Mecanismos de activación transcripcional durante la diferenciación de los heterocistos en la cianobacteria modelo anabaena sp. Pcc 7120

Índice I ÍNDICE ÍNDICE I ÍNDICE DE FIGURAS VI ÍNDICE DE TABLAS X ABREVIATURAS XI 1.Introducción 3 1.1. Regulación del inicio de la transcripción en bacterias 3 1.1.1 RNAP bacteriana 4 1.1.1.1 Subunidad sigma 6 1.1.2. Promotores de E. coli 7 1.1.2.1 Promotores basales 7 1.1.2.2 Promotores regulados 8 1.1.3. Reguladores transcripcionales de la familia CRP de E. coli 10 1.1.3.1 Promotores dependientes de CRP de clase I 10 1.1.3.2 Promotores dependientes de CRP de clase II 11 1.2. Las cianobacterias 13 1.2.1. Generalidades 13 1.2.2. Asimilación del nitrógeno 17 1.2.2.1. Fijación de nitrógeno 17 1.2.2.2. Control por nitrógeno en cianobacterias 19 1.2.2.3. El regulador transcripcional NtcA 22 1.2.3. El Heterocisto 24 1.2.3.1. Estructura del heterocisto 24 1.2.3.2. Metabolismo del heterocisto 26 1.2.3.3. Diferenciación de los heterocistos 28 1.2.4. Aspectos específicos de la transcripción en cianobacterias. 30 1.2.4.1. RNA polimerasa de cianobacterias 30 1.2.4.2. Promotores cianobacterianos 31 1.2.5. Regulación de la expresión génica durante la diferenciación de los heterocistos 32 1.2.5.1. El regulador HetR 34 1.2.5.2. Relaciones entre NtcA y HetR 37 Sergio Camargo Bernal II 1.2.5.3. Promotores de genes de la diferenciación de heterocistos 38 1.2.5.4. Papel de PipX durante la diferenciación de heterocistos 40 1.3. Objetivos de esta tesis 41 2. MATERIALES Y MÉTODOS 4 2.1. Organismos y condiciones de cultivo 45 2.1.1. Cianobacterias 45 2.1.1.1. Estirpes de cianobacterias utilizadas 45 2.1.1.2. Medios y condiciones de cultivo 46 2.1.1.3. Método de recogida y lavado de células 48 2.1.1.4. Determinación de la cantidad de clorofila 48 2.1.2. Escherichia coli 49 2.1.2.1. Estirpes empleadas 49 2.1.2.2. Medios y condiciones de cultivo 49 2.2. Métodos de manipulación y análisis de DNA 50 2.2.1. Plásmidos utilizados 50 2.2.2. Transferencia de DNA 53 2.2.2.1. Transferencia de DNA a E. coli mediante transformación 53 2.2.2.2. Transferencia de DNA a Anabaena sp. mediante conjugación 54 2.2.3. Aislamiento de DNA 55 2.2.3.1 Aislamiento de DNA plasmídico de E. coli 55 2.2.3.2. Aislamiento de DNA total de cianobacterias 55 2.2.4. Determinación de la concentración de DNA 56 2.2.5. Separación de fragmentos de DNA en geles de agarosa y purificación 56 2.2.6. Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR) 57 2.2.7. Secuenciación del DNA 60 2.2.8. Tratamientos enzimáticos el DNA 61 2.2.8.1. Restricción del DNA 61 2.2.8.2. Desfosforilación del DNA 62 2.2.8.3. Relleno de extremos 3’ recesivos 62 2.2.8.4. Ligación del DNA 62 2.2.8.5. Marcaje radiactivo de fragmentos de DNA 62 2.3. Métodos de manipulación y análisis de RNA 64 2.3.1. Aislamiento de RNA 64 2.3.2. Electroforesis de RNA en geles de agarosa 65 Índice III 2.3.3. Detección de secuencias de RNA mediante hibridación en filtro con sonda radiactiva (Análisis de northern) 65 2.3.4. Ensayo de extensión de cebador 66 2.3.5. Amplificación rápida de extremos 5’ de cDNA ( 5’-RACE) 67 2.4. Métodos de purificación y análisis de proteínas 69 2.4.1. Preparación de extractos libres de células 69 2.4.2. Purificación de NtcA recombinante mediante cromatográfia de afinidad por heparina 70 2.4.3. Purificación de NtcA-His, HetR-His y PipX-His mediante cromatografía de afinidad por níquel 70 2.4.4. Preparaciones de RNAP de Anabaena recombinante 72 2.4.4.1. Purificación de las distintas subunidades 72 2.4.4.2. Reconstitución y purificación del complejo RNAP-SigA. 74 2.4.5. Cuantificación de proteínas 76 2.4.6. Electroforesis analítica de proteínas en geles de SDS-Poliacrilamida 77 2.5. Ensayos de transcripción in vitro 78 2.6 Análisis de la interacción Proteína-DNA 79 2.6.1. Ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA) 79 2.6.2. Ensayos de resonancia de plasmones superficiales (SPR) 80 2.6.2.1. Principios básicos 80 2.6.2.2. Análisis SPR de la interacción Proteína-DNA 82 2.6.3. Ensayos de protección frente a la degradación por DNasa I (Footprinting) 84 2.7. Microscopia láser confocal 85 2.8. Análisis informático de secuencias de DNA y proteínas 86 3. RESULTADOS 42 3.1. Generación de mutantes del gen hetR 89 3.2. Análisis de la activación transcripcional del operón devBCA. Papel de los reguladores NtcA Y HetR. 94 3.2.1. Ensayos de extensión de cebador en la región promotora del gen devB 94 3.2.2. Análisis del patrón espacio-temporal de la expresión de los distintos promotores del gen devB 96 3.2.3. Análisis in vitro de la actividad transcripcional de la región promotora del gen devB. Efecto de NtcA y HetR. 100 3.2.3.1. Ensayos de transcripción in vitro 100 3.2.3.2. EMSA de la unión de NtcA al DNA en la región comprendida Sergio Camargo Bernal IV entre los TSPs del gen devB 102 3.2.3.3. Ensayos de protección frente a la degradación por DNasa I 104 3.2.3.4. Efecto del regulador HetR en la unión de NtcA al promotor proximal del gen devB 106 3.3. Análisis de la activación transcripcional de otras regiones promotoras complejas de Anabaena 108 3.3.1. Activación transcripcional en la región promotora del gen hetC 108 3.3.2. Activación transcripcional en la región promotora del gen ntcA 111 3.3.2.1. Efecto de NtcA y HetR 112 3.3.3. Activación transcripcional en la región promotora del gen hetR 114 3.4. Efecto de PipX en la activación de promotores dependientes de NtcA 118 3.4.1. Efecto de PipX sobre la expresión del gen nrrA in vivo 118 3.4.2. Efecto de PipX en la unión de NtcA al DNA en las regiones promotoras de los genes nrrA y devB 119 3.4.2.1. Ensayos de retardo en gel 120 3.4.2.2. Análisis SPR 121 3.4.3. Efecto de PipX en la transcripción in vitro en promotores dependientes de NtcA 123 3.4.4. Efecto de NtcA y PipX en la unión de la RNAP al promotor distal del operón devBCA in vitro 126 3.5. Determinación y caracterización de la región promotora del operón alr2729-cox3 128 3.5.1. Determinación de los inicios de transcripción del operón cox3 128 3.5.1.1. Ensayos de extensión de cebador 128 3.5.1.2. Análisis 5’ RACE 129 3.5.2. Estudio de la unión de NtcA a la region promotora del operón cox3 131 3.5.2.1. Ensayos de retardo en gel 131 3.5.2.1. Ensayos de protección por NtcA frente a la degradación por DNasa I 131 3.6. Estudio de la expresión del factor sigma vegetativo SigA durante la diferenciación de heterocistos en Anabaena 134 3.6.1. Ánalisis de la expresión de sigA mediante fusión con gfp 135 3.6.2. Estudio de la unión del regulador NtcA a la región promotora del gen sigA 144 4. DISCUSIÓN 85 4.1. Papel de NtcA y HetR en la activación transcripcional de genes especifícos del proceso de diferenciación de heterocistos. 149 Índice V 4.1.1. Papel de NtcA y HetR en la activación transcripcional del agrupamiento génico devBCA y el gen hetC 151 4.1.2. Papel de NtcA y HetR en la activación transcripcional en otras regiones promotoras complejas 155 4.2. Papel de PipX en la activación transcripcional de promotores dependientes de NtcA durante la diferenciación de heterocistos. 159 4.3. Caracterización de la región promotora del operón cox3 162 4.4. Estudio de la localización espacio-temporal de la expresión de SigA durante la diferenciación. 163 5. CONCLUSIONES 141 6. BIBLIOGRAFÍA 169 Sergio Camargo Bernal XII Nm Neomicina ORF Open Reading Frame (pauta de lectura abierta) p/p relación peso/peso p/v relación peso/volumen pb Par de núcleotidos (bases) PCC Colección de cultivos tipo del Instituto Pasteur PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo RNA Ácido ribonucleico RNasa Ribonucleasa rpm Revoluciones por minuto SDS Laurilsulfato sódico Sm Estreptomicina Sp Espectinomicina TEMED N, N, N’, N’-tetra-metiletilendiamida TES Ácido N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico Tricina N-tris(hidroximetil)metilglicina Tris Tris(hidroximetil)aminoetano TSP Transcription start point (sitio de inicio de la transcripción) U Unidad de actividad enzimática v/v relación volumen/volumen X-gal 5-bromo-4-cloro-indolil-"-D-galactopiranósido Bases nitrogenadas A adenosina C citosina G guanina T timina Aminoácidos A Ala alanina L Leu leucina R Arg arginina K Lys lisina N Asn asparagina M Met metionina D Asp ácido aspártico F Phe fenilalanina C Cys cisteína P Pro prolina E Glu ácido glutámico S Ser serina Q Gln glutamina T Thr treonina G Gly glicina W Trp triptófano H His histidina Y Tyr tirosina I Ile isoleucina V Val valina 1.INTRODUCCIÓN Introducción 3 1.1. REGULACIÓN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN EN BACTERIAS Las bacterias poseen una gran capacidad de adaptación o respuesta ante los cambios que se producen en el medio ambiente donde éstas viven. Esta gran capacidad de adaptación es el resultado de un preciso y rápido control de la expresión génica en estos microorganismos. El control sobre la expresión génica puede ser ejercido en distintos niveles de este proceso: a nivel transcripcional, de la estabilidad del mRNA, traduccional y post-traduccional. En las bacterias, el control de la expresión génica se realiza fundamentalmente a nivel transcripcional, ya que es el más económico para la célula en términos energéticos. Concretamente es en el inicio de este proceso donde reside el punto principal de control. La transcripción del DNA la lleva a cabo la enzima RNA polimerasa dependiente de DNA (RNAP), que cataliza la síntesis de una molécula de RNA, siguiendo la secuencia de una cadena molde de DNA y utilizando ribonucleótidos trifosfato como sustrato, que son unidos mediante la formación de enlaces 5’-3’ fosfodiester. Este proceso comienza en secuencias específicas de DNA denominadas promotores, que indican dónde tiene que situarse la RNAP para comenzar a transcribir. La transcripción es un proceso cíclico que puede dividirse en tres etapas fundamentales: Unión de la RNAP al DNA e inicio de la síntesis de la cadena de RNA; elongación de la cadena de RNA y terminación del proceso. De forma simplificada, el proceso comienza con la interacción de la RNAP con el promotor dando lugar al complejo cerrado de transcripción (RPc, closed RNAP-Promoter complex). A continuación, tiene lugar la separación de la doble cadena del DNA, mediada por cambios conformacionales en la enzima RNAP, formándose el denominado complejo abierto de transcripción (RPo, open RNAP-Promoter complex). Tras la disociación de la enzima del promotor, se forma el complejo ternario de elongación (RNAP-DNA-RNA) que continua con la elongación del RNA hasta que se encuentra con secuencias terminadoras en el DNA, que provocan la disociación del complejo ternario y la terminación del proceso de transcripción. Sergio Camargo Bernal 4 1.1.1 RNAP bacteriana E. coli constituye el modelo más utilizado para el estudio de los procesos transcripcionales en bacterias. La RNAP bacteriana consta de dos componentes: un núcleo (en inglés “core”) que cataliza la polimerización y síntesis del RNA y los factores sigma que le confieren a la enzima especificidad por determinadas secuencias promotoras. La estructura formada por el núcleo y el factor sigma se denomina holoenzima (E#). El núcleo, de aproximadamente 400 kDa, está constituido por cuatros subunidades distintas denominadas !, ", "’ y $, con una estequiometria 2:1:1:1 (Burguess, 1969). Aunque el núcleo posee toda la maquinaria catalítica requerida para sintetizar RNA, sólo la holoenzima puede iniciar la transcripción en sitios específicos, ya que el núcleo por sí mismo es incapaz de reconocer los promotores. La secuencia, estructura y función del núcleo están conservadas evolutivamente desde las bacterias hasta el hombre (Sweetser et al., 1987; Ebright, 2000; Darst, 2001; Borukhov y Nudler, 2003). La RNAP de Escherichia coli es la mejor caracterizada hasta la fecha, tanto genética como bioquímicamente; sin embargo, su estructura, determinada mediante microscopía crioelectrónica, ha sido resuelta a una resolución relativamente baja, de 15Å (Darst et al., 2002). Las estructuras cristalinas del núcleo de las RNAP de Thermus aquaticus (Taq) y Thermus thermophilus (Tth) si se han podido resolver con una resolución atómica de 3.3 Å y 2,6 Å, respectivamente (Zhang et al., 1999; Vassylyev et al., 2002). No obstante, debido a la gran similitud entre las RNAP de estos microorganismos, los datos obtenidos de estas estructuras pueden aplicarse a la enzima de E. coli. De acuerdo con los datos estructurales disponibles, las RNAP de Taq y Tth comparten una estructura general con forma de “pinza de cangrejo” (Fig. 1.1), donde las pinzas superior e inferior estarían constituidas por las subunidades " y "’, respectivamente. Cada subunidad ! está constituida por dos dominios, un dominio N-terminal (!-NTD) y un dominio C-terminal (!-CTD) que se unen mediante una secuencia de estructura flexible (Blatter et al., 1994). Las subunidades " y "’ se unen en su parte posterior a los dominios !-NTD del dímero de subunidades !, jugando estos dominios un importante papel en el ensamblaje de " y "’ en el core. Los dominios !-CTD interaccionan con un amplio rango de reguladores transcripcionales que pueden unirse a secuencias específicas de DNA en la región promotora (Haugen et al., 2008). En esta estructura, la subunidad $ se dispone rodeando la parte C-terminal de la Introducción 5 subunidad "’. $ es un polipéptido de 91 aminoácidos que no tiene un papel directo en la transcripción y parece funcionar como una chaperona que asiste al plegamiento de la subunidad "’. En todas las estructuras estudiadas hasta la fecha, el espacio interno dispuesto entre las subunidades " y "’ delimita tres canales. Un canal principal de 20-27 Å, que acomoda la doble cadena de DNA y la cadena híbrida DNA-RNA, y dos canales menores de unos 10-12 Å, que se bifurcan a partir del canal principal, uno de los cuales funciona como canal de salida para la molécula de RNA recién sintetizada, “canal de salida del RNA” y otro como sitio de entrada para los NTPs hacia el sitio activo de la enzima, “canal secundario”. El centro activo de la enzima, que se localiza en la parte posterior del canal principal, está compuesto por una triada catalítica de residuos de Asp de la subunidad "’, que establecen interacciones con dos iones Mg2+, que son esenciales al intervenir en la reacción de síntesis de RNA (Zhang et al., 1999; Vassylyev et al., 2002; Muramaki et al., 2002; Cramer et al., 2001) (Fig. 1.1). En las holoenzimas de Taq y Tth, la subunidad # tiene forma de V y está parcialmente encajada entre las pinzas superior e inferior en la parte delantera (Vassyliev et al., 2002; Murakami et al., 2002). Figura 1.1. Estructura de la RNAP de Thermus aquaticus. En la parte izquierda de la figura se muestra el core de la RNAP, y se señalan las distintas subunidades que lo componen: Subunidades ! (magenta y azul), " (marrón), "’ (verde) y $ (gris). También se señalan el canal principal de entrada del DNA, en cuya parte posterior se puede observar un ión Mg2+ (representado por una esfera roja) constituyente del centro catalítico. A la derecha se muestra cómo se dispone la subunidad # en el core para formar la holoenzima. Figura adaptada de Murakami et al., 2002. ! !' "1 "2 # $ Canal principal Centro catalítico Core Holoenzima (E$70) Sergio Camargo Bernal 6 1.1.1.1 Subunidad sigma La subunidad # tiene tres funciones principales: i) Reconocer secuencias específicas del promotor, ii) posicionar correctamente la RNAP en el promotor y iii) facilitar la separación de las cadenas de DNA cerca del sitio de inicio de transcripción (Wosten, 1998). Los factores sigma se pueden clasificar en dos grandes familias: factores de la familia #70 y factores de la familia #54. La familia #70 está subdividida en distintos grupos o subfamilias en base a sus relaciones filogenéticas (Lonetto et al., 1992). Así, se puede diferenciar entre factores sigma de los grupos I, II, III y IV. El grupo I incluye los factores sigma primarios o vegetativos que están muy conservados en secuencia y son esenciales para el crecimiento celular. El grupo II incluye factores sigma que son bastante similares en secuencia y estructura a los del grupo I pero que no son esenciales. Al grupo III pertenecen los factores sigma alternativos, que no se parecen ni en secuencia ni en estructura a los factores sigma anteriores, reconociendo promotores con estructura diferente, que frecuentemente están relacionados con procesos específicos, como son las respuestas generales a estrés, movilidad, choque térmico y esporulación. Por último, los factores sigma del grupo IV, anteriormente conocidos como ECF (extracytoplasmic function), se encuentran ampliamente representados en muchas bacterias y constituyen las subunidades sigma más pequeñas encontradas hasta la fecha. En E. coli se pueden expresar hasta siete factores sigma diferentes. La holoenzima asociada al factor sigma vegetativo o primario, #70, (E#70) transcribe la mayoría de los genes para el mantenimiento de la célula durante la fase de crecimiento exponencial. El resto de factores sigma se unen al núcleo en situaciones especiales o concretas, para formar distintas holoenzimas que reconocen distintos tipos de promotores (Lonetto et al., 1992; Wosten, 1998) que van a dirigir la expresión de ciertos genes que deben ser expresados en circunstancias concretas. Los miembros de la familia #70 del grupo I son homólogos al factor sigma principal de E. coli y B. subtilis y presentan cuatro dominios helicoidales muy conservados (#1.1, #2, #3 y #4) conectados por regiones de unión flexibles (Malhotra et al., 1996; Campbell et al., 2002; Murakami et al., 2002). Estos dominios presentan, a su vez, regiones altamente conservadas, denominadas: regiones 1.1, 1.2-2.4, 3.0-3.1, y 4.1-4.2, siendo la región 3.2 la que conecta los dominios #3 y #4 (Gruber y Gross, 2003). La región 1.1, que todavía no se ha podido cristalizar, parece que interviene en el Introducción 7 proceso de autoinhibición del reconocimiento del promotor por la subunidad sigma en estado libre, jugando también un papel importante en la formación del complejo abierto (Murakami et al., 2002). La región 2.4 participa en el reconocimiento de una de las secuencias conservadas en el promotor, el hexámero -10. La región 2.3 juega un papel fundamental en la separación de la doble hélice de DNA y en la estabilización de la burbuja transcripcional al inicio del proceso de transcripción (Aiyar et al., 1994), mientras que la región 4.2 interacciona con el determinante o hexámero -35 del promotor. 1.1.2. Promotores de E. coli Un promotor es una región de DNA que determina el inicio de transcripción de un gen determinado, que tiene lugar mediante la interacción de la RNAP con determinantes o secuencias específicas de dichas regiones. Entre los promotores dependientes de E#70 se puede diferenciar entre promotores basales y promotores regulados. 1.1.2.1 Promotores basales El inicio de la transcripción desde este tipo de promotores sólo requiere la interacción de la RNAP con el DNA de la región promotora, sin que sea necesaria la participación de ninguna otra proteína reguladora. En la secuencia de DNA de este tipo de promotores se han identificado cuatro elementos diferentes. Los dos elementos principales son dos hexámeros muy conservados denominados cajas -10 y -35. El hexámero o caja -10 posee una secuencia consenso y una posición concreta con respecto al sitio de inicio de la transcripción o TSP (del inglés, Transcriptional Start point) -12TATAAT-7, mientras que el consenso y posición del hexámero -35 es -35TTGACA-30, donde los nucleótidos TTG están conservados en un 90% de los casos en este determinante (Hawley y McClure, 1983; Harley y Reynols, 1987) . El espaciamiento entre estos dos hexámeros también está muy conservado, y consiste en una secuencia no específica que oscila entre 16-18 pb (pares de bases), siendo 17 pb la distancia óptima. En la mayoría de los promotores estudiados, la transcripción comienza en una purina localizada 7-8 pb por detrás de la caja -10 (Hawley y McClure, 1983; Harley y Reynols, 1987). El elemento -10 es reconocido por la región 2.4 de la subunidad # de la RNAP, mientras que el determinate -35 es reconocido por la región 4.2 de # (Fig. 1.2). Además de estos dos elementos fundamentales, en algunos promotores basales también existen Sergio Camargo Bernal 8 otros dos elementos complementarios, denominados región -10 extendida y elemento UP. La región -10 extendida consiste en un dinucleótido 5’-TG-3’, que precede al hexámero -10, en las posiciones -14 y -15, y es reconocido por la región 3.0 de la subunidad # (Fig. 1.2) (Keilty y Rosenberg, 1987; Kumar et al., 1993). Los promotores que portan una caja -10 extendida frecuentemente carecen de un elemento -35 discernible, de manera que hay una interacción de la RNAP con el dinucleótido TG (Barne et al., 1997). Algunos promotores de E. coli también poseen, delante del determinante -35, un elemento UP, que es una secuencia rica en nucleótidos AT que se dispone entre las posiciones -40 y -60 y facilita contactos extras con los dominios !-CTD de las subunidades ! (Fig. 1.2), pudiendo aumentar la eficacia de la transcripción en dos ordenes de magnitud (Ross et al., 1993; Estrem et al., 1998). La ocurrencia de estos elementos en las regiones promotoras, así como la variabilidad con respecto al consenso establecido para estos elementos, determina por sí misma una regulación intrínseca de la eficacia de los distintos promotores. Figura 1.2. Esquema de las interacciones de la RNAP en promotores basales. El modelo representado se basa en los diferentes estudios cristalográficos de la holoenzima RNAP asociada con el DNA. Los dominios !-NTD y !-CTD se conectan a través de un dominio de unión o brazo flexible. En la subunidad # se señalan los cuatro dominios. Se representa la interacción de los dominios de # con las secuencias consenso de los determinantes -35 (TTGACA), caja -10 extendida (TGn) y caja -10 (TATAAT), así como la de los dominios !-CTD de las subunidades ! con el elemento UP. Figura adaptada de Browning y Busby, 2004. 1.1.2.2 Promotores regulados Un gen cuya región promotora posea elementos que reproduzcan fielmente las secuencias consenso anteriormente descritas tendría una expresión elevada en todo momento. La realidad es que la mayoría de los genes poseen determinantes o elementos imperfectos o alejados de la secuencia consenso, expresándose por debajo de su nivel !’ "4 "3 "2 "1 #-NTD #-CTD -10 -35 TATAAT TGn TTGACA Elemento UP +1 ! Introducción 9 óptimo y a veces requiriendo la participación de reguladores transcripcionales. Los promotores regulados poseen un sitio de unión para la RNAP y uno o mas sitios para la unión de reguladores transcripcionales, que pueden actuar activando o reprimiendo el inicio del proceso de transcripción. En la mayoría de los casos estudiados, los activadores transcripcionales se unen al DNA en una posición próxima al hexámero -35, pudiendo contactar con la(s) subunidad(es) ! y/o # de la RNAP. También se pueden unir en posiciones más alejadas del determinante -35, ya que la región flexible que conecta los dominios !-NTD y !-CTD permiten el contacto de la RNAP con el regulador en estas posiciones más alejadas (Murakami et al., 1997). También se han encontrado activadores transcripcionales que pueden unirse en posiciones lo suficientemente alejadas del hexámero -35 como para que la subunidad ! no pueda establecer contactos con los mismos. En este caso se requiere de la intervención de una segunda proteína que medie el contacto entre el activador y la RNAP. El sitio de unión del activador nunca coincide con el determinante -10, ya que esto impediría la formación del complejo abierto (Collado-Vides et al., 1991). La mayoría de los promotores que presentan un sitio de unión para un activador muestran una caja -35 muy poco conservada con respecto al consenso, de forma que en ausencia del activador no tiene lugar la transcripción, o tiene lugar a un nivel muy bajo. Los represores transcripcionales tienen un efecto negativo sobre la transcripción, impidiendo la formación del complejo cerrado, la del complejo abierto, o bien dificultando las primeras etapas de la elongación. Para ello, el represor se une al DNA en un sitio situado normalmente entre los determinantes -35 y -10 o, en algunas ocasiones, en posiciones más alejadas del sitio de unión de la RNAP (Collado-Vides et al., 1991). En muchas ocasiones un mismo regulador transcripcional puede actuar como activador o represor de la transcripción, dependiendo de la posición en la que éste se una al promotor (Browning y Busby, 2004; Perez-Rueda y Collado-Vides, 2000). Sergio Camargo Bernal 16 Estudios filogenéticos realizados mediante la comparación de secuencias de los rRNA 16S de las estirpes más representativas de estos grupos taxonómicos indicaron que sólo las Secciones II (comparten la fisión múltiple) y las secciones IV y V conjuntamente (exhiben procesos de diferenciación celular) son grupos filogenéticamente coherentes, mientras que las secciones I y III agrupan morfotipos con diferentes posiciones filogenéticas (Giovannoni et al., 1988). A pesar de la utilidad de esta clasificación tradicional, aún vigente, los estudios de filogenia molecular más recientes muestran que quizás ninguna de estas secciones constituyan grupos monofiléticos (Giovannoni et al., 1988; Gugger y Hoffmann, 2004), y que durante la historia evolutiva del grupo se han producido distintas transiciones entre la unicelularidad y la multicelularidad (Schirrmeister et al., 2011). Debido a que en los estudios filogenéticos anteriores las estirpes unicelulares de la sección I estaban más representadas que las de otras secciones, recientemente se han incluido 54 genomas de estirpes que cubrían las cinco secciones (Shih et al., 2013). En estos estudios se clasifica a las cianobacterias en 7 clados principales, poniéndose de manifiesto que la capacidad de formar filamentos y la división celular en varios planos aparecen en múltiples momentos e independientemente a lo largo de la evolución del grupo. Además el clado B1, que comprende a las cianobacterias formadoras de heterocistos (secciones IV y V), parece constituir un verdadero grupo monofilético, compartiendo sus miembros la posesión de un grupo de proteínas específicas del proceso de diferenciación de heterocistos (Shi et al., 2013). En contraste con su diversidad morfológica, las cianobacterias constituyen un grupo muy homogéneo desde el punto de vista metabólico. La gran mayoría de las estirpes conocidas son fotoautótrofas aeróbicas (Zerh et al., 2008), realizando la fotosíntesis oxigénica y sólo algunas como Oscillatoria limnetica, en determinadas condiciones, realizan una fotosíntesis anoxigénica oxidando SH2 y liberando S. La fijación del carbono la realizan mediante la vía reductiva de las pentosas fosfato o ciclo de Calvin-Benson. Parte del CO2 fijado se acumula en forma de glucógeno, que se utiliza como material de reserva y se degrada en condiciones de oscuridad, cuando no se realiza la fotosíntesis. Para el metabolismo respiratorio, que se realiza principalmente en condiciones de oscuridad, utilizan la vía oxidativa de las pentosas fosfato. Dado que carecen de la enzima 2-oxoglutarato deshidrogenasa (Stanier y Cohen-Bazire, 1977), el ciclo de Krebs tiene una función anabólica, suministrando el 2-OG necesario para la Introducción 17 incorporación del nitrógeno inorgánico en esqueletos carbonados, la síntesis de aminoácidos de la familia del glutamato y la síntesis de %-aminolevulinato, que es un precursor inmediato para la síntesis de porfirinas, ficobilinas y clorofila (Beale, 1994). Algunas cianobacterias son capaces también de asimilar determinados azúcares como la sacarosa, glucosa o fructosa, necesitando o no iluminación para ello, por lo que pueden clasificarse como fotoheterótrofas o heterótrofas facultativas, respectivamente. Esta capacidad depende, al menos en parte, de la existencia de permeasas específicas que facilitan la entrada de los azúcares en la célula. La cianobacteria en la que se ha centrado este trabajo es la estirpe filamentosa Anabaena sp. PCC 7120, perteneciente a la sección IV de la clasificación de Rippka et al., (1979). 1.2.2. Asimilación del nitrógeno 1.2.2.1. Fijación de nitrógeno La fijación biológica del nitrógeno consiste en la reducción de una molécula de dinitrógeno (N2) a dos moléculas de amoniaco (NH3) según la siguiente reacción: Esta reacción es muy endergónica, necesitándose un minimo de 16 moles de ATP por mol de N2 reducido y consumiendo poder reductor (8e- por cada mol de N2 fijado), estando catalizada por el complejo enzimático de la nitrogenasa. El complejo enzimático de la nitrogenasa está formado por dos componentes proteicos: la dinitrogenasa (proteína que contiene Fe y Mo) y la dinitrogenasa reductasa (proteína que contiene Fe). La dinitrogenasa es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades ! y dos subunidades " determinadas por los genes nifD y nifK, respectivamente, y tiene un peso molecular de unos 220-240 kDa; contiene cuatro centros [4Fe-4S] organizados como dos “agrupamientos P” (Dean et al., 1993) y dos cofactores Fe-Mo-Co. La dinitrogenasa reductasa es un dímero compuesto por dos subunidades idénticas, determinadas por el gen nifH, con una masa molecular aproximada de 60-70 kDa y un centro [4Fe-4S] (Rubio y Ludden, 2008). La dinitrogenasa reductasa media la transferencia, dependiente de ATP, de electrones !"#$%&$#$#%'(#$)*#+,-###########################"!&.#$#&"#$#)*#+/-#)*#-0# !"#$%&'!()(* Sergio Camargo Bernal 18 procedentes de donadores fisiológicos externos como la ferredoxina o la flavodoxina a los centros sulfoférricos de la dinitrogenasa, que une N2 mediante el cofactor Fe-Mo-Co y cataliza su reducción a NH3. La fijación del N2 va siempre acompañada por una reducción de protones (H+) y la consiguiente formación de H2 (Fay, 1992). Parte de la energía y el poder reductor empleados en la reducción de H+ se recuperan mediante la acción de hidrogenasas. Una de estas hidrogenasas, denominada hidrogenasa de consumo, determinada por los genes hupL y hupS (Tamagnini et al., 2002), cataliza la reacción de oxidación de H2 a H+, dirigiendo los electrones resultantes a las cadenas de transporte de electrones respiratoria y fotosintética permitiendo generar ATP y poder reductor. Los genes de la fijación del nitrógeno, genes nif, normalmente están agrupados en el cromosoma bacteriano. Los genes nif estructurales, nifH, nifD y nifK están conservados en todas las especies de microorganismos fijadores estudiados. Además de los genes estructurales, existen otros genes nif que presentan mayor variabilidad entre los distintos microorganismos, teniendo la gran mayoría de ellos una función reguladora, o bien participando en la síntesis de los distintos cofactores de la nitrogenasa. En Anabaena sp. PCC 7120 y Synechococcus sp. RF-1 se han caracteriazado 15 genes que están localizados en un solo agrupamiento y organizados en 6 unidades transcripcionales: nifB-fdxN-nifS-nifU, nifHDK, nifEN, nifX-orf2, nifW-hesA-hesB y fdxH (Herrero et al., 2001; Haselkorn y Buikema, 1992; Huang et al., 1999). En Anabaena sp. PCC 7120 se han encontrado además, en otras posiciones del cromosoma, los genes nifV, nifZ y nifT (Böhme, 1998). La nitrogenasa es una enzima extremadamente sensible al oxígeno; de hecho, sus dos componentes se inactivan rápidamente cuando se extraen de las células en presencia de O2 (Robson y Postgate, 1980). Debido a esta sensibilidad al O2, los distintos microorganismos capaces de fijar nitrógeno atmosférico han desarrollado mecanismos para proteger este complejo enzimático. Aunque el mecanismo y la maquinaria de fijación de N2 es común en casi todos los microorganismos fijadores, los mecanismos de protección frente al O2 sí varían entre los distintos fijadores de N2, siendo las cianobacterias las que despliegan o muestran un repertorio de mecanismos de protección más complejo y regulado, debido a que necesitan protegerse no solo del O2 externo, sino también del que se libera en el proceso de fotosíntesis. La estrategia más común en las cianobacterias no formadoras de heterocistos consiste en una separación temporal de ambos procesos, expresando la actividad nitrogenasa cuando están en Introducción 19 oscuridad y desarrollando fotosíntesis oxígenica cuando se exponen a la luz (Fay, 1992). La otra gran línea estratégica, seguida por cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, como la de los géneros Nostoc y Anabaena, consiste en separar espacialmente ambos procesos implicando multicelularidad y diferenciación celular. 1.2.2.2. Control por nitrógeno en cianobacterias El nitrógeno constituye uno de los bioelementos cuantitativa y cualitativamente más importantes, que se incorpora a la Biosfera mediante distintos procesos asimilatorios llevados a cabo por microorganismos y plantas. En los microorganismos que asimilan distintas fuentes de nitrógeno se produce un fenómeno ampliamente observado denominado control por nitrógeno, que consiste en la represión de las vías de asimilación de algunas fuentes de nitrógeno cuando otras, más fácilmente asimilables, están disponibles para las células (Merrick y Edwards, 1995). En cianobacterias, las fuentes de nitrógeno más comúnmente utilizadas son el amonio, el nitrato, la urea y el dinitrógeno (Flores y Herrero, 1994), siendo el amonio el nutriente nitrogenado preferido (Herrero et al., 2001). También algunas cianobacterias pueden utilizar como fuente de nitrógeno algunos aminoácidos como la glutamina y la arginina para cubrir sus necesidades metabólicas (Flores y Herrero, 1994). La asimilación de estas sustancias exige su incorporación al interiror celular y su posterior metabolización para generar amonio, que es el compuesto nitrogenado inorgánico que se incorpora a esqueletos carbonados para dar lugar a compuestos orgánicos nitrogenados. La incorporación del amonio a esqueletos carbonados se realiza fundamentalmente mediante el ciclo de la glutamina sintetasa-glutamato sintasa, GS-GOGAT (Wolk et al., 1976; Meeks et al., 1978; Flores y Herrero, 1994), el cual constituye la conexión entre el metabolismo del carbono y el nitrógeno (Figura 1.5). En este ciclo, el primer paso lo realiza la enzima GS, que cataliza la incorporación dependiente de ATP de amonio a una molécula de glutamato para generar glutamina, mientras que el segundo lo lleva a cabo la GOGAT, que cataliza la transferencia del grupo amido de la Gln a una mólecula de 2-OG produciendose dos moléculas de glutamato, en una reacción que requiere poder reductor (Van den Heuvel et al., 2004). En cianobacterias, la asimilación de nitrógeno está regulada en función de la fuente de nitrógeno disponible y en función del Ci (carbono inorgánico) disponible. Debido a la Sergio Camargo Bernal 20 falta de 2-OG deshidrogenasa, la síntesis de 2-OG representa el paso final de esta rama oxidativa del ciclo de Krebs, siendo el ciclo GS-GOGAT la principal vía de utilización de este compuesto. De esta forma, los niveles de 2-OG dependen del flujo de asimilación de nitrógeno y de carbono (Herrero et al., 2001), siendo el 2-OG un metabolito sensor de los niveles C/N en la célula (Forchhammer, 1999; 2004; Herrero et al., 2004; Luque y Forchhammer, 2008) (Fig. 1.5). Figura 1.5. Esquema de las principales vías de asimilación del nitrógeno en las cianobacterias y su conexión con el metabolismo del carbono a traves del ciclo GS-GOGAT. Las distintas fuentes de nitrógeno se incorporan a la célula en algunos casos a través de permeasas, y son metabolizadas para generar amonio, que se incorpora a esqueletos carbonodos a través del ciclo GS-GOGAT. En Anabaena sp. PCC 7120 la nitrogenasa sólo está presente en los heterocistos, donde tiene lugar la fijación de dinitrógeno (Figura adaptada de Flores y Herrero, 2005). NrtP, transportador monocomponente de nitrato/nitrito; Nrt, transportador de tipo ABC de nitrato/nitríto; Cyn, transportador de tipo ABC de cianato/nitrito; Urt, transportador de tipo ABC de urea; Amt, permeasa de amonio; N-I, transportador de tipo ABC de aminoácidos neutros e hidrofóbicos; Bgt, transportador de tipo ABC de aminoácidos básicos; N-II, transportador de aminoácidos ácidos y neutros polares; Nar, nitrato reductasa; Nir, nitrito reductasa; GS, glutamina sintetasa; GOGAT, glutamato sintasa; 2-OG, 2 oxoglutarato. En cianobacterias el control por nitrógeno se realiza fundamentalmente a través de dos proteinas sensoras del 2-OG, el regulador transcripcional denominado NtcA (ver apartado 1.2.2.1) y una proteína tipo PII, GlnB. Así, la primera respuesta de las cianobacterias al deficit de nitrógeno (percibido en primera instancia como un incremento de los niveles de 2-OG) es activar genes dependientes del regulador NtcA que estan implicados en la asimilación de otras fuentes de nitrógeno, como los genes del operón nir (proteínas de asimilación de nitrato) y genes amt (trasportadores de amonio). !"#$% !"&$% !"#$% !"&$% !"&$% !"#$ '()*% !%&'$ !(#$ )#*"+"$ !,$ !-.#/0*1"+"$ !#.$ !#.2$ 341$ )#.$ 56.$!%&'$ 56(1/78(9/+$ !:-$!:--$;0.$ +,-% +,.% 3(8</$$$$$$$ =>:=?=5@$ =>$ 3(8</$9*$ 3"<A(1$ ,:?=$ =<1$ =<B$ 3?,$ =?=5@$ Introducción 21 Además, en cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, NtcA interviene en el proceso de diferenciación de heterocistos (aspecto que será tratado en el apartado 1.2.5.1). Las proteinas de tipo PII constituyen una de las familias de proteínas transductoras de señales más ampliamente distribuida en la naturaleza, encontrándose representada en bacterias, archeas y plantas y juegando un papel muy importante en la monitorización del estado nitrogenado y del balance C/N celular (Forchhammer, 2004). La proteína PII se identificó en Synechococcus sp. PCC 6301 y sus principales propiedades bioquímicas se determinaron en Synechococcus sp. PCC 7942. PII es un homotrímero compuesto por subunidades cuyo peso molecular oscila entre 12 y 13 kDa, y cada subunidad posee un sitio de unión para una molécula de ATP o ADP y otro sitio de unión para una molécula de 2-OG. ATP y ADP compiten por el mismo sitio, teniendo el ATP mayor afinidad por el último (Fokina et al., 2010). La unión de ATP y 2-OG es sinérgica (Forchhammer et al., 1997). Además, en cianobacterias esta proteína también se regula por fosforilación (Forchhammer et al., 2004 y 2008). PII actúa interaccionando con distintas dianas proteicas, activando o reprimiendo algunos procesos en función del estado nitrogenado celular. En cianobacterias se han identificado tres procesos en los que PII actuaría como regulador: el transporte de nitrato y nitrito, la biosíntesis de arginina y la expresión de genes dependientes de NtcA (Luque y Forchhammer, 2008). Existen interacciones reguladoras complejas entre PII y NtcA. En Synechococcus, NtcA regula los niveles transcripcionales y post-traduccionales de PII (Lee et al., 1999; Sauer et al., 1999). Además, PII se requiere para estimular la actividad de NtcA bajo condiciones de limitación de nitrógeno (Aldehni et al., 2003; Paz-Yepes et al., 2003). Además, en Synechococcus sp. PCC 7942 se ha descrito una proteína pequeña que interacciona físicamente con PII, denominada PipX (PII interaction protein X). Mediante ensayos de doble híbrido y “Surface Plasmon Resonance” se ha descrito que PipX interacciona también con NtcA (Espinosa et al., 2006). En base a esto y a una cierta disminución de los niveles de expresión de algunos genes regulados por NtcA en mutantes pipX, se había propuesto que la proteína PipX sería un coactivador de NtcA (Espinosa et al., 2006). P II se une a PipX en su estado desfosforilado. Durante la realización de este trabajo se han publicado dos estructuras cristalográficas de los complejos PipX-PII y PipX-NtcA (Llácer et al., 2010; Zhao et al., 2010). Sergio Camargo Bernal 22 1.2.2.3. El regulador transcripcional NtcA NtcA (del inglés Nitrogen Control) es una proteína de unos 222 aminoácidos con una distribución universal en cianobacterias (Frías et al., 1993) que pertenece a la familia de reguladores transcripcionales CRP. El gen ntcA se clonó por primera vez de Synechococcus sp. PCC 7942 y, al igual que otros reguladores de la familia CRP, NtcA presenta un dominio HTH de unión al DNA en su extremo carboxilo terminal (Vega- Palas et al., 1990; Herrero et al., 2001) y se comporta como un dímero en disolución (Wisén et al., 1999). NtcA ejerce su acción sobre la expresión de los genes a los que regula mediante interacción con la región promotora de los mismos, uniéndose al DNA en sitios de secuencia específica que contienen el consenso GTAN8TAC (Luque et al., 1994). Esta secuencia palindrómica está muy conservada, siendo los dos nucleótidos externos de cada triplete (subrayados) los más importantes (Luque et al., 1994; Ramasubramanian et al., 1994; Vázquez-Bermúdez et al., 2002a). Se ha determinado además que la presencia de los nucleótidos C y A situados respectivamente en las posiciones segunda y tercera tras el triplete GTA, así como la presencia de Ts o As flanqueando la secuencia consenso, favorecen la unión de NtcA (Herrero et al., 2001). En ensayos realizados in vitro se ha observado que la unión de NtcA a sus secuencias diana en el DNA aumenta por la interacción con el 2-OG, si bien NtcA puede unirse a estas secuencias con menor afinidad en ausencia de este metabolito (Vázquez-Bermúdez et al., 2002b; Tanigawa et al., 2002). Durante la realización de este trabajo se ha resuelto la estructura cristalográfica de NtcA de Anabaena sp. PCC 7120 en presencia o ausencia de 2-OG en (Zhao et al., 2010) (Fig. 1.6). Al igual que CRP, NtcA funciona como un dímero, en el que cada monómero posee una región N-terminal con un dominio EBD (Efector Binding Domain) o dominio de unión a efector y una región C-terminal con un dominio HTH de unión a DNA conectados por una gran hélice (hélice C o !3) (Luque et al., 1994; Zhao et al., 2010). El 2-OG se une en una región con forma de bolsillo del dominio EBD, resultando en una cambio de conformación en el dímero, de forma que las dos helices C (una de cada monómero) se aproximan, adquiriendo una conformación coiled-coil. Este aproximación de las hélices C provoca un cambio conformacional, de manera que la estructura del dímero se vuelve más compacta y los dos dominios HTH de unión al DNA se disponen más próximos y adoptan una orientación que favorece la interacción con el surco mayor del DNA (Zhao et al., 2010). A diferencia de CRP, que no es capaz Introducción 23 de unirse al DNA en ausencia de AMPc (su efector), la estructura apo-NtcA (sin unir 2-OG) es más permisiva con la unión al DNA (Zhao et al., 2010), confirmando los resultados anteriormente obtenidos mediante ensayos de unión in vitro (Olmedo-Verd et al., 2008). El estudio comparativo de los promotores de genes directamente activados por NtcA ha permitido determinar una estructura consenso para los mismos, que se ha denominado promotor canónico activado por NtcA. Éste se compone de un sitio de unión de NtcA centrado aproximadamente en la posición -41.5 con respecto al sitio de inicio de la transcripción, separado por unos 22 nucleótidos de una caja o determinante -10 de secuencia consenso TAN3T, secuencia muy similar a la reconocida por la RNAP unida al factor #70 en E. coli. Por tanto, esta estructura de promotor se ajusta a la de los promotores bacterianos regulados de clase II, en los que el sitio de unión del activador se encuentra solapando con, o reemplazando, al determinante -35 (Herrero et al., 2001; Browning y Busby, 2004). NtcA también puede actuar como represor de la expresión de determinados genes. En estos casos el sitio de unión de NtcA bloquea la unión de la RNAP, solapando entonces con la caja -10 o con el TSP, o encontrándose después del TSP (Herrero et al., 2001). Figura 1.6. Estructura del homodímero de NtcA en su forma apo-NtcA y NtcA-2OG. En la parte izquierda se representa la estructura de apo-NtcA, con sus dos subunidades en colores naranja y violeta. Se señalan con flechas las helices-C y hélices-F de los dominios hélice-vuelta-hélice. La unión de dos moleculas de 2-OG al homodímero produce un cambio conformacional, de manera que en el complejo NtcA-2OG, las subunidades, representadas en color cian y rosa, se disponen en una estructura más compacta (parte derecha), que se une con mayor afinidad al DNA. Figura adaptada de Zhao et al., 2010. NtcA no sólo ejerce el control por nitrógeno en cianobacterias, sino que también regula otros genes que intervienen en el metabolismo del carbono, la fotosíntesis y !"#$% Apo-NtcA NtcA-2-OG Helices F Helices C Sergio Camargo Bernal 24 respuestas a estrés (Herrero et al., 2001), considerándose actualmente como un regulador global de cianobacteriano (Picossi et al., 2014). 1.2.3. El Heterocisto Los heterocistos son células terminalmente diferenciadas, altamente especializadas en la fijación de nitrógeno atmosférico bajo condiciones óxicas, en las que se alberga el sistema de fijación de nitrógeno, protegido tanto del oxígeno atmosférico como del generado por la propia cianobacteria mediante el proceso de fotosíntesis oxigénica. Durante el proceso de diferenciación de heterocistos, las células pierden la capacidad de división y se producen una serie de cambios tanto a nivel morfológico y estructural como a nivel metabólico, que van a distinguir al heterocisto de la célula vegetativa de la que procede (Haselkorn, 1978; Wolk et al., 1994; Herrero et al., 2004). A diferencia de otros tipos de células diferenciadas como las esporas y los akinetos que permiten la supervivencia de la célula en condiciones desfavorables a través de una disminución de su metabolismo o estado de latencia, los heterocistos presentan un metabolismo muy activo, cuya función principal es proporcionar nitrógeno combinado al resto de células del filamento (Wolk et al., 1994). La relación que se establece entre los heterocistos y las células vegetativas es mutualista, de forma que los heterocistos proporcionan nitrógeno fijado a estás, mientras que las células vegetativas llevan a cabo la fijación fotosintética del CO2 y proporcionan a los heterocistos compuestos reducidos de carbono. 1.2.3.1. Estructura del heterocisto Entre las adaptaciones estructurales que presenta el heterocisto destacan la formación de una gruesa envuelta que se deposita sobre la pared celular Gram negativa que poseen las cianobacterias. Esta envuelta dificulta la difusión de gases, disminuyendo la entrada del oxígeno extracelular (Murry y Wolk, 1989). La envuelta de los heterocistos está formada por dos capas (Figura 1.7 b). La capa más interna, o capa laminada, está formada fundamentalmente por glicolípidos específicos de este tipo celular, que consisten en derivados de hexosas con largas cadenas de polihidroxialcoholes (Winkenbach et al., 1972; Fay, 1992). Esta capa, que rodea al heterocisto excepto por las zonas de unión con las células vegetativas, Introducción 25 constituye una barrera frente a la difusión de gases. La capa externa, o capa homogénea, esta formada por polisacáridos específicos, cuya función es proteger de daños físicos a los glicolípidos de la capa interna (Cardemil y Wolk, 1979; Murry y Wolk, 1989). Se ha demostrado que la envuelta que presentan los heterocistos, especialmente la capa de glicolípidos, puede variar en grosor dependiendo de la concentración de oxígeno extracelular (Kangatharalingam et al., 1992). Para reducir la difusión de oxígeno entre las células vegetativas y los heterocistos, el contacto entre los dos tipos celulares es mínimo, produciéndose a través de un septo muy estrecho y diferenciado, en el que la envuelta da lugar a una especie de canal (Lang y Fay, 1971; Giddings y Staehelin, 1978, 1981) (Figura 1.7 a). Dada la gran similitud entre las moléculas de O2 y N2, la envuelta del heterocisto debe proporcionar el grado de permeabilidad adecuado para asegurar que la concentración de N2 en el citoplama sea suficiente para el proceso de fijación, pero que la cantidad de O2 que entre sea lo suficientemente baja como para poder ser consumida por la actividad respiratoria, de forma que su nivel intracelular sea mínimo (Walsby, 1985). Alternativamente, se ha propuesto que la pared del heterocisto podría ser muy impermeable a todos los gases en general, y que el nitrógeno molecular podría entrar desde las células vegetativas adyacentes, exclusivamente a traves de los septos, mediante un mecanismo regulado (Walsby, 2007). Otra adaptación estructural importante del heterocisto es la reorganización de las membranas intracitoplasmáticas. La distribución concéntrica y periférica, típica de las membranas tilacoidales de las células vegetativas desaparece para dar paso a un sistema de membranas más reticulado que se localiza próximo al septo (Wildon y Mercer, 1963; Lang, 1965; Lang y Fay, 1971; Fay, 1992) (Figura 1.7 a), constituyendo la región denominada “honeycomb” (en panal) (Lang y Fay, 1971), que posee una alta concentración de enzimas respiratorias (Murry et al., 1981). Los heterocistos presentan dos gránulos polares visibles al microscopio óptico, localizados próximos a los septos de unión con las células vegetativas, que están constituidos por cianoficina (Sherman et al., 2000). La cianoficina es un polímero de alto peso molecular y de síntesis no ribosómica formado por cantidades equimolares de Asp y Arg. Debido a su conspicua presencia en los polos del heterocisto, se ha sugerido que este polímero podría actuar como una reserva dinámica de nitrógeno (Carr, 1988; Mackerras et al., 1990). Sergio Camargo Bernal 32 del promotor. También se conserva un residuo de treonina que en E.coli interacciona con la secuencia -10 (Brahamsha y Haselkorn, 1991). A pesar de la gran similitud entre la RNAP de cianobacterias y la de E. coli, deben de existir diferencias en cuanto a la especificad en el reconocimiento de promotores, ya que los promotores cianobacterianos son utilizados más eficazmente por la RNAP cianobacteriana que por la enzima de E. coli (Schneider et al., 1991). Al comparar distintos promotores vegetativos de cianobacterias, se puede observar que éstos se desvían algo del consenso en los determinantes -10 y -35. Además, como se tratará más adelante en el apartado 1.2.5.3, algunos promotores que dirigen la expresión de genes específicos del proceso de diferenciación de heterocistos no poseen el determinante -35, y sólo presentan un determinante -10, cuya secuencia a veces se desvía bastante del consenso establecido para E. coli. Todo ello permite pensar en la existencia de exclusivos mecanismos de regulación de la transcripción durante este proceso. 1.2.5. Regulación de la expresión génica durante la diferenciación de los heterocistos Desde hace tiempo se había observado que ciertas proteínas se expresan exclusivamente en heterocistos, otras sólo se expresan en células vegetativas, mientras que otras se expresaban en ambos tipos celulares (Fleming y Haselkorn, 1974). Posteriormente se observó que ciertos genes sólo se expresaban en determinados tipos celulares. De esta forma, algunos como los del operón nifHDK, sólo se expresan en heterocistos maduros (Elhai y Wolk, 1990), otros como los del operón rbcXLS sólo se expresan activamente en células vegetativas (Elhai y Wolk, 1990), mientras que otros como el gen glnA se expresan en ambos tipos celulares (Schneider et al., 1987; Frías et al., 1994; Valladares et al., 2004). Todo ello llevó a la idea de que la regulación de la expresión génica durante este proceso de diferenciación de los heterocistos, ocurría principalmente a nivel transcripcional (Wolk et al., 1994). En Anabaena sp. PCC 7120 se han realizado estudios globales a nivel genómico, mediante análisis de microarrays, de la abundancia de transcritos a las 3, 8 y 24 horas tras eliminar el nitrato del medio donde se cultivaban las células. Estos estudios han mostrado que al menos 495 genes incrementan significativamente su expresión y 196 genes disminuyen su expresión durante el proceso de diferenciación Introducción 33 (Ehira y Ohmori, 2003). En este estudio también se ha observado que al imponer condiciones de carencia de nitrógeno combinado, aumentan en primer lugar la expresión de genes relacionados con el aprovechamiento de cualquier traza de nitrógeno combinado que pudiera existir en el medio, como los genes que determinan transportadores para la incorporación de nutrientes (Ehira y Ohmori, 2003). Cuando el déficit de nitrógeno persiste, a continuación se activa la expresión de los genes específicos de la diferenciación de los heterocistos (Flores y Herrero, 2010). Durante este proceso, la inducción o represión de genes no se produce al unísono, sino que los cambios transcripcionales están regulados temporalmente, de manera que la síntesis y el efecto de un determinado producto génico sólo ocurre en un momento determinado del desarrollo, teniendo a veces un efecto transitorio, que llega a ser imperceptible o nulo en otro estadio de la diferenciación (Kumar et al., 2010; Herrero et al., 2013). Esta regulación temporal en el proceso de diferenciación de heterocistos implica una secuencia temporal de eventos de activación génica. A grandes rasgos, se pueden establecer tres etapas de activación génica o categorías de genes (Fig. 1.8). Entre los denominados genes tempranos, se encuentran distintos reguladores tanto positivos como negativos de este proceso, como hetR, nrrA, patA, hetC, hetP, hetF, que determinan reguladores positivos, y el gen patS, que como se comentó anteriormente determina un regulador negativo de la diferenciación. Durante la etapa intermedia o de maduración tiene lugar la activación de los llamados genes intermedios, y es cuando se van a producir los grandes cambios morfológicos en las células que se están diferenciando. Así, entre las 4 y 10 h de deficiencia de nitrógeno se produce la inducción de los genes que intervienen en la formación y deposición de la envuelta característica de los heterocistos, como los genes hep (hepA, hepB y hepC) implicados en la formación de la capa de polisacáridos, y los genes devR y hetK, que determinan un sistema de regulación de dos componentes de este proceso. La formación de la cap de glicolípidos de la envuelta, se debe a la activación de los genes hgl (heterocyst envelope glycolipids) hglB, hglC, hglD y hglE, que son los genes estructurales implicados en la biosíntesis de glicolípidos. También tienen una importancia crucial para la maduración de la envuelta la activación del operón devBCA y del gen hgdD, que determinan un exportador tipo ABC y una proteína tipo Tol-C, respectivamente, ambas implicadas en la exportación de glicolípidos. Por último se activan los denominados genes tardíos, cuyos productos proporcionan funcionalidad al heterocisto. Entre las 18-24 h de déficit de nitrógeno, se inducen los genes nif, genes de la fijación del nitrógeno, (Elhai y Wolk Sergio Camargo Bernal 34 1990; Golden et al., 1991), los genes cox, que determinan oxidasas terminales respiratorias, genes hupLS, que determinan la hidrogenasa de consumo irreversible, y algunos genes que intervienen en la incorporación del NH4+ en compuestos orgánicos nitrogenados. Figura 1.8. Regulación temporal de la activación génica durante la diferenciación de heterocistos. La diferenciación de heterocistos tiene lugar en respuesta a la deficiencia de nitrógeno e implica la expresión secuencial de una serie de genes, tanto reguladores como estructurales. A grandes rasgos este proceso puede ser dividido en tres etapas (ver texto). Dos reguladores transcripcionales juegan un papel clave en los procesos de activación génica durante la diferenciación de heterocistos. Uno de ellos es NtcA, que no sólo se requiere al comienzo del proceso de diferenciación, sino que es necesario en etapas intermedias y tardías del proceso. El otro regulador clave es HetR, un regulador específico del proceso de diferenciación de heterocistos. 1.2.5.1. El regulador HetR HetR se requiere para la diferenciación de los heterocistos (Buikema y Haselkorn, 1991a; 1991b; Black et al., 1993; Khudyakov y Golden, 2004). Mientras que los mutantes hetR no forman heterocistos, cuando se sobreexpresa hetR (Buikema y Haselkorn, 1991a; Buikema y Haselkorn, 2001) los filamentos presentan una frecuencia incrementada de heterocistos, produciéndose incluso la diferenciación de heterocistos !"#$#%& '()*+($#,"& -*"$#,"& !"#$%&'(")!"!**$!& +,"$!"+,"-!& '(".%&'("/" .%/#0($1+#)%02&'(+$0.!"1(2)&3& '("4& 3/#$%/45#)%02&'560%.%7%8%& 1(20.$!"'517&& '("9& !:;<74& #=>?%&#=>@& 'A+B-& 56!$%&& 678$#7"$#(&)7& "#9+,:7"%& 37"70& 97;5+("%0& 37"70& #"97+;7)#%0& 37"70&9(+)4%0& Introducción 35 en condiciones represoras (con nitrógeno combinado), aunque éstos no son funcionales (Buikema y Haselkorn, 2001). hetR es uno de los primeros genes que se induce durante la diferenciación de heterocistos, presentando autorregulación positiva (Black et al., 1993; Buikema y Haselkorn, 2001). Su expresión se incrementa en todas las células del filamento tan sólo 30 minutos después de haber impuesto condiciones de deficiencia de nitrógeno combinado. Tras 3,5 h, su expresión ya está confinada a ciertas células que muestran un patrón de espaciamiento similar al de los heterocistos una vez diferenciados (Black et al., 1993). La proteína HetR se había descrito como una proteasa tipo serina dependiente de calcio inusual (Zhou et al., 1998a), que in vitro era capaz de autodegradarse y de degradar a una proteína que une calcio, la proteína Ccbp (Shi et al., 2006; Zhou et al., 1998a). Aunque hasta la fecha no se ha podido determinar con exactitud el papel del Ca2+ intracelular en el desarrollo de heterocistos, se piensa que el aumento de los niveles de Ca2+ intracelular que tiene lugar durante la diferenciación estaría relacionado con la actividad proteolítica de algunas proteasas (Shi et al., 2006; Zhao et al., 2005). Por otra parte, también se había descrito que HetR tenía cierta capacidad de unión al DNA in vitro, interaccionando con las regiones promotoras de algunos genes de la diferenciación (Huang et al., 2004). En el caso de la región promotora de hetP, se determinó la secuencia de DNA a la que se une HetR, que consiste en una repetición invertida de 17 pb (Fig.1.9) (Higa y Callahan, 2010). También se ha determinado la secuencia de DNA con la que interacciona HetR en la región promotora de hetZ (Fig.1.9) (Du et al., 2012). Al comparar ambas secuencias de interacción de HetR, se detecta una secuencia común de 14 nucleótidos (Fig.1.9 b), que son esenciales para la interacción de HetR en la región promotora de hetZ. Sin embargo, no se han encontrado secuencias similares en las regiones promotoras de hetR, patS, hepA y pknE, con las que HetR interacciona también (Du et al., 2012). La capacidad de unión al DNA de HetR parece depender de su capacidad de formar homodímeros en solución, interfiriendo el péptido PatS con dicha unión (Huang et al., 2004). Concretamente, se ha comprobado que el pentapéptido PatS-5, RGSGR, que representa la secuencia C-terminal de PatS inhibe la unión in vitro de HetR a algunas regiones promotoras de genes regulados (Huang et al., 2004; Risser y Callahan, 2007; Feldman et al., 2012; Du et al., 2012), interaccionando directamente con el homodímero HetR (Feldmann et al., 2011). Sergio Camargo Bernal 36 Figura 1.9. Representación de la estructura tridimensional del homodímero HetR y secuencia de unión al DNA propuesta para este regulador. En la parte superior de la imagen se representa la estructura tridimensional del dímero de HetR, con la unidad central de unión al DNA (azul) y los dominios flap y hood (rojo y verde, respectivamente). En la parte inferior se muestra la comparación de las secuencias de 51 pb que contienen el sitio de unión de HetR en los promotores hetZ y hetP. Las bases coincidentes en ambas secuencias se señalan en negrita y mediante flechas la repetición invertida de 17 pb encontrada en el promotor de hetP. (Figura adaptada de Kim et al., 2011 y Du et al., 2012). Recientemente, se ha resuelto la estructura cristalina de HetR de la cianobacteria termófila de la sección V Fischerella, mostrando a esta proteína como un homodímero (Fig. 1.9) con una unidad central de unión al DNA constituida por las regiones N- terminales de las dos subunidades, cada una de las cuales aporta un motivo HTH (Kim et al., 2011), y dos dominios globulares denominados flap, que se extienden hacia ambos lados de la estructura del dímero (Kim et al., 2011) y que podrían ser dominios de interacción con otras proteínas. También posee un dominio denominado hood, constituido por las regiones C-terminales de ambas subunidades, situado sobre la región central de unión al DNA. Se ha postulado que esta región es la que podría estar implicada en la interacción con PatS (Feldman et al., 2011; 2012). Dominio Flap Dominio Flap Dominio Hood Motivos HTH Región central de unión al DNA Introducción 37 1.2.5.2. Relaciones entre NtcA y HetR Como se ha indicado antes, NtcA y HetR son los reguladores principales de la diferenciación de los heterocistos, y en los mutantes ntcA o hetR no se observa ningún signo de diferenciación (Frías et al., 1994; Wei et al., 1994; Buikema y Haselkorn, 1991). Ambos reguladores se requieren para que se inicie el proceso (Buikema y Hasselkorn, 1991; Frías et al., 1994; Wei et al., 1994; Herrero et al., 2013). En Anabaena sp. PCC 7120 se ha observado que la activación transitoria del gen hetR al principio de la diferenciación (Black et al. 1993) requiere del regulador NtcA (Frías et al., 1994). También se ha observado que la activación de la expresión de ntcA depende del gen hetR. Por tanto, ntcA y hetR presentan una dependencia mutua para su activación, precediendo la activación de hetR a la de ntcA (Muro-Pastor et al., 2002). El incremento de expresión de los dos reguladores se produce principalmente en las células que se están diferenciando (Black et al., 1993; Olmedo-Verd et al., 2006). Figura 1.10. Activación mutua de genes de los reguladores NtcA y HetR durante la diferenciación de heterocistos. En el esquema se representa un filamento de Anabaena cultivado con una fuente de nitrógeno combinado, en el cual NtcA y HetR están presentes a bajo nivel. En respuesta a la deficiencia de nitrógeno combinado, NtcA se activa, probablemente por interacción con su efector 2-OG. NtcA en su forma activa (NtcA*) activaría la expresión de hetR en algunas células, desencadenando un bucle de amplificación entre NtcA-HetR, que incluye la autoregulación de ntcA y hetR (ver texto), y cuyo resultado sería un aumento de los niveles celulares de ambas proteínas necesario para la activación de otros genes de la diferenciación. Deficiencia de nitrógeno NtcA NtcA* hetR ntcA NtcA HetR HetR NtcA* + + Genes específicos de la diferenciación + NtcA* + Sergio Camargo Bernal 38 Se ha propuesto un modelo en el cual los niveles bajos de NtcA ya presentes en el filamento expuesto a nitrógeno combinado se activarían, posiblemente en respuesta a un incremento en los niveles celulares de 2-OG, para activar la expresión de hetR. Cuando se alcanzase cierto nivel de la proteína HetR, promocionado por el carácter de autorregulador positivo de hetR, ésta activaría la expresión de ntcA, también potenciada por autorregulación positiva (Herrero et al., 2004). La activación mútua por autorregulación de ambos resultaría en un aumento de la expresión de los dos reguladores, que es crucial para el establecimiento de los niveles de expresión requeridos para el proceso de diferenciación de heterocistos (Fig. 1.10) (Flores y Herrero, 2010; Herrero et al., 2013). 1.2.5.3. Promotores de genes de la diferenciación de heterocistos Muchos de los genes específicos del proceso de diferenciación de heterocistos poseen regiones promotoras complejas que permiten el comienzo de la transcripción desde distintos TSPs, pudiendo éstos ser dirigidos por distintos tipos de promotores, que muestran in vivo distinta especificidad espacio-temporal en su expresión. En estas regiones promotoras complejas se pueden encontrar promotores constitutivos, tipo #70, con determinantes -10 y -35, que aseguran cierto nivel de expresión génica independiente del régimen de nitrógeno soportado por las células. Otros promotores de genes de la diferenciación muestran una dependencia in vivo del regulador NtcA (Fig. 1.11). Entre éstos se incluyen promotores directamente activados por NtcA uniéndose a un sitio de unión consenso (ya referidos en el apartado 1.2.2.3), con una estructura que se ajusta a la de los promotores bacterianos regulados de clase II, en los que el sitio de unión del activador se encuentra solapando con, o reemplazando, al determinante -35 (Herrero et al., 2001; Browning y Busby, 2004). La expresión in vivo desde este tipo de promotores es independiente del regulador HetR. Como ejemplo de estos promotores se pueden mencionar al promotor P1 de glnA, P2 de devBCA, P2 de hetC y el único promotor de nrrA. La presencia de RNAP, NtcA y su efector el 2-OG son necesarios y suficientes para que se produzca la activación in vitro de este tipo de promotores, teniendo el regulador NtcA y su efector 2-OG un efecto positivo en el reclutamiento de la RNAP y jugando un papel principal en la formación del complejo abierto transcripcionalmente activo (Valladares et al., 2008). También existe otro tipo de promotores dependientes del regulador NtcA en los que el sitio de unión de este Introducción 39 regulador se situa por delante de la posición -41,5, ajusándose a la estructura de los promotores bacterianos regulados de clase I (ver apartado 1.1.3.1). Como ejemplo de este tipo de promotores están el promotor P1 de ntcA o el P1 del cphB1, que poseen sitios de unión de NtcA centrados en las posiciones -93,5 y -92,5, respectivamente. Finalmente, hay un tipo especial de promotores que depende in vivo de NtcA y HetR pero no muestran ningún sitio de unión de NtcA reconocible, en los cuales tan sólo se puede identificar en algunos casos, una posible caja o determinante -10. Ejemplos de este tipo de promotor son el P1 de hetC, P1 de devB, P2 de hetR y P3 de ntcA. Figura 1.11. Estructura de los distintos tipos de promotores regulador de genes de la diferenciación de heterocistos. Arriba se representa el promotor canónico activado por NtcA, representando el determinante -10 por un cuadrado azul y el sitio de unión de NtcA consenso con un rectángulo rojo. También se indica la distancia entre ambos determinantes. En el centro se representa el promotor que posee un sitio de unión para NtcA centrado por delante de la posición -41,5 y abajo el que no posee ningún sitio reconocible para el regulador NtcA. !"#$#%#"&'()(*'+(*%(&'(&,%-.&'(&/012(&33&&& !"#$#%#"&'()(*'+(*%(&'(&,%-.&4&5(%6& TAN3T ! 22 pb !"#$%"#&' tsp Gen regulado por N P2 hetC P2 devBCA P1 glnA PnrrA (-41,5) !"#$#%#"&'()(*'+(*%(&'(&,%-.&'(&/012(&3& P1 ntcA (-94,5 y -54,5) P1 cphB1 (-92,5) > 22 pb Sin sitios reconocibles para NtcA P1 devBCA, P1 hetC, P2 hetR, , P3 ntcA Sergio Camargo Bernal 40 1.2.5.4. Papel de PipX durante la diferenciación de heterocistos Como se ha mencionado antes, PipX es una proteína pequeña que se descubrió en la cianobacteria unicelular Synechococcus sp. PCC 7942 y que interacciona con PII y NtcA, ejerciendo un papel positivo en la expresión de genes relacionados con el metabolismo de distintas fuentes de nitrógeno combinado (Espinosa et al., 2006) (apartado 1.2.2.2). En Anabaena sp. PCC 7120, la ORF asr0485 determina una proteína homóloga a PipX. Este gen se induce bajo condiciones de ausencia de nitrógeno combinado, observándose su expresión preferentemente en proheterocistos durante el proceso de diferenciación y en heterocistos maduros (Valladares et al., 2011). La transcripción de pipX en Anabaena tiene lugar desde una región promotora compleja que incluye promotores regulados por NtcA y HetR (Valladares et al., 2011). Los mutantes pipX presentan un crecimiento diazotrófico ralentizado y una menor actividad nitrogenasa respecto a la estirpe silvestre, resultando particularmente afectados los niveles de esta actividad bajo condiciones óxicas (Valladares et al., 2011). Este fenotipo es debido en parte a una expresión disminuida y/o retardada de los genes estructurales de la nitrogenasa y los agrupamientos génicos, coxB2A2C2 y coxB3A3C3, que determinan oxidasas respiratorias terminales involucradas en la protección de la nitrogenasa frente al oxígeno (Valladares et al., 2011). Por tanto, parece que PipX juega un papel regulador importante durante el proceso de diferenciación de heterocistos, permitiendo la expresión óptima de genes específicos que se activan en una etapa intermedía-tardía de este proceso (Valladares et al., 2011). Introducción 41 1.3. OBJETIVOS DE ESTA TESIS El objetivo inicial que nos planteamos en este trabajo de Tesis fue el de profundizar en el conocimiento de los mecanismos de activación transcripcional de los distintos tipos de promotores que dirigen la expresión de genes específicos del proceso de diferenciación de heterocistos. Para ello se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Estudio del papel de los reguladores NtcA y HetR en la activación transcripcional del operón devBCA. 2. Estudio del papel de los reguladores NtcA y HetR en la activación transcripcional desde las regiones promotoras complejas que dirigen la expresión de los genes hetC, ntcA y hetR. 3. Estudio del posible papel de PipX en la activación de la transcripción dependiente de NtcA durante la diferenciación de heterocistos. 4. Estudio del patrón espacio-temporal de expresión del factor sigma vegetativo SigA durante el proceso de diferenciación de heterocistos. Parte de los resultados que se exponen en este trabajo han sido ya publicados: Camargo, S., Valladares, A., Flores, E. y Herrero, A. (2012). Transcription activation by NtcA in the absence of consensus NtcA-Binding sites in an Anabaena heterocyst differentiation gene promoter. J. Bacteriol. 194: 2939-2948. Camargo, S., Valladares, A., Forchhammer, K. y Herrero, A. (2014). Effect of PipX on NtcA-dependent promoters and characterization of the cox3 promoter region in the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. FEBS Lett. 588: 1787-1794. Sergio Camargo Bernal 48 2.1.1.3. Método de recogida y lavado de células Las cianobacterias se recogían mediante centrifugación a temperatura ambiente en una céntrifuga Heraeus modelo “Megafuge 1.0” a 4,000 x g durante 5-10 min, o bien mediante centrifugación a temperatura ambiente o 4ºC en una centrifuga Beckman Coulter modelo “Avanti J-25”, utilizando el rotor JLA 16.250 a 5,403 x g durante 5 min (volúmenes pequeños, 5-50 ml), o mediante un sistema Millipore de filtración por vacío a través de filtros Millipore HA de 0,45 µm de diámetro de poro. Para el aislamiento de RNA, las células (50-100 ml de cultivo) se recogían mediante filtración por vacío, se lavaban en el mismo filtro con 10 ml de tampón T50E100 (Tris-HCl 50 mM, EDTA 100 mM [pH 8.0]), se resuspendían en el mismo tampón, y se transferían a tubos de microcentrífuga, donde se centrifugaban 1-2 min a 14,100 x g, descartándose el sobrenadante y congelándolas con nitrógeno líquido. Cuando, por razones experimentales, se requería transferir las células a un medio suplementado con una fuente de nitrógeno diferente de la utilizada para su cultivo, era necesario su lavado. Para ello, las células recogidas por centrifugación se resuspendían en medio BG110C, se centrifugaban y se descartaba el sobrenadante, repitiéndose éste proceso de lavado dos veces. Las células recogidas mediante filtración se lavaban en el filtro con medio BG110C. Para la diferenciación de heterocistos, los filamentos se cultivaban en medio líquido BG110-NH4+ hasta alcanzar una densidad celular de 3-6 µg Chl·ml-1, se recogían, se lavaban con BG110C y se reinoculaban en un volumen de BG110C igual al del cultivo del que procedian, continuándose la inducción en las mismas condiciones de cultivo. La muestra de t=0 h se tomaba en el momento de recoger las células cultivadas con NH4+. 2.1.1.4. Determinación de la cantidad de clorofila El contenido de clorofila a (Chl) de las suspensiones celulares se determinaba espectrofotometricamente en extractos metanólicos (Mackinney, 1941). Un volumen de suspensión celular de 100 µl, conteniendo un máximo de 60 µg de Chl, se mezclaba con 900 µl de metanol en un tubo de microcentrífuga y, tras agitación vigorosa (en un agitador tipo vórtex durante 2 min), la suspensión resultante se centrifugaba a 13,000 x g durante 2 min. La concentración de clorofila se estimaba en el sobrenadante en base a Material y métodos 49 su absorbancia a 665 nm, utilizándose un coeficiente de extinción: E=74,46 (mg·ml)-1 cm-1. 2.1.2. Escherichia coli 2.1.2.1. Estirpes empleadas Las estirpes de Escherichia coli utilizadas en este trabajo y las características más relevantes de su genotipo se muestran en la tabla 2.3. Tabla 2.3. Estirpes de E. coli utilizadas en este trabajo Estirpe Genotipo Referencia DH5α F- supE44 hsdR17 (rK-mk+) recA1 girA96 (NAIr) endA1 thi-1 relA1 '(lacZYA-argF) ((80lacZ'M15) U169. Hanahan, 1983 HB101 F- hsdS20 (rB-mB-) leu supE44 ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 recA13 mcrB. Boyer y Roulland- Dussoix, 1969 BL21 (D3) F- ompT gal [dcm] [Ion] hsdSB (r B-mB-), una E. coli B) con DE3 (profago de ) portador del gen de la RNApolimerasa de T7). Studier et al., 1990 XL-1Blue F´::Tn10 proA+B+lacIq '(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96 (NaIr) thi hsdR17 (rK-mK+) supE44 relA1 lac. Bullock et al., 1987 2.1.2.2. Medios y condiciones de cultivo Las estirpes de E. coli se cultivaban en el medio rico Luria-Bertani (LB) que se compone de NaCl 10 g·l-1, bactotriptona 10 g·l-1 y extracto de levadura 5 g·l-1 (Sambrook y Russel, 2001). Para la preparación de medio sólido se añadía agar a una concentración final de 1,5% (p/v). El medio se esterilizaba en autoclave. Cuando se quería reducir la expresión basal de las proteínas que se querían sobre-expresar, las estirpes XL1-Blue y BL21 (D3) se cultivaban en medio LB suplementado con un 2% de glucosa. Para los cultivos en medio líquido se utilizaban tubos de 10 ml de capacidad con 3 ml de medio (cultivos a pequeña escala) o matraces Erlenmeyer de 1 l de capacidad conteniendo 250 ml de medio (cultivo a gran escala), que se incubaban en agitadores orbitales (200 rpm) a 37ºC. Los cultivos en medio sólido se realizaban en cajas de Petri Sergio Camargo Bernal 50 y se incubaban a 30 ó 37ºC. Cuando era necesario, los cultivos se suplementaban con antibióticos a las siguientes concentraciones finales: ampicilina (Ap) 50 µg·ml-1, kanamicina (km) 50 µg·ml-1, cloranfenicol (Cm) 30 µg·ml-1, estreptomicina (Sm) 25 µg·ml-1, epectinomicina (Sp) 100 µg·ml-1. Los antibióticos se esterilizaban por filtración. 2.2. MÉTODOS DE MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DE DNA 2.2.1. PLÁSMIDOS UTILIZADOS Los plásmidos utilizados durante este trabajo, no construidos durante la realización del mismo, se relacionan en la Tabla 2.4, y los construidos en este trabajo en la Tabla 2.5. Tabla 2.4. Plásmidos utilizados no construidos en este trabajo. Plásmido Resistencia a antibióticos Características relevantes Referencia pAN503 Ap Fragmento de 7,5 kb conteniendo el gen glnA de Anabaena sp. PCC 7120 clonado en el plásmido pBR322. Fisher et al., 1981 pCSAM70 Ap Contiene el gen ntcA de Anabaena sp. PCC 7120 clonado en fase con el sitio de inicio de la traducción, tras el promotor inducible por IPTG, en el vector de expresión pQE9. La proteína NtcA recombinante contiene una cola de His en el extremo amino. Muro-Pastor et al., 1999 pCSAM83 Ap Fragmento de 853 pb de hetC de Anabaena sp. PCC 7120, correspondiente a las posiciones -693 a +160 (respecto al inicio de traducción del gen), clonado en pGEM-T. Muro-Pastor et al., 1999 pCSAM105 Ap Plásmido pTrc99A que contiene el gen hetR de Anabaena sp. PCC 7120 seguido de una secuencia codificante de 6 His. Camargo et al., 2012 pCSAM113b Ap Contiene un fragmento de 602 pb del gen nrrA de Anabaena sp. PCC 7120, correspondiente a las posiciones -488 a +104, clonado en el plásmido pGEM-T. Muro-Pastor et al., 2006 Material y métodos 51 Tabla 2.4. (Continuación) Plásmido Resistencia a antibióticos Características relevantes Referencia pCSAM138 Sm Sp Fusión traduccional nifH-gfp (contiene toda la región promotora y primeros codones de nifH de Anabaena sp. PCC 7120) en el plásmido pCSV3. A.M. Muro-Pastor y E. Flores (no publicado) pCSAM155 Ap Fragmento de 842 pb de devB de Anabaena sp. PCC 7120, correspondiente a las posiciones -825 a +17, clonado en pMBL-T. Muro-Pastor et al., 2009 pCSAM211 Km Plásmido pDUCA7 que lleva clonado el gen gfp-mut2 precedido de su propia secuencia Shine-Dalgarno. Ionescu et al., 2010 pCSAV143 Ap Fragmento de 1.921 pb que contiene el gen rpoD (subunidad SigA de la RNA polimerasa de Anabaena sp. PCC 7120) insertado en pQE9. Valladares et al., 2008 pCSAV155 Ap Fragmento de 3.527 pb que contiene el gen rpoB (subunidad " de la RNA polimerasa de Anabaena sp. PCC 7120) clonado en el vector de expresión pTrc99A. Valladares et al., 2008 pCSAV157 Ap Fragmento de 4.164 pb que contiene el gen rpoC2 (subunidad "’ de la RNA polimerasa de Anabaena sp. PCC 7120) clonado en el vector pTrc99A. Valladares et al., 2008 pCSAV158 Ap Fragmento de 1.924 pb que contiene el gen rpoC1 (subunidad & de la RNA polimerasa de Anabaena sp. PCC 7120) clonado en el vector pTrc99A. Valladares et al., 2008 pCSE4b Ap Plásmido pIC20R con un fragmento de 2,2 kb de Anabaena sp. PCC 7120 (que incluye la región promotora de ntcA y la primera mitad del gen ntcA sitios hasta el sitio ClaI) clonado entre los sitios HindIII-ClaI. J.E. Frías y E. Flores (no publicado) pCSEL21 Ap Plásmido pIC20R incluyendo una fusión ntcA-gfp, usado para construir fusiones traduccionales con el gen gfp mediante sustitución del fragmento de ntcA. Olmedo-Verd et al., 2006 pCSV3 Sm Sp Plásmido derivado de pRL500 en el que el gen de resistencia a Ap se ha escindido con DraI y reemplazado por la casete C.S3. Valladares et al., 2011 pCSV25 Ap Gen rpoA (subunidad ! de la RNA polimerasa de Anabaena sp. PCC 7120) insertado en pQE9. Valladares et al., 2008 pCSV31 Ap Gen pipX fusionado en fase con una secuencia codificante de 6 His en el plásmido pQE9. Camargo et al., 2014 pIC20R Ap Vector de clonación derivado de pUC19. Marsh et al., 1984 Sergio Camargo Bernal 52 Tabla 2.4. (Continuación) Tabla 2.5. Plásmidos utilizados construidos en este trabajo Plásmido Resistencia a antibióticos Características relevantes Referencia pMBL-T Ap Vector empleado para la clonación de fragmentos de DNA generados mediante PCR. Dominion MBL pQE9 Ap Vector de expresión para la producción de proteínas fusionadas a un péptido de 6 His. Qiagen pRL278 Km Vector para la selección positiva de dobles recombinantes en Anabaena. Contiene el gen sacB de Bacillus subtilis. Black et al., 1993 pRL443 Ap Tc Plásmido conjugativo de amplio espectro, derivado de RP4, capaz de movilizar plásmidos derivados de ColE1. Elhai y Wolk, 1988b pRL500 Ap Vector para la selección positiva de plásmidos recombinantes. Elhai y Wolk, 1988a pRL623 Cm Derivado de ColK, portador de mob y genes de metilasas de sitios AvaI, AvaII y AvaIII. Elhai y Wolk, 1997 pT7-7120 Ap Plásmido que contiene el gen rnpB de Anabaena sp. PCC 7120 clonado en pUC19. Vioque, 1997 pTrc99A Ap Vector de expresión que contiene el promotor trc inducible por IPTG. Pharmacia pWB216S2.4 Km Fragmento de 2,4 kb que engloba tanto la región promotora como la ORF del gen hetR de Anabaena sp. PCC 7120 clonado en el plásmido pDUCA7. Buikema y Hasselkorn, 1991a Plásmido Resistencia a antibióticos Características relevantes pCSSC7 Km Gen hetR de Anabaena sp. PCC 7120 con una deleción de 0,5 kb insertado entre las dianas de restricción BamHI y XhoI del pRL278 (ver apartado 3.1). pCSSC8 Km Derivado del plásmido pCSSC7 en el que se ha insertado la casete C.S3 en el sitio NheI (introducido con oligonucleótidos) situado entre las dos regiones flanqueantes del gen hetR utilizadas para producir su deleción (ver apartado 3.1). Material y métodos 53 Tabla 2.5. (Continuación) 2.2.2. Transferencia de DNA 2.2.2.1. Transferencia de DNA a E. coli mediante transformación Las células transformables, preparadas según el método de Hanahan (Hanahan, 1983), fueron proporcionadas por el Servicio de Cultivos Biológicos del Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja (CICIC). Para la transformación se mezclaban 0,1 ml de suspensión de células transformables, previamente descongeladas en hielo, con 10 µl de la preparación de DNA transformante (1 µl si se trataba de un plásmido purificado). La mezcla se incubaba en hielo durante 15 min, tras lo cual se sometía a un choche térmico mediante incubación a 42ºC durante 90 s. Después se mantenía 2 min en hielo, se le añadía 1 ml de medio LB y se incubaba durante 1 h a Plásmido Resistencia a antibióticos Características relevantes pCSSC9 Ap Región promotora del gen glnA amplificada con los oligonucleótidos GA-3 y GA-13 y clonada en el plásmido pMBL-T. pCSSC12 Ap Región promotora de gen rpoD (sigA) desde la posición -1498 hasta la posición +24, amplificada con los oligonucleótidos rpoD3 y rpoD-4 (que introduce una diana EcoRV) y posteriormente clonado en el vector pMBL-T. pCSSC13 Ap Fragmento XhoI/EcoRV procedente de pCSSC12 insertado en las mismas dianas de restricción del plásmido pCSEL21 produciéndose la fusión traduccional sigA-gfp. pCSSC14 Sm Sp Fragmento escindido de pCSSC13 mediante digestión con KpnI y posterior inserción en la misma diana del vector pCSV3. pCSSC18 Nm Fusión transcripcional en la que un fragmento que incluye los dos promotores del gen devB dirige la expresión del gen gfp-mut2 precedido de su propia secuencia Shine-Dalgarno insertado entre los sitios ClaI/XhoI de pCSAM211 (ver apartado 3.1.2.1.3). pCSSC19 Nm Fusión transcripcional en la que un fragmento que incluye solo el promotor distal del gen devB dirige la expresión del gen gfp-mut2 precedido de su propia secuencia Shine-Dalgarno insertado en los sitios ClaI/XhoI de pCSAM211 (ver apartado 3.1.2.1.3). pCSSC20 Nm Fusión transcripcional en la que un fragmento que incluye solo el promotor proximal del gen devB dirige la expresión del gen gfp-mut2 precedido de su propia secuencia Shine-Dalgarno. pCSSC35 Ap Fragmento de la región promotora de alr2729 que cubre desde las posiciones -703 a +64 (respecto al inicio de traducción del gen) clonado en el vector pMBL-T. Sergio Camargo Bernal 54 37ºC. Por último, las células se sembraban en cajas de Petri que contenían medio LB sólido suplementado con los antibióticos adecuados. Para identificar mediante ensayos de “complementación !” transformantes que hubieran incorporado un plásmido con inserto, el medio sólido se suplementaba con X-Gal 40 µg·ml-1 (Sambrook y Russell, 2001). Las colonias portadoras de plásmido con inserto eran de color blanco, mientras que las que habían recibido plásmido sin inserto eran de color azul. 2.2.2.2. Transferencia de DNA a Anabaena sp. mediante conjugación La transferencia de DNA a Anabaena sp. se realizaba, según se describe en Elhai y Wolk (1988a), mediante conjugación con una estirpe de E. coli que contenía el plásmido a transferir (plásmido cargo) además del plásmido auxiliar pRL623 (Tabla 2.4). El plásmido pRL623 contiene genes que determinan metilasas de los sitios AvaI, AvaII y AvaIII (Elhai et al., 1997). Las metilaciones catalizadas por estas enzimas protegen al plásmido cargo frente a las endonucleasas de restricción de la cianobacteria receptora. Los plásmidos eran movilizados mediante el plásmido conjugativo pRL443 (Tabla 2.4) (Elhai y Wolk, 1988a) aportado por una segunda estirpe de E. coli. Para la conjugación, alícuotas de 0,25 ml de cultivos en fase estacionaria de E. coli ED8654 (pRL443) y E. coli HB101 (pCSX, pRL623), donde pCSX representa el plásmido a transferir, se utilizaban para inocular nuevos cultivos de 10 ml de medio LB suplementado con los antibióticos adecuados. Después de incubar a 37ºC con agitación durante 2,5 h, las células, en fase exponencial de crecimiento, se recogían mediante centrifugación, se lavaban dos veces con 10 ml de LB (para eliminar cualquier traza de antibiótico) y se mezclaban en un volumen de 200-300 µl, incubándose entonces a temperatura ambiente sin agitación durante 2h. A continuación, dichas células se mezclaban con una suspensión de células de Anabaena sp. que contenía 10 µg de Chl (en un volumen de 200-300 µl), y la mezcla resultante se extendía sobre un filtro de nitrocelulosa (Inmobion-NC, Millipore) dispuesto sobre una caja de Petri con medio de cultivo de cianobacterias permisivo (sin antibióticos) suplementado con LB al 5% (v/v). Las cajas se incubaban a 30ºC con luz de baja intensidad durante 2-6 h y, posteriormente, en las condiciones habituales de cultivo durante 20-24 h. A continuación, los filtros se transferían a cajas con medio permisivo sin LB, que se incubaban 24 h en condiciones de cultivo, tras lo cual se pasaban a medio selectivo con Material y métodos 55 antibióticos. Las colonias resistentes aparecían en este último medio tras 10-15 días de incubación. 2.2.3. Aislamiento de DNA 2.2.3.1 Aislamiento de DNA plasmídico de E. coli Para el aislamiento de DNA plasmidico a pequeña escala se empleó el método basado en la lisis alcalina de las células (Sambrook y Russel, 2001). Las células procedentes de 3 ml de cultivo se recogían mediante centrifugación (14,100 x g, 2 min) en tubos de microcentrífuga y se resuspendían en 100 µl de disolución I (Tris-HCl 25 mM, glucosa 50 mM, EDTA 10 mM [pH 8]). A continuación, se añadían 200 µl de disolución II recién preparada (NaOH 0,2 N, SDS 1% [p/v]) y se agitaba brevemente, provocando la lisis celular. Después se añadían 150 µl de disolución III (acetato potásico 5 M [pH 4,8]), se homogeneizaba agitando suavemente, se incubaba en hielo durante 5 min y se centrifugaba (14,100 x g, 5 min a 4ºC). El sobrenadante obtenido se transfería a un tubo limpio y se sometía a dos extracciones sucesivas, una con fenol:cloroformo (1:1, [v/v]) y otra con cloroformo, separándose las fases mediante centrifugación (2 min a 14,100 x g). El DNA se precipitaba con 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío (1 h, -20ºC). Tras centrifugar las muestras (14,100 x g, 15-30 min a 4ºC), el precipitado se lavaba con etanol al 70% (v/v), se secaba al aire y se resuspendía en 25 µl de agua desionizada de alta calidad o tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM [pH 8]). Para el aislamiento de DNA plasmídico de alta calidad, utilizado en las reacciones de secuenciación, se empleaba el sistema comercial “NucleoSpin Plasmid” (Macherey Nagel) basado también en la lisis alcalina de las células. 2.2.3.2. Aislamiento de DNA total de cianobacterias El aislamiento de DNA total de Anabaena sp. PCC 7120 se realizaba siguiendo el método descrito por Cai y Wolk (1990). Las células procedentes de 25-50 ml de cultivo se recogían por centrifugación y se resuspendían en 400 µl de tampón T1/10E (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM [pH 8]). A la suspensión celular se le añadían 150 µl Sergio Camargo Bernal 56 de perlas de vidrio (0,25-0,30 mm de diámetro, previamente lavadas con ácido nítrico y agua destilada, y esterilizadas a 180ºC), 20 µl de SDS al 10% (p/v) y 400 µl de una mezcla de fenol:cloroformo (1:1, [v/v]). La mezcla resultante se sometía a cuatro ciclos de agitación con un agitador tipo vórtex (1 min) e incubación en hielo (1 min). El lisado se centrifugaba utilizando una centrífuga Eppendorf modelo 5415R (15 min a 16,100 x g, 4ºC), y el sobrenadante obtenido se sometía a sucesivas extracciones con un volumen de fenol (1 vez), un volumen de fenol:cloroformo (1:1 [v/v]) (2 veces), y un volumen de cloroformo (1 vez). Los ácidos nucleicos presentes en la fase acuosa final se precipitaban mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío y 0,1 volúmenes de acetato potásico 3 M (pH 5,2) (1 h, -20ºC). Tras centrifugar las muestras (15 min a 16,100 x g, 4ºC), el precipitado se lavaba con etanol al 70% (v/v), se secaba al aire y se resuspendía en 30 µl de agua desionizada de alta calidad o tampón T1/10E. 2.2.4. Determinación de la concentración de DNA La concentración de DNA de las muestras se determinaba por comparación con muestras de concentración conocida. Para ello, alícuotas de las muestras problema o de éstas diluidas se sometían a electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio o Gel RedTM (Biotium) (apartado 2.2.4), utilizándose como patrón de tamaños y carga cantidades conocidas de DNA del fago ) digerido con ClaI o el marcador de tamaño comercial “DNA molecular Weight Marker X” (Roche). En algunas ocasiones la concentración de un fragmento de DNA también se determina espectrofotométricamente, utilizando un espectrofotómetro NanoDrop modelo ND-1000. 2.2.5. Separación de fragmentos de DNA en geles de agarosa y purificación La separación de fragmentos de DNA se realizaba mediante electroforesis en geles de agarosa (Sambrook y Russell, 2001) de concentración variable 0,7-2% (p/v) preparados en tampón TBE (Tris-borato 90 mM, EDTA 2 mM [pH 8]). Las muestras que contenían RNA se trataban con RNasa A (concentración final 0,05 µg·ml-1) antes de ser sometidas a electroforesis y se suplementaban con 0,1 volúmenes de tampón de carga 10X (glicerol 50% [v/v], azul de bromofenol 0,4% [p/v], xileno cianol FF 0,4% [p/v]). Para la detección del DNA se añadía bromuro de etidio a una concentración de 1 Material y métodos 57 µg·ml-1 o Gel RedTM siguiendo las instrucciones del fabricante. Las electroforesis se llevaban a cabo en aparatos horizontales DNA Sub Cell (Bio-Rad). Para determinar el tamaño de los fragmentos sometidos a electroforesis se empleaban como patrón los fragmentos de DNA del fago ) digerido con ClaI, o los marcadores de tamaños comerciales “DNA Molecular Weight Marker X” (Roche) o “KiloBaseTM DNA Marker” (Amersham). El DNA se visualizaba iluminando los geles con un transiluminador de luz ultravioleta. Los fragmentos de DNA previamente separados mediante electroforesis se extraían de los geles de agarosa mediante congelación y presión. Este procedimiento se basa en la congelación de la porción de gel de agarosa que contiene el DNA, manteniéndolo a -20ºC en el interior de una jeringa durante 1 h, y la extracción de la fase líquida mediante presión. La fase líquida así obtenida se diluía en un volumen mayor de agua desionizada (para minimizar las perdidas de DNA en el proceso de purificación) y se sometía después a una extracción con fenol:cloroformo 1:1 (v/v), seguida de otra extracción con cloroformo. Posteriormente, el DNA se precipitaba añadiendo a la muestra 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 2 volúmenes de etanol absoluto, tras lo cual la muestra se sometía a congelación con N2 líquido y centrifugación a 16,100 x g durante 30 min. El precipitado se lavaba con etanol al 70% y, tras dejar secar, se resuspendía en un volumen de 10-20 µl de agua ultrapura. Alternativamente, la purificación de fragmentos de DNA en disolución o en geles de agarosa se realizaba mediante la unión específica del DNA a columnas comerciales con matriz de fibra de vidrio “IllustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (GE Healthcare), siguiendo las recomendaciones del fabricante. 2.2.6. Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR) La amplificación de DNA mediante PCR se realizaba en un termociclador Whatman-Biometra modelo Tpersonal en un volumen final de 25 o 50 µl, de una mezcla que contenía: 1-5 ng de DNA molde, 0,2 mM de cada desoxirribonucleotido trifosfato (dNTP), 25-50 pmol de cada cebador y la DNA polimerasa en su tampón correspondiente (ver Tabla 2.6.). Como molde se utilizaba DNA genómico aislado de cianobacterias, DNA plasmídico aislado de E. coli o el DNA contenido en la biomasa Sergio Camargo Bernal 64 2.3. MÉTODOS DE MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DE RNA 2.3.1. Aislamiento de RNA Se utilizó el método descrito por Mohamed y Jansson (1989), que consiste básicamente en una rotura del extracto celular con fenol ácido (pH 4,5, Amresco) a 65ºC, con algunas modificaciones. Las células de Anabaena sp. PCC 7120 contenidas en un volumen de 50-100 ml de cultivo se recogían por filtración (apartado 2.1.1.3), se lavaban con 10 ml de T50E100 (Tris-HCl 50 mM, EDTA 100 mM [pH 8]) y, tras descartar el sobrenadante, las muestras se congelaban con nitrógeno líquido. El sedimento se resuspendía en 300 µl de tampón de resuspensión (sacarosa 0,3 M, acetato sódico 10 mM [pH 4,5]), 400 µl de tampón de lisis (SDS 2%, acetato sódico 10 mM [pH 4,5]) y 100 µl de Na2-EDTA 250 mM (pH 8,0). La mezcla de células resultantes se añadía a un volumen de 1 ml de fenol ácido (previamente calentado a 65ºC) y se calentaban durante 2,5 min a 65ºC y posteriormente se agitaban mediante vórtex durante 30 s (repitiéndose este bucle de calentamiento-agitación al menos 3 veces). Después se centrifugaba 5 min a 16,100 x g a 4ºC y se recogía la fase acuosa, de donde se extraían las proteínas con fenol caliente dos veces más. Finalmente, se realizaba una extracción con fenol ácido:cloroformo (1:1 [v/v]) a 65ºC y, por último, una extracción con cloroformo sin calentar. El sobrenadante recogido tras las extracciones anteriores se precipitaba con 1 volumen de isopropanol, sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido para facilitar la precipitación. Posteriormente, los ácidos nucleicos se recogían por centrifugación a 16,100 x g durante 30 min a 4ºC, se lavaban con etanol al 70% (v/v) y se secaban al aire, resuspendiéndose con 200 µl de H2O tratada con DEPC. El DNA contaminante en estas preparaciones se eliminaba tratando las muestras con DNasa Turbo (libre de RNasas) (Ambion), siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras una nueva extracción con fenol:cloroformo (1:1 [v/v]), y otra con cloroformo, el RNA se precipitaba con 0,2 volúmenes de LiCl y etanol absoluto frío, se lavaba con etanol 70% (v/v) y, tras dejar secar las muestras, se resuspendía en un volumen final de 30-50 µl con agua tratada con DEPC. El RNA contenido en las muestras se cuantificaba mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop modelo ND-1000. Material y métodos 65 2.3.2. Electroforesis de RNA en geles de agarosa Los geles para la electroforesis de RNA se preparaban a una concentración de agarosa del 1% (p/v) en tampón MOPS 1x y formaldehído al 2% (v/v). El tampón MOPS 1x consistía en: MOPS 40 mM, acetato sódico 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,2). Las muestras, preparadas en un volumen final de 28 µl, contenían: 10-30 µg de RNA en un volumen de 7 µl, 1,4 µl de tampón MOPS 10x, 4,9 µl de formaldehído al 37% (v/v) y 14 µl de formamida. Tras una incubación a 95ºC durante 3 min, las muestras se enfriaban en hielo, se suplementaban con 1/5 en volumen de tampón de carga (EDTA 1 mM [pH 8.0], azul de bromofenol 0,25% [p/v], xilenocianol FF 0,25% [p/v] y glicerol 50% [v/v]) y con 0,2 µl de bromuro de etidio, se cargaban en el gel y sometían a electroforesis a 5 V·cm-1. Para determinar el tamaño de los transcritos sometidos a análisis se empleaba el marcador de tamaños ssRNA Ladder (New England Biolabs) cargado junto a las muestras de RNA anteriormente citadas. El RNA se visualizaba iluminando los geles con un transiluminador de luz ultravioleta. 2.3.3. Detección de secuencias de RNA mediante hibridación en filtro con sonda radiactiva (Análisis de northern) Tras la electroforesis de las muestras de RNA, el gel se sometía a tres lavados con agua destilada durante 5 min cada uno para eliminar el formaldehído y se equilibraba sumergiéndolo durante 10 min en SSPE 10x (preparado a partir de un stock 20x: NaCl 3 M, Na2HPO4 0,2 M [pH 7,4], EDTA 0,02 M). A continuación, el RNA se transfería a un filtro de nylon HybondTM-N+ (GE-Healthcare), mediante aplicación de vacío durante 1 h, utilizando un aparato TransVac TE80 (Pharmacia Biotech). Como disolución de transferencia se usaba NaOH 100 mM. Posteriormente, el filtro se dejaba reposar durante 10 min sobre un papel Whatman humedecido con NaOH 100 mM, se sumergía brevemente en SSPE2x y se secaba a 80ºC durante 15-30 min. Para la hibridación con sondas radiactivas del RNA fijado a un filtro de nylon, el filtro se incubaba en un horno de hibridación 2h a 65ºC (prehibridación) con una disolución de K2HPO4 0,5 M, KH2PO4 0,6 M, SDS 7% y EDTA 1 mM (pH 8). Posteriormente se añadía la sonda marcada radiactivamente (apartado 2.2.8.5 A), que previamente había sido desnaturalizada calentando a 100ºC durante 5 min, y se incubaba durante 12-15 h a 65ºC en un horno de hibridación. Tras la hibridación, el Sergio Camargo Bernal 66 filtro se lavaba tres veces en el horno a 65ºC. Los dos primeros lavados se realizaban con la disolución 2xSSC, SDS 10% (lavando 10 min cada vez), y el tercer lavado con la disolución 1xSSC, SDS 0,1% incubando durante 15 min. La disolución SSC 20x, contiene: NaCl 3 M y citrato sódico 0,3 M. Como control de la cantidad de RNA cargada en cada calle y de la transferencia del RNA a la membrana, ésta se hibridaba con una sonda del gen rnpB de Anabaena sp. PCC 7120 que determina el RNA de la Ribonucleasa P y se expresa constitutivamente (Vioque, 1997). El fragmento de DNA que se utilizaba como sonda se obtenía mediante PCR con la pareja de oligonucleótidos M13-Universal y M13-Reverso como cebadores y el plásmido pT7-7120 como molde (Vioque, 1997). Para poder reutilizar los filtros después de la hibridación, la sonda unida al filtro se eliminaba mediante incubación del mismo a temperatura ambiente durante 1 h con agitación moderada en una disolución de SDS 0,5% (p/v) que se añadía hirviendo, o bien hirviendo el filtro durante 10-30 min en una disolución conteniendo: Tris-HCl 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM y 1% de SDS. La detección y el análisis de las áreas radiactivas en los filtros se realizaban mediante autorradiografía electrónica con el sistema Cyclone Storage Phosphor System y el programa de análisis de imágenes Optiquant (Packard). 2.3.4. Ensayo de extensión de cebador Para la determinación del extremo 5’ de moléculas de RNAs se llevaban a cabo ensayos de extensión de un cebador. Para ello se utilizaban oligonucleótidos marcados en el extremo 5’ con la enzima T4 polinucleótido quinasa y [&-32P]dATP (3.000 Ci·mmol-1) (Perkin Elmer), según se describe en el apartado 2.2.8.5 C. En primer lugar se procedía para que tuviera lugar la unión o apareamiento del cebador a las secuencias complementarías en el RNA. Para ello se preparaba una mezcla conteniendo, en un volumen final de 15 µl: Tris-HCl 10 mM (pH 8), KCl 150 mM, EDTA 1 mM (pH 8), 15-25 µg de RNA total y 2 pmol de oligonucleótido marcado radiactivamente. Esta mezcla se incubaba a 85ºC durante 10 min, con el fin de desnaturalizar el RNA, y después, a 50ºC durante 1 h, para permitir el apareamiento del cebador con el RNA. Posteriormente, esta mezcla se utilizaba para la reacción de extensión, que se realizaba en un volumen final de 45 µl y contenía: Tris-HCl 50 mM (pH 8), KCl 75 mM, MgCl 3 mM, los cuatro dNTPs a concentración final de 0,25 mM cada uno, DTT 10 mM y 200 U de transcriptasa inversa SuperScriptTM II (Invitrogen). Tras una incubación de 1 h a Material y métodos 67 47ºC, la mezcla de reacción se suplementaba con 100 µl de otra mezcla que contenía 0,04 µg de RNasa A libre de DNasas (Roche) y 0,2 µg de DNA de esperma de salmón (Roche), y se incuba 15 min a 37ºC. Tras una extracción fenol:cloroformo (1:1 [v/v]), el DNA monocatenario sintetizado se precipitaba junto con el DNA de esperma de salmón (DNA “transportador”) con 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío, y se resuspendía en un tampón que contenía: formamida 97,5 % (v/v), xilenocianol FF 0,3 % (p/v), azul de bromofenol 0,3 % (p/v) y EDTA 10 mM (pH 8) (Sambrook y Russel, 2001). Estas muestras se resolvían en un gel de urea-poliacrilamida (al 6 % de poliacrilamida) paralelamente a las muestras de secuenciación que se utilizaban como marcador de tamaños (2.2.7). 2.3.5. Amplificación rápida de extremos 5’ de cDNA ( 5’-RACE) Para determinar si los extremos 5’ de RNAs detectado/s en ensayos de extensión del cebador se correspondían con sitios de inicio de transcripción (TSP) se utilizó un procedimiento desarrollado por Bensing et al., (1996), basado en la amplificación de muestras de RNA a cuyo extremo 5’ se liga un oligoribonucleótido o adaptador de RNA. Básicamente, este procedimiento consiste en usar muestras duplicadas del RNA celular total tratadas y no tratadas con la enzima pirofosfatasa ácida de tabaco (TAP). Esta enzima cataliza la rotura de enlaces pirofosfato de moléculas de RNA con extremos 5’ trifosfato. Las muestras son ligadas posteriormente a un adaptador de RNA de secuencia conocida, pero la unión solo se produce en las moléculas de RNA con extremos 5’ monofosfato. Después, se realiza un paso de retrotranscripción con un oligonucleótido especifico del gen objeto de estudio, utilizándose a continuación el cDNA obtenido para amplificación por PCR utilizando un oligonucleótido específio del gen objeto de estudio y un oligonucleótido que interacciona específicamente con la secuencia correspondiente al RNA adaptador. Los inicios de transcripción corresponden a los extremos 5’ detectados sólo después del tratamiento con TAP (Fig 2.1). El tratamiento con TAP, se llevaba a cabo incubando 20 µg de RNA total con 20 U de TAP (Epicentre) durante 2 h a 37ºC en un volumen final de 50 µl. La mezcla de reacción se sometía a una extracción con fenol:cloroformo (1:1 [v/v]), y el RNA se precipitaba con etanol absoluto frío y acetato sódico 3 M (pH 5,2) y se resuspendía con 10 µl de agua desionizada de alta calidad, añadiendo después 60 pmol de adaptador 5’RNA (Sigma Proligo), con la secuencia: Sergio Camargo Bernal 68 y 80 U de Ligasa de RNA del fago T4 (Amersham) incubando durante 16 h a 15ºC. La mezcla de reacción se sometía después a extracciones con fenol:cloroformo (1:1 [v/v]) y cloroformo, precipitándose el RNA con etanol absoluto frío y acetato sódico 3 M (pH 5,2). Finalmente, El RNA se resuspendía en 20 µl agua desionizada de alta calidad. La reacción de retrotranscripción se realizaba con 6,5 µg de RNA ligado al adaptador y 10 pmol del oligonucleótido específico del gen objeto de estudio en cada caso, utilizándose 100 U de transcriptasa inversa SuperScriptTM II (Invitrogen). Para las reacciones de PCR, se utilizaba como molde 5 µl de la mezcla de retrotranscripción (aproximadamente 1 µg de DNA), y los productos de PCR del tamaño esperado se aislaban del gel de agarosa (apartado 2.2.5), se clonaban en el vector pMBL-T (tabla 2.4) y se secuenciaba. El primer nucleótido que precedía a la secuencia del adaptador se consideraba correpondía al TSP. Figura 2.1. Esquema del procedimiento 5’RACE. En este ejemplo se muestra el tratamiento de dos especies distintas de RNA. En verde se representa un transcrito con extremo 5’ correspondiente a un TSP y en naranja un RNA producto de procesamiento o de degradación. (5’CUAGUACUCCGGUAUUGCGGUACCCUUGUACGCCUGUUUUAUA-3’) +TAP -TAP Ligasa de RNA Adaptador Bensing Retrotranscripción cDNA PCR con los oligonucleótidos apropiados Transcrito con extremo 5’ primario Transcrito hidrolizado !!- + !!+ + (Transcrito procesado) (RNA total) Material y métodos 69 2.4. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 2.4.1. Preparación de extractos libres de células Para la purificación de la proteína NtcA recombinante de Anabaena sp. PCC 7120 se utilizaban extractos crudos de la estirpe DH5! de E.coli (Tabla 2.3) con el plásmido pCSAM61, en el que ntcA está clonado en el vector de expresión pTrc99A bajo el control del promotor trc (Tabla 2.4). Para la purificación de la proteína NtcA-His de Anabaena sp. PCC 7120 se utilizó el plásmido pCSAM70 (Tabla 2.4). Este plásmido era mantenido en células de la estirpe E.coli BL21 (DE3) (tabla 2.3) que portaba el plásmido pREP4 (Quiagen) y expresaba altos niveles del represor LacIq. Para HetR-His de Anabaena sp. PCC 7120, se usó el plásmido pCSAM105 (que porta el gen hetR seguido de una cola de histidinas en el plásmido pTrc99A) en la estirpe XL1-Blue, y para la proteína PipX-His de Anabaena sp. PCC 7120 se utilizaron extractos crudos de E. coli BL21 (DE3) conteniendo el plásmido pCSV31 (Tabla 2.4). Se partía de células de E.coli, cultivadas en medio LB suplementado con 50 µg·ml-1 de Ap y 2% de glucosa (p/v) e incubadas a 37ºC durante 10-12 h. Un volumen de 25 ml de cultivo se lavaba con LB para eliminar la glucosa y se inoculaban en 250 ml de LB conteniendo 50 µg·ml-1 Ap, incubándose a 37ºC con agitación. Cuando los cultivos alcanzaban una densidad óptica a 600 nm de 0,6, se le añadía IPTG a una concentración final de 1 mM. Tras 3 h de incubación, las células se recogían por centrifugación (2.1.2.3), se lavaban con tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8) y se congelaban a -20ºC. Para la obtención de los extractos libres de células, éstas se resuspendían en tampón de lisis compuesto por: tampón fosfato sódico 20 mM (pH 7), NaCl 0,5 M, y glicerol 10% en el caso de NtcA nativa, o en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 200 mM y 10% de glicerol para NtcA-His, HetR-His y PipX-His. A las células resuspendidas se les añadía fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM a razón de 3 ml por gramo de células, y la suspensión resultante se sometía a dos ciclos de rotura (20.000 psi) en una prensa de French (SLM-AMINCO). El lisado celular se centrifugaba 30 min a 18,500 x g a 4ºC en una centrifuga Beckman Coulter modelo Avanti J-25 con un rotor JA 25.50 para eliminar las membranas y restos celulares. La fracción soluble resultante se sometía directamente a cromatografía. Sergio Camargo Bernal 70 2.4.2. Purificación de NtcA recombinante mediante cromatográfia de afinidad por heparina La proteína NtcA se purificaba a partir de la fracción soluble del extracto libre de células mediante cromatografía de afinidad por heparina con una columna “HiTrap Heparin HP 1 ml” (Amersham) en un sistema FPLC de Pharmacia, según las instrucciones del fabricante. El método utilizado consistía en el equilibrado de la columna con 25 ml de tampón A: tampón fosfato sódico 20 mM (pH 7), NaCl 0,5 M, glicerol 10%, seguido de la inyección de la muestra y el lavado de la columna con el mismo tampón de equilibrado (100 ml). La elución de las proteínas se realizaba utilizando un gradiente de NaCl de 0,5 a 1,5 M preparado en tampón fosfato sódico 20 mM (pH 7) y glicerol 10%. Las fracciones recogidas se visualizaban mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida al 12 % y tinción con azul de Coomassie (apartado 2.4.6) (Fig. 2.2). Antes de su utilización en ensayos de transcripción in vitro las fracciones resultantes de la cromatografía se dializaban frente a un volumen de 1 L de tampón fosfato sódico 20 mM (pH 7), NaCl 250 mM y glicerol 30% durante 4 h a 4ºC. Figura. 2.2. Purificación de la proteína NtcA nativa. Análisis mediante SDS-PAGE de muestras de la fracción soluble del extracto libre de células (EC), fracción no retenida en la columna (NR), muestras de las fracciones obtenidas mediante cromatografía de afinidad por heparina con un gradiente de NaCl de 0,5 a 1,5 M (10-44). S, patrón de tamaños (en kDa). 2.4.3. Purificación de NtcA-His, HetR-His y PipX-His mediante cromatografía de afinidad por níquel La proteína NtcA con una cola 6His, se purificó mediante cromatografía de afinidad por níquel con una columna “1 ml HisTrapTM HP column” (GE Healthcare). El método utilizado consistía en el equilibrado de la columna con 15 ml de tampón A !!!!EC S NR 10 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 36 50 64 98 148 NtcA Material y métodos 71 (Tris-HCl 50 mM [pH 8], NaCl 400 mM y 20% de glicerol), seguido de la inyección de la muestra, a la que previamente se le había añadido imidazol 30 mM. El lavado de la columna se realizaba con el mismo tampón de equilibrado suplementado con 30 mM de imidazol. La elución de las proteínas se realizaba utilizando un gradiente de imidazol de 90-500 mM preparado en tampón A. NtcA eluía a una concentración de imidazol de 200 mM, y las fracciones resultantes se analizaban como en el apartado anterior. Antes de su utilización en EMSA y ensayos de protección frente a la degradación por DNasa I, la preparación de proteína NtcA se dializaba frente a un volumen de 1 L de un tampón (Tris-HCl 50 mM (pH 8), 400 mM NaCl y 50% glicerol) a 4ºC y se suplementaba con un 20% de glicerol. HetR-6His se purificaba de manera similar excepto que la columna se equilibraba con imidazol 6 mM, también añadido a esa concentración a la muestra de proteína, y la elución se realizaba con un gradiente de 6-500 mM. HetR-6His eluyó a una concentración aproximada de 200 mM de imidazol. Las fracciones con proteína purificada se dializaban frente a 1 L de tampón fosfato sódico 20 mM (pH 7), 150 mM NaCl y 20% de glicerol. Posteriormente, estas fracciones se purificaron mediante cromatografía de afinidad por heparina (2.4.2), con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M. Antes de su utilización en ensayos TIV, EMSA y de protección frente a la degradación por DNasa I las preparaciones purificadas se dializaban frente a un volumen de 1 L de tampón fosfato sódico 20 mM (pH 7), NaCl 250 mM y glicerol 30% durante 4 h. Figura. 2.3. Purificación de la proteína HetR-His. Análisis mediante SDS-PAGE de alicuotas de la fracción soluble del extracto crudo libre de células (EC), fracción no retenida en la columna (NR), muestras de las fracciones obtenidas mediante cromatografía de afinidad por níquel con un gradiente de imidazol 6-500 mM (4-41). S, patrón de tamaños en kDa. !!!!EC S NR 4 9 11 13 15 17 19 21 23 26 29 33 37 41 HetR 64 36 50 98 148 22 Sergio Camargo Bernal 72 Para la purificación de la proteína PipX-6His, la columna fue equilibrada tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 300 mM y 10% de glicerol. Después de lavar la columna con el mismo tampón suplementado con 10 mM de imidazol, se uso un gradiente lineal de 50 a 700 mM de imidazol para la elución de PipX. PipX eluyó a una concentración de imidazol de 316,47 mM. Las fracciones que contenían PipX fueron mezcladas y sometidas a diálisis frente a 1 L de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 300 mM y 30% de glicerol durante 4 horas a 4ºC. Figura. 2.4. Preparación de proteína PipX-6His purificada. En la figura se muestran dos cantidades distintas de proteína PipX tras el paso de diálisis. El patrón de tamaños, (en kDa) se muestra en la primera calle del gel. 2.4.4. Preparaciones de RNAP de Anabaena recombinante 2.4.4.1. Purificación de las distintas subunidades Tanto la subunidad ! como la subunidad sigma (SigA), portando ambas una cola 6His, se obtenían de cultivos de E. coli (que portaban los plásmidos pCSV25 y pCSAV143, respectivamente [Tabla 2.4]) tratados con IPTG en las mismas condiciones mencionadas anteriormente (2.4.1). Excepto que para la rotura de las células se resuspendían en un tampón de solubilización (Tris-HCl 50 mM [pH 8.0], hidrocloruro de guanidina 6M, NaCl 300 mM y 10% de glicerol). Tras la rotura de las células y obtención de las fracciones solubles de ambos cultivos (2.4.1), las proteínas se purificaban mediante cromatografía de afinidad por níquel, utilizándose una columna de “1 ml HisTrapTM HP column” (GE Healthcare) para cada subunidad. El método seguido para la purificación de ambas subunidades fue el siguiente: Tras equilibrar las columna con tampón A (Tris-HCl 50 mM [pH 8.0], NaCl 300 mM, urea 6 M y 10% de glicerol), se inyectaba la muestra suplementada con 20 mM de imidazol. Tras lavar la columna con 36 ml de tampón A suplementado con 20 mM de 75 25 11 17 PipX Material y métodos 73 imidazol, y la elución se realizaba con un gradiente de 20 a 400 mM de imidazol. Las fracciones seleccionadas de cada purificación se mezclaban y, tras aumentar la concentración de glicerol al 50%, se guardaban a -20ºC (Fig. 2.5) Figura. 2.5. Purificación de las subunidades !-His y SigA-His de RNAP mediante cromatografía de afinidad por níquel. A) Purificación de la subunidad !. B) Purificación de la subunidad SigA. Se sometían a SDS-PAGE alícuotas de la fracción no retenida en la columna (NR) y de las fracciones obtenidas mediante cromatografía de afinidad por níquel con un gradiente de imidazol de 0,002 a 0,4 M. A la izquierda se muestra el patrón de tamaños en (KDa). Las subunidades ", "’ y & se obtenían de cuerpos de inclusión de cultivos de E. coli que portaban los plásmidos pCSAV155, pCSAV157 y pCSAV159, respectivamente (tabla 2.4) tras inducción con IPTG (2.4.1). Tras recoger las células por centrifugación, se lavaban con tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8) y se congelaban a -20ºC. Para la lisis celular y el aislamiento de los cuerpos de inclusión de estas estirpes, las células se resuspendían en 5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM [pH 8.0], hidrocloruro de guanidina 6M, NaCl 300 mM y 10% de glicerol) por gramo de células. Tras una primera homogeneización, se añadía 1 mg lisozima y 10 mg de desoxicolato !!!! S NR 14 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 40 41 ! 36 50 64 98 148 !!!! S NR 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 SigA 36 50 64 98 148 A B Sergio Camargo Bernal 80 2.6.2. Ensayos de resonancia de plasmones superficiales (SPR) 2.6.2.1. Principios básicos En óptica, el índice de refracción de un medio puede ser definido como el cociente entre la velocidad de la luz en el vacío y la velocidad de la luz en dicho medio. Cuando un rayo de luz pasa de un medio con un índice de refracción mayor (n1) a otro medio con un índice de refracción menor (n2), parte de la luz es reflejada y parte de la luz es refractada. Este fenómeno ocurre solo si el ángulo de incidencia de la luz es menor a cierto ángulo crítico. Cuando un haz de luz incide con un ángulo superior al crítico se produce el fenómeno conocido como reflexión total interna de la luz, en el que no se produce refracción y toda la luz es reflejada. Cuando los rayos de luz inciden con ciertos ángulos sobre una lámina fina de metal (oro, plata, plomo, etc.) se produce el fenómeno de reflexión total interna, y es en estas condiciones cuando cierta fracción de la energía de la luz incidente puede interactuar con los electrones deslocalizados de estas láminas metálicas (plasmones superficiales), produciéndose una absorción de energía por parte de éstos y pudiéndose detectar una disminución de la intensidad de la luz reflejada. El ángulo de incidencia de la luz que produce la resonancia de plasmones (ángulo SPR) se afecta por diversos factores, siendo uno de los principales el índice de refracción cerca de la parte posterior de la lamina metálica. El sistema Biacore, utilizando este fenómeno físico, ha desarrollado distintos biosensores para medir interacción entre biomoléculas. Estos biosensores constan de una lamina de oro situada en la interfaz entre un prisma de cristal y un micro-conducto por el que pasa líquido (tampón) (Fig. 2.8). Esta lámina de oro o superficie sensora, está recubierta por una capa de dextrano en la cual, tras distintos tratamientos químicos, se pueden inmovilizar distintas biomoléculas (ligandos). Cuando al pasar tampón con una molécula determinada (analito), se produce un cambio en el índice de refracción de la superficie sensora, registrado como un cambio en el ángulo SPR, se deduce que el analito interacciona con el ligando. Los cambios en el ángulo SPR, medidos como cambios en el índice de refracción, son proporcionales a la masa inmovilizada en la superficie y se miden en unidades de resonancia (RU). La representación de estos cambios de resonancia a lo largo del tiempo genera un sensorgrama. Material y métodos 81 Figura. 2.8. Resonancia de plasmones superficiales. A, Esquema de un biosensor basado en el fenómeno SPR (ver texto). B, Un cambio en el ángulo SPR puede ser detectado como una disminución de la energía de reflexión (ver texto). C, Fotografía del sistema Biosensor Biacore X usado en este trabajo. En un ensayo estándar de SPR se genera un sensorgrama en el que se pueden diferenciar tres fases principales: 1. Fase de equilibrado, durante la cual la superficie sensora del chip con el ligando unido está expuesta a un flujo de tampón que provoca pequeñas variaciones en la señal de resonancia hasta que ésta se estabiliza. 2. Fase de asociación, que comienza con la inyección del analito en el sistema. Tras esta, si analito y ligando interaccionan se registrará un aumento en las unidades de resonancia, hasta que se llega a un estado de equilibrio. 3. Fase de disociación, tras un lavado casi instantáneo con tampón para eliminar el analito no unido, se produce la disociación de éste y el ligando, registrada como una disminución de las unidades de resonancia. Tras este ciclo el sistema puede ser regenerado para ser utilizado de nuevo eliminando cualquier interacción existente y cualquier rastro de analito (Fig. 2.9). C n2>n1 Luz reflejada Superficie sensora (lámina de oro) Prisma de cristal (n2) Luz incidente Tampón (n1) Ángulo (SPR) ! Reflexión 0% 100% Ángulo de incidencia de la luz Ángulo crítico: Reflexión total interna Cambio en el ángulo SPR Disminución de la energía de reflexión. A B Sergio Camargo Bernal 82 Figura. 2.9. Fases principales del sensorgrama de un ensayo SPR. En la parte izquierda de la figura se representa el registro del sensorgrama y en la parte derecha la superficie sensora del chip, mostrando el ligando en verde y el analito en rojo. 2.6.2.2. Análisis SPR de la interacción Proteína-DNA En este trabajo se ha utilizado el análisis SPR para estudiar el efecto de PipX en la interacción de NtcA con el DNA, . Los experimentos se realizaron usando un sistema BIAcore X biosensor system (Biacore AB, Uppsala, Sweden). Se utilizaron tres chip SA, con estreptavidina inmovilizada covalentemente en una matriz de dextrano carboximetilada, que permitían fijar distintos fragmentos de DNA de doble cadena biotinilados. Para generar la doble cadena de DNA de cada uno de los promotores analizados se utilizaron los oligonucleótidos, biotinilados o no, que se recogen en la Tabla 2.9. En el sistema BIAcore X biosensor system cada chip queda dividido en dos zonas o células independientes, de forma que en una de las células, denominada FC2, se inmoviliza el dúplex de DNA objeto de estudio, mientras que en la otra célula, FC1, se inmoviliza el dúplex de DNA usado como control negativo. Tiempo Tiempo Resonancia RU Tiempo Resonancia RU Resonancia RU Fase de equilibrado (Flujo de tampón) Fase de asociación (Interacción analito/ligando) Fase de disociación (Disociación analito/ligando) Material y métodos 83 Para la generación de los fragmentos de DNA de doble cadena utilizados, 5 µM de la pareja de oligonucleótidos biotinilado y no biotinilado correspondiente (Tabla 2.9), en un volumen de 100 µl de tampón Tris-HCl (pH 7,4) 10 mM, EDTA 1 mM y NaCl 100 mM, se calentaba hasta 95ºC y se iba enfriando progresivamente hasta 35ºC en un termociclador. Previamente a la inmovilización de cada fragmento de DNA, la superficie del chip sensor, se sometía a un lavado con tampón HBS (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 300 mM, EDTA 0,2 mM y 0,005% de nonidet P-40) de 6 min con un flujo de 10 µl/min. Tras este lavado la superficie se activaba con cuatro inyecciones consecutivas de tampón de activación (NaCl 1 M y NaOH 50 mM) a un flujo de 20 µl/min. Tras la activación, la superficie sensora se volvía a lavar con tampón HBS hasta que la señal de resonancia era estable. Cada fragmento de DNA se diluía hasta una concentración final de 0,25 µM en tampón HBS, inyectándose 50 µl de esta disolución en el sistema. La inyección de la muestra se realizaba a un flujo de 10 µl/min hasta que se alcanzaban 350-380 RU (después de aproximadamente 30 s), momento en el cual se paraba la inyección. Todos los tampones se filtraban y desgaseaban antes de se usados. Todos los ensayos se llevaron a cabo a 25ºC. Las proteínas se preparaban en tampón HBS y se incubaban 20 min a 37ºC. 75 µl de dichas preparaciones se inyectaban simultáneamente en ambas células del chip (FC1 y FC2) a un flujo de 30 µl/min. Para cuantificar la especificidad de unión se registraba la diferencia de resonancia entre FC2 y FC1 ('RU). Después de cada inyección, la superficie del chip se regeneraba con inyecciones de NaCl 2 M. Los datos obtenidos se procesaban utilizando los programas BiaEvaluation 3.0 (Biacore AB) y KaleidaGraph 4.0 (1896-2006 by Synergy Software). Sergio Camargo Bernal 84 Tabla 2.9. Oligodesoxinucleótidos usados en la generación de dúplex de DNA para ensayos SPR. En negrita se señalan los sitios de unión del regulador NtcA. Mediante subrayado las posibles cajas -10, y resaltado en verde los TPPs. Btn, biotina. 2.6.3. Ensayos de protección frente a la degradación por DNasa I (Footprinting) Los fragmentos de DNA utilizados en estos ensayos se obtenían mediante amplificación por PCR utilizando un oligonucleótidos marcado radiactivamente con la enzima polinucleotido quinasa del fago T4 (2.2.8.5 C). El producto de PCR se sometía a extracción con un volumen de fenol:cloroformo (1:1, [v/v]), separándose las fases centrifugando 2 min a 20238 x g. El DNA se precipitaba tras la adición de acetato amónico 2,5 M (pH 7,5), glucógeno 0,01 µg·µl-1 y 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío a las muestras, que se congelaban en nitrógeno líquido. Tras una nueva centrifugación (15 min a 20,238 x g), el precipitado resultante se lavaba con etanol al 70% (v/v), se secaba al aire y se resuspendía con 50 µl de agua desionizada. Oligonucleótido Secuencia (5’-3’) Posición/gen P2devB-F [Btn]TCATTTGTACAGTCTGTTACCTTTACCTGAAACAGATGA ATGTAGAATTTATAAA -756 a -702 devB P2devB-R TTTATAAATTCTACATTCATCTGTTTCAGGTAAAGGTAACAGA CTGTACAAATGA -702 a -756 devB P1devB-F [Btn]AAAACCTTTGATAGAACCTCTTCAAAAAAACAAATAAAG TCATCTAAGTTGCAGAAAA -541 a -484 devB P1devB-R TTTTCTGCAACTTAGATGACTTTATTTGTTTTTTTGAAGAGGT TCTATCAAAGGTTTT -484 a -541 devB nrrA-F [Btn]GGCTAGAGTAACAAAGACTACAAAACCTTGGGCATGGG CTTGTTACTTTGAAATT -81 a -27 nrrA nrrA-R AATTTCAAAGTAACAAGCCCATGCCCAAGGTTTTGTAGTCTT TGTTACTCTAGCC -27 a -81 nrrA psbA-F [Btn]CTGATAAGTGAGCTATTCACTTTAGGTTTAGGATGAAAA CTAGAGGATCTCAATG -145 a -91 psbA psbA-R CATTGAGATCCTCTAGTTTTCATCCTAAACCTAAAGTGAATAG CTCACTTATCAG -91 a -145 psbA Material y métodos 85 10 fmol de los fragmentos de DNA marcados se incubaban con las proteínas en un volumen final de 13,5 µl de tampón Tris-HCl 23 mM (pH 8.0), KCl 80 mM, MgCl2 10 mM, CaCl2 5 mM, DTT 2 mM, BSA 0,07 mg/ml, Poly (dI-dC) 0,07 mg/ml, durante 30 min a 30ºC. Tras esta incubación, se añadía 1,5 µl de una mezcla que contenía 1 U de DNasa I (Roche) en CaCl2 100 mM y MgCl2 100 mM y, tras incubaciones muy cortas a 30ºC (0-30 s), se paraba la reacción con la adición de 4 µl de una disolución conteniendo 1,5 M de acetato sódico (pH 5,2), 100 mM EDTA (pH 8), 1 mg/ml de DNA de esperma de salmón y 2,5 mg/ml de glucógeno. El DNA se precipitaba añadiendo a las muestras 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío y sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido. Posteriormente, las muestras se centrifugaban 15 min a 20,238 x g y el precipitado resultante se lavaba con etanol al 70 % (v/v), se secaba al aire y se resuspendía en 3 µl de una disolución que contenía: formamida 97,5 % (v/v), xilenocianol FF 0,3 % (p/v), azul de bromofenol 0,3 % (p/v) y EDTA 10 mM (pH 8) (Sambrook y Russel, 2001). Las muestras se resolvían en un gel de poliacrilamida al 6% con 8 M de urea (apartado 2.2.7). Como patrón de tamaños se incluía en la electroforesis reacciones de secuenciación llevadas a cabo con el mismo fragmento de DNA y el oligonucleótido utilizado para su amplificación (apartado 2.2.7). 2.7. MICROSCOPIA LÁSER CONFOCAL En este trabajo se ha utilizado la proteína testigo GFP-mut2, una versión modificada de la proteína verde fluorescente que presenta un pico de excitación a 481 nm y de emisión a 507 nm (Cormack et al., 1996). La fluorescencia de la GFP se analizaba mediante microscopía láser confocal en un microscopio Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Alemania) con un objetivo de inmersión en aceite HCX PLAN-APO 63X 1.4 NA. Excitando con luz de una longitud de onda de 488 nm proporcionada por un láser de argón. Se utilizaron ventanas de captación de 500-538 nm para la fluorescencia de la GFP, y de 630-700 nm para la autofluorescencia de las cianobacterias. Todas las imágenes de un mismo experimento se adquirían con los mismos parámetros, de forma que se podía establecer una comparación entre ellas. Sergio Camargo Bernal 86 2.8. ANÁLISIS INFORMATICO DE SECUENCIAS DE DNA Y PROTEÍNAS Para la búsqueda de pautas de lectura abiertas (ORFs), localización de sitios de restricción y traducción de secuencias nucleotídicas a secuencias de aminoácidos, se utilizaba el programa DNA-Strider diseñado por C. Mark (Service de Biochimie, Centre d’Études Nucléaires de Saclay, Francia). Para el diseño de los oligodesoxinucleótidos utilizados como cebadores en reacciones de PCR se empleaba el programa Amplify versión 3.1.4 diseñado por B. Engels (Genetics Department, University of Wisconsin, EE.UU.). La secuencia del genoma completo de Anabaena sp. PCC 7120 (Kaneko et al., 2001) ésta disponible en “Cyanobase” (http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/). Sergio Camargo Bernal 3. RESULTADOS Resultados 89 3.1. GENERACIÓN DE MUTANTES DEL GEN hetR Para realizar un estudio más exhaustivo del papel que el regulador HetR tiene en la activación de algunos promotores de la diferenciación se generaron dos nuevos mutantes del gen hetR. En uno de los mutantes se inactivó el gen hetR mediante deleción de la mayor parte de esta ORF y en el otro se inactivó este gen mediante deleción e inserción de una casete de resistencia a antibióticos. Para la generación del mutante de deleción del gen hetR, se amplificaron mediante PCR dos fragmentos de DNA. Un fragmento cubría desde la posición -558 hasta la posición +200 con respecto al comienzo del gen hetR, y el otro fragmento cubría desde la posición +714 hasta la posición +1460, este último incluía las 184 pb del extremo 3’ de hetR y 562 pb sobrepasando el final del gen. Para la amplificación de ambos fragmentos se utilizó DNA genómico procedente de Anabaena sp. PCC 7120 como molde. Para la amplificación del primer fragmento se utilizaron los oligonucleótidos alr2329-19 (que introduce una diana BamHI) y alr2329-20 (que introduce una diana NheI) para generar un fragmento de 0,75 kb. Para la amplificación del segundo fragmento se utilizó la pareja de oligonucleótidos alr2339-22 (que introduce diana NheI) y alr2339-21 (que introduce una diana XhoI) generándose un fragmento de 0,75 kb. Los dos fragmentos se digirieron con la endonucleasa NheI y se ligaron, generándose un único fragmento de 1,5 kb. Este fragmento resultante se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos alr2339-19 y alr2339-21, posteriormente se digirió con las endonucleasas de restricción BamHI y XhoI y se clonó en el plásmido pRL278. pRL278 es un plásmido conjugativo que permite la selección de dobles recombinantes, al poseer un determinante de resistencia a Nm (NmR) y el gen sacB que confiere sensibilidad a sacarosa (Cai y Wolk, 1990). El plásmido resultante fue denominado pCSSC7 (Fig. 3.1). Sergio Camargo Bernal 96 Como se puede apreciar en la figura 3.6B, el incremento en la abundancia de transcritos originados en ambos TSPs que se observaba en la estirpe silvestre tras 6 horas y, especialmente, tras 12 horas de incubación en ausencia de nitrógeno combinado no se producía en la estirpe mutante CSE2 (ntcA). Por otra parte, en ninguno de los dos mutantes hetR se observaba la acumulación máxima del transcrito originado en el TSP proximal (Fig. 3.6B para DR884a y Fig. 3.6C para CSSC2). En cambio, la transcripción desde el promotor distal parecía no estar afectada en los mutantes del gen hetR. 3.2.2. Análisis del patrón espacio-temporal de la expresión de los distintos promotores del gen devB Para estudiar la localización celular de la expresión génica desde cada promotor de devB, así como desde la región promotora completa, y la influencia de NtcA y HetR, se generaron estirpes que expresan el gen gfp-mut2 a partir de diferentes fragmentos de DNA que incluyen el promotor distal, promotor proximal o ambos promotores del gen devB. El análisis se realizó en los fondos silvestre, mutante ntcA y mutante hetR. Para construir dichas estirpes se amplificaron tres fragmentos de DNA de la región promotora de devB utilizando el plásmido pCSAM155 (contiene un fragmento de DNA que cubre desde la posición -825 hasta +17 con respecto al inicio de la traducción del gen devB [Muro-Pastor et al,. 2009]) como molde y las siguientes parejas de oligonucleótidos: alr3710-30/alr3710-35, alr3710-30/alr3710-32 y alr3710-33/alr3710- 31. Las tres parejas de oligonucleótidos incluyen dianas para las endonucleasas de restricción ClaI y XhoI (Tabla 2.7). Los fragmentos resultantes se clonaron delante del gen gfp-mut2, que va precedido por su propia secuencia Shine-Dalgarno, contenido en el plásmido pCSAM211 (Ionescu et al,. 2010), generándose los plásmidos pCSSC18, pCSSC19 y pCSSC20, respectivamente. El plásmido pCSAM211 está basado en el pDUCA7, el cual contiene una casete de resistencia a Nm e incluye el replicón pDU1 (Buikema y Haselkorn, 1991b), por lo que tanto este plásmido como sus derivados pueden transferirse a, y replicarse en, Anabena sp. PCC 7120 (Fig. 3.7). Los plásmidos pCSSC18, pCSSC19 y pCSSC20, así como el plásmido pCSAM211 usado como control de la fluorescencia basal, se transfirieron a las estirpes Anabaena sp. PCC 7120, CSE2 (ntcA) y CSSC2 (hetR) por conjugación triparental, seleccionándose clones resistentes a Nm. De esta forma se generaron 12 estirpes diferentes, cuya estructura genética se analizó mediante PCR utilizando DNA total de los clones seleccionados como molde y las parejas de oligonucleótidos pDU1/gfp-5, para detectar la presencia Resultados 97 del plásmido transferido, y las parejas de oligonucleótidos pDU1/alr37310-16, pDU1/alr3710-15 y alr3710-34/gfp-5, respectivamente, para analizar si se había producido la integración del plásmido correspondiente en la región cromosómica del gen devB. El resultado de este análisis fue que todos los clones contenían de forma libre el plásmido que se les había transferido, exceptuando los que portaban la construcción con ambos promotores dirigiendo la expresión de gfp-mut2 en los fondos silvestre y mutante hetR, que tenían mayoritariamente el plásmido integrado en la región cromosómica devB (datos no mostrados). Figura 3.7. Representación esquemática de la construcción de los plásmidos con las construcciones PdevB-gfp-mut2. A, Se muestran la región cromosómica devB y los distintos fragmentos del promotor devB usados para llevar a cabo las fusiones transcripcionales. Los triángulos negros indican los distintos oligonucleótidos usados para la amplificación de los fragmentos de DNA. El rectángulo rojo representa el sitio de unión de NtcA en el promotor distal. Se indican los TSPs (puntas de flechas negras). B, Esquema del plásmido pCSAM211 mostrando sus principales determinantes así como las dianas de restricción relevantes. pDU1 oriV nptII (NmR) cos gfp (Shine-Dalgarno) SD BamHI XbaI SalI PstI XhoI BglII ClaI EcoRI EcoRI pCSAM211 (pDUCA7) devB -454 -704 -454 -704 alr3710-35 (XhoI) alr3710-30 (ClaI) -704 alr3710-32 (XhoI) -454 alr3710-35 (XhoI) alr3710-33(ClaI) A B alr3710-30 (ClaI) Sergio Camargo Bernal 98 Se seleccionaron clones que portaban los plásmidos pCSSC18, pCSSC19 y pCSSC20 en fondo silvestre, denominándose CSSC6, CSSC7 y CSSC8, respectivamente. Los clones seleccionados en fondo mutante ntcA, se denominaron CSSC9, CSSC10 y CSSC11, respectivamente; y CSSC12, CSSC13 y CSSC14 los del fondo mutante hetR. Los clones seleccionados que portaban el plásmido control pCSAM211 en fondo silvestre, mutante ntcA y mutante hetR , se denominaron CSSC15, CSSC16 y CSSC17, respectivamente. Las estirpes así generadas se cultivaron con agitación en un medio BG110 + NH4+. Posteriormente los filamentos se incubaron en ausencia de nitrógeno combinado, tomándose muestras a distintos tiempos para ser estudiadas. El análisis de la fluorescencia de la proteína GFP se realizó mediante microscopía confocal, según se describe en Materiales y Métodos (apartado 2.7). Tras la incubación en ausencia de nitrógeno combinado, las estirpes CSSC6, CSSC7 y CSSC8 (que expresan el gen gfp-mut2 desde ambos promotores, solo el distal y solo el proximal, respectivamente, en fondo silvestre) mostraron niveles altos de fluorescencia principalmente en células que, por su morfología y pérdida de autofluorescencia, se identificaron como proheterocistos o heterocistos (Fig. 3.8). No obstante, en el caso de CSSC7 la expresión era también considerable en el resto de células del filamento. En las estirpes mutantes ntcA, CSSC9 (promotor completo), CSSC10 (promotor distal) y CSSC11 (promotor proximal) no se detectaba fluorescencia de GFP por encima del nivel basal. Entre las estirpes mutantes hetR, CSSC12 y CSSC13 (ambos promotores y promotor distal, respectivamente) mostraban un nivel de fluorescencia alto en todas las células del filamento, mientras que en la estirpe CSSC14 (promotor proximal) la fluorescencia era indetectable (Fig. 3.8). Resultados 99 Figura 3.8. Expresión del gen gfp-mut2 dirigido desde los promotores del gen devB en los fondos silvestre, mutante ntcA y mutante hetR. Se muestran las micrografías de fluorescencia de la GFP (parte superior) y campo claro (parte inferior), de filamentos cultivados con gaseo en medio BG110-NH4 + e incubados 40 horas en medio BG110. En la parte derecha se muestra un esquema de la región promotora que en cada caso dirige la expresión del gen gfp-mut2. Las flechas blancas señalan (pro)heterocistos. Barra de escala, 10 µm. !"# !"#$% &'"(% CSSC6 CSSC9 CSSC12 CSSC7 CSSC10 CSSC13 CSSC8 CSSC11 CSSC14 gfp -704 -454 $%&'(#)*'%'+'*,(# -704 gfp #-*'%'+'*#./(+01# -454 gfp #-*'%'+'*#)*'2/%01# Sergio Camargo Bernal 100 3.2.3. Análisis in vitro de la actividad transcripcional de la región promotora del gen devB. Efecto de NtcA y HetR. De los estudios realizados in vivo se pudo concluir que mientras que el promotor distal del agrupamiento génico devBCA depende exclusivamente del regulador NtcA, el promotor proximal depende tanto de NtcA como de HetR. Dado que entre estos dos reguladores existe una dependencia mutua en su activación, y que además la expresión de otros reguladores que intervienen durante el proceso de diferenciación depende de NtcA y HetR, era difícil discernir mediante ensayos in vivo si NtcA y HetR juegan un papel directo en la activación de promotores. Por ello, decidimos estudiar el papel de NtcA y HetR in vitro en sistemas bien definidos. 3.2.3.1. Ensayos de transcripción in vitro En trabajos previos de nuestro grupo se puso a punto un sistema TIV que incluye la RNAP de Anabaena sp. PCC 7120 reconstituida a partir de sus subunidades clonadas y expresadas en E. coli. Utilizando este sistema in vitro se demostró que la presencia de NtcA y 2-OG era necesaria y suficiente para que se produjese transcripción desde el promotor distal de devB (Valladares et al., 2008). Para ensayar el promotor proximal y la región promotora completa, se generaron mediante PCR distintos fragmentos de DNA, usando como molde el plásmido pCSAM155 (posiciones -825 hasta +17 con respecto al punto de inicio de la traducción del gen devB [Muro-Pastor et al,. 2009]) y las parejas de oligonucleótidos alr3710-1/alr310-16 para la amplificación del fragmento a, alr3710-17/alr3710-16 para el fragmento b y alr3710-18/alr3710-16 para el fragmento c (Fig. 3.9A). Cuando se utilizaba en ensayos TIV el fragmento que incluye ambos promotores se producía un transcrito de 411 nucleótidos (distancia desde el TSP -704 hasta el final del fragmento) siempre que estuvieran presentes NtcA y 2-OG (Fig. 3.9, fragmento a). Cuando se utilizaban los fragmentos que incluyen sólo el promotor proximal, se producía un transcrito de 161 nucleótidos (distancia entre el TSP -454 y el final del fragmento), requiriéndose también la presencia de NtcA y 2-OG. (Fig. 3.9, fragmentos b, c). Este transcrito procedente del promotor proximal se producía también desde el fragmento a, si bien se generaba más eficazmente en ausencia del promotor distal (Fig. 3.9B comparar calle 2 con las 5 y 7). Resultados 101 En estos ensayos también se incluyó el regulador HetR. Cuando se utilizaba el fragmento que contenía ambos promotores, HetR no parecía tener efecto significativo en la transcripción. Sin embargo, cuando se utilizaban fragmentos que sólo incluían al promotor proximal, HetR tenía un cierto efecto positivo en la producción de transcritos. Aunque este efecto positivo era pequeño, se observaba repetidamente (Fig. 3.9B fragmento c). Por otra parte, la actividad del promotor distal parecía tener un efecto negativo sobre la del proximal, aunque la relación entre la actividad de ambos promotores puede ser diferente in vivo dependiendo de las concentraciones de los factores reguladores implicados. Figura 3.9. Efecto de NtcA y HetR en la transcripción in vitro desde los promotores del gen devB. A, Esquema de los fragmentos de DNA usados en TIV. Se indica la localización aproximada de los TSPs -454 y -704, las posibles cajas -10 (azul) y el sitio consenso de unión de NtcA (rojo). B, Ensayos TIV realizado con los tres fragmentos representados en el panel A, previamente incubados en presencia o ausencia de NtcA (130 nM) más 2-OG (0,6 mM) y HetR (28 nM), según se indica, antes de ser incubados con la RNAP (27 nM) suplementada con SigA (88 nM). Las flechas señalan los transcritos generados desde cada TSP (indicados entre paréntesis). El marcador de tamaños (20 bp Molecular Ruler DNA Size Standart, Bio-Rad) se presenta a la izquierda de la figura. -825/-293 (alr3710-1/alr3710-16) (a) -731/-293 (alr3710-17/alr3710-16) (b) -652/-293 (alr3710-18/alr3710-16) (c) NtcA+2-OG - + + - + - + + HetR - - + - - - - + !" #" !""#$# %&"#$# %'"#$# (""#$# '""#$# 161 nt (-454) 411 nt (-704) -10 box -10 box -704 -454 devB Sitio de unión de NtcA 1 2 3 4 5 6 7 8 Sergio Camargo Bernal 102 3.2.3.2. EMSA de la unión de NtcA al DNA en la región comprendida entre los TSPs del gen devB Dado que para que se produjera transcripción in vitro desde el promotor proximal del gen devB se requiere de la presencia de NtcA y su efector 2-OG, y teniendo en cuenta que en esta región no se había identificado ningún sitio de unión de NtcA, se decidió ensayar la unión in vitro de este regulador a la región de DNA comprendida entre los dos TSPs. Se llevaron a cabo ensayos EMSA según se describe en el apartado 2.6.1 de Materiales y Métodos, empleando la proteína NtcA purificada (apartado 2.4.3) y un fragmento de DNA que incluía los TSPs de esta región pero no el sitio de unión de NtcA del promotor distal (Fig. 3.10A, fragmento d). Este fragmento se obtuvo mediante PCR utilizando los oligonucleótidos alr3710-17 y alr3710-19 y el plásmido pCSAM155 como molde. Como se puede apreciar en la figura 3.10B, al incrementar la concentración de NtcA aparecían una o dos bandas retrasadas que iban aumentando en proporción respecto a la del fragmento libre. Estas dos bandas se apreciaban bien utilizando concentraciones de NtcA de 10 ó 20 µM, requiriendo la más lenta una mayor concentración de NtcA, además de exhibir una fuerte dependencia de 2-OG. (Fig. 3.10C). Para comprobar la especificidad de la unión, se llevaron a cabo ensayos EMSA en presencia de un exceso de diferentes fragmentos de DNA no marcados radiactivamente: el mismo fragmento utilizado en el ensayo, un fragmento que incluía el sitio de unión de NtcA consenso del promotor distal de devB (Fig. 3.10A, fragmento e) y un fragmento que incluía el promotor del gen psbA (posiciones -145 a +47) de Amaranthus hybridus, al que NtcA no se une. Para amplificar el fragmento e se utilizaron los oligonucleótidos alr3710-1 y alr3710-2 y el plásmido pCSAM155 como molde, y para la amplificación del fragmento del promotor del gen psbA, los oligonucleótidos CK3-1 y CK3-2 y como molde el plásmido pRL278. En la figura 3.10D se observa que al añadir un exceso de DNA no marcado (fragmentos d y e), se producía un descenso de la proporción de fragmento radiactivo (d) retrasado, mientras que la adición de un exceso de un fragmento no radiactivo no relacionado (PpsbA) no tenía ningún efecto. Por tanto, la unión de NtcA a la región de DNA entre los dos TSPs del gen devB es específica. Resultados 103 Figura 3.10. Ensayos de retardo en gel de la unión de NtcA al DNA entre los dos TSPs del gen devB. A, Esquema de la región promotora del gen devB en el que se muestran los fragmentos utilizados. B, C y D, 2 fmol de fragmento (d) se incubaron, como se indica, con NtcA purificada (en presencia de 0,6 mM de 2-OG, excepto cuando es indicado en el panel C) antes de someter a electroforesis. Las concentraciones de NtcA en el panel B son las siguientes: 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 y 10 µM. D, La concentración de NtcA era de 0,6 µM; se utilizó un exceso de DNA no marcado (100x y 200x) de los fragmentos d y e, y 100x, 200x y 300x del fragmento de PpsbA. Se indica el fragmento libre (triángulos blancos) y los fragmentos unidos a NtcA (triángulos negros). Los números en la parte inferior de las figuras indican el porcentaje de fragmento retrasado respecto al DNA total en cada calle. !" NtcA - 2-OG + - + - + - + - + NtcA (µM) - 2 4 10 20 - 8 4 2 10 5 3 - 22 24 26 24 25 #" $" - - (d) (e) - (PpsbA) %" -10 box -10 box -731/-452 (alr3710-17/alr3710-19) (d) -825/-571 (alr3710-1/alr3710-2) (e) -704 -454 devB Sitio de unión de NtcA Sergio Camargo Bernal 104 3.2.3.3. Ensayos de protección frente a la degradación por DNasa I Para determinar las secuencias de DNA con que interacciona NtcA en la región comprendida entre los dos TSPs de la región promotora devB, se llevaron a cabo experimentos de protección por NtcA frente a la degradación por DNasa I (apartado 2.6.3, Materiales y Métodos). Para ello se utilizaron fragmentos que cubrían la misma región que los utilizados en los ensayos EMSA. Dependiendo de qué cadena de la doble hélice se quisiera analizar, se utilizaba uno u otro de los dos oligonucleótidos marcados radiactivamente, alr3710-17 para la cadena superior (cadena codificante) o alr3710-19 para la cadena inferior (cadena no codificante). Los fragmentos marcados se incubaban con distintas concentraciones de la proteína NtcA purificada (apartado 2.4.3), y posteriormente se sometían a un tratamiento con DNasa I. Finalmente, los productos generados por esta digestión se resolvían en geles de urea-poliacrilamida (apartado 2.2.7, Materiales y Métodos). Se pudo observar que la presencia de NtcA provocaba cambios en el patrón de digestión en ambas cadenas. (Fig. 3.11A y B). Se detectaron dos zonas principales de cambios, o ventanas de protección, con algunas posiciones exhibiendo hipersensibilidad a la digestión. Cuando se utilizaron otros fragmentos con los que se resolvían mejor determinadas zonas de la región de DNA estudiada, no se encontraron otros cambios significativos y repetitivos fuera de estas dos zonas principales de protección (no mostrado). En la figura 3.12 se representa la región de DNA estudiada y los resultados obtenidos de este análisis. Al examinar la secuencia de las dos ventanas de protección de NtcA observadas, se encuentra una secuencia GTCN8TGC, que recuerda al consenso de los sitios de unión para este regulador (los nucleótidos que coinciden con el consenso se señalan en negrita). Conjuntamente, los resultados de los ensayos EMSA y de protección frente a la degradación por DNasa I indican una interacción específica de NtcA con el DNA entre los dos TSPs del gen devB, posiblemente en dos posiciones diferentes. Resultados 105 Figura 3.11. Análisis de protección por NtcA frente a la digestión por DNasa I en la región de DNA situada entre los dos TSPs del gen devB. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando distintas concentraciones de la proteína NtcA, tal como se indica, en presencia de 0,6 mM de 2-OG. A) Ensayo de protección en la cadena superior, utilizando el fragmento amplificado con la pareja de oligonucleótidos alr3710-17 (marcado)-al3710-26 (no marcado). B) Ensayo de protección en la cadena inferior, utilizando el fragmento amplificado con los oligonucleótidos alr3710-17 (no marcado) y alr3710-19 (marcado). Como patrón de tamaños se utilizaron las reacciones de secuenciación realizadas con el plásmido pCSAM155 y el oligonucleótido alr3710-16 o alr3710-19, respectivamente. Las líneas verticales delimitan zonas de protección por NtcA, y en ellas los triángulos señalan posiciones de hipersensibilidad a la degradación. NtcA (µM) - - 1.0 2.5 5.0 10 A C G T NtcA (µM) - - 1.0 2.5 5.0 A G T C !" #" Cadena superior Cadena inferior Sergio Camargo Bernal 112 Figura 3.16. Región promotora del gen ntcA en Anabaena sp. PCC 7120. A, Esquema de la región promotora de ntcA en el que se señalan con flechas los TSPs. También se representan, mediante rectángulos rojos, los sitios de unión de NtcA: centrado en la posición -143,5 el “sitio distal” y centrado en -103,5 el “sitio proximal”, y las posibles cajas -10 de los promotores P1 y P2 (rectángulos azules). B, Secuencia de nucleótidos de esta región promotora, donde se indican en rojo los hemisitios de unión del regulador NtcA. Los posibles hexámeros -10 se indican en negrita. El inicio del gen ntcA , señalado en rojo, se indica como +1. 3.3.2.1. Efecto de NtcA y HetR Para estudiar el efecto de NtcA y su efector el 2-OG en la activación transcripcional de los distintos promotores del gen ntcA, se utilizaron distintos fragmentos de DNA de esta región promotora en ensayos TIV. Uno de estos fragmentos contenía la región promotora completa y se amplificó utilizando el plásmido pCSE4b como molde y los oligonucleótidos alr4392-13 y alr4392-43 (Fig. 3.17A, fragmento a). Otro fragmento incluía todos los TSPs, pero sólo 15 nucleótidos de la región que precede al promotor P3; para su amplificación se utilizaron los oligonucleótidos alr4392-44 y alr4392-43 (Fig. 3.17A, fragmento b). En otro de los fragmentos se excluyó el promotor P3 y la región comprendida entre las posiciones -180 y -143, que se había descrito podría tener un papel negativo en la expresión de los promotores situados detrás; este fragmento se amplificó con los oligonucleótidos alr4392-45 y alr4392-43 (Fig. 3.17A, fragmento c) y, por ultimo, un fragmento que contenía el promotor P1 y del -180 -136 ntcA -49 P3 P1 P2 !"#$%&' !"($%&' !"#$%&#$'()!"#$%&$$'() CCAGTCAGATTCAGCATAGAGATTTTTGTTGTCATTAATGTGATCGATTCATTTGTACAGCTTGACAGAAATC ACTACCCAGTAGAAGAGGTAATCAAGCTATGTTGGGAATTTTCTTGCTGTTTAACTCGAAAGAATGTCTAGGG GACAGGAGGAGAGCAAGAGAGGCAAGGTAGGCCAGGGAGGAAAGAGGTTCAGAATTTTTCTTTTCCCCCTTAC TCAAGAACAGCCTGCCTGAACCAAGATAGGACTTAGGCAATCTATACCCCTATACCCCTATACCCCTATACCC CTACACCCTTATCCAAACCCTTTATCTTTGTTTTATACATGGTTAGCAAAAATGATGATTATTAAGGGCGTTT TTTAGAATAAAATGTTTGTTATTTCTTAAGATATTTTCAAGATTACTTAATTTTTTCTGCAAAAAACCTGATG GTTAGAGAAAGTAGAAGTATCTATCAAGAACTGCTAGCTAAAAATAGCAAAAGTTGGGTATCATTATGAACAA ATAACCATAAAGTTGTACGTTTGAGTATAGGAAAGTACAGAAAGGTTAACGGTGCTTTATTGATTTTTCAGGT GTATTCTTAGGTAATTAGTTTTTAGTTTTTTGTTATTCCGGCATTGGGTAGGGGAAGGGAGATGATCGTGACA CAAGATAAGGCCCTAGCAAATGTTTTTCGTCAGATGGCAACCGGAGCTTTTCCTCCTGTTGTCGAA! *+,) *-&.) *-/0) 1-) $) 2) Resultados 113 que se excluyeron los dos sitios de unión del regulador NtcA (Fig. 3.17A, fragmento d). Estos fragmentos se utilizaron en ensayos TIV en presencia de NtcA y 2-OG. El tamaño esperado para los transcritos procedentes de cada promotor era: 125 nucleótidos (P1), 214 nt (P2) y 239 nt (P3). Figura 3.17. Efecto de NtcA y 2-OG en la transcripción in vitro desde la región promotora de ntcA. A, Esquema de los fragmentos de DNA utilizados en los ensayos TIV. Los ensayos fueron realizados con los fragmentos a y b (panel B) y con los fragmentos c y d (panel C) previamente incubados en presencia o ausencia de NtcA (130 nM) más 2-OG (0,6 mM) antes de la adición de RNAP-SigA (27 nM) y SigA (88 nM). Los triángulos señalan los transcritos generados. En C, se indica con un triangulo blanco un transcrito producido desde el promotor P1. El marcador de tamaños se muestra a la izquierda de las figuras. Cuando se utilizó el fragmento completo a o el fragmento b, se detectó un transcrito de unos 214 nucleótidos, que se corresponde con el tamaño esperado para el que comenzara en P2, pero no se pudo apreciar transcripción desde P1 o P3. No se observó ningún efecto de NtcA y 2-OG (Fig. 3.17B). Con el fragmento b se detectó además una banda muy tenue que correspondería a un transcrito de unos 125 nt, aún menos representado en presencia de NtcA (Fig. 3.17B). Cuando se utilizó el fragmento c también se produjo este último transcrito, principalmente en ausencia de NtcA (Fig. 3.17C). -180 -136 ntcA -49 P3 P1 P2 !"#$%&' !"($%&' !"#$%&#$'()!"#$%&$$'() -645/+77 (alr4392-13/alr4392-43) (a) -195/+77 (alr4392-44/alr4392-43) (b) -156/+77 (alr4392-45/alr4392-43) (c) -100/+77 (alr4392-46/alr4392-43) (d) $) )(('!' )#('!' ")('!' $(('!' 214 nt 125 nt )(('!' ")('!' "#('!' )#('!' 125 nt NtcA - + - + ''' NtcA - + - + ''' *) ') Sergio Camargo Bernal 114 En presencia de NtcA se producía además un transcrito algo mayor, de aprox. 135 nt, en detrimento del de aprox. 125 nt (Fig. 3.17C, fragmento c). Cuando se utilizó un fragmento en el que se excluyía tanto el sitio de unión distal como proximal de NtcA (fragmento d), este transcrito no se detectaba, detectándose sólo el transcrito de 125 nt, sin efecto de NtcA. Parece por tanto que el transcrito de aprox. 135 nt es el resultado de la operación regulada por NtcA de P1. También se probó el efecto de HetR en TIV con los fragmentos a y c. No obstante, en ningún caso se observó un efecto significativo de la presencia de éste. 3.3.3. Activación transcripcional en la región promotora del gen hetR La región promotora de hetR incluye cuatro promotores cuyos TSPs se localizan en las posiciones -728, -696, -271 y -184 (respecto al inicio de traducción del gen hetR) (Buikema y Haselkorn, 2001). La transcripción desde el promotor P1, originada desde la posición -184, es independiente del estado nitrogenado (Buikema y Haselkorn, 2001; Muro-Pastor et al., 2002). La transcripción desde los promotores P4 y P3, originadas desde las posiciones -728 y -696 respectivamente, se activa en ausencia de nitrógeno combinado (Buikema y Haselkorn, 2001; Muro-Pastor et al., 2002). In vivo la expresión desde P4 depende del regulador NtcA (Muro-Pastor et al., 2002), aunque se cree que esta dependencia se ejerce de forma indirecta, a través de NrrA, un regulador de respuesta de la familia OmpR (Ehira y Ohmori, 2006a; Ehira y Ohmori, 2006b). También se ha observado dependencia de NtcA en la expresión desde P2 (originada desde la posición -271). En ninguno de estos dos promotores se han identificado sitios de unión consenso para NtcA, ni se ha podido detectar unión de este regulador in vitro (Muro-Pastor et al., 2002). Mientras que la expresión desde P4 y P3 no depende del regulador HetR, la expresión desde P2 es totalmente dependiente de HetR (Buikema y Haselkorn, 2001; Muro-Pastor et al., 2002) (Fig. 3.18). Para estudiar posibles efectos directos de los reguladores NtcA y HetR en la activación transcripcional desde esta región promotora, se utilizaron distintos fragmentos de DNA de la misma en ensayos TIV . Resultados 115 Figura 3.18. Región promotora del gen hetR en Anabaena sp. PCC 7120. A, Esquema de la región promotora de hetR en el que se señalan los inicios de transcripción con puntas de flecha, y las posibles cajas -10 de los promotores P1, P2, P3 y P4 se representan mediante rectángulos azules. B, Secuencia de nucleótidos de esta región promotora, donde se destacan en negrita los TSPs y los posibles hexámeros -10. El inicio del gen hetR se indica como +1. Uno de los fragmentos utilizados contenía la región promotora completa, y se amplificó utilizando el plásmido pWB216S2.4 (Buikema y Haselkorn, 1991) y los oligonucleótidos alr2339-12 y alr2339-7 (Fig. 3.19A, fragmento a). Otro fragmento sólo incluía los dos promotores distales P3 y P4, y se amplificó con los oligonucleótidos alr2339-12 y alr2339-15 (Fig. 3.19A, fragmento b). Por último, se amplificó, con los oligonucleótidos alr2339-32 y alr2339-33, un fragmento que incluía solo P2 (Fig. 3.19A, fragmento c). Estos fragmentos se incubaron en presencia o ausencia de NtcA y 2-OG previamente a su incubación con RNAP-SigA. Los tamaños esperados para los !" #" hetR -184 P1 -271 P2 -696 P3 -728 P4 AACTCTGGACTTCTGGCTCAGTAGTCATAATGGCTTAATGTCAGCAAACCTTGATTTTTCCATGGA AAAACCATTGGTTATTCATCAATCCTGGAAATTTTTAGCAAAAGAAAAGTTAAGAGTAGATTAATT CATGCAATTTTAATAATATGACAGATAAATATAGAATATTATGTTGTGAGGAAATAAAAGGTATTG CTAAGTTGGAATTACCTGTCTTATTTAGCGTCTATAATTTTCCCTCCAGCCAACGACCTACACTGC CATAAGAGCAAAAAAATTGTCAGCATCTCGGCAGATAAGAACGCTCTATTGATTCAATGGGCGTTA GTGAGTTTGGCGTAGTCGGCAGGTGACTTTTTCAAAAAATCACTTCCTGTTATTTCTGGAAATAAT CGGTCAGCATCTGAGTAAAATTACTCAGGAATAGAGTATTCACCTCAAGGAGAGATTGTGCGATTA TAATCTCCCATTGTTGGCCGTTGTGTTGCTATCTCCTAAATCCGGGTGCAGCCCAAAAGTCTTAAA AATAGCAAATTTATTGACGCTATTAAAGAGCAGATAAGTTCCGGATAATAGGGAAAGTCCTTGTAG GTTACTTATTAGAACCATAAAGTTCGCCAGTAATTGACAAATGTTATAAATGAGGAAATTCTGGCA GTTATTTTGTGATTTTTCGGTAAGATACAAGCACGTCTAGTAACAACACTGTTGCTAGTTATATGC CATAAATTACGGAGGAATGAGCATCTTGACCATTAATCGACTTTTATTTAAAACATCATAAGCATT TTGGTGTCACAATCTCACCCCCCTATGGGTGTATACCAACTACTTTTTTTAGACTAATAAGCGTGC TATTCAACTATTTGTAATATG! $%&'" $()%" $)(&" $*+*" ,%" Sergio Camargo Bernal 116 transcritos iniciados en P1, P2, P3 y P4 usando el fragmento a son: 139, 226, 651 y 683 nt, respectivamente. Como se puede apreciar en la figura 3.19B, al utilizar el promotor completo en ausencia de NtcA y 2-OG se detectaron dos transcritos, uno de ellos con un tamaño de aproximadamente 140 nucleótidos (que podría corresponder al generado desde el promotor P1) y otro con un tamaño superior a los 500 nucleótidos, que podría corresponder a transcritos generados desde los promotores P3 y/o P4. En presencia de NtcA y 2-OG aumentaba algo la producción de estos transcritos de mayor tamaño. Por el contrario, se inhibía la producción del de menor tamaño, originándose uno nuevo de unos 160 nt. Para discernir si la banda correspondiente a transcritos de tamaños mayores podía resolverse en varias, se utilizó el fragmento de DNA que sólo incluía los promotores P3 y P4 (fragmento b), resolviendo los transcritos producidos mediante una electroforesis de mayor duración. Así, se detectaron dos transcritos de tamaños aproximados a los esperados para los producidos desde P3 y P4: 316 y 348 nt, respectivamente. Estos transcritos se generaban en ausencia de NtcA y 2-OG. No obstante, la adición de NtcA y 2-OG tenía un ligero efecto positivo sobre la producción del transcrito originado desde el P4, y negativo sobre el originado desde en P3, haciendo que se invirtiera la relación entre ambos (Fig. 3.19C). También se analizó mediante ensayos TIV el posible papel directo de HetR en la región promotora del gen hetR. Se utilizaron fragmentos que incluían P4 y P3, P2 y P1, o la región promotora completa, pero sólo se obtuvo un efecto apreciable cuando se utilizó el fragmento c, que sólo incluye P2. Cuando se incubó sólo en presencia de HetR, se detectó un transcrito de unos 120 nucleótidos (el esperado era de 86 nt), que podría haber sido originado desde este promotor tras una terminación de la transcripción imprecisa, o desde un inicio de transcripción anterior a la posición -271. La producción de este transcrito se inhibía por NtcA. Resultados 117 Figura 3.19. Efecto de NtcA y HetR en TIV desde la región promotora de hetR. A, Esquema de los fragmentos de DNA utilizados en los ensayos de transcripción in vitro. B y C, Los ensayos TIV se realizaron con los fragmentos a y b incubados en presencia o ausencia de NtcA (130 nM) más 2-OG (0,6 mM) antes de ser incubados con la RNAP (27 nM) y SigA (88 nM). D, Ensayo TIV con el fragmento c incubado en presencia o ausencia de HetR (28 nM) y NtcA y 2-OG en las mismas condiciones que en B y C. Los triángulo indican los transcritos generados En B se indica con un triángulo blanco la producción de un transcrito dependiente de NtcA. El marcador de tamaños se muestra a la izquierdas de la figuras. -883/-45 (alr2339-12/alr2339-7) (a) -883/-380 (alr233912/alr2339-15) (b) !" hetR -184 P1 -271 P2 -696 P3 -728 P4 -508/-186 (alr2339-32/alr2339-33) (c) NtcA - + !!! #" "##!$! "%#!$! &##!$! '##!$! (%#!$! 139 nt 651 nt (P3) 683 nt (P4) NtcA - + !!!! 316 nt (P3) $" &"#!$! '##!$! &##!$! &%#!$! %##!$! 348 nt (P4) '##!$! "##!$! (##!$! ("#!$! ()#!$! *#!$! NtcA - - + + !!! HetR - + - + !!! %" 120 nt Sergio Camargo Bernal 118 3.4. EFECTO DE PipX EN LA ACTIVACIÓN DE PROMOTORES DEPENDIENTES DE NtcA Dado el papel esencial de NtcA durante la diferenciación de heterocistos, cualquier factor que influya sobre su actividad podría jugar también un papel relevante en la regulación de este proceso. En este contexto, el factor PipX se había descrito como un coactivador de NtcA en Anabaena, reforzando la expresión de algunos genes tardíos durante el proceso de diferenciación de los heterocistos (Valladares et al., 2011). Para profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de PipX se han realizado estudios in vitro e in vivo, de la acción de este factor en distintos tipos de promotores dependientes de NtcA. 3.4.1. Efecto de PipX sobre la expresión del gen nrrA in vivo Se ha estudiado si PipX tiene algún efecto en la expresión in vivo de un promotor que se activa en los estadios iniciales de la diferenciación de heterocistos; el único promotor, dependiente de NtcA de clase II del gen nrrA, que determina un regulador de respuesta de la familia OmpR que parece influir positivamente en la expresión de hetR (Ehira y Ohmori, 2006a; Ehira y Ohmori, 2006b). Se realizó un análisis de northen de la expresión del gen nrrA tanto en la estirpe silvestre Anabaena, como en la estirpe mutante de pipX (CSV6; Valladares et al., 2011). Como se puede apreciar en la figura 3.20, el nivel de transcritos de nrrA en la estirpe CSV6 parece ser menor en comparación con el nivel de transcritos de la estirpe silvestre. Las diferencias se aprecian sobre todo tras 3, 6 y 9 h de incubación en condiciones de deficiencia de nitrógeno combinado, mostrando en esos tiempos la estirpe CSV6 una expresión de 2,40; 2,41 y 4,6 veces menor que la estirpe silvestre. Sin embargo, el nivel de transcritos parece recuperarse tras 12 o 24 h en condiciones de deficiencia. Resultados 119 Figura 3.20. Análisis de northen de la expresión del gen nrrA en el mutante pipX (CSV6). Se utilizó RNA (25 µg por calle) aislado de filamentos de Anabaena sp. PCC 7120 y de la estirpe mutante pipX (CSV6) cultivados con amonio (0 h) e incubados en ausencia de nitrógeno combinado durante los tiempos indicados (en h). El filtro se hibridó con una fragmento de DNA de 750 pb de la región genómica de nrrA obtenido mediante PCR utilizando como molde el plásmido pCSAM115 (Muro-Pastor et al., 2006) y los oligonucleótidos all4312-22 y all4312-23. Como control de carga y transferencia, el filtro se hibridó con una sonda del gen rnpB de Anabaena sp. PCC 7120 (apartado 2.3.4.2 de Materiales y Métodos). A la izquierda se indican las posiciones de un marcador de tamaños de RNA. El tamaño de nrrA y su region leader es de 0,79 kb. 3.4.2. Efecto de PipX en la unión de NtcA al DNA en las regiones promotoras de los genes nrrA y devB Se ha estudiado mediante EMSA y SPR, si la proteína PipX purificada tiene algún efecto en la unión de NtcA a fragmentos de DNA conteniendo distintos tipos de promotores con sitios de unión de NtcA. En concreto, se han utilizado los dos promotores del operón devBCA y el único promotor del gen nrrA. Este último y el promotor distal de devBCA son activables por NtcA de clase II, mientras que el promotor proximal de devBCA presenta dos regiones de interacción con NtcA, una de las cuales incluye una secuencia de unión de NtcA degenerada (ver apartado 3.2.3.2, Figura 3.12). 0 3 6 9 12 24 0 3 6 9 12 24 PCC 7120 CSV6 !" #$%" &$%" #" rnpB nrrA Sergio Camargo Bernal 120 3.4.2.1. Ensayos de retardo en gel Los ensayos EMSA se realizaron según se describe en el apartado 2.6.1 de Materiales y Métodos, empleando la proteína NtcA purificada (apartado 2.4.3), su efector 2-OG y la proteína PipX purificada (apartado 2.4.3). Los fragmentos utilizados se amplificaron mediante PCR, utilizándose el plásmido pCSAM113b (Muro-Pastor et al., 2006) como molde y los oligonucleótidos all4312-2 y all4312-1 para la amplificación del único promotor del gen nrrA; el plásmido pCSAM155 y los oligonucleótidos alr3710-1 y alr3710-2 para el promotor distal del gen devB (devBCA P2) y el mismo plásmido y la pareja de oligonucleótidos alr3710-17 y alr3710-19 para la amplificación del promotor proximal del gen devB (devBCA P 1). Como se puede observar en la figura 3.22 (paneles A y B), tanto con el promotor devBCA P2 como con el promotor de nrrA, NtcA produce una banda retrasada, cuya proporción aumenta en presencia de PipX, mientras que la adición de PipX sola no produce ningún retraso. En el caso de nrrA, sólo se pudo apreciar una banda retrasada, por lo que no queda claro si PipX permanece en el complejo NtcA-DNA. En el caso de devBCA P 2, cuando se utilizaron altas concentraciones de PipX y un gel con la concentración de acrilamida estándar, se detectó una banda de retraso bastante amplia. Cuando se realizó el mismo ensayo utilizando un gel de mayor dureza (8% acrilamida), se pudieron observar dos bandas retrasadas en presencia de ambas proteínas. Como este fragmento sólo incluye un sitio de unión para NtcA, la banda más retrasada podría corresponder al complejo ternario NtcA-PipX-DNA. Por otra parte, con el promotor devBCA P1 sólo se observaba una banda retrasada producida por NtcA (sólo se esperaba una con la concentración de NtcA usada en este ensayo), incrementándose la proporcion de esta banda en presencia de PipX (Fig .3.21C). Resultados 121 Figura 3.21. Efecto de PipX en la unión de NtcA a las regiones promotoras de los genes nrrA y devB. Los fragmentos de DNA de los promotores devBCA P2 (A), nrrA (B) y devBCA P1 (C) se incubaron con NtcA y PipX a las concentraciones que se indica, en presencia de 2-OG 0,6 mM. Los triángulos indican la posición de los complejos NtcA-DNA. D, Secuencia de DNA de las regiones promotoras ensayadas. Las puntas de flecha indican TSPs; en negrita se señalan las posibles cajas -10, y los sitios de unión de NtcA aparecen subrayados. 3.4.2.2. Análisis SPR El efecto de PipX sobre la unión de NtcA también se analizó mediante SPR (apartado 2.6.2.1 de Materiales y Métodos). Esta técnica permite la monitorización en tiempo real de la interacción entre distintas moléculas, en nuestro caso la interacción de proteínas con DNA. !" #" $" GCTAGAGTAACAAAGACTACAAAACCTTGGGCATGGGCTTGTTACTTTGAAATTCATCGA nrrA! TCATTTGTACAGTCTGTTACCTTTACCTGAAACAGATGAATGTAGAATTTATAAAACTA! devBCA P2! devBCA P1!AATAAAGTCATCTAAGTTGCAGAAAATCTTTAAAAGATTTGCCATAATGAAATCTATCTGCA! PipX (µM) - - 0,8 2,4 - 1,6 3,2 0,8 2,4 3,2 NtcA (µM) - 0,4 0,8 - - - PipX (µM) - - 0,8 2,4 - 1,6 3,2 0,8 2,4 3,2 NtcA (µM) - 0,4 0,8 - - - devBCA P1 nrrA PipX (µM) - - 3,2 NtcA (µM) - 0,8 0,8 %" PipX (µM) - - 0,8 2,4 - 1,6 3,2 0,8 2,4 3,2 NtcA (µM) - 0,4 0,8 - - - devBCA P2 devBCA P2 Sergio Camargo Bernal 128 NtcA más 2-OG facilita la formación del complejo abierto (Valladares et al., 2008). La presencia de PipX no afectó apreciablemente la proporcion de esta banda adicional o complejos RNAP-NtcA-DNA (Fig. 3.25, calles 7ª y 9ª). Por tanto, aunque no se puede deducir un efecto claro de PipX en la formación del complejo ternario RNAP-NtcA- DNA, podría existir cierto efecto positivo de PipX sobre la formación de los complejos RNAP-DNA. No obstante esta cuestión requeriría estudios adicionales. 3.5. DETERMINACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA REGIÓN PROMOTORA DEL OPERÓN alr2729-cox3 Entre los cambios que se producen durante la diferenciación de los heterocistos para mantener un ambiente microóxico destaca la expresión de oxidasas respiratorias terminales, como la de los complejos Cox2 y Cox3. El agrupamiento génico alr2729-cox3 determina la oxidasa Cox3 específica de heterocistos. Este agrupamiento se expresa en una estadío tardío en las células que se están diferenciando, dependiendo su expresión de NtcA y HetR y estando regulado positivamente por PipX (Valladares et al., 2003; 2011). Para estudiar el papel de NtcA, HetR y PipX en la regulación de la expresión de este operón (cox3), se procedió, en primer lugar, a una caracterización detallada de su región promotora. 3.5.1. Determinación de los inicios de transcripción del operón cox3 En el genoma de Anabaena sp. PCC 7120, las ORFs alr2729 y alr2730, con función desconocida, preceden a los genes coxB3-coxA3-coxC3, y los cinco se expresan como un operón (Valladares et al., 2003) (ver Fig. 3.27A). Para caracterizar experimentalmente la región promotora de este operón se procedió a la determinación de sus TPSs, así como su dependencia de los reguladores NtcA y HetR. 3.5.1.1. Ensayos de extensión de cebador Estos ensayos se realizaron utilizando RNA aislado de filamentos de la estirpes Anabaena sp. PCC 7120, el mutante ntcA (CSE2), y los mutantes hetR (CSSC2 y 216), cultivados con amonio y posteriormente incubados en ausencia de nitrógeno combinado. En la estirpe silvestre, utilizando los oligonucleótidos alr2729-14 y Resultados 129 alr2729-13 como cebadores para la extensión, se detectaron tres especies de RNA distintas, cuya cantidad aumentaba en ausencia de nitrógeno combinado. Los extremos 5’ de estas tres especies de RNA fueron localizados en las posiciones -166, -278 y -388 (respecto del inicio de traducción del gen alr2729) (Fig. 3.26A). En las estirpes mutantes, el nivel de los transcritos cuyo extremo 5’ correspondía a las posiciones -388 o -278 era mucho menor que en la estirpe silvestre en condiciones de deficiencia de nitrógeno, mientras que el transcrito con extremo 5’ en la posición -166 no se detectaba (Fig. 3.26A). 3.5.1.2. Análisis 5’ RACE Para discernir si las especies de RNA antes detectadas se correspondían con transcritos primarios, o si se originaban a partir de transcritos de mayor tamaño, se realizó un análisis 5’ RACE con muestras de RNA de la estirpe silvestre cultivada con amonio y posteriormente incubada en ausencia de nitrógeno combinado. Muestras duplicadas de RNA aislado tras 0 h y 12 h de incubación en ausencia de nitrógeno combinado se trataron o no con la enzima TAP (apartado 2.3.5 de Materiales y Métodos). Las muestras tratadas y no tratadas se ligaron a un adapatador de RNA y después se usaron para retrotranscripción con el oligonucleótido alr2729-9. El material resultante se utilizó como molde para una reacción de PCR, con los oligonucleótidos alr2729-9 o alr2729-13 (específicos del gen) junto a un oligonucleótido de la región del RNA adaptador (apartado 2.3.5 de Materiales y Métodos). En la figura 3.26B se muestra el resultado de este análisis. Sólo se detectó amplificación de los fragmentos de DNA con tamaños correspondientes a la distancia desde el cebador utilizado hasta los extremos 5’ de transcritos identificados previamente en las muestras tratadas con TAP, y principalmente después de la incubación en ausencia de nitrógeno combinado. Ello indica que los extremos 5’ de las tres especies de RNA identificadas anteriormente corresponden a inicios de transcripción, y que la transcripción desde estos tres TSPs está regulada por nitrógeno. Sergio Camargo Bernal 130 Figura 3.26. Determinación de los TPSs del operón cox3. A, Ensayos de extensión de cebador realizados con los oligonucleótidos alr2729-14 (panel superior) y alr2729-13 (panel inferior) como cebadores y RNA aislado de las estirpes Anabaena sp. PCC 7120 (WT), CSE2 (ntcA) y CSSC2 o 216 (hetR) cultivadas con amonio (0) e incubados en ausencia de nitrógeno combinado durante los tiempos indicados (en h). Las posiciones de los extremos 5’ de los RNA se indican mediante triángulos negros. Las reacciones de secuencia de la misma región de DNA también se muestran en cada figura. B, Análisis 5’ RACE con RNA de la estirpe silvestre cultivada con amonio (0) e incubada en ausencia de nitrógeno combinado durante 12 h (12), tratadas (+) o no (-) con la enzima TAP, como se indica. Se usó el oligonucleótido alr2729-9 para la retrotranscripción, y los oligonucleótidos alr2729-13 (panel izquierdo) y alr2729-9 (panel derecho) como cebadores específicos en las PCRs. Se indica la posición 5’ correspondiente a algunos productos de amplificación. El marcador de tamaños de DNA, Marker X (Roche), se muestra en la parte izquierda de cada panel. !" #" 0 0 12 12 -166 -278 !"#$ !%%$ &"'$ &&($ &()$ 0 0 12 12 -388 -166 !"#$ !%%$ &"'$ &&($ &()$ )*%$ )!%$ -388 WT CSSC2 CSE2 0 24 0 24 0 24 A C G T 0 12 24 0 12 24 0 12 24 WT CSE2 216 A C G T -166 -278 Resultados 131 3.5.2. Estudio de la unión de NtcA a la region promotora del operón cox3 La interacción del regulador NtcA con el DNA de la región promotora del operón cox3, así como el posible efecto del regulador PipX se estudiaron mediante EMSA y Footprinting. 3.5.2.1. Ensayos de retardo en gel Para estos ensayos se utlizaron dos fragmentos de DNA, uno que incluía los tres TSPs de esta región antes determinados, y otro que sólo incluía el localizado en la posición -166 (Fig. 3.27A fragmentos a y b). Estos fragmentos se obtuvieron mediante amplificación por PCR, utilizando el plásmido pCSSC35 como molde y las parejas de oligonucleótidos alr2729-17/alr2729-18 para el fragmento a, y alr2729-12/alr2729-13 para el fragmento b. Cuando se utilizó el fragmento a (que cubre desde la posición -98 hasta la posición -563) en presencia de concentraciones crecientes de NtcA, se pudieron detectar hasta tres bandas retrasadas, que podrían corresponder a NtcA unida a uno, dos y tres sitios, respectivamente (Fig. 3.27B). Aunque PipX no se unía por sí solo al fragmento de DNA usado (no mostrado), sí potenciaba la formación de los complejos DNA-NtcA de menor movilidad electroforética (Fig. 3.27B comparar calle 9 con calles 10 y 11). Cuando se utilizó el fragmento de DNA que cubría desde la posición -8 hasta la -272, se detectaba una banda retrasada en presencia de NtcA. Este complejo DNA- NtcA también se potenciaba por la presencia de PipX (Fig. 3.27C). 3.5.2.1. Ensayos de protección por NtcA frente a la degradación por DNasa I Para identificar las regiones de DNA en las que interaccionaba la proteína NtcA en la región promotora del operón cox3, y el efecto de PipX, se llevaron a cabo ensayos de protección frente a la degradación por DNasa I (apartado 2.6.3, Materiales y Métodos). Se utilizaron los mismos fragmentos de DNA que en los ensayos EMSA, marcando radiactivamente con 32P los oligonucleótidos alr2729-17 y alr2729-12 y, además, otro fragmento amplificado con los oligonucleótidos alr2729-17 (marcado) y alr2729-2b (no marcado). En la figura 3.28 se muestran los resultados del análisis de la cadena superior o codificante de estos fragmentos. Al utilizar distintas concentraciones de NtcA, se detectaron tres ventanas de protección (Fig. 3.28), requiriendo el sitio 2 Sergio Camargo Bernal 132 mayores concentraciones de NtcA que los sitios 1 y 3 (Fig. 3.28B y C). Además, se observaba que PipX potencia la protección por NtcA en los tres sitios. Figura 3.27. Unión de NtcA a la región promotora del operón cox3 y efecto de PipX. A, Esquema de la región promotora del operón cox3 en el que se señalan con puntas de flecha negras los TSPs, y las posibles cajas -10 con rectángulos azules. Se representa la posición aproximada de los fragmentos usados en los ensayos EMSA y footprinting (ver Fig. 3.28). Muestras del fragmento a (B) y el fragmento b (C) se incubaron en presencia de NtcA y PipX antes de someterse a electroforesis. Las concentraciones de NtcA usadas se indican en las figuras. Las concentraciones de PipX aparecen indicadas como múltiplos de las correspondientes concentraciones de NtcA. Las puntas de flechas negras señalan las posiciones de los complejos NtcA-DNA. En la parte inferior de las figuras se indica el nº de cada calle. alr2729 caja -10 -563/-98 (alr2729-17-alr2729-18) (a) -272/-8 (alr2729-12-alr2729-13) (b) alr2730 coxB3 coxA3 coxC3 -166 -278 -384 caja -10 caja -10 !" -563/-202 (alr2729-17-alr2729-2b) (c) PipX - - - - - - x2 x6 - x2 x6 NtcA (nM) - 150 300 500 1000 150 500 #" 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 NtcA (nM) - 500 1000 2000 500 PipX - - - - - x2 x6 $" 1 2 3 4 5 6 7 Resultados 133 Figura 3.28. Ensayos de protección por NtcA y PipX frente a la degradación por DNasa I en la región promotora del operón cox3. Los ensayos se llevaron a cabo en presencia o ausencia de las proteínas NtcA y PipX, como se indica, utilizando fragmentos de DNA de la región promotora de alr2729-cox3 amplificados por PCR con los oligonucleótidos: alr2729-17 (marcado con P32)-alr2729-2b (no marcado) (A), alr2729-17 (marcado con P32)-alr2729-18 (no marcado) (B) y alr2729-12 (marcado con P32)-alr2729-13 (no marcado) (C). Concentraciones de NtcA: 230 nM (1), 500 nM (2), 1000 nM (3), 2000 nM (4). Las concentraciones de PipX fueron 2 veces (x2) o 6 veces (x6) superiores a la concentración de NtcA indicada en cada caso, o 3000 nM (5). Las líneas verticales delimitan zonas protegidas por NtcA, zona 1 (verde), zona 2 (azul) y zona 3 (naranja). D) Secuencia de DNA de la región promotora de alr2729-cox3, en la que se señalan las distintas zonas protegidas por NtcA sombreadas con sus colores correspondientes. También se señalan con puntas de flechas las posiciones de los TSPs, las posibles cajas -10 y -35 se resaltan mediante subrayado, y los posibles sitios de unión de NtcA se indican en negrita. PipX - x2 x6 - x2 x6 5 - NtcA 1 1 1 2 2 2 - - NtcA - 2 3 4 - 2 2 2 - - PipX - - - - - - x2 x6 5 - !" NtcA - 3 3 4 - #" $" #" $" !" #" $" %&'" %&'" %&'" %()" *" CAACATCTTTTCCTTTGTGCCTTTGTAGTAAAATACCAAGAAATTGTAACTACAAAGGTGCAA GGATATAGAAATTTAAGACATACATTTTAGATCCTTGCACAAATGATTTAGGTCTTAGATAAG ATTGAAGATACTAAATCAGTTTTTATTGATTAACTTTCCTATTTATTAAATATTGATGGTATT TTTAATTACAAATTAATAATCGATAGATGTTGCTATCGCACACTTAAACAATTCATATATGCA ATATAGTAAAATAGCTAGTAAAGATACATTGTAAAACGATTATTTTTGCTAGTCAGAATATTT TTATCAATTTGTTACAATTACTTTTGACAAGTACTAAAAAAATCCTTAAGCTAATAGATAGGA CTCACCAAATAGCCAGACAGCAGCAATTTTGTTAGATAAATTAAAATCGCTGTTGCAGCGTAT CAGCATGAACAAATAAATTAACCTCAATCATTGACTATAAATAATAGCCTCATCCAATTGGTT GATAACACGGCTGATACTGGCGTGATGGGAATTAGCCGTGTAAATCTGATCAACAAATTCTGG TCATGAGTGAATGCCTATTTCGATGTGAGTAATGTCAATCATTGAAGTTTAGCTGCGGTGCAG TAGATATGTCTAGGAGAGGACAATG Sergio Camargo Bernal 134 3.6. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL FACTOR SIGMA VEGETATIVO SigA DURANTE LA DIFERENCIACIÓN DE HETEROCISTOS EN ANABAENA En Anabaena sp. PCC 7120 se han identificado un factor sigma principal, SigA (Brahamsha y Haselkorn, 1991), y once genes que determinan otros posibles factores sigma, encontrándose representados los grupos I, II, III y IV (apartado 1.1.1.1). Se ha observado que algunos de ellos se expresan transitoriamente durante el proceso de diferenciación de heterocistos, específicamente en las células que se están diferenciando (Aldea et al., 2007). Aunque para la mayoría de estos factores sigma no se ha podido establecer un papel específico, los mutantes de alr4249 (sigE) muestran una expresión anormal de algunos genes de diferenciación (Mella-Herrera et al., 2011). Para que otro factor sigma se asocie al núcleo de la RNAP, éste debe competir con el factor sigma principal, que normalmente presenta mayor afinidad por el mismo. En muchos casos, esto se consigue mediante el secuestro del factor sigma principal por parte de factores anti-sigma o mediante una disminución transitoria de su expresión. Una cuestión crucial para entender si la regulación de la transcripción durante la diferenciación de heterocistos es conocer la evolución de la expresión del factor principal SigA durante este proceso. En estudios previos se había observado mediante análisis de northern blot, la producción de dos transcritos del gen sigA de Anabaena (Brahamsha y Haselkorn, 1991). Mientras que el nivel de uno de ellos permanecía constante durante la diferenciación, la abundancia del otro aumentaba tras incubación en ausencia de nitrógeno combinado (Brahamsha y Haselkorn, 1991). También en dicho trabajo, mediante estudios de extensión de cebadores, se habían determinado cinco posibles TSPs de sigA: en las posiciones -328 respecto al inicio de traducción del gen (P1), -592 (P2), -605 (P3), -800 (P4) y -868 (P5). Mientras que el transcrito con extremo 5’ correspondiente a P 1 presentaba la misma abundancia en presencia y ausencia de nitrógeno combinado, los correspondientes a P2, P4 y P5 aumentaban en abundancia en condiciones de deficiencia de nitrógeno. No obstante, algunos de estos presuntos TSPs pueden corresponder en realidad a productos de procesamiento. Por su parte, el transcrito originado en P3 sólo se detectaba en condiciones de limitación de nitrógeno. Resultados 135 3.6.1. Ánalisis de la expresión de sigA mediante fusión con gfp Los estudios de expresión con RNA aislado de filamentos completos no permitían determinar si el incremento de la cantidad de transcritos de sigA en respuesta a la deficiencia de N tenía lugar en todo el filamento o en células concretas. Para obtener información del patrón de expresión espacio-temporal del gen sigA en Anabaena, se generó una estirpe derivada que expresaba 24 pb del inicio de sigA fusionadas al gen gfp-mut2 dirigidos por la región promotora de sigA (los 1500 pb que preceden al gen). Para generar la construcción sigA-gfp, la región promotora de sigA, PsigA completa (desde la posición -1498 a la +24 respecto al sitio de inicio de la traducción de sigA) se amplificó utilizando DNA genómico de Anabaena como molde y los oligonucleótidos rpoD-3 y rpoD-4 como cebadores (Tabla 2.7). El oligonucleótido rpoD-4, correspondiente al extremo 5’ del gen sigA, introduce una diana EcoRV que permite la fusión traduccional con el gen testigo gfp. El producto de PCR se clonó en el vector pMBL-T (Tabla 2.4), obteniéndose el plásmido pCSSC12. La secuencia de este plásmido se comprobó mediante secuenciación (apartado 2.2.7 de Materiales y Métodos). El fragmento XhoI-EcoRV de pCSSC12, que contiene el promotor de sigA, se introdujo en el vector pCSEL21 (Olmedo-Verd et al,. 2006) previamente digerido también con las enzimas XhoI-EcoRV, obteniéndose la fusión entre el promotor de sigA, los tres primeros codones de SigA, dos nuevos aminoácidos producto de la fusión, los codones 6, 7 y 8 de SigA, y el gen gfp, en un nuevo plásmido denominado pCSSC13. El fragmento KpnI de pCSSC13, que contiene el producto de la fusión se clonó en la diana KpnI del plásmido pCSV3 (Tabla 2.4), originándose el plásmido pCSSC14 (Fig. 3.29). El plásmido pCSSC14 se transfirió mediante conjugación triparental (apartado 2.2.2.2 de Materiales y Métodos), a las estirpes Anabaena sp. PCC 7120, al mutante CSVT20 (patS) y al mutante CSSC2 (hetR). Los exconjugantes se seleccionaron en medio BG110 + NH4Cl, suplementado con 5 µg/ml de Sm y 5 µg/ml de Sp. La integración de pCSSC14 mediante recombinación homóloga en la región cromosómica de sigA daría lugar a una duplicación del promotor sigA, de manera que una copia del PsigA dirigiría la expresión de sigA-gfp y la otra dirigiría la expresión del gen sigA silvestre (Fig. 3.30). Sergio Camargo Bernal 136 Figura 3.29. Representación esquemática de la construcción de pCSSC14. La región promotora de sigA (PsigA) con los 5 TSPs descritos (puntas de flecha negras) se representa en gris. Se indican las dianas de restricción relevantes. Los oligonucleótidos utilizados se representan como triángulos negros y también se indica, entre paréntesis, el plásmido del que deriva cada plásmido no construidos en este trabajo (Ver texto). Se analizó mediante PCR la estructura cromosómica de varios clones resultantes de la transferencia de pCSSC14 a cada una de las estirpes parentales. La integración del gen sigA-gfp se analizó con un oligonucleótido correspondiente a la región promotora de sigA que se mantiene en el gen fusionado (RpoD-5) y un oligonucleótido específico del gen gfp (gfp-4). El tamaño del fragmento de DNA esperado para las estirpes que tuvieran el gen sigA-gfp integrado en su región cromosómica era de 1,6 kb. Además se analizó la segregación de los cromosomas mutantes usando un oligonucleótido de la región promotora de sigA por delante de la región que interviene en la fusión (rpoD-5) y un oligonucleótido interno del gen sigA (rpoD-2). El tamaño del XhoI (pMBL-T) EcoRV pCSSC12 ApR KpnI Clonación en pMBL-T -328 -868 -592 -605 -800 sigA rpoD-4 (EcoRV) rpoD-3 1,5 kb PCR Clonación del fragmento XhoI-EcoRV en pCSEL21 Clonación del fragmento KpnI en pCSV3 XhoI (pIC20R) EcoRV pCSEL21 gfp PsigA XhoI (pIC20R) pCSSC13 KpnI EcoRV gfp PsigA KpnI pCSV3 (pRL500) C.S3 C.S3 KpnI KpnI XhoI EcoRV pCSSC14 (pRL500) gfp PsigA Resultados 137 producto de amplificación rpoD-5/rpoD-2 era de 2,8 kb en la estirpe silvestre, mientras que no se esperaba amplificación en las estirpes con la mutación segregada. Figura 3.30. Representación esquemática de la generación de estirpes portadoras de la construcción sigA-gfp. Representación esquemática de la región cromosómica de sigA en la estirpe Anabaena sp. PCC 7120 (arriba) y la integración del plásmido pCSSC14 por recombinación homóloga. Abajo se representa la región sigA resultante. Se especifica la secuencia de nucleótidos donde se fusionan los genes sigA y gfp, resaltándose los codones de inicio de la traducción de ambos. El resultado obtenido fue que todos los clones analizados portaban la construcción sigA-gfp segregada. Se seleccionó un clon procedente de cada parental, que se denominaron estirpe CSSC3 (sigA-gfp en fondo silvestre), estirpe CSSC4 (sigA- gfp en fondo patS) y estirpe CSSC5 (sigA-gfp en fondo hetR) (Fig. 3.31). all5264 all5263 sigA PsigA all5264 all5263 gfp C.S3 PsigA sigA PsigA KpnI XhoI EcoRV pCSSC14 (pRL500) gfp C.S3 KpnI PsigA Estirpes portadoras de sigA-gfp pCSSC14 Anabaena sp. PCC 7120 !!"!"###""#!!#$#$"##"!$#"$"!"##!$% !"#$% #&'% ()*$%&