Caracterización del modelo condicional neuronal de caspasa 3 en condiciones fisiológicas y patológicas

CARACTERIZACIÓN DEL MODELO CONDICIONAL NEURONAL DE CASPASA 3 EN CONDICIONES FISIOLÓGICAS Y PATOLÓGICAS Memo ia p esen ada po la G aduada Mª Angus ias Roca Ceballos pa a op a al í ulo de doc o a po la Uni e sidad de Se illa. A mi abuelo, José Ceballos Villegas Lo que e es es lo que has sido, lo que se ás es lo que haces a pa i de aho a. Siddhā ha Gau ama. ABREVIATURAS A: Be a-amiloide ABP: Placas be a-amiloides AD: en e medad de Alzheime ADN: Ácido desoxi ibonucleico ADNc: ADN complemen a io AIFs: Fac o es induc o es de apop osis AIM2: Absen in melanoma 2 Ak : P o eína quinasa B AMPA: Ácido α-amino-3 hid oxi-5 me il-4 isoxazol p opiónico AMPAR: Recep o de ácido α-amino-3 hid oxi-5 me il-4 isoxazol p opiónico APAF1: Apop osis p o ease-ac i a ing ac o -1 APP: P o eína P ecu so a Amiloide ARN: Ácido ibonucleico ARNm: ARN mensaje o ASC: Apop osis-associa ed speck-like p o ein BAD: BCL2 associa ed agonis o cell dea h BAK: Bcl-2 homologous an agonis /kille BAX: BCL2 associa ed X p o ein BCL-2: B cell CLL/lymphoma-2 BCL-B: Bcl-2-like p o ein 10 BCL-W: Bcl-2-like p o ein 2 BCL-XL: B-cell lymphoma-ex a la ge BH: Dominios de homología de BCL-2 Bid: BH3 in e ac ing-domain dea h agonis Bik: Bcl-2-in e ac ing kille BimL: Bcl-2-like p o ein 11 Blk: B lymphocy e kinase BMF: Bcl-2-modi ying ac o BOE: Bole ín o icial del es ado BOK: Bcl-2 ela ed o a ian kille BSA: Albúmina sé ica bo ina C3: Caspasa-3 TEM: Mic oscopía elec ónica de ansmisión TNF: Tumo nec osis ac o TNFR1: Tumo nec osis ac o ecep o TRADD: Tumo nec osis ac o ecep o ype 1-associa ed DEATH domain TRAF2: TNF ecep o -associa ed ac o 2 TRAF5: TNF ecep o -associa ed ac o 5 TRAIL: Tumo nec osis ac o - ela ed apop osis-inducing ligand. TRAILR1: TNF- ela ed apop osis-inducing ligand ecep o 1 TRAILR2: TNF- ela ed apop osis-inducing ligand ecep o 2 TRAMP: Recep o TNFR1, DR1 WT: Wild ype XIAP: X-linked inhibi o o apop osis p o ein AGRADECIMIENTOS Puedo deci , que es e apa ado es el que, pa a mí, iene más sen ido de oda la esis, y es que nada de es o pod ía habe sido posible sin la mo i ación, la ayuda y el apoyo de las pe sonas han es ado conmigo siemp e. El p ime o y más impo an e, e es ú, a quien dedico es a esis y odos es os años de abajo en in es igación: José Ceballos Villegas, mi abuelo. Todo es o empezó po i, desde que siendo pequeña me p opuse da odo lo que pudie a po con ibui en la medida que ue a posible en la in es igación de esas en e medades que, en algún momen o, e hubiesen a eba ado la son isa o los ecue dos. Pa a mejo a la ida de las pe sonas que padezcan es as en e medades y de las amilias que los acompañan. Po que an os sueños y una ida an que ida y boni a como la uya no me ecían se en u biados. He enido la sue e de pode lle a lo a cabo, dando igual las ho as, el abajo o el dine o, lo único impo an e ha sido con ibui lo máximo posible. ¡Po eso siemp e he que ido es a me ida en odo! Aho a que es a e apa se acaba y esc ibo es o no sé cómo sen i me ni que deci , solo ag adece e habe impulsado es e p opósi o y habe me es ado ayudando y que iendo an o, en los momen os más complicados y ambién en los elices, aunque haya sido desde lejos, yo e sien o siemp e a mi lado y sé que siemp e lo as a es a . Te quie o. En segundo luga , ag adecé selo a mis pad es. A i mamá po odos los días y noches de es udio que e has pasado a mi lado desde pequeña, po qui a le impo ancia y hace que me ol ida a de odos los agobios, que no han sido pocos siendo como soy. G acias po enseña me desde pequeña que es lo e dade amen e impo an e den o del abajo y de la ida. G acias po habe i ido es a e apa sin iéndolo como si ue a uyo y ayudándome an o. G acias po se un modelo de muje a la que admi a . A i papá g acias po an ísimas isas como las que nos hemos pegado es udiando, po es a siemp e o gulloso de mí independien emen e de cómo salie a odo. G acias po acaba sacándome siemp e una isa an e cualquie p oblema que me p eocupa a, así se hacían pequeños. G acias po demos a me lo que es la enacidad y la cons ancia y como g acias a eso se acaba consiguiendo odo lo que e p opongas. A mi he mana g acias po ayuda me a que e se mejo cada día, po habe celeb ado conmigo cada paso has a aquí como si ue a uyo y po p eocupa e siemp e po mí a pesa de odo. A mi he mano po que he c ecido siendo u somb a y me has ayudado a se la muje que soy hoy en día, g acias po habe me egalado al mejo sob ino que pod ía habe imaginado. G acias a F an, po que no haga al a esc ibi le nada. Ag adece a mis di ec o es de esis, José Luis y Rocío. A José Luis g acias an e odo po la opo unidad de desa olla es e abajo y po siemp e ene una son isa y ganas de ayuda an e cualquie cosa que necesi ásemos, e es el mayo ejemplo que conozco de lo que es se un g an p o esional, je e y cien í ico. A Rocío, g acias a ni el p o esional po habe me ayudado a c ece an o, po que en es os años a u lado he adqui ido segu idad, he ap endido a se independien e y a c ee en mi abajo. A ni el pe sonal, g acias po habe o mado un g upo con los cua o que é amos en un inicio que acabó dándome muchos de los mejo es momen os del doc o ado, g acias po u apoyo en el inicio de es a e apa, po siemp e es a disponible pa a habla y po aleg a e an o de lo bueno que ue llegando. Como no, ag adece a Ja ie Vi o ica y a Ma isa Vizue e, po da me la p ime a opo unidad den o de la in es igación, g acias po odo lo ap endido y lo i ido en ese labo a o io y g acias po ab i me la pue a a conoce el labo a o io donde he podido e mina lo que siemp e he que ido. G acias a odos con los que compa í an os buenos momen os y isas y de los que ap endí an o, g acias po ayuda me y mo i a me, g acias a Viky, Sebas ián, Vi u, Elena y Luisa. G acias al pe sonal del CITIUS I y II (Juan Luis Ri as, Modes o Ca aballo, Lau a Na a o y C is ina Reyes) po acili a nos an o el abajo y po acudi en cada momen o de incomp ensión o c isis an e cualquie p oblema que su gie a. G acias especialmen e a Asunción Fe nández Es e ane, no solo po las ho as en el con ocal, sino po siemp e ene una son isa y esa olun ad po ayuda y anima , g acias po enseña me que sea cual sea la edad, la ilusión po la ciencia y po segui ap endiendo y supe ándose nunca se pie den, po ene esa i alidad y aleg ía y po hace boni a cada mañana o a de abajando allí. G acias a Vicen e po oda la ayuda y los ánimos cada ez que salía con ca a de loca de compo amien o, solo él y mi salud men al, saben odas las ho as que he echado en esa sala. Me queda ía sin páginas pa a ag adece odo lo que me gus a ía, a odo el g upo con el que he compa ido es os años y de los que me lle o an o ca iño y ecue dos. Rocío Ma ínez, Ana, An onio J y Ma i, son con los que más iempo he podido compa i . No solo sois g andísimos p o esionales, sino que ansmi ís aleg ía, es áis pendien es y os p eocupáis po cómo nos sen imos odos los que es amos allí, es áis dispues os a ayuda siemp e, hacéis del labo a o io algo oda ía más boni o. Muchas g acias po odas las isas, las b omas, las cha las, el apoyo y los consejos. Miguel, Manolo y José An onio, aunque con ellos haya podido compa i menos momen os, es oy ag adecida de odo lo que me han enseñado y de odas las isas y anécdo as compa idas. Como no ag adece a Ca men, que cada ez que en abas al labo a o io con mala ca a enía algo que deci e que acababa aleg ándo e, po odas las cha las y isas apoyada en su pue a y po ene la segu idad que no iba a habe p oblemas en un ema an emido como es la bu oc acia, eso sí, sus egañinas e an lo más emido del labo a o io. G acias a odas las pe sonas que han pasado po el labo a o io pa a comple a el más e o la ca e a, llenos de ilusión y que me han pe mi ido enseña y ap ende a pa es iguales, g acias a Ma a, Miguel, Es e anía, Lidia y Mai e. A i Emilio no puedo inclui e en el g upo an e io , aunque e enga aún en el mó il como Emilio TFM, y es que, aunque pasas e po el labo a o io e has e minado quedando y ayudándome has a el úl imo momen o, siendo incluso sal ado en es os úl imos meses. G acias po odas las quedadas y po an ísima isa, po man ene la e en la ciencia y po odo lo que queda. A Ra a, g acias po millones de cosas, desde enseña me el mind ulness, a cómo cuida nues a plan a abso be-ene gías. G acias po se an buena pe sona a pesa de las ci cuns ancias que e odeen, po se au én ico y buen amigo. G acias a i, Juan Ca los, po que conseguis e que los compo amien os ue an di e idos (una au én ica p oeza) po se un ejemplo de pe sona abajado a y p o esional sin pe de la aleg ía y las ganas de hace el on o, g acias po u since idad, u na u alidad y po an os momen os buenos que espe o segui compa iendo. Toca ag adece a una pe sona que u o una llegada a es e labo a o io un poco ab up a y se con i ió en alguien undamen al pa a el g upo y pa a mí. G acias a Paco po ayuda me an o en el labo a o io, po se an g an p o esional y aún mejo pe sona y amigo, como muchas eces e he dicho e es mi pe sona boni a, la mayo ía de los ag adecimien os que que ía hace e no co esponden a es a esis, y eso dice mucho. G acias po es a a mi lado y po oda la elicidad que me das. Isa, ú uis e la p ime a TFG a la que ayudé. Te he is o c ece y llega paso a paso a donde es ás aho a, alguien undamen al en el labo a o io. He is o como u esón, u since idad y u abajo e han lle ado a se una au én ica in es igado a. G acias po odas las isas y las locu as de una cab a loca que has compa ido conmigo y po oda la ayuda que siemp e me has dado. Y después de an os años en el labo a o io y sin espe á melo, u e una so p esa y a la ez egalo, que ue que acaba as allí. G acias a i, Luis, po habe llegado siemp e dispues o a ayuda , po ene un ondo an boni o, po que hemos sido el uno la somb a del o o du an e es e úl imo echo y po que lo más boni o lo hemos i ido y lo amos a segui i iendo ue a. Imposible, aunque no sea de es e labo a o io, no ag adece a Manu los millones de isas, la de ka ma nega i o acumulado a u lado y la ayuda que siemp e es ás dispues o a da , e me eces odas las cosas buenas que lleguen a u ida. A las pe sonas que habéis llegado cuando yo ya e minaba, Jesús, Jenni e , Paco, Alicia, sois el p esen e del labo a o io. Además de abaja y ap ende odo lo que podáis, dis u ad y a eso ad odos los momen os que podáis, eí os con ues os compañe os has a que sean amigos, que, al inal, eso es lo más impo an e que os lle a eis de es os años. Como no, enía que acaba con el g upo o iginal, aquellos que compa íamos días y p ác icamen e noches en el labo a o io. Nada hubiese sido igual sin oso os. A i Alex, que cuando en é e emía de lo se io que pa ecías, y al inal esul as e se odo lo con a io, el mejo co ije o que oy a conoce (puede que el único). G acias po odo lo que he ap endido de i, po las pa idas al dixi y po las isas y los b indis en el Peca a con odos los demás. I ene, a pesa de habe es ado an os años en la ca e a jun as, nos conocimos de e dad cuando el mismo día comenzamos el doc o ado. Hemos coincidido jus o en el momen o que debía se , nos hemos acompañado y ayudado en es e camino donde hemos es ado pegadas an o den o como ue a del labo a o io. G acias po esos años y po an os ecue dos boni os. Juan a i muchas g acias po habe sido mi he mano mayo en el labo a o io, po habe me o o muchos es e eo ipos, po que g acias a i, no solo he ap endido de ciencia, sino de mi misma, g acias po p eocupa e siemp e po mí y po ayuda me, y g acias po los momen os que quedan, e es un amigo de e dad. El g upo que o mamos es algo que c eo odos eco da emos. G acias po odos es os años. G acias po úl imo a odos mis amigos que, aunque algunos no sepan ni como se llama es a esis han es ado du an e es os años a mi lado, dándole colo a los días. G acias en especial a i, Rocío Rome o, po se el signi icado de la palab a amis ad hecha pe sona. ÍNDICE RESUMEN 1.INTRODUCCIÓN 1.1 CASPASAS 1.2 CASPASAS INFLAMATORIAS 1.3 CASPASAS APOPTÓTICAS 1.3.1 Vía in ínseca 1.3.2 Vía ex ínseca 1.3.3 Vía pe o ina/g anzima 1.3.4 Vía común 1.4 FUNCIONES NO APOPTÓTICAS DE LAS CASPASAS 1.5 CASPASA 3 FUNCIONES FISIOLÓGICAS Y NO APOPTÓTICAS 1.5.1 Desa ollo y di e enciación 1.5.2 Guía axonal 1.5.3 Poda axonal 1.5.4 Plas icidad sináp ica 1.6 CASPASA 3 EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 2. OBJETIVOS 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 EXPERIMENTACIÓN ANIMAL 3.2 GENERACIÓN DE LAS LÍNEAS ANIMALES 3.3 IDENTIFICACIÓN Y GENOTIPADO 3.3.1 Ma caje 3.3.2 Ex acción de ADN 1 5 7 10 11 12 15 17 19 20 23 23 24 26 27 31 38 42 44 45 48 48 49 3.3.3 PCR con encional y análisis de los p oduc os de PCR 3.4 PRUEBAS CONDUCTUALES 3.4.1 Ca ac e ización 3.4.2 Reconocimien o de obje os 3.4.3 Tes en campo abie o 3.4.4 Labe in o en Y 3.4.5 En e amien o de canicas 3.4.6 Fo mación de nido 3.4.7 Ro a od 3.5 OBTENCIÓN DE MUESTRA Y PERFUSIÓN INTRACARDIACA 3.6 ANÁLISIS DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE ARNm 3.6.1 Ex acción de ARN 3.6.2 Re o ansc ipción de ARN 3.6.3 PCR a iempo eal 3.7 ANÁLISIS HISTOLÓGICO 3.7.1 Inmuno luo escencia 3.8 TINCIÓN DE GOLGI-COX 3.9ELECTROFISIOLOGÍA 3.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 4. RESULTADOS 4.1 ESTUDIO DE LA CASPASA 3 A NIVEL FISIOLÓGICO 4.1.1 DEMOSTRACIÓN DE LA DELECIÓN SELECTIVA DE CASPASA 3 4.1.2 ANÁLISIS FUNCIONAL. PROTOCOLO SHIRPA 4.1.3 CARACTERIZACIÓN CONDUCTUAL 52 52 53 54 54 55 55 55 56 57 57 58 59 60 60 62 63 65 67 69 69 72 76 49 4 po cen aje de espinas co as (madu as) y mayo po cen aje de espinas la gas y delgadas (inmadu as). Finalmen e, se es udió a a és de écnicas elec o isiológicas, cómo la po enciación a la go plazo (LTP) se encon aba inhibida en es a línea de a ones. Es os esul ados sugie en que la casp 3 end ía un papel undamen al en los p ocesos de ap endizaje y memo ia, a ec ando a la LTP y a la plas icidad de las espinas den í icas. Además, hab íamos conseguido un modelo mu ino condicional neu onal de casp 3 que alcanza la edad adul a y no p esen a cambios neu opa ológicos, pudiendo se la base de es udios u u os sob e la in luencia de la casp 3 en la plas icidad sináp ica y sob e los mecanismos molecula es que p o ocan dichas al e aciones. En el a ón KO condicional de casp 3 APP/PS1, se comenzó comp obando, al igual que en el p ime modelo, a a és de una pequeña ba e ía de compo amien o, que no exis ían anomalías que u ie ámos que ene en cuen a a lo la go del es udio. En es e caso nos cen amos en el análisis de la implicación de casp 3 en la gene ación de las placas de A y en el es udio de la mic oglía p esen e en a ones de 6 meses. Pa a ello, analizamos a a és de una inmuno luo escencia de iple ma caje, dis in os pa áme os mo ológicos de las placas de A además del po cen aje de mic oglía po á ea de A, sin ob ene esul ados signi ica i os en es os casos. Es udios a edades más a anzadas se ían necesa ios pa a comple a el análisis de la in luencia de casp 3 en la EA. 5 INTRODUCCIÓN 6 1. INTRODUCCIÓN 7 1.1 CASPASAS Las caspasas cons i uyen una amilia al amen e conse ada de cis eín p o easas cuya unción p incipal es á ligada a la egulación de la mue e celula p og amada (Hyman and Yuan, 2012). El nomb e ‘Caspasa’, Cis eín- ASPá ico p o e ASAS hace e e encia a su ac i idad como p o easa, p esen ando una cis eína en su si io ca alí ico, que a aca esiduos que se encuen an después de un aspá ico (en su ex emo C- e minal), aunque en algunas ocasiones sucede as un glu ama o y, a amen e seguido de esiduos de os ose ina (González Ramí ez and Sal esen, 2018; Seaman e al., 2016). La p ime a caspasa ca ac e izada ue la enzima con e ido a de in e leuquina-1β o ICE (In e leukin-1β–Con e ing Enzyme), elacionada con la madu ación de la IL-1β (In e leuquina- 1β) y pos e io men e denominada caspasa 1 (Yuan e al. 1993). Fue en 1993 cuando se desc ibió po p ime a ez el papel de las caspasas en la mue e celula al demos a se que el gen ced-3, esencial en la apop osis de Caeno habdi is elegans, codi icaba una p o eína cis eín p o easa homóloga a la enzima con e ido a de in e leuquina-1β en humanos. A pa i de en onces se han desc i os nume osos miemb os de es a amilia en especies de mamí e os y no mamí e os (Yuan e al., 1993; Miu a e al., 1993; Kuma e al., 1992). Las caspasas se exp esan en las células como p ecu so es inac i os, denominados zimógenos o p o-caspasas cuyo p ocesamien o p o eolí ico (dime ización o au op o eolisis), iniciado po señales apop ó icas, da luga a la con o mación ac i a, un he e o e áme o compues o po dos he e odíme os (Figu a 1) (Kuma , 2006; Ea nshaw e al., 1999). Su es uc u a p ima ia cons a de un p odominio N- e minal, una subunidad g ande (p20) y una subunidad pequeña (p10). 1. INTRODUCCIÓN 8 El cen o ca alí ico se localiza en la subunidad p20 y con iene un esiduo de cis eína que o ma pa e de una secuencia de aminoácidos muy conse ada (Fuen es-P io and Sal esen, 2004). Figu a 1. Es uc u a y p ocesamien o p o eolí ico de las caspasas. El p odominio N- e minal con iene un Aspa a o pa a la (au o) p o eólisis y a ía en longi ud dependiendo del ipo de caspasa. Las caspasas e ec o as ienen p odominios co os (ap oximadamen e 25 esiduos), mien as que an o las caspasas in lama o ias como las iniciado as ienen p odominios la gos (ap oximadamen e 100 a 200 esiduos). Es os p odominios con ienen dominios e ec o es de mue e, DED (dea h e ec o domain) o dominios de eclu amien o de caspasas, CARD (caspase ec ui men domain), los cuales median la dime ización y/o eclu amien o de las caspasas en complejos más g andes pa a acili a su ac i ación (Mackenzie and Cla k, 2012; Kuma , 2006). Ac ualmen e se conocen 18 caspasas en mamí e os, 13 de las cuales se exp esan en humanos (Eckha e al., 2008; Shalini e al., 2014). La amilia de caspasas p esen es en humanos se di iden en es g upos undamen ales, es a di isión es á basada en la simili ud de sus secuencias y en sus unciones biológicas (Sal esen and Ashkenazi, 2011). El p ime g upo es á cons i uido po las caspasas in lama o ias, CASPASA 1, 4, 1. INTRODUCCIÓN 9 5, 11, 12. Es as caspasas poseen un p odominio la go con un dominio de eclu amien o de caspasas (CARD). El segundo g upo lo cons i uyen las caspasas e ec o as de la apop osis, CASPASAS 3, 6 y 7, que con ienen p odominios co os y son conside adas las ejecu o as de la apop osis. Po úl imo, el e ce g upo es á o mado po las caspasas iniciado as, CASPASAS 2, 8, 9, 10, ca ac e izadas po un p odominio la go que con ienen dominios e ec o es de mue e, (DED) o dominios de eclu amien o de caspasas (CARD) (Figu a 2) (Shalini e al., 2014). Figu a 2. Clasi icación de las caspasas codi icadas po el genoma de mamí e os según sus unciones biológicas y la simili ud de sus secuencias. Adap ado de (Opdenbosch and Lamkan i, 2019) 1. INTRODUCCIÓN 10 1.2 CASPASAS INFLAMATORIAS El p ime indicio de la implicación de las caspasas en los p ocesos in lama o ios ino con el descub imien o del papel de la caspasa 1 en el p ocesamien o y madu ación de miemb os de la amilia de ci oquinas como IL-1β (In e leuquina 1 be a) e IL-18 (In e leuquina 18), mediado es c í icos de p ocesos in lama o ios (Tho nbe y e al. 1992; Ghayu e al. 1997). En humanos, las caspasas in lama o ias incluyen las CASPASAS 1, 4, 5 y 12, siendo la caspasa 1 el miemb o p o o ipo de es a amilia. La ac i ación de las caspasas in lama o ias iene luga a a és de la o mación de complejos de p o eínas mul imolecula es ensamblados en el ci osol, denominados in lamasomas. La es imulación de los ecep o es de econocimien o de pa ógenos (PRRs) po pa ones molecula es asociados a pa ógenos (PAMP), señales molecula es asociadas a daños (DAMP) o p ocesos molecula es que al e an la homeos asis (HAMP), ac i an la con o mación de es os complejos (Agos ini e al. 2004; Ma inon e al. 2002). En los in lamasomas canónicos (mediados po caspasa 1), la p o eína adap ado a ASC (apop osis-associa ed speck-like p o ein) es la pieza cen al del complejo, conec ando los senso es del in lamasoma con la caspasa 1 (Yi, 2017). Los senso es de in lamasoma incluyen miemb os de la amilia NLR (Nucleo ide-binding oligome iza ion domain-like ecep o s) (NLRP1, NLRP3, NAIP y su adap ado NLRC4), AIM2 y pi ina. La na u aleza del senso de ine el nomb e del complejo in lamasoma (po ejemplo, el in lamasoma NLRP3) (Shalini e al., 2014). En los in lamasomas no canónicos (mediados po caspasa 4/caspasa 5), la caspasa 4 pod ía pa icipa en un p oceso de ac i ación que no equie e los componen es p opios del in lamasoma, ya que ac ua ía di ec amen e como senso de lipopolisacá ido ci osólico (LPS) y como caspasa e ec o a (Ma inon e al., 2002; Kayagaki e al.,2011; Haga e al., 2013). 1. INTRODUCCIÓN 11 T as la ac i ación, la caspasa 1 desencadena dos e en os p incipales: una mue e celula in lama o ia ápida, denominada pi op osis, y la ac i ación de la IL-1β e IL-18. La pi op osis se debe a la escisión mediada po caspasa 1 de una p o eína denominada gasde mina D (GSDMD). El agmen o N- e minal escindido se oligome iza en la memb ana plasmá ica dando luga a la o mación de un po o. En in lamasomas no canónicos, la caspasa 4 escinde el GSDMD, desencadenando di ec amen e la pi op osis (Co nu e al., 2020). El papel isiológico de la caspasa 5 sigue sin es a cla o, aunque se conoce que es a caspasa de ec a el LPS ci osólico y las esículas de la memb ana ex e na de Pseudomonas ae uginosa (Bi o e al., 2018). La Caspasa-11, se ha suge ido como ac i ado de caspasa-1 (Wang e al., 1998). 1.3 CASPASAS APOPTÓTICAS Desde su descub imien o, el conocimien o de la mue e celula p og amada o apop osis, y, po an o, de las caspasas como sus p incipales mediado es, ha sido cen o de nume osas in es igaciones. La apop osis se de ine como una o ma de mue e celula p og amada que elimina células indi iduales dañadas de un o ganismo p ese ando la es uc u a del ejido ci cundan e (Pa ish e al., 2013). El é mino de mue e celula p og amada ue expues o po p ime a ez en 1964, al descub i que la mue e celula que iene luga en el desa ollo emb iona io, no ocu e de o ma acciden al, sino que es u o de una secuencia de e apas con oladas que concluyen en la eliminación de la célula de una o ma local y empo almen e de inida (Lockshin e al., 1964). Años más a de, en un a ículo de Ke y colabo ado es de 1972, ue in oducido el é mino apop osis, así como la desc ipción de muchas de las ca ac e ís icas mo ológicas p opias de es e p oceso (Ke e al. 1972). Sin emba go, no ue has a mediados de la década de 1990 cuando la apop osis se inculó con la ac i ación de las caspasas al descub i que ac uaban sob e sus a os 1. INTRODUCCIÓN 12 in acelula es cla es pa a p omo e la mue e celula (Ce e i e al. 1992; Nicholson e al. 1995; Alnem i e al. 1996; Liu e al. 1996; Tho nbe y and Lazebnik 1998). Debido al papel undamen al que desempeñan las caspasas du an e la apop osis, an o su ac i ación como sus unciones es án al amen e eguladas (Pa ish e al., 2013). Las in es igaciones desc ibie on dos ías apop ó icas p incipales: la ía ex ínseca o del ecep o de mue e y la ía in ínseca o mi ocond ial. Con los años, se demos ó que ambas ías se encon aban inculadas y que las moléculas de una ía podían in lui en la o a (Igney y K amme , 2002). Exis e ambién una ía adicional que se elaciona con la ci o oxicidad mediada po células T y con la mue e celula dependien e de pe o ina-g anzima. Finalmen e, odas es as ías con e gen en una ía común de ejecución (Elmo e, 2007). 1.3.1 Vía in ínseca La apop osis po ía in ínseca, puede ac i a se po di e sos es ímulos, en e los que se encuen an, daño geno óxico ( adiación ionizan e o quimio e apias ci o óxicas di igidas al ADN), daño a o gánulos celula es o pla a o mas de señalización (es és del e ículo endoplasmá ico [ER], daño mi ocond ial, inhibición de ías de señalización in acelula ), es imulación mi ogénica excesi a o mue e celula inducida po un oncogén (oncogén c-Myc). Incluso es posible que las células lleguen a la apop osis po la al a de un es ímulo adecuado, como po ejemplo la ausencia de ac o es de c ecimien o o la p i ación de nu ien es (Singh e al., 2019). Es a di e sidad de es ímulos se e leja en la a iedad de ni eles y ipos de e ec o es que inician el p oceso de apop osis po ía in ínseca. Independien emen e del es ímulo o el e ec o que comience el p oceso, odos con e gen en la ac i ación de di e en es p o eínas p o- apop ó icas pe enecien es a la amilia BCL2, p incipales egulado as de es a ía (Holl ille e al., 2019). 1. INTRODUCCIÓN 13 La amilia de p o eínas BCL-2 (B cell CLL/lymphoma-2), denominada así, po se és e el p ime miemb o desc i o, se compone de una a iedad de p o eínas an iapop ó icas y p oapop ó icas. La egulación en e es os dos g upos de p o eínas p oapop ó icas y an iapop ó icas dic a la supe i encia o la es imulación del p oceso apop ó ico (Chipuk e al., 2010). Cada miemb o de es a amilia con iene uno o más dominios de homología de BCL-2 (BH) (Singh e al., 2019). Las p o eínas an iapop ó icas (BCL‑2, BCL-XL, BCL-W, MCL1, BCL-B) con ienen cua o dominios de homología BCL-2 (BH1-4). Po o a pa e, las p o eínas p oapop ó icas, se di iden en p o eínas e ec o as (BAX, BAK y BOK) y p o eínas BH3 (Bad, Bid, Bik, Blk, BimL, PUMA, NOXA, BMF, HRK) (Chipuk e al., 2010). O iginalmen e se desc ibió que las p o eínas e ec o as con enían solo los dominios BH1-3, sin emba go, es udios pos e io es e ela on un mo i o BH4 conse ado (K ansakul e al., 2008). Las p o eínas BH3 con ienen un único dominio BH (BH3). La p esencia de alguno de los es ímulos apop ó icos an e io men e mencionados da luga a la ac i ación de las p o eínas solo BH3 a a és de di e en es mecanismos, que incluyen, inducción ansc ipcional, escisión o des os o ilación. Es as p o eínas ienen como unción p incipal ac i a a las p o eínas BCL2 p oapop ó icas e inac i a las p o eínas BCL2 an iapop ó icas. De es a o ma, algunas p o eínas BH3 conocidas como ac i ado es di ec os (Bim, Bid, Puma) in e ac úan con Bax p omo iendo su cambio con o macional y su inse ción en las memb anas mi ocond iales, o con Bak, cons i u i amen e localizada en la memb ana, p o ocando su ac i ación (Chipuk e al., 2010; Happo e al., 2012; Shamas-Din e al., 2011). 1. INTRODUCCIÓN 20 No obs an e, la apop osis ambién ocu e como mecanismo de de ensa a a és de la eliminación de las células in adidas po pa ógenos an e una eacción inmuni a ia, o como componen e undamen al de un daño celula p o ocado po una lesión, en e medad o agen es noci os, ayudando a elimina células in lama o ias o egulando la cica ización en e o as unciones (No bu y and Hickson, 2001; G eenhalgh, 1998). 1.4 FUNCIONES NO APOPTÓTICAS DE CASPASAS Desde que las caspasas ue on elacionadas con el p oceso de apop osis, la mayo ía de las in es igaciones se han en ocado en el es udio de su ac i ación y unciones du an e el p oceso de mue e celula (Baena-López e al, 2018; Vene o e al, 2011). Sin emba go, en los úl imos años se han descubie o nume osas e idencias que elacionan las caspasas con o os modelos de mue e celula como la nec op osis, la au o agia o la pi op osis (Shalini e al., 2014) e incluso con unciones no apop ó icas en conside ables p ocesos celula es como en la in lamación, la di e enciación celula y p oli e ación en e o os (Yi and Yuan, 2009). Los a ances en las in es igaciones ace ca de los mecanismos apop ó icos se desa olla on du an e a ios años en C. elegans, sin emba go, la gene ación de mu an es de D osophila y el desa ollo pos e io de es udios in i o mos a on impo an es unciones no apop ó icas de las caspasas (Mukhe jee and Williams, 2017). El p ime papel no apop ó ico de las caspasas desc i o ue en la indi idualización de espe má idas en D osophila (A ama e al., 2003). La indi idualización es el p oceso po el cual se eliminan las conexiones ci oplasmá icas en e las espe má idas de cada quis e pa a da luga a los espe ma ozoides indi iduales. Du an e es e p oceso, los au o es encon a on la p esencia de caspasas e ec o as en el complejo de indi idualización, un complejo de memb ana ci oesquelé ica que se mue e a lo la go del quis e hacia la cola del espe ma. 1. INTRODUCCIÓN 21 De la misma o ma, los mu an es de D onc, homólogo de caspasa 9 en mamí e os, no ealiza on la indi idualización comple a (A ama e al., 2003; A ama e al., 2005). Con espec o al papel de las caspasas en los dis in os ipos de mue e celula , des aca el papel de la caspasa 8 en la nec op osis o nec osis p og amada (Vandenabeele e al, 2010). El é mino nec op osis apa eció po p ime a ez en 2005 desc ibiendo un caso de mue e celula nec ó ica egulada (Deg e e e al, 2005). Es e ipo de mue e se induce no malmen e cuando se ha bloqueado la ac i idad caspasa y se ca ac e iza mo ológicamen e po un aumen o del olumen celula , in lamación de los o gánulos y up u a de la memb ana plasmá ica (Vandenabeele e al, 2010). Pa a en ende el papel de la caspasa 8 en la nec op osis es necesa io eco da la ía ex ínseca de la apop osis. En dicha ía, la in e acción de TNF con su ecep o daba luga a la o mación del complejo I que pos e io men e se in e na en la célula de o ma que RIP1 se disocia de la memb ana plasmá ica e in e ac úa con TRADD, FADD, p ocaspasa 8 y cFLIPL o mando el complejo IIa. Llegados a es e pun o, la caspasa 8 escindi á RIP1 y RIP3 ac i ando pos e io men e la ía no mal de apop osis, sin emba go, una inhibición a macológica o gené ica de la caspasa 8 e i a la escisión de RIP1 y RIP3 que son os o iladas, p oduciéndose la o mación de o a pla a o ma denominada ipop osoma y la ac i ación de los mecanismos de la nec op osis (Zhao e al., 2015; Vanden Be ghe e al., 2014; Vandenabeele e al, 2010). De es a o ma se pod ía deci que la caspasa 8 iene un papel inhibi o io de la nec op osis du an e el desa ollo al ac ua sob e RIP1 y RIP3 (Kaise e al., 2011; Obe s e al., 2011; Zhang e al., 2011). O os ipos de mue e celula elacionados con caspasas son la pi op osis, dependien e de la caspasa 1 y la caspasa 11 o la au o agia (Shalini e al., 2014). 1. INTRODUCCIÓN 22 Además de pa icipa en los ipos de mue e celula an e io men e mencionados, las caspasas asesinas desa ollan unciones no apop ó icas en o os p ocesos celula es como la di e enciación celula , la ac i ación mic oglial, p ocesos in lama o ios, el desa ollo neu al y emb iona io o la egene ación de ejidos (Baena-López e al, 2018; Vene o e al, 2011; Connolly e al., 2014; Julien and Wells, 2017). Den o de la di e enciación celula exis en nume osos es udios que elacionan las caspasas con la di e enciación de dis in os ipos celula es. En 2008 el abajo de Fuji a y colabo ado es mos ó la incapacidad de células mad e emb iona ias de a ones mu an es en casp 3 y caspasa 9 pa a di e encia se (Fuji a e al., 2008). Además, la ac i ación de caspasa se ha obse ado en la di e enciación e i oide, o en la di e enciación de monoci os de sang e pe i é ica humana (So de e al., 2002). En el es udio de Rebe y colabo ado es se mues a como la escisión de RIP1 mediada po caspasa 8 es necesa ia pa a la egulación de NF-K du an e la di e enciación de mac ó agos (Rebe e al., 2007). También es des acable el descub imien o del papel cla e de las caspasas 3/7 y 8 en el p oceso de la ac i ación p oin lama o ia de la mic oglía (Bu guillos e al., 2011). La caspasa 8 ambién se ha elacionado en la egulación de la ac i ación del in lamasoma y en la madu ación y egulación de las ci oquinas (Miwa e al., 1998; Vince e al., 2012; Mael ai e al., 2008). Respec o a la epa ación y egene ación de ejidos, la unción de las caspasas ha sido demos ada en nume osos modelos expe imen ales (Cikalae al., 1999; Che ae al., 2009; Tseng e al., 2007; Fuchsand S elle , 2011; Vlaskalin e al., 2004). En el caso de los mamí e os, algunos ejidos como el hígado pueden expe imen a una egene ación conside able después de una lesión (Taub, 2004). Es udios como el de Li y colabo ado es en 2010, demues an como en a ones de icien es en casp 3 y 7 la egene ación del hígado, así como la cica ización de he idas se encuen an al e adas (Li e al., 2010). 1. INTRODUCCIÓN 23 Es as solo son una pequeña pa e de las unciones no apop ó icas de las caspasas, o as unciones no apop ó icas a ni el neu onal se án aba cadas más adelan e. Es necesa io des aca la impo ancia del es udio de los papeles no apop ó icos de las caspasas, ya que una mejo comp ensión de es os, puede ene implicaciones mucho más impo an es de lo que se pensaba, p opo cionando es a egias mejo adas pa a e apias e ec i as en el á ea de la in lamación, las en e medades neu odegene a i as, au oinmunes y el cánce (Shalini e al., 2014). 1.5 CASPASA 3. FUNCIONES FISIOLÓGICAS Y NO APOPTÓTICAS La casp 3 es la caspasa e ec o a mejo ca ac e izada. Los es udios ace ca de la cascada de caspasas y la ca ac e ización de sus a os, indican que la casp 3 iene unciones di e en es y supe pues as con las caspasas 6 y 7. Es a caspasa in e iene en mul i ud de p ocesos no apop ó icos, algunos de ellos desc i os an e io men e. Den o del SNC, la casp 3 ambién ha demos ado juga un impo an e papel en g an can idad de e en os, en e los que des acan su pa icipación en el con ol de la ami icación y guía de c ecimien o axonal, el desa ollo y la di e enciación neu al (D’Amelio e al., 2010), la poda dend í ica (Williams e al., 2006) o la plas icidad sináp ica (Li e al., 2010). 1.5.1 Desa ollo y di e enciación Como se ha mencionado an e io men e, el papel de las caspasas en el neu odesa ollo es undamen al en el con ol de la población neu onal y en la eliminación de las células inmadu as que no hayan en ablado conexiones neu onales óp imas. 1. INTRODUCCIÓN 24 En el es udio de Kuida y colabo ado es de 1996, la mayo pa e de a ones de icien es en casp 3 mo ían du an e el desa ollo emb iona io o du an e las p ime as es semanas pos na ales, p esen ando una educción en la apop osis emp ana, un aumen o en el espeso de la supe icie ce eb al y una acumulación inadecuada de p ogeni o es neu ales, poniendo de mani ies o el papel undamen al de la casp 3 en el desa ollo del sis ema ne ioso (Leona d e al., 2002; Kuida e al., 1996; Pompeiano e al., 2000). Es udios pos e io es ealizados en a ones de icien es en caspasa 9 y Apa 1, componen es undamen ales de la ía in ínseca, demos a on que és a es la ía p incipal empleada du an e el desa ollo neu onal. Los a ones de icien es en caspasa 9 p esen an le alidad pe ina al además de impo an es mal o maciones del ce eb o como hipe plasia p ominen e del p osencé alo u obs ucciones de los en ículos la e ales, así como del e ce en ículo (Hakem e al., 1998; Kuida e al., 1998). Los a ones de icien es en Apa 1 ambién mos a on al e aciones mo ológicas du an e su e apa emb iona ia, p esen ando un c ecimien o excesi o del diencé alo y mesencé alo, plegamien o ano mal y amaño educido de las esículas elence álicas (Cecconi e al., 1998). Los a ones de icien es en caspasa 9 y Apa 1 no p esen a on ac i ación de casp 3, man eniendo un eno ipo neu al simila al de a ones de icien es en es a caspasa, lo que indica una ac i ación lineal de casp 3 a a és del apop osoma (que con iene Apa 1 y caspasa 9) du an e el neu odesa ollo y pone de mani ies o su impo ancia en es e p oceso (D’Amelio e al., 2010). 1.5.2 Guía axonal Du an e el desa ollo, el c ecimien o y la guía axonal esul an esenciales pa a consegui una o ganización celula o denada y una ed de conexiones neu onales uncional. I egula idades en es a es uc u a axonal pueden causa cambios en el compo amien o (Smea e al., 2007) y as o nos en el desa ollo neu onal (Wong, 2008). 1. INTRODUCCIÓN 25 En es e p oceso, los axones son guiados hacia su des ino po moléculas que son sec e adas o se encuen an unidas a la memb ana y que uncionan como a ayen es o epelen es con el in de guia a los axones en c ecimien o a egiones especí icas (Tessie -La igne and Goodman, 1996; Ba um e al., 2015). Den o de las moléculas de guía axonal des acan las p o eínas ne inas, sli s, sema o inas y e inas. En 2003 un es udio de Campbell y Hol demos ó po p ime a ez una elación en e la casp 3 y el p oceso de guía axonal mediado po Ne ina-1. En expe imen os in i o se obse ó una ac i ación de casp 3 en los conos de c ecimien o de las neu onas de la e ina es imuladas con Ne ina-1, además de la pa icipación de es a caspasa en el e ec o quimio ó ico a ac i o mediado po es e ac o guía (Figu a 6) (Campbell and Hol , 2003). Es udios pos e io es in i o, pusie on de mani ies o una es imulación de la ac i idad de casp 3 po el ac o guía Sli 1a y su ecep o Robo 2, en células gangliona es e inianas emb iona ias de pez ceb a, donde es a caspasa ac uaba p omo iendo an o la o mación como la e acción de ami icaciones de o ma local (Figu a 6) (Campbell and Okamo o, 2013). También se ha elacionado la casp 3 a a és de la ía Bax/Bak con el con ol de la ami icación axonal en e apas pos na ales. Figu a 6. P ocesos de guía axonal y ami icación axonal mediados po caspasa 3. Adap ado de (Holl ille and Deshmukh, 2018). 1. INTRODUCCIÓN 26 Los a ones que p esen aban una inac i ación pos na al emp ana de Bax/Bak en la co eza mo o a, no log aban desa olla mo imien os olun a ios inos a causa de una pé dida de e inamien o de la conec i idad (Gu e al., 2017). 1.5.3 Poda axonal La poda axonal pe mi e la eliminación selec i a de la sinapsis, axones o dend i as sin que se p oduzca la mue e del cue po celula (Ya on and Schuldine , 2016). Es e p oceso, que iene luga du an e el desa ollo pos na al emp ano, es undamen al pa a el e inamien o de la conec i idad neu onal y el es ablecimien o de una ed madu a y uncional (Riccomagno and Kolodkin, 2015; Schuldine and Ya on, 2014), elacionándose su des egulación con as o nos como la esquizo enia (Penzes e al., 2011) o el au ismo (Hu sle and Zhang, 2010). Los p ime os es udios desca a on un papel de la caspasa en la degene ación axonal (Finn e al., 2000; Ra e al., 2002; Wa s e al., 2003; Sago e al., 1995), sin emba go, es udios pos e io es en D osophila melanogas e e ela on la exis encia de caspasas ac i as de o ma localizada den o de los axones en degene ación, además de una implicación de la caspasa iniciado a D onc, Da k (dApa 1) o la DIAP1 (D osophila IAP) en la poda axonal (Williams e al., 2006; Kuo e al., 2006). Con el in de iden i ica la pa icipación de las caspasas en es e p oceso, se ealiza on in es igaciones en e eb ados con neu onas dependien es del ac o de c ecimien o ne ioso (NGF), además de es udios sob e la unción de a ios componen es de la maquina ia apop ó ica a a és de en oques a macológicos y de eliminación (E nsbe ge , 2009; Nikolae e al., 2009). O os es udios han u ilizado eliminaciones gené icas pa a con i ma que la caspasa 9 y la casp 3 son esenciales pa a la poda axonal y encuen an que la caspasa 6, BAX y XIAP ambién es án in oluc ados (Figu a 7) (Simon e al., 2012; Cusack e al., 2013; Unsain e al., 2013; Simon e al., 2016). 1. INTRODUCCIÓN 27 Figu a 7. Rep esen ación esquemá ica del mecanismo de poda axonal y de la implicación de casp 3 en el mismo. En ausencia de ac o es neu o ó icos (NGF), la ac i ación de la ía JNK p omue e la egulación posi i a ansc ipcional de Puma lo que da como esul ado la ac i ación de Bax, la despola ización mi ocond ial y la ac i ación de las caspasas, lo que lle a a la degene ación local del axón. Además, el ecep o de mue e DR6 pod ía desempeña un papel en la ac i ación local de la cascada de caspasas. Adap ado de (Holl ille and Deshmukh, 2018). 1.5.4 Plas icidad sináp ica La plas icidad sináp ica consis e en la modi icación de las conexiones neu onales es ablecidas du an e el desa ollo como espues a a la expe iencia p e ia y adap ación a los cambios ambien ales (Mukhe jee and Williams, 2017; Li and Sheng, 2012; Holl ille and Deshmukh, 2017). Es a modi icación de las conexiones puede da luga a una in ensi icación du ade a de la ansmisión sináp ica, lo que se conoce como po enciación a la go plazo (LTP) o a una educción de la ansmisión, conocida como dep esión a la go plazo (LTD) (A ola e al., 1990). 1. INTRODUCCIÓN 28 Es e mecanismo se ha asociado con el ap endizaje, la memo ia espacial y la memo ia en el hipocampo, la memo ia del miedo en la amígdala, la memo ia de a eas en la co eza y el ap endizaje mo o en el ce ebelo (Colling idge e al., 2010), conside ándose como el mecanismo p incipal del ap endizaje y la memo ia (Mukhe jee and Williams, 2017). La o ma mejo ca ac e izada de LTP y LTD se obse a en las sinapsis exci a o ias en espues a al L-glu ama o y es á mediado po dos ecep o es pos sináp icos iono ópicos, el ecep o del N-me il-D-aspa a o (NMDA) y el ecep o del ácido α-amino-3 hid oxi-5 me il-4 isoxazol p opiónico (AMPA) (Es eban e al., 2003; Bliss and Colling idge, 1993). Una ca ac e ís ica in e esan e de la plas icidad sináp ica es el cambio mo ológico que acompaña a la modi icación uncional de la sinapsis. Mien as que la LTP se asocia con la o mación y el c ecimien o de las espinas dend í icas (Enge and Bonhoe e , 1999; Kopec e al., 2006; Ma suzaki e al., 2004; Nage l e al., 2004), la LTD se asocia con su con acción y pé dida (Nage l e al., 2004; Okamo o e al., 2004; Zhou e al., 2004; Oh e al., 2013). La hipó esis de que las caspasas pod ían es a implicadas en la LTD ue p opues a po p ime a ez po Ma son y colabo ado es (Ma son e al., 1998; Ma son e al., 1999). Es a idea ue e o zada po in es igaciones que demos aban que las subunidades AMPAR e an sus a os de es as p o eínas (Chan e al., 1999; Lu e al., 2002). Es udios pos e io es emplea on inhibido es de caspasa en expe imen os in i o demos ando un papel uncional de és as en la o mación de la memo ia espacial, de e i ación y audi i a, localizándose ac i a en el hipocampo y la co eza (Dash e al., 2000; S epaniche e al., 2005; Huesmann and Clay on, 2006). Años más a de, Li y colabo ado es demos a on como la casp 3 ac i a desempeñaba una unción esencial en la dep esión a la go plazo en el hipocampo, acele ando la in e nalización de los ecep o es AMPA. En es e es udio, en los a ones ca en es de casp 3, la LTD dependien e del ecep o NMDA se encon aba inhibida mien as que la LTP podía induci se con no malidad. 1. INTRODUCCIÓN 29 El bloqueo del p oceso de LTD ambién se podía impulsa a a és de la inhibición a macológica de la casp 3 y -9, sin emba go, no se eía a ec ada po la inhibición de la caspasa 1 (Li e al., 2010). En 2011, Jiao y colabo ado es demos a on que la ac i ación de la casp 3 y 9 en la LTD dependía de la ac i ación de la ía in ínseca. En es a in es igación se comp obó cómo en los a ones de icien es de BAD o BAX, la dep esión a la go plazo se encon aba al e ada. También se obse ó como en las neu onas some idas a LTD, BAD se encon aba ac i ada a ni eles meno es que en la apop osis y de o ma ansi o ia, lo que conducía a una ac i ación mode ada de la casp 3, su icien e como pa a p omo e la in e nalización de los ecep o es AMPA sin llega a induci la mue e celula (Jiao and Li, 2011). Exis en al menos dos o mas en las que la casp 3 puede in lui en la LTD. En la p ime a se encuen an in oluc adas la casp 3, Ak (p o eína quinasa B) y GSK3 (glucógeno sin asa quinasa 3). La ac i ación de casp 3 p o oca la escisión de Ak y, po an o, la sup esión de su ac i idad quinasa, e minando con la inhibición que eje cía sob e GSK3. De es a o ma PSD95 (p o eína de densidad pos sináp ica) es os o ilada di ec amen e po GSK3, dando luga a la deses abilización de PSD95 den o de las densidades pos sináp icas (Figu a 8) (Asselin e al., 2001; Li e al., 2010c; Nelson e al., 2013; Peineau e al., 2008). La segunda o ma implica la ac i ación de la calcineu ina a a és de la escisión de casp 3 (Muke jee e al., 2000). La calcineu ina es una p o eína os a asa egulada po el lujo de calcio dependien e del ecep o NMDA (NMDAR) y cuya ac i ación p o oca la des os o ilación de la subunidad GluA1, desencadenando la in e nalización de los ecep o es AMPA (Bea ie e al., 2000; Es eban e al., 2003). Es a p o eína ambién ac úa a a és de la ía mi ocond ial, des os o ilando BAD pa a así p omo e la ac i ación no apop ó ica de la casp 3 (Figu a 8) (Wang e al., 1999). 1. INTRODUCCIÓN 36 Figu a 9. Rep esen ación esquemá ica de la in luencia de Caspasa 3 en la en e medad de Alzheime . Adap ado de (Hyman, 2011). 37 38 OBJETIVOS 39 2. OBJETIVOS 40 La casp 3 es una p o easa ampliamen e conocida po se cla e ac uando como mediado a en la apop osis neu onal. En la ac ualidad, se han pues o de mani ies o unciones de la casp 3 en el SNC no elacionadas con la apop osis, des acando su papel egulado en la neu ogénesis y en la ac i idad sináp ica. La inalidad de es a esis doc o al es de e mina el papel de la casp 3 en la plas icidad sináp ica del SNC adul o en las á eas implicadas en memo ia y ap endizaje (hipocampo) u ilizando pa a ello un modelo mu ino condicional neu onal. Además, es e modelo a a pe mi i es udia la implicación de es a p o eína en el p og eso de en e medades neu odegene a i as, cen ándonos en la EA. Pa a ello se es ablecie on obje i os más conc e os. Se comenzó con la gene ación de un a ón condicional neu onal de casp 3 pa a el es udio de las posibles implicaciones uncionales de la ausencia de es a caspasa en la sinapsis en condiciones isiológicas. Po o o lado, se gene ó un modelo expe imen al pa a el es udio de la unción de la caspasa-3 y su papel como posible diana e apéu ica en la EA. El siguien e obje i o ue el análisis compo amen al de ambos g upos de a ones expe imen ales y de sus co espondien es g upos con oles, pa a e alua el e ec o de la ausencia de casp 3 sob e las unciones cogni i as, psico isiológicas y mo o as en el a ón condicional y en el modelo de EA casp 3 KO. Como e ce obje i o se es ableció el es udio mo ológico de las espinas dend í icas de la egión CA1 del hipocampo, p incipales es uc u as implicadas en los p ocesos cogni i os, así como la ca ac e ización elec o isiológica del hipocampo pa a es udia la plas icidad sináp ica en odajas de ce eb os de a ones condicionales de casp 3. El úl imo obje i o ue ealiza un análisis mo ológico de las placas amiloides en el modelo de EA casp 3 KO, con el in de es udia la implicación de la casp 3 en los p ocesos elacionados con las placas de A. 41 42 MATERIALES Y MÉTODOS 43 3. MATERIALES Y MÉTODOS 44 3.1 EXPERIMENTACIÓN ANIMAL Todas las p uebas ealizadas du an e el desa ollo de es e p oyec o de esis se lle a on a cabo de acue do con el documen o “Guidelines o he Eu opean Union Council” (86/609/EU), siguiendo la no ma i a española (BOE 34/11370-421, 2013) en ma e ia de ob ención, anspo e, c ía, cuidado y manipulación de animales de expe imen ación y con la ap obación del comi é é ico cien í ico de la Uni e sidad de Se illa. Los a ones se man u ie on en jaulas conjun as, en g upos de 4-6 animales. Con condiciones con oladas en odo momen o a empe a u a cons an e de 22±1ºC, una humedad ela i a del 60%, con un ciclo de luz-oscu idad de 12 ho as y acceso lib e a comida y agua. Pa a es e p oyec o se emplea on seis g upos de a ones de dis in o geno ipo. Los animales se subdi idie on en dos g upos en unción del obje i o de es udio. Como se mues a en la igu a 10, se emplea on los a ones dobles ansgénicos pa a el es udio de la implicación en condiciones isiológicas de nues a p o eína de in e és y los iples ansgénicos pa a el es udio en condiciones isiopa ológicas de dicha p o eína. 1.1. Doble loxeado en Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e + (C3KO) 1.2. Doble loxeado en Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e – (con ol) 1.3. Doble loxeado en Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e + APP + (C3KO APP+) 1.4. Doble loxeado en Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e + APP - (C3KO) 1.5. Doble loxeado en Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e – APP + (con ol APP+) 1.6. Doble loxeado en Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e – APP – (con ol) 3. MATERIALES Y MÉTODOS 45 El g upo de dobles ansgénicos ue es udiado a dos meses de edad, y el g upo de iples ansgénicos ue es udiado a seis meses de edad. Los a ones Camk2 ue on cedidos amablemen e po el D . Juan Ped o Bolaños de la Uni e sidad de Salamanca, los a ones casp 3 po el P o . Richa d Fla ell de la Uni e sidad de Yale y los PS1xAPP po el D . Ja ie Vi o ica. 3.2 GENERACIÓN DE LAS LÍNEAS ANIMALES En la ob ención de los modelos animales, se empleó el sis ema de ecombinación C e/loxP. Pa a el desa ollo de es e sis ema es p eciso el uso de dos líneas de a ones ansgénicos. El a ón loxeado po a el gen de in e és con un agmen o a deleciona lanqueado po dos secuencias loxP, y el a ón ansgénico C e con un p omo o ejido-especí ico, cuen a con la exp esión condicionada de la ecombinasa C e en de e minados ipos celula es dependiendo del p omo o empleado. CONDICIONES FISIOLÓGICAS CONDICIONES FISIOPATOLÓGICAS Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e + (Expe imen al) Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e + APP +(Expe imen al) Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e – (Con ol) Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e + APP – (Con ol) Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e – APP + (Con ol) Casp 3 ( lox/ lox) CAMK2 c e – APP – (Con ol) Figu a 10. Subdi isión de los g upos de animales en unción de las condiciones de es udio. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 52 3.4 PRUEBAS CONDUCTUALES Como conside aciones p e ias, la habi ación en la que se ealiza on las p uebas conduc uales se man u o aislada de uidos y con una iluminación homogénea y enue. Desde dos días p e ios al inicio las p uebas conduc uales, así como du an e el anscu so de las mismas, el se ín de las jaulas de los a ones no se cambió. Los a ones ue on asladados al cua o de compo amien o una ho a an es del comienzo de las p uebas pa a que se habi ua an al en o no y educi el es és. Todo el equipo, así como los obje os empleados en las p uebas conduc uales se limpia on con e anol (70% en agua) p e iamen e a la ealización de los expe imen os, además de en e sesiones y animales pa a e i a que los olo es ex años a ec a an a los pa ones de compo amien o. Las p uebas conduc uales se desa olla on du an e la ase de luz es ánda , en e las 9:00 y las 15:00h. Las p uebas conduc uales ue on ealizadas en un o den conc e o pa a que los animales es u ie an expues os al meno es és posible. 3.4.1 CARACTERIZACIÓN Se aplicó una e sión simpli icada del p o ocolo de examen p ima io SHIRPA (Smi hKline Beecham, Ha well, Impe ial College, Royal London Hospi al, pheno ype assessmen ) a animales de 1 mes, semanalmen e y du an e 4 semanas. Se a a de un exhaus i o p o ocolo de examen del compo amien o y la mo ología, desa ollado o iginalmen e po Roge s y colabo ado es en el Conso cio de la Mu agénesis ENU (ENU Mu agenesis Conso ium) (Roge s e al., 1997). Con es e examen p ima io SHIRPA simpli icado, se p e endió es udia la unción muscula , (ac i idad espon ánea, capacidad mo iz, o ma de anda , posición y ono co po al y de las ex emidades, ele ación de la cola, posición isual, equilib io y coo dinación, micción y de ecación), unción senso ial (agi ación po aslado, o ma de anda , posición isual, posición de las ex emidades, espues a al sonido), así como algunas unciones neu opsiquiá icas (agi ación po aslado, miedo, ac i idad espon ánea, ag esi idad) y unciones au ónomas 3. MATERIALES Y MÉTODOS 53 Tabla 3: Pa áme os e aluados en el p o ocolo SHIRPA (ele ación de la cola, micción y de ecación). Las p uebas ealizadas, así como su pun uación apa ecen ecogidas en la siguien e ( abla.3). 3.4.2 RECONOCIMIENTO DE OBJETOS NUEVOS Es a p ueba es á basada en el ins in o inna o de los a ones de explo a lo no edoso en e a lo amilia . Pa a ealiza es a p ueba, los a ones se coloca on en un campo abie o ec angula (25x40x40cm). Inicialmen e se lle ó a cabo un pe iodo de 5 min de habi uación al campo abie o, seguido de una sesión de en enamien o donde los a ones se expusie on a dos obje os iguales, colocados sepa ados y equidis an es, du an e 15 min. Finalizado es e en enamien o y anscu ida una ho a, se expuso du an e 10 min a los a ones a un obje o amilia (uno de los u ilizados an e io men e) y a un obje o no edoso (que se di e encia en o ma y colo del obje o amilia ) colocados en la misma posición que los an e io es. Pasadas 24 h los a ones ue on expues os du an e 10 min al obje o amilia (u ilizado el p ime día y colocado en la misma posición) y un obje o no edoso di e en e, en colo y o ma, al usado el día an e io . La p ueba Pa áme o Pun uación Obse aciones Sexo Peso Es ado del pelaje 0-3 Limpio o sucio y e uel o Colo del pelaje 0-3 P esencia de pa ches de canas Pa ches de cal icie 0-3 ausen e o p esen e Posición co po al 0-2 Sin ono muscula o sal os epe i i os Ac i idad espon ánea 0-4 Ninguna o mo imien os ené gicos con inuos (suje o po cola) Ri mo espi a o io 0-3 Len a e i egula o hipe en ilación Temblo 0-2 Ninguno o emblo e iden e Micción - De ecación - Pasos 0-3 No mal o incapacidad mo iz e asión de con ac o 0-3 Ninguna eacción o escape ené gico Piloe ección 0-2 ausen e o p esen e Compo amien o anómalo 0-1 ausen e o p esen e Clasping 0-1 ausen e o p esen e Fue za en ejilla 0-4 Ninguna ue za o ue e aga e Re lejo ocula 0-2 Respues a palpeb al a luces y es ímulos ác iles. Ag esi idad (p o ocada) 0-1 ausen e o p esen e Lag imeo 0-1 ausen e o p esen e Reacción al sonido 0-3 Ninguna espues a o ue e espues a a es ímulo Equilib io 0-10 segundos que pe manezca en la a illa Fue za en ba a 0-10 segundos que pe manezca en la a illa 3. MATERIALES Y MÉTODOS 54 que se ealizó después de una ho a del ensayo si ió pa a e alua la adquisición de la in o mación (memo ia a co o plazo), mien as que la que u o luga 24 ho as después del ensayo se empleó pa a e alua el almacenamien o de és a (la memo ia a la go plazo). Todas las sesiones ue on g abadas pa a su pos e io análisis. El análisis se basa en la di e encia en e el núme o de eces que el a ón se ace ca a los di e en es obje os gene ando un índice de disc iminación (I.D.) que se co esponde a: 3.4.3 TEST EN CAMPO ABIERTO El animal se colocó en una supe icie ec angula blanca de (55x40x40cm) y ue g abado du an e 5 min. Con es e p o ocolo se es udió la ansiedad y la capacidad de habi uación de los animales a en o nos no edosos. Es e es udio se basa en el iempo que pasa cada animal en la zona cen al en e al iempo que pasa en la zona pe i é ica. El cen o de la supe icie se conside ó como un cuad ado que ocupó el 50% del á ea o al. Pa a el análisis se u ilizó el p og ama SMART 3.0 ideo acking sys em (Panlab). 3.4.4 LABERINTO EN Y El labe in o en Y consis e en es b azos idén icos (18x8x15 cm). Los a ones ue on colocados en el cen o del labe in o, pe mi iendo la lib e explo ación du an e 9 min. Todas las sesiones ue on g abadas pa a su pos e io análisis. Con es e es se p e ende es udia la memo ia de abajo y su análisis consis ió en la cuan i icación del núme o o al de en adas en cada uno de los b azos y de las eces que el a ón en o dos eces consecu i as al mismo b azo, lo que se conside ó como un e o . La al e nancia se calculó a endiendo a la ó mula: % Al e nancia = (Núme o de al e nancias/ [En adas o ales-2]) *100 3. MATERIALES Y MÉTODOS 55 3.4.5 ENTERRAMIENTO DE CANICAS En una jaula mediana (22 cm de anchu a x 22 cm de la go x 14,5 cm de p o undidad) con 2 cm de se ín en su base, se coloca on doce canicas dispues as en es columnas de cua o ilas. El a ón ue colocado en la caja y se le pe mi ió la explo ación lib e du an e 10 min. Se omó una o o al inicio del expe imen o y o a al inal. Con el in de medi la ansiedad de los animales se compa a on ambas o os y se cuan i icó el núme o de canicas en e adas, conside ándose como al, cuando quedaba menos de un 25% obse ables en la supe icie. 3.4.6 FORMACIÓN DE NIDO En es a p ueba se emplea on cajas de es abulación pequeñas, donde los a ones se encon aban indi idualizados desde el día an e io . En es as cajas, se in odujo una pieza de algodón de ap oximadamen e un g amo de peso. Se ealiza on medidas de la can idad de algodón que los animales no habían u ilizado en la o mación del nido a 1, 2, 4, 6 y 24 h después de comenza la p ueba. La inalidad de es a p ueba es medi la capacidad na u al de los a ones de o ma un nido como p o ección del en o no y así medi sus capacidades sociales. 3.4.7 ROTAROD Es e apa a o, 47650 Ro a-Rod NG (Ugo Basile) es á o mado po un cilind o gi a o io ho izon al (3 cm de diáme o y 30 cm de longi ud) que posee una supe icie ugosa. El cilind o se encuen a di idido en cinco calles de eje cicio de 5,7 cm po unos cí culos pe pendicula es. La elocidad de gi o, la acele ación y el iempo de eje cicio pueden se con olados. La p ueba comienza con una ase de habi uación de 5 min de du ación a una elocidad cons an e de 5 e oluciones po minu o ( pm). Finalizada es a e apa se ealizó una anda de cua o ensayos de 5 min de du ación cada uno a elocidad acele ada (5-50 pm en 5 min). 3. MATERIALES Y MÉTODOS 56 Pasadas 24 h del en enamien o, se e aluó la memo ia mo o a ealizando una sesión de 5 min igual a una de las sesiones de en enamien o. Todas las sesiones se g aba on pa a su pos e io análisis. Se analizó el núme o de caídas de los a ones y el iempo de la encia de la p ime a caída. 3.5 OBTENCIÓN DE MUESTRA Y PERFUSIÓN INTRACARDIACA Los a ones se anes esia on p o undamen e con una mezcla de Ke amina (Ke amido ®50 mg/Kg) y mede omidina (Dom o ® 10mg/kg) po ía in ape i oneal. Después de con i ma que se encon aban anes esiados co ec amen e, los animales se ija on a una supe icie y se p ocedió a la ealización de la pe usión. La pe usión se ealizó con ampón os a o salino ío (PBS, del inglés Phospha e bu e ed saline). Con unas ije as de ci ugía y con ayuda de unas pinzas hemos á icas, se ab ió la caja o ácica y se dejó expues o el co azón. Pos e io men e se in odujo en el en ículo izquie do una aguja que se encon aba conec ada a una bomba de pe usión (Pe is al ic Pump FH100M. The mo Fishe Scien i ic) uen ea una elocidad de 90ml/h du an e 5 min. Se ealizó un co e en la au ícula de echa pa a pe mi i la salida del líquido de pe usión. Pa a la ex acción del ce eb o, se hizo un co e longi udinal en el c áneo, sepa ando ambos hemis e ios, con ayuda de las pinzas se ex ajo el c áneo, quedando inalmen e expues o el ce eb o. Una ez ex aído, el ce eb o se di idió en dos hemis e ios. Un hemis e io se des inó pa a p uebas de inmunohis oquimica e inmuno luo escencia. En p ime luga , pa a ija el ejido, la mues a se in odujo en un ubo de 15 ml que con enía 6 ml de pa a o maldehído (PFA), ío al 4% (PanReac-AppliChem) es as mues as se almacena on a 4ºC du an e 1 día como mínimo pa a asegu a su ijación. Pos e io men e se ans i ie on a un ubo de 15 ml que con enía una solución de saca osa al 30% en PBS con el in de c iop o ege el ejido. Los ejidos se man u ie on en la solución c iop o ec o a has a su hundimien o. Finalmen e ue on congelados po inme sión en isopen ano a -40ºC (PanReac-AppliChem) y se conse a on a -80ºC. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 57 El o o hemis e io se des inó a dis in as p uebas de biología molecula . Con unas pinzas de disección se sepa a on hipocampo, co eza y ce ebelo. Se almacena on en mic o ubos de 2 ml, se congela on ápidamen e en ni ógeno líquido y inalmen e se man u ie on a -80ºC pa a su pos e io análisis. 3.6 ANÁLISIS DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE ARN MENSAJERO (ARNm) 3.6.1 EXTRACCIÓN DE ARN La ex acción de ARN se ealizó con mues as de hipocampo y co eza que se encon aban conse adas a -80ºC en mic o ubos de 2 ml. La ex acción se ealizó siguiendo el p o ocolo de inido po el ab ican e del eac i o empleado, TRIsu e (Bioline). Todo el p oceso se lle ó a cabo en campana de gases Duc less Fume Hood CRUMA 870. En p ime luga , se añadió 1 ml de TRisu e y 10 pe las de id io a cada una de las mues as. Los mic o ubos se in oduje on en apa a o lisado de ejido TissueLyse II (Qiagen), donde la agi ación del apa a o y el choque que p o ocaba en e las pe las y el ejido, dio luga a la disg egación del ejido y a la libe ación del con enido in acelula . Finalizada la disg egación, se asladó el con enido a mic o ubos de 1,5 ml, que se deja on a empe a u a ambien e du an e 5 min, se añadió 0,2 ml de clo o o mo (PanReac-AppliChem) a cada mic o ubo, se agi a on du an e 15 s y se cen i uga on a 12.000g du an e 15 min a 4ºC, después de habe los dejado incuba du an e 3 min. Finalizada la cen i ugación, se podían dis ingui es ases en cada una de las mues as, (p ime a, ase acuosa con ARN; segunda, in e ase con ADN; y úl ima, ase con las p o eínas). La ase acuosa se ans i ió cuidadosamen e a un nue o mic o ubo de 1,5 ml. Las o as ases se almacena on du an e una noche a 4º y se u iliza án en la ex acción de ADN y p o eínas la cual se desa olla á más adelan e. A la ase acuosa ans e ida se añadió 0,5 ml de isop opanol (PanReac-AppliChem) con el in de p ecipi a 3. MATERIALES Y MÉTODOS 58 el ARN. Se agi a on du an e 15 s, se deja on a empe a u a ambien e y se cen i uga on a 12.000g du an e 10 min a 4ºC. Finalizada la cen i ugación las mues as queda on sepa adas en un sob enadan e y en un p ecipi ado de ARN. Se eliminó el sob enadan e, y pa a la a el p ecipi ado se añadió 1 ml de e anol ío al 75% (PanReac-AppliChem) en agua especí ica pa a Biología Molecula (Nzy ech) a cada una de las mues as. Después de una agi ación en o ex (Labo aq), las mues as se cen i uga on a 7.500g du an e 5 min a 4ºC. Se desca ó el sob enadan e de nue o as la cen i ugación y se dejó seca el p ecipi ado al ai e du an e 10 min pa a elimina los es os de e anol. Cuando se obse ó que el p ecipi ado es aba seco, se esuspendió en 50 µl de agua pa a biología molecula (Nzy ech). La mues a de ARN aislado se cuan i icó en un espec o o óme o NanoD op™ 2000 Spec opho ome e s (The mo Fische ). 3.6.2 RETROTRANSCRIPCIÓN DE ARN Pa a ealiza la e o ansc ipción del ARN a ADN complemen a io (ADNc) se empleó el ki de e o ansc ipción Re e Aid™ Fi s S and cDNA Syn hesis ki (The mo Fische ). El p o ocolo empleado ue el acili ado po el ab ican e. Pa a la e o ansc ipción, se empleó 1 µg de ARN de cada mues a, que se ans i ió a un mic o ubo de 0,2 ml, diluyendo en agua pa a biología molecula en caso que ue a necesa io. A es e mic o ubo se le añadió la mezcla de eac i os del ki (Tabla 4). El es o del p o ocolo se ealizó en un e mociclado PTC-100 The mal Cycle (MJ Resea ch) siguiendo el p og ama es ablecido que cons a de una p ime a incubación de 5 min a 25ºC, o a de 60 min a 42ºC, y una úl ima de 5 min a 70ºC. El ADNc ob enido en los 20 μl o ales de la eacción se u ilizó di ec amen e pa a el es udio de exp esión génica o se congeló a -80ºC. Tabla 4. Reac i os y olúmenes empleados en la e o ansc ipción. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 59 3.6.3 PCR A TIEMPO REAL La es imación de los ni eles de ARNm se ealizó a a és de una PCR a iempo eal (RT-PCR). Se u ilizó un ki de PCR SensiFASTTM SYBR No-ROX ki (Bioline) siguiendo el p o ocolo de inido po el ab ican e en odo momen o. Se u iliza on 42 ng de ADNc po 4,2 μl de mues a. Pa a lo cual las mues as de ADNc se diluye on en agua pa a biología molecula (Nzy ech) has a alcanza una concen ación de 5ng/µl. La mezcla de eacción se p epa ó añadiendo po mues a, según el p o ocolo seguido: 5 μl de 2x SensiFAST SYBR No-ROX Mix y 0,4 μl de cada cebado (Tabla 5). El ADNc y la mezcla de eacción p epa ados se ans i ie on a una placa de 384 pocillos Ligh Cycle 480 (Roche) con la pipe a au omá ica E1-ClipTipTM Blue oo hTM Elec onic Mul ichannel Pipe es (The mo Fische ). Cada una de las mues as se es udió po iplicado. La RT-PCR se lle ó a cabo en un e mociclado Ligh Cycle ® 480 (Roche). El p og ama u ilizado empezó con un p ime ciclo de 2 min a 95ºC seguido de 40 ciclos cons i uidos po una ase de desna u alización de 5 s a 95ºC, una segunda ase de hib idación de 10 s a 65ºC y una e ce a y úl ima ase de ex ensión de 20 s a 72ºC. El p og ama inalizó con un paso inal de 7 min a 72ºC. Random hexame p ime 1 μl 5x Reac ion Bu e 4 μl RiboLock RNase Inhibi o (20 U/μL) 1 μl Re e Aid M-MuLV RT (200 U/μL). 1 μl 10 mM dNTP Mix 2 μl Nomb e Secuencia en sen ido (S) Secuencia en an isen ido (A) Casa come cial GAPDH S:5´- GTGTTTCCTCGTCCCGTAGA A:5´- AATCTCCACTTTGCCACTG Sigma-Ald ich CRE GTCGAGCGATGGATTTCCG GTTGATAGCTGGCTGGTGG Sigma-Ald ich Tabla 5. Cebado es pa a RT-PCR 3. MATERIALES Y MÉTODOS 60 3.7 ANÁLISIS HISTOLÓGICO Los ejidos, que se encon aban c iop o egidos, congelados y almacenados a -80ºC ue on co ados u ilizando un c ios a o Leica CM 1850 UV a -22ºC. Se ealiza on co es co onales a 30 µm de g oso y se almacena on en placas de 24 pocillos que con enían una solución an icongelan e (20% agua des ilada, 20% PBS 2x, 30% e ilenglicol, 30% glice ina). Las placas se man u ie on a -40ºC. 3.7.1 INMUNOFLUORESCENCIA En es e caso, el acoplamien o del an icue po secunda io con luo oc omos hace isible la eacción del an ígeno-an icue po. De es a o ma, usando la combinación adecuada de an icue pos secunda ios y luo o o os se puede de ec a múl iples an ígenos en una sola p ueba. También pe mi e ealiza es udios de colocalización. El p o ocolo seguido se desc ibe a con inuación. En p ime luga , los ejidos se in oduje on en placas de 12 pocillos y se ealiza on es la ados de 10 min con PBS (Nzy ech) pa a elimina los es os de solución an icongelan e. En caso de que uese necesa io, en base a los an icue pos u ilizados, los ejidos se in oduje on en ubos de ensayo de 15 ml con ci a o (Nzy ech) al 0,024% pa a aumen a su an igenicidad y se incuba on a 80ºC du an e 30 min. Pos e io men e los ejidos se la a on en PBS y se incuba on du an e 1 h en PBS con i ón (PBS-T) al 1% pa a aumen a la pe meabilidad. Después, con el in de p e eni las uniones inespecí icas del an icue po se ealizó un bloqueo de 2 h en PBS-T 1% con 5% de albumina bo ina sé ica (BSA) (Sigma Ald ich). Finalmen e se incuba on con los an icue pos p ima ios co espondien es ( abla 6) disuel os en PBS-T1% y BSA1% a empe a u a ambien e du an e 30 min y a 4ºC du an e oda la noche. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 61 En el segundo día, se incuba on los ejidos a empe a u a ambien e du an e 30 min. Pos e io men e pa a elimina el exceso de an icue pos, se hicie on seis la ados de 10 min en PBS-T 0,1% y se incuba on con los an icue pos secunda ios co espondien es ( abla7) disuel os en PBS-T 0,1% y BSA 1% du an e 1 h. Finalizada la incubación, solo en el caso de las inmuno luo escencias con io la ina, los ejidos se incuba on du an e 4 min con io la ina (Sigma) a una concen ación 1:3000. Pos e io men e, se ealiza on seis la ados de 10 min en PBS-T0,1% y se p ocedió al mon aje de los co es. Pa a ello los co es se coloca on en po aobje os sin gela iniza , se añadió medio de mon aje Glice ol 50% pa a luo escencia, se coloca on los cub eobje os y se sella on con laca de uñas. Las p epa aciones ue on conse adas a 4ºC y en oscu idad pa a e i a la pé dida de luo escencia de las secciones. Todo el p oceso se hizo en agi ación. Las imágenes de las p epa aciones de inmuno luo escencia ue on omadas con un mic oscopio con ocal de luo escencia ZEISS LSM 7 DUO (Ci ius, Uni e sidad de Se illa). Todas las imágenes ue on omadas en las mismas condiciones, pa a su pos e io análisis y compa ación. ANTÍGENO CONCENTRACIÓN HUÉSPED CASA COMERCIAL REFERENCIA NeuN 1:500. Ra ón Millipo e MAB377 Caspase-3 1:250. Conejo Cell Signaling 9662S Aβ 1:1000 a ón Synap ic Sys ems 218.721 Iba 1 1:500 conejo Wako 019-19741 ANTÍGENO CONCENTRACIÓN HUÉSPED CASA COMERCIAL REFERENCIA An i-Rabbi Alexa-488 1:500. Bu o The mo Fishe Scien i ic A-21206 An i-Mouse Alexa-647 1:500. Bu o Li e echnologies A31571 An i-Rabbi Alexa-546 1:500. Bu o Li e echnologies A10040 Tabla 6. An icue pos p ima ios Tabla 7. An icue pos secunda ios 68 4. RESULTADOS 69 4.1 ESTUDIO DE LA CASPASA 3 A NIVEL FISIOLÓGICO. MODELO DE RATÓN CASP3 / CAMKIIc e/w 4.1.1 DEMOSTRACIÓN DE LA DELECIÓN SELECTIVA DE CASPASA-3 T as la ealización de las p uebas conduc uales, se comenzó po es udia en los ejidos ex aídos (Figu a 14), la e ec i idad de la deleción de casp 3 en la egión hipocampal de los suje os expe imen ales. Pa a ello, se ealizó una inmuno luo escencia en secciones co onales de hipocampo en el g upo expe imen al y con ol. Se u ilizó un an icue po p ima io pa a ma ca la exp esión de casp 3 jun o con el an icue po especí ico pa a NeuN, ma cado de neu onas madu as. El uso de los an icue pos de NeuN, pe mi e consegui un ma caje con ol de las neu onas. Figu a 14. Esquema de gene ación de los dos g upos de a ones de es udio y línea empo al seguida du an e la in es igación. De izquie da a de echa se obse a de mane a esquemá ica la es a egia de c uce en el sis ema c e-LoxP pa a la gene ación de los dos g upos de es udio. A los dos meses se ealiza on las p uebas conduc uales de dichos g upos y ap oximadamen e al mes del comienzo de las p uebas se ex aje on los ejidos pa a el es udio a ni el molecula . 4. RESULTADOS 70 Como puede obse a se en la igu a 15, exis e una cla a disminución del ma caje de casp 3 en el g upo expe imen al, siendo es a disminución mayo en la egión CA1, mien as que en NeuN no se obse a ningún cambio en e ambos g upos. Figu a 15. Inmuno eac i idad en e a caspasa 3 y NeuN en secciones co onales de hipocampo de a ones Caspasa 3 / Camk IIc e/w y Caspasa 3 / Camk IIw /w . Se mues a, de o ma cuali a i a, la disminución de inmuno eac i idad posi i a pa a caspasa 3 en el g upo expe imen al (columna de la de echa), siendo más acen uada en la egión CA1. La ba a de calib ación es de 200 μm 4. RESULTADOS 71 Con el in de comp oba la e iciencia del sis ema c e-LoxP se ealizó un análisis de exp esión génica de CRE gene al po medio de la écnica de RT-PCR de ARNm en hipocampo de a ones del g upo con ol y expe imen al. Como con ol in e no se midió la exp esión del ma cado GAPDH. Los esul ados ob enidos e ela on un aumen o signi ica i o de la exp esión de CRE en los animales Casp 3 / Camk II c e/w , siendo p ác icamen e inexis en e la exp esión de CRE en el g upo con ol Casp 3 / Camk II w /w con un alo de p= 0,003 (Figu a 16). % Exp esión de ARN mensaje o CRE (no malizado al g upo expe imen al) Figu a 16. Ni eles de exp esión de ecombinasa CRE en la egión hipocampal. En es a igu a se obse an los ni eles de exp esión de ARN mensaje o de la ecombinasa CRE en los dis in os g upos de es udio, ob enidos median e RT-PCR. Los esul ados se exp esan como po cen aje espec o al g upo expe imen al y se ep esen an como media ± EEM. **p<0.02. 4. RESULTADOS 72 4.1.2 ANÁLISIS FUNCIONAL. PROTOCOLO SHIRPA Una ez comp obada la e iciencia del sis ema c e-LoxP, se ealizó un análisis uncional comple o. Se comenzó e aluando el eno ipo gene al de los a ones, comp obando así la posible exis encia de alguna anomalía en el g upo expe imen al. Se ealizó una e sión simpli icada del p o ocolo de examen p ima io SHIRPA es udiando la apa iencia gene al de a ón y e aluando la p esencia de al e aciones en la ma cha, la pos u a, el peso, en el con ol mo o o la coo dinación. Es e análisis se ealizó en una pequeña mues a de a ones a una edad pos na al de 30 días (P30), después de que se es ablecie a el pa ón adul o de ecombinación (Tsien e al.,1996) y u o una du ación de cua o semanas. Respec o a los pesos (Figu a 17) no exis e di e encia signi ica i a en e el g upo con ol y expe imen al. 0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 Peso co po al (g) Semanas C3CAMK2- C3CAMK2+ Figu a 17. Peso co po al de los g upos de ensayo. Peso co po al medio po semana de los a ones con oles Caspasa 3 CamkII- y de los a ones expe imen ales Caspasa 3 CamkII+, desde p30 has a p60. 4. RESULTADOS 73 Los esul ados de la ba e ía de ensayos SHIRPA (Figu a 18) e idencia on di e encias signi ica i as du an e las dos p ime as semanas en la ac i idad espon ánea, p ueba que consis ía en e alua la ac i idad de los a ones mien as se encon aban suje os po la cola. El g upo expe imen al p esen ó mayo agi ación y mo imien os más ené gicos y con inuos que el g upo con ol (semana 1 p = 0,035; semana 2 p= 0,014). El g upo Casp 3 Camk II+ aunque p esen ó una mayo de eacción al sonido en casi odas las semanas, la di e encia en e g upos no ue signi ica i a (semana 1 p= 0,092; semana 3 p= 0,058; semana 4 p= 0,092). Con el paso de las semanas apa eció un lige o emblo en los a ones expe imen ales, sin emba go, los da os e e en es a es e pa áme o no esul a on signi ica i os. Des aca po úl imo que en la semana 3 exis e una di e encia signi ica i a en la p ueba de ue za en ejilla (p= 0,014), p esen ando una meno ue za de aga e en sus ex emidades supe io es los a ones pe enecien es al g upo expe imen al. Sin emba go, a la siguien e semana es e pa áme o se igualó a los alo es del g upo con ol. Respec o al es o de pa áme os no hubo p ác icamen e di e encias en e los dos g upos de es udio. Po lo an o, se obse a que excep o los pa áme os de ac i idad espon ánea y de eacción al sonido, los a ones expe imen ales no p esen a on di e encias que se man u ie an en las semanas espec o a los con oles, demos ando así que, en p incipio, la deleción de la casp 3 no hab ía a ec ado de mane a c í ica al eno ipo del a ón. 4. RESULTADOS 74 B A * * * 4. RESULTADOS 75 D C Figu a 18. Medias de los pa áme os es udiados du an e la moni o ización o denados po semanas. Los apa ados de los paneles (A, B, C y D) co esponden a las semanas de moni o ización de la 1 a la 4 espec i amen e. Los pa áme os ue on analizados en g upos compues os po una n=4. Los alo es de las medias y el e o es ánda se adjun an a modo de ablas en el anexo I. ** 4. RESULTADOS 76 4.1.3 CARACTERIZACIÓN CONDUCTUAL Después de lle a a cabo una p ime a e aluación uncional y obse a alguna posible di e encia en e el g upo con ol y expe imen al, se quiso p o undiza ealizando un análisis conduc ual con el in de es udia las modi icaciones en las capacidades mo o as, psico isiológicas, sociales y cogni i as de los a ones expe imen ales. 4.1.3.1 EVALUACIÓN DEL COMPORTAMIENTO MOTOR El es udio del compo amien o mo o de los a ones Casp 3 / Camk IIc e/w se lle ó a cabo a a és de dos p uebas. La p ueba en campo abie o, con la que se p e endía e alua la ac i idad espon ánea y la p ueba de o a od pa a e alua el equilib io y la coo dinación. La ac i idad espon ánea se e aluó en una sesión de 5 min. Los a ones expe imen ales y con oles mos a on da os simila es en la ac i idad locomo o a, pudiendo obse a se únicamen e un meno núme o de en adas a la zona cen o po pa e del g upo expe imen al, sin llega a se signi ica i o (Figu a 19A). Respec o a la p ueba de equilib io y coo dinación a pesa de ap ecia se en las g á icas (Figu a 19B) una lige a di e encia en el núme o de caídas, siendo mayo en el g upo expe imen al en e al con ol, es a di e encia no esul ó signi ica i a. 4. RESULTADOS 77 A B 5 50 pm 5 min Figu a 19. E ec o de la deleción de caspasa 3 en el compo amien o mo o . (A) Esquema de la p ueba de campo abie o de 5 min de du ación. Debajo se ep esen an (de izquie da a de echa) la media del iempo que los a ones de cada g upo se encuen an en el bo de, exp esado en po cen aje. La media de iempo que los a ones pe manecen en eposo, exp esada en s y, po úl imo, la media del núme o de eces que cada a ón en a en la zona es ablecida como cen o. 5 min 4. RESULTADOS 84 4.1.5 ELECTROFISIOLOGÍA Los es udios de plas icidad sináp ica ealizados en a ones Casp 3 / CamkII c e/w y en a ones con ol se lle a on a cabo a a és del egis o de los EPSPs (Po enciales pos -sináp icos exci a o ios de campo) inducidos en las neu onas de la egión CA1 del hipocampo median e la es imulación de las cola e ales de Scha e en el es a o adia um de los co es de ce eb o. Los es udios se ealiza on en colabo ación con An onio Rod iguez, en a ones de 2 a 3 meses de edad. La LTP se ep esen ó como la pendien e EPSP no malizada espec o a la línea base, la cual se ijó en el 100%. Como puede obse a se en la igu a 25A, a los 50-60 min de g abación después de aplica el p o ocolo de HFS (Es imulación a al a ecuencia), en el g upo con ol se alcanzó ap oximadamen e el 200% de la línea base mien as que en el g upo expe imen al se alcanzó únicamen e un 135% de la línea base, dando luga a una di e encia signi ica i a en e ambos g upos (p<0,05) (Figu a 25B). También se puede ap ecia una di e encia signi ica i a en la STP (p<0,05), la cual se calculó como la pendien e máxima (pico) jus o después de la aplicación del p o ocolo de es imulación a al a ecuencia. En el caso del g upo con ol ue de un en o no a 175% mien as que en g upo expe imen al ue de menos del 150% (Figu a 25C). Figu a 24. Rep esen ación g á ica de los análisis de densidad y ca ego ización de las espinas dend í icas. (A) Densidad espinal (espinas po ɥm2) de ambos g upos de es udio. (B) Rep esen ación esquemá ica de los dis in os ipos de espinas dend í icas, o ganizadas en una escala en unción de su madu ez. (C) Po cen ajes de los dis in os ipos de espinas dend í icas encon adas en los segmen os dend í icos de es udio. *p<0,05; p<0,02. 4. RESULTADOS 85 Además, se ealizó un es udio de pulsos pa eados as la inducción de la LTP pa a e alua los posibles e ec os de es imulación. El a io de pulsos pa eados (PPR) se exp esó como la pendien e del segundo EPSP di idida po la pendien e del p ime EPSP. En es e caso los g upos con ol y expe imen al no mos a on di e encias signi ica i as, lo que indica ía que no exis i ían cambios en los e ec os de es imulación debido a la inducción de LTP (imagen 25D). A B C D 4. RESULTADOS 86 Po úl imo, se lle ó a cabo una cu a de es ímulo- espues a (0,1–0,6 µA, media de cinco EPSP en cada es imulación) pa a los di e en es a ones u ilizados. En la igu a 27 se puede ap ecia como a una in ensidad de 350 µA exis e una cla a di e encia signi ica i a (p<0,02.) en e el g upo casp 3 camkII c e/w y el g upo con ol. Mien as que el g upo con ol p esen a una EPSP de ap oximadamen e 100% el g upo expe imen al p esen a 75%. Es os da os pod ían indica que las di e encias obse adas en los análisis de LTP en e los di e en es g upos de es udio, pod ía debe se a un de ec o en la ansmisión sináp ica basal. Figu a 25. Regis o y análisis del es udio de la po enciación a la go plazo. (A) Rep esen ación de la pendien e de EPSP en el cu so empo al del p o ocolo de LTP inducido en la egión hipocampal. Se mues a la EPSP an es y 60 min después de la aplicación del p o ocolo de LTP. Los símbolos ep esen an las espues as p omedio p esen adas cada 60 s pa a cada geno ipo. Después de 10 min de egis o con ol se aplica el p o ocolo de LTP como iene señalado en la g á ica. (B, C) ep esen ación compa a i a en e el g upo con ol y expe imen al de la pendien e EPSP no malizada en la LTP y STP. (D) ep esen ación del a io de pulsos pa eados del g upo con ol y expe imen al du an e la es imulación basal y 60 min después de la aplicación del p o ocolo de LTP. *p<0,05. Figu a 27. Cu a es ímulo- espues a. Rep esen ación de la pendien e de EPSP de ambos g upos de es udio, en unción de la in ensidad del es ímulo ecibido. **p<0,02. 4. RESULTADOS 87 4.2 ESTUDIO DE LA CASPASA 3 A NIVEL FISIOPATOLÓGICO. MODELO DE RATÓN CASP3 / CAMKII c e/w APP+ 4.2.1 CARACTERIZACIÓN CONDUCTUAL An es de comenza con el obje i o p incipal de es e apa ado, que es el es udio de las placas amiloides y de la posible implicación de la casp 3 en los p ocesos elacionados con és as, se ealizó una pequeña ba e ía de p uebas conduc uales pa a con i ma que no exis ía ninguna anomalía en cuan o a coo dinación, compo amien o mo o o ansiedad en el g upo expe imen al. Es as p uebas se ealiza on a los 6 y 9 meses de edad. 4.2.1.1 EVALUACIÓN DEL COMPORTAMIENTO MOTOR Al igual que con los a ones Casp 3 / Camk II c e/w , el compo amien o mo o se ealizó a a és de dos p uebas. La p ueba en campo abie o si ió pa a e alua la ac i idad espon ánea y la p ueba de o a od pa a e alua el equilib io y la coo dinación. A B 6 meses 9 meses 4. RESULTADOS 88 En la p ueba de campo abie o, se e aluó el iempo que los a ones pasaban en el bo de, el iempo de descanso y el núme o de en adas al cen o. Como puede obse a se en la igu a 28, en ninguno de es os pa áme os se e idencia on di e encias signi ica i as en e los g upos con ol y expe imen al pa a las dos edades e aluadas. Tampoco se encon a on esul ados signi ica i os en la p ueba de o a od a ninguna de las edades (Figu a 29). A B Figu a 28. E ec o de la deleción de caspasa 3 en el compo amien o mo o de a ones PS1xAPP. (A, B) Se ep esen an (de izquie da a de echa) La media del iempo que los a ones de cada g upo se encuen an en el bo de, exp esado en po cen aje. La media de iempo que los a ones pe manecen en eposo, exp esada en segundos y, po úl imo, la media del núme o de eces que cada a ón en a en la zona es ablecida como cen o. (A) G upos expe imen al y con ol de 6 meses de edad. (B) G upos expe imen al y con ol de 9 meses de edad. 6 meses 9 meses 4. RESULTADOS 89 4.2.1.2 EVALUACIÓN DE LA ANSIEDAD Pa a e alua el es ado de ansiedad de los a ones, se lle ó a cabo la p ueba de en e amien o de canicas de 10 min de du ación. Es a p ueba solo ue ealizada a los seis meses de edad. El núme o de canicas en e adas po el g upo de a ones expe imen ales ue signi ica i amen e meno a las en e adas po el g upo con ol (p= 0,028) lo que sugie e que los a ones Casp 3 / CamkII c e/w APP+ expe imen an una conduc a más ansiosa que los con oles (Figu a 30). Figu a 29. E ec o de la deleción de caspasa 3 en el compo amien o mo o ( o a od) de a ones PS1xAPP. (A, B) se ep esen a la media de caídas en la p ueba inal y la media de la la encia de caídas exp esada en segundos. (A) G upos expe imen al y con ol de 6 meses de edad. (B) Mismos pa áme o medido en el panel A pe o en a ones de 9 meses de edad. Figu a 30. E ec o de la deleción de caspasa 3 en la ansiedad de a ones PS1xAPP. Se ep esen a la media de las canicas en e adas po cada g upo de es udio. *p<0,05. 4. RESULTADOS 90 4.2.2 ANÁLISIS DE PLACAS A Después de comp oba que los a ones expe imen ales no p esen aban ninguna anomalía inespe ada, excep o la p esencia de un mayo ni el de ansiedad en el g upo expe imen al, se p ocedió al análisis de las placas de A en a ones de 6 meses. Pa a ello, se ealizó una inmuno luo escencia de iple ma caje en secciones co onales de hipocampo del g upo expe imen al y con ol, con a el pép ido A, la p o eína Iba 1 (al amen e exp esada en mic oglía) y con a las ib as amiloides ib ila es a a és de la inción con io la ina (Figu a 31). En el es udio mo ológico de las placas, se lle ó a cabo un análisis compa a i o en e los g upos expe imen al y con ol, del á ea y pe íme o de las placas y de la in ensidad de luo escencia media de A. Con es os da os se calculó la ci cula idad de las placas pa a comp oba si és as p esen aban un eno ipo compac o o di uso. Finalmen e se calculó el núme o de placas po á ea y el po cen aje de Iba 1 po á ea de A, con el in de encon a alguna di e encia en la dis ibución de la mic oglía en los a ones casp 3 KO APP+. En es e g upo de edad, no se encon a on di e encias signi ica i as en e los a ones con ol y expe imen al pa a ninguno de los pa áme os es udiados (Figu a 32). 4. RESULTADOS 91 Figu a 31. Es udio mo ológico de las placas de A. Inmuno eac i idad en e a A (blanco) (A, E), Iba 1 ( ojo) (C, G) y ma caje con io la ina ( e de) (B, F) en secciones co onales de hipocampo de a ones Caspasa 3 / Camk IIc e/w APP+ y Caspasa 3 / Camk IIw /w APP+. La ba a de calib ación es de 272 μm. Aβ Aβ ThS ThS Iba1 Iba1 Me ge Me ge Con ol Exp A B C D E F G H 4. RESULTADOS 92 Figu a 32. Es udio mo ológico de las placas A en a ones KO condcional de caspasa 3 APP+ y en a ones con ol. Rep esen ación g á ica del á ea de A (A), de la in ensidad de luo escencia media (B) del pe íme o de las placas de A (C), de su ci cula idad (D), del núme o de placas po mm2 (E) y del po cen aje de Iba1 po á ea de A (F). Los alo es se ep esen an como media ± EEM. A B C D E F 93 5. DISCUSIÓN 100 Lewis, 2000; Hu sle and Zhang, 2010; Ma in e al., 2012). Además, se han encon ado al e aciones en el núme o de espinas dend í icas y cambios en su mo ología en los as o nos de dé ici cogni i o (Le enga and Willemsen, 2012). Nues o modelo de a ón p esen a una disminución signi ica i a de las espinas co as o ambién denominadas go das, espinas es ables y madu as elacionadas con la memo ia, a la ez que p esen a un aumen o de las espinas la gas y delgadas. Es a si uación se egis ó de mane a simila en el es udio de Pe ez-Villegas y colabo ado es en 2020 en el que sus a ones denominados ambalean es, p esen a on una disminución de las espinas co as y ami icadas a la ez que un aumen o de las espinas inmadu as la gas y delgadas (Pé ez-Villegas e al., 2020). Sin emba go, los a ones ambalean es no p esen a on di e encias en la densidad espinal. El aumen o en las espinas dend í icas inmadu as se ha podido obse a en a ios as o nos de dé ici cogni i o como en el sínd ome de Re (Le enga and Willemsen, 2012) o el sínd ome del c omosoma X ágil. Es e úl imo se asocia con una mayo densidad espinal (Le enga and Willemsen, 2012), además de un aumen o de las o mas inmadu as, si uación simila a la es udiada en los a ones caspasa3 / Camk2 CRE/W , que p esen an un aumen o signi ica i o de la densidad espinal, acompañado, como se ha comen ado an e io men e, po un aumen o de las o mas inmadu as. Es os esul ados co elacionan con los ob enidos en la ca ac e ización conduc ual donde los a ones expe imen ales p esen aban un dé ici en la memo ia a la go plazo. Po úl imo, los es udios de elec o isiología ealizados mos a on, como se había hipo e izado según los da os ob enidos p e iamen e, que los a ones caspasa3 / Camk2 CRE/W mos aban una LTP inhibida, además los da os ob enidos en la cu a de es ímulo- espues a indica ían que las di e encias obse adas pod ían debe se a un de ec o en la ansmisión siná ica basal. La hipó esis de que las caspasas pod ían es a implicadas en los p ocesos de plas icidad sináp ica su gió al descub i se que las subunidades de los ecep o es AMPA e an sus a os de 5. DISCUSIÓN 101 escisión de caspasas (Chan e al., 1999; Lu e al., 2002). Nume osos es udios que emplean inhibido es a macológicos, apoyan que la casp 3 pod ía es a implicada en la po enciación a la go plazo (Ma son e al., 1998; Chan e al., 1999; Chan and Ma son, 1999; Ma son and Duan, 1999; Glazne e al., 2000; Ma son, 2000; Kud yasho e al., 2001, 2002; Shimohama e al., 2001a, b; Yan e al.,2001; Gilman and Ma son, 2002; Lu e al., 2002). En e las in es igaciones in i o des aca el es udio ealizado po Huesmann y Clay on en 2006, donde se demos ó que los ni eles de casp 3 ac i a aumen a on pos sináp icamen e en la co eza audi i a de las a es du an e la habi uación al can o, y que el bloqueo de dicha caspasa impedía la adquisición de la memo ia asociada a una canción especí ica (Huesmann and Clay on, 2006). En nues o es udio, el análisis de la p ueba de pulsos pa eados pod ía señala que la di e encia obse ada en la LTP no se debe ía, en p incipio, a un allo p esináp ico, es os da os, po an o, se e ían apoyados po el es udio de Huesmann y Clay on, donde el aumen o de casp 3 ac i a se p odujo de mane a pos sináp ica. Sin emba go, se ían necesa ios es udios complemen a ios pa a pode a i ma es a conclusión. In es igaciones ealizadas en a as empleando inhibido es de casp 3, ambién mues an su implicación en los p ocesos de memo ia y ap endizaje a ni el conduc ual (S epaniche e al., 2005) y a ni el elec o isiológico (Gulyae a e al., 2003). Es e úl imo es udio es de especial in e és al se la p ime a e idencia de que la ac i idad de casp 3 es esencial pa a la LTP en la egión CA1 del hipocampo. Si bien es cie o que Li y colabo ado es publica on en 2010 un es udio en el que so enían que la casp 3 no enía un papel c ucial en la LTP, los a ones empleados en ese es udio no ue on KO condicionales, p esen ando, aunque mínimos, algunos cambios neu opa ológicos (Kuma , 2007; Je ey e al., 2002). Po o a pa e, el p o ocolo que se lle ó a cabo pa a la inducción de la LTP ue dis in o al p esen ado en es e abajo, así como la edad de los a ones empleados. 5. DISCUSIÓN 102 Aún no se ha desc i o el mecanismo molecula que explica el posible papel de la casp 3 en la LTP, aunque si se ha especulado ace ca de la posibilidad de que ac úe a ni el p e o pos sináp ico, sob e alguno de los sus a os con los que se ha elacionado a es a caspasa, implicados en la LTP. Algunos ejemplos encon ados a a és de una ex ensa búsqueda bibliog á ica apa ecen ecogidos en las ablas 8 A y B. Tabla 8 A y B. Sus a os sináp icos de caspasa 3 A B 5. DISCUSIÓN 103 5.2 GENERACIÓN DEL MODELO CASPASA 3 / CAMK2 CRE/WT APPxPS1 Y ESTUDIO MORFOLÓGICO DE LAS PLACAS DE A Pa a lle a a cabo el es udio de la deleción de casp 3 en la EA, se gene ó una nue a línea de a ones a pa i de a ones Casp 3 / CamkII c e/w y modelos mu inos de la EA PS1xAPP, que p esen an depósi os de A, os o ilación de Tau, in lamación en el ce eb o y dé ici cogni i o. Es e modelo de la EA p esen a una en aja con espec o a los demás modelos ya que es un doble ansgénico PS1del a9 x APPSwe, que sob eexp esa una o ma mu ada de las p o eínas PS1 y Mo/HuAPP695swe, asociadas ambas con la EA de inicio emp ano. G acias a es e modelo mu ino se p e ende analiza la implicación de la casp 3 en el desa ollo de la EA desde su e apa más emp ana, a a és del es udio de los g upos con ol y expe imen al a di e en es edades (6, 9 y 12 meses). En el p esen e abajo se han mos ado los da os co espondien es al g upo de 6 meses de edad. En p ime luga , se ealizó una pequeña ba e ía de p uebas conduc uales pa a asegu a nos de que no exis ía ninguna anomalía en el g upo expe imen al que se debie a ene en cuen a a lo la go del es udio. Se hizo una e aluación del compo amien o mo o a los 6 y 9 meses y de la ansiedad únicamen e a los 6 meses. Los análisis de las p uebas mo o as no mos a on di e encias signi ica i as en e el g upo expe imen al (Casp 3 / CamkII c e/w APP+) y el g upo con ol (Casp 3 / CamkII w /w APP+), sin emba go, sí se encon a on di e encias signi ica i as en la p ueba de en e amien o de canicas en e ambos g upos. Es a p ueba, que pe mi e e alua el es ado de ansiedad de los a ones, mos ó como el g upo expe imen al p esen aba una conduc a más ansiosa que el g upo con ol. En 2013, Webs e y colabo ado es demos a on que, además de las al e aciones ca ac e ís icas en ap endizaje y memo ia, los a ones APP/PS1 no p esen aban o as al e aciones de compo amien o, como la ansiedad (Webs e e al., 2013). Po lo an o, es a conduc a es a ía elacionada con la deleción de casp 3 en el modelo. 5. DISCUSIÓN 104 En es e abajo no se incluye on p uebas conduc uales de ap endizaje y memo ia ya que nues o obje i o se cen ó en el es udio de la in luencia de casp 3 en el desa ollo de las placas de A y en el papel de la mic oglía en la EA. Las e idencias de los modelos de animales que es udian las unciones de APP en la pa ogénesis de EA, sugie en que la ac i idad de las caspasas juega un papel cla e que impulsa los de ec os sináp icos inducidos po es a p o eína (Unsain e al., 2013). Se ha demos ado que los agmen os de A de APP son capaces de inhibi la LTP y acili a la LTD en la egión hipocampal (Cheng e al., 2009; Kim e al., 2001; Rowan e al., 2005; Shanka e al., 2008) a a és de la ac i ación de una ía dependien e de casp 3, la cual escindi ía Ak , libe ando la inhibición de la quinasa GSK3 (Jo e al., 2011). Es a quinasa ambién es capaz de hipe os o ila Tau, o o conocido sus a o de la casp 3 (Fasulo e al., 2002). Po o o lado, a ios es udios han demos ado que la eliminación sináp ica de los AMPAR inducida po A42 se basa en la ac i ación de la calcineu ina (Wu e al., 2010, 2012; Zhao e al., 2010), la cual, a su ez, puede se ac i ada po escisión de la caspasa 3 (Muke jee e al., 2000). De es a o ma, se ía posible que los p oduc os de APP ac i en a la casp 3, que escindi ía a la calcineu ina. Po úl imo, des aca el es udio de Tesco y colabo ado es, donde se demues a que GGA3, una p o eína adap ado a sus a o de casp 3, egula ía los ni eles de BACE y la ac i idad de la -sec e asa. Es a p o eína se encon a ía disminuda en la EA, mien as que los ni eles de BACE se encon a ían aumen ados. De es a mane a, el es udio sugie e que la casp 3 al escindi GGA3, a ec a ía a la deg adación y es abilización de BACE y es o conduci ía a una mayo p oducción del pép ido de A, con ibuyendo a la pa ogénesis de la EA (Tesco e al., 2007). A pesa de es os es udios que apoyan nues o obje i o de analiza como a ec a la deleción de casp 3 a la mo ología (á ea, pe íme o, in ensidad media) y núme o de las placas A, pa a el g upo expe imen al de 6 meses de edad no se ob u ie on esul ados signi ica i os de los 5. DISCUSIÓN 105 pa áme os analizados espec o a los a ones con ol APP/PS1 sin casp 3 delecionada. Tampoco se ob u ie on esul ados signi ica i os en la medida del g ado de compac ación de las placas. Po o a pa e, eniendo en cuen a que en la EA una ca ac e ís ica llama i a es la ag upación de la mic oglía al ededo de los depósi os de A, así como los es udios que elacionan es a mic oglía an o de mane a bene iciosa como pe judicial con la pa ogénesis de la en e medad (Lee y Land e h, 2010; Condello e al., 2011; Block e al., 2007), se decidió hace un análisis del po cen aje de mic oglia po á ea de A en nues o modelo mu ino. En es os esul ados ampoco hubo una di e encia signi ica i a en e ambos g upos. Es os esul ados pueden debe se a la edad an emp ana a la que se ha comenzado el es udio de es e modelo de a ón, ya que el desa ollo de las placas en los a ones ansgénicos de APP/PS1 comienza en e los 6 y 7 meses de edad (h ps://www.jax.o g/), po an o, u u os expe ime os con a ones de 9 y 12 meses de edad se án necesa ios pa a analiza la e olución del papel de la casp 3 en la EA. Es e modelo de a ón pe mi i ía el es udio a di e en es edades de la implicación de la casp 3 en di e en es aspec os de la en e medad, a ni el compo amen al, de sinapsis o de es udios de LTP, además de los es udios de placas A y de mic oglía comenzados en es e abajo. 106 107 CONCLUSIONES 108 6. CONCLUSIONES 109 1. El modelo condicional neu onal de casp 3 gene ado alcanza la edad adul a sin p esen a cambios neu opa ológicos. 2. La ausencia de casp 3 en neu onas de la egión hipocampal p o oca al e aciones en la memo ia a la go plazo. 3. La deleción de casp 3 en neu onas del hipocampo p o oca una modi icación en la densidad espinal y una disminución de las espinas dend í icas madu as (co as) acompañada de un aumen o de las espinas dend í icas inmadu as (la gas y delgadas). 4. La ausencia de casp 3 neu onal en la egión hipocampal p o oca una inhibición de la LTP. 5. El modelo APP/PS1 condicional neu onal de casp 3 no p esen a al e aciones en la mo ología de las placas de A espec o al modelo APP/PS1 a los 6 meses de edad. Tampoco p esen a di e encias en la ac i ación o dis ibución de la mic oglía que odea las placas de A. 7. BIBLIOGRAFÍA 116 - Connolly, P.F., Jäge , R., & Fea nhead, H.O. (2014). New oles o old enzymes: kille caspases as he engine o cell beha io changes. F on ie s in physiology, 16, 5,149.  Co nu , M., Bou donnay, E., & Hen y, T. (2020). T ansc ip ional Regula ion o In lammasomes. In e na ional jou nal o molecula sciences, 21(21), 8087.  Cox, W.H. (1891). Imp agna ion des cen alen ne ensys ems mi Quecksilbe salzen. A chi ü mik oskopische Ana omie, 37, 16-21.  Cusack, C.L., Swaha i, V., Hamp on Henley, W., Michael Ramsey, J., & Deshmukh, M. (2013). Dis inc pa hways media e axon degene a ion du ing apop osis and axon- speci ic p uning. Na u e Communica ions, 4, 1876.  Dash, P.K., Blum, S., & Moo e, A.N. (2000). 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