Complejo de reconocimiento de origen en la replicación de eucariotas

Complejo de econocimien o de o igen en la eplicación de euca io as Uni e sidad de Se illa, Facul ad de Fa macia Ma ía Belén Rod íguez Campuzano T abajo Fin de G ado de ca ác e bibliog á ico G ado en Fa macia Complejo de econocimien o de o igen en la eplicación de euca io as Au o a: Ma ía Belén Rod íguez Campuzano Tu o : Ma iniano San iago Pa ón Uni e sidad de Se illa, Facul ad de Fa macia Depa amen o de Bioquímica Se illa, junio 2021 1 RESUMEN La eplicación del ADN du an e el ciclo celula inicia con la licencia de eplicación a a és del econocimien o po el Complejo de econocimien o del o igen de secuencias de inicio den o del genoma denominadas o ígenes, pa a p ocede al ensamblaje de la maquina ia de eplicación. Los o ganismos p oca io as equie en de un único o igen O iC, el cual es una secuencia econocida y es uc u ada de ubicación única. Mien as que en el caso de los euca io as son necesa ios miles de o ígenes dispe sos a lo la go del c omosoma pa a asegu a la eplicación en un ma co de iempo. La al a de conocimien os sob e es as secuencias de nucleó idos plan ea in e ogan es sob e los iniciado es implicados en su econocimien o pa a la eplicación, y en consecuencia esponsables del inicio y con ol de la eplicación en cada ciclo celula , lo que lle a a expone enzimas ú iles como diana en el desa ollo de á macos con ines diagnós icos y e apéu icos. La pa icipación de ORC en o os p ocesos celula es no eplica i os, explica su papel egulado undamen al no solo en el ciclo celula , sino ambién como coo dinado de la sín esis del ADN y el ciclo celula . En consecuencia, al e aciones en el mismo pueden pone en iesgo la ansmisión exac a e idónea del ma e ial gené ico du an e la eplicación, conduciendo a una ines abilidad genómica de e minan e de en e medades como el cánce , diabe es… En e medades gené icas como el sínd ome de Meie -Go lin son esul ado de mu aciones en ORC que p o ocan una al e ación en su unción, o bien sín omas que son p o ocados po pa ógenos que u ilizan el ORC del huésped pa a su p opia eplicación. PALABRAS CLAVE: Ciclo celula , o igen de econocimien o, eplicación, helicasa, unciones no eplica i as, mu ación. 2 ABSTRACT: DNA eplica ion du ing he cell cycle begins wi h he eplica ion license h ough he ecogni ion by he O igin Recogni ion Complex (ORC) o s a sequences wi hin he genome called o igins, o p oceed wi h he assembly o he eplica ion machine y. P oka yo ic o ganisms equi e a single O iC o igin, which is a ecognized and s uc u ed sequence o unique loca ion. While in he case o euka yo es, housands o o igins sca e ed h oughou he ch omosome a e necessa y o ensu e eplica ion in a ime ame. The lack o knowledge abou hese nucleo ide sequences aises ques ions abou he p ime s in ol ed in hei ecogni ion o eplica ion, and consequen ly esponsible o he ini ia ion and con ol o eplica ion in each cell cycle, which leads o exposing use ul enzymes as a a ge in de elopmen . o d ugs o diagnos ic and he apeu ic pu poses. The pa icipa ion o ORC in o he non- eplica i e cellula p ocesses explains i is undamen al egula o y ole no only in he cell cycle, bu also as a coo dina o o DNA syn hesis and he cell cycle. Consequen ly, al e a ions in i can pu a isk he exac and sui able ansmission o gene ic ma e ial du ing eplica ion, leading o a de e mining genomic ins abili y o diseases such as cance , diabe es... Gene ic diseases such as Meie -Go lin synd ome a e he esul o mu a ions in ORC ha cause an al e a ion in his unc ion, o symp oms ha a e caused by pa hogens ha use he hos 's ORC o hei own eplica ion. KEYWORDS: Cell cycle, o igin o ecogni ion, eplica ion, helicase, non- eplica i e unc ions, mu a ion. 3 ÍNDICE Resumen…………………………………………………………………………………………………………1 Palab as cla e…………………………………………………………………………………………………1 Ab e ia u as……………………………………………………………………………………………………4 1. In oducción………………………………………………………………………………………………6 2. Obje i os…………………………………………………………………………………………………..10 3. Me odología…………………………………………………………………………………………..…10 4. Resul ados y discusión………………………………………………………………………………11 4.1 O ígenes de eplicación……………………………………………………………………….11 4.1.1 ORC………………………………………………………………………………12 4.2 Fo mación del complejo eplica i o……………………………………………………13 4.3 P oceso de eplicación celula …………………………………………………………….18 4.4 Funciones no eplica i as de ORC………………………………………………………..20 4.5 En e medades elacionadas con ORC……………………………….…………………23 5. Conclusiones……………………………………………………………………………..……………..27 6. Bibliog a ía………………………………………………………………………………………………..28 4 ABREVIATURAS Cdc10: Cell di ision con ol 10. Cdc45: Cell di ision cycle 45. Cdc6: Cell di ision cycle 6. CDK: Cyclin-dependen kinase. Cd 1: Ch oma in licensing and DNA eplica ion ac o 1. CMG: Cdc45:MCM2-7:GINS CKI: P o eínas inhibido as de quinasas dependien es de ciclinas. CTD: Dominio C- e minal. C 4: Ch omosome T ansmission Fideli y 4. EBNA1: Eps eins-Ba nuclea an igen 1. FEN1: Flap S uc u e-Speci ic Endonuclease 1. FPM: ac o p omo o de la madu ación. G1: Fase GAP 1. G2: Fase GAP 2. GINS: Go-Ichi-Ni-San. GTPasa: Guanosina i os a asa. HP1: He e och oma in p o ein 1. H2i: Helix 2 inse . S: Fase de sín esis. M: Fase de mi osis. MAPK: Cascada de p o eínas quinasas ac i adas po agen e mi ógenos. MCM2-7: Minich omosome main enance p o ein 2-7. NTD: Dominio N- e minal. OB: Pliegue de unión de oligonucleó idos. ORC: Complejo de econocimien o del o igen de eplicación. PCNA: P oli e a ing cell nuclea an igen. PS1: P e-senso 1 β-hai pin. RF: Mo i o dedo de a ginina. RFC: Replica ion ac o C. RPA: Replica ion p o ein A. SIR: Silen in o ma ion egula ion. 5 Skp2: P o eína quinasa 2 asociada a la ase S. Sld (2/3): Syn he ically Le hal wi h Dpb11-1. SIR: Silen in o ma ion egula ion. VEB: Vi us Eps ein-Ba . WA/WB: Mo i o Walke A/B. ZF: Mo i o de unión a Zinc N- e minal. 6 1. INTRODUCCIÓN En la conse ación de especies y el desa ollo celula de o ganismos de odos los einos, es undamen al la duplicación del ADN (ácido desoxi ibonucleico) du an e el ciclo celula , pa a la ansmisión iel de la in o mación gené ica a las dos células hijas esul an es de la di isión celula . El ciclo celula iene como unción la o mación comple a de una nue a célula, asegu ando que el p oceso se ealice de o ma adecuada y egulada (Loman o e al., 2003). En el caso de o ganismos mul icelula es son necesa ios múl iples secuencias de di isiones celula es pa a c ea un nue o indi iduo, o bien pa a sus i ui las células al e adas o mue as. Du an e el ciclo celula , la célula aumen a su amaño, sus componen es in acelula es, duplica su ma e ial gené ico y se di ide. Es e se o ganiza en una se ie de e apas: una ase de sín esis (S), una ase de seg egación mi ó ica (M) y dos ases in e medias (G1 y G2). Las ases G1, S y G2 co esponden a la in e ase, donde la célula c ece, duplica su ADN c omosómico y p epa a los o gánulos pa a pasa una copia comple a del genoma a cada una de las dos células hijas. Y una ez alcanza la ase M, que se di ide en p o ase, p ome a ase, me a ase, ana ase, elo ase y ci ocinesis (Fig. 1), se comple a la seg egación de los c omosomas y la di isión celula (ci oquinesis), o mando las células hijas, p epa adas pa a comenza su espec i o ciclo celula (Scha e , 1998). Du an e la ase G1 la célula se p epa a pa a la eplicación del ADN median e acumulación del ATP eque ido, aumen o de ma e ial enzimá ico y, o as moléculas y es uc u as ci oplasmá icas. La p og esión de la ase G1 es á egulada po un “pun o de es icción”, que la di ide en una ase emp ana y una ase a día, los ac o es de e minan es en es e pun o son una combinación de ac o es in ínsecos ( asa de sín esis de p o eínas) y ac o es ex ínsecos como las señales mi ógenicas ( ac o es de c ecimien o, e c.) (Ze e be g e al., 1995). Los ac o es mi ógenos ac úan po unión a ecep o es de memb ana que ac i an po os o ilación a la p o eína G monomé ica Ras, lo que a su ez p o oca la cascada de os o ilaciones de las p o eínas MAPK (quinasas ac i adas po mi ógenos) que ocasiona la ansc ipción de genes ales como las ciclinas pa ícipes de G1 (Loman o e al., 2003). Sin emba go, la ausencia de es os ac o es in ínsecos y ex ínsecos p o oca que la célula en e en un es ado de eposo denominado ase G0, en ando en un es ado de la encia den o del ciclo celula que puede du a días, semanas o años, e incluso en ocasiones puede que pa a nunca ol e a di idi se. 13 Hay que señala que O c6 no iene ninguna simili ud es uc u al con el es o de subunidades O c, pe o sí p esen a una semejanza es uc u al con el ac o de ansc ipción TFIIB (Liu e al., 2011). O c6 se une a O c1-5 en la ase G1/M y se disocia de ellos du an e la ase S. Den o de O c6 se ha encon ado una mu ación de su α hélice en el C- e minal causan e del sínd ome de Meie -Go lin, en e medad que causa enanismo p imo dial en humanos y que es desc i a en es e abajo pos e io men e (Bicknell e al., 2011). Exis e una elación cla a en e ORC y el iempo de eplicación, en el caso del ORC de Sacha omyces ce e isiae se puede di idi , en unción del iempo de eplicación, en si ios de eplicación emp ana y si ios de eplicación a día (Popo a e al., 2018). Lo que puede elaciona se con la cons an e de disociación de ORC, los si ios de eplicación a día p esen an una cons an e de disociación baja, mien as que una cons an e de disociación al a co esponde a los si ios de eplicación emp ana. La p e e encia de ORC po cadenas de c oma ina abie a y de mayo núme o en si ios de unión explica la elación en e la eplicación emp ana y las egiones de euc oma ina, en compa ación con las egiones de he e oc oma ina donde la eplicación suele se a día. 4.2 FORMACIÓN DEL COMPLEJO REPLICATIVO. Con inuando con la o mación del complejo p e- eplica i o (p e-RC), du an e la ase M del ciclo celula , se p ocede a la unión dependien e de ATP de un ac o adicional, denominado Cdc6, es e ac o se une al ORC unido a c oma ina lo que p o oca una eo ien ación en el dominio N- e minal de O c1. Además, es a unión aumen a la especi icidad de la in e acción en e ORC y el o igen de eplicación. Cdc6 es á compues o de 4 p o eínas de unión a ATP ( anspo ado es ABC), las cuales, p esen an una es echa homología con las subunidades AAA+ de O c1. Es a unión iene luga a a és de una in e acción di ec a con O c1, donde el C- e minal de Cdc6 se dispon e en e las subunidades O c1 y O c2 (Fig. 4). La p esencia de Cdc6 y ATP, p o oca que la o ma de media luna se ans o me en un anillo ce ado con una g an ca idad cen al (Sun e al., 2012) 14 Figu a 4. Esquema de la disposición de Cdc6 unido a ORC, donde se puede obse a como llena el espacio en e las subunidades O c1 y O c2. (Sun e al., 2017) La unción de ORC/Cdc6 es ca ga el complejo de man enimien o de minic omosomas 2-7 (MCM2-7) que cons i uye el núcleo de la helicasa eplica i a y, el cual, se encuen a unido, a su ez, a la p o eína de ansc ipción 1 (Cd 1) dependien e de Cdc10, o mando el complejo OCCM (Fig. 5). La hid ólisis del ATP po acción de Cdc6 p omue e la unión de Cd 1 al o igen po medio de una in e acción con O c6, lo que p omue e la ca ga de la helicasa MCM2-7 en la c oma ina. Es e Cd 1, po unión al ex emo N- e minal de las subunidades Mcm2, Mcm4 y Mcm6, con ibuye a la emodelación del complejo MCM2-7, es e con ac o pe mi e ensancha la pue a Mcm2/5 pa a su unión a la c oma ina y el cie e pos e io del anillo. El hep áme o Cd 1-MCM2-7 es á unido de o ma que el ex emo C- e minal de las subunidades MCM2-7 se asocia al dominio WH de ORC, dejando accesible el ex emo N- e minal. Es e MCM2-7 o ma si ios de unión de ATP en las in e aces de sus subunidades pa a u iliza la ene gía de la hid ólisis de ATP en la usión del ADN bica ena io y conduci las heb as monoca e ias a a és del canal cen al del anillo Mcm2-7 (Kuma y Remus, 2016). ORC ambién es enca gado de induci la lexión del ADN pa a su en ada po la pue a Mcm2/5. Figu a 5. Mecanismo de ca ga de Cd 1-MCM2-7 en el ADN de doble cadena. Se mues a un ni el in e io compues o de Cd 1-MCM2-7 y un ni el supe io con ORC-Cdc6 (Sun e al., 2017). 15 Den o de cada subunidad Mcm se disponen una ATPasa cen al lanqueada po un dominio N- e minal y un dominio C- e minal, conocidos como “NTD” y “CTD”, espec i amen e (Fig.4). El conjun o p esen a una disposición en espi al con un espacio en la in e az Mcm2/Mcm5, en la cual se inse a el ADN de doble cadena, quedando el anillo pa cialmen e ce ado al ededo del mismo. Den o del dominio NTD exis en es subdominios conse ados, en el que se dis inguen las egiones NTD-A, -B y –C (Figu a 6) (Li e al., 2015). El dominio NTD-A o ma un paque e en o ma de hélice helicoidal simila a las p o eínas de unión al ADN. En el caso del subdominio NTD-B, a a és de sus dedos de Zinc, es esponsable de la es abilidad del hexáme o MCM2-7. El e ce dominio NTD-C p esen a un pliegue de unión a oligonucleó idos (OB) que pa icipa, a a és de in e acciones hid o óbicas, en los con ac os con el ADN, así como en la oligome ización de MCM2-7 en la es uc u a hexamé ica, e minando en la ho quilla N- e minal (N Hp). El dominio C- e minal (CTD) supone el mo o de la helicasa, donde se di e encia la egión WA, los bucles de la ho quilla β (H2i), la egión WB, el p esenso 1 de unión al ADN (PS1) y un dedo de a ginina (RF). Ambos dominios pueden inclui ex ensiones pa a múl iples uniones a di e sas p o eínas que pa icipan en la eplicación. La in e acción de MCM2-7 con el ADN iene luga a a és de la inse ción de la ho quilla β que acili a el con ac o de la p o eína ATPasa con el ADN pa a su ac i idad pos e io . Figu a 6. Es uc u a de los dominios de la p o eína Mcm, en cuyo ex emo N- e minal se encuen an los dominios NTD –A, -B y –C donde se encuen an el pliegue de unión de oligonucleó idos (OB), la ho quilla de Zinc (ZF) y la ho quilla N- e minal. Seguido del ex emo C- e minal que cons i uye el mo o de la helicasa con el dominio de unión Walke A (WA) a ATP, Walke B (WB) y el dedo de a gininina (RF). En e las in e aces de los dominios Walke se encuen an el p esenso 1 de unión al ADN (PS1) y los bucles de inse ción de la ho quilla β en la hélice (H2i). (Rie a e al.,2017) Aunque MCM2-7 cons i uye el núcleo de la helicasa, po sí solo no es capaz de cumpli su unción, y a a és de su unión con di e en es ac o es o ma los complejos OCCM → OCM → DH → CMG que acaban o mando el eplisoma. La salida de Cdc6 y Cd 1 de OCCM, impulsada po la hid ólisis de ATP, se asocia con el cie e del p ime anillo MCM2-7 (Ticau e al., 2017). La unión de un nue o Cdc6 al complejo ORC-MCM2-7 supone un in e medio ansi o io (complejo 16 OCM) pa a el eclu amien o del segundo hep áme o Cd 1-MCM2-7, ambién impulsado po la hid ólisis de ATP. En el OCCM el ADN de doble cadena ya es á den o del canal cen al de MCM2-7, aunque es a en ada queda oda ía pa cialmen e abie a en e Mcm2 y Mcm5. La libe ación del segundo Cdc6 seguida de ORC p o oca el cie e del segundo anillo MCM2-7 al ededo del ADN, dando como esul ado un complejo es able (Complejo de p e- eplicación o MCM2-7 DH). Cdc6 unciona como un ac o de con ol de calidad, cuya ac i idad ATPasa asegu a que los complejos MCM2-7 de ec uosos o incomple os sean eliminados de los o ígenes de eplicación (Kang y Wa ne , 2014). El complejo MCM2-7 DH ca ece de capacidad de hid oliza el ATP y de desen olla el ADN, pe o sí iene la capacidad de desliza se po la cadena de ADN has a si ios que no con ienen el o igen de eplicación. Es o es debido a que la pue a Mcm2/5 se encuen a bloqueada has a su ac i ación du an e la ansición G1/S (Rie a e al., 2017). Una ez si uados, los hexáme os MCM su en una inclinación isible o gi o en e los dominios NTD y CTD mediados po sus dedos de Zinc (ZF), pa a que es os puedan in e acciona ca a a ca a y o ma el hexáme o doble. La ca ga de múl iples DH en muchos o ígenes de eplicación es una o ma de almacena g andes can idades de la helicasa eplica i a inac i a an es de que enga luga la sín esis de ADN (Al e e al., 2014). Es os hexáme os MCM2-7 DH cons i uyen el núcleo de la helicasa en es ado inac i o, no es has a la ase S del ciclo celula , cuando se desencadena un aumen o de los ni eles de la p o eína quinasa DDK dependien e de Db 4 y de la quinasa dependien e de cicilina (CDK). De es a o ma el doble hexáme o MCM2-7 ac úa como pla a o ma obje i o de DDK pa a os o ila las subunidades Mcm2, Mcm4 y Mcm6 pe mi iendo la unión la e al de cada hexáme o MCM2- 7 con una copia del ciclo de di isión celula (Cdc45) y el complejo e amé ico go-ichi-ni-sa (GINS) pa a o ma dos o ganizaciones de once p o eínas denominadas CMG (Fig.7) que cons i uyen la o ma ac i a de la helicasa. La DDK se o ma po unión de la quinasa Cdc7 con el co ac o Db 4, bloqueando la ac i idad au oinhibido a de Cdc7. La acción egulado a de la quinasa dependien e de ciclina, no solo es impo an e en la licencia de o igen de eplicación y en la ac i ación del complejo DH, ambién esul a undamen al pa a e i a el inicio de un nue o ciclo de eplicación as la sín esis del ADN, a a és de la os o ilación de las subunidades ORC, CDC6 y Cd 1. Conduciendo a la deg adación o exclusión de es os, e i ando la concesión de nue as licencias de eplicación. Cd 1 ambién es egulado po la p o eína Geminin (GMNN) que ac úa impidiendo la unión de Cd 1 con MCM2-7. 17 Figu a 7. Cambios es uc u ales desde el complejo OCCM donde iene luga la unión del p ime MCM2- 7, seguido de la asociación del segundo MCM2-7 ca a a ca a pa a o ma el complejo DH inac i o. Po úl imo, la ac i ación del mismo a a és el e áme o GINS y Cdc45. (Rie a y Ba bon, 2017) A medida que las células a anzan en la ase S, pa a comple a la o mación del complejo CMG, se ensamblan el es o de ac o es de ac i ación, ales como la P o eína A de eplicación (RPA), la subunidad MCM10 pa a la sepa ación de las dos helicasas de CMG, la Polime asa  o p imasa, la Polime asa épsilon (Pol ε) que ac úa sob e la heb a p incipal, la Polime asa del a (Pol δ) esponsable de la heb a ezagada y el ac o CTF4. Pol-ε es un complejo de cua o p o eínas compues o po una subunidad ca alí ica Pol2, que se asocia al ex emo C- e minal de CMG a és del íme o CTF4 y cuyas subunidades se encuen an en ec uzadas con Mcm2, Mcm5 y Mcm6 (Sun e al., 2017). En es a nue a ag upación, iene luga una eo denación del ex emo NTD de la mi ad de los anillos Mcm (3,5 y 2), los cuales, se gi an hacia la izquie da y las es an es hacia la de echa, lo que econ igu a ía el canal cen al de la helicasa (Rie a e al., 2017). El eclu amien o de es os ac o es ambién es á egulado po acción de la quinasa CDK, median e la os o ilación de la subunidad Mcm2, p o oca la ape u a del anillo CMG y debili a la unión Mcm2/5 pa a acili a el paso de la doble cadena de ADN. La os o ilación dependien e de DDK de MCM2-7 es impo an e pa a acili a el eclu amien o de los ac o es Sld3 y Sld2, que o man el complejo DPB11 necesa io pa a es abiliza la unión de Cdc45 a MCM2-7 (Masai e al., 2006). El complejo CMG p esen a dos con ó me os dis in os según la o ganización de sus subunidades, median e la ansición de un es ado inac i o a un es ado elajado/ac i o a pa i de la in e acción de los dominios NTD con los ac o es GINS y Cdc45, acoplado al eo denamien o aslacional y o acional de las subunidades Mcm6 y Mcm4 del anillo esul ado de la al e ación de la pue a Mcm2/5. 18 En cada o igen, se ca gan uno o más MCM2-7, pe o solo una mino ía se ans o ma en CMG ac i os du an e la ase S; quedando los es an es como “o ígenes la en es”, que se ac i an solo si una bi u cación de eplicación p oximal se con ie e en e minal. 4.3 PROCESO DE REPLICACIÓN CELULAR. Tan o Cdc45 como el complejo GINS son coac i ado es de la helicasa, cuya unión comple a su ac i ación. De o ma que el mo imien o de CMG a a és de su ex emo N- e minal a lo la go de la doble cadena de ADN en sen ido 3´-5´p o oca la sepa ación de las cadenas u ilizando la ene gía de hid ólisis de ATP p oceden e de las in e aces Mcm3/5 y Mcm5/2. De es a o ma su e un cambio con o macional en el que cada complejo CMG odea una heb a de ADN monoca ena io, excluyendo la plan illa de la heb a e asada ue a de la es uc u a. Son los dominios WH de Mcm5 y Mcm6, median e eo denamien o, los esponsables de la cons icción del po o donde se encuen a el ADN de doble cadena has a queda en un amaño an pequeño donde es imposible albe ga lo. En la eplicación de las cadenas monoca ena ias, las ADN polime asas ca alizan en sen ido 3ᶦ-5ᶦ el enlace os odiés e en e el g upo hid oxilo 3ᶦ de la heb a y el g upo os a o 5ᶦ del nue o nucleó ido. Una ez excluida es é icamen e la cadena ezagada hacia la supe icie ex e na de MCM, es odeada de la p o eína de eplicación A (RPA) y lis a pa a que la Pol α pueda coloca el cebado. El complejo polime asa p imasa α se une a a és del ac o C 4 que ac úa como puen e, unido al ex emo N- e minal de GINS. Es e complejo con ac i idad ARN p imasa y ADN polime asa comple a la sín esis de 7-10 nucleó idos de ARN seguidos de 10-12 nucleó idos de ADN an es de que ocu a el cambio de polime asas (Kuma , 2016) (Fig. 8). En el caso de la heb a p incipal, es a pasa a a és de un canal ca gado posi i amen e donde es ablece in e acción con el bucle H2i de Mcm2/3/5/6 pa a p ocede a la acción de Pol-ε a a és de su dominio N- e minal en sen ido 3´-5´. T as es o la pue a de en ada de ADN en Mcm2/5 es bloqueada po GINS y Cdc45, quedando o almen e ce ada. La es uc u a an ipa alela del ADN de doble cadena, p o oca que una de las heb as se sin e ice en la misma di ección que la ho quilla, siendo el caso de la heb a p incipal. Mien as que la heb a ezagada c ece en di ección con a ia a la ho quilla en agmen os co os que pos e io men e se p ocesan y se ligan. 19 Figu a 8. A qui ec u a del eplisoma con posibles u as de las cadenas de ADN, donde la heb a p incipal eco e el in e io del complejo con in e acciones con las subunidades Mcm, mien as que los enlaces de la heb a e asada ienen luga en la supe icie N- e minal (Hedglin y Benko ic, 2017). La eplicación de la heb a ezagada cons a de a ias ases: cebado inicial po acción de ADN p imasa, ala gamien o en sen ido 5´→3´del cebado ARN po la Pol α, cambio de Pol α a Pol δ, ala gamien o del agmen o de Okazaki (100-200 nucleó idos) po Pol δ y madu ación a a és de Pol δ, FEN1 y ADN ligasa. La p esencia de la Pol δ as la ac i idad de la Pol α se debe a su limi ada p og esión en plan illas la gas y su ca en e ac i idad exonucleasa 3´→5’ pa a co egi los e o es, po lo que esul a undamen al la pa icipación exonucleasa de Pol δ en la co ección. Una ez comple ada la ac i idad Polα es inhibida po medio de su disociación a pa i del ac o RPA en un p oceso dependien e de ATP, pa a p ocede al ensamblaje del an ígeno nuclea celula en p oli e ación (PCNA) en el ex emo del cebado . Su asociación en la unión cebado - agmen o de Okazaki es ca alizada po las enzimas del ac o de eplicación C (RFC) a pa i de la ene gía de hid ólisis del ATP. Se ca ga un anillo de PCNA en cada agmen o de Okazaki de la heb a ezagada, mien as que se u iliza un único anillo PCNA en la heb a p incipal (Hedglin y Benko ic, 2017). La in e acción de PCNA y Pol δ o ma una ab azade a deslizan e con una ca idad cen al lo su icien emen e g ande como pa a albe ga el ADN bica ena io de nue a sín esis, es o con inúa 1-2 nucleó idos adicionales en el ex emo 5´ con el in de elimina los cebado es iniciales a a és de la ac i idad 3´→ 5’ exonucleasa del complejo FEN1 y Pol δ (Bu ge s, 2009). Una ez deg adado odo el ARN, la ADN ligasa es esponsable de la unión ADN-ADN. Den o del segmen o de 20 nucleó idos sin e izados suponen zona c í ica de posible mu ación, esul ando imp escindible la acción de la Pol δ en la co ección de los e o es que engan luga en la misma. 20 En el caso de la heb a p incipal la sín esis en o ma con inua es mediada únicamen e po acción de Pol-ε. La eplicación de cada heb a con inúa de o ma independien e has a que las ho quillas se ace can demasiado en e sí has a su encuen o donde no se p oduce un es ancamien o de ho quillas, sino que los complejos CMG se des ían en e sí libe ándose del ADN a a és de un mecanismo de poliubiqui inación de la subunidad Mcm7 (Kang e al., 2018), y iene luga la usión de las heb as de ambas cadenas (Fig. 9). Figu a 9. Modelo e minación de la eplicación en euca io as. El ace camien o en e las bi u caciones p oduce la usión de las cadenas complemen a ias y des iación de los complejos CMG, que con inúan anslocándose has a alcanza un agmen o de Okazaki y su p ocesamien o (Dewa , 2017). 4.4 FUNCIONES NO REPLICATIVAS DE ORC. El papel de ORC, no solo implica unciones eplica i as, a pesa de se la unción más es udiada, ambién se ha demos ado su pa icipación en la inhibición de la ansc ipción y o mación de he e oc oma ina, condensación c omosómica, desa ollo neu onal... De es a o ma se explica el papel de es as p o eínas, no solo en la sín esis del ADN, sino ambién como cen o de coo dinación del ciclo celula y de la sín esis del ADN. Una ez comple ada la eplicación del ADN en la ase S, las subunidades O c1-4 se localizan en los cen osomas, donde se ha mos ado que la ausencia de O c1 p o oca de ec os en la di isión del cen osoma, p o ocando una eplicación excesi a de los cen iolos. Los cen iolos ienen la capacidad de di idi se de o ma dependien e a la quinasa del complejo Ciclina A / CDK2 y Ciclina E/ CDK2. En es e caso, es la egión N- e minal de la subunidad O c1, denominada dominio CID (dominio inhibido de CDK), la que ac úa como egulado a de la di isión del cen osoma du an e la ase G1 median e unión e inhibición a los complejos ciclinas, de es a o ma, se impide un segundo ciclo de duplicación del cen osoma limi ándolo a una sola onda po ciclo celula (Popo a e al., 2018). 21 Du an e la me a ase, las c omá idas he manas esul an es se unen en e sí median e el complejo de cohesina has a alcanza la ana ase, cuando se sepa an y mig an hacia los polos de la célula. La cohesina o ma un anillo de múl iples subunidades enca gado de odea a las c omá idas he manas. La implicación de ORC se ha descubie o a a és de dos mecanismos di e en es en le adu as y euca io as supe io es. Es udios en la le adu a Schizosaccha omyces pombe desc iben el papel de la subunidad O c5 en el eclu amien o de los componen es de la cohesina en las egiones cen omé icas de los c omosomas (Popo a e al., 2018). Es e eclu amien o coincide con la o mación del complejo de eplicación en la ase G1 del ciclo celula , pe o solo iene luga en condiciones en las que la ca ga de la helicasa se encuen a inhibida, lo que explica ía la implicación independien e del co espondien e ORC en la cap ación de la cohesina con su ac i idad en la eplicación del ADN. Mien as que, en el caso de Saccha omyce ce e isiae, ORC ac úa de mane a independien e a la cohesina, ya que aún en p esencia de es a, la ausencia de O c2 p o oca una inhibición de la unión de las c omá idas, o incluso la exis encia de mu aciones en la cohesina no al e an la cohesión de las c omá idas he manas debido a la pa icipación de las secuencias de ORC en el genoma. No obs an e, oda ía es necesa io ealiza más es udios pa a conoce si ORC media di ec amen e o si se equie e de la ac uación de ac o es adicionales. Den o de la egulación de la di isión celula , el papel de ORC iene luga a a és de la in e acción del ex emo N – e minal de O c6 y la p o eína sep ina. Es a p o eína con iene una egión GTPasa y es capaz de o ma complejos he e omé icos muy es uc u ados, su unción es ac ua como andamios en el eclu amien o y o ganización de p o eínas de los dominios memb anales has a p o oca un es angulamien o en la célula en di isión, que ac úa como ba e a de di usión y en el eclu amien o de los ac o es implicados en la mo ogénesis. La subunidad O c6 es esponsable de es imula la ac i idad GTPasa de la sep ina y p o oca la desconexión de los ilamen os o mados pa a la sepa ación de ini i a de ambas células (Schole ield y Veening, 2011). 22 Figu a 10. Esquema de las dis in as unciones de ORC a lo la go del ciclo celula . Du an e la ase S es el enca gado de inicia la eplicación del ADN (i) y egula la duplicación del cen osoma (ii). Una ez en me a ase, acili a la cohesión de las c omá idas he manas de o ma dependien e a la cohesina (iii) o independien e a es a (i ). Pa a inaliza con su implicación en la elo ase, pa icipa en la ci ocinesis de la célula po in e acción con la p o eína sep ina ( ). Además del papel de ORC en la seg egación c omosómica du an e la mi osis. (Schole ield y Veening, 2011) En cuan o a la seg egación c omosómica, se ha suge ido la pa icipación de ORC en el es ablecimien o de las p o eínas de silenciamien o de ansc ipción. Debido al ni el de empaque amien o de la c oma ina, esul a undamen al la ac uación de las p o eínas modi icado as de his onas pa a pe mi i el acceso de los ac o es de ansc ipción génica. Exis en múl iples ipos de modi icado es de his onas, en es e caso, se hace e e encia a HMR y HML, las cuales son dianas del ac o SIR (Silen In o ma ion Regula o ) esponsable del silenciamien o e inhibición de la ansc ipción en Saccha omyces ce e isiae. Sin emba go, pa a es a unión esul a indispensable la p esencia de la subunidad O c1 unida a a és del ex emo N- e minal, enca gada de eclu a al ac o de he e oc oma ina SIR, el cual es el esponsable del econocimien o pa a la unión de las p o eínas HMR y HML. Es a unción se ha conse ado a ni el euca io a, la localización de ORC en células euca io as supe io es, como D osophila melanogas e y Xenopus lae is. En es e caso la in e acción iene luga a ni el c omosómico 29 Kuma C, Remus D. Euka yo ic eplica ion o igins: S eng h in lexibili y. Nucleus. 2016; 7(3): 292–300. Li H, S illman B. The o igin ecogni ion complex: A biochemical and s uc u al iew. Subcell Biochem. 2012; 62: 37–58. Li N, Zhai Y, Zhang Y, Li W, Yang M, Lei J, Tye BK, Gao N. S uc u e o he euka yo ic MCM complex a 3.8 Å. Na u e. 2015; 524(7564) :186–191. Liu S, Balaso M, Wang H, Wu L, Chesnoko IN, Liu Y. S uc u al analysis o human O c6 p o ein e eals a homology wi h ansc ip ion ac o TFIIB. 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