Avances en la cura de la ELA

PAULA CAMPO MAZUECOS UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA AVANCES EN LA CURA DE LA ELA 1 PAULA CAMPO MAZUECOS SEVILLA, JUNIO 2023 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA TUTOR: JOSE ANTONIO LEBRÓN ROMERO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA AVANCES EN LA CURA DE LA ELA TRABAJO FIN DE GRADO UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA GRADO EN FARMACIA 2 RESUMEN La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad en la cual se produce una degeneración neuronal de manera progresiva. Dicha enfermedad va a afectar al paciente en las actividades de su vida cotidiana, ya que van a verse afectadas regiones del organismo desde las extremidades, las cuales ira dejando de mover poco a poco por esa neurodegeneración, hasta el aparato respiratorio, provocando así una parada respiratoria la cual va a producir su muerte. Hay dos tipos de ELA, la esporádica y la familiar. Realmente en la actualidad hay más porcentaje de personas con ELA esporádica que familiar. Según la mutación del gen que presente el paciente, la enfermedad se desarrollará de una forma u otra y la progresión será más lenta o más rápida. La esperanza de vida de estas personas es muy corta y a pesar de toda la investigación que hay, aún no han descubierto ningún fármaco efectivo al 100% y que la pueda frenar. Los fármacos que se emplean en la enfermedad, principalmente, son el Riluzol y la Edaravona. La enfermedad va a tener como signos característicos mutaciones en genes determinados los cuales están presentes en la ELA como son TDP-43, SOD1, FUS, entre otros. Además, debido a estas mutaciones se van a producir agregaciones de proteínas las cuales van a producir inclusiones que derivaran en anomalías. Actualmente, se está haciendo mucho hincapié en la terapia génica, realizando estudios sobre vectores, oligonucleótidos antisentido, Tocilizumab, Tofersen y el ensayo CENTAUR, con los que pretenden aumentar la supervivencia y disminuir la progresión de la enfermedad. Además de la terapia génica, también destaca el sistema CRISPR/Cas9 que se administrara con la intención de poder eliminar una expansión repetida de hexanucleotidos que provocan modificaciones en el ADN de pacientes con ELA. Otros avances, también, serán Tofersen y el ensayo CENTAUR con otro fármaco. Palabras clave: agregación proteica, terapia génica, CRISPR/Cas9, TDP-43, SOD1. 3 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1.1. La enfermedad 4 1.1.1. Descripción de la enfermedad 4 1.1.2. Factores de la enfermedad 5 1.1.3. Síntomas de la enfermedad 6 1.1.4. Diagnóstico y técnicas empleadas 6 1.1.5. Moléculas implicadas en la ELA: genes y proteínas 8 1.1.5.1. TDP-43 9 1.1.5.2. SOD1 11 1.1.5.3. FUS 13 1.1.5.4. Otras 14 1.1.6. Agregación proteica 15 2. OBJETIVOS 17 3. METODOLOGÍA 17 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 18 4.1. Tratamiento 18 4.2. Avances en el tratamiento 20 4.2.1. Terapia génica 20 4.2.2. CRISPR/Cas9 26 4.2.3. Ensayo “CENTAUR” 27 4.2.4. Tofersen 27 4.2.5. Tocilizumab 29 5. CONCLUSIONES 30 6. BIBLIOGRAFÍA 31 4 1. INTRODUCCIÓN 1.1. LA ENFERMEDAD 1.1.1. DESCRIPCIÓN DE LA ENFERMEDAD La ELA, esclerosis lateral amiotrófica, es un trastorno neurodegenerativo que causa la muerte de las neuronas motoras de forma progresiva (Duranti, Villa, 2022). Las neuronas que se ven afectadas son, tanto las superiores de la corteza y el tracto corticoespinal, como las inferiores de la medula espinal (Berning, Walker, 2019). Se produce una parálisis del músculo esquelético que desemboca en la degeneración de dichas neuronas motoras (Duranti, Villa, 2022). La muerte es provocada por una insuficiencia respiratoria originada por una denervación, y posterior atrofia, de determinados grupos musculares, entre los que se encuentran los respiratorios (Berning, Walker, 2019). La edad media de aparición de dicha enfermedad está entre los 30 y los 83 años, aunque es menos frecuente entre los jóvenes. La supervivencia de una persona enferma de ELA va de 1 a 12 años. Además, se ha observado que, dentro de una misma familia, la edad de inicio puede variar, por lo que se concluyó que los factores genéticos y ambientales afectan a la expresión de la enfermedad (Mackenzie, Rademakers, 2008). La enfermedad puede tener un origen hereditario, ELA familiar, o no hereditario. Este último supone un 85-90% de los casos. Dos de los sistemas principales de la degradación celular son: el sistema ubiquitina-proteosoma (UPS) y el sistema de autofagia-lisosomal (ALP). El primero es el responsable de degradar proteínas tanto funcionales como disfuncionales. El segundo se encarga de degradar orgánulos completos, grandes agregados de proteínas y proteínas individuales. Habitualmente, las patologías relacionadas con las proteínas, suelen ser trastornos mixtos, por lo que, las alteraciones que nos podemos encontrar en una enfermedad neurodegenerativa dada, también pueden estar presentes en otras (Duranti, Villa, 2022). 5 Un gran porcentaje de pacientes enfermos de ELA, desarrollan déficits cognitivos. Además, suelen presentar en la corteza frontotemporal y en el hipocampo brotes de células neuronales embrionarias (Mackenzie, Rademakers, 2008). También existe otro tipo de ELA, denominada ELA juvenil. En un estudio se vio que estos pacientes presentaban variantes en SPTLC1 (subunidad 1 de cadena larga de serina palmitoiltransferasa). Se vio que SPTLC1 se expresaba en las neuronas motoras del tejido sano de la medula espinal. Estos pacientes tenían un cuadro clínico caracterizado por una restricción del crecimiento, deterioro cognitivo, amiotrofia, hiperreflexia, parálisis de las cuerdas vocales e insuficiencia respiratoria (Johnson et al., 2021). 1.1.2. FACTORES DE LA ENFERMEDAD No se conocen aún los factores que provocan esta enfermedad. No obstante, diferentes estudios han mostrado que en los pacientes enfermos de ELA aparece un aumento anormal del tono muscular, además de darse una agregación proteica. El transporte entre los axones también se encuentra alterado y el metabolismo del calcio aumenta. La combinación de todos estos mecanismos anómalos, los cuales producen estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, citotoxicidad y cambios en el metabolismo del ARN (ácido ribonucleico), son los que van a provocar la muerte de las neuronas motoras (Duranti, Villa, 2022). Estudios realizados en ratones que presentaban la mutación G93A (sustitución ácida de glicina por alanina en el codón 93), desvelaron que cuando se inician los síntomas de la enfermedad, los marcadores de la oxidación se duplican. Además, por otro lado, la respiración celular, el ATP (adenosín trifosfato) intracelular y los elementos mitocondriales se encuentran disminuidos. Todo esto conlleva una desregulación homeostática en las motoneuronas, y como consecuencia de una revisión sistemática de 45 artículos, los autores proponen que eso sea un signo que caracteriza a la enfermedad (Kaur et al., 2016). 6 1.1.3. SÍNTOMAS DE LA ENFERMEDAD La enfermedad presenta una fase inicial de diagnóstico a la que le sigue una segunda fase de paresia. En la primera fase de la enfermedad aparecen una serie de síntomas como una disminución sensorial en la zona lumbar y en las caderas, aparece dolor en las rodillas y una sensación de calor. Conforme comienza la segunda fase, estos síntomas van remitiendo. Sin embargo, algunos pacientes comienzan a presentar trastornos de vejiga, ataxia o dolor, aunque estos síntomas no son tan frecuentes (Andersen, 2006). 1.1.4. DIAGNÓSTICO Y TÉCNICAS EMPLEADAS Para el diagnóstico de la ELA es importante tener en cuenta los hallazgos clínicos característicos y el historial completo del paciente. Hay un síntoma a destacar de esta enfermedad que es la pérdida de peso, que puede proporcionar información sobre la progresión de la misma. Para realizar el diagnostico se mide, fundamentalmente, la actividad de nervios y músculos. Esto se hace a través de una electromiografía y otros estudios de conducción nerviosa. De esta forma se puede distinguir entre el daño muscular y el nervioso. Para poder medir el daño causado en las neuronas motoras, se emplea la estimulación magnética transcraneal. En caso de no saber exactamente de qué enfermedad se trata, se podrían descartar otras enfermedades relacionadas con la ELA mediante una resonancia magnética de imagen (MRI) (Kaur et al., 2016). Otra de las técnicas útiles en el diagnóstico de la ELA es la realización de una biopsia de la piel. Esto se puede explicar si se considera que en el extremo del axón de las fibras nerviosas se puede ver daño mitocondrial. Los biomarcadores también pueden emplearse para el diagnóstico de la ELA. Aquellos relacionados con el estrés oxidativo, la excitotoxicidad, la inflamación, la disfunción metabólica, etc. Es importante destacar el biomarcador creatinina quinasa, ya que niveles bajos de esta enzima podrían indicar una supervivencia prolongada en pacientes con ELA (Kaur et al., 2016). Uno de los biomarcadores que más se utiliza es una especie corta de ARNnc (ARN no codificante), que se denomina microARN (miARN) (de menos de 100 nucleótidos de longitud), dado 7 que tiene facilidad para estar presente en fluidos como son la sangre, el líquido cefalorraquídeo o incluso la orina (Joilin et al., 2019). En la enfermedad de la ELA empieza a tener un papel importante la rehabilitación. Según varios estudios, la fisioterapia puede ayudar a los pacientes a tener una mejor calidad de vida (Bello-Haas, 2018). En estudios realizados post mortem, se ha visto que la ELA también incluye fallos fisiológicos que no son motores. En relación a ello, los fisioterapeutas pueden hacer preguntas al paciente sobre diferentes cambios sensoriales que hayan tenido, lo que va a ayudar en la detección de nuevos síntomas de esta enfermedad y permitirá evaluar la progresión de la misma en cada persona. En este sentido, tiene una gran importancia la comunicación entre el paciente y el profesional de la salud, ya que, cuando ésta es buena, los profesionales pueden hacer una clasificación más detallada de la enfermedad de la ELA, facilitando así, el diagnóstico y las necesidades de tratamiento (Bello-Haas, 2018). Se ha desarrollado un nuevo sistema de clasificación de la ELA, que tiene en cuenta 4 aspectos. La etapa en que se encuentra la enfermedad, el fenotipo, el diagnóstico y los criterios de la Federación Mundial de Neurología, los cuales se conocen como criterios de El Escorial. Su uso se debe a que facilitan el diagnóstico de la enfermedad. Estos criterios tienen en cuenta la presencia de degeneración de la motoneurona inferior y superior, la expansión progresiva de síntomas y la ausencia de otras enfermedades que puedan provocar también daño neurológico y tengan síntomas en común (Bello-Haas,2018). De todos los daños causados por la ELA, el más importante es el que afecta al sistema respiratorio, ya que los enfermos de ELA suelen morir por un fallo de dicho sistema. Los músculos se debilitan y, por lo tanto, estos pacientes van a respirar con dificultad. A ello se une las limitaciones para expulsar secreciones, lo que no les permite toser con facilidad. Por eso, los fisioterapeutas tienen que realizar técnicas y pruebas, como es la del flujo espiratorio, para valorar la capacidad respiratoria que tiene la persona. Una de las técnicas usadas para despejar las vías respiratorias es el apilamiento 8 de la respiración. También sugieren el uso de dispositivos para aumentar la tos, ya que así consiguen que se dé un aclaramiento de las secreciones (Bello-Haas, 2018). 1.1.5. MOLÉCULAS IMPLICADAS EN LA ELA: GENES Y PROTEÍNAS Es en el año 1995 cuando se aísla por primera vez la proteína que causaba, fundamentalmente, la ELA, la TDP-43. Investigaciones posteriores pusieron de manifiesto que otras proteínas también estarán implicadas en la aparición de la enfermedad, como son la SOD1(superóxido dismutasa 1) o la FUS (fusionado en el sarcoma) (Duranti, Villa, 2022). En 2014 se empiezan a estudiar los genes asociados a la enfermedad, como son los MATR3, CHCHD10, TUBA4A, TBK1, NEK1, C21orf2 y CCNF. (Chia et al., 2018). Dichos genes presentan interacciones entre ellos, ver figura 1. Los genes mencionados tendrán información necesaria para codificar proteínas que serán importantes en procesos del organismo. Cabe destacar que el gen TARDBP codifica la proteína TDP-43, el gen SOD1 codifica a la proteína SOD1 y el gen FUS a la proteína FUS. FIGURA 1. Interacciones entre los genes (Chia et al., 2018). 15 retículo endoplásmico. Los pacientes que presentan mutaciones en NEK1 no son muchos, pero en caso de que tengan esa mutación, sufren la ELA típica, sin demencia. Tanto NEK1 como C21orf2 interactúan entre ellos, estando involucrados en el ensamblaje de los microtúbulos, la reparación del ADN y la función de las mitocondrias (Chia et al.; 2018). En el caso del gen CCNF, se encontraron mutaciones del mismo en personas de raza caucásica enfermas de ELA y de demencia frontotemporal, o de ambas enfermedades juntas. Este gen se encarga de reconocer el sustrato de ubiquitina-ligasa Skp-culin-F-box E3, responsable de etiquetar proteínas con ubiquitina para que puedan ser degradadas. Cuando hay una mutación en este gen, hay un aumento en las proteínas etiquetadas, donde se encuentra la TDP-43, por lo que la vía de degradación se va a ver alterada provocando patologías en la proteína TDP-43 (Chia et al., 2018). Para terminar, tenemos las cromograninas, que son proteínas presentes en las vesículas neurosecretoras y en el sistema neuroendocrino. Estas proteínas tienen una acción similar a las chaperonas, de tal forma que ayudan en la secreción del SOD1 mutado, causando así, la muerte de las células (Kaur et al., 2016). 1.1.6. AGREGACIÓN PROTEICA Para que las proteínas presenten una estructura bien definida, hacen falta una serie de plegamientos. En el caso de que esos plegamientos no sean los adecuados, se producirá una agregación de las mismas. En la enfermedad de la ELA, es característico observar agregados proteicos que se presentan en forma de inclusiones ubiquitinadas. Las podemos encontrar en las neuronas y en las células gliales. Hay determinadas proteínas que, dada su naturaleza, presentan una mayor tendencia a agregarse tras sufrir errores en el proceso de síntesis proteica. Las células de nuestro organismo contienen chaperonas, que son proteínas que se encargan de que el plegamiento de otras proteínas sea el adecuado. Si se produce una anomalía en las chaperonas, el control del plegamiento no sería el correcto y, como consecuencia, se van a producir agregados proteicos. Además de las causas, ya mencionadas, que pueden provocar la agregación, también podemos encontrar otras, ver figura 3. Es importante destacar que, como se ha 16 indicado anteriormente, la formación de estos agregados está íntimamente ligada a la aparición de la enfermedad que conlleva la aparición de mecanismos de neurodegeneración (Duranti, Villa, 2022). Por otro lado, los procesos de UPS (sistema de ubiquitina-proteasoma) y autofagia, son imprescindibles para la degradación de las proteínas, por lo que también están muy relacionados con la presencia de agregados o inclusiones. Es decir, se sabe que la agregación de proteínas puede causar una interrupción de las vías primarias de degradación de las mismas. Así pues, es clave para la investigación sobre la ELA conocer los mecanismos de estos procesos (figura 4) para, así, conseguir nuevos tratamientos para dicha enfermedad o avances en los ya existentes (Duranti, Villa, 2022). Se realizó un estudio sobre el gen SOD1, con cultivos celulares, donde se sembraron agregados de SOD1 que ya estaban desarrollados. Se produjo una rotura de la célula debido al proceso de macropinocitosis, por lo que provocaron un mal plegamiento de la proteína SOD1, la cual se denomina igual que el gen, y, en consecuencia, la agregación de proteínas. Estos agregados que se formaban, se FIGURA 3. Procesos que intervienen en la agregación de proteínas (Duranti, Villa, 2022) 17 transportaban a los tejidos cercanos mediante nanotúbulos. Este proceso de formación de agregados se convirtió en algo cíclico (Kaur et al., 2016). 2. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo es analizar los avances en el tratamiento de la ELA mediante el examen de los avances en la comprensión de los mecanismos biológicos subyacentes a la enfermedad. Se sabe que la ELA es una enfermedad compleja, que involucra múltiples sistemas biológicos y procesos patológicos. Uno de estos se encuentra relacionado con la agregación y acumulación anormal de proteínas en las células nerviosas. 3. METODOLOGíA El trabajo se ha realizado a través de búsqueda de artículos en la base de datos Pubmed y Google schoolar y Web of Science. Se ha realizado una búsqueda de artículos empleando como filtro las palabras clave “TDP-43”, “SOD1”, “gene therapy”, “cure of FIGURA 4. Agregación proteica y procesos implicados (Blokhuis et al., 2013) 18 ALS”, “treatment of ALS”, entre otras. Se han seleccionado los artículos siguiendo unos criterios de selección. El primer criterio de selección ha sido el título del artículo, el cual tenía que mencionar aspectos relacionados con las proteínas y la genética involucrados en la aparición de la ELA. El segundo criterio ha sido el año de publicación, el cual estaba comprendido entre 2018 y 2022, a pesar de que hay algunos artículos que son de 2008 o de 2016. No obstante, también se consideraron artículos publicados hace más tiempo, dado que la investigación sobre la ELA se inició hace mucho tiempo, aunque los avances en su tratamiento han sido muy lentos. Otro criterio de selección fue tomar artículos que hablaran de la enfermedad desde un punto de vista fisiológico, que describieran signos y síntomas para poder entender mejor la ELA. La mayoría de los artículos escogidos son revisiones, dado que pueden proporcionar una idea más clara de las investigaciones llevadas a cabo sobre la ELA, de los fracasos y de los avances en su tratamiento. Tras haber seleccionado los artículos, se ha organizado la información para estructurar la introducción y los resultados. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. TRATAMIENTO Actualmente no existe ningún tratamiento que pueda frenar la enfermedad. Los tratamientos existentes solo son capaces de alargar la esperanza de vida, e intentan mejorar la calidad de la misma. Se emplean, fundamentalmente el Riluzol, la Edaravona (Chia et al., 2018) y el Bexaroteno (Kaur et al., 2016); ver figura 5. Además del Redelsemtiv, el cual no se está empleando. El Riluzol es un antagonista del glutamato, que se encarga de prolongar la supervivencia de 2 a 3 meses en personas menores de 75 años, aunque su calidad de vida apenas mejora. Sin embargo, la Edaravona si mejora la calidad de vida de los pacientes, pero, por el contrario, no hay estudios que confirmen que aumenta la esperanza de vida (Chia et al., 2018). Este medicamento es un eliminador de radicales 19 libres (Berning, Walker, 2019). El Bexaroteno es un agonista del receptor retinoide X y se observó en un estudio que la supervivencia de los pacientes aumentaba en un 30%. Se cree que este último fármaco actúa como un agente neuroprotector (Kaur et al., 2016). Otro fármaco que se ha empleado es el Redelsemtiv. Se realizó un ensayo, de este fármaco, de fase 2b en pacientes con ELA, pero no se alcanzó el análisis primario. Esto pudo deberse a que los resultados obtenidos en dicho análisis mostraron que los síntomas de la enfermedad se ralentizaban más en el grupo placebo que para los demás. Una de las causas pudo ser que los criterios de inclusión favorecen a los pacientes de progresión lenta. Por tanto, no se conocen con seguridad cuáles son los efectos de este fármaco (Shefner et al., 2021-2022). Los pacientes de ELA necesitan un tratamiento paliativo, el cual va a ir en aumento conforme vaya progresando la enfermedad. Uno de los cuidados que se les suele proporcionar es la ventilación no invasiva, dado que estos pacientes suelen morir por insuficiencia respiratoria. También se está utilizando la politerapia, que consiste en el uso de células madre o de la terapia génica. Por otra parte, dado que estudios previos habían mostrado que el plegamiento anómalo de las proteínas podía deberse a una metilación incompleta del SOD1, se les receta a los pacientes ingestas de Zn (Kaur et al., 2016). FÁRMACOS RILUZOL - Prolonga supervivencia de 2-3 meses. - No mejora calidad de vida EDARAVONA - No aumenta la supervivencia - mejora calidad de vida BEXAROTENO - Mejora la supervivencia en un 30% REDELSEMTIV No alcanzó el análisis 1º FIGURA 5. Fármacos de la ELA 20 4.2. AVANCES EN EL TRATAMIENTO 4.2.1. TERAPIA GÉNICA Como posible terapia prometedora en el tratamiento de la ELA, se puede considerar el uso de la terapia génica, la cual a su vez va a presentar diferentes estrategias, ver figura 5. Esta puede emplearse para reemplazar el gen mutado por uno sano, para reducir la expresión del gen anómalo, para adicionar genes que sean beneficiosos o para modificar los genes ya presentes. Las principales terapias estaban orientadas a las dos formas principales de la ELA. La ELA ligada al SOD1 y la ELA causada por mutaciones en C9orf72, el cual codifica para la proteína C9orf72 (proteína factor de intercambio de nucleótidos de guanina) (Capella et al., 2019). Para que la terapia génica sea la adecuada hay que tener en cuenta parámetros como definir la naturaleza del material genético empleado, definir la herramienta que se FIGURA 6. Estrategias de terapia génica (Amado, Davidson, 2021) 21 va a usar para llegar a las células diana y el modo en que se va a administrar dicho material genético. La forma de administración puede ser tanto in vivo como ex vivo. Si se da ex vivo va a ser a través de pruebas genéticas. Se modifican células in vitro y luego se implantan en el huésped. En caso de que sea in vivo, se introduce directamente el gen terapéutico en la célula diana. Hay determinados virus que se pueden emplear como vectores tras haber sido modificados, más adelante vamos a profundizar para explicar así los virus que más se emplean como vectores. Los vectores se usan en la terapia génica para poder proporcionar material genético al interior de las células. Estos virus empleados se diferencian entre ellos en el tropismo, que hace referencia a la especificidad que tiene un virus para infectar a un determinado tipo de célula o tejido, en la interacción con el genoma del huésped, en su capacidad de empaquetar el material genético, en la respuesta inmune que provocan y en la eficiencia de la transducción (Capella et al., 2019). Se conocen, en su mayor parte, las mutaciones relacionadas con la aparición de la ELA, sobre todo en la ELA familiar. La terapia génica pretende ser útil para todas las mutaciones. Sin embargo, los estudios más avanzados son los realizados para los genes SOD1 y C9orf72, como ya hemos mencionado anteriormente. El gen C9orf72 se caracteriza por una expansión de la repetición del hexanucleótido (HRE) GGGGCC (G4C2) más larga que en sujetos sanos. Está compuesto por 11 exones y se puede transcribir en 3 pre-ARNm: V1, V2 y V3. V2 y V3 codifican la forma larga de la proteína y V1 la forma corta. La proteína que codifica está muy presente en las neuronas y podría estar implicada en procesos de endocitosis y autofagia. Hay 3 mecanismos distintos relacionados con las HRE que pueden causar la enfermedad, pero aún no se conoce cuál de ellos provoca la neurotoxicidad. Se identificó un locus mutante en el brazo corto del cromosoma 9 (9p21), el cual se encuentra sobre todo en el 40% de los casos de la ELA familiar. Se realizó un estudio de la ELA en ratones con mutaciones en el SOD1, en los que se realizó una sustitución ácida de glicina por alanina en el codón 93 (G93A). Los ratones que presentaban SOD1- G93A (proteína con una sustitución ácida de glicina por alanina en el codón 93) tuvieron una vida más corta, presentaban parálisis progresiva y pérdida de las motoneuronas en la médula espinal. Para aumentar la esperanza de vida un poco 22 más, cerca de 157 días, se produjo un retrocruzamiento de ratones que presentaban SOD1-G93A con C57BL/6J (modelo de ratón) dando lugar al B6. SOD1-G93A. Posteriormente, se dio una reducción del número de copias del transgén, dando lugar a un ratón alternativo con una vida media de 300 días. Por otro lado, se dio una sobreexpresión del transgén SOD1-G93A dando lugar a parálisis y degeneración de la parte superior, además de una vida media de 130 días. Tras descubrir la HRE (Expansión de repetición de hexanucleótido) en C9orf72, se produjeron modelos de ratón que presentaban un cromosoma artificial bacteriano (BAC) con repeticiones de GGGGCC (G4C2) de diferentes longitudes. Estos ratones tenían de 500 repeticiones o de 100 a 1000 repeticiones, y tenían focos de ARN y DPR (proteínas repetidas de dipéptidos), sin la neurodegeneración típica de la ELA. Otros grupos de ratones, expresaban 450 y 500 repeticiones y tenían alteraciones conductuales y motoras (Capella et al., 2019). Por otro lado, se puede utilizar una terapia génica que no está basada en el uso de vectores. Esta es importante para los trastornos neurodegenerativos como es la enfermedad de la ELA. Este tipo de terapia se centra en la utilización de los ASO, oligonucleótidos antisentido, que son fragmentos cortos de ácidos nucleicos que se unen a un ARN mensajero, ARNm, para impedir que este sea traducido en la proteína correspondiente. También utilizan ARN de interferencia pequeños, siARN (Capella et al., 2019). Los ASO son selectivos y pueden evitar la interacción con proteínas de unión a ARN específicas, también pueden inducir la degradación del ARNm (ARN mensajero) a través de la activación de la ribonucleasa H (RNasa H). Por sí solos no atraviesan la BHE (Barrera hematoencefálica), pero se pueden administrar directamente al LCR (Líquido cefalorraquídeo) y ellos mismos se distribuyen por todo el encéfalo y la médula espinal, por lo que sería mejor opción para la terapia génica. En 2006 se demostró que al inyectar ASO en el LCR se daba una reducción del ARNm de SOD1 mediante la ribonucleasa H, aumentando así la supervivencia de ratones en 10 días. Esto llevó a la realización de ensayos clínicos en pacientes con ELA-SOD1 y se llegó a la conclusión de que era bien tolerada por los humanos y no producía efectos adversos graves. Además de emplear ASO (oligonucleótido antisentido) para la reducción de la proteína SOD1, se emplearon ratones con ELA procedente de la mutación C9orf72. Se probó primero en células madre pluripotentes inducidas, en fibroblastos derivados de pacientes con mutaciones C9orf72 23 y en modelos de ratón. En este caso se administraba de manera interventricular. Se comprobó que mejoraba los déficits cognitivos y conductuales (Jiang et al., 2016). Tras probar este modelo en ratones transgénicos, se realizó un ensayo clínico de fase I/II. Se observó, que, si se administraba de forma repetida, por vía intratecal (entre dos vertebras de la parte inferior de la columna vertebral y alrededor de la médula espinal) a enfermos de ELA, se observaban mejoras en la sintomatología, lo que permitiría considerarlo como un nuevo tratamiento a utilizar. Sin embargo, cuando las administraciones se hacían directamente en el LCR (líquido cefalorraquídeo), se observaban complicaciones. Es pues necesario seguir con estas investigaciones (Capella et al.; 2019). El ARN de interferencia es postranscripcional y produce el silenciamiento génico. Se trata de dúplex de ARN de doble cadena de 19 a 23 nucleótidos que se procesan dentro de la célula y se ensamblan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN. Puede producir también cambios en la expresión génica, promoviendo así la degradación del ARNm, la manipulación alternativa de empalme y el silenciamiento transcripcional. El siARN (ARN pequeño de interferencia) puede ser expresado mediante un microARN artificial o un siARN sintético. Los siARN sintéticos son menos estables debido a su degradación. Se usó siARN en ensayos para que silenciara la producción de la proteína SOD1. No obstante, los resultados no fueron buenos debido a la inestabilidad del siARN que puede ser degradado, entre otros, por las nucleasas. Esto supondría que habría que administrar dosis demasiado altas, lo que pueden provocar toxicidad. En base a lo anterior, se iniciaron investigaciones donde se usaban como vectores para el material genético nanosistemas como pueden ser los liposomas o las nanopartículas (Capella et al.; 2019). La idea de diseñar y preparar vectores virales, ya mencionados, para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, tiene como objetivo superar la limitación de atravesar la BHE (barrera hematoencefálica). Los más empleados en la terapia génica son los vectores derivados de lentivirus, los AAV (virus adenoasociados). Los lentivirus (LV) son miembros de la familia Retroviridae y de ellos derivan los vectores lentivirales. Hay diferentes generaciones de LV según el plásmido que va a empaquetarse. Es importante tener en cuenta que para que estos vectores sean útiles 24 en la terapia génica, se tienen que eliminar genes reguladores que los conviertan en inofensivos para el organismo. Entre estos se pueden mencionar el tat o el vpr. El primero es responsable de la oncogénesis y el segundo está involucrado en la apoptosis. Los vectores derivados de lentivirus tienen una buena capacidad para transducir la división a las células que no se dividen, además de penetrar fácilmente a través de las membranas nucleares. Son muy utilizados como vectores en la terapia génica. El pseudotipo más usado inicialmente fue la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), que presenta un amplio tropismo in vitro y preferencia por el tropismo neuronal in vivo, pero su uso realmente está limitado porque el tropismo no es selectivo y tiene dificultad para entrar en el SNC (sistema nervioso central). El que esta pseudotipado con la glicoproteína de la cubierta del virus de la rabia (RVG), transduce las neuronas motoras in vivo mediante el transporte retrógrado, dato importante. Se combinaron ambos tipos dando lugar a LV-HiRet. Este es un LV altamente eficiente en ratones y, además, más adecuado que el VSV-G, el cual tiene dificultad para entrar en el SNC. En la investigación de la ELA familiar, se usó el enfoque de ARN de interferencia en ratones. Se demostró que la inyección intraespinal bilateral de un VSV-G LV (lentivirus VSV-G) en ratones SOD1-G93A de 40 días de edad, produce una reducción de la aparición de la enfermedad en un 20% y protege la pérdida de motoneuronas. Por otro lado, se demostró también, que la inyección intramuscular de un RVG-LV (lentivirus RVG) que codifica un shARN (ARN de horquilla corta) para SOD1 produjo un retraso en el inicio de los síntomas de la ELA y aumentó la supervivencia en un 77% en ratones SOD1-G93A con 7 días de edad. A pesar de tener toda esta información, estos estudios no han alcanzado la fase clínica debido a los efectos no deseados que se observaron. Para su resolución, se está siguiendo esta línea de investigación en Cedars-Sinai Medical Center, EEUU, donde se corrige el LV (lentivirus) con células madres mesenquimales con un transgén del factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales y luego se inyectan en el paciente en la médula espinal (Capella et al.; 2019). Los virus AAV (virus adenoasociados) se pueden emplear para transferir genes in vivo en pacientes con enfermedades neurodegenerativas. Estos virus contienen ADN monocatenario y pertenecen a la familia Parvoviridae. Los AAV presentan una serie de 31 5. CONCLUSIÓN La Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) se encuentra en constante estudio. Hasta el momento, han descubierto genes relacionados con la enfermedad y cómo estas se manifiestan en el organismo, aunque dicho estudio no está concluido. Dependiendo del gen mutado que presentes, los síntomas de la enfermedad se desarrollarán de una forma u otra en el paciente. Se trata de una enfermedad que se da en edades tardías, no suele afectar a los jóvenes. Un factor muy importante es detectar la enfermedad a tiempo y hay técnicas de diagnóstico que se emplean para ello. Los pacientes necesitan de cuidados específicos los cuales van en aumento conforme el estado de la enfermedad empeora. Actualmente, solo se están empleando tres fármacos, y estos son el Riluzol, la Edaravona y el Bexaroteno. Hay un avance muy significativo en los últimos años en el estudio de la terapia génica, ya que se ha visto que puede ser una opción muy potente para frenar el progreso de la enfermedad, aunque por ahora, no se ha conseguido tener unos resultados satisfactorios (100%). Tras el análisis de la bibliografía consultado puedo exponer que aún quedan muchos años para poder conseguir un fármaco que pueda frenar la enfermedad, ya que es una enfermedad en la que intervienen numerosos factores y que presenta muchas alteraciones y genes mutados. A pesar de esto, los avances relacionados con los lentivirus, los oligonucleótidos antisentido, el sistema CRISPR/Cas9, entre otros, son muy prometedores. 32 6. BIBLIOGRAFÍA Amado DA, Davidson BL. Gene therapy for ALS: A review. Mol Ther. 2021;29(12):3345–58. Benatar M, Wuu J, Andersen PM, Bucelli RC, Andrews JA, Otto M, et al. Design of a randomized, placebo-controlled, phase 3 trial of tofersen initiated in clinically presymptomatic SOD1 variant carriers: The ATLAS study. Neurotherapeutics.2022;19(4):1248–58. Berning BA, Walker AK. The pathobiology of TDP-43 C-terminal fragments in ALS and FTLD. Front Neurosci. 2019;13:335. Blokhuis AM, Groen EJN, Koppers M, van den Berg LH, Pasterkamp RJ. Protein aggregation in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 2013;125(6):777–94. Cappella M, Ciotti C, Cohen-Tannoudji M, Biferi MG. Gene therapy for ALS-A perspective. Int J Mol Sci. 2019;20(18):4388. Cappella M, Pradat P-F, Querin G, Biferi MG. 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