Diseño y evaluación de nuevas plataformas basadas en productos naturales frente a enfermedades degenerativas

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Facultad de Ciencias Químicas y Centro de Química-Instituto de Ciencias Doctorado en Ciencias Químicas Universidad de Sevilla Departamento de Química Orgánica Facultad de Química Doctorado en Química “Diseño y evaluación de nuevas plataformas basadas en productos naturales frente a enfermedades degenerativas” T E S I S Que para obtener el grado de Doctor en Ciencias Químicas en el área de Química Orgánica Presenta M. C. Rosa Isela Martínez Lara Directores de tesis Dra. Penélope Merino Montiel Dr. Óscar López López Puebla, México. Octubre 2024 Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Facultad de Ciencias Químicas y Centro de Química-Instituto de Ciencias Doctorado en Ciencias Químicas Universidad de Sevilla Departamento de Química Orgánica Facultad de Química Doctorado en Química Memoria presentada por la M.C. Rosa Isela Martínez Lara para optar al grado de Doctora en Química Puebla, México. Octubre 2024 Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Facultad de Ciencias Químicas y Centro de Química-Instituto de Ciencias Doctorado en Ciencias Químicas Universidad de Sevilla Departamento de Química Orgánica Facultad de Química Doctorado en Química Vo Bo. De los Directores de la tesis Fdo. Dra Penelope Merino Montiel Fdo. Dr. Óscar López López A QUIEN CORRESPONDA: Por este conducto la Comisión Revisora formada por la D. C. María Concepción Sara Montiel Smith, D.C. José María Fernández-Bolaños Guzmán, D.C. Inés Maya Castilla, D.C. Estibaliz Sansinenea Royano y el D.C Jorge R. Juárez Posadas, informan haber leído y aprobado para su impresión, la tesis denominada “Diseño y evaluación de nuevas plataformas basadas en productos naturales frente a enfermedades degenerativas ” , que presenta la alumna M. en C. Rosa Isela Martínez Lara para obtener el grado de Doctora en Ciencias Químicas. Se extiende la presente a los nueve días del mes de octubre del año dos mil veinticuatro. A T E N T A M E N T E D. C. María Concepción Sara Montiel Smith D. C. José María Fernández-Bolaños Guzmán D.C. Inés Maya Castilla D.C. Estibaliz Sansinenea Royano D.C Jorge R. Juárez Posadas Posgrado en Ciencias Químicas FCQ - ICUAP Edif. 105 I, Ciudad Universitaria, Col. San Manuel, Puebla, Pue. C.P. 72570 01 (222) 2 29-55-00 Ext. 7387 BUAP El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Síntesis y Modificación de Productos Naturales de la Facultad de Química de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, así como en el Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla, España bajo la dirección de la Dra. Penélope Merino y del Dr. Óscar López López, con el apoyo de la beca nacional otorgada por CONAHCyT (CVU/Becario) 472799/758819 del 1 de enero de 2020 al 31 de diciembre de 2023 y de la VIEP-BUAP con el apoyo en los gastos de transporte para la estancia de investigación realizada en la Universidad de Sevilla, España. Publicación derivada del presente trabajo de Tesis: I Parte de los resultados de este trabajo se presentaron en los siguientes congresos: ▪ Rosa Isela Martínez Lara, Penélope Merino Montiel, Blanca Colin Loza, Sara Montiel Smith, José Luis Vega Báez, Óscar López. Estudios computacionales de ésteres del ácido oleanólico. Congreso Internacional de la Sociedad Química de México 2021, "Al ritmo de nuevos tiempos" (Cartel, modalidad virtual). 30 de agosto del 2021. ▪ Rosa Isela Martínez Lara, Blanca Colin Loza, Penélope Merino Montiel, Sara Montiel Smith, José Luis Vega Báez, Óscar López. Estudios computacionales de ésteres del ácido oleanólico frente a diversas anhidrasas carbónicas. LatinXChem Twitter Conference 2021 (Cartel, modalidad virtual). 20 de septiembre del 2021. ▪ Rosa Isela Martínez Lara, Penélope Merino Montiel, Sara Montiel Smith, José Luis Vega Báez, Óscar López. Híbridos ácido oleanólico-cumarinas con potencial actividad anticancerígena. XVII Reunión de la Academia Mexicana de Química Orgánica A.C. (Cartel, modalidad presencial, Puebla). 25 de agosto del 2022. ▪ Rosa Isela Martínez Lara, Penélope Merino Montiel, Óscar López. Estudios computacionales de ésteres de ácido oleanólico frente a diversas anhidrasas carbónicas. Simposio interno XXVI del posgrado en Ciencias Químicas, BUAP (Ponencia, modalidad virtual). 9 de noviembre de 2022. ▪ Rosa Isela Martínez Lara, Penélope Merino Montiel, Sara Montiel Smith, José Luis Vega Báez, Óscar López. Síntesis de híbridos de ácido oleanólico con potencial actividad anticancerígena. LatinXChem Twitter Conference 2022 (Cartel, modalidad virtual). 28 de noviembre del 2022. ▪ Rosa Isela Martínez Lara, Penélope Merino Montiel, Óscar López. Síntesis de ésteres de ácido oleanólico con potencial actividad anticancerígena. 3er II Simposio de Egresados de la Maestría en Química Bioorgánica (Ponencia, modalidad virtual). 30 de noviembre del 2022. ▪ Rosa Isela Martínez Lara, Penélope Merino Montiel, Sara Montiel Smith, José Luis Vega Báez, Adrián Puerta, José M. Padrón, José G. Fernández Bolaños, Óscar López. Selenocianatos derivados de ácido oleanólico con potencial actividad antiproliferativa. Congreso Internacional de la Sociedad de Química de México 2023 (Ponencia, modalidad virtual). 2 de octubre del 2023. ▪ Rosa Isela Martínez Lara, Penélope Merino Montiel, Sara Montiel Smith, José Luis Vega Báez, Adrián Puerta, José M. Padrón, José G. Fernández Bolaños, Óscar López. Derivados organoselénicos de triterpenoides. Evaluación de la actividad antiproliferativa. LatinXChem Twitter Conference 2023 (Cartel, modalidad virtual). 16 de octubre del 2023. III Agradecimientos A mis directores de tesis la Dra. Penélope Merino Montiel y el Dr. Oscar López López, por aceptarme como alumna de doctorado y por todo su apoyo ante las adversidades que se presentaron en la realización en este trabajo de tesis y sobre todo por todas sus enseñanzas y dedicación. A mi comité revisor, por su tiempo y observaciones para el presente trabajo de tesis: Dra. Inés Maya Castilla Dra. María Concepción Sara Montiel Smith Dra. Estibaliz Sansinenea Royano Dr. Jorge R. Juárez Posadas Dr. José María Fernández-Bolaños Guzmán Al grupo de trabajo del Dr. José Manuel Padrón (Universidad de la Laguna, Tenerife, España), por el apoyo en la realización de las pruebas antiproliferativas. Al grupo de trabajo del Dr. Claudiu T. Supuran (Universidad de Florencia, Italia) y a la Dra. Paloma Begines Aguilar, por el apoyo en la realización de las pruebas de inhibición de anhidrasas carbónicas. Al grupo de trabajo del Dr. Maikel Castellano (Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, España), por su apoyo en la realización de los estudios de mecanismo de muerte celular y en los estudios in vivo con C. elegans. A CONAHCYT, por la beca otorgada para la realización de los estudios de doctorado. A la VIEP BUAP, por el apoyo otorgado para la realización de la estancia en la Universidad de Sevilla, España. X mediante técnicas de imagen holotomográfica 3D en células vivas (SW1573, célula de pulmón no pequeña); dicho estudio reveló la inducción de necrosis en las células tumorales. Este tipo de muerte celular podría llevarse a cabo por afectaciones en la replicación durante la fase S por efecto del selenocianato 13, específicamente en células malignas HeLa, que, como consecuencia, llevó a una reducción de células mitóticas, lo que indica daño en la replicación también durante la fase M del ciclo celular. Adicionalmente, los selenocianatos 11 y 14 (sustitución en C-28, n=6, R=H; OH libre o OAc en C-3, respectivamente) se evaluaron in vivo empleando Caenorhabditis elegans, un nematodo con genoma secuenciado, y considerado como un modelo validado en investigación oncológica. Los resultados indicaron que dichos compuestos, por un lado, mostraban una excelente selectividad, no provocando alteraciones morfológicas ni fisiológicas del organismo, pero sí una notable reducción del tamaño de la línea germinal tumoral, presumiblemente mediante una acción citostática. Figura 1.2. Estructura general de los selenocianatos derivados del ácido oleanólico preparados. En el capítulo 5 se ha abordado una aproximación novedosa para la obtención de agentes antiproliferativa con actividad selectiva hacia las células tumorales (Figura 1.3). Dicha aproximación ha consistido en la combinación de dos fragmentos fundamentales, empleando un núcleo central de p-aminofenol para la unión de ambos. Por un lado, un residuo de tipo selenocianato, como farmacóforo que proporcione actividad antiproliferativa y, por otro lado, un catión lipofílico diseñado XI para actuar como vehículo selectivo hacia las mitocondrias de las células tumorales. Los compuestos con estructura de este tipo se denominan agentes mitocondriotrópicos, y cuando manifiestan actividad antitumoral, mitocans (mitocondria + cáncer). Se ha obtenido una amplia diversidad estructural, modificado la naturaleza, tipo y longitud del conector (fragmento hidrocarbonado, tiourea, amida), así como la naturaleza del catión lipofílico (trifenilfosfonio (TPP), piridinio, quinolinio, N- metilimidazolio, rodamina B), conduciendo a 8 derivados. Los datos de la actividad antiproliferativa de estos derivados arrojaron que presentan un efecto de inhibición del crecimiento celular sobre las 6 líneas celulares de tumores sólidos estudiadas en el rango micromolar bajo, destacando los cationes de tipo trifenilfosfonio y rodamina, donde 25 fue el derivado cabeza de serie siendo hasta casi 9 veces más potente que los fármacos de referencia sobre la línea celular resistente a multifármacos. Por otro lado, la adición del fragmento de selenio a la rodamina B permitió aumentar la actividad de esta hasta 11 veces en la línea celular resistente a multifármacos. Figura 1.3. Estructura general de los agentes mitocondriotrópicos preparados. XII Finalmente, en el Capítulo 6 se ha llevado a cabo la preparación de inhibidores duales de anhidrasas carbónicas y NAMPT (nicotinamida adenina dinucleótido fosforribosiltransferasa), como ejemplos de fármacos multidiana con actividad antitumoral; la Figura 1.4 muestra la estructura general de los 10 híbridos obtenidos. Ambas enzimas se consideran en la actualidad como dianas terapéuticas de interés frente al cáncer. Las anhidrasas carbónicas, sobreexpresadas en tumores hipóxicos, son responsables del microambiente ácido del tumor, que permite su supervivencia y expansión; como farmacóforo para su inhibición se ha seleccionado un residuo de cumarina, que actúa como inhibidor suicida. Por otro lado, la NAMPT es la enzima limitante de biosíntesis de NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido), altamente demandado por las células tumorales; para su inhibición se ha empleado un residuo de piridina, sustituido en C-3 ó C-4, como mimético de la nicotinamida (NAM). El diseño de inhibidores de ambas enzimas sigue un patrón relativamente análogo, con la existencia de una cabeza que interaccionan con el centro activo de la enzima, y una cola hidrofóbica, que puede establecer interacciones de van der Waals favorables. Como fragmento heterocíclico mimético de la NAM se ha empleado un residuo de piridina, sustituido bien en la posición C-3 ó C-4, con conectores de tipo cianoguanidina, tiourea o amida. El espaciador fue, en todos los casos, un fragmento de tipo hexametileno; por otro lado, en la cumarina se incorporaron distintos sustituyentes en las posiciones C-3 y C-4. XIII Figura 1.4. Diseño estructural para la preparación de inhibidores duales de anhidrasas carbónicas-NAMPT. Todos los derivados resultaron ser inhibidores potentes y selectivos de las dos isoformas de anhidrasas carbónicas humanas involucradas en procesos tumorales (CA IX y XII), con un rango de actividad nanomolar-submicromolar e índice de selectividad superior a 8700 con respecto a isoformas citosólicas. El orden de actividad observado fue: amida > cianoguanidina C-4 > tiourea C-3 > cianoguanidina C-3. Estos compuestos se evaluarán también próximamente como inhibidores del NAMPT. Por otro lado, con respecto a las actividades antiproliferativas, si bien no se observa un patrón claro, el empleo de cianoguanidinas en C-4 y tioureas en C-3 del fragmento de piridina, así como cumarinas dimetiladas proporcionó las mejores actividades en la mayoría de las líneas celulares evaluadas. De esta forma, la tiourea 41 podría considerarse como el derivado cabeza de serie, con valores de GI50 en el rango micromolar bajo para 5 de las 6 líneas, incluyendo las dos líneas de tumores resistentes a multifármaco. XIV 1. Abstract This Doctoral Thesis has been developed within the research groups Síntesis y Modificación de Productos Naturales (Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP), Puebla, México) and Química Fina de Carbohidratos (Universidad de Sevilla), whose research is focused on the preparation of bioactive compounds targeting degenerative diseases like cancer, diabetes, or Alzheimer’s disease. Research presented in this document was funded by projects of Basic Science (CB-2015/257464, CONACyT, México), Paradigms and Controversies 2022 (320334, CONACyT, México), Synthesis and in silico studies of antiproliferative agents from natural products (VIEP, 2023-2024, BUAP, México), and by projects from the Spanish Ministry of Science and Innovation (MICIN), Molecules and Macromolecules with Multitarget Activity towards Degenerative Diseases (CTQ2016-78703-P) and Chemical Systems for the Vectorization and Selective Release of New Cytotoxic Enzyme Inhibitors (PID2020-116460RB-I00), from the Spanish Ministry of Science and Innovation (MICIN, Spain). The Thesis is structured into three different sections, each of them addressing innovative approaches for the development of new products with potential antitumor activity. Chapter 4 describes the preparation of derivatives of the pentacyclic triterpenoid oleanolic acid, isolated from more than 1600 plant species, particularly abundant in the Oleaceae family, mainly in the olive tree. Oleanolic acid exhibits interesting biological activities, especially antitumoral, suggesting that it can serve as an excellent building block for obtaining new derivatives with enhanced activities. In this Chapter, the derivatization of oleanolic acid at the C-3 (hydroxyl group) and C-28 (carboxylic acid) positions has been accomplished, using two different approaches. Thus, oleanolic acid-coumarin hybrids have been prepared to analyse the possible synergy in the activities of both fragments; coumarins, whose structure XV comes from the fusion of benzene and α-pyrone, are phenolic systems widely distributed in nature and considered as privileged structures in biomedical research. These hybrids were prepared by inserting a hydrocarbon spacer at the C-28 position of the oleanolic acid and C-7 of the coumarin. Both, the distance between these pharmacophores, and the substituents on the C-3 and C-4 positions of the coumarin were modified, aiming to obtain structure-activity relationships in their antiproliferative properties; this allowed to obtain 9 hybrids, whose general structure is shown in Figure 1.1. The connection between the coumarin residue, obtained in an efficient fashion through the Pechmann condensation of resorcinol and different β-ketoesters, and the oleanolic acid took place with good yields. The in vitro evaluation of antiproliferative activity, performed on 6 human solid tumour cell lines, revealed that only compound 4 (R1=CH3, R2=H, n=3) showed appreciable activity; this compound demonstrated good activity against the HeLa tumor line (cervical cancer, GI50= 7.0 µM), with potency significantly superior to that shown by the reference drug abiraterone. Figure 1.1. General structure of the oleanolic acid-coumarin hybrids prepared herein. The second approach for the derivatization of oleanolic acid involved its combination with a second pharmacophore of organoselenium nature, specifically selenocyanate. This strategy comes from the vast experience of the research groups XVI involved in this Doctoral Thesis in the preparation of organoselenium compounds with biological activity. The incorporation of the organoselenium residue was carried out at both the C-3 and C-28 positions of oleanolic acid, using a spacer as shown in the previous section. The influence of the conformational flexibility of the spacer (hydrocarbon vs. p-phenylene), its length, the derivatization position on oleanolic acid (C-3 vs. C-28), and the nature of C-3 (OH vs. OAc) were analyzed; this allowed the synthesis, with good overall yields, of 14 hybrids whose general structure is shown in Figure 1.2. The study of the in vitro antiproliferative properties revealed promising results. On the one hand, derivatives substituted at C-28, with spacer lengths of up to six carbons, acted as potent antiproliferative agents, with GI50 values in the low micromolar range (1.3‒2.4 µM), representing an up to 19-fold increased activity compared to natural oleanolic acid, and higher than 77-fold compared to abiraterone, a synthetic steroidal drug used in chemotherapy. The use of longer chains (n=9) led to a significant decrease in activity; no difference in activity was observed when modifying the conformational flexibility of the spacer. Derivatives substituted at C-28 with the free hydroxyl group at C-3 proved to be more potent than their O-acetylated counterparts; furthermore, substitution at C-28 proved to be more beneficial than that at C-3, especially for multidrug resistant cell lines. To further investigate into the mode of action of these compounds, selenocyanate 11 (substitution at C-28, n=3, R=H) was subjected to a study using 3D holotomographic imaging techniques on living cells (SW1573, non-small cell lung); this study revealed the induction of necrosis in tumor cells. This type of cell death could be carried out by replication impairments over the S phase provoked by selenocyanate 13, specifically in malignant HeLa cells, which as a consequence, led to a reduction in mitotic cells, indicating damage to replication also during the M phase of the cell cycle. XVII Additionally, selenocyanates 11 and 14 (substitution at C-28, n=6, R=H) were evaluated in vivo using Caenorhabditis elegans, a nematode with a sequenced genome, considered as a validated model in oncological research. The results indicated that these compounds showed excellent selectivity, causing no morphological or physiological alterations in the organism, but a notable reduction in the size of the tumor germline, presumably through a cytostatic action. Figure 1.2. General structure of oleanolic acid-derived selenocyanates prepared herein. In Chapter 5, a novel approach has been addressed for obtaining antiproliferative agents with selective activity against tumor cells (Figure 1.3). This approach involved the combination of two key fragments using a core of paminophenol for their incorporation. On the one hand, a selenocyanate residue that would act as a pharmacophore providing antiproliferative activity, and on the other hand, a lipophilic cation designed to serve as a selective vehicle targeting the mitochondria of tumor cells. Compounds with this structure are called mitochondriotropic agents, and when they exhibit antitumor activity, they are known as mitocans (mitochondria + cancer). A wide structural diversity has been achieved by modifying the nature, type, and length of the linker (hydrocarbon fragment, thiourea, amide), as well as the nature of the lipophilic cation (triphenylphosphonium (TPP), pyridinium, quinolinium, N-methylimidazolium, rhodamine B), leading to 8 derivatives. The antiproliferative activity data of these derivatives showed that they induce the inhibition of cell growth on the 6 solid tumor cell lines in the low micromolar range. The best results were obtained when triphenylphosphonium bromide and rhodamine were used as XVIII lipophilic cations, compound 25 being the lead derivative, roughly 9-fold stronger than the reference drug against WiDr cell line. Interestingly, the addition of the selenium fragment to rhodamine B allowed to increase its cellular inhibition effect up to 11 times in the multidrug-resistant cell line. Figure 1.3. General structure of the mitochondriotropic agents prepared herein. Finally, in Chapter 6, the preparation of dual inhibitors of carbonic anhydrases and NAMPT (nicotinamide phosphoribosyltransferase) enzymes has been accomplished as examples of multitarget drugs with antitumor activity; Figure 1.4 shows the general structure of the 10 hybrids obtained. Both enzymes are currently considered as therapeutic targets of interest against cancer. Carbonic anhydrases, overexpressed in hypoxic tumors, are responsible for the acidic microenvironment of the tumor, which allows its survival and expansion; a coumarin residue, acting as a suicide inhibitor, has been selected as the pharmacophore for their inhibition. On the other hand, NAMPT is the ratelimiting enzyme in the biosynthesis of NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotide), highly demanded by tumor cells; a pyridine residue substituted at C-3 or C-4, acting as a nicotinamide (NAM) mimic, has been selected for its inhibition. XIX The design of inhibitors for both enzymes follows a relatively similar pattern, featuring a head that interacts with the enzyme active center, and a hydrophobic tail, which can establish favorable van der Waals interactions. A pyridine residue substituted either at the C-3 or C-4 position was used for mimicking the heterocyclic moiety of NAM, with linkers such as cyanoguanidine, thiourea, or amide. The spacer was, in all cases, a hexamethylene fragment, and the coumarin incorporates different substituents at the C-3 and C-4 positions. All derivatives proved to be potent and selective inhibitors of the two human carbonic anhydrase isoforms involved in tumor processes (CA IX and XII), with activities in the nanomolar-submicromolar range and a selectivity index relative to cytosolic isoforms greater than 8700. The observed activity order was: amide > C-4 cyanoguanidine > C-3 thiourea > C-3 cyanoguanidine. These compounds will also be evaluated as potential NAMPT inhibitors. Regarding antiproliferative activities, although a no clear pattern was observed, the use of C-4 cyanoguanidines and C-3 thioureas, as well as dimethylated coumarins, provided the best activities in most of the evaluated cell lines. Thus, thiourea 41 could be considered the leading derivative, with GI50 values in the low micromolar range for 5 out of the 6 lines, including the two multi-drug resistant tumor lines. Figure 1.4. Structural design for the dual carbonic anhydrases-NAMPT inhibitors. Introducción 1 3. Introducción general El cáncer es un conglomerado de cientos de enfermedades donde las células presentan un desarrollo descontrolado y tiene el potencial de extenderse a diferentes partes del cuerpo, 1 siendo una de las principales causas de mortalidad y morbilidad a nivel mundial. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó que en el año 2022 hubo cerca de 20 millones de nuevos casos de cáncer y alrededor de 9.7 millones de defunciones a nivel global, estimándose más de 35 millones de nuevos casos para el año 2050. 2 En México se registraron cerca de 848 mil muertes en el año 2022, de las cuales un 10.6% fue causado por tumores malignos, principalmente a partir de los 50 años en ambos sexos. Por otro lado, entre los diferentes rangos de edad de la población, los principales causantes de defunciones relacionadas con el cáncer fueron leucemia, linfoma no Hodgking y tumores de mama, colon, estómago, ovario y pulmón. 3 Los principales tratamientos existentes contra el cáncer son la cirugía, radioterapia y quimioterapia, incluyendo la inmunoterapia. 4 Sin embargo, en algunos casos estos tratamientos resultan poco efectivos, debido en parte a la quimiorresistencia adquirida por las células tumorales a los diferentes agentes quimioterapéuticos, o son causantes de efectos secundarios severos, a consecuencia de su falta de selectividad. Todo esto hace que la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos sea un área prioritaria en la investigación biomédica. 5 1 . Dutta S., Mahalanobish S., Saha S., Ghosh S., Sil P.C. Natural products: An upcoming therapeutic approach to cancer. Food Chem. Toxicol. 2019, 128, 240‒255. 2 . OMS. https://www.who.int/es/news/item/01-02-2024-global-cancer-burden-growing--amidst- mounting-need-for-services. [Último acceso: 20/10/2024]. 3 . INEGI. https://www.inegi.org.mx/contenidos/saladeprensa/aproposito/2024/EAP_CANCER24.pdf. [Último acceso: 20/10/2024]. 4 . Tian W., Huang J., Zhang W., Wang Y., Jin R., Guo H., Tang Y., Wang Y., Lai H., Leung E.L. Harnessing natural product polysaccharides against lung cancer and revisit its novel mechanism. Pharmacol. Res. 2024, 199, 107034. 5 . Chen T., Xiao Z., Liu X., Wang T., Wang Y., Ye F., Su J., Yang X., Xiong L., Yang D. Natural products for combating multidrug resistance in cancer. Pharmacol. Res. 2024, 202, 107099. Introducción 2 Los productos naturales en el tratamiento del cáncer han cobrado gran relevancia en la industria farmacéutica, gracias a su buena selectividad contra las células “anormales” y a su amplia variedad estructural, lo cual los convierte en interesantes farmacóforos. 6 Muchos de ellos interfieren en algunas fases del ciclo celular, ya que durante el desarrollo de la enfermedad se observan mutaciones en el desarrollo de algunos genes que regulan la producción de proteínas de señalización celular, factores de crecimiento y sus receptores, así como proteínas antiapoptóticas y proapoptóticas o a factores de transcripción; estos últimos se siguen utilizando como algunas de las dianas terapéuticas para el descubrimiento de fármacos anticancerígenos. 7 Aproximadamente un 80% de los medicamentos aprobados para el tratamiento del cáncer deriva de los productos naturales, siendo un 75% de estos provenientes de plantas. 8 , 9 Los principales productos naturales derivados de plantas como agentes anticancerígenos, ya aprobados clínicamente, se han clasificado en cuatro grandes grupos: alcaloides de la vinca, epipodofilotoxinas, taxanos y camptotecinas (figura 3.1). Entre los alcaloides procedentes de la vinca, la vinblastina y la vincristina se han utilizado en quimioterapia durante 40 años, donde su mecanismo de acción es la interrupción de la formación del huso mitótico por el ensamblaje con la β-tubulina, lo que detiene el ciclo celular en la metafase lo que a su vez lleva a la muerte celular, y se emplean principalmente contra el linfoma de Hodgkin, cáncer de pulmón y de mama. 10 6 . Harvey A.L., Edrada-Ebel R., Quinn R.J. 1 The re-emergence of natural products for drug discovery in the genomics era. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111‒129. 7 . Liao Y., Y, G., Li Q., An, J., Wang, D. The signaling pathways and targets of natural products from traditional Chinese medicine treating gastric cancer provide new candidate therapeutic strategies. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Cancer. 2023, 1878, 188998. 8 . Newman D.J., Cragg G.M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J. Nat. Prod. 2020, 83, 770‒803. 9 . Taïbi K., Abderrahim L.A., Ferhat K., Betta S., Taïbi F., Bouraada F., Boussaid M. Ethnopharmacological study of natural products used for traditional cancer therapy in Algeria. Saudi Pharm. J. 2020, 28, 1451‒1465. 10 . van der Heijden L.T., Gebretensae A., Thijssen B., van Andel L., Nijstad A.L., Wang Y., Rosing H., Huitema A.D.R., Beijnen J.H. A highly sensitive bioanalytical method for the quantification of Introducción 3 La podofilotoxina se aisló de la resina de Podophyllum peltatum L., pero se descubrió que era demasiado tóxica en ratones; su derivatización y estudio posterior condujo al etopósido como el primer fármaco clínicamente aprobado derivado de este fitoquímico. El etopósido detiene la etapa premitótica de la división celular mediante la inhibición de la topoisomerasa II. Por otro lado, la camptotecina, aislada de la corteza y hojas del árbol de origen chino Camptotheca acuminata, actúa sobre la topoisomerasa I, inhibiendo la replicación del ADN y la transcripción del ARN; tanto el etopósido como la camptotecina son utilizados en varios tipos de cáncer. 11 Figura 3.1. Principales productos naturales derivados de plantas. Del grupo de los taxanos, el paclitaxel o Taxol® es de los fármacos anticancerígenos más utilizados, y se ha aislado de la corteza del árbol Taxus brevifolia Nutt. (tejo del Pacífico; Nutt. abreviatura del autor taxonómico para Thomas Nuttall) y se siguen proponiendo rutas sintéticas debido a la pequeña vinblastine, vincristine, vinorelbine and 4-O-deacetylvinorelbine in human plasma using LCMS/MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2022, 215, 114772. 11 . Topkaya C., Aslan S., Hökelek T., Göktürk T., Kincal S., Altuntas D.B., Güp R. Syntheses, crystal structures, hirshfeld surface analyses and electrochemical etoposide/camptotechin sensor applications of acetaldehyde oxime derivatives. J. Mol. Struct. 2022, 1265, 133339. Introducción 4 cantidad aislada de su fuente natural. La corteza de un solo árbol proporciona del orden de 0.5 g de taxol, y para el tratamiento efectivo de un paciente se requerirían de 1 a 3 árboles. 12 Como alternativa, de las agujas del tejo se aisló un compuesto denominado bacatina III, sin comprometer la integridad del árbol, y que puede ser transformado en taxol mediante un proceso de semisíntesis. Su principal mecanismo de acción es sobre la tubulina, lo que causa problemas en el ensamblaje del huso mitótico y segregación cromosómica, bloqueando la mitosis, lo cual conduce a su vez a la apoptosis celular de las células tumorales. 13 Además de los compuestos mencionados anteriormente, los triterpenos pentacíclicos son un grupo de metabolitos secundarios prometedores para el tratamiento del cáncer. Los triterpenos que pertenecen a los grupos lupano, oleano o ursano tienen potencial para tratar el cáncer mediante diferentes modos de acción, principalmente por su efecto inductor de apoptosis, 14 lo cual se abordará con mayor detalle en el Capítulo 4 en la preparación de los derivados del ácido oleanólico. Una de las dianas utilizadas en la actualidad en la terapia contra el cáncer es la mitocondria, orgánulo responsable de la producción de la energía celular. En este contexto, se diseñan moléculas de bajo peso molecular que actúan como ‘vectores’ para la administración selectiva de fármacos hacia el interior de la mitocondria, a lo que se denomina agentes mitocondriotrópicos. 15 Un mecanismo para la obtención de este tipo de moléculas es mediante la adición a los farmacóforos de algunos cationes lipofílicos, esto debido a que la membrana mitocondrial presenta un potencial negativo, más acusado en las células tumorales, permitiendo de esta 12 . Li Y., Zhang G., Pfeifer B.A. Current and Emerging Options for Taxol Production. Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. 2015, 148, 405‒425. 13 . Lv L., Wang S.C., Mo J.Y., Huang K.L., Xu M.L., Liu J. Effects and mechanis of FBXO31 on Taxol chemoresistance in esophageal squamous cell carcinoma. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2022, 586, 129‒136. 14 . Chan E.W.C., Soon C.Y., Tan J.B.L., Wong S.K., Hui Y.W. Ursolic acid: An overview on its cytotoxic activities against breast and colorectal cancer cells. J. Integr. Med. 2019, 17, 155‒160. 15 . Horobin R.W., Trapp S., Weissig V. Mitochondriotropics: a review of their mode of action, and their applications for drug and DNA delivery to mammalian mitochondria. J. Control. Release. 2007, 121, 125‒136. Introducción 5 manera la acumulación de derivados de carga positiva en su interior. 16 Un ejemplo, es la incorporación del grupo trifenilfosfonio (+PPh3, TPP+), lo que aumenta la eficacia de compuestos antiproliferativos sin alterar su mecanismo de acción; 17 esta temática se desarrollará en el Capítulo 5. Otra de las estrategias para la búsqueda de moléculas anticancerígenas es la inhibición de enzimas clave en el desarrollo y/o funcionamiento celular. En este contexto, existe interés en el desarrollo de compuestos que, mediante la inhibición de alguna enzima, afecte alguna de las fases del metabolismo celular; ejemplo de esto es el dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD), el cual funciona como cofactor en procesos como la glucólisis y en la síntesis y oxidación de lípidos, donde la NAMPT (nicotinamida fosforribosiltransferasa) actúa como enzima reguladora de su biosíntesis. 18 Se ha observado que en células cancerígenas hay un aumento en el consumo de NAD, por lo que la inhibición de NAMPT resulta una diana atractiva para el desarrollo de nuevos agentes anticancerígenos. 19 Entre los derivados sintéticos reportados con actividad sobre NAMPT, considerados de primera generación, destacan derivados de piridina de tipo amida como el compuesto FK866 y cianoguanidinas como el compuesto CHS- 828 (figura 3.2). 20 16 . Hicke F.J., Puerta A., Dinić, J., Pešić M., Padrón J.M., Lopéz Ó., Fernandez‐Bolanos J.G. Straightforward access to novel mitochondriotropics derived from 2-arylethanol as potent and selective antiproliferative agent. Eur. J. Med. Chem. 2022, 228, 113980. 17 . Dong L., Jameson V.J., Tilly D., Černý J., Mahdavian E., Marín‐Hernández Á., Hernández‐ Esquivel, L., Ledvina M., Salvatore B.A., Moreno‐Sánchez R., Coster M.J., Neužil J. Mitochondrial targeting of Vitamin E succinate enhances its pro-apoptotic and anti-cancer activity via mitochondrial complex II J. Biol. Chem. 2011, 286, 3717‒3728. 18 . He T., Wang L., Wang T., Yang J., Zheng S., Tong J., Jiang S., Zhang X., Zhang K. Recent advances of targeting nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) for cancer drug discovery. Eur. J. Med. Chem. 2023, 258, 115607. 19 . Dong G., Chen W., Wang X., Yang X., Xu T., Wang P., Zhang W., Rao Y., Miao C., Sheng C. Small molecule inhibitors simultaneously targeting cancer metabolism and epigenetics: Discovery of novel nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) and histone deacetylase (HDAC) dual inhibitors. J. Med. Chem. 2017, 60, 7965‒7983. 20 . Ozgencil F., Eren G. Field-based 3D-QSAR studies on amide- and urea-containing NAMPT inhibitors. Chemom. Intell. Lab. Syst. 2023, 242, 104984. Introducción 6 Figura 3.2. Inhibidores de NAMPT de primera generación. Otro ejemplo son las anhidrasas carbónicas, este es un grupo de metaloenzimas cuya función es catalizar la hidrólisis reversible de CO2 a bicarbonato y protón. 21 Estas enzimas se han categorizado en 8 familias, donde la familia α corresponde a las anhidrasas carbónicas humanas. De entre las 15 isoformas de estas últimas, las anhidrasas carbónicas IX y XII son de interés por su sobreexpresión en células tumorales, lo que las convierte en una diana terapéutica interesante para el descubrimiento de moléculas bioactivas contra el cáncer. 22 Entre los principales inhibidores de anhidrasas carbónicas humanas destacan las cumarinas, las cuales se encuentran categorizadas como inhibidores no clásicos, y varios grupos de investigación han demostrado su efectividad. 23 Lo anterior se abordará más detalladamente en el Capítulo 6. 21 . Takla F.N., Zaib S., Bayoumi W.A., Shehzadi K., El‐Messery S.M., Anjum S., Faisal A., Nasr M.N. Targeting carbonic anhydrases II/IX/XII with novel series of coumarin-based compounds: Synthesis, biological activity and molecular dynamics analysis. J. Mol. Struct. 2024, 1300, 137277. 22 . Singh P., Goud N.S., Swain B., Supuran C.T., Ullah Q., Supuran C.T., Arifuddin M. Design, synthesis and in vitro evaluation of novel thiazole-coumarin hybrids as selective and potent human carbonic anhydrase IX and XII inhibitors. Int. J. Biol. Macromol. 2024, 268, 131548. 23 . Buran K., Bua S., Poli G., Bayram F.E.Ö., Tuccinardi T., Supuran C.T. Novel 8-substituted coumarins that selectively inhibit human carbonic anhydrase IX and XII. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 1208. Antecedentes 7 4. Síntesis de derivados del ácido oleanólico con potencial actividad antiproliferativa 4.1. Introducción 4.1.1. Aspectos generales del ácido oleanólico El ácido oleanólico (ácido 3β-hidroxiolean-12-en-28-oico, (OA, figura 4.1) es un triterpenoide pentacíclico, aislado de aproximadamente 1620 especies de plantas tanto medicinales, como de uso alimentario. Este compuesto es abundante en plantas pertenecientes a la familia Oleaceae, principalmente el olivo (Olea europea), del cual adquirió su nombre. 24 , 25 Se encuentra también en plantas como la Lantana camara y Lisgustrum lucidum, usadas en la medicina tradicional para tratar diversos padecimientos. 26 Figura 4.1. Estructura del ácido oleanólico con la numeración de su esqueleto carbonado. En la naturaleza, el OA se encuentra en forma de ácido libre o como glicósidos de saponinas triterpenoides, y comúnmente viene acompañado de su isómero, el ácido ursólico.25 Es un compuesto de color amarillo claro, no volátil, 24 . Pollier J., Goossens A. Oleanolic acid. Phytochemistry, 2012, 77, 10‒15. 25 . Lee J.H., Yoo E.S., Han S.H., Jung G.H., Han E.J., Jung S.H., Kim B.S., Cho S.D., Nam J.S., Choi C., Che J.H., Jun J.Y. Oleanolic acid induces apoptosis and autophagy via the PI3K/AKT/mTOR pathway in AGS human gastric cancer cells. J. Funct. Foods, 2021, 87, 104854. 26 . Ayeleso T.B., Matumba M.G., Mukwevho E. Oleanolic acid and its derivatives: Biological activities and therapeutic potential in chronic diseases. Molecules, 2017, 22, 1915‒1930. Antecedentes 8 soluble en butanol y acetato de etilo, y menos soluble en etanol, propan-2-ol, metanol, acetona y agua. 27 La biosíntesis de OA en plantas tiene como precursor primario al 2,3- oxidoescualeno (sintetizado por la vía del mevalonato), que se cicla a β-amirina, por mediación de la enzima β-amirina sintasa. Posteriormente, la enzima citocromo P450 oxida en tres pasos a la β-amirina en la posición C-28 para producir el OA (figura 4.2).26, 28 Gracias a su actividad biológica, disponibilidad y bajo costo de producción, el OA se considera como una plataforma interesante para la obtención de derivados mediante semisíntesis. Las tres posiciones reactivas del OA, C-3 (grupo hidroxilo), C-12 y C-13 (doble enlace) y C-28 (ácido carboxílico), han dado lugar, mediante transformaciones químicas, a nuevas series de triterpenoides con distintos efectos biológicos. 29 27 . Castellano J.M., Ramos-Romero S., Perona J.S. Oleanolic acid: Extraction, characterization and biological activity. Nutrient, 2022, 31, 623‒651. 28 . Gill B.S., Kumar S., Navgeet. Triterpenes in cancer: significance and their influence. Mol. Biol. Rep. 2016, 43, 881‒896. 29 . Rali S., Oyedeji O.O., Aremu O.O., Oyedeji A.O., Nkeh-Chungag B.N. Semisynthesis of derivatives of oleanolic acid from Syzygium aromaticum and their antinociceptive and antiinflammatory properties. Mediat. Inflamm. 2016, 8401843. Antecedentes 9 Figura 4.2. Ruta biosintética del ácido oleanólico. Abreviaturas: IPP, pirofosfato de isopentenilo; DMAPP, difosfato de dimetilalilo; FPS, pirofosfato de farnesilo sintasa; FPP, pirofosfato de farnesilo; SQS, escualeno sintasa; SQE, escualeno epoxidasa; OCS, oxidoescualeno ciclasa; BAS, β-amirina sintasa; CYP716, enzima del citocromo P450 que pertenece al grupo CP71. Adaptado de Borela et al. 30 La biodisponibilidad es la proporción de un compuesto que ingresa a la circulación sistémica con respecto a la cantidad inicialmente introducida en el organismo; 31 estudios experimentales y clínicos describieron la presencia de ácido 30 . Borella R., Forti L., Gibellini L., de Gaetano A., de Biasi S., Nasi M., Cossarizza A., Pinti M. Synthesis and anticancer activity of CDDO and CDDO-Me, two derivatives of natural triterpenoids. Molecules, 2019, 24, 4097‒4116. 31 . Abuhassira-Cohen Y., Livney Y.D. Enhancing the bioavailability of encapsulated hydrophobic nutraceuticals: Insights from in vitro, in vivo, and clinical studies. Curr. Opin. Food Sci. 2022, 45, 100832. Antecedentes 10 oleanólico en sangre varias horas después de la ingesta sin ser metabolizado, debido a su biodisponibilidad oral baja por su poca solubilidad en agua (4.61 mg/L a 20°C). 32 Debido a su baja biodisponibilidad, la baja solubilidad y poca permeabilidad en membranas biológicas, se ha clasificado al OA dentro de la categoría IV de fármacos, y una de las soluciones a estos problemas es su posible administración en nanoemulsiones, liposomas o nanopartículas, así como la bioconjugación con proteínas, por ejemplo albúmina. 33 Entre las propiedades biológicas más importantes del OA se encuentra su efecto antiinflamatorio, antibacteriano, 34 antiviral, 35 antidiabético, 36 antioxidante 37 y anticancerígeno. 38 Tal actividad anticancerígena la ejerce mediante la inducción de apoptosis celular y mediante vía mitocondrial por la activación de caspasas, como la caspasa C, disminución de la actividad de Bcl-2 y sobreexpresión del regulador 32 . Jiang, Q., Yang, X., Du, P., Zhang, H., Zhang, T. Dual strategies to improve oral bioavailability of oleanolic acid: Enhancing water-solubility, permeability, and inhibiting cytochrome P450 isozymes. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2016, 99, 65‒72. 33 . Dopierala K., Krajewska M., Weiss M. Physicochemical characterization of oleanolic acid–human serum albumin complexes for pharmaceutical and biosensing applications. Langmuir, 2020, 36, 3611‒3623. 34 . Yan S., Lin H., Huang H., Yang M., Xu B., Chen G. Microbial hydroxylation and glycosidation of oleanolic acid by Circinella muscae and their anti-inflammatory activities. Nat. Prod. Res. 2019, 33, 1849‒1855. 35 . Medina-O'Donnell M., Rivas F., Reyes-Zurita F.J., Cano-Muñoz M., Martínez A., Lupiañez J.A., Parra A. Oleanolic acid derivatives as potential inhibitors of HIV-1 protease. J. Nat. Prod. 2019, 82, 2886‒2896. 36 . Silva F.S., Oliveira P.J., Duarte M.F. 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Antecedentes 17 propiedades biológicas, como antiinflamatorias, 56 antibacterianas, 57 antivirales, antioxidantes, antitrombóticos, anti-Alzheimer y efectos antitumorales. 58 ‒ 61 Su efecto biológico puede atribuirse a la capacidad de formar interacciones no covalentes, de tipo π-π, hidrofóbicas, electrostáticas, enlaces de hidrógeno, coordinación con metales y fuerzas de van der Waals con diferentes enzimas y dianas terapéuticas; adicionalmente, suelen exhibir una reducida toxicidad. 62 , 63 La ingesta o contacto dérmico con plantas que contienen cumarinas permite su absorción al torrente sanguíneo, sin embargo, su actividad puede ser variable debido a diferentes factores como la estabilidad o su absorción intestinal. La administración directa por vía oral de las cumarinas, a diferencia de su consumo por fuentes alimentarias, dan lugar a concentraciones mucho mayores en el torrente sanguíneo. Se ha reportado la presencia de furanocumarinas en plasma 15 minutos después de su administración y su concentración máxima a los 60 minutos, lo que 56 . Song S., Ren B., Wu X., Xie Y., Cheng B., Wei Q., Pang W., Wu Z., Zhang X., Li X., Xiao W. Asiaticasics A-O, structurally intriguing coumarins from Toddalia asiatica with potential inflammatory inhibitory activity. Phytochemistry, 2024, 221, 114042. 57 . Loganathan V., Ahamed A.J., Surendrakumar R., Gaafar A.Z., Raman G., Idhayadhulla, A. Synthesis of anthraquinone-connected coumarin derivatives via grindstone method and their evaluation of antibacterial, antioxidant, tyrosinase inhibitory activities with molecular docking, and DFT calculation studies. Heliyon, 2024, 10, e25168. 58 . Al-Warhi T., Sabt A., Elkaeed E.B., Eldehna W.M. Recent advancements of coumarin-based anticancer agents: An up-to-date review. Bioorg. Chem. 2020, 103, 104163. 59 . Cervi A., Aillard P., Hazeri N., Petit L., Chai, C.L.L., Willis A.C., Banwell, M.G. Total syntheses of the coumarin-containing natural products Pimpinellin and Fraxetin using Au(I)-catalyzed intramolecular hydroarylation (IMHA) chemistry. J. Org. Chem. 2013, 78, 9876–9882. 60 . Gangopadhyay A. Plant-derived natural coumarins with anticancer potentials: future and challenges. J. Herb. Med. 2023, 42, 100797. 61 . Mustafa Y.F., Ismael R.N., Jebir R.M. Natural coumarins from two cultivars of watermelon seeds as biosafe anticancer agents, an algorithm for their isolation and evaluation. J. Mol. Struct. 2024, 1295, 136644. 62 . Ahmed E.Y., Abdelhafez O.M., Zaafar D., Serry A.M., Ahmed Y.H., El‐Telbany R.F.A., Abd Elmageed, Z.Y., Ali, H.I. Antitumor and multikinase inhibition activities of some synthesized coumarin and benzofuran derivatives. Archiv. Pharm. 2022, 355, 2100327. 63 . Zeki N.M., Mustafa, Y.F. 6,7-Coumarin-heterocyclic hybrids: A comprehensive review of their natural sources, synthetic approaches, and bioactivity. J. Mol. Struct. 2024, 1303, 137601. Antecedentes 18 indica una fácil absorción por vía gastrointestinal y rápida distribución al resto del organismo. 64 Las cumarinas se metabolizan inicialmente por enzimas monooxigenasas del citocromo P-450 (CYP2A6) en el hígado, lo que lleva a una hidroxilación (mayoritariamente en la posición 7 y 3 para dar 7-hidroxicumarina o 3- hidroxicumarina) antes de la conjugación en el metabolismo de fase II principalmente con ácido glucurónico. 65 La presencia de ácido O-cumárico (OCA), principal metabolito biodisponible de cumarinas en plasma puede indicar una ruta metabólica alternativa de las cumarinas en humanos (figura 4.9). Las cumarinas permanecen intactas en el medio ácido del estómago, en el intestino son hidrolizadas en el medio básico para formar OCA y se absorbe con el resto de cumarina para llegar al hígado y se metaboliza por la enzima CYP2A6 por metabolismo de fase I, mientras que otra parte sufre metabolismo de fase II para dar el glucurónido de 7-hidroxicumarina.60, 66 64 . Melough M. M., Cho E. Furocoumarins: A review of biochemical activities, dietary sources and intake, and potential health risks. Food Chem.Toxicol. 2018, 113, 99‒107. 65 . Annunziata F., Pinna C., Dallavalle S., Tamborini L., Pinto A. An overview of coumarin as a versatile and readily accessible scaffold with broad-ranging biological activities. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4618. 66 . Leonart L.P., Gasparetto J.C., Pontes F.L.D., Cerqueira L.B., De Francisco T.M.G., Pontarolo R. New metabolites of coumarin detected in human urine using ultra performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry. Molecules, 2017, 22, 2031. Antecedentes 19 Figura 4.9. Metabolismo de cumarinas en humanos. Adaptado de Gangopadhyay et al.60 Las cumarinas han tenido un rol importante también la industria alimenticia y cosmética, como blanqueadores ópticos, como anticoagulantes y en la preparación de insecticidas, así como en el campo de los sensores, celdas solares, diodos orgánicos emisores de luz y tintes de láseres. 67 ‒ 69 Las cumarinas se sintetizaron por primera vez en 1868, con el tratamiento de la sal sódica de salicilaldehído con anhídrido acético, conocida como reacción de Perkin. Otros métodos son con el tratamiento de salicilaldehído con ynamidas utilizando bromuro de zinc como catalizador 70 o mediante la irradiación con microondas a 1,3-dihidrobenceno con acetoacetato de etilo en condiciones libres de 67 . Amoozadeh A., Ahmadzadeh M., Kolvari E. Easy access to coumarin derivatives using alumina sulfuric acid as an efficient and reusable catalyst under solvent-free conditions. J. Chem. 2013, 767825. 68 . Lee J.H., Jeong A.R., Shin I., Kim H., Hong J. Fluorescence Turn-On sensor for cyanide based on a cobalt(II)−coumarinylsalen complex. Org. Lett. 2010, 12, 764‒767. 69 . Zhou S., Jia J., Gao J., Li H., Li Y., Wei S. The one-pot synthesis and fluorimetric study of 3-(2′- benzothiazolyl)coumarins. Dyes Pigments, 2010, 86, 123‒128. 70 . Yoo H.J., Youn S.W. Zn(II)-catalyzed one-pot synthesis of coumarins from ynamides and salicylaldehydes. Org. Lett. 2019, 21, 3422–3426. Antecedentes 20 disolvente; 71 no obstante, la condensación de Pechmann continúa siendo la metodología más utilizada para la síntesis de cumarinas. 72 La reacción de Pechmann consiste en la condensación de fenoles con βcetoésteres, usualmente en presencia de diferentes ácidos como catalizadores, para dar lugar a cumarinas 4-sustituidas (figura 4.10). 73 Se ha reportado que la naturaleza del grupo presente en la posición C-4 va a condicionar la actividad contra células cancerígenas.51,74 Figura 4.10. Mecanismo de reacción propuesto por Amoozadeh et al. de la condensación de Pechmann.67 Algunos derivados de cumarinas han demostrado la capacidad de desencadenar la detención del ciclo celular, inhibición de angiogénesis, inhibición de quinasas, inhibición de telomerasas, inhibición de transportadores de 71 . Bouasla S., Amaro-Gahete J., Esquivel D., López M., Jiménez-Sanchidrián C., Teguiche M., Romero-Salguero F. Coumarin derivatives solvent-free synthesis under microwave irradiation over heterogeneous solid catalysts. Molecules, 2017, 22, 2072. 72 . Chandrakanth M., Thomas N.M., Arya C.G., Fabitha K., Banothu J. Coumarin–1,2,4-triazole hybrids: Recent advances in synthesis and medicinal applications. J. Mol. Struct. 2024, 1299, 137197. 73 . Vargas-Soto F.A., Céspedes-Acuña C.L., Aqueveque-Muñoz P.M., Alarcón-Enos J.E. Toxicity of coumarins synthesized by Pechmann-Duisberg condensation against Drosophila melanogaster larvae and antibacterial effects. Food. Chem. Toxicol. 2017, 109, 1118‒1124. Antecedentes 21 monocarboxilatos, inhibición de anhidrasas carbónicas, inhibición de la aromatasa y sulfatasas en diferentes líneas celulares de cáncer, incluidas aquellas con quimiorresistencia. 74 Por todo ello, muchos de estos derivados muestran actividades antitumorales prometedoras. La aromatasa es una enzima responsable de la conversión de andrógenos en estrógenos, y altos niveles de esta enzima están relacionados en el desarrollo del cáncer de mama, de endometrio y de próstata. 75 En este contexto, Chen y et al. 76 sintetizaron derivados de cumarina con posible actividad inhibitoria de aromatasa y emplearon como grupos funcionales bencilo y metilo para modular tal actividad. Se observó que el grupo metilo y bencilo tuvieron mejor afinidad hacia el grupo hemo de la aromatasa, sin embargo, solo se observa la actividad inhibitoria cuando C-4 está sustituido por un grupo bencilo (figura 4.11). R1 R2 R3 Actividad en aromatasa (IC50) Bencilo p-Clorofenilo Metoxilo 0.08 µM Figura 4.11. Estudio SAR de derivados de cumarinas con actividad sobre aromatasa. Modificado de Dandriyal et al.53 74 . Zhang L., Xu Z. Coumarin-containing hybrids and their anticancer activities. Eur. J. Med. Chem. 2019, 181,111587. 75 . Molehin, D., Filleur S., Pruitt, K. Regulation of aromatase expression: Potential therapeutic insight into breast cancer treatment. Mol. Cell Endocrinol. 2021, 531, 111321. 76 . Chen S., Cho M., Karlsberg K., Zhou D., Yuan Y.C. Biochemical and biological characterization of a novel anti-aromatase coumarin derivative. J. Biol. Chem. 2004, 279, 48071–48078. Antecedentes 22 Otra de las dianas terapéuticas contra el cáncer de las cuales se han diseñado numerosos derivados de cumarinas son las anhidrasas carbónicas (CAs). Este grupo de metaloenzimas catalizan la hidratación reversible del dióxido de carbono para generar HCO3- e hidronio; esto permite mantener la homeostasis del pH inter- e intracelular, y el transporte transmembrana de iones, que pueden afectar el metabolismo celular. 77 Entre los varios tipos de anhidrasas carbónicas, se ha observado que las isoformas de tipo transmembrana CA IX y CA XII de la familia α (mamíferos) se encuentran sobreexpresadas en ciertos tipos de tumores y son una buena diana para el diseño de agentes anticancerígenos. 78 Se proporciona una descripción más detallada de estas enzimas en el Capítulo 6 de la presente Tesis Doctoral. A modo de ejemplo, Zengin et al. desarrollaron compuestos basados en cumarinas y sulfonamidas, con el objetivo de observar su actividad inhibitoria sobre CA I, CA II (citosólicas, usadas como control para el estudio de la selectividad), CA IX y CA XII y la relación entre esta inhibición y su actividad sobre células de cáncer de colon. Con ello determinaron que el compuesto 59 muestra una inhibición selectiva en la proliferación celular y en la actividad de CA IX y XII con una Ki=45.5 nM y 596.6 nM respectivamente, 79 así como derivados de bis-cumarinas, donde el derivado 60 mostró una Ki=144.6nM y 71.5 nM sobre estas mismas anhidrasas (figura 4.12). 80 En este último, al realizar un estudio SAR observaron que la adición de un grupo metilo en C-4 de la cumarina, así como un aumento del tamaño del espaciador eran de importancia en el aumento de la actividad sobre CA IX. 77 . Supuran C.T. Carbonic anhydrase inhibition and the management of hypoxic tumors. Metabolites, 2017, 7, 48. 78 . Wu Y., Xu J., Liu Y., Zeng Y., Wu G. A review on anti-tumor mechanisms of coumarins. Front. Oncol. 2020, 10, 592853. 79 . Zengin Kurt B.Z., Sonmez F., Ozturk D., Akdemir A., Angeli A., Supuran C.T. Synthesis of coumarin-sulfonamide derivatives and determination of their cytotoxicity, carbonic anhydrase inhibitory and molecular docking studies. Eur. J. Med. Chem. 2019, 183, 111702. 80 . Kurt B.Z, Dag A., Doğan B., Durdagi S., Angeli A., Nocentini A., Supuran C.T., Sonmez F. Synthesis, biological activity and multiscale molecular modeling studies of bis-coumarins as selective carbonic anhydrase IX and XII inhibitors with effective cytotoxicity against hepatocellular carcinoma. Bioorg. Chem. 2019, 87, 838–850. Antecedentes 23 Figura 4.12. Triazoles derivados de cumarinas obtenidos por Zengin et al.79,80 Otro ejemplo de derivados de 7-hidroxicumarinas, fue el reportado por Thacker et al. 81 En particular, prepararon 7-hidroxicumarina-3-carboxamidas, destacando el derivado 61 (figura 4.13), con una Ki =200 nM sobre CA IX. Estudios de docking molecular revelaron, interacciones de 61 y los aminoácidos del sitio activo de CA IX (His94, Thr198 y Pro200). Figura 4.13. Derivado de 7-hidroxicumarina con actividad sobre CAs.81 En los grupos de investigación donde se ha desarrollado esta Tesis Doctoral se han sintetizado una amplia variedad de derivados cumarínicos con potencial actividad sobre anhidrasas carbónicas. Ejemplo reciente es el reportado por Fuentes-Aguilar et al. 82 Se sintetizaron dos familias de mitocans con actividad dual 81 . Thacker P.S, Alvala M., Arifuddin M., Angeli A., Supuran C.T. Design, synthesis and biological evaluation of coumarin-3-carboxamides as selective carbonic anhydrase IX and XII inhibitors. Bioorg. Chem. 2019, 8, 386–392. 82 . Fuentes-Aguilar A., González‐Bakker A., Jovanović M., Stojanov S.J., Puerta A., Gargano A.D., Dinić J., Vega-Báez J.L., Merino-Montiel P., Montiel‐Smith S., Alcaro S., Nocentini A., Pešić M., Supuran C.T., Padrón, J.M., Fernandez‐Bolaños J.G., López, Ó. Coumarins-lipophilic cations conjugates: Efficient mitocans targeting carbonic anhydrases. Bioorg. Chem. 2024, 145, 107168. Antecedentes 24 mediante la combinación de cumarinas sustituidas en C-3 y C-4 con potencial actividad sobre CA IX y XII y un fragmento lipófilo cargado positivamente (grupo fosfonio y sal de guanidinio) como vector selectivo hacia las mitocondrias de las células malignas. Se observó que los derivados monosustituidos en C-4 (R1=CH3), o disustituidos en C-3 y C-4 (Me/Me, Cl/Me) y un grupo espaciador pentilo tuvieron actividad sobre CA IX y XII en el rango nM y fueron agentes antiproliferativos selectivos frente a células tumorales. El compuesto 63f presentó la mejor actividad inhibitoria con valores de Ki= 7.8 y 8.1 nM contra CA IX y XII, respectivamente (figura 4.14). Figura 4.14. Derivados cumarínicos con actividad sobre CAs.82 Por otro lado, se sintetizaron híbridos de cumarina-aminobenzoxazol como inhibidores potenciales de CA IX y CA XII, modificándose la naturaleza de los sustituyentes sobre la cumarina y el residuo de benzoxazol, así como la longitud del espaciador hidrocarbonado (figura 4.15). Todos los derivados presentaron actividad selectiva (rango nM) sobre las CAs IX y XII implicadas en procesos tumorales. También mostraron actividad antiproliferativa en el rango µM, siendo el compuesto 64e el que presentó mejor actividad, con un valor de GI50= 2.6 µM sobre células A549 (cáncer de pulmón). 83 83 . Fuentes-Aguilar A., Merino-Montiel P., Montiel‐Smith S., Meza‐Reyes S., Vega-Báez J.L., Puerta A., Fernandes M X., Padrón J M., Petreni A., Nocentini A., Supuran C.T., López Ó., Fernandez‐ Bolaños J.G. 2-Aminobenzoxazole-appended coumarins as potent and selective inhibitors of tumour-associated carbonic anhydrases. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2021, 37, 168‒177. Antecedentes 25 Figura 4.15. Ejemplo de híbridos cumarina-benzoxazole.83 Por otro lado, se han desarrollado derivados cumarínicos conjugados con triterpenos. Vega et al. 84 sintetizaron derivados del ácido maslínico sobre los hidroxilos en C-2 y C-3 y en el grupo ácido de C-28 con diferentes cumarinas comerciales, utilizando diaminas primarias de diferente longitud de cadena como grupo espaciador (figura 4.16). La finalidad era obtener sondas que funcionaran como marcadores de moléculas biológicas pequeñas, y a su vez evaluar la actividad citotóxica en varias líneas de células de cáncer y en células sanas. El derivado 66 presentó los mejores resultados citotóxicos, al poseer dos moléculas de ácido cumarino-3-carboxílico acoplado a los grupos hidroxilo en C-2 y C-3 del triterpeno, contra las líneas celulares B16-F10, HT29 y Hep G2 con una IC50= 0.6, 1.1 y 0.9 µM respectivamente; adicionalmente, mostraron una excelente selectividad manteniendo una viabilidad celular del 90% en células no tumorales a una dosis igual que su IC50 determinado para células de cáncer. 84 . Vega-Granados K., Medina-O’Donnell M., Rivas F., Reyes-Zurita F. J., Martinez A., Alvarez De Cienfuegos L., Lupiañez J. A., Parra, A. Synthesis and biological activity of triterpene−coumarin conjugates. J. Nat. Prod. 2021, 84, 1587–1597. Comp. R1 R2 R3 n a CH3 H H 3 b CH3 H H 5 c CH3 H H 6 d CH3 CH3 H 6 e CH3 Cl H 6 f Ph H H 6 g CH3 H CH3 5 h CH3 H Br 5 i CH3 H Ph 5 j CH3 H SO2NH2 5 Antecedentes 26 Figura 4.16. Conjugados ácido maslínico-cumarina sintetizados por Vega et al.84 4.1.3. Aspectos generales de los compuestos organoselénicos El selenio (Se) es un micronutriente esencial en el cuerpo humano y es obtenido a través de la dieta o de suplementos alimenticios. 85 La cantidad de selenio requerida para mantener una salud óptima es de 55 µg/día (0.7 µmol/día) en adultos; un consumo por debajo de 15 µg/día en la dieta podría ser un riesgo para el organismo, al igual que un consumo superior a los 400 µg/día puede ser causante de una intoxicación por Se denominada selenosis. 86 , 87 La ingesta de selenio es variable por área geográfica, ya que depende de factores como la cantidad de Se en tierras de cultivo y forraje, pH del suelo, contenido de materia orgánica y presencia de algunos iones que pueden formar complejos con el Se. Algunos efectos de la deficiencia de consumo de este elemento 85 . Tan H.W., Mo H.Y., Lau A.T.Y., Xu Y.M. Selenium species: Current status and potentials in cancer prevention and therapy. Int. J. Mol. Sci. 2018, 20, 75. 86 . Loscalzo J. Keshan disease, selenium deficiency, and the selenoproteome. N. Engl. J. Med. 2014, 370, 1756–1760. 87 . Sutter M.E.; Thomas J.D.; Brown J.; Morgan B. Selenium toxicity: a case of selenosis caused by a nutritional supplement. Ann. Intern. Med. 2008, 148, 970–971. Antecedentes 33 Recientemente se ha reportado la síntesis de derivados de selenocianatos esteroidales. Huang et al. 109 sintetizaron selenocianatos de estradiol y analizaron su actividad antiproliferativa frente a líneas celulares dependientes de hormonas (figura 4.21). Observaron que la introducción del grupo SeCN al esteroide le otorgó la probabilidad de inhibir el crecimiento de células tumorales, siendo el compuesto 75e (n=8) el que mostró mejor actividad sobre células HeLa (cáncer cervicouterino, IC50= 5.69 µM). Es de destacar, que conforme aumentaba la cadena del fragmento selenoalquílico también aumentó la actividad de los compuestos 75a‒75f, hasta los 8 carbonos. Figura 4.21. Metodología para la obtención de selenocianatos de estradiol.109 Huang et al. 110 sintetizaron selenocianatos a partir de la posición 17, 3 y 2 de la estrona, mediante la formación de amidas, ésteres, éteres u oximas. Evaluaron la actividad antiproliferativa sobre líneas de células tumorales, observando que el grupo selenocionato incrementó la actividad de la estrona, manteniéndose la actividad citotóxica hasta un total de 8 carbonos. Las amidas con el grupo SeCN en la posición 2 de la estrona fueron los que presentaron mejor actividad citotóxica seguidos de los ésteres. El compuesto 81a fue el que tuvo la actividad inhibitoria más potente (IC50=1 µM en células HepG2 y IC50=2.6 µM en células Sk-Ov-3) en comparación a abiraterona y 2-metoxiestradiol. Por otro lado, el compuesto 81c indujo apoptosis en células Sk-Ov-3 y el compuesto 77d presentó mejor actividad in vivo. 109 . Huang Y., Peng Z., Wei M., Gan C., Zhang Y., Chen S., Xiao J., Cui J. Synthesis and antiproliferative evaluation of some novel estradiol selenocyanates. Steroids, 2022, 181, 108992. 110 . Huang Y., Wei M., Peng Z., Cheng Y., Zhang Y., Li J., Xiao J., Gan C., Cui J. Synthesis of estrone selenocyanate Compounds, anti-tumor activity evaluation and structure-activity relationship analysis. Bioorg. Med. Chem. 2022, 76, 117086. Objetivos 34 Figura 4.22. Selenocianatos derivados de estrona. Adaptado de Huang et al.110 4.2. Objetivo general de sección Preparar híbridos de ácido oleanólico y 7-hidroxicumarinas sustituidas en C-3 y/o C-4 mediante esterificación de la posición C-28 del ácido oleanólico, así como híbridos ácido oleanólico-selenocianatos modificando tanto las posiciones C-3 como C-28 del triterpenoide, y analizar ambas familias como potenciales agentes antiproliferativos. 4.3. Objetivos particulares de sección Parte A: • Sintetizar 7-hidroxicumarinas a partir de resorcinol con tres diferentes β-ceto ésteres (2-cloroacetato de etilo, acetoacetato de etilo y benzoilacetato de etilo) mediante la condensación de Pechmann. • Realizar la mono-alquilación de cada 7-hidroxicumarina con diferentes dibromoalcanos (1,3-dibromopropano, 1,4-dibromobutano y 1,6- dibromohexano) en medio básico (K2CO3). • Preparar híbridos de ácido oleanólico-cumarina mediante la reacción de cada cumarina alquilada con ácido oleanólico en medio básico (K2CO3). Objetivos 35 • Evaluación de la actividad antiproliferativa (Capítulo 7). Parte B: • Realizar la mono-alquilación de ácido oleanólico con diferentes α,ωdibromoalcanos (1,3-dibromopropano, 1,4-dibromobutano, 1,5- dibromopentano, 1,6-dibromohexano y 1,9-dibromononano), así como α,α’- p-dibromoxileno en medio básico (K2CO3). • Sintetizar los selenocianatos a partir de ácido oleanólico alquilado mediante la sustitución con KSeCN. • Evaluar la actividad antiproliferativa in vitro de los diferentes selenocianatos sintetizados frente a líneas celulares de tumores sólidos humanos y realizar un análisis estructura-actividad. • Profundizar en el modo de acción del derivado cabeza de serie. • Evaluar la actividad antiproliferativa in vivo y selectividad de los derivados más potentes mediante el modelo de C. elegans. 4.4. Discusión de resultados 4.4.1. Híbridos ácido oleanólico-cumarinas En este capítulo se abordará la preparación de híbridos de ácido oleanólicocumarinas, que podría conducir a una sinergia de las actividades biológicas exhibidas por ambos tipos de farmacóforos; la estructura general de dichos híbridos se muestra en la figura 4.23. Ambos fragmentos pueden proporcionar actividad antiproliferativa, y en el caso de la cumarina, podría provenir de la inhibición de CAs, aromatasa, sulfatasa o telomerasa. Adicionalmente, la presencia de un espaciador hidrocarbonado podría modular las propiedades físico-químicas del híbrido. Discusión de resultados 36 Figura 4.23. Diseño de híbridos de ácido oleanólico-cumarina. La ruta de síntesis para la obtención de estos derivados se muestra en el esquema 4.1. Esquema 4.1. Ruta de síntesis de híbridos ácido oleanólico-cumarina. a) H2SO4 al 60%, 24h, t.a.; b) α,ω-Dibromoalcano, K2CO3, MeCN anhidro, 4h, 65°C; c) Ácido oleanólico, K2CO3, MeCN‒DMF anhidro (3:1), 24h, 65°C. Como se ha mencionado en la introducción, uno de los procedimientos más utilizados para la preparación de cumarinas es la reacción de Pechmann, la cual consiste en la condensación de fenoles, en este caso resorcinol comercial, con distintos β-cetoésteres en medio ácido (H2SO4 al 60%) como catalizador, para dar lugar a cumarinas sustituidas en las posiciones 3 y 4, y con un grupo hidroxilo Discusión de resultados 37 funcionalizable en la posición C-7. Las cumarinas se obtuvieron con un rendimiento moderado (55%‒65%) tras precipitación y purificación cromatográfica. Posteriormente, se llevó a cabo la alquilación de cada cumarina sobre el hidroxilo en la posición 7, con un exceso de diferentes α,ω-dibromoalcanos en medio básico (K2CO3) para la obtención de los compuestos 83‒85. Esta última es una reacción tipo Williamson para la obtención de éteres fenólicos a partir de un haluro de alquilo primario con un ion fenolato (nucleófilo) mediante un mecanismo SN2. 111 Finalmente, cada cumarina alquilada reaccionó con el ácido oleanólico en medio básico (K2CO3) para obtener el híbrido (1‒9) mediante una reacción SN2 del ion carboxilato sobre el grupo metileno terminal. Esta metodología sencilla permitió la obtención de 9 ésteres derivados de ácido oleanólico con rendimientos de moderados a excelentes (64%‒88%). Se observó que al aumentar ligeramente los equivalentes de base (de 1.0 a 1.5 equiv.) hubo una mejoría en los rendimientos. Los espectros de 1H- y 13C-RMN confirmaron las estructuras 1‒9. En la figura 4.24 se muestra, a modo de ejemplo, el espectro de 1H-RMN del compuesto 2. Destacan las señales en 5.27, 3.19 y 2.85 ppm correspondientes a H-12, H-3 y H- 18 del triterpenoide; los dos tripletes a 4.09 y 4.05 ppm se corresponden con los metilenos de las posiciones H-1’ y H-4’ de la cadena alquílica. La presencia del fragmento cumarínico se confirma mediante el patrón de señales que resuenan entre 7.51-6.80 ppm: un doblete a 7.51, con J5’’,6’’=8.9 Hz, asignada a H-5’’, un doble de dobles a 6.89 (J5’’,6’’=8.9 Hz, J8’’,6’’=2.4 Hz), correspondiente a H-6’’ y un doblete (J8’’,6’’=2.4 Hz), de H-8’’. Igualmente, en la figura 4.25 se observa a modo de ejemplo el espectro de 13C-RMN para el compuesto 2. Destacan las señales en 177.9 y 162.0 111 . Yearty K.L., Maynard R.K., Cortes C.N., Morrison, R. A multioutcome experiment for the Williamson ether synthesis. J. Chem. Educ. 2020, 97, 578‒581. Discusión de resultados 38 correspondientes a los grupos carbonilo del triterpenoide (C-28) y de la cumarina (C-2’’), respectivamente. El fragmento cumarínico se confirma por las señales entre 157.6-101.4 ppm, a excepción de las señales en 143.9 y 122.5 ppm que corresponden a C-13 y C-12 del triterpenoide, respectivamente. Con respecto a la cadena alquílica, se observan las señales en 68.2 y 63.7 ppm para los metilenos C- 1’ y C-4’ unidos a oxígeno. Figura 4.24. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 2. CH3 Cumarina Discusión de resultados 39 Figura 4.25. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 2. Otro ejemplo es el espectro de 1H-RMN del compuesto 8, el cual se muestra en la figura 4.26. Destaca el multiplete en 7.47 ppm correspondiente al grupo fenilo en C-4 de la cumarina, y una señal simple en 6.21 ppm que corresponde a H-3’’ de la cumarina. Por otro lado, en el espectro de 13C-RMN (figura 4.27) destacan las señales para el grupo fenilo en C-4 de la cumarina en 129.7 (Ar-Cipso), 128.9 (Ar- Cm), 128.5 (Ar-Co) y 128.1 (Ar-Cp) ppm. Discusión de resultados 40 Figura 4.26. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 8. Figura 4.27. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 8. Discusión de resultados 41 4.4.2. Derivados de selenio En esta sección abordamos la combinación del ácido oleanólico con una función organoselénica, en concreto, selenocianato, como potenciales agentes antiproliferativos, siguiendo la estructura general mostrada en la figura 4.27. Se pretende analizar la influencia de la sustitución en C-3 y C-28, la longitud y la libertad conformacional del espaciador, así como de la naturaleza del grupo sobre C-3 (R= H, Ac) en las propiedades biológicas exhibidas. Figura 4.28. Estructura general de los híbridos ácido oleanólico-selenocianato preparados en esta Tesis Doctoral. De esta forma, una primera aproximación para la obtención de selenocianatos del ácido oleanólico fue derivatizar la posición C-28 (ácido carboxílico), y emplear la posición C-3 tanto libre como acetilada; a tal efecto se emplearon cadenas alquílicas de diferente longitud como grupo espaciador. En un primer paso, se llevó a cabo la alquilación del ácido oleanólico y el ácido 3-O-acetiloleanólico en la posición C-28 empleando diversos α,ωdibromoalcanos (1,3-dibromopropano, 1,4-dibromobutano y 1,6-dibromohexano), en medio básico (K2CO3) para obtener los derivados 86‒91. Posteriormente, sobre el metileno terminal de la cadena alquílica se llevó a cabo una sustitución nucleofílica con KSeCN, realizada en condiciones anhidras y de oscuridad para la obtención de los selenoderivados 11‒16 (esquema 4.2). Discusión de resultados 42 Esquema 4.2. Ruta de síntesis para la obtención de selenocianatos de ácido oleanólico. Se obtuvieron así un total de 6 selenoderivados de ácido oleanólico (compuestos 11‒16) con rendimientos de buenos a excelentes (83‒91%). La caracterización espectroscópica se describe en la sección de metodología. Alternativamente, y con objeto de comparar ambas metodologías, también se evaluó la posibilidad de realizar la síntesis invirtiendo el orden de las tres etapas implicadas. Así pues, se procedió en primer lugar a la alquilación del ácido oleanólico empleando espaciadores de tipo p-fenileno, pentil y nonil (compuestos 10, 92, 93), seguido de desplazamiento nucleofílico con KSeCN (compuestos 17‒ 19) y, finalmente, acetilación (compuestos 20‒22), según lo indicado en el esquema 4.3. No se observaron diferencias significativas en el rendimiento global de las metodologías mostradas en los esquemas 4.2 y 4.3, por lo que ambas variantes son apropiadas para el acceso a los productos deseados. Discusión de resultados 49 Figura 4.36. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 22. Para los selenocianatos en C-3 del ácido oleanólico se siguió la ruta de síntesis del esquema 4.4. Como primer paso, se llevó a cabo la transformación del grupo ácido (C-28) en éster metílico mediante la alquilación con CH3I en medio básico (K2CO3) para obtener el 3β-hidroxiolean-28-oato de metilo (94) con rendimiento cuantitativo. Posteriormente, se realizó la esterificación en C-3 del ácido oleanólico con dos haluros de ácido comerciales de tamaño de cadena variable (cloruro de cloroacetilo y cloruro de 5-bromovalerilo) en medio básico (TEA) y utilizando DMAP como catalizador. Se obtuvieron así los compuestos 95 y 96 con buenos rendimientos (76 y 78%, respectivamente). Este paso fue difícil de monitorear por cromatografía en capa fina, lo que dificultó la purificación de los ésteres en C-3. Como tercer paso, sobre el metileno terminal se llevó a cabo una sustitución nucleofílica con KSeCN, en condiciones C-Ar OCH2Ar CH3COO Discusión de resultados 50 anhidras y de oscuridad para la obtención de los selenoderivados 23 y 24, con rendimientos del 70 y 64%, respectivamente. Esquema 4.4. Ruta de síntesis para la obtención de selenocianatos en C-3 de ácido oleanólico. A modo de ejemplo, se muestran las señales características de RMN para el compuesto 24. En 1H-RMN se observaron como señales representativas las de 5.28, 4.51 y 2.85 ppm del H-12, H-3 y H-18 del triterpenoide; a 3.62 ppm se observa la señal del metoxilo, mientras que a 3.06 y 2.37 ppm resuenan los protones en 2’ y 5’ de la cadena alquílica (figura 4.37). En 13C-RMN destaca la señal del carbonilo del éster en C-3 (172.8 ppm) y la señal de selenocianato en 101.4 ppm (figura 4.38), que confirman la esterificación del hidroxilo en C-3 del OA. Discusión de resultados 51 Figura 4.37. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 24. Figura 4.38. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 24. CH3O Antecedentes 52 5. Derivados mitocondriotrópicos 5.1. Introducción 5.1.1. Papel de la mitocondria en el cáncer Las mitocondrias son el principal orgánulo en la célula eucariota, cuya función principal es la producción de energía, controlar el metabolismo de carbohidratos, la regulación de la transducción de señales y la muerte celular. Estos orgánulos presentan un diámetro y longitud variable entre 0.5 a 1.0 µm, 113 , 114 y además se caracterizan por poseer una doble membrana, siendo este aspecto estructural fundamental en el diseño de los compuestos abarcados en esta sección. Las mitocondrias están conformadas por cuatro compartimentos: la membrana mitocondrial externa (OMM), el espacio intermembrana (IMS), membrana mitocondrial interna (IMM) y la matriz mitocondrial. La caracterización de este orgánulo cerrado por una doble membrana se estableció por Palade y Sjöstrand en el año 1950. Este orgánulo presenta una variabilidad estructural dependiendo del tejido, el estado fisiológico y la etapa de desarrollo, pero algunas variaciones pueden relacionarse a ciertos padecimientos en humanos. 115 , 116 Un papel importante de la mitocondria es el de almacén de cationes calcio (Ca2+), siendo la membrana mitocondrial externa permeable a estos. 117 La transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) es un aumento instantáneo de la permeabilidad hacia el espacio intermembrana a moléculas menores a los 1500 Da. 113 . Roy S., Das A., Bairagi A., Das D., Jha A., Srivastava A.K., Chatterjee N. Mitochondria act as a key regulatory factor in cancer progression: Current concepts on mutations, mitochondrial dynamics, and therapeutic approach. Mutat. Res. Rev. Mutat. Res. 2024, 793, 108490. 114 . Liu P., Ho P. Mitochondria: A master regulator in macrophage and T cell immunity. Mitochondrion, 2018, 41, 45‒50. 115 . Zick M., Rabl R., Reichert A.S. Cristae formation-linking ultrastructure and function of mitochondria. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2009, 1793, 5‒19. 116 . Wang Z., Guo W., Kuang X., Hou S., Liu, H. Nanopreparations for mitochondria targeting drug delivery system: Current strategies and future prospective. Asian J. Pharm. Sci. 2017, 12, 498‒ 508. 117 . Bagur R., Hajnóczky G. Intracellular Ca2+ sensing: its role in calcium homeostasis and signaling. Mol. Cell. 2017, 66, 780–788. Antecedentes 53 La apertura de MPT se da por ciertos estímulos causados por especies reactivas de oxígeno, aumentos de niveles de Ca2+, estrés del RE, ácidos grasos o presencia de fosfato inorgánico. Sin embargo, la apertura a largo plazo del MPT es perjudicial y puede llevar a la muerte celular, mediante la liberación de citocromo c y activación de caspasas (familia de las BCL-2) que dan lugar a la apoptosis. 118 , 119 La membrana interna se caracteriza por plegarse hacia dentro y formar crestas, lo que le da mayor superficie y es donde se lleva a cabo principalmente la producción de ATP. El ATP es la fuente de energía celular y se transporta dentro de las células en procesos metabólicos como la fosforilación oxidativa (OxPhos) o la glucólisis. En este mismo espacio se encuentra también la cadena de transporte de electrones, donde participa principalmente la ATP sintasa, la cual es responsable de producir ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. 120 Todos estos procesos metabólicos son importantes para la supervivencia celular. El espacio intermembrana (IMS) es el menor de los compartimentos de la mitocondria y juega un papel fundamental en el transporte y modificación de proteínas, lípidos e iones metálicos, además en la regulación y montaje de los complejos de la cadena respiratoria. El IMS también está involucrado en la coordinación de los pasos claves de la muerte celular por apoptosis. 121 El espacio intermembrana proporciona un espacio activo redox que promueve la oxidación de residuos de cisteína con un potencial de membrana (ΔΨm) de ‒220 118 . Kalkavan H., Green D.R. MOMP, cell suicide as a BCL-2 family business. Cell Death Differ. 2017, 25, 46–55. 119 . Galluzzi L., Vitale I., Aaronson S.A., Abrams J., Adam D., Agostinis P., Alnemri E.S., Altucci L., Amelio I., Andrews D.W., Annicchiarico-Petruzzelli M., Antonov A.V., Arama E., Baehrecke E.H., Barlev N.A., Bazán N.G., Bernassola F., Bertrand M., Bianchi K., Manic G. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018, 25, 486‒541. 120 . Lu P., Bruno B., Rabenau M., Lim C.S. Delivery of drugs and macromolecules to the mitochondria for cancer therapy. J. Control. Release, 2016, 240, 38‒51. 121 . Vögtle F., Burkhart J.M., Rao S.R., Gerbeth C., Hinrichs J., Martinou J., Chacińska A., Sickmann A., Zahedi R.P., Meisinger C. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Mol. Cell. Proteom. 2012, 11, 1840‒1852. Antecedentes 54 mV en células cancerígenas y de ‒108 a ‒180 mV en una célula normal debido a que la ATP sintasa está regulada negativamente por su unidad alfa mutada, lo que provoca incapacidad para utilizar el gradiente de protones formado, conllevando a su acumulación en el espacio intermembrana. 122 Para la síntesis de ATP se requiere un gradiente electroquímico (de protones) entre IMS y la matriz mitocondrial para el correcto funcionamiento de la ATP sintasa, lo que hace que la membrana interna mitocondrial este altamente polarizada negativamente, y que lleva a concentraciones de protones más altas (mayor acidez) en el espacio intermembrana con respecto a la matriz mitocondrial, causando mayor potencial de membrana en una célula cancerosa que en una célula normal. 123 Figura 5.1. Funciones biológicas de la mitocondria. Abreviaturas: AAA, proteasas dependientes de ATP de la membrana interna; E3, ubiquitina-proteína ligasa; RE, retículo endoplásmico; ADNmt, ADN mitocondrial; ATC, ciclo del ácido tricarboxílico; Ub, ubiquitina. Adaptado de Pfanner y col. 124 122 . Nuebel E., Manganas P., Tokatlidis K. Orphan proteins of unknown function in the mitochondrial intermembrane space proteome: New pathways and metabolic cross-talk. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2016, 1863, 2613‒2623. 123 . Zorova L.D., Popkov V.A., Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Pevzner I.B., Jankauskas, S. S., Babenko, V. A., Zorov, S. D., Balakireva, A. V., Juhaszova, M., Sollott, S. J., Zorov D.B. Mitochondrial membrane potential. Anal. Biochem. 2018, 552, 50‒59. 124 . Pfanner N., Warscheid B., Wiedemann N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2019, 20, 267‒284. Antecedentes 55 La matriz mitocondrial contiene hasta 10 000 unidades de ADN mitocondrial (ADNmt), con estructura de doble hélice cíclica, y un tamaño de 16.6 kb. Tiene, a su vez, enzimas y cofactores implicados en una serie de reacciones y vías metabólicas, incluido el ciclo del ácido tricarboxilico (ATC), la fosforilación oxidativa, la degradación de ácidos grasos, el ciclo de la urea y la gluconeogénesis. 125 Se estima que, entre el 0.2‒2.0% del oxígeno consumido por la mitocondria en la cadena respiratoria, se reduce hasta anión superóxido y otras especies reactivas del oxígeno (ROS), como el peróxido de hidrógeno. De hecho, las mitocondrias son responsables de la generación de aproximadamente un 90% de los ROS celulares. 126 Los ROS liberados por las mitocondrias provocan la oxidación de lípidos y proteínas, daño al ADNmt/ARNmt, la activación de los canales dependientes de Ca2+, así como la activación y liberación del citocromo c. Lo anterior conlleva a la formación del apoptosoma, complejo multiproteico que inicia el proceso de la muerte celular por apoptosis. 127 Es por lo anterior que las mutaciones genéticas de proteínas mitocondriales y estrés oxidativo causan disfunciones en la mitocondria que están relacionadas con padecimientos como el cáncer, diabetes, enfermedades neurodegenerativas e insuficiencia cardíaca.116, 128 En una célula normal, el superóxido generado en la fosforilación oxidativa se convierte a peróxido de hidrógeno mediante el superóxido dismutasa (SOD) y es 125 . Singh B., Modica-Napolitano J.S., Singh, K.K. Defining the momiome: Promiscuous information transfer by mobile mitochondria and the mitochondrial genome. Semin. Cancer Biol. 2017, 47, 1‒ 17. 126 . Tirichen H., Yaigoub H., Xu W., Wu C., Li R., Li Y. Mitochondrial reactive oxygen species and their contribution in chronic kidney disease progression through oxidative stress. Front. Physiol. 2021, 12, 627837. 127 . Dong L., Neužil J. Targeting mitochondria as an anticancer strategy. Cancer Commun. 2019, 39, 1‒3. 128 . Porporato P.E., Filigheddu N., Pedro J.M.B., Kroemer G., Galluzzi L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Res. 2017, 28, 265‒280. Antecedentes 56 eliminado como agua por acción de la peroxidasa. 129 Los niveles de ROS en una célula cancerígena son hasta 5000 veces más altos (~0.1 mM) con respecto a una célula normal (~20 nM). Es por ello que se postula que el control de ROS podría constituir un objetivo interesante en el diseño de fármacos anticancerígenos. 130 No obstante, existe aún bastante controversia en el tipo de compuestos que se deberían utilizar para combatir el desequilibrio entre los niveles de ROS y el sistema antioxidante en cáncer, ya que se pueden emplear agentes antioxidantes (reducción de los niveles de ROS) o agentes pro-oxidantes (incremento de los niveles de ROS para generar muerte celular probablemente por apoptosis). 131 La importancia de las mitocondrias en el cáncer radica en su participación en la tumorigénesis, la progresión y resistencia terapéutica, debido a que el metabolismo mitocondrial se ve alterado, lo que favorece su rápida proliferación al tener mayor suministro energético y de otros precursores biosintéticos. 132 En una célula normal el ATP es producido mediante la fosforilación oxidativa, sin embargo, cuando se transforma a una célula cancerosa por agentes como la radiación, carcinógenos, oncogenes u oncoproteínas, la célula cambia su mecanismo de producción preferente de ATP mediante glucólisis. Como consecuencia, el piruvato formado se convierte a lactato y se libera extracelularmente, por lo que el pH extracelular se torna ácido (pHe=6.2-6.9), mientras que el pH intracelular se torna alcalino (pHi=7.12-7.65). El pH alcalino en la matriz mitocondrial podría ayudar a mejorar la solubilidad de fármacos débilmente 129 . Oyewole A.O., Birch‐Machin M.A. Mitochondria‐targeted antioxidants. FASEB J. 2015, 29, 4766‒4771. 130 . Weinberg F., Chandel N.S. Mitochondrial metabolism and cancer. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2009, 1177, 66‒73. 131 . Kim S.J., Kim H.S., Seo Y.R. Understanding of ROS-inducing strategy in anticancer therapy. Oxid. Med. Cell. Longev. 2019, 2019, 1‒12. 132 . Singh D. A sojourn on mitochondria targeted drug delivery systems for cancer: Strategies, clinical and future prospects. Mitochondrion, 2024, 74, 101826. Antecedentes 57 ácidos o acoplados a nanopartículas, lo que podría mejorar su afinidad hacia este tipo de células como tratamiento del cáncer. 133 ‒ 135 Otro factor importante para la mitocondria es el oxígeno, ya que funciona como aceptor de electrones durante la síntesis de ATP, consumiéndose cerca del 85‒90% de oxígeno intracelular. 136 En una célula cancerosa, el nivel de oxígeno intracelular es menor por el ambiente hipóxico de los tumores, pero el oxígeno mitocondrial presenta mayores niveles a comparación de una célula normal.135, 137 Debido a que la síntesis de ATP es menor en mitocondrias cancerosas, el oxígeno es empleado en su mayoría para la producción de ROS lo que causa, entre otros efectos, un mayor daño al ADN, favoreciendo la tumorigénesis. 138 133 . Shirmanova M V., Druzhkova I., Lukina M.M., Matlashov M.E., Belousov V.V., Snopova L.B., Prodanetz N.N., Dudenkova V.V., Lukyanov S., Zagaynova E.V. Intracellular pH imaging in cancer cells in vitro and tumors in vivo using the new genetically encoded sensor SypHer2. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 2015, 1850, 1905‒1911. 134 . Perry S.W., Norman J.P., Barbieri J., Brown E.B., Gelbard H.A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 2011, 50, 98‒ 115. 135 . Cho H., Cho Y., Shim M.S., Lee J.Y., Lee H.S., Kang H.C. Mitochondria-targeted drug delivery in cancers. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2020, 1866, 165808. 136 . Kurokawa H., Ito H., Inoue M., Tabata K., Sato Y., Yamagata K., Kizaka‐Kondoh S., Kadonosono T., Yano S., Inoue M., Kamachi T. High resolution imaging of intracellular oxygen concentration by phosphorescence lifetime. Sci. Rep. 2015, 5, 10657. 137 . Kueh H.Y., Niethammer P., Mitchison T.J. Maintenance of mitochondrial oxygen homeostasis by cosubstrate compensation. Biophys. J. 2013, 104, 1338‒1348. 138 . Moreno A.C.R., Olean‐Oliveira A., Olean-Oliveira T., Nunes M.T., Teixeira M.F., Seraphim P.M. Resistance training prevents damage to the mitochondrial function of the skeletal muscle of rats exposed to secondary cigarette smoke. Life Sci. 2022, 309, 121017. Antecedentes 58 Figura 5.2. Diferencias estructurales en la membrana mitocondrial en una célula normal y una célula cancerosa. Adaptado de Cho et al.135 En este sentido, un objetivo terapéutico contra el cáncer que ha generado un interés creciente en el seno de la comunidad científica en los últimos años es el diseño de moléculas con especificidad hacia la mitocondria de la célula cancerosa para reducir efectos secundarios producidos en la quimioterapia por su acción hacia otros compartimentos celulares. Sin embargo, lograr esta especificidad es complicado debido a la heterogeneidad tumoral, que causa también diferencias en las propiedades mitocondriales de células cancerosas con respecto a una célula Antecedentes 65 El derivado F-16 ha sido recientemente descubierto y se acumula selectivamente en la matriz mitocondrial de células tumorales. Altas concentraciones de este catión inducen la muerte celular mediante la interrupción de la cadena respiratoria, disminución de los niveles intracelulares de ATP e inducción de la apoptosis. 151 , 152 El análogo derivado de rodacianina MKT-077 es un catión lipófilo soluble en agua y presenta la capacidad de inhibir miembros de la familia HSP70 mitocondrial (Heat Shock Protein, proteína sobreexpresada en situación de estrés celular) lo que provoca la desestabilización de la membrana mitocondrial; sin embargo, algunos estudios clínicos de derivados de MKT-077 han mostrado toxicidad renal, 153 , 154 lo que reduce su posibilidad de aplicación clínica. Uno de los cationes lipófilos más utilizados es el trifenilfosfonio (TPP+), el cual presenta una carga positiva estabilizada por la presencia de tres grupos fenilo, y normalmente se acopla a moléculas bioactivas mediante un conector alifático. 155 , 156 Fue implementado por primera vez por Murphy et al. mediante la síntesis de 151 . Peng Y., Zha, Z L., L, T., Xi, G J., Chen, J., Den, T.G., Sun Y., Li X., Hu X., Zhang X.B., Ye M., Tan W.A Multi‐mitochondrial anticancer agent that selectively kills cancer cells and overcomes drug resistance. Chem. Med. Chem. 2017, 12, 250‒256. 152 . Spivak A.Y., Nedopekina D.A., Gubaidullin R.R., Davletshin E., Tukhbatullin A.A., D’yakonov V. A., Yunusbaeva M.M., Dzhemileva L.U., Dzhemilev U.M. Pentacyclic triterpene acid conjugated with mitochondria-targeting cation F16: Synthesis and evaluation of cytotoxic activities. Med. Chem. Res. 2021, 30, 940‒951. 153 . Hong S., Starenki D., Johnson O.T., Gestwicki J.E., Park J.I. Analogs of the heat shock protein 70 inhibitor MKT-077 suppress medullary thyroid carcinoma cells. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 1063‒ 1076. 154 . Shao H., Li X., Moses M.A., Gilbert L.A., Kalyanaraman C., Young Z.T., Chernova M., Journey S. N., Weissman J.S., Hann B., Jacobson M.P., Neckers L., Gestwicki J.E. Exploration of benzothiazole rhodacyanines as allosteric inhibitors of protein–protein interactions with heat shock protein 70 (Hsp70). J. Med. Chem. 2018, 61, 6163‒6177. 155 . Chen Z., Li M., Zhang L., He J., Wu L., Xiao Y., Duan J., Cai T., Li W. Mitochondria-targeted drug delivery system for cancer treatment. J. Drug Target. 2015, 24, 492‒502. 156 . Zinovkin R.A., Zamyatnin A.A. Mitochondria-targeted drugs. Curr. Mol. Pharmacol. 2019, 12, 202‒214. Antecedentes 66 bromuro de tiobutiltrifenilfosfonio. 157 El acoplamiento de TPP a moléculas bioactivas tiene como ventaja la vectorización de estos derivados hacia la mitocondria, mejorar sus propiedades lipofílicas e hidrofílicas y una síntesis y purificación sencillas.144 Los derivados de TPP tienen tendencia a unirse a biomembranas, como consecuencia de su carga y lipofilicidad. De esta forma, la fracción cargada tiende a asociarse a la cabeza de los fosfolípidos, cargadas negativamente, y si el resto de la molécula es lipófila puede acumularse en el espacio intermembrana y en la matriz. 158 De esta forma, el principal mecanismo de acción de TPP es mediante su acumulación en la mitocondria de células cancerosas, aumentando la generación de ROS, induciendo la muerte celular por apoptosis. 159 5.1.2.2. Péptidos mitocondriotrópicos Comparado con los cationes lipofílicos, los péptidos presentan un gran potencial para el diseño de agentes mitocondriotrópicos debido a la biocompatibilidad con los componentes celulares, lo que disminuye su toxicidad. Los péptidos de penetración mitocondrial (MPPs) están conformados por 4‒16 aminoácidos, que contienen un resto catiónico (arginina, lisina) y un resto hidrofóbico (fenilalanina, tirosina e isoleucina) y su efectividad para dirigirse hacia la mitocondria dependerá del potencial de membrana y su lipofilicidad y han funcionado como una poderosa herramienta para el diseño de moléculas antineoplásicas (figura 5.6).145, 160 157 . Burns R.J., Smith R A., Murphy M. Synthesis and characterization of thiobutyltriphenylphosphonium bromide, a novel thiol reagent targeted to the mitochondrial matrix. Arch. Biochem. Biophys. 1995, 322, 60‒68. 158 . Szabó I., Zoratti M., Biasutto L. Targeting mitochondrial ion channels for cancer therapy. Redox Biol. 2021, 42, 101846. 159 . Neužil J., Dong L., Rohlena J., Truksa J., Ralph S.J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion, 2013, 13, 199‒208. 160 . Wu J., Li J., Wang H., Liu, C. Mitochondrial-targeted penetrating peptide delivery for cancer therapy. Expert Opin. Drug Deliv. 2018, 15, 951‒964. Antecedentes 67 Figura 5.6. Optimización para el diseño de péptidos penetrantes de células (CPP) y de mitocondrias (MPP). Abreviaturas: Fx, ciclohexilalanina; hex, hexilo; r, D-arginina; OMM; membrana mitocondrial externa; IMS, espacio intermembrana; IMM, membrana mitocondrial interna. Imagen tomada de Jean et al. 161 Una clase de péptido mitocondriotrópico son los denominados Szeto-Schiller (SS). Estos están formados por aminoácidos aromáticos y básicos alternados (10 aminoácidos de carga +3 y un D-aminoácido en la primera y segunda posición). 162 Su mecanismo de acción es la reducción de la producción de ROS, alteración de la permeabilidad mitocondrial y subsecuente liberación del citocromo c.156, 163 La función antioxidante la lleva a cabo el residuo de tirosina o dimetiltirosina. A diferencia de los cationes lipófilos, estos péptidos ingresan a la célula independientemente de la energía y libremente a pH fisiológico. Se cree que su ingreso a la mitocondria tiene lugar como consecuencia de las interacciones electrostáticas con los grupos fosfato de las cardiolipinas en la membrana interna mitocondrial. 164 , 165 161 . Jean S.R., Ahmed M., Lei E.K., Wisnovsky S., Kelley S. O. Peptide-mediated delivery of chemical probes and therapeutics to mitochondria. Acc. Chem. Res. 2016, 49, 1893‒1902. 162 . Szeto, H.H. Development of Mitochondria‐targeted Aromatic‐cationic peptides for neurodegenerative diseases. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2008, 1147, 112‒121. 163 . Szeto, H. H., Liu, S. Cardiolipin-targeted peptides rejuvenate mitochondrial function, remodel mitochondria, and promote tissue regeneration during aging. Arch. Biochem. Biophys. 2018, 660, 137‒148. 164 . Szeto H.H. First‐in‐class cardiolipin‐protective compound as a therapeutic agent to restore mitochondrial bioenergetics. Br. J. Pharmacol. 2014, 171, 2029‒2050. 165 . Gasanoff E.S., Yaguzhinsky L.S., Garab, G. Cardiolipin, non-bilayer structures and mitochondrial bioenergetics: relevance to cardiovascular disease. Cells, 2021, 10, 1721‒1745. Antecedentes 68 5.1.2.3. Nanopartículas y liposomas El uso de nanoportadores ha permitido la vehículización de moléculas bioactivas a sitios específicos para mejorar su eficacia y evitar el riesgo de toxicidad. Destacan nanoportadores basados en micelas, polímeros, materiales a base de carbono, liposomas, nanopartículas metálicas y dendrímeros (figura 5.7), principalmente con un enfoque quimioterapéutico. 166 Un nanoportador se encuentra en un rango de 10 a 200 nm de diámetro, lo que les permite el fácil acceso a diferentes tejidos, y específicamente para direccionarse a la mitocondria se conjugan con diferentes ligandos catiónicos, siendo los más empleados el TPP y DQA. Estas nanopartículas permiten mejorar problemas de solubilidad, selectividad y quimiorresistencia, permitiendo su acumulación dentro de la mitocondria. 167 Algunos de los mecanismos de acción de derivados de nanopartículas es la destrucción de células cancerosas selectivamente mediante la generación de ROS, alteración del potencial de membrana mitocondrial y el bloqueo de la síntesis de ATP.127 Por otro lado, los liposomas mitocondriotrópicos (MITO-porter) se diseñaron como portadores eficientes de moléculas pequeñas o macromoléculas hacia la mitocondria. Su especificidad es debida a la presencia de cargas positivas deslocalizadas en los liposomas, principalmente derivados de DQA y TPP, 168 y son capaces de liberar moléculas bioactivas de diferentes tamaños y diferentes características químicas y fisicoquímicas, lo que aumenta su capacidad de 166 . Zeng Z., Fang C., Zhang Y., Chen C., Zhang Y., Zhang, K. Mitochondria-targeted nanocarriers promote highly efficient cancer therapy: A review. Front. Bioeng. Biotechnol. 2021, 9, 784602. 167 . Tabish T.A., Narayan R.J. Mitochondria-targeted graphene for advanced cancer therapeutics. Acta Biomater. 2021, 129, 43‒56. 168 . Benien P., Almuteri M., Shah S., Böhlke M., Mehanna A.S., D’Souza G.G.M. Synthesis of triphenylphosphonium phospholipid conjugates for the preparation of mitochondriotropic liposomes. En Methods in molecular biology-Mitochondrial Medicine (Eds. Weissig V., Edeas M.), 2015, Vol. 2, pp. 51‒57. Antecedentes 69 transportar agentes a la mitocondria, y son una buena alternativa para el tratamiento del cáncer.144,145, 169 Figura 5.7. Estructuras para el diseño de nanoportadores mitocondriales. Adaptado de Liew et al. 170 Abreviaturas: PLGA, poli(ácido láctico-glicólico); PDA: poli(dopamina); PDMAEMA: poli[2- (Dimetilamino) etil metaclitalo]; PMMA: poli(Metil metacrilato); PGA: poli(Ácido glicólico); PGE: poli(etilenglicol); PCL, Policaprolactona; STTP: Estearil-TPP; DLPE-TPP, 1,2-Dilauroil-sn-glicero-3- fosforiletanolamina-TPP. 5.1.3. Ejemplos de agentes mitocondriotrópicos con actividad antiproliferativa Méndez y col. 171 diseñaron diferentes o-carbonilhidroquinonas bicíclicas conectadas a un catión de trifenilfosfonio mediante una cadena alquílica corta (figura 5.8), con la finalidad de evaluar su efecto antiplaquetario evitando la formación de coágulos, y mejorando de esta manera la salud cardiovascular. El derivado 104 fue el que mostró mejor efecto antiplaquetario y baja citotoxicidad a dosis de 10-100 µM 169 . Benien P., Solomon M., Nguyen P., Sheehan E.M., Mehanna A.S., D’Souza G.G.M. Hydrophobized triphenyl phosphonium derivatives for the preparation of mitochondriotropic liposomes: choice of hydrophobic anchor influences cytotoxicity but not mitochondriotropic effect. J. Liposome Res. 2015, 26, 21‒27. 170 . Liew S.S., Qin X., Zhou J., Li L., Huang W., Yao S Q. Smart design of nanomaterials for mitochondria‐targeted nanotherapeutics. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 2232‒2256. 171 . Méndez D., Tellería F., Monroy-Cárdenas M., Montecino-Garrido H., Mansilla S., Castro L., Trostchansky A., Muñoz-Córdova F., Zickermann V., Schiller J., Alfaro S., Caballero J., Araya‐ Maturana R., Fuentes E. Linking triphenylphosphonium cation to a bicyclic hydroquinone improves their antiplatelet effect via the regulation of mitochondrial function. Redox Biol. 2024, 72, 103142. Antecedentes 70 en plaquetas, al dirigirse y acumularse correctamente a la mitocondria gracias a la unión con el catión TPP+. El mecanismo de acción propuesto fue la actividad a nivel de OxPhos, alterando la producción de ROS mitocondrial. Figura 5.8. Derivados de hidroquinonas bicíclicas y sus sales de fosfonio.171 a) BF3·2H2O, 140 °C, 30 min; b) Ag2O, CH2Cl2, 4-(2-metil-1-propenil)-morfolina; c) HCl, EtOH, reflujo; d) PPh3, MeCN, 130 °C, 30 min; e) CH3I, K2CO3, acetona; f) PPh3, MeCN, 130 °C, 30 min. El ácido glicirretínico (figura 5.9) ha sido estudiado por su actividad antitumoral; sin embargo, presenta la desventaja de poseer una pobre biodisponibilidad por su reducida solubilidad en agua. Jin y col. 172 sintetizaron derivados a partir del triterpenoide funcionalizando la posición C-3 o C-30 con TPP+ y cadenas alquílicas de diferente longitud a modo de espaciadores, con la finalidad de biodirigirlo a la mitocondria. Así mismo, evaluaron su actividad citotóxica en 172 . Jin L., Dai L., Ji M., Wang H. Mitochondria-targeted triphenylphosphonium conjugated glycyrrhetinic acid derivatives as potent anticancer drugs. Bioorg. Chem. 2019, 85, 179‒190. Antecedentes 71 diferentes líneas celulares, tanto tumorales como no tumorales, para comparar su selectividad gracias al acoplamiento del catión lipófilo. Los derivados mostraron un incremento en su actividad citotóxica con respecto al ácido glicirretínico sin funcionalizar. El derivado 111b mostró buena citotoxicidad sobre líneas de cáncer (IC50=5.25‒9.22 µM) y bajos valores de citotoxicidad en células normales de hígado HL-7702 (IC50=68.22 µM), además de inducir la producción de ROS que podría conllevar a la muerte celular por apoptosis (figura 5.9). Figura 5.9. Derivados del ácido glicirrétinico-TPP funcionalizados en C-3 y C-30.172 Antecedentes 72 Con la finalidad de inhibir la enzima colina quinasa α1, como una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer, Rubinni et al., 173 sintetizaron una nueva clase de derivados piridinio/quinolinio asimétricos (figura 5.10). La actividad antiproliferativa fue evaluada frente a un panel de 6 líneas celulares: carcinoma de cérvix (HeLa), células T de leucemia (Jurkat), carcinoma alveolar (A549), células de leucemia promielocítica (HL-60), adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231) y carcinoma de colon (HT-29). Todos los derivados presentaron actividad antiproliferativa, que osciló el rango nanomolar y el micromolar bajo. Los derivados 117‒121 presentaron la mejor actividad antiproliferativa; entre ellos destaca el compuesto 119, con valores de GI50 en el rango 0.05 a 0.90 µM para las líneas en las que fue evaluado. Los compuestos 120 y 121, dos de los más potentes de la serie, fueron evaluados frente a linfocitos periféricos de la sangre, mostrando una actividad claramente inferior con respecto a la observada en las células tumorales (GI50=10 y 5.1 µM, respectivamente). No obstante, en presencia de fitohemaglutinina, un estímulo mitogénico, dicho valor de GI50 bajó hasta 1.5 µM, indicando que su acción depende de la velocidad de crecimiento celular. Por otro lado, el derivado 121 fue el que presentó mejor actividad inhibitoria sobre la colina quinasa (IC50=0.29 µM). En base a lo anterior, concluyeron que la adición de dos cabezas catiónicas mejora la actividad antiproliferativa y de inhibición enzimática, con el beneficio de una baja citotoxicidad hacia células sanas. 173 . Rubbini G., Buades A.B., Kimatrai-Salvador M., Entrena A., Gallo-Mezo M.Á., Ríos-Marco P., Marco C., Mattiuzzo E., Bortolozzi R., Mariotto E., Greco F., Macchiarulo A., Carrasco-Jiménez M. P., Viola G., Cara C.L. Lead optimization-hit expansion of new asymmetrical pyridinium/quinolinium compounds as choline kinase α1 inhibitors. Future Med. Chem. 2018, 10, 1769‒1786. Antecedentes 73 Figura 5.10. Derivados asimétricos piridinio/quinolinio. a) t.a., butanona, 72 h; b) 140 °C (Reflujo), MeCN, P > 1 atm, 72 h.173 Otro catión lipófilo utilizado como vector mitocondrial es la rodamina B 133. Kraft y col. sintetizaron como agentes citotóxicos híbridos del triterpenoide ácido asiático con el catión lipofílico rodamina B y fueron evaluados en diferentes líneas celulares de tumores sólidos, así como su selectividad con fibroblastos no malignos (figura 5.11). Observaron que la adición de un grupo espaciador en el carboxilo del anillo E del triterpenoide permitió modular su actividad, donde los derivados 131a, 131b y 133 presentaron valores similares de citotoxicidad, pero la adición de la rodamina aumentó considerablemente su citotoxicidad y selectividad hacia líneas celulares de cáncer. El derivado 132b fue el que presentó la mejor actividad inhibitoria (EC50=0.8 nM) en células A2780 (cáncer de ovario). Por su parte, el análisis de función mitocondrial demostró el efecto de 132b sobre el metabolismo Antecedentes 74 energético como principal mecanismo de acción observándose una disminución casi total en los niveles de producción de ATP. 174 Figura 5.11. Híbrido ácido asiático-Rodamina B.174 Battula et al. diseñaron tres amidas derivadas de rodamina B. El grupo carboxilo fue funcionalizado con aminas secundarias, para dar lugar a las amidas correspondientes (figura 5.12). Evaluaron la viabilidad celular en diferentes líneas de células tumorales y obtuvieron valores de IC50 en el rango de 14 a 61 µM en células A549, B16F10 y MDA-MB-231, donde la amida 134 fue la que presentó mejor efecto sobre la línea A549 (IC50=14.86 µM). Los derivados presentaron 174 . Kraft O., Hartmann A., Brandt S., Hoenke S., Heise N.V., Csuk R., Mueller T. Asiatic acid as a leading structure for derivatives combining sub-nanomolar cytotoxicity, high selectivity, and the ability to overcome drug resistance in human preclinical tumor models. Eur. J. Med. Chem. 2023, 250, 115189. Discusión de resultados 81 Esquema 5.5. Ruta de síntesis de tioureas derivadas de piridinio, quinolinio y N-metilimidazolio. Con respecto a la rodamina B, se intentó llevar a cabo la conexión mediante enlace de tipo amida con el p-aminofenol O-alquilado 141a, empleando para ellos una reacción tipo Schotten-Baumann; ésta consiste en la reacción de una amina con un haluro de ácido para la obtención de amidas. Como primer paso, se hizo reaccionar rodamina B con SOCl2 y al finalizar se concentró a sequedad para dar lugar al haluro de ácido 149. Este último se hizo reaccionar con la amina 141a en medio básico (DIPEA) durante 72 h para dar lugar a 150, que fue obtenido en cantidades de traza tras purificación cromatográfica (4%). Alternativamente, se optó por la reacción de rodamina B con un agente acoplante (EDC•HCl) en medio básico (DIPEA) y en presencia de cantidades catalíticas de DMAP. Con esta metodología se obtuvo a 150 con un rendimiento moderado (35%) (esquema 5.6), pero sensiblemente superior al obtenido mediante la reacción de Schotten-Baumann. Discusión de resultados 82 Esquema 5.6. Ruta de síntesis para la preparación de amida a partir de rodamina B. Una vez sintetizadas las tioureas 147a‒d, 148a‒c y la amida de rodamina 150 se llevó a cabo la obtención de selenocianatos, mediante una reacción de sustitución nucleofílica sobre el fragmento bromoalquílico con KSeCN. Los híbridos selenocianatos-cationes lipofílicos 25‒28 se obtuvieron con rendimientos moderados (13‒56%, esquemas 5.7 y 5.8). Esquema 5.7. Ruta de síntesis para la obtención de selenocianatos mitocondriotrópicos de trifenilfosfonio. A modo de ejemplo se muestra en la figura 5.15 el espectro de 1H-RMN de 25. Destacan las señales en 7.80 ppm de los protones del trifenilfosfonio, los multipletes en 7.31 y 6.87 ppm de los H del fragmento p-aminofenol y las señales en el rango 2.10‒4.12 ppm, correspondientes a las cadenas alquílicas. Discusión de resultados 83 Figura 5.15. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 25. En la figura 5.16 se muestra el espectro de 13C-RMN de 25, destacando la señal en 182.5 ppm de C=S del grupo tioureido; las señales dobles en 135.4, 133.7 y 130.8 ppm de los carbonos de la unidad del trifenilfosfonio: Ar-Cpara (4JC,P=3.0 Hz), Ar-Corto (2JC,P=10.1 Hz) y Ar-Cmeta (3JC,P=12.8 Hz) y sobre 118.1 ppm el doblete de Ar-Cipso (1JC,P=86.1 Hz), todos ellos acoplados al átomo de fósforo. La formación del selenocianato se confirma con la señal en 102.4 ppm. Por otro lado, las señales de 66.4 a 20.3 ppm correspondieron a los carbonos de las cadenas alquílicas; se destaca la señal doble en 44.1 ppm para C-2 (2JC,P=16.0 Hz), el doblete en 22.5 ppm de C-3 (3JC,P=3.9 Hz) y el doblete en 20.6 ppm de C-1 (1JC,P=51.9 Hz) correspondientes a la cadena alquílica unida al fragmento del trifenilfosfonio. Con lo anterior, se confirma la formación del compuesto 25. Discusión de resultados 84 Figura 5.16. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 25. El esquema 5.8 muestra la metodología para acceder a los selenocianatos 29‒31, derivados de piridina, quinolina y N-metilimidazolio. Discusión de resultados 85 Esquema 5.8. Ruta de síntesis para la obtención de selenocianatos de piridinio, quinolinio y N- metilimidazolio. A modo de ejemplo se muestra el espectro de 1H-RMN de 29 en la figura 5.17. Destacan las señales en 9.06 a 8.10 ppm, correspondientes a los protones del núcleo piridínico, los multipletes en 7.18 y 6.98 ppm de los protones de fenilo y el conjunto de señales de 4.73 a 2.30 ppm de los hidrógenos de las cadenas alquílicas. En el espectro de 13C-RMN de 29 se confirma la presencia del grupo tioureido con la señal en 182.9 ppm (C=S), y la formación del selenocianato por la señal en 104.3 ppm (figura 5.18). Discusión de resultados 86 Figura 5.17. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) del compuesto 29. Figura 5.18. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CD3CD) del compuesto 29. Finalmente se llevó a cabo la preparación del selenocianato derivado de rodamina B. A partir de la amida 150 y con una reacción de sustitución nucleofílica Discusión de resultados 87 sobre el fragmento bromoalquílico 150 con KSeCN se obtuvo el compuesto 32 con un rendimiento del 52% (esquema 5.9). Esquema 5.9. Ruta de síntesis del selenocianato de rodamina B. En la figura 5.19 se observa el espectro de 1H-RMN para 32. Destacan las señales en 7.99 y 7.16 ppm de los H-3’ y H-4’, respectivamente, el multiplete sobre 6.65‒6.59 ppm de los protones de fenilo (H-2’’, H-3’’, H-5’’, H-6’’) y H-8 de la rodamina; Las señales en 3.95, 3.21 y 2.20 ppm corresponden a los protones de la cadena selenoalquílica y sobre 3.32 (CH2) y 1.15 (CH3) ppm se observan las señales del grupo dietilamino de rodamina B. Con respecto a las señales de 13C-RMN, se observa en 167.8 la señal de carbonilo de amida, la señal de SeCN en 102.0 ppm, las señales en 66.0, 30.2 y 26.5 ppm de los carbonos de la cadena selenoalquílica y las señales en 44.4 y 12.7 de CH2 y CH3 del grupo dietilamina de la rodamina B (figura 5.20). Lo anterior confirma la obtención de 32. Discusión de resultados 88 Figura 5.19. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 32. Figura 5.20. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 32. Antecedentes 89 6. Derivados de cumarina como potenciales inhibidores duales de NAMPT y anhidrasas carbónicas 6.1. Introducción 6.1.1. Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) La nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) es un metabolito que desempeña un papel esencial en la homeostasis celular, principalmente como cofactor de reacciones de oxido-reducción relacionadas con la producción de energía, la glucólisis, el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), la fosforilación oxidativa, oxidación de ácidos grasos y biosíntesis de serina. 177 , 178 El NAD+ se describió por primera vez en 1906 por Arthur Harden como un cofactor necesario en la fermentación del alcohol. Años después, en 1929, Hans von Euler-Chelpin identificó a este cofactor como un fosfato de azúcar nucleósido. Posteriormente, en 1935, Otto Warburg aisló al NADP+ y describió su papel en la transferencia de hidrógeno en reacciones bioquímicas como una coenzima importante para el metabolismo energético. 179 El NAD se presenta en dos formas, la oxidada (NAD+) y la forma reducida (NADH), y su equilibrio es crucial para mantener la funcionalidad en humanos y su consumo y regeneración se regulan por diferentes vías del metabolismo (figura 6.1). 180 Es de destacar, que la relación de NAD+/NADH disminuye con la edad, lo que causa una disminución en la capacidad de reparación del ADN y a la resistencia 177 . Yaku K., Okabe K., Nakagawa T. NAD metabolism: Implications in aging and longevity. Ageing Res. Rev. 2018, 47, 1‒17. 178 . Yaku K., Okabe K., Hikosaka K., Nakagawa, T. NAD metabolism in cancer therapeutics. Front. Oncol. 2018, 8, 622. 179 . Cantó C., Menzies K.J., Auwerx, J. NAD(+) metabolism and the control of energy homeostasis: A balancing act between mitochondria and the nucleus. Cell Metab. 2015, 22, 31‒53. 180 . Nishigaki J., Ishida T., Honma T., Haruta M. Oxidation of β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) by au cluster and nanoparticle catalysts aiming for coenzyme regeneration in enzymatic glucose oxidation. ACS Sustainable Chem. Eng. 2020, 8, 10413‒10422. Antecedentes 90 de radicales libres, por lo que mantener los niveles es una estrategia contra el envejecimiento y problemas relacionados. 181 , 182 Figura 6.1. Estructura química de NAD+ y NADP+.180 Es normal encontrar a NAD+ en su forma oxidada como forma mayoritaria, con una proporción NAD+/NADH que varían de 10/1 a 700/1, con una concentración celular total entre 0.3 y 1.0 mM en mamíferos. A su vez, NAD+ puede fosforilarse a NADP+ por la NAD quinasa, y también presentarse en su forma reducida (NADPH), cuyo papel principal es actuar como reductor en reacciones anabólicas, como la biosíntesis de ácidos nucleicos o de lípidos y también tienen un papel importante en la homeóstasis del calcio y en la supervivencia o muerte celular. Las concentraciones de NADP(H) se encuentran en un 10% con respecto a los niveles 181 . Zhang H., Ryu D., Wu Y., Gariani K., Wang X., Luan P., D’Amico D., Ropelle E.R., Lütolf M.P., Aebersold R., Schoonjans K., Menzies K.J., Auwerx, J. NAD⁺ repletion improves mitochondrial and stem cell function and enhances life span in mice. Science, 2016, 352, 1436‒1443. 182 . Li X., An Q., Ma Z., Zhang Y., Chen X., Chai Y., Meng F. Bioactive NAD+ regeneration promoted by multimetallic nanoparticles based on graphene–polymer nanolayers. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2022, 14, 39285‒39292. Antecedentes 97 inhibidor de NAMPT del que hay reporte, con capacidad para inducir apoptosis en HepG2 (carcinoma hepático), con una IC50 de aproximadamente 1.0 nM. Se comprobó que su mecanismo de acción es suprimir la actividad respiratoria mitocondrial debido a la reducción de la producción de NAD.186, 209 Figura 6.4. Inhibidores de NAMPT de primera generación. CHS828 es una piridinil cianoguanidina con actividad anticancerígena desarrollado por la compañía Leo Pharma A/S (Dinamarca). Fue reportado en 1997 por Björkling y colaboradores, y mostró un potente efecto anticancerígeno contra células de cáncer de pulmón y de mama (IC50=31 nM en células MCF-7 y IC50=2.7 nM en células NYH, respectivamente). 210 No fue hasta 2008 que Olesen et al. demostraron su actividad de bloqueo de NAMPT en células cancerígenas llevando a su muerte celular al reducir la producción de NAD. 211 Gracias a su evaluación en fase clínica, se han diseñado diversos profármacos con mejor farmacocinética y solubilidad.186 Otro inhibidor de NAMPT en fase clínica I es OT-82 (figura 6.5) y fue diseñado por OncoTaris en 2019. Su mecanismo de acción es por el control en la producción 209 . Hasmann M., Schemainda I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Res. 2003, 63, 7436‒7442. 210 . Schou C., Ottosen E.R., Petersen H., Björkling F., Latini S., Hjarnaa P.V., Bramm E., Binderup L. Novel cyanoguanidines with potent oral antitumour activity. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 3095‒3100. 211 . Olesen U.H., Christensen M.K., Björkling F., Jäättelä M., Jensen P.B., Sehested M., Nielsen S. Anticancer agent CHS-828 inhibits cellular synthesis of NAD. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 367, 799‒804. Antecedentes 98 de NAD y ATP que llevó a la muerte celular por apoptosis. Este compuesto presentó una fuerte acción contra neoplasias malignas hematopoyéticas con una IC50= 2.89 nM y en células no hematopoyéticas con una IC50=13.03 nM y una potente inhibición de NAMPT, con IC50=41 nM. Por otro lado, en estudios toxicológicos realizados en ratones y primates no se observaron efectos toxicológicos a nivel cardíaco, neurológico o en retinas, por lo que OT-82 es un candidato para el tratamiento de neoplasias hematológicas. 212 Figura 6.5. Inhibidor de NAMPT OT-82. Los inhibidores de NAMPT de segunda generación han sido clasificados por He y col. 213 en cuatro tipos: 1) inhibidores de NAMPT siguiendo el modelo clásico; 2) inhibidores de NAMPT estructuralmente distintos; 3) inhibidores de NAMPT sin sustrato; 4) inhibidores duales. Ejemplo de derivados que siguen el modelo clásico fueron los reportados por Zheng et al. 214 Presentaron una serie de ureas y tioureas como inhibidores de NAMPT. De entre todos los derivados, el análogo con grupo enlazante tioureido 151 212 . Korotchkina L.G., Kazyulkin D., Komarov P.G., Polinsky A., Andrianova E.L., Joshi S., Gupta M., Vujcic S., Kononov E., Toshkov I., Tian Y., Krasnov P., Chernov M.V., Veith J., Antoch M.P., Middlemiss S., Somers K., Lock R.B., Norris M.D., Gudkov, A.V. et. al. OT-82, a novel anticancer drug candidate that targets the strong dependence of hematological malignancies on NAD biosynthesis. Leukemia, 2020, 34, 1828‒1839. 213 . He T., Wang L., Wang T., Yang J., Zheng S., Tong J., Jiang S., Zhang X., Zhang K. Recent advances of targeting nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) for cancer drug discovery. Eur. J. Med. Chem. 2023, 258, 115607. 214 . Zheng X., Bauer P., Baumeister T., Buckmelter A.J., Caligiur, M., Clodfelter K.H., Han B., Ho Y.K., Kley N., Lin J., Reynolds D.J., Sharma G., Smith C.C., Wang Z., Dragovich P.S., Oh A., Wang W., Zak M., Gunzner-Toste J., Bair K. W. et. al. Structure-based identification of ureas as novel nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) inhibitors. J. Med. Chem. 2013, 56, 4921‒4937. Antecedentes 99 y ureido 152 fueron potentes inhibidores de NAMPT (IC50=7 y 3 nM, respectivamente). Estudios computacionales predijeron la existencia de interacciones de ambos compuestos con Asp219 y Ser241 de la cadena lateral de NAMPT a través de enlaces de hidrógeno. Observaron que al sustituir el grupo ureido por una amida para obtener el derivado 153 se mejoraba la energía de interacción con NAMPT originando una IC50=9 nM y una fuerte actividad antiproliferativa (IC50=10 nM) frente a células A2780 (cáncer de ovario humano). La modificación de los grupos cabeza y cola con diferentes fragmentos originó los derivados 154 (GNE-617), 155 y 156, con actividades inhibitorias y antiproliferativas (A2780) en el rango nM bajo (figura 6.6). Es de destacar que GNE-617 en modelos in vivo de ratón provocó una regresión tumoral con xenoinjerto U251 a los 7 días de tratamiento (dosis: 25 mg/kg) y los efectos perduraron aun después de terminado el tratamiento, e inhibición de crecimiento tumoral de cáncer de colon a una dosis de 15 mg/kg. Sin embargo, GNE-617 presentó baja solubilidad en agua y provocó daño a la retina.214 Figura 6.6. Tioureas, ureas y amidas con actividad inhibitoria de NAMPT.214 Antecedentes 100 Otro grupo enlazante como potencial inhibidor de NAMPT son los triazoles. Los primeros triazoles inhibidores de NAMPT fueron reportados por Tron y colaboradores en 2010. 215 Ellos reemplazaron la 3-(piridin-3-il) acrilamida de FK866 con un triazol 1,4-disustituido (figura 6.7). Los derivados con la piridina meta sustituida presentaron actividad citotóxica en el rango nM. Al realizar un estudio de relación estructura-actividad observaron que el mejor efecto lo tuvo el grupo cola bifenilo >> 1,1’-difenil éter > 1,1’-bifenilmetano ≥ 1,1’-difeniletano y con respecto al grupo espaciador la mejor actividad fue para n=8 > n=6 > n=7. En base a lo anterior, el compuesto 158b fue el que presentó mejor actividad antiproliferativa frente a líneas de cáncer de leucemia, colon, melanoma, ovario, renal y próstata. Figura 6.7. Primeros derivados de triazol inhibidores de NAMPT sintetizados por Colombano et al.215 En base a lo reportado por Tron y colaboradores, más recientemente Travelli et al. sintetizaron una serie de derivados de triazol con diferentes grupos cola 215 . Colombano G., Travelli C., Galli U., Caldarelli A., Chini M.G., Canonico P.L., Sorba G., Bifulco G., Tron G.C., Genazzani A.A. A novel potent nicotinamide phosphoribosyltransferase inhibitor synthesized via click chemistry. J. Med. Chem. 2010, 53, 616‒623. Antecedentes 101 hidrofóbicos como potenciales inhibidores de NAMPT (figura 6.8). 216 El compuesto más activo fue el 165c en modelos de xenoinjerto y aloinjerto lo que corroboró su potencial antiproliferativo (EC50=5.2 nM, células SH-SY5Y neuroblastoma) por medio de la inhibición de NAMPT (IC50=3.8 nM) y disminución de los niveles de NAD (IC50=6.7 nM). Adicionalmente, este derivado ayudó a disminuir la colitis en ratones, siendo el primer inhibidor de NAMPT con este tipo de efecto. Figura 6.8. Ejemplo de algunos triazoles con actividad inhibitoria de NAMPT.216 Un ejemplo de derivado inhibidor de NAMPT estructuralmente diferente es el descubierto por Zhao et al., el LSN3154567, en la búsqueda de inhibidores selectivos de NAMPT para disminuir el riesgo de daño a retina al disminuir su permeabilidad (figura 6.9). Este derivado presentó un IC50=3.2 nM contra NAMPT y estudios in vivo demostraron una disminución en el contenido de NAD a una dosis de 2 mg/kg en ratones, además de poseer actividad antiproliferativa en varias líneas celulares de cáncer. Con la administración oral general moderada de 2 mg/kg se 216 . Travelli C., Aprile S., Rahimian R., Grolla A.A., Rogati F., Bertolotti M., Malagnino F., Di Paola R., Impellizzeri D., Fusco R., Mercalli V., Massarotti A., Stortini G., Terrazzino S., Del Grosso E., Fakhfouri G., Troiani M.P., Alisi M.A., Grosa G., Sorba G., Canonico P.L., Orsomando G., Cuzzocrea S., Genazzani A.A., Galli U., Tron G.C. Identification of novel triazole-based nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) inhibitors endowed with antiproliferative and antiinflammatory activity. J. Med. Chem. 2017, 60, 1768‒1792. Antecedentes 102 reportó una biodisponibilidad del 39% (Cmax= 57 nM) y un aclaramiento renal alto (CL=158.73 ml/min/kg). Al evaluar la toxicidad de este compuesto no se observó retinopatía en ratas en comparación con otros inhibidores de NAMPT y en combinación con ácido nicotínico se pudo tratar a perros con toxicidad retiniana. 217 Figura 6.9. Estructura del inhibidor de NAMPT LSN3154567.217 Con el objetivo de obtener inhibidores de NAMPT con mejor solubilidad en agua, Marra y colaboradores recientemente sintetizaron β-D-iminoribofuranósidos formados por diferentes heterociclos conectados a través de la posición anomérica del carbohidrato (figura 6.10). Evaluaron su actividad inhibitoria en diferentes líneas de células tumorales, la inhibición enzimática de NAMPT y la disminución intracelular de los niveles NAD+. Sin embargo, la presencia del iminoazúcar produjo una reducción en la potencia tanto de la inhibición de NAMPT, como antiproliferativa en comparación con FK866 (IC50=2.4nM). De los derivados preparados, el compuesto 174 tuvo la mejor actividad antiproliferativa, aunque moderada en células MiaPaCa-2 (células de cáncer de páncreas) con una IC50=32 µM. Para este último, el agotamiento de NAD+ a dosis de 100 mM, después de 24 h, fue del 79%. Por lo cual, este tipo de derivados son prometedores para el desarrollo de inhibidores de NAMPT. 218 217 . Zhao G., Green C.F., Hui Y., Prieto L., Shepard R L., Dong S., Wang T., Tan B., Gong X., Kays L., Johnson R.L., Wu W., Bhattachar S., Del Prado M., Gillig J.R., Fernandez M., Roth K.D., Buchanan S.G., Kuo M., Geeganage S., Burkholder T.P. Discovery of a highly selective NAMPT inhibitor that demonstrates robust efficacy and improved retinal toxicity with nicotinic acid coadministration. Mol. Cancer Ther. 2017, 16, 2677‒2688. 218 . Conforti I., Benzi A., Caffa I., Bruzzone S., Nencioni A., Marra A. Iminosugar-based nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) inhibitors as potential anti-pancreatic cancer agents. Pharmaceutics, 2023, 15, 1472. Antecedentes 103 Figura 6.10. Derivados β-D-Iminoribofuranósidos inhibidores de NAMPT.218 Ejemplo de inhibidores de NAMPT sin sustrato fueron las ureas de isoindolina reportados por Curtin et al. 219 Los inhibidores de NAMPT cuentan con un átomo de nitrógeno básico indispensable para la interacción con la enzima, sin embargo, las ureas reportadas carecían del heteroátomo con nitrógeno como grupo cabeza. De la serie de compuestos preparados, el 176 y 177 (figura 6.11) presentaron una buena actividad antiproliferativa en el rango nM y actividad antitumoral in vivo en modelo de xenoinjerto en ratón. Ambos compuestos presentaron una excelente disponibilidad oral (100 y 59% respectivamente), aclaramiento renal de 0.11 L/h/kg y 0.26 L/h/kg y una vida media de 4.8 y 3 h, respectivamente. Los valores de reducción de crecimiento tumoral en ratón fueron del 90% y 78% para 177 y 176, respectivamente. Al evaluar la inhibición de NAMPT obtuvieron valores de Ki= 56 y 83 nM para 176 y 177, respectivamente. Los resultados, aunque no son mejores a moléculas inhibidoras de NAMPT de referencia, marcaron la pauta para nuevos derivados de este tipo. 219 . Curtin M.L., Heyman H.R., Clark R.F., Sorensen B.K., Doherty G., Hansen T.M., Frey R.R., Sarris K., Aguirre A.L., Shrestha A., Tu N.P., Woller K.R., Pliushchev M., Sweis R.F., Cheng M., Wilsbacher J.L., Kovar P., Guo J., Cheng D., Longenecker K.L., Raich D., Korepanova A.V., Soni N.B., Algire M.A., Richardson P.L., Marin V.L., Badagnani I., Vasudevan A., Buchanan F.G., Maag M., Chiang G.G., Tse C., Michaelides M. SAR and characterization of non-substrate isoindoline urea inhibitors of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT). Bioorg. Med. Chem. Lett. 2017, 27, 3317‒3325. Antecedentes 104 Figura 6.11. Ureas de isoindolina con potencial actividad inhibitoria de NAMPT.219 Con la finalidad de mejorar problemas de farmacorresistencia, farmacocinética y de toxicidad se ha optado por el diseño de moléculas híbridas, que puedan presentar dos mecanismos de acción diferentes (inhibidores duales) para el desarrollo de fármacos. En algunos casos, son más beneficiosos en comparación a las terapias combinadas, sobre todo por la disminución de efectos secundarios.186 Un ejemplo de inhibidor dual es el reportado por Dong et al. (figura 6.12).207 Diseñaron moléculas que inhibían simultáneamente a NAMPT e histona desacetilasa (HDAC). Las HDAC’s tienen un papel importante en la regulación de la expresión genética de la tumorigénesis y el mantenimiento del tumor y constituyen la diana terapéutica de diversos fármacos en el tratamiento del cáncer cutáneo y de linfomas de células T. 220 De los derivados reportados, el compuesto 178 presentó una actividad excelente y equilibrada contra NAMPT (IC50=31 nM) y HDAC1 (IC50= 55 nM), y su posible mecanismo de acción sería la inducción de apoptosis, autofagia y consecuente muerte celular. Además, 178 presentó eficacia antitumoral in vivo en modelo de xenoinjerto en ratón con células HCT116 a una dosis de 25 mg/kg dos veces al día durante 21 días consecutivos. A dosis de 2 mg/kg en rata se observó que la vida media de 178 fue de 1.8 h y un aclaramiento plasmático de 745 ng/ml, lo cual indicó problemas de farmacocinética. Sin embargo, estos compuestos constituyen una buena base para el diseño de otras moléculas duales. 220 . Zhou M., Yuan M., Zhang M., Lei C., Aras Ö., Zhang X., An F. Combining histone deacetylase inhibitors (HDACis) with other therapies for cancer therapy. Eur. J. Med. Chem. 2021, 226, 113825. Antecedentes 105 Figura 6.12. Diseño de inhibidores duales de NAMPT/HDAC.220 En base a todo lo anterior, un reporte reciente de derivados con actividad inhibitoria sobre NAMPT con actividad antitumoral por parte de Robina y colaboradores, 221 se basó en la preparación de tres familias de compuestos basados en inhibidores de NAMPT de primera generación (figura 6.13), que contienen grupos (piridin-3-il)triazol, (piridin-3-il)tiourea y (piridin-3/4- il)cianoguanidinas como grupo conector y un grupo furano como grupo cola (como mimético del grupo benzamida en FK866). Los derivados se evaluaron en diferentes líneas de células de cáncer hematológico y de tumores sólidos, mostrando una actividad citotóxica en el rango 221 . Fratta S., Biniecka P., Moreno-Vargas A.J., Carmona A.T., Nahimana A., Duchosal M.A., Piacente F., Bruzzone S., Caffa I., Nencioni A., Robina I. Synthesis and structure-activity relationship of new nicotinamide phosphoribosyltransferase inhibitors with antitumor activity on solid and haematological cancer. Eur. J. Med. Chem. 2023, 250, 115170. Antecedentes 106 nM o subnanomolar, inferiores a los reportados para el compuesto de referencia FK866. De los derivados sintetizados los compuestos 179, 180 y 181 mostraron actividad citotóxica contra células ML2 (células de leucemia mieloide aguda) con una IC50=18, 46 y 49 pM y contra MiaPaCa-2 (células de cáncer pancreático) con una IC50=0.005, 0.455 y 2.81 nM, respectivamente, siendo la del compuesto 179 mucho más potente FK866 (IC50=2.4 nM). También es de destacar que cuando emplearon como grupo espaciador cadenas alquílicas, la cadena de 6C fue la que presentó mejor efecto citotóxico y de entre los grupos enlazantes, el grupo triazol fue el que presentó menor actividad citotóxica con respecto a las tioureas y cianoguanidinas. Se observó por otro lado, que al modificar el grupo piridina por isoindolina la actividad antitumoral decayó. Figura 6.13. Inhibidores de NAMPT basados en FK866.221 Antecedentes 113 exterior del sitio catalítico, lo que impide el ingreso de sustratos, inhibiendo la catálisis de la anhidrasa carbónica.241, 242 Figura 6.18. Ejemplos de inhibidores no clásicos de anhidrasas carbónicas. En particular, las cumarinas, que son los inhibidores de CAs abordados en este capítulo de la Tesis Doctoral, actúan en realidad como profármacos; las CAs tienen también actividad de tipo lipasa, pudiendo hidrolizar la lactona de las cumarinas, originando un derivado del ácido o-hidroxicinámico, que ocluye la entrada al sitio activo de la enzima (inhibidor suicida). Las cumarinas suelen comportarse como inhibidores muy selectivos de CA IX y CA XII, y, por tanto, pueden ser un punto de partida interesante para el desarrollo de fármacos antitumorales. 243 , 244 242 . Lomelino C.L., Supuran C.T., McKenna R. Non-classical inhibition of carbonic anhydrase. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1150. 243 . Giovannuzzi S., De Luca V., Nocentini A., Capasso C., Supuran C.T. Coumarins inhibit η-class carbonic anhydrase from Plasmodium falciparum. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2022, 37, 680‒ 685. 244 . Gümüş A., Bozdağ M., Akdemir A., Supuran C.T., Selleri S., Carta F., Supuran C.T. Thiosemicarbazide-substituted coumarins as selective inhibitors of the tumor associated human carbonic anhydrases IX and XII. Molecules, 2022, 27, 4610. Objetivos 114 6.2. Objetivo general de sección Sintetizar inhibidores duales de NAMPT y CAs IX y XII como potenciales agentes antiproliferativos. Como farmacóforo en la inhibición de NAMPT se empleará un residuo de piridin-3(ó 4)-il unido a un conector de tipo tiourea, cianoguanidina o amida. Por otro lado, se incorporará una unidad de cumarina con diferentes sustituyentes en C-3 y C-4 como profármaco en la inhibición de CAs relacionadas con procesos tumorales. Ambos farmacóforos estarán conectados por un espaciador de longitud fija (hexametileno). 6.3. Objetivos particulares de sección • Sintetizar 7-hidroxicumarinas a partir de resorcinol, y tres diferentes βcetoésteres (acetoacetato de etilo, 2-metilacetoacetato de etilo y 4,4,4- trifluoroacetoacetato de etilo). • Realizar la alquilación de cada hidroxicumarina con 1,6-dibromohexano, seguido de la preparación de la consecuente azida con NaN3, e hidrogenación catalítica estándar para originar las correspondientes aminas en posición ω de la cadena alquílica. • Sintetizar (piridin-3-il)amidas a partir de ácido nicotínico y los aminoderivados de cumarina. • Preparar los intermediarios para la síntesis de cianoguanidinas (carbamimidatos) a partir de 3 y 4-aminopiridina con imidocarbonato de N- cianodifenilo. • Sintetizar las correspondientes (piridin-3/4-il)cianoguanidinas, mediante la reacción de las aminas de cumarina con el correspondiente carbamimidato. • Sintetizar las tioureas a partir de las aminas de cumarina con 3- piridilisotiocianato comercial. • Evaluar la actividad antiproliferativa. • Evaluar la inhibición de CAs humanas relacionadas con procesos tumorales (CA IX, XII), así como el índice de selectividad. • Evaluar la inhibición de NAMPT. • Establecer relaciones estructura-actividad. Discusión de resultados 115 6.4. Discusión de resultados Para el diseño de los derivados inhibidores de NAMPT, este estudio se basó en el reporte de Fratta et al.221 En este capítulo se abordó la preparación de 3 familias de inhibidores duales de NAMPT y CAs: tioureas, cianoguanidinas y amidas incorporando una unidad de piridina y de cumarina sustituida en cada extremo del espaciador (figura 6.19). Figura 6.19. Diseño estructural de la familia de compuestos inhibidores duales de NAMPT-CAs sintetizados. En primer lugar, se llevó a cabo la preparación de las 7-hidroxicumarinas 182a‒c (reacción de Pechmann entre resorcinol y diversos β-cetoésteres) y su alquilación en el hidroxilo fenólico mediante síntesis de Williamson (compuestos 183a‒c). La preparación de las azidas de cumarina se realizó por una reacción SN2 con azida de sodio, en DMF, obteniéndose los derivados 184a‒c con rendimientos de excelente a cuantitativos. Las azidas se utilizaron sin purificar para el siguiente paso de reacción (esquema 6.1), una hidrogenación estándar con catálisis Discusión de resultados 116 heterogénea, para originar las correspondientes aminas 185a‒c, intermedios clave en la preparación de las tres familias de inhibidores abordadas en este capítulo de la Tesis Doctoral. Esquema 6.1. Ruta de síntesis para la preparación de aminas derivadas de cumarinas. Para la síntesis de amidas, se utilizó como reactivo de partida ácido nicotínico comercial que se acopló con las aminas 185a y 185b en medio básico (DIPEA), tal y como se muestra en el esquema 6.2, en presencia de EDCI (1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida) y HOBt (1-hidroxibenzotriazol) como agentes acoplantes. EDCI tiene como función activar al ácido carboxílico para dar lugar a un intermediario más reactivo (O-acilisourea), que a su vez reacciona con HOBt para originar un éster (esquema 6.3), 245 capaz de reaccionar más fácilmente con aminas y dar lugar a las amidas 33 y 34. El mecanismo de reacción para la obtención de amidas con estos agentes acoplantes se muestra en el esquema 6.3. Consiste en primer lugar, en la formación del ion carboxilato del ácido nicotínico, seguida de la adición nucleofílica de éste a EDCI para formar el intermediario O-acilisourea. Posteriormente, se da una nueva 245 . Magano J. Large-scale amidations in process chemistry: practical considerations for reagent selection and reaction execution. Org. Process Res. Dev. 2022, 26, 1562‒1689. Discusión de resultados 117 adición al carbonilo por parte de HOBt para dar lugar a la eliminación de la urea de EDCI y el correspondiente éster del ácido nicotínico con HOBt. Finalmente, se produce el ataque nucleofílico al carbonilo de dicho éster por parte de la amina de cumarina para dar las correspondientes amidas y eliminación de HOBT. Esquema 6.2. Síntesis de amidas con potencial inhibición dual de NAMPT-CAs. Esquema 6.3. Mecanismo de reacción para la formación de amidas mediada por EDCI/HOBt. Discusión de resultados 118 A modo de ejemplo, en la figura 6.20, se muestra el espectro de 1H-RMN para el compuesto 34. Las señales en 8.96, 8.71, 8.11 y 7.37 ppm corresponden a los protones de piridina; las señales en 7.47, 6.82, 6.76 ppm corresponden a los protones H-5’, H-6’, H-8’, respectivamente, de la cumarina. Por otro lado, la señal en 6.32 ppm se asigna al NH del grupo amida y las señales localizadas en 3.99 (triplete) y 3.49 (cuartete) ppm se corresponden con los extremos de la cadena alquílica (H-6 y H-1, respectivamente). Por su parte, en el espectro de 13C-RMN, la resonancia en 165.8 ppm, asignada al grupo carbonilo de amida, confirma la formación de esta (figura 6.21). Figura 6.20. Espectro de 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) del compuesto 34. Discusión de resultados 119 Figura 6.21. Espectro de 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) del compuesto 34. También se abordó la preparación de cianoguanidinas derivadas de piridina sustituidas en las posiciones C-3 y C-4. Para ello, en primer lugar, se sintetizó el correspondiente cianocarbamimidato de fenilo, a partir de cianocarbonimidato de difenilo comercial con 3 ó 4-aminopiridina en medio básico (TEA, esquema 6.4). Los carbamimidatos se obtuvieron con rendimientos moderados de 69% para 186a y de 53% para 186b. Esquema 6.4. Ruta de síntesis de los carbamimidatos 186a,b. A continuación, se llevó a cabo el acoplamiento de los carbamimidatos 186a ó 186b con un exceso de las cumarinas 185a‒c en medio básico (TEA), en presencia de DMAP como catalizador (esquema 6.5). En total se obtuvieron 6 cianoguanidinas con rendimientos de moderados (36, 59%) a buenos (38, 85%). Discusión de resultados 120 Esquema 6.5. Síntesis de cianoguanidinas derivadas de cumarinas como potenciales inhibidores duales de NAMPT-CAs. A modo de ejemplo, la figura 6.22 muestra el espectro de 1H-RMN de la cianoguanidina 36 sustituida en C-3’ de la piridina, de gran semejanza al indicado previamente para el compuesto 34; en él se observan los protones del residuo de piridina (8.55, 8.50, 7.50 y 7.36 ppm) y de cumarina (7.47, 6.84 y 6.80 para H-5’, H- 6’ y H-8’, respectivamente). También pueden observarse las señales de los grupos NH unidos a la piridina y a la cadena alifática (7.72 y 5.17 ppm, respectivamente). En la región alifática destacan las señales que resuenan en 3.97 y 3.33 ppm, asignadas de nuevo a los extremos de la cadena hidrocarbonada (H-6 y H-1), así como los singuletes en 2.36 y 2.17 ppm, correspondientes a los dos grupos metilo sobre las posiciones C-3’ y C-4’ de la cumarina. Por otro lado, en el espectro de 13C-RMN de 36 destacan las señales en 162.7 ppm (grupo carbonilo de la cumarina), 161.1 ppm (grupo imino de la cianoguanidina), así como la del grupo ciano (114.3 ppm). Adicionalmente, las señales en 68.3 y 42.3 ppm corresponden a los carbonos metilénicos situados en los extremos de la cadena alquílica y sobre 15.2 y 13.3 ppm las señales para los metilos de cumarina en las posiciones C-3’ y C-4’ (figura 6.23). Todo ello corrobora la formación de la cianoguanidina esperada. Discusión de resultados 121 Figura 6.22. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del compuesto 36. Figura 6.23. Espectro de 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) del compuesto 36. C=O Discusión de resultados 122 También se incluyen los espectros de 1H- y 13C-RMN de la cianoguanidina 37 sustituida en C-4’ de la piridina (figuras 6.24 y 6.25, respectivamente). Con respecto a los derivados anteriormente indicados, destaca la ausencia de sustituyentes en la posición C-3’ de la cumarina, por lo que se observa un cuartete ancho correspondiente al protón H-3’ en 6.07 ppm, con una 4JH,H=1.2 Hz, por su acoplamiento alílico con los protones del CH3 en C-4’ de la cumarina, el cual se observa como una señal doble en 2.36 ppm. Figura 6.24. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del compuesto 37. El espectro de 13C-RMN de 37 posee una gran analogía con el mostrado para la cianoguanidina 36, destacando las señales a 160.2 y 114.6 ppm, que demuestran la presencia del grupo cianoguanidino. H-6 H-1 Parte experimental 225 9.8.4.7. Bromuro de 1-metil-3-{3’-[3’’-(4’’’-(3’’’’-selenocianatopropoxi)fenil) tioureido]propil}-1H-imidazol-3-io (31) Se empleó 148c (89 mg, 0.18 mmol) y KSeCN (78 mg, 0.54 mmol), obteniéndose 31 como espuma de color rosa (12 mg, 13%). 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) δ 8.98 (s, 1H, H-2), 7.67 (m, 1H, H-5), 7.58 (m, 1H, H-4), 7.17 (m, 2H, H- 2’’’, H-6’’’), 6.99 (m, 2H, H-3’’’, H-5’’’), 4.28 (t, 2H, JH,H=8.6 Hz, H-1), 4.15 (t, 2H, JH,H=7.4 Hz, H-1’’’’), 3.93 (s, 3H, CH3), 3.65 (t, 2H, JH,H=2.4 Hz, H-3), 3.31 (m, 2H, H-3’’’’), 2.37 (quint., 2H, H-2), 2.20 (quint., 2H, H2’’’’) ppm. 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) δ 182.8 (C=S), 158.7 (C-4’’’), 132.2 (C-2), 134.8 (C-1’’’), 124.4 (C-2’’’, C-6’’’), 124.9 (C-4), 123.7 (C-5), 116.5 (C-3’’’, C-5’’’), 104.3 (SeCN), 67.8 (C-1’’’’), 42.4 (C- 1), 36.5 (C-3), 31.7 (CH3), 30.7(C-2’’’’), 27.4 (C-2) ppm. 9.8.4.8. Cloruro de 3,6-bis(dietilamino)-9-{2'-[N-(4''-(3'''-selenocianatopropoxi) fenil)carbamoil]fenil}xantilio (32) Se empleó 150 (69 mg, 0.10 mmol) y KSeCN (43 mg, 0.30 mmol) obteniéndose después de 2 h a 32 como espuma rosa (37.5 mg, 52%). 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 7.99 (m, 1H, H-3’), 7.49 (m, 2H, H-6’,H-1), 7.16 (m, 1H, H-4’/H- 5’), 6.65-6.59 (m, 5H, H-2’’, H-3’’, H-5’’,H-6’’,H-8), 6.32 (dd, 2H, J2,1=11.1 Hz, J2,4=3.3 Hz, H-2/H-7), 6.24 (d, 2H, J4,2= 3.3 Hz, H-4, H-5 ), 3.95 (t, 2H, JH,H=7.2 Hz, H-1’’’), 3.32 (m, 8H, H-15, H-15’, H-17, H-17’), 3.21 (t, 2H, JH,H=8.4 Hz, H-3’’’), 2.30 (quint., 2H, JH,H=8.9 Hz, H-2’’’), 1.15 (t, 12H, JH,H=8.8 Hz, H-16, H-16’, H-18, H-18’) ppm. 13C-RMN (125.7 MHz, CD3OD) δ 167.8 (C=O), 157.0 (C-11, C-12), 153.4 (C-4’’), Parte experimental 226 153.1 (C-3/C-6), 148.9 (C-1’’), 132.8 (C-1), 131.4 (C-9), 129.8 (C-8), 129.2, 129.0 (C-2’’,C-6’’), 128.3 (C-6’), 124.2 (C-4’), 123.4(C-3’), 114.6 (C-5’’/C-3’’), 108.2 (C-2/C- 7), 106.5, 102.0 (SeCN), 97.9 (C-4/C-5), 67.5, 66.0 (C-1’’’), 44.4 (C-15, C-15’, C-17, C-17’), 30.2 (C-2’’’), 26.5 (C-3’’’), 12.7 (C-16, C-16’, C-18, C-18’) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C38H41N3N+O377Se ([M+H]+): 681.2317, encontrado: 681.2317. 9.8.5. Procedimiento general para la preparación amidas con potencial actividad inhibitoria de NAMPT A una solución de ácido nicotínico (1.0 equiv.), amina 185a ó 185b (2.0 equiv.), EDCI (4.0 equiv.), y HOBt (1.5 equiv.) en DMF anhidra (3 mL) se adicionó DIPEA (1.5 equiv.). La reacción se mantuvo en agitación a t.a. hasta consumo de materia prima (~24h). Al finalizar la reacción, se concentró a sequedad y se disolvió en CH2Cl2 y se lavó con NH4Cl aq. sat. (2x10 mL), NaHCO3 aq. sat. (2x10mL) y agua (1x15 mL). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el filtrado se concentró a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna con una mezcla de CH2Cl2‒MeOH (60:1→50:1). 9.8.5.1. N-(6-[(4’-metil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il)oxi]hexil)nicotinamida (33) Se empleó acido nicotínico (17 mg, 0.14 mmol), 185a (75 mg, 0.27 mmol), EDCI (104 mg, 0.54 mmol), HOBt (28 mg, 0.20 mmol) y DIPEA (26 mg, 0.20 mmol) obteniéndose 33 como espuma amarilla clara (20 mg, 73%). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8.96 (dd, 1H, J2’’,6’’=1.7 Hz, H-2’’), 8.70 (dd, 1H, J6’’,4’’=1.6 Hz, J6’’,5’’=4.8 Hz, H-6’’), 8.11 (ddd, 1H, J4’’,5’’=9.7 Hz, J4’’,2’’=1.8 Hz, J4’’,6’’=2.2 Hz, H-4’’), 7.47 (d, 1H, J5’,6’=8.8 Hz, H-5’), 7.37 (m, 1H, H-5’’), 6.83 (dd, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, J6’,5’=8.8 Hz, H-6’), 6.77 (d, 1H, J8’,6’=2.5 Hz, H-8’), 6.37 (sa, 1H, NH), 6.11 (ca, 1H, JH,H=1.3 Hz, H-3’), 4.00 (t, 2H, JH,H=6.4 Hz, H-6), 3.49 (c, 2H, JH,H=6.9 Hz H-1), 2.38 (d, 3H, JH,H=1.3 Hz, CH3), 1.83 (m, 2H, H-5), 1.68 (m, 2H, H-2), 1.50 (m, 4H, H-3, H-4) ppm. 13C- RMN (75.5 MHz, CDCl3) δ 165.8 (OC-NH), 162.3 (C-2’), 161.5 (C-7’), 155.4 (C-8a’), Parte experimental 227 152.8 (C-2’’), 152.3 (C-6’’), 147.9 (C-4’), 135.2 (C-4’’), 130.6 (C-3’’), 125.6 (C-5’), 123.7 (C-5’’), 113.6 (C-3’), 112.8 (C-4a’), 112.0 (C-6’), 101.5 (C-8’), 68.5 (C-6), 40.2 (C-1), 29.7 (CH2), 29.0 (CH2), 26.8 (CH2), 25.8 (CH2), 18.8 (CH3) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C22H25N2O4 ([M+H]+): 391.1809, encontrado: 381.1818. 9.8.5.2. N-(6-[(3’,4’-dimetil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il)oxi]hexil)nicotinamida (34) Se empleó acido nicotínico (10 mg, 0.08 mmol), 185b (47 mg, 0.16 mmol), EDCI (62 mg, 0.33 mmol), HOBt (16 mg, 0.12 mmol) y DIPEA (16 mg, 0.12 mmol) obteniéndose 34 como espuma amarilla clara (27 mg, 84%). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8.96 (dd, 1H, J2’’,6’’=1.7 Hz, H-2’’), 8.71 (dd, 1H, J6’’,4’’=1.8 Hz, J6’’,5’’=4.8 Hz, H-6’’), 8.11 (ddd, 1H, J4’’,5’’=8.0 Hz, J4’’,2’’=1.8 Hz, J4’’,6’’=2.0 Hz, H-4’’), 7.85 (d, 1H, J5’,6’=8.9 Hz, H-5’), 7.38 (m, 1H, H-5’’), 6.82 (dd, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, J6’,5’=8.9 Hz, H-6’), 6.76 (d, 1H, J8’,6’=2.5 Hz, H-8’), 6.32 (sa, 1H, NH), 3.99 (t, 2H, JH,H=6.3 Hz, H-6), 3.49 (c, 2H, JH,H=7.0 Hz, H-1), 2.35 (s, 3H, CH3), 2.17 (s, 3H, CH3), 1.83 (m, 2H, H- 5), 1.68 (m, 2H, H-2), 1.51 (m, 4H, H-3, H-4) ppm. 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) δ 165.8 (OC-NH), 162.7 (C-2’), 161.1 (C-7’), 153.7 (C-8a’), 152.3 (C-2’’), 147.9 (C-4’), 146.5 (C-6’’), 135.2 (C-4’’), 130.6 (C-3’’), 125.4 (C-5’), 123.7 (C-5’’), 119.0 (C-3’), 114.2 (C-4a’), 112.6 (C-6’), 101.2 (C-8’), 68.4 (C-6), 40.2 (C-1), 29.7 (CH2), 29.0 (CH2), 26.8 (CH2), 25.9 (CH2), 15.2, 13.3 (CH3-3’,CH3-4’) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C23H26N2O4 ([M+H]+): 395.1975, encontrado: 395.1975. 9.8.6. Método general para la preparación de cianoguanidinas con potencial actividad inhibitoria de NAMPT A una solución del carbamimidato 186a ó 186b (1.0 equiv.) en MeCN‒DMF anhidros (3:1, 8mL), se le adicionó la amina correspondiente (1.3 equiv.), TEA (2.8 equiv.) y DMAP (cat.) y se agitó a 80 °C bajo atmósfera inerte durante una noche (~16 h). Al finalizar la reacción, se concentró a sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna con una mezcla de AcOEt‒MeOH 80:1→40:1. Parte experimental 228 9.8.6.1. N-Ciano-N’-(6-([4’-metil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il]oxi)hexil)-N’’-piridin-3- il guanidina (35) Se empleó 185a (57 mg, 0.21 mmol), 186a (38 mg, 0.16 mmol) y TEA (45 mg, 0.45 mmol) obteniéndose 35 como espuma blanca (50 mg, 75%). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8.51 (dd, 1H, J2’’,4’’=2.3 H-2’’), 8.35 (da, 1H, J6’’,5’’=4.7 Hz, H-6’’), 7.67 (da, 1H, J5’,6’=8.1 Hz, H-5’’), 7.44 (d, 1H, J5’’,4’’=8.8 Hz, H-5’), 7.27 (ddd, 1H, J4’’,6’’=4.8 Hz, J5’’,4’’=8.5 Hz, H-4’’), 6.81 (dd, 1H, J6’,5’=8.8 Hz, J6’,8’=2.4 Hz, H-6’), 6.71 (d, 1H, J6’,8’=2.4 Hz, H-8’), 6.06 (ca, 1H, JH,H=1.3 Hz, H-3’), 5.78 (sa, 1H, NH), 3.96 (t, 2H, JH,H=6.3 Hz, H-1), 3.32 (m, 2H, H-6), 2.35 (d, 3H, JH,H=1.3 Hz, CH3), 1.77 (m, 2H, H- 5), 1.59 (m, 2H, H-2), 1.42 (m, 2H, H-3, H-4) ppm. 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) δ 162.3 (C=O),161.6 (C-7’), 158.6 (C=N), 155.3 (C-8a’), 153.1 (C-4’), 147.1 (C-2’’), 145.9 (C-6’’), 133.6 (C-3’’), 132.3 (C-4’’), 125.7 (C-5’), 124.2 (C-5’’) 117.8 (CN), 113.5 (C-4a’), 112.8 (C-6’), 101.4 (C-8’), 68.4 (C-6), 42.3 (C-1), 29.3 (CH2), 28.9 (CH2), 26.5 (CH2), 25.7 (CH2), 18.8 (CH3) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C23H26N5O3 ([M+H]+): 420.2030, encontrado: 420.2028. 9.8.6.2. N-Ciano-N’-(6-([3’,4’-dimetil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il]oxi)hexil)-N’’- piridin-3-ilguanidina (36) Se empleó 185b (44 mg, 0.15 mmol), 186a (28 mg, 0.11 mmol) y TEA (33 mg, 0.33 mmol) obteniéndose 36 como espuma blanca (30 mg, 59%). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8.58 (dd, 1H, J2’’,4’’=2.4 H-2’’), 8.50 (dd, 1H, J6’’,5’’= 8.5 Hz, J6’’,4’’= 1.2 Hz, H-6’’), 7.72 (sa, 1H, NH), 7.66 (da, 1H, J5’,6’=8.5 Hz, H-5’’), 7.47 (d, 1H, J5’’,4’’=8.9 Hz, H-5’), 7.36 (ddd, 1H, J4’’,6’’=4.8 Hz, J5’’,4’’=8.1 Hz, H-4’’), 6.82 (dd, 1H, J6’,5’=8.9 Parte experimental 229 Hz, J6’,8’=2.5 Hz, H-6’), 6.74 (d, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, H-8’), 5.17 (sa, 1H, NH), 3.97 (t, 2H, JH,H=6.3 Hz, H-1), 3.33 (m, 2H, H-6), 2.36 (s, 3H, CH3), 2.17 (s, 3H, CH3), 1.80 (m, 2H, H-5), 1.60 (m, 2H, H-2), 1.50 (m, 2H, H-3) 1.40 (m, 2H, H-4) ppm. 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) δ 162.7 (C=O),161.1 (C-7), 158.7 (C=N), 153.7 (C-8a’), 148.2 (C- 4’), 146.6 (C-2’’), 132.8 (C-6’’), 125.4 (C-3’’), 124.5 (C-4’’), 119.0 (CN), 114.3 (C-4a’), 112.6 (C-6’), 101.2 (C-8’), 68.3 (C-6), 42.3 (C-1), 29.3 (CH2), 29.0 (CH2), 26.6 (CH2), 25.8 (CH2), 15.2, 13.3 (CH3-3’,CH3-4’) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C24H28N5O3 ([M+H]+): 434.2187, encontrado: 434.2195. 9.8.6.3. N-Ciano-N’-(6-([4’-metil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il]oxi)hexil)-N’’-piridin-4- ilguanidina (37) Se empleó 185a (55 mg, 0.20 mmol), 186b (37 mg, 0.15 mmol) y TEA (44 mg, 0.43 mmol) obteniéndose 37 como espuma blanca (54 mg, 83%). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8.35 (d, 2H, J2’’,3’’= 6.3 Hz, H-2’’, H-6’’), 7.46 (d, 1H, J5’,6’=8.8 Hz, H- 5’), 7.23 (d, 2H, J3’,2’=5.3 Hz, H-3’’, H-5’’), 6.81 (dd, 1H, J6’,8’=2.4 Hz, J6’,5’=8.8 Hz, H- 6’), 6.73 (d, 1H, J6’,8’=2.4 Hz, H-8’), 6.07 (ca, 1H, JH,H=1.0 Hz, H-3’), 3.97 (t, 2H, JH,H=2.4 Hz, H-1), 3.37 (t, 2H, JH,H=2.4 Hz, H-6), 2.36 (d, 3H, JH,H=1.0 Hz, CH3), 1.78 (m, 2H, H-5), 1.62 (m, 2H, H-2), 1.44 (m, 4H, H-3, H-4) ppm. 13C-RMN (75.5 MHz, DMSO-d6) δ 161.8 (C=O),160.2 (C=N), 157.1 (C-7’), 154.8 (C-8a’), 153.4 (C-2’’), 150.2 (C-NH), 145.8 (C-3’’), 126.4 (C-5’), 116.4(C-4’’) 114.6 (C-3’), 113.0 (C-4a’), 112.4 (C-4’), 111.0 (C-6’), 101.1 (C-8’), 68.2 (C-6), 41.7 (C-1), 28.6 (CH2), 28.3 (CH2), 25.9 (CH2), 25.1 (CH2), 18.1 (CH3) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C23H26N5O3 ([M+H]+): 420.2030, encontrado: 420.2027. Parte experimental 230 9.8.6.4. N-Ciano-N’-(6-([3’,4’-dimetil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il]oxi)hexil)-N’’- piridin-4-ilguanidina (38) Se empleó 185b (46 mg, 0.16 mmol), 186b (29 mg, 0.12 mmol) y TEA (35 mg, 0.34 mmol) obteniéndose 38 como espuma blanca (45 mg, 85%). 1H-RMN (300 MHz, MeOD) δ 8.60 (d, 2H, J2’’,3’’= 6.2 Hz, H-2’’, H-6’’), 7.82 (d, 1H, J5’,6’=8.8 Hz, H- 5’), 7.58 (d, 2H, J3’,2’=5.2 Hz, H-3’’, H-5’’), 7.14 (dd, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, J6’,5’=8.8 Hz, H- 6’), 7.05 (d, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, H-8’), 4.29 (t, 2H, JH,H=6.3 Hz, H-1), 3.68 (t, 2H, JH,H=7.2 Hz, H-6), 2.65 (s, 3H, CH3), 2.41 (s, 3H, CH3), 2.10 (m, 2H, H-5), 1.94(m, 2H, H-2), 1.77 (m, 4H, H-3, H-4) ppm. 13C-RMN (75.5 MHz, MeOD) δ 164.0 (C=O),162.0 (C=N), 154.0 (C-7’), 153.4 (C-8a’), 150.0 (C-2’’), 148.4 (C-NH), 147.7 (C-3’’) 126.2 (C-5’), 118.9 (C-3’), 115.8 (C-4’’), 114.7 (C-4a’), 114.4 (C-4), 113.3 (C-6’), 101.5 (C- 8), 68.9 (C-6), 42.9 (C-1), 30.2 (CH2), 29.8 (CH2), 26.9 (CH2), 26.2 (CH2), 15.3, 13.1 (CH3-3’, CH3-4’) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C24H28O3N5 ([M+H]+): 434.2187, encontrado: 434.2186. 9.8.6.5. N-Ciano-N’-(6-([4’-trifluorometil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il]oxi)hexil)-N’’- piridin-4-ilguanidina (39) Se empleó 185c (53 mg, 0.16 mmol), 186b (29 mg, 0.12 mmol) y TEA (35 mg, 0.34 mmol) obteniéndose 39 como espuma amarillo claro (45 mg, 76%). 1H- RMN (500 MHz, CDCl3) δ 8.54 (d, 2H, J2’’,3’’= 5.9 Hz, H-2’’, H-6’’), 7.61 (d, 1H, J5’,6’=9.0 Hz, H-5’), 7.20 (d, 2H, J3’,2’=4.9 Hz, H-3’’, H-5’’), 6.90 (dd, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, J6’,5’=9.0 Hz, H-6’), 6.83 (d, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, H-8’), 6.60 (s, 1H, H-3’), 5.58 (sa, 1H, NH), 4.04 (t, 2H, JH,H=6.3 Hz, H-1), 3.38 (m, 2H, H-6), 1.84 (m, 2H, H-5), 1.66 (m, Parte experimental 231 2H, H-2), 1.53 (m, 2H, H-3) 1.44 (m, 2H, H-4) ppm. 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) δ 163.1 (C=O),159.7 (C=N), 157.7 (C-7’), 156.5 (C-2’’), 151.4 (C-NH), 142.2 (C-3’’), 141.8 (c, 2JCF= 32.7 Hz, C-4’), 126.5 (C-5’), 121.7 (c, 1JCF= 275.7 Hz, CF3), 117.0 (C-4’’), 116.2 (C-4a'), 113.9 (C-2’), 112.2 (c, 3JCF= 5.7 Hz, C-3’), 107.1 (C-6’) 102.0 (C-8’), 68.9 (C-6), 42.5 (C-1), 29.2 (CH2), 28.9 (CH2), 26.6 (CH2), 25.7 (CH2) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C23H23F3N5O3 ([M+H]+): 474.1748, encontrado: 474.1754. 9.8.7. Método general para la preparación de tioureas con potencial actividad inhibitoria de NAMPT A una solución de 185a, 185b ó 185c (1.0 equiv.) en THF (5 mL), se adicionó 3-piridinil isotiocianato (1.5 equiv.) y se refluyó durante 4 h. Al finalizar la reacción, se concentró a sequedad y el crudo se purificó mediante cromatografía en columna empleando como eluyente una mezcla de CH2Cl2‒MeOH (90:1→80:1). 9.8.7.1. N-(6-[(4’-Metil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il)oxi]hexil)-N’-(piridin-3-il)tiourea (40) Se empleó 185a (34 mg, 0.12 mmol) y 3-piridinil isotiocinanato (25 mg, 0.19 mmol) obteniéndose 40 como espuma blanca (14 mg, 27%). 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 8.53 (dd, 1H, J2’’,4’’=2.5 Hz, H-2’’), 8.50 (dd, 1H, J6’’,4’’=1.1 Hz, J6’’,5’’=4.7 Hz, H-6’’), 7.88 (sa, 1H, NH), 7.71 (ddd, 1H, J5’’,6’’=6.8 Hz, H-4’’), 7.48 (d, 1H, J5’,6’=8.8 Hz, H-5’), 7.36 (m, 1H, H-5’’), 6.84 (dd, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, J6’,5’=8.8 Hz, H-6’), 6.77 (d, 1H, J8’,6’=2.5 Hz, H-8’), 6.16 (sa, 1H, NH), 6.12 (ca, 1H, JH,H=1.2 Hz, H-3’), 4.99 (t, 2H, JH,H=6.5 Hz, H-6), 3.49 (m, 2H, H-1), 2.39 (d, 3H, JH,H=1.2 Hz, CH3), 1.81 (m, 2H, H-5), 1.64 (m, 2H, H-2), 1.51 (m, 2H, H-4), 1.43 (m, 2H, H-3) ppm. 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) δ 181.4 (C=S), 162.3 (C=O), 161.7 (C-7’), 155.4 (C-8a’), 153.0 (C-4’), 147.9 (C-6’’), 146.6 (C-2’’), 132.7 (C-3’’), 125.7 (C-4’’), 124.4 (C-5’), 113.6 (C- Parte experimental 232 5’’), 112.9 (C-3’), 111.9 (C-6’), 101.4 (C-8’), 68.5 (C-6), 45.5 (C-1), 29.0 (CH2), 28.9 (CH2), 26.7 (CH2), 25.5 (CH2), 18.8 (CH3) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C22H26N3O3S ([M+H]+): 412.1689, encontrado: 412.1701. 9.8.7.2. N-(6-[(3’,4’-Dimetil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il)oxi]hexil)-N’-(piridin-3- il)tiourea (41) Se empleó 185b (59 mg, 0.20 mmol) y 3-piridinil isotiocinanato (42 mg, 0.31 mmol) obteniéndose 41 como espuma blanca (14.8 mg, 17%). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8.53 (dd, 1H, J2’’,6’’=2.4 Hz, H-2’’), 8.46 (dd, 1H, J6’’,4’’=1.3 Hz, J6’’,5’’=4.7 Hz, H-6’’), 8.13 (sa, 1H, NH), 7.79 (da, 1H, J5’’,6’’=8.2 Hz, H-5’’), 7.63 (dd, 1H, J5’,6’=8.8 Hz, H-5’), 7.33 (m, 1H, H-5’’), 6.82 (dd, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, J6’,5’=8.9 Hz, H-6’), 6.77 (d, 1H, J8’,6’=2.5 Hz, H-8’), 6.34 (sa, 1H, NH), 3.97 (t, 2H, JH,H=6.4 Hz, H-6), 3.64 (m, 2H, H-1), 2.36 (s, 3H, CH3), 2.16 (s, 3H, CH3), 1.79 (m, 2H, H-5), 1.65 (m, 2H, H-2), 1.46 (m, 4H, H-4 y H-3) ppm. 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) δ 181.4 (C=S), 162.8 (C=O), 161.1 (C-7’), 153.4 (C-8a’), 146.9 (C-4’), 146.8 (C-6’’), 145.8 (C-2’’), 134.8 (C-3’’), 125.3 (C-4’’), 123.9 (C-5’), 118.6 (C-5’’), 114.0 (C-3’), 112.6 (C-6’), 101.0 (C- 8’), 68.3 (C-6), 45.1 (C-1), 29.8 (C-2), 28.9 (C-5), 26.6 (C-3), 25.7 (C-4), 15.2 (CH3), 13.3 (CH3) ppm. HRESI-MS m/z calcd. para C23H28N3O3S ([M+H]+): 426.1846, encontrado: 426.1855. 9.8.7.3. N-(6-[(4’-Trifluorometil-2’-oxo-2’H-cromen-7’-il)oxi]hexil)-N’-(piridin-3- il)tiourea (42) Parte experimental 233 Se empleó 185c (33 mg, 0.10 mmol) y 3-piridinil isotiocinanato (20 mg, 0.15 mmol) obteniéndose 42 como espuma amarilla (19 mg, 40%). 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 8.53 (m, 2H, H-2’’, H-6’’), 7.73 (sa, 1H, NH), 7.65 (da, 1H, J5’’,6’’=5.2 Hz, H- 4’’), 7.38 (m, 1H, H-5’’), 6.90 (dd, 1H, J6’,8’=2.5 Hz, J6’,5’=9.0 Hz, H-6’), 6.77 (d, 1H, J8’,6’=2.5 Hz, H-8’), 6.60 (s, 1H, H-3), 6.01 (sa, 1H, NH), 4.02 (t, 2H, JH,H=6.4 Hz, H- 6), 3.65 (m, 2H, H-1), 1.82 (m, 2H, H-5), 1.64 (m, 2H, H-2), 1.52 (m, 2H, H-4), 1.42 (m, 2H, H-3) ppm. 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) δ 181.4 (C=S), 163.2 (C-7’), 159.7 (C=O), 156.5 (C-8a’), 148.2 (C-6’’), 146.7 (C-2’’), 141.8 (c, 1C, 2JCF= 33.1 Hz, C-4’), 132.9 (C-3’’), 126.5 (C-4’’), 124.6 (C-5’), 121.7 (c, 1C, 1JCF= 272.1 Hz, CF3), 118.5 (C-5’’), 113.9 (C-4a), 112.2 (c, 1C, 3JCF= 5.7 Hz, C-3’), 107.1 (C-6’), 102.0 (C-8’), 68.7 (C-6), 45.6 (C-1), 29.0 (CH2), 28.9 (CH2), 26.7 (CH2), 25.7 (CH2) ppm. HRESIMS m/z calcd. para C22H23F3N3O3S ([M+H]+): 466.1407, encontrado: 466.1419. 234 10. ANEXO Espectroscopía de RMN 241 Espectroscopía de RMN Figura 10.7. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 4. 242 Espectroscopía de RMN Figura 10.8. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 4. 243 Espectroscopía de RMN Figura 10.9. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 5. 244 Espectroscopía de RMN Figura 10.10. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 5. 245 Espectroscopía de RMN Figura 10.11. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 6. 246 Espectroscopía de RMN Figura 10.12. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 6. 247 Espectroscopía de RMN Figura 10.13. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 7. 248 Espectroscopía de RMN Figura 10.14. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 7. 249 Espectroscopía de RMN Figura 10.15. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 8. 250 Espectroscopía de RMN Figura 10.16. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 8. 257 Espectroscopía de RMN Figura 10.23. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 12. 258 Espectroscopía de RMN Figura 10.24. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 12. 259 Espectroscopía de RMN Figura 10.25. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 13. 260 Espectroscopía de RMN Figura 10.26. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 13. 261 Espectroscopía de RMN Figura 10.27. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 14. 262 Espectroscopía de RMN Figura 10.28. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 14. 263 Espectroscopía de RMN Figura 10.29. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 15. 264 Espectroscopía de RMN Figura 10.30. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 15. 265 Espectroscopía de RMN Figura 10.31. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 16. 266 Espectroscopía de RMN Figura 10.32. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 16. 273 Espectroscopía de RMN Figura 10.39. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del compuesto 20. 274 Espectroscopía de RMN Figura 10.40. Espectro de 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) del compuesto 20. 275 Espectroscopía de RMN Figura 10.41. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del compuesto 21. 276 Espectroscopía de RMN Figura 10.42. Espectro de 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) del compuesto 21. 277 Espectroscopía de RMN Figura 10.43. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 22. 278 Espectroscopía de RMN Figura 10.44. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 22. 279 Espectroscopía de RMN Figura 10.45. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 23. 280 Espectroscopía de RMN Figura 10.46. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 23. 281 Espectroscopía de RMN Figura 10.47. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 24. 282 Espectroscopía de RMN Figura 10.48. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 24. 289 Espectroscopía de RMN Figura 10.55. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 28. 290 Espectroscopía de RMN Figura 10.56. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 28. 291 Espectroscopía de RMN Figura 10.57. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 29. 292 Espectroscopía de RMN Figura 10.58. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 29. 293 Espectroscopía de RMN Figura 10.59. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 30. 294 Espectroscopía de RMN Figura 10.60. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 30. 295 Espectroscopía de RMN Figura 10.61. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) del compuesto 31. 296 Espectroscopía de RMN Figura 10.62. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CD3OD) del compuesto 31. 297 Espectroscopía de RMN Figura 10.63. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 32. 298 Espectroscopía de RMN Figura 10.64. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 32. 305 Espectroscopía de RMN Figura 10.71. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del compuesto 36. 306 Espectroscopía de RMN Figura 10.72. Espectro de 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) del compuesto 36. 307 Espectroscopía de RMN Figura 10.73. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del compuesto 37. 308 Espectroscopía de RMN Figura 10.74. Espectro de 13C-RMN (75.5 MHz, DMSO-d6) del compuesto 37. 309 Espectroscopía de RMN Figura 10.75. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del compuesto 38. 310 Espectroscopía de RMN Figura 10.76. Espectro de 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) del compuesto 38. 311 Espectroscopía de RMN Figura 10.77. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 39. 312 Espectroscopía de RMN Figura 10.78. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 39. 313 Espectroscopía de RMN Figura 10.79. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 40. 314 Espectroscopía de RMN Figura 10.80. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 40.