Complejo de reconocimiento de origen en la replicación de eucariotas

Complejo de reconocimiento de origen en la replicación de eucariotas Universidad de Sevilla, Facultad de Farmacia María Belén Rodríguez Campuzano Trabajo Fin de Grado de carácter bibliográfico Grado en Farmacia Complejo de reconocimiento de origen en la replicación de eucariotas Autora: María Belén Rodríguez Campuzano Tutor: Martiniano Santiago Pavón Universidad de Sevilla, Facultad de Farmacia Departamento de Bioquímica Sevilla, junio 2021 1 RESUMEN La replicación del ADN durante el ciclo celular inicia con la licencia de replicación a través del reconocimiento por el Complejo de reconocimiento del origen de secuencias de inicio dentro del genoma denominadas orígenes, para proceder al ensamblaje de la maquinaria de replicación. Los organismos procariotas requieren de un único origen OriC, el cual es una secuencia reconocida y estructurada de ubicación única. Mientras que en el caso de los eucariotas son necesarios miles de orígenes dispersos a lo largo del cromosoma para asegurar la replicación en un marco de tiempo. La falta de conocimientos sobre estas secuencias de nucleótidos plantea interrogantes sobre los iniciadores implicados en su reconocimiento para la replicación, y en consecuencia responsables del inicio y control de la replicación en cada ciclo celular, lo que llevar a exponer enzimas útiles como diana en el desarrollo de fármacos con fines diagnósticos y terapéuticos. La participación de ORC en otros procesos celulares no replicativos, explica su papel regulador fundamental no solo en el ciclo celular, sino también como coordinador de la síntesis del ADN y el ciclo celular. En consecuencia, alteraciones en el mismo pueden poner en riesgo la transmisión exacta e idónea del material genético durante la replicación, conduciendo a una inestabilidad genómica determinante de enfermedades como el cáncer, diabetes… Enfermedades genéticas como el síndrome de Meier-Gorlin son resultado de mutaciones en ORC que provocan una alteración en su función, o bien síntomas que son provocados por patógenos que utilizan el ORC del huésped para su propia replicación. PALABRAS CLAVE: Ciclo celular, origen de reconocimiento, replicación, helicasa, funciones no replicativas, mutación. 2 ABSTRACT: DNA replication during the cell cycle begins with the replication license through the recognition by the Origin Recognition Complex (ORC) of start sequences within the genome called origins, to proceed with the assembly of the replication machinery. Prokaryotic organisms require a single OriC origin, which is a recognized and structured sequence of unique location. While in the case of eukaryotes, thousands of origins scattered throughout the chromosome are necessary to ensure replication in a time frame. The lack of knowledge about these nucleotide sequences raises questions about the primers involved in their recognition for replication, and consequently responsible for the initiation and control of replication in each cell cycle, which leads to exposing useful enzymes as a target in development. of drugs for diagnostic and therapeutic purposes. The participation of ORC in other non-replicative cellular processes explains it is fundamental regulatory role not only in the cell cycle, but also as a coordinator of DNA synthesis and the cell cycle. Consequently, alterations in it can put at risk the exact and suitable transmission of genetic material during replication, leading to a determining genomic instability of diseases such as cancer, diabetes... Genetic diseases such as Meier-Gorlin syndrome are the result of mutations in ORC that cause an alteration in his function, or symptoms that are caused by pathogens that use the host's ORC for their own replication. KEYWORDS: Cell cycle, origin of recognition, replication, helicase, non-replicative functions, mutation. 3 ÍNDICE Resumen…………………………………………………………………………………………………………1 Palabras clave…………………………………………………………………………………………………1 Abreviaturas……………………………………………………………………………………………………4 1. Introducción………………………………………………………………………………………………6 2. Objetivos…………………………………………………………………………………………………..10 3. Metodología…………………………………………………………………………………………..…10 4. Resultados y discusión………………………………………………………………………………11 4.1 Orígenes de replicación……………………………………………………………………….11 4.1.1 ORC………………………………………………………………………………12 4.2 Formación del complejo replicativo……………………………………………………13 4.3 Proceso de replicación celular…………………………………………………………….18 4.4 Funciones no replicativas de ORC………………………………………………………..20 4.5 Enfermedades relacionadas con ORC……………………………….…………………23 5. Conclusiones……………………………………………………………………………..……………..27 6. Bibliografía………………………………………………………………………………………………..28 4 ABREVIATURAS Cdc10: Cell division control 10. Cdc45: Cell division cycle 45. Cdc6: Cell division cycle 6. CDK: Cyclin-dependent kinase. Cdt1: Chromatin licensing and DNA replication factor 1. CMG: Cdc45:MCM2-7:GINS CKI: Proteínas inhibidoras de quinasas dependientes de ciclinas. CTD: Dominio C-terminal. Ctf4: Chromosome Transmission Fidelity 4. EBNA1: Epsteins-Barr nuclear antigen 1. FEN1: Flap Structure-Specific Endonuclease 1. FPM: factor promotor de la maduración. G1: Fase GAP 1. G2: Fase GAP 2. GINS: Go-Ichi-Ni-San. GTPasa: Guanosina trifosfatasa. HP1: Heterochromatin protein 1. H2i: Helix 2 insert. S: Fase de síntesis. M: Fase de mitosis. MAPK: Cascada de proteínas quinasas activadas por agente mitógenos. MCM2-7: Minichromosome maintenance protein 2-7. NTD: Dominio N-terminal. OB: Pliegue de unión de oligonucleótidos. ORC: Complejo de reconocimiento del origen de replicación. PCNA: Proliferating cell nuclear antigen. PS1: Pre-sensor 1 β-hairpin. RF: Motivo dedo de arginina. RFC: Replication factor C. RPA: Replication protein A. SIR: Silent information regulation. 5 Skp2: Proteína quinasa 2 asociada a la fase S. Sld (2/3): Synthetically Lethal with Dpb11-1. SIR: Silent information regulation. VEB: Virus Epstein-Barr. WA/WB: Motivo Walker A/B. ZF: Motivo de unión a Zinc N-terminal. 6 1. INTRODUCCIÓN En la conservación de especies y el desarrollo celular de organismos de todos los reinos, es fundamental la duplicación del ADN (ácido desoxirribonucleico) durante el ciclo celular, para la transmisión fiel de la información genética a las dos células hijas resultantes de la división celular. El ciclo celular tiene como función la formación completa de una nueva célula, asegurando que el proceso se realice de forma adecuada y regulada (Lomanto et al., 2003). En el caso de organismos multicelulares son necesarios múltiples secuencias de divisiones celulares para crear un nuevo individuo, o bien para sustituir las células alteradas o muertas. Durante el ciclo celular, la célula aumenta su tamaño, sus componentes intracelulares, duplica su material genético y se divide. Este se organiza en una serie de etapas: una fase de síntesis (S), una fase de segregación mitótica (M) y dos fases intermedias (G1 y G2). Las fases G1, S y G2 corresponden a la interfase, donde la célula crece, duplica su ADN cromosómico y prepara los orgánulos para pasar una copia completa del genoma a cada una de las dos células hijas. Y una vez alcanza la fase M, que se divide en profase, prometafase, metafase, anafase, telofase y citocinesis (Fig. 1), se completa la segregación de los cromosomas y la división celular (citoquinesis), formando las células hijas, preparadas para comenzar su respectivo ciclo celular (Schafer, 1998). Durante la fase G1 la célula se prepara para la replicación del ADN mediante acumulación del ATP requerido, aumento de material enzimático y, otras moléculas y estructuras citoplasmáticas. La progresión de la fase G1 está regulada por un “punto de restricción”, que la divide en una fase temprana y una fase tardía, los factores determinantes en este punto son una combinación de factores intrínsecos (tasa de síntesis de proteínas) y factores extrínsecos como las señales mitógenicas (factores de crecimiento, etc.) (Zetterberg et al., 1995). Los factores mitógenos actúan por unión a receptores de membrana que activan por fosforilación a la proteína G monomérica Ras, lo que a su vez provoca la cascada de fosforilaciones de las proteínas MAPK (quinasas activadas por mitógenos) que ocasiona la transcripción de genes tales como las ciclinas partícipes de G1 (Lomanto et al., 2003). Sin embargo, la ausencia de estos factores intrínsecos y extrínsecos provoca que la célula entre en un estado de reposo denominado fase G0, entrando en un estado de latencia dentro del ciclo celular que puede durar días, semanas o años, e incluso en ocasiones puede que para nunca volver a dividirse. 13 Hay que señalar que Orc6 no tiene ninguna similitud estructural con el resto de subunidades Orc, pero sí presenta una semejanza estructural con el factor de transcripción TFIIB (Liu et al., 2011). Orc6 se une a Orc1-5 en la fase G1/M y se disocia de ellos durante la fase S. Dentro de Orc6 se ha encontrado una mutación de su α hélice en el C-terminal causante del síndrome de Meier-Gorlin, enfermedad que causa enanismo primordial en humanos y que es descrita en este trabajo posteriormente (Bicknell et al., 2011). Existe una relación clara entre ORC y el tiempo de replicación, en el caso del ORC de Sacharomyces cerevisiae se puede dividir, en función del tiempo de replicación, en sitios de replicación temprana y sitios de replicación tardía (Popova et al., 2018). Lo que puede relacionarse con la constante de disociación de ORC, los sitios de replicación tardía presentan una constante de disociación baja, mientras que una constante de disociación alta corresponde a los sitios de replicación temprana. La preferencia de ORC por cadenas de cromatina abierta y de mayor número en sitios de unión explica la relación entre la replicación temprana y las regiones de eucromatina, en comparación con las regiones de heterocromatina donde la replicación suele ser tardía. 4.2 FORMACIÓN DEL COMPLEJO REPLICATIVO. Continuando con la formación del complejo pre-replicativo (pre-RC), durante la fase M del ciclo celular, se procede a la unión dependiente de ATP de un factor adicional, denominado Cdc6, este factor se une al ORC unido a cromatina lo que provoca una reorientación en el dominio N-terminal de Orc1. Además, esta unión aumenta la especificidad de la interacción entre ORC y el origen de replicación. Cdc6 está compuesto de 4 proteínas de unión a ATP (transportadores ABC), las cuales, presentan una estrecha homología con las subunidades AAA+ de Orc1. Esta unión tiene lugar a través de una interacción directa con Orc1, donde el C- terminal de Cdc6 se disponte entre las subunidades Orc1 y Orc2 (Fig. 4). La presencia de Cdc6 y ATP, provoca que la forma de media luna se transforme en un anillo cerrado con una gran cavidad central (Sun et al., 2012) 14 Figura 4. Esquema de la disposición de Cdc6 unido a ORC, donde se puede observar como llena el espacio entre las subunidades Orc1 y Orc2. (Sun et al., 2017) La función de ORC/Cdc6 es cargar el complejo de mantenimiento de minicromosomas 2-7 (MCM2-7) que constituye el núcleo de la helicasa replicativa y, el cual, se encuentra unido, a su vez, a la proteína de transcripción 1 (Cdt1) dependiente de Cdc10, formando el complejo OCCM (Fig. 5). La hidrólisis del ATP por acción de Cdc6 promueve la unión de Cdt1 al origen por medio de una interacción con Orc6, lo que promueve la carga de la helicasa MCM2-7 en la cromatina. Este Cdt1, por unión al extremo N-terminal de las subunidades Mcm2, Mcm4 y Mcm6, contribuye a la remodelación del complejo MCM2-7, este contacto permite ensanchar la puerta Mcm2/5 para su unión a la cromatina y el cierre posterior del anillo. El heptámero Cdt1-MCM2-7 está unido de forma que el extremo C-terminal de las subunidades MCM2-7 se asocia al dominio WH de ORC, dejando accesible el extremo N-terminal. Este MCM2-7 forma sitios de unión de ATP en las interfaces de sus subunidades para utilizar la energía de la hidrólisis de ATP en la fusión del ADN bicatenario y conducir las hebras monocaterias a través del canal central del anillo Mcm2-7 (Kumar y Remus, 2016). ORC también es encargado de inducir la flexión del ADN para su entrada por la puerta Mcm2/5. Figura 5. Mecanismo de carga de Cdt1-MCM2-7 en el ADN de doble cadena. Se muestra un nivel inferior compuesto de Cdt1-MCM2-7 y un nivel superior con ORC-Cdc6 (Sun et al., 2017). 15 Dentro de cada subunidad Mcm se disponen una ATPasa central flanqueada por un dominio N- terminal y un dominio C-terminal, conocidos como “NTD” y “CTD”, respectivamente (Fig.4). El conjunto presenta una disposición en espiral con un espacio en la interfaz Mcm2/Mcm5, en la cual se inserta el ADN de doble cadena, quedando el anillo parcialmente cerrado alrededor del mismo. Dentro del dominio NTD existen tres subdominios conservados, en el que se distinguen las regiones NTD-A, -B y –C (Figura 6) (Li et al., 2015). El dominio NTD-A forma un paquete en forma de hélice helicoidal similar a las proteínas de unión al ADN. En el caso del subdominio NTD-B, a través de sus dedos de Zinc, es responsable de la estabilidad del hexámero MCM2-7. El tercer dominio NTD-C presenta un pliegue de unión a oligonucleótidos (OB) que participa, a través de interacciones hidrofóbicas, en los contactos con el ADN, así como en la oligomerización de MCM2-7 en la estructura hexamérica, terminando en la horquilla N- terminal (NtHp). El dominio C-terminal (CTD) supone el motor de la helicasa, donde se diferencia la región WA, los bucles de la horquilla β (H2i), la región WB, el presensor 1 de unión al ADN (PS1) y un dedo de arginina (RF). Ambos dominios pueden incluir extensiones para múltiples uniones a diversas proteínas que participan en la replicación. La interacción de MCM2-7 con el ADN tiene lugar a través de la inserción de la horquilla β que facilita el contacto de la proteína ATPasa con el ADN para su actividad posterior. Figura 6. Estructura de los dominios de la proteína Mcm, en cuyo extremo N-terminal se encuentran los dominios NTD –A, -B y –C donde se encuentran el pliegue de unión de oligonucleótidos (OB), la horquilla de Zinc (ZF) y la horquilla N-terminal. Seguido del extremo C-terminal que constituye el motor de la helicasa con el dominio de unión Walker A (WA) a ATP, Walker B (WB) y el dedo de argininina (RF). Entre las interfaces de los dominios Walker se encuentran el presensor 1 de unión al ADN (PS1) y los bucles de inserción de la horquilla β en la hélice (H2i). (Riera et al.,2017) Aunque MCM2-7 constituye el núcleo de la helicasa, por sí solo no es capaz de cumplir su función, y a través de su unión con diferentes factores forma los complejos OCCM → OCM → DH → CMG que acaban formando el replisoma. La salida de Cdc6 y Cdt1 de OCCM, impulsada por la hidrólisis de ATP, se asocia con el cierre del primer anillo MCM2-7 (Ticau et al., 2017). La unión de un nuevo Cdc6 al complejo ORC-MCM2-7 supone un intermedio transitorio (complejo 16 OCM) para el reclutamiento del segundo heptámero Cdt1-MCM2-7, también impulsado por la hidrólisis de ATP. En el OCCM el ADN de doble cadena ya está dentro del canal central de MCM2-7, aunque esta entrada queda todavía parcialmente abierta entre Mcm2 y Mcm5. La liberación del segundo Cdc6 seguida de ORC provoca el cierre del segundo anillo MCM2-7 alrededor del ADN, dando como resultado un complejo estable (Complejo de pre-replicación o MCM2-7 DH). Cdc6 funciona como un factor de control de calidad, cuya actividad ATPasa asegura que los complejos MCM2-7 defectuosos o incompletos sean eliminados de los orígenes de replicación (Kang y Warner, 2014). El complejo MCM2-7 DH carece de capacidad de hidrolizar el ATP y de desenrollar el ADN, pero sí tiene la capacidad de deslizarse por la cadena de ADN hasta sitios que no contienen el origen de replicación. Esto es debido a que la puerta Mcm2/5 se encuentra bloqueada hasta su activación durante la transición G1/S (Riera et al., 2017). Una vez situados, los hexámeros MCM sufren una inclinación visible o giro entre los dominios NTD y CTD mediados por sus dedos de Zinc (ZF), para que estos puedan interaccionar cara a cara y formar el hexámero doble. La carga de múltiples DH en muchos orígenes de replicación es una forma de almacenar grandes cantidades de la helicasa replicativa inactiva antes de que tenga lugar la síntesis de ADN (Alver et al., 2014). Estos hexámeros MCM2-7 DH constituyen el núcleo de la helicasa en estado inactivo, no es hasta la fase S del ciclo celular, cuando se desencadena un aumento de los niveles de la proteína quinasa DDK dependiente de Dbf4 y de la quinasa dependiente de cicilina (CDK). De esta forma el doble hexámero MCM2-7 actúa como plataforma objetivo de DDK para fosforilar las subunidades Mcm2, Mcm4 y Mcm6 permitiendo la unión lateral de cada hexámero MCM2- 7 con una copia del ciclo de división celular (Cdc45) y el complejo tetramérico go-ichi-ni-sa (GINS) para formar dos organizaciones de once proteínas denominadas CMG (Fig.7) que constituyen la forma activa de la helicasa. La DDK se forma por unión de la quinasa Cdc7 con el cofactor Dbf4, bloqueando la actividad autoinhibidora de Cdc7. La acción reguladora de la quinasa dependiente de ciclina, no solo es importante en la licencia de origen de replicación y en la activación del complejo DH, también resulta fundamental para evitar el inicio de un nuevo ciclo de replicación tras la síntesis del ADN, a través de la fosforilación de las subunidades ORC, CDC6 y Cdt1. Conduciendo a la degradación o exclusión de estos, evitando la concesión de nuevas licencias de replicación. Cdt1 también es regulado por la proteína Geminin (GMNN) que actúa impidiendo la unión de Cdt1 con MCM2-7. 17 Figura 7. Cambios estructurales desde el complejo OCCM donde tiene lugar la unión del primer MCM2- 7, seguido de la asociación del segundo MCM2-7 cara a cara para formar el complejo DH inactivo. Por último, la activación del mismo a través el tetrámero GINS y Cdc45. (Riera y Barbon, 2017) A medida que las células avanzan en la fase S, para completar la formación del complejo CMG, se ensamblan el resto de factores de activación, tales como la Proteína A de replicación (RPA), la subunidad MCM10 para la separación de las dos helicasas de CMG, la Polimerasa  o primasa, la Polimerasa épsilon (Pol ε) que actúa sobre la hebra principal, la Polimerasa delta (Pol δ) responsable de la hebra rezagada y el factor CTF4. Pol-ε es un complejo de cuatro proteínas compuesto por una subunidad catalítica Pol2, que se asocia al extremo C-terminal de CMG través del trímero CTF4 y cuyas subunidades se encuentran entrecruzadas con Mcm2, Mcm5 y Mcm6 (Sun et al., 2017). En esta nueva agrupación, tiene lugar una reordenación del extremo NTD de la mitad de los anillos Mcm (3,5 y 2), los cuales, se giran hacia la izquierda y las restantes hacia la derecha, lo que reconfiguraría el canal central de la helicasa (Riera et al., 2017). El reclutamiento de estos factores también está regulado por acción de la quinasa CDK, mediante la fosforilación de la subunidad Mcm2, provoca la apertura del anillo CMG y debilita la unión Mcm2/5 para facilitar el paso de la doble cadena de ADN. La fosforilación dependiente de DDK de MCM2-7 es importante para facilitar el reclutamiento de los factores Sld3 y Sld2, que forman el complejo DPB11 necesario para estabilizar la unión de Cdc45 a MCM2-7 (Masai et al., 2006). El complejo CMG presenta dos confórmeros distintos según la organización de sus subunidades, mediante la transición de un estado inactivo a un estado relajado/activo a partir de la interacción de los dominios NTD con los factores GINS y Cdc45, acoplado al reordenamiento traslacional y rotacional de las subunidades Mcm6 y Mcm4 del anillo resultado de la alteración de la puerta Mcm2/5. 18 En cada origen, se cargan uno o más MCM2-7, pero solo una minoría se transforma en CMG activos durante la fase S; quedando los restantes como “orígenes latentes”, que se activan solo si una bifurcación de replicación proximal se convierte en terminal. 4.3 PROCESO DE REPLICACIÓN CELULAR. Tanto Cdc45 como el complejo GINS son coactivadores de la helicasa, cuya unión completa su activación. De forma que el movimiento de CMG a través de su extremo N-terminal a lo largo de la doble cadena de ADN en sentido 3´-5´provoca la separación de las cadenas utilizando la energía de hidrólisis de ATP procedente de las interfaces Mcm3/5 y Mcm5/2. De esta forma sufre un cambio conformacional en el que cada complejo CMG rodea una hebra de ADN monocatenario, excluyendo la plantilla de la hebra retrasada fuera de la estructura. Son los dominios WH de Mcm5 y Mcm6, mediante reordenamiento, los responsables de la constricción del poro donde se encuentra el ADN de doble cadena hasta quedar en un tamaño tan pequeño donde es imposible albergarlo. En la replicación de las cadenas monocatenarias, las ADN polimerasas catalizan en sentido 3ᶦ-5ᶦ el enlace fosfodiéster entre el grupo hidroxilo 3ᶦ de la hebra y el grupo fosfato 5ᶦ del nuevo nucleótido. Una vez excluida estéricamente la cadena rezagada hacia la superficie externa de MCM, es rodeada de la proteína de replicación A (RPA) y lista para que la Pol α pueda colocar el cebado. El complejo polimerasa primasa α se une a través del factor Ctf4 que actúa como puente, unido al extremo N-terminal de GINS. Este complejo con actividad ARN primasa y ADN polimerasa completa la síntesis de 7-10 nucleótidos de ARN seguidos de 10-12 nucleótidos de ADN antes de que ocurra el cambio de polimerasas (Kumar, 2016) (Fig. 8). En el caso de la hebra principal, esta pasa a través de un canal cargado positivamente donde establece interacción con el bucle H2i de Mcm2/3/5/6 para proceder a la acción de Pol-ε a través de su dominio N-terminal en sentido 3´-5´. Tras esto la puerta de entrada de ADN en Mcm2/5 es bloqueada por GINS y Cdc45, quedando totalmente cerrada. La estructura antiparalela del ADN de doble cadena, provoca que una de las hebras se sintetice en la misma dirección que la horquilla, siendo el caso de la hebra principal. Mientras que la hebra rezagada crece en dirección contraria a la horquilla en fragmentos cortos que posteriormente se procesan y se ligan. 19 Figura 8. Arquitectura del replisoma con posibles rutas de las cadenas de ADN, donde la hebra principal recorre el interior del complejo con interacciones con las subunidades Mcm, mientras que los enlaces de la hebra retrasada tienen lugar en la superficie N-terminal (Hedglin y Benkovic, 2017). La replicación de la hebra rezagada consta de varias fases: cebado inicial por acción de ADN primasa, alargamiento en sentido 5´→3´del cebador ARN por la Pol α, cambio de Pol α a Pol δ, alargamiento del fragmento de Okazaki (100-200 nucleótidos) por Pol δ y maduración a través de Pol δ, FEN1 y ADN ligasa. La presencia de la Pol δ tras la actividad de la Pol α se debe a su limitada progresión en plantillas largas y su carente actividad exonucleasa 3´→5’ para corregir los errores, por lo que resulta fundamental la participación exonucleasa de Pol δ en la corrección. Una vez completada la actividad Polα es inhibida por medio de su disociación a partir del factor RPA en un proceso dependiente de ATP, para proceder al ensamblaje del antígeno nuclear celular en proliferación (PCNA) en el extremo del cebador. Su asociación en la unión cebador-fragmento de Okazaki es catalizada por las enzimas del factor de replicación C (RFC) a partir de la energía de hidrólisis del ATP. Se carga un anillo de PCNA en cada fragmento de Okazaki de la hebra rezagada, mientras que se utiliza un único anillo PCNA en la hebra principal (Hedglin y Benkovic, 2017). La interacción de PCNA y Pol δ forma una abrazadera deslizante con una cavidad central lo suficientemente grande como para albergar el ADN bicatenario de nueva síntesis, esto continúa 1-2 nucleótidos adicionales en el extremo 5´ con el fin de eliminar los cebadores iniciales a través de la actividad 3´→ 5’ exonucleasa del complejo FEN1 y Pol δ (Burgers, 2009). Una vez degradado todo el ARN, la ADN ligasa es responsable de la unión ADN-ADN. Dentro del segmento de 20 nucleótidos sintetizados suponen zona crítica de posible mutación, resultando imprescindible la acción de la Pol δ en la corrección de los errores que tengan lugar en la misma. 20 En el caso de la hebra principal la síntesis en forma continua es mediada únicamente por acción de Pol-ε. La replicación de cada hebra continúa de forma independiente hasta que las horquillas se acercan demasiado entre sí hasta su encuentro donde no se produce un estancamiento de horquillas, sino que los complejos CMG se desvían entre sí liberándose del ADN a través de un mecanismo de poliubiquitinación de la subunidad Mcm7 (Kang et al., 2018), y tiene lugar la fusión de las hebras de ambas cadenas (Fig. 9). Figura 9. Modelo terminación de la replicación en eucariotas. El acercamiento entre las bifurcaciones produce la fusión de las cadenas complementarias y desviación de los complejos CMG, que continúan translocándose hasta alcanzar un fragmento de Okazaki y su procesamiento (Dewar, 2017). 4.4 FUNCIONES NO REPLICATIVAS DE ORC. El papel de ORC, no solo implica funciones replicativas, a pesar de ser la función más estudiada, también se ha demostrado su participación en la inhibición de la transcripción y formación de heterocromatina, condensación cromosómica, desarrollo neuronal... De esta forma se explica el papel de estas proteínas, no solo en la síntesis del ADN, sino también como centro de coordinación del ciclo celular y de la síntesis del ADN. Una vez completada la replicación del ADN en la fase S, las subunidades Orc1-4 se localizan en los centrosomas, donde se ha mostrado que la ausencia de Orc1 provoca defectos en la división del centrosoma, provocando una replicación excesiva de los centriolos. Los centriolos tienen la capacidad de dividirse de forma dependiente a la quinasa del complejo Ciclina A / CDK2 y Ciclina E/ CDK2. En este caso, es la región N-terminal de la subunidad Orc1, denominada dominio CID (dominio inhibidor de CDK), la que actúa como reguladora de la división del centrosoma durante la fase G1 mediante unión e inhibición a los complejos ciclinas, de esta forma, se impide un segundo ciclo de duplicación del centrosoma limitándolo a una sola ronda por ciclo celular (Popova et al., 2018). 21 Durante la metafase, las cromátidas hermanas resultantes se unen entre sí mediante el complejo de cohesina hasta alcanzar la anafase, cuando se separan y migran hacia los polos de la célula. La cohesina forma un anillo de múltiples subunidades encargado de rodear a las cromátidas hermanas. La implicación de ORC se ha descubierto a través de dos mecanismos diferentes en levaduras y eucariotas superiores. Estudios en la levadura Schizosaccharomyces pombe describen el papel de la subunidad Orc5 en el reclutamiento de los componentes de la cohesina en las regiones centroméricas de los cromosomas (Popova et al., 2018). Este reclutamiento coincide con la formación del complejo de replicación en la fase G1 del ciclo celular, pero solo tiene lugar en condiciones en las que la carga de la helicasa se encuentra inhibida, lo que explicaría la implicación independiente del correspondiente ORC en la captación de la cohesina con su actividad en la replicación del ADN. Mientras que, en el caso de Saccharomyce cerevisiae, ORC actúa de manera independiente a la cohesina, ya que aún en presencia de esta, la ausencia de Orc2 provoca una inhibición de la unión de las cromátidas, o incluso la existencia de mutaciones en la cohesina no alteran la cohesión de las cromátidas hermanas debido a la participación de las secuencias de ORC en el genoma. No obstante, todavía es necesario realizar más estudios para conocer si ORC media directamente o si se requiere de la actuación de factores adicionales. Dentro de la regulación de la división celular, el papel de ORC tiene lugar a través de la interacción del extremo N –terminal de Orc6 y la proteína septina. Esta proteína contiene una región GTPasa y es capaz de formar complejos heteroméricos muy estructurados, su función es actuar como andamios en el reclutamiento y organización de proteínas de los dominios membranales hasta provocar un estrangulamiento en la célula en división, que actúa como barrera de difusión y en el reclutamiento de los factores implicados en la morfogénesis. La subunidad Orc6 es responsable de estimular la actividad GTPasa de la septina y provocar la desconexión de los filamentos formados para la separación definitiva de ambas células (Scholefield y Veening, 2011). 22 Figura 10. Esquema de las distintas funciones de ORC a lo largo del ciclo celular. Durante la fase S es el encargado de iniciar la replicación del ADN (i) y regular la duplicación del centrosoma (ii). Una vez en metafase, facilita la cohesión de las cromátidas hermanas de forma dependiente a la cohesina (iii) o independiente a esta (iv). Para finalizar con su implicación en la telofase, participa en la citocinesis de la célula por interacción con la proteína septina (v). Además del papel de ORC en la segregación cromosómica durante la mitosis. (Scholefield y Veening, 2011) En cuanto a la segregación cromosómica, se ha sugerido la participación de ORC en el establecimiento de las proteínas de silenciamiento de transcripción. Debido al nivel de empaquetamiento de la cromatina, resulta fundamental la actuación de las proteínas modificadoras de histonas para permitir el acceso de los factores de transcripción génica. Existen múltiples tipos de modificadores de histonas, en este caso, se hace referencia a HMR y HML, las cuales son dianas del factor SIR (Silent Information Regulator) responsable del silenciamiento e inhibición de la transcripción en Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, para esta unión resulta indispensable la presencia de la subunidad Orc1 unida a través del extremo N-terminal, encargada de reclutar al factor de heterocromatina SIR, el cual es el responsable del reconocimiento para la unión de las proteínas HMR y HML. Esta función se ha conservado a nivel eucariota, la localización de ORC en células eucariotas superiores, como Drosophila melanogaster y Xenopus laevis. En este caso la interacción tiene lugar a nivel cromosómico 29 Kumar C, Remus D. Eukaryotic replication origins: Strength in flexibility. Nucleus. 2016; 7(3): 292–300. Li H, Stillman B. The origin recognition complex: A biochemical and structural view. Subcell Biochem. 2012; 62: 37–58. Li N, Zhai Y, Zhang Y, Li W, Yang M, Lei J, Tye BK, Gao N. Structure of the eukaryotic MCM complex at 3.8 Å. Nature. 2015; 524(7564) :186–191. Liu S, Balasov M, Wang H, Wu L, Chesnokov IN, Liu Y. Structural analysis of human Orc6 protein reveals a homology with transcription factor TFIIB. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108(18): 7373–7378. Lomanto LD, Ortiz OL, Bretón CO, Gómez AI, Mesa VM. El ciclo celular. Medunab. 2003; 6(16): 21–29. Masai H, Taniyama C, Ogino K, Matsui E, Kakusho N, Matsumoto S, Kim JM, Ishii A, Tanaka T, Kobayashi T, Tamai K, Ohtani K, Arai K.La fosforilación de MCM4 por la cinasa Cdc7 facilita su interacción con Cdc45 sobre la cromatina. J Biol Chem. 2006; 281 : 39249–39261 de Munnik SA, Hoefsloot EH, Roukema J, Schoots J, Knoers NV, Brunner HG, Jackson AP, Bongers EM. Meier-Gorlin syndrome. Orphanet J Rare Dis. 2015; 10(1): 114. Popova VV, Brechalov AV, Georgieva SG, Kopytova DV. Nonreplicative functions of the origin recognition complex. Nucleus. 2018; 9(1): 460–473. Rasanth SG, Shen Z, Prasanth KV, Stillman B. Human origin recognition complex is essential for HP1 binding to chromatin and heterochromatin organization. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107(34): 15093–15098. Riera A, Barbon M, Noguchi Y, Reuter LM, Schneider S, Speck C. From structure to mechanism— understanding initiation of DNA replication. Genes Dev. 2017; 31(11): 1073– 1088. Gasser S. Once and Only Once. Cell. 2019; 177(3): 495–498. Scholefield G, Veening JW, Murray H. DnaA and ORC: More than DNA replication initiators. Trends Cell Biol. 2011; 21(3): 188–194. Stillman B. Origin recognition and the chromosome cycle. FEBS Letters. 2005; 579: 877–884. 30 Sun J, Kawakami H, Zech J, Speck C, Stillman B, Li H. Cdc6-induced Conformational Changes in ORC Bound To Origin DNA Revealed by Cryo-Electron Microscopy. Structure. 2012; 20(3): 534– 544. Sun J, Yuan Z, Bai L, Li H. Cryo-EM of dynamic protein complexes in eukaryotic DNA replication. Protein Sci. 2017; 26(1): 40–51. Ticau S, Friedman LJ, Champasa K, Corrêa IR Jr, Gelles J, Bell SP. Mechanism and Timing of Mcm2–7 Ring Closure During DNA Replication Origin Licensing. Nat Struct Mol Biol. 2017; 24(3): 309–315. Shen Z. The origin recognition complex in human diseases. Biosci Rep. 2013; 33(3): 475–483. Zetterberg A, Larsson O, Wiman O, Klas G. What is the restriction point? Curr Opin Cell Biol. 1995; 7(6): 835–842.