Genes car y enzimas de la carotenogénesis en Fusarium fujikuroi

Genes car y enzimas de la carotenogénesis en Fusarium fujikuroi Alfonso Prado Cabrero Tesis Doctoral Universidad de Sevilla 2006 Genes car y enzimas de la carotenogénesis en Fusarium fujikuroi Trabajo realizado en el Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, para optar al grado de Doctor en Biología por el LicenciadoAlfonso Prado Cabrero Sevilla, Octubre de 2006 El doctorando El director de la Tesis Fdo: Alfonso Prado Cabrero Fdo: F. JavierAvalos Cordero, Profesor Titular de Genética 1 1 2 3 3 4 5 5 7 9 9 9 10 11 12 12 13 13 13 14 14 15 16 17 19 19 20 20 21 22 22 23 24 25 27 29 31 33 34 36 37 37 39 40 INDICE INTRODUCCIÓN 1. El organismo: Biología de Fusarium fujikuroi 1.1 El género Fusarium 1.2 Genética de Fusarium 1.3 Estirpes silvestres utilizadas en esta Tesis 1.4Actividad patogénica de F. fujikuroi 1.5 Metabolismo secundario de Fusarium 1.5.1 Los terpenoides 1.5.2 Las giberelinas 1.5.3Agrupamientos génicos 2. Los carotenoides 2.1 Rutas biosíntéticas de carotenoides 2.2 Bases físicas del color de los carotenoides 2.3 Los apocarotenoides 2.4 Funciones de los carotenoides en animales y plantas 2.5 Funciones de los carotenoides en los hongos 3. Las enzimas de la carotenogénesis: rutas biosintéticas y metabolismo 3.1 Desaturasas de carotenoides 3.1.1 Nuevas enzimas de la familia con funciones diferentes a la desaturación 3.1.2 Interés aplicado de las desaturasas de carotenoides 3.1.3 El problema de la regeneración del poder reductor 3.2 Ciclasas de carotenoides y sintasas de fitoeno 3.3 Oxigenasas de carotenoides 3.3.1 Estructura de las dioxigenasas de carotenoides 4. Las opsinas 4.1. Tipos de opsinas 4.2. Cromóforo de las opsinas y su respuesta a la luz 4.3. Proteínas fúngicas de la familia de las opsinas 4.4. Opsinas fúngicas relacionadas con la luz 5. Genética de la carotenogénesis en hongos 5.1. Carotenogénesis en hongos mucorales 5.2. Carotenogénesis en hongos ascomicetos y basidiomicetos 5.3. Síntesis de carotenoides en F. fujikuroi 5.4. Regulación de la carotenogénesis en F. fujikuroi OBJETIVOS DE LATESIS RESULTADOS Resumen CAPÍTULO 1 Caracterización de un mutante carB superproductor de γ-caroteno y β-caroteno 1.1. Fenotipo del mutante SF21 1.2. El alelo carB de SF21 está mutado 1.3. Reemplazamiento de un alelo carB silvestre por el alelo carB36 1.4. Búsqueda de mutantes carB36 en el fondo genético silvestre 1.5. Generación de mutantes carB36 en un fondo superproductor de carotenoides 1.6. Fenotipo de los mutantes carB36 obtenidos por reemplazamiento alélico 1.7. Mutantes derivados de SF21 1.8. Expresión de los genes car en los mutantes del gen carB 1.9. Predicciones estructurales de CarB y ubicación de la mutación carB36 1.10. Discusión CAPÍTULO 2 Secuencia y regulación del gen carO, que determina una proteína de la familia de las opsinas 2.1. El gen carO 2.2. Similitud de CarO con otras proteínas 2.3. Predicciones sobre la estructura de CarO 2.4. Regulación de carO a nivel de ARNm 2.5. Discusión CAPÍTULO 3 Caracterízación del gen carX, que determina una proteína de la familia de las oxigenasas de carotenoides 3.1. CarX es una posible oxigenasa de carotenoides 3.2. Transcripción de carX 3.3. Función del gen carX 3.4. Fenotipo de mutantes ∆carX 3.5. Expresión de los genes car en los mutantes ∆carX 3.6. Discusión CAPÍTULO 4 Determinación de la actividad enzimática de la proteína CarX: síntesis de retinal 4.1. La expresión de carX en células de E. coli altera el fenotipo cuando estas acumulan β-caroteno 4.2. Los cultivos de E. coli productores de β-caroteno que expresan carX contienen retinal 4.3. Producción de retinal libre in vivo 4.4. Espectrometría de masas del producto de CarX in vivo 4.5.Actividad in vitro de la proteína CarX 4.6. Relación entre la producción de retinal y el fenotipo de los mutantes carX 4.7. Discusión CAPÍTULO 5 Identificación del gen carT, que determina la oxigenasa de carotenoides responsable del corte oxidativo de toruleno 5.1. Clonación del gen carT 5.2. El gen carT está mutado en la estirpe productora de toruleno SG68 5.3. CarT es una oxigenasa de carotenoides que corta licopeno in vivo 5.4. CarT convierte el toruleno en β-apo-4´-carotenal (C35) in vitro 5.5. El lugar de rotura de CarT está determinado por la distancia al extremo no ciclado 5.6. CarT muestra preferencia de corte por extremos no oxigenados frente a extremos oxigenados 5.7. El gen carT muestra una regulación común con los otros genes car de F. fujikuroi 5.8 Elementos reguladores en los genes car 5.9. Discusión DISCUSIÓN GENERAL CONCLUSIONES APÉNDICE 40 41 42 44 49 50 50 52 52 54 59 60 61 62 62 64 66 69 70 70 73 73 74 75 77 81 82 82 84 84 85 86 87 89 90 93 99 103 MATERIALY MÉTODOS 1. Estirpes 2. Vectores de clonación y plásmidos auxiliares 3. Plásmidos construidos 4. Medios, soluciones y condiciones de cultivo 4.1 Fusarium fujikuroi 4.1.1. Medios de cultivo para F. fujikuroi 4.1.2. Condiciones de cultivo 4.2. Escherichia coli 5. Mutagénesis de F. fujikuroi con N–metil–N’–nitro–N–nitrosoguanidina. 6. Transformación 6.1. Transformación de F. fujikuroi 6.1.1. Preparación de protoplastos 6.1.2. Transformación 6.2. Transformación de E. coli 6.2.1. Preparación de células competentes 6.2.2 Transformación 7. Extracción y manipulación de ácidos nucleicos 7.1. Extracción de ácidos nucleicos 7.1.1. Extracción deADN plasmídico de E. coli 7.1.2. Extracción deADN genómico de F. fujikuroi 7.1.3. Extracción deADN genómico de F. fujikuroi a pequeña escala 7.1.4. Extracción deARN total de F. fujikuroi 7.2. Cuantificación de la concentración de ácidos nucleicos 7.3. Manipulación enzimática delADN 7.3.1. Digestiones con enzimas de restricción 7.3.2. Relleno de extremos de moléculas deADN 7.3.3. Ligaciones 7.4. Electroforesis de ácidos nucleicos 7.4.1. Electroforesis deADN 7.4.2. Electroforesis deARN 7.5.Aislamiento de fragmentos deADN de geles de agarosa 8. Detección de secuencias deADN y ARN con el sistema DIG 8.1. Detección de secuencias deADN (Southern-blot) 8.1.1. Marcaje de sonda de ADN con DIG-dUTP 8.1.2. Transferencia deADN a la membrana de hibridación 8.1.3. Hibridación de ADN transferido a la membrana 8.1.4. Detección 8.2. Detección de secuencias deARN con el sistema DIG 8.2.1. Obtención y marcaje de sondas 8.2.2. Transferencia deARN a la membrana de hibridación 8.2.3. Hibridación y detección de ARN transferido a membranas 9. Reacciones de PCR 9.1. Enzimas utilizadas 9.2. Condiciones de la reacción 10.Análisis de proteínas 10.1. Extracción y purificación de proteínas expresadas en E. coli 10.1.1. Preparación e inducción del cultivo 10.1.2. Extracción de proteínas y purificación 10.1.3. Tratamiento con Trombina 107 108 108 109 111 111 111 112 112 113 113 113 113 113 114 114 114 114 114 114 115 115 115 115 116 116 116 116 116 116 117 117 117 117 117 118 118 118 118 118 119 119 119 119 119 121 121 121 121 121 122 122 123 123 123 123 123 124 124 124 124 125 125 125 125 125 126 126 126 126 127 10.1.4. Fraccionamiento de proteínas en geles desnaturalizantes (SDS-PAGE) 10.2. Ensayos in vitro 11.Análisis de carotenoides 11.1.Análisis de carotenoides de F. fujikuroi 11.1.1. Extracción y análisis del espectro crudo de las muestras 11.1.2. Separación de carotenoides neutros y polares 11.1.3. Cromatografía en capa fina (TLC) 11.1.4. Cromatografía de alta presión (HPLC) 11.2.Análisis de carotenoides de E. coli 11.2.1. Protocolo básico de extracción 11.2.2. Extracciones modificadas de carotenoides 11.2.2.1.Acetilación de retinol 11.2.2.2. Extracción con formaldehido 11.2.2.3. Extracción con hidroxilamina 11.2.3.Análisis de Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (CG-EM) 12. Informática 12.1. Escritura, cálculo y dibujo 12.2.Análisis de secuencias deADN 12.3. Similitud con secuencias publicadas en las bases de datos 12.4. Predicción de estructura secundaria BIBLIOGRAFÍA Introducción 1. El organismo: Biología de Fusarium fujikuroi 1.1. El género Fusarium El género Fusarium, definido por Link en 1809 (Booth, 1971), recoge numerosos hongos imperfectos con esporas fusiformes, denominadas conidios. Muchos de ellos son patógenos de plantas con interés económico, lo que ha estimulado la atención de los investigadores (Booth, 1971). Se denominan hongos imperfectos aquellos en los que no se ha observado ciclo sexual, de manera que se carece de la base para clasificarlos dentro de algunos de los grandes grupos de hongos, definidos originalmente por las estructuras sexuales características en su ciclo de vida (ascas, basidios, oosporas o zigosporas). Siguiendo un mal hábito sin fundamento genético, los taxónomos cambian el nombre de las especies de hongos imperfectos que desarrollan ciclo sexual en laboratorio. La mayoría de las estirpes del género Fusarium con ciclo sexual se renombraron como Nectria,Calonectria yGibberella, pertenecientes al orden Hypocreales, a la subclase Ascomycotina y a la clase Euascomycetes (Nelson et al., 1983). A esta clase pertenecen también los géneros Neurospora,Aspergillus y Saccharomyces. Los taxónomos han reconocido en el género Gibberella 15 especies distintas (Nelson et al., 1983), entre ellas G. pulicaris,G. zeae, G. subglutinans yG. fujikuroi. Esta última tiene su origen en el hongo imperfecto Fusarium moniliforme, incluido en la sección parafilética Liseola (Kuhlman, 1982). Gibberella fujikuroi es un hongo haplonte y heterotálico con un sistema sexual con dos alelos (+) y (-) de un único gen (Steenkamp et al., 2000). Esta especie constituye realmente un grupo de especies (species complex) separables por criterios genéticos y moleculares. Los criterios genéticos (compatibilidad sexual) han distinguido al menos nueve grupos de cruzamiento, denominados con letras desde la A a la I (Tabla I). Cada una de estas especies parasita preferentemente una especie de planta (Kuhlman, 1983; Leslie, 1991; Voigt et al., 1995). Los criterios moleculares, basados en la comparación de diferentes tipos de secuencias altamente conservadas, han confirmado estas diferencias y han permitido asignar nombres definitivos a las especies del grupo, englobadas todas bajo el género Fusarium (O‘Donnell et al., 1998). La especie objeto de estudio en esta Tesis es la correspondiente al grupo de xxx Tabla 1. Especies de Fusarium pertenecientes al “complejo Gibberella fujikuroi”, dentro del cual constituyen el grupo de cruzamiento indicado. Se indican en la tercera columna las referencias donde se definió su nombre como especie y en la cuarta columna referencias anteriores a su nombramiento como especie independiente por O‘Donnell et al. (1998) Grupo de cruzamiento Especie referencia referencia anterior Averticillioides O‘Donnell et al 1998 Wineland, 1924 Bsacchari “ Nelson et al., 1983 Cfujikuroi “ Nirenberg, 1976 Dproliferatum “ Kuhlman, 1982 Esubglutinans “ Nelson et al., 1983 Fthapsicum “ Klittich et al., 1997 Gnygamai “ Klaasen y Nelson, 1996 Hcircinatum Britz et al., 1999 Ikonzum Zeller et al., 2003 Introducción 2 cruzamiento C del complejo, denominada Fusarium fujikuroi. Esta estirpe destaca entre las demás por su capacidad de producir giberelinas, hormonas vegetales descritas en el apartado 1.5.2. 1.2 Genética de Fusarium El ciclo sexual de Fusarium se reproduce en condiciones de laboratorio añadiendo conidios de la estirpe de sexo (+) sobre micelio de la estirpe (-) cultivada en un medio apropiado (Sidhu, 1983a; Klittich y Leslie, 1988). Tras varios días de incubación se forman los peritecios, estructuras especializadas en las que se desarrollan tétradas con ascosporas desordenadas. En Fusarium se han descrito estirpes heterocariontes, aisladas de la naturaleza (Sidhu, 1983a; 1983b) o conseguidas en el laboratorio tanto por anastomosis (Ming et al., 1966; Correll et al., 1987; Adams et al., 1987) como por fusión de protoplastos (Adams et al., 1987). Es frecuente la incompatibilidad vegetativa o incapacidad de formar heterocariontes de unas estirpes con otras (Puhalla y Spieth, 1983; 1985), y la autoincompatibilidad, o incapacidad de formarlos con ella misma (Correll et al., 1989). Fusarium se reproduce asexualmente mediante esporas denominadas conidios (Fig. I.1). Se distinguen dos tipos de conidios: los microconidios, pequeños, fusiformes y uninucleados (Avalos et al., 1985), y los macroconidios, más grandes, arqueados, tabicados y presumiblemente multinucleados (Kuhlman, 1983). Las estirpes empleadas en esta Tesis prácticamente solo producen microconidios, un carácter habitual en F. fujikuroi. La presencia en los microconidios de un solo núcleo facilita el aislamiento de estirpes con mutaciones recesivas (Avalos et al., 1985), y su exposición a diversos agentes mutagénicos, físicos o químicos, produce elevadas tasas de mutación (Puhalla y Spieth, 1983;Avalos et al., 1985; Koelblin et al., 1990). 1.3. Estirpes silvestres utilizadas en esta Tesis La mayor parte del trabajo previo sobre la síntesis de carotenoides de F. fujikuroi, tema de esta Tesis, se ha llevado a cabo con la estirpe silvestre IMI58289. Recientemente, el grupo de investigación ha extendido sus investigaciones a una segunda estirpe silvestre de la misma especie, FKMC1995, utilizada como patrón de cruzamiento del grupo C. Esta estirpe presenta ventajas sobre IMI58289 como objeto de investigación, ya que esta última muestra una baja capacidad de esporulación, una limitada fertilidad sexual y autoincompati-bilidad vegetativa. La estirpe silvestre FKMC1995, por el contrario, es sexualmente fértil (Leslie, 1991) (Fig. I.2), conidia abundantemente y sus hifas fusionan espontáneamente para formar heterocariontes, permitiendo los análisis de complementación. Además, presenta una elevada capacidad de producir giberelinas (Oller-López et al., 2003) y su carotenogénesis es equivalente a la de la estirpe IMI58289 tanto en los carotenoides producidos como en su regulación. En esta Tesis se ha usado una u otra estirpe en función de lo que aconsejaran los experimentos y, en su caso, han sido objeto de comparación. Se ha utilizado también para propósitos puntuales la estirpe silvestre de F. fujikuroi m567, de características más parecidas a IMI58289 que a FKMC1995. Esa estirpe fue elegida por su capacidad de producción de giberelinas como modelo de trabajo por el grupo de la Dra. B. Tudzynski en la Universidad de xxx Fig. I.1 Conidios de F. fujikuroi.Los núcleos fueron teñidos con mitramicina y visualizados por fluorescencia (Avalos et al., 1985). Introducción Fig. I.2. Peritecios procedentes del cruzamiento de dos estirpes derivadas de FKMC1995 3 Fig I.8. Carotenoides producidos por F. fujikuroi. El recuadro indica la extensión del cromóforo. Se indica además el espectro de absorción (250-550 nm) así como la longitud de onda de máxima de absorción. 419 440 470 407 430 355 289 381 401 426 (427) 452 479 437 462 492 458 486 518 O OH 473 332 350 369 Lincoln (Porter y Lincoln, 1950), está presente en diversos hongos mucorales, como Phycomyces blakesleeanus (Cerdá-Olmedo, 1987), Mucor circinelloides (Fraser et al., 1996) o Blakeslea trispora (Mehta et al., 2003), éste último empleado para su producción a escala industrial (Avalos y Cerdá-Olmedo, 2004). La ruta de Porter y Lincoln también se ha encontrado en hongos de otros grupos taxonómicos, como los ascomicetos Aspergillus giganteus (El-Jack et al., 1988) o Cercospora sp. (Norman, 1991; Ehrenshaft y Daub, 1994). No es inusual, sin embargo, que las rutas biosintéticas difieran de este modelo. Así, por ejemplo, la síntesis de astaxantina en el basidiomiceto Xanthophyllomyces dendrorhous, anteriormente conocido como Phaffia rhodozyma (Johnson y Lewis, 1979) requiere dos reacciones enzimáticas adicionales sobre los dos anillos del β-caroteno. Una actividad cetolasa introduce grupos ceto y una actividad hidrolasa introduce grupos hidroxilo, dando lugar a la astaxantina, una xantofila de interés biotecnológico. En este hongo ambas actividades enzimáticas las lleva a cabo un solo producto génico (Ojima et al., 2006) La astaxantina es un ejemplo representativo de los carotenoides oxigenados o xantofilas. Estas son estructuralmente muy heterogéneas, y se conocen numerosos ejemplos en bacterias, algas y plantas. Entre ellos figuran el esferoideno y el esferoideneno en Rhodobacter, el ceto-toruleno y la mixobactona en Myxococcus, la criptoxantina y la zeaxantina en Erwinia, o la zeaxantina y la equinona en diversas cianobacterias (revisado por Armstrong, 1997). El producto principal de la carotenogénesis de F. fujikuroi es una xantofila, la neurosporaxantina (Fig. I.8) (Aasen y Jensen, 1965), descubierta previamente en el ascomiceto N. crassa. 2.2. Bases físicas del color de los carotenoides Los carotenoides son conocidos por sus atractivos colores, habitualmente desde el amarillo hasta el rojo. Su diversidad de colores se debe a pequeñas xxxx 10 Introducción γ-caroteno β-caroteno toruleno neurosporaxantina ζ-caroteno fitoeno fitoflueno neurosporeno β-zeacaroteno 2.3.Apocarotenoides Los apocarotenoides son moléculas procedentes de reacciones de corte o rotura oxidativa de carotenoides (ver apartado 3.3). Distintos apocarotenoides o moléculas derivadas juegan papeles relevantes en el control del crecimiento celular y el desarrollo en plantas, animales y organismos inferiores. El ejemplo más evidente en plantas es el ácido abscísico (ABA), hormona necesaria para el desarrollo de la semilla y la adaptación a cambios ambientales (Leung et al., 1998). La síntesis del ácido abcísico tiene su arranque en la rotura asimétrica de un carotenoide, la 9-cis-violaxantina. Otros apocarotenoides producto de rotura asimétrica son la β-ionona, el β-ciclocitral o el safranal, entre otros (Giuliano et al., 2003; Auldridge et al., 2006). Sus funciones son muy diversas, incluyendo la quimioatracción, o la proporción de aromas o sabores. Una categoría particularmente importante dentro de los apocarotenoides son los retinoides, derivados principalmente del corte del β-caroteno. Entre los retinoides más relevantes figuran el retinal y el ácido retinoico. El retinal es el cromóforo que hace posible la detección de luz por las proteínas de la visión, las opsinas (Filipek et al., 2003), presentes en la retina de los animales (Morriss-Kay y Ward, 1999). Como consecuencia, la ausencia persistente de β-caroteno en la dieta puede producir ceguera. De manera similar, el retinal unido a opsinas es responsable de la fototaxis en algas verdes (Foster et al., 1984), bacterias y arqueas (Spudich, 2006), así como del bombeo de protones (Bibikov et al., 1993). Por su parte, el ácido retinoico es un morfógeno crítico en el desarrollo de los cordados (Marletaz et al., 2006). La alteración en los niveles de ácido retinoico durante el desarrollo embrionario temprano produce malformaciones en el feto, que afectan especialmente a la determinación de su eje antero-posterior. El β-caroteno es también fuente de otros retinoides mediante rotura asimétrica. Entre ellos figuran la β-ionona y el β-10´-apocarotenal en vertebrados, apocarotenoides cuya función biológica aun no ha sido establecida (Kiefer et al., 2001). variaciones en su estructura química (Kohler, 1995). Todos los carotenoides comparten un esqueleto formado por una cadena poliénica que contiene un número variable de dobles enlaces conjugados. Este segmento de la molécula es el cromóforo, que contiene electrones deslocalizados. Cuanto más extensa es la región de dobles enlaces conjugados, menos energía es necesaria para que sean excitados los electrones. Así, un número reducido de dobles enlaces conjugados solo absorbe luz de alta energía, en la región UV del espectro, y por tanto no confieren color. Sin embargo, si el cromóforo es suficientemente extenso, absorbe fotones de menor energía, entrando ya en la región visible del espectro y confiriendo color a la molécula (Fig. I.8). El cromóforo es responsable también de la capacidad de neutralizar especies reactivas de oxígeno y, por tanto, de las propiedades antioxidantes de los carotenoides (ver Apartado 2.4). La presencia de anillos en los extremos de la molécula acorta la región poliénica y eleva sensiblemente la energía necesaria de los fotones para poder interaccionar con la molécula. A ello se debe, por ejemplo, la diferencia de color entre el licopeno y el β-caroteno, siendo el primero capaz de absorber fotones de energía ligeramente inferior, dando lugar a su típico color rojo. 11 Introducción 2.4. Funciones de los carotenoides en animales y plantas Los carotenoides se encuentran en la inmensa mayoría de los seres vivos, incluso cuando no son capaces de sintetizarlos, como ocurre con los animales. La mayor parte de los carotenoides presentes en la naturaleza se encuentran en plantas y algas, aunque su presencia es enmascarada por la clorofila. Su función en organismos fotosintéticos es actuar de pigmentos fotorreceptores, absorbiendo la luz y transfiriéndola en forma de energía a los centros de reacción de la fotosíntesis (Edge et al., 1997). La importancia de este papel la pone en evidencia el efecto herbicida de los inhibidores de las enzimas de la carotenogénesis. Los carotenoides pueden jugar un papel secundario como pigmentos. En las plantas proporcionan colores llamativos a flores y frutos facilitando su atracción sobre los animalesy, en consecuencia, la polinización o la dispersión de semillas. En algunos animales, como crustáceos, peces y aves, la ingesta de carotenoides es necesaria para adquirir su pigmentación, que puede jugar un papel importante en su etología, por ej. en la atracción sexual (Faivre et al., 2003; Blount et al., 2003). Además del papel jugado en la apariencia de animales y plantas, los carotenoides tienen otras funciones derivadas de sus especiales características químicas. Al ser pigmentos hidrofóbicos se localizan en las membranas celulares, regulando su fluidez. Poseen además propiedades antioxidantes que les permiten neutralizar singletes de oxígeno molecular (Conn et al., 1991) y radicales generados en la peroxidación lipídica (Sies y Stahl, 1995). Además actúan sinérgicamente con otras vitaminas como protectores ante la fotooxidación (Edge et al., 1997; Stahl y Sies, 2002).Aesta actividad antioxidante se atribuye el papel supuestamente beneficioso que el consumo de carotenoides puede ejercer sobre la salud humana, que incluye protección frente al cáncer (Giovannucci et al., 1995; Rao et al., 1999) o mejora de la respuesta inmunológica (Jyocouchi et al., 1991). En el caso de la especie humana, los carotenoides, muy especialmente el βcaroteno (provitamina A), son importantes para la salud, existiendo sistemas específicos de asimilación y enzimas encargadas de su metabolismo (Von Lintig et al., 2005). Los tejidos animales retienen cantidades considerables de diferentes carotenoides, como el licopeno, la zeaxantina y la luteina, que unen su efecto antioxidante al del β-caroteno. Además, la zeaxantina y la luteina están presentes en la región central de la retina, la denominada mácula lútea, donde ejercen de filtro de protección de las células de la retina y disminuyen la aberración cromática (Snodderly et al., 1995; Landrum y Bone, 2001). La deficiencia en el consumo de luteína está asociado con diferentes anomalías de la visión que pueden derivar en ceguera, como las cataratas o la degeneración macular (Moeller et al., 2000). 2.5. Funciones de los carotenoides en los hongos La función de los carotenoides en los hongos no se ha establecido con claridad, pero numerosas observaciones experimentales sugieren que su papel principal es la proteccción frente a la oxidación (Gessler et al., 2002; Ligusa et al., 2005). La luz aumenta el estrés oxidativo de la célula, lo que puede explicar la frecuente regulación por la luz de la carotenogénesis en estos organismos (Avalos et al., 1993). En los casos investigados, los carotenoides no parecen ser xxx 12 Introducción usados como cromóforo responsable de fotorrespuestas, tales como la inducción de la conidiación o de la propia síntesis de carotenoides. El descubrimiento reciente de proteínas de la familia de las opsinas en hongos ha abierto nuevas perspectivas sobre las funciones de los carotenoides en este grupo taxonómico, ya que, como se ha indicado anteriormente, muchas de estas proteínas requieren retinal para ser funcionalmente activas. Hasta la fecha no se ha identificado ningún gen de hongos implicado en la síntesis de apocarotenoides. Ciertos zigomicetos, como B. trispora oP. blakesleeanus emplean como hormonas sexuales moléculas derivadas de apocarotenoides. Estas hormonas, llamadas ácidos trispóricos, se sintetizan a partir del β-caroteno (Austin et al, 1970). Por ese motivo, los mutantes de P. blakesleeanus bloqueados en la ruta biosintética son sexualmente incompetentes (Sutter, 1975). 3. Enzimas de la carotenogénesis: rutas biosintéticas y metabolismo 3.1. Desaturasas de carotenoides Como ya se mencionó en el apartado 2.1, las desaturasas de carotenoides introducen dobles enlaces de carbono en las rutas biosintéticas de estos pigmentos. Los miembros más conocidos de esta familia de enzimas son las desaturasas de fitoeno, que introducen 2, 3, 4 ó 5 desaturaciones a lo largo de la ruta empezando por este sustrato. Otras desaturasas utilizan como sustrato solo carotenoides que ya han sufrido desaturaciones por medio de una primera desaturasa. Entre sus sustratos figuran el ζ-caroteno (Linden et al., 1994), el hidroxineurosporeno (Albrecht et al., 1997), el metoxineurosporeno (Albrecht et al., 1997), el dehidroescualeno (Wieland et al., 1994) o el propio β-caroteno (Schumann et al., 1996). A nivel de secuencia existe considerable variación entre estas enzimas y la similitud entre aquellas pertenecientes a distintos grupos taxonómicos puede llegar a ser muy baja. La mayor divergencia se encuentra entre las desaturasas de fitoeno de bacterias y de plantas (Pecker et al., 1992; Sandmann, 1994). En base a sus notables diferencias, se ha postulado que ambos tipos de desaturasas tienen origenes evolutivos distintos, y que sus similitudes se deben a necesidades estructurales para catalizar la misma reacción enzimática. 3.1.1. Nuevas enzimas de la familia con funciones diferentes a la desaturación Recientemente se han clonado y caracterizado dos proteínas con evidente parecido a las desaturasas de carotenoides pero con otras funciones enzimáticas. La primera de ellas, llamada CRTISO, fue descrita en paralelo por dos grupos (Isaacson et al., 2002 y Park et al., 2002). Esta enzima produce licopeno en el tomate a partir de prolicopeno (7Z,9Z,7Z,9Z-tetracis-licopeno) mediante una reacción de isomerización. La similitud de secuencia de la CRTISO con las desaturasas ha llevado a postular que su mecanismo de acción consiste en una reacción de saturación, un giro a través del enlace simple generado y la restitución del estado anterior mediante una desaturación (Giuliano et al., 2002) (Fig. I.9). Desaturasa de carotenoides Isomerasa de prolicopeno (CRTISO) Saturasa de retinal (RetSat) Fig I.9. Representación esquemática de las reacciones catalizadas por las desaturasas de carotenoides, isomerasa de prolicopeno (CRTISO) y saturasa de retinal (RetSat) 13 Introducción La secuencia de la CRTISO permitió la identificación de otra enzima, abreviada RetSat (Moise et al., 2004), que lleva a cabo una reacción de saturación sobre retinol todo-trans en vertebrados. Todavía no se conoce el papel biológico del producto de esta reacción, el 13,14-dihidroretinol todo-trans. A pesar de pertenecer a organismos superiores, las secuencias de estas dos enzimas son más parecidas a las de las desaturasas de bacterias y hongos que a las de plantas, lo que sugiere su procedencia por transmisión horizontal. Por otro lado, la existencia de proteínas de esta familia con funciones distintas a las reacciones de desaturación, como la isomerización o la saturación (Fig. I.9), indica una versatilidad y diversidad funcional mayor de lo que los datos disponibles hasta hace poco permitían anticipar. Tanto las desaturasas de carotenoides como estas nuevas enzimas de la misma familia comparten dos dominios en los que la similitud de secuencia es marcadamente más alta que en el resto de la proteína. El primero de ellos es el dominio de unión de dinucleótido (Armstrong et al., 1990; Bartley et al., 1990). Se trata de un corto segmento en la región del extremo amino de la proteína que une el cofactor (FAD ó NAD), necesario para que se lleve a cabo la reacción de desaturación (ver apartado 3.1.3). El segundo es el dominio de unión de caroteno (Armstrong et al., 1989), localizado en la región del extremo carboxilo. 3.1.2. Interés aplicado de las desaturasas de carotenoides Las desaturasas de carotenoides, especialmente las que actúan sobre el fitoeno,hansidoobjeto deconsiderableatenciónporparte de los investigadores. El motivo principal es de tipo económico, pues la desaturasa de fitoeno de plantas es la diana de numerosos herbicidas comercialmente importantes (Bramley, 1994). Además, esta enzima se considera un factor limitante en la síntesis de carotenoides en plantas; al ser estos compuestos importantes en la maduración del fruto o la semilla, se ha tratado de aumentar su actividad (Chamovitz et al., 1993; Al-Babili et al., 2006). En tercer lugar, dado el interés aplicado de los carotenoides en medicina, alimentación animal, colorantes y suplementos vitamínicos, se ha investigado en el campo de su producción industrial. Un hito importante en la metodología de los estudios bioquímicos de la carotenogénesis es el uso de E. coli como vehículo de expresión heteróloga de genes relevantes. Expresando los genes bajo los elementos reguladores apropiados, se han desarrollado estirpes de E. coli capaces de sintetizar carotenoides, facilitando enormemente los ensayos de actividades enzimáticas de esta ruta. Esto ha permitido enfoques experimentales más sofisticados, como la realización de estudios de evolución dirigida de las desaturasas (Schmidt- Dannert et al., 2000; Wang et al., 2001). 3.1.3. El problema de la regeneración del poder reductor Como se ha descrito en el apartado anterior, las desaturasas de carotenoides utilizan un cofactor para aceptar los protones que se liberan del carotenoide cuando éste es desaturado. En esta Tesis utilizamos el término desaturación en lugar de deshidrogenación porque no se conoce el cofactor utilizado ni el mecanismo por el que se lleva a cabo este proceso. Si bien parece que el cofactor preferido por las desaturasas bacterianas (Fraser et al., 1992; Raisig et al., 1996; Dailey y Dailey, 1998) y vegetales (Hugueney et al., 1992; Al-Babili et al., 1996) xx 14 Introducción Reacciones de desaturación (CDS) Fitoeno Licopeno PQ PQH2 e-PTOX O2 H2O X es el FAD, existen indicios de que en hongos (Haussmann y Sandmann, 2000) y cianobacterias (Schneider et al., 1997) el cofactor es el NAD. Incluso se ha sugerido para algunas enzimas que el aceptor no es ninguno de estos cofactores, sino el oxígeno molecular (Albrecht et al., 1997; Schneider et al., 1997) Tampoco se sabe cómo se regenera el cofactor utilizado (FAD o NAD) para poder aceptar un nuevo par de protones de la siguiente desaturación. Se ha sugerido que en el caso del FAD, éste se mantiene unido a la proteína (Al-Babili et al., 1996), de forma que deberían existir otras proteínas que le asistan para la renovación del poder reductor. Se ha demostrado que en plantas este agente regenerador es la plastoquinona (Norris et al., 1995), equivalente vegetal de la ubiquinona. También se ha caracterizado la enzima que deshidrogena la plastiquinona, llamada PTOX (Plastid Terminal Oxidase) (Carol y Kuntz., 1999; Wu et al., 1999), que acopla la deshidrogenación de la plastoquinona a la reducción del oxígeno molecular (Josse et al., 2000) (Fig. I.10). Se ha postulado la intervención de una proteína o complejo multiproteico en la transferencia de los electrones a la plastoquinona (Nievelstein et al., 1995). Finalmente, se ha propuesto que las reacciones de desaturación de los carotenoides están acopladas al proceso de clororrespiración (Bennoun, 2001), asociado a los cambios en el estado redox de la plastoquinona. 3.2. Ciclasas de carotenoides y sintasas de fitoeno La ciclación de carotenoides es llevada a cabo en diferentes grupos filogenéticos por al menos dos tipos de enzimas. En organismos con carotenogénesis oxigénica, el gen de la ciclasa se ha denominado crtL, y en aquellos con carotenogénesis no oxigénica, crtY olyc. Ambos tipos de ciclasa son muy diferentes en secuencia, aunque conservan tres pequeños dominios conservados. Contienen además regiones hidrofóbicas correspondientes probablemente a dominios transmembranales (Armstrong, 1997; Sieiro et al., 2003). Se conocen representantes de crtY ocrtL en eubacterias, algas y plantas, pero no en hongos. Los intentos de identificar el gen responsable de la ciclasa en hongos por similitud con las ciclasas mencionadas fracasaron, retrasando el estudio de esta enzima en este grupo taxonómico. La primera ciclasa fúngica se identificó en el basidiomiceto X. dendrorhous (Verdoes et al., 1999a). La nueva enzima, denominada CrtYB y descubierta mediante expresión del gen en una estirpe de E. coli productora de licopeno, resultó ser muy similar a la proteína Al-2 de N. crassa, identificada previamente como sintasa de fitoeno en este hongo. Esta proteína resultó ser por tanto bifuncional, pues cataliza tanto la síntesis de xxxxx Fig. I.10. Reacciones en el cloroplasto destinadas a regenerar el poder reductor necesario para la actividad de las desaturasas de carotenoides. PQ, plastoquinona, PTOX, Plastid Terminal Oxidase. Adaptado de Carol y Kuntz (1999). 15 Introducción fitoeno como la ciclación de licopeno. La actividad ciclasa del gen bifuncional fue posteriormente confirmada en otros hongos, como M. circinelloides (Velayos et al., 2000) y P. blakesleeanus (Arrach et al., 2001), o el mismo N. crassa (Schmidhauser et al., 1994). Los dos dominios de la proteína son distinguibles por su hidrofobicidad, mayor en el caso de la ciclasa, que se encuentra en la región del extremo amino. Las comparaciones de secuencia sugieren que el dominio sintasa de fitoeno es similar a la sintasa de fitoeno de organismos fotosintéticos y también a la sintasa de escualeno. Por su parte, el dominio responsable de la actividad ciclasa de licopeno no guarda similitud con CrtY o con CrtL, pero sí con dos proteínas presentes en Brevibacterium linens yMyxococcus xanthus. Estas proteínas están determinadas por dos genes contiguos, y su similitud de secuencia sugiere que se originaron por una duplicación génica (Krubasic y Sandmann, 2000). Particularmente interesante es la organización génica en Halobacterium salinarum, donde ambas proteínas son determinadas por un mismo gen que incluye un nuevo segmento transmembrana que mantiene unidos a los dos dominios y les permite mantener su topología (Peck et al., 2002). Estos datos sugieren una posible relación evolutiva entre las ciclasas de licopeno de bacterias y hongos. Primeramente una duplicación y posterior fusión habría dado lugar a la ciclasa de licopeno de H. salinarum. Seguidamente, el gen bifuncional de hongos podría haberse originado por la fusión de la ciclasa de licopeno de arqueas con una sintasa de fitoeno (Arrach et al., 2001; Peck et al., 2002; Velayos et al., 2000b; Verdoes et al., 1999a). 3.3. Oxigenasas de carotenoides Las oxigenasas de carotenoides constituyen una familia de enzimas con más de 100 miembros conocidos. La primera enzima identificada en esta familia fue el producto del gen viviparous14 (VP14) de maiz, una oxigenasa de 9´-cis- epoxicarotenoides que corta la 9-cis-violaxantina para producir el precursor de la hormona vegetal ácido abscísico (Fig. I.11A) (Schwartz et al., 1997). Este trabajo pionero facilitó el subsiguiente descubrimiento de nuevas enzimas de la misma familia. Entre ellas figuran otras oxigenasas de carotenoides de plantas, en algunos casos implicadas en la producción de apocarotenoides de valor comercial, como el azafrán (Bouvier et al., 2003a) o la bixina (Bouvier et al., 2003b). Una consecuencia importante del descubrimiento de estas enzimas fue la identificación de oxigenasas de carotenoides en animales, especialmente la βcaroteno-15,15´-oxigenasa (BCO-I, Fig. I.11B), que corta β-caroteno simétricamente para dar dos moléculas de retinal (Von Lintig et al., 2000; Wyss et al., 2000; Redmon et al., 2001). Otra enzima de vertebrados, la BCO-II, corta asimétricamente el β-caroteno para producir β-ionona (Kiefer et al., 2001). No todos los miembros de la familia cortan carotenoides. Un ejemplo lo constituye la RPE65, proteína que juega un papel indispensable en la visión recogiendo el re-tinal todo trans de la membrana y transfiriendolo a la proteína que lo isomeriza a 11-cis retinol para cerrar el ciclo visual (Mata et al., 2004). La mayoría de estas enzimas se distribuyen en 5 subfamilias. Dos de ellas comprenden proteínas dedicadas al metabolismo de carotenoides en plantas: corte de dobles enlaces 9,10 y 9´,10´ de diferentes carotenoides (Schwartz et al., 2001) y oxigenasas de 9-cis epoxicarotenoides, que cortan epoxi-xantofilas en la ruta del ácido abscísico (Taylor et al., 2000), mencionada arriba. Otras dos subfamilias engloban enzimas de animales implicadas en el metabolismo de la xxxxxxxxxxxxxxxxxx 16 Introducción Fig. I.11. Reacciones características de los miembros de tres subfamilias representativas de oxigenasas de carotenoides. 4,4'-dihidroxi-3,3'- dimetoxiestilbeno OH HO H C-O 3 O-CH 3 O 2 x vanillina O O2 HO H C-O 3 OH O-CH 3 lignostilbeno-α,β oxigenasa β-caroteno 2 x retinal O2 O O β,β-caroteno-15,15' oxigenasa O O OH Xantoxina HO O OH O aldehido apo-alénico C25 HO 9-cis neoxantina OH O2 9-cis-epoxicarotenoide oxigenasa OH vitamina A: 15,15´ oxigenasas que convierten el β-caroteno en dos moléculas de retinal (von Lintig y Wyss 2001) y proteinas del grupo de RPE65 (Redmond et al., 1998). Este último grupo incluye también enzimas animales que cortan carotenoides de forma asimétrica (Kiefer et al., 2001). El último grupo está formado por las lignostilbeno-α,β-oxigenasas bacterianas (Fig. I.11C). Estas enzimas cortan lignostilbeno, empleado como modelo bifenólico de lignina, y otras moléculas relacionadas (Kamoda et al., 2003). Este compuesto, químicamente distante de los carotenoides, tiene un doble enlace central similar al doble enlace que cortan las oxigenasas de carotenoides, aunque no en el contexto de un sistema de dobles enlaces conjugados. Todas las enzimas de la familia con actividad de corte dejan en los extremos de los productos un grupo aldehido (Fig. I.11 y 12). 3.3.1. Estructura de las oxigenasas de carotenoides Todos los miembros de la familia de las oxigenasas de carotenoides presentan similitudes significativas a nivel de secuencia. Entre ellas destacan 4 histidinas estrictamente conservadas en su secuencia primaria y una especial abundancia en láminas βen las estructuras secundarias predichas. Esto hace pensar que todas estas proteínas comparten la misma estructura tridimensional. Recientemente se ha purificado y cristalizado una proteína de esta familia, la apocarotenoide-15,15‘-oxigenasa de Synechocystis sp. (conocida como ACO), y se ha determinado su estructura tridimensional (Kloer et al., 2005). Dicha estructura está formada por una hélice compuesta de 7 hojas, con 4 histidinas en el eje de la hélice que median la unión de un átomo de Fe2+. Cada hoja la forman varias láminas βantiparalelas (cuatro láminas las hojas 2, 3 y 4, y cinco láminas las hojas 1 y 5), situandose las histidinas en las láminas βmás internas de la xxxx 1 2 345 6 7 9 11 13 15 14´ 12´ 10´ 8´ 6´ 4´ 2´ 8 10 12 14 15´ 13´ 11´ 9´ 7´ 5´ 3´ 1´ β-apo-4´-carotenal β-apo-8´-carotenal β-apo-10´-carotenal O O O Fig. I.12. Nomenclatura y ejemplos de apocarotenales. Se muestran tres apocarotenales producto de corte de oxigenasas de carotenoides. AB C 17 Introducción AB C función es la de vía de acceso para el oxígeno, necesario para la reacción de rotura oxidativa. Las oxigenasas de carotenoides discriminan el sustrato a nivel de entrada en la proteína por medio de constricciones en la abertura, la cual se situa adyacente al dominio de unión a membrana (Fig. I.14). La proximidad de ambos dominios facilita el acceso del sustrato desde la membrana (Kloer et al., 2005; Schezinger et al., 2006). Presumiblemente, todos los miembros de esta familia conservan los aspectos básicos de esta estructura y poseen centros activos similares que llevan a cabo xxx Fig. I.14. Estructura tridimensional de la enzima NosACO. A. Representación de superficie mostrando el lugar de entrada del carotenoide y el dominio de unión a membrana, que se destaca en verde. B. Corte de la proteína que muestra el tunel de unión y corte de sustrato. Se indica con flechas la constricción que evita la entrada de carotenoides ciclados. Se señala con un círculo la posición del átomo de Fe2+ responsable de la reacción de corte. C. Vista ampliada de la constricción con un carotenoide ciclado a escala. Se aprecia la imposibilidad de éste para entrar en la proteína. Adaptado de Schezinger et al. (2006). hélice. Los giros de la parte superior de la hélice son muy largos, formando una gran cúpula sobre el centro activo. Los giros en la parte inferior en general son más cortos. La superficie de la cúpula, un dominio apolar formado en su mayoría por leucinas y fenilalaninas, se ha propuesto como la parte de la proteína que se introduce en la membrana, por donde entraría el sustrato, fuertemente apolar (Fig. I.13 y I.14). El análisis de la estructura sugiere por tanto que se trata de una proteína de membrana monotópica (penetra solo la mitad de la bicapa lipídica), como se ha sugerido para otra proteína de la ruta, la desaturasa de carotenoides (Schmidt y Sandmann, 1990). La enzima ACO contiene un túnel que se extiende hacia el interior de la proteína, cerca del presunto dominio apolar de integración en la membrana, hasta alcanzar el centro activo. Después de pasar el ion Fe2+, el túnel gira y se comunica con el exterior en otro punto de la proteína (Fig. I.13B). La enzima contiene además un bolsillo profundo y estrecho que comienza en un lugar próximo al eje del tunel y termina cerca del ion Fe2+. Se ha propuesto que su xxxxx Fig. I.13. Estructura tridimensional de la enzima SynACO. A. Aspecto exterior. B. Corte de la proteína donde se observa el túnel por donde entra el carotenoide que va a ser cortado. (Tomado de Kloer et al., 2005). A B 18 Introducción reacciones con mecanismos parecidos. Las peculiaridades de la estructura de hojas βrodeando un eje central, denominada por los autores originales propeller, permiten identificar con facilidad la región de la proteína que rodea al centro activo en los distintos miembros de la familia (Kloer et al., 2005). 4. Opsinas 4.1. Tipos de opsinas Además de las enzimas directamente involucradas en la biosíntesis de carotenoides, existen otras proteínas capaces de reconocer carotenoides y usarlos para su función. Entre ellas destacan las opsinas, un grupo de proteínas fotoquímicamente reactivas que usan retinal como cromóforo, y de las que se han descrito más de trescientas en organismos procariotas y eucariotas. Todas ellas tienen en común una estructura consistente en siete hélices αembebidas en membrana, formando un bolsillo en el que se une el retinal (Fig. I.15). Las comparaciones de sus secuencias permiten clasificarlas en dos grupos, denominados tipo 1 y tipo 2. El grado de similitud es elevado dentro de cada grupo y muy dispar entre los dos grupos, sugiriendo una vez más origenes evolutivos distintos (Spudich et al., 2000). Las primeras opsinas conocidas, las de tipo 1, se identificaron en arqueas, y se encontraron también posteriormente en bacterias y algas. Los ejemplos más representativos lo constituyen la bacteriorrodopsina (Fig. I.15) y la halorrodopsina, bombas de iones que utilizan la luz como fuente de energía (Spudich, 1998). A este grupo pertenecen también las rodopsinas sensoras I y II, que actúan como receptores fototácticos (Spudich et al., 1998). También se han identificado rodopsinas en hongos, pero solo recientemente comienza a dilucidarse la función de algunas de ellas (Waschuck et al., 2005). Las opsinas de tipo 2 son básicamente los receptores fotosensibles de los ojos de los animales (Helmreich y Hofmann, 1996; Rao y Oprian, 1996; Sakmar, 1998; Tokunaga et al., 1999), y los receptores de la glándula pineal, hipotálamo y otros tejidos de vertebrados inferiores (Gärtner y Towner, 1995). También a este grupo pertenecen los retinocromos, opsinas oculares extrarretinales (localizadas en tejido ocular pero fuera de la retina) que actuan como fotoisomerasas de retinal (Pepe y Cugnoli, 1992). Otras opsinas de animales superiores están situadas fuera del ojo, como las pinopsinas de la glándula pineal, o la encefalopsina del cerebelo. Todas las opsinas de tipo 2 conocidas se encuentran en eucariotas superiores. A pesar de las diferencias en secuencia entre las dos familias, su estructura presenta características similares, representando un ejemplo de convergencia estructural. Además de la arquitectura de siete hélices, los análisis espectroscópicos y químicos han mostrado en proteínas de ambos grupos que el retinal se une por medio de un enlace de base de Schiff a un residuo de lisina de la séptima hélice (Eyring y Mathies, 1979). Sin embargo los cambios que induce la luz en la estructura del cromóforo y la proteína son distintos en ambas familias (Spudich et al., 2000). También existen coincidencias en las funciones de las proteínas de ambos grupos. Los pigmentos visuales y las pinopsinas de animales llevan a cabo señalización fotosensora por medio de interacciones proteína-proteína inducidas por la luz (Okano y Fukada 1997), tal como hacen las opsinas sensoras de arqueas, que interaccionan con proteinas transductoras de la xxxxxx Fig. I.15. Representación de la bacteriorrodopsina de H. salinarum. Pueden observarse las siete hélices transmembrana y la molécula de retinal. Adaptado de Grigorieff et al. (1996) 19 Introducción et al., 1999). Este sistema de regulación está siendo objeto de atención detallada en el mismo grupo de investigación. En F. fujikuroi se aíslan con facilidad mutantes superproductores de carotenoides, los cuales acumulan elevadas cantidades de pigmento independientemente de la presencia de luz (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987). Este incremento en la producción se corresponde con un alto nivel de ARNm de los genes carRA ycarB (Prado et al., 2004; Thewes et al., 2005) y con una mayor actividad enzimática de sus productos (Avalos et al., 1988). Se desconoce el gen o genes responsables de este fenotipo, que se ha denominado carS. Los mutantes carB nulos, carentes totalmente de actividad desaturasa, acumulan cinco veces más carotenoides que la estirpe parental (Fernández- Martín et al., 2000). Este dato sugiere la existencia de un mecanismo de retroinhibición por un producto posterior de la ruta. En apoyo a esta hipótesis, mutantes en los genes carB ocarRA obtenidos por reemplazamiento génico en un mutante carS muestran una sensible incremento en los niveles de ARNm de sus genes (Linnemannstöns et al., 2002). 26 Introducción OBJETIVOS DE LATESIS Por su versatilidad metabólica, facilidad de cultivo y manipulación en el laboratorio, los hongos filamentosos han constituido una potente herramienta en la investigación de los genes y las enzimas responsables de la síntesis de carotenoides (Avalos y Cerdá-Olmedo, 2004). En los últimos 20 años F. fujikuroi se ha reafirmado como un modelo en este campo. A ello ha contribuido la coexistencia en el mismo organismo de otra ruta biosintética de terpenoides de interés aplicado, como son las giberelinas, y la posesión de una ruta biosintética de carotenoides peculiar, cuyos últimos pasos no han sido investigados aún en ningún organismo. La información disponible sobre los genes de la carotenogénesis de F. fujikuroi, sus funciones y su regulación, tanto a nivel genético como bioquímico, es sin embargo aún muy limitada. El objetivo de esta Tesis es ahondar en el conocimiento de esta ruta, prestando especial atención a la identificación de nuevos genes involucrados cuya existencia es predecible por la información disponible. Para ello se han planteado dos objetivos generales: 1. Caracterizar el agrupamiento génico de la carotenogénesis de F. fujikuroi. Se pretende investigar nuevos aspectos de la función y regulación de los genes ya conocidos, y explorar la existencia de nuevos genes del agrupamiento mediante el análisis de genes adyacentes y su posible relación con la carotenogénesis. 2. Identificar nuevos genes asociados a la carotenogénesis de F. fujikuroi. Se pretenden identificar el gen carT, cuya existencia fue puesta en evidencia por mutación, y un supuesto gen para producción de retinal, cuya existencia cabe predecir de la presencia de genes de opsinas potencialmente capaces de emplear este cromóforo. En ambos casos se espera que las enzimas responsables sean capaces de llevar a cabo reacciones de rotura oxidativa de distintos sustratos de la ruta. 27 Introducción Resultados RESUMEN Los resultados descritos en esta Tesis han profundizado en el conocimiento de los genes y enzimas de la síntesis de carotenoides y han identificado dos nuevos genes de su metabolismo. En la Fig. C0.1 se muestra el mapa del agrupamiento génico de la carotenogénesis antes y después de las aportaciones descritas en este trabajo. Esta Tesis ha contribuido al esclarecimiento del papel de la desaturasa determinada por el gen carB, en especial a su papel como enzima responsable también de la quinta desaturación (Capítulo 1), y al conocimiento de la secuencia y regulación del gen carO (Capítulo 2). La existencia de ambos genes se conocía anteriormente. El agrupamiento génico se ha extendido a un cuarto gen, denominado carX (Capítulo 3), el cual se ha demostrado que es responsable de la síntesis de retinal (Capítulo 4), supuesto cromóforo de la proteína determinada por el gen carO. Finalmente, las herramientas de análisis de secuencias han permitido identificar un gen de la misma familia de carX, alejado de los otros genes car, que se ha identificado como carT (Capítulo 5). El análisis bioquímico de la enzima determinada por este gen ha permitido demostrar que su función es la catálisis del corte oxidativo del toruleno, paso crítico en la síntesis de neurosporaxantina. El producto de la reacción sugiere la existencia de una nueva enzima necesaria para generar el extremo carboxilo de esta xantofila. Fig. C0.1. Mapa del agrupamiento génico de la carotenogénesis. Se destacan en negro los genes identificados en esta Tesis. Se desconoce la ubicación del gen carT, que no forma parte del agrupamiento. CarB O O OH 2x Pirofosfato de geranilgeranilo O PPi Fitoeno Fitoflueno ζ-caroteno Neurosporeno β-zeacaroteno γ-caroteno Toruleno β-apo-4´-carotenal Neurosporaxantina β-caroteno CarB CarB CarB CarB CarT CarRA CarRA PPi CarRA CarX carRA carB carOcarX 1 Kb Car? O O Retinal Retinal carT 31 Capítulo 1. Caracterización de un mutante carB superproductor de γ-caroteno y β-caroteno La primera estrategia experimental abordada en esta Tesis fue la obtención de mutantes de la carotenogénesis en el fondo genético FKMC1995, que como se indica en la Introducción (apartado 1.3), presenta ventajas metodológicas sobre la estirpe silvestre IMI58289. Por la experiencia previa con esta última estirpe, las alteraciones de color son más visibles en un fondo superproductor de carotenoides. Por tanto, el primer paso fue la obtención de mutantes superproductores a partir de la estirpe FKMC1995. Se eligió como estirpe patrón el mutante SF4, cuyas características fenotípicas son muy similares a las del mutante carS SG22, anteriormente descrito (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987). La mutagénesis de SF4 permitió identificar distintos mutantes con la coloración alterada, entre los cuales llamó especialmente la atención una estirpe con una intensa pigmentación amarilla, que se denominó SF21 (Fig. C1.1). De acuerdo con la información disponible sobre la carotenogénesis de F. fujikuroi, no se espera ningún fenotipo de ese color por pérdida de función de cualquiera de los genes de la ruta. Por ese motivo, se decidió investigar el mutante más en detalle. 0 1000 2000 3000 4000 O L silv SF4 SF21 O L O L β-caroteno γ-caroteno Fitoeno neurosporaxantina Carotenoides (µg/g peso seco) A tiempo de retención (min) B 1.1. Fenotipo del mutante SF21 Se analizaron los carotenoides acumulados por el mutante SF21 y su estirpe parental SF4 mediante HPLC (Fig. C1.2), así como espectrofotometría y cromatografía en capa fina (Fig. C1.3 y C1.4). Los análisis mostraron que SF21 acumula mayores cantidades de carotenoides que SF4, siendo en su gran mayoría neutros en el primero frente a una composición mayoritaria en carotenoides polares en el segundo. Las concentraciones totales fueron sensiblemente mayores en la luz que en la oscuridad en el mutante SF4, mientras que no hubo diferencias significativas en el caso de SF21. Este fenotipo fotosensible de SF4 contrasta con el de otros mutantes superproductores de carotenoides de F. fujikuroi obtenidos a partir de la estirpe IMI58289, cuyas concentraciones de carotenoides no se ven influidas por la luz (Avalos y Cerdá- Olmedo, 1987). Los análisis por HPLC de los carotenoides acumulados por ambos mutantes mostraron una elevada cantidad de γ-caroteno y β-caroteno en SF21 en comparación con SF4, donde apenas se detectaron estos compuestos (Fig. C1.2). En su lugar, SF4 acumuló cantidades menores de toruleno y altas concentraciones de neurosporaxantina, que no aparece en el cromatograma. El nivel de γcaroteno de SF21 fue unas 400 veces mayor que el de SF4, y el de β-caroteno aproximadamente 800 veces (Fig. C1.2). La concentración de fitoeno en SF21 es unas50 veces mayor que en SF4. Uno de los picos del cromatograma de SF21 (pico a, Fig. C1.2A) corresponde a un carotenoide ausente en la estirpe SF4, cuyo espectro no nos permite su identificación. Su absorción máxima se produce a 446 nm, y la forma de su espectro sugiere la presencia de al menos un anillo de β-ionona en su estructura. En el cromatograma de SF21 no se detectó toruleno, que es el carotenoide neutro mayoritario en el mutante SF4. Las condiciones de separación empleadas están optimizadas para la separación de carotenos no polares; a fin de determinar la presencia de neurosporaxantina en el mutante SF21 decidimos xxxx Fig. C1.2. Análisis de los carotenoides acumulados por SF4 y SF21. A. Análisis mediante HPLC de los carotenos neutros acumulados por ambas estirpes cultivadas 9 días en oscuridad en medio DG con asparragina. Se muestra el cromatograma a 462 y 286 nm. Se muestra el espectro de absorción de los carotenos coloreados (350-550 nm) y del fitoeno (250-400 nm), así como su longitud de onda de absorción máxima. B. Carotenoides acumulados por la estirpe silvestre FKMC1995 (silv) y los mutantes SF4 y SF21 en luz (L) y oscuridad (O). Los datos mostrados combinan resultados de análisis por HPLC y espectrofotometría de muestras neutras y polares. Fig. C1.1. Aspecto de las colonias de la estirpe silvestre F K M C 1 9 9 5 ( s i l v ) , y l o s mutantes SF4 y SF21. Las estirpes se cultivaron en la luz a 22ºC en medio mínimo con asparragina como fuente de nitrógeno. Absorbencia silv SF4 SF21 04 8 12 16 b c cd 446 473 d a b a c SF4 SF21 486 462 452 d 462 nm 286 nm e286 e e Resultados. C1 34 aprovechar su polaridad para separarla de los carotenos no polares en cromatografía en capa fina. En las condiciones empleadas en la separación cromatográfica mostrada en la Fig. C1.3, se pudo apreciar que la gran mayoría de los carotenoides acumulados por el mutante SF4 quedan retenidos en el origen de la capa fina. El espectro de los carotenoides eluidos de esta xxxxxxxxxxxxx Fig. C1.3. A. Separación por cromatografía en capa fina de silica gel (tolueno:eter de petroleo 5:95) de los carotenoides acumulados por S F 4 y S F 2 1 . L a s e s t i rp e s se cultivaron durante 9 días en DG con asparragina en luz. Se muestran los espectros (350-550 nm) de las fracciones de carotenoides separada s, ind ica das c on números rom a n o s. B . C o mpara c i ó n d e l espectro (350-550 nm) de los carotenoides totales de SF4 y SF21. C. Comparac i ó n d e l esp e c tro de absorción (350-550 nm) de los carotenoides polares de SF4 y SF21 (bandas I y I´). 449 I473 II 483 III´ 458 448 IV´ 449 I´ III 458 478 475 449 SF21 SF21 SF4 SF4 I II III´ IV´ III I´ Carotenoides totales Carotenoides polares AB C SF4 SF21 I476 II 478 III 473 IV 472 V 473 I´ 454 II´ 473 III´ 472 IV´ 471 V´ 467 VI´ 467 VII´ 460 I II IV´ V´ III I´ IV V II´ III´ VI´ VII´ Fig. C1.4. A. Separación por cromatografía en capa fina de silica gel (hexano:acetato de etilo:isopropanol 76:12 :12) de los carot enoides polares acumulados por SF4 y SF21. Los carotenoides provienen de las estirpes cultivadas durante 9 días en DG con asparragina en luz. El espectro de absorción de cada banda (350-550 nm) se indica con números romanos. banda, intensamente pigmentada, coincidieron con el de la neurosporaxantina, con una absorción máxima a 473 nm (espectro I, Fig. C1.3). En el mismo carril, se apreciaron más arriba una tenue banda correspondiente a toruleno (II) y una tercera banda aún más tenue, reconocible como γ-caroteno (III). Los resultados fueron muy diferentes en el caso de SF21, que mostró dos bandas de carotenos no polares, correspondientes a γ-caroteno (III´) y β-caroteno (IV´), y una banda de carotenoides polares retenidos en el origen (I´), en cantidad mucho menor que la presente en el mutante SF4. El espectro de esta banda difiere del de la neurosporaxantina, tanto en su forma como en su longitud de onda de máxima absorción (Fig. C1.3C). Hemos calculado que los carotenoides presentes en esta banda no supera el 7% del total de carotenoides acumulados por la estirpe SF21. Esta estima se ha hecho atribuyendo a esta fracción el coeficiente de extinción de la neurosporaxantina, aunque desconocemos la naturaleza química de los carotenoides que la forman. Estos resultados nos permiten afirmar, sin embargo, que la síntesis de neurosporaxantina por el mutante SF21 es muy reducida o inexistente. Resultados. C1 35 SF4 SF21 FKMC1995 SF1 SF4 SF21 SF73 SF98 O LO L O L O L O L O L carB 1 0 rRNA carRA rRNA Fig. C1.12. Expresión del gen carB en la estirpe silvestre FKMC1995 y en los mutantes indicados.Northern blot de muestras de ARN total de las estirpes cultivadas en la oscuridad (O) durante tres días, y expuestas 1 hora a 25 W/m2de luz blanca (L). Se muestran las señales de ARNr como control de carga. Las barras mostradas bajo las hibridaciones muestran el cociente entre la intensidad de cada señal de ARNm y la de ARNr (oscuridad: barras grises; luz: barras blancas). Los valores, estimados por análisis de densitometría de las hib rida c i ones , mue str a n la m e dia de d o s ex peri ment o s independientes referidos al valor más alto, tomado como 1; los puntos muestran los valores reales de cada experimento. La barra sombreada indica el valor más alto, tomado como 1. 1.9. Predicciones estructurales de CarB y ubicación de la mutación carB36 El análisis estructural delas desaturasas de carotenoides descrito en el apartado 1.2 se extendió a otras desaturasas, a la isomerasa de carotenoides de plantas y cianobacterias (CRTISO, Isaacson et al., 2002; Park et al., 2002; Breitenbach, 2001; Masamoto, 2001) y a la todo-trans-retinol:todo-trans-13,14- dihidroretinol saturasa (RetSat, Moise et al., 2004) (Fig. C1.13). A pesar de la baja similitud de secuencia entre las proteínas estudiadas (por ej. 12% de identidad entre CarB de F. fujikuroi y ZCD de A. thaliana), el programa predijo una estructura secundaria similar en todas ellas (Fig. C1.13). Se han propuesto dos dominios para las desaturasas de carotenoides, el de unión del sustrato (Armstrong et al., 1989) y el de unión de dinucleotido (Armstrong et al., 1990; Bartley et al., 1990), el cual formaparte de uno mayor, el dominio de Rossman (Rossmann et al., 1974). Estos dos dominios se establecieron a partir de las similitudes de secuencia de las desaturasas de carotenoides con la deshidrogenasa de lipoamida y la reductasa de glutatión por un lado (Bartley et al., 1990), y con la oxidasa de monoamina y la oxidasa de protoporfirinógeno por otro (Dailey and Dailey, 1998). El programa 3D-PSSM confirmó la conservación de ambos dominios en estas proteínas y un mayor parecido estructural de las desaturasas de carotenoides con la MAO (código de acceso de estructura mmdb Id: 18020; valor E dado por el programa 3D-PSSM al comparar con CarB: 4,8e-5), a la oxidasa de L-aminoácidos (mmdb Id: 14081; E: 2,9e-3) y a la oxidasa de poliaminas (mmdb Id: PAO, 15294; E: 3,2e-3). exposición a la luz. La cantidad de ARNm de este gen en el mutante superproductor de carotenoides SF4 en la oscuridad fue similar a la detectada en la estirpe silvestre y SF1 expuestas a la luz. Se observó así mismo un sensible aumento de ARNm en SF4 en el cultivo iluminado. Los niveles de ARNm de carB en las estirpes derivadas de SF4 fueron comparables a los mostrados por ésta, observándose en todas ellas un incremento moderado cuando se cultivan una hora en la luz. Este comportamiento en los mutantes superproductores provenientes de la estirpe silvestre FKMC1995 es comparable al observado en mutantes similares provenientes de la estirpe silvestre IMI58289 (Capítulo 5, Fig. C5.11). En conclusión, la expresión de carB en el mutante SF21 y en los mutantes derivados de éste son muy parecidos a los de SF4, lo que indica que la mayor producción de carotenoides en estas estirpes no es resultado de un aumento en la expresión de los genes responsables de la carotenogénesis . Resultados. C1 42 Fig. C1.14. Estructura predicha par a las t res r egi on es que c o n f o r m an e l d o m i n i o d e Rossmann en las pro teínas descritas en el texto. A. dominio lámina β-hélice α-lámina βque contiene el dominio de unión de dinucle o t i d o . B . lá minas β contíguas que envuelven al dominio de unión de dinucleotido. C. Lámina βy hélice alfa que incluye el dominio de unión de caroteno. Todas estas proteínas utilizan FAD como cofactor, unido supuestamente por medio del dominio de Rossman. El análisis estructural realizado (Fig. C1.13) indica que dicho dominio está conservado en todas ellas. Lo forman tres regiones: la primera constituye el dominio de unión de dinucleotido, formado por dos láminas βy una hélice α(β1, α1 y β2, Fig. C1.14A y C1.15); la segunda abarca cinco láminas βadyacentes (β3, βa, βb, βc y β4, Fig. C1.14B y C1.15) y una sexta lámina βseparada de éstas, no incluida en la Figura; la tercera comprende una lámina βy una hélice αpróximas al extremo carboxilo (β5 y α2, Fig. C1.14C y C1.15). Se han identificado varios aminoácidos conser-vados en este último segmento para las proteínas que unen dinucleótidos como cofactor (Eggink et al., 1990), y se ha propuesto que una secuencia similar está presente en las desaturasas de carotenoides estructurada como una lámina βy una hélice α(Vallon et al., 2000).Esta secuencia conservada (TxxxxhφhhGD; donde “h” indica aminoácido hidrofóbico, “φ” aromático y “x” cualquier aminoácido) se encuentra dentro del dominio anteriormente propuesto de unión de caroteno. La mutación carB36 se ubica fuera del dominio de Rossmann. β1 α1 β2 β3 β4 βa βb βc β5 α2 A B C Resultados. C1 43 Eucaria Arquea Hipertermofilos Halófilos extremos Metanógenos Protozoos Mohos del cieno Hongos Animales Vegetales Bacterias púrpura Cianobacterias Bacterias Gram-positivas Espiroquetas Bacterias verdes fotosintéticas Ss PHD Ff PHD At PHD At ZCD Rs PHD Hm DPHD Hs PHD Mt PHD As PHD At CRTISO Hs RetSat Fig. C1.13. Predicciones de estructura secundaria de enzimas de la familia de las desaturasas de carotenos. Las predicciones se realizaron con el programa 3D PSSM (Kelley et al., 2000). Se comparan la desaturasa de fitoeno (PHD), deshidrogenasa de diapofitoeno (DPDH), ó deshidrogenasa de ζ-caroteno (ZCD) de Sulfolobus solfataricus (Ss), Halobacterium salinarum (Hs), Methanobacterium thermoautotrophicum (Mt), Fusarium fujikuroi (Ff), Arabidopsis thaliana (At), Rhodobacter sphaeroides (Rs), Anabaena sp. (As) y Heliobacillus mobilis AAC84034.1 (Hm). Los rectángulos grandes indican hélices α, y los rectángulos pequeños indican láminas β. Los rectángulos coloreados forman parte del dominio de Rossmann. La flecha indica la posición de la mutación carB36. Fig. C1.15. Dominio de Rossmann en las desaturasas de carotenoides según se d e d u c e d e l a s p r e d i c c i o n e s d e estructura secundaria y de las similitudes de secuencia. A. Representación integrada de las tres partes del dominio de Rossmann. B. Posición relativa de las tres partes del dominio de Rossmann a l o l a r go d e l a s d e s a t u r a sa s d e carotenoides. 100 aminoacids β1α1β2β3βaβbβcβ4β5α2 COOH NH3 β1 β2 β3 β4 β5 α1α2 βa βb βc A B NH3 COOH 1.10. Discusión Este capítulo describe un mutante de F. fujikuroi, SF21, que presenta una fuerte pigmentación amarilla debido a la acumulación de γ-caroteno y βcaroteno como productos mayoritarios de la carotenogénesis. Hemos comprobado que esta estirpe posee una mutación en el gen carB (alelo carB36) y hemos demostrado mediante la técnica de reemplazamiento alélico que esta mutación es la responsable del fenotipo. Las características del mutante indican que su desaturasa realiza las primeras cuatro desaturaciones de la ruta, pero ha perdido casi completamente la capacidad de catalizar la quinta. Se trata por tanto de una alteración muy sutil en la proteína, que explica la infrecuencia de este tipo de mutante. Anteriormente se habían descrito dos mutantes de F. fujikuroi, llamados SG45 y SG70, con incrementos en las cantidades relativas de β-caroteno y γ-caroteno, pero en ambos casos se detectaron también cantidades apreciables de toruleno y uno de ellos sintetiza tanta neurosporaxantina como la estirpe parental (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987). Se trata, por tanto, del primer mutante con un fenotipo nulo especifico para la quinta desaturación en este organismo y en cualquier otro que posea una ruta similar. Así lo indican la ausencia de toruleno en su micelio y la cantidad extremadamente baja de neurosporaxantina detectable en los análisis. El fenotipo de SF21 recuerda en su coloración al mutante ylo de N. crassa, aunque en este caso el patrón de acumulación de carotenoides no permite sacar conclusiones claras sobre el tipo de alteración sufrida (Goldie y Subden, 1973). Esto puede ser debido a que la estirpe silvestre de este hongo acumula mayores cantidades de carotenoides intermediarios que F. fujikuroi en las condiciones habituales de cultivo. Llama la atención que el fenotipo ylo de N. crassa no se debe a una alteración en la desaturasa (Al-1), sino en una supuesta deshidrogenasa de aldehído, cuyo gen no ha sido aún objeto de investigación. Este hecho sugiere una interpretación alternativa al fenotipo del mutante SF21: la mutación puede haber afectado al sitio de interacción de la desaturasa con otra proteína. Ese podría ser el caso, por ejemplo de una proteína dedicada a regenerar el poder reductor de su cofactor (ver Introducción, apartado 3.1.3). En contra de esta hipótesis, parece difícil que tal tipo de interacción solo sea necesaria para llevar a cabo una de las cinco desaturaciones. Además de la diferencia en su composición, la concentración de carotenoides en el mutante SF21 cuadruplica al menos la mostrada por la estirpe superproductora de carotenoides de la que procede (SF4). Esta diferencia es especialmente acusada en la oscuridad, ya que la estirpe parental muestra un aumento en la concentración de carotenoides en la luz, resultado que tiene su reflejo en un sensible incremento en las cantidades de ARNm del gen carB tras una hora de iluminación. Los niveles de ARNm son muy similares en el mutante SF21, por lo que no parece que las diferencias en las concentraciones de carotenos acumulados sean debidas a diferencias de expresión o de estabilidad de dichos ARNm. Las diferencias observadas pueden tener su causa en que el γcaroteno y β-caroteno sean más estables que la neurosporaxantina, pero esta hipótesis exigiría además una alta sensibilidad de la neurosporaxantina a la luz. En contra de esta predicción, los mutantes superproductores de neurosporaxantina derivados de IMI58289 contienen cantidades parecidas de esta xantofila en luz y en oscuridad (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987). Alternativamente, el alelo carB36 puede conferir una mayor capacidad biosintética de carotenoides a la estirpe que lo alberga. Dicho aumento en la eficiencia afectaría también como xx Discusión. C1 44 Discusión. C1 45 A A HfHfHlHl Ff Rs P173>S L148>H mínimo a la síntasa de fitoeno, como indica la mayor acumulación de fitoeno en SF21 en comparación con la estirpe parental SF4 (Fig. C1.11). Cabe especular que la desaturasa controle de alguna forma la actividad de la sintasa de fitoeno, y que tal mecanismo de control se haya perdido en la desaturasa determinada por el alelo carB36. Otra posible explicación la proporciona un trabajo en M. circinelloides, donde se ha descrito el gen crgA, que determina una proteína represora de la carotenogénesis. Se ha propuesto que CrgA lleva a cabo esta fun-ción colaborando con el mecanismo de ubiquitinación, promoviendo la degra-dación de las proteínas de la carotenogénesis (Lorca-Pascual et al., 2004). Si un mecanismo semejante actuara en Fusarium, la mutación carB36 podría haber abolido la actuación de este mecanismo sobre la maquinaria carotenogénica, traduciéndose en un incremento en la producción de carotenoides en SF21. Las predicciones de la estructura de las proteínas de la familia a la que pertenecen las desaturasas han mostrado que, aunque la similitud entre ellas a nivel de secuencia es relativamente baja, conservan en rasgos generales las mismas características estructurales, incluyendo la persistencia del dominio de Rossmann, presuntamente responsable de la unión del cofactor aceptor de protones (Fig. C1.13). Esta conservación en la estructura facilita las comparaciones de resultados obtenidos con desaturasas de diferentes orígenes. Un ejemplo particularmente relevante lo encontramos en una mutación descrita en la desaturasa de Rhodobacter sphaeroides (Wang et al., 2001) que presenta un curioso paralelismo con la alteración encontrada en la desaturasa de fitoeno del mutante SF21. La mutación de R. sphaeroides afecta también a un solo aminoácido situado en la misma región de la proteína. Sin embargo, en este caso la consecuencia es opuesta a la observada en el mutante de F. fujikuroi, pues la versión alterada de esta enzima bacteriana introduce una desaturación adicional en su sustrato (Wang et al., 2001). Tanto la mutación carB36 de F. fujikuroi, como la de la desaturasa de R. sphaeroides, localizadas fuera del dominio de Rossmann, se encuentran en una zona compuesta por hélices α(Fig. C1.16), que presenta una alta variabilidad de secuencia incluso entre las desaturasas fúngicas (Fig. C1.5). A pesar de su bajo grado de conservación, dos de las hélices son siempre anfipáticas y ricas en aminoácidos básicos. Estas características son típicas del dominio de unión a membrana de ciertas proteínas monotópicas, que utilizan hélices αanfipáticas para embeberse parcialmente en la membrana lipídica y son particularmente ricas en aminoácidos básicos para interaccionar con las cabezas oxigenadas de los fosfolípidos (Picot et al., 1994; Wendt et al., 1997). Este dominio estructural forma un poro a través del cual el sustrato, hidrofóbico y supuestamente ubicado en la membrana, entra en la enzima para ser metabolizado. Fig. C1.16. Predicción del dominio de unión a membrana de la desaturasa de F. fujikuroi (Ff) y R. sphaeroides (Rs). Los rectángulos grandes representan hélices α, y los rectángulos pequeños representan láminas β. En negro se destaca la región de hélices αdonde se encuentran las mutaciones descritas en el texto; las barras verticales indican posiciones donde se localizan aminoácidos básicos (lisina o arginina). Dentro de ese segmento, se indica el carácter hidrofílico (Hl), hidrofóbico (Hf) o anfipático (A) de cada hélice α. En gris se indican las tres regiones de la proteína que forman el dominio de Rossmann (Fig. C1.13). Las desaturasas de carotenoides son proteínas perimembranales (Sandmann, 1997), y los carotenoides son moléculas hidrofóbicas que encuentran acomodo en la bicapa lipídica. Se ha demostrado recientemente que otras enzimas que reconocen carotenoides como sustrato, las oxigenasas de carotenoides, los discriminan en el sitio de entrada a la enzima (Kloer et al., 2005; Schezinger et al., 2006). Como ocurre con las oxigenasas de carotenoides, las desaturasas son capaces de metabolizar in vitro muchos sustratos inexistentes en su entorno natural (Raisig y Sandmann, 2001; Tobias y Arnold, 2006). Este hecho sugiere un mecanismo de discriminación particularmente relajado, que tiene lugar a nivel de entrada de la molécula en el hueco hidrófobo de la enzima. El aminoácido sustituido en la proteína del alelo carB36 está localizado en el giro previo a las dos hélices αanfipáticas (Fig. C1.15), y la de R. sphaeroides se encuentra en el giro precedente, previo a la hélice αhidrofóbica (Fig. C1.15). Parece probable que la sustitución de una leucina original por una histidina en la desaturasa de R. sphaeroides haya relajado el reconocimiento del sustrato de forma que permita la entrada de neurosporeno en la proteína. En el caso de CarB de F. fujikuroi el cambio de la serina original por una prolina, un aminoácido particularmente influyente en las estructuras proteicas, podría traer consigo un reordenamiento estructural de las hélices αadyacentes de forma que el γ-caroteno no pueda entrar en el sitio activo de la enzima. Curiosamente esta prolina está conservada en dos desaturasas capaces de llevar a cabo cinco desaturaciones, Al-1 de N. crassa (Haussmann y Sandmann, 2000) y CrtI de X. dendrorhous (An et al., 1999; Verdoes et al., 1999). En contraste, las desaturasas que llevan a cabo cuatro desaturaciones presentan un aminoácido alifático en esa posición. Ese es el caso de CarB de P. blakesleeanus (Ruiz-Hidalgo et al., 1997) y M. circinelloides (Velayos et al., 2000), que acumulan β-caroteno como producto final. Una excepción es la desaturasa de C. nicotianae, que conserva la prolina pero que produce también β-caroteno (Ehrenshaft y Daub, 1994). A partir de la estirpe SF21 se obtuvieron dos nuevos mutantes con alteraciones sutiles en la desaturasa que afectan a la preferencia de sustrato. Ambos mutantes están afectados en el último segmento del dominio de Rossmann, que solapa con el dominio de unión de carotenoide, región donde se encuentran también varias mutaciones carB descritas en P. blakesleeanus (Sanz et al., 2002). Uno de nuestros mutantes, SF73, se espera que produzca una versión truncada de la desaturasa que carezca de toda esa región. A pesar de ello, el mutante acumula pequeñas cantidades de ζ-caroteno, lo que significa que la variante truncada de la proteína conserva una actividad residual para las dos primeras desaturaciones de la ruta, indicando que la región perdida no es absolutamente crítica para su funcionamiento. De acuerdo con nuestras predicciones estructurales, el dominio afectado se encarga de interaccionar con el cofactor aceptor de electrones. En el segundo mutante, SF98, la mutación produce el cambio de un solo aminoácido. Si bien el mutante es capaz de sintetizar cantidades modestas de γcaroteno, acumula una cantidad inusualmente alta de ζ-caroteno, demostrando una disminución parcial en la capacidad de realizar la tercera y cuarta desaturación. En ambos casos se acumulan concentraciones elevadas de fitoeno, demostrando que se trata de desaturasas muy defectuosas. Debido a la simetría de las dos primeras parejas de reacciones, no sorprende que en ambos mutantes las desaturaciones se vean afectadas por pares. Este tipo de alteración de la desaturasa tiene un precedente en el hongo P. blakesleeanus, donde se ha descrito un mutante (S442) que acumula una mezcla de carotenos enriquecida en fitoeno Discusión. C1 46 Discusión. C1 47 yζ-caroteno. Su fenotipo indica una mutación rezumante que afecta sobre todo al segundo par de desaturaciones (Bejarano et al., 1987; Sanz et al., 2002). Los resultados descritos en este capítulo corroboran la conclusión alcanzada por medios bioquímicos en N. crassa sobre el papel de la desaturasa como enzima responsable de las cinco desaturaciones de la ruta (Hausmann y Sandmann 2000). A la misma conclusión se llegó por métodos genéticos con la desaturasa de P. blakesleeanus, aunque en este caso la ruta solo incluye cuatro desaturaciones. En este organismo se ha propuesto que las desaturasas forman un tetrámero dentro del cual se transfieren los sustratos a medida que cada monómero realiza una reacción de desaturación (Aragón et al., 1976; Hausmann y Sandmann 2000; Sanz et al., 2002). Las predicciones estructurales ya discutidas parecen indicar que la desaturasa de F. fujikuroi ejerce su función individual-mente como proteína monotópica, de forma que una misma enzima podría reconocer y desaturar uno a uno los diferentes sustratos. Este modelo se amoldaría también más fácilmente al peculiar fenotipo del mutante ya mencionado de R. sphaeroides, en el cual la enzima adquiere la capacidad de llevar a cabo una quinta desaturación inexistente en la enzima silvestre (Wang et al., 2000). Tobias y Arnold (2006) optaron por esta misma hipótesis tras conseguir que la desaturasa de Erwinia uredovora introduzca hasta dos desaturaciones adicionales en carotenoides de 45 y 50 carbonos. El modelo es compatible con que la desaturasa de F. fujikuroi forme dímeros u homopolímeros, siempre que cada subunidad ejerza su actividad individualmente a través del poro en su conexión con la membrana. Así, por ejemplo, la oxidasa de protoporfirinógeno (PPO) se organiza en dímeros, donde cada monómero introduce seis desaturaciones en el protoporfirinógeno IX (Poulson y Polglase, 1975). La propiedad del alelo carB36 de desviar la ruta hacia la síntesis de γcaroteno y β-caroteno sugiere posibles aplicaciones biotecnológicas. Un ejemplo lo encontramos en el basidiomiceto X. dendrorhous, usado como fuente industrial de astaxantina. Esta xantofila, utilizada por la industria piscícola para proporcionar la pigmentación a salmones y crustáceos (Visser et al., 2003), deriva del β-caroteno y contiene grupos hidroxilo y ceto en los anillos de la molécula. En este hongo, la síntesis de astaxantina compite con una ruta paralela en la que la desaturasa (CrtI) introduce una quinta desaturación para producir toruleno, precursor de los productos finales 3-hidroxi-3´,4´-didehidro- β-ψ-caroten-4-ona (HDCO) y 3,3´-dihidroxi-β,ψ-caroten-4,4´-diona (DCD) (An et al., 1999). El residuo de prolina afectado por la mutación del alelo carB36 está conservado en el gen crtI de X. dendrorhous. La introducción de la misma mutación en el gen crtI silvestre podría bloquear la ruta paralela no deseada incrementando la cantidad y proporción de astaxantina. De no tener el mismo efecto la mutación en este hongo, cabe la alternativa de introducir el alelo carB36 de F. fujikuroi bajo control de un promotor de X. dendrorhous en una estirpe de este basidiomiceto carente de actividad CrtI. Otro ejemplo de sus posibles aplicaciones nos lo proporciona la especie Fusarium venenatum. Este hongo es la base del producto denominado micoproteína (Wiebe, 2002), usado como sustituto de la carne por la industria alimentaria en algunos paises de la Unión Europea. F. venenatum posee la misma ruta biosintética que F. fujikuroi (L.R. Rodriguez-Ortiz, resultados no publicados). La introducción de la mutación carB36 en F. venenatum daría lugar a la acumulación de pequeñas cantidades de γ-caroteno y β-caroteno en el micelio empleado para uso alimentario, incrementando por tanto el valor xxxxxxx Discusión. C1 48 nutritivo de la micoproteína por su contenido en provitamina A. Aunque la legislación actual es extremadamente restrictiva en cuanto al uso de organismos modificados genéticamente, el posible uso del alelo carB36 para fines aplicados ha dado lugar a la solicitud de una patente (Prado-Cabrero y Avalos, 2003). La baja similitud de secuencia entre las desaturasas de carotenoides de bacterias y plantas ha llevado a algunos autores a proponer para ellas un origen independiente (Pecker et al., 1992; Sandmann, 1994). El reciente descubrimiento de nuevos miembros de esta familia (CRTISO y RetSat) ha llevado a reconsiderar la evolución de esta familia. Ambas enzimas, a pesar de encontrarse en organismos fotosintéticos y vertebrados respectivamente, son más parecidas a las desaturasas bacterianas que a las vegetales (Park et al., 2002). Hemos comparado la estructura secundaria predicha para estas dos nuevas enzimas con ejemplos representativos de desaturasas de origen bacteriano y vegetal (Fig. C1.13). A pesar de la alta variabilidad en las secuencias comparadas (el grado de identidad de CarB de F. fujikuroi con ZCD de A. thaliana es del 12%, y con la desaturasa del hongo C. nicotianae del 60%), todas las enzimas analizadas comparten una estructura secundaria predicha similar, condicionada probablemente por la necesidad de conservar el dominio de Rossmann (Fig. C1.14 y C1.15). Estos resultados sugieren un origen evolutivo común para todas las enzimas de esta familia. Uno de los puntos de arranque de esta Tesis es el conocimiento previo de la existencia a continuación de carB de un gen que se denominó carO (Fig. C2.1) y que determina una proteína de la familia de las opsinas. Su descubrimiento, a raíz de la secuenciación de un extremo de un segmento de ADN que contiene el gen carB (Fernández-Martín et al., 2000), dio lugar al análisis de su función por reemplazamiento génico y al estudio del efecto de la luz y de las mutaciones carS sobre sus niveles de ARNm. Estos experimentos, realizados por María del Mar Prado en el mismo grupo de investigación (Prado et al., 2004), revelaron que la pérdida de carO no produce sobre F. fujikuroi ninguna alteración fenotípica externa en las condiciones de cultivo de laboratorio, incluyendo la síntesis de carotenoides (Fig. C2.2). Además, los niveles de ARNm del gen carO muestran el mismo patrón de regulación que el de los genes carB ycarRA en respuesta a la luz y a las mutaciones de superproducción de carotenoides, motivo de la denominación car del gen. Capítulo 2. Secuencia y regulación del gen carO, que determina una proteína de la familia de las opsinas 2.1. El gen carO En este capítulo se ha determinado la secuencia del gen carO, tanto a partir de ADN genómico como a partir de ADN complementario. A continuación se ha analizado dicha secuencia y la de la correspondiente proteína, y se ha ampliado el conocimiento de su regulación mediante el estudio del efecto del choque térmico sobre los niveles de su ARNm. Fig. C2.1. Mapa del gen carO y genes vecinos. carRA carB carO El gen carO se extiende a lo largo de 1192 pb, incluyendo 4 intrones (54, 57, 97 y 50 pb), tres de los cuales se agrupan en la región 5´ del gen (Fig. C2.1, apéndice 2.1). Con la excepción del intrón de 97 pb, el tamaño de los intrones concuerda con los de otros genes de Fusarium estudiados, habitualmente muy próximos a los 50 pb. 2.2. Similitud de CarO con otras proteínas La proteína CarO es muy similar a las proteínas de la familia de las opsinas. El parecido más elevado lo encontramos en dos proteínas del hongo Coriolus versicolor, Cvhsp30/1 y Cvhsp30/2, a las que se ha atribuido un papel en la respuesta al choque térmico (Iimura y Tatsumi, 2002). De los 307 aminoácidos de CarO, el 34% coinciden en las mismas posiciones en estas dos proteínas, las cuales difieren entre sí solo en tres posiciones. También se han encontrado grados significativos de identidad con la proteína de choque térmico HSP30 de S. cerevisiae (29%), las opsinas Ops de L. maculans (29%) y Nop-1 de N. crassa (26%) y la bacteriorrodopsina de H. salinarum (26%). En la Fig. C2.3 se comparan las secuencias de estas proteínas resaltando las posiciones coincidentes. Se incluye también en esta comparación una segunda presunta opsina de N. crassa, más parecida a CarO que Nop-1 (29% vs 26%). Al comparar CarO con otras opsinas de esta amplia familia (Zhai et al., 2001), los porcentajes de identidad son similares o ligeramente menores. Se conoce la estructura tridimensional de la bacteriorrodopsina y se han determinado los aminoácidos implicados en su mecanismo de transporte de protones (Luecke et al., 1998), lo cual se ha utilizado como guía en el análisis xxx Fig. C2.2. Aspecto de colonias de un mutante carO-(-) y su estirpe control (+) con el alelo carO funcional. Las estirpes fueron cultivadas durante 5 días en medio mínimo con asparragina como fuente de nitrógeno en oscuridad (panel izquierdo) o en luz (panel derecho). La secuencia codificante, 924 pb, determina una proteína de 307 aminoácidos (apéndice 2.2) predominantemente hidrofóbica. El análisis de su secuencia polipéptídica con la herramienta TMHMM (CBS, Dinamarca) indica que se trata de una proteína membranal con siete dominios transmembrana. Resultados. C2 50 E204 K K K K 1 2 4 5 6 7 R82 D85 E194 3D96 Sc 1 -----------------MNDTLSSFLNRNEALGLNPP----HGLDMHITKRGSDWLWAVFAVFGFILLCYVVMFFIAENKGSRLTRYALAPA Cv 1 --------------------------MGNSALDLNP-----PNATFHLSTHGSDWLWAAFSVFGVSLLTVVAWTFTRP-RGARLFHQIAIVV Nc2 1 ---------------------MAILLPRNDVLNVHP-----APQGQHLSVHGSDWLWAATALFAFNTLVLFALKFKAS-RGERLWHYIWIVT Nc1 1 ---------MIHPEQVADMLRPTTSTTSSHVPGPVPTVVPTPTEYQTLGETGHRTLWVTFALMVLSSGIFALLSWNVP-TSKRLFHVITTLI Ff 1 -------------------MADHLYARKNDALNVNPDIVNGQRSDINITVRGSDWYWAVCAVMTVSTFAFLGLGMRKP-RTDRIFHYITAGI Lm 1 MIVDQFEEVLMKTSQLFPLPTATQSAQPTHVA-PVPTVLPDTPIYETVGDSGSKTLWVVFVLMLIASAAFTALSWKIP-VNRRLYHVITTII Hs 1 ---------------------MLELLP--TAVEGV------SQAAQITGRPEWIWLALGTALMGLGTLYFLVKGMGVSDPDAKKFYAITTLV Sc 72 FLITFFEFFAFFT-YASDLGWTGVQAEFNHVKVSKSITGEVPGIRQIFYSKYIAWFLSWPCLLFLIELAASTTGENDDISALDMVHSLLIQI Cv 61 LTTGSLAYFSMAS----DLGATPVP-----VEFRGEG------TRQIWFVRYIQWFITFPLLLLELLLATGLS-----------LSDIFTTL Nc2 66 NLVATFAYFAMAA----NLAWDVVSQ---RNQVRQHGP-----TRQIFWAKYVLWVVSFPAAILAMGILSGVS-----------WATIVFNI Nc1 83 TVVASLSYFAMATGHATTFNCDTAWDHHKHVPDTSHQV-----CRQVFWGRYVDWALTTPLLLLELCLLAGVD-----------GAHTLMAI Ff 73 TMIASIAYFTMAS----NLGWTPIAVEFQRSNHRVAGI-----YREIFYARYIDWFLTTPLLLTDLLLTAGMP-----------WPTVLWVI Lm 91 TLTAALSYFAMATGHGVALNKIVIRTQHDHVPDTYETV-----YRQVYYARYIDWAITTPLLLLDLGLLAGMS-----------GAHIFMAI Hs 63 PAIAFTMYLSMLLGYGLTMVP-------------FGGE-----QNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDAD-----------QGTILALV Sc 163 VGTLFWVVSLLVGSLIKST---YKWGYYTIGRVAMLVTQGVICQRQFFNLKTRG-----FNALMLCTCMVIVWLYFICWGLS-DGGNRIQPD Cv 127 FMSIVLVITGLVAALVPST---YKWGYYTFGVSALFYIWYVLLWHGPHTTFAAGGVLRRGYILAAGYLSFLLLLYPIAWACA-EGGNVISVT Nc2 135 FLSWIWVIGYLVAAYVPSN---YKWGLFAFAALAHIFLAFETLFRARSSANRVG--INRDYTMLSGWTNLLWLLYPIAWGVS-DGGNVIGVT Nc1 159 VADVIMVLCGLFAALGEGGNTAQKWGWYTIGCFSYLFVIWHVALHGSRTVTAKGRGVSRLFTGLAVFALLLWTAYPIIWGIA-GGARRTNVD Ff 145 LVDWVMIVTGLVGALVKSS---YKWGYFAFGCAALAYIVYVLAWEARLHAKHVGPDVGRTFVMCGSLTAVVWILYPIAWGVC-EGGNLIAPD Lm 167 VADLIMVLTGLFAAFGSEG-TPQKWGWYTIACIAYIFVVWHLVLNGGANARVKGEKLRSFFVAIGAYTLILWTAYPIVWGLA-DGARKIGVD Hs 126 GADGIMIGTGLVGALTKVY--SYRFVWWAISTAAMLYILYVLFFGFTSKAESMRPEVASTFKVLRNVTVVLWSAYPVVWLIGSEGAGIVPLN Sc 246 GEAIFYGVLDLCVFAIYPCYLLIAVSRDGKLPRLSLTGGFSHHHATDDVEDAAPETKEAVPESPRASGETAIHEPEPEAEQAVEDTA 332 Cv 215 SEMIWYGILDIFAGPIFLFFFLWELRGVDYATFGLHSGKYTDKSAYAPNTAQAAGTVPATTSTG---AAGNV--------------- 283 Nc2 221 KSMIFFGILDVLFITTLSYAFVVLSRRWDYSRLNIAFTQYGRVPIAGTYPEKHATTDPHSGVTDPHTAAPAV--------------- 292 Nc1 250 TEILIYTVLDLLA PVFGFWLLLSHRAMPET--NIDLPGYWSHGLATEGRIRIGEED------------------------------ 304 Ff 233 SEAVFYGILDLIA PVFGALLLWGHRNIDPARLGLRIRDIDERIFPDGPNNKVASGHGARNDTATASGSNVNPNA------------ 307 Lm 257 GEIIAYAVLDVLA GVFGAWLLVTHANLRES--DVELNGFWANGLNREGAIRIGEDDGA---------------------------- 313 Hs 216 IETLLFMVLDVSA VGFGLILLRSR------------AIFGEAEAPEPSAGDGAAATSD---------------------------- 262 Fig. C2.3. Comparación de CarO con proteínas representativas de la familia de las opsinas. Las proteínas mostradas son HSP30 de S. cerevisiae (Sc, código de acceso NP_009950), Cvhsp30/1 de C. versicolor (Cv, 074631), Yro-2r de N. crassa (Nc2, CAB92637), Nop-1 del mismo hongo (Nc1, AAD45253), CarO (Ff, CAD97459), Ops de L. maculans (Lm, AAG01180) y la bacteriorrodopsina de H. salinarum (Hs AAG42454). Los aminoácidos coincidentes en la misma posición en al menos cuatro de las proteínas comparadas están sombreados en gris. Los aminoácidos relevantes conservados están indicados por el código de una letra y su posición en la bacteriorrodopsina. Las barras numeradas indican los siete dominios transmembrana. estructural de nuevos miembros de la familia. La similitud de la secuencia de CarO con la de la bacteriorrodopsina sugiere una estructura tridimensional similar para la primera, organizada en siete hélices αtransmembranales. Los segmentos correspondientes a cada una de estas hélices se destacan en la Fig. C2.3. Una vez disponible la secuencia del genoma de F. graminearum, se llevó a cabo un análisis de la presencia de genes de presuntas opsinas en este hongo mediante la búsqueda de genes con similitud a carO. Los análisis mediante BLAST permiteron identificar tres genes de esta familia. Uno de ellos (XP_383240) es presumiblemente el ortólogo de carO, a juzgar por el alto porcentaje de identidad de la proteína determinada (77%) y su ligamiento al agrupamiento de los genes car. El segundo (XP_387730) determina una presunta proteína con un porcentaje de identidad con CarO del 36%. El correspondiente ortólogo de F. fujikuroi se ha denominado opsA y está siendo actualmente estudiado por Alejandro F. Estrada en el mismo grupo de investigación. El tercero (XP_381616) determina una proteína con un grado de identidad menor con CarO (25%). Como CarO, las presumibles proteínas determinadas por XP_387730 y OpsA poseen el residuo de lisina supuestamente responsable de la unión de retinal, pero no así la proteína determinada por XP_381616, por lo cual se está dando menos prioridad al estudio de esta última. Resultados. C2 51 K216 Como ya se ha indicado en la introduccion, los genes carRA,carB ycarO se encuentran contiguos en el genoma de F. fujikuroi y comparten su regulación a nivel de ARNm (Prado et al., 2004). Puesto que predecimos la existencia de más genes asociados a esta ruta, parece probable que puedan estar ubicados en el entorno de esos tres genes, formando un agrupamiento génico de mayor tamaño. A fin de investigar esta posibilidad, se han analizado las secuencias adyacentes bajo la perspectiva de una posible conexión funcional con la ruta biosintética o el metabolismo de los carotenoides. Resultados previos del grupo mostraron que en dirección 3’ por detrás de carO se encuentra un marco abierto de lectura que determina una proteína similar a permeasas de amonio (Fernandez et al., 2000). El grupo de la Dra. Bettina Tudzynski, en la Universidad de Münster (Alemania), analizó la secuencia en dirección 5’ por delante de carRA (Linnemanstöns et al., 2002), y encontró un marco abierto de lectura cuya similitud con otras proteínas nos ha permitido identificar sus extremos 5’ y 3’. La secuencia de este gen, al cual llamamos carX, fue determinada en colaboración entre ambos laboratorios, a partir de ADN genómico en el laboratorio de Münster, y a partir de ADN complementario en esta Tesis. La secuencia fue depositada en las bases de datos bajo el código de acceso GenBank/EMBL AJ854252. Capítulo 3. Caracterízación del gen carX, que determina una proteína de la familia de las oxigenasas de carotenoides 3.1. CarX es una posible oxigenasa de carotenoides El gen carX consiste en una secuencia codificante de 2.135 pares de bases (apéndice 3.1), interrumpida por un único intrón de 44 pares de bases, que se espera que determine una proteína de 696 aminoácidos (Apéndice 3.2). El gen carX está orientado en sentido contrario a carRA, compartiendo con éste una misma región 5’ con potenciales señales reguladoras comunes (Fig. C3.1). El análisis mediante Blast de la secuencia de la presumible proteína CarX reveló un elevado grado de similitud con proteínas de la familia de las oxigenasas de carotenoides, de las cuales se muestran algunos ejemplos xxxxxxx Fig. 2. Comparación de CarX con seis proteínas de la familia de las oxigenasas de carotenoides. Los aminoácidos presentes en la misma posición en al menos tres de las proteínas están sombreados en gris; los recuadros negros indican las posiciones conservadas en al menos seis de las proteínas comparadas. Hs: Homo sapiens (Hs1: proteína del epitelio pigmentado de la retina (RPE65), código de acceso Q16518; Hs2: β,β–caroteno 15,15´-dioxigenasa, Q9HAY6). At: Arabidopsis thaliana (At1: 9-cisepoxicarotenoide dioxigenasa, Q9LRR7; At2: carotenoide 9,10–9´,10´ dioxigenasa, CAA06712). Ss: Synechocystis sp. (lignostilbeno-α,βdioxigenasa, P74334). Cc: Coprinus cinereus (UDP-N-acetilglucosamina-dolicil-fosfato-N-acetilglucosaminafosfotransferasa, O13438). Ff: Fusarium fujikuroi (proteína CarX). carX carRA carB carO Hs1 1 -----------------------------------MSIQVEH--------------------PAG------------------GYKKLFE---------------------------- Hs2 1 -----------------------------------MDI-IF------------------------------------------GRNRK------------------------------ Ss 1 ---------------------------------MVTSPPTSS--------------------PSQR------------SYSPQDWLRGYQ---------------------------- At1 1 ---------------------------MAEKLSDGSIIISVH--------------------PRPS------------KGFSSKLLDLLERLVVKLMHDAS---------LPLHYLSG At2 1 MASFTATAAVSGRWLGGNHTQPPLSSSQSSDLSYCSSLPMASRVTRKLNVSSALHTPPALHFPKQSSNSPAIVVKPKAKESNTKQMNLFQRAAAAALDAAEGFLVSHEKLHPLPKTAD Ff 1 ----------------------------MKFLQQNSFTQTSMS------------------QPHED------------VS-PAIRHPYLTG--------------------------- Cc ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Hs1 18 ----TV------EELSSPLTAHVTGRIPLWLTG-SLLRCGPG-LFEVGSEPFYHLFDGQALLHKFDFK----EGHVTYHRR--FIRTDAYVR---AMTEKRIVIT-EFGTCAFPDPCK Hs2 11 ------------EQL-EPVRAKVTGKIPAWLQG-TLLRNGPG-MHTVGESRYNHWFDGLALLHSFTIR----DGEVYYRSK--YLRSDTYNT---NIEANRIVVS-EFGTMAYPDPCK Ss 26 ----SQ------PQEWDYWVEDVEGSIPPDLQG-TLYRNGPG-LLEIGDRPLKHPFDGDGMVTAFKFPG---DGRVHFQSK--FVRTQGYVEE--QKAGKMIYRG-VFGSQPAGGWLK At1 51 NFAPIR------DETPPVKDLPVHGFLPECLNG-EFVRVGP--NPKFDAVAGYHWFDGDGMIHGVRIK----DGKATYVSR--YVKTSRLKQE--EFFGAAKFMK-IGDLKGFFGLLM At2 119 PSVQIAGNFAPVNEQPVRRNLPVVGKLPDSIKG-VYVRNGA--NPLHEPVTGHHFFDGDGMVHAVKFE----HGSASYACR--FTQTNRFVQE--RQLGRPVFPKAIGELHGHTGIAR Ff 33 ---NFAP----IHKTTNLTPCTYSGCIPPELTGGQYVRNGGNPVSHQDLGKDAHWFDGDGMLSGVAFRKASIDGKTIPEFVNQYILTDLYLSRKTTSIASPIMPSITTLVNPLSTMFQ Cc 1 ----MQR-----RNLLNGEETMVLGPNPRPLSN--VSLFGL--VPVASWFVVRPFIDPVPHVPALYTS----IGFSIFAFL-----TALYLIP---ALGPTFIKSNLKGRDLLKTYES Hs1 114 NIFSRFFSYFRG--VEV---------TDNALVNVYPVGEDYYACTETNF---ITKINPETLETIKQVDLCNYVSVN-G----------------------ATAHPHIENDGTVYNIGN Hs2 104 NIFSKAFSYLSHTIPDF---------TDNCLINIMKCGEDFYATSETNY---IRKINPQTLETLEKVDYRKYVAVN-L----------------------ATSHPHYDEAGNVLNMGT Ss 124 TIFDLRLKNIAN------------------T-NITYWGDRLLALWEGGQ---PHRLEPSNLATIGLDDLGGILAEGQP----------------------LSAHPRIDPASTFDGGQP At1 151 VNIQQLRTKLKILDNTYG--------NGTANTALVYHHGKLLALQEADKPYVIKVLEDGDLQTLGIIDYDKRLTHS------------------------FTAHPKVDP---VTGEMF At2 226 LMLFYARAAAGIVDPAHG--------TGVANAGLVYFNGRLLAMSEDDLPYQVQITPNGDLKTVGRFDFDGQLEST------------------------MIAHPKVDP---ESGELF Ff 144 IMFATFRTIFLVILSNLPGSQQAIKRISVANTAVLYHDGRALATCESGP---PMRIQLPSLDTVGWFDGVEAEGEPEISQAGSDDSPFGGSGIFSFMKEWTTGHPKVDP---VTGEML Cc 94 QGLICGAVYILS-----------------LILFIPFAFNHPLEPPPEAK---PEGISILDFPHHKLSVYLSSIISLLI----------------------ATFLGFLDDVFDIRWRHK Hs1 195 CFGKN-FSIAYNIVKIPP--LQADKE--DPISKSEIVVQFPCSDRFKPSYVHSFGLTPNYIVFVETPVKINLFKFLSSWSLWGANYMDCFESNETMGVWLHIADKKRKKYLNNKYRTS Hs2 187 SIVEK-GKTKYVIFKIPATVPEGKKQGKSPWKHTEVFCSIPSRSLLSPSYYHSFGVTENYVIFLEQPFRLDILKMATAY-IRRMSWASCLAFHREEKTYIHIIDQRTRQPVQTKFYTD Ss 198 CYVT--FSIKSSLSSTLT-LLELDPQGKLLRQKTETFPGF-----A---FIHDFAITPHYAIFLQNNVTLNGLPYLFGL--R--GAGECVQFHPDKPAQIILVPRDGGEIKRIPVQAG At1 234 TFGYS-HTPPYLTYRVIS--KDGIMHDPVPITISEPIM------------MHDFAITETYAIFMDLPMHFRPKEMVKEK-------KMIYSFDPTKKARFGVLPRYAKDELMIRWFEL At2 309 ALSYDVVSKPYLKYFRFS--PDGTKSPDVEIQLDQPTM------------MHDFAITENFVVVPDQQVVFKLPEMIRGG-------SP-VVYDKNKVARFGILDKYAEDSSNIKWIDA Ff 256 LYHNT-FMPPYVHCSVLP---KSNEKAPGHRLVNQPVLGVSG-----ARMMHDFGASRSHTIIMDLPLSLDPLNTMKGK--------EVVAYDPTKPSRFGVFPRHLPSS--VRWFHT Cc 170 LPIPIIASIPLLMVYYAE---RGNTNIVMPIPLRPLFG-----------TLVNLGPLYYLYMILLSTFSTNSINILAGI-----------NGSEASQALIIAISVILNDLLYLPWRFG Hs1 308 P-FNLFHHINTYED------NGFLIVDLCCWKGFEFVYNY---LYLANLRENWEEVKKNARKAPQPEVRRYVLPLNIDK-ADTGKNLVTLPNTTATAILCSDETIWLEPEVLFSGP-- Hs2 303 A-MVVFHHVNAYEE------DGCIVFDVIAYE-DNSLYQL---FYLANLNQDFKE---NSRLTSVPTLRRFAVPLHVDKNAEVGTNLIKVASTTATALKEEDGQVYCQPEFLYEG--- Ss 301 ---FVFHHANAFEE------NGKIILDSICYN-------S---LPQVDTDGDFRS-------------------TNFDN-LDPGQLWRFTIDPAAATVEKQLMVSRC----------- At1 330 PNCFIFHNANAWEE------EDEVVLITCRLE-----------NPDLDMVSGKVK-------------------EKLENFGNELYEMRFNMKTGSASQKKLSASAVD----------- At2 405 PDCFCFHLWNAWEEPE----TDEVVVIGSCMT------------PPDSIFNESDE--------------------NLKS---VLSEIRLNLKTGESTRRPIISNEDQQ---VN----- Ff 355 APCCIFHTANTWDSQSSE-GELSVNLLACRMTSSTLVYTAGNIRPPVRSRCTQARVWSDERE---ETACRYKEAPALESPGESTGLADYFPITAESDDYDQCRLYYYEFDLAMESRNH Cc 263 -FRFPLHLLGNRAEVEFGGVYGAGMAKGSHILVERHLFSFYFMLPLVAVVSAFLY------------------HNWYPARAFPGDTLCYLNGKAFAVVGIQAHFSKTLLL-------- Hs1 413 --------RQAFEFPQINYQKYCGKPYTYAYGLGLN----------HFVPDRLCKLNVKT-KETWVWQEPDS--------------------------------YPSEPIFVSHPDAL Hs2 404 -----------LELPRVNY-AHNGKQYRYVFATGVQW---------SPIPTKIIKYDILT-KSSLKWREDDC--------------------------------WPAEPLFVPAPGAK Ss 369 -----------CEFPVVHP-QQVGRPYRYVYMGAAHHSTG------NAPLQAILKVDLESGTETLRSFAPHG--------------------------------FAGEPIFVPRPGGV At1 401 -------------FPRINE-CYTGKKQRYVYGTILDS---------IAKVTGIIKFDLHAEAETGKRMLEVGGN-------------------IKGIYDLGEGRYGSEAIYVPRETAE At2 476 -----------LEAGMVNR-NMLGRKTKFAYLALAEP---------WPKVSGFAKVDLTT-GEVKKHLYGDN-------------------------------RYGGEPLFLPGEGGE Ff 469 VKSQWALSAIPFEFPSVRP-DREMQEARYIYGCSTSTSCFGVALGRADKVDLLVKMDAKTLIQRGKKMNATSITGCVDRRSVCEILQEQRKDDPIYIFRLPPNHYAQEPRFVPRACST Cc 354 -----------FFIPQVFN-FVLSAPQLFGLVPCPRHR--------VPRFDPETNLLYPSKAQFLKPPSRLS-----------------------AAVLHILSTLGLVELTVHPNGSI Hs1 480 EEDDGVVLSVVVSPGAG----------QKPAYLLILNAKDLSEVARAEVEINIPVTFHGLFKKS------------------------------------------------ 533 Hs2 468 DEDDGVILSAIVSTDP-----------QKLPFLLILDAKSFTELARASVDVDMHMDLHGLFITDMDWDTKKQAASEEQRDRASDCHGAPLT--------------------- 547 Ss 437 AEDDGWLLCLIYKADLH----------RSELVILDAQDITAPAIATLKLKHHIPYPLHGSWAQT------------------------------------------------ 490 At1 477 -EDDGYLIFFVHDENTG----------KSCVTVIDAKTMSAEPVAVVELPHRVPYGFHALFVTEEQLQEQTLI--------------------------------------- 538 At2 541 -EDEGYILCFVHDEKTW----------KSELQIVNA--VSLEVEATVKLPSRVPYGFHGTFIGADDLAKQVV---------------------------------------- 599 Ff 586 EEDDGYLLFYVFDESQLLPSGDCPPSATSELWILDAK-NMRDVVAKVRLPQRVPYGLHGTWFSSQDIESQRSVESLRSLEVVQRKKEEWVNSGGQIRKSWMVLREKLEKAVG 696 Cc 429 LEVTNLTILNFFLVRLG---------PMNEKRLNQV--LMASQTAGSVLAFVIRYGLAGLVYDGDRR--------------------------------------------- 484 Fig. C3.1. Agrupamiento de los genes car. En gris se destacan los genes ya estudiados, y en negro el gen objeto de estudio de este capítulo, carX. Las interrupciones indican intrones Resultados. C3 60 representativos en la Fig. C3.2. Varios miembros de esta familia catalizan reacciones de rotura oxidativa de diferentes carotenoides, dando lugar a apocarotenoides. Hemos confeccionado un árbol filogenético con una colección representativa de proteínas de esta familia (Fig. C3.3). En este árbol se puede apreciar que CarX no se ubica en ninguno de los grupos de enzimas de función conocida, sugiriendo que se trata de una enzima perteneciente a una nueva subfamilia. El mayor parecido se encuentra en una enzima de Streptomyces antibioticus, probablemente implicada en la síntesis del antibiótico simociclinona (Galm et al., 2002). Fig. C3.3. Árbol filogenético (método Neibourgh joining) de proteínas representativas de la familia de las oxigenasas de carotenoides. Cada proteína está nombrada con su código de acceso SPTREMBL y la abreviatura de la especie. Ag, Ambystoma tigrinum; As, Anabaena sp.; At, Arabidopsis thaliana; Br, Brachydanio rerio; Bs, Bos taurus; Ca, Capsicum annuum; Cc, Coprinus cinereus; Cp, Cynops pyrrhogaster; Cs, Crocus sativus; Gg: Gallus gallus; Hs, Ho mo sap ien s; Le, Lyc op e rs ic on esculentum; Mm, Mus musculus; Pa, Persea americana; Pp, Pseudomonas paucimobilis; Ps, Pisum sativum; Pv, Phaseolus vulgaris; Sa, Streptomyces an ti bi oticu s; Se , Sy ne cho co cc us elongatus; Ss, Synechocystis sp.; Zm, Zea mays. Los asteriscos indican las secuencias comparadas en la Fig. C2.3 La barra interrumpida es tres veces más larga de lo mostrado (marcada con “x3”). La barra de escala representa 0,1 sustituciones por sitio. 3.2. Transcripción de carX La secuencia de carX y su ligamiento al agrupamiento génico sugiere una posible relación con la ruta biosintética de los carotenoides. Esta relación es reforzada por el análisis del efecto de la luz y las mutaciones de superproducción de carotenoides sobre los niveles de ARNm del gen carX (Thewes et al., 2005). El resultado (Fig. C3.4) mostró un claro paralelismo con los genes carRA,carB ycarO en diferentes condiciones de cultivo y fondos genéticos (Prado et al., 2004), indicando la existencia de un mecanismo de regulación común para los cuatro genes. En particular, los niveles de ARNm de carX fueron casi indetectables en la estirpe silvestre incubada en la oscuridad y aparecieron en respuesta a la luz, alcanzando un máximo tras una hora de iluminación para disminuir en las horas siguientes, un proceso conocido como fotoadaptación, ya descrito en la Introducción. Aún más significativamente, los niveles de ARNm fueron elevados en la oscuridad en dos mutantes desregulados para la síntesis de carotenoides. Q94IR2 Pv oxigenasas de carotenoides 9,10- 9',10' Q84KG4 Ca Q84KG5 Cs Q9AXZ5 Pa Q9LRM7 At O24592 Zm Q9LRR7 At O24023 Le Q8LP14 Ps oxigenasas de 9-cis epoxicarotenoide P74334 Ss Q8YPB4 As Q8DMU6 Se oxigenasas de α,β lignostilbeno CarX Q8RQW2 Pp Q53353 Pp Q52008 Pp Q93FA4 Sa Q9YGX2 Gg Q16518 Hs Q05661 Bs Q8AXN9 Cp Q9YI25 Ag proteínas del epitelio pigmentado de la retina Q99NF1 Mm Q7ZTS0 Br O13438 Cc CAA06712 At * * * Q9HAY6 Hs Q9I993 Gg oxigenasas de β,β-caroteno - 15,15‘ 0.1 * * * * x 3 Resultados. C3 61 Fig. C3.5. Aspecto de la estirpe silvestre IMI58289 y tres mutantes ∆carX. L a s e s t i r p e s h a n s i d o cultivadas en oscuridad (panel superior) o en la luz (panel inferior) en medio mínimo durante 4 días a 30ºC. 3.3. Función del gen carX La clase de reacciones enzimáticas llevadas a cabo por las oxigenasas de carotenoides sugiere de inmediato una función para CarX en la ruta carotenogénica de Fusarium, ya que el último paso de esta ruta es la rotura oxidativa de toruleno para dar lugar a un apocarotenoide oxigenado, la neurosporaxantina. Aunque la naturaleza de esta reacción química difiere en sus detalles con las realizadas por otras enzimas de la misma familia (generación de un radical carboxilo en lugar de un radical aldehído), se decidió comprobar esta hipótesis investigando el efecto de la pérdida de función del gen carX. Como parte de la colaboración ya citada, el grupo de la Dra. Tudzynski generó mutantes nulos del gen carX por reemplazamiento con un gen de resistencia a higromicina (hygR). Para ello transformaron la estirpe silvestre IMI58289 con un plásmido que contiene dicho gen rodeado por secuencias adyacentes a carX y seleccionaron transformantes que hubieran reemplazado el gen carX por el gen hygR mediante doble recombinación (Thewes et al., 2005). 3.4. Fenotipo de mutantes ∆carX El grupo de la Dra. Tudzynski proporcionó tres transformantes carentes del gen carX, que denominaron T2.1, T5.2 y T17.1, y cuyo fenotipo fue investigado en esta Tesis. Los tres mutantes mostraron un crecimiento y morfología similares a los de la estirpe silvestre (Fig. C3.5). Sin embargo, se apreciaron diferencias en la pigmentación, siendo ésta más intensa en la luz en los tres mutantes en comparación con la estirpe silvestre. También llamó la atención la presencia de una ligera pigmentación anaranjada en la oscuridad, ausente en la estirpe silvestre. Se determinó la concentración de carotenoides en las cuatro estirpes, (tres mutantes y silvestre) cultivadas sobre agar en luz y oscuridad a dos temperaturas diferentes, 22°C y 30°C. Las diferencias de pigmentación se apreciaron externamente a ambas temperaturas, y correlacionaron con la acumulación de diferentes concentraciones de carotenoides en sus micelios, xxxxxxx silvT2.1 T5.2 T17.1 silvT2.1 T5.2 T17.1 carX ARNr carX ARNr 0 1 O 15 30 60 120 O O O silv SG22 SG68silv 240 Fig. C3.4. Expresión de carX. Northern blot de ARN total de la estirpe silvestre IMI58289 (silv) y dos mutantes superproductores de carotenoides (SG22 y SG68) cultivados en oscuridad (O) o en luz durante el tiempo indicado (minutos). Se muestran las señales de ARNr como control de carga. Las barras mostradas bajo las hibridaciones muestran el cociente entre la intensidad de cada señal de ARNm y la de ARNr (Oscuridad: barras grises; luz: barras blancas). El valor más alto en cada hibridación se tomó como 1. Resultados. C3 62 F i g . C 3 . 6 . Análi sis de carotenoides de la estirpe silvestre IMI58289 (silv) y tres mutantes carX.A. Contenido en carotenoides de las estirpes cultivadas en medio mínimo en oscuridad (barras gris oscuro) y luz (barras gris claro). Los datos de los culti vo s iluminados representan la suma de los carotenos neutros (sección inferior de la barra) y los carotenos polares (sección superior de la barra). Cada barra representa la media de dos determinaciones. B. Espectro de absorción de la fracción polar de la estirpe silvestre y los tres mutantes cultivados en la luz a 30ºC. La longitud de onda de absorción máxima de los cuatro espectros es aproximadamente 477 nm. El análisis mediante HPLC de los carotenoides neutros acumulados por estas estirpes mostró un incremento de al menos cuatro veces en fitoeno y βcaroteno en los mutantes en relación a la estirpe silvestre (Fig. C3.7). Además, el pico de γ-caroteno fue más prominente en los cromatogramas de los mutantes, indicando un cociente mayor γ-caroteno/toruleno. La mayor proporción de fitoeno, β-caroteno y γ-caroteno sugiere una mayor actividad de sintasa de fitoeno y ciclasa, ambas actividades supuestamente determinadas por el gen bifuncional carRA. siendo éstas mayores en los mutantes en todas las condiciones de cultivo (Fig. C3.6). El incremento de la cantidad de carotenoides de los mutantes fue proporcionalmente más llamativo en oscuridad, donde se observó un incremento de unas 5 veces (T5.2 y T17.1) o 10 veces (T2.1) en relación a los valores en la estirpe silvestre. Cuando las estirpes se cultivaron en la luz, las diferencias fueron mayores a nivel de cantidad, pero no tanto en cociente, limitándose la diferencia a incrementos del 50% a 30°C y del doble a 22°C. El contenido de carotenoides de todas las estirpes fue mayor a 30°C que a 22°C en la oscuridad, un dato ya descrito anteriormente (Avalos y Cerdá-Olmedo., 1987). La mayor concentración de carotenoides en la luz a 30°C que a 22°C debe atribuirse a la mayor intensidad lumínica empleada a 30°C más que a la diferencia de temperatura. Para llevar a cabo un análisis más detallado de los carotenoides producidos por la estirpe silvestre y los mutantes, se escogieron las condiciones de iluminación por ser mayores las concentraciones de carotenoides y, por tanto, la fiabilidad del análisis. De forma análoga a la estirpe silvestre, los tres mutantes contienen una mezcla de carotenoides polares y no polares (Fig. C3.6A) tanto a 22°C como a 30°C. El espectro de la fracción polar de las cuatro estirpes es similar en forma y máximo de absorción, y coincide aproximada-mente con el de la neurosporaxantina (Fig. C3.6B). El incremento en el contenido de carotenoides de los mutantes se debe principalmente a una mayor acumulación de carotenos neutros, correspondientes a los intermediarios de la ruta. silv T2.1 T5.2 T17.1 22ºC 0 50 100 150 200 250 300 30ºC silv T2.1 T5.2 T17.1 350 A B T2.1wt T5.2 T17.1 400 500 600 longitud de onda (nm) 400 500 600400 500 600400 500 600 Carotenoides (µg/g masa seca) Absorbancia Resultados. C3 63 3.5. Expresión de los genes car en los mutantes carX Investigamos la expresión de los genes carRA,carB ycarO en la estirpe silvestre y en dos de los mutantes ∆carX (Fig. C3.8). Las tres estirpes contuvieron cantidades muy bajas de ARNm de estos genes en la oscuridad, y cantidades mucho mayores tras una hora de iluminación. El análisis cuantitativo de las señales de los tres genes en las estirpes investigadas mostró mayores niveles para carRA ycarO en los dos mutantes en la luz, pero no para carB (Fig. C3.8, recuadros de la izquierda). Aunque las diferencias observadas xx Fig. C3.8. Expresión de los genes carRA,carB ycarO en los mutantes carX. Los Northern blots mostrados están realizados con ARN total de la estirpe silvestre IMI58289 (silv) y dos mutantes ∆carX, cultivados en la oscuridad (O) o expuestos a la luz (L) durante una hora. Los paneles a la izquierda muestran el resultado de exposiciones cortas para una mejor apreciación de las diferencias en expresión. Los paneles de la derecha muestran exposiciones largas de las señales en la oscuridad de la izquierda y la de la estirpe silvestre en la luz como control de sobreexposición. Las señales de ARNr se utilizan como control de carga. Las barras bajo los paneles muestran los cocientes entre las intensidades de las señales de los genes indicados y las señales de ARNm (oscuridad: barras grises; luz: barras blancas). Los valores se representan en relación al cociente máximo en cada panel, tomado como 1. La intensidad de las señales fue estimada mediante densitometría. carRA carB silv silv T2.1 T5.2 T2.1 T5.2 0 0 carO rRNA carO rRNA rRNA rRNA 1 1 1 0 carB rRNA carRA rRNA Fig. C3.7. Cromatogramas de HPLC de la fracció n de carotenos neutros acumulados por la est irpe silvestre IMI58289 (silv) y los mutantes carX.Las estirpes se cultivaron a 30ºC en la luz (absorción a 462 n m p a r a l o s c a r o t e n o s coloreados y 286 nm para el fitoeno). fitoeno γ-caroteno β-caroteno toruleno 6 26 26 29 10 5 4 5 T2.1 T5.2 T17.1 silv 1 462 nm 286 nm 12 14 16 tiempo de elución (min) Absorbencia Resultados. C3 64 O L O L O L O L O O no fueron muy importantes, correlacionan con el incremento de fitoeno y carotenos ciclados en los cromatogramas de los mutantes (Fig. C3.7). La sobreexposición de las membranas obtenidas en estos experimentos de Northern sobre las películas permitió detectar niveles apreciables de ARNm de carRA ycarB en el micelio de los mutantes cultivados en la oscuridad, pero no en el de la estirpe silvestre (Fig. C3.8, paneles de la derecha). Este dato correlaciona con el incremento en carotenoides en la oscuridad observada en los mutantes ∆carX. Esta diferencia no se apreció, sin embargo, para el gen carO, aunque los cambios de expresión de este gen no se espera que tengan consecuencias sobre la ruta carotenogénica. Resultados. C3 65 3.6. Discusión En este capítulo hemos descrito el gen carX, situado en la región 5’ anterior al gen carRA y orientado de forma divergente a éste último. carX determina una proteína cuya secuencia la identifica como miembro de la familia de la oxigenasas de carotenoides. La mayoría de los miembros de esta familia llevan a cabo reacciones de corte oxidativo de carotenoides. La comparación de su secuencia con las de enzimas de esta familia investigadas en detalle a nivel bioquímico muestra que CarX conserva las cuatro histidinas que coordinan el átomo de Fe2+ del centro activo de este tipo de enzima. Por tanto, CarX presenta características que sugieren que se trata de una enzima funcional, capaz de llevar a cabo una reacción de corte oxidativo de un carotenoide. El análisis filogenético no coloca a CarX dentro de ninguno de los grupos bien establecidos de oxigenasas de carotenoides, lo que dificulta hacer predicciones más concretas sobre la reacción enzimática que cataliza. Su pertenencia a una subfamilia diferente sería coherente con una actividad enzimática distinta a las descritas hasta la fecha, como podría ser el corte oxidativo del toruleno, cuya enzima responsable no ha sido identificada. Este hecho, unido al ligamiento de carX a los genes necesarios para producir toruleno desde pirofosfato de geranilgeranilo (carRA ycarB), y a compartir con ellos una misma regulación a nivel de ARNm (Linnemanstöns et al., 2002; Prado et al., 2004), hacen que su función como enzima responsable de la conversión de toruleno en neurosporaxantina sea una hipótesis muy tentadora. La existencia de un gen responsable de este paso enzimático fue puesto en evidencia por la identificación de mutantes que acumulan toruleno (Avalos y Cerda-Olmedo., 1987). Uno de ellos, denominado SG68, fue tomado como referencia de este fenotipo y de base para la denominación genética del gen responsable, carT. En consecuencia, de ser cierta la citada hipótesis, los mutantes del gen carX deberían tener el fenotipo de SG68, visible externamente por una característica pigmentación rojiza resultante de la acumulación de toruleno en lugar de neurosporaxantina. Sin embargo, los mutantes carX descritos en este capítulo conservan la capacidad de sintetizar neurosporaxantina y su pigmentación, como en la estirpe silvestre, es anaranjada. El gen que denominamos carX no es, por tanto, carT. Esta conclusión fue reafirmada por la posterior identificación del auténtico gen carT, descrita en el Capítulo 5 de esta Tesis. La información disponible sobre carX, su hipotética función como gen de una oxigenasa de carotenoides y su corregulación con los genes carRA,carB y carO, son aún pistas muy significativas sobre su posible papel biológico. Los genes car investigados proporcionan una segunda hipótesis tan sugerente como la anterior. Como ya se indicó en la Introducción, las opsinas utilizan retinal como grupo prostético. Las características de la hipotética opsina determinada por el gen carO sugiere que muy probablemente necesita retinal para llevar a cabo su función (Capítulo 2 de resultados; Prado et al., 2004). La capacidad para ligar retinal ha sido demostrada in vitro para la opsina determinada por un gen similar en N. crassa,nop-1 (Bieszke et al., 1999a). Parece lógico pensar que si carO necesita retinal, esta molécula la sintetice una enzima cuyo gen comparta su regulación con la de carO. Por tanto, es plausible que la función de CarX sea producir retinal por rotura oxidativa de un carotenoide precursor. Son varias la enzimas conocidas de la familia de las oxigenasas de carotenoides responsables de la producción de retinal por rotura oxidativa de β-caroteno, precursor que se encuentra presente en F. fujikuroi. Discusión. C3 66 De ser cierta esta hipótesis, el fenotipo de los mutantes ∆carX debería coincidir con el del mutante carO. Los mutantes de este gen no dan lugar a ninguna alteración fenotípica en condiciones de laboratorio (Prado et al., 2004). Sin embargo, la pérdida del gen carX produce un sensible incremento en los niveles de carotenoides, una alteración detectable externamente y reflejada en cambios en los niveles de ARNm. Concluimos que la mutación carX tiene consecuencias en la regulación de la ruta biosintética en su conjunto. En el contexto de la hipótesis planteada, este hecho puede tener al menos dos causas: (1) el retinal es una señal reguladora y su ausencia induce la ruta, y (2) el retinal es usado como grupo prostético por al menos una segunda proteína, que pierde su función en su ausencia y da lugar al fenotipo observado. En apoyo de la segunda opción, ya se hizo mención en el Capítulo anterior de la existencia en F. fujikuroi al menos un segundo gen para una supuesta opsina potencialmente capaz de ligar retinal (Alejandro F. Estrada, datos no publicados). Cabe pensar, por tanto, que el fenotipo de la mutación carX se deba a la pérdida de función de esta segunda opsina, actualmente en estudio en el mismo grupo de investigación. El fenotipo manifestado por los mutantes ∆carX puede tener su causa también en un posible papel regulador de la propia proteína CarX. Hasta ahora se han descrito tres agentes causantes de incremento de la producción de carotenoides en F. fujikuroi: la luz (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987; Avalos y Schrott, 1990), las mutaciones en el gen carS (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987) y la pérdida del gen carB (Fernández-Martín et al., 2000). El tercero de ellos, interpretado como resultado de un mecanismo de retroinhibición por producto final, se caracteriza por un incremento de cinco veces en el contenido de carotenoides y solo se manifiesta en la luz (Fernandez-Martín et al., 2000; A. F. Estrada, datos no publicados). Ninguno de estos tres fenómenos regulatorios es aparentemente asociable al fenotipo mostrado por los mutantes carX, que produce un incremento moderado de la carotenogénesis, tanto en luz como en oscuridad. El análisis químico de los carotenoides acumulados en la luz por las estirpes estudiadas muestra un enriquecimiento en fitoeno, β-caroteno y γ-caroteno en los mutantes ∆carX, lo que sugiere un incremento relativo de las actividades sintasa de fitoeno y ciclasa de caroteno (dependientes de CarRA) respecto a la actividad desaturasa (CarB). Es interesante resaltar que este resultado concuerda con el sensible incremento observado en los niveles de ARNm de carRA pero no de carB en los mutantes carX en la luz. Es también un hecho a resaltar que la mutación carX en la luz aparentemente solo afecta a carRA, mientras que en la oscuridad se observa que la mutación ∆carX afecta también a la expresión de carB. Aunque no tiene aparentes consecuencias sobre la ruta biosintética, también parece haber diferencias en el efecto de la mutación carX sobre los niveles de ARNm del gen carO en la luz y en la oscuridad. La falta de información sobre los mecanismos de regulación a nivel molecular de la carotenogénesis por la luz nos impiden proponer explicaciones a estas diferencias. Si la función de carX fuera sintetizar retinal, cabría esperar que la regulación de dicha síntesis mostrara peculiaridades independientes de las necesidades de regulación de la síntesis de neurosporaxantina. Así, en oscuridad, un nivel bajo de expresión de los genes car debe dar lugar a un nivel bajo de opsina, que necesitará un nivel bajo de retinal. La pérdida de carX daría lugar a la pérdida completa de retinal; en ese caso, el incremento en la síntesis de carotenoides en xx Discusión. C3 67 F i g . C 4 . 1 1 . E x p r e s i ó n y purificación de la proteína CarX. SDS-PAGE del extracto total de E. coli expresando GST- CarX (carril 1), el correspondiente control, expresando GST (carril 2), proteínas solubilizadas conteniendo GST-CarX (carril 3) y GST-CarX purificada por glutatión-sefarosa y eluída con glutatión (carril 4). Fig. C4.12. Actividad in vitro de CarX sobre β-caroteno. A n á l i s i s p o r H P L C d e l o s productos resultantes de la incubación de β-caroteno en ausencia de CarX (GST) o en presencia de 1,1 µg/ml de CarX (GST-CarX). Los recuadros interiores muestran el espectro de los picos relevantes y su interpretación: β-caroteno (a); retinal (b). La longitud de onda (nm) de absorción máxima de cada carotenoide se indica en el espectro (350-550 nm). Se muestra en el recuadro superi- o r l a r e a c c i ó n d e c o r t e propuesta. 170 130 100 70 55 40 35 1 2 3 4 GST- CarX GST 386 451 b a a b tiempo (min) 10 20 30 40 50 60 GST GST- CarX 0 a a b b absorbencia O O 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 161.0 57.0 91.0 105.0 175.0 284.1 M+ 120.0 159.0 85.0 185.0 213.0 241.1 285.1 294.1 354.9 429.9 388.9 489.1 529.0 629.2612.5 m/z Abundancia relativa A110 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 175.1 159.0 119.0 105.0 285.1 241.0 269.0 213.0 77.0 286.1 342.3 404.9 430.0 523.0492.0 555.3 630.4595.3 161.0 284.1 M+ m/z Abundancia relativa B110 Fig. C4.10. Cromatograma CG/EM de la muestra de presunto retinal presente en el cultivo de E. coli que expresa el gen carX. A. Espectro del compuesto correspondiente al pico “b” en la Fig. C4.9. B. Espectro del retinal. 2005; Scherzinger et al., 2006). El espectro incluye la presencia del ion característico de m/z = 284 y el fragmento típico de m/z = 161, indicativo de la pérdida del anillo de ionona del ion parental. Los datos descritos sugieren fuertemente que las células de E. coli que expresan el gen carX cortan β-caroteno para producir retinal. 4.5. Actividad in vitro de la proteína CarX Para investigar la actividad enzimática de la proteína CarX, se expresó el gen carX fusionado a un gen de transferasa de S-glutatión (GST) en una estirpe apropiada de E. coli. La correspondiente proteína de fusión CarX-GST producida por la bacteria se purificó (Fig. C4.11) y se utilizó en ensayos in vitro con β-caroteno como sustrato. El análisis mediante HPLC mostró que dicha incubación da lugar a la aparición de cantidades significativas de retinal, ausente en incubaciones control (Fig. C4.12). Experimentos hechos en paralelo en presencia de licopeno no permitieron detectar ningún producto, indicando la Resultados. C4 74 382 462 a b tiempo (min) 10 20 30 40 50 60 b a GST GST-CarX 0 a O OO O a b absorbencia necesidad de una anillo β-ionona en el sustrato. Recientemente se ha descrito que la enzima SynACO (ver apartado 3.3.1 en Introducción) corta apocarotenoides de diferente longitud de cadena en el doble enlace central 15,15‘, produciendo en todos los casos una molécula de retinal y un supuesto fragmento de tamaño variable (Ruch et al., 2005). Para investigar la capacidad de CarX de producir retinal a partir de apocarotenales, se hicieron ensayos in vitro con β-apo-8´-carotenal (C30) como sustrato. El análisis mediante HPLC de los carotenoides resultantes de esta incubación muestran de nuevo la aparición de retinal, indicando la capacidad de CarX para reconocer también este sustrato (Fig. C4.13). Fig. C4.13. Actividad in vitro de CarX sobre β-apo-8´-carotenal. Análisis por HPLC de los productos resultantes de la incubación de β-apo-8´-carotenal en ausencia de CarX (GST) o en presencia de 1,1 µg/ml de CarX (GST-CarX). Los recuadros interiores muestran el espectro de los picos principales y su interpretación: β-apo-8´-carotenal (a); retinal (b). La longitud de onda (nm) de absorción máxima de cada carotenoide se indica en el espectro (350-550 nm). Se muestra a la derecha la reacción de corte propuesta. 4.6. Relación entre la producción de retinal y el fenotipo de los mutantes carX Como ya se ha descrito, los mutantes carX acumulan más carotenoides que la estirpe silvestre tanto en luz como en oscuridad (Capítulo 3; Thewes et al., 2005). Se ha propuesto en la discusión del capítulo anterior que este fenotipo, presuntamente regulatorio, puede ser causado por la falta de retinal, que podría ejercer así de señal regulatoria. Para comprobar esta hipótesis, se cultivó la estirpe silvestre y un mutante ∆carX en medio mínimo suplementado con retinal y ácido retinoico (ambos a 0,75 mM). Para facilitar el acceso de estos retinoides a la célula, se añadieron al medio disueltos en etanol y emulsionados con un detergente (tween-80), condiciones empleadas previamente para investigar el efecto de la vitamina A (en forma de acetato de retinol) o la βionona (apocarotenoide) en la estirpe silvestre (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1986). El experimento se realizó a 22°C en oscuridad, condiciones en las que la diferencia en la producción de carotenoides entre la estirpe sivestre y los mutantes carX es proporcionalmente mayor. Los resultados de este experimento (Fig. C4.14) muestran un aumento en las concentraciones de carotenoides tanto en la estirpe silvestre como en el mutante ∆carX en presencia de retinal o de ácido retinoico, pero también en presencia de xxx Resultados. C4 75 Fig. C4.14. Concentraciones de carotenoides en el micelio de la estirpe silvestre IMI58289 (silv) y el mutante ∆carX T2.1. Las estirpes se incubaron siete dias en la oscuridad a 22°C en medio mínimo en presencia de los compuestos que se indican. Se representa la media de dos medidas, indicadas por puntos. las mismas concentraciones de etanol y detergente empleados para su solubilización. El resultado del experimento sugiere que la presencia de estos retinoides no tiene consecuencias relevantes sobre la regulación de la síntesis de carotenoides en F. fujikuroi, tanto en la estirpe silvestre como en el mutante carente de actividad CarX. 60 50 40 30 20 10 0silv T21 silv T21 silv T21 silv T21 control EtOH Tween EtOH Tween retinal EtOH Tween ác.retinoico Resultados. C4 76 carotenoides (µg/g masa seca) Fig. C4.15. Probables modificaciones químicas del retinal en E. coli. O Retinal OH Retinol O O Retinil-acetato E. coli E. coli 4.6. Discusión En este capítulo se han empleado varias estrategias experimentales para demostrar que la proteína CarX es una oxigenasa de carotenoides que cataliza la reacción de corte de β-caroteno para producir retinal. Aunque los cultivos de E. coli productores de β-caroteno no mostraron una coloración muy intensa, la expresión del gen carX en estas células dio lugar a la pérdida de la pigmentación amarilla característica del β-caroteno, un cambio particularmente visible cuando las células se precipitan por centrifugación. Tal pérdida de color no fue resultado de la desaparición de los carotenoides, sino de su conversión en carotenoides de menor tamaño que absorben a longitudes de onda fuera del visible. Tal es el caso del retinol, retinil ester y retinal, detectados a concentraciones variables en estos experimentos, pero cuyos máximos de absorción por debajo de 400 nm les impiden dar color al cultivo. Especialmente relevante fue la confirmación de la presencia de retinal en este cultivo de E. coli. Su naturaleza química quedó sólidamente demostrada mediante la comparación con retinal comercial por varias técnicas diferentes, incluyendo su patrón de separación en HPLC, su espectro de absorción y su cromatograma CG-EM. La presencia de retinol y retinil ester fue verificada también por su patrón de elución en HPLC y su espectro. En el caso del retinol, se confirmó además la naturaleza química del grupo alcohol mediante esterificación. En contraste con la decoloración producida en células de E. coli productoras de β-caroteno, no se observó cambio de color como resultado de la expresión de carX en un cultivo productor de licopeno. Una actividad baja de la enzima sobre este sustrato posiblemente no se vería reflejada en el color del cultivo, pero en los cromatogramas de HPLC no se detecta la menor traza de ningún carotenoide nuevo, sugiriendo muy baja o nula eficiencia de CarX para cortar licopeno. Resultados similares se obtuvieron con la enzima BCO-I humana, que corta β-caroteno pero no licopeno (Lindqvist y Andersson, 2002). Este resultado indica que CarX necesita que su sustrato posea un extremo ciclado. Esta conclusión fue reafirmada por la ausencia de actividad sobre licopeno en ensayos in vitro con la enzima CarX purificada. La presencia de retinol además de retinal en los experimentos in vivo puede levantar dudas sobre la identidad del auténtico producto generado por la enzima CarX a partir del β-caroteno. Esta duda quedó despejada mediante el análisis de la actividad in vitro de la enzima. Bajo estas condiciones, la incubación de CarX con β-caroteno dio lugar exclusivamente a retinal, demostrando que la actividad de la enzima es la reacción de corte en el doble enlace 15,15´ del sustrato dejando grupos aldehído en los dos extremos. La existencia de retinol y acetato de retinol en las muestras solo puede ser explicada por la oxidación del radical aldehído del retinal y la posterior acetilación del grupo alcohol, reacciones que tienen lugar presuntamente en la propia bacteria (Fig. C4.15). Existen ya precedentes de la capacidad de E. coli para oxidar retinal a retinol (von Lintig y Vogt, 2002). La enzima CarX fue capaz de cortar también un sustrato monocíclico, el βapo-8´-apocarotenal, dando lugar igualmente a retinal. Este experimento nos dice que el reconocimiento del doble enlace 15,15´ es determinado por la distancia desde un anillo de β-ionona, siendo la naturaleza química del otro extremo mucho menos relevante. Este mismo mecanismo de selección de sitio se observó en las enzimas SynACO (Ruch et al., 2005; Kloer et al., 2005) y xxxxxxx Discusión. C4 77 NosACO (Scherzinger et al., 2006). Desconocemos si las modificaciones sufridas por el retinal en E. coli tienen lugar también en F. fujikuroi. El grupo aldehído de los apocarotenales tiende a reaccionar de forma espontánea con los grupos amino de los aminoácidos de proteínas de E. coli, formando enlaces de base de Schiff similares a los que forma con las opsinas. Puesto que la presencia de retinal en E. coli es una situación artificial para la bacteria, las reacciones químicas sufridas (oxidación, esterificación y unión a proteínas) pueden ser consecuencia de su acumulación en ausencia de procesos naturales que controlen su destino. No debe ser ese el caso del hongo, que se espera que posea mecanismos de captación del retinal para ser incorporado a las opsinas, bien de forma directa o por mediación de algún tipo de proteína transportadora. La primera posibilidad es plausible, ya que el retinal es una molécula básicamente apolar que se ubica con facilidad en el entorno hidrofóbico de las membranas lipídicas, lugar donde se encuentran también las opsinas. La segunda posibilidad sería necesaria si el lugar de síntesis de carotenoides estuviera fisicamente separado de las membranas donde ejerzan su función las opsinas. Ese podría ser fácilmente el caso si las opsinas fueran proteínas mitocondriales. La demostración del papel de CarX como enzima suministradora de retinal permite reconsiderar el fenotipo parcialmente desregulado de los mutantes carentes de la enzima (capítulo 3). Estrictamente hablando, podemos considerar acarX como un nuevo gen estructural de la ruta, y el retinal como uno de sus presumibles productos finales. Parece razonable pensar por tanto que la célula emplee el retinal como señal reguladora, y que la ausencia de retinal provoque una estimulación de la ruta, por ej. a través de un mecanismo de retroinhibición. Nuestros resultados contradicen esta hipótesis, ya que el mutante carX sigue mostrando una síntesis elevada de carotenoides cuando se le suministra retinal en el medio de cultivo. Sin embargo, no la descartan, ya que no se puede demostrar que el retinal acceda al sitio adecuado en la célula. En experimentos similares en el hongo P. blakesleeanus, la adición al medio de acetato de retinol u otros retinoides, emulsionados de la misma forma que en nuestro experimento, da lugar a una fuerte activación de la carotenogénesis, resultado que es interpretado por la interferencia ejercida por estos compuestos sobre el mecanismo de retroinhibición por β-caroteno (Eslava et al., 1974). En F. fujikuroi ya se conocía con anterioridad la falta de efecto de la adición de acetato de retinol o β-ionona a la estirpe silvestre (Avalos y Cerdá-Olmedo., 1986). Estos mismos experimentos describieron sin embargo un modesto efecto inductor del etanol, que explica la ligera activación encontrada en los experimentos descritos en la Fig. C4.14. Si el retinal no ejerce un papel como señal reguladora, la desregulación observada en los mutantes carX puede ser debida a la ausencia de la propia enzima o a la pérdida de función de una proteína que requiera retinal, como es el caso de las opsinas (Capítulo 1 de resultados). La primera hipótesis parece improbable, ya que no hay precedentes que nos permitan atribuir a una oxigenasa de carotenoides una función regulatoria a sumar a la de su propia actividad enzimática. Como ya se indicó en el Capítulo 2 de resultados, los mutantes nulos carO carecen de fenotipo sobre la carotenogénesis, pero existe un segundo gen de opsina, opsA, cuya pérdida de función pudiera ser la desencadenante de la desregulación. Ese sería el caso, por ej., si como consecuencia de la pérdida de las opsinas se produjera un aumento del estrés oxidativo en la célula, señal capaz de incrementar la síntesis de carotenoides en xxx Discusión. C4 78 otros hongos (Gessler et al., 2002; Yoshida y Hasunuma, 2004). Los resultados descritos en este capítulo constituyen la primera demostración de síntesis de retinal en hongos. El descubrimiento en los últimos años de la existencia de opsinas en este Reino, y la demostración en el caso particular de una de ellas (Nop-1 de N. crassa) de la utilización de retinal como grupo prostético, dirige la atención a la existencia de enzimas similares con la misma función que carX en otros hongos. Nuestros resultados abren la puerta a estos estudios. Discusión. C4 79 Capítulo 5. Identificación del gen carT, que determina la oxigenasa de carotenoides responsable del corte oxidativo de toruleno Los resultados del capítulo anterior muestran que el gen carX determina una oxigenasa de carotenoides, confirmando por tanto su relación con la carotenogénesis y extendiendo el regulón car a cuatro genes. Puesto que tanto la mutación dirigida del gen carX (Capítulo 3; Thewes et al., 2005) como el análisis de la actividad de la proteína CarX (Capítulo 4) indican que no guardan relación con la reacción de rotura oxidativa del toruleno, se procedió a buscar otros genes de la misma familia en el genoma de F. graminearum. El análisis mediante Blast reveló la presencia de un nuevo gen con similitud significativa a la oxigenasa de βcaroteno humana I (BCO I; código de acceso NP_059125). A la luz de los resultados descritos en este capítulo, hemos identificado este gen como carT, anteriormente definido por mutación (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987). En contraste con carX,carT no está ligado a los genes estructurales de la ruta en el genoma de F. graminearum, sino que se encuentra a 1,2 megabases de distancia en el mismo cromosoma. 5.1. Clonación del gen carT La supuesta proteína con similitud a BCO I identificada en F. graminearum es XM_382801. Aprovechando la similitud de secuencia entre F. graminearum yF. fujikuroi, se escogieron segmentos altamente conservados de dicha proteína y se diseñaron cebadores adecuados con los que se hicieron experimentos de PCR para obtener un fragmento interno del mismo gen de F. fujikuroi (Fig. C5.1). De esta forma se obtuvo un fragmento de 657 pb a partir de la estirpe silvestre FKMC1995. A continuación se emplearon nuevos cebadores basados en dicha secuencia para obtener los extremos 5´ y 3´ del gen mediante la técnica de Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). Finalmente, se clonó el gen completo de las estirpes silvestres FKMC1995 e IMI58289 a partir de ADN genómico y ADN complementario, y se determinó su secuencia. Fig C5.1. Proceso de clonación del gen carT de F. fujikuroi. En un primer paso se obtuvo un segmento interno mediante PCR. En un segundo paso se obtuvieron los extremos 5´y 3´mediante la técnica de RACE. En ambas estirpes silvestres se identificó un marco de lectura de 1781 pb (apéndices 5.1 y 5.2), interrumpidos por un solo intrón de 47 pb, que determina una presumible proteína de 577 aminoácidos (apéndices 5.3 y 5.4). La secuencia del gen carT de FKMC1995 difiere de la de IMI58289 en 11 bases, que da lugar a siete aminoácidos diferentes en las correspondientes proteínas (Fig. C5.2). Esta divergencia es inesperadamente alta al tratarse de dos estirpes silvestres de la misma especie, y contrasta con la ausencia de diferencias entre otras parejas de genes ortólogos, tales como carRA ocarO. La proteína CarT tiene el mismo tamaño que la de F. graminearum, y ambas comparten un 82% de identidad. Como cabe esperar, la identidad es mucho menor si se compara con enzimas de la misma familia de otras especies. Así, por ej., solo un 27% de los aminoácidos están conservados entre CarT y BCO I (Fig. C5.3). Sorprendentemente, BCOI muestra menor similitud con la otra oxigenasa de carotenoides de F. fujikuroi (20%), CarX, aunque ambas enzimas catalizan la misma reacción, la rotura central del β-caroteno para dar retinal (Capítulo 4). Además, las proteínas CarX y CarT de F. fujikuroi son tan diferentes entre sí como cada una de ellas con BCOI, (28% de identidad). Ambos genes contienen un solo intrón en el dominio 5´, aunque no está localizado en posiciones idénticas (Fig. C5.3). 5.2. El gen carT está mutado en la estirpe productora de toruleno SG68 Se ha descrito previamente un mutante de F. fujikuroi que acumula toruleno en lugar del producto final neurosporaxantina (Avalos y Cerda-Olmedo, 1987). Este mutante (SG68) presenta un color rojizo, distinguible del color naranja de la estirpe de la que proviene, SG22 (Fig. C5.4). El análisis por HPLC de los carotenoides de ambas estirpes confirmó la abundancia de toruleno y la inexistencia de neurosporaxantina en el mutante SG68 en comparación con SG22. Fig C5.2. Diferencias de secuencia de la proteína C a r T e n l a s e s t i r p e s s i l v es t r e s I M I 5 8 2 8 9 y FKMC1995. Las barras indican sobre el mapa del gen las posiciones donde el aminoácido es distinto en ambas estirpes. 5´ 3´ oligos degenerados RACE RACE 1000 20000 carT 82 Resultados. C5 462 c 473 a 452 d b a c d b cd 5 486 b 100 tiempo (min) SG22 SG68 absorbencia ACO --------MVTSPPTSSPSQRSYS-------------------PQDWLRG-YQSQPQEWDYWVEDVEGSIPPDLQG-TLYRNGPGLLEIGDRPLK-----HPFDGDGMVTAFKFPG---- 82 NCED MAEKLSDGSIIISVHPRPSKGFSSKLLDLLERLVVKLMHDASLPLHYLSGNFAPIRDETPPVKDLPVHGFLPECLNGEFVRVGPNPK--FDAVAGY----HWFDGDGMIHGVRIK----- 109 BCOI --------------------------------------------MDIIFG--RNRKEQLEPVRAKVTGKIPAWLQG-TLLRNGPGMHTVGESRYN-----HWFDGLALLHSFTIR----- 63 CarX -MKFLQQNSFTQTSMSQPHEDVS-----------------PAIRHPYLTGNFAPIHKTTNLTPCTYSGCIPPELTGGQYVRNGGNPVSHQDLGKDA----HWFDGDGMLSGVAFR----- 93 CarT --MALNGPGVYHRTREHEQEDASDITKN---------ILAESWKSWPNEAAFDRLEEHRGPLRLTLKGTIPSWAAG-SLYRTGPGQSRVEDTARGTHFTTHWFDGFAQTHRFDIIPSEDG 108 ACO DGRVHFQSKFVRTQGYVEEQKAGKMIYRGVFG----------------SQPAGGWLKTIFDLRLKN------------IANTNITYWGDRLLALWEGGQPHRLEPSNLATIGLDDLGGIL 174 NCED DGKATYVSRYVKTSRLKQEEFFGAAKFMKIG---------DLKGFFGLLMVNIQQLRTKLKILDNTYGNG--------TANTALVYHHGKLLALQEADKPYVIKVLEDGDLQTLGIIDYD 212 BCOI DGEVYYRSKYLRSDTYNTNIEANRIVVSEFGT-------------MAYPDPCKNIFSKAFSYLSHTIPDFT------DNCLINIMKCGEDFYATSETNYIRKINPQTLETLEKVDYRKYV 164 CarX KASIDGKTIPEFVNQYILTDLYLSRKTTSIASPIMPSITTLVNPLSTMFQIMFATFRTIFLVILSNLPGSQQAIKRISVANTAVLYHDGRALATCESGPPMRIQLPSLDTVGWFDGVEAE 213 CarT ETQVWYSSRRQADEWIADVKKKGWRSGMTFGQKADPCVGIFAKVMTVFEPKLGNHNVALLANVPGVPKDEETEVSNGVPGPLGHRVNTSNLFVSTDYTGIRRIDPSTLQPLAETTQYDLH 228 ACO AE----------------------GQPLSAHPRIDPASTFD--------GGQPCYVTFSIKSSLSSTLTLLELD---PQGKLLRQKTETFPGFAFIHDFAITPHYAIFLQNNVTLNGLPY 261 NCED KR---------------------LTHSFTAHPKVDPVT------------GEMFTFGYSHTPPYLTYRVISKDG------IMHDPVPITISEPIMMHDFAITETYAIFMDLPMHFR---P 290 BCOI AVN-----------------------LATSHPHYDEAGNVLNMGTSIVEKGKTKYVIFKIPATVPEGKKQGKSP-WKHTEVFCSIPSRSLLSPSYYHSFGVTENYVIFLEQPFRLDILKM 260 CarX GEPEISQAGSDDSPFGGSGIFSFMKEWTTGHPKVDPVT------------GEMLLYHNTFMPPYVHCSVLPKSNEKAPGHRLVNQPVLGVSGARMMHDFGASRSHTIIMDLPLSLD---P 318 CarT PSLS--------------------GPCSCSHAQRDPDS------------GDLFNFNLAFG-RVPTYRIFRVDTASGETEVLATISDLNVP-PAYMHSFFLTENHVVICIPASHYAWRGL 314 ACO LFGLRGAG---ECVQFHPDKPAQIILVPRDGG---EIKRIPVQAGFVFHHANAFEE----NGK-----IILDSICYNSLPQVDTDG--------------------------DFRSTNFD 340 NCED KEMVKEKK---MIYSFDPTKKARFGVLPRYAKDELMIRWFELPNCFIFHNANAWEE----EDE-----VVLITCRLENPDLDMVSG---------------------------KVKEKLE 371 BCOI ATAYIRRMSWASCLAFHREEKTYIHIIDQRTR-QPVQTKFYTDAMVVFHHVNAYEE----DGCIVFDVIAYEDNSLYQLFYLANLN------------------------QDFKENSRLT 351 CarX LNTMKGK----EVVAYDPTKPSRFGVFPRHLP--SSVRWFHTAPCCIFHTANTWDS----QSSEGELSVNLLACRMTSSTLVYTAGNIRPPVRSRCTQARVWSDEREETACRYKEAPALE 428 CarT KTQWEGNIID-SMKPFDKERKCKWLVVDRRHG-KGLVATFSTPAAFFFHSINAFEKNIEDEDGTEQTDLFFDLAKYNNMDIIKGFY--------------------------YDVLMDRD 406 ACO NLDPG--------------------QLWRFTIDPAAATVEKQL----MVSRCCEFPVVHPQQVGRPYRYVYMG------AAHHSTGNAPLQAILKVDLESGTETLRS------------- 416 NCED NFGN---------------------ELYEMRFNMKTGSASQKK----LSASAVDFPRINECYTGKKQRYVY---------GTILDSIAKVTGIIKFDLHAEAETGKRMLEVGGN------ 451 BCOI SVPTLRRFAVPLHVDKNAEVGTNLIKVASTTATALKEEDGQVYCQPEFLYEGLELPRVNYAHNGKQYRYVF---------ATGVQWSPIPTKIIKYDILTKSSLKWR------------- 449 CarX SPGESTGLADYFPITAESDD-YDQCRLYYYEFDLAMESRNHVKSQWALSAIPFEFPSVRPDREMQEARYIYGCSTSTSCFGVALGRADKVDLLVKMDAKTLIQRGKKMNATSITGCVDRR 547 CarT DATKKYWFKNDRYKNCAPTLTRYRFRLPSAPTPDTTFSASAEQVLAIPSPHAGELPTIHPLRNGKPYRYVYS--------ASLRGLTTSVDALVKTDLDTSEAFIWTG------------ 506 ACO -------------------FAPHGFAGEPIFVPRPGGVAEDDGWLLCLIYKAD----------LHRSELVILDAQDITAPAIATLKLKHHIPYPLHGSWAQT------------------ 490 NCED -------------IKGIYDLGEGRYGSEAIYVPRET-AEEDDGYLIFFVHDEN----------TGKSCVTVIDAKTMSAEPVAVVELPHRVPYGFHALFVTEEQLQEQTLI--------- 538 BCOI --------------------EDDCWPAEPLFVPAPGAKDEDDGVILSAIVSTD---------PQKLPFLLILDAKSFTELARASVDVDMHMD--LHGLFITDMDWDTKKQAASEEQRDRA 538 CarX SVCEILQEQRKDDPIYIFRLPPNHYAQEPRFVPRACSTEEDDGYLLFYVFDESQLLPSGDCPPSATSELWILDAKNMR-DVVAKVRLPQRVPYGLHGTWFSSQDIESQRSVESLRSLEVV 666 CarT --------------------PEGHTPGEPVFVPRPGAEAEDDGIVFSLVVDGVN----------EKAYILCLNGKTMEELGRAEADFAIGQG--FHGIHLPAA----------------- 577 ACO ------------------------------ NCED ------------------------------ BCOI SDCHGAPLT--------------------- 547 CarX QRKKEEWVNSGGQIRKSWMVLREKLEKAVG 696 CarT ------------------------------ Fig. C5.3. Comparación mediante Clustal de CarT, CarX y tres proteínas representativas de la familia de las dioxigenasas de carotenoides. Se han sombreado en gris los aminoácidos presentes en la misma posición en al menos tres de las proteínas. Se destacan en negro las cuatro histidinas que coordinan el átomo de Fe2+. Los recuadros de trazo contínuo enmarcan láminas βy los de trazo discontinuo hélices α(Kloer et al., 2005). La estrella bajo la secuencia de CarT muestra el residuo afectado por la mutación en la estirpe SG68. Los triángulos muestran la posición del intrón en carX ycarT. ACO: oxigenasa de apocarotenoides de Synechocystis sp, código de acceso NP_441748; BCO-1: dioxigenasa de β-caroteno 1 de H. sapiens, Q9HAY6; NCDE: oxigenasa de carotenoides 1 de A. thaliana, CAA06712. Fig. C5.4. Pigmentación y análisis de carotenoides de las estirpes SG22 y SG68. Las fotos muestran colonias de 3 días de edad cultivadas a 30ºC en medio mínimo en la oscuridad. Los carotenoides acumulados por estas colonias fueron analizados por HPLC. Se muestran los cromatogramas obtenidos a la longitud de onda de 462 nm. Los espectros (350-550 nm) y longitud de onda de absorción máxima de los picos relevantes, correspondientes a neurosporaxantina (a), toruleno (b), γcaroteno (c) y β-caroteno (d), se muestran en los recuadros internos. Como primera aproximación para elucidar el posible papel del gen carT en la conversión enzimática de toruleno en neurosporaxantina, se secuenció el alelo de este gen en SG68 y se comparó con la secuencia de la estirpe parental. El alelo carT de SG68 contiene una transición G259->A, que se espera provoque la sustitución de una glicina por un residuo de aspartato en la posición 71 de la proteína (Fig. C5.3). Este aminoácido neutro está muy conservado en diferentes enzimas de esta familia, lo cual sugiere que su sustitución por un aminoácido altamente polar puede alterar severamente a la actividad de la enzima. Este resultado nos lleva a proponer que CarT es la oxigenasa de carotenoides que media el corte oxidativo del toruleno para producir neurosporaxantina en F. fujikuroi. 83 Resultados. C5 5.9. Discusión En este capítulo se describe un gen de F. fujikuroi que determina una nueva enzima de la familia de las oxigenasas de carotenoides. Hemos demostrado que dicha enzima lleva a cabo una reacción de corte sobre el toruleno para producir β-apo-4´-carotenal (C35), la forma aldehído del carotenoide ácido neurosporaxantina. Es la primera vez que se describe esta actividad enzimática, tanto en hongos como en cualquier ser vivo. Además, hemos encontrado que un mutante descrito anteriormente como bloqueado en la reacción de corte del toruleno, denominado SG68, presenta una mutación en este gen. Nuestros resultados rellenan un hueco muy significativo en el conocimiento de la ruta biosintética de la neurosporaxantina. Esta ruta no solo está presente en Fusarium (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987) sino también en Verticillium sp. (Valadon y Mummery, 1976) y N. crassa, el primer organismo en el que este carotenoide fue descrito (Aasen y Jensen, 1965). Siguiendo una estrategia complementaria a este trabajo, se ha comprobado que la mutación dirigida del ortólogo de carT en N. crassa (llamado cao-2) da lugar al bloqueo de la síntesis de neurosporaxantina y a la consiguiente acumulación de toruleno (Saelices et al., manuscrito en preparación). La enzima CarT muestra similitud significativa con la enzima SynACO de la cianobacteria Synecchocystis sp. (Ruch et al., 2005), cuya estructura tridimensional ha sido determinada recientemente (Kloer et al., 2005). Además de las cuatro histidinas esenciales que coordinan el cofactor Fe2+, muchos otros aminoácidos importantes están conservados en CarT, incluyendo los implicados en la formación del centro activo. Así, esta enzima parece conservar la estructura básica de SynACO, la cual se presume que se conserva en otros miembros de esta familia. La disparidad en la longitud del polipéptido predicho para CarT en comparación con otros miembros de la familia (87 residuos más que en SynACO) se debe básicamente a diferencias en la longitud de los dominios que constituyen los lazos que unen las diferentes hojas β, y afectan mínimamente a los dominios importantes. La mutación encontrada en la estirpe SG68, localizada muy cerca de la cuarta histidina que coordina el Fe2+, afecta a un residuo de glicina altamente conservado. Es presumible que su reemplazamiento por un residuo de ácido aspártico, diferente tanto en tamaño como en carga eléctrica, altere la estructura del centro activo y de lugar a una proteína no funcional. Las pruebas más consistentes del papel de CarT como enzima responsable de la reacción de corte del toruleno para producir neurosporaxantina provienen del estudio de su actividad enzimática. Tanto su expresión en células de E. coli productoras de carotenos como su purificación y posteriores ensayos in vitro con diferentes sustratos apuntan a una actividad como oxigenasa de carotenoides capaz de cortar de forma asimétrica diferentes sustratos para producir apocarotenoides con un extremo aldehído. Se trata de una enzima que requiere sustratos con al menos un extremo no ciclado. Así, la enzima carece de actividad sobre el β-caroteno, un rasgo que la diferencia del producto del gen parálogo carX. Los experimentos in vitro fueron facilitados por la solubilidad y estabilidad de la proteína CarT purificada, que permitieron hacer los ensayos sobre carotenoides no disponibles en E. coli. De esta forma, la incubación con su sustrato natural predecible, el toruleno, solo se pudo realizar in vitro, ya que nuestros intentos para obtener una estirpe productora de toruleno de E. coli xxxx 90 Discusión. C5 fracasaron. Los ensayos in vitro, sin embargo, fueron particularmente eficaces cuando se empleó toruleno. CarT cortó este sustrato con gran eficiencia para producir β-apo-4´-carotenal como único producto. Esta molécula es idéntica a la neurosporaxantina, salvo que posee en su extremo un grupo aldehído en lugar de un grupo ácido. Estos datos sugieren que el papel biológico de CarT en la carotenogénesis de F. fujikuroi es producir una primera reacción de corte oxidativo sobre el toruleno. Dadas la singulares características de esta reacción, se llevaron a cabo ensayos in vitro con diferentes carotenoides para obtener información sobre los requisitos de reconocimiento del sustrato. Para ello se utilizaron carotenoides sintéticos, como el β-apo-8´-carotenal, el β-apo-10´-carotenal y el apo-8´-licopenal. Ninguno de estos sustratos se espera que sean sustratos naturales de CarT en el hongo; sin embargo, fueron reconocidos por la enzima para dar lugar con diferentes grados de eficiencia a otros apocarotenoides. La incubación con β-apo-8´-carotenal (C30) yβ-apo-10´-carotenal (C27) dió lugar a la producción principalmente de dos isómeros de un aldehído de 22 carbonos y retinal, respectivamente. Aunque se obtuvieron trazas de retinal en el ensayo con β-apo-8´-carotenal (C30), estos resultados sugieren que el sitio de corte lo determina la distancia al extremo no ciclado, no la distancia al extremo ciclado. De ser la distancia al anillo la que determinara el punto de reacción, se esperaría un solo producto de ambos sustratos, sin importar que ambos tengan diferente longitud de cadena. Este es el caso de la enzima SynACO, la cual produce retinal a partir de apo-carotenales de diferente tamaño (Ruch et al., 2005; Kloer et al., 2005). Respecto a la naturaleza química del extremo reconocido por la enzima, los dos apocarotenales utilizados poseen un grupo aldehído, mientras que el toruleno carece de oxígeno en la molécula. Para investigar el efecto de la presencia de este radical, se incubó la enzima con apo-8´-licopenal, sustrato que presenta dos extremos que se diferencian en la presencia o ausencia de un grupo aldehído. De hecho, el extremo no oxigenado de este carotenoide es idéntico al extremo no ciclado del toruleno. El resultado de este ensayo es la formación preferente de un dialdehído, lo que nos permite concluir que CarT reconoce más eficientemente un extremo como el presente en el toruleno. Aún así, el reconocimiento de los diferentes sustratos ensayados implica que CarT reconoce el extremo de la molécula de forma relativamente relajada, siendo irrelevante la longitud de ésta o la naturaleza química del otro extremo. Por tanto, aunque posiblemente con menor eficiencia, el producto de corte del toruleno, el β-apo-4´- carotenal, puede teóricamente ser reconocido también por la enzima. En tal caso se generaría un nuevo apocarotenoide de cadena más corta, que aún podría seguir siendo sustrato de CarT para sufrir nuevos recortes. In vivo no se detectan tales productos, probablemente porque la reacción predominante sobre el β-apo- 4´-carotenal sea su oxidación para generar un grupo carboxilo y dar lugar a la neurosporaxantina. La generación por CarT de un producto con un extremo aldehído era predecible, ya que esta es una característica típica de las enzimas pertenecientes a la familia de las oxigenasas de carotenoides (Wyss, 2004). Como ya se ha indicado arriba, nuestros resultados no cierran los genes de la ruta sino que los extiende a otro más, ya que cabe esperar la existencia de una enzima que reconozca β-apo- 4´-carotenal para producir neurosporaxantina. Los mutantes carentes de esta actividad enzimática acumularían presumiblemente β-apo-4´-carotenal, y deberían por tanto presentar una pigmentación rojiza, presumiblemente fácil de distinguir en el fondo anaranjado que caracteriza la acumulación de neurosxxxxx 91 Discusión. C5 poraxantina. Cabe esperar sin embargo que en ausencia de competencia, el βapo-4´-carotenal acumulado sea degradado por la propia enzima carT, en cuyo caso no está claro la pigmentación que tendría tal mutante. Hasta la fecha, no se han identificado mutantes que permitan sospechar la acumulación de β-apo-4´- carotenal, pero tampoco se han hecho búsquedas sistemáticas. Nuestros resultados invitan a ver con nuevos ojos los escrutinios de los experimentos de mutagénesis. El patrón de expresión del gen carT proporciona pruebas adicionales sobre su papel en la ruta de síntesis de carotenoides en F. fujikuroi. Este es el primero de los genes estructurales que no se encuentra ligado al agrupamiento de los genes car, formado por cuatro genes corregulados: carX,carRA,carB ycarO. El gen carT comparte con éstos la regulación por la luz de los niveles de ARNm incluyendo la fotoadaptación, y el incremento en la oscuridad en los mutantes superproductores de carotenoides. Esta es la regulación esperada para un gen estructural de la ruta biosintética de la neurosporaxantina. Como cabía esperar, los promotores de estos genes en F. graminearum comparten secuencias candidatas a facilitar la unión de proteínas reguladoras. Es interesante resaltar, sin embargo, que la desregulación manifestada por los mutantes superproductores de carotenoides afecta menos al gen carT que a los otros genes car en la oscuridad, mientras que en la luz no muestra diferencias. Esto se ve reflejado en una menor producción de neurosporaxantina en oscuridad en mutantes carS (ver estirpe SF4 en la Fig. C1.11). Este resultado sugiere que la luz interfiere sobre el mecanismo represor alterado en estos mutantes. Aunque CarT y CarX pertenecen a la misma familia y se encuentran en el mismo organismo, la comparación de sus secuencias muestra una alta divergencia de secuencia. De hecho, son tan diferentes entre sí como cada una de ellas respecto a la enzima humana BCOI, encargada de producir retinal a partir de β-caroteno. Parece probable que carX ycarT provengan de un gen común ancestral a raiz de una duplicación que, a juzgar por la alta divergencia, debió haber ocurrido muy temprano en la evolución. 92 Discusión. C5 Discusión general Discusión final Discusión general Los hongos filamentosos han sido extensamente usados como modelos de investigación de la biosíntesis de carotenoides y su regulación (Sandmann y Misawa, 2002). Entre ellos destacan los zigomicetos P. blakesleeanus,M. circinelloides yB. trispora para la producción de β-caroteno, el basidiomiceto X. dendrorhous para la producción de astaxantina, y los ascomicetos N. crassa yF. fujikuroi con la neurosporaxantina como producto mayoritario (revisado por Avalos y Cerda-Olmedo, 2004). En los casos de producción de β-caroteno y astaxantina, las investigaciones han estado justificadas por el interés aplicado de dichos carotenos, utilizandose actualmente B. trispora yX. dendrorhous para su producción industrial. Los genes responsables de las enzimas específicas de la carotenogénesis a partir de GGPP han sido identificados en los cuatro organismos citados (Ruiz-Hidalgo et al., 1997; Arrach et al., 2001; Velayos et al., 2000a, 2000b; Rodríguez-Saiz et al., 2004; Verdoes et al., 1999a; 1999b), incluyendo el reciente descubrimiento del gen responsable de la conversión de β-caroteno en astaxantina en X. dendrorhous (Ojima et al., 2006). La situación es distinta en N. crassa yF. fujikuroi. Las dos especies poseen una ruta carotenogénica muy similar que culmina con la síntesis de neurosporaxantina, una xantofila para la que de momento no se han encontrado aplicaciones comerciales. Los motivos de estudio de su carotenogénesis difieren en ambos hongos. En el caso de N. crassa las investigaciones tienen su origen en el aislamiento de mutantes albinos y en su utilización como marcadores en numerosos trabajos genéticos. En el caso de F. fujikuroi, el interés proviene de su uso como modelo en la producción de diferentes terpenoides además de los carotenoides, especialmente las giberelinas, así como otros metabolitos secundarios de la familia de los policétidos. Los resultados obtenidos abren nuevas perspectivas biotecnológicas en estos hongos ya que demuestran que sus rutas biosintéticas pueden desviarse hacia β-caroteno. Las concentraciones de carotenoides en F. fujikuroi, incluyendo el mutante SF21 (Capítulo 1 de Resultados), no compiten con los elevados niveles de producción descritos en P. blakesleeanus (Murillo et al., 1978) o B. trispora (Mehta et al., 2003), pero representan un punto de partida para futuras mejoras de la producción. En el caso de F. fujikuroi, las concentraciones actuales podrían tener ya interés aplicado si se tiene en cuenta que la biomasa del hongo es un subproducto obligado en la fermentaciones de producción de giberelinas, ya que éstas son escretadas al medio. Desconocemos el destino de las masas de micelio derivadas de esta industria. Si se reutilizan para alimentación animal, el incremento de βcaroteno puede representar una ventaja nutricional. También existen aplicaciones evidentes aún a bajas concentraciones de caroteno en el caso del uso de micelio de Fusarium para consumo humano (Wiebe, 2002), aunque en este caso la introducción de la mutación en la estirpe empleada por esta industria biotecnológica chocaría con la rigidez de la legislación en lo referente al uso de organismos modificados genéticamente. El peculiar fenotipo del mutante SF21 proporciona nuevas perspectivas en el conocimiento no solo de la desaturasa de F. fujikuroi sino de las desaturasas de carotenos en general. La visión rígida que se tenía de esta enzima está cambiando a medida que aparecen en la bibliografía nuevos ejemplos sobre su versatilidad. Así, por ejemplo, desaturasas que ejercen su función sobre sustratos de 40 átomos de carbono son también capaces de ejercer su acción sobre sustratos de 35 átomos de carbono (Umeno y Arnold, 2003) o de xxxxxxxxx 94 Discusión final 45 o 50 átomos de carbono (Tobias y Arnold, 2006). El único precedente de cambio en la especificidad de los sitios de reconocimiento dentro de un mismo sustrato se ha encontrado en R. sphaeroides (Wang et al, 2001). Es especialmente interesante que el efecto de la mutación es justamente el contrario que el observado en SF21, es decir, la adquisición de una nueva reacción de desaturación en un punto de la molécula donde antes no era capaz de actuar. En ambos casos se debe al cambio de un aminoácido en la misma región de la proteína. La versatilidad en el reconocimiento de sustratos y en la capacidad de hacer cuatro o más desaturaciones no parece fácil de reconciliar con la supuesta rigidez que impone la organización de la enzima en un complejo multimérico en el que cada monómero realiza una sola desaturación, descrito anteriormente para P. blakesleeanus (Aragón et al., 1976). En el momento de iniciar esta Tesis, tanto en N. crassa como en F. fujikuroi se habían identificado los genes necesarios para la síntesis de toruleno a partir de GGPP, al-1 yal-2 en un caso, carB ycarRA en el otro. Sin embargo, se desconocían los genes del resto de la ruta, presumiblemente un solo gen responsable de la síntesis de neurosporaxantina a partir de toruleno, cuya pérdida de función da lugar al fenotipo rojo mostrado por un mutante denominado carT (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987). Esta laguna de información es particularmente llamativa en N. crassa debido a la enorme atención prestada a la genética de este organismo, incluyendo el análisis de su genoma y su proteoma. Los resultados mostrados en esta Tesis han supuesto un avance considerable en el conocimiento de la genética y bioquímica de la síntesis de carotenoides en estos hongos, identi-ficando a CarT, una enzima capaz de introducir un corte oxidativo en el toruleno en una posición asimétrica. Esta proteína representa una nueva subfamilia dentro de las oxigenasas de carotenoides, y abre la puerta a la identificación de genes homólogos en otros hongos. Se espera, por ejemplo, que esté presente también en otras especies de Fusarium cuyos genomas serán pronto secuenciados, como es el caso de F. oxysporum. Además, su descubrimiento ha facilitado la identificación del gen homólogo en N. crassa en un trabajo realizado en el mismo grupo, próximo a ser publicado (L. Saelices et al., manuscrito en preparación). De forma inesperada, los resultados no cierran la ruta, sino que descubren una complejidad en sus últimas reacciones mayor de lo que cabía anticipar, ya que el producto de rotura del toruleno no es la neurosporaxantina, sino su versión aldehído. Parece por tanto probable la existencia de otro gen necesario para la síntesis de la xantofila ácida. Además, datos mostrados en el Capítulo 1 de esta Tesis (Fig. C1.4, estirpe SF4) señalan que F. fujikuroi posee diferentes variantes de la neurosporaxantina, como lo indican la similitud del espectro y las diferencias en su comportamiento cromatográfico de las diferentes fracciones de carotenoides polares identificadas. Aunque es posible que tales variantes sean el resultado de alteraciones químicas producidas en el proceso de extracción o en la manipulación de las muestras, es probable que tales modificaciones sean introducidas por el hongo sobre la neurosporaxantina de forma controlada, como ocurre al menos en otra especie de Fusarium (Sakaki et al., 2002) y que diferentes productos puedan cumplir distintas funciones. En tal caso cabe predecir actividades enzimáticas directa o indirectamente asociadas a la ruta. Como primer paso para abordar este problema, será necesario llevar a cabo un análisis químico de las diferentes fracciones mostradas en la Fig. C1.4, estudio no abordado en esta Tesis por limitaciones de tiempo. Una aportación particularmente relevante es la demostración de que F. xxxxxxxxx 95 Discusión final fujikuroi posee una enzima, que hemos denominado CarX, capaz de sintetizar retinal. Una enzima similar debe estar presente en todos los hongos que posean opsinas fotorreactivas. La necesidad de producción de retinal quedó en evidencia por primera vez en N. crassa con la demostración de la unión de este retinoide a la opsina Nop-1 (Bieszke et al., 1999b), pero este trabajo no fue acompañado por esfuerzos para demostrar la existencia de genes o enzimas involucrados en su síntesis. La comparación de los genomas fúngicos disponibles ha mostrado que no todos los hongos que poseen genes de presuntas opsinas poseen los genes necesarios para sintetizar caro-tenoides. Aunque en principio la existencia de opsinas con retinal no exige la capacidad de sintetizar este compuesto, como lo demuestran las opsinas visuales de los animales, es improbable que los hongos carentes de caroteno-génesis puedan incorporar carotenoides externos para utilizarlos como fuente de retinal. Por un lado los carotenoides son compuestos muy insolubles, y por otro lado no se conoce ningún mecanismo molecular de incorporación de carotenoides por microorganismos a partir del medio. Parece lógico por tanto que la presencia de opsinas que utilicen retinal como grupo prostético vaya siempre acompañado por la capacidad de sintetizar carotenoides y de cortarlos para producir el correspondiente apocarotenoide. El descubrimiento del gen carX tiene su origen en su ligamiento con otros genes estructurales de la carotenogénesis de F. fujikuroi así como con el gen de la opsina CarO. El único precedente de tal relación de ligamiento se ha encontrado recientemente en ciertas bacterias marinas fototróficas, cuyos operones para síntesis de carotenoides incluyen un gen de síntesis de retinal y otro gen para la proteorrodopsina, que utiliza como bomba de protones dependiente de la luz (Sabehi et al., 2005). Como en estas bacterias, la existencia del agrupamiento en F. fujikuroi cobra especial sentido desde la perspectiva de un regulón enfocado a la producción de una opsina fotoactiva, en el que carRA, carB ycarX acompañarían a carO como genes auxiliares necesarios para la síntesis de su grupo prostético. La necesidad de iluminación para la expresión del agrupamiento génico puede guardar relación con que la unidad CarO- retinal sea solo funcional en la luz. Desde el punto de vista de la función de los carotenoides, la provisión de retinal a la célula para su uso como cromóforo de ciertas proteínas puede representar su papel biológico más importante en el hongo. A la luz de estas consideraciones, cobra especial relevancia la asignación de función a la opsina CarO. La ausencia de fenotipo detectable del mutante carente de la versión funcional de la proteína (Prado et al., 2004) sugiere que CarO juega un papel secundario en la biología del hongo. Posiblemente su función es relevante solo bajo circunstancias ambientales o de ciclo de vida ausentes en las condiciones experimentales usadas en el laboratorio, como pueden ser el ciclo sexual o la patogénesis. Su secuencia polipeptídica muestra características que la acercan a ciertas proteínas de choque térmico, pero al contrario que éstas, posee los aminoácidos necesarios para la utilización de retinal y para el bombeo de protones; este dato, unido a su regulación por la luz y a su estrecha relación con los genes de la carotenogénesis, apoyan fuertemente que se trata de una fotoproteína. Pertenece, sin embargo, a una subfamilia de opsinas que se encuentra en hongos patógenos, como Fusarium yUstilago, lo cual podría sugerir alguna conexión con su capacidad infectiva. A raíz de ciertas diferencias de CarO con la bacteriorrodopsina, se ha sugerido que esta subfamilia podría haberse especializado en captar una longitud de onda distinta de la xxxx 96 Discusión final que captan las opsinas más comunes, como Ops o Nop-1, (Brown, 2004). Se desconocen las implicaciones que este hecho pueda tener sobre la función biológica de CarO. Actualmente se investiga el posible papel de esta proteína en el ciclo sexual del hongo (A. F. Estrada, datos no publicados). El retinal es el primer producto de la carotenogénesis al que se puede asignar una función biológica explícita en ascomicetos. No es el caso de la neurosporaxantina o sus precursores, cuya función se desconoce, y que es probable que jueguen un papel secundario o menos determinante. De los genes necesarios para la síntesis de neurosporaxantina, ajenos a la producción de retinal, solo se conoce carT, pero cabe esperar la existencia de otro gen para la generación del extremo carboxilo, y posiblemente alguno más implicado en modificaciones posteriores de la molécula. Parece probable que tales genes hayan sido adquisiciones posteriores a la de los genes necesarios para producir retinal. La escasa presencia de neurosporaxantina en hongos sugiere que los genes para su síntesis debieron aparecer en un antepasado relativamente reciente de Fusarium, aunque anterior a su separación de la línea que dio lugar a N. crassa. La incorporación tardía de la capacidad de sintetizar este carotenoide es coherente con la presencia del gen carT en un lugar independiente del agrupamiento génico de los restantes genes car. No descartamos la posibilidad de que los genes asociados a la síntesis o metabolismo de esta xantofila formen un segundo agrupamiento génico. Tal posibilidad no ha sido investigada en F. fujikuroi, pero en el genoma de F. graminearum carT está rodeado por genes de función desconocida. Uno de ellos se transcribe en orientación divergente y podría compartir por tanto elementos reguladores con carT. La comprobación de esta hipótesis requeriría nuevos experimentos, que podrían empezar por el análisis del efecto de la luz o la mutación carS sobre la expresión de estos genes. La existencia de proteínas que emplean retinal como grupo prostético no excluye otros usos de este carotenoide. El importante papel del ácido retinoico como señal reguladora en animales nos lleva a plantearnos un posible papel biológico de este compuesto en hongos. Aunque no existen datos de la presencia de este retinoide en este grupo taxonómico, el análisis del genoma de F. graminearum revela la existencia de un marco abierto de lectura (XP_391210) para una proteína con una elevada similitud con la deshidrogenasa de retinal de Gallus gallus (NP_990326), enzima responsable de la conversión de retinal en ácido retinoico. Futuros experimentos como los descritos en esta Tesis para CarT y CarX permitirán confirmar la actividad de esta supuesta enzima. En cualquier caso, como ya ocurre con el retinal o las opsinas, la información disponible permite descartar un posible papel del ácido retinoico sobre el desarrollo asexual de F. fujikuroi en las condiciones habituales de laboratorio. Así lo demuestra el fenotipo silvestre (excluyendo la pigmentación) de los mutantes nulos carB, totalmente bloqueados en la ruta carotenogénica y, por tanto, incapaces de sintetizar retinal y, en su caso, ácido retinoico. A este respecto, es interesante resaltar que no se ha investigado el papel de la síntesis de carotenoides (y de retinoides por extensión) en aspectos de la biología de F. fujikuroi que implican el reconocimiento entre estirpes, como puede ser el ciclo sexual. De encontrarse un fenotipo asociable a la pérdida de función de la supuesta deshidrogenasa de retinal, la sencillez de F. fujikuroi como modelo de estudio facilitaría la búsqueda de posibles proteínas receptoras de ácido retinoico como señal. La purificación de las enzimas CarT y CarX descrita en esta Tesis, además de permitir el análisis de sus actividades enzimáticas in vitro, ha confirmado que se 97 Discusión final trata de enzimas razonablemente solubles y estables, propiedades que han facilitado la ejecución de los experimentos. A juzgar por su parecido estructural con enzimas de la misma familia para las que se ha determinado la estructura tridimensional (Kloer et al. 2005; Schezinger et al., 2006), tanto CarT como CarX parecen ser proteínas perimembranales. Sus sustratos predecibles, toruleno en un caso y probablemente β-caroteno o γ-caroteno en el otro, son altamente insolubles y se encuentran posiblemente asociados a membranas. La interacción de CarX y CarT con la membrana celular donde tienen lugar los pasos anteriores de la ruta debe facilitar su acceso a los sustratos a las bajas concentraciones presentes en la estirpe silvestre. Se desconoce si se trata de cualquier membrana en la célula, de la membrana plasmática o de la membrana de algún orgánulo celular especializado, tal como el denominado carotenosoma de ciertas bacterias fotosintéticas (Frigaard et al., 2005). El análisis de las secuencias disponibles de genomas fúngicos revela la existencia de marcos de lectura para supuestas oxigenasas de carotenoides en al menos un zigomiceto, Rhizopus oryzae, y un basidiomiceto, Ustilago maydis. La considerable distancia evolutiva de ascomicetos con basidiomicetos y sobre todo con zigomicetos, sugiere que los genes para oxigenasas de carotenoides ya estaban presentes en estadíos muy tempranos de la evolución, en antepasados comunes a los ascomicetos, basidiomicetos y ascomicetos. 98 Conclusiones 1. Estirpes Las estirpes de Fusarium utilizadas en este trabajo, así como su fenotipo y origen, se describen en las Tablas 1 y 2. La estirpe silvestre IMI58289 procede del Imperial Mycological Institute (Kew, Surrey, Inglaterra). La estirpe FKMC1995 fue cedida por el Dr. J.F. Leslie (Universidad del Estado de Kansas, EE.UU.). La estirpe de Fusarium graminearum NRRL31084 fue cedida por el Dr. Kerry O´Donnell (Servicio de Investigación Agrícola, Illinois, EE.UU.). estirpe especie procedencia IMI58289 F. fujikuroi Imperial Mycological Institute, Kew, Surrey, Reino Unido FKMCC1995 F. fujikuroi Dr. John F. Leslie, Universidad del Estado de Kansas Manhattan, Kansas, EE.UU. m567 F. fujikuroi Dra. Bettina Tudzynski, Instituto Botánico, Universidad de Münster, Alemania NRRL31084 F. graminearum Dr. Kerry O´Donnell, Servicio de Investigación Agrícola, Peoria, Illinos, EE.UU. Tabla 1. Estirpes silvestres de Fusarium empleadas en este trabajo estirpe origen genotipo referencia SF1 FKMCC1995 niaD4 (Prado et al., 2004) SF4 SF1 carS35 niaD4 SF21 SF4 niaD4 carS35 carB36 SF73 SF21 niaD4 carS35 carB36 carB37 SF98 SF21 niaD1 carS35 carB36 carB38 SF100 SF1 niaD1 carO1 (Prado et al., 2004) SF101 SF1 niaD1 carO2 (Prado et al., 2004) SF188 SF1 niaD4 carB36 SF191 SF189 niaD4 carS- carB36 carB SF214 SF191 niaD4 carS- carB36 SF215 SF191 niaD4 carS- carB36 SG22 IMI58289 carS (Avalos y Cerda-Olmedo, 1987) SG36 IMI58289 carS (Avalos y Cerda-Olmedo, 1987) SG39 IMI58289 carS (Avalos y Cerda-Olmedo, 1987) SG68 IMI58289 carS carT (Avalos y Cerda-Olmedo, 1987) T2.1 IMI58289 ∆carX (Thewes et al., 2005) T5.2 IMI58289 ∆carX (Thewes et al., 2005) T17.1 IMI58289 ∆carX (Thewes et al., 2005) Tabla 2. Estirpes mutantes de F. fujikuroi empleadas en esta Tesis La estirpe de Escherichia coli utilizada rutinariamente fue DH5α, cuyo genotipo es: F- endA1 hsdR17 (rK+mK-)supE44 thi-1 gyrA96 recA1 relA1 DlacU169 [F80cl lacZDM15]l-(Hanahan, 1983). La estirpe de E. coli utilizada en los experimentos en la Universidad de Friburgo fue la XL1-Blue strain a,b recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZM15 Tn10 (TetR)], excepto para la producción de proteínas, que se utilizó la estirpe de BL21(DE3) F-ompT hsdSB (rB-, mB-) dcm gal ë(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). 2. Vectores de clonación y plásmidos auxiliares A continuación se describen los plásmidos comerciales (se indica la casa proveedora) o cedidos por otros investigadores (se indica la referencia) que se han utilizado en esta Tesis. 108 Materiales y Métodos pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.) Vector derivado de pUC19, con el gen de resistencia a ampicilina. Contiene un sitio de clonación multiple que interrumpe el gen de la β-galactosidasa y permite la selección de plásmidos recombinantes por color con Xgal e IPTG. pGEM-T Easy (Promega Madison, Wisconsin, EE.UU.) Molécula plásmidica lineal con el gen de resistencia a ampicilina, digerido con EcoRV y con una timina añadida en cada extremo 3´ para facilitar la clonación de productos de PCR. El lugar de clonación interrumpe el gen de la β-galactosidasa y permite por tanto la selección de plásmidos recombinantes por color con Xgal e IPTG. pCR 2.1-TOPO (Invitrogen) Molécula plásmidica lineal con el gen de resistencia a ampicilina y con una timina añadida a cada extremo 3´ para la inserción directa de fragmentos de PCR. La ligación es facilitada por el sistema “TOPO Cloning”, de la misma casa comercial. El lugar de clonación interrumpe el gen de la β-galactosidasa y permite la selección de plásmidos recombinantes por color con Xgal e IPTG. pBAD-TOPO TA (Invitrogen) Molécula plásmidica lineal diseñada para producción heteróloga de proteína en E. coli y su posterior purificación y análisis de actividad in vivo. La molécula posee una timina añadida a cada extremo 3´ para la inserción directa de fragmentos de PCR en fase con el promotor regulable araBAD (pBAD). Contiene además el gen araC que regula positivamente este promotor, transcribiendo la secuencia insertada en presencia de L- arabinosa. pGEX-4T (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Inglaterra) Plásmido diseñado para producción heteróloga de proteína en E. coli y su posterior purificación por el sistema de la Glutatión-S-transferasa, que precede a un lugar de clonación múltiple donde se inserta la secuencia objeto de análisis. El promotor se activa por el gen lacI (también presente en el plásmido), el cual se induce con IPTG. pHJA2 (Fernández-Martín et al., 2000) Plásmido derivado de pAN7-1 (Punt et al., 1987) y pBluescript® II KS +. que contiene el gen de resistencia a higromicina del primero y el sitio de clonación multiple del segundo. Un segmento de ADN de 4 kb, conteniendo el gen de resistencia a higromicina y sus señales reguladoras, se obtuvo por digestión total de pAN7-1 con XbaI y parcial con EcoRI, se trató con la polimerasa Klenow para volver sus extremos romos y se clonó en la diana NaeI de pBluescript® II KS +. 3. Plásmidos construidos A continuación se describen los plásmidos construidos en esta Tesis, derivados de los arriba descritos. Las secuencias de los cebadores se describen en el apartado 9.2. 109 Materiales y métodos pB21H El alelo carB del mutante SF21 se obtuvo por PCR con los cebadores CarRAG-3F y Ops-4R sobre ADN genómico de esta estirpe. El producto de la reacción, de 4,5 Kb, se introdujo en pGEM-T Easy, se escindió posteriormente mediante digestión con NotI y se clonó en pHJA2 tratado con la misma enzima de restricción, dando lugar a pB21H. pCRcarT El gen carT se obtuvo por PCR con los cebadores carT-8F y carT-8R sobre una muestra de ADNc de la estirpe SF1 obtenida mediante una reacción de retrotranscripción de ARN total de dicha estirpe. El producto de la reacción de PCR se clonó en pCR 2.1-TOPO y posteriormente se secuenció para confirmar la ausencia de intrones o mutaciones. pBADcarTs y pBADcarTa Se obtuvo la secuencia codificadora del gen carT mediante PCR con los cebadores carT-1 y carT-2 sobre el plásmido pCRcarT. El producto de la reacción se clonó en pBAD-TOPO TA. Como resultado se obtuvo una mezcla de plásmidos con las dos orientaciones del gen respecto al promotor en el vector. El plásmido con la orientación correcta de carT se denominó pBADcarTs, y el plásmido con la orientación inversa se denominó pBADcarTa, utilizado como control negativo en los experimentos de expresión del gen en E. coli. pGEXTs y pGEXTas El gen carT se escindió de pCRcarT mediante digestión con EcoRI y se clonó en el vector pGEX-4T cortado con la misma enzima de restricción. De forma análoga al apartado anterior, se obtuvo una mezcla de plásmidos con las dos orientaciones del gen respecto al promotor en el vector. El plásmido con la orientación correcta de carT se denominó pGEXTs, y el plásmido con la orientación inversa se denominó pGEXTas, utilizado como control negativo. pCRcarX El gen carX se obtuvo por PCR con los cebadores CLU-4R y CLU-5F sobre una muestra de ADNc de la estirpe SF1 obtenida mediante una reacción de retrotranscripción de ARN total de dicha estirpe. El producto de la reacción de PCR se clonó en pCR 2.1-TOPO y posteriormente se secuenció para confirmar la ausencia de intrones o mutaciones. pBADcarXs y pBADcarXa Se obtuvo la secuencia codificadora del gen carX mediante PCR con los cebadores CarX-1 y CarX-2 sobre el plásmido pCRcarX. El producto de la reacción se clonó en pBAD-TOPO TA. Como resultado se obtuvo una mezcla de plásmidos con las dos orientaciones del gen respecto al promotor en el vector. El plásmido con la orientación correcta de carX se denominó pBADcarXs, y el plásmido con la orientación inversa se denominó pBADcarXa, utilizado xxxxxxxxx 110 Materiales y Métodos como control negativo. pGEXXs y pGEXXas El gen carX se escindió de pCRcarX mediante digestión con NotI y el fragmento de ADN resultante se trató con polimerasa T4 y y con Ecl39II para conseguir extremos romos. A continuación se clonó en el vector pGEX-4T-1 previamente digerido con SmaI y tratado con fosfatasa alcalina. Como resultado de la ligación se obtuvo una mezcla de plásmidos con las dos orientaciones del gen respecto al promotor en el vector. El plásmido con la orientación correcta de carX se denominó pGEXXs, y el plásmido con la orientación inversa se denominó pGEXXas, utilizado como control negativo. 4. Medios, soluciones y condiciones de cultivo 4.1 Fusarium fujikuroi Todos los medios sólidos utilizados en esta Tesis contienen 16 g/l de agar (Adsa Micro, Barcelona). 4.1.1. Medios de cultivo para F. fujikuroi Medio mínimo (DG) Su composición por litro es: 30 g de glucosa, 3 g de NaNO3, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4*7H2O, 0,5 g de KCl y 2 ml de una solución de microelementos que contienen 10 mg de H3BO3, 10 mg de CuSO4, 20 mg de FeCl3, 20 mg de MnCl2, 20 mg de NaMoO4y 2 mg de ZnSO4(Avalos et al., 1985). Medio DG asn Medio DG con 3 g/l de asparragina en lugar de NaNO3. Medio NG Medio DG con 4 g/l de extracto de levadura, 8 g/l de peptona y sin microelementos (Avalos et al., 1985). Medio de esporulación Su composición por litro es: 1 g de glucosa, 1 g de NH4NO3, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4*7H2O, 0,5 g de KCl, y 1 g de extracto de levadura (Avalos et al., 1985). DG osmoestabilizado Medio DG con 90 g/l de KCl. Para hacer medio DG osmoestabilizado de cobertera se utilizaron 4 g/l de agar. Medios selectivos Para seleccionar transformantes resistentes a higromicina se añadió al medio higromicina B (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Alemania) a una concentración de 0,1 g/l. DG clorato Medio DG asn con 30 g/l de KClO3. 111 Materiales y métodos 4.1.2. Condiciones de cultivo Condiciones de iluminación Los cultivos se iluminaron con 5 W/m2de luz blanca procedente de una bateria de cinco lámparas fluorescentes (Sylvania Standard F36/154-t8) instaladas sobre una lámina de vidrio difusora. En los casos de iluminación a 30°C la intensidad luminosa fue 25 W/m2. El flujo luminoso se midió con un fotodiodo de silicio PIN-10DP/SB (United Detector Technology, Hawthorne, California, EE.UU.) conectado a un picoamperímetro 485 (Keithley Instruments, Cleveland, Ohio, EE.UU.). Extracción de ARN Para extraer ARN de FKMC1995 o de estirpes derivadas, éstas se cultivaron durante 3 días en oscuridad a 30°C. El inóculo se hizo con 106esporas en medio líquido DGasn, en cajas de Petri de 9 cm de diámetro. En su caso, a los tres días de cultivo las cajas se expusieron a la luz el tiempo deseado. Para extraer ARN de IMI58289 o de estirpes derivadas, se cultivaron 106 esporas de la estirpe en un matraz con 250 ml de medio DG líquido. A los 3 días de crecimiento se separó el micelio por filtración al vacio. En su caso, se expuso a la luz el tiempo deseado. Manipulación de protoplastos de F. fujikuroi Los protoplastos se inocularon en agar de cobertera (8 g/l) osmoestabilizado (90 g/l de ClK) sobre medio de cultivo igualmente osmoestabilizado. Las diluciones de protoplastos se realizaron en SO4Mg 0,9 M. 4.2. Escherichia coli Medio nutritivo LB Su composición por litro es: 5 g de extracto de levadura, 10 g de peptona hidrolizada enzimáticamente (“bacto-tryptone” Difco BD, Frankling Lakes, New Jersey, EE.UU.) y 5 g de NaCl (Sambrook et al., 1989). Medio SOC Para preparar un litro, se autoclavan 960 ml con 20 g de Triptona, 5 g de Extracto de levadura, 0,6 g de NaCl y 0,19 g de KCl. Después se añaden 10 ml de MgCl21M, 10 ml de MgSO41M y 20 ml de glucosa 20% (p/v). Suplementos En su caso, el medio LB se suplementó con ampicilina a una concen-tración final de 100 mg/l. Para detección de actividad β-galactosidasa, el medio se suplementó con Xgal e IPTG a concentraciones finales de 40 mg/l y 20 mg/l respectivamente. 112 Materiales y Métodos 5. Mutagénesis de F. fujikuroi con N–metil–N’–nitro–N–nitrosoguanidina Se obtuvieron 107esporas de la estirpe correspondiente, se resuspendieron en 100 ml de N-metil-N´-nitro-N-nitrosoguanidina a una concentración de 2 mg/ml y se incubaron 30 min en oscuridad (Avalos et al., 1985). El mutágeno se eliminó mediante dos lavados de las esporas con agua estéril. Finalmente, las esporas mutagenizadas se resuspendieron en glicerol 15% y se almacenaron a -20°C. Los restos de agua y las puntas que entraron en contacto con el mutágeno se trataron con tiosulfato 2% (p/v). Para el escrutinio de mutantes de la carotenogénesis las esporas se sembraron sobre medio DG asn y se incubaron 4 días en luz o en oscuridad en función del fenotipo buscado. 6. Transformación 6.1. Transformación de F. fujikuroi 6.1.1. Preparación de protoplastos Se inocularon 5x108esporas en 200 ml NG y se incubaron a 28°C durante 14 h a 150 rpm en un matraz de 500 ml. Se miró una alícuota al microscopio para confirmar una tasa de germinación superior al 95%, se filtraron las germínulas a través de dos filtros Monodur y se lavaron dos veces con solución OM (MgSO41,2 M, NaH2PO42mM) para eliminar el PDB residual y esporas no germinadas. Para la lisis de las paredes celulares se disolvió 1 g de enzimas líticas en 18 ml OM en un tubo Falcon, y se añadieron con cuidado las germínulas lavadas. Se incubó el tubo horizontalmente aproximadamente 50 min a 30°C con agitación suave. Durante la incubación se controló la aparición de los protoplastos por observación al microscopio. Una vez terminado el proceso de lisis se pasaron los protoplastos por dos filtros monodur y se lavaron con STC (sorbitol 14,5%, Tris HCl 10 mM pH 7,5, CaCl250 mM). La suspensión de protoplastos se centrifugó a 4°C durante 15 min a 3000 rpm en una centrífuga con rotor vasculante. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 1 ml de STC. La concentración se ajustó a 2x108protoplastos por ml y se guardaron en alícuotas de 100 µl a -80°C. 6.1.2. Transformación Se descongeló lentamente en hielo una alícuota de protoplastos (2 x 107). Se mezcló la cantidad apropiada de plásmido (1-10 µg) en un volumen no superior a 10 µl con 12,5 µl de PEG (PEG 4000 60% (p/v), MOPS 12,5% (p/v)). Se añadió la mezcla a los protoplastos y se incubaron 20 min en hielo. A continuación se añadió lentamente 1 ml de PEG, se mezcló suavemente y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. La mezcla se volcó en un tubo de 10 ml con 2 ml de STC y se centrifugó durante 10 min a 3.500 rpm. Tras eliminar el sobrenadante, el precipitado se resuspendió en 500 µl de medio NG líquido osmoestabilizado y se incubó a 30°C durante 12-15 h para permitir la regeneración de la pared celular de los protoplastos. A continuación se añadieron a la muestra 3 ml de NG osmoestabilizado de cobertera a 48°C y la mezcla se extendió inmediata-mente en una caja de Petri de medio DG suplementado con 1 g/l de extracto de levadura y 0,1 mg/l de higromicina. Los transformantes comienzan a aparecer a partir del cuarto ó quinto día de incubación a 30°C. 113 Materiales y métodos 6.2. Transformación de E. coli 6.2.1. Preparación de células competentes Este método, basado en el descrito por Inoue y colaboradores (Inonue et al., 1990), se empleó para transformar con mezclas de ligaciones. Se añadió 1 ml de un cultivo en fase estacionaria de E. coli a 200 ml de medio SOC en un matraz de 1 litro. Se incubó en agitación a 22°C hasta alcanzar una densidad óptica de 0,5 a 600 nm, y se enfrió en hielo durante 10 min. Manteniendo las células en todo momento en frío, se centrifugaron a 2.500 rpm durante 10 min, se resuspendieron en 80 ml de tampón TB (PIPES 0,38%, CaCl2*2H2O 2,2%, KCl 18,6% y MnCl2*6H2O 11,2%, pH 6,7) preenfriado y se incubaron 10 min en hielo. Las células se centrifugaron de nuevo repitiendo el proceso ya descrito y se resuspendieron en 20 ml de tampón TB enfriado en hielo. Finalmente se añadieron 1,5 ml de DMSO, se incubaron 10 min en hielo, se separaron en alícuotas de 0,5 ml, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta su uso. 6.2.2 Transformación Se añadieron de 1 a 20 µl de la solución de ADN a un tubo de plástico de 10 ml y se mantuvo en hielo. Se añadieron 100-200 µl de células competentes de E. coli previamente descongeladas (evitando que el volumen de solución de ADN superara el 10% del volumen de células), se incubó la mezcla en hielo durante 30 min, se sometió a un choque térmico de 42°C durante 45 s y se enfrió en hielo durante 2 min. A continuación se añadió 1 ml de medio LB y se incubó a 37°C 45 min. Por último se concentraron las células por centrifugación y se sembraron en medio LB suplementado con ampicilina. 7. Extracción y manipulación de ácidos nucleicos 7.1. Extracción de ácidos nucleicos 7.1.1. Extracción de ADN plasmídico de E. coli Para la obtención de pequeñas cantidades de ADN (menos de 10 µg, miniprep) se utilizaron dos métodos. El primero (Stephen et al., 1990) es una variante de método de lisis alcalina de Sambrook et al. (1989). Se inocularon 3 ml de LB adecuadamente suplementado con una colonia de la estirpe correspondiente de E. coli y se incubaron a 37°C durante 8-12 horas. Se centrifugó 1,5 ml del cultivo (13.000 rpm, la misma velocidad empleada en el resto de centrifugaciones del protocolo) durante 20 s, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 150 ml de una solución de Tris 50 mM pH 7.5, EDTA 10 mM y 10 mg/l ARNasa, previamente enfriada en hielo. Las células se lisaron mediante la adición de 150 ml de una solución de NaOH 0,2 M y 10 g/l SDS. Se agitó con suavidad hasta aclaramiento de la mezcla y se mantuvo en hielo. Finalmente se neutralizó la mezcla de lisis mediante adición de 150 ml de acetato potásico 1.32 M pH 4,8. Tras una nueva centrifugación de 5 min, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf. Para precipitar el ADN se añadieron 450 µl de isopropanol, se xxxxxxx 114 Materiales y Métodos mezcló y se centrifugó 5 min. El precipitado de ADN se lavó por adición de 200 ml de etanol 70% y 5 min de centrifugación. Finalmente se eliminó el sobrenadante, se secó el precipitado y se resuspendió en 20 ml de tampón TE. El segundo método consiste en el empleo de los materiales y soluciones proporcionados por el juego GFXTM Micro Plasmid Prep Kit (Amersham Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la obtención de cantidades elevadas de ADN plasmídico se utilizó el juego Midiprep Jetstar Plasmid MIDI Kit 50 2.0 (Genomed, Löhne, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. 7.1.2. Extracción de ADN genómico de F. fujikuroi Para extraer ADN genómico del hongo se utilizó el juego Gen Elute Plant Genomic DNA miniprep (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. 7.1.3. Extracción de ADN genómico de F. fujikuroi a pequeña escala Para su uso como sustrato en reacciones de PCR, se hicieron extracciones de ADN genómico de F. fujikuroi a partir de pequeños fragmentos de micelio. En un tubo Eppendorf se mezclaron aproximadamente 1 mg de micelio, 300 mg de perlas de vidrio (0.5 µm), 200 µl de una solución de 20 g/l de tritón, 10 g/l de SDS, ClNa 100 mM, EDTA 1 mM y Tris HCl 10 mM pH 8, y 200 ml de fenol/cloroformo (1:1). La mezcla se agitó vigorosamente en Vortex durante 4 min, se centrifugó 5 min a 13.000 rpm y se transfirió la epifase a un tubo Eppendorf limpio. Posteriormente se añadió 1 ml de etanol 96%, se mezcló y se volvió a centrifugar. El precipitado se secó por vacío y se resuspendió en 400 µl de tampón TE. Para eliminar el ARN, se añadieron 3 ml de ARNasa (10 mg/ml), se incubó la mezcla 10-15 min a 37°C y se precipitó el ADN añadiendo 10 µl de acetato amónico 4 M y 1 ml de etanol 96%. La mezcla se centrifugó 5 min en una microcentrífuga a 13.000 rpm, se eliminó el sobrenadante, se secó el precipitado y se resuspendió en 50 µl de tampón TE. Con este tratamiento se obtuvieron típicamente muestras de ADN con una concentración de 20 ng/µl. 7.1.4. Extracción de ARN total de F. fujikuroi Las muestras de ARN se extrajeron con el juego Eukaryotic mini (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. 7.2. Cuantificación de la concentración de ácidos nucleicos Para cuantificar las concentraciones de cebadores, plásmidos, ADN genómico y ARN total, se siguió a Ausubel et al. (1995). las concentraciones en mg/l de ADN y ARN se obtuvieron calculando la absorbencia a 260 nm en agua en cubetas de cuarzo de 1 cm de paso, utilizando los coeficientes de extinción 0,027 (ADN unicatenario), 0,02 (ADN bicatenario) y 0,025 (ARN unicatenario). Cuando estuvo disponible, las medidas espectrofotométricas se hicieron con un equipo Nanodrop 3.0.1 (Coleman Technologies Inc., Orlando, Florida, EE.UU.). Las concentraciones de fragmentos de ADN disueltos en pequeños volúmenes se estimaron mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Sambrook et al., 2001). La fluorescencia de las bandas de ADN, separadas en el gel, se comparó con la de marcadores de tamaño a concentraciones conocidas. Para este fin, xxx 115 Materiales y métodos se usaron habitualmente muestras del fago lambda digerido con HindIII. 7.3. Manipulación enzimática del ADN Las enzimas empleadas para digerir muestras de ADN, rellenar los extremos de fragmentos lineales o ligarlos, se adquirieron a las compañías Amersham Biosciences, New England Biolabs (Ipswich, Massachussetts, EE.UU.), Fermentas GMBH (Leon-Rot, Alemania) o Roche (Basilea, Suiza). 7.3.1. Digestiones con enzimas de restricción Las enzimas de restricción se usaron siguiendo las recomendaciones y tampones proporcionados por el propio fabricante, o bien siguiendo a Sambrook et al. (1989). Las digestiones de ADN plasmídico se realizaron en volúmenes de 20 a 50 µl durante al menos dos horas a la temperatura recomendada. Para las hibridaciones en Southern se digirieron muestras de 5-10 µg de ADN genómico con 20 unidades de enzima durante una noche en un volumen final de 450 µl. Antes de su separación en electroforesis, las muestras se precipitaron con 50 µl de acetato sódico 3 M pH 5.2 y 1 ml de etanol 96%. Posteriormente se centrifugaron a en una microcentrífuga a 13.000 rpm, se lavaron con 1 ml de etanol 70%, se secaron y se resuspendieron en los volúmenes adecuados de tampón TE. 7.3.2. Relleno de extremos de moléculas de ADN A fin de obtener moléculas con extremos romos, los fragmentos de restricción con extremos 3´ unicatenarios salientes y los productos de las reacciones de PCR se trataron con el fragmento Klenow de la polimerasa del ADN (Roche). En el caso de los fragmentos con extremos 5´ unicatenarios salientes se utilizó la polimerasa del ADN de T4 (Roche). En ambos casos se siguieron las instrucciones del fabricante. 7.3.3. Ligaciones Las ligaciones de fragmentos de ADN se realizaron en volúmenes de 10 µl utilizando 1 unidad de ligasa de T4 (Roche). Las incubaciones se llevaron a cabo durante una noche a 16°C. 7.4. Electroforesis de ácidos nucleicos 7.4.1. Electroforesis de ADN Las electroforesis de ADN se hicieron en geles de agarosa de baja electroendo-ósmosis (Agarosa D1 baja EEO, Pronadisa, Madrid) a una concentración de 8 g/l o a otra concentración cuando los tamaños de los fragmentos relevantes a separar así lo requierieron. Para las electroforesis se empleó tampón TAE (Sambrook et al., 2001). 116 Materiales y Métodos Las electroforesis se llevaron a cabo en cubetas de las casas Lagoplast (Madrid) o Ecogen (Barcelona), conectadas a una fuente de alimentación Pharmacia, modelo LKB. Como marcadores del tamaño de los fragmentos de ADN se utilizó ADN del fago Lambda digerido con HindIII o marcadores comerciales (escalera de 1 Kb, Techline, Aberdeen, Washington, EE.UU.). Para las hibridaciones en Southern, en caso de detección no radiactiva se empleó el marcador Molecular III (Roche), que contiene fragmentos de tamaño conocido marcados con digoxigenina. Las bandas de ADN se visualizaron con bromuro de etidio presente en el propio gel de agarosa o, en algunos casos, sumergiendo el gel en una solución de bromuro de etidio a una concentración de 5 mg/l. Los geles teñidos se expusieron a radiación ultravioleta en un transiluminador Fotodyne (Hartland, Wisconsin, EE.UU.) y se fotografiaron mediante un equipo de análisis de imagen ImageStore 5000, UVP. Los fragmentos destinados a la secuenciación o a la construcción de vectores de expresión se visualizaron con una fuente de mano de radiación ultravioleta de longitud de onda larga (312 nm). 7.4.2. Electroforesis de ARN Para las electroforesis de ARN se emplearon cubetas, peines y bandejas tratadas previamente con NaOH 0,4 N durante 12 h y lavadas con agua tratada con DEPC. Se emplearon geles de 100 ml con 12 g/l de agarosa, incluyendo 10 ml de tampón MOPS 40 mM pH 7, acetato sódico 10 mM, EDTA 1 mM y 5,3 ml de formaldehído añadidos a 65°C, antes de la coagulación de la agarosa. Las muestras a cargar en los geles contienen 15 µg de ARN en 10 µl de formamida, 3 µl de tampón MOPS, 3,5 µl de formaldehído 12,3 M y 4,5 µl de agua tratada con DEPC. Las muestras se calentaron a 65°C durante 15 min, se incubaron varios min en hielo y se mezclaron con 3 µl del tampón de carga usado habitualmente en las electroforesis de ADN previamente tratado con DEPC. Una vez cargadas, se separaron en el gel de electroforesis a 75 V. 7.5. Aislamiento de fragmentos de ADN de geles de agarosa Los fragmentos de ADN de interés se visualizaron en el gel con la fuente de mano de radiación ultravioleta y se separaron cortando pequeños bloques de agarosa, de los cuales se extrajeron con dos métodos diferentes. El primero, basado en el uso de las columnas Wizard Minicolumns (Promega), consiste en meter el fragmento de agarosa en la columna y centrifugar durante 10 minutos a 13.000 rpm. El ADN, presente en el eluyente, se precipitó y se resuspendió en un volumen adecuado de TE. El segundo método se basó en el empleo de columnas GFXTM PCR DNA, disponibles en el juego Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences), utilizadas según las instrucciones del fabricante. 8. Detección de secuencias de ADN y ARN con el sistema DIG 8.1. Detección de secuencias de ADN (Southern blot) 8.1.1. Marcaje de sonda de ADN con DIG-dUTP La sonda para el gen carB se obtuvo mediante PCR sobre ADN genómico de FKMC1995 utilizando los cebadores CarBG-2F y CarBG-3R. El marcaje se llevó a cabo xxx 117 Materiales y métodos 11.1.4. Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) Las muestras crudas de carotenoides se disolvieron en 500 µl de n-hexano y se inyectaron en un cromatografo líquido de alta presión (HPLC) Hewlett Packard Series 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EE.UU.) equipado con un degasificador G1322A, una bomba cuaternaria G1311 y un detector de diodos en línea G1315A. Las muestras inyectadas (25 µl) se separaron en una columna de fase reversa de 4.6 x 100 mm Hypersil ODS (octadecylsilyl) 5 m (Waters Corporation, Milford, EE.UU.) utilizando una mezcla de metanol, acetonitrilo y cloroformo en una relación constante 47:47:6. Los análisis llevados a cabo en la Universidad de Friburgo (Alemania) se realizaron con un equipo HPLC Waters system (Eschborn, Alemania) equipado con un detector de diodos en línea modelo 996. Las muestras se separaron en una columna C30 de fase reversa (YMC Europe, Schermbeck, Alemania) siguiendo protocolos descritos por Scherzinger et al. (2006). El toruleno se purificó a partir de una muestra de carotenoides del mutante SG68 usando el sistema de solventes A: metanol/tert-butil metil éter (1:1, v/v) B: metanol/tertbutil metil éter/agua (30:1:10, v/v/v). La separación se llevó a cabo con una tasa de flujo de 1 ml/min con un gradiente lineal a partir de un 100% hasta un 43% de B durante los primeros 43 min. En el minuto siguiente B pasó al 0%, y se mantuvo esta proporción durante 26 min a una tasa de flujo de 2 ml/min. 11.2. Análisis de carotenoides de E. coli 11.2.1. Protocolo básico de extracción Se centrifugó el cultivo de E. coli, se eliminó el sobrenadante y se añadieron al precipitado 10 ml de acetona:metanol (7:3). Se agitó vigorosamente en Vortex y se sonicó durante 1 minuto en un sonicador digital Branson SLPe (Dietzenbach, Alemania) bajo los parámetros 15% duty cycle y 2,5 output control. A continuación se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 min, se pasó el sobrenadante a un tubo nuevo y se añadieron 10 ml de éter de petroleo:dietil eter (1:4). Tras agitación en Vortex, se añadieron 5 ml de H2O, se centrifugó durante 1 min a 14.000 rpm para separar las dos fases, se recogió la fase superior y se secó en un rotoevaporador bajo vacío a temperatura ambiente. Finalmente, la muestra seca de carotenoides se resuspendió en un volumen apropiado (normalmente 100 µl) para su análisis en HPLC. 11.2.2. Extracciones modificadas de carotenoides En los casos de solapamiento de picos de retinoides en los cromatogramas de HPLC, se llevaron a cabo modificaciones químicas selectivas. 11.2.2.1. Acetilación de retinol El precipitado seco de retinol (o la correspondiente fracción de HPLC) se disolvió en una mezcla de 100 µl de ácido acético y 200 µl de piridina y se incubó durante una hora en oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 300 ml de etanol. Después de la incubación en oscuridad, los compuestos lipofílicos (en este caso retinil ester) se extrajeron por partición con éter de petróleo y se xxxxxx 124 Materiales y Métodos secaron mediante rotoevaporación en vacío. 11.2.2.2. Extracción con formaldehido El precipitado de E. coli de un cultivo de 50 ml se resuspendió en 150 µl de agua destilada y 50 µl de formaldehido (37%). La resuspensión se pasó a otro tubo eppendorf. Se añadió un volumen de metanol y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente (ó 30°C) en oscuridad. La reacción se paró añadiendo 600 µl de acetona. Los retinoides y carotenoides se extrajeron añadiendo 500 µl de eter de petroleo. La extracción con eter de petróleo se repitió dos veces y la muestra completa se secó por por rotoevaporación de vacío. 11.2.2.3. Extracción con hidroxilamina El precipitado del cultivo de E. coli (apartado 11.2.1) se resuspendió en 200 µl de hidroxilamina 2M pH 6.8 y se pasó a un tubo Eppendorf. Se añadió un volumen de metanol y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 600 µl de acetona. Los carotenoides y/o retinoides se extrajeron por adición de 500 µl de éter de petróleo. La extracción se repitió dos veces y la muestra completa se secó por rotoevaporación en vacío. 11.2.3. Análisis de Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (CG-EM) Se utilizó un espectrómetro de masas Finnigan Trace DSQ acoplado a un cromatógrafo de gases Trace GC. Las separaciones se llevaron a cabo con una columna Zebron ZB5 (5% fenil - 95% dimetilpolisilanoxano, 0.25 mm I.D. y 0.25 µm de grosor; Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). Para la cuantificación de retinal, se utilizó un programa con una temperatura inicial de 100°C durante 5 min, seguido de un incremento de 25°C/min hasta alcanzar los 320°C, que fueron mantenidos durante otros 5 min. Se mantuvo un flujo constante de helio a 1 ml/min usando una división de flujo de 1:30. El tiempo sin división de flujo fue de 3 min, y la temperatura del inyector fue de 220°C. Se utilizó una potencia iónica de 70 eV a 200°C. El retinal se identificó por comparación con el comportamiento cromatográfico de referencia y por comparación del espectro de masas con el proporcionado por el programa NIST Mass Spectral Search Program Version 2.0 (National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, Maryland y Boulder, Colorado, EE.UU). 12. Informática 12.1. Escritura, cálculo y dibujo Para el tratamiento de los datos se usaron el procesador de textos Word y la hoja de cálculo y representación de datos Excel X de Microsoft (Microsoft Corp., Redmond, Washington, EE.UU.). Las imágenes digitalizadas se manejaron con el programa Photoshop 7.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, California, EE.UU.). En algunos casos se mejoró la calidad de las imágenes modificando parámetros que no alteran su información, como la latitud, o el brillo y contraste. Las gráficas, dibujos e imágenes se realizaron con el programa Canvas (Deneba Software, Miami, Florida, EE.UU.). Los espectros de carotenos se manejaron con la hoja de cálculo Excel X a partir de archivos xx x 125 Materiales y métodos proporcionados por el espectrofotómetro. 12.2. Análisis de secuencias de ADN Los mapas de restricción, las fases abiertas de lectura y las secuencias complementarias de las secuencias de ADN se manejaron con el programa Strider 1.1 (Institut de Recherche Fondamentale, CEA, Francia). 12.3. Similitud con secuencias publicadas en las bases de datos. Las secuencias de ADN y las informaciones sobre el genoma de F. graminearum se obtuvieron por medio del servidor www.fgsc.net (McCluskey, 2003). Las comparaciones de secuencias se llevaron a cabo por Blast mediante el servidor NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Los análisis BlastP se realizaron frente a la base de datos Swissprot no redundante. Las comparaciones de secuencias se llevaron a cabo con el programa ClustalX 1.83 (Jeanmougin et al., 1998). 12.4. Predicción de estructura secundaria Las predicciones de estructura secundaria se realizaron con el programa 3D- PSSM (Kelley et al., 2000). 126 Materiales y métodos Bibliografía Aasen, A. J. y Jensen, S. L. (1965). Fungal carotenoids II. The structure of the carotenoid acid Neurosporaxanthin. Acta Chem Scand 19, 1843-1853. Adams, G., Johnson, N., Leslie, J. F. y Hart, L. P. (1987). Heterokaryons of Gibberella zeae formed following hyphal anastomosis or protoplast fusion. Exp Mycol 11, 339-353. Al-Babili, S., von Lintig, J., Haubruck, H. y Beyer, P. (1996). A novel, soluble form of phytoene desaturase from Narcissus pseudonarcissus chromoplasts is Hsp70-complexed and competent for flavinylation, membrane association and enzymatic activation. Plant J 9, 601-612. Al-Babili, S., Hoa, T. T. y Schaub, P. (2006). Exploring the potential of the bacterial carotene desaturase CrtI to increase the beta-carotene content in Golden Rice. J Exp Bot 57, 1007-1014. 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