Papel de la microglía asociada a neurodegeneración en un modelo atáxico

TRABAJO FIN DE GRADO DE CARÁCTER EXPERIMENTAL PAPEL DE LA MICROGLÍA ASOCIADA A NEURODEGENERACIÓN EN UN MODELO ATÁXICO María de los Santos Letrán Sánchez Grado en Farmacia Facultad de Farmacia · Universidad de Sevilla Curso 2022/2023 1 TRABAJO FIN DE GRADO DE CARÁCTER EXPERIMENTAL PAPEL DE LA MICROGLÍA ASOCIADA A NEURODEGENERACIÓN EN UN MODELO ATÁXICO María de los Santos Letrán Sánchez Grado en Farmacia Facultad de Farmacia · Universidad de Sevilla Curso 2022/2023 Tutora - Dra. Rocío Ruiz Laza Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 2 AGRADECIMIENTOS Me siento afortunada, esta etapa que hoy culmina me ha dejado una huella en el alma, y es por todas las personas que me han acompañado durante el camino en el que he tenido la enorme oportunidad de aportar mi granito de arena. La felicidad sólo es real cuando se comparte, por eso, me gustaría agradeceros todos aquellos momentos que me habéis regalado durante estos cinco intensos años. Gracias Rocío por transmitirme esa inmensa pasión que tienes por la ciencia desde el primer día que coincidimos en clase y por brindarme tu confianza durante estos años en los que he tenido la suerte de ser tu alumna interna y realizar este trabajo bajo tu tutela. Gracias por creer siempre en mí y hacerme sentir valiosa. A ti Paco, por guiarme en cada paso que he dado durante este tiempo, por hacerme disfrutar de cada instante y por enseñarme a confiar en mí misma. Por encima de todo esto, quiero agradecerte que hayas estado a mi lado, has sido luz y has sabido cómo sacarme una sonrisa, especialmente en aquellos momentos más duros. Gracias Alberto por preocuparte tanto, por tener siempre unas bonitas palabras para mí y por ofrecerme ese abrazo cuando más lo necesitaba. A ti Sonia, por ser más que amiga, mi mitad, por haber compartido todo este tiempo conmigo, por darme tantas anécdotas que contar y por aportarme esa seguridad que en muchas ocasiones me falta. A vosotros y a todos los que formáis parte del laboratorio BIO-113, gracias por abrirnos las puertas y permitirnos dar nuestros primeros pasos en la investigación, por compartir vuestro precioso trabajo y hacer que nos emocione la Neurociencia. Gracias por ser familia. También me gustaría dar las gracias a todos los que han sido compañeros y ahora son amigos. A los que han estado junto a mi durante la carrera, a los que llegaron más tarde, y a los que, por casualidad, he conocido hace poco. Gracias por hacerme más fácil el recorrido enseñándome a disfrutar de él y por contagiarme de vuestra alegría infinita. A cada uno de vosotros, os guardo un hueco en mi corazón para siempre. Por último, me gustaría agradecer a mis abuelos, por haberme educado en valores, por su dedicación, esfuerzo y entrega. A Raúl, por ser cómplice, por saber escucharme y por orientarme en cada rumbo que tomo en la vida. Y a ti mamá, gracias por mostrarme tu orgullo y admiración a través de esos ojos brillantes que llevaré eternamente en el recuerdo, y por darme fuerzas para seguir luchando por conseguir mis sueños. A los que, por suerte, puedo abrazar con fuerza y a los que no están, pero sé que no me sueltan de la mano, Gracias de verdad. 3 RESUMEN La mutación autosómica recesiva Gly483Glu, que ocurre espontáneamente en la proteína murina Herc1, conduce a su sobreexpresión en el cerebelo del ratón tambaleante (tbl). Esto provoca un descontrol de la muerte por autofagia de las células de Purkinje a partir de los dos meses de edad, así como una desregulación de la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR encargada de la correcta mielinización axonal. Ambas situaciones desencadenan la aparición de un síndrome neuromuscular atáxico caracterizado por alteraciones en el control motor. Ante esta perturbación homeostática, incluso antes de que ocurra la muerte de las células de Purkinje, la microglía presente en el cerebelo es capaz de iniciar una potente respuesta inmunitaria adquiriendo un perfil de fenotipo DAM con una sobreexpresión de Galectina-3 (Gal3). Con el objetivo de estudiar el papel de esta microglía en el proceso degenerativo que tiene como consecuencia la muerte de las células de Purkinje en el modelo tbl, se ha eliminado el gen lgals3 para suprimir la expresión de Gal3. Una vez generado el nuevo modelo murino, se cuantificaron mediante inmunohistoquímica las células de Purkinje y la densidad que ocupaban en el cerebelo de ratones de dos meses en muestras procedentes de tres grupos experimentales, WT, tbl y tbl/Gal3KO, así como el número de células microgliales presentes en la corteza y en la sustancia blanca de las secciones coronales de los mismos. Así se confirmó la hipótesis inicial en tanto que, al suprimir la expresión de Gal3, se recuperaba parcialmente la población de células de Purkinje. No se observaron cambios en la cantidad de células microgliales entre los grupos tbl y tbl/Gal3KO, pero sí entre ambos y el WT presentando los grupos experimentales una mayor cantidad en comparación con el control, siendo esta diferencia mayor en corteza a causa de la respuesta inflamatoria originada por el daño neuronal. PALABRAS CLAVE HERC1, tambaleante, Purkinje, Galectina-3, microglía 4 ÍNDICE RESUMEN Y PALABRAS CLAVE 3 INTRODUCCIÓN 5 Sistema Nervioso Central (SNC) y el movimiento 5 Sistema Ubiquitina-Proteasoma (UPS) 6 Proteínas HERC 7 Ratones tambaleantes 10 Manifestaciones clínicas 12 Microglía asociada a enfermedad (DAM) 13 Galectina-3 (Gal3) 14 OBJETIVOS 16 MATERIALES Y MÉTODOS 17 Animales experimentales 17 Obtención y preparación de muestras 18 Inmunohistoquímica (IHC) 19 Adquisición y análisis de imágenes 21 IHC con anticuerpo primario Anti-Calbindin 21 IHC con anticuerpo primario Anti-Iba1 22 Análisis estadístico 23 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24 Distribución de células de Purkinje y microglía en el eje anteroposterior del cerebelo 24 Cuantificación de células de Purkinje 26 Variación de la densidad de células de Purkinje (%) con respecto al número de células de Purkinje en el área medida (mm2) 28 Cuantificación de microglía 29 Corteza cerebelosa 30 Sustancia blanca cerebelosa 31 Variación de la cantidad de microglía en corteza con respecto al número de células de Purkinje en el área medida (mm2) y a la densidad de células de Purkinje (%) 33 Variación de la cantidad de microglía en sustancia blanca con respecto al número de células de Purkinje en el área medida (mm2) y a la densidad de células de Purkinje (%) 34 Variación de la cantidad de microglía en sustancia blanca con respecto a la cantidad de microglía en corteza por área medida (mm2) 35 CONCLUSIONES 37 ABREVIATURAS 38 BIBLIOGRAFÍA 39 5 INTRODUCCIÓN Desde finales del siglo XIX, gracias a los avances científicos que han tenido lugar hasta día de hoy, la esperanza de vida ha aumentado a un ritmo considerablemente rápido, lo que ha impulsado la aparición de una población notablemente envejecida con una alta tasa de morbilidad. Por esta razón, las enfermedades neurodegenerativas presentan cada vez una mayor incidencia en dicha población y, como consecuencia, suponen un impacto sociosanitario y económico verdaderamente relevante. La ciencia se está ocupando de investigar el origen de estas patologías con el objetivo de evitar, retardar su aparición y mejorar la calidad de vida de los pacientes, pero aún queda una gran parte etiológica que sigue siendo desconocida. El modelo murino tambaleante (tbl) utilizado para la realización de este estudio presenta un síndrome complejo de ataxia caracterizado por alteraciones en el control motor como consecuencia de la degeneración y muerte de las células de Purkinje en el cerebelo (Bachiller et al., 2020). Este modelo nos permitirá estudiar el papel de la microglía en la degeneración y muerte de las células de Purkinje. Sistema Nervioso Central (SNC) y el movimiento El cerebelo es la porción del encéfalo ubicada en la parte posterior del cráneo, entre el cerebro y el tronco encefálico, encargada principalmente de la función motora del organismo. En el corte histológico transversal (Figura 1), se pueden observar dos capas bien diferenciadas que forman surcos a lo largo de toda la estructura, la sustancia gris y blanca. La sustancia gris está constituida por la corteza, que es la capa más superficial, y hacia el interior de la misma se disponen la capa molecular, un estrato de células de Purkinje y la capa granular. Las células de Purkinje se encuentran bordeando la capa granular y proyectan su árbol dendrítico hacia la capa molecular donde se colocalizan con otras células neurogliales como las neuronas estrelladas y en cesta. Su axón atraviesa la capa granular hasta alcanzar la sustancia blanca donde se mieliniza para realizar la sinapsis con otras neuronas que componen los núcleos intracerebelosos (Treuting et al., 2017). Por otra parte, la sustancia blanca está formada fundamentalmente por axones recubiertos de vainas de mielina, una estructura multilaminar rica en lípidos que es generada por los oligodendrocitos para facilitar la transmisión del impulso nervioso, y que es la que confiere el color blanco a esta región cerebelar (Safaiyan et al., 2021). Dadas las similitudes en la histología cerebelar entre ratones y humanos, se utilizan modelos murinos para estudiar la fisiopatología humana de esta estructura encefálica. 6 A B Figura 1. Corte histológico del cerebelo de ratón (A) y humano (B) (Treuting et al., 2017). Capa molecular (Mo), estrato de células de Purkinje (Pk), capa granular (Gr) y sustancia blanca (WM). El cerebelo forma parte del Sistema Nervioso Central (SNC) y funciona como un centro de coordinación encargado de integrar la información que obtiene del Sistema Nervioso Periférico (SNP) a partir de los nervios sensitivos sobre la posición del cuerpo y su movimiento, y proporcionar señales nerviosas a los nervios motores con el objetivo de controlar la marcha y el equilibrio (Mashimo et al., 2009). Además, Dow y Moruzzi, en 1958, plantearon la hipótesis de que el cerebelo no solo controla el movimiento como tal, sino que contribuye al aprendizaje motor asociativo que asegura que los movimientos sean precisos y correctos, y posteriormente Marr, en 1969, localizó esta función propiamente en la corteza cerebelosa (Marr, 1969). Los movimientos voluntarios, por muy sencillos que sean, requieren de la interacción coordinada de múltiples estructuras que forman parte de la unión neuromuscular (UNM) ya que las conexiones que se establecen entre ellas son altamente especializadas. La UNM se compone de una motoneurona (MN) en la zona presináptica, cuyo soma se encuentra en el asta ventral de la médula espinal, una fibra muscular o placa motora terminal en la zona postsináptica y una célula de Schwann que actúa como soporte para las capas de mielina encargadas de transmitir el impulso nervioso saltatorio a través de los nódulos de Ranvier. Durante la sinapsis, cuando un potencial de acción llega a la zona presináptica, se libera acetilcolina como neurotransmisor a la hendidura sináptica, donde interacciona con los receptores nicotínicos localizados en la zona postsináptica. Esto provoca la entrada de cationes y el inicio de una despolarización, con la consecuente apertura de canales de sodio voltaje-dependientes en la membrana de la fibra muscular que desencadena el proceso de contracción muscular (Bachiller et al., 2020). Sistema Ubiquitina-Proteasoma (UPS) Tanto el desarrollo como la homeostasis de este sofisticado mecanismo requieren de la coordinación de un gran número de proteínas que son codificadas por distintos genes que 7 controlan la histogénesis, diferenciación y muerte celular dentro del Sistema Nervioso. Para asegurar que las proteínas implicadas funcionan correctamente debe mantenerse la proteostasis, lo que significa que debe haber un balance entre las proteínas recién formadas y las proteínas envejecidas o mal plegadas. Para lograr este equilibrio es fundamental el proceso de degradación proteica, llevado a cabo principalmente por las vías de autofagia/lisosoma y proteasoma (Pérez-Villegas et al., 2022). La mayoría de las enfermedades neurodegenerativas cursan con una alteración de la homeostasis proteica, que podría ser debido a un fallo en el Sistema Ubiquitina-Proteasoma (UPS) (Figura 2). El mecanismo de ubiquitinación está implicado en ambas vías de degradación proteica, entre otras muchas funciones. Un defecto en el funcionamiento de éste conlleva la acumulación de proteínas envejecidas y mal plegadas y, por ende, una disminución en la calidad de las proteínas que participan en la transmisión del impulso nervioso. Por este motivo, el UPS resulta una diana de gran interés para el estudio e investigación de enfermedades neurodegenerativas (Bachiller et al., 2020). En el UPS están involucrados tres grupos de enzimas, enzimas activadoras de ubiquitina (E1), enzimas conjugadoras de ubiquitina (E2) y enzimas ligasas de ubiquitina (E3), que llevan a cabo una cascada de reacciones catalíticas para ubiquitinar, etiquetar y translocar, respectivamente, las proteínas defectuosas hacia el proteasoma para su posterior degradación y renovación a proteínas funcionales (Bachiller et al., 2015, 2020). Figura 2. Esquema del Sistema Ubiquitina-Proteasoma (UPS) (Bachiller et al., 2020). La enzima E1, en una reacción dependiente de ATP, activa a una molécula de ubiquitina (Ub). Posteriormente, la ubiquitina activada se conjuga con la enzima E2 para poder ser transferida por la enzima E3 a la proteína diana. Este proceso se repite varias veces hasta conseguir que la proteína esté poliubiquitinada y pueda ser reconocida por el proteasoma para su degradación en péptidos y aminoácidos. Finalmente, las enzimas desubiquitinizantes (DUBs) son las encargadas de desensamblar la cadena de poliubiquitina para que la ubiquitina en su forma monomérica pueda ser reciclada (Bachiller et al., 2020). Proteínas HERC Las proteínas HERC pertenecen a una de las tres subfamilias de enzimas ligasas de ubiquitina (E3) que actúan en la tercera etapa del proceso de ubiquitinación reconociendo la proteína diana 8 y catalizando la adición de las moléculas de ubiquitina unidas a E2 a dicho sustrato. Existen seis genes distintos que codifican proteínas HERC en humanos, no obstante, este trabajo se centra en estudiar uno de ellos, aquel que codifica la proteína HERC1 (Mashimo et al., 2009; Pérez- Villegas et al., 2022). HERC1, al principio denominada p619 y más tarde p532, fue la primera proteína de la familia en ser identificada a través de un cribado que se realizó para la búsqueda de secuencias oncogénicas humanas relacionadas con el cáncer de mama (García-Gonzalo & Rosa, 2005). Se trata de una proteína de gran tamaño con casi 5000 residuos de aminoácidos en una sola cadena polipeptídica, 4861 aminoácidos en Homo sapiens -Hs- y 4859 en Mus musculus -Mm-, y con un peso molecular superior a 520 kDa (Pérez-Villegas et al., 2022). Las seis proteínas HERC tienen en común la presencia de un dominio HECT (del inglés, Homologous to the E6AP Carboxyl Terminus) y, como mínimo, un dominio RLD (del inglés, Regulator of Chromosome Condensation 1 (RCC1) Like Domain) (Mashimo et al., 2009; Pérez- Villegas et al., 2022). El primero de ellos tiene una estructura bilobulada y se encarga propiamente de transferir Ub o proteínas similares a ella a proteínas diana para que pueda tener lugar el proceso de degradación proteica (Mashimo et al., 2009). En un principio, se pensaba que era específico para la degradación de p53, no obstante, estudios posteriores han demostrado que la actividad ligasa de ubiquitina no está restringida a condiciones patológicas en las que se expresa p53 sino que también se desarrolla en condiciones fisiológicas durante el proceso de ubiquitinación de otras proteínas diana (García-Gonzalo et al., 2005). Sin embargo, el segundo tipo de dominio está constituido por siete secciones de hojas β-plegadas, actúa como factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF, del inglés, Guanine nucleotide Exchange Factor) y está implicado en el intercambio de nucleótidos de guanina entre proteínas con sitio de unión a GTP. Además, parece ser más versátil ya que presenta la capacidad de interaccionar con diversas proteínas como clatrina, ARF y Rab, y con lípidos como 4,5-fosfatidilinositol que juegan un relevante papel en el tráfico de membranas de las células (Pérez-Villegas et al., 2022). La proteína HERC1 (Figura 3), además de un dominio HECT y dos dominios RLD, RLD1 y RLD2, presenta otras características estructurales que la diferencia funcionalmente de las otras cinco proteínas HERC. Contiene un dominio SRPY (del inglés, spl A and RyR), un dominio BH3 (del inglés, Bcl-2 Homology Domain 3), siete repeticiones de WD40 características de la subunidad β de las proteínas G heterodiméricas, una cremallera de leucina, secuencias ricas en prolina que se unen a SH3 y varias cadenas laterales de carácter polar y ácido (Pérez-Villegas et al., 2022). 15 Figura 6. Estructura y organización de Gal3. Basada en (Yang et al., 2008). [Creada en BioRender.com] Gal3 es una galectina quimera formada por dos dominios de reconocimiento de carbohidratos, uno C-terminal y otro N-terminal, unidos por repeticiones de residuos de glicina y prolina. Es capaz de dimerizarse reversiblemente a través del CRD C-terminal y de polimerizarse irreversiblemente a través del CRD N-terminal utilizando carbohidratos como ligandos (Boza-Serrano et al., 2019). Gal3 es codificada por el gen LGALS3 y actúa como un mediador inflamatorio liberado por algunas células activadas, como la microglía, en respuesta a una afección neurodegenerativa como, por ejemplo, el proceso de lesión isquémica. Se encuentra distribuida por el núcleo, citoplasma y las membranas, pero ante ciertos estímulos proinflamatorios puede ser liberado al medio extracelular (Boza-Serrano et al., 2014). En condiciones de neuroinflamación, la microglía activada libera Gal3 al medio extracelular y ésta actúa como ligando de los receptores TREM2 (del inglés, Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2) (Boza-Serrano et al., 2019) y TLR4 (del inglés, Toll-Like Receptor 4) (Burguillos et al., 2015) presentes en la microglía circundante, provocando así una mayor expresión del fenotipo DAM en el SNC. Por tanto, Gal3 es capaz de actuar como inmunomodulador amplificando la reacción proinflamatoria dependiente de TLR4 y generando una activación microglial completa en una situación de lesión neuronal (Burguillos et al., 2015). Dado que la proteína Gal3 está muy relacionada con la adquisición del fenotipo DAM por parte de la microglía, en el modelo experimental utilizado para la elaboración de este trabajo se ha planteado como hipótesis que, eliminando el gen lgals3 para suprimir la expresión de Gal3, se podría obtener un efecto de menor muerte neuronal, un rescate motor en los ratones tbl y una detección del proceso neurodegenerativo en el cerebelo. 16 OBJETIVOS Este estudio parte de un modelo experimental formado por ratones que presentan la mutación autosómica recesiva Gly483Glu en el gen que codifica la proteína Herc1, lo que provoca una degeneración de las células de Purkinje en el cerebelo y los dota de su fenotipo tbl que se manifiesta como un trastorno atáxico. Análisis preliminares realizados en nuestro grupo de investigación ponen de manifiesto que la microglía localizada en el cerebelo de estos ratones vira a fenotipo DAM previamente al comienzo de la muerte de las células de Purkinje, es decir, antes de que se alcancen los dos meses de edad. Además, se conoce que la microglía se activa aún más cuando aumenta la expresión de Gal3, lo que podría estar provocando una mayor muerte neuronal entre las células de Purkinje y un agravamiento del proceso neurodegenerativo. El presente trabajo persigue como principal objetivo estudiar la repercusión que tiene la microglía al adquirir fenotipo DAM en presencia de Gal3 en el transcurso de la neurodegeneración de las células de Purkinje en el cerebelo de los ratones tbl. En este sentido, se ha eliminado el gen lgals3 de los ratones tbl para conseguir ratones con fenotipo tbl que no expresen Gal3. Con el fin de alcanzarlo, planteamos los siguientes objetivos específicos: 1. Caracterización del ratón tbl a través de la cuantificación de las células de Purkinje presente en la corteza cerebelosa. 2. Análisis molecular, morfológico y cuantitativo, de la microglía presente en el ratón tbl vinculada a la muerte de las células de Purkinje en el cerebelo. 3. Análisis molecular, morfológico y cuantitativo, de las células de Purkinje y la microglía presente en el ratón tbl tras la eliminación de la expresión de la proteína Gal3 por deleción del gen lgals3. 17 MATERIALES Y MÉTODOS Animales experimentales Los animales de experimentación empleados fueron ratones proporcionados por el Centro de Experimentación Animal Óscar Pintado ubicado en el Centro de Investigación, Tecnología e Innovación III (CITIUS-III) Manuel Losada Villasante, en Sevilla, España. Allí permanecieron en un ambiente a temperatura constante de 22 ± 1ºC, con una humedad relativa del 60%, un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y con acceso a comida y agua ad libitum. A los dos meses de edad fueron trasladados al laboratorio del grupo BIO-113 del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular situado en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, España, donde fueron sacrificados. Los ratones con fenotipo tbl se obtuvieron mediante cruces reproductivos de parejas de ratones portadores de la mutación que codifica para Herc1. Al nacer, todos los ratones tbl presentan el gen lgals3 y expresan fisiológicamente Gal3 en la microglía activada con fenotipo DAM. Para conseguir la expresión del fenotipo tbl/Gal3KO (del inglés, Gal3 Knock-Out) se requieren ratones con deleción en el gen lgals3 y en los que se encuentra suprimida la liberación de Gal3 en la microglía DAM. En este sentido, se cruzaron ratones heterocigóticos para Herc1 con ratones homocigotos para Gal3KO. Todos los ratones que forman la descendencia fueron genotipados mediante PCR a través del Centro de Investigación, Tecnología e Innovación II (CITIUS-II) Celestino Mutis, en Sevilla, España, para poder ser organizados. Para la realización de este estudio, los ratones se clasificaron en tres grupos experimentales en función de su genotipo (Tabla 1). El primero de ellos fue denominado WT (del inglés, Wild-Type) y en él se incluían ratones con fondo genético C57BL/6, que eran WT para la mutación en el gen que codifica Herc1tbl y para Gal3KO o bien WT para Herc1tbl y la expresión de Gal3KO en heterocigosis. El segundo grupo experimental, llamado tbl, comprendía ratones que expresaban Herc1tbl en homocigosis y eran WT o heterocigóticos para Gal3KO. Por último, el tercer grupo, tbl/Gal3KO, lo componían ratones que expresaban tanto Herc1tbl como Gal3KO en homocigosis. Tabla 1. Grupos experimentales según los genotipos del animal para Herc1tbl y Gal3KO. El código de colores utilizado en adelante es amarillo para WT, verde para tbl y morado para tbl/Gal3KO. Grupo experimental Herc1tbl Gal3KO WT WT WT WT heterocigosis tbl homocigosis WT homocigosis heterocigosis tbl/Gal3KO homocigosis homocigosis 18 Del primer grupo experimental, o grupo control, se seleccionaron seis ratones, de los cuales dos eran macho y cuatro eran hembras. Por otra parte, de los dos grupos experimentales restantes, se seleccionaron cinco ratones, del segundo se escogieron al azar tres machos y dos hembras mientras que del tercero se eligieron también aleatoriamente dos machos y tres hembras, haciendo un total de 16 ratones, con el fin de conseguir una distribución homogénea entre sexos y evitar que sea un factor que suponga una gran influencia en los resultados del estudio. Todos los ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con el documento “Guidelines of the European Union Directive” (2010/63/EU) y la legislación española vigente RD 53/2013 (BOE 34/11370-421, 2013) sobre el uso de animales de experimentación. Los protocolos fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de Sevilla. Obtención y preparación de muestras Tanto los ratones pertenecientes a los grupos experimentales tbl y tbl/Gal3KO como sus compañeros de camada isogénicos que se incluyen en el grupo WT se sacrificaron a los dos meses de edad, para asegurar que el fenotipo microglial estuviera completamente alcanzado y que se hubiera producido degeneración en las células de Purkinje de la corteza cerebelosa. En primer lugar, los ratones se anestesiaron con ketamina Ketamidor® de Richter Pharma® (Ref. 580395.1) y medetomidina Sedin® de Laboratorios Calier S.A. (Ref. 572768) por vía intraperitoneal, y se comprobó que el plano anestésico era adecuado mediante la pérdida de la respuesta refleja podal en las extremidades inferiores. Posteriormente, se llevó a cabo el procedimiento de perfusión intracardiaca utilizando 40 ml de suero salino fisiológico preparado a una concentración de NaCl del 0,9% y enfriado con hielo previamente. Pasados unos minutos, los animales se decapitaron para proceder a la extracción del cerebro y cerebelo. Sobre una placa de hielo, se diseccionó y separó el cerebro del cerebelo. Ambas partes del hemisferio izquierdo se congelaron a una temperatura de -80ºC para poder ser utilizadas en posteriores pruebas de Biología Molecular y las del hemisferio derecho se fijaron mediante inmersión en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, del inglés Phosphate Buffered Saline) Q Path® de VWR Chemicals® (Ref. 11699408) durante 24 horas a 4ºC. Posteriormente, el tejido se crioprotegió en una solución de sacarosa de Labbox® (Ref. SUCR- 00A-5K0) al 30% en PBS 1x con azida sódica de Sigma-Aldrich® (Ref. 26628-22-8) para evitar contaminación externa, y se conservó en cámara fría a 4ºC hasta que se hundió en el tubo cónico de 15 ml. Una vez en el fondo, se procedió a su congelación utilizando hielo seco y se almacenó en congelador a -20ºC. 19 Del hemisferio derecho de cada cerebelo se obtuvieron secciones coronales a un grosor de 20 µm y a una temperatura de -20ºC, haciendo uso del Criostato Leica® CM 1850 UV. Se colocaron cuatro secciones consecutivas, siguiendo siempre el mismo orden de posición (Figura 7), en portaobjetos previamente gelatinizados. Una vez obtenidas todas las muestras en los portaobjetos, se guardaron en cajas dentro de un arcón a -20ºC para su posterior procesado en los respectivos análisis histológicos. Figura 7. Orden de posición de los cortes histológicos del hemisferio derecho del cerebelo en el portaobjetos. Para llevar a cabo la gelatinización de los portaobjetos, se calentó agua destilada en una estufa y, cuando alcanzó una temperatura de 52ºC, se añadió gelatina tipo A de Sigma-Aldrich® (Ref. G2500) en pequeñas porciones y en continua agitación. Una vez disuelta, se añadió la misma cantidad de agua destilada calentada previamente y sulfato de cromo potásico dodecahidratado de Panreac® (Ref. 141284). Cuando la mezcla quedó transparente, se apartó de agitación y se reservó a temperatura ambiente hasta que estuvo templada. Luego, se filtró y se vertió en cubetas para poder introducir las rejillas de tinción con los portaobjetos sin gelatinizar durante 1 minuto. Finalmente, las rejillas de tinción con los portaobjetos ya gelatinizados se secaron en la estufa a 45ºC durante 24 horas. Inmunohistoquímica (IHC) Para la realización de la técnica de inmunohistoquímica (IHC), se seleccionaron tres portaobjetos por cada ratón a tres alturas del cerebelo distintas. Dado que se sacrificaron 16 ratones, se obtuvieron un total de 48 portaobjetos. El primer portaobjetos fue escogido de la zona posterior del cerebelo, entre los primeros quince portaobjetos obtenidos; el segundo, de la zona media, que corresponde a los portaobjetos que se encontraban entre la decimoquinta y vigésima posición; y el tercero, de la zona anterior, entre los portaobjetos obtenidos más allá de la posición veinteava. De esta forma, se garantiza que las estructuras tisulares escogidas sean equivalentes en todas las muestras. Se realizaron seis repeticiones de la técnica siguiendo el mismo protocolo, una para cada conjunto de portaobjetos que pertenecían a la misma altura del cerebelo. En las tres primeras IHC se estudió la degeneración de las células de Purkinje en la corteza cerebelosa utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón que se une a la calbindina (Tabla 2). Las otras tres IHC restantes se realizaron con el fin de observar y cuantificar la microglía presente en la corteza y sustancia blanca del cerebelo, para lo que se usó un anticuerpo policlonal de conejo que se une a Iba1 (del 20 inglés, Ionized calcium-Binding Adaptor molecule 1), un marcador que se expresa en la superficie de estas células gliales (Tabla 2). Los portaobjetos previamente seleccionados se colocaron sobre una placa calefactora de Axel Johnson Lab System® a unos 40ºC aproximadamente durante 10 minutos. Después, utilizando ImmEdge® Pen de Vector Laboratories® (Ref. H-4000), se trazaron circunferencias alrededor de cada corte con el objetivo de crear una capa hidrofóbica para delimitar la zona donde quedan los reactivos sobre el tejido. Los portaobjetos se colocaron en una cubeta donde se lavaron con PBS 1x (3 x 5 minutos) para el acondicionamiento de los cortes histológicos. A continuación, se incubaron en una disolución de peróxido de hidrógeno al 1% v/v en metanol durante 15 minutos a temperatura ambiente, y se lavaron de nuevo con PBS 1x (3 x 5 minutos). Una vez preparado el tejido, se eliminó el líquido sobrante sobre los portaobjetos y se colocaron sobre una cámara húmeda para proseguir con el protocolo de IHC. En primer lugar, se bloquearon las uniones inespecíficas del anticuerpo primario incubando las secciones en una solución de albúmina bovina sérica (BSA, del inglés Bovine Serum Albumin) de Sigma-Aldrich® (Ref. A7906) al 5% p/v en PBS-Tritón al 2,5% durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución de bloqueo utiliza PBS con Tritón para poder permeabilizar las membranas plasmáticas de las células del tejido y permitir que los anticuerpos depositados posteriormente sobre los cortes puedan penetrar al interior de las mismas y, de esta forma, obtener un buen marcaje para la posterior visualización. Seguidamente, se añadió el anticuerpo primario (Tabla 2) diluido en una solución de BSA al 2,5% p/v en PBS-Tritón al 2,5% durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente, las secciones se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de realizar los lavados con PBS 1x (3 x 5 minutos) en la cubeta. Una vez terminados, los portaobjetos se volvieron a colocar en la cámara húmeda para incubar las secciones con el anticuerpo secundario (Tabla 2) en una solución de BSA al 1% p/v en PBS-Tritón al 2,5% durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego, se lavaron de nuevo con PBS 1x (3 x 5 minutos) en la cubeta. Tabla 2. Anticuerpos utilizados en la técnica de IHC. Ac primario Origen Laboratorio Dilución Ac secundario Origen Laboratorio Dilución Anti- Calbindin Mouse Sigma-Aldrich® (Ref. ABN2192) 1:1000 Anti-Mouse IgG (H+L) Biotinylated Goat Vector Labs.® (Ref. BA-9200) 1:200 Anti- Iba1 Rabbit FUJIFILM Wako® (Ref. 019-19741) 1:1000 Anti-Rabbit IgG (H+L) Biotinylated Goat Vector Labs.® (Ref. BA-1000) 1:200 21 Posteriormente, se incubaron las muestras con un kit de tinción ABC VECTASTAIN® Elite® de Vector Laboratories® (Ref. PX-6100) durante 1 hora. Este kit incluye los reactivos para llevar a cabo la técnica del complejo avidina-biotina, así como la enzima peroxidasa, y de esta forma poder amplificar la intensidad de tinción y mejorar la sensibilidad en la posterior detección de las diferentes estructuras en el tejido. Después, los cortes se lavaron de nuevo con PBS 1x (3 x 5 minutos) en la cubeta. Tras los lavados, se utilizó otro kit para preparar una solución que incluía 3,3’-diaminobencidina (DAB), enzima peroxidasa y cloruro de níquel de Vector Laboratories® (Ref. SK-4100). Se dejó actuar de 2 a 4 minutos sobre las secciones para llevar a cabo una reacción en el que el producto precipitado es de color marrón y así teñir el tejido. Justo a continuación, las muestras se lavaron con PBS 1x (3 x 5 minutos) en la cubeta y los residuos de los reactivos se desecharon en los depósitos destinados a ello en el armario de seguridad del laboratorio. Finalmente, los cortes se deshidrataron con disoluciones de etanol a concentraciones crecientes, se aclararon con xileno y se montaron con la resina acrílica DPX de Sigma-Aldrich® (Ref. 06522) y un cubreobjetos con precaución de no formar burbujas que pudiesen deteriorar el tejido. Adquisición y análisis de imágenes • IHC con anticuerpo primario Anti-Calbindin Una vez completado el protocolo para las tres IHC que utilizan Anti-Calbindin de Sigma-Aldrich® (Ref. ABN2192) como anticuerpo primario (Tabla 2), se tomó una imagen completa por cada sección colocada en los portaobjetos haciendo uso de la Lupa Zeiss® AxioZoom V16 a campo claro con el objetivo de 100x, junto al programa informático ZEN Blue®, ubicado en el Centro de Investigación, Tecnología e Innovación I (CITIUS-I), en Sevilla, España. Posteriormente, utilizando el programa offline FijiImageJ Software®, se procedió al análisis de las mismas. En primer lugar, para estimar la densidad de células de Purkinje se cuantificó el número de somas presentes en una determinada área de corteza medida en mm2. Para ello, de la imagen original (Figura 8A) se seleccionaron tres porciones de corteza aleatorias por cada corte histológico (Figura 8C), obteniéndose 576 en total, y con la herramienta Cell Counter se contabilizaron todos los somas visibles en ella (Figura 8D). Se establecieron como criterios que no era necesario que las dendritas estuvieran aparentemente completas, sino que era suficiente con la visualización del núcleo para contar una célula, y que las células no tocaran los bordes de la porción delimitada. Por otra parte, en esas mismas porciones de corteza también se estimó la densidad de células de Purkinje mediante la cuantificación del marcaje de Calbindina utilizando un mismo 22 umbral o Threshold (Figura 8E), lo que se traduce en el área que ocupan las células de Purkinje con respecto a una determinada área de corteza medida en mm2. Estos últimos valores se expresaron en forma de porcentaje. Luego, se construyeron gráficas donde se podría conocer la degradación de las células de Purkinje en la corteza cerebelosa de cada grupo experimental. A B C D E F Figura 8. Metodología para llevar a cabo la estimación de la densidad de células de Purkinje en la corteza cerebelosa utilizando el programa offline FijiImageJ Software®. (A) Imagen original. (B) Imagen en escala de grises a 8 bits. (C) Porción de corteza seleccionada. (D) Cuantificación de somas. (E) Aplicación del umbral o Threshold. (F) Determinación del área generada. • IHC con anticuerpo primario Anti-Iba1 Posteriormente a las IHC con anticuerpo primario Anti-Calbindin, se realizaron tres IHC con anticuerpo primario Anti-Iba1 de FUJIFILM Wako® (Ref. 019-19741) como anticuerpo primario (Tabla 2). Las secciones se observaron utilizando el Microscopio óptico Olympus® BX61 a campo claro con el objetivo de 20x y el programa informático cellSens®, ubicado en el Centro de Investigación, Tecnología e Innovación I (CITIUS-I), en Sevilla, España. Se tomaron tres imágenes de la corteza cerebelosa, obteniéndose 144 en total, para cuantificar la microglía en cada una de ellas utilizando el programa offline FijiImageJ Software®. Por otra parte, las mismas secciones presentes en los portaobjetos se observaron utilizando el Microscopio óptico Leica® a campo claro con el objetivo de 20x, ubicado en el laboratorio BIO-113 del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular situado en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, España. Allí se visualizaron tres campos de sustancia blanca cerebelosa, 144 en total, en los que se cuantificaron los somas de las células microgliales. Se tuvieron en cuenta las células que se encontraban en el interior y aquellas que estaban en contacto con los márgenes superior y derecho de la celda, por tanto, quedaron excluidas aquellas células en los márgenes inferior e 23 izquierdo de la celda (Figura 9). Posteriormente, multiplicando el número de somas por el factor numérico 5,9, se obtuvo el número de células microgliales por área medida en mm2. Así, se construyeron gráficas donde se podría conocer la cantidad de microglía presente en la corteza y la sustancia blanca cerebelosas de cada grupo experimental. Figura 9. Imagen de la celda del Microscopio óptico Olympus a campo claro utilizada para cuantificar las células microgliales presentes en la sustancia blanca cerebelosa. Se cuantificaron las que se encontraban en el interior y aquellas que estaban en contacto con los márgenes superior y derecho de la celda, por tanto, quedaron excluidas aquellas células en los márgenes inferior e izquierdo de la celda. Análisis estadístico El análisis estadístico de los datos y la posterior confección de las gráficas se ha realizado utilizando el programa GraphPad Prism Software® versión 8.4.2. En primer lugar, se obtuvieron los valores medios con sus correspondientes desviaciones estándar de cada uno de los cuatro parámetros cuantificados para cada ratón y altura del cerebelo, por lo que se determinó una N de 16. Los datos seguían una distribución normal en la mayoría de los casos al ser analizados mediante los tests de Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov, por lo que se procedió a utilizar test paramétricos. En todos los casos, el nivel de significación se estableció en p < 0,05. A continuación, se llevó a cabo la prueba t-Student con el fin de observar si existen diferencias significativas entre las zonas anterior, media y posterior del cerebelo dentro de un mismo grupo experimental para cada parámetro cuantificado. En aquellos casos donde se observaron diferencias, se aplicó un test más restrictivo, ANOVA de un factor, para comprobar que realmente existe una distribución heterogénea de las células de Purkinje o microgliales a lo largo del eje anteroposterior del cerebelo del ratón. Para conocer si los grupos experimentales son significativamente distintos con respecto a uno de los parámetros, se utilizó el test ANOVA de un factor seguido del test pos hoc de Tukey para comparaciones múltiples y los resultados se representaron en diagramas de violín. Finalmente, se representaron en gráficos de dispersión parejas de datos de dos variables distintas con el fin de obtener rectas de regresión y coeficientes de correlación que informen de qué forma podría influir uno sobre otro. Además, se estudió si existen diferencias significativas entre las pendientes para los distintos grupos experimentales. 24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN • Distribución de células de Purkinje y microglía en el eje anteroposterior del cerebelo En primer lugar, se comprobó que la distribución de las células de Purkinje y de la microglía era homogénea a lo largo de todo el eje anteroposterior del cerebelo del ratón. Para ello, se realizó la prueba t-Student y comparando por parejas los datos obtenidos para cada altura del cerebelo, dentro de un mismo grupo experimental y para una variable concreta. Posteriormente, se aplicó el test ANOVA y el test pos hoc de Tukey para comparaciones múltiples, más restrictivos, para confirmar que efectivamente, en algunos grupos experimentales existen diferencias significativas entre las diferentes zonas del cerebelo para un parámetro en concreto. Tanto en la cantidad de células de Purkinje (Figura 10A, E y I) como en el área que ocupan las mismas dentro de la corteza cerebelosa reflejada a través de área que ocupa el marcaje del anticuerpo Anti-Calbindin (Figura 10B, F y J) no se observan diferencias significativas entre las tres zonas del cerebelo para cada uno de los tres grupos experimentales. De la misma forma, tampoco existen diferencias significativas en la cantidad de microglía presente en la corteza cerebelosa (Figura 10C, G y K) a lo largo del eje anteroposterior en los distintos grupos experimentales. Sin embargo, el análisis estadístico muestra que la cantidad de microglía en la sustancia blanca (Figura 10D, H y L) es significativamente inferior en el tercio posterior del cerebelo de los ratones WT y tbl, en comparación con los tercios anterior y medio, es decir, el número de células microgliales decrece a medida que se avanza en el eje anteroposterior en estos dos casos. En los ratones WT y tbl se produce la disminución en la microglía de la sustancia blanca en la zona posterior del cerebelo de manera similar, al contrario de los ratones tbl/Gal3KO en los que no tiene lugar, sino que se mantiene en unos valores constantes a lo largo de todo el cerebelo. Esto podría estar relacionado con el papel que juega Gal3 en la formación de las vainas de mielina de los axones que conforman la sustancia blanca. Varios autores describen que Gal3 interviene en la maduración y diferenciación de oligodendrocitos responsables del proceso de mielinización ya que promueve la activación de AKT y, por tanto, el transcurso de la vía PI3K/AKT/mTOR para el crecimiento y proliferación celular (Thomas & Pasquini, 2018). En ratones WT y, principalmente en ratones tbl que presentan una sobreexpresión de Herc1tbl, podría estar prevaleciendo el efecto inhibitorio de esta proteína sobre la ruta frente al de Gal3, disminuyendo el crecimiento y proliferación celular así como dando lugar a una mielina con una menor integridad y compactación. Sería interesante realizar un estudio en el que se incluyeran ratones con la condición WT/Gal3KO para poder observar si este efecto ocurre específicamente al suprimir la expresión de Gal3. 31 o Sustancia blanca cerebelosa Por otro lado, se realizó el mismo procedimiento para analizar la cantidad de células microgliales presentes en la sustancia blanca cerebelosa. Los resultados reflejan que la población microglial en la sustancia blanca cerebelosa de los ratones WT (89,3 ± 3,9) es significativamente menor a la de ratones tbl (99,7 ± 5,0) y tbl/Gal3KO (101,5 ± 5,2), al igual que ocurre en la corteza cerebelosa. Sin embargo, en este caso, el número de células microgliales es solo un 11,7% superior en los ratones tbl y un 13,7% en los ratones tbl/Gal3KO con respecto a los ratones WT, tampoco existiendo diferencias significativas entre los grupos experimentales (Figura 13D). Este aumento significativo, aunque en menor medida que en la corteza cerebelosa, en el número de células microgliales en la sustancia blanca del cerebelo de los ratones tbl y tbl/Gal3KO con respecto a los WT podría estar relacionado con defectos en el proceso de mielinización a causa de la sobreexpresión de la proteína Herc1tbl. Como se ha comentado anteriormente, el correcto funcionamiento de dicha proteína es necesario para una mielinización axonal adecuada. Sin embargo, cuando se encuentra mutada, estabiliza a AKT fosforilada y provoca fallos en la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR que desencadenan defectos en la mielinización y, en consecuencia, en la conducción del impulso nervioso (Bachiller et al., 2018 [B]). Por otra parte, algunos autores sugieren que el receptor TREM2 y la microglía DAM están implicados en la mediación de la respuesta inmunitaria necesaria para metabolizar los restos de mielina (Safaiyan et al., 2021). Sin embargo, al no observar diferencias entre los grupos tbl y tbl/Gal3KO, es posible que este mecanismo no se encuentre implicado en nuestro modelo murino en el que se bloquea lgals3, ya que la ausencia de expresión de Gal3 parece no afectar al número de microglía en la sustancia blanca. En estudios posteriores donde se midan los niveles de marcadores específicos comentados anteriormente permitirán profundizar en el papel de Gal3 en la mielinización. En resumen de lo observado con respecto a la microglía, podemos concluir que hay indicios claros de que la microglía que se encuentra en la corteza estrechamente asociada a las células de Purkinje adquiere un fenotipo DAM más reactivo inmunológicamente que en condiciones de degeneración mielínica en los axones neuronales presentes en la sustancia blanca. Del mismo modo, tal como avanzamos anteriormente, entre los ratones tbl (99,7 ± 5,0) y tbl/Gal3KO (101,5 ± 5,2) la cantidad de microglía presente en la sustancia blanca cerebelosa aumenta en un 2% únicamente con respecto al control (Figura 13D). Dado que, de nuevo, no existe una diferencia significativa entre los dos grupos experimentales, se reafirma que la supresión de la expresión de Gal3 no conlleva un cambio en la proliferación microglial que podría estar asociado a procesos neuroinflamatorios en los ratones con dos meses de edad. 32 A C B D Figura 13. Estudio del marcaje específico de microglía en el cerebelo de ratones de 2 meses. (A) Imagen de microscopía óptica a campo claro con objetivo 20x de corteza en el cerebelo de ratones WT, tbl y tbl/Gal3KO. La microglía se ha marcado con un anticuerpo Anti-Iba1. Barra de escala: 200 µm. (B) Número de microglía en el área medida (mm2) en la corteza del cerebelo de ratones WT, tbl y tbl/Gal3KO. (C) Imagen de microscopía óptica a campo claro con objetivo 20x de sustancia blanca en el cerebelo de ratones WT, tbl y tbl/Gal3KO. La microglía se ha marcado con un anticuerpo Anti-Iba1. Barra de escala: 200 µm. (D) Número de microglía en el área medida (mm2) en la sustancia blanca del cerebelo de ratones WT, tbl y tbl/Gal3KO. Los resultados se representan en diagramas de violín que reflejan la dispersión de los datos con respecto a la media con una N=16. La significación estadística se calculó con el test ANOVA de un factor seguido del test pos hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Se establece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001. WT WT tbl tbl tbl/Gal3KO / tbl/Gal3KO / 33 • Variación de la cantidad de microglía en corteza con respecto al número de células de Purkinje en el área medida (mm2) y a la densidad de células de Purkinje (%) Se han representado en dos diagramas de dispersión las parejas de datos y sus correspondientes rectas de regresión con el objeto de conocer de qué forma varía la cantidad de microglía en la corteza con respecto al número de células de Purkinje por área (Figura 14A) y a la densidad que ocupan en cada grupo experimental (Figura 14B). A partir de los mismos, se calcularon las pendientes de las rectas y los coeficientes de correlación, y se analizaron estadísticamente. Ambos diagramas reflejan cómo el número de células de Purkinje por área y la densidad que ocupan en la sustancia blanca del cerebelo es mayor en ratones WT que en ratones tbl/Gal3KO y tbl (Figura 14). Esto significa que, de nuevo, aunque en el cerebelo de los ratones tbl existe una disminución en el número de células de Purkinje, la supresión de la expresión de Gal3 implica un rescate en la población de dichas células en los ratones del grupo experimental tbl/Gal3KO. Según el análisis estadístico, el valor para la pendiente de la recta para los ratones tbl (7,0270; R2=0,9672 (A) 14,8100; R2=0,9728 (B)) y tbl/Gal3KO (6,5550; R2=0,9908 (A) 6,9230; R2=0,9547 (B)) es significativamente mayor que en los ratones WT (0,7417; R2=0,9881 (A) 2,0800; R2=0,9003 (B)). Por tanto, para un mismo número de células de Purkinje por área o densidad de las mismas en el cerebelo, existe una mayor cantidad de microglía en la corteza los ratones tbl y tbl/Gal3KO que en ratones WT, lo que quiere decir que la respuesta microglial está más presente en condiciones patológicas que en el grupo control, probablemente por la degeneración de las células de Purkinje en ellas. Aunque la pendiente de la recta para los ratones tbl es mayor que para los ratones tbl/Gal3KO en ambos casos, en el diagrama donde se representa la densidad de células de Purkinje en el eje de abscisas (Figura 14B), la diferencia entre las pendientes para los grupos tbl y tbl/Gal3KO es más notable que en el que se representa la cantidad de células de Purkinje por área (Figura 14A). Esto significa que podría existir una menor activación de las células de la microglía al haber un rescate de la población de las células de Purkinje en los ratones tbl/Gal3KO. No obstante, teniendo en cuenta los resultados descritos anteriormente, esta variación entre las pendientes podría deberse al aumento de la ramificación de las células de Purkinje en los ratones tbl/Gal3KO, que hace que la densidad de las mismas en la corteza cerebelosa sea mayor y, por tanto, la proporción con respecto a la cantidad de microglía presente en esta zona disminuya. 34 A 0 50 100 0 50 100 150 200 250 Células de Purkinje / mm2 Microglía / mm2 CORTEZA B 0 50 100 0 50 100 150 200 250 Densidad Células de Purkinje (%) Microglía / mm2 CORTEZA WT tbl tbl/Gal3KO Figura 14. Variación de la cantidad de microglía en corteza con respecto las células de Purkinje en el cerebelo de ratones de 2 meses pertenecientes a los grupos experimentales WT, tbl y tbl/Gal3KO. (A) Variación de la cantidad de microglía en corteza con respecto al número de células de Purkinje en el área medida (mm2). Para ratones WT la pendiente es 0,7417 y R2=0,9881, para ratones tbl la pendiente es 7,0270 y R2=0,9672 y para ratones tbl/Gal3KO la pendiente es 6,5500 y R2=0,9908. Las tres pendientes son significativamente diferentes de cero (p<0,0001, ****). (B) Variación de la cantidad de microglía en corteza con respecto a la densidad de células de Purkinje (%). Para ratones WT la pendiente es 2,0800 y R2=0,9903, para ratones tbl la pendiente es 14,8100 y R2=0,9728 y para ratones tbl/Gal3KO la pendiente es 6,9230 y R2=0,9547. Las tres pendientes son significativamente diferentes de cero (p<0,0001, ****). La significación estadística se calculó con un test que determina si las pendientes y las intersecciones entre rectas son significativamente distintas. Se establece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001. • Variación de la cantidad de microglía en sustancia blanca con respecto al número de células de Purkinje en el área medida (mm2) y a la densidad de células de Purkinje (%) Al igual que en el caso anterior, se han construido dos diagramas de dispersión con los datos de las dos variables y se han dibujado las rectas de regresión con el fin de saber cómo influye la variación en el número de células de Purkinje por área (Figura 15A) y la densidad que ocupan (Figura 15B) en la cantidad de microglía presente en la sustancia blanca por cada grupo experimental. A partir de ellos, se obtuvieron las pendientes de las rectas y sus coeficientes de correlación, y después se analizaron estadísticamente. En ambos casos se puede ver como el número de células de Purkinje por área y la densidad que ocupan en la sustancia blanca del cerebelo es mayor en ratones WT que en ratones tbl/Gal3KO y tbl (Figura 15). Esto confirma que existe un rescate en la población de las células de Purkinje cuando se suprime la expresión de Gal3 en los ratones tbl/Gal3KO. Una vez realizado el análisis estadístico, el valor para la pendiente de la recta para los ratones tbl (4,3450; R2=0,9575 (A) 9,1670; R2=0,9650 (B)) y tbl/Gal3KO (3,562; R2=0,9734 (A) 4,1200; R2=0,9723 (B)) es significativamente mayor que en los ratones WT (0,8161; R2=0,9958 (A) 2,2870; R2=0,9970 (B)). Por ende, para un mismo número de células de Purkinje por área o densidad ocupada por éstas en el cerebelo, hay más células microgliales en la sustancia blanca cerebelosa de los ratones tbl y tbl/Gal3KO que en ratones WT, lo cual significa que la microglía es más 35 abundante en los grupos experimentales que incluyen fenotipo tbl donde hay una disminución en la población de células de Purkinje y una respuesta neuroinflamatoria asociada a ella. Igualmente, la pendiente de la recta es más pronunciada para los ratones tbl que para los ratones tbl/Gal3KO en ambos casos. No obstante, en el diagrama donde se representa la densidad de células de Purkinje en el eje de abscisas (Figura 15B), la diferencia entre las pendientes para los grupos tbl y tbl/Gal3KO es más notable que en el que se representa la cantidad de células de Purkinje por área (Figura 15A). Al igual que en la corteza cerebelosa, parece que la activación microglial es menor en los ratones tbl/Gal3KO que en los tbl a causa del rescate de la población de las células de Purkinje, aunque se debe tener en cuenta lo indicado anteriormente. A 0 50 100 0 50 100 150 Células de Purkinje / mm2 Microglía / mm2 SUSTANCIA BLANCA B 0 50 100 0 50 100 150 Densidad Células de Purkinje (%) Microglía / mm2 SUSTANCIA BLANCA WT tbl tbl/Gal3KO Figura 15. Variación de la cantidad de microglía en sustancia blanca con respecto las células de Purkinje en el cerebelo de ratones de 2 meses pertenecientes a los grupos experimentales WT, tbl y tbl/Gal3KO. (A) Variación de la cantidad de microglía en sustancia blanca con respecto al número de células de Purkinje en el área medida (mm2). Para ratones WT la pendiente es 0,8161 y R2=0,9958, para ratones tbl la pendiente es 4,3450 y R2=0,9575 y para ratones tbl/Gal3KO la pendiente es 3,5620 y R2=0,9734. Las tres pendientes son significativamente diferentes de cero (p<0,0001, ****). (B) Variación de la cantidad de microglía en sustancia blanca con respecto a la densidad de células de Purkinje (%). Para ratones WT la pendiente es 2,2870 y R2=0,9970, para ratones tbl la pendiente es 9,1670 y R2=0,9650 y para ratones tbl/Gal3KO la pendiente es 4,1200 y R2=0,9723. Las tres pendientes son significativamente diferentes de cero (p<0,0001, ****). La significación estadística se calculó con un test que determina si las pendientes y las intersecciones entre rectas son significativamente distintas. Se establece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001. • Variación de la cantidad de microglía en sustancia blanca con respecto a la cantidad de microglía en corteza por área medida (mm2) Por último, se ha construido un diagrama en el que se representa cómo varía la cantidad de microglía presente en la sustancia blanca con respecto a la existente en la corteza cerebelosa (Figura 16). Para ello, de nuevo se han representado las parejas de datos como puntos y se han dibujado las rectas de regresión, las cuales llevan asociadas una pendiente y un coeficiente de correlación, parámetros que se utilizarán posteriormente para el análisis estadístico. Para los tres grupos experimentales se cumple que el aumento en la cantidad de microglía localizada en la corteza cerebelosa es directamente proporcional a la cantidad de microglía en la 36 sustancia blanca, por tanto, a medida que aumenta el número de células microgliales en la corteza, también aumenta en la sustancia blanca cerebelosa. En este caso, al contrario que en los anteriores, el valor para la pendiente de la recta en los ratones WT (1,0920; R2=0,9925) es significativamente superior al de los ratones tbl (0,6210; R2=0,9983) y tbl/Gal3KO (0,5874; R2=0,9921). Esto significa que, en ratones WT, por cada célula microglial presente en la corteza hay una en la sustancia blanca, mientras que en ratones tbl y tbl/Gal3KO, hay una célula microglial en la sustancia blanca por cada dos presentes en la corteza cerebelosa. Por tanto, se puede concluir que, en ratones con condiciones fenotípicas tbl y tbl/Gal3KO, la cantidad de células microgliales en la corteza es mayor que en la sustancia blanca. Esto podría deberse a que, como se ha observado que la degeneración de las células de Purkinje en los ratones tbl y tbl/Gal3KO se produce mayoritariamente en la corteza cerebelosa, existe una mayor proliferación microglial en las capas más superficiales del cerebelo antes de que se produzca en las capas más profundas, como la sustancia blanca. 0 50 100 150 200 0 50 100 Microglía / mm2 CORTEZA Microglía / mm2 SUSTANCIA BLANCA WT tbl tbl/Gal3KO Figura 16. Variación de la cantidad de microglía en la sustancia blanca con respecto a la cantidad de microglía en corteza en el área medida (mm2) en el cerebelo de ratones de 2 meses pertenecientes a los grupos experimentales WT, tbl y tbl/Gal3KO. Para ratones WT la pendiente es 1,0920 y R2=0,9925, para ratones tbl la pendiente es 0,6210 y R2=0,9983 y para ratones tbl/Gal3KO la pendiente es 0,5874 y R2=0,9921. Las tres pendientes son significativamente diferentes de cero (p<0,0001, ****). La significación estadística se calculó con un test que determina si las pendientes y las intersecciones entre rectas son significativamente distintas. Se establece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001. 37 CONCLUSIONES Una vez expuestos y discutidos los resultados obtenidos en este estudio, se puede concluir que: - La distribución de las células de Purkinje y de la microglía es homogénea a lo largo del eje anteroposterior del cerebelo del ratón, por lo que no existen diferencias significativas en la cantidad de estas células entre las zonas anterior, media y posterior del mismo. - La población de células de Purkinje en el cerebelo de los ratones tbl y tbl/Gal3KO es menos abundante que la de ratones WT a causa de la degeneración de las mismas por la sobreexpresión de la proteína mutada Herc1tbl en el cerebelo de los ratones con dos meses de edad. - Al bloquear el gen lgals3 y suprimir la expresión del mediador neuroinflamatorio Gal3 en los ratones con fenotipo tbl, se observa cómo la muerte autofágica de las células de Purkinje disminuye y, por tanto, existe un posible rescate motor en ellos. - La microglía es más abundante en los ratones tbl y tbl/Gal3KO en respuesta al proceso neuroinflamatorio, no obstante, no existen diferencias en esta población celular entre los ratones tbl y tbl/Gal3KO, por lo que la supresión de Gal3 no supone ninguna ventaja con respecto a la detención del aumento de la población microglial en el cerebelo. - Dado que la población de células microgliales es mayor en la corteza que en la sustancia blanca cerebelosas, la degeneración de las células de Purkinje predominante en la corteza cerebelosa de los ratones tbl y tbl/Gal3KO podría estar causando una mayor activación y reactividad de la microglía ante estas condiciones neuroinflamatorias en las capas más superficiales del cerebelo antes que en las profundas. - El aumento en la cantidad de microglía en la sustancia blanca del cerebelo de ratones tbl y tbl/Gal3KO en comparación con los WT puede deberse a problemas en la mielinización axonal, no obstante, no es tan notable como en la corteza cerebelosa. - En cuanto al análisis morfológico, parece que las células de Purkinje de los ratones tbl/Gal3KO presentan un árbol dendrítico más ramificado que las de los otros dos grupos experimentales. Esto podría deberse a un mayor control del proceso neuroinflamatorio que tiene lugar en la corteza cerebelosa principalmente por la degeneración de las células de Purkinje en los ratones tbl. 38 ABREVIATURAS ARNm: ARN mensajero BDNF: Brain Derived Neurotrophic Factor BH3: Bcl-2 Homology Domain 3 BSA: Bovine Serum Albumin CITIUS: Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla CRD: Carbohydrate Recognition Domain DAB: 3,3’-diaminobencidina DAM: Disease-Associated Microglia E1: enzimas activadoras de ubiquitina E2: enzimas conjugadoras de ubiquitina E3: enzimas ligasas de ubiquitina Gal3: Galectina-3 GEF: Guanine nucleotide Exchange Factor GN: Gastrocnemius GTEx: Genotype-Tissue Expression HECT: Homologous to the E6AP Carboxyl Terminus Hs: Homo sapiens Iba1: Ionized calcium-Binding Adaptor molecule 1 IHC: inmunohistoquímica IL-12: interleukin-12 IL-1β: interleukin-1β KO: Knock-Out LAL: Levator Auris Longus MDFPMR: Macrocephaly, Dysmorphic Facies and Psychomotor Retardation Mm: Mus musculus MN: motoneurona mTORC1: mammalian Target Of Rapamycin Complex 1 NMSC: células de Schwann no mielinizantes NO: óxido nítrico NRS: especies reactivas de nitrógeno PBS: Phosphate Buffered Saline PFA: paraformaldehído PI3K: fosfatidilinositol 3-cinasa PKB: proteína cinasa B RLD: Regulator of Chromosome Condensation 1 (RCC1) Like Domain ROS: especies reactivas de oxígeno S6K1: Ribosomal Protein S6 Kinase β-1 SNC: Sistema Nervioso Central SNP: Sistema Nervioso Periférico SRPY: spl A and RyR tbl: tambaleante TEA: Trastornos del Espectro Autista TGF-β: Transforming Growth Factor β TLR4: Toll-Like Receptor 4 TNF-α: Tumor Necrosis Factor α TREM2: Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2 TSC1: Tuberous Sclerosis Complex 1 TSC2: Tuberous Sclerosis Complex 2 TVA: Transversus Abdominis Ub: ubiquitina UNM: unión neuromuscular UPS: Sistema Ubiquitina-Proteasoma WT: Wild-Type 39 BIBLIOGRAFÍA Bachiller S, Alonso-Bellido IM, Real LM, Pérez-Villegas EM, Venero JL, Deierborg T et al. 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