que parecen fenotípicamente similares pero que pueden tener etiologías distintas. Se incluyen 4 categorías y un grupo adicional de individuos que tienen glucemias anormales con alto riesgo de desarrollar diabetes (Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 2003), de forma que los principales tipos de diabetes serán los siguientes:  Diabetes Mellitus Tipo 1: La diabetes tipo 1 (también llamada insulinodependiente, juvenil o de inicio en la infancia), se caracteriza por una destrucción de las células beta pancreáticas, deficiencia absoluta de insulina, tendencia a la cetoacidosis y requiere la administración diaria de insulina. Se desconoce aún la causa de la diabetes tipo 1 y no se puede curar con el conocimiento actual. Se pueden distinguir 2 subgrupos: o Autoinmune: Esta forma de diabetes, previamente conocida por los términos diabetes dependiente de insulina, diabetes tipo 1 o diabetes juvenil, resulta de una destrucción autoinmune de las células beta pancreáticas (Atkinson y INTRODUCCIÓN 7 Maclaren, 1994), provocando que la secreción de insulina termine siendo mínima o nula; se presenta en general durante la primera infancia y la adolescencia, aunque su aparición puede ocurrir a cualquier edad. La predisposición genética es múltiple y además se relaciona con factores ambientales aún no totalmente definidos. o Idiopática: Se refiere a las formas de etiología desconocida de mínima prevalencia. Algunos de estos pacientes tienen insulinopenia permanente y son propensos a la cetoacidosis, pero no hay evidencia de autoinmunidad. La prevalencia de este tipo de paciente es muy baja, siendo la mayoría de origen africano o asiático. Esta forma de diabetes tiene una importante carga hereditaria y carece de evidencia inmunológica para la autoinmunidad de las células beta pancreáticas (Banerji y Lebovitz, 1989).  Diabetes Mellitus Tipo 2: La diabetes tipo 2 (también llamada no dependiente de la insulina o diabetes del adulto), es un término que se utiliza para las personas que tienen resistencia a la insulina y por lo general tienen una relativa deficiencia en la síntesis de insulina (Reaven et al., 1976; Olefsky et al., 1982; DeFronzo et al., 1979; Turner et al., 1979), representando aproximadamente un 90-95% de todos los pacientes diabéticos (American Diabetes Association, 2015). Al menos inicialmente y con frecuencia durante toda su vida, estos pacientes no necesitan tratamiento con insulina para sobrevivir. Probablemente hay numerosas causas de esta forma de diabetes y es probable que la proporción de pacientes en esta categoría disminuya en el futuro con la identificación de los procesos patogénicos específicos y defectos genéticos causantes. Aunque no se conocen las causas específicas de la diabetes tipo 2, la destrucción autoinmune de las células beta pancreáticas no se produce. La mayoría de los pacientes son obesos, por lo que la obesidad en sí provoca un cierto grado de resistencia a la insulina (Kolterman et al., 1981; Bogardus et al., 1985) o bien INTRODUCCIÓN 8 presentan una acumulación de grasa corporal en la región abdominal sin llegar a ser obesos (Kissebah y Peiris, 1989; Butkiewicz et al., 1995; Banerji et al., 1994; Umpierrez et al., 1995). Esta forma de diabetes cursa con frecuencia sin diagnosticar durante muchos años debido a que la hiperglucemia se desarrolla gradualmente, no presentando la suficiente gravedad en etapas anteriores como para que el paciente observe cualquiera de los síntomas clásicos de la diabetes (Harris; Zimmet, 1992; Fujimoto et al., 1987). Sin embargo, estos pacientes tienen un mayor riesgo de desarrollar complicaciones macrovasculares y microvasculares (Fujimoto et al., 1987; Moss et al., 1994; Kuusisto et al., 1994; Andersson y Svärdsudd, 1995; Uusitupa et al., 1993). La secreción de insulina es defectuosa en estos pacientes e insuficiente para compensar la resistencia a la insulina. Esta puede mejorar con la reducción del peso y/o tratamiento farmacológico de la hiperglucemia, pero rara vez podrá restaurarse la normalidad (Scarlett et al.; Firth et al., 1986; Simonson et al., 1984; Henry et al., 1986; Wing et al., 1994). El riesgo de desarrollar este tipo de diabetes aumenta con la edad, la obesidad y la falta de actividad física (Zimmet, 1992); además con frecuencia se asocia con una fuerte predisposición genética, incluso en mayor magnitud que la forma autoinmune de la diabetes tipo 1 (Newman et al., 1987; Barnett et al., 1981). Sin embargo, la genética de esta forma de diabetes es compleja y no está definida totalmente.  Diabetes Mellitus Gestacional (DMG): Durante muchos años, la DMG se definió como cualquier grado de intolerancia a la glucosa con el inicio o primer reconocimiento durante el embarazo (Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 2003), independientemente de si la condición puede haber precedido al embarazo o comenzado de forma concomitante con este (Metzger, 1991). Esta definición facilitó una estrategia uniforme para la detección y clasificación de DMG, pero se INTRODUCCIÓN 9 vio limitada por la imprecisión. Por ello, las mujeres con diabetes en el primer trimestre serán clasificados como diabetes tipo 2, mientras que se considera DMG aquella diagnosticada en el segundo o tercer trimestre del embarazo que no es claramente diabetes manifiesta. En cualquier caso, unas 6 semanas o más después de que termine el embarazo, la diabetes de la mujer debe ser reclasificada de modo que podría diagnosticarse una glicemia alterada en ayunas (IFG) o intolerancia a la glucosa (IGT), las cuales no deben ser vistas como entidades clínicas, pero constituyen factores de riesgo para el desarrollo de la diabetes. En la mayoría de los casos de DMG, la regulación de la glucosa volverá a la normalidad después del parto.  Otros tipos Específicos: Según la ADA, en un pequeño porcentaje de los casos la diabetes puede ocurrir en personas con ciertos desórdenes o condiciones, como son los siguientes: o Alteraciones genéticas: Varias formas de diabetes están asociados con defectos monogenéticos en la función de las células beta pancreáticas (Vaxillaire y Froguel, 2008). Estas formas de diabetes se caracterizan frecuentemente por la aparición de hiperglucemia en una edad temprana y se caracterizan por la secreción de insulina alterada e incluyen la diabetes mellitus neonatal o diabetes monogénica de la primera infancia, la diabetes del adulto de inicio juvenil (MODY), síndromes asociados con resistencia extrema a la insulina y otros síndromes poco frecuentes en los que la diabetes es una más de una pléyade de manifestaciones, como el síndrome de Wolcott-Rallison o el síndrome de Wolfram (Vaxillaire et al., 2009; Urano, 2016). o Endocrinopatías: Varias hormonas (hormona del crecimiento, cortisol, glucagón o epinefrina) antagonizan con la acción de la insulina. Las cantidades excesivas de estas hormonas (acromegalia, síndrome de Cushing, glucagonoma o feocromocitoma), pueden causar diabetes (Jadresic et al., INTRODUCCIÓN 10 1982; Stenström et al., 1988). Esto ocurre generalmente en individuos con defectos preexistentes en la secreción de insulina y la hiperglucemia se resuelve normalmente cuando se retira el exceso de la hormona. o Enfermedades pancreáticas: Cualquier proceso adquirido que daña de forma difusa al páncreas puede causar diabetes como pueden ser la pancreatitis, trauma, infección, pancreatectomía y el carcinoma de páncreas (Cersosimo et al., 1991; Larsen et al., 1987). o Diabetes inducida por drogas o químicos: Muchos medicamentos pueden afectar la secreción de insulina. Estos medicamentos no pueden causar la diabetes por sí mismos, pero pueden precipitar la aparición de diabetes en personas con resistencia a la insulina (Pandit et al., 1993; O’Byrne y Feely, 1990; Izzedine et al., 2005). o Infecciones: Ciertos virus se han asociado con la destrucción de células beta pancreáticas. La diabetes se produce en pacientes con rubéola congénita (Forrest et al., 1971), aunque la mayoría de estos pacientes tienen antígenos leucocitarios humanos (HLA) y marcadores inmunológicos característicos de la diabetes tipo 1. Además, las infecciones ocasionadas por otros virus como son citomegalovirus, adenovirus, Coxsackie B y mixovirus han sido implicados en la inducción en ciertos casos de la enfermedad (King et al., 1983; Karjalainen et al., 1988; Pak et al., 1988) . 1.2.2. Prevalencia y diagnóstico Los criterios diagnósticos para la diabetes se han modificado a partir de los previamente recomendados por el Comité de Expertos del NDDG (Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 2003) o el grupo de estudio de la OMS (WHO Study Group, 1985). Las mismas pruebas se utilizan tanto para la predicción como el diagnóstico de la diabetes y puede ser identificada en cualquier lugar a lo largo del espectro de escenarios clínicos posibles, ya sea en individuos aparentemente en bajo INTRODUCCIÓN 11 riesgo, en pacientes sintomáticos y en individuos de alto riesgo con sospechas de diabetes. Las mismas pruebas también pueden detectar individuos con prediabetes, un trastorno en que el nivel de la glucosa en la sangre es mayor de lo normal pero no lo suficientemente alto como para diagnosticar diabetes, pero significa que se encuentra en riesgo de desarrollarla. Existen varios métodos para diagnosticar la diabetes y cada uno debe ser confirmado posteriormente por cualquiera de los métodos dados, los cuales están resumidos en la siguiente Tabla 1: Prueba Descripción Diabetes Prediabetes Hemoglobina glucosilada (A1C) Promedio de glucosa en la sangre durante los últimos 2-3 meses ≥ 6,5 %. 5,7%–6,4 %. Glucosa plasmática ayunas (PGA) Nivel glucosa en sangre en ayuno ≥ 126mg/dl 100–125 mg/dl Tolerancia glucosa oral (PTOG) Nivel glucosa en sangre antes y después de la ingesta de una solución glucosada (75 gr) ≥ 200 mg/dl 140–199 mg/dl Prueba Aleatoria glucosa oral Análisis de sangre en cualquier momento del día ≥ 200 mg/dl TABLA 1. Criterios de diagnóstico y predicción de la diabetes. En 2014 la OMS informa que la carga de morbilidad de la diabetes está aumentando en todo el mundo y en particular en los países en desarrollo. Las causas son complejas, pero en gran parte están relacionadas con el rápido aumento del sobrepeso, la obesidad y la inactividad física. La FID ha dado a conocer, durante la celebración del Congreso Mundial de la Diabetes en Vancouver, los datos de su Atlas de la Diabetes séptima edición (2015), que constituye la fuente acreditada de información sobre la prevalencia global y regional de la diabetes, así como del gasto y la mortalidad asociados. En este se registra que en el mundo hay más de 415 millones de personas con diabetes y para 2040 se prevé que esta cifra aumente a 642 millones, además se calcula que las muertes por diabetes aumentarán más de un 50% en los próximos 10 años tal y como se refleja en la Figura 1. Actualmente, la diabetes se ha convertido en una de las causas INTRODUCCIÓN 12 principales de enfermedad y muerte prematura en la mayoría de los países, sobre todo debido al aumento del riesgo de enfermedades cardiovasculares (50%-80% de las muertes de pacientes diabéticos se deben a causas cardiovasculares) y se prevé que la diabetes se convierta en el año 2030 en la séptima causa mundial de muerte. Además, la diabetes es una causa importante de ceguera, amputación e insuficiencia renal. FIGURA 1. Representación de la distribución geográfica de personas afectadas por diabetes, indicando el número de personas con diabetes a nivel mundial por región en 2015 y la estimación en 2040. Imagen modificada del Atlas de Diabetes de la FID. Séptima edición, 2015. El estudio [email protected] realizado desde el CIBERDEM del Instituto de Salud Carlos III (Ministerio de Ciencia e Innovación) en colaboración con la SED y la FED (Soriguer et al., 2012), situó la prevalencia de la diabetes en España en torno al 13,8% de la población, un porcentaje ligeramente superior a los estudios realizados anteriormente en España. La diabetes se ha convertido en uno de los problemas sanitarios más graves de nuestro INTRODUCCIÓN 13 tiempo, los resultados del estudio también confirman la asociación entre diabetes, obesidad e hipertensión arterial y la importancia de la actividad física como método de prevención. 1.2.3. Tratamiento de la diabetes La era de la insulinoterapia o terapia insulínica de la diabetes se inició en 1922, cuando los profesores Frederick Grant Banting, Charles Herbert Best, Jon James Richard Macleod y Jame Bertram Collip, trabajando en la universidad de Toronto, fueron capaces de aislar y purificar la insulina (Rosenfeld, 2002; Maclean, 1926), lo cual proporcionó a la ciencia médica uno de los más importantes medios de prolongar la vida humana y constituyó un hito en la historia del tratamiento de la fatal enfermedad. Por primera vez en la historia, el tratamiento impidió la cetoacidosis y muerte permitiendo a los pacientes con diabetes vivir durante décadas con la enfermedad. La capacidad de esta terapia de prevenir la muerte y proporcionar una vida casi normal a los pacientes parecía milagrosa y los muchos problemas asociadas al tratamiento insulínico eran preferibles a la alternativa de una muerte segura. Sin embargo, el conocimiento de estas complicaciones trajo consigo la necesidad de una terapia más sofisticada. Desde entonces, las preparaciones de insulina y las estrategias terapéuticas han ido desarrollándose inicialmente a expensas del origen de la insulina y posteriormente con la incorporación de sustancias que modificaban su absorción. Ya en la década de los 90 surgieron entonces los análogos de la insulina, con una especial capacidad de cambio en su farmacocinética. Más adelante se introdujeron nuevas formas de liberación a la insulina inyectable con jeringuilla o pluma, como son las bombas de infusión continua y la insulina inhalada, todo esto apoyado por nuevos sistemas de monitorización de la glucosa. En la última década, el trasplante de islotes pancreáticos y la terapia celular con la obtención de células productoras de insulina a partir de células troncales pluripotentes aumentan las expectativas, en la Tabla 2 se resumen los principales INTRODUCCIÓN 20 FIGURA 2. Una sección transversal del páncreas muestra los islotes de Langerhans, que es la unidad funcional del páncreas endocrino, constituido por diferentes grupos celulares como son las células beta pancreáticas, sintetizan y secretan insulina; células alfa, secretan glucagón, que aumenta la concentración de azúcar en la sangre; células delta, secretan la hormona inhibidora del crecimiento somatostatina, que inhibe la secreción de la insulina y el glucagón; células epsilon, secretan grelina y células PP, secretan el polipéptido pancreático, el cual influye en la secreción de enzimas intestinales y gástricas, inhibe los movimientos en el intestino y actúa como neurotransmisor. 1.3.1. Desarrollo endodérmico: Origen del páncreas Una de las primeras decisiones en el destino celular realizada durante la embriogénesis de vertebrados es la separación de las 3 capas germinales clásicas: ectodermo, mesodermo y endodermo. El endodermo, el cual primero forma la parte externa del INTRODUCCIÓN 21 embrión para más tarde internalizarse, dará lugar al sistema respiratorio y digestivo, y sus órganos asociados, como son el hígado, páncreas, pulmones, intestino o estómago. Al endodermo embrionario se le atribuyen 2 funciones principales; la primera función es inducir la formación de varios órganos mesodérmicos como son el corazón, los vasos sanguíneos e incluso la capa germinativa mesodérmica; la segunda función del endodermo embrionario es construir el revestimiento de 2 tubos en el interior del cuerpo de los vertebrados, uno de ellos se forma como una evaginación del tubo digestivo que finalmente se bifurca, originando los pulmones y el otro que se extiende a lo largo de la longitud corporal origina el tubo digestivo y formará a partir de sus esbozos el hígado, vesícula biliar, páncreas y órganos accesorios que se desarrollan inmediatamente caudal al estómago. El páncreas se desarrolla a partir de la fusión de los primordios dorsal y ventral endodérmicos procedentes de la parte caudal del intestino anterior, los cuales se aproximan al crecer y finalmente se fusionan durante la rotación del estómago e intestino. El brote endodérmico dorsal formará la mayor parte del páncreas (cabeza, cuerpo y cola) y el brote ventral desarrollará la apófisis uncinada y parte duodenal de la cabeza del páncreas (Mastsumara y England, 1996). La formación del páncreas puede ser la otra cara de la formación del hígado, de forma que mientras las células del corazón promueven y la notocorda impide la formación del hígado, la notocorda puede promover activamente la formación del páncreas y el corazón bloquearla. Durante la formación del endodermo se ha postulado la hipótesis de que la expresión de PDX1 le otorga a una región particular del tubo digestivo la capacidad para llegar a ser páncreas o hígado (Song et al., 1999) como se observa en la Figura 3A. Por tanto, un grupo de condiciones como son la presencia de notocorda y ausencia de corazón, lleva a la formación de páncreas (Kim et al., 1997). La notocorda activa el desarrollo del páncreas al reprimir la expresión de la vía de señalización Sonic hedgehog (Shh) en el endodermo (Hebrok et al., 1998), el cual es expresado en todo el INTRODUCCIÓN 22 endodermo del tubo digestivo, excepto en la región que formará el páncreas. La notocorda en esta región del embrión secreta activina y el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), que son capaces de regular la expresión de la vía de señalización Shh en el endodermo. El desarrollo pancreático es iniciado en aquellas localizaciones donde el endodermo del intestino anterior contacta al endotelio de los vasos sanguíneos principales. Por tanto, la asociación de tejidos pancreáticos con vasos sanguíneos es crítica en la formación de células endocrinas y exocrinas del páncreas como observamos en la siguiente Figura 3B. FIGURA 3. A) Se observa el inicio del desarrollo pancreático como dos evaginaciones, dorsal y ventral, formándose sobre la futura región duodenal del intestino primitivo. El PDX1 (verde) es expresado dorsal y ventralmente, mientras que su expresión es baja en el tubo primitivo del intestino, que se extiende hasta el estómago posterior. Las células productoras de glucagón (rojo) comienzan a formarse en la raíz dorsal, células similares durante las siguientes horas también empiezan a diferenciarse en la raíz ventral. La diferenciación endocrina en las regiones adyacentes (estómago e intestino) no se inicia hasta aproximadamente 5 días más tarde (Madsen et al., 2001). B) Islotes pancreáticos (rojo) y vasos sanguíneos (verde), que muestran como la revascularización induce una fuerte proliferación de células de los islotes pancreáticos (Joana Almaça et al., 2014). Barra de escala =97,63 µm. 1.3.2. Patrones de expresión génica que regulan el desarrollo del páncreas Los factores de transcripción constituyen una clase de proteínas capaces de regular la expresión de numerosos genes, para ejecutar un determinado programa celular. INTRODUCCIÓN 23 Múltiples factores de transcripción intervienen en el desarrollo pancreático y constituyen una compleja e intrincada red reguladora que han sido resumidos en la Figura 4A. Una vez se ha establecido el endodermo, varios factores de transcripción son esenciales para el establecimiento y proliferación de las células progenitoras pancreáticas que incluye varios genes tipo HNF como son HNF1β (TCF2), HNF1α (TCF1), HNF4, HNF6 (OC-2) o HNF3β (FOXA2) (Bort et al., 2004; Grapin-Botton et al., 2001; Jacquemin et al., 2003; Haumaitre et al., 2005; Dufort et al., 1998; Poll et al., 2006; Yang et al., 2016), este último es un gen regulador clave en el desarrollo endodérmico y participa en la expresión génica específica en pulmón, hígado y páncreas adultos (Gao et al., 2008; Lee et al., 2002). Estos factores parece que cooperan con un regulador clave del desarrollo pancreático como es PDX1, requerido para la formación del páncreas, su expresión comienza en células epiteliales de la región dorsal y ventral pancreática, presentando una clara heterogeneidad de forma que reduce su expresión gradualmente con la diferenciación exocrina y está implicado en varios aspectos de la función de células beta pancreáticas adultas (Jennings et al., 2013; Sherwood et al., 2009; Fujitani et al., 2006; Offield et al., 1996). Durante el desarrollo pancreático PDX1 provoca la formación del esbozo desde el epitelio del tubo digestivo; reprime la expresión de genes que son característicos de otras regiones del tubo digestivo (Teo et al., 2015); mantiene la represión de la vía de señalización Shh; inicia aunque no completa la diferenciación celular de los islotes pancreáticos y es necesario para la expresión de la insulina (GrapinBotton et al., 2001). En los embriones humanos, la robusta detección de PDX1 fue acompañada inicialmente por una débil expresión de SOX9 en el endodermo pancreático, necesario para el mantenimiento de poblaciones progenitoras multipotentes (Pan y Wright, 2011; Cano et al., 2014; Jennings et al., 2013), que también expresan SOX17 necesario para la formación del endodermo (Spence et al., 2009) y factores Gata (GATA4 y GATA6) requeridos al menos parcialmente para una apropiada expresión de PDX1 (Carrasco et al., 2012; Cano et al., 2014). INTRODUCCIÓN 24 La determinación pancreática no es un estado permanente, tendrá lugar una especificación de compartimentos más especializados del endodermo donde las células adquieren su destino terminal especializado con el tiempo y su especialización implica una mayor participación de reguladores intrínsecos de la célula. Las primeras células endocrinas que aparecen en el páncreas son las células beta, seguidas del resto de tipos celulares de los islotes pancreáticos (Piper et al., 2004; Lyttle et al., 2008; Riedel et al., 2012; Jennings et al., 2013). Coincidente con la pérdida de SOX9, el compromiso endocrino en las células epiteliales pancreáticas se inicia con la expresión de NEUROG3 (Gradwohl et al., 2000; Lyttle et al., 2008; Jennings et al., 2013), que precede a la inducción de los factores de transcripción ISL1, NEUROD1, MAFA/B, NKX2.2, NKX6.1 y PAX6 implicados en la maduración celular endocrina (Jeon et al., 2009). Con el uso de un sistema inducible Cre-Lox para marcar las células de la progenie que expresan NEUROG3 o PDX1 (Gu et al., 2002), se demostró que las células que están expresando NEUROG3 son específicamente progenitoras de células de los islotes pancreáticos, mientras que las células que están expresando PDX1 dan origen a los 3 tipos de tejido pancreático (exocrino, endocrino y células ductales). Los factores de transcripción NKX6.1 y NKX2.2 constituyen marcadores tempranos del epitelio pancreático. En los islotes pancreáticos maduros, la expresión de NKX6.1 está restringida a las células beta pancreáticas (Jensen et al., 1996), donde se ha sugerido que actúa como un represor transcripcional del glucagón (Gauthier et al., 2007; Schisler et al., 2005), mientras que NKX2.2 es un marcador de células alfa, beta y F o PP (Sussel et al., 1998). El factor ISL1 parece ser necesario para el desarrollo de páncreas en humanos y ratones (Du et al., 2009; May). En todos los tipos de células endocrinas de los islotes pancreáticos adultos se encuentra la expresión de NEUROD1 (Jeon et al., 2009; Jennings et al., 2013) y resulta esencial para la maduración de células beta pancreáticas (Gu et al., 2010). Otro factor como PAX6 comienza a expresarse durante el desarrollo pancreático y se mantendrá en las células de islotes pancreáticos adultos (Lyttle et al., 2008) y parece intervenir en la diferenciación y asignación de células endocrinas (Sander et al., 1997; Ahlqvist et al., INTRODUCCIÓN 25 2012). Por último, MAFA tiene una expresión relativamente tardía en el desarrollo (Dai et al., 2012), asociándose como un marcador de maduración crucial para la respuesta de células beta pancreáticas a la glucosa a través de la regulación de INS y GLUT2 (Hang y Stein, 2011). FIGURA 4. A) esquema de los factores de transcripción que definen los diferentes tipos celulares y estadios de diferenciación durante el desarrollo pancreático. B) Imágenes de fluorescencia representativas de las principales células endocrinas (células-β, células-α, células-δ y células-F o PP) de los islotes pancreáticos, con los núcleos identificados con DAPI. Las fases de desarrollo pancreático incluye la determinación de los dominios pancreáticos en el intestino anterior ventral y dorsal, la formación de los conductos y el crecimiento, seguido por la diferenciación de los linajes pancreáticos, donde la combinación de un conjunto de factores es determinante en la especificación del tejido y los diferentes tipos celulares (Figura 4B), y no la simple acción de un regulador máster INTRODUCCIÓN 26 altamente específico. La identificación de todos estos factores y determinar los tiempos adecuados de expresión, es clave para un mejor conocimiento del desarrollo pancreático que nos permitirá mejorar los procesos de obtención de células beta pancreáticas terapéuticas que puedan ser trasplantadas en pacientes diabéticos. 1.4. Células troncales 1.4.1. ¿Qué es una célula troncal? La biología de las células troncales es una de las áreas más importantes en la investigación biomédica actual. El primer concepto de terapia celular y medicina regenerativa surge ya en 1959, cuando el Profesor E. Donnall Thomas realiza el primer trasplante de médula ósea con éxito y es premiado con el Premio Nobel de Fisiología y Medicina. En aquellos años, nadie hablaba de células troncales y el Profesor E. Donnall Thomas solamente explicaba que tenía que haber algún tipo celular responsable de la regeneración hematopoyética en los pacientes afectados con leucemia que recibían dicho trasplante de médula ósea (Thomas et al., 1959). Además, la embriología y zoología ya había demostrado con anterioridad, si bien en especies inferiores como la salamandra o el ajolote, la existencia de una regeneración tisular. Según la definición aportada por Weissman en 2002 (Weissman, 2002) podemos definir a las células troncales como aquellas células que tienen la capacidad, no sólo de poder cultivase y reproducirse a sí mismas, sino también de generar células adultas de diferente progenie, es decir de diferentes tejidos. Las células troncales se definen de manera puramente funcional como unidades biológicas capaces de auto-renovarse de forma prolongada y de generar diferenciación a múltiples estirpes celulares (Weissman, 2000). Por tanto, una célula troncal es aquella capaz de realizar divisiones asimétricas, a diferencia del resto de las células de un organismo que lo hacen exclusivamente de forma simétrica (autorrenovación). El poder realizar divisiones asimétricas, permite mantener un número más o menos constante de estas poblaciones de células troncales INTRODUCCIÓN 27 durante toda la vida del organismo e ir generando otras células “hijas” que son las responsables de construir y mantener las estructuras funcionales (Knoblich, 2008). Además, una célula troncal debe poseer una capacidad de multiplicación alta y potencial para generar varios linajes celulares (pluripotencia), la plasticidad o potencialidad de las células troncales es una característica que indica la variedad de tipos celulares que pueden generar. Parece cada vez más claro que alteraciones de este mecanismo básico de autorrenovación se encuentran implicadas tanto en fenómenos genuinamente fisiológicos como en el envejecimiento, cáncer y en muy diversas patologías humanas. FIGURA 5. Propiedades principales de las células troncales (autorrenovación y pluripotencia), representando la capacidad de las células para llevar a cabo un tipo de división asimétrica, que permite la transición hacia distintos tipos de células especializadas en un tejido concreto, mientras que se mantiene la población de células troncales al originarse también una célula idéntica a la progenitora. 1.4.2. Clasificación de las células troncales Existen 2 grandes formas de clasificar las células troncales, en función de su potencialidad o de su origen como se representa en la Figura 6. La clasificación más común de las células troncales se fundamenta en la potencialidad que tienen para originar células de diferentes estirpes, lo cual está relacionado con el grado de diferenciación de las células troncales. Por tanto, a grandes rasgos y de manera relativa podemos definir diferentes tipos de células troncales en base a su descendente capacidad de regeneración: INTRODUCCIÓN 28  Células troncales totipotentes: células capaces de crecer y formar un organismo completo. La célula troncal totipotente por excelencia es el cigoto, formado tras la fecundación de un óvulo por un espermatozoide.  Células troncales pluripotentes: células capaces de formar todas las células de los tejidos embrionarios, aunque no son capaces de originar un individuo completo. En las primeras etapas del desarrollo embrionario se forma el blastocito, formado por una gran cavidad interior y 2 tipos celulares como son la capa externa que dará lugar la placenta y las envolturas embrionarias (trofoblasto) y la masa celular interna (MCI) que formará todos los tejidos del organismo. Las células de la MCI del blastocisto son células pluripotentes, es decir que no pueden formar un organismo completo, pero puede formar cualquier tipo de célula proveniente de las 3 capas embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como del linaje germinal y/o saco vitelino.  Células troncales multipotentes: células más diferenciadas que sólo pueden dar tipos celulares de su propia capa o linaje embrionario de origen. Una vez desarrolladas se auto-renuevan durante toda la vida del individuo, a diferencia de las células troncales totipotentes y pluripotentes, que solo se encuentran durante la etapa embrionaria.  Células troncales unipotentes o específicas de tejido: células que sufren una restricción en la expresión de su genoma, desarrollando un mayor grado de diferenciación y producen tipos celulares característicos del tejido en el cual se encuentran. Desde un punto de vista ontogénico, las células troncales pueden obtenerse de diferentes tejidos, entre los que podemos destacar los siguientes:  Células troncales embrionarias (CTEs): Las CTEs sólo existen en las primeras fases del desarrollo embrionario y son capaces de producir cualquier tipo de célula en el cuerpo. Bajo las condiciones adecuadas, estas células conservan la capacidad INTRODUCCIÓN 29 de dividirse y hacer copias de sí mismas indefinidamente. Los científicos están empezando a comprender cómo hacer que estas células se conviertan en cualquiera de los más de 200 tipos de células del cuerpo humano. Conforme avanza el desarrollo embrionario se forman diferentes poblaciones de células troncales con potencialidad para generar tejidos cada vez más restringida y que en la edad adulta se encuentran en "nichos" en algunos tejidos del organismo.  Células troncales adultas (CTAs): Las CTAs, no son exclusivas del embrión en desarrollo, sino que están presentes también en el tejido adulto, donde son importantes en la homeostasis del organismo. Las CTAs son más limitadas y especializadas que las CTEs, ya que pueden dar origen solo a las células propias de cada tejido u órgano (células troncales unipotenciales) o ser capaces de originar unos pocos tipos celulares (células troncales multipotenciales). Las células troncales adultas también tienen una capacidad más limitada para reemplazarse que las células troncales embrionarias. FIGURA 6. Representación esquemática de los tipos de células troncales, que en función del origen presentarán una potencialidad con diferente limitación. Las CTEs y CTAs presentan sus ventajas y desventajas con respecto a su potencial aplicación en la terapia celular. Una de las principales diferencias entre ambas es su INTRODUCCIÓN 36 de los pre-miRNAs. Cada miRNA en el genoma humano es capaz de silenciar un conjunto de genes diana, existiendo entre ellos genes importantes para el desarrollo y la diferenciación (Kedde y Agami, 2008), de forma que LIN28 puede revertir el efecto diferenciador de los miRNAs, regulando la transición entre un estado pluripotente y el compromiso a un linaje celular determinado (Tsialikas y Romer-Seibert, 2015). 1.5.2. Controles extrínsecos A diferencia de las CTEs murinas, un factor extrínseco como es el LIF no es suficiente para mantener la pluripotencia en las CTEs humanas, donde la señalización FGF y el balance entre TGF-β (Factor de crecimiento transformante beta), activina y señalización BMP (Proteínas morfogénicas ósea) son esenciales para la autorrenovación de las CTEs humanas. La superfamilia de ligandos TGF-β, la cual contiene unos 40 ligandos en el genoma humano, juega el mayor papel en el mantenimiento de la autorrenovación de las CTEs humanas. A través de la vía de señalización TGF-β/Activina/Nodal, la cual implica la activación de la proteína SMAD2/3 a través de receptores Tipo I ALK4/5/7 (Quinasa similar al receptor de activina 4/5/7). La activación de la rama TGF-β/Activina/Nodal a través de SMAD2/3 está asociada con la pluripotencia y es requerida para el mantenimiento del estado no diferenciado en las CTEs humanas. En contraste a la señalización TGF-β/Activina/Nodal, la cual promueve el mantenimiento de las CTEs humanas pluripotentes, la vía de señalización BMP es incapaz de soportar la autorrenovación y está asociada con la diferenciación hacia trofoblasto o endodermo extraembrionario. En las CTEs humanas, la proteína morfogénica ósea 4 (BMP4) induce la diferenciación hacia mesodermo y ectodermo, mientras que la proteína morfogénica ósea 2 (BMP2) promueve la diferenciación hacia endodermo extraembrionario. La represión de la señalización BMP en las CTEs humanas mediante los factores nogina y INTRODUCCIÓN 37 bFGF apoya la autorrenovación a largo plazo. El bFGF es conocido como el mejor factor promotor de la autorrenovación en las CTEs humanas, mediante la activación de la ruta PI3K/Akt. Una vez activada se promueve la proliferación, supervivencia, crecimiento y motilidad celular y está implicada también en la tumorogenicidad. Además, la activación de PI3K/Akt dependiente del bFGF es requerida para la eficiente expresión de proteínas de la matriz extracelular (MEC) (Xiao et al., 2006; Conley et al., 2007; Wang et al., 2005; Xu et al., 2005). Las proteínas WNTs constituidas por un grupo de proteínas que forman parte del grupo de moléculas de señalización para procesos biológicos y del desarrollo, desempeñan un importante papel en el control del mantenimiento de las CTEs. La vía de señalización WNT es conocida por estar implicada en la regulación de la proliferación de las células troncales. Los componentes de la vía de señalización WNT están presentes en las CTEs, aunque los niveles de los diferentes receptores variaran entre poblaciones de células no diferenciadas y diferenciadas. Esta vía se cree que es capaz de estimular tanto la proliferación de las CTEs humanas como la diferenciación (Xiao et al., 2006; Miyabayashi et al., 2007; Davidson et al., 2007). Un lisofosfolípido bioactivo, la Esfingosina-1-fosfato (S1P) también mantiene la autorrenovación de las CTEs humanas. La S1P ha sido implicada en diversos procesos biológicos, que incluyen crecimiento celular, diferenciación, migración y apoptosis en muchos tipos celulares distintos. Debido a que la prevención de la apoptosis es un mecanismo de autorrenovación común, S1P potencialmente ayuda al proceso de autorrenovación en las CTEs humanas. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDFG) ha sido implicado también en la prevención de la apoptosis. La combinación del PDFG extracelular y S1P mantiene la autorrenovación de las CTEs humanas (Chase y Firpo, 2007; Inniss y Moore, 2006). INTRODUCCIÓN 38 1.6. Diferenciación de las CTEs hacia células productoras de insulina Las CTEs exhiben como acabamos de exponer, una serie de vías de señalización implicadas en la autorrenovación y pluripotencia que son interdependientes y muestran una serie de mecanismos relacionados. Descifrar estas vías es esencial para la generación de metodologías mejoradas para el mantenimiento y la proliferación de las CTEs pluripotentes in vitro, que junto con la comprensión de los factores exógenos y endógenos que controlan la autorrenovación y la diferenciación, facilitará el uso de estas células en terapias basadas en células y permitirá la comprensión de los procesos tempranos del desarrollo. Diversos factores están involucrados tanto en el mantenimiento del estado no diferenciado como en la diferenciación de las células troncales, incluyendo la estructura celular, factores de crecimiento, interacciones celulares, el estado nutricional, la rigidez y composición de la matriz, la tensión mecánica, la adhesión célula-matriz y el microambiente o nicho celular (anoxia, hipoxia y normoxia; temperatura; humedad) como se observa en la Figura 8. FIGURA 8. Las CTEs aisladas de la MCI del blastocisto pueden mantenerse en estado no diferenciado o diferenciarse in vitro en diversos tipos celulares específicos, mediante el control ejercido por varios factores intrínsecos transcripcionales y factores extrínsecos. INTRODUCCIÓN 39 1.6.1. Diferenciación espontánea Las células troncales residen dentro de microambientes especializados que constituyen el nicho celular, el cual modula la proliferación y diferenciación, la prevalencia simétrica frente a la división asimétrica y las protege del estrés fisiológico. Durante el desarrollo embrionario, un complejo conjunto de señales regula estos procesos fisiológicos en las células troncales pluripotentes, dirigiéndolas hacia un compromiso con determinados fenotipos celulares. Estas señales constituyen una red reguladora transcripcional muy controlada que mantiene las células con capacidad de autorrenovación y pluripotencia, de cuyo equilibrio depende la posibilidad de diferenciarse hacia tipos celulares especializados. Así, mientras las CTEs proliferan en cultivo bajo las condiciones apropiadas se mantendrán en estado no diferenciado, pero cuando se permite la salida de este estado las células tienden a agruparse formando cuerpos embrionarios (EBs), que corresponden a estructuras tridimensionales muy semejantes a los embriones en los primeros estadios de desarrollo y se desencadena una modificación de la red reguladora que inicia un proceso de diferenciación espontáneo y pueden constituir diversos tipos celulares. Aunque la diferenciación espontánea es una buena indicación de que el cultivo de las CTEs es adecuado, se trata de un proceso no dirigido y por tanto una ineficiente estrategia para producir cultivos celulares específicos con fines terapéuticos, de modo que una de las principales dificultades de la terapia celular radica en el control de su diferenciación hacia las células o tejidos deseados. 1.6.2. Diferenciación dirigida En los últimos años, han sido identificados un gran número de factores de crecimiento que en función de su actividad biológica son capaces de diferenciar las CTEs selectivamente hacia linajes mesodérmico, endodérmico o ectodérmico (Schuldiner et al., 2000), concluyendo que tales moléculas pueden desempeñar papeles importantes durante la embriogénesis y se pueden utilizar para dirigir o apoyar la diferenciación de células troncales pluripotentes. Dilucidar y recapitular todos estos biofactores es INTRODUCCIÓN 40 esencial para controlar la diferenciación de las células troncales y dirigir de forma fiable la diferenciación de las CTEs hacia tipos celulares específicos, ofreciendo la posibilidad de una fuente renovable de células y tejidos de reemplazo para un posible tratamiento de enfermedades, incluyendo por ejemplo la diabetes, degeneración macular, artritis o cardiopatías. En la obtención de células productoras de insulina se pueden distinguir las siguientes etapas fundamentales: especificación, diferenciación y maduración. Las CTEs se diferencian en células productoras de insulina a través de las siguientes etapas: la especificación del endodermo definitivo y tejido pancreático a partir del tubo primitivo del intestino y del intestino anterior del páncreas; la diferenciación de progenitores pancreáticos y el desarrollo de las células productoras de insulina maduras caracterizadas por la expresión de determinados factores de transcripción. Las vías de transducción de señales implicadas en la obtención de células productoras de insulina a partir de las CTEs han sido ampliamente estudiadas en las últimas décadas. Una comprensión completa del desarrollo pancreático viene determinada por el conocimiento de todas las señales extracelulares en las diferentes etapas y también por los mecanismos moleculares fundamentales de cada molécula y factor que activan una respectiva señal para dar lugar a la diferenciación de las CTEs. La atención se ha centrado en gran medida en la identificación de las redes fundamentales de moléculas y vías de señalización en el desarrollo de las células productoras de insulina. Los protocolos de diferenciación utilizados hasta la fecha pretenden simular los eventos que tienen lugar durante el desarrollo del páncreas y la diferenciación de los islotes pancreáticos. Esto requiere un amplio conocimiento de las vías de señalización implicadas, para la inclusión de moléculas de señalización en el medio de cultivo que simulen a los factores de crecimiento secretados. Actualmente, se han identificado varias moléculas que actúan como señales extracelulares para el correcto desarrollo del linaje de pancreático, en el que la primera etapa del endodermo definitivo recibe INTRODUCCIÓN 41 señales de los tejidos adyacentes. Al inicio del desarrollo pancreático, las señales de la superfamilia TGF-β de activinas juegan un papel primordial. La presencia de activina y la alta señalización nodal en esta etapa son suprimidas por una regulación negativa de la vía de señalización PI3K para activar la pluripotencia de las CTEs (McLean et al., 2007). La vía de señalización PI3k activada utiliza fosfatidilinositol mono-, bio tri-fosfato para activar a la proteína quinasa B (PKB o AKT) y la GSK3β. La inhibición de PI3K y AKT, junto con una alta señalización nodal inducen la diferenciación de las CTEs hacia el endodermo definitivo (Hori et al., 2002; Vallier et al., 2009; Chen et al., 2006). La activina A ha demostrado desempeñar un papel fundamental en la migración de los islotes pancreáticos y la regulación de la diferenciación celular endocrina y exocrina durante la formación inicial del páncreas (Moriya et al., 2000; Maldonado et al.; Kim et al., 2000; Shiozaki et al., 1999; Zhang et al., 2002; Furukawa et al., 1995). La vía de señalización Wnt es otra vía importante en el desarrollo pancreático, principalmente en la polaridad celular, la migración y la proliferación. Si esta vía promueve la autorrenovación o la diferenciación de las células troncales durante la diferenciación y organogénesis es objeto de controversia. Aproximadamente se han identificado 20 moléculas diferentes de la familia Wnt, entre ellas algunas interaccionan con el receptor Frizzled (FRZ) y activan una proteína llamada DVL para bloquear a la GSK3β, la cual fosforila a la CTNNB. Por tanto, la CTNNB defosforilada se acumula en el citoplasma formando un complejo con el factor TCF7L2 en el núcleo (Liu y Habener, 2010). Este complejo es importante para el desarrollo del páncreas y la secreción de insulina. La vía de señalización Wnt es más importante durante las etapas iniciales que en las etapas tardías de la diferenciación de las CTEs. Se ha visto que OCT4 reprime la vía de señalización Wnt durante el proceso de autorrenovación y la señalización de CTNNB fue observada solo con OCT4 bloqueado. Por consiguiente, se llegó a la conclusión de que la vía de señalización Wnt funciona principalmente en la diferenciación, pero no en la autorrenovación de las CTEs y además, se ha observado que la activación de la señalización Wnt/CTNNB, mediante la adición de Wnt3a puede estimular la INTRODUCCIÓN 42 proliferación de las CTEs (Davidson et al., 2012). En conjunto estas observaciones, han desembocado en varios estudios que sugieren la combinación de Wnt3a y activina A para promover la diferenciación de las CTEs hacía el endodermo definitivo (Kroon et al., 2008; Johannesson et al., 2009; Mfopou et al., 2010; D’Amour et al., 2006). Otra ruta destacada en el desarrollo pancreático es la vía de señalización BMP, que actúa como un inhibidor en las etapas tempranas del desarrollo del endodermo, mientras que se requiere en la última parte de la formación de células progenitoras de pancreáticas (Cai et al., 2010; Zhang et al., 2009; Vallier et al., 2009), esta vía de señalización es controlada por la proteína nogina (Jiang et al., 2007a; Kroon et al., 2008). Por otro lado, la inhibición de la vía de señalización Shh en las células humanas y murinas promueve la formación del linaje pancreático (Kawaguchi et al., 2002; Kim y Melton, 1998; Hebrok et al., 2000; Lau y Hebrok, 2010). En las primeras etapas, durante la formación del mesendodermo y el endodermo definitivo, la activina A y el bFGF se usan para inhibir la vía de señalización Shh (Jiang et al., 2007a; D’Amour et al., 2006). Así como, el bFGF y la ciclopamina se utilizan posteriormente en la expansión de progenitores pancreáticos (D’Amour et al., 2006). 1.6.3. Protocolos de diferenciación Los primeros estudios para la obtención de células productoras de insulina a partir de las CTEs murinas (Shiroi et al., 2002; Soria et al., 2001, 2000) y humanas (Assady et al., 2001; Lumelsky et al., 2001), indicaron que se pueden obtener in vitro a partir de células pluripotentes espontáneamente diferenciadas. Esta diferenciación espontánea tenía un rendimiento muy bajo, insuficiente para una aplicación clínica. Durante la última década muchos grupos han contribuido a generar protocolos de diferenciación que simulan desarrollo del páncreas (Van Hoof et al., 2009). A partir de los estudios iniciales sobre la formación del endodermo definitivo, varios protocolos han sido publicados para la generación de células productoras de insulina, simulando el amplio conocimiento adquirido en el desarrollo pancreático en Xenopus y roedores (Van Hoof et al., 2009; INTRODUCCIÓN 43 Rezania et al., 2012; Chen et al., 2009; Kroon et al., 2008; D’Amour et al., 2006). Se obtuvieron grandes poblaciones de células que expresan factores de transcripción presentes en endodermo pancreático, incluyendo PDX1 y NEUROG3. Sin embargo, un gran porcentaje de las células eran poli-hormonales, al expresar simultáneamente somatostatina, glucagón y/o insulina (Bruin et al., 2014). La expresión de múltiples marcadores hormonales dentro de una sola célula y la mala respuesta a la glucosa en cuanto a la liberación de insulina, sugirió que los protocolos requieren nuevas mejoras. En base al protocolo de diferenciación de D’Amour et al., una compañía de biotecnología en San Diego (ViaCyte), intervino de forma importante en el desarrollo de protocolos para generar células productoras de insulina a partir de células troncales con respuesta a estímulos de glucosa, mediante el trasplante de células progenitoras pancreáticas encapsuladas en ratones donde posteriormente maduran hasta convertirse en células beta pancreáticas funcionales in vivo capaces de proteger contra la hiperglucemia inducida por estreptozotocina (STZ) (Kroon et al., 2008). En un trabajo más reciente, las células progenitoras pancreáticas se diferenciaron en células productoras de insulina con un alto porcentaje (≈80%) de células endocrinas, de las cuales la mitad expresaron insulina (Agulnick et al., 2015). Recientemente, se han publicado otros protocolos mejorados para la generación de células productoras de insulina sensibles a glucosa (Pagliuca et al., 2014; Russ et al., 2015; Pezzolla et al., 2015; Rezania et al., 2014). En todos ellos, las células se cultivan en suspensión para simular mejor las condiciones del crecimiento in vivo y la diferenciación. Existe una considerable variación entre los protocolos para la formación del endodermo definitivo y progenitores pancreáticos, aunque las condiciones de cultivo para conducir las células a partir de precursores pancreáticos endocrinos a células productoras de insulina inmaduras y finalmente a madurar son muy similares. Sin embargo, existe una serie de retos que deben ser superados antes de llegar a una terapia basada en células productoras de insulina para el tratamiento de la diabetes. Uno de los principales problemas a superar es la maduración completa de las células INTRODUCCIÓN 44 productoras de insulina in vitro, ya que las células diferenciadas secretan generalmente muy bajo nivel de insulina, expresan varias hormonas y muestran una respuesta insuficiente a la estimulación de glucosa. Otro reto es la supervivencia a largo plazo de los implantes de células productoras de insulina, ya que el trasplante de células extrapancreáticamente podrían sufrir una dediferenciación o incluso cambiar a otros tipos celulares. Además, las CTEs murinas y humanas son diferentes en muchos aspectos, de forma que trasladar la investigación de animales a humanos requiere extremar las precauciones. Si bien hasta el momento existen fuertes evidencias que confirman que las células productoras de insulina generadas pueden reducir la hiperglucemia en roedores, la capacidad de estas células para el tratamiento de los pacientes diabéticos no ha sido comprobada y la generación de células a gran escala para la aplicación clínica constituye otro obstáculo, aunque los recientes avances hacen indicar que la meta está cada vez más próxima. Por otra parte, persiste la incógnita de cuál podría ser la reacción del sistema inmune del huésped frente a las células productoras de insulina obtenidas, ya que similar a la situación del trasplante de islotes pancreáticos, las células troncales trasplantadas también enfrentan el problema del rechazo inmunológico, de modo que el reto para una terapia basada en células con éxito en el tratamiento de la diabetes no es sólo la obtención de células productoras de insulina funcionales, sino también el bloqueo de la respuesta autoinmune. Por ello, muchos de los esfuerzos de la investigación actual se basan en técnicas que mejoren el implante de las células trasplantadas y evitar cualquier tipo de rechazo por el sistema inmunológico. En este sentido, una de las estrategias perseguidas ha consistido en utilizar una gran variedad de moléculas inmunosupresoras, ya sea aisladas o combinadas, para proteger a las células obtenidas de las CTEs del rechazo inmunológico, como podría ser la combinación del CTLA4-Ig, un fármaco aprobado por la Agencia de alimentos y medicamentos norteamericana (FDA), para el tratamiento de la artritis reumatoide que suprime las células T responsables del rechazo inmune y una proteína llamada PD-L1 que se sabe que es importante para la inducción de la tolerancia inmune en tumores, que ha INTRODUCCIÓN 45 permitido sobrevivir a las células alogénicas en ratones humanizados, los cuales se caracterizan por expresar un sistema inmunológico equivalente al humano, sin provocar el rechazo inmune (Rong et al., 2014). Otra estrategia reciente que se ha perseguido activamente como un medio de afrontar el ataque autoinmune, consiste en la encapsulación celular. En este caso, se lleva a cabo la protección de las células encapsuladas del sistema inmunitario al tiempo que se permite una oxigenación adecuada, el tránsito de nutrientes y glucosa, y el transporte de insulina a través de la barrera. Aunque no se ha descrito una exitosa y reproducible encapsulación de islotes pancreáticos humanos que dure más de unas pocas semanas en pacientes con diabetes tipo 1, ViaCyte defiende que las células productoras de insulina obtenidas a partir de células troncales pueden funcionar in vivo en sus dispositivos de macro-encapsulación patentados (Agulnick et al., 2015). Por tanto, a pesar de que se trata de retos importantes, hay muchas razones para creer que la terapia de reemplazo de células beta pancreáticas puede convertirse en una realidad clínica para el tratamiento de pacientes con diabetes. 1.7. Regulación epigenética de las CTEs El principal rol de la epigenética es la regulación de genes, este proceso es clave en diferentes procesos celulares como pueden ser: • La modulación individual de genes y su actividad; • El desarrollo y diferenciación de tipos celulares mediante grupos de genes que son funcionales en cada tipo celular específico. • La plasticidad metabólica celular, que le permite adaptarse a los cambios exógenos. Comprender todos los mecanismos moleculares gobernantes que controlan las CTEs es de inmenso interés biológico. Como se ha comentado con anterioridad, trabajos previos han identificado una red transcripcional dirigida por factores de transcripción tales INTRODUCCIÓN 52 codificaba para un RNA regulador de unos 22 nucleótidos, no sería descrito hasta 7 años después. El let-7 actuaba promoviendo el desarrollo de la larva tardía hacia la forma adulta, así como lin-4 actuaba en el desarrollo temprano en la transición del primer estadio larvario al segundo (Reinhart et al., 2000; Slack et al., 2000). A raíz del descubrimiento del let-7, se fueron descubriendo homólogos en otros genomas como el humano o el de otros animales bilaterales constituyendo una gran familia, además de otros muchos miRNAs que desde el año 2002 están siendo registrados en la base de datos Sanger miRBase (http://www.mirbase.org/), la cual representa un archivo en línea de secuencias de miRNAs y según el último recuento en la versión 21 de junio de 2014 hay más de 35.828 miRNAs maduros registrados en 223 especies, que incluye más de 2.588 miRNAs identificados en humanos. 1.9.1. Biogénesis de los miRNAs Los genes que codifican los miRNAs pueden variar su localización ampliamente en el genoma, localizándose principalmente dentro de los intrones de genes que pueden codificar para proteínas, pero también pueden encontrarse en regiones intergénicas o exónicas (Rodriguez, 2004; Zeng, 2006). En el primer caso, la expresión de los miRNAs puede ir correlacionada con la regulación transcripcional de su gen huésped y de esta manera explicaría una especificidad tisular debida a la expresión de diferentes grupos de genes (Lin et al., 2006; Bartel, 2004). En el segundo caso, la expresión de los miRNAs viene regulada de forma independiente a través de sus propios elementos reguladores (Zeng, 2006). También se ha observado que los miRNAs pueden estar derivados de secuencias repetitivas del DNA (Smalheiser y Torvik, 2005). Los miRNAs maduros son moléculas de unos 20-30 nucleótidos de longitud, con un grupo fosfato en el extremo 5’ y un grupo hidroxilo en el extremo 3’. Los miRNAs maduros se generan a través de múltiples etapas de procesamiento de escisiones secuenciales endonucleolíticas que se inician en el núcleo de la célula y culminan en el INTRODUCCIÓN 53 citoplasma. Aunque se han descrito algunos casos de transcripción por la RNApolimerasa III (Borchert et al., 2006), en la mayoría de los casos serán transcritos por la RNA-polimerasa II que produce una larga molécula precursora de RNA que puede exceder varias kilobases, conocida con el nombre de miRNA primario (pri-miRNA) (Lee et al., 2004; Cai et al., 2004). Este forma una estructura stem-loop (Lee et al., 2003) y será procesado en el núcleo por el complejo microprocesador, formado por la RNasa III conocida con el nombre de Drosha, que dimeriza con la proteína de la región crítica del gen 8 del síndrome DiGeorge (DGCR8), también conocida como Pasha. Drosha escinde de forma asimétrica ambas cadenas en los sitios cercanos a la base de la estructura primaria en forma de stem-loop, de forma que el producto resultante es una molécula de RNA precursora de unos 70-120 nucleótidos denominada pre-miRNA (Denli et al., 2004; Lee et al., 2003). Este es exportado al citoplasma de forma activa a través del complejo Exportina-5, dependiente de Ran-GTP (Lund et al., 2004; Yi et al., 2003), en el que la proteína nuclear asociada a Ras (Ran) es un cofactor que une GTP durante la exportación nuclear del RNA. En el citoplasma, la molécula de GTP es hidrolizada a GDP y el pre-miRNA es liberado del complejo exportador. En el citoplasma, los pre-miRNAs son reconocidos por el complejo de procesamiento de los pre-miRNAs formado por Dicer, la proteína de unión a RNA en respuesta a trans-activación (TRBP) y la proteína quinasa activadora dependiente de RNA de cadena doble inducible por interferón (PRKRA), dando lugar a una molécula de doble cadena conocida como miRNA dúplex (Lund et al., 2004; Yi et al., 2003; Hutvágner et al., 2001; Grishok et al., 2001). Tras el procesamiento, se separan las 2 hebras del miRNA dúplex, dependiendo de varios factores tales como la asimetría termodinámica de los dúplex y la estabilidad de emparejamiento de bases en el extremo 5', determinándose una hebra guía que será preferentemente integrada con una de las 4 proteínas Argonautas (Ago) para formar el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) (Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003), el cual constituye la maquinaria catalítica responsable de la degradación del mRNA diana y/o inhibición de la traducción, mientras que la otra hebra (hebra INTRODUCCIÓN 54 pasajera o miR*), por lo general se degrada o en casos raros puede asociarse con proteínas Ago, permitiendo a ambas hebras servir como miRNAs funcionales (Krol et al., 2010; Okamura et al., 2009; Czech et al., 2009). Al RISC que lleva a cabo su acción asociado con la hebra guía del miRNA, se le conoce como miRISC y constituye el enzima catalítico que procesa el mRNA diana para bloquear su traducción. En la Figura 10, se refleja en detalle los procesos y factores implicados en la biogénesis de los miRNAs. FIGURA 10. El procesamiento de los miRNAs clásico se inicia con la (1) transcripción del pri-miRNA mediante la RNA polimerasa II. (2) A continuación el transcrito primario es escindido en un premiRNA mediante el complejo formado por Drosha y DCGR8 (Microprocesador). (3) La siguiente etapa implica la exportación nuclear dependiente de RAN-GTP, mediante la Exportina-5. (4) Esta nueva localización permite a la RNasa Dicer y TRBP escindir el pre-miRNA, dando lugar a un duplex imperfecto de aproximadamente 19-24 nucleótidos de longitud, que se disociará en una hebra guía y otra pasajera. (5) Finalmente, la proteína argonauta-2 (Ago2), basándose en reglas termodinámicas seleccionará la hebra guía del miRNA, (6) constituyéndose el miRISC que se encarga de la regulación del mRNA diana. INTRODUCCIÓN 55 1.9.2. Mecanismos de acción de los miRNAs Los miRNAs pueden regular negativamente la expresión génica a través de 2 mecanismos principales que son la degradación del mRNA diana o la represión de la traducción, la utilización de un mecanismo u otro dependerá del mRNA diana. Una vez el miRNA se incorpore en el RISC, actuará un mecanismo u otro dependiendo del grado de complementariedad del miRNA con su diana. Si la complementariedad es elevada o total se producirá la degradación del mRNA (Bagga et al., 2005), mientras que si la complementariedad no es total o es insuficiente se producirá una inhibición de la traducción. Uno de los principales puntos de discusión en este campo gira en torno al grado de complementariedad necesario para el silenciamiento génico y a cuántos miRISC son necesarios para inhibir la traducción. Según los conocimientos disponibles sobre los siRNAs, se cree que serían necesarios al menos 11 pb para una elevada afinidad en el reconocimiento del mRNA diana y la unión al miRISC, por debajo de este número la afinidad del miRISC por su diana se encuentra comprometida. Sin embargo, Doench y Sharp (Doench y Sharp, 2004) describieron que la habilidad de los miRNAs para suprimir la traducción dependía enormemente de la energía libre de unión entre los primeros 8 nucleótidos del extremo 5’-UTR del miRNA y mRNA diana. Según esto un miRNA puede actuar sobre muchas zonas 3’-UTR de un gran número de genes. Estudios de expresión de microarrays mostraron que los miRNAs pueden inhibir muchos mRNAs dianas que contengan secuencias que sean complementarias a las posiciones 2-7 del extremo 5’-UTR de un miRNA, región que se conoce como secuencia semilla (seed) (Lim et al., 2005). La segunda cuestión podría responderse considerando la afinidad del miRISC por su diana; las evidencias apuntan a que se requieren varias regiones de unión a miRNAs para una interacción miRNA-mRNA de alta afinidad que suprima la traducción. Es plausible pensar que un miRISC que reconoce una unión imperfecta entre el miRNA y el mRNA con sólo 7-9 nucleótidos, se uniría a la diana con baja afinidad. Por lo que múltiples copias de miRISC podrían unirse a la diana para compensar la unión de baja afinidad entre el miRISC y el mRNA (Lim et al., 2005; Pillai et al., 2005). INTRODUCCIÓN 56 Cuando un miRNA guía hacia la degradación de un mRNA, el corte se produce precisamente en el mismo sitio en que lo producen los siRNAs en su acción, entre los nucleótidos que rodean al residuo 10-11 del miRNA (Hutvágner y Zamore, 2002). Después de la degradación del mRNA, el miRNA permanece intacto y puede guiar hacia el reconocimiento y la destrucción de mRNAs adicionales. En general en este mecanismo de acción la complementariedad se puede dar tanto en regiones codificantes como en regiones 3’-UTR, mientras que cuando actúa inhibiendo la traducción suele unirse exclusivamente a la región 3’-UTR del mRNA. Existen excepciones como la que se ha observado con miR-122 que afecta positivamente la replicación del virus de la Hepatitis C, por unión a la región 5’-UTR no codificante (Jopling et al., 2005), en este caso el miRNA tiene función activadora de la expresión génica, aunque no está claro si es un mecanismo único o si representa un mecanismo de acción todavía desconocido de los miRNAs. En el mecanismo de inhibición de la traducción, el principal efector es un miembro de la familia de RNA helicasas (RCK/p54) y componente del miRISC. Diversos estudios muestran que algunos componentes del miRISC colocalizan en los cuerpos-P (puntos citoplasmáticos que contienen complejos proteicos) junto con el mRNA reprimido traduccionalmente. Múltiples copias del miRISC que contienen RCK/p54 pueden iniciar un evento de oligomerización que secuestra al mRNA y lo transporta a los cuerpos-P, una vez allí el mRNA traduccionalmente reprimido podría permanecer en estructuras oligoméricas para su almacenamiento o podría formar un complejo con enzimas decapping y proteínas cap-binding que degradan el mRNA. En resumen, el miRNA en el miRISC indica la secuencia diana y RCK/p54 es la molécula efectora que transporta el mRNA hacia el almacenaje o procesamiento en los cuerpos-P (Sen y Blau, 2005; Liu et al., 2005; Valencia-Sanchez, 2006). Por otro lado, algunos siRNAs pueden unirse al DNA y realizar no sólo represión posttranscripcional sino también represión transcripcional, esto apunta a que los miRNAs INTRODUCCIÓN 57 podrían también actuar de esta manera. Además, los miRNAs podrían estar relacionados con la regulación de la estructura de la cromatina. En este sentido, la predicción de genes diana de los miRNAs entre los cuales hay proteínas modificadoras de histonas, como son las histonas metil-transferasas, proteínas de unión a islas CpG e histonas deacetilasas, apoyaría esta hipótesis (Lewis et al., 2005). 1.9.3. Los miRNAs y la autorrenovación de las CTEs La decisión del estado de autorrenovación o diferenciación está regulada por un complejo conjunto de factores, incluyendo factores de transcripción, modificaciones de la cromatina, vías de señalización y ncRNAs. El programa molecular de las CTEs necesita ser conservado con el fin de mantener el estado de pluripotencia no diferenciado, mientras que este programa se verá sometido a cambios de expresión génica y la intervención de la epigenética, cuando las células están comprometidas hacia un proceso de diferenciación que resulta en una transformación masiva del fenotipo celular. Por su capacidad para regular de forma simultánea cientos de dianas, los miRNAs representan excelentes candidatos para esta rápida y gran transformación. En este sentido los miRNAs han demostrado ser piezas clave en la regulación del desarrollo de las células troncales al jugar un papel crítico en la formación y la definición de la pluripotencia de células troncales, así como en su diferenciación (Yi y Fuchs, 2011). La expresión de los miRNAs se ha examinado ampliamente en las CTEs murinas y humanas mediante diversas técnicas revelando que la expresión global de los miRNAs es más baja en las CTEs en comparación a las mismas células diferenciadas. Sin embargo, algunos miRNAs están limitados a las CTEs, mientras que otros se encuentran ampliamente expresados, pero disminuyen significativamente durante la diferenciación. Por tanto, un número limitado de los miRNAs se transcriben en las CTEs y se expresan preferentemente en el estado pluripotente, mientras que serán inmediatamente silenciados una vez que reciben señales de diferenciación (Houbaviy et al., 2003). La INTRODUCCIÓN 58 mayoría de estos miRNAs específicos se puede agrupar en 4 grandes grupos. Uno de ellos constituido por la familia miR-290 (miR-291, -294 y -295) en ratones y su homólogo en humanos la familia miR-371/373 (miR-371, -372 y -373); otro por la familia miR302/367 (miR-302a/b/c/d y -367) común en ratones y humanos; la familia miR-17/92 (miR-17, -18a, -19a/b, -20a y -92); y la familia C19MC que incluye 46 miRNAs codificados en el cromosoma 19 (Stadler et al., 2010). La expresión común de similares miRNAs en CTEs murinas y humanas sugiere un importante papel funcional en la biología de las células troncales. La mayoría de estas familias de miRNAs se transcriben como transcritos policistrónicos, lo que sugiere que comparten reguladores comunes y el mismo patrón de expresión. De hecho, los promotores de la mayoría de estos miRNAs pueden ser activados por OCT4, SOX2 y NANOG (Marson et al., 2008). Además, presentan una secuencia semilla (seed) idéntica o muy similar (AAGUGCU o AAAGUGC), por lo que pueden dirigirse a un grupo común de mRNAs diana (Stadler et al., 2010). El hecho de que muchos miRNAs tengan la misma secuencia semilla (seed) y que un solo miRNA puede actuar en múltiples dianas hacen difícil estudiar su función de forma individual. La eliminación de todos los miRNAs se puede conseguir mediante la supresión de los genes que codifican las enzimas implicadas en el procesamiento o funcionamiento de los miRNAs, Drosha, Dicer o DGCR8, entre otros. La deficiencia de Dicer genera muerte prematura en etapas tempranas del desarrollo de ratones (Bernstein et al., 2003), mientras que las CTEs murinas mutantes en Dicer son viables en cultivo, pero presentan defectos en la diferenciación (Kanellopoulou et al., 2005). La pérdida de Dicer también conduce a graves defectos de crecimiento de las CTEs y prolonga ligeramente las fases G1 y G0 del ciclo celular (Murchison et al., 2005). De forma similar a la deficiencia de Dicer, la inactivación de DCGR8 da lugar a ratones no viables y las CTEs murinas con defectos en la proliferación y fallos en la diferenciación (Wang et al., 2008). Las deficiencias conjuntas de Drosha y Dicer atenúan drásticamente la división celular de las CTEs humanas e inducen defectos en la diferenciación (Qi et al., INTRODUCCIÓN 59 2009). En conjunto estos datos ponen en evidencia que los miRNAs son críticos para la autorrenovación y diferenciación de las CTEs. Una regulación estricta de la división de células troncales es primordial para mantener la capacidad de autorrenovación. Los defectos observados en la proliferación de mutantes Dicer, Drosha y DGCR8 sugieren que los miRNAs están involucrados en la regulación de su ciclo celular. Se sabe que las CTEs se caracterizan por un atípico ciclo celular acelerado, debido a una corta transición de la fase G1 a la fase S en comparación a las células somáticas (Fluckiger et al., 2006; Wang et al., 2008). Los puntos de control regulan la progresión a través de las fases del ciclo celular y son regulados por la activación e inactivación secuencial de las proteínas quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Contrariamente a las células somáticas, las CTEs expresan muy bajos niveles de inhibidores del ciclo celular (p21, p27 y p16), lo que hace que exhiban un atípico ciclo celular. Mucho de los defectos en la proliferación inducidos por la deficiencia de las enzimas Dicer o Drosha, pueden ser contrarrestados por miembros de las familias miR290 y -302, lo que revela que se trata de miRNAs importantes como reguladores del ciclo celular (Wang et al., 2008; Sinkkonen et al., 2008). Por ello, a estos miRNAs se les conoce como específicos del ciclo celular de las CTEs (ESCC), dado que predominantemente intervienen en la regulación el ciclo celular (miRNAs promotores del ciclo celular de las CTEs). Este tipo de miRNAs comparten una secuencia semilla (seed) común, lo que sugiere que regulan un conjunto común de genes. La búsqueda de sus dianas reveló que funcionan mediante la supresión de varios reguladores clave (p21, Rbl2 y Last2) de puntos de restricción como la vía CiclinaE/CDK2, que regula la transición de las fases G1/S permitiendo así una rápida proliferación en las CTEs (Wang et al., 2008, 2013b). Interesantemente, la familia miR-290 en ratones ha sido mostrada como diana de Rbl2 y disminuye la expresión de las DNA metiltransferasas (Wang et al., 2008), de forma similar actúa su ortólogo en humanos la familia miR-372 (Qi et al., 2009). En conjunto, estos numerosos cambios moleculares inducidos sugieren que los miRNAs ESCC tienen un importante efecto promotor del ciclo celular y preservador de la INTRODUCCIÓN 60 capacidad proliferativa, lo que les convierte en actores principales en el control de la división de las CTEs. El circuito regulador básico (OCT4-SOX2-NANOG), desempeña un papel central en el mantenimiento y adquisición de la pluripotencia, aunque existen otros factores que participan también en la red reguladora de la pluripotencia como LIN28, c-MYC, KLF4, TCF3 o STAT3. Se puede diferenciar un grupo de miRNAs característicos de las CTEs que son capaces de promover la autorrenovación de las células troncales y a su vez inhiben la diferenciación celular. Por ello, el impacto de los miRNAs sobre el transcriptoma de las CTEs ha sido analizado en profundidad. Se ha descubierto que los miRNAs parecen incrementar la actividad de c-MYC a través de múltiples rutas indirectas (Lin et al., 2009; Cartwright et al., 2005). Este factor promueve la proliferación y es requerido para la autorrenovación de las CTEs y su inhibición promueve la perdida de la autorrenovación (Singh y Dalton, 2009). Además, c-MYC conduce a la transcripción de numerosos miRNAs que promueven la autorrenovación como son miR-141, -200 y -429 (Lin et al., 2009). Interesantemente, los promotores de las familias miR-290 y -302 son directamente regulados por los factores de pluripotencia (OCT4, SOX2, NANOG y TCF3) y a su vez los miRNAs mantienen la expresión de los factores de pluripotencia mediante la inhibición de silenciadores (Judson et al., 2009; Marson et al., 2008). Otros factores asociados a la pluripotencia son también indirectamente promovidos por los miRNAs, estos incluyen LIN28, TRIM71 y SALL4 (Melton et al., 2010) o bien son los miRNAs los que promueven su expresión como la familia miR-17/92 que induce a LIN28 (Warrander et al., 2016). Por tanto, parece claro que se establecen circuitos de retroalimentación entre los factores de transcripción y los miRNAs que ayuda a fortalecer el mantenimiento del estado pluripotente de las CTEs. INTRODUCCIÓN 61 1.9.4. Los miRNAs y la diferenciación celular de las CTEs La transición del estado de autorrenovación de las CTEs a un estado diferenciado es un proceso robustamente regulado para un desarrollo normal y la homeostasis de los tejidos. Dado que los miRNAs se adaptan para estabilizar el estado de autorrenovación, están bien situados para promover la transición de la autorrenovación a la diferenciación. Los miRNAs pro-diferenciación pueden ser inducidos rápidamente con el inicio de los procesos de diferenciación de las CTEs a linajes específicos y silencian la autorrenovación actuando directamente sobre la red central de factores de pluripotencia. Una segunda clase de miRNAs pro-diferenciación van siendo inducidos durante el transcurso de la diferenciación y en general suprime programas génicos asociados a las CTEs pero no a los mismos factores de transcripción centrales de pluripotencia (Tiscornia y Izpisúa Belmonte, 2010). Estas 2 clases de miRNAs de diferenciación probablemente juegan distintos roles en el proceso de diferenciación, de modo que la primera clase de miRNAs suprimen directamente el estado de autorrenovación de las CTEs, mientras que la segunda clase de miRNAs predominantemente estabilizan el estado diferenciado, al igual que los miRNAs ESCC estabilizan el estado pluripotencial de las CTEs (Ong et al., 2015). Durante la diferenciación de las CTEs humanas es sobreexpresado miR-145 (Stadler et al., 2010), este incremento reprime la expresión de factores de pluripotencia y facilita la diferenciación, mientras que su disminución perjudica a la diferenciación e induce la expresión de OCT4, SOX2 y KLF4. Por tanto, miR-145 controla la diferenciación de las CTEs mediante la interacción con los factores de pluripotencia silenciando el programa de autorrenovación (Xu et al., 2009). Interesantemente, el promotor de miR-145 es inhibido por OCT4 estableciéndose un circuito de retroalimentación negativo. En las CTEs murinas se ha demostrado que varios miRNAs promueven la diferenciación mediante interacción con genes que codifican factores de transcripción implicados en el mantenimiento de la identidad de células troncales. Los miRNAs miR-200c, -203 y -183 2. OBJETIVOS OBJETIVOS 71 Nuestro grupo fue pionero en demostrar que las CTEs murinas pueden diferenciarse in vitro hacia células productoras de insulina y revertir in vivo la glucemia en modelos murinos diabéticos, estudios posteriores han demostrado que los protocolos de diferenciación in vitro pueden ser optimizados para aumentar la eficacia y eficiencia, consiguiendo células productoras de insulina maduras funcionales en cantidad suficiente para una posible terapia celular. Durante el desarrollo un complejo entramado de señales inductoras y de factores de transcripción reguladores determina de forma combinatoria la adquisición de un fenotipo pancreático. Nuestra hipótesis consistía en comprobar si es posible aumentar la eficacia y eficiencia del proceso de diferenciación de las células pluripotentes hacia células productoras de insulina, mediante un mecanismo regulador innovador ejercido por pequeñas moléculas de ncRNAs como son los miRNAs, de forma que podrán constituir herramientas moleculares útiles en la manipulación de las CTEs. El objetivo principal se centra especialmente en el aislamiento de miRNAs candidatos e involucrados en la diferenciación de células troncales pluripotentes a células productoras de insulina, analizando el posible patrón de expresión común de miRNAs durante el desarrollo embrionario pancreático y la diferenciación de las CTEs hacia células productoras de insulina e identificar específicos miRNAs candidatos que puedan desempeñar un papel regulador clave en la diferenciación de las CTEs, así como analizar el patrón de expresión de miRNAs en las células maduras de islotes pancreáticos adultos y con este propósito nos hemos planteado los siguientes objetivos específicos: 1. Estudiar el posible efecto de las pequeñas moléculas de ncRNAs en los procesos de diferenciación in vitro de las CTEs. 2. Analizar la expresión global de los miRNAs durante el proceso de diferenciación in vitro de las CTEs hacia células humanas productoras de insulina, mediante microarrays para la identificación de miRNAs específicos implicados en el proceso de diferenciación. OBJETIVOS 72 3. Analizar el patrón de expresión de los miRNAs en el tejido pancreático adulto e identificar aquellos preferentemente expresados en las células de islotes pancreáticos adultos. 4. Estudiar los perfiles de expresión común a los miRNAs descritos en la organogénesis del páncreas y la diferenciación de las CTEs hacia células productoras de insulina, determinando los mecanismos compartidos en la regulación mediada por estos miRNAs y comprobar si la regulación tiene lugar a través de las mismas proteínas diana. 5. Estudiar el efecto de la inhibición o sobreexpresión de los miRNAs identificados con una expresión preferente tanto en el proceso de diferenciación pancreática como en los islotes pancreáticos adultos. Analizando la implicación funcional de los miRNAs validados y seleccionados en la diferenciación in vitro de las CTEs hacia células productoras de insulina y la implicación de estos miRNAs en la inducción de cambios de expresión de los marcadores de diferenciación pancreática. 3. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 75 3.1. Bioética y experimentación animal Se emplearon ratones adultos C57BL/6J como modelo de experimentación y fueron alojados en la Unidad de Recursos Biológicos del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER). Los protocolos de manipulación de animales, incluyendo eutanasia y sacrificio, se realizaron bajo la guía de legislación de la Comunidad Europea y fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del CABIMER (CEEA-CABIMER. 19/2010). 3.1.1. Obtención de muestras biológicas a partir de tejidos de origen murino Los animales adultos de 3 meses se sacrificaron mediante dislocación cervical, para la obtención de los islotes pancreáticos. Una vez sacrificados se practica una laparotomía media completa, abatiendo la pared abdominal lateralmente mediante 2 secciones horizontales inmediatamente por debajo de los rebordes costales inferiores. Se movilizaron el hígado y se fijó la pared costal mediante un papel de filtro. Se desplazaron los intestinos a partir del yeyuno hacia la derecha del animal, de forma que quedaron expuestos el páncreas, la vesícula biliar y la porción proximal del conducto biliar común. Se movilizó el duodeno con el fin de localizar la porción distal del conducto biliar común y se ligó el colédoco en su unión al duodeno, a unos 2 o 3 milímetros por debajo de la vesícula biliar, se introdujo en el conducto biliar una aguja de punta roma, previamente doblada en ángulo recto; a continuación, se pasó una ligadura que fija la aguja en su posición. Se inyectó con una jeringa 6 mL de solución de Hanks (Gibco, 14025092), suplementada con 0,08 mg/mL de colagenasa (SIGMA, C9263). De este modo, se logra una buena distensión del tejido pancreático que facilita su extracción, además de permitir un buen acceso de la colagenasa a todo el páncreas. Se extrajo el páncreas de la cavidad abdominal por disección y se transfirió a un tubo de ensayo de 15 mL, que se incubó en un baño termostatizado a 37°C durante 10 minutos, agitando enérgicamente a los 5 y 10 minutos. El tejido pancreático en digestión se detuvo MATERIALES Y MÉTODOS 76 mediante la adición de solución de Hanks a 4°C. A partir de este momento comienza la primera fase de lavado; el digerido se agitó suavemente con una pipeta, para disgregar y resuspender el tejido, después se sedimentó mediante centrifugación a 1.200 revoluciones por minuto (rpm) durante 2 minutos y por último se decantó el líquido sobrante, dejando solo el sedimento de tejido. Este proceso se repite 2 veces con el fin de eliminar la colagenasa del medio. A partir del tejido pancreático digerido final se recuperan los islotes pancreáticos individualmente, mediante succión con pipeta automática con la finalidad de separar bien los islotes pancreáticos del resto de tejido exocrino. Los islotes pancreáticos fueron entonces almacenados a -80°C hasta ser sometidos al proceso de extracción del RNA. 3.2. Cultivo Celular 3.2.1. Líneas celulares cultivadas y condiciones de cultivo Las distintas líneas celulares utilizadas incluyen CTEs de origen murino (ES-D3) y humano (HS181), una línea celular de iPSC de origen humano (MSUH-001) y una línea derivada a partir de células beta pancreáticas murinas de origen tumoral (INS-1E):  ES-D3: Línea de CTEs murinas comercial (ATCC®; CRL-1934™), derivadas de la masa celular interna de blastocisto de ratón 129S2/SvPas (RF32835) y generadas por el grupo de Doetschman (Friedrich-Miescher-Laboaratorium der Max-PlanckGesellschaft Institute, Alemania) (Doetschman et al., 1985). Las células ES-D3 no necesitan ser cultivadas sobre una capa de células nodrizas o matriz proteica, sino que para el mantenimiento de su estado pluripotencial no diferenciado es suficiente la adición en el medio de cultivo del LIF, facilitando algunos abordajes experimentales (p. ej. transfección). Las células fueron mantenidas en medio de cultivo DMEM GlutaMAX™ (Gibco, 32430) con 15% de suero fetal bovino inactivado (FBS Lonza, DE14-801F), suplementado con penicilina 100 U/mL y MATERIALES Y MÉTODOS 77 estreptomicina 100 µg/mL (Gibco, 15140), aminoácidos no esenciales 2mM (Invitrogen, 25030-024), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Invitrogen, 31350-010) y LIF 106 U/mL (Millipore, ESG1107) e incubadas a 37°C y 5% de CO2.  HS181: Línea de CTEs humana cedida por parte de Hovatta, derivada en la Unidad de Fertilidad del Hospital Universitario Karolinska, después de la aprobación por el Consejo ético de investigación del Instituto Karolinska, Drno 454/02. Esta línea se derivó de un embrión que no podría ser utilizado para el tratamiento de la infertilidad de una pareja, previo consentimiento informado para la donación del embrión con el fin de derivar una posible línea de CTEs permanente para ser utilizado en investigación. La línea HS181 está incluida en el registro de la Unión Europea hESC (http://www.hescreg.eu/). A diferencia de las CTEs de origen murino, las CTEs humanas deben cultivarse sobre un sustrato celular o bien una matriz proteica junto con el hrbFGF para mantener su estado de pluripotencia, lo que permite que las células crezcan formando colonias de bordes bien definidos y mantengan su estado no diferenciado. Las células fueron cultivadas según lo descrito en el trabajo de Hovatta (Hovatta et al., 2003). Las placas de cultivo fueron tratadas con matrigel (1:60) y las células fueron mantenidas con medio de cultivo condicionado obtenido a partir de una línea de fibroblastos humanos fetales comercial (ATCC® CRL-2429) que previamente habían sido inactivados con mitomicina C (10 µg/mL) durante 3h a 37 °C. El medio condicionado obtenido a partir del cultivo de fibroblastos fetales inactivados (ATCC®; CRL-2429™) que liberan al medio FGF, está constituido por medio de cultivo DMEM KnockOut™(Gibco, 10829-018) con 20% de reemplazante de suero (Gibco, 10828028), L-Glutamina 2 mM (Gibco, 25030-032), aminoácidos no esenciales 2mM (Gibco, 11140-035), penicilina 50 U/mL y estreptomicina 50 μg/mL (Gibco, 15140122), 2-Mercaptoethanol 0,1 mM (Gibco, 31350-010) y al que posteriormente se le suplementó con hrbFGF 8 ng/mL (R&D System, 234-FSE), para mantener las células HS181 que son incubadas a 37°C y 5% de CO2. MATERIALES Y MÉTODOS 84 control de transfección Dy547-labeled miRIDIAN mimic (Dharmacon, CP-004500) que permite una rápida visualización de la entrada de mimic-miRNAs en las células, ya que la transfección puede ser monitorizada y visualizada por epifluorescencia con microscopia óptica. 3.4. Técnicas de biología molecular 3.4.1. Extracción del RNA La extracción del RNA se llevó a cabo utilizando la técnica del TRIzol descrita por (Chomczynski y Sacchi, 1987). A partir de los muestras celulares o tejidos se procedió a la homogenización añadiendo 1 mL de TRIzol® Reagent (Thermo Fisher Scientific, 15596026), utilizando la pipeta automática e incubando 5 minutos a temperatura ambiente (20-25°C). A continuación para conseguir la separación de fases que permita aislar el RNA, se añadieron 200 µL de cloroformo 99,2% (BDH, 22711.290), agitando vigorosamente en vortex 15 segundos e incubando 2-3 minutos a temperatura ambiente (20-25°C) y se centrifugó a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4°C de forma que se consiguió obtener una fase inferior, una interfase de fenol-cloroformo y una fase superior acuosa que contenía el RNA, por lo que se recogió esta fase acuosa con precaución de no alterar las otras fases. La siguiente etapa comprende la precipitación del RNA con 500 µL de isopropanol 98,5% (SIGMA, I9392), para ellos se mezcló por inversión varias veces para precipitarlo incubando 10 minutos a temperatura ambiente (20-25°C) y se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4°C descartándose el sobrenadante resultante. Por último, se procedió a una fase de lavado del RNA. Para ello, se resuspendió en 1 mL de etanol 75% (Merck, 08543) para eliminar sales y se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos a 4°C, descartando nuevamente el sobrenadante y secando el pellet a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 10 minutos. Finalmente, se resuspendió el MATERIALES Y MÉTODOS 85 pellet en 10-20 µL de agua grado biología molecular libre de RNasas, DNasas y proteasas (5PRIME, 2500010). La cuantificación espectrofotométrica se llevó a cabo mediante Nanodrop (ND-100), empleándose como criterios de pureza del RNA el ratio 260/280 (1,8-2) y se mantuvieron los RNAs resultantes a -80°C hasta el momento de su utilización. 3.4.2. Retrotranscripción o transcripción Inversa La transcripción inversa, transcripción reversa o retrotranscripción es una reacción que implica la generación de una cadena de DNA de doble cadena complementaria al RNA o miRNA de cadena simple. La síntesis del DNA complementario (cDNA) de los genes de interés tiene lugar a partir del RNA total, empleándose cebadores aleatorios y la enzima transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina Moloney (M-MLV). La síntesis se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante en tubos de microcentrífuga estériles. En primer lugar, se constituyó la mezcla de 1 µg del RNA total y 1 µL de cebadores aleatorios o random primers (Promega, C118A), completándose hasta un volumen final de 10 µL con agua grado biología molecular libre de RNasas, DNasas y proteasas (5PRIME, 2500010). A continuación, se desnaturalizó a 70°C durante 5 minutos para eliminar las estructuras secundarias enfriándose inmediatamente a 4°C para prevenir la reformación de estructuras secundarias. En segundo lugar, se añadieron 15 µL de la mezcla de reacción con los componentes detallados en la Tabla 5, para el alineamiento cebador/muestra, finalmente se mezclaron todos los componentes agitando suavemente y el tubo se incubó a 37 °C durante 60 minutos. MATERIALES Y MÉTODOS 86 Mezcla de Reacción Volumen (µL ) Concentración Solución de reacción M-MLV RT 5x (Promega,M531A) 5 1x dNTPs 10mM (Bioline, BIO39029) 1,25 0,5 mM Inhibidor RNasas 40 U/ µL (Promega, N211B) 0,6 1 U/µL M-MLV RT 200U/ µL (Promega, M170A) 0,5 4 U/µL cDNA 100 ng/µL 10 40 ng/µL Agua grado biología molecular (5PRIME, 2500010) 7,65 Volumen Final 25 TABLA 5. Descripción de los reactivos y concentraciones de los mismos utilizadas durante la transcripción inversa del RNA. La síntesis del cDNA de los miRNAs de interés tiene lugar a partir del RNA total ajustando su concentración a 5 ng/µL y se utiliza el kit de síntesis universal de cDNA para miRNAs (Exiqon, 203301), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para ello, se incuba la mezcla de reacción (Tabla 6) a 60°C durante 1 hora, transcurrido este tiempo se inactiva la reacción enzimática aumentando la temperatura hasta los 95°C durante 5 minutos e inmediatamente se enfría a 4°C. Mezcla de Reacción Volumen (µL ) Concentración Solución de reacción 5x (Exiqon, 203300-04) 2 1x Mezcla enzimática 10x (Exiqon, 203300-03) 1 1x RNA total 100 ng/µL 2 20 ng/µL Agua grado biología molecular (Exiqon, 203300-01) 5 Volumen Final 10 TABLA 6. Descripción de los reactivos y concentraciones de los mismos utilizadas durante la transcripción inversa de los miRNAs. 3.4.3. Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa Inversa (RT-PCR) Realizada la transcripción inversa a partir del cDNA obtenido de una secuencia especifica del RNA de los genes de interés, se obtuvieron múltiples copias mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), un método enzimático de síntesis in vitro. La RT-PCR se llevó a cabo con un volumen final de 20 µL y se emplearon los siguientes componentes (Tabla 7): MATERIALES Y MÉTODOS 87 Mezcla de Reacción Volumen (µL) Concentración Solución de reacción 10x (Bioline, BIO-37025) 2 1x MgCl2 50Mm (Bioline, BIO-37026) 0,6 1,5 mM dNTPs 10mM (Bioline, BIO-39028) 0,4 0,2 mM BIOTAQ™ 5 U/µL (Bioline,BIO-21040) 0,2 0,05 U/µL Cebadores 5 µM 2 500 nM cDNA 10 ng/µL 4 2 ng/µL Agua grado biología molecular (5PRIME, 2500010) 10,8 Volumen Final 20 TABLA 7. Composición de la mezcla de reacción utilizada para llevar a cabo la RT-PCR. La secuencia de los cebadores de los genes de interés utilizados se detallan en la Tabla 8, analizándose la expresión de Oct4, Nanog y Sox2 como marcadores de expresión de pluripotencia; Sox17, Foxa2, Pdx1, Neurog3, Nkx6.1, Pax6, Pax4, Ptf1, Mist1, Gcg, Ins-I, Ppy, Sst, Amy2a5 y Ctrb1 como marcadores de expresión del desarrollo pancreático; Sox7 como marcador de endodermo temprano; Sox1 y Brachyury como marcadores ectodérmico y mesodérmico respectivamente; y se usaron como genes de referencia Tbp y Actb: Gen Secuencia del Cebador (5’-3’) Tamaño Amplicón (pb) Oct4 F:GGCGTTCTCTTTGGAAAGGT R:TCTCATTGTTGTCGGCTTCCT 113 Nanog F:AGGGTCTGCTACTGAGATGCTC R:CAACCACTGGTTTTTCTGCCACC 366 Sox2 F:CACAGATGCAACCGATGCA R:GGTGCCCTGCTGCGAGTA 127 Sox7 F:TGGACACGTATCCCTACGGG 96 R:TCCTGACATGAGGACGAGAAG Sox17 F:CTTTATGGTGTGGGCCAAAG 116 R:GGTCAACGCCTTCCAAGACT Foxa2 F:CCCTACGCCAACATGAACTCG R:GTTCTGCCGGTAGAAAGGGA 222 Pdx1 F:CCCCAGTTTACAAGCTCGCT R:CTCGGTTCCATTCGGGAAAGG 177 Neurog3 F:CTTCACAAGAAGTCTGAGAACACCAG R:CTGCGCATAGCGGACCACAGCTTC 232 Nkx6.1 F:CTGCACAGTATGGCCGAGATG R:CCGGGTTATGTGAGCCCAA 136 Pax6 F:GCAGATGCAAAAGTCCAGGTG R:CAGGTTGCGAAGAACTCTGTTT 285 Pax4 F:GCAGTGTGAATCAGCTAGGGG R:CAGGGTCGCATCCCTCTTATT 103 La tabla continúa en la página siguiente MATERIALES Y MÉTODOS 88 Ptf1 F:TCCCATCCCCTTACTTTGATGA R:GTAGCAGTATTCGTGTAGCTGG 140 Mist1 F:GCTGACCGCCACCATACTTAC R:TGTGTAGAGTAGCGTTGCAGG 198 Gcg F:TTACTTTGTGGCTGGATTGCTT R:AGTGGCGTTTGTCTTCATTCA 149 Ins-I F:CACTTCCTACCCCTGCTGG R:ACCACAAAGATGCTGTTTGACA 81 Ppy F:CAGGCGACTATGCGACACC R:CAGGGAATCAAGCCAACTGG 175 Sst F:ACCGGGAAACAGGAACTGG R:TTGCTGGGTTCGAGTTGGC 160 Amy2a5 F:CCAAGGAAGCAGACCTTTCA R:ACACGGCCATTTCCAAAGTA 149 Ctrb1 F:AACGGAGAGGATGCTATCCCT R:GACCACCCAGTTTTCGCTGA 108 Actb F:TGGGAATGGGTCAGAAGGAC R:TGAAGCTGTAGCCACGCTCG 467 Sox1 F:AAGGAACACCCGGATTACAAGT 242 R:GTTAGCCCAGCCGTTGACAT Brachyury F:GCGGACAATTCATCTGCTTG 124 R:TGGGATACTGGCTAGAGCCA Tbp* Tataa Biocenter’s 174 TABLA 8. Lista y secuencia de cebadores usados para RT-PCR y qPCR de las CTEs murinas. Cebador F: cebador sentido; cebador R: cebador antisentido. *Cebador del panel de genes de referencia humanos comerciales suministrados por Tataa Biocenter's (Gotemburgo, Suecia). La reacción se realizó con los siguientes parámetros, una desnaturalización inicial realizada a 95°C durante 15 minutos seguida de 26 ciclos de una RT-PCR de 3 etapas para la hibridación y extensión: 95°C 1 minuto, 60°C 1 minuto y 72°C 1 minuto. Finalmente se llevó a cabo una elongación final a 72°C durante 10 minutos. El análisis de los productos de amplificación obtenidos se realizó mediante electroforesis (100 mV) en geles de agarosa 2% teñidos con GelRed (Biotium, 41003), que fueron sumergidos en tampón TAE 1x (5PRIME, 2500060). Para la visualización de la banda de amplificación, los geles fueron sometidos a luz ultravioleta en el transiluminador (Gel Doc XR+ System, Bio-Rad Laboratories, CA, EEUU) y las imágenes fueron tomadas y archivadas con el software Quantity One 4.6. La tabla viene de la página anterior MATERIALES Y MÉTODOS 89 3.4.4. PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) La PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) es una variación de la PCR estándar descrita previamente, utilizada para la cuantificación del DNA o RNA de una muestra, mediante el método cuantificación relativa normalizada respecto a un gen de referencia. La cuantificación de genes de interés en nuestro estudio se llevó a cabo en un volumen final de 20 μl y por triplicado para cada muestra y se emplearon los siguientes componentes (Tabla 9): Mezcla de Reacción Volumen (µL) Concentración SensiFAST™ SYBR® Lo-ROX Kit 10x (Bioline, 94020) 10 1x Cebadores 5 µM 1,6 400 nM cDNA 10 ng/µL 4 2 ng/µL Agua grado biología molecular (5PRIME, 2500010) 4,4 Volumen Final 20 TABLA 9. Composición de la mezcla de reacción utilizada para llevar a cabo la qPCR. La reacción se realizó con los siguientes parámetros, una desnaturalización inicial realizada a 95°C durante 2 minutos seguida de 40 ciclos de una qPCR de 2 etapas para la hibridación y extensión, durante la cual se recogen los datos de fluorescencia emitidos por los fluoróforos de las sondas en cada uno de los ciclos: 95°C durante 5 segundos y 60°C durante 1 minuto. La principal limitación de las sondas inespecíficas como el SYBR GREEN es que al unirse al total de ácidos nucleicos en la reacción de la qPCR, emiten una señal luminosa tanto para productos específicos como para aquellos que no lo son como pueden ser los dímeros de los oligonucleótidos. Para hacer frente a esta situación realizó un análisis de los resultados en la curva de fusión (Curva de disociación o curva de melting). Este análisis permite que los productos no específicos puedan ser discriminados de los productos amplificados específicos. Los resultados de la qPCR se analizaron con el ViiA™ 7 Software (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados para las muestras del cDNA de las CTEs murinas se detallan previamente en la Tabla 8, utilizándose como gen de MATERIALES Y MÉTODOS 90 referencia Tbp y los cebadores utilizados para las muestras del cDNA de las CTEs humanas están detallados en la siguiente Tabla 10, utilizando en este caso como genes de referencia RPLP, ACTB y TUBB: Gen Secuencia del cebador (5’-3’) Tamaño Amplicón (pb) OCT4 F:GTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG R:AAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC 245 NANOG F:GCGCGGTCTTGGCTCACTGC R:GCCTCCCAATCCCAAACAATACGA 405 SOX2 F:ATGCACCGCTACGACGTGA R:CTTTTGCACCCCTCCCATTT 437 SOX1 F:AACACTTGAAGCCCAGATGGA 150 R:GCAGGCTGAATTCGGTTCTC BRACHYURY F:TGCTTCCCTGAGACCCAGTT 121 R:GATCACTTCTTTCCTTTGCAT FLK1 F:GTGATCGGAAATGACACTGGAG 124 R:CATGTTGGTCACTAACAGAAGCA SOX7 F:ACGCCGAGCTCAGCAAGAT 73 R:TCCACGTACGGCCTCTTCTG SOX17 F:TGGACCGCACGGAATTTGAACA R:TGTGTAACACTGCTTCTGGCCT 221 FOXA2 F:TTGCTGGTCGTTTGTTGTGGCT R:TTCATGTTGCTCACGGAGGAGT 153 PDX1 F:TACTGGATTGGCGTTGTTTGTGGC R:AGGGAGCCTTCCAATGTGTATGGT 133 GSC F:GAGGAGAAAGTGGAGGTCTGG R:CTCTGATGAGGACCGCTTCTG 72 HNF1β F:TCACAGATACCAGCAGCATCAGT R:GGGCATCACCAGGCTTGTA 79 HNF4α F:CATGGCCAAGATTGACAACCT R:TTCCCATATGTTCCTGCATCAG 113 PAX6 F:CTCGGGCACCACTTCAACA R:TCCGGGAACTTGAACTGGAA 64 NKX6.1 F:AGGGCTCGTTTGGCCTATTC R:AGAGGCTTATTGTAGTCGTCGT 194 NKX2.2 F:ACCAAACCGTCCCAGCGTTA 116 R:GGCTGACAATATCGCTACTCACACA MAFA F:GTCCGCTTGTACATACGTTGA R:AAAGGGAGGCTGAGAAGAGA 138 GLUT2 F:TTCCGGAATCAATGGCATTT R:TGTTTACAGCGCCAACTCCA 101 INS F:TTTGTGAACCAACACCTGTGCGG R:TTGTTCCACAATGCCACGCTTCTG 210 NEUROG3 F:CTAAGAGCGAGTTGGCACTGA 86 R:GAGGTTGTGCATTCGATTGCG NEUROD1 F:GGATGACGATCAAAAGCCCAA 179 R:GCGTCTTAGAATAGCAAGGCA La tabla continúa en la página siguiente MATERIALES Y MÉTODOS 91 ACTB F:CGCACCACTGGCATTGTCAT R:TTCTCCTTGATGTCACGCAC 206 TUBB* Tataa Biocenter’s 150 RPLP* Tataa Biocenter’s 161 TABLA 10. Lista y secuencia de cebadores usados para qPCR de genes de las CTEs humanas. Cebador F: cebador sentido; cebador R: cebador antisentido. *Cebador del panel de genes de referencia humanos comerciales suministrados por Tataa Biocenter's (Gotemburgo, Suecia). La qPCR para el análisis de los miRNAs se llevó a cabo en un volumen final de 10 μl y por triplicado para cada muestra y se emplearon los siguientes componentes (Tabla 11): Mezcla de Reacción Volumen (µL) Concentración ExiLENT SYBR® Green master mix 10x (Exiqon, 94020) 5 1x Cebadores 10x5x 1 1x cDNA 0,25 ng/µL 4 0,1 ng/µL Volumen Final 10 TABLA 11. Composición de la mezcla de reacción utilizada para llevar a cabo la qPCR. La reacción se llevó a cabo con los siguientes parámetros, una desnaturalización inicial realizada a 95°C durante 10 minutos seguida de 40 ciclos de una qPCR de 2 etapas para la hibridación y extensión, durante la cual se recogen los datos de fluorescencia emitidos por los fluoróforos de las sondas en cada uno de los ciclos: 95°C durante 10 segundos y 60°C durante 1 minuto. Realizándose como se describió previamente un análisis de especificidad de los resultados con la curva de disociación y los resultados de la qPCR se analizaron también con el ViiA™ 7 Software (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados se obtuvieron de Exiqon y se detallan en la siguiente Tabla 12, empleándose como gen de referencia un pequeño RNA nucleolar, SNORD48 o RNU48: miRNA Nº Acceso Secuencia del cebador (5’-3’) Nº Catálogo hsa-miR-7-5p MIMAT0000252 UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU 205877 hsa-miR-15a-5p MIMAT0000068 UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG 204066 hsa-miR-15b-5p MIMAT0000417 UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 204243 hsa-miR-16-5p MIMAT0000069 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 205702 hsa-miR-26a-5p MIMAT0000082 UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 206023 hsa-miR-29a-3p MIMAT0000086 UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA 204698 hsa-miR-29b-3p MIMAT0000100 UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU 204679 hsa-miR-29c-3p MIMAT0000681 UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA 204729 La tabla viene de la página anterior La tabla continúa en la página siguiente MATERIALES Y MÉTODOS 92 hsa-miR-30d-5p MIMAT0000245 UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 206047 hsa-miR-148a-3p MIMAT0000243 UCAGUGCACUACAGAACUUUGU 205867 hsa-miR-195-5p MIMAT0000461 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC 205869 hsa-miR-200a-3p MIMAT0000682 UAACACUGUCUGGUAACGAUGU 204707 hsa-miR-200c-3p MIMAT0000617 UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA 204482 hsa-miR-375 MIMAT0000728 UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA 204362 hsa-miR-376a-3p MIMAT0000729 AUCAUAGAGGAAAAUCCACGU 204508 SNORD48 NR_002745 AGUGAUGAUGACCCCAGGUAACUCUGAGUGU GUCGCUGAUGCCAUCACCGCAGCGCUCUGACC 203903 TABLA 12. Lista y secuencia de cebadores usados para qPCR de los miRNAs. El análisis por PCR en tiempo real se ha realizado de manera relativa, este tipo de cuantificación mide los cambios en el estado basal de un gen de interés respecto a un gen de expresión constante que actúa como control endógeno o constitutivo. Debido a que no se conoce la cantidad absoluta del estándar interno, sólo se pueden determinar los cambios relativos del gen de interés con referencia al gen endógeno. Es necesario normalizar los datos entre el valor que se obtiene para el gen blanco y el del gen endógeno, de tal manera que los valores resultantes sean reflejo de los cambios de expresión del gen y no de las diferencias en la cantidad de muestra añadida. La normalización de la expresión génica se llevó a cabo mediante el método comparativo de Ct (2-∆∆Ct)(Livak y Schmittgen, 2001). Este método es un modelo matemático que calcula los cambios de expresión génica como un cambio relativo en ésta (número de veces) entre una muestra experimental o gen de interés y un calibrador o gen endógeno, cuyas eficiencias de amplificación (E) deben ser comparables. Se obtienen los valores de ∆Ct = (Ctgen-Ctendógeno) y la cantidad relativa en cada muestra viene definida por la siguiente fórmula: 2-(∆Ct, r-∆Ct, cb) =2-∆∆Ct , donde r es la muestra de referencia y cb la muestra calibrador. 3.4.5. Microarray de expresión génica de miRNAs El microarray utilizado en este estudio presenta un formato de 8x15K, esto implica que en un solo porta (slide) se integran 8 arrays individuales impresos utilizando la tecnología Agilent's 60-merSurePrint technology, permitiendo así analizar 8 ensayos distintos de un solo color en un mismo cristal. A su vez, cada array incluye La tabla viene de la página anterior MATERIALES Y MÉTODOS 93 aproximadamente 15.000 sondas diseñadas a partir de la información existente en la base de datos Sanger miRBase. Las sondas son oligonucleótidos de 60-mer directamente sintetizados sobre el slide. El microarray fue realizado por la unidad de apoyo de Genómica de CABIMER utilizando los protocolos y las recomendaciones del fabricante para este tipo de array. En el Human microRNA Microarray están representados 939 miRNAs (850 humanos y 89 virales). La mayoría de estos miRNAs tiene en la placa varios cebadores para detectarlos, aumentando la especificidad. El resto de sondas son controles replicados varias veces y en varias posiciones dentro de cada array, los cuales el fabricante Agilent no recomienda que se utilicen para normalizar sino únicamente para evaluar la eficiencia del marcaje e hibridación. Los datos de intensidad de fluorescencia de cada uno de las sondas han sido obtenidos mediante el software GenePix Pro 7.0. Posteriormente, se corrigió el ruido de fondo (background) mediante el algoritmo normexp (Ritchie et al., 2007) y se ha realizó una normalización entre arrays por cuantiles. Finalmente, las sondas que se corresponden con un mismo miRNA han sido sumariadas mediante la mediana de los respectivos datos de expresión normalizados. Una vez hecho, esto se aplicó el test estadístico limma (Smyth, 2004) para el estudio de la expresión diferencial en las distintas condiciones experimentales y se representaros los resultados mediante Heatmap, que consiste en una representación gráfica de los datos a partir de valores individuales contenidos en una matriz representada con una escala de colores, elaborado con el software libre para análisis estadístico R. Como se puede apreciar de forma esquematizada en la Figura 11, los resultados significativamente estadísticos del análisis de expresión de los miRNAs mediante microarray deben ser validados, para ello normalmente se utilizan una serie de técnicas como qPCR, Northern blotting (NB), Western Blotting (WB) e incluso el uso de múltiples plataformas de microarrays, siendo la herramienta de validación más ampliamente utilizada la qPCR para confirmar los datos de expresión génica obtenidos. MATERIALES Y MÉTODOS 100 3.5. Microscopía La visualización de las células se realizó mediante un microscopio invertido Olympus IX71 (Olympus, Tokyo, Japón), con sistema de captura de imágenes (Nikon Eclipse TS100/TS100-F) con contraste de fases para obtener campos claros y lámpara de mercurio con los filtros correspondientes para la visualización de fluorescencia. El control de la cámara y procesamiento de las imágenes requirió del software Olympus DP controller y DP manager versión 1.2.1.107 (Olympus, Tokyo, Japón). Las imágenes confocales fueron obtenidas utilizando el microscopio confocal invertido TCS SP5 Leica DMI6000 (Leica, Wetzlar, Alemania) que requiere el software LAS-AF versión (Leica, Wetzlar, Alemania) para el control de la exploración, visualización y adquisición de las imágenes. El análisis de cuantificación de la florescencia se realizó mediante el software MetaMorph versión 7.5.1.0. (MDS Analytical technologies, Sunnyvale, CA, USA). Para ello, se utilizó la relación de los valores de intensidad del marcador fluorescente (Alexa Fluor®) y el marcador de núcleos (Hoechst 33342), por encima de la señal inespecífica de ruido de fondo (background) procedente de la IF emitida por el sustrato y los datos se expresaron como unidades arbitrarias (AU). La cuantificación fue realizada en al menos 50 células por experimento de 3 experimentos independientes. 3.6. Análisis bioinformático El estudio nos proporciona el estado de expresión (inhibición o sobreexpresión) de una lista de genes durante el proceso de diferenciación pancreático, que se relacionó con la lista de los miRNAs con diferencias de expresión significativas detectados en el microarray de muestras de páncreas, islotes pancreáticos, y las CTEs diferenciadas y no diferenciadas. Se procedió a la combinación de ambos resultados en un análisis bioinformático, para intentar elucidar las rutas de señalización y redes de expresión génica en las que están MATERIALES Y MÉTODOS 101 implicados los miRNAs diferencialmente expresados. Para ello, con el objetivo de facilitar la interpretación de las funciones biológicas afectadas por los miRNAs con una expresión diferencial reflejada en el Microarray y confirmado por qPCR, una predicción tanto funcional como de dianas génicas fue realizada usando la base de datos miRSystem. Esta se encuentra integrada por un sistema para la caracterización de funciones y rutas de señalización enriquecidas de dianas de miRNAs. Para identificar rutas de señalización o funciones biológicas destacadas, se aplicó la relación Observados-Esperados (O/E) de genes diana, donde la probabilidad de identificación observada (O) para un gen dado viene dado por la proporción de los miRNAs consultados predichos como diana de ese gen, mientras que la probabilidad esperada (E) la determina la proporción de todos los miRNAs de la base de datos miRsystem predichos como dianas de ese gen. Este parámetro constituye un indicador de la significación estadística que se le otorga a la posible unión miRNA/mRNA diana, dependiente de una serie de valoraciones energéticas y de posición para esa unión y representa la probabilidad de que un gen diana sea seleccionado al azar por los miRNAs, así como también se aplicaron otros análisis estadísticos como el valor hipergeométrico y empírico de la permutación, y un ranking de puntuación de las rutas de señalización a partir del valor de expresión relativa de los miRNAs. 3.6.1. Análisis predictivo de dianas de miRNAs El análisis bioinformático de los genes diana potencialmente regulados por los miRNAs en estudio a partir de los genes diferencialmente expresados, se llevó a cabo aplicando los recursos bioinformáticos actualmente disponibles en la Red como es la base de datos online MirSystem que alberga 2 bases de datos de experimentos validados y 7 bases de datos de predicción de dianas de los miRNAs:  TarBase (Version 7.0)  miRecords (Abril, 2013) MATERIALES Y MÉTODOS 102  Diana-microT (Version 5.0)  miRanda (Agosto, 2010)  miRBridge (Abril, 2010)  PicTar (Marzo, 2007)  PITA (Agosto, 2008)  RNA22 (Version 2.0)  TargetScan (Version 7.1) Para aumentar la fiabilidad de las predicciones con un número manejable de registros, los miRNAs y su expresión relativa fueron introducidos en la base de datos miRSystem, con el fin de dilucidar las rutas de genes, funciones biológicas y rutas canónicas más alteradas en nuestros datos. Solo las dianas de miRNAs validadas o identificadas por al menos 4 programas de predicción fueron consideradas para la anotación en las rutas de señalización de la base de datos KEGG o de funciones moleculares registradas en el proyecto Ontología Génica (GO). Además, los parámetros fueron configurados para un límite de 25-500 genes por ruta de señalización o función biológica, una relación observados-esperados igual o superior a 1,8 (O/E ≥ 1,8) y un ranking de puntuación igual o superior a 1 (score ≥ 1). Esta puntuación se determina a partir de los niveles de expresión de los miRNAs a comparar entre el grupo experimental y control mediante el método weighted pathway-ranking, que consite en asignarles un peso calculado dividiendo el valor absoluto de la expresión de cada miRNA por la suma absoluta de los valores de expresión de todos los miRNAs de entrada (∑∀miRNAwi). A continuación, después de identificar los genes diana mediante los algoritmos de selección definidos anteriormente se obtiene un valor p (Pi) para ellos y finalmente se calcula la puntuación o score (∑∀miRNAwi [-log10(pi)]). MATERIALES Y MÉTODOS 103 3.7. Análisis estadístico Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Se presentan los datos, para cada conjunto de muestras, como el valor promedio ± el error estándar de la media (SEM). Para el tratamiento estadístico de los datos de los que constan los diferentes estudios de este trabajo, fue necesario el uso del software GraphPad Prism versión 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). El análisis de las diferentes condiciones experimentales para determinar las diferencias estadísticamente significativas se llevó a cabo mediante análisis de variación unidireccional (ANOVA) para múltiples comparaciones, seguido por la corrección de Holm-Šídák para comparar promedios entre 2 grupos a un nivel de significancia del valor p de al menos 0,05 (p≤0,05). 4. RESULTADOS RESULTADOS 107 4.1. Caracterización de líneas celulares pluripotentes El estudio realizado requiere líneas celulares pluripotentes capaces de diferenciarse in vitro en derivados de alguno de los posibles linajes embrionarios: endodermo, mesodermo y ectodermo. En nuestro laboratorio contamos con varias líneas celulares de CTEs de origen humano (HS181) o murino (ES-D3), así como líneas celulares de iPSCs de origen humano (MSUH-001). La trazabilidad de las líneas celulares pluripotentes utilizadas con el fin de definir inequívocamente que se trata de poblaciones de CTEs o iPSCs y demostrar su pluripotencia, es llevada a cabo por un personal técnico cualificado y en dedicación exclusiva a los procesos a esta caracterización que incluye principalmente los siguientes parámetros:  Morfología Celular: las células fueron cultivadas in vitro como se ha descrito previamente por un largo número de pases (<100) sin que presenten modificaciones en su morfología o aspecto. Una vez iniciado el cultivo las células fueron observadas diariamente bajo microscopía óptica (Figura 12), para evaluar su morfología, observándose durante los sucesivos pases la formación de colonias que adoptan la típica forma descrita con bordes netos y compactos. Las células embrionarias presentan una relación núcleo/citoplasma alta, con nucléolos prominentes. FIGURA 12. Se observan fotografías en campo claro de las células pluripotentes de origen murino (ES-D3) y humano (HS181 y MSHU-001), agrupadas densamente y formando colonias de bordes netos características de un estado no diferenciado mantenido en cultivo in vitro. Barra de escala =50 µm. RESULTADOS 108  Análisis de factores de trascripción responsables de la pluripotencialidad: el carácter pluripotente de las colonias de células no diferenciadas viene definido por diversos factores de transcripción entre los que podemos destacar la expresión de los marcadores pluripotentes OCT4, NANOG y SOX2. Como se muestra en la Figura 13, estudios de RT-PCR indicaron que las CTEs murinas (ESD3) y humanas (HS181), expresan marcadores nucleares de pluripotencia (OCT4, NANOG Y SOX2), los cuales se han descrito como reguladores clave de las redes de pluripotencia y nos indica que conservan un estado no diferenciado cuando son cultivadas en las condiciones in vitro de mantenimiento requeridas. Esta expresión a nivel génico fue confirmada también por la identificación de estos factores de transcripción pluripotentes mediante WB que refleja además como la abundante expresión en células no diferenciadas se pierde con la diferenciación de las células, mientras que la IF nos muestra la expresión homogénea en las colonias de los marcadores de pluripotencia (OCT4, NANOG y SOX2), que puede verse disminuida en las células de la periferia de las colonias debido al inicio de procesos de diferenciación en esta zona. La figura continúa en la página siguiente RESULTADOS 109 FIGURA 13. Caracterización de los marcadores de pluripotencia (OCT4, NANOG y SOX2) de las células pluripotentes en estado no diferenciado mediante RT-PCR, WB y detección de inmunofluorescencia en las CTEs murinas (ES-D3) y humanas (HS181). Barra de escala = 2 µm.  Análisis de marcadores de membrana. Otro factor importante que define a las células pluripotentes es la expresión de marcadores de superficie de membrana exclusivos como SSEA-4 y las glicoproteínas transmembrana TRA-1-60 y TRA-180, todas ellas detectadas mediante IF reflejado en la Figura 14A. Otro método para el seguimiento de la pluripotencia de las células Las células pluripotentes es la determinación de la expresión de fosfatasa alcalina (AP), que puede ser fácilmente ensayada debido a la capacidad de esta enzima para cambiar la conformación de un reactivo colorimétrico de un estado soluble a un precipitado, generando la tinción de colonias celulares fácilmente identificables. FIGURA 14. Caracterización de marcadores de superficie (SSEA-4, TRA-1-60 Y TRA-1-80) y tinción de la AP en las CTEs (HS181) e iPSCs (MSHU-001) de origen humano. Barra de escala =50 µm. La figura viene de la página anterior RESULTADOS 116 diferenciadas fue determinada mediante ELISA en respuesta a las diferentes concentraciones de glucosa (2,7-20 mM). Las células diferenciadas espontáneamente al retirar del medio de cultivo el LIF (LIF-), no responden a la estimulación y solo se observa una liberación de insulina basal independiente de la presencia o ausencia de glucosa. Mientras que en las células diferenciadas a baja concentración de glucosa (2,7 mM), ya se observó una liberación de insulina que fue aproximadamente 4 veces mayor (p≤0,05) en las células diferenciadas sin transfectar (Control) y 6 veces mayor (p≤0,05) en las células diferenciadas transfectadas con los miRNAs (miRNAs-pool) respecto a las células diferenciadas espontáneamente (LIF-). Las células no transfectadas (Control) aunque manifiestan una respuesta inicial a bajas concentraciones de glucosa, no respondieron a un incremento en la concentración de glucosa (10 mM), mientras que en las células transfectadas (miRNAs-pool) si aumento la liberación de insulina significativamente hasta 10 veces (p≤0,05), sin embargo con altas concentraciones de glucosa (20 mM) parece que las células no resistieron las condiciones y no pudieron responder al estímulo como podría hacerlo una célula beta pancreática totalmente funcional como podemos observar en la Figura 18. FIGURA 18. Secreción de insulina frente a la estimulación con glucosa (2,7-20 mM) durante 1 hora en las células obtenidas al final del proceso de diferenciación: CTEs diferenciadas espontáneamente (LIF-); CTEs sometidas al protocolo de diferenciación sin adición del pool de miRNAs (Control); CTEs con la adición del pool de miRNAs (miRNAs-pool). Los valores son mostrados (media±SEM). n=3; ∗p≤0,05; acorde al test holm-šídák. RESULTADOS 117 Por tanto, parece que los miRNAs pueden constituir candidatos para mejorar las estrategias de diferenciación actuales para obtener células productoras de insulina maduras a partir de las CTEs in vitro. Por lo que, nos propusimos profundizar en el estudio de la implicación de los miRNAs en el desarrollo pancreático y determinar su efecto en los procesos de diferenciación. Esta primera aproximación con las pequeñas moléculas de ncRNA específicas de los islotes pancreáticos, apoyó nuestra hipótesis de trabajo en la regulación que pueden ejercer los miRNAs en los procesos de diferenciación de las CTEs a nivel post-transcripcional, clave para controlar la coordinación de la expresión génica. Por ello, para profundizar en el estudio del papel que los miRNAs pueden ejercer en este control, nos propusimos analizar el patrón de expresión diferencial de los miRNAs durante el proceso de diferenciación de las CTEs humanas hacia células productoras de insulina. 4.2.2. Expresión de los miRNAs característicos del páncreas Ya se ha demostrado que muchos miRNAs muestran patrones de expresión temporal y específica de tejidos, desestabilizando diversos procesos de transcripción génica para definir aún más los perfiles de transcripción específicos de tejidos. El análisis funcional puede ser corrompido por el estudio de interacciones entre miRNAs y mRNAs diana que no se expresan en el tejido considerado, por ello analizamos la expresión diferencial de miRNAs en diversos tejidos humanos (páncreas, corazón, riñón, hígado, pulmón y cerebro), para ello recurrimos a la base de datos de expresión de miRNAs (http://www.microrna.org), que nos proporciona un amplio conjunto de datos sobre la expresión de los miRNAs y la predicción de mRNAs diana derivado de un amplio proyecto de secuenciación de un gran conjunto de tejidos de mamíferos y líneas celulares de origen animal, como podemos observar en la Figura 19 cada tejido presenta un perfil de expresión de miRNAs característico. RESULTADOS 118 FIGURA 19. Base de datos de expresión de miRNAs en los tejidos del organismo. La escala en gradiente de color representa los valores de expresión de un perfil específico de miRNAs en los tejidos del organismo, en las columnas se representa el nivel de expresión de los miRNAs y en las filas los diferentes tejidos. El análisis de los resultados nos permitió identificar el subconjunto de miRNAs expresados abundantemente y de forma preferente en cada tejido. El páncreas presenta un subconjunto o grupo de miRNAs que se puede asociar con la adquisición y el mantenimiento del fenotipo pancreático entre los podemos destacar miR-7, -15a, -16, -26a, -29a/b/c, -30d, -124, -148a, -214, -200a/c, -375 y -376a (Figura 20A). Para comprobar la correlación entre el subconjunto de miRNAs pancreáticos identificado en la base de datos y los miRNAs expresados en nuestra muestra del pool de miRNAs de islotes pancreáticos utilizadas para la transfección de las CTEs murinas descrita anteriormente, se analizó la expresión diferencial de miRNAs entre dicha muestra del pool de islotes pancreáticos y un nuevo pool generado a partir de muestras de corazón murino mediante qPCR. Este análisis reveló que el miRNA con mayor expresión en las muestras pancreáticas fue miR-375, seguido de las familias miR-29 (miR-29a/b/c) y miR200 (miR-200a/c) y también destaca la expresión de miR-7, -15a, -148a y -214. Sin embargo, a diferencia de los niveles de expresión reflejados por la base de datos para RESULTADOS 119 los miRNAs pancreáticos donde destaca miR-124, los resultados de qPCR no evidenciaron expresión de este miRNA en el pool de miRNAs transfectados como podemos en observar en la Figura 20B. FIGURA 20. A) La base de datos de expresión de miRNAs revela un conjunto de miRNAs con una expresión preferentemente pancreática. B) Análisis mediante qPCR del pool de miRNAs pancreáticos utilizado en la transfección de las CTEs frente a un pool de miRNAs de muestras de corazón murino. Los valores son mostrados (media±SEM). n=3; ∗p≤0,05, ∗∗p≤0,01, ∗∗∗p≤0,001; acorde al test holmšídák. RESULTADOS 120 4.3. Análisis de miRNAs en la diferenciación de las CTEs 4.3.1. Diferenciación de las CTEs hacia células productoras de insulina Con el objetivo de estudiar el patrón de expresión de miRNAs característicos de las CTEs en diferenciación hacia células productoras de insulina, utilizamos el protocolo CABIMER de diferenciación en las CTEs humanas (HS181) establecido en nuestro laboratorio. Este protocolo ha sido descrito en detalle previamente en el apartado 3.2 y pretende simular las etapas del desarrollo pancreático in vivo instruyendo a las CTEs a través de cada etapa intermedia del desarrollo endodérmico, similar a lo que ocurre durante el desarrollo pancreático (endodermo definitivo, endodermo del intestino primitivo, endodermo pancreático y precursores endocrinos), mediante la combinación de diferentes factores de crecimiento que activen o inactiven secuencialmente las vías de desarrollo adecuadas, como se observa esquematizado en la Figura 21. FIGURA 21. Esquema de las etapas requeridas para la diferenciación de las CTEs humanas (HS181) en células productoras de insulina, junto con imágenes de microscopio representativas de las diferentes etapas. Representación esquemática del protocolo de diferenciación dirigida basado en la activación secuencial de vías de señalización durante el desarrollo, induciendo la diferenciación de las CTEs humanas (HS181) hacia un destino de célula beta pancreática. Barra de escala =200 µm. Al final de este protocolo de diferenciación para comprobar su efectividad, analizamos la expresión de genes asociados a la pluripotencia, marcadores de linaje embrionario RESULTADOS 121 (ectodermo, mesodermo y endodermo) y marcadores pancreáticos mediante qPCR, como se puede observar en la Figura 22. En primer lugar, la expresión de los genes de pluripotencia OCT4, NANOG y SOX2 sufrieron una rápida inhibición significativa a día 5 tanto en las células diferenciadas espontáneamente (SD-hCTE) como en las células diferenciadas con el protocolo CABIMER (DD-hCTE) respecto a las CTEs no diferenciadas, indicativo de la rápida salida del estado no diferenciado de las células. A continuación, para evaluar la posible formación inespecífica de células provenientes de linajes embrionarios no deseados (ectodermo y mesodermo), se evaluó la expresión de marcadores ectodérmicos (SOX1) y mesodérmicos (FLK1, BRACHYURY), los cuales no presentaban un aumento de expresión significativo en las células sometidas al protocolo de diferenciación CABIMER (DD-hCTE), sin embargo las células diferenciadas espontáneamente (SD-hCTE) sí que mostraron un aumento significativo de los niveles de expresión de SOX1, FLK1 y BRACHYURY. FIGURA 22. Inducción de la diferenciación in vitro de las CTEs humanas (HS181), mediante el protocolo CABIMER. Las CTEs fueron diferenciadas a células productoras de insulina (DD-hCTE) o diferenciadas espontáneamente (SD-hCTE). Se analizaron marcadores de genes de pluripotencia, ectodermo y mesodermo mediante qPCR. Los valores de expresión relativa de los genes detectados (calculadas a partir de los valores de Ct normalizados por el método de 2-ΔΔCt), asumiendo como muestra de referencia las CTEs no diferenciadas y RPLP como gen normalizador. Los valores son mostrados (media±SEM). n=6; ∗p≤0,05 acorde al test holm-šídák. RESULTADOS 122 Con el objetivo de validar si las células diferenciadas mediante el protocolo CABIMER (DD-hCTE) podrían estar comprometidas con la ruta de diferenciación endodérmica, se analizó la expresión de genes diferencialmente expresados que constituyen marcadores del endodermo definitivo durante la primera etapa del protocolo. Esta se caracteriza por condiciones de cultivo con baja concentración de suero (FBS) para inhibir la activación de la vía de señalización PI3K y la adición combinada de factores esenciales como la activina A activador de la vía de señalización Nodal y el Wnt3a activador de la vía de señalización Wnt, para inducir la formación del mesendodermo con el objetivo final de obtener el endodermo definitivo, reflejado en un aumento significativo de los niveles de expresión de SOX17, GSC y HNF3β (FOXA2), dando lugar a una población de células GSC+/SOX17+/HNF3β+ característica del endodermo definitivo. El proceso de diferenciación prosiguió hacia el endodermo pancreático inducido mediante la adición progresiva de suero (FBS, 0-5%) y la retirada de la activina A del cultivo a los 5 días, reflejado en un aumento de expresión significativo de marcadores génicos como HNF1β y HNF4α, además NEUROG3 un regulador esencial de la diferenciación celular endocrina pancreática con sus dianas NEUROD1 y NKX2.2 fue transitoriamente inducido en esta población celular, aunque su expresión fue inhibida rápidamente impidiendo la inducción prematura del programa pancreático endocrino. La adición combinada del hrbFGF, inductor del fenotipo pancreático y el ácido retinoico un potente morfógeno inductor de la diferenciación durante 3 días permite inhibir la vía de señalización Shh, dando lugar a la inducción del programa pancreático. Por tanto, para inducir la formación de los precursores endocrinos in vitro, las células fueron tratadas secuencialmente durante 6 días en total con los factores nogina para inhibir la vía de señalización Bmp (3 días) y ciclopamina que fortalece la inhibición de la vía de señalización Shh (3 días), obteniéndose un desarrollo endocrino preferente a expensas de otros derivados endodérmicos. Las células manifestaron un aumento significativo de la expresión de PAX6, NKX2.2 y PDX1, este último un factor esencial para el desarrollo RESULTADOS 123 del páncreas y la formación de las células beta pancreáticas, generándose una población celular resultante de progenitores pancreáticos fácilmente identificable por la expresión NKX2.2+/PAX6+/PDX1+. La última etapa, se caracteriza por el cultivo de las células en suspensión induciendo la formación de agregados celulares similares a los cluster de los islotes pancreáticos, constituyéndose una estructura tridimensional importante en la inducción de células maduras funcionales productoras de insulina a partir de las CTEs. Además, para complementar este proceso de maduración durante esta etapa final de cultivo en suspensión se proporcionó al medio una mezcla de factores constituida por insulina, transferrina, selenio y fibronectina durante 6 días, suplementada con resveratrol los últimos 2 días, cuyo objetivo es la maduración de la población NKX2.2+/PAX6+/PDX1+ obtenida previamente, diferenciándose en células que expresan específicamente insulina, pero no otras hormonas pancreáticas, tales como glucagón y somatostatina. En primer lugar, observamos como la etapa de maduración reactiva la expresión de NEUROG3 acompañado de un aumento significativo en la expresión de varios marcadores que constituyen reguladores transcripcionales importantes para determinar la identidad de células endocrinas con una expresión restringida a las células beta como son NEUROD1, NKX6.1 y MAFA y además, se observó un aumento de expresión significativo de algunos de los marcadores clásicos de células beta de los islotes pancreáticos que incluyen a la insulina (INS) y un transportador de glucosa (GLUT2) requerido para la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) en la última etapa del protocolo de diferenciación. El análisis de expresión diferencial de los genes específicos de endodermo y páncreas resumido, entre los grupos celulares DD-hCTE y SD-hCTE, puede ser visualizado a continuación con más detalle en la Figura 23. RESULTADOS 124 FIGURA 23. Inducción de la diferenciación in vitro de las CTEs humanas (HS181), mediante el protocolo CABIMER. Las CTEs fueron diferenciadas a células productoras de insulina (DD-hCTE) o diferenciadas espontáneamente (SD-hCTE). Se analizaron marcadores de genes del desarrollo endodérmico y pancreático mediante qPCR. Los valores de expresión relativa de los genes detectados (calculadas a partir de los valores de Ct normalizados por el método de 2-ΔΔCt), asumiendo como muestra de referencia las CTEs no diferenciadas y RPLP como gen normalizador. Los valores son mostrados (media±SEM). n=6; ∗p≤0,05, ∗∗p≤0,01, ∗∗∗p≤0,001 acorde al test holm-šídák. RESULTADOS 125 La detección de las proteínas FOXA2, PDX1, PÉPTIDO-C e INSULINA en las CTEs diferenciadas in vitro (Figura 24) confirmaron los resultados de expresión transcripcional obtenidos mediante qPCR. En las primeras etapas se observó una expresión generalizada en el cultivo de un marcador temprano del endodermo definitivo como FOXA2 (días 5-8), posteriormente se generaron colonias celulares positivas para un marcador esencial en el desarrollo pancreático como PDX1 (días 11-22) y en las últimas etapas la colocalización de INSULINA y PÉPTIDO-C (días 14-22) revela la síntesis de insulina por colonias de células productoras de insulina obtenidas a partir de las CTEs. FIGURA 24. Detección mediante IF durante el proceso de diferenciación de marcadores de células y progenitores pancreáticos para la determinación de células productoras de insulina obtenidas a partir de las CTEs (HS181) en estadios tempranos, intermedios y avanzadas del proceso de diferenciación. A) FOXA2 (verde) en las células diferenciadas hacia el endodermo definitivo en la etapa temprana. B) PDX1 (verde) en células comprometidas a progenitores pancreáticos en la etapa intermedia. C) INSULINA (rojo) y PÉPTIDO-C (verde) en cluster similares a islotes pancreáticos en la etapa avanzada de diferenciación. Barra de escala =50 µm. Por tanto, estos datos confirman la obtención de células productoras de insulina obtenidas a partir de las CTEs mediante el protocolo CABIMER de diferenciación y nos proporciona la base de estudio de expresión de los miRNAs durante el proceso de diferenciación. BIBLIOGRAFÍA 228 Sander, M., A. Neubüser, J. Kalamaras, H.C. Ee, G.R. Martin, y M.S. German. 1997. Genetic analysis reveals that PAX6 is required for normal transcription of pancreatic hormone genes and islet development. Genes Dev. 11:166273. Scarlett, J.A., R.S. Gray, J. Griffin, J.M. Olefsky, y O.G. Kolterman. Insulin treatment reverses the insulin resistance of type II diabetes mellitus. Diabetes Care. 5:353-63. Scharp, D.W., J.J. Murphy, W.T. Newton, W.F. Ballinger, y P.E. Lacy. 1975. Transplantation of islets of Langerhans in diabetic rhesus monkeys. Surgery. 77:100-5. 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