Tratamientos de conservación de monumentos en piedra. Precipitación biológica de carbonato cálcico como método alternativo

Equation Chapter 1 Section 1 Proyecto Fin de Carrera Ingeniería Química Autor: Samuel Álvaro Rivas Pavón Tutor: Rosario Villegas Sánchez Dpto. de Ingeniería Química y Ambiental Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2021 Tratamientos de conservación de monumentos en piedra. Precipitación biológica de carbonato cálcico como método alternativo Proyecto Fin de Carrera Ingeniería Química Tratamientos de conservación de monumentos en piedra. Precipitación biológica de carbonato cálcico como método alternativo Autor: Samuel Álvaro Rivas Pavón Tutor: Rosario Villegas Sánchez Profesor titular Dpto. de Ingeniería Química y Ambiental Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2021 Proyecto Fin de Carrera: Tratamientos de conservación de monumentos en piedra. Precipitación biológica de carbonato cálcico como método alternativo Autor: Samuel Álvaro Rivas Pavón Tutor: Rosario Villegas Sánchez El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2013 AGRADECIMIENTOS A mi tutora de trabajo final de carrera Rosario Villegas Sánchez, por la paciencia y la gran aportación de bibliografía y conocimiento. Ha sido una responsabilidad enorme tratar un tema del que desconozco tanto ante una persona con tanta sapiencia sobre ello y publicaciones a sus espaldas. A Pepe Cabello de KBYOBILOGICAL por atender cada llamada y por su disposición. A mi familia y amigos, por tanta paciencia y apoyo moral durante estos largos años, por animarme cuando era preciso, pero también por hacerme ver las veces que me equivocaba. En especial a mis padres por facilitarme realizar estos estudios y a mi hermana Raquel por preocuparse de que no me faltaran fuentes bibliográficas en ningún momento y por estar dispuesta a resolver cualquier duda que tuviera que ver con restauración. RESUMEN En los últimos años, la biomineralización ha sido propuesta como una tecnología compatible y respetuosa con el medio ambiente para la conservación de piedras ornamentales. En este trabajo se exponen los métodos convencionales utilizados en la protección del Patrimonio en piedra, así como los ensayos llevados a cabo para la comprobación de su validez e idoneidad, y se compara con dicha técnica basada en la precipitación biológica del carbonato de calcio como método alternativo, en base a la revisión bibliográfica de diferentes ensayos in situ y en laboratorio. 1 1 INTRODUCCIÓN El deterioro en los materiales pétreos, ya sea piedra ornamental utilizada en edificios históricos o de nuestras obras, o materiales utilizados en escultura, se ha visto acentuado en los últimos tiempos debido a los factores derivados de la contaminación ambiental y lluvia ácida. Este efecto es notable en especial en zonas urbanas o industriales con alta exposición a productos tóxicos, derivados de combustibles, etc. Esto ha supuesto que la conciencia sobre la importancia de este tipo de casos haya aumentado al producirse deterioros severos o pérdidas en edificios y esculturas de gran valor histórico-artístico (González-Muñoz, 2008). En su 17ª reunión en París en 1972, la conferencia general de la UNESCO adoptó la Convención sobre la protección del mundo y la naturaleza. El objetivo de este programa era catalogar y conservar lugares con un patrimonio excepcional y belleza natural, ya fuera de interés científico, natural o cultural. En virtud de este programa, muchos edificios históricos y sitios patrimoniales del mundo fueron identificados y listados como patrimonio cultural que se encontraba en un estado de deterioro progresivo. Fue un punto de inflexión en la gestión del patrimonio, ya que a partir de entonces se han iniciados muchos proyectos y programas para la preservación de edificios y bienes patrimoniales. Algunos países, la mayoría de ellos pertenecientes a la Unión Europea, han lanzado proyectos de investigación para mejorar las técnicas convencionales, estudiándose de este modo el papel de la biotecnología como método de conservación. (Dakal & Cameotra, 2012). El objetivo de este trabajo es recabar información sobre las técnicas de conservación del patrimonio empleadas hoy en día y los ensayos llevados a cabo para evaluar la eficacia de éstos, así como la investigación bibliográfica sobre el método basado en la precipitación biológica del carbonato cálcico para regenerar la piedra. Se expondrán ensayos reales cuyos resultados dan a conocer el comportamiento de esta técnica de la que aún se desconocen datos, pero la cual ya se está empleando en proyectos europeos, sobre todo en Francia, Portugal y España. 2 2 TÉCNICAS DE INTERVENCIÓN 2.1 CRITERIOS GENERALES DE INTERVENCIÓN EN MATERIALES PÉTREOS Los principios comunes que deben presidir la restauración y conservación de la piedra están recogidos en la Carta de Venecia o Carta Internacional para la Conservación y Restauración de Monumentos y Sitios (1964). En ésta se recoge que todos los procedimientos empleados deberán conservar el aspecto original de la piedra y mantener el mensaje artístico y estético que sus autores pretendieron transmitir. (Villegas, Baglioni, & Sameño, Tipología de Materiales para Tratamiento, 2003) En la mayoría de los casos conlleva cierta complejidad llevar esta teoría a la práctica desde el punto de visto técnico debido a la agresión que sufre la piedra por parte del ambiente. Al intervenir, no solo se pretende frenar el deterioro, si no también contribuir a la conservación de la pieza haciendo que ésta aguante dichas agresiones durante un tiempo. De forma general, se sigue un criterio de prioridad de conservación en el que en primer lugar se actúa sobre las causas de deterioro para eliminarlas -o minimizarlas- y posteriormente se lleva a cabo la intervención de la piedra propiamente dicha. Cabe destacar que la piedra en un edificio es solo la capa externa y superficial, pero está en contacto con otros materiales (morteros, rellenos de muros, etc.) a los que pueden afectar los tratamientos pétreos. Los tratamientos existentes actualmente para la conservación de la piedra cumplen, en general, las prestaciones para las que han sido diseñados (consolidan, protegen, etc.) pero la mayoría de ellos están concebidos para ser aplicados a materiales homogéneos, con una composición, textura y porosidad uniformes. Un ejemplo de ello podría ser el hormigón. Sin embargo, la piedra es un material extraordinariamente heterogéneo, con un grado de penetración y distribución de los productos de tratamiento diferente en cada punto del seno de la piedra, lo que conlleva una diferente durabilidad. Por ello, es necesario un estudio experimental, previo a la aplicación de productos a una piedra, para determinar el comportamiento del sistema piedra-tratamiento que se haya seleccionado. Los comportamientos obtenidos al aplicar un tratamiento a un tipo de roca no pueden extrapolarse a otras variedades, ya que se estarían cometiendo errores significativos. Esta es la razón por la que, junto a la escasez de negocio que supone para la industria química los productos de tratamientos de la piedra, el número de investigaciones realizadas en este campo es pequeño, suponiendo una falta de conocimiento en el comportamiento de la piedra frente a ciertos tratamientos. Debito a esto, resulta importante remarcar que es preferible no aplicar ningún tratamiento ante la falta de elementos de juicio sobre el sistema piedra-tratamiento, o hacerlo solo cuando sea absolutamente imprescindible. (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003) 3 2.2 ETAPAS DE INTERVENCIÓN Los procesos de conservación de la piedra se clasifican en los siguientes tres grupos principales: - Limpieza - Consolidación - Protección Así se decidió en la reunión del Grupo de Trabajo para el Tratamiento de la Piedra en Bolonia (Octubre 1971). Debido a esto, el tratamiento de la piedra no se considera un proceso único, si no una secuencia ordenada de operaciones adecuadas a las necesidades: primero se identifica el mecanismo de deterioro, a continuación, se realiza un proceso de limpieza, seguida de una consolidación y, por último, si el ambiente agresivo no ha cambiado, se protege la piedra para evitar un nuevo deterioro. (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003) Cabe destacar, además de las etapas principales mencionadas, las siguientes actuaciones: - Preconsolídación: se suele llevar a cabo en piezas o partes de edificios que tengan un valor artístico alto, como escudos, esculturas, paramentos con policromía,etc. Se aborda antes de la limpieza en piedras que presentan un significativo grado de decohesión. - Desalinización: las sales solubles en una piedra, en caso de detectarse, deben ser eliminadas siempre de forma total ya que una incompleta eliminación condicionaría la evolución de los tratamientos aplicados posteriormente. Se considera una fase de la limpieza. - Eliminación de organismos vivos (plantas superiores, insectos, hongos, líquenes, bacterias, etc.) así como de los productos de su metabolismo y su desarrollo sobre los edificios (nidos de aves o insectos, guano de aves, etc.). Se puede llevar a cabo como una fase de la limpieza, aunque en la mayoría de los casos se requiere de tratamientos biocidas específicos. - Reintegración de elementos con pérdidas, sustituyendo con el mismo material (en el caso de la piedra, si se conoce la cantera original) o con materiales similares de aspecto y propiedades físicas y mecánicas - Mantenimiento y conservación preventiva: no están incluidas, desde el punto de vista formal, en lo que se consideran etapas de intervención. Sin embargo, para que los tratamientos aplicados consigan una durabilidad aceptable, es imprescindible abordar estas dos fases. (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997) 2.2.1 Limpieza El objetivo de la limpieza es eliminar cualquier producto nocivo o suciedad que puedan encontrarse en la superficie de la piedra que acelere su deterioro, además de mejorar su estética y acercarla a la que tuviera originalmente. Es necesario el planteamiento de las siguientes cuestiones, previamente al comienzo de la limpieza: - En relación con el valor artístico del objeto - En relación con la naturaleza de la piedra y de los productos a eliminar (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997) La costra que cubre la piedra consiste, principalmente, en sales solubles, incrustaciones insolubles, restos de antiguos tratamientos, partículas de combustibles inquemados, vegetación, microorganismos y excrementos 4 de pájaros. El problema aparece al encontrarse estos productos, generalmente, formando una capa persistente y regular sobre la piedra, por lo que es conveniente tomar muestras para determinar su naturaleza e identificarlas con precisión. Otro inconveniente puede llegar a ser que la limpieza, al ser la primera de las etapas -en algunos casos, la únicaque se lleva a cabo, se aborda en muchos edificios de valor histórico-artístico como una limpieza industrial, no teniendo en cuenta ningún criterio de especialistas en restauración. Además, esta etapa condiciona al resto de etapas de intervención posteriores, siendo necesario por este motivo el uso de métodos y productos compatibles con dichas estapas. Para ello, se deben cumplir los siguientes requisitos durante la limpieza: - La acción limpiadora debe ser lenta en la medida en la que el responsable de dicha operación sea capaz de controlar los posibles efectos. - El producto o el método empleado no debe generar ningún producto que pueda perjudicar el proceso de conservación. - Éste tampoco debe producir fuertes abrasiones, microfracturas o modificaciones del relieve superficial de la piedra que faciliten su posterior deterioro. La elección del método de limpieza depende fundamentalmente de: - La naturaleza de las sustancias a eliminar - Las características petrofísicas de la piedra y su estado de conservación. - El tipo, grosor, extensión y uniformidad de la capa de suciedad que se quiere eliminar (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997). 2.2.1.1 Métodos basados en agua Tienen como finalidad disolver los compuestos solubles, ablandando además los no solubles, para facilitar su posterior eliminación por medios mecánicos suaves. Para estos métodos se suele recurrir a agua corriente, destilada o desmineralizada a través de resinas intercambiadoras de iones. El agua, sea cual sea el método empleado, debe penetrar lo mínimo posible para evitar deterioro causado porque se lleguen a mojar elementos internos. No se debe aplicar en épocas del año frías para evitar las heladas y los efectos que éstas puedan inducir (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997). Chorro de agua a presión Se somete la superficie de la piedra a un chorro de agua a presión durante un periodo de tiempo suficiente hasta alcanzar un grado de ablandamiento que permita disolver la materia soluble y retirar la materia no soluble mediante un cepillo. Por ello, resulta eficaz cuando la costra superficial está compuesta por sales solubles, pero poco efectivo si dicha capa es muy gruesa. Se debe evitar su uso en piedras con un alto grado de decohesión (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003). Agua pulverizada Se aplica agua en forma de rocío sobre la superficie hasta que la costra resulta reblandecida. Se repite la aplicación varias veces, se cepilla y se aclara retirando el material disuelto. No es aconsejable ya que se necesita emplear mucha cantidad de agua, lo que puede conllevar a infiltraciones hacia el interior de la piedra. Si el agua tiene sales solubles, éstas se depositan por evaporación (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997). 5 Agua nebulizada La nebulización (atomización) permite un efecto máximo con la mínima cantidad de agua. Se convierte el agua en gotas de niebla de 80-120 micras, con una alta superficie específica, mediante nebulizadores. Se consigue una gran cantidad de puntos de contacto piedra-agua debido a la gran cantidad de gotas y a la alta superficie específica de éstas, reduciendo en gran medida la necesidad de limpieza mecánica. Además, es posible dirigir esta nube de gotas hacia zonas con difícil acceso o a zonas localizadas debido a su capacidad de dispersión a través del aire. (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003) Vapor de agua Se genera en una caldera vapor de 0,5 Kg/cm2 y se aplica sobre la piedra a tratar. Pero para que este tratamiento sea efectivo debe cumplirse dos condiciones: que la piedra sea capaz de resistir altas temperaturas del vapor y que no retenga una alta cantidad de éste pudiendo provocar eflorescencia. Se considera apropiada para superficies irregulares y en edificios de bajo valor artístico, ya que sus efectos no pueden ser controlados y se puede dañar la piedra debido a las altas temperaturas. Agua aplicada con apósitos Se coloca sobre la superficie de la piedra unos apósitos o compresas empapados en aguas. Éstos pueden ser tanto de materiales inorgánicos (arcillas, filosilicatos hidratados de magnesio, sílice micronizada…) como orgánicos (por ejemplo, pasta de papel o de madera). Se caracteriza por tener una gran superficie específica que le permite absorber, en relación a su peso, una gran cantidad de líquido sin hincharse, ocupando el líquido los espacios vacíos de la estructura del material del que esté compuesto el apósito. Se trata de un método eficaz para costras de poco espesor (máx. 1 mm), por lo que suele emplearse en estatuas o frescos localizados en interiores de edificios. Para costras gruesas sería tedioso y poco rentable, ya que habría que repetir el proceso un número muy elevado de veces. Es interesante destacar que, mediante apósitos, si se sustituye el agua por el disolvente conveniente, es posible eliminar diferentes tipos de suciedad como las grasas. Este método presenta las siguientes ventajas: • No es dañino, lo que lo hace aconsejable para la limpieza de objetos delicados • Barato • De fácil aplicación Pero también presenta ciertas desventajas: • Lentitud del proceso • No es controlable • Baja eficacia para costras gruesas. Además, existen diferentes propuestas que mejoran este método: • Paquete biológico: mediante el cual los microorganismos formados durante la aplicación contribuyen en la eliminación de la suciedad. Se realiza aplicando una mezcla con la siguiente composición (Istituto Centrale per il Restauro, Roma): - 1 litro de agua - 50 gramos de urea (NH2)2CO 6 - 22 ml de glicerina (CH2OH)2CHOH - Arcilla hasta formar una pasta. • Hempel propone una mezcla similar: - 500 ml de agua - 25 gramos de urea - 100 ml de glicerol - Cantidad suficiente de sepiolita para formar una pasta. El apósito debe estar aplicado sobre la piedra alrededor de un mes, permitiendo al término de este tiempo la eliminación de la mayor parte de la costra con un simple lavado. Se desconoce el mecanismo de acción, pero se cree que las bacterias aportan un efecto disolvente sobre los ligantes de las costras. Para eliminar problemas con las bacterias en procesos posteriores, se recomienda trata la piedra con fungicidas. (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003) 2.2.1.2 Métodos mecánicos Se trata de métodos que limpian la costra de la piedra utilizando energía mecánica. Hay que tener en cuenta que la acción mecánica no debe dañar el material al limpiar, por lo que la separación se debe producir justo en la interfase entre la piedra y la suciedad. Métodos mecánicos sencillos Estos métodos sencillos deben llevarse a cabo siempre de forma controlable, ya sea manualmente (papel de lija, bisturí, espátula, etc) o mediante instrumentos de pequeñas dimensiones con acción eléctrica, por lo que su eficacia depende de la sensibilidad y la habilidad de la que disponga el operario que maneje el instrumento. Chorro de arena seca Una suspensión de algún material abrasivo, arrastrado por un chorro de aire a presión, se hace impactar contra la superficie de la piedra que se quiere tratar. Es importante que este abrasivo sea fino y con un tamaño homogéneo. Pueden utilizarse sílice, escorias metálicas, esferas de vidrio, etc. Los efectos de esta acción mecánica dependen de varios factores: • Presión del chorro de aire • Tiempo de aplicación del abrasivo • Distancia de la boquilla de salida del aire a presión a la superficie a tratar • Forma de las partículas abrasivas • Densidad y dureza de éstas Ventajas de esta técnica: • No provoca eflorescencias debido a que se trabaja sin agua (como en el chorro húmedo explicado a continuación) • Aplicable en cualquier estación del año sin peligro de congelación 7 Inconvenientes: • Difícil de controlar • Puede eliminar sustrato además de la costra • Mayor problema en pidras heterogéneas, ya que puede erosionar las partes menos resistentes Chorro de arena húmeda Se trata de un chorro de agua, a una presión entre 0,5 y 3 Kg/cm2, que arrastra arena en su interior e impacta con la piedra a tratar arrancando la costra. No se produce tras su aplicación polvo que pueda ser dañino para el operador o el medio mabiente, pero se crea una película de barro en la superficie que debe ser eliminarda al eliminar la etapa mediante lavado. No se recomienda, además, su uso en edificios de alto interes histórico-artístico ya que puede depositar sales solubles en el chorro de agua que cristalicen tras el secado y evaporación de ésta. Microchorro de arena Es un proceso parecido al chorro de arena visto anteriormente, pero en este caso, el polvo abrasivo es mucho más fino (aproximadamente de unas 40 micras) y de menor dureza y la boquilla utilizada es de un diámetro muy pequeño. Se suele usar esferas de vidrio o alúmina como abrasivo. Presenta las siguientes ventajas: • Presión del chorro y cantidad de abrasivo regulable, lo que facilita su utilización en cualquier tipo de piedra • Efectivo para costras gruesas y delgadas, e incluso para costras negras (hollín, cenizas, carbón, gasoil, etc. (García de Miguel, Sánchez Castillo, González Aguado, & Puche Riart)) que cubren las piedras con policromías, sin dañar las pátinas cromáticas originales que se encuentran debajo Desventajas: • Aparatos, mantenimiento y abrasivos costosos • Método lento • Desprende una gran cantidad de polvo que es preciso eliminar 2.2.1.3 Métodos químicos Los métodos químicos son aquellos en los que se ponen en contacto a la costra con un producto químico, soluble en agua, con el que reacciona dicha suciedad, facilitando su eliminación posterior con agua y métodos mecánicos (hay que asegurarse que se retira todo el limpiador). Para facilitar el contacto entre la costra y el producto, este último se suele aplicar junto una pasta absorbente que impide la evaporación del agua, lo que minimiza el consumo de agente limpiador. Deben evitarse productos muy ácidos (pH menor que 5), muy básicos (pH mayor que 8) y aquellos que puedan generar sales solubles. Agentes ácidos Estos agentes ácidos o sales ácidas reaccionan con las costras disolviéndolas. Pero su acción resulta áltamente agresiva, dejando muestras de su tratamiento años después de la aplicación, por lo que no es recomendable su uso. Principalmente es peligroso el ácido clorhídrico, ya que puede formar cloruros, posibles causantes de una 8 gran degradación de la piedra. Este efecto puede tener consecuencias visuales en zonas donde puedan encontrarse impurezas de hierro. Éstas migran hacia la superficie al ser atacadas por el clorhídrico, dotando de un color amarillento a la piedra. Otras sustancias a considerar son el bifloruro de amonio y el ácido fluorhídrico, las cuales transforman el carbonato cálcico en fluoruro de calcio, el cual tiene un tamaño mucho menos que el primero, creando grietas en la superficie de la piedra que facilitan la entrada a contaminantes. Sin embargo, hay casos particulares en los que sí puede ser apropiado el uso de agentes ácidos, como en la limpieza de herrumbre en el mármol medianta ácido fosfórico (aunque necesita ser neutralizado posteriormente con amoniaco). Agentes básicos Se ponen en contacto la suciedad con agentes con un alto pH, junto con aditivos que permiten controlar la actividad superficialy aumentar su efectividad. Los agentes más usados son la sosa caústica y las mezclas basadas en amoniaco, teniendo un gran uso efectivo sobre mármoles, calizas y morteros si se quiere eliminar las costras de yeso. Villegas, Baglioni, y Sameño (2003) indican, al respecto de las mezclas con amoniaco, que: Entre ellos se encuentra una mezcla de metafosfato de sodio con formiato de amonio, un agente humidificante y etanolamina, a un pH de 9, la cual tiene la propiedad de disolver el yeso sin atacar a la calcita. Una fórmula puesta a punto por técnicos del Istituto Centrale del Restauro es la siguiente: - 1.000 cc de agua - 30 g de bicarbonato de amonio - 50 g de bicarbonato de sodio - 25 g de EDTA (sal bisodica) - 10 cc de desogen - 60 g de carboximetil celulosa Dicha mezcla se identifica con la sigla AB57. Es importante que el pH no sea superior a 8 para evitar la corrosión de las calizas y la formación de subproductos dañinos. Una vez aplicada se eliminan los residuos de la pasta con varios lavados y cepillados; de este modo, se eliminan las sales básicas nocivas que podrían permanecer en las piedras. (p.173) Este método no es recomendable para mármoles, donde podría provocar decohesión de los granos de calcita, ni para calizas muy porosas, ya que pueden desprenderse restos del material al retirar el apósito. Por el contrario, sí resulta apropiado para eliminar sedimentos calcáreos de poco espesor y cierta dureza. Presenta las siguientes ventajas: • Rápido • De fácil aplicación • Bajo coste 2.2.1.4 Aplicación de radiación láser Se trata de un proceso físico en el que se produce la fotoablación, es decir, la vaporización de los materiales 9 que conforman la costra gracias a la absorción de pulsos de luz coherente (todos los fotones del haz están en fase y presentan la misma longitud de onda) por parte de ésta. Al desaparecer la costra, se produce un cambio de color (ya que normalmente las costras son más oscuras que la piedra subyacente), minimizando la absorción de energía en la superficie, lo que hace que el proceso se pare. Las características de este método son las siguientes: - Radiación monocromática: esto permite elegir una determinada longitud de onda para eliminar una capa concreta sin dañar al sustrato. - Radiación en pulsos: los cuales tienen una duración muy corta, de unos 10 ns, lo que garantiza que, a pesar de utilizar altas potencias, no se producirán alteraciones en la piedra por altas temperatura. - El haz que se aplica sobre la piedra es regulable, lo que permite expandirlo para abarcar más superficie o reducirlo para concentrar en zonas de pequeño tamaño toda la energía. Las características con las que se indica el tipo de láser requerido son: • Medio activo que emplea • Duración del pulso • Potencia máxima de salida o energía total por pulso Con este método es posible limpiar capas de distintos espesores ya que permite variar la intensidad de la luz, llegando a emplearse energías de más de 10 megavatios/m2 para las costras más gruesas. La velocidad de trabajo se mueve en números cercanos a los 100 cm2/min para superficies lisas pero puede variar en caso de que el relive sea diferente o dependiendo de la intensidad aplicada. En cuanto al efecto sobre recubrimientos cromáticos que pueda tener la superficie de la piedra, el rayo láser no se muestra dañino si se aplica con la intensidad adecuada a la situación, aunque en el caso de haber colores rojizos en esa capa podrían llegar a surgir algunas complicaciones. Las ventajas más importantes de la limpieza con láser, a modo se recopilación, son: • Agresividad física prácticamente nula, lo que permite no preconsolidar. • Elevada selectividad. • Ausencia de contacto directo con la piedra. • Inexistencia de daños causados por la humedad o abrasión debido a que no necesita el uso de agua o abrasivos. 2.2.1.5 Aplicación de ultrasonidos Se trata de la transmisión de vibraciones desde un emisor hasta la costra a eliminar, mediante una película de agua. La costra se despega de la superficie y posteriormente se elimina por lavado. Este método no produce ningún daño a la piedra, es muy preciso y resulta de gran utilidad principalmente en piezas policromadas, pero debido a que es un proceso lento, resulta aconsejable su aplicación en objetos de pequeño tamaño. 16 Las características primarias son las más importantes y pueden resumirse como sigue: a) Valor consolidante: es decir, la capacidad para restablecer la cohesión entre los granos de la piedra. Los ensayos empleados para cuantificar este valor son: resistencia a la compresión, a la tracción, a la abrasión y dureza superficial. b) Alterabilidad de la piedra consolidada: que, para que tenga sentido el tratamiento, debe ser menor que la de la piedra sin trata. Se comprueba mediante ensayos de alteración acelerada. c) Profundidad de penetración: debe ser alto, ya que, si existiera un cambio poco gradual de las propiedades entre la superficie tratada y el interior de la piedra no tratada, se podría perder la cohesión entre ambas zonas y desprenderse la primera. La profundidad de penetración es inversamente proporcional a la viscosidad del producto y al ángulo de contacto con la piedra. d) Modificación de la porosidad y porometría: La porosidad es uno de los parámetros que más afectan a la alterabilidad de la piedra, debido a que ésta determina la cantidad de agua que ésta contenga en sus poros y la capacidad de movimiento que experimente por ella. e) Capacidad de transferencia de humedad: A pesar de que es importante impedir la entrada de agua de lluvia a la piedra, también lo es permitir la salida de humedad contenida en la piedra y así impedir acumulaciones de sales y aguas en zonas interiores. f) Compatibilidad con la piedra: Desde el aspecto físico se debe procurar que las características del consolidante y la piedra sean lo más parecidas posibles para evitar tensiones. En cuanto a la parte química, se debe evitar reacciones con componentes de la piedra. g) Efecto en el aspecto: La piedra consolidada no solo no debe mostrar diferencias estéticas con la piedra original, sino que, además, hay que procurar que no se produzcan alteraciones visuales con el paso del tiempo debido a los agentes ambientales. 2.2.3.2 Consolidantes inorgánicos Dadas sus grandes semejanzas con los minerales que forman la piedra en cuanto a su composición, los consolidantes inorgánicos podrían parecer un método perfecto para consolidar la piedra. Sin embargo, este parentesco hace que, tras el tratamiento, la piedra se siga alterando de igual forma que antes de éste. Ventajas: • Mayor duración • Gran resistencia a agentes medioambientales Inconvenientes: • Dificultad de penetración • Baja acción consolidante • Formación de sales solubles como subproductos • Cambio de color en la superficie Entre los consolidantes inorgánicos se encuentran los siguientes: a) Hidróxido cálcico: que reacciona con el dióxido de carbono atmosférico dando lugar al carbonato cálcico que actúa de consolidante. 𝐶𝑎(𝑂𝐻)2+𝐶𝑂2→ 𝐶𝑎𝐶𝑂3+ 𝐻2𝑂 Ecuación 1: Formación de carbonato a partir de hidróxido de calcio (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997, p. 78) 17 b) Hidróxido de bario: se produce una reacción similar a la anterior, pero en este caso los carbonatos formados (carbonato de bario) son menos solubles que los de calcio, lo que significa que son más resistentes a la alteración. 𝐵𝑎(𝑂𝐻)2+𝐶𝑂2→ 𝐵𝑎𝐶𝑂3+ 𝐻2𝑂 Ecuación 2: Formación de carbonato a partir de hidróxido de bario c) Silicatos alcalinos: que producen sílice precipitada. Presentan un problema debido a la precipitación de sales alcalinas, muy solubles, además de experimentar una penetración muy baja. d) Derivados del Flúor: El ácido fluorhídrico reacciona en las piedras calizas dando fluoruro cálcico, y en las areniscas dando fluosilicato, en ambos casos en costras muy finas. Con el ácido fluosilícico y los fluosilicatos se obtienen fluoruro cálcico y sílice, pero se forma una costra muy fina y de distinta composición que el sustrato, que normalmente termina desprendiéndose. e) Anhídrido carbónico y carbonato: Empleando estos compuestos se pretende reconvertir el yeso formado como consecuencia de la alteración en carbonato cálcico” (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003) 2.2.3.3 Consolidantes organosilícicos Se trata de consolidantes cuya acción consiste en formar estructuras moleculares que se asemejen a la de la sílice, como se muestra a continuación: Ilustración 1: Estructura de la sílice Reciben el nombre de alquilalcoxisilanos debido a los radicales que existen en la molécula. El primer paso en el proceso de polimerización es la hidrólisis del grupo alcoxi a partir del monómero: Ecuación 3: Hidrólisis del grupo alcoxi 18 Posteriormente se produce la polimerización total: Ecuación 4: Polimerización de los consolidantes organosilícicos Acabando una vez hayan reaccionado todos los grupos alcoxi. La caracterización del polímero formado se debe a los grupos alquilos que permanecen sin reaccionar una vez acabada la polimerización: • Si se parte de un tetraalcoxisilano: se obtiene únicamente un efecto consolidante con una estructura similar a la de la sílice. • Si se parte de un alquiltrialcoxisilano: se obtiene un producto con propiedades consolidantes e hidrófugas, dada su estructura tridimensional con grupos orgánicos. • Si se parte de un dialquildialcoxisilano: el resultado es un polímero lineal con dos grupos orgánicos en cada átomo de silicio. Proporcionará un efecto únicamente hidrófugo. (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003) 2.2.3.4 Consolidantes orgánicos. Polímeros sintéticos Si bien aún se usan consolidantes orgánicos de origen natural, los más empleados son los sintéticos, que aportan, además de su acción consolidante, un carácter hidrófugo debido a la composición orgánica. Pueden aplicarse sobre la piedra ya en forma de polímeros, o hacerlo en forma de monómeros y que se produzca en la propia piedra la polimerización. Los grandes problemas que presenta la consolidación con productos orgánicos son: • Penetración: la cual viene condicionada por la viscosidad. Si se aplica un polímero, con moléculas grandes y elevada viscosidad, la penetración en la piedra será muy pobre. Sin embargo, si aplicamos monómeros que polimericen en el interior, la mejora en la penetración será notable. Este último caso tiene el inconveniente de lo difícil que resulta una correcta polimerización en el interior de la piedra. • Radiación UV: Afecta prácticamente a todos los polímeros. Sin embargo, algunos como las resinas epoxi, se alteran en mayor medida. Los grupos que engloban a los diferentes polímeros sintéticos son: a) Ceras: Supone una de las primeras medidas empleadas en la protección de la piedra. Se trata de un derivado del petróleo, que puede aplicarse disueltas en una solución o fundida. Presenta dos principales desventajas: la adhesión del polvo y el ablandamiento a altas temperaturas. b) Polímeros acrílicos: Son los más utilizados y se obtienen de los ácidos acrílico y metacrílico. Comercialmente suele encontrarse combinados con otros monómeros. 19 c) Resinas epoxi: Se emplea juntando dos componentes junto a un catalizador que desencadena la reacción en el momento de la aplicación. Principalmente se utiliza como adhesivo o como base para un mortero. d) Resinas de estireno poliéster. Se trata de copolímeros fruto de la combinación de monómeros diferentes. Se aplican disueltos, poniéndolos en contacto con un catalizador en el momento de la aplicación. 2.2.3.5 Productos comerciales En la tabla 2 se recogen algunos productos comerciales usados para la consolidación de la piedra junto a su naturaleza química: Fabricante Naturaleza química Producto Ciba Resida epoxídica Araldyt AY103 Eurostac Resida epoxídica cicloalifática EP 2101/K210 Rhom & Haas Resina acrílica Paraloid o Acryloid B72 Albus Resina acrílica Albuperl Z4B Wacker Chemie Silicato de etilo Wacker OH Goldschmidt Silicato de etilo Tegovakon V Rhône-Poulenc Metil-fenil polisiloxano Rhôdorsil 11309 Silicatos de etilo Rhoximat HD RC-70 Silicatos de etilo modificados Rhoximat HD RC-80 Dow Corning Metil-trimetoxi-silano Z-6070 Fenil-trimetoxi-silano Z-6124 Tabla 2: Productos comerciales utilizados en Europa como consolidantes (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997, p. 81) 2.2.4 Aplicación de los tratamientos: disolventes y emulsiones La forma de aplicar los tratamientos puede condicionar en gran medida la evolución de este sobre la piedra, por lo que adquiere una importancia significativa. Como ya se ha comentado, el primer factor que determina la funcionalidad de un tratamiento es la capacidad para penetrar y distribuirse por el interior de la piedra. Esta penetración estará condicionada principalmente por: • La concentración, viscosidad y tensión superficial de la solución. • La porosidad de la piedra. 20 • El tiempo de contacto entre la piedra y la solución. • La naturaleza del consolidante y del disolvente. • Las condiciones de temperatura y humedad relativa del ambiente. Estos datos son facilitados por los fabricantes en los consolidantes comerciales. Estos productos suelen aplicarse mediante un nebulizador o mediante un pincel, aunque para ciertas situaciones específicas es habitual el uso de apósitos. Sin embargo, en el laboratorio los productos suelen aplicarse por: nebulización, capilaridad, autoclave, gota a gota, inmersión total, inmersión total al vacío, etc.; aunque conviene evaluar los tratamientos con la misma técnica que se vaya a emplear en la piedra final. En investigaciones con finalidad puramente científica, se estudia el comportamiento con diferentes sistemas piedra-tratamiento para establecer patrones de comportamiento de los que se pueda extraer una referencia. Los disolventes empleados frecuentemente son, alguno de ellos, tóxicos o contaminantes, por lo que se está trabajando en el diseño de un nuevo tipo de producto: las emulsiones acuosas. Estas emulsiones suelen venir en dos fases: producto activo y agua que sirve como medio emulsionante. Al aplicarlo se vuelve a diluir en agua para facilitar su penetración. El comportamiento de los productos en forma de emulsión parece ser similar al resto que tengan el mismo principio activo. La principal ventaja que presentan es que no son tóxicas ni contaminantes, pero presentan una caducidad más corta que otros productos, demandando una aplicación lo más próxima a su preparación. 2.2.5 Hidrofugación Villegas (2003) al respecto de los hidrofugantes, señala: La humedad es un factor de esencial importancia en el proceso de deterioro de los materiales de construcción. Los hidrófugos son productos incoloros utilizados para reducir la absorción de agua a través de la superficie de los materiales, sin afectar sensiblemente a su aspecto. La hidrofugación, también llamada protección, se basa en la aplicación de un tratamiento que impida la entrada de agua líquida en la piedra pero que permita la salida del agua en forma de vapor, es decir, que mantenga la "respiración" del material. Este tipo de tratamiento debe utilizarse siempre que el agua sea un factor de alteración importante y complementándolo con medidas que impidan la entrada de agua por otros frentes: resane de cornisas, canalizaciones de los desagües de las cubiertas, etc. 21 Ilustración 2: Representación de los diferentes comportamientos de superficies pétreas frente a la acción del agua. (A) Pared sin protección, (B) Pared hidrofugada en la que se forma una película superficial que reduce la entrada de agua líquida, permitiendo el intercambio de vapor de agua con el ambiente, (C) Pared impermeabilizada (Hidalgo & Villegas, 2018, p. 24) No es necesario que la penetración del tratamiento sea demasiado grande dado que la entrada de agua líquida se da en la gran mayoría de los casos en la superficie. Sin embargo, es aconsejable que el tratamiento penetre mínimamente en la piedra. Es importante que la protección se mantenga a pesar de los agentes atmosféricos y sin cambiar el aspecto físico de la piedra tratada. Es posible conseguir esta protección mediante: • Taponamiento de los poros y capilares; produciendo una impregnación total del tratamiento ya que se rellenan todos los huecos. Se emplean productos acrílicos y se puede aplicar únicamente a objetos pequeños que permiten someterlos previamente a vacío para asegurar el llenado. El principal inconveniente viene dado porque la ausencia de llenado total en una pequeña zona puede suponer el comienzo de una alteración. • Creación de una película más o menos adherida a la superficie del material, que aísla a la piedra de los agentes medioambientales. Es difícil conseguir un aislamiento total, y presenta el inconveniente de que, si entra agua al interior de la película, no podría salir fácilmente. Al igual que en el caso anterior, solo es aplicable a objetos de tamaño pequeño. • Disminución de la energía superficial del soporte; se aumenta el ángulo de contacto provocando que el agua líquida no moje al sustrato, pero permitiendo la salida del vapor de la roca, ya que está no está cubierta. 2.2.5.1 Características de los hidrofugantes Todos los hidrofugantes deben cumplir (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003): a) Impermeabilidad al agua líquida. b) Permeabilidad al agua vapor saliente de la piedra. c) Estabilidad frente a los agentes de alteración y frente a la radiación UV. d) Reversibilidad o posibilidad de aplicar un nuevo tratamiento encima. e) Buena adhesión al material para que no pueda ser eliminado por la lluvia. f) Suficiente profundidad de penetración. 22 g) Mantenimiento de la apariencia estética de la piedra. (Villegas Sánchez, 1989) h) Inexistencia de subproductos perjudiciales en caso de ocurrir una reacción entre la piedra y el producto de tratamiento. (Villegas Sánchez, 1989) Para que todas estas características se cumplan, las moléculas de los productos hidrófugos deben tener una parte hidrofílica y otra hidrofóbica; la primera estaría en contacto directo con la piedra, dejando pasar el vapor y la segunda daría hacia el exterior, impidiendo la entrada de agua externa, pero sin taponar los poros. 2.2.5.2 Siliconatos Estos compuestos se forman a partir de monómeros del tipo: Ilustración 3: Monómero de partida de los silicatos En el interior de la piedra se produce la primera reacción de la formación de silicatos, que es la hidrólisis: Ecuación 5: Hidrólisis de los silicatos Seguidamente se producirá la polimerización, quedando en la cadena un radical alquilo en cada átomo de silicio. Este proceso es muy lento, teniendo mayor éxito en materiales muy porosos. El principal inconveniente es la formación de carbonatos alcalinos, que son muy solubles. 2.2.5.3 Productos organosilícicos Al igual que se explicó anteriormente al hablar de los consolidantes, estos compuestos están basados en monómeros con radicales alquilo. 2.2.5.4 Polímeros orgánicos Son los mismos productos que se utilizan como consolidantes. Los más adecuados son aquellos consiguen proporcionar mayor eficacia en la superficie de la piedra. 23 2.2.6 Sustitución Se trata de colocar una piedra nueva en el lugar de una en mal estado, que tenga un aspecto similar a la original y unas características petrofísicas acordes al edificio y al ambiente en el que se va a colocar. Es preciso realizar un estudio para determinar cuál es la piedra más adecuada en cada caso. 2.2.7 Reintegración Ya sea por criterios funcionales o meramente estéticos, la reintegración es una etapa que casi siempre hay que acometer. Ésta, pretente recuperar las formas arquitectónicas ya sea con piedra natural, con morteors, etc. En esta etapa, además, se incluye el relleno de juntas y fisuras con un mortero que debe ser estable y de características compatibles con la piedra que se está trabajando, como también debe asemejarse estéticamente dicha piedra. Para ello se pueden utilizar áridos de la misma piedra original para la fabricación de los morteros. 2.2.8 Mantenimiento y conservación preventiva Se trata de actividades dedicadas a prolongar los resultados obtenidos durante la restauración, en el caso del mantenimiento, y a intentar disminuir la velocidad de deterioro actuando sobre los agentes que lo provocan, en el caso de la conservación preventiva. Esta conservación pasiva no suele recogerse en los programas de restauración y conservación del patrimonio pétreo, pero es igualmente importante debido a que los tratamientos tienen un tiempo limitado de efecto. El mantenimiento engloba revisiones periódicas y un control sobre los factores de alteración relacionados con la propia piedra, mientras que la conservación preventiva se encarga de registrar posibles alteraciones externas como la contaminación ambiental. (Villegas, Baglioni, & Sameño, 2003) Todos estos tratamientos de mantenimiento y conservación preventiva serán más fácil de llevar a cabo en interiores o en piezas de museo que en exteriores, donde la exposición ambiental es más alta y se puede llegar a requerir el cierre de la pieza como protección a modo de cápsula. (Doehne & Price, 2010, p. 28) 2.3 MÉTODOS Y MATERIALES AVANZADOS PARA LA CONSERVACIÓN DE LA PIEDRA Se están desarrollando técnicas y metodologías innovadoras en los últimos tiempos que atraen la atención de muchos expertos, que esperan acaben siendo compatibles con las características fisicoquímicas de los sustratos tratados y al mismo tiempo minimice el potencial de alteración. Estos materiales podrían mitigar los efectos indeseables al tiempo que otorga estabilidad a largo plazo y reduce los costos de las intervenciones. Además, se persigue un aumento de la sostenibilidad, una reducción del impacto ambiental y que puedan proporcionar beneficios sociales, ecológicos y económicos. (Hosseini & Karapanagiotis, 2018) Algunos ejemplos de estas nuevas técnicas y materiales son: • Nanopartículas (SiO, TiO, ZnO y Ag) que confieren propiedades superhidrófugas, autolimpiantes 24 y antiincrustantes. • Consolidante híbrido con tensioactivo que reduce la presión capilar y protege del agrietamiento. • Nanopartículas inorgánicas para la consolidación y protección antifúngica. • Inhibición del crecimiento bacteriano con nanopartículas (NPs). • Biomineracización: Bacterias que generan carbonato cálcico. • Revestimientos autolimpiantes. • Morteros geopoliméricos. • Inhibidores de cristalización de sales (Villegas Sánchez, Clases del Máster en Ingeniería Química, 2021). • Otros 25 3 EVALUACIÓN DEL TRATAMIENTO Y ESTUDIOS PREVIOS 3.1 INTRODUCCIÓN Al intervenir una obra que constituya parte del Patrimonio Histórico, hay que considerar su exposición a agentes externos, llamados factores extrínseco, que condicionan la evolución que la piedra pueda experimentar a lo largo del tiempo. Paralelamente existen los factores intrínsecos, los cuales están compuestos por aquellos ligados a la estructura y los materiales del propio edificio o la piedra. Esto supone que exista un tipo de tratamiento para cada piedra y lugar. Es decir, un mismo tipo de estructura y composición no tiene por qué ser tratado igual en dos lugares diferentes porque puede variar del uno al otro las condiciones climáticas, la contaminación, etc. Dada esta multitud de situaciones posibles obliga a tener que realizar una evaluación de los tratamientos previa a su aplicación. (Villegas Sánchez, 2003) Junto a esta evaluación, llevada a cabo mediante ensayos en laboratorio, es necesario recabar toda la información posible relativa a la obra de arte y entorno, así como de las condiciones ambientales a las que haya estado expuesta, tanto en el pasado como en la actualidad. Además, se debe realizar una inspección ocular del edificio u obra para analizar las características generales observables a simple vista o identificables con medios sencillos, como el color, la composición de la piedra, estado de alteración superficial, tipos de microorganismos que la habitan, etc. Este proceso de examen visual puede repetirse tras realizar los ensayos en laboratorio, consiguiéndose mayor exactitud a saber los resultados de las pruebas. (Martín Pérez, 1993) 3.2 EVALUACIÓN DE LOS TRATAMIENTOS 3.2.1 Metodología general Para cualquier tipo de obra que sea objeto de estudio, se debe seguir la metodología general para determinar la idoneidad la técnica y producto de tratamiento, según la cual hay que evaluar lo siguiente: - Compatibilidad entre los productos empleados y la piedra a tratar, así como con otros productos aplicados a la misma pieza en otra fase del proceso. - Eficacia del tratamiento, para alcanzar los objetivos para los que ha sido utilizado ese producto. - Capacidad para resistir a los factores de alteración que puedan actuar sobre la obra después del proceso de restauración. 32 Tipos de ensayos para el cálculo de la porosidad: • Microscopía óptica: permite la visualización de los poros en una sección bidimensional y la cuantificación del área correspondiente a cada tipo de poro en un rango de tamaños en las 2,5 y las 10000 micras. Los principales inconvenientes que presenta es que no permite cuantificar por debajo de las 2 micras y que, al ser tan delgada la capa que se estudia en cada medida, hacen falta un gran número de éstas para que el estudio sea representativo. • Microscopía electrónica: esta técnica mejora a la anterior ya que permite el análisis en secciones tridimensionales. En este caso es posible trabajar en un rango de tamaños más pequeño, entre 0,1 y 500 micras. Ambas microscopías permiten digitalizar las imágenes, permitiendo su cuantificación con exactitud, y posibilita la diferenciación entre los poros y la piedra mediante la aplicación de resinas coloreadas. • Microscopía confocal láser: es la más avanzada de las tres. Se inyecta en los poros de la piedra una resina con una sustancia fluorescente a la luz láser. Permite visualizar imágenes tridimensionales y efectuar cortes, lo que deja de manifiesto la geometría y la distribución de los poros. Además, es posible realizar el cálculo de la porosidad mediante métodos indirectos, es decir, aquellos que permite el cálculo de ésta a partir de la determinación experimental de otras propiedades fisico-químicas: • Absorción forzada de agua a vacío: es el método más importante dentro de los indirectos. La característica calculada en este método es el contenido máximo de agua que es capaz de retener una roca rellenando todos sus poros. Basándose en las normas UNE-EN 1936/99 y Rilem: Comm 25- PEM: Se toman de 3 a 6 probetas de forma cúbica, cilíndrica o prismática, de mínimo 25 mL, se secan hasta que no exista variación de masa a unos 70ºC. Tras ello se pesan y se introducen durante unas 24 horas en un recipiente a vacío para eliminar el aire de los poros. Se sumergen totalmente en agua desmineralizada a 20ºC y se dejan otras 24 horas. Posteriormente se restablece la presión atmosférica y se dejan de nuevo 24 horas. Se sacan y se pesan (pesada hidrostática), se secan con un paño y se vuelve a pesar (pesada saturada). Con los datos obtenidos se realizan los siguientes cálculos: Ecuación 6: Porosidad abierta: 𝑛0(%)=𝑀𝑠− 𝑀0 𝑀𝑠− 𝑀ℎ𝑥100 Ecuación 7: Densidad aparente: 𝑑𝑎𝑝(𝑔 𝑐𝑚3) = 𝑀0 𝑀𝑠− 𝑀ℎ Ecuación 8: Contenido de agua a saturación: 𝑊 𝑠(%)=𝑀𝑠− 𝑀0 𝑀0𝑥100 Donde M0 corresponde al peso seco, Mh, al peso saturado sumergido (pesada hidrostática) y Ms, al peso satura do al aire. • Otros: Método de succión, absorción de N2, porosimetría o intrusión de Hg (MIP), difracción de rayos X de bajo ángulo, etc. (IAPH, 2006, pp.56-57) 33 Un ejemplo de cálculo de porosidad: Muestra de roca Consumo (%) Materia seca (%) Porosidad total (%) Sin tratar - - 33,50±3,65 TV100 13,84±1,09 7,86±0,45 26,68±1,89 BS290 7,01±1,51 1,42±0,48 30,38±2,59 UCAT-o 14,56±0,62 8,40±0,39 27,51±1,96 UCAT-10Po 14,20±0,64 8,29±0,46 24,95±4,61 UCAT-2o 14,91±0,67 8,51±0,42 22,96±4,41 UCAT-5P2o 15,01±0,67 8,08±0,42 22,22±0,91 UCAT-10P2o 14,89±0,59 8,11±0,49 23,07±1,10 Tabla 4: Valores de consumo y materia seca de los diferentes tratamientos aplicados sobre la calcarenita de Snata Pudia y valores de porosidad total obtenidos mediante MIP (Illescas Salinas, 2012, p. 205) 3.2.3.3 Análisis de propiedades hídricas Las propiedades hídricas están fuertemente condicionadas por la porosidad y porometría de la piedra, pero también influye las características superficiales de los productos que se apliquen y cómo se distribuyan estos por el interior de la piedra. En caso de producirse una alteración en la permeabilidad y en la higroscopicidad de la pieza con respecto a su estado sin el tratamiento, se podrían llegar a producir acumulaciones de humedades en zonas concretas y cristalización de sales en la interfase, creando problemas de separación de placas. En este sentido, uno de los parámetros a tener en cuenta más relevantes, es la velocidad de evaporaciónde agua. No solo para tratamientos destinados puramente a una acción hidrofugante sino también para consolidantes que puedan producir dificultades a la hora de que el agua y el vapor de agua circulen por los poros hacia el exterior. (Villegas Sánchez, Metodología para la evaluación y estudio previo de tratamientos, 2003) Cálculo de la velocidad de evaporación Este ensayo está basado en la dinámica que siguen los materiales como la piedra a la hora de secarse. Este secado se divide en dos etapas: En la primera la probeta está saturada de agua, por lo que en su interior se mueve el agua líquida, que se evapora al llegar a la superficie exterior. Así, la velocidad de secado durante esta primera etapa será constante (y característica de cada tipo de piedra). La segunda etapa se produce cuando el contenido de agua en el interior de los poros es menor que cierto valor límite (contenido de agua crítico, también propio de cada tipo de material), lo que supone discontinuidades en la película de agua líquida, provocando que la salida del agua en forma de vapor se produzca desde el interior de la piedra. A partir de ese momento, la velocidad de secado cae significativamente y el contenido en agua se mantiene casi estable durante largo tiempo. Los tratamientos suelen disminuir la velocidad de secado y aumentar el contenido en agua crítico, lo que supone que el agua se retenga durante más tiempo en el interior pudiendo provocar alteraciones. 34 ➢ Procedimiento de ensayo: El proceso será en un lugar con ausencia de corrientes de aire y a unas condiciones de temperatura y humedad controladas de unos 20ºC y un 50% respectivamente. Se saturan las muestras en agua a vacío para facilitar que se llenen por completo los poros. Una vez saturadas, se secan superficialmente con un paño y se pesan, colocándolas posteriormente en un soporte con rejilla para que a lo largo de toda su superficie se produzca la evaporación de igual forma. Cada cierto intervalo de tiempo (intervalos iguales), se pesan las probetas hasta alcanzar un equilibrio, es decir, que la diferencia entre una pesada y la anterior sea inferior a un 0,1%. Los resultados obtenidos mostrarían una curva de evaporación relacionando el contenido en agua de la muestra en función del tiempo. La velocidad de evaporación del agua se puede calcular con la pendiente del tramo lineal, y el contenido de agua crítico será el contenido residual de agua (%) una vez alcanzado el equilibrio (Ontiveros Ortega & Villegas Sánchez, 2006) Ilustración 7: Curva de evaporación del agua (Ontiveros &Villegas, 2006, p.42) 3.2.4 Eficacia del tratamiento Para determinar la eficacia de un tratamiento se mide alguna de las características principales que se quiere conseguir con su aplicación. Sin embargo, también hay que tener en cuenta el comportamiento de un tratamiento está supeditado a las condiciones ambientales. Por esta razón, el estudio de la eficacia de los tratamientos puede usarse para obtener información acerca de cuáles son las condiciones externas más adecuadas para su utilización. Para tratamientos de limpieza y tratamientos de extracción de sales, la eficacia se valora realizando medidas en el propio edificio, y al completar el tratamiento, se toman muestras para que sean estudiadas en el laboratorio donde se determina la eliminación de suciedad de la capa superficial. La eficacia de los tratamientos biocidas se determina cuantificando la cantidad de organismos presentes, mediante inspección visual o con microscopía óptica o electrónica, que posibilita el estudio a diferentes niveles de profundidad. Los productos hidrófugos deberán impedir la entrada de agua desde el exterior, pero sin imposibilitar la 35 salida de vapor para evitar que se produzcan acumulaciones de agua en el interior. Por tanto, para medir la eficacia hay que estudiar propiedades que indiquen la facilidad o dificultad que pueda tener el agua para moverse a través de la piedra. El principal mecanismo estudiado para ello es la absorción que puede medirse por inmersión (a presión atmosférica, a vacío, a presión, a ebullición) o por capilaridad: o Por inmersión: Este ensayo tiene como objetivo determinar la capacidad natural de la muestra para absorber agua. Esta absorción libre depende de dos factores principalmente: de las características del material y del tiempo de inmersión (resultando un comportamiento más homogéneo del material para tiempos de inmersión más altos). El coeficiente de saturación de define como el cociente de el volumen de agua absorbida por la probeta durante 48 horas sumergida en agua a presión atmosférica entre el volumen total de poros. Esta relación se denomina absorción de agua según la norma ASTM/1978; según la norma RILEM (1980), en el caso de inmersión gradual durante el primer día, se denomina coeficiente Mishwald; para tiempos largos en los que se permite alcanzar valores de equilibrio, se denomina capacidad de absorción según la norma ICR (1981). • Procedimiento de ensayo Las probetas son sumergidas en agua destilada sobre un soporte que protege de cualquier contacto con la superficie, y se dejan a unos 21ºC el tiempo necesario. Las probetas se van sacando, secando con un paño húmedo y pesando cada cierto periodo de tiempo, volviendo a introducir las probetas en el agua tras la pesada. Estas pesadas deberán realizarse cada vez más espaciadas en el tiempo a medida que avanza el ensayo. Cada pesada indica el peso húmedo de la probeta (Mi). El ensayo debe durar al menos 7 días, finalizando si al término de estos días la diferencia entre pesadas con 24 horas de espaciado es inferior al 1%. Los resultados obtenidos, representando la variación del contenido en agua (% en peso) frente al tiempo, muestran una curva en la que se puede observar un carácter lineal al principio del ensayo. Con la pendiente de este tramo recto se obtiene la velocidad de absorción, característica de cada material. A partir de un determinado valor, la curva se hace asintótica coincidiendo con la saturación máxima W(max.) de la piedra. Ilustración 8: Contenido en agua (% p/p) en función del tiempo 36 La cantidad de agua absorbida se calcula como: Ecuación 9: Cantidad de agua absorvida 𝑊𝑖(%)=𝑀𝑖− 𝑀0 𝑀0 𝑥100 El coeficiente de saturación (Si) se calcula: Ecuación 10: Coeficiente de saturación 𝑆𝑖=𝑀𝑖− 𝑀0 𝑀𝑠− 𝑀0 𝑥100 Donde Mi es el peso en el tiempo ti, Ms es el peso saturado M0 el peso seco. o Por capilaridad: La absorción capilar constituye el mecanismo principal de transporte de agua y sales, desde el exterior de la roca hasta el interior de ella por ósmosis y foresis. Mediante este ensayo se puede determinar la tendencia del material a permitir la entrada de agua por capilaridad y evaluar las posibles alteraciones debidas a ella. Los problemas que asociados a la capilaridad se debe a: • Cristalización de sales • Acción de hidrólisis • Oxidaciones e hidrataciones de los componentes minerales que conforman el material • Circulación de agua en el interior de la piedra a través de los poros La fuerza de succión que se experimenta al poner en contacto un material poroso con agua depende del diámetro de poro y de la naturaleza de la superficie del material. Teniendo en cuenta estas variables, se puede expresar la altura de ascenso capilar mediante la Ley de Javin: Ecuación 11: Ley de Javin para el cálculo de la altura de ascenso capilar: 𝐻 = 2 𝑐𝑜𝑠𝜃 𝑟𝛾 Donde H representa la altura de ascenso capilar, 𝜃 el ángulo de contacto líquido-sólido, r el radio de poro y 𝛾 la viscosidad. Es posible calcular también la cantidad de agua absorbida en un determinado periodo de tiempo por una probeta prismática inicialmente seca, que se pone en contacto con una superficie de agua libre: Ecuación 12: Cantidad de agua absorbida por capilaridad: 𝑚 = 𝐴√𝑡 Siendo m la cantidad de agua absorbida en Kg/m2, t el tiempo en segundos y A el coeficiente de absorción de agua. • Procedimiento de ensayo: Las probetas utilizadas deben ser de base plana y mantener una sección constante, siendo recomendables las formas cilíndricas o prismática, con su sección más larga perpendicular a la superficie del líquido. El ensayo se debe desarrollar en unas condiciones controladas de temperatura y humedad relativa, siendo éstas en torno a 20ºC y 20% respectivamente. Se colocan las probetas en una bandeja donde previamente se ha introducido al fondo algún material poroso formando una delgada capa. Sobre esta capa se coloca un papel de filtro de al menos 1 cm de grosor. Se añade 37 agua destilada a la bandeja de forma que vaya rellenando la parte ocupada por el material poroso hasta llegar al papel. Con ayuda de un paño húmedo se secan las probetas y se realizan pesadas cada cierto tiempo, siendo aconsejable realizar el mayor número de pesadas en la primera hora. Se repiten las medidas hasta que la variación de peso sea mínima. Además, se mide la altura que alcanza el agua de las cuatro caras de la probeta y se realiza una media. Los datos obtenidos se pueden representar en una curva que relaciona la variación de peso por unidad de superficie con la raíz cuadrada del tiempo: Ilustración 9: Absorción por capilaridad de una probeta expresada como la variación de la masa de agua en % respecto a la raíz del tiempo Calculándose la variación de peso: Ecuación 13: Variación de peso por capilaridad: ∆𝑀𝑖(𝑔/𝑐𝑚2)=𝑀𝑖− 𝑀0 𝑆 Donde Mi es el peso en el tiempo ti, Mi es el peso seco y S la superficie de absorción. (Ontiveros Ortega & Villegas Sánchez, 2006) Además de los mecanismos vistos anteriormente para estudiar la capacidad que tiene una piedra para que el agua viaje por sus poros, podemos destacar otros dos ensayos que dan información sobre la hidrofugación superficial: o Velocidad de absorción de gotas: La velocidad de absorción de gota de agua es el tiempo necesario para que una determinada cantidad de agua sea absorbida por una superficie. Es un ensayo muy útil a la hora de evaluar el comportamiento hidrófugo de un tratamiento. • Procedimiento de ensayo: Para este ensayo se utiliza una probeta seca, con una superficie plana horizontal y lo suficientemente grande para separar las gotas de agua al menos medio centímetro. Se coloca una microbureta de 1 mL a 1 cm de la superficie de la muestra y se colocan gotas de 0,01 mL. El tiempo que tarde en ser absorbida será la velocidad de ensayo y se denomina tx. 38 o Ángulo de contacto: Esta medida determina el grado de hidrorrepelencia de la superficie de un material. El ángulo de contacto de una gota de agua se define con la expresión siguiente, explicándose sus variables en la ilustración 10: Ecuación 14: Ángulo de contacto de gota: 𝑡𝑔 𝜃 2=2ℎ 𝑏 → 𝜃 = 2 · 𝑎𝑟𝑐𝑡𝑔(2ℎ 𝑏) Donde 𝜃 es el ángulo de contacto, h la altura de la gota y b la longitud de la base de contacto con la superficie. • Procedimiento de ensayo: Se mide la altura (h) y la anchura de la base en contaco (b) de cada probeta, repitiéndose al menos el procesimiento 5 veces por probeta. Una vez calculado el ángulo de contacto de cada prueba, se realiza una media. (Ontiveros Ortega & Villegas Sánchez, 2006) Ilustración 11: Hidrorrepelencia en función del ángulo de contacto de la gota de agua (ATRIA Innovation, 2016) En cuanto a los consolidantes, ya que su finalidad principal es restaurar o mejorar la cohesión del material, se evalúa su eficacia estudiando la modificación de características mecánicas: Ilustración 10: Medida del ángulo de contacto de gota 39 Ilustración 12: Ensayos para determinar las diferentes propiedades mecánicas de un material (Ontiveros Ortega & Villegas Sánchez, 2006) Hay dos grandes grupos de métodos para medir las propiedades mecánicas: los métodos directos y los métodos indirecto. Entre los primeros se pueden encontrar ensayos como los de resistencia a la compresión, a la tracción, a la flexión, etc., pero no se suele recurrir ellos debido a su carácter destructivo sobre la pieza y al requerimiento de varias probetas de gran tamaño. Por el contrario, los métodos indirectos son muy empleados a la hora de evaluar la eficacia de un consolidante. Los ensayos indirectos que se pueden llevar a cabo para la determinación de las propiedades mecánicas de un material son: o Velocidad de propagación del sonido: Ultrasonidos Es la técnica no destructiva más empleada en los ensayos realizados para analizar los materiales del Patrimonio, pudiendo detectar propiedades tanto en el seno como en la superficie de un material. Se utilizan vibraciones elásticas con frecuencias de onda superiores a los 20 KHz, rango de frecuencias imperceptible para el oído humano. Para la propagación de estas ondas ultrasónicas es necesario un medio material que lo permita. Al actuar una fuerza externa sobre una partícula del material, ésta se desplaza de su posición de equilibrio propiciando el movimiento de otras partículas adyacentes a ella. Esto da lugar a una reacción en cadena que permite dicha propagación. Existen dos tipos de ondas: • Internas: se propagan en el interior de los materiales. Son de tipo longitudinal, propagándose paralelas al avance de la onda y tienen mayor velocidad que las siguientes. • De superficie: como su nombre indica, se propagan en la superficie y su dirección de trasmisión es perpendicular a la propagación de la onda. Esta técnica está muy desarrollada en materiales cerámicos y metales, con alta conductividad ultrasónica y distancias cortas de recorrido de onda. Se usa también en materiales como rocas ornamentales, pero se aplica con mayor dificultad por su baja conductividad y por la mayor distancia de recorrido de las ondas. Las ondas ultrasónicas experimentan fenómenos de reflexión, refracción y difusión, dependiendo de la impedancia acústica del medio. Por este motivo, cuando el haz de ultrasonido encuentra una superficie 40 que separa dos materiales con diferente impedancia, el haz se divide en los 3 fenómenos anteriores. La impedancia de un medio se calcula mediante la siguiente expresión: Ecuación 15: Calculo de la impedancia 𝑍 = 𝐶 · 𝜌 Donde Z es la impedancia, C la velocidad de propagación de la onda y 𝜌 la densidad del material por el que se transmite. • Procedimiento de ensayo: Conforme recoge la norma UNE 14579/05 para la determinación de la velocidad de propagación de las ondas ultrasónicas a través de la piedra natural, se deben tomar muestras de forma regular (diámetro mínimo de 5 cm para probetas cilíndricas y sección mínima de 7 x 7 cm para paralelepípedos). La esbeltez de las probetas debe oscilar entre 1 y 4, utilizando un número de probetas no inferior a 5. Se colocan los palpadores del emisor y del receptor en tres configuraciones diferentes: en caras opuestas, en caras contiguas y en la misma cara. La velocidad de propagación se calcula: Ecuación 16: Velocidad de propagación de los impulsos ultrasónicos: 𝑣 = 𝐿 𝑡 Donde v es la velocidad a calcular, L la longitud del camino recorrido en metros y t el tiempo de propagación en segundos. (Ontiveros Ortega & Villegas Sánchez, Porgrama de normalización de estudios previos y control de calidad de las intervenciones. Propiedades mecánicas 2ª Parte, 2006) Para estudiar el comportamiento de los tratamientos consolidantes las propiedades mecánicas superficiales pueden proporcionar más información que las anteriores, ya que los productos aplicados suponen una fina capa en la superficie de la piedra. Las más empleadas son: o Dureza al rayado: Este ensayo está basado en la propiedad de los materiales de rayar o ser rayado. Para determinar esta propiedad, se evalúa la presión requerida para realizar un rayado, así como por el tamaño de rayado bajo una carga fija. Esta técnica tiene 3 limitaciones principales: se necesitan un gran número de medidas en una misma probeta, no se puede aplicar sobre materiales demasiado duros y son difíciles de normalizar. Para su normalización se emplea el aparato de Martens. • Procedimiento de ensayo: El aparato de Martens se compone de un pequeño carro que se desplaza sobre dos ruedas arañando la probeta con una punta de acero tratada o de diamante de forma piramidal. El proceso se efectúa con un ángulo de 90º en la punta, sobre la cual se deja actuar una carga determinada. Se realiza un total de cien medidas por cada tipo de piedra sobre un mínimo de 5 muestras y posteriormente se calcula la media. o Dureza a la abrasión: Este método se utiliza para saber la resistencia de un material a las pisadas, la cual depende de la dureza de los componentes del material y de la fortaleza de las uniones entre ellos. El ensayo de dureza viene normalizado por la normal ASTMC/448-64, mediante la cual: El aparato consta de una pista de rozamiento que gira a una velocidad mínima de 1 m/s; 2 portaprobetas solidarios a los ejes de deslizamiento y diametralmente opuestos sobre el bastidor, centrado sobre la superficie de rozamiento; un dispositivo que permite comprimir las probetas entre los platos; otro que permite verter de manera uniforma el abrasivo, y agua en la superficie de rozamiento. Las probetas se someten a un recorrido de mil metros, tras lo cual se extraen de la máquina y se limpian. Se requiere al 41 menos dos probetas de 7 cm de arista, Se determina su volumen inicial mediante pesada hidrostática y la superficie a desgastar con un calibre. El resultado se puede expresar mediante la expresión: Ecuación 17: Desgaste lineal por abrasión: 𝐷 = 𝑣𝑖− 𝑣𝑓 𝐴 Donde vi es el volumen inicial, vf el volumen final y A la superficie de las caras de las probetas en contacto (en mm) (Ontiveros Ortega & Villegas Sánchez, 2006). 3.2.5 Resistencia al deterioro: Ensayos de alteración acelerada Tras la aplicación de los ensayos anteriores para medir sus características, se deben someter las probetas a ensayos de alteración acelerada en los que se recrean las condiciones reales a las que estará expuesta la obra. Nacen de la necesidad de disminuir los plazos para obtener cambios en las características con respecto a ensayos a la intemperie. Aunque también se somete la probeta a las circunstancias reales, el grado de alteración es muy pequeño. Por eso se reproducen artificialmente, obteniendo grados de alteración mayores en menos tiempo. Una de las limitaciones que tienen estos ensayos es que pueden no representar fielmente la situación real, ya que se aplican ensayos aislados para cada factor de alteración, sin tener en cuenta efectos sinérgicos de distintos factores. Ante esto, muchos autores realizan ciclos en los que van alternando distintos factores de alteración, y así acercarse lo máximo posible a la superposición de posibles acciones de deterioro real. (Villegas Sánchez, 2003) Para cada estudio, se debe seleccionar los ensayos con una relación más directa con las características del ambiente donde se encuentre la piedra. Estos ensayos se valoran de la siguiente manera (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997): • Observación antes, durante y después del tratamiento de la morfología de las probetas objeto de ensayo. • Descripción de las modificaciones y su posible relación con los ciclos. • Pérdidas de materiales durante y tras los ensayos. • Comparación de las propiedades físicas que se han seleccionado, antes y después de realizar el ensayo. Existen cinco tipos básicos de ensayos acelerados (Villegas Sánchez, 2003): • Heladicidad • Cristalización de sales • Ciclos termohigrométricos • Ensayos de radiación UV • Ataque químico con soluciones o atmósferas contaminadas 48 49 Tabla 5: Bioprotectores de los monumentos patrimoniales (Dakal & Cameotra, 2012) Las bacterias del filo Fimicutes, principalmente, Bacillus, producen una precipitación de carbonato cálcico impulsado por la ayuda de la enzima ureasa, operando anaeróbicamente. La precipitación formada recibe el nombre de Biocemento. Entre las pertenecientes al filo Proteobacteria, se encuentran reductoras de sulfato y azufre (reduciendo a sulfuro) y reductoras de nitrato (reduciendo a nitrógeno gaseoso o a óxido nitroso). Esta característica es muy útil en multitud de situaciones, como por ejemplo, en las estatuas de mármol que se encuentran a la intemperie, vulnerables a las adversidades ambientales y a la lluvia ácida. El ácido sulfúrico de la lluvia ácida reacciona con el carbonato cálcico del mármol y lo transforma en sulfato cálcico dihidratado, más conocido como yeso. Gauri y colaboradores comprobaron el papel de las bacterias reductoras de sulfato en la eliminación de las incrustaciones de yeso de una estatua de mármol al convertir el yeso en calcita. (Dakal & Cameotra, 2012). 50 4.2 PROCESO DE BIOMINERALIZACIÓN La mineralización de carbonato de calcio bacteriano está regulada por cuatro factores clave (Narvasi, Mastromei, & Perito, 2020): • Concentración de calcio. • Concentración de carbono inorgánico disuelto. • Grado de acidez o alcalinidad del medio. • Disponibilidad de sitios de nucleación. El principal tipo de bacterias empleadas en los procesos de biomineralización son las mixobacterias (bacterias gramnegativas que se deslizan por el suelo). Las células de estas mixobacterias son bastones largos y delgados con una longitud de 3-12 µm y un diámetro de 0,7-1,2 µm (Ilustración 16a). Son especialmente abundantes en suelos ricos en materia orgánica como suelos cultivados y madera en descomposición. Las mixobacterias viven formando grandes comunidades conocidas como enjambres y se alimentan degradando una gran variedad de macromoléculas como proteínas, almidón, lípidos, ácidos nucleicos e incluso celulosa ya que producen una gran variedad de sustancias hidrolíticas extracelulares. Además, disponen de recursos de adaptación al medio que le permiten sobrevivir. Si el medio tiene suficiente aporte de nutrientes siguen un ciclo de vida vegetativo en el que las células se alargan y se dividen por fisión binaria dando lugar a dos células hijas. Por el contrario, cuando las condiciones son adversas y no disponen de los nutrientes necesarios, las células inician un ciclo de desarrollo, que es muy singular entre los procariotas: las células dentro de un enjambre se mueven hacia ciertos puntos originando estructuras multicelulares, que se conocen como cuerpos fructíferos, observables a simple vista (Ilustración 16b). Dentro de los cuerpos fructíferos, las células se diferencian y originan mixosporas, etapas latentes y resistentes a diversas condiciones de estrés como la desecación, la irradiación UV y la sonicación. (Jiménez-López, Jroundi, Rodríguez-Gallego, Arias, & González-Muñoz, 2007) Ilustración 16: a) Microfotografía de microscopía electrónica de barrido (SEM) de células vegetativas de Myxococcus xanthus. (La barra representa 2 µm). b) Microfotografía SEM de un cuerpo fructífero de M. xanthus. (La barra representa 10 µm) 51 4.2.1 Producción de carbonatos: Los dos tipos de polimorfos más comunes del carbonato de calcio son la calcita y la aragonita. Sin embargo, se ha descubierto recientemente, gracias a ensayos en laboratorio, que la formación de vaterita es más común de lo que se creía. Pero no es el único descubrimiento al que se ha llegado: la vaterita puede conducir a una mejor compresión de la mineralización del carbonato procedente microbiano y ayudar a detectar indicios de vida, tanto en la Tierra como en otros planetas. Además, puede solucionar el problema del polimorfismo del carbonato de calcio, ya que se ha demostrado que M. xanthus tiende a inducir la precipitación de vaterita principalmente, el polimorfo más estable del carbonato de calcio (Jiménez-López, Jroundi, Rodríguez- Gallego, Arias, & González-Muñoz, 2007). La vaterita inducida por A. xanthus muestra una morfología esferoidal y similar a la de las lentejas, como se muestra en la siguiente ilustración: Ilustración 17: a) yb) Microfotografías SEM de cristales de vaterita inducidos por M. xanthus en medio de cultivo M3-P. (La barra representa 5 µm). La vaterita muestra una morfología esférica y una apariencia similar a la de las lentejas. El mecanismo de precipitación de carbonatos más sencillo de controlar que permite producir grandes cantidades en poco tiempo es a través de la hidrólisis de la urea, llevado a cabo por bacterias ureolíticas. Durante la actividad de la ureasa microbiana, se produce la reacción intracelular que se expone a continuación, en la cual un mol de urea se hidroliza a 1 mol de amoniaco y 1 mol de carbamato, que se hidroliza espontáneamente para formar ácido carbónico y otro mol adicional de amoniaco (Dhami, Sudhakara Reddy, & Mukherjee, 2013). Ecuación 18: Hidrólisis de la urea 1: 𝐶𝑂(𝑁𝐻2)2+ 𝐻2𝑂𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎 → 𝑁𝐻2𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝑁𝐻3 Ecuación 19: Hidrólisis de la urea 2: 𝑁𝐻2𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐻2𝑂 → 𝑁𝐻3+ 𝐻2𝐶𝑂3 Los productos resultantes se equilibran en agua, formándose así 1 mol de amonio y aniones de hidróxido que se traducen en un aumento del pH del medio, y el carbonato reacciona con calcio para formar el carbonato de calcio en esas condiciones de alcalinidad, según las siguientes ecuaciones: Ecuación 20: Formación de carbonato a partir de ácido carbónico: 𝐻2𝐶𝑂3 → 2𝐻++ 2𝐶𝑂3 2− Ecuación 21: Formación de aniones de hidróxido que elevan el pH del medio: 𝑁𝐻3+ 𝐻2𝑂 → 𝑁𝐻4 ++𝑂𝐻− 52 Ecuación 22: Formación de carbonato de calcio a partir de carbonato. (Ksp es la constante del producto de solubilidad): 𝐶𝑎2+ +𝐶𝑂3 2− → 𝐶𝑎𝐶𝑂3 (𝐾𝑆𝑃 = 3.8𝑥10−9) Existen algunas cepas microbianas aerobias gramnegativas que solo pueden utilizar aminoácidos como su única fuente de energía para iniciar la biomineralización del carbonato de calcio. Como se muestra en la Ilustración 18, el dióxido de carbono y el amoníaco se producen por desaminación oxidativa de aminoácidos. El amoníaco (ecuación 21) aumenta la alcalinidad en el microambiente alrededor de la célula, mientras que el CO2 se disuelve y se transforma en HCO3- o CO32- a un pH más alto. Aquí también, la presencia de calcio y un ambiente alcalino favorece la precipitación de carbonato cálcico por nucleación heterogénea en las paredes celulares bacterianas (Rodríguez-Navarro et al. 2003). Ilustración 18: Proceso de bioprecipitación de carbonato cálcico a partir de aminoácidos (Jroundi, Gonzalez-Muñoz, & Rodriguez-Navarro, 2021) Se atribuye a las bacterias que su principal función es crear el ambiente alcalino para favorecer la reacción principal a través de diversas actividades fisiológicas. Pero lo cierto es que, además de esta función, también es importante para la precipitación del calcio: las bacterias contienen en su superficie grupos cargados negativamente, lo que, a un pH neutro, haría que los iones metálicos con carga positiva se unan a ella, favoreciendo la nucleación heterogénea (Bäuerlein, 2003). De esta forma, los cristales de carbonato se desarrollan sobre la pared externa de las células bacterianas por estratificación sucesiva. Tras un tiempo, la célula bacteriana queda encapsulada, limitando la transferencia de nutrientes y acabando en la muerte celular. Ilustración 19: Proceso de formación de carbonato de calcio sobre la pared bacteriana inducido por la urea. DIC es el carbonato inorgánico disuelto y AMM el amoniaco (Muynck, Belie, & Verstraete, 2009). 53 La precipitación del CaCO3 en un medio urea-CaCl2 se produciría de la siguiente forma: Ecuación 23: Captación del ion de calcio por la bacteria: 𝐶𝑎2+ + 𝐶𝑒𝑙𝑙 → 𝐶𝑒𝑙𝑙 − 𝐶𝑎2+ Ecuación 24: Formación del carbonato y cloruro amónico: 𝐶𝑙−+𝐻𝐶𝑂3− +𝑁𝐻3 → 𝑁𝐻4𝐶𝑙 + 𝐶𝑂3 2− Ecuación 25: Formación de carbonato de calcio en la superficie de la célula: 𝐶𝑒𝑙𝑙 − 𝐶𝑎2+ +𝐶𝑂3 2− → 𝐶𝑒𝑙𝑙−𝐶𝑎𝐶𝑂3 Algunos autores ponen en duda el papel de bacterias, opinando que se trata de un subproducto indeseado y accidental del metabolismo bacteriano (Knorre & Krumbein, 2000) 4.3 ENSAYOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Los tratamientos convencionales, tanto orgánicos como inorgánicos, empleados para la consolidación de piedras ornamentales, tienen varias desventajas: incompatibilidad a largo plazo del sustrato y el cemento nuevo utilizado para la consolidación, taponamiento de poros inducidos por el nuevo cemento, aceleración de la alteración de la piedra, etc. Las incompatibilidades observadas han propiciado la búsqueda y desarrollo de nuestros tratamientos de conservación para la protección de consolidación de la piedra, siendo los métodos biológicos más adecuados que los tradicionales. Pero, ¿son éstos realmente la mejor opción? A continuación, se exponen unos ensayos en los que se determina la viabilidad de estos métodos evaluando diferentes características de la piedra en diferentes circunstancias tratada con biomineralización. 4.3.1 Consolidation of quarry calcarenite by calcium carbonate precipitation induced by bacteria activated among the microbiota inhabiting the stone (Jimenez-Lopez, Jroundi, Pascolini, Rodríguez-Navarro, & al., 2008) En el año 2008 la Universidad de Granada llevó a cabo un estudio sobre piedra caliza sin eliminar la comunidad bacteriana natural de la misma. El carbonato de calcio que se producía era compatible con el sustrato y consolidó la piedra sin taponar poros. Se trata del primer estudio que propone el uso de un medio de cultivo bacteriano no inoculado en la consolidación de piedras. La aplicación de los medios de cultivos especificados en este estudio se propone como un procedimiento en la protección eficaz de la piedra caliza ornamental. 4.3.1.1 Materiales y métodos Los experimentos de biomineralización se realizaron sumergiendo losas de piedra esterilizadas y no esterilizadas en dos medios de cultivos diferentes: uno estéril y otro inoculado con M. xanthus. El medio de cultivo activa de forma focalizada entre todos los microorganismos existentes en la piedra, aquellos con potencial para precipitar carbonato de calcio y, por tanto, aumentar la consolidación del material tratado. Para evaluar el potencial de precipitación de carbonato de calcio de las bacterias activadas de la comunidad microbiana y los efectos sobre la consolidación, se utilizaron variaciones en propiedades químicas del medio, así como propiedades físicas y mecánicas de la piedra. 54 1. Losas, inóculo y medios de cultivo Para las pruebas de biomineralización se utilizó piedra calcarenita de cantera de La Escribanía (Escúzar, España), una piedra caliza bioclástica porosa. El sur de España, más concretamente la zona de Granada y sus alrededores, es muy conocido por su legado arquitectónico y escultórico, con el material de construcción predominante, la calcarenita, extraída de la cantera de Escúzar. El edificio ornamental más antiguo en el que está documentado el uso de calcarenita de la cantera de Escúzar data del siglo VIII. Se optó por utilizar piedra de este lugar debido a la importancia de esta cantera y la posibilidad de que de ella salieran nuevas piedras para reemplazar las piedras dañadas. Se cortaron 36 losas de piedra de 2x5x0,5 cm con una sierra de diamante y se pesaron. Se esterilizaron 18 placas de piedra y las otras 18 no. Para minimizar la alteración, se esterilizaron calentando las losas con vapor de agua a 100 ºC durante 1 hora, 4 días seguidos, con almacenamiento intermedio a temperatura ambiente. El microorganismo utilizado fue M. xanthus (cepa 422 proporcionada por la Colección Española de Cultivos Tipo, Burjasot, Valencia, España). Para la preparación del inóculo, se cultivó M. xanthus en medio líquido CT (Rodríguez-Navarro et al., 2003). Se incubó en un agitador rotatorio (18.85 rad s) durante 48 h a 28 Cº para alcanzar una fase tardía de crecimiento exponencial con una densidad celular de aprox. 3x108 células ml-1. Las pruebas de biomineralización se realizaron en tres medios líquidos: • M-3 [1 wt% Bacto Casitone, 1 wt% Ca(CH2COO)2·4H2O, 0,2 wt% K2CO3·1/2H2O en agua destilada, pH 8; Rodriguez-Navarro et al., 2003] • M-3P [1wt% Bacto Casitone, 1 wt% Ca(CH2- COO)2·4H2O, 0,2 wt% K2CO3·1/2H2O, 10 mM tampón de fostato en agua destila, pH 8; Rodriguez-Navarro et al., 2003] • CC [0.3 wt% Bacto Casitone, 0.4 wt% Ca(CH2COO)2·4H2O, 0,1 wt% CaCl2 0.3% NaHCO3, 0,1 wt% extracto de levadura en agua destilada, pH 8; Ben Chekroun, 2000]. Se prepararon medios de cultivo sólidos M-3, M-3P y CC añadiendo agar-agar al 18% en peso al medio de cultivo líquido. 2. Procedimientos experimentales Se llenaron quince matraces Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio de cultivo líquido M-3 filtrado. A continuación, el medio de cultivo se esterilizó en autoclave durante 20 min a 120ºC. Una vez esterilizados, seis de los matraces Erlenmeyer, que contenían M-3 estéril, se inocularon con 2 ml de cultivo de M. xanthus, quedando sin inocular los nueve restantes. De los 6 inoculados, en tres de ellos se introdujeron calcarenita estéril (una losa por frasco), mientras que en los tres restantes se introdujeron tres placas de calcarenita no estéril. Con respecto a los nueve matraces sin inocular, tres no recibieron losas (control), tres recibieron losas estériles y tres recibieron losas no estériles. Este mismo procedimiento se llevó a cabo con los otros dos medios de cultivo (M-3P y CC). Todos los matraces Erlenmeyer se incubaron en la oscuridad a 28°C durante 30 días en un agitador rotatorio a 5,97 rad/s. La tasa de evaporación se midió pesando cada matraz cada 24 h. Todas las losas (tanto esterilizadas como no esterilizadas) que están sumergidas en cualquier medio de cultivo se denominan aquí "losas tratadas" frente a las losas "no tratadas", que son losas en bruto a las que no se les dio ningún tratamiento. A intervalos de tiempo predeterminados (0, 1, 3, 5, 7, 10, 15 y 30 días) se extrajo una alícuota de 7 ml de medio de cultivo de los matraces Erlenmeyer en condiciones asépticas. Se preparó una serie de diluciones decimales a partir de 500 µl de la muestra y luego se colocó un volumen de 100 µl de cada dilución en los correspondientes medios de cultivo sólidos M-3, M-3P y CC esparciendo el volumen de manera homogénea 55 sobre la superficie de la muestra. Se incubaron placas de Petri que contenían medios de cultivo inoculados a 28ºC durante 4 días. Se realizó una siembra en medio de cultivo sólido para determinar el tamaño de la población bacteriana. El resto de la alícuota se filtró a través de una membrana Millipore de 0,2 micras y se mantuvo en refrigeración en viales sellados para análisis químico. Al final del experimento (30 días), se retiraron 2 ml del medio de cultivo de los matraces en condiciones asépticas y se centrifugaron a 1571,05 rad/s durante 5 min, y el sedimento se almacenó a -80°C para análisis moleculares adicionales de la microbiota creciendo en los medios de cultivo. Se recogieron losas de piedra, se enjuagaron dos veces con agua destilada y se secaron en un horno a 40ºC durante 48 h. Finalmente, se pesaron. 4.3.1.2 Resultados y discusión Los medios de cultivo utilizados en los experimentos tenían una composición particular que debía cumplir con dos objetivos importantes: (1) promover el crecimiento de esas bacterias, entre la comunidad microbiana que habita la piedra, capaces de inducir la precipitación de carbonato cálcico; y (2) para prevenir la producción de ácidos que pueden formarse debido a la naturaleza de la actividad metabólica de las bacterias activadas, ya que la producción de ácidos detendría la formación de carbonato de calcio y/o conduciría a la disolución del carbonato de calcio previamente formado. Para ello, se excluyeron los carbohidratos del medio de cultivo, mientras que se introdujo una digestión pancreática de caseína (y extracto de levadura en medio CC) como fuente de carbono y nitrógeno. La eliminación de carbohidratos como fuente de carbono excluyó el crecimiento de microorganismos que producen ácidos orgánicos como resultado del metabolismo de esos carbohidratos, y se fomentó el crecimiento de aquellos que usan aminoácidos. Esto es importante ya que la desaminación oxidativa de los aminoácidos da como resultado una liberación de amoniaco, que alcaliniza el medio de cultivo, y es esta alcalinización la que luego favorece la formación de carbonato cálcico. Además, la alcalinización limita el crecimiento de hongos, que preferentemente crecen en condiciones más ácidas. Cabe señalar que la mayoría de los métodos propuestos hasta ahora para consolidar piedra ornamental basados en la aplicación de un medio de cultivo inoculado con bacterias utilizan medios de cultivo que contienen una cantidad considerable de carbohidratos. No se detectó crecimiento en los medios de cultivo estériles que contenían cálculos estériles y solo se detectó el crecimiento de M. xanthus en medios de cultivo inoculados con M. xanthus que contenían cálculos estériles. Esto indica que el método de esterilización utilizado fue eficaz. Por el contrario, se detectó crecimiento microbiano en los medios de cultivo sólidos inoculados con muestras recolectadas de experimentos que contenían placas no estériles sumergidas en medios de cultivo estériles e inoculados con M. xanthus, lo que indica que esos medios de cultivo fueron capaces de activar las bacterias pertenecientes a la comunidad microbiana de la piedra Se realizó una identificación filogenética de las bacterias activadas con el fin de evaluar si la aplicación de los medios de cultivo había potenciado el crecimiento de algún microorganismo que pudiera ser potencialmente peligroso para la consolidación del material. En la piedra sin tratamiento, se detectaron bacterias presentes en acuíferos contaminados y relacionadas con la contaminación fecal. Sin embargo, al estudiar la piedra con el tratamiento, aparecieron bacterias grampositivas de baja G+C, miembros de las Bacillales y Oceanobacillus, que son bacterias que pueden usar aminoácidos como fuente de carbonato de calcio, siendo altamente efectiva su contribución. Ninguna de las bacterias activadas parece ser potencialmente peligrosa para la consolidación del cálculo. El estudio de la producción de carbonato de calcio por las diferentes bacterias aisladas de los medios de cultivo en los que se trataron los cálculos no estériles muestra que todos los aislados fueron capaces de inducir la precipitación de carbonato de calcio en los medios de cultivo M-3 y M-3P. La única diferencia fue en el momento en que cada aislado produjo los cristales y la masa relativa de producción de carbonato (Tablas 6 y 7). Se observaron tipos de colonias similares en los dos medios de cultivo. Las diferencias entre ellos se relacionaron con la cantidad relativa de cristales producidos, que fue mayor en M-3 que en M-3P. 56 Los cristales comenzaron a aparecer dentro de la colonia. Durante las primeras etapas aparecieron principalmente en los bordes, pero con el tiempo, la producción de cristales de carbonato de calcio se extendió a toda la colonia e incluso a los medios de cultivo que la rodean. Dado que la producción de cristales de carbonato de calcio ocurre como resultado del metabolismo bacteriano, ocurrirá donde los metabolitos están más concentrados (dentro de la colonia) y luego en cualquier lugar (en la colonia o incluso en el medio de cultivo). El hecho de que todas las bacterias aisladas de los medios de cultivo (M-3 y M-3P) en los que se sumergieron los cálculos no estériles fueron capaces de inducir la precipitación de carbonato cálcico en esos medios es muy importante, ya que demuestra que (1) la aplicación de los medios de cultivo especificados en nuestro estudio sólo activa el crecimiento de bacterias productoras de carbonato de calcio entre la comunidad microbiana que habita la piedra; y (2) dicha activación tiene un papel favorable en la consolidación del cálculo. Tabla 6: Producción de cristales de carbonato de calcio a lo largo del tiempo por aislamientos de experimentos que contienen calcarenita no estéril sumergida en medios de cultivo estériles M-3 y M-3P Tabla 7: Producción de cristales de carbonato de calcio a lo largo del tiempo por aislamientos de experimentos que contienen calcarenita no estéril sumergida en medios de cultivo M-3 y M-3P inoculados con M.xanthus 4.3.1.3 Evolución de la química de los medios de cultivo Los valores de pH de los medios de cultivo estériles que no contenían placas de piedra (controles) fueron casi constantes durante todo el experimento. Las variaciones estuvieron en el rango de ± 0,1 unidades de pH. Los valores de pH de los medios de cultivo estériles que contienen placas estériles variaron dentro de ±0,3 unidades de pH y fueron más bajos que los de los controles. Sin embargo, este no fue el caso de las pruebas que contenían placas estériles en las que los medios de cultivo se inocularon con M. xanthus. En el último caso, los valores de pH oscilaron dentro de los primeros 10-15 días y luego aumentaron drásticamente a valores finales de 9.62, 9.00 y 9.69 a los 30 días para las pruebas de M-3, M-3P y CC, respectivamente. Los valores máximos de pH se observaron en medios de cultivo inoculados con M. xanthus que contenían cálculos no estériles, alcanzando valores finales de 9,85, 10,37 y 10,28 para los medios de cultivo M-3, M- 3P y CC, respectivamente. Se midieron tasas de evaporación de aproximadamente 0,5 ml al día a lo largo 57 de todo el curso de los experimentos. En cuanto a la formación de carbonato de calcio, se puede determinar mediante la disminución de los valores de CaTaq) a lo largo del tiempo. Solo se detectó una ligera disminución en CaTaq) en los experimentos de control (con la excepción del medio de cultivo M-3), mostrando una precipitación limitada de carbonato de calcio. En losas estériles que contienen M-3 estériles hubo una disminución en CaTag) de 43% con respecto al valor inicial, mientras que en losas estériles que contienen M-3P y CC estériles, las reducciones en CaTag) fueron inferiores al 5%. Por el contrario, se observó una disminución del 98% de los valores iniciales en las pruebas en las que M. xanthus y / o la comunidad microbiana estaban presentes, lo que demuestra una precipitación de carbonato de calcio muy notable. Esta disminución se produjo principalmente durante los primeros 15 días del experimento, permaneciendo los valores casi constantes a partir de entonces. En resumen, la disminución de CaTaq) fue más importante en la siguiente secuencia (de mayor a menor): (a) medios inoculados con M. xanthus que contienen cálculos no estériles: (b) medios de cultivo estériles que contienen cálculos no estériles: (c) medios inoculados con M. xanthus que contienen cálculos estériles; y finalmente. (d) medios de cultivo estériles que contienen cálculos estériles. Sin embargo, los valores finales para (a), (b) y (c) son muy similares (Ilustración 20). Por tanto, la presencia de M. xanthus y/o bacterias activadas de la comunidad microbiana del cálculo parecen ser cruciales para inducir una precipitación notable de carbonato de calcio. CaTaq) y los datos de pH demuestran que la presencia de estas bacterias activadas produjo la alcalinización que propició la precipitación del carbonato de calcio. Aunque se observaron aumentos en los valores de pH cuando M. xanthus o la comunidad microbiana estaban presentes, fue en su presencia combinada donde tales aumentos fueron más importantes. Estos resultados sugieren que entre M. xanthus y la comunidad microbiana de piedra existe un esfuerzo cooperativo en la mejora de la precipitación de carbonato de calcio. Ilustración 20: Imágenes microscópicas ópticas de colonias de diferentes aislamientos que muestran producción de carbonato cálcico, (a) colonia con producción considerable de carbonato cálcico; (b) notable precipitación de carbonato de calcio dentro de la colonia y también en el medio de cultivo circundante; (c) borde de una colonia que muestra una intensa precipitación de carbonato de calcio; (d) precipitación intensa de carbonato de calcio en el interior y los bordes de una colonia e incluso en el medio de cultivo adyacente; (e): colonias que muestran pocos cristales de carbonato de calcio: (f) colonias que muestran una producción notable de carbonato de calcio. Las áreas mineralizadas dentro de las colonias aparecen oscuras. 64 3. Procedimiento de tratamiento por biodeposición Para la biodeposición se incuban las probetas en una sala a 28ºC y condiciones estándar al aire libre (no estériles). El primer paso realizado fue sumergir los cálculos durante 24 horas en un cultivo de B. sphaericus de 1 día de edad. Tras esto, las muestras se retiraron de la solución de cultivo y se limpiaron suavemente con una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido de la superficie. En el segundo paso, las muestras se sumergieron durante 4 días en un medio de biodeposición que contenía 20 g por litro de urea y 50 g por litro de CaCl·2H₂O. En ambos pasos se midió el pH de los diferentes líquidos antes y después de la inmersión de las probetas. Éstas se trataron por un lado (inmersión parcial) o por todos los lados (inmersión completa) dependiendo del parámetro de durabilidad a ensayar: Los cubos se sumergieron completamente (para experimentos de ataque con sal y de congelación y descongelación) o se sumergieron a una profundidad de aproximadamente 1 cm (para experimentos de absorción de agua y comportamiento de secado), mientras que los prismas se sumergieron completamente en recipientes de aluminio conteniendo 200 ml de biodeposición o medio de cultivo. Los cilindros para análisis microtomográficos se trataron junto con los prismas (es decir, completamente sumergidos en los mismos recipientes al mismo tiempo). A continuación, las muestras se dejaron secar durante 3 días a 28°C antes de ser almacenadas en un horno a 80 ° C hasta obtener un peso constante. Tabla 12: Aumento de peso de las piedras calizas y valores de pH para diferentes tipos de tratamientos de biodeposición. 65 Caracterización de la piedra: La estructura de poros de los diferentes cálculos se estudió mediante porosimetría de intrusión de mercurio (MIP). Los análisis de MIP se realizaron en prismas no tratados, mientras que la porosidad de los cubos de piedra secados al horno se determinó mediante saturación con agua al vacío. Caracterización de la actividad ureolítica en el interior de la piedra: La actividad ureolítica de los diferentes cálculos se determinó mediante medidas de conductividad con un multímetro: Se sumergieron completamente seis prismas de cada tipo de cálculo durante 24 h en un cultivo de B. sphaericus de 1 día. A continuación, los prismas se limpiaron suavemente con una toallita de papel y se almacenaron por separado en matraces Erlen Meyer que contenían 100 ml de una solución de urea (20 g/litros de urea y 8,5 g/litros de NaCl). Los experimentos se realizaron en condiciones estacionarias y no estériles. Se midieron la conductividad y el pH de la solución, en momentos puntuales del proceso. Se realizó una caracterización de la capa de reposición mediante un análisis SEM, un análisis microtomográfico por rayos X, un cálculo de la variación de peso mediante la diferencia de peso antes y después del tratamiento, un análisis espectrofotométrico y un estudio de sonicación. 4.3.3.2 Resultados Ilustración 23: Influencia del número de células (A), la presencia de calcio (B) y el tipo de piedra (C) sobre la cantidad de urea hidrolizada por la bacteria B. sphaericus Como se puede observar en la ilustración 23, el cálculo de cal que se había sumergido en cultivos de B. sphaericus mostró actividad ureolítca al transferirse a una solución que contenía urea. La velocidad de reacción y la cantidad de urea hidrolizada depende también del tipo de piedra, siendo Massangis y Euville las de menor tasa (ambas poco porosas) 66 Ilustración 24:Influencia de la porosidad en la capacidad de absorción de agua (A y B) y la evaporación de ésta (C y D) (en términos de pérdida de peso) para diferentes tipos de piedra Todos los cálculos tratados mostraron una disminución de la tasa de absorción de agua (Ilustración 24 A y B), mientras que se disminuyó también la velocidad de secado, acentuándose el efecto en las piedras más porosas (Ilustración 24 C y D). 67 Ilustración 25:Influencia de la porosidad a la resistencia a la sonicación (en términos de pérdida de masa provoca por este fenómeno) para los diferentes tipos de piedra en diferentes medios. Los cálculos tratados mostraron en torno a un 50 % menos de pérdida de peso tras la sonicación que las no tratadas, lo que induce a pensar que los cristales de carbonato biogénicos estaban firmemente adheridos a la superficie de la piedra. 68 Ilustración 26:Influencia de la porosidad al ataque salino (en términos de pérdida de peso tras la congelación y descongelación -menor pérdida de peso supone una mayor resistencia-) El tratamiento de biodeposición dio como resultado una mayor resistencia de la piedra al ataque de la sal, siendo el efecto más pronunciado para las piedras más porosas. Los Savonnières tratados con biodeposición permanecieron prácticamente intactos después de 15 ciclos de exposición al sulfato de sodio, pero sigue siendo un resultado aceptable dado que los cálculos no tratados se degradaron en gran medida. 4.3.3.3 Conclusiones: El objetivo principal que se ha perseguido en este estudio es la influencia de la estructura de los poros en la profundidad de penetración, así como en la eficiencia del tratamiento de biomineralización. La estructura de los poros que presenta una piedra afecta al transporte bacteriano, y por ende a la cantidad y distribución de los cristales de carbonato de calcio formado gracias a dichas bacterias. Además de la estructura de poros, este transporte bacteriano depende de la absorción de bacterias a la matriz mineral. Esto último, se ve afectado por características físicas, químicas y microbiológicas, pero debido a que todas las piedras usadas en el ensayo consisten principalmente en carbonato, los factores fisicoquímicos no son los que más afectan a la precipitación biogénica, centrándose así la atención sobre aquellos relacionados con la microbiología. Este trabajo de investigación se ha limitado a evaluar el tratamiento en condiciones controladas y óptimas. En un futuro se plantea el estudio en circunstancias que se asemejen más a las reales, y se le dará mayor importancia al tipo de medio de cultivo que tiene una gran influencia en la apariencia visual de la piedra tratada. Éste es el primer estudio en el que se trata la penetración del tratamiento de biomineralización en la piedra. Se observaron los mayores efectos de penetración en Euville y Savonnières, del orden de 2 mm superior que en los tratamientos anteriores de biodeposición. Aunque se observaron diferencias en la profundidad de penetración entre los 5 tipos de piedra, no fue así para el efecto consolidante, tratados mediante sonicación. Podría significar que el ensayo de sonicación no es lo suficientemente sensible para detectar variaciones en ensayos a esas profundidades. La mayor cantidad de carbonato biogénico se produjo en la piedra con mayor número de poros 69 (Savonnières), siendo razonable el resultado ya que la absorción de células bacterianas se ve facilitado al haber un mayor espacio en los poros. Esta mayor presencia de cristales de carbonato dio lugar a una menos absorción de agua, lo que supone un aumento en la resistencia ante procesos de degradación derivados del agua (congelación, ataque de sales transportadas por el agua, etc.). 70 4.3.4 TABLA RESUMEN DE LOS RESULTADOS OPTENIDOS EN LOS ESPERIMENTOS Ensayos Año Tipo de piedra Contenido bacteriano de las probetas Medio de cultivo Conclusiones Consolidation of quarry calcarenite by calcium carbonate precipitation induced by bacteria activated among the microbiota inhabiting the stone 2008 Calcarenita bioplástica - Estériles - Sin inocular - M. xanthus - M-3 (líquido y sólido) - M-3P (líquido y sólido) - CC (líquido y sólido) - Promueve el crecimiento de bacterias de la piedra que precipitan carbonato cálcico a partir de aminoácidos - Evita la formación de ácidos - A mayor pH, mayor consolidación - La alcalinidad producida limita el crecimiento de hongos - Se consolida la piedra Consolidation of ornamental stone by microbial carbonatogenesis 2010 Calcarenita bioplástica - Blanco - Sin inocular - M.xanthus M-3P - Mayor dureza superficial con respecto a la piedra sin tratar - No se producen variaciones de color - Se aumenta la población bacteriana y el porcentaje de ellas que son carbonatogénicas, en concreto, proteobacterias - Se activan bacterias que precipitan el carbonato independientemente de la presencia de sales - No se hallan bacterias peligrosas - Buen método para su aplicación in situ Influence of pore structure on the effectiveness of a biogenic carbonate surface treatment for limestone conservation 2011 Calizas menos porosas (Massangis, Euville y Aubigny) y calizas más porosas (Savonnières y Avesnes) B. sphaericus Levadura + Urea - Mayor producción de carbonato biogénico en las piedras con mayor número de poros - Menor absorción del agua en piedras con mayor número de poros debido a la mayor formación de cristales en ellos Tabla 13: Resumen de los ensayos de biomineralización 71 4.4 ÚLTIMOS AVANCES Los ensayos estudiados anteriormente se centran en dos modos de aplicación de la técnica: la inoculación de bacterias externas a la piedra junto a un medio de cultivo favorable para su desarrollo y la inyección de un medio de cultivo estéril que propicie el crecimiento de la comunidad bacteriana autóctona en la piedra a tartar. Sin embargo, estos dos métodos presentan rendimientos limitados cuando se aplican en situaciones de alta erosión por sal. Se sabe que la meteorización por sal es altamente perjudicial y suele suponer un taponamiento parcial de los poros debido a las sales solubles, que además puede inhibir la proliferación de bacterias carbonatogénicas. Como solución, recientemente se propuso un nuevo modo de aplicación de esta técnica: se extrajeron muestras de una piedra dañada por el ataque de sales y se llevaron a un laboratorio donde se introdujeron en un medio de cultivo. Transcurridas 24 horas, se habían incubado una gran población de bacterias autóctonas de la propia piedra, que posteriormente se aplicó sobre la pieza original in situ. Los resultados obtenidos fueron mejores, en el caso de piezas con este tipo de ataques, que con los dos métodos de aplicación anteriores. Sorprendentemente, tal tratamiento ayuda a reducir la cantidad de microorganismos nocivos implicados en el biodeterioro, probablemente porque están en desventaja competitiva con las bacterias carbonatógenas activadas selectivamente por el tratamiento. Esto es de gran interés, ya que implica que el tratamiento de conservación bacteriana no solo ayuda a proteger y consolidar el sustrato tratado, sino que también reduce los posibles procesos de biodeterioro microbiano. La facilidad de aplicación del segundo método lo lleva a ser el más funcional en la mayoría de los casos. Sin embargo, este tercer método sería el recomendable para aquellas situaciones de alto ataque salino. La limitación de estos dos métodos radica en la necesidad de presencia de bacterias autóctonas en la piedra, aunque los estudios han demostrado que en casi todos los sustratos en la superficie de la Tierra existen bacterias carbonatogénicas (Jroundi, Gonzalez-Muñoz, & Rodriguez-Navarro, 2021). 4.5 VENTAJAS E INCONVENIENTES El método de biomineralización presenta un gran número de ventajas, aunque también algunos inconvenientes, que se detallan a continuación (Hansen, Doehme, Fidler, et al., 2003): Ventajas: • Compatible ambiental y físicamente con piedra caliza y yeso. • Menor impacto ambiental por escasa utilización de sustancias contaminantes y la reducción de gasto energético (Flores, 2015). • Económicamente más rentable (Flores, 2015). • Reduce la permeabilidad al agua de la piedra mientras mantiene su transpiración para permitir el intercambio de gases (González-Muñoz, 2008). • Mejora la química de la precipitación aprovechando el proceso biológico. • Forma un calcio coherente, bien cementado y una estructura de carbonato fuertemente adherida al sustrato. • Mediante la utilización de las bacterias y los medios de cultivo apropiados se pueden personalizar el tipo de cemento y la textura. • No altera el color de la piedra ni tapa los poros naturales (González-Muñoz, 2008). Desventajas: • Funciona mejor en piedra recién limpiada. • Limitada profundidad de penetración. 72 • Puede promover más tipos de crecimiento biológico en superficies. 4.6 INVESTIGADORES Y PROYECTOS EUROPEOS Exista un gran número de investigadores y equipos de investigación que trabajan en el desarrollo de esta técnica de una u otra manera, alguno de ellos, en el marco de una serie de proyectos europeos. Dentro de estos proyectos se han destacado los siguientes (González-Muñoz, 2008): • Equipo de investigación de Adolphe, Castanier, Loubière, Le Métayer-Levrel y colaboradores (grupo francés). • Research team of González-Muñoz and Rodríguez-Gallego (group of the Universidad de Granada, Spain). • Group of Verstraete (Ghent University, Bélgica). • Group of Bang (Escuela de Minas y Tecnología de Dakota del Sur, EE. UU.). • Proyecto BIOBRUSH (http://www.heritage.xtd.pl/pdf/Bio_3_May.pdf), coordinador Eric (Universidad de Portsmouth, Reino Unido). En el marco de este proyecto, el grupo de Claudia Sorlini (Università degli Studi di Milano, Italia). • Proyecto BIOREINFORCE http://www.ub.es/rpat/bioreinforce/bi oreinforce.htm), coordinador Piero norte Tirano (Instituto para la Conservación y Valorización del Patrimonio Cultural, G Sesto Fiorentino, Italia). En el marco de este proyecto, el grupo de Brunella Perito y Giorgio Mastromei th (Universidad de Florencia, Italia). Una empresa privada española con la que ha sido posible contactar y que utiliza este método para la restauración y conservación de la piedra en monumentos es K-BYO Biological (K-BYO Biological, 2021). Esta empresa granadina trabaja con un producto llamado Myxostone M3P, una solución acuosa de componentes orgánicos e inorgánicos que actúa como medio de cultivo natural, sin aditivos ni conservantes, totalmente ecológico que sirve de alimento para la bacteria Myxococcus xanthus. Es interesante destacar que el producto es solo el medio, pero no contiene ninguna bacteria; las bacterias que se reproducirán y llevarán a cabo la biomineralización son únicamente las autóctonas que ya se encuentren en la propia piedra. Este cultivo es el resultado de investigaciones llevadas a cabo por la Universidad de Granada durante más de 20 años. Este producto es aplicable a cualquier tipo de roca (calcárea porosa alterada, calcárea porosa de cantera, morteros tradicionales de cal y bastardos, morteros a base de cemento Portland, piedra arenisca, etc.) siempre que exista población de estas bacterias carbonatogénicas. También se ha demostrado su efectividad en mármol, en yesos y, gracias a unos ensayos recientes, también en tapiales. Su uso es más eficaz en piedras con alta porosidad, ya que estos poros facilitan la expansión de la población bacteriana. Para piedra calcárea porosa, las condiciones óptimas de porosidad se darían en un rango de entre 10 y 35%, mientas que para un mortero tradicional a base de cal sería entre 15 y 40%. A la hora de aplicar el producto, se debe llevar a cabo un estudio previo para asegurar la presencia de bacterias carbonatogénicas. La superficie a tratar debe estar limpia y si la piedra contiene sales hay que eliminarlas, ya que la sal ocupa los huecos y los cristales formados en la mineralización de las bacterias no se unen entre sí y no forman una estructura sólida. Si en el proceso de limpieza de la piedra se utilizan biocidas, deberá esperarse 3 meses antes de proceder a la aplicación de Myxostone M3P, para permitir la regeneración natural de la microbiota. 73 El producto se debe aplicar mediante un atomizador o spray sobre la superficie de la piedra cada 12 horas (2 veces al día normalmente, o las necesarias para mantener la piedra saturada) a lo largo de un periodo de entre 7 y 10 días. A los 5 o 6 días comienza a verse los nuevos cristales de carbonato cálcico. Si se aplica a piezas pequeñas o en condiciones de laboratorio, se sugiere proceder de la misma forma que para en grandes superficies o in situ. Aunque no se han descrito efectos nocivos en contacto con la piel, se recomienda el uso de un equipo de seguridad adecuado (guantes, mascarilla, ropa protectora, etc) El rango óptimo de temperatura y humedad es de 18 a 22ºC y de 50 a 80% respectivamente. Además, exponer la zona tratada durante el tratamiento a radiación sola u otras fuentes luminosas podría causar que el producto no funcionara. Algunas bacterias producen un pigmento anaranjado para protegerse de los rayos ultravioletas, lo que produce un indeseable cambio estético en la piedra. Para mantener las condiciones ambientales que se indican anteriormente, es importante realizar un encapsulado de la zona, donde, además, mantener una concentración de CO2 estable. El Myxostone M3P ha sido utilizado en diferentes monumentos de interés como en las columnas de mármol del Patio de los Leones de la Alhambra de Granada (España), el Alcázar de Córdoba (España), la Basílica de Fátima en Ourém (Portugal), el Palacio da Pena en Sintra (Portugal), o en el pilar de la fuente del Palacio de Carlos V de la Alhambra de Granada (España). De este último, se exponen a continuación imágenes comparativas entre antes y después de la aplicación del tratamiento: Ilustración 27: Muestra de los efectos del tratamiento Myxostone M3P sobre calcarenita bioclástica de un pilar de la fuente del Palacio de Carlos V en la Alhambra de Granada. Lupa de 800 aumentos (KBYOBIOLOGICAL, 2021). 80 Índice de tablas Tabla 1: Características de los consolidantes (Villegas, 1989) ............................................................. 15 Tabla 2: Productos comerciales utilizados en Europa como consolidantes (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997, p. 81) ........................................................................................................................... 19 Tabla 3: Resultados de pruebas de color (coordenadas CIE) en probetas de Guadix (Villegas, 2003, p. 198) ....................................................................................................................................................... 31 Tabla 4: Valores de consumo y materia seca de los diferentes tratamientos aplicados sobre la calcarenita de Snata Pudia y valores de porosidad total obtenidos mediante MIP (Illescas Salinas, 2012, p. 205) ......................................................................................................................................... 33 Tabla 5: Bioprotectores de los monumentos patrimoniales (Dakal & Cameotra, 2012) ...................... 49 Tabla 6: Producción de cristales de carbonato de calcio a lo largo del tiempo por aislamientos de experimentos que contienen calcarenita no estéril sumergida en medios de cultivo estériles M-3 y M- 3P .......................................................................................................................................................... 56 Tabla 7: Producción de cristales de carbonato de calcio a lo largo del tiempo por aislamientos de experimentos que contienen calcarenita no estéril sumergida en medios de cultivo M-3 y M-3P inoculados con M.xanthus .................................................................................................................... 56 Tabla 8: Disminución de peso (g/m2) tras la prueba de cinta Peeling sobre la piedra tratada. Apse es el “Ábside” y Gate la “Puerta”. ................................................................................................................ 60 Tabla 9: Recuento de colonias bacterianas (ufc/ml) y % de bacterias carbonatogénicas en el “Ábside”. A) Tratada con M.xanthus + M-3P; B) Tratada únicamente con M-3P ................................................ 61 Tabla 10: Recuento de colonias bacterianas (ufc/ml) y % de bacterias carbonatogénicas en la “Puerta”. A) Tratada con M.xanthus + M-3P; B) Tratada únicamente con M-3P. A1,B1) Inoculadas en medio sólido M3-P; A2,B2) Inoculadas en medio sólido MH (para muestras de las áreas salinas) ................ 61 Tabla 11: Porcentaje de bacterias productoras de ácido (cultivadas en medio suplementado con glucosa) ................................................................................................................................................. 61 Tabla 12: Aumento de peso de las piedras calizas y valores de pH para diferentes tipos de tratamientos de biodeposición. .................................................................................................................................. 64 Tabla 13: Resumen de los ensayos de biomineralización .................................................................... 70 81 82 Índice de ecuaciones Ecuación 1: Formación de carbonato a partir de hidróxido de calcio (Esbert, Ordaz, Alonso, & Montoro, 1997, p. 78) ........................................................................................................................... 16 Ecuación 2: Formación de carbonato a partir de hidróxido de bario .................................................... 17 Ecuación 3: Hidrólisis del grupo alcoxi ................................................................................................ 17 Ecuación 4: Polimerización de los consolidantes organosilícicos ........................................................ 18 Ecuación 5: Hidrólisis de los silicatos .................................................................................................. 22 Ecuación 6: Porosidad abierta: .............................................................................................................. 32 Ecuación 7: Densidad aparente: ............................................................................................................ 32 Ecuación 8: Contenido de agua a saturación: ....................................................................................... 32 Ecuación 9: Cantidad de agua absorvida .............................................................................................. 36 Ecuación 10: Coeficiente de saturación ................................................................................................ 36 Ecuación 11: Ley de Javin para el cálculo de la altura de ascenso capilar: .......................................... 36 Ecuación 12: Cantidad de agua absorbida por capilaridad: .................................................................. 36 Ecuación 13: Variación de peso por capilaridad: .................................................................................. 37 Ecuación 14: Ángulo de contacto de gota: ............................................................................................ 38 Ecuación 15: Calculo de la impedancia ................................................................................................ 40 Ecuación 16: Velocidad de propagación de los impulsos ultrasónicos:................................................ 40 Ecuación 17: Desgaste lineal por abrasión: .......................................................................................... 41 Ecuación 18: Hidrólisis de la urea 1: .................................................................................................... 51 Ecuación 19: Hidrólisis de la urea 2: .................................................................................................... 51 Ecuación 20: Formación de carbonato a partir de ácido carbónico: ..................................................... 51 Ecuación 21: Formación de aniones de hidróxido que elevan el pH del medio: .................................. 51 Ecuación 22: Formación de carbonato de calcio a partir de carbonato. (Ksp es la constante del producto de solubilidad): ...................................................................................................................... 52 Ecuación 23: Captación del ion de calcio por la bacteria: .................................................................... 53 Ecuación 24: Formación del carbonato y cloruro amónico: ................................................................. 53 Ecuación 25: Formación de carbonato de calcio en la superficie de la célula: ..................................... 53 83 84 Referencias Bäuerlein, E. (2003). Biomineralization of unicellular organisms: an unusual membrane biochemistry for the production of inorganic nano- and microstructures. Becerra, J., Zaderenko, A. P., & Ortiz, P. (2019). Basic Protocol for On-Site Testing Consolidant Nanoparticles on Stone Cultural Heritage. NDPI. Biological, K.-B. (2021). Guía de Aplicación Myxostone M3P. Clifton, J. (1980). Stone Consolidating Materials: A Status Report. 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