Estudio de lípidos aislados de microalgas y polifenoles en modelos inflamatorios de piel.

Universidad de Sevilla Facultad de farmacia Departamento de farmacología Estudio de lípidos aislados de microalgas y polifenoles en modelos inflamatorios de piel Tesis doctoral, Sevilla 2017 Azahara maría rodríguez luna Dirigida por: Curriculum científico Licenciada en Farmacia, estudiante de Doctorado y miembro de la Comisión de Jóvenes Farmacólogos de la Sociedad Española de Farmacología. Fecha de nacimiento: 12 Abril 1990 Nacionalidad: Española Datos de contacto Dirección: C/Castellar 58D, 2D, 41003 Sevilla, España. Teléfono: +34 661372978 e-mail: [email protected] Ocupación actual/estudios: Desde Octubre de 2014, estudiante de Doctorado en Farmacología, en la Facultad de Farmacia (Universidad de Sevilla) desarrollando la Tesis Doctoral titulada “Estudio de lípidos aislados de microalgas y polifenoles en modelos inflamatorios de piel” bajo la dirección de la Dra. Virginia Motilva Sánchez, la Dra. Elena Talero Barrientos y el Dr. Javier Ávila Román. - Máster Oficial en Especialización Profesional en Farmacia. Especialidad en Gestión y Calidad asistencial en la Oficina de Farmacia. Facultad de Farmacia (US) 2013-2014. Nota media: 9,13. Mención a mejor expediente curso 2013-2014. - Licenciado en Farmacia, (US) 2008-2013. Nota media: 7,1 - Protección y Experimentación Animal. Función A, B y C en Roedores, Lagomorfos, Peces y Anfibios 2017. - Contrato como personal investigador para la ejecución del proyecto “Acción II.3 (B) V Plan Propio de Investigación de la US” (INV-2016-I-008), asociado al proyecto “Interés de los Polifenoles en Inflamación Crónica y Cáncer: Papel de los Sistemas Celulares de Regulación Mitocondrial y del Inflamasoma” Polfanat- II (P12-AGR-430, 2013/1302). Proyecto de Excelencia, Junta de Andalucía (Octubre 2016-Agosto 2017). - Contrato como personal investigador con cargo al proyecto “Interés de los Polifenoles en Inflamación Crónica y Cáncer: Papel de los Sistemas Celulares de Regulación Mitocondrial y del Inflamasoma” Polfanat-II (P12-AGR-430, 2013/1302). Proyecto de Excelencia, Junta de Andalucía. (Septiembre 2015-Octubre 2016). - Contrato como personal investigador. Ayudas a la gestión de la investigación (PPI2015-I.5). V Plan Propio de Investigación, Universidad de Sevilla (Julio-Septiembre 2015). - Asistente Honorario del Departamento de Farmacología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, durante el cursos 2015/2016. - Contrato como personal investigador con cargo al proyecto “Desarrollo de una cadena de producción de microalgas marinas e hipersalinas y productos derivados orientada al mercado de la alimentación” ALGALIMENTO IPT-2011-1370-060000 (Proyecto INNPACTO) Ministerios de Economía y competitividad (Octubre 2013- Diciembre 2014). - Contrato en Oficina de Farmacia (Junio-Agosto 2013). - Alumna Interna en el Departamento de Farmacología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, durante los cursos 2012/2013 y 2011/1012. Bajo la dirección de la Dra. Elena Talero Barrientos. - Impartición de la asignatura de prácticas Farmacología y Farmacoterapia I, 4º Curso del Grado en Farmacia. 3 créditos totales impartidos durante el curso 2016/2017 - Colaboración en proyecto Internacional. Búsqueda de principios activos antiinflamatorios y anticancerígenos a partir de especies vegetales del Estado de Hidalgo. Área de química, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, México. Responsable: J. Jesús Martín Torres Valencia (Desde 2015- Actualidad). - Investigadora del proyecto Polfanat-II (P12-AGR-430 MO). Interés de los Polifenoles en Inflamación Crónica y Cáncer: Papel de los Sistemas Celulares de Regulación Mitocondrial y del Inflamasoma. Junta de Andalucía. Responsable: Dra. Virginia Motilva Sánchez. (Desde Septiembre 2015- Actualidad). - Investigadora del proyecto ALGALIMENTO IPT-2011-1370-060000 (Proyecto INNPACTO). Desarrollo de una cadena de producción de microalgas marinas e hipersalinas y productos derivados orientada al mercado de la alimentación. (2013-2014). Ministerio de Economía y competitividad. Responsable: Dra. Virginia Motilva Sánchez (Desde Octubre 2013-Diciembre 2014). Grupo de investigación: Farmacología Molecular y Aplicada (FARMOLAP) Ministerio de Innovación y ciencia. Junta de Andalucía Código: CTS 658 Responsable: Virginia Motilva Sánchez www.grupo.us.es/farmolap - Estancia en el Departamento de Biología de la Universidad de Aveiro, Portugal. (Febrero-Mayo 2017). En colaboración con la Dra. Helena Oliveira. [email protected] - Prácticas en el Área de Dermatología del Hospital Universitario Virgen del Rocío. Área de Dermatología. Conocimiento, detección y tratamiento de patologías relacionadas con la piel. 160 horas. Sevilla (Mayo 2014). - Estancia en el Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia. (Octubre 2014). En colaboración con el Dr. Miguel Payá Peris. [email protected] - Prácticas en Farmacia Hospitalaria en Hospital Universitario Virgen de Valme. 400 horas. Sevilla. 2013. - Prácticas en Oficina de Farmacia “República Argentina 10, D. Pedro A Villalba Orellana”. 400 horas. Sevilla 2013. De los Reyes, C., Ortega, M.J., Rodríguez-luna, A., Talero, E., Motilva, V., Zubía, E. 2016. Molecular Characterization and Antiinflammatory Activity of Galactosylglycerides and Galactosylceramides from the Microalga Isochrysis galbana. J. Agric. Food Chem. 1–39. doi:10.1021/acs.jafc.6b03931 Ávila-Román, J., Talero, E., Rodríguez-Luna, A., García-Mauriño, S. and Motilva, V. 2016. Anti-inflammatory effects of an oxylipincontaining lyophilised biomass from a microalga in a murine recurrent colitis model. Br. J. Nutr. 1–9. doi: 10.1017/S0007114516004189. Talero, E., García-Mauriño, S., Ávila-Román, J., Rodríguez-Luna, A., Alcaide, A., Motilva, V., 2015. Bioactive Compounds Isolated from Microalgae in Chronic Inflammation and Cancer. Mar. Drugs 13, 6152–209. doi:10.3390/md13106152 1. Rodríguez-Luna, A., Ávila-Román, J., González-Rodríguez., M.L., Talero, E., Zubía, E., Motilva, V. Topical pre-treatment with a carotenoid from microalgae reduces cutaneous UVB-induced inflammation in hairless mice. Oral presentatation. 37th National Meeting of the Spanish Society of Pharmacology (SEF) (Barcelona, 2017). 2. Rodríguez-Luna, A., Oliveira, H., Ávila-Román, J., Talero E., Motilva, V. Efectos del carotenoide F-111 y del polifenol RA- 303, solos o en combinación, sobre la producción de ROS y la apoptosis en queratinocitos humanos HaCaT irradiados con UVB. IX Reunión de jóvenes farmacólogos de Andalucía. Comunicación oral (Sevilla, 2017). 3. A. Rodríguez-Luna, E. Talero, FJ. Ávila-Román, V. Motilva Topical pre-treatment with a carotenoid from microalgae reduces cutaneous UVB-induced inflammation in hairless mice. II Jornadas de Doctorado en Farmacia. Comunicación oral (Sevilla, 2017). 4. A. Rodríguez-Luna, E. Talero, FJ. Ávila-Román, V. Motilva ¿Son necesarias nuevas terapias en fotoprotección? Nuestra experiencia con productos de origen natural. Jornadas Internacionales de Investigación e Innovación en Ciencias de la Salud. Póster (Sevilla, 2016). 5. A. Rodríguez-Luna, FJ. Ávila-Román, I. Sosa-Rosado, ML. González-Rodríguez, MJ. Cózar, C. de los Reyes, E. Zubía, V. Motilva, E. Talero. Estudio de fórmulas farmacéuticas con compuestos de origen marino para el tratamiento de patologías inflamatorias de la piel. VIII Reunión de Jóvenes Farmacólogos de Andalucía. Comunicación oral (Málaga, 2016). 6. I. Sosa-Rosado, A. Rodríguez-Luna, FJ. Ávila-Román, V. Motilva, E. Talero. Estudio de productos naturales marinos como estrategia terapéutica en modelos de inflamación y cáncer de colon. VIII Reunión de Jóvenes Farmacólogos de Andalucía. Comunicación oral (Málaga, 2016). 7. FJ. Ávila-Román, A. Rodríguez-Luna, E. Talero, I. Sosa-Rosado, C. de los Reyes, E. Zubía, S. García-Mauriño, V. Motilva. Our experience in the use of microalgae products in inflammatory process: Importance of fatty acids and carotenoids compounds. European Roadmap for an Algae-based industry. European Conference Olhão. Póster (Portugal 2016). 8. E. Talero, A. Rodríguez-Luna, V. Cechinel Filho, R. Niero, LB. Mariano, V. Motilva. In vitro antioxidant, cytotoxic and antiinflammatory activity of uncommon xanthones from branches of Garcinia achachairu Rusby. International Conference of polyphenols and health. Póster (Tours, Francia, 2015). 9. A. Rodríguez-Luna, E. Talero, C. de los Reyes, E. Zubía, MC. Terencio, V. Motilva. Compuestos aisaldos de la microalga Isochrysis galbana previenen la hiperplasia en un modelo de psoriasis en ratón. I Jornadas Internacionales de Ciencias de la Salud. Comunicación oral (Sevilla, 2015). 10. A. Rodríguez-Luna, E. Talero, FJ. Ávila-Román, A. Alcaide, MJ. Cózar, ML. González-Rodríguez, C. de los Reyes, E. Zubía, MC. Terencio, V. Motilva. Topical application of glycolipids and fucoxanthin from microalgae prevents inflammation in a murine model of TPA-induced hyperplasia. 36º Congreso de la Sociedad Española de Farmacología. Póster (Valencia, 2015). 11. FJ. Ávila-Román, E. Talero, A. Rodríguez-Luna, A. Alcaide, C. de los Reyes, E. Zubía, S. García-Mauriño , V. Motilva. Proresolving effects of an oxylipins-containing biomass from Chlamydomonas debaryana in a recurrent colitis model in mice. 36º Congreso de la Sociedad Española de Farmacología (Valencia, 2015). 12. A. Rodríguez-Luna, E. Talero, A. Alcaide, C. de los Reyes, E. Zubía, M. Payá, MC. Terencio, V. Motilva. Glicolípidos aislados de microalgas previenen la hiperplasia epidérmica inducida con TPA en ratones. VII Reunión de Jóvenes Farmacólogos de Andalucía. Comunicación oral (Granada, 2015). 13. A. Rodriguez-Luna, E. Talero, C. de los Reyes, E. Zubía, S. García-Mauriño, V. Motilva. Photoprotective effect of glycosylglycerols and glycolipids from microalgae in HaCaT keratinocytes. 35º Congreso de la Sociedad Española de Farmacología. Póster (Madrid, 2014). 14. A. Rodriguez-Luna, E. Talero, C. de los Reyes, E. Zubía, S. García-Mauriño, V. Motilva . Photoprotective effect of glycosylglycerols and glycolipids from microalgae in HaCaT keratinocytes. VI Reunión de Jóvenes Farmacólogos de Andalucía. Comunicación oral. (Sevilla, 2014). - Premio a “Mejor comunicación oral”. Efectos del carotenoide F- 111 y del polifenol RA-303, solos o en combinación, sobre la producción de ROS y la apoptosis en queratinocitos humanos HaCaT irradiados con UVB. IX Reunión de Jóvenes Farmacólogos de Andalucía. (Sevilla, 2014). - Reconocimiento a Mejor Expediente Académico de la Primera Promoción del Máster Universitario en Especialización Profesional en Farmacia. Facultad de Farmacia (Sevilla, 2014). - Finalista al I Premio de la Confederación Empresarial de Oficinas de Farmacia de Andalucía. Facultad de Farmacia (Sevilla, 2014). - Premio a “Mejor comunicación oral”. Photoprotective effect of glycosylglycerols and glycolipids from microalgae in HaCaT keratinocytes. VI Reunión de Jóvenes Farmacólogos de Andalucía. (Sevilla, 2014). - Comité organizador en IX Reunión de Jóvenes Farmacólogos de Andalucía. (Sevilla, 2017). - Comité organizador en VI Reunión de Jóvenes Farmacólogos de Andalucía. (Sevilla, 2014). - Asistencia a Taller sobre “Cómo publicar Trabajos de Investigación”. Springer. (Sevilla, 2013). - Módulo de Farmacología y Farmacoterapia. Comisión de Formación Continuada. (Valencia, 2013). - Miembro de la Comisión de Jóvenes Farmacólogos de la Sociedad Española de Farmacología. Community manager. iv L LC Células de Langerhans LDH Lactato deshidrogenasa LPS Lipopolisacárido M MAPK Map kinasas MCP-1 Proteína quimioatrayente de monocitos tipo 1 MGDGs Monogalactosyldiacylglycerols MGMGs Monogalactosil-monoacilglicerol MMP Metaloproteinasa MPO Mieloperoxidasa MTX Metotrexato N NF-κB Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas NL Nanoliposomas NMSC Non-melanoma skin cancer NO Óxido nítrico Nrf2 Factor nuclear eritroide 2 NRLP3 NOD-LRR-and pyrin domain-containing 3 P PASI Psoriasis Area Severity Index PdI Polidispersity index PGA Physician Global Assessment PGs Prostaglandinas pKa Constante de ionización PKC Proteína kinasa C Poli(I:C) Poliinosínico-policitidílico PRRs Receptores de reconocimiento de patrones PUVA Psoraleno oral y radiación de la zona afectada con luz UVA Q QA Queratosis actínica R RA Ácido rosmarínico RMS Root mean square RNS Especies reactivas de nitrógeno ROS Especies reactivas de oxígeno S SC Stratum corneum SDC Sodium deoxycholate SOD Superóxido dismutasa SQAGs Sulfoquinovosil-diacilgliceroles SRB Sulforhodamine B STAT Señal de activación y traducción T TFG-β Factor de crecimiento transformante beta Th1 Células T helper 1 TLR Receptores Toll like TNF-α Factor de necrosis tumoral α TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate U UV Ultravioleta v V VEGF Vascular endothelial growth factor Índice de tablas y figuras ix Figura 1: Corte transversal de piel y tejido subcutáneo 19 Figura 2: La epidermis, epitelio escamoso estratificado 21 Figura 3: Imagen de una lesión en placa, forma más común de psoriasis 25 Figura 4: Cambios histológicos observados en la piel de un ratón con hiperplasia epidérmica frente a la de un ratón sano. 26 Figura 5: Esquema resumido de la inmunopatogénesis de la psoriasis 28 Figura 6: Esquema resumen de células y citocinas implicadas en la inmunopatogénesis de la psoriasis 32 Figura 7: Esquema de los diferentes tratamientos empleados en la psoriasis según la severidad del paciente 34 Figura 8: Efectos de la radiación solar en la piel según la longitud de onda (nm) 37 Figura 9: Esquema resumen de cómo afecta la exposición solar a lo largo del tiempo 38 Figura 10: Esquema de activación del complejo Nrf2 41 Figura 11: Esquema de activación del inflamasoma 42 Figura 12: Esquema de activación del proceso de apoptosis 43 Figura 13: Ciclo celular y apoptosis 44 Figura 14: Imágenes de diferentes lesiones de Queratosis actínica 45 Figura 15: Principales compuestos obtenidos de las microalgas 48 Figura 16: Estructuras de los glicolípido MGDG, DGDG, SQDG. 49 Figura 17: Fórmula estructural plana del β-caroteno 55 Figura 18: Estructura química de la fucoxantina 56 Figura 19: Esquema adaptado de la formación del RA 59 Figure 1: Effect of galactolipids 1-13 on TNF-α production in LPS-stimulated THP-1 macrophages 85 x Figure 2: Effect of glycolipids from microalgae on UVB-induced LDH leakage in human HaCaT keratinocytes 86 Figure 3: Effect of glycolipids from microalgae on UVB-induced ROS production in human HaCaT keratinocytes 87 Figure 4: Effects of glycolipids on UVB-induced production of IL-6 in human HaCaT keratinocytes 88 Figure 1: Topical application of acetone-dissolved glycolipids from I. galbana inhibits skin inflammation and hyperplasia on the murine 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced model 111 Figure 2: Effect of the glycolipid MGMG-A and the fraction MGDG from I. galbana on the production of cytokines in skin homogenates in the murine 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced hyperplasia model 112 Figure 3: Effect of the vehicle composition and physicochemical properties of the drug on the permeation characteristics 114 Figure 4: Topical pre-treatment with cream containing the glycolipid fraction MGDG from I. galbana decreases skin inflammation and hyperplasia on the murine 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced model 116 Figure 5: Topical pre-treatment with cream containing the glycolipid fraction MGDG from I. galbana attenuates 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced COX-2 expression in mouse skin 117 Figure 1: Experimental setting for the TPA-induced epidermal hyperplasia model in mice and treatment groups 139 Figure 2: Experimental setting for the of UVB-induced acute erythema model in hairless mice and treatment groups 140 Figure 3: Effects of Fucoxanthin (FX) from I. galbana on proinflammatory cytokines production in THP-1 macrophages and HaCaT keratinocytes 143 Figure 4: Permeation profiles 146 Figure 5: Fucoxanthin (FX) ameliorates skin hyperplasia and inflammation induced by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) in mice 148 xi Figure 6: Protective effect of Fucoxanthin (FX) on UVB-induced damage in HaCaT cells 150 Figure 7: Fucoxanthin (FX) has photoprotective effects in UVB- induced erythema model in hairless mice 152 Figure 8: Anti-inflammatory and antioxidant effects of Fucoxanthin (FX) in UVB-induced erythema model in hairless mice 153 Figure 1: In vitro release profiles of Rosmarinic acid (RA) in nanoliposomes (RA-NL), Dexamethasone (Dex) in nanoliposomes (Dex-NL) and free drug solution (RA solution and Dex solution) 177 Figure 2: Rosmarinic acid (RA) ameliorates skin inflammation on the murine IMQ-induced psoriasis-like model 179 Figure 1: Selection of UVB-dose and evaluation of cell viability and ROS production in UVB-irradiated HaCaT cell 199 Figure 2: Effect of RA, F and combinations in cell cycle and apoptosis studied by flow cytometry 201 Figure 3: Pre-treatment with RA, F and M2 modulates inflammasome activation on UVB-irradiated HaCaT cells 202 Figure 4: Effect of RA, F and M2 on up-regulation of Nrf2 and HO-1 protein expression in UVB-exposed keratinocytes 203 Table 1. Chemical structures of the MGMGs isolated from the biomass of the microalgae M. pusillum (1-4) and I. galbana (4, and 11-13) 83 Table 2. Chemical structures of the DGDGs 5-10 isolated from the biomass of M. pusillum 84 Table 1. Effects of glycolipids from I. galbana on IL-6 and IL-8 production in TNF-α-stimulated HaCaT human keratinocytes 109 Table 1: Total percentage permeated across artificial lipophilic membrane of β-Carot from different topical formulations, and flux rate 145 Table 1. Characterization parameters of the different batches 176 resumen xv Título: “Estudio de lípidos aislados de microalgas y polifenoles en modelos inflamatorios de piel" Autora: Azahara M Rodríguez Luna Resumen: La piel es el principal órgano que actúa como defensa frente a agresiones externas, protegiendo al organismo de sustancias tóxicas, daño físico, e invasión por patógenos o radiaciones, suponiendo una pieza indispensable del sistema inmunológico. En este sentido, la perturbación de su estructura o función podría estar causada tanto por factores externos, como sustancias tóxicas o radiación ultravioleta (UV), o por factores internos, como pueden ser la predisposición genética, desórdenes inmunitarios u hormonales, o estrés. Como resultado de estas alteraciones, se puede desencadenar una respuesta inflamatoria, una disminución de la respuesta inmune o un daño oxidativo, entre otros. La exposición crónica de la piel a la luz UV induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como una respuesta inflamatoria, la cual juega un papel importante en el fotoenvejecimiento, en el desarrollo de lesiones pre-cancerosas, como la queratosis actínica, y en el cáncer de piel. Por otro lado, las enfermedades inflamatorias de la piel tienen un alto impacto en la calidad de vida de los pacientes; una de ellas es la psoriasis, enfermedad crónica mediada por el sistema inmune, de afectación predominantemente cutánea, cuya patogénesis no está clara aún. Hoy en día, las estrategias para la protección de la piel se centran en el uso de compuestos naturales para contrarrestar el estrés oxidativo y la inflamación. En los últimos años, las microalgas han emergido como fuente de compuestos bioactivos, incluyendo lípidos, proteínas, polisacáridos y carotenoides. Estos compuestos han atraído el interés de la industria farmacéutica y cosmética en base a sus actividades como antioxidantes, anti-inflamatorios y anti-carcinogénicos. En este estudio, hemos evaluado la actividad biológica de ciertos glicolípidos y el carotenoide fucoxantina, aislados de la especie Isochrysis galbana, así como del polifenol ácido rosmarínico, en diferentes modelos inflamatorios de piel tanto in vitro como in vivo, los cuales están desarrollados en los siguientes párrafos. En primer lugar, hemos evaluado la actividad citotóxica, antioxidante y fotoprotectora de diferentes glicolípidos aislados de xvi la microalga Isochrysis galbana, empleando un modelo in vitro de queratinocitos humanos HaCaT irradiados con UVB. El pre-tratamiento de los queratinocitos con compuestos puros con estructuras de monogalactosil-monoacilgliceroles (MGMGs) y digalactosildiacildigliceroles (DGDGs), así como las fracciones ricas en monogalactosil-diasilgliceroles (MGDGs) o DGDGs redujeron significativamente el daño celular inducido por UVB, mediante la disminución de la liberación de LDH, ROS y la producción de IL-6. Este estudio preliminar nos permitió la selección de los compuestos más activos, que fueron la fracción de glicolípidos MGDG y el glicolípido puro MGMG-A, para su estudio posterior en modelos in vivo(Capítulo 1). En el primer modelo in vivo, se estudiaron la fracción MGDG y el glicolípido puro MGMG-A, en un modelo de hiperplasia epidérmica inducida TPA en ratones Swiss CD-1. Son numerosas las evidencias que muestran que la exposición de la piel a un activador de la proteína kinasa C, como es el 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), induce una respuesta pleiotrópica en el tejido, dando lugar al desarrollo de lesiones macroscópicas como descamación y eritema, lo cual se asemeja al fenotipo aparente de la psoriasis. En primer lugar, examinamos los efectos anti-inflamatorios de la aplicación tópica de MGDG y MGMG-A, disueltos en acetona (10 µg/µL, 200 µg por zona), comparándolos con la Dex como compuesto de referencia. Los tratamientos se aplicaron en un área delimitada de 1 cm2 en el dorso de los ratones y después de 30 minutos, se aplicó tópicamente el TPA (disuelto en acetona a 2 nmol por zona), en las mismas áreas durante 3 días. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con los glicolípidos disminuyó el edema, el espesor de la epidermis y la producción de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-17. Sin embargo, es sabido que la aplicación tópica de compuestos requiere una adecuada incorporación de las moléculas bioactivas en una fórmula que ofrezca estabilidad, que permita la permeación y que permanezca el suficiente tiempo en la piel. En este sentido, desarrollamos diferentes estudios de permeación in vitro, ex vivo e in vivo, para comparar el perfil de tres formulaciones diferentes (gel, pomada y crema). Los estudios in vitro y ex vivo se desarrollaron en células de Franz y se completaron con un estudio de permeabilidad in vivo, usando gel, pomada y crema con rodamina, lo que permitió evaluar la estabilidad de las formulaciones y las propiedades de permeación de las mismas a través de las capas de la piel. Los estudios de permeabilidad mostraron que la crema era la formulación con el mejor xvii perfil de permeación. Por tanto, estos resultados nos llevaron a evaluar una crema que contenía la fracción MGDG (MGDG-crema) (0.2 % p/p), en el modelo de hiperplasia en ratón, comenzando esta vez el tratamiento 2 días antes de la primera aplicación de TPA. En concordancia con la actividad anti-inflamatoria demostrada in vitro con esta fracción, la aplicación de la crema disminuyó el edema provocado por el TPA, mejoró los daños histopatológicos y redujo el infiltrado celular. Cabe destacar que estos resultados fueron más significativos con la aplicación de la crema que con la fracción disuelta en acetona. Además, esta formulación inhibió la expresión epidérmica de COX-2 de manera similar, alcanzando niveles similares a la Dex. Por tanto, nuestros datos muestran por primera vez el efecto preventivo de los glicolípidos en patologías inflamatorias de la piel como la psoriasis y sugieren que la fracción formulada en crema podría ser una interesante estrategia terapéutica para el tratamiento de esta patología (Capítulo 2). El siguiente estudio nos condujo a la evaluación del efecto anti-inflamatorio, antioxidante y fotoprotector del carotenoide fucoxantina (FX) aislado de Isochrysis galbana en modelos tanto in vitro como in vivo. En primer lugar, la actividad anti-inflamatoria fue evaluada en macrófagos THP-1 estimulados con LPS y en queratinocitos HaCaT estimulados con TNF-α y la actividad antioxidante en queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (50 mJ/cm2). Nuestros resultados mostraron una disminución de las citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-6, así como un efecto protector de la FX, debido a la reducción de la producción intracelular de ROS y LDH. Estos datos nos llevaron a evaluar el posible efecto preventivo de la FX en dos modelos in vivo: un modelo de hiperplasia epidérmica inducida por TPA en ratones Swiss CD-1, y un modelo de eritema agudo inducido por UVB en ratones sin pelo SKH-1, expuestos a una irradiación de 360 mJ/cm2. Con el objeto de evitar los efectos negativos derivados del uso de disolventes como la acetona y de aumentar la permeabilidad de la FX a través de la piel, se formuló una crema que contenía el carotenoide (FX-crema) para su aplicación a los animales (0.2 % p/p). Los resultados del modelo de TPA mostraron que el pre-tratamiento con la FX-crema efectivamente mejoraba la hiperplasia en ratón inducida por TPA, reduciendo significativamente el edema de la piel, el espesor de la epidermis y la actividad de la MPO, así como la expresión epidérmica de los niveles de COX-2. Por otro lado, los datos obtenidos del modelo de exposición a UVB xxvi like receptor 7 and 8 agonist, which, topically applied to the back of the Balb/c female mice, induces skin inflammation accompanied by structural features typical of psoriasis. Since the effectiveness of topical application of RA can be limited by its low liposolubility, stability, photo-oxidation or photo-degradation, we used nanoliposomes to encapsulate this polyphenol. Topical treatment with RA- gel and RA-loaded nanoliposomes in gel (0.2 % w/w) 30 min prior to IMQ application (62.5 mg per site for 6 consecutive days) inhibited macroscopic damage and the skin punch weight, suggesting an inhibition of skin edema, neutrophilic infiltration, MPO activity and the expression of pro-inflammatory cytokines as TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL- 17. RA-gel showed better results than RA-loaded nanoliposomes in gel. This could be due to that the dissociation constant (pKa) of RA at physiologic pH affected the liberation of this compound from nanoliposome to cell medium and, consequently, reduced its biological action. In stating that the chemistry structure of RA affects the formulation activity, would be necessary a specific NL elaboration for this kind of molecules. Contributing with these results to use of these systems in the pharmaceutical industry, since suppose hopeful vehicles for topical drug delivery systems due to their effectiveness to enhancing skin permeation and to delivering drug in skin specific areas(Chapter 4). Finally, we evaluated a possible synergism between the main compounds assayed in this thesis, FX and RA. For that purpose, these products were tested in an UVB-irradiated HaCaT human keratinocytes model at the dose of 5 µM, studying their mechanism of action and evaluating if a mixture of these compounds (5 µM of FX + 5 µM of RA) may improve the individual biological activity. Cell viability, cell cycle arrest, apoptosis induction and inflammasome mediators have been assessed in this study. The mixture has shown a better photoprotective and antioxidant effect than the individual compounds, by reducing cell death and the consequent increase of cell viability diminishing apoptosis and ROS production induced by UVB exposition in pre-treated cells. Furthermore, the mixture modulated inflammatory response by diminishing the expression of inflammasome components as NLRP3 and ASC, in addition to increase the expression of the antioxidant HO-1 protein levels through Nrf-2 signalling pathway (Chapter 5). In conclusion, our in vitro and in vivo studies have demonstrated the beneficial effects of some natural products, xxvii specially fucoxanthin and rosmarinic acid in inflammation, associated with UVB exposure and psoriasis. Their mechanisms of action could be related with the prevention of oxidative stress through of activation of Nrf2 pathways as well as with the reduction of inflammation via reduction of inflammasome components and other cytokines involved in NF-κB pathway. For this reason, these compounds could be promising molecules for their incorporation in many skin care products such as sun protectors and anti-aging creams, as well as for the treatment of inflammatory skin pathologies as psoriasis. Study of cytotoxic, antioxidant and protective activities of different glycolipids and carotenoids obtained from Isochrysis galbana, employing an UVB-irradiated HaCaT human keratinocytes in vitro model The fraction of glycolipids MGDG and the pure glycolipid MGMG-A, was selected to their evaluation on TPA-induced skin hyperplasia model in Swiss CD-1 mice The anti-inflammatory and photo-protective effect of the carotenoid fucoxanthin (FX) both in vitro and in vivo models. Firstly, the anti-inflammatory activity was studied in LPS-stimulated THP-1 macrophages (50 mJ/cm2) Evaluation of the preventive effects of FX-cream on UVB-induced acute erythema model in hairless SKH-1 mice (360 mJ/cm2) Evaluation of the preventive effects of FX-cream on TPA-induced epidermal hyperplasia in Swiss CD-1 mice The anti-inflammatory activity of glycolipids (MGDG and MGMG-A) was studied in LPS-stimulated keratinocytes Furthermore, we studied the topical effect of RA-loaded liposomes in the murine Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation model Finally, the main compounds employed in this thesis as FX and RA were evaluated in an UVB-irradiated HaCaT human keratinocytes in vitro model to elucidate their mechanism of action and evaluate if a mixture of these compounds might improve their biological activities INTRODUCCIÓN 3 BLOQUE A: PIEL, INFLAMACIÓN Y PATOLOGÍAS 1. PIEL Anatomía La piel es un órgano complejo integrado por células, tejidos y elementos de la matriz extracelular que median una importante función de barrera contra agentes patógenos, agresiones mecánicas o químicas, cambios de temperatura, o radiación ultravioleta (UV). Cabe destacar su función reguladora de los fluidos corporales, modulando la pérdida transcutánea de agua, el mantenimiento del equilibrio térmico y la transmisión de información externa que accede al organismo por el tacto, la presión, la temperatura y los receptores del dolor. Se trata del órgano de mayor tamaño, siendo su superficie media de 2 m2, según el peso y la altura del individuo. Tiene un espesor medio de 2 mm y representa el 6 % del peso corporal. Estructuralmente, la piel se encuentra dividida en tres capas de tejido. Desde el exterior hacia el interior, se encuentran (I) la epidermis, (II) la dermis y (III) la hipodermis o tejido subcutáneo (Figura 1). Mientras que la epidermis, y su capa más externa, el estrato córneo, constituyen una gran parte de la barrera física que proporciona la piel, la dermis y la hipodermis son las responsables de la integridad estructural de la piel como un todo. 1.1.1. Epidermis Figura 1: Corte transversal de piel y tejido subcutáneo. Imagen adaptada de (Tortora and Derrickson, 2013) 4 La epidermis se caracteriza por ser un epitelio plano poliestratificado y queratinizado que cubre la totalidad de la superficie corporal. Se trata de una estructura que se renueva continuamente y que da origen a estructuras derivadas denominadas apéndices (unidades pilosebáceas, uñas y glándulas sudoríparas). Es la capa que presenta mayor número de células, teniendo un espesor variable, de 0,1 - 2 mm según la zona del cuerpo. La mayor parte de las células en la epidermis son queratinocitos que están organizados en cuatro estratos o capas, que desde el exterior al interior corresponderían con: (I) estrato córneo (stratum corneum), (II) granuloso (stratum granulosum), (III) espinoso (stratum spinosum) y (IV) basal (stratum basale). En las zonas en la que la epidermis presenta un mayor grosor, cuenta con cinco capas al aparecer el estrato lúcido (stratum lucidum), el cual se encuentra situado entre la capa córnea y la granular. La mayor parte de células que componen la epidermis son queratinocitos, células capaces de sintetizar queratina, una proteína estructural, insoluble en agua y que presenta gran resistencia frente a cambios de pH y temperatura. Los queratinocitos se van diferenciando progresivamente a partir de células basales proliferativas, adheridas a la membrana basal epidérmica, hasta que terminan su diferenciación formando ya parte del estrato córneo queratinizado, el cual es la capa más externa de la piel. Entre estos queratinocitos, se encuentran intercalados otros tipos celulares como son los melanocitos (sistema pigmentario), células de Langerhans (sistema inmune) y células de Merkel (sistema nervioso). Otras células como los linfocitos, no suelen aparecer en la piel sana y, cuando aparecen, lo hacen de forma transitoria debido a que actúan en presencia de antígenos desencadenando la respuesta inmune cuando es necesario. Estrato basal Los queratinocitos constituyen el 80 % del total de las células de la piel. El proceso de diferenciación de un queratinocito o queratinización, consta de modificaciones morfológicas y eventos metabólicos programados genéticamente, cuyo fin es un queratinocito muerto terminalmente diferenciado (corneocito). En la capa basal es donde se localizan principalmente las células mitóticamente activas de la epidermis, las cuales ocuparán el espacio de las células erosionadas de la capa córnea. 5 Estrato espinoso La forma, estructura y propiedades moleculares de las células espinosas están relacionadas con su posición dentro de la epidermis. A medida que se van diferenciando, se van desplazando hacia la epidermis superior y se vuelven progresivamente más aplanadas, desarrollando gránulos laminares. Las células espinosas retienen las queratinas estables que se producen en la capa basal, pero no sintetizan nuevo ARN mensajero (ARNm) que dé lugar a estas proteínas, excepto en trastornos hiperproliferativos. En patologías como la psoriasis, la queratosis actínica (QA) o la reparación de heridas, se produce una disminución del ARNm de las proteínas de queratinas estables, viéndose favorecida la síntesis de queratinas propias de queratinocitos hiperproliferativos, lo cual provoca una discontinuidad en la diferenciación normal de las siguientes capas epidérmicas, granulosa y estratificada. Estrato granuloso Se denomina así por los gránulos queratohialinos basófilos, precursores de la queratina que se acumula en el citoplasma en forma de gránulos, adquiriendo la morfología típica de esta capa y siendo aquí donde se comienza a formar la envoltura de las células queratinizadas. La etapa final de la diferenciación de las células granulosas incluye la destrucción de las mismas, transformándose en corneocitos diferenciados. Estrato córneo La completa diferenciación celular de las células granulosas da lugar a capas apiladas de células sin núcleo, queratinizadas y aplanadas que forman el estrato córneo. Esta capa aporta a la piel la protección mecánica y actúa como barrera frente a la pérdida de agua y a la invasión de sustancias. El estrato lúcido y el estrato córneo están compuestos de células muertas, estrechamente empaquetadas y Figura 2: La epidermis consiste en un epitelio escamoso estratificado. Imagen adaptada de (Tortora and Derrickson, 2013) 6 rodeadas de lípidos. Estas capas protegen las más internas y son finalmente eliminadas por descamación conforme nuevos queratinocitos las van reemplazando. En condiciones fisiológicas, esta progresión tiene una duración de 28 días y va acompañada de cambios fundamentalmente en el contenido celular, que dan lugar a las diferentes capas visibles al microscopio (Figura 2). Debido a que el ciclo celular típico de un queratinocito tiene una duración aproximada de 6 días, no todas las células de la capa basal están activas a la vez. Sin embargo, en determinadas condiciones patológicas, como la psoriasis (Perera et al., 2012) o algunos tipos de Cáncer de Piel No Melanocítico (CPNM) como puede ser el Carcinoma Epidermoide Cutáneo (CEC), se produce una hiperproliferación de queratinocitos normales y atípicos que rompen la membrana basal e invaden la dermis subyacente formando islotes o cordones de células atípicas, con una tendencia variable a la queratinización (Xiang et al., 2017). 1.1.2. Dermis La dermis es un sistema complejo y vascularizado que sirve de soporte y alimento a la epidermis. Se encuentra formada principalmente por tejido conectivo fibroelástico, en el que se localizan las redes vasculares y nerviosas. Mientras que las células de la epidermis son numerosas e íntimamente asociadas, las de la dermis están separadas por un complejo conglomerado de material extracelular como el colágeno, la elastina y otras fibras extracelulares que dotan de fuerza estructural y flexibilidad a la piel. Las células principales de la dermis son los fibroblastos, pero también existen células del sistema inmune, terminaciones nerviosas y vasos sanguíneos encargados de irrigar tanto la dermis como la epidermis (Figura 1). Histológicamente, la dermis se divide en dos capas: la papilar (stratum papillare) y la reticular (stratum reticulare). Esta estructura es la que proporciona a la piel la elasticidad y capacidad de adaptarse a movimientos y cambios de volumen. Además, la dermis interactúa con la epidermis para mantener la unión entre ambas capas, e interviene en la reparación y remodelación de la piel después de sufrir heridas. 1.1.3. Hipodermis El límite entre la dermis reticular profunda y la hipodermis es la transición de un tejido conjuntivo dérmico predominantemente 7 fibroso a un tejido subcutáneo fundamentalmente adiposo. Aunque anatómicamente son diferentes, estructural y funcionalmente se encuentran integrados mediante nervios, vasos y apéndices epidérmicos. Los folículos pilosos en crecimiento activo, se extienden hacia la grasa subcutánea, encontrándose también a esta profundidad las glándulas sudoríparas. La masa principal de la hipodermis se encuentra formada por adipocitos organizados en lóbulos definidos por tabiques de tejido conjuntivo fibroso. El tejido subcutáneo o hipodermis actúa como reservorio de energía, aislante térmico y protector mecánico frente a golpes (Cordero, 1996; Wolff, et al., 2009). 2. INFLAMACIÓN El proceso inflamatorio o inflamación es un concepto antiguo, acuñado por primera vez en el siglo I por Cornelius Celso, que describe este proceso como la conjunción de cuatro puntos cardinales: enrojecimiento, hinchazón, calor y dolor. Así, el desarrollo de una enfermedad inflamatoria se definía como un desequilibrio de estos cuatro puntos (Majno, 1975)(Majno, G, Joris I, 2004). Posteriormente, se añadió a la definición la pérdida de función. Actualmente, el proceso inflamatorio agudo se considera una respuesta que tiene lugar en los tejidos vascularizados para defender al hospedador y mantener la homeostasis tisular, considerándose un proceso activo y altamente regulado que conlleva una resolución programada del mismo. Tradicionalmente, se ha considerado que el proceso inflamatorio puede eliminarse mediante el catabolismo de los mediadores proinflamatorios. Sin embargo, ésta es sólo una fase del proceso de resolución de la inflamación, ya que, una vez las células inmunes o polimorfonucleares (PMNs) han cumplido su misión, deben eliminarse de forma controlada y efectiva, debido a que pueden ocasionar daños si permanecieran infiltradas en el tejido. Para la resolución completa de la inflamación, estas células inflamatorias deben ser devueltas nuevamente al torrente sanguíneo (proceso no bien conocido hasta el momento) o bien se produce una muerte local de éstas, para ser retiradas, mediante fagocitosis, por los macrófagos. Tras esta fagocitosis, parte de estos macrófagos saldrían de la zona inflamada vía linfática y otros morirían por apoptosis (Serhan et al., 2007). Si estos acontecimientos transcurren de esta forma, la inflamación aguda se resolverá sin causar excesivos daños tisulares, impidiendo que la inflamación persista provocando las consecuentes complicaciones, como una inflamación crónica o fibrosis del tejido. 8 Pueden ser diversos los estímulos que causen una lesión tisular, bien de tipo exógeno o endógeno, dando lugar al desarrollo de un proceso inflamatorio, por lo que el tipo y el grado de respuesta inflamatoria dependerán tanto de la naturaleza del agente que la provoque, como de la persistencia del mismo. En este sentido se pueden desarrollar o exacerbar diferentes patologías inflamatorias, de tipo inmune, como la psoriasis o las ocasionadas por un agente externo como es el eritema cutáneo por exposición al sol, el cual puede degenerar en lesiones precancerosas y cáncer de piel. Psoriasis La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel, de carácter autoinmune, cuyas manifestaciones clínicas son eritema, aumento del espesor de la piel y descamación cutánea. Las afectaciones cutáneas suelen aparecer en forma de placas eritematosas que frecuentemente cursan con prurito e incluso dolor. Aunque puede afectar a cualquier región corporal, las zonas más afectadas son los codos y las rodillas, además de la zona sacra, el cuero cabelludo o las uñas (Perera et al., 2012) (Figura 4). Clínicamente, esta enfermedad se puede clasificar en lesiones pustulosas y no pustulosas. Existen varios tipos de psoriasis, pero las más comunes se encuentran dentro de las no-pustulosas, como son la psoriasis en gota, la artritis psoriásica y la psoriasis vulgaris, que es el fenotipo más común, constituyendo el 80-90 % de los pacientes psoriásicos (Sarac G, Koca T T, 2016). La psoriasis es una patología crónica que afecta al 2-4 % de la población mundial, presentando carácter recurrente, con periodos intermitentes de exacerbación y remisión. Actualmente, su etiología es desconocida, pero se conoce su carácter multifactorial donde se combinan factores tanto genéticos (hereditarios), como ambientales (alcohol, tabaco, infecciones, estrés, fármacos) que pueden favorecer su aparición, así como su desarrollo y exacerbación. El pronóstico de los pacientes con psoriasis no suele afectar a la salud general del paciente, es sólo en las manifestaciones más graves en las que se requieren tratamientos sistémicos. Sin embargo, resulta de gran importancia el impacto en la calidad de vida de los mismos, ya que al tratarse de una enfermedad que puede resultar visualmente impactante, en muchos casos puede llegar a condicionar la vida socio-profesional y emocional del paciente (Sala et al., 2016). 2.1.1. Fenotipo y características histopatológicas de la psoriasis 15 COX-2, siendo éste característico en lesiones psoriásicas (Schirmer et al., 2010). Otra citocina pro-inflamatoria presente de forma constitutiva en la piel sana es la IL-6, cuyos niveles se encuentran aumentados tanto en las biopsias como en el plasma de pacientes con psoriasis (Lowes et al., 2014). Es una de las primeras citocinas de la inmunidad innata cuya síntesis aumenta junto a la IL-1β y el TNF-α y, su importancia radica en su capacidad de iniciar la diferenciación de células T a Th17 y bloquear las funciones de las células T (Kupetsky et al., 2013). La IL-8 es un miembro de la familia de las quimiocinas (CXC) que estimula la quimiotaxis y desgranulación de los neutrófilos, induce la angiogénesis y ejerce gran influencia sobre la función de los queratinocitos (Pietrzak et al., 2008). La IL-8 se sintetiza por una gran cantidad de células implicadas en el proceso inflamatorio, como los monocitos, las células endoteliales y con un papel destacado, los queratinocitos (Ozawa et al., 2005). Su principal papel lo lleva a cabo activando a los neutrófilos, los cuales están involucrados en la activación de las células T y en la proliferación de los queratinocitos (Li et al., 2003). En psoriasis, los neutrófilos se encuentran principalmente en la epidermis y, cuando se activan por diferentes CXC, aumentan los niveles de citocinas pro-inflamatorias como la IL-17 (Figura 6) (Mahil et al., 2016). Además, esta acumulación de neutrófilos va acompañada de la liberación de grandes cantidades de IL-8, lo que se relaciona con el desarrollo de patologías inflamatorias crónicas, tales como la psoriasis (Tuschil et al., 1992). Se ha observado que en modelos animales de inflamación aguda, anticuerpos neutralizantes de la IL-8 reducen considerablemente la función de los neutrófilos y resuelven la inflamación. Por lo tanto, la neutralización de la actividad de la IL-8 representa una estrategia terapéutica para enfermedades inflamatorias crónicas (Pietrzak et al., 2008; Wu et al., 2017). 16 Figura 6: Esquema resumen de células y citocinas implicadas en la inmunopatogénesis de la psoriasis. Abreviaturas: MHC, complejo mayor de histocompatibilidad; TCR, receptor de células T; IL, interleucina; IFN-γ, interferón gamma; TFG-β, factor de crecimiento transformante beta; TNF, factor de necrosis tumoral. Adaptado de (Perera et al., 2012). 2.1.4. Farmacoterapia En la actualidad, no se dispone de ningún tratamiento curativo para la psoriasis, por lo tanto, el fin de los tratamientos asignados para esta patología es paliar los síntomas y disminuir la gravedad y extensión de las lesiones. Existen una gran variedad de terapias que incluyen los tratamientos tópicos o fototerapia, seguidos de los tratamientos sistémicos y los fármacos biológicos en las formas más severas. La elección del tratamiento se realiza utilizando herramientas de medida validadas como el grado y la extensión de las lesiones (Psoriasis Area Severity Index (PASI)), la valoración global por parte del médico (Physician Global Assessment (PGA)) y el índice de calidad de vida dermatológica (Dermatology Life Quality Index (DLQI)). Debido a la naturaleza crónica de estos tratamientos, aparecen inconvenientes como el coste elevado, las reacciones adversas o las comorbilidades que pueden limitar su elección y/o uso de largos periodos de tiempo (Sala et al., 2016). En este sentido, el primer escalón terapéutico empleado es el tratamiento tópico, que se basa en el uso de corticoides, queratolíticos, antralinas (ditranol), alquitranes y derivados de la vitamina D (calcipotriol) o de la vitamina A (retinoides), algunos de los cuales pueden combinarse con 17 fototerapia con luz UVA o UVB (Almutawa et al., 2015) (Warren et al., 2016). Actualmente, la primera línea de tratamiento son los corticoides (Figura 7), tanto en monoterapia como en tratamiento complementario en la terapia sistémica. Tienen propiedades anti-inflamatorias, antimitóticas, apoptóticas, vasoconstrictoras e inmunomoduladoras. Se clasifican en 4 clases según su potencia anti-inflamatoria: (I) leve, (II) moderadamente potente, (III) potente, y (IV) muy potente, siendo imprescindible el conocimiento de su clasificación para su aplicabilidad (Uva et al., 2012). Se sabe que los corticoesteroides tienen una tolerabilidad favorable cuando se usan en diferentes rangos terapéuticos, pero la continua exposición a los mismos está asociada a problemas tanto cutáneos (atrofia y aclaramiento de la piel o dermatitis) como sistémicos (supresión del eje hipotálamo-hipofisario, originando insuficiencia suprarrenal), los cuales se relacionan de forma directa con la potencia del corticoide (Gastaldello et al., 2017). Por todo ello, y teniendo en cuenta el carácter crónico de los tratamientos, su aplicación conlleva una implicación importante por parte del paciente, en términos de seguridad y/o eficacia (Queille- Roussel et al., 2015). En relación a la fototerapia, que consiste en la exposición de la piel a longitudes de onda de luz UV bajo supervisión médica, la más empleada es la PUVA. Ésta resulta de la combinación de un Psoraleno oral (metoxaleno) y la radiación de la zona afectada con luz UVA (Hemne et al., 2017). Aunque es muy común recomendar la exposición solar natural de forma controlada, la exposición a luz UVB bajo supervisión médica y dirigida ha sido desarrollada para evitar la exposición de la piel sin lesiones. Este tipo de terapia permite aplicar mayores dosis de UVB sobre las lesiones, lo que mejora considerablemente el aclaramiento de las placas psoriásicas (Almutawa et al., 2015). 18 Figura 7: Esquema de los diferentes tratamientos empleados en la psoriasis según la severidad del paciente. La elección del tratamiento se realiza utilizando herramientas de medida validadas como el grado y la extensión de las lesiones (Psoriasis Area Severity Index (PASI)), la valoración global por parte del médico (Physician Global Assessment (PGA)) y el índice de calidad de vida dermatológica (Dermatology Life Quality Index (DLQI)). Abreviaturas: UV, ultravioleta; MTX, Metotrexato. Si fracasan los tratamientos anteriormente citados, se recurre a la terapia por vía sistémica, siendo numerosos los fármacos empleados. Los inmunosupresores, como el metrotexato o la ciclosporina A, eran las principales elecciones en las formas más severas, sin embargo, se han ido sustituyendo debido a su elevada toxicidad y eficacia moderada, que comprometía, en gran medida, la vida de los pacientes más graves (Visser and van der Heijde, 2009; Delyon et al., 2015; Fink et al., 2017). En los últimos años, hemos sido testigos de una auténtica revolución en la farmacoterapia de la psoriasis respecto al uso de agentes biológicos, que han permitido el tratamiento efectivo de las formas más severas de la enfermedad. En la actualidad, disponemos de siete agentes biológicos aprobados; Alefacept (Anti-CD2), Etanercept, Infliximab y Adalimumab (Anti-TNF-α), Ustekinumab (Anti-IL-12/IL-23), Brodalumab e Ixekizumab (Anti-IL-17A) (Kazemi et al., 2017). Además, hay otros fármacos que se encuentran en las fases más avanzadas de los ensayos clínicos como son: Secukinumab (anti-IL-17A), Briakinumab (anti IL-12/IL-23), Guselkumab o Tildrakizumab (Anti-IL-23) (Dong and 19 Goldenberg, 2017) (Hanley and Yiu, 2017). Sin embargo, la mayoría de los pacientes no se beneficiarán de estos nuevos tratamientos, al menos a corto plazo; el elevado coste de las terapias biológicas, la vía de administración parenteral, y el riesgo de aparición de reacciones adversas graves, limita el uso de este tipo de agentes en los casos leves-moderados, que suponen el 90 % de los pacientes diagnosticados (Feldman et al., 2016). Por lo que, pese a los grandes avances logrados en las terapias sistémicas, los tratamientos tópicos empleados rutinariamente han permanecido invariables durante los últimos 20 años. 2.1.4.1. Nuevos horizontes La búsqueda de nuevas moléculas sencillas, aptas para el tratamiento de las formas menos agresivas de la enfermedad, supone un área de especial interés dentro de la actual farmacoterapia de la psoriasis. Durante el desarrollo de esta tesis, nos centraremos en la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos de origen natural, con los que elaboraremos diferentes fórmulas galénicas para su aplicación vía tópica. En este sentido, la aparición de nuevos sistemas de administración de fármacos abre nuevas puertas al tratamiento de enfermedades dermatológicas. En los últimos años, se ha incrementado el interés por la utilización de las vesículas lipídicas para el desarrollo de formulaciones basadas en liposomas y estructuras coloidales como sistemas portadores de fármacos activos. La utilidad fundamental de estos vehículos radica en conseguir formulaciones eficaces y seguras que mejoren la calidad de vida del paciente, basándose en una mejora en la penetración a través de la piel y la acumulación de fármaco en los diferentes estratos. La capacidad hidratante de las vesículas lipídicas y sus interacciones con los lípidos de la piel, son la posible razón de la mejora en el transporte cutáneo de los fármacos. El desarrollo de nuevos sistemas de liberación basados en sistemas lipídicos se presenta como una alternativa capaz de ejercer un control sobre el comportamiento fisicoquímico, en general, y biofarmacéutico, en particular, de los compuestos (Gonzalez-Rodriguez et al., 2007) (González-Rodríguez and Rabasco, 2011). Otra ventaja adicional de estos sistemas estriba en su capacidad para encapsular moléculas tanto de naturaleza lipófila como hidrófila (Maestrelli et al., 2005). Estos sistemas han sido ampliamente evaluados como potenciales sistemas portadores de fármacos 20 para su uso en terapéutica, por su capacidad de alterar las propiedades farmacocinéticas y reducir la toxicidad de los fármacos que se incorporan en ellos (Maestrelli et al., 2006). La aplicación de formulaciones de liposomas por vía tópica ha sido propuesta como una de las más relevantes y con mayor eficacia en el tratamiento de trastornos dermatológicos. Estas formas de administración, gracias a los fosfolípidos que contienen como componentes mayoritarios, así como a sus características estructurales, han permitido encapsular numerosos polifenoles en liposomas, con aplicaciones en el tratamiento del cáncer de piel o infecciones vaginales (Jøraholmen et al., 2015). En esta línea, la administración de fármacos a través de liposomas o similares por vía tópica para paliar los síntomas de la psoriasis, ya está siendo investigada (Zhang et al., 2014; Moghddam et al., 2016; Kumar et al., 2016; Doppalapudi et al., 2017). Efectos de la radiación UV en la piel 2.2.1. Radiación ultravioleta La luz solar es un elemento vital para los seres humanos, pero a la vez es fuente de radiaciones que dañan la piel, proceso conocido como fotodaño. La exposición al sol de forma excesiva a lo largo del tiempo predispone, por acción acumulativa, a la aparición de afecciones dermatológicas de tipo estéticas y de poca gravedad como el fotoenvejecimiento, la hiperpigmentación o las arrugas, además de dar lugar a otras consecuencias más severas como el cáncer de piel. El espectro solar está integrado principalmente por la radiación UV, que se divide en UVC (100-280 nm), UVB (280-315 nm) y UVA (315- 400nm), así como la luz visible (400-770 nm) y los rayos infrarrojos (> 700 nm). De todas ellas, la luz UVC es bloqueada por la capa de ozono, mientras que la UVB y UVA son las que atraviesan las diferentes capas de la atmósfera y entran en contacto con la piel (Figura 8) (Rass and Reichrath, 2008). 21 Figura 8: Efectos de la radiación solar en la piel según la longitud de onda (nm). Abreviaturas: IR, infrarrojo; UV, ultravioleta. Los efectos nocivos de la radiación UV sobre la piel son ampliamente conocidos, aunque su mecanismo de acción no lo es tanto (Figura 9). Los UVA corresponden al 95 % de la radiación UV y la piel recibe 1000 veces más UVA que UVB, ya que están presentes todo el día. Estas radiaciones penetran hasta la dermis profunda, producen bronceado de corta duración, fotoenvejecimiento, cáncer de piel, reacciones por fotosensibilidad medicamentosa y daño en la retina (Matsumura and Ananthaswamy, 2004). Sin embargo, aunque de la radiación UVB llega sólo un 10 % a la piel, es más energética que la UVA y se concentra a las horas con más intensidad solar, entre las 10 y 16 horas. El UVB penetra desde las capas más superficiales de la piel hasta la capa basal de la epidermis, donde genera ROS y de nitrógeno (RNS) nocivas. Es la principal responsable de la quemadura solar y el bronceado prolongado; también favorecen el envejecimiento cutáneo, la inflamación, la inmunosupresión cutánea y el cáncer de piel (Duncan et al., 2009). La radiación UVC es absorbida por la capa de ozono y son muy peligrosos en cuanto a su acción eritematógena y cancerígena. En los últimos años, en los que cada vez son más palpables los efectos del cambio climático, se ha notado una gran disminución de la capa de ozono, lo que ha permitido un incremento de la infiltración de rayos UVC hacia la superficie terrestre afectando, entre otros aspectos, al riesgo de sufrir lesiones cancerígenas (Schuch and Menck, 2010; Lucas et al., 2015). 22 Es importante destacar que los datos más recientes tanto epidemiológicos, clínicos, como los estudios en modelos animales, apuntan a la radiación UV solar como elemento clave inductor de inflamación. Esta condición, establecida de manera permanente, pero de bajo nivel, de tal manera que no provoca manifestaciones clínicas alarmantes, favorece la aparición de lesiones como la QA, incrementa el envejecimiento celular y facilita el desarrollo de cáncer de piel (Zhan et al., 2016). Figura 9: Esquema resumen de cómo afecta la exposición solar a lo largo del tiempo. Abreviaturas: ROS, especies reactivas de oxígeno; CPNM, Cáncer de piel no melanocítico; CBC, Carcinoma Basocelular; CEC, Carcinoma espinocelular. 2.2.2. Estrés oxidativo e inflamación Es sabido que el estrés oxidativo tiene una gran implicación en enfermedades crónicas con base inflamatoria tales como las enfermedades cardiovasculares (Mahmoud et al., 2017), la diabetes (Yang et al., 2017), las enfermedades de la piel (Caddeo et al., 2016a) o el cáncer (Saha et al., 2017). Entre los mecanismos moleculares que podrían explicar cómo un proceso inflamatorio permanente afecta a los tejidos, destaca el estrés oxidativo mantenido en el tiempo. Esta situación genera una sobreproducción de ROS, que se traduce en un desajuste de la respuesta inflamatoria, provocando un daño tisular. En el caso de enfermedades cutáneas, la exposición a luz 23 UV puede causar un aumento de ROS, lo que facilitaría el desarrollo de un proceso inflamatorio en la zona afectada. Las ROS, o también llamadas radicales libres de oxígeno, son una familia de moléculas generadas, transformadas y consumidas en el organismo como consecuencia de la vida aerobia y se producen principalmente a partir de las reacciones metabólicas. Las principales ROS que participan en estas reacciones son el anión superóxido ([O2].- ), el peróxido de hidrógeno (H2O2), el ácido hipocloroso (HOCl), el singulete de oxígeno (1O2), el radical hidroxilo ([OH].), y diferentes hidroperóxidos (ROOH). La principal fuente de O2- es la mitocondria o el retículo endoplasmático, seguidos de otros orgánulos como peroxisomas y fagosomas, los cuales median reacciones catabólicas de oxidación para obtener la energía para el organismo a través de reacciones de oxidación-reducción (redox) (Bergendi et al., 1999)(Chang, 2012). En condiciones fisiológicas existe un delicado equilibrio entre la producción de ROS y su eliminación mediante los sistemas de defensa antioxidantes de las propias células (equilibrio redox). Si este equilibrio es alterado hacia el aumento de ROS, se produce lo denominado como estrés oxidativo. Esto puede deberse a varias causas (Lushchak, 2014): - Incremento en los niveles endógenos de ROS, o de compuestos exógenos que entran en auto-oxidación acoplada a la producción de ROS. - Inactivación de la producción de enzimas antioxidantes y disminución de antioxidantes intracelulares de bajo peso molecular como el ácido ascóbico (Vitamina), tocoferol (vitamina E), carotenoides, etc. En condiciones fisiológicas, los niveles de ROS se encuentran dentro de unos parámetros estables. Sin embargo, estos niveles pueden aumentar fuertemente, de modo que si los sistemas antioxidantes son capaces de eliminar el exceso de ROS y volver a las condiciones homeostásicas, se trataría de una situación de “estrés oxidativo agudo”. Por el contrario, si el sistema antioxidante no es capaz de contrarrestar estos niveles, el aumento en la concentración de ROS podría tender a ser más estable en el tiempo y modificar ciertos componentes celulares, por lo que estaría distorsionando la homeostasis, dando lugar a un “estrés oxidativo crónico”, situación 24 que ocurre en las patologías como la psoriasis o la queratosis actínica (Figura 9). En cuanto a la radiación UV, se sabe que la exposición a la misma induce la respuesta inflamatoria con activación de células del sistema inmunitario con capacidad de generar ROS, como los neutrófilos (Wölfle et al., 2014). Estas ROS son también producidas por efecto directo de la radiación, pero en cualquier caso, desencadenan una serie de acontecimientos especialmente dañinos para la piel, incluyendo la producción de peróxidos lipídicos que favorecen la destrucción de la porción hidrofóbica de la membrana, y la generación de hidroperóxidos cíclicos altamente tóxicos por su implicación en la disfunción de la mitocondria y la afectación de órganos como el hígado. Actualmente, se trabaja en dilucidar los mecanismos moleculares capaces de explicar cómo un estado inflamatorio permanente afecta a los tejidos. Además del daño oxidativo, el componente inflamatorio supone la activación de varias vías de señalización intracelular reguladas por cinasas, como el activador mitógeno de proteína quinasa (MAPK) (Choi et al., 2017), la janus quinasa (JAK), y la señal de activación y traducción (STAT). Consecuentemente, se produce la activación de factores de transcripción como el NF-κB (Bosch et al., 2015), coordinándose así la producción de numerosos mediadores inflamatorios, incluyendo citocinas y quimiocinas (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10)(Terui and Tagami, 2000), PGs producidas por la actividad enzimática coordinada de la COX y de la prostaglandina sintetasa de membrana (mPGES-1)(Tang et al., 2017), así como óxido nítrico (NO), sintetizado por la enzima iNOS (Wu et al., 2017). Además, se produce la activación de factores de transcripción, que regulan la expresión de genes antioxidantes, como el factor nuclear eritroide 2 (Nrf2), entre otros. 2.2.3. Vías de señalización 2.2.3.1. Respuesta antioxidante Como se ha comentado anteriormente, el organismo dispone de moléculas y enzimas antioxidantes cuya síntesis se encuentra regulada por el factor Nrf2, el cual determina la señal de la respuesta antioxidante (Furue et al., 2017). 31 (Caddeo et al., 2016b), la taxifolina (Kim et al., 2015), o el ácido rosmarínico (Fernando et al., 2016), han recibido especial atención por sus efectos beneficiosos para la salud humana, debido a sus propiedades antioxidantes, anti-inflamatorias y antitumorales (Chinembiri et al., 2014; Działo et al., 2016; Costa et al., 2016). BLOQUE B. MOLECULAS EN ESTUDIO 3. MICROALGAS COMO FUENTE DE MOLÉCULAS BIOACTIVAS En base a la necesidad de nuevas alternativas terapéuticas para procesos inflamatorios, la quimioprevención con compuestos naturales está en auge en estos tiempos. La quimioprevención es un viejo concepto que consiste en el uso de medicamentos, vitaminas, o alimentos funcionales para reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad (Sporn, 2011). En este sentido, alternativas de interés surgen sobre la idea de que en cáncer la prevención de la inflamación sería de máximo provecho (Singh et al., 2014). Del mismo modo, compuestos anti-inflamatorios capaces de retrasar el fotoenvejecimiento de la piel serían excelentes estrategias alternativas o complementarias a la terapéutica actual. Tradicionalmente, los compuestos bioactivos procedentes de plantas han sido estudiados extensamente en el desarrollo de sustancias con actividades terapéuticas (Cragg et al., 2014). Sin embargo, en los últimos años, la necesidad de nuevas moléculas ha proporcionado numerosos estudios con compuestos procedentes de invertebrados o de microorganismos marinos. El mundo de las microalgas está poblado por sorprendentes especies que modulan sus capacidades metabólicas para adaptarse a un entorno en constante cambio. Las microalgas son organismos primigenios formados por una membrana lipídica que protege, con una serie de estructuras, a unas moléculas más o menos complejas, y a una maquinaria que les sirve para sobrevivir y perpetuarse. Tal y como comentábamos anteriormente, la investigación en la última década, ha llevado al descubrimiento de nuevos e interesantes compuestos de origen marino, acuñándose el término “productos naturales marinos”. En este sentido, las microalgas son las que centran gran parte de la actividad de nuestro trabajo debido al alto y variado contenido en moléculas bioactivas, entre las que se incluyen ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (PUFAs), polisacáridos, glicolípidos, o carotenoides. Las microalgas 32 han demostrado ser una fuente alternativa a sus homólogos terrestres de productos con uso farmacológico. Sus singulares características las hacen idóneas para obtener diferentes productos que han demostrado tener potente actividad biológica (Talero et al., 2015). Se ha demostrado que muchas de estas estructuras moleculares pueden ser potencialmente usadas como fármacos en el tratamiento de enfermedades como el cáncer, la inflamación crónica, infecciones y desórdenes neurológicos (Granado-Lorencio and Hernández-Alvarez, 2016; Ruiz-Torres et al., 2017; Valcarcel et al., 2017). En la Figura 15 se recogen los principales componentes de las microalgas, los cuales destacan por su actividad antioxidante y algunos en su mayoría antinflamatoria y anticancerígena (Talero et al., 2015). Figura 15: Principales compuestos obtenidos de las microalgas. En la presente Tesis Doctoral se han estudiado varios compuestos que se encuentran dentro del grupo de los glicolípidos, así como se ha profundizado en la actividad biológica de un carotenoide aislado de microalgas como es la fucoxantina. Glicolípidos Resultan de la unión de un lípido y un hidrato de carbono, y se caracterizan por formar parte de las membranas tilacoidales de los orgánulos fotosintéticos de plantas, algas eucariotas y cianobacterias (Nakamura and Li-Beisson, 2016). 3.1.1. Estructura 33 Los glicerolglucolípidos están formados por un azúcar y un glicérido, normalmente PUFAs ω-3, unidos mediante enlace glucosídico, siendo los principales los galactolípidos y sulfolípidos (Dominguez, 2013). Dentro de los galactolípidos, en los que el hidrato de carbono es la galactosa unida al glicérido por enlace tipo-β, se diferencian los monogalactosil-diacilgliceroles (MGDGs) y digalactosildiacilgliceroles (DGDGs). Los sulfolípidos son similares, pero presentan un grupo funcional de azufre en el hidrato de carbono, se unen al glicérido por enlace tipo-α y se nombran como sulfoquinovosildiacilgliceroles (SQAGs)(Figura 16) (Colombo et al., 2013). Figura 16: Estructuras de los glicolípido MGDG, DGDG, SQDG. Abreviaturas: MGDG, monogalactosil-diacilgliceroles; DGDG, digalactosil-diacilgliceroles; SQAG, sulfoquinovosil-diacilgliceroles (Plouguermé et al., 2014). 3.1.2. Actividad biológica Debido a su alto porcentaje lipídico, la principal aplicación de las microalgas es la obtención de biofuel, estableciéndose como una fuente con alto potencial para suponer una alternativa a las fuentes actuales (Yamane et al., 2013; Paniagua-Michel et al., 2014; Navarro López et al., 2016). Sin embargo, en los últimos años, han supuesto una revolución innovadora como fuente de ingredientes funcionales en alimentación, debido a su alto contenido en lípidos, proteínas e hidratos de carbono. Debido a su alta tasa de generación y requerimientos nutricionales simples, las microalgas pueden ser cultivadas a gran escala, bien en condiciones naturales o artificiales mediante el uso de fotorreactores, suponiendo en los últimos años, microorganismos de gran interés para la explotación biotecnológica en las industrias química, alimentaria y farmacéutica. En relación a la actividad biológica que desempeñan, los glicolípidos han destacado principalmente por su función como antitumorales y anti-inflamatorios. Para los primeros estudios con 34 glicolípidos de microalgas se utilizó Gymnodinium mikimotoi, microalga perteneciente al género de las Dinoflageladas, especie que destacó por su contenido en MGDG y DGDG, y por su actividad hemolítica, la cual fue asociada con la actividad citotóxica que se producía en ciertas especies de peces al ingerir dicha microalga (Parrish et al., 1998). Sin embargo, estos compuestos se distinguen por su actividad anticancerígena, la cual ha sido ampliamente demostrada en estos años. En este sentido, determinados glicolípidos con estructura monogalactosil-monoacilglicerol (MGMG), MGDG, DGDG y SQDG han destacado por su capacidad de inhibir a la ADN-polimerasa y la topoisomerasa II, por lo cual se les ha atribuido el papel de inmunosupresores y agentes antitumorales (Matsumoto et al., 2000; Maeda et al., 2005). Numerosos estudios han demostrado su efecto antitumoral en diferentes líneas celulares, destacando su selectividad por células tumorales, sin afectar a las células sanas, sugiriendo que este tipo de estructuras moleculares podrían tener gran potencial como agentes anti-tumorales (Matsui et al., 2009). Estudios realizados en diferentes líneas tumorales, incluyendo tejidos gástricos (Murakami et al., 2003; Mizushina et al., 2003; Kuriyama et al., 2005), melanoma (Maeda et al., 2005), colon (Hossain et al., 2005) y cérvix (Maeda et al., 2007a)(Maeda et al., 2007b), sirvieron como precedente para realizar ensayos con animales a los que se les administraron preparados con MGDG por vía oral para estudiar la progresión de tumores en colon. Se observó el papel antitumoral, debido a la inhibición de la angiogénesis y a la acción anti-proliferativa de células tumorales por un aumento de la apoptosis (Maeda et al., 2008; Maeda et al., 2013). Los glicolípidos de microalgas comienzan a tener un papel importante para su aplicación en patologías inflamatorias gracias a los estudios de Banskota et al. 2013b, en los que demostraron su capacidad de interferir en los mecanismos de acción del óxido nítrico (NO). En este sentido, extractos de Tetraselmis chui y Palmaria palmata mostraron un efecto inhibitorio de la producción del NO inducida por LPS en macrófagos RAW254.7, así como una disminución de la actividad de la enzima iNOS, en el caso de P. palmata (Arjun H. Banskota et al., 2013; Banskota et al., 2014). 3.1.3. Estudios con glicolípidos en piel Los efectos de los glicolípidos aislados de microalgas frente a inflamación y cáncer de piel, así como sus mecanismos de acción, han 35 sido ampliamente estudiados, empleando tanto modelos in vitro como experimentos con animales. En este sentido, Colombo et al. 2000 investigaron varios glicoglicerolípidos sintéticos con el fin de valorar su actividad frente a la incidencia de tumores de piel. Para ello, utilizaron un modelo en el que el tumor se inició con dimetilbenz[a]antraceno (DMBA) y se continuó con TPA durante 20 semanas, observándose progresivamente el aumento en la incidencia de papilomas. El tratamiento tópico con este tipo de compuestos, redujo tanto la incidencia (número de ratones que expresaron tumores), así como la multiplicidad (número de tumores por animal), en comparación con el grupo control sin tratamiento. Sería más adelante, cuando evaluarían el mecanismo de acción de dichos compuestos con experimentos en fibroblastos estimulados con el agente promotor de tumores TPA, confirmando la disminución de la traslocación de la proteína kinasa C (PKC) (Colombo et al., 2011), proteína relacionada con procesos de crecimiento celular e implicada en la señalización de mecanismos vinculados a la carcinogénesis (Foster et al., 2012). Posteriormente, estos autores avanzaron en su investigación sintetizando nuevos glicolípidos con el fin de buscar estructuras que presentasen una mejor respuesta en los modelos tumorales de piel estudiados (Colombo et al., 2013). En relación con la actividad anti-inflamatoria, se han desarrollado modelos de inflamación en oreja y pata de ratón, en los que diferentes compuestos MGDG y DGDG fueron aplicados por vía tópica disueltos en etanol. La actividad anti-inflamatoria de un compuesto MGDG aislado de un alga azul, Phormidium sp ETS-05, destacó en comparación con los agentes usados de referencia, betametasona, en el caso del modelo de inflamación en oreja, e indometacina, empleado en el modelo en pata de ratón, planteando el posible mecanismo de acción del mismo por su actuación sobre la COX-2 e iNOS (Bruno et al., 2005). Con respecto a la inflamación inducida por UVB, existen pocos trabajos que hayan evaluado la actividad de estos compuestos en este tipo de modelos. Se ha confirmado la actividad anti-inflamatoria de una fracción aislada del alga parda Sargassum fulvellum, por su supresión de enzimas como la COX-2, iNOS o PGE2, cuya síntesis es inducida tras la exposición a UVB, tanto en modelos in vitro con queratinocitos humanos inmortaizados HaCaT como en modelos con animales empleando ratones Balb/c (Lee et al., 2013). Carotenoides 36 Los carotenoides son pigmentos naturales biosintetizados por todos los organismos fotosintéticos y algunos hongos y bacterias no fotosintéticas. Estos pigmentos se encuentran ampliamente repartidos entre los seres vivos, estimándose una producción anual de más de 100,000.000 toneladas, destacando la fucoxantina, procedente de diversas especies de microalgas, seguida de los tres carotenoides presentes en las hojas verdes como son la luteína, violaxantina y neoxantina. El reparto de los carotenoides en las plantas no presenta un patrón único; así, en verduras se concentran en mayor proporción luteína, β-caroteno, violaxantina y neoxantina, mientras que en frutos encontramos en mayor medida xantofilas, aunque hay excepciones como el tomate en el que el licopeno es el carotenoide mayoritario (Meléndez- Martínez et al., 2004). Respecto al reino animal, son incapaces de sintetizar carotenoides, por lo que deben incluirlos en su dieta. En el caso de los animales, estos carotenoides son los responsables del color característico de ciertas especies (como es el caso del salmón, cangrejo o gamba). Sin embargo, los humanos los incorporamos a nuestra dieta y son útiles, en nuestro organismo, por su función como precursores de compuestos esenciales, como la vitamina A. Los carotenoides que encontramos en mayor proporción en nuestro organismo son el β-caroteno y α-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina y α- y β-criptoxantina, los cuales, tras ser ingeridos, son transportados hasta la piel y acumulados en las capas de la epidermis. La cantidad de los pigmentos en el organismo variará en función del aporte dietético de cada individuo, así como de la biodisponibilidad de los mismos en los alimentos (Fernández-García, 2014). Entre las numerosas fuentes de carotenoides, las microalgas son consideradas uno de los principales reservorios. Por esta razón, las microalgas no sólo se emplean para aislar compuestos puros, sino que se posicionan como un potencial ingrediente para su incorporación en alimentos funcionales debido a sus múltiples actividades biológicas descritas (Matos et al., 2017). 3.2.1. Estructura Los carotenoides son compuestos con estructura isoprenoide, que contienen una serie de dobles enlaces conjugados, lo que conforma el grupo cromóforo. La presencia de este grupo, además de ser el responsable de los colores amarillos, naranjas o rojos, les proporciona la capacidad de captar la energía luminosa, en el caso de organismos fotosintéticos, para transferirla a las clorofilas de los sistemas fotosintéticos donde se transforma, durante la fotosíntesis, 37 en energía química (Meléndez-Martínez et al., 2007). Estos compuestos se pueden clasificar en dos subgrupos atendiendo a su composición química: los carotenos y las xantofilas. Los carotenos son hidrocarburos lineales o cíclicos en uno o ambos lados de la cadena. Los más importantes son α- y β-caroteno y licopeno, destacando por su papel en la síntesis de vitamina A, esencial para determinadas funciones biológicas. Respecto a las xantofilas, son derivados oxigenados, y destacan la astaxantina, luteína o fucoxantina, cuya aplicabilidad es fundamentalmente como antioxidantes y colorantes. 3.2.2. Actividad biológica Numerosas evidencias indican los efectos beneficiosos de los carotenoides para la salud humana. Si bien se conocen por su papel antioxidante y anti-inflamatorio, sus acciones se relacionan con su capacidad para modular la expresión de diferentes genes. Los efectos de algunos carotenoides se relacionan con su actividad provitamina A (β-caroteno y β-criptoxantina); sin embargo, otros carotenoides, que no presentan esta actividad, también presentan claros efectos beneficiosos sobre la salud. Son numerosas las propiedades biológicas que se les han atribuido a estos compuestos debido al efecto que ejercen en patologías crónicas como la ateroesclerosis (Howard and Thurnham, 2017), trastornos metabólicos (dislipemias) (Deng et al., 2017), enfermedades cardiovasculares (Chung et al., 2017), diabetes mellitus (Roohbakhsh et al., 2017), patologías neurodegenerativas (Kim et al., 2017), y patologías oculares como la degeneración macular asociada a la edad (Bernstein et al., 2016). Además, presentan una importante actividad anti-tumoral, siendo numerosos los estudios que la avalan en diferentes líneas celulares, recientemente revisados en Hoshyar and Mollaei 2017. 3.2.3. Estudios con carotenoides en piel Los carotenoides siempre han destacado por su papel antioxidante debido a su estructura, lo cual se ha relacionado con el papel fotoprotector frente al daño solar (Stahl and Sies, 2012b). Numerosos estudios, tanto in vitro como in vivo, atribuyen a los carotenoides un papel fotoprotector, planteando diferentes mecanismos de acción. Yoshihisa et al. 2014, observaron que la astaxantina disminuyó la expresión de COX-2 e iNOS, los niveles de citocinas proinflamatorias IL-1β y TNF-α, y ciertos marcadores apoptóticos, en 38 queratinocitos HaCaT irradiados con UVB. Otros autores utilizaron queratinocitos humanos primarios irradiados y observaron que la astaxantina atenuaba la producción de transglutaminasa, un factor que regula la queratinización de la piel, interfiriendo en diferentes vías que confluyen en la activación de NF-κB (Terazawa et al., 2015). De manera similar, la luteína, en células HaCaT irradiadas con luz UV, redujo la actividad de la metaloproteinasa MMP-9 y los niveles de TNF- α, confirmándose así la actividad anti-inflamatoria y sugiriéndola como un potente remedio para patologías inflamatorias de la piel (Oh et al., 2013). Por otro lado, la luteína y la zeaxantina, incorporadas a la dieta de ratones SKH-1 sin pelo y somentidos a irradiación UVB, mostraron un descenso significativo en la respuesta cutánea edematosa, entre otros parámetros, demostrando su capacidad de generar una respuesta anti-inflamatoria y antiproliferativa ante la exposición a esta radiación (González et al., 2003). Más recientemente, modelos in vivo con astaxantina, han puesto de manifiesto su papel antiinflamatorio, reduciendo la síntesis de citocinas pro-inflamatorias características de un modelo de dermatitis en ratón (Yoshihisa et al., 2016). La astaxantina también destaca por su papel fotoprotector, atenuando varios parámetros asociados al fotodaño como son la pérdida de agua transepidermal o la aparición de arrugas, en un modelo de ratones SKH-1 irradiados con UVA, a los que se administraba en la dieta, astaxantina obtenida de la microalga Haematococcus pluvialis (Komatsu et al., 2017). Siguiendo esta línea, Cooperstone et al. 2017, evaluaron el efecto protector de una dieta con tomate frente a otra libre del mismo, en un modelo de tumores de piel inducidos por UVB. Los resultados mostraron que los animales que consumían tomate, con alto contenido en licopeno seguido de fitoeno, presentaban menor número de tumores en comparación con los que tenían una dieta exenta de tomate. Por estas razones, los carotenoides, principalmente licopeno, βcaroteno y luteína son considerados compuestos de interés por su aplicabilidad en la industria cosmética, de modo que son incorporados en formulaciones fotoprotectoras debido a su demostrada actividad biológica (Corinaldesi et al., 2017). βcaroteno El β-caroteno es el carotenoide más conocido y consumido por los humanos ya que se encuentra en numerosas frutas y verduras. En 39 relación a las fuentes marinas, se halla principalmente en especies de microalgas pertenecientes a los géneros Dunaliella y Haematococcus. El β-caroteno se convierte en el principal precursor de la vitamina A, ya que su estructura simétrica (Figura 17) es capaz de dividirse en dos moléculas de trans-retinol, convirtiéndose así en una importante fuente de esta vitamina A (Grune et al., 2010). Figura 17: Fórmula estructural plana del β-caroteno (Meléndez-Martínez et al., 2004). Algunos de sus efectos antioxidantes y anticancerígenos se asocian a esta transformación en retinol, molécula que interviene y controla numerosos procesos como embriogénesis, crecimiento, proliferación celular, apoptosis, visión ocular, formación de huesos, metabolismo y procesos inmunitarios (Chelstowska et al., 2016; Moreb et al., 2017; Milani et al., 2017). Los primeros estudios in vitro analizaron su potencial antioxidante, mostrando que reducía la inactivación inducida por UV de enzimas antioxidantes como la catalasa y la SOD. Este pigmento, entre otras de sus funciones, ha demostrado prevenir la expresión de HO-1 en fibroblastos irradiados con UVA, evitándose así mecanismos que desencadenan la respuesta oxidante (Trekli et al., 2003). En esta línea, estudios en fibroblastos pretratados con un extracto rico en β-caroteno, y posteriormente estresados con H2O2, mostraron un incremento en la viabilidad celular, así como una significativa reducción de la cantidad de ROS, la peroxidación lipídica y el daño en el ADN, lo cual se acompañó de una mejora en la funcionalidad de la mitocondria, aumentando la capacidad regenerativa de las células tras la exposición al estímulo prooxidante (Giampieri et al., 2014). La actividad anti-inflamatoria y antioxidante del β-caroteno también se ha puesto de manifiesto en modelos in vivo. En este sentido, los efectos de este pigmento han sido evaluados en modelos de inflamación en oreja, mostrando una reducción del edema, así como de la actividad de la enzima MPO (Horváth et al., 2015b). La capacidad protectora de este compuesto también se demostró en un modelo de inflamación en piel de ratón inducida por ozono, reduciendo mediadores pro-inflamatorios tales como TNF-α, COX-2, e iNOS, así como marcadores 40 de estrés oxidativo como HO-1 (Valacchi et al. 2009). Además, se han llevado a cabo estudios en humanos que reflejan que la suplementación con este carotenoide previene el edema inducido por UVB, debido al efecto que ejerce sobre la peroxidación lipídica (Lee et al., 2000). En esta línea, un estudio en mujeres de más de 50 años demostró que la ingesta diaria de β-caroteno mejoró la presencia de arrugas, elasticidad y daño en el ADN inducido por la radiación UVB, lo que sugiere que este compuesto previene y repara las alteraciones asociadas al fotodaño (Cho et al., 2010). En estudios relacionados con CPNM, se ha descrito que pacientes con niveles reducidos de este pigmento en suero, debido a que su ingesta dietética es menor, presentan una mayor incidencia de desarrollar tumores de tipo no melanoma (Kune et al., 1992). En este sentido, se determinó que la aplicación de este compuesto por vía tópica evitó la disminución de los niveles totales de carotenoides en piel tras la exposición a radiación infrarroja, ejerciendo un efecto protector en voluntarios sanos irradiados, en comparación con los sujetos tratados solo con el vehículo (Darvin et al., 2011). Fucoxantina La fucoxantina es uno de los carotenoides más abundantes, constituyendo más del 10 % de la producción total de estos pigmentos en la naturaleza. Se caracteriza por su color naranja, se encuentra principalmente en algas pardas, macro y microalgas y diatomeas, y pertenece al grupo de las xantofilas (Chuyen and Eun, 2017). Respecto a su estructura, incluye un enlace aleno, inusual en carotenoides, y grupos funcionales oxigenados como epóxido, hidroxilo, carbonilo y carboxilo (Figura 18), responsables de su actividad antioxidante (Peng et al., 2011). Figura 18: Estructura química de la fucoxantina (Zhang et al., 2015). Debido a su carácter antioxidante, se le han atribuido actividades relacionadas con el secuestro de radicales libres (radical scavenging) (Sachindra et al., 2007), efectos anti-inflamatorios (Kim et al., 2010), anti-obesidad (Beppu et al., 2013), protector en 47 son su baja liposolubilidad, alta biotransformación (Baba et al., 2004), o reducida estabilidad por su rápida oxidación, ocasionada por la luz o el calor, dificultando, por tanto, su aplicación (Nunes et al., 2015). En este sentido, cada vez son más los autores que plantean alternativas para vehiculizar estos compuestos con el objetivo de proteger su estructura y/o aumentar su permeabilidad a través de la piel (Stelmakienė et al., 2015)(Ezzat et al., 2016). OBJETIVOS 51 En base a la necesidad de encontrar nuevas alternativas terapéuticas en el tratamiento de la psoriasis, la queratosis actínica o el cáncer de piel, la quimioprevención con compuestos naturales está tomando un importante papel en los últimos años. Así, compuestos antiinflamatorios capaces de reducir las manifestaciones clínicas de la psoriasis o de impedir el desarrollo frecuente de recidivas son excelentes alternativas complementarias a la terapéutica actual. Del mismo modo, la búsqueda de estrategias encaminadas a retrasar el fotoenvejecimiento de la piel para prevenir el desarrollo de lesiones pre-cancerosas presenta un gran interés en la actualidad. En los últimos años, las microalgas han emergido como fuente de compuestos bioactivos, incluyendo lípidos, proteínas, polisacáridos y carotenoides. Estos compuestos han atraído el interés de la industria farmacéutica y cosmética en base a sus actividades como antioxidantes, anti-inflamatorios y anti-carcinogénicos. Por todo ello, el objetivo general de esta Tesis Doctoral es valorar la potencial actividad biológica (antioxidante, antiinflamatoria y fotoprotectora) de compuestos lipídicos aislados de las microalgas Isochrysis galbana y Micractinium pusillum (glicolípidos y carotenoides principalmente) y del polifenol ácido rosmarínico (RA), así como evaluar su uso para el tratamiento de diversas patologías de la piel con base inflamatoria, en diversos modelos experimentales. Los objetivos específicos planteados para esta Tesis Doctoral fueron los siguientes: 1. Evaluar la actividad anti-inflamatoria, anti-oxidante y fotoprotectora de una serie de glicolípidos aislados de las microalgas I. galbana y M. pusillum, en un modelo in vitro de queratinocitos humanos HaCaT irradiados con UVB. 2. Desarrollar, en colaboración con el Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la US, fórmulas farmacéuticas óptimas para la aplicación tópica de una fracción de glicolípidos (MGDG), fucoxantina (FX) y ácido rosmarínico (RA). 3. Estudiar el efecto preventivo de un glicolípido puro (MGMG-A), así como de una fracción enriquecida en glicolípidos (MGDG) de I. galbana, tanto disuelta en acetona como formulada en crema, en un modelo experimental de hiperplasia epidérmica inducida por TPA en ratones. 52 4. Evaluar las propiedades farmacológicas de la FX, aislada de I. galbana, incorporada a una formulación en crema, en el modelo de hiperplasia epidérmica inducida con TPA en ratón, así como en un modelo de eritema cutáneo inducido por una exposición aguda a radiación UVB en ratón. 5. Estudiar los efectos anti-inflamatorios del RA en un modelo experimental de psoriasis inducida por imiquimod en ratón, empleando una formulación basada en nanoliposomas. 6. Evaluar los posibles mecanismos de acción anti-inflamatoria y anti-oxidante de la FX y del RA, así como una posible sinergia entre ambos, en queratinocitos humanos HaCaT irradiados con luz UVB. OBJECTIVES 55 Given the necessity to find new therapeutics alternatives for psoriasis treatment, actinic keratosis or skin cancer, the chemoprevention with natural products is playing an important role in last years. Thus, anti-inflammatory compounds that reduce clinical manifestations of psoriasis or prevent the recurrences are excellent alternatives to complement the current treatments. Moreover, the use of therapeutic strategies for delaying the photoaging and preventing the development of pre-cancerous lesions is currently being investigated. In last years, the microalgae have emerged as source of bioactive compounds including, lipids, proteins, polysaccharides and carotenoids. These compounds have attracted the interest of pharmacy and cosmetic industry due to their antioxidant, anti-inflammatory and anti-carcinogenic activities. For these reasons, the overall objective of this Doctoral Thesis is to assess the potential biological activity (antioxidant, antiinflammatory and photoprotective) of lipid compounds isolated from the microalgae Isochrysis galbana and Micractinium pusillum (glycolipids and carotenoids) and the polyphenol rosmarinic acid (RA), as well as to evaluate their use for the treatment of inflammatory skin pathologies, in different experimental models. This work has been focused on the following specific objectives: 1. To evaluate the anti-inflammatory, antioxidant and photoprotective effects from a variety of galactolipids isolated from the microalgae M. pusillum and I. galbana, using an in vitro model of UVB-irradiated HaCaT human keratinocytes. 2. To develop, in collaboration with the Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology of Faculty of Pharmacy of Seville, pharmaceutical formulations to improve the topical application of a fraction of glycolipids (MGDG), fucoxanthin (FX) and rosmarinic acid (RA). 3. To study the preventive effect of a pure glycolipid (MGMG-A), and an enriched fraction of glycolipids (MGDG) from I. galbana, such dissolved in acetone as formulated in cream, on the 12-O- tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)-induced epidermal hyperplasia in mice. 56 4. To evaluate the pharmacological properties of a FX, from I.galbana, loaded in a cream formulation, on the TPA-induced hyperplasia model in mice, as well as on the UVB-induced erythema model in hairless mice. 5. To study the anti-inflammatory effect of RA on an imiquimodinduced psoriasis-like model in mice, employing a formulation elaborated with nanoliposomes. 6. To evaluate the potential anti-inflammatory and antioxidant action mechanisms of FX and RA, as well as a possible synergy between them, on UVB-exposed HaCaT human keratinocytes. CAPÍtulo I 59 aAzahara Rodríguez-Luna, aJavier Ávila-Román, aElena Talero, bCarolina de los Reyes, bMaría J. Ortega, bEva Zubía, aVirginia Motilva a Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, University of Seville, Seville 41012, Spain b Department of Organic Chemistry, Faculty of Marine and Environmental Sciences, University of Cádiz, Puerto Real 11510, Cádiz, Spain Abstract Chronic exposure of the skin to ultraviolet B (UVB) radiation induces reactive oxygen species (ROS) production and inflammatory responses, which play a crucial role in actinic keratosis and skin cancer. Nowadays, strategies for skin protection comprise the use of natural compounds to counteract oxidative stress and inflammation. In this line, galactolipids have shown anti-inflammatory and anti-tumor properties in different skin models. This study was aimed to evaluate the anti-inflammatory effects on macrophages THP-1 and the protective mechanisms against UVB-induced cell damage in HaCaT human keratinocytes of a variety of glycolipids isolated from the microalgae Micractinium pusillum and Isochrysis galbana. The structures of the isolated monogalactosylmonoacylglycerols (MGMG), and digalactosyldiacylglycerols (DGDG) were defined by spectroscopic analyses (NMR, HRMS, and MS/MS). TNF-α production was evaluated on LPS-stimulated THP-1 macrophages. LDH enzyme activity, intracellular ROS levels and IL-6 production were measured on UVB-irradiated HaCaT cells. Seven MGMGs and six DGDGs displaying a variety of C16 and C18 acyl chains were obtained from the microalgae and subjected to bioactivity assays. Most of these compounds significantly reduced TNF-α levels in LPS-stimulated THP-1 cells. Pretreatment of HaCaT keratinocytes with pure MGMGs and DGDGs and fractions containing MGDGs or DGDGs markedly attenuated UVB-induced cell damage through reduction of LDH release, ROS levels and IL-6 production. The present study confirms the anti-inflammatory properties of a variety of glycolipids in macrophages and reports for the first time the photoprotective activity of these compounds in HaCaT keratinocytes, suggesting their potential use as novel agents for the prevention of sun exposure-induced skin damage. Keywords: microalgae; HaCaT; UVB; glycolipids; MGMG; DGDG. 60 Abbreviations: MGMG, monogalactosylmonoacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol DGDG, digalactosyldiacylglycerol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol; UV, ultraviolet radiation; LDH, lactate dehydrogenase; ROS, reactive oxygen species; TNF-α, tumor necrosis factor alpha; LPS lipopolysaccharide; PMA, Phorbol 12-myristate 13- acetate; IL-6, Interleukin 6; DCF-DA, dichlorofluorescein diacetate. Introduction Skin is considered the largest organ in the body and represents the first barrier that protects us from the deleterious effects of solar ultraviolet (UV) radiation, which is the main cause for skin cancer (Ramos-e-Silva and Jacques, 2012)). Development of skin cancer depends on the cumulative amount and form of the UV radiation, as well as on the skin type of the individual exposed. Solar UV radiation consists of UVC (100–280 nm), UVB (280–315 nm) and UVA (315–400 nm). Compared with UVA, UVB is less abundant but is more energetic causing dermal change besides affecting epidermal function (Rass and Reichrath, 2008). Direct absorption of UVB to the epidermis may induce damage in epidermal keratinocytes by the production of pro-inflammatory cytokines, chemokines, prostaglandins and reactive oxygen species (ROS) (Divya et al., 2015). An imbalance between the cellular production of ROS and antioxidant defence mechanisms may be defined as oxidative stress (Kim, 2016). Oxidative stress produces oxidative damage of DNA, proteins and lipids, contributing to photoaging and many degenerative processes as actinic keratosis (AK). AK is a common skin lesion associated with longterm exposure to UV radiation, which is characterized by dysplastic keratinocyte lesions confined to the basal epidermal layer of the skin. If untreated, up to 10% of AKs can undergo malignant transformation and progress to squamous cell carcinoma (SCC) (Goldenberg and Perl, 2014). Since sunscreens can provide an insufficient photoprotection, the use of antioxidant and anti-inflammatory compounds incorporated to sunscreen formulations may be a useful strategy for a higher prevention of skin photodamage (Kuo et al., 2015). Nevertheless, nowadays the composition of sunscreens and cosmetic products is highly regulated due to the alarm generated by the environmental risk of organic UV filters (Sobek et al., 2013). The high consumption worldwide of UV filters is leading to their elevated detection in various environmental places as sea water, wastewater, tap water, sediments and biota, among others (Li et al., 2007; Kameda et al., 2011; Li et al., 2017). Marine algae have been reported to be an interesting natural source of bioactive compounds, including fatty acids, carotenoids, proteins, 67 4 (Rho et al., 1996), 11 (Hiraga et al., 2008), and 13 (Kwon et al., 1998) matched those described in the literature. To the best of our knowledge, this is the first report of the isolation and spectroscopic data (supplementary material) of the MGMGs 3 and 12. The structures determined for the DGDGs 5-10 isolated from M. pusillum are shown in Table 2. The isolated DGDGs contain C16 and C18 acyl chains. The spectroscopic data obtained from compounds 5 (Morimoto et al., 1995), 8 (Morimoto et al., 1995) and 9 (Reshef et al., 1997) matched those described in the literature. To the best of our knowledge, this is the first report of the isolation and spectroscopic data (supplementary material) of the MGMGs 6/7 and 10. The fractions I-MGDG and I-DGDG were mixtures of MGDGs and DGDGs, respectively, displaying C14, C16, and C18 acyl chains as previously described (De los Reyes et al., 2016). Table 1. Chemical structures of the MGMGs isolated from the biomass of the microalgae M. pusillum (1-4) and I. galbana (4, and 11-13). MGMG R 1 2 3 4 11 12 13 68 Table 2. Chemical structures of the DGDGs 5-10 isolated from the biomass of M. pusillum. Effect of glycolipids on cell viability The effect of glycolipids on THP-1 macrophages and HaCaT cells viability was measured by using the SRB assay. Results from cytotoxicity study showed that none of the tested concentrations of the pure compounds (10 µM to 100 µM) and fractions (10 µg/mL to 100 µg/mL) affected cell viability. The inhibitory concentration 50 (IC50) (half maximal inhibitory concentration) was above 100 µM (compounds) or 100 µg/mL (fractions) at 24, 48 and 72 h after treatment (data not shown). DGDG R1 R2 5 6 7 8 9 10 69 Effect of glycolipids on TNF-α production We have studied the activity of compounds 1-13 as inhibitors of the pro-inflammatory cytokine TNF-α Assays were performed on human THP- 1 macrophages using LPS to stimulate the production of TNF-α. As shown in Fig. 1, LPS stimulation significantly increased TNF-α levels in THP- 1 macrophages in comparison with unstimulated control cells (P < 0.001). In particular, pretreatment of cells with the MGMGs 2, 4, 11 and 12 at 50 μM significantly decreased LPS-induced TNF-α production by 40%, 47%, 57% and 45%, respectively, upon comparison with LPS-stimulated untreated THP-1 cells (Fig. 1A). Pure DGDGs 5, 6/7, 8, 9 and 10 were more active, causing at 50 µM inhibition of this cytokine levels by 60%, 55%, 59%, 63% and 59%, respectively (P < 0.001) (Fig. 1B). In addition, the fraction I-SQDG at 50 µg/mL reduced significantly the LPS-induced TNF-α production (Fig. 1C). Figure 1. Effect of galactolipids 1-13 on TNF-α production in LPS-stimulated THP-1 macrophages. Cells were pretreated with monogalactosylmonoacylglycerols (MGMGs) 1-4 and 11-13 and digalactosyldiacylglycerols (DGDG) 5-10 at 10, 30 and h, TNF-α levels were measured using ELISA assay. Dexamethasone (Dex) was used as positive reference compound at 1 µM. Data are means ± SEM from four independent experiments. ***P < 0.001 vs. untreated cells; + P < 0.05, ++ P < 0.01 and +++ P < 0.001 vs. LPS-stimulated control. Effect of glycolipids on intracellular LDH activity 70 The effect of glycolipids on intracellular enzymatic activity was examined by measuring the LDH enzyme activity in fresh cell lysates and supernatants 24 h after exposure of the cell cultures to UVB radiation. As expected, UVB irradiation to 50 mJ/cm2 significantly increased LDH activity in HaCaT keratinocytes compared to unirradiated control (P <0.001) (Fig. 2A). Pretreatment of cells with MGMGs 1-4 and 11-13 1 h prior to UVB exposure significantly decreased UVB-induced mortality, preserving cell membrane integrity, at all concentrations tested (10, 30 and 50 μM, P <0.001) (Fig. 2A). Similar results were exhibited with keratinocytes pretreated with DGDGs 5-10 for 1 h (Fig. 2B). The study with fractions containing MGDGs, DGDGs, and SQDGs also showed a significant reduction on LDH enzyme activity (P <0.001) (Fig. 2C). Figure 2. Effect of glycolipids from microalgae on UVB-induced LDH leakage in human HaCaT keratinocytes. Cells were pretreated with monogalactosylmonoacylglycerols (MGMGs) 1-4, and 11-13 (10, 30 and 50 µM) (A), digalactosyldiacylglycerols (DGDGs) 5-10 (10, 30 and 50 µM) (B) and glycolipidcontaining fractions I-MGDG, I-DGDG, and I-SQDG (12.5, 25 and 50 µg/mL) (C) for 1 h, and then exposed to UVB light (50 mJ/cm2). After incubation for 24 h, cell viability was assessed by using LDH assay. Results are expressed as percentage respect to untreated control cells and bars represents mean ± SEM of four independent experiments (n = 4). *** P < 0.001 vs. untreated cells; + P < 0.05, ++ P < 0.01 and +++ P < 0.001 vs. UVB-irradiated cells. Effect of glycolipids on UVB-induced ROS production 71 We cultured HaCaT cells with the compounds for 1 h followed by UVB exposure and evaluated intracellular ROS levels based on the DCF-DA assay (Fig. 3). A significant increase in ROS content was observed in UVB- irradiated cells in relation to untreated control cells (without UVB irradiation) (P < 0.001). The MGMGs 1, 2 and 4 markedly reduced ROS levels by 42%, 34% and 37%, respectively, at the highest concentration tested (P < 0.001) (Fig. 3A). At the same concentration, compounds 3 and 11 were less active, causing 19% and 22%, respectively, of decrease of ROS production. As regards DGDGs, pre-treatment with 5, 6/7 and 9 at the concentration of 50 µM led to 25%, 22% and 18% of inhibition of ROS accumulation, respectively, in UVB-irradiated cells (P <0.001, P <0.01, P <0.05, respectively) (Fig. 3B). However, only the fraction I-MGDG was able to reduce intracellular ROS production by 26% (P <0.05) (Fig. 3C). Figure 3. Effect of glycolipids from microalgae on UVB-induced ROS production in human HaCaT keratinocytes. HaCaT cells were pretreated with monogalactosylmonoacylglycerol (MGMGs) 1-4 and 11-13 (50 µM) (A), digalactosyldiacylglycerola (DGDG) 5-10 (50 µM) (B) and glycolipid-containing fractions I-MGDG, I-DGDG, and I-SQDG (50 µg/mL) (C) for 1 h, and then irradiated with UVB (50 mJ/cm2). ROS levels were estimated indirectly by measuring the fluorescence emitted by dichlorofluoresceine formed in proportion to the intracellular ROS, 30 min after UVB irradiation. Results are expressed as percentage respect to untreated control cells and bars represents mean ± SEM of four independent experiments (n = 4). ** P < 0.01 vs. untreated cells; + P < 0.05 and ++ P < 0.01 vs. UVB-irradiated cells. Effect of glycolipids on IL-6 production 72 UVB exposure induces abnormally increased cytokine release from keratinocytes leading to inflammatory skin disorders. To evaluate the effects of the isolated glycolipids on the UVB-induced production of the pro-inflammatory cytokine IL-6, HaCaT cells were pre-treated with pure compounds and fractions for 1 h, and then were exposed to UVB (50 mJ/cm2). UVB-irradiated HaCaT cells manifested high IL-6 levels in comparison with unirradiated control (P <0.001) (Fig. 4A). Pre-treatment with the MGMGs 11, 12 and 13 substantially inhibited this cytokine levels by 86%, 85% and 66% at 50 μM, respectively. At this concentration, the compounds 1 and 2 exhibited less activity, causing 61% and 54% of inhibition, respectively (Fig. 4A). In relation to DGDGs, IL-6 production was only reduced after treatment with 8, 9 and 10 at all the concentrations tested. It is worth mentioning that compound 10 was the most active, reducing this cytokine levels by 66%, 88% and 88%, at 10, 30 and 50 μM, respectively (Fig. 4B). As regards fractions, I-MGDG caused the greatest inhibition of IL-6 production, which was decreased by 70%, 90%, and 99%, at 10, 30 and 50 µg/mL, respectively. Fraction I-DGDG also showed significant activity at the three concentrations tested, reducing IL-6 levels by 55%, 56% and 58%, respectively (Fig. 4C). Figure 4. Effects of glycolipids on UVB-induced production of IL-6 in human HaCaT keratinocytes. HaCaT cells were pretreated with monogalactosylmonoacylglycerols (MGMGs) 1-4, and 11-13 (10, 30 and 50 µM) (A), digalactosyldiacylglycerols (DGDGs) 5-10 (10, 30 and 50 µM) (B) and glycolipidcontaining fractions I-MGDG, I-DGDG, and I-SQDG (10, 30 and 50 µg/mL) (C) for 1 h, and then irradiated with UVB (50 mJ/cm2). After incubation for 24 h, IL-6 levels were measured by ELISA kit. Data are means ± SEM from four independent 73 experiments (n = 4). *** P < 0.001 vs. untreated cells; + P < 0.05, ++ P < 0.01 and +++ P < 0.001 vs. UVB-irradiated cells. Discussion The skin is the main organ that participates in temperature maintenance of the body and offers protection from chemicals, microorganisms and UV radiation. Solar radiation has positive effects as mediator of vitamin D in the skin, improvement of endorphins and reduction of blood pressure (Pérez-Sánchez et al., 2016). However, an excessive UV exposition can lead to several skin pathological disorders, including erythema, sunburn, hyperpigmentation, immunosuppression, edema, premature aging and non-melanoma skin cancer (Li et al., 2016). Previous papers have reported the photoprotective properties of different molecules from natural origin through antioxidant and antiinflammatory mechanisms (El-mahdy et al., 2009; Radice et al., 2016),. Therefore, treatment of the skin with oral or topical formulations containing these natural compounds may be a useful strategy for preventing UV-induced skin damage and ultimately skin cancer (Hu et al., 2016). Moreover, the use of natural products is advantageous since may be an alternative for reducing the pollution of marine waters (Sánchez- Quiles and Tovar-Sánchez, 2015). Microalgae have been shown to be a rich source of bioactive molecules, including polar lipids such as the galactolipids. Lipid extracts and pure galactolipids from microalgae have previously demonstrated anti-inflammatory (Banskota et al., 2014; Robertson et al., 2015), and antitumor promoting (Morimoto et al., 1995) properties, which make them suitable candidates for further investigation. In our study, we have demonstrated that a variety of glycolipids of the MGMG, MGDG and DGDG classes can protect HaCaT keratinocytes against acute UVB radiation due to the inhibition of ROS generation and the decrease of the production of the pro-inflammatory cytokine IL-6, suggesting that these molecules could play an important role in protecting the skin exposed to UVB. In a first experiment, we tried to confirm the anti-inflammatory potential of the compounds under study in the in vitro model of LPS- stimulated human THP-1 macrophages and TNF-α production. TNF-α is a potent pro-inflammatory cytokine whose dysregulation is associated with a variety of chronic inflammatory and autoimmune diseases, such as psoriatic arthritis, actinic keratosis, atopic dermatitis and skin cancer (Udommethaporn et al., 2016). We have recently demonstrated that 74 fractions containing MGDGs or DGDGs and pure DGDGs significantly inhibited TNF-α production in the LPS/THP-1 model (De los Reyes et al., 2016). Consistent with those results, in the present study we have confirmed the anti-inflammatory potential of the MGMGs 2, 4, 11 and 12 and of the DGDGs 5-10, which caused a marked reduction of TNF-α levels in LPS-stimulated THP-1 cells. Our results are also in line with a previous paper that showed that the MGDG containing two linolenoyl acyl chains isolated from Rose hip (Rosa canina) downregulated the expression of pro-inflammatory cytokines in macrophages and peripheral blood leukocytes and inhibited the inflammatory process in primary chondrocytes by reducing matrix metalloproteinases levels (Schwager et al., 2011). Moreover, in recent years several microalgal galactolipids, including MGMGs, MGDGs, and DGDGS with C14, C16, C18, and C20 acyl chains, have been shown to decrease the production of the inflammatory mediator NO in RAW264.7 macrophages (Banskota et al., 2014). In relation to in vivo studies, Bruno et al. (2015) demonstrated that fractions containing MGDGs, DGDGs, or SQDGs obtained from a blue green alga reduced the inflammation in croton-oil-induced ear edema and carrageenan-induced paw edema models. Next, we aimed to study the possible protective effects of glycolipids in HaCaT keratinocytes, a well-established in vitro model for investigations on UV radiation-induced cell damage. UVB exposure promotes cell cytotoxicity by loss of cellular membrane integrity, which leads to liberation of LDH enzyme from cytosol to the culture medium. The cell membrane damage upon UVB exposure is correlated with increased ROS production. It has been reported that excessive generation of ROS results in oxidative stress in skin cells and plays an essential role in the initiation, promotion and progression of skin aging, carcinogenesis and many inflammatory disorders (Fehér et al., 2016). In the present study, pre-treatment of HaCaT keratinocytes with pure MGMGs and DGDGs and with fractions containing MGDGs or DGDGs significantly attenuated UVB-induced skin damage by increasing cell viability, as demonstrated by reduced LDH release, and inhibiting ROS levels. These results are in line with a previous report that showed that glycolipid extracts from spinach, with a high content in MGDGs and DGDGs, attenuated the PMA-induced ROS production in Caco-2 cells, the inhibitory effect of DGDG being much potent than that of MGDG (Shiota et al., 2010). In a similar way, two bacterial MGDGs exhibited protective activity against oxidative stress induced by alkyl peroxyl radicals (Matsufuji et al., 2000b), exogenous H2O2 or heat (Matsufuji et al., 2000a). In addition, a crude sulfoglycolipidic fraction from the microalga Porphyridium 75 cruentum, rich in long-chain PUFAs, inhibited superoxide anion generation in primed neutrophils (Bergé et al., 2002). UVB irradiation of the skin also induces a robust inflammatory response, characterized by the production of numerous inflammatory mediators, such as chemokines and cytokines in epidermis, which in turn further elevate ROS production and increase oxidative stress (Decean et al., 2013). Excessive production of these factors leads to hyperpigmentation, erythema, photo-aging as well as chronic inflammation, which in turn could raise the risk of skin carcinogenesis (Aoki-Yoshida et al., 2013). It has been previously reported an upregulation of the pro-inflammatory cytokine IL-6 in human and rat skin (Dawes et al., 2014), and human HaCaT keratinocytes after UVB-induced inflammation (Borland et al., 2011). Our results showed that glycolipids presented in this study inhibited IL-6 production in UVB-irradiated HaCaT cells. In a similar way, treatment of human articular chondrocytes with the MGDG fraction of the microalga Phormidium sp. ETS-05 suppressed this cytokine expression induced by IL-1α and TNF-α (Ulivi et al., 2011). In summary, our findings confirm the anti-inflammatory properties of a variety of glycolipids of the MGMG and DGDG classes in macrophages and report for the first time the protective activity of these compounds against UVB-caused damage to HaCaT keratinocytes. These actions seem to be mediated by their antioxidant and anti-inflammatory properties. Future studies are needed to expand the vision of the effects and mechanisms by which these glycolipids exert their photoprotective activity. These investigations will support the potential use of these products as novel agents for the prevention of sun exposure-induced skin damage including cancer development. Bibliography Aoki-Yoshida, A., Aoki, R., Takayama, Y., 2013. Protective effect of pyruvate against UVB-induced damage in HaCaT human keratinocytes. J. Biosci. Bioeng. 115, 442–448. doi:10.1016/j.jbiosc.2012.11.004 Banskota, A.H., Gallant, P., Stefanova, R., Melanson, R., O’Leary, S.J.B., 2013. Monogalactosyldiacylglycerols, potent nitric oxide inhibitors from the marine microalga Tetraselmis chui. Nat. Prod. Res. 27, 1084–1090. doi:10.1080/14786419.2012.717285 Banskota, A.H., Stefanova, R., Gallant, P., Osborne, J.A., Melanson, R., O’Leary, S.J.B., 2013. Nitric oxide inhibitory activity of monogalactosylmonoacylglycerols from a freshwater microalgae Chlorella sorokiniana. Nat. Prod. Res. 27, 1028–31. doi:10.1080/14786419.2012.696255 76 Banskota, A.H., Stefanova, R., Sperker, S., Lall, S.P., Craigie, J.S., Hafting, J.T., Critchley, A.T., 2014. Polar lipids from the marine macroalga Palmaria palmata inhibit lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW264.7 macrophage cells. Phytochemistry 101, 101–108. doi:10.1016/j.phytochem.2014.02.004 Bergé, J.P, Debiton, E., Dumay, J., Durand, P., and Barthomeuf, C., 2002. In Vitro Anti-inflammatory and Anti-proliferative Activity of Sulfolipids from the Red Alga Porphyridium cruentum. J. Agric. Food Chem. 50, 6227–6232. Borland, M.G., Khozoie, C., Albrecht, P.P., Zhu, B., Lee, C., Lahoti, T.S., Gonzalez, F.J., Peters, J.M., 2011. Stable over-expression of PPAR??/?? and PPAR?? to examine receptor signaling in human HaCaT keratinocytes. Cell. Signal. 23, 2039–2050. doi:10.1016/j.cellsig.2011.07.020 Bruno, A., Rossi, C., Marcolongo, G., Di Lena, A., Venzo, A., Berrie, C.P., Corda, D., 2005. Selective in vivo anti-inflammatory action of the galactolipid monogalactosyldiacylglycerol. Eur. J. Pharmacol. 524, 159–168. doi:10.1016/j.ejphar.2005.09.023 Colombo, D., Compostella, F., Ronchetti, F., Scala, A., Toma, L., Kuchide, M., Tokuda, H., Nishino, H., 2000. Anti-tumor-promoting effects of glycoglycerolipid analogues on two-stage mouse skin carcinogenesis. Cancer Lett. 161, 201–5. Dawes, J.M., Antunes-Martins, A., Perkins, J.R., Paterson, K.J., Sisignano, M., Schmid, R., Rust, W., Hildebrandt, T., Geisslinger, G., Orengo, C., Bennett, D.L., McMahon, S.B., 2014. Genome-wide transcriptional profiling of skin and dorsal root ganglia after ultraviolet-B-induced inflammation. PLoS One 9. doi:10.1371/journal.pone.0093338 De los Reyes, C., Ortega, M.J., Rodríguez-Luna, A., Talero, E., Motilva, V., Zubía, E., 2016. Molecular Characterization and Anti-inflammatory Activity of Galactosylglycerides and Galactosylceramides from the Microalga Isochrysis galbana. J. Agric. Food Chem. 64, 8783–8794. doi:10.1021/acs.jafc.6b03931 Decean, H., Perde-Schrepler, M., Tatomir, C., Fischer-Fodor, E., Brie, I., Virag, P., 2013. Modulation of the pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinases production in co-cultivated human keratinocytes and melanocytes. Arch. Dermatol. Res. 305, 705–714. doi:10.1007/s00403-013- 1353-6 Divya, S.P., Wang, X., Pratheeshkumar, P., Son, Y.O., Roy, R.V., Kim, D., Dai, J., Hitron, J.A., Wang, L., Asha, P., Shi, X., Zhang, Z., 2015. Blackberry extract inhibits UVB-induced oxidative damage and inflammation through MAP kinases and NF-κB signaling pathways in SKH-1 mice skin. Toxicol. Appl. Pharmacol. 284, 92–99. doi:10.1016/j.taap.2015.02.003 El-mahdy, M.A., Zhu, Q., Wang, Q., Wani, G., Patnaik, S., Zhao, Q., Arafa, E., 84 cream application attenuated TPA-induced skin edema, improved histopathological features and showed a reduction of the inflammatory cell infiltrate. In addition, this formulation inhibited epidermal expression of COX-2 on a similar way than dexamethasone. Our results suggest that a MGDG-containing cream could be an emerging therapeutic strategy for the treatment of inflammatory skin pathologies as psoriasis. Abbreviations: CLSM, Confocal Laser Scanning Microscopy; Dex, Dexamethasone; IL, Interleukin; I. galbana, Isochrysis galbana; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; MPO, myeloperoxidase; RMS, root mean square; SC, stratum corneum; TNF-α, tumor necrosis factor alpha; TPA, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Keywords: glycolipids, MGDG, skin, inflammation, epidermal hyperplasia, microalgae, Isochrysis galbana. Introduction Inflammatory skin diseases have a significant impact on the quality- of-life of patients; one of them is psoriasis, considered as a common immune-mediated inflammatory skin disorder. It is estimated that 2-4 % of the population suffers psoriasis (An et al., 2016). Although the exact mechanism of this pathology is not completely understood, it is known that both genetic predisposition and environmental factors as stress, infection, trauma and drugs have an important role in its etiology (Arasa et al., 2014). This disease is associated with several comorbidities as cardiovascular diseases, metabolic syndrome, and psychiatric disorders. Accumulating evidence has demonstrated that exposure of skin to the protein kinase C activator 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) induces a pleiotrophic tissue response and promotes macroscopic lesions as peeling and erythema, mimicking an apparent psoriasis phenotype. Furthermore, it has been observed an increase of thickness of epidermis resulting from hyperproliferation and aberrant differentiation of keratinocytes as well as infiltration of inflammatory leukocytes into the epidermis and dermis (Liu et al., 2015). The activated leukocytes cause uncontrolled production of reactive oxygen species (ROS), leading to peroxidative damage to skin membranes and contributing to the exacerbation of lesions. Moreover, these immune cells release growth factors, chemokines and pro-inflammatory cytokines such as tumour necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6, IL-1β and IL-17, which interact as a network in the pathogenesis of psoriasis (Lowes et al., 2007). The inducible enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) has also been 85 demonstrated to play a central role in skin proliferative disorders through overproduction of pro-inflammatory prostaglandins as PGE2 (Zulfakar et al., 2016). Currently, treatment of psoriasis include topical agents (corticoids, vitamin D derivatives, retinoids and calcineurin inhibitors), photo-chemo-therapy, as well as systemic treatments (immunosuppressants and biological drugs) (Guerra et al., 2016). However, many patients, especially those with moderate-to-severe generalized psoriasis, are not adequately treated with effective, longterm therapies, and most of them have various degrees of side effects. Thus, the development of well-tolerated immune-modulatory agents can offer an alternative option for the treatment of psoriatic patients. Microalgae have emerged as a source of bioactive compounds, including lipids, proteins, polysaccharides and carotenoids, which have attracted the interest of the pharmaceutical industry based on their anti-oxidant, anti-inflammatory or anti-carcinogenic activities in different skin inflammatory models (reviewed in Talero et al., 2015) (Talero et al., 2015). The topical application requires a suitable incorporation of these bio-compounds into a carrier that offers stability, permeation enhancer properties, and remaining time onto the skin. The formulation of these substances involves the selection of appropriate combinations of ingredients in the formula with the aim to exert the desirable local o systemic effect. Recently, microalgae derivatives are being used as cosmeceuticals, through their incorporation in many face and skin care products (e.g., anti-aging cream, regenerating care products, emollient and anti-irritant in peelers), sun protectors and hair care products (Martins et al., 2014). We have previously reported that galactosylglycerides isolated from the marine microalga Isochrysis galbana (I. galbana) inhibit the production of the pro-inflammatory cytokine TNF-α in lipopolysaccharide-stimulated human THP-1 macrophages (De los Reyes et al., 2016). Given the interesting anti-inflammatory properties elicited by these compounds, the aim of the present study was to evaluate the preventive effects of galactosylglycerides from I. galbana on a murine model of TPA-induced epidermal hyperplasia in female Swiss mice. To test this possibility, we have analysed the effects of topical application of acetone-dissolved glycolipids. However, it is known that acetone-dissolved glycolipids for further application onto the mice skin exhibit several drawbacks, such as amount of this organic solvent remaining in contact to the skin, spreading of the formulation and loss of sample, heterogeneity of the dose contacting with the skin and difficulty for applying the sample. The use of pharmaceutical carriers able to load the active molecule may 86 solve the above limitations of glycolipid solutions. Among them, topical formulations of different nature are used, including ointment, cream, or hydrophilic gel, in which the active compound is suspended or dissolved. Materials and Methods Glycolipids The monogalactosylmonoacylglyceride (2S)-1-O-[(6Z,9Z,12Z,15Z)- octadeca-6,9,12,15-tetraenoyl]-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol (MGMG- A) was isolated from the microalga I. galbana, as previously described in Rodríguez-Luna et al., (submitted). The fraction of monogalactosyldiacylglycerides (MGDG) was obtained from the microalga I. galbana, as previously described in (De los Reyes et al., 2016). Cell culture HaCaT human keratinocytes were obtained from the American Type Culture Collection and maintained in high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, GIBCO, Grand Island, NY) supplemented with 10 % fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin in an atmosphere of 5 % CO2 at 37 ºC. Cell viability assay Viability of HaCaT cells upon exposure to glycolipid compounds was determined by the sulforhodamine B (SRB) assay (Skehan et al., 1990). Briefly, the cells were seeded into 96-well plates at 1x104 cells/well. After 24 h, cells were incubated with compounds at the final concentrations range of 10-100 µM or 10-100 μg/mL (100 µL/well) that were prepared by dilution of stocks solutions (10 mM) in DMSO in fresh medium. After 24, 48, and 72 h, cells were fixed with 50 μL of trichloroacetic acid (TCA 50 % v/v), at 4 ºC for 1 h and processed as described in the literature. Determination of IL-6 and IL-8 production HaCaT cells were seeded in 6-well plates (2 mL/well) at 5x105 cells/well. After 24 h, the cells were treated with different concentrations of MGMG-A (10, 30 and 50 μM) and MGDG (10, 30 and 50 μg/mL) and dexamethasone (Dex) (1 μM) for 1 h, and then were stimulated with TNF-α (10 ng/mL) for 24 h. Then, supernatant fluids were collected and stored at -80 °C until IL-6 and IL-8 measurements. Controls contained medium with equivalent amounts of solvent compared to treatments, and 87 were incubated with and without TNF-α. Commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (Diaclone GEN-PROBE, France) were used to quantify cytokines according to the manufacturer’s protocol. The absorbance at 450 nm was read by a microplate reader. Skin topical formulations - Hydrophilic gel. Carbopol® 934P was selected as a gelling agent at 1 % (w/v) due to its widespread use in pharmaceutical formulations and fast dispersion in water. Rhodamine 6G solution in ethanol absolute (10 µg/µL) was gradually added to the polymer dispersion under magnetic stirring. The dispersion was neutralized with triethanolamine to obtain an adequate consistency suitable for topical application. - Cream. This O/W emulsion was prepared by gradually adding rhodamine (10 µg/µL), MGDG (10 mg/mL) or Dex (10 µg/µL) solution in ethanol absolute to a cold mix excipient composed of Caprylic/Capric Triglycerides, Glycol Stearate, PEG-3 Glyceryl Cocoate and Steareth-7 previously heated to improve the drug interposition. The final formulations contained 0.2 % (w/w) MGDG. - Lipophilic ointment. This formulation was obtained using melt emulsification combined with stirring. Briefly, Brij® 72 (5 % w/w) and white soft paraffin (77.3 % w/w) were blended under gentle stirring in a water bath at 70 °C to form the lipid phase. Successively, liquid paraffin (5 % w/w) and α-tocopherol (0.002 % w/w) were added into the lipid phase until complete interposition at 60 °C. Then, rhodamine dissolved in propylene glycol (10 µg/µL) was added to the mixture. Meanwhile, two solutions of EDTA (0.0065 % w/w) and disodium phosphate dihydrate (0.026 % w/w) were prepared with distilled water at 60 °C and added dropwise to the lipid phase, with moderate magnetic stirring at 150 rpm for 20 min. Finally, rhodamine-loaded ointment was maintained at room temperature for further use. Animals For the present study, 8-week-old female Swiss CD-1 mice (25–30 g) were supplied by Janvier-Labs (Le Genest St Isle, France). Mice were maintained in our Animal Laboratory under standard conditions (temperature of 24–25 °C, humidity of 70–75 % and 12 h light–12 h dark cycle). Mice were allowed free access to a standard diet (Panlab) and water ad libitum. Dorsal region of the mice was shaved by using an electric clipper and treated with depilatory cream skin (Deliplus, Barcelona, Spain) without scratching or damaging the surface in order 88 to maintain the integrity of the skin. All studies were performed in accordance with the recommendations of the European Union regarding animal experimentation (Directive of the European Council 2010/63/EU). The experiments followed a protocol approved by the Animal Ethics Committee of the University of Seville. In vivo skin depth permeation by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) CLSM studies were performed in order to investigate the skin penetration ability of the different formulations through the skin layers (Álvarez-Roman et al., 2004). Towards this aim, Carbopol® hydrogel, cream and ointment were prepared by adding a hydrophobic fluorescent probe, i.e. rhodamine 6G, in the lipid or in the water-ethanol phase, according to the composition of formulations. Rhodamine 6G was selected as an equivalent marker for MGDG or Dex due to their comparable lipophilic properties. Appropriate samples of these formulations were taken and placed on stratum corneum (SC) of mice and were maintained in contact with the skin for 24 h. At the end of the experiment, the remaining preparation was carefully washed with purified water from the skin surface. Then, dorsal skin was excised and rinsed with pH 7.4 phosphate buffer solution, rapidly frozen by liquid nitrogen and then stored at - 80 ºC. Sections of skin (50 µm thickness) were then perpendicularly cut with a cryomicrotome and examined to investigate the fluorescent marker distribution in the different skin layers. Analysis was carried out using a Leica TCS SP II Confocal Laser Scanning Imaging System (Leica, Heidelberg, Germany) equipped with a Kr– Ar–He–Ne ion laser and a Leica DM IRE 2 microscope endowed with HCPL Fluotar Leica X10 and X20 dry objectives and HCXPLAN APO Leica X40 multiimmersion objective (numeric aperture 0.85). For excitation of the fluorescent label the 488nm wavelength was used and the fluorescence emission was detected at 520 nm. From the confocal images, a mathematical treatment was carried out in order to evaluate the intensity of fluorescence in the samples, as appeared in the histogram curve provided from Leica software. Statistical calculations were as follows:  Arithmetical mean value: μ(I)=1 Npixel ∙∑Ii  Average image energy: 𝐼𝑚𝑒𝑎𝑛 2=1 𝑁𝑝𝑖𝑥𝑒𝑙 ∙∑𝐼𝑖2 𝑝𝑖𝑥𝑒𝑙  Root mean square value: Imean 2=√1 Npixel∑Ii2 pixel 89  Skewness of the distribution: Skew(I)=1 N∑[Ii−μ(I) √VAR(I)]3 i Where I is the energy intensity, Npixel is the number of pixels of the image and VAR is the variance. Ex-vivo permeation studies Ex-vivo diffusion studies were carried out using a Franz diffusion cell apparatus (SES-Gmgh Analyses system, Germany) with an effective diffusional area of 3.14 cm2. Excised mice skin was used as membrane. Animals were sacrificed and full thickness dorsal skin was excised. A specific portion of the skin was cut and used for the permeation study after washing it with distilled water. Study was carried out following the methodology previously reported (López-Pinto et al., 2005). Animal skin was inserted between the donor and receiving compartments and adjusted by means of a pinch clamp. The receiving chamber was filled with 14.5 mL of degassed ethanol absolute and was thermostated by means of a water bath circulator and a jacket surrounding the cell, maintaining 32 ºC in the skin surface. The receiving medium was continuously stirred to avoid diffusion layer effect. Once selected the cream carrier from the previous study, MGDG-cream (0.2 % w/w), MGDG control solution (0.2 % w/w) and Dex-cream (0.2 % w/w) were accurately measured and placed on SC in the donor compartment and sealed with parafilm. Aliquots of 0.5 mL were withdrawn from the receiving medium at predetermined time intervals (0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 24 h) according to international guidelines and the same volume was replaced with fresh ethanol absolute at the same temperature. These samples were quantified by HPLC (Hitachi Elite LaChrom) for MGDG quantification and spectrophotometry UV-visible (Agilent 8453) was used for Dex quantification. The HPLC system is equipped with an L-2130 isocratic pump, a diode array detector L-2455 and L-2200 autosampler. The chromatographic separation was performed on a reverse phase LichroCART® C18 column (5 μm, 4.6 mm ID × 150 mm) using as mobile phase acetonitrile (ACN, solution A): formic acid solution (0.1 % v/v), solution B) adjusted to pH 2.67 in the following gradient (v/v): 0–6 min, 90 % A, 10 % B, flux 1 mL/min; 6-15 min, 100 % A. The injection volume was 30 µL. Cumulative amount of drug in receptor chamber for the three formulations (MGDG-cream, MGDG control solution and Dex control solution) was plotted as a function of time (t, h). The cumulative amount (%) of drug permeated 90 through the skin (P %) was determined as per the following equation (Li Z, Liu M, Wang H, 2016): 𝑃%=𝐶𝑛∙𝑉+∑𝐶𝑖∙𝑉𝑖 𝑛−1 𝑖=1 𝑀∙100 Where Cn is the drug concentration of the nth sampling point (mg/mL), Ci is the drug concentration of the ith sample point (mg/mL), V is the total volume (14.5 mL) of liquid in receiving pool, Vi is the volume (0.5 mL) of the ith sampling points and M is the mass of drug (MGDG or Dex). TPA-induced epidermal hyperplasia model and treatments We evaluated the effect of glycolipids from I. galbana on TPA- induced hyperplasia in murine skin by using two experimental protocols. Briefly, dorsal skin of female Swiss mice was shaved and 24 h later, animals that displayed no evidence of hair regrowth or injury were assigned to the different groups. In the first protocol, MGMG-A and MGDG dissolved in acetone (10 µg/µL, 200 µg per site), the reference agent Dex dissolved in acetone (10 µg/µL, 200 µg per site), or vehicle (acetone) were topically administered to the skin surface of the backs in an area of 1 cm2 by using a micropipette (total volume of 20 µL). After 30 min, TPA (2 nmol per site, dissolved in acetone) was topically applied to the same areas (day 1). A reference control group was included for comparison with the TPA-induced group: sham group received acetone, instead TPA solution, in a comparable volume. This procedure was repeated during two consecutive days (Arasa et al., 2014). In the second protocol, MGDG-cream formulation (100 mg per site, containing 200 µg of MGDG dissolved in ethanol at 10 µg/µL), Dex (100mg per site, equivalent at 200 µg of compound dissolved in ethanol) or vehicle (cream with a comparable volume of ethanol) were applied on the dorsal skin in an area of 1 cm2 by using a syringe, and starting 2 days before the hyperplasia induction. Twenty-four hours after the second cream administration, TPA (2 nmol per site, dissolved in ethanol) was topically applied to the same areas (day 1). After 1 h, MGDG-cream, Dex or vehicle were administered following the mentioned protocol. This procedure was repeated during two consecutive days. 91 For the two experimental protocols, 3 days after the first TPA application (day 4), mice were sacrificed by cervical dislocation and punch biopsies were collected from the treated dorsal skin and weighed to evaluate edema. One tissue piece per animal was fixed in 4% buffered paraformaldehyde. Other pieces were frozen in liquid nitrogen for measurement of biochemical parameters. Histological study Tissue samples from the dorsal skin of four animals were fixed in 42 % buffered paraformaldehyde, dehydrated by increasing concentrations of ethanol and embedded in paraffin. Tissue sections were cut at 7 μm on a rotary microtome (Leica Microsystems, Germany), were mounted on slides, deparaffinized with xylene, rehydrated through graded alcohols and stained with haematoxylin and eosin, according to standard protocols. All tissue sections were examined under an Olympus BH-2 microscope (GMI Inc., MIN, USA) for determination of histopathological changes. Epidermal thickness was measured using Scientific Imaging Systems (Biophotonics ImageJ Analysis Software; National Institutes of Health, USA). MPO activity Myeloperoxidase (MPO) activity was assayed as a marker of neutrophil infiltration according to the method of Grisham et al. (Grisham et al., 1990). The tissue was thawed, weighed and homogenised in ten volumes of 50 mM-PBS (pH 7.4). The homogenate was centrifuged at 20,000 g for 20 min at 4 °C. The pellet was again homogenized in ten volumes of 50 mM-PBS (pH 6) containing hexadecyl trimethylammonium bromide (0.5%) and 10 mM-EDTA. This homogenate was subjected to one cycle of freezing/thawing and a brief period of sonication. A sample of the homogenate (50 µL) was added to a 96-well microplate and incubated at 37 °C for 3 min with a mixture containing o-dianisidine dihydrochloride (0.067 %), hexadecyl trimethyl-ammonium bromide (0.5 %) and 0.3 mM-H2O2. Changes in absorbance at 450 nm were measured with a microplate reader (Labysystem Multiskan EX, Thermo Scientific, NY, USA). One unit of MPO activity was defined as the amount of enzyme present that produced a change in absorbance of 1.0u nit/min at 37 °C in the final reaction volume containing the acetate. Results are expressed as units/mg tissue. Measurement of cytokines in skin homogenates 92 Frozen skin biopsies were homogenised in three volumes of ice-cold tissue lysis buffer containing PBS (pH 7.2) with 0.1 M of EDTA, 1 mg/mL of leupeptin, 1 mg/mL of pepstatin, 1 mg/mL of aprotinin and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. Homogenates were centrifuged at 12,000 g for 10 min at 4 °C. Supernatants fluids were stored at -80 °C until measurements. Levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 and IL-10 were measured by quantitative Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay kits (ELISA) (Peprotech, Germany), according to the manufacturer’s instructions. Data are reported as pg/mg tissue. Immunohistochemical analysis Staining of COX-2 was performed using a streptavidin-biotin- peroxidase method (Talero et al., 2011). Paraffin-embedded dorsal skin sections (7 µm) were mounted on slides, deparaffinized with xylene and rehydrated through graded alcohols. These sections were boiled (10 mM citrate buffer, pH 6.0 for 3 min) for antigen retrieval, followed by cooling at room temperature for 20 min. Endogenous peroxidase was quenched with 0.3 % (v/v) hydrogen peroxide for 20 min. Sections were rinsed with PBS for 10 min. Nonspecific adsorption was minimized by incubating sections in normal horse serum (Vectastain Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA) for 20 min. Subsequently, slides were incubated with rabbit polyclonal anti-COX-2 antibody (Cayman Chemical, MICH, USA) (1:300) overnight at 4 ºC. Then, slides were treated with anti-mouse IgG antibody for 30 min and incubated with the streptavidin– peroxidase complex for 30 min, at room temperature (Vectastain Kit; Vector Laboratories, CA, USA). The enzymatic activities were developed with 3,3´-diaminobenzidine (DAB), and the sections were counterstained with hematoxylin. Negative control sections were treated in the same way, omitting the primary antibody (Talero et al., 2012). COX-2 immunoreactivity was examined on all sections using a microscope Olympus BX61 (Olympus Optical Co. Ltd. Tokyo, Japan) The quantification of immunohistochemical data was done by counting the number of immunostained cells as percent of total epidermal cells from ten microscopic fields of immunostained tissues per animal. Statistical Analysis All values in the figures and text are expressed as arithmetic means ± SEM. Data were evaluated with GraphPad Prism version 5.00 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). In all cases, the Shapiro-Wilk test was used to verify the normality of the data. The Mann-Whitney U-test was chosen for non-parametric values. The parametric 93 values groups were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni’s Multiple Comparison Test. P values < 0.05 were considered statistically significant. In the histological experiment, results shown are representative of at least four independent experiments performed on different days. Results Effects of glycolipids on IL-6 and IL-8 production in TNF-α-stimulated HaCaT human keratinocytes To investigate the effect of the glycolipid MGMG-A and the fraction MGDG on the production of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8, HaCaT cells were pretreated with non-cytotoxic concentrations of glycolipids (10, 30, and 50 µM for pure compound and µg/mL for fraction) for 1 h, and then, were stimulated with TNF-α (10 ng/mL) for 24 h. TNF- α-stimulated HaCaT cells manifested high IL-6 and IL-8 levels in comparison with unstimulated control cells (P < 0.001) (Table 1). Pretreatment with the compound and fraction significantly inhibited IL-6 and IL-8 production at the different tested concentrations. MGMG-A (µM) MGDG (µg/mL) Control TNF-α Dex 10 30 50 10 30 50 IL-6 (pg/ml) 8.738 ± 2.5 123.2 ± 10.8 *** 27.9 ± 10.7 ++ 36.6 ± 16.2 + 34.6 ± 14.8 + 32.5 ± 13.9 + 44.5 ± 13.5 + 45.3 ± 8.8 + 45.9 ± 8.9 + IL-8 (pg/ml) 5473 ± 971.1 55505 ± 7148 *** 20848 ± 2848 +++ 28822 ± 3938 ++ 26727 ± 4170 ++ 25205 ± 3610 ++ 31838 ± 5851 + 30601 ± 6962 + 27979 ± 6116 ++ Table 1. Effects of glycolipids from I. galbana on IL-6 and IL-8 production in TNF-α-stimulated HaCaT human keratinocytes. IL-6 levels and IL-8 levels in TNF- α-stimulated HaCaT human keratinocytes. Cells were pre-incubated with the glycolipid MGMG-A (10, 30, 50 µM) and the fraction MGDG (10, 30, 50 µg/mL), and then stimulated with TNF-α (10 ng/mL) for 24 h. Dexamethasone (Dex) was used as positive reference compound at 1 µM. After 24 h, the production of cytokines in the supernatants was measured by ELISA assay. Results are representative of six independent experiments (n=6). Values are means with standard errors represented by vertical bars. Mean value was significantly different compared with the control group (*** P < 0.001; Student t test). Mean value was significantly 100 Figure 4. Topical pre-treatment with cream containing the glycolipid fraction MGDG from I. galbana decreases skin inflammation and hyperplasia on the murine 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced model. Glycolipid cream formulation (100 mg per site containing 200 µg of MGDG), Dexamethasone (Dex) (100 mg per site, equivalent at 200 µg of compound) or vehicle (cream with a comparable volume of ethanol) were topically administered from 2 days before hyperplasia induction and 30 min after each TPA application (2 nmol per zone for three consecutive days). Dex was used as positive reference compound. (a) Representative images of macroscopic appearance of the dorsal skin. (b) Determination of skin edema as punch biopsy weight. (c) Histological appearance of mouse dorsal skin after haematoxylin/eosin (H&E)-staining; Bar = 100 µm. 101 Original magnification 100X. (d) Epidermal thickness assessment in H&E-stained skin slides. (e) Myeloperoxidase (MPO) activity. Values are means with standard errors represented by vertical bars. Data are means ± SEM (n=6-8 mice/group). Mean value was significantly different compared with the sham group (***P < 0.001; Student t test). Mean value was significantly different compared with cream-TPA group (+P < 0.05, +++P < 0.001; one-way ANOVA followed by Bonferroni’s Multiple Comparison test). Figure 5. Topical pre-treatment with cream containing the glycolipid fraction MGDG from I. galbana attenuates 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)- induced COX-2 expression in mouse skin. (a) Representative photographs of epidermal COX-2 distribution by immunohistochemical detection; Bar = 200 µm. Original magnification 200X. (b) Positive COX-2 epidermal layer was assessed by counting the COX-2 positive cells versus total cells in different immunostainned dorsal skin sections per animal; photographs are representative from one out of three mice investigated. Values are means with standard errors represented by vertical bars. Data are means ± SEM (n=6). Mean value was significantly different compared with the sham group (***P < 0.001; Student t test). Mean value was significantly different compared with cream-TPA group (+++P < 0.001; one-way ANOVA followed by Bonferroni’s Multiple Comparison test). Discussion Inflammatory skin diseases have a significant impact in society, being atopic dermatitis, acne, sunburn and psoriasis the most common manifestations. Psoriasis is a chronic, autoimmune and multisystem 102 inflammatory disease that affects at 2-4 % of population (Anand et al., 2017). Currently, conventional treatments of this disease are based on the degree of severity and include from topical therapy and systemic agents through to phototherapy or combinations of those. However, many of these therapies are not recommended for a vast majority of patients afflicted of mild forms of psoriasis because of their potential risk (Malatestinic et al., 2017). Therefore, other approaches for mild psoriasis treatment that require topical therapy only are still needed. In this regards, natural products provides some options for increasing safety and efficacy in the management of this pathology (Herman et al., 2016). Microalgae species are a promising source of a variety of bioactive molecules, including polar lipids such as glycolipids. Lipid enriched extracts or pure glycolipids have previously demonstrated their in vitro anti-inflammatory (Banskota et al., 2014; Robertson et al., 2015), and antitumor promoting properties (Hossain et al., 2005), which make them suitable candidates for further investigation. However, the use of galactosylglycerides to prevent skin pathologies such as psoriasis has not been previously evidenced. In this sense, we have recently observed that this kind of metabolites, protect human keratinocytes HaCaT against UVB radiation through inhibition of ROS generation and decrease of the production of the pro-inflammatory cytokine IL-6 (Rodríguez-Luna, et al., submitted). These findings suggest that this type of molecules could play a main role not only in protecting the skin against UVB exposition but also in preventing the skin inflammatory process. In this context, we aimed to evaluate the anti-inflammatory effects of the glycolipid MGMG-A and, the fraction MGDG in an experimental TPA-induced hyperplasia model in mice. Moreover, we used different semisolid formulations in which the glycolipid was loaded in order to facilitate its topical application and to enhance the permeation mechanism compared to conventional liquid preparations. Firstly, we tried to demonstrate the anti-inflammatory potential of the compounds under study in the in vitro model of TNF-α-stimulated HaCaT keratinocytes. This cytokine plays a crucial role in the pathogenesis of skin inflammatory diseases as psoriasis (Paya et al., 2007). We proved that pre-treatment with the compound MGMG-A or the fraction MGDG significantly reduced the production of the proinflammatory cytokines IL-6 and IL-8 in stimulated HaCaT keratinocytes. These results led us to evaluate the possible preventive effects of these products on TPA-induced hyperplasia in murine skin by using two experimental approaches. In the first in vivo experiment, glycolipids, 103 dissolved in acetone, were topically administered to dorsal skin 30 min before TPA administration. Our data showed that TPA clearly caused peeling, erythema, and a strong inflammatory reaction, produced by a marked influx of mononuclear and polymorphonuclear leukocytes in epidermis and dermis. Treatment of mice with the compound MGMG-A or the fraction MGDG from I. galbana reduced the hyperplasia manifestations and the inflammation grade, presumably due to an inhibition of inflammatory cells infiltration, as revealed MPO study. These findings are interesting since the cellular infiltrate has pathogenic roles in psoriasis and thus, its control is extremely important for the attenuation of this disease (Yazici et al., 2016). Microscopic analysis of the dorsal skin was in accordance with macroscopic study reflecting the attenuation of the keratinocytes hyperproliferation in the epidermis after the treatment with the acetone-dissolved glycolipids. Our results are in line with a previous report that showed that topical pre-treatment with the glycoglycerolipids MGDG, DGDG, or SQDG, obtained from a blue green alga, reduced the inflammation in croton-oil-induced ear edema, and in carrageenan-induced paw edema models (Bruno et al., 2005). The role for TNF-α, IL-17, and IL-1β in psoriasis pathogenesis has been well documented (Mahil et al., 2016), as strategies to block these cytokines showed to be particularly effective in the treatment of this disease (Campa et al., 2016). In the present study, dorsal skin samples from TPA group showed increased levels of the pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-17, which were decreased in skin samples from mice treated with MGMG-A or MGDG fraction. On the other hand, IL-10 is considered an anti-inflammatory cytokine because it inhibits the T cells and macrophages pro-inflammatory cytokine production (Geginat et al., 2016). Our data showed no lower significant levels of IL-10 in mice treated with the acetone-dissolved glycolipids in comparison with that in TPA group, suggesting a lower role of this cytokine in the immune response by MGMG-A or MGDG. After examining the preventive effects of the compound MGMG-A and fraction MGDG obtained from I. galbana, we aimed to optimize the permeation behaviour of these substances with respect to previously acetone-dissolved preparations. In the skin diseases, such as psoriasis, local topical delivery can be improved by following two main approaches. Firstly, the adequate choice of formulation can optimize the local targeting. Secondly, the physicochemical parameters of the drug itself, such as lipophilicity, can affect the degree of delivery as well. 104 Concerning to the adequate choice of carrier composition, different formulations, including hydrophilic gel, cream and ointment were prepared and analyzed. For these studies, a fluorescent hydrophobic marker such as rhodamine 6G, with an oil/water partition coefficient of 2.62 was added, as a model drug (Wang et al., 2012). The in vivo CLSM study defined the cream as the best vehicle to dig deeper in the skin preserving the entity of different tissue layers. This may be assigned to the fact that the surfactant-like properties of this heterogeneous disperse system could enhance the amount permeated of rhodamine 6G. On the other hand, control solution using ethanol as solvent and hydroalcoholic Carbopol® gels, exhibited also high drug permeation. This could be also attributed to the presence of ethanol in the formulation, which was used as solubilizer and permeation enhancer. On the contrary, the deposition of the fluorophore from lipid ointment onto the skin was very low. This would be ascribed to the hydrophobic nature of the vehicle, being insoluble, which did not penetrate through the skin and remained onto the skin surface, as visualized in figure 3. Usually, the permeation pathway across the SC resides in the intercellular lipid domains. Conversely, at the viable epidermis level, the fluorophore is not restricted to the cell membranes only, but also accumulates in the cytosol. In this study, a relationship between lipophilicity of the applied formulation on the accumulation of the fluorophore in SC and viable epidermis was observed. Although the fluorescent label was applied onto the SC of mice, only low relative accumulation in the deeper layers of the skin was observed for the most lipophilic vehicle, the ointment. This can be explained since the lipid lamellae constitute only a small region of the SC compared to the corneocytes. However, the adjacent viable epidermis is much more brightly stained than SC in samples from the rhodamine-loaded cream and hydrogel formulations, because in this layer the label can distribute throughout the entire epidermis, which results in a brighter appearance (Aggarwal et al., 2012). Once selected the cream for further studies, an ex vivo permeation process was planned for comparison MGDG-loaded cream with MGDG reference solution and Dex cream. This corticoid was selected for being the most used drug in the psoriasis treatment. In this study, the permeation through mice excised skin was determined using Franz diffusion apparatus and degassed absolute ethanol. Since the goal of this study was to find the experimental conditions that allowed a fast and accurate method to evaluate the permeability properties of different formulations across the skin, we decided to use ethanol as solvent forming the receiving 105 compartment because the assayed molecules (MGDG and Dex) are freely soluble in this medium. This solvent has been used for analyzing the skin diffusion kinetic of other molecules, such as α-tocopherol acetate (Mahamongkol et al., 2005). However, the use of this solvent has the potential to extract lipids from the SC and to artificially increase the skin permeability. Since all the formulations tested in these experiments had ethanol as penetration enhancer interacting with skin constituents to increase drug flux, this would not affect the relative results. MGDG and Dex from the three formulations were detected in the receiver medium in a time-dependent and cumulative amount permeated curves were plotted. Concerning MGDG cream respect to MGDG ethanolic solution, the difference in the permeability percentage may be attributed to the surfactant-like properties of emulsion components and their affinity to the phospholipids of the skin membrane (Williams and Barry, 2012). A common mechanism of action of surfactants as penetration enhancers involves firstly a “push” effect to increase the drug solubility and hence to create a high concentration gradient. Secondly, a “pull” effect is related to the flux of the permeation enhancer through the skin, which can induce skin structural transformations (Puglia and Bonina, 2008). On the other hand, findings from our study indicate that the cream exerted the best effect in increasing skin permeation of MGDG compared to Dex, in which the permeated amount was lower (15 % ± 3.1). In accordance to another studies (Wang et al., 2004), this behaviour can be attributed to lower partition coefficient of this molecule (logP 1.83) with respect to MGDG (Maréchal et al., 1994). The interaction of the drug between water and oil phase can determine the extent of lowering of the thermodynamic activity in external phase, which is in contact with the skin. Partitioning of the drug into internal oily phase (higher logP) is due to hydrophobic characteristic of the drug. Being both molecules highly lipophilic substances, the extremely slow permeation of Dex from the emulsion through the mice skin can be explained by the fact that diffusion of drug through oily phase is the limiting step for drug permeation (Grams et al., 2003). An important consideration in psoriasis is the skin condition. Topical formulations may be applied either to opened lesions that have lost SC barrier properties or to thickened lesions that represent an additional barrier to absorption (Garnier T, 2002). Thus, our findings suggest that a hydrophilic vehicle (cream) could be an interesting alternative to improved topical delivery of MGDG in both conditions. 106 Based on the results above, we selected the fraction MGDG from I. galbana, and elaborated a cream with MGDG to evaluate its effects on a second TPA-induced hyperplasia model in mice. In this experimental model, TPA was applied 1 h before the administration of MGDG-containing cream to ensure the correct absorption of the product as well as increase its permeation and protect the lipid integrity. Our data showed that dorsal application of TPA caused similar manifestations to those detected in the previous model. Consistently with the anti-inflammatory activity of glycolipids, pre-treatment with MGDG-cream ameliorated macroscopic cutaneous lesions induced by repetitive application of TPA, which was correlated with the histological normalization of epidermal. Interestingly, the reduction of skin edema and MPO activity were higher with MGDG-cream than those detected in the compound dissolved in acetone, reaching similar levels to those of the reference corticosteroid Dex. It has been shown that topical application of TPA activates intracellular transduction signals, enhancing aberrant expression of COX-2 in mouse skin (Kundu et al., 2009; Passos et al., 2013). To further elucidate the mechanisms for the anti-inflammatory role of MGDG-cream in damaged skin, we detected this protein expression by immunohistochemistry. The results evidenced that pre-treatment with MGDG-cream markedly attenuated COX-2 expression in TPA-stimulated mouse skin, reaching similar levels to Dex. These findings, at least partly, suggest that suppression of COX-2 expression may be involved in the preventive effect of this glycolipid fraction on TPA-induced epidermal hyperplasia. In conclusion, our study demonstrates for the first time the preventive effects of topical administration of the glycolipid MGMG-A or a fraction MGDG from I. galbana, in the inflammatory model of TPA- induced skin hyperplasia. These actions may be associated with a reduction of edema, leucocyte infiltration, proinflammatory cytokines production and COX-2 expression in skin mouse. Topical application of MGDG-cream enhanced the sample permeability and consequently significantly increased the preventive effects of this product. Future studies are needed to expand the vision of the mechanisms by which these lipid products improve skin inflammation and will support their potential use in the development of effective therapeutic strategies for skin pathologies as psoriasis. Conflicts of interest The authors have no conflict of interest to declare. 107 Acknowledgment This study was supported by grants from Ministerio de Economía y Competitividad MICIIN INNPACTO-IPT-2012-1370-060000 and Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa-Junta de Andalucía POLFANAT-P12-AGR-430. The authors thank “Centro de Investigación, Tecnología e Innovación” of the University of Seville for providing technical assistance. The authors’ contributions are follows: MC. T., E.T., V. M. and J. A-R designed the study protocol; C. DLR., performed chemical characterization of glycolipids from I. galbana; A. R-L., J. A-R. and E. T., conducted the in vivo and histological experiments and analysed the data; A. R-L. and ML. G-R executed technologic experiments; A. R- L., E. T., J. A-R., V. M. and ML. G-R wrote the draft of the manuscript. All the authors critically reviewed and approved the final version of the manuscript. None of the authors has any conflicts of interest to declare. Bibliography Aggarwal, N., Goindi, S., Mehta, S.D., 2012. Preparation and Evaluation of Dermal Delivery System of Griseofulvin Containing Vitamin E-TPGS as Penetration Enhancer 13, 0–7. doi:10.1208/s12249-011-9722-y Álvarez-Roman, R., Naik, A., Kalia, Y.N., Fessi, H., Guy, R.H., 2004. Visualization of skin penetration using confocal laser scanning microscopy 58, 301–316. doi:10.1016/j.ejpb.2004.03.027 An, J., Li, Z., Dong, Y., Ren, J., Huo, J., 2016. Amentoflavone protects against psoriasis-like skin lesion through suppression of NF-κB-mediated inflammation and keratinocyte proliferation. Mol. Cell. Biochem. 413, 87– 95. doi:10.1007/s11010-015-2641-6 Anand, S., Gupta, P., Bhardwaj, R., Narang, T., Dogra, S., Minz, R.W., Saikia, B., Chhabra, S., 2017. Is psoriasis an autoimmune disease: Interpretations from an immunofluorescence-based study. J. Cutan. Pathol. 1–6. doi:10.1111/cup.12891 Andrés, R.M., Montesinos, M.C., Navalón, P., Payá, M., Terencio, M.C., 2013. NF- κB and STAT3 inhibition as a therapeutic strategy in psoriasis: in vitro and in vivo effects of BTH. J. Invest. Dermatol. 133, 2362–71. doi:10.1038/jid.2013.182 Arasa, J., Martos, P., Terencio, M.C., Valcuende-Cavero, F., Montesinos, M.C., 2014. Topical application of the adenosine A2A receptor agonist CGS-21680 prevents phorbol-induced epidermal hyperplasia and inflammation in mice. Exp. Dermatol. 23, 555–60. doi:10.1111/exd.12461 Banskota, A.H., Stefanova, R., Sperker, S., Lall, S.P., Craigie, J.S., Hafting, 108 J.T., Critchley, A.T., 2014. Polar lipids from the marine macroalga Palmaria palmata inhibit lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW264.7 macrophage cells. Phytochemistry 101, 101–108. doi:10.1016/j.phytochem.2014.02.004 Bruno, A., Rossi, C., Marcolongo, G., Di Lena, A., Venzo, A., Berrie, C.P., Corda, D., 2005. Selective in vivo anti-inflammatory action of the galactolipid monogalactosyldiacylglycerol. Eur. J. Pharmacol. 524, 159–68. doi:10.1016/j.ejphar.2005.09.023 Campa, M., Mansouri, B., Warren, R., Menter, A., 2016. A Review of Biologic Therapies Targeting IL-23 and IL-17 for Use in Moderate-to-Severe Plaque Psoriasis. Dermatol. Ther. (Heidelb). 6, 1–12. doi:10.1007/s13555-015-0092- 3 De los Reyes, C., Ortega, M.J., Rodríguez-Luna, A., Talero, E., Motilva, V., Zubía, E., 2016. Molecular Characterization and Anti-inflammatory Activity of Galactosylglycerides and Galactosylceramides from the Microalga Isochrysis galbana. J. Agric. Food Chem. 64, 8783–8794. doi:10.1021/acs.jafc.6b03931 Garnier T, C.S., 2002. Topical treatment for cutaneous leishmaniasis. Curr. Opin. Investig. drugs 2 3, 538–544. Geginat, J., Larghi, P., Paroni, M., Nizzoli, G., Penatti, A., Pagani, M., Gagliani, N., Meroni, P., Abrignani, S., Flavell, R.A., 2016. The light and the dark sides of Interleukin-10 in immune-mediated diseases and cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 30, 87–93. doi:10.1016/j.cytogfr.2016.02.003 Grams, Y.Y., Alaruikka, S., Lashley, L., Caussin, J., Whitehead, L., Bouwstra, J.A., 2003. Permeant lipophilicity and vehicle composition influence accumulation of dyes in hair follicles of human skin. Eur. J. Pharm. Sci. 18, 329–336. doi:10.1016/S0928-0987(03)00035-6 Grisham, M.B., Benoit, J.N., Granger, D.N., 1990. Assessment of leukocyte involvement during ischemia and reperfusion of intestine. Methods Enzymol. 186, 729–42. Guerra, I., Pérez-Jeldres, T., Iborra, M., Algaba, A., Monfort, D., Calvet, X., Chaparro, M., Mañosa, M., Hinojosa, E., Minguez, M., Ortiz de Zarate, J., Márquez, L., Prieto, V., García-Sánchez, V., Guardiola, J., Rodriguez, G.E., Martín-Arranz, M.D., García-Tercero, I., Sicilia, B., Masedo, Á., Lorente, R., Rivero, M., Fernández-Salazar, L., Gutiérrez, A., Van Domselaar, M., López-SanRomán, A., Ber, Y., García-Sepulcre, M., Ramos, L., Bermejo, F., Gisbert, J.P., 2016. Incidence, Clinical Characteristics, and Management of Psoriasis Induced by Anti-TNF Therapy in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Inflamm. Bowel Dis. 22, 894–901. doi:10.1097/MIB.0000000000000757 Herman, A., Herman, A.P., Herman, A., 2016. Topically Used Herbal Products for the Treatment of Psoriasis – Mechanism of Action , Drug Delivery , Clinical 109 Studies. Planta Med. 82, 1447–1455. Hossain, Z., Kurihara, H., Hosokawa, M., Takahashi, K., 2005. Growth inhibition and induction of differentiation and apoptosis mediated by sodium butyrate in caco-2 cells with algal glycolipids. Vitr. Cell. Dev. Biol. - Anim. 41, 154–159. doi:10.1290/0409058.1 Kundu, J.K., Hwang, D.M., Lee, J.C., Chang, E.J., Shin, Y.K., Fujii, H., Sun, B., Surh, Y.J., 2009. Inhibitory effects of oligonol on phorbol esterinduced tumor promotion and COX-2 expression in mouse skin: NF-κB and C/EBP as potential targets. Cancer Lett. 273, 86–97. doi:10.1016/j.canlet.2008.07.039 Li Z, Liu M, Wang H, D.S., 2016. Increased cutaneous wound healing effect of biodegradable liposomes containing madecassoside : preparation optimization , in vitro dermal permeation , and in vivo bioevaluation 11, 2995–3007. Liu, R.F., Wang, F., Wang, Q., Zhao, X.C., Zhang, K.M., 2015. Mesenchymal stem cells from skin lesions of psoriasis patients promote proliferation and inhibit apoptosis of HaCaT cells. Genet. Mol. Res. 14, 17758–17767. doi:10.4238/2015.December.21.49 López-Pinto, J.M., González-Rodríguez, M.L., Rabasco, a M., 2005. Effect of cholesterol and ethanol on dermal delivery from DPPC liposomes. Int. J. Pharm. 298, 1–12. doi:10.1016/j.ijpharm.2005.02.021 Lowes, M.A., Bowcock, A.M., Krueger, J.G., 2007. Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature 445, 866–873. doi:10.1038/nature05663 Mahamongkol H, Bellantone RA, Stagni G, Plakogiannis FM, 2005. Permeation study of five formulations of alpha-tocopherol acetate through human cadaver skin. J Cosmet Sci 56, 91–103. Mahil, S.K., Capon, F., Barker, J.N., 2016. Update on psoriasis immunopathogenesis and targeted immunotherapy. Semin Immunopathol 38, 11– 27. doi:10.1007/s00281-015-0539-8 Malatestinic, W., Nordstrom, B., Wu, J.J., Goldblum, O., Solotkin, K., Lin, C.- Y., Kistler, K., Fraeman, K., Johnston, J., Hawley, L.L., Sicignano, N., Araujo, A., 2017. Characteristics and Medication Use of Psoriasis Patients Who May or May Not Qualify for Randomized Controlled Trials. J. Manag. Care Spec. Pharm. 23, 370–381. doi:10.18553/jmcp.2017.16367 Maréchal, E., Block, M.A., Joyard, J., Douce, R., 1994. Comparison of the kinetic properties of MGDG synthase in mixed micelles and in envelope membranes from spinach chloroplast. FEBS Lett. 352, 307–310. doi:10.1016/0014- 5793(94)00978-3 Martins, A., Vieira, H., Gaspar, H., Santos, S., 2014. Marketed marine natural products in the pharmaceutical and cosmeceutical industries: Tips for success. Mar. Drugs 12, 1066–1101. doi:10.3390/md12021066 118 formulations. To date, we have developed topical experiments in mice with ethanol or acetone-dissolved compounds (Urikura et al. 2011; Arasa et al., 2014). With the aim to solve the irritant effect of this solvent for use in human, in the present work, FX will be dissolved in ethanol absolute to further be incorporated into several common topical formulations. The aim of this study was to evaluate the pharmacological properties of a FX-loaded galenic formulation in the 12-O- tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)-induced hyperplasia model in mice, which mimics psoriatic parameters in dorsal murine skin, and in the UVB- induced erythema model in hairless mice, which reproduces the consequences expected in humans receiving acute UVB radiation. Herein, we reported the in vitro anti-inflammatory and photoprotective effects of FX. In addition, the pre-treatment with the FX-loaded galenic preparation effectively ameliorated TPA-induced hyperplasia by decreasing skin edema, epidermal thickness, MPO activity and COX-2 expression levels. Moreover, we showed that FX reduced UVB-induced erythema in mice thorough down-regulation of COX-2 and iNOS protein expressions as well as up-regulation of the anti-oxidant heme oxygenase 1 (HO-1) protein levels through nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf- 2) signalling pathway. MATERIALS AND METHODS Materials Dried biomass derived from culture of the microalgae I. galbana was provided by the Department of Biotechnology of the Instituto Tecnológico de Canarias (35119 Santa Lucía, Gran Canaria, Canary Islands, Spain). The extraction of the dried biomass of I. galbana and structural determination of FX was developed by the Department of Organic Chemistry of the Cadiz University. Cell culture The THP-1 human monocytic leukemia cell line and HaCaT human keratinocytes were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, USA). THP-1 cells were cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY) containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin. HaCaT human keratinocytes were maintained in high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, GIBCO, Grand Island, NY) with the same proportion of compounds (Aoki- 119 Yoshida et al., 2013). Both cell lines were grown in a humidified atmosphere containing 5% CO2 at 37 ºC. Cell viability assay Sulforhodamine B (SRB) assay was used for determining the viability of THP-1 macrophages and HaCaT cells upon exposure to FX (Skehan et al., 1990). Firstly, for differentiation into macrophages, THP-1 cells (104 cells/well) were incubated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (0.2 µM) for 72 h in 96-well plates and HaCaT cells were seeded into 96-well plates in the growth medium (104 cells/well) for 24 h to ensure the adherence. After that, cells were treated with FX at final concentrations range of 10-100 µM in DMSO 0.1% (v/v) and the cytotoxicity was measured after 24, 48 and 72 h of incubation. The absorbance was determined at 492 nm in a microplate spectrophotometer (Sinergy HT, Biotek®, Bad Friedrichshall, Germany). Determination of TNF-α production THP-1 monocytes were differentiated into macrophages in 96-well plates (104 cells/well). Then, cells were incubated for 1 h with FX (10, 30 and 50 µM). The positive reference compound used was dexamethasone (Dex) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 µM). Inflammatory response was induced by addition of lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL) except for control group. After 24 h, commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Diaclone GEN-PROBE, France) was used to quantify TNF-α according to the manufacturer’s protocol. Determination of IL-6 and IL-8 production HaCaT cells were seeded in 6-well plates (5x105 cells/well). After 24 h, cells were washed twice (PBS, 4 ºC) and medium was added containing FX (10, 30 and 50 μM) or Dex (1 μM) as reference compound, for 1 h. Then, cells were stimulated with TNF-α (10 ng/mL) except for control group. After 24 h, commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Diaclone GEN-PROBE, France) was used to quantify IL-6 and IL-8 according to the manufacturer’s protocol. UVB irradiation of HaCaT Keratinocytes Human keratinocytes were exposed to UVB radiation as previously described (Huang et al., 2010). Briefly, the cells were grown to confluence and were treated with different concentrations of FX (10, 30 and 50 µM) for 1 h. Then, medium was removed and a thin layer of PBS was 120 added. Cells were exposed to a single dose of UVB radiation (50 mJ/cm2) for 1 min. The UVB source was a CL-1000M UV Crosslinker (UVP, Upland, CA, USA), which was used to deliver an energy spectrum of UVB light (280-315 nm; peak intensity, 302 nm). After UVB irradiation, the cells were supplied with fresh complete medium and incubated for 24 h. Analysis of intracellular LDH activity The measure of cytosolic enzyme lactate dehydrogenase (LDH) is one of the commonly used methods for assessing loss of cellular membrane integrity. Assay is based on the conversion of lactate to pyruvate in the presence of LDH with the consequence oxidation of NADH as previously described (Verhulst et al., 1998). HaCaT cells were seeded in 6-well plates (5x105 cells/well). After 24 h, cells were treated with FX (10, 30 and 50 μM) for 1 h and then, were irradiated with UVB. After 24 h, free-cells supernatants and cell lysates were mixed in a 96-well plate and the absorbance was read by using a microplate reader system (Sinergy HT, Biotek®, Bad Friedrichshall, Germany). LDH leakage was estimated calculating the LDH activity in the cell-free medium and LDH activity in lysates ratio. Results were represented as the percentage (%) of change in activity compared with the control cells. Intracellular ROS scavenging activity For quantification of ROS in HaCaT cells, the dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) assay was employed (Wang and Joseph, 1999). HaCaT cells were seeded in 96-well plates (104 cells/well). Non-irradiated cells were used as negative control. After 24 h, cells were treated with FX (10, 30 and 50 µM) for 1h and then, were exposed to UVB. Post irradiation, cells were incubated with 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) solution (5 mg/mL) in PBS for 30 min. The fluorescence of the 2’,7’-dichlorofluorescein (DCF) product was determined using a fluorescence plate reader (Sinergy HT, Biotek®, Bad Friedrichshall, Germany) at 485 nm for excitation and 535 nm for emission. Determination of IL-6 production in UVB-exposed HaCaT keratinocytes HaCaT cells (5x105 cells/well) were seeded in 6-well plates and allowed to attach . After 24 h, cells were treated with FX (10, 20 and 50 μM) for 1 h and then, were exposed to UVB. After 24 h, supernatant fluids were collected and ELISA kit (Diaclone GEN-PROBE, France) was employed to quantify IL-6 according to the manufacturer’s protocol. The 121 absorbance at 450 nm was read by a microplate reader (Labysystem Multiskan EX, Thermo Scientific, NY, USA). Preparation of topical formulations Topical creams containing 3 mg/g of drug (beta-carotene (β-Carot), FX or Dex) were prepared using a very simple preparation method of Oil/Water (O/W) emulsion. β-Carot was employed as reference compound because of its structural similarity with FX. The drug was dissolved in absolute ethanol (10 mg/mL) and then was added to an excipient cold mixture composed of Caprylic/Capric Triglycerides, Glycol Stearate, Polyethylene glycol (PEG)-3 Glyceryl Cocoate and Steareth-7, which was previously heated up to 50ºC to improve the drug interposition. The preparation was then mixed and stirred until to obtain a homogeneous semisolid formulation. Lipophilic ointment was prepared using a traditional preparation method of semisolid formulations combining both the melt emulsification and stirring. In brief, a first portion of the oily phase, consisting of Brij® 72 (5 % w/w) and white soft paraffin (77.3 % w/w) were blended under gentle stirring in a water bath at 70 °C following the addition of liquid paraffin (5 % w/w) and α-tocopherol (0.002 % w/w) until complete interposition at 60 °C. Then, β-Carot dissolved in ethanol (10 mg/mL) was added to the mixture. The aqueous phase was prepared by adding two solutions of EDTA (0.0065 % w/w) and disodium phosphate dihydrate (0.026 % w/w) prepared with distilled water at 60 °C dropwise to the lipid phase, with moderate magnetic stirring at 150 rpm for 20 minutes until a homogeneous semisolid formulation was obtained. For preparing the hydrophilic gel, Carbopol 934P (1% w/v) was soaked in water for 2 h and then dispersed by stirring at 500 rpm (IKA) to obtain a smooth dispersion. After the dispersion was allowed to stand, β-Carot solution in ethanol absolute (10 mg/mL) was gradually added to the polymer dispersion under magnetic stirring. At this stage, triethanolamine was added to the preparation with slow-rate stirring. The presence of ethanol in the preparation makes that no additional preservative is required. The formulations were kept in vacuum overnight in order to escape any entrapped air in the gel base. In vitro permeation studies from topical formulations In vitro drug permeation studies from the topical formulations were performed using a Franz diffusion cell apparatus (SES-Gmgh Analyses system, Germany), with 14,5 mL receptor volume and 3,14 cm2 diffusion area. 122 An appropriately conditioned regenerated cellulose nitrate membrane (Tuffryn®; Pall Corporation, Port Washington, NY, USA) impregnated with lauryl alcohol (membrane weight increase 90–110%) was used as artificial lipophilic membrane simulating the epidermal barrier (Mura et al., 1993; Maestrelli et al., 2005). The membrane was placed in the diffusion cell sandwiching the donor and receptor compartments. The receiver solution contained absolute ethanol and the donor chamber was filled with 1 g of formulation (cream, ointment or hydrogel). The whole diffusion cell was thermostated maintaining the temperature at 32ºC. The amount of all the formulations was equivalent to 3 g of β- Carot, FX or Dex. Aliquots of 0,5 mL were withdrawn from the receptor chamber after 0.5, 1, 1.5, 2 and 3 h and replaced by fresh ethanol. The concentrations of β-Carot and Dex were spectrometrically assayed at 454 nm and 254 nm (UV/vis 1601 Shimadzu), respectively. The FX content in the ethanol solutions was analyzed by using HPLC method. The correction for the cumulative dilution was calculated. FX analysis was performed on a Hitachi Elite Lachron HPLC system equipped with a L-2130 isocratic pump, a diode array detector L-2455 and a L-2200 autosampler. Separation was carried out within a chromatographic C18 column (Merck, RP-18 LichroCART® 150 mm × 4 mm, 5 µm). For drug analysis, the injection volume was 10 mL, and the flow rate and column temperature was set at 1.0 mL/min and 25 ºC, respectively. The mobile phase consisted of A (formic acid 0.1%) and B (acetonitrile). The elution program was: 6 min isocratic at 90% B, followed by a gradient to 100% B at 10 min. Afterwards, the column was re-equilibrated during 5 min at 90% B. The cumulative amounts of permeated drug per unit area in the receiver chamber (µg/cm2) were plotted as a function of time (h). The slope of the linear portion of the plot was presented as steady state flux (Jss, µg/cm2/h). From the permeation profiles, the AUC (area under the drug permeation curve) was calculated using the trapezoidal rule as a quantitative parameter for studying the permeation magnitude (Cirri et al., 2015). Animals Female Swiss CD-1 mice (25-30 g) were purchased from Janvier-Labs (Le Genest St Isle, France) and female SKH-1 hairless mice (18-20 g) from Charles River Laboratories (France). Mice were maintained on a standard conditions (temperature of 24–25°C, humidity of 70-75% and 12 h light-12 h dark cycle) and were allowed free access to a standard diet (Panlab) and water ad libitum. All studies were performed in accordance 123 with the recommendations of the European Union regarding animal experimentation (Directive of the European Council 2010/63/EU). The experiments followed protocols approved by the Animal Ethics Committee of the University of Seville. TPA-induced epidermal hyperplasia model and treatments Female Swiss CD-1 mice (n = 10 per group) were used to study the effect of FX from I. galbana on TPA-induced hyperplasia in dorsal mice skin (Andrés et al., 2013). Briefly, the dorsal hair of animals was removed with an electric clipper and treated with depilatory cream (Deliplus, Barcelona, Spain) and 24 h later, the animals were assigned to the different groups: Sham (100 mg of cream with 0.2% of ethanol), TPA (20 µl of ethanol containing 2 nmol of TPA per site), TPA-Cream (100 mg of cream and 2 nmol of TPA, dissolved in 20 µl of ethanol), Dex (100 mg per site, equivalent at 200 µg of compound dissolved in ethanol) and FX-cream formulation (100 mg per site, containing 200 µg of FX dissolved in ethanol at 10 µg/µl) were applied on the dorsal skin in an area of 1 cm2 by using a syringe, during 2 days before the hyperplasia induction. Day 4, TPA was topically applied to the same areas. After 1 h, FX-cream, Dex or vehicle were administered following the mentioned protocol. This procedure was repeated during two consecutive days (Fig. 1). After 24 h of the last TPA dorsal application (day 7), mice were sacrified by cervical dislocation. Edema was assessed by punch biopsies from the treated dorsal skin. Skin pieces were fixed in 4 % buffered paraformaldehyde for histological studies. Other pieces were frozen in liquid nitrogen for measurement of biochemical parameters. Figure 1: Experimental setting for the TPA-induced epidermal hyperplasia model in mice and treatment groups. TPA, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate; Dex, dexamethasone; FX, Fucoxanthin; EtOH, ethanol. UVB-induced erythema in hairless mice 124 Female SKH-1 hairless mice (n = 8 per group) were used to study the effect of FX from I. galbana on UVB-induced erythema. Animals were pre-treated with β-carotene-cream (100 mg per site, containing 200 µg of β-carotene dissolved in ethanol at 10 µg/µl) as reference control and FX-cream formulation (100 mg per site, containing 200 µg of FX dissolved in ethanol at 10 µg/µl) or vehicle (cream with a comparable volume of ethanol) (Fig. 2). Sham control mice were treated topically with cream vehicle. The formulations were applied on the dorsal skin (1 cm2/area) by using a syringe, and starting 2 days before irradiation. On day 3, 30 min after application of the substances, mice were exposed to an acute UVB dose (360 mJ/cm2) as previously described (Sirerol et al., 2015). 48 h after UVB exposure, mice were macroscopically evaluated and sacrificed. At this end-point time, a pronounced UVB-induced cutaneous inflammation was shown (J Duncan, 2009). Figure 2: Experimental setting for the of UVB-induced acute erythema model in hairless mice and treatment groups. β-carot, βeta-carotene; FX, Fucoxanthin; EtOH, ethanol; UVB, ultraviolet B. Dermatoscope measures Dorsal skin was macroscopically examined every day by using a multi-dermatoscope (Dermatoscope MDS 800, Microcaya, Bilbao, Spain). Corneometer® was used to determinate the hydration in the stratum corneum through electrical capacitance of the skin surface (Haruta-Ono et al., 2012). Cutometer® probe was used as suction method to analyse the real elasticity of skin (Nishimori Y., Edwards C., Pearse A., Matsumoto K., Kawai M., 2001). In the last step, Mexameter® was employed to analyse the redness skin by melanin index (Wang et al., 2001). Every day, dorsal skin mice was assessed twice and finally the results were expressed in arbitrary units (a. u.) or by a melanin index scale (1-36). 125 Histological study The samples were fixed in paraformaldehyde, dehydrated by increasing concentrations of ethanol and embedded in paraffin. For haematoxylin and eosin stains, tissue sections were cut at 7 μm on a rotary microtome (Leica Microsystems, Germany), mounted on slides, deparaffinized with xylene, rehydrated through graded alcohols and stained according to standard protocols. All tissue sections were examined under an Olympus BH-2 microscope (GMI Inc., MIN, USA) for determination of histopathological changes. Epidermal thickness was measured by using Scientific Imaging Systems (Biophotonics ImageJ Analysis Software; National Institutes of Health, USA). MPO activity For acute inflammatory models, the measurement of myeloperoxidase (MPO) activity was used as a marker of neutrophil infiltration (Grisham et al., 1990). The tissue was thawed, weighed and homogenised in ten volumes of 50 mM-PBS (pH 7.4). Then, the homogenate was centrifuged at 20,000 g for 20 min at 4 °C and the pellet was again homogenized in ten volumes of 50 mM-PBS (pH 6) containing hexadecyl trimethylammonium bromide (0.5 %) and 10 mM-EDTA. This homogenate was subjected to one cycle of freezing/thawing and sonicated. The homogenate samples (50 µl) were added to 96-well microplate and incubated at 37 °C for 3 min with a measurement mix (o-dianisidine dihydrochloride (0.067 %), hexadecyl trimethyl-ammonium bromide (0.5 %) and 0.3 mM-H2O2). The changes in absorbance were monitorized at 450 nm with a microplate reader (Labysystem Multiskan EX, Thermo Scientific, NY, USA). MPO activity unit was defined as the amount of enzyme present that produced a change in absorbance of 1.0 unit/min at 37 °C in the final reaction volume containing acetate. Results are expressed as units/mg tissue. Immunohistochemical analysis COX-2 was measured by immunohistochemical analysis by using a streptavidin-biotin-peroxidase method (Talero et al., 2011). Paraffinembedded dorsal skin sections (7 µm) were mounted on slides, deparaffinized with xylene and rehydrated through graded alcohols. These sections were boiled (10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 3 min) for antigen retrieval, followed by cooling at room temperature for 20 min. Endogenous peroxidase was quenched with 0.3 % (v/v) hydrogen peroxide for 20 min and the sections were washed (PBS, 10 min). To minimize the non-specific adsorption the sections were incubated in normal horse serum (Vectastain Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA) for 20 min. 126 Afterwards, slides were incubated with rabbit polyclonal anti-COX-2 antibody (Cayman Chemical, MICH, USA) (1:300) overnight at 4 ºC. Then, the samples were treated with anti-mouse IgG antibody. After 30 min the cells were incubated with the streptavidin–peroxidase complex for 30 min, at room temperature (Vectastain Kit; Vector Laboratories, CA, USA). The enzymatic activities were developed with 3,3´-diaminobenzidine (DAB), and the sections were counterstained with hematoxylin. Negative control sections were treated in the same way, omitting the primary antibody. To examine COX-2 immunoreactivity, the microscope Olympus BX61 was used (Olympus Optical Co. Ltd. Tokyo, Japan). The quantification of immunohistochemical data was done by counting the number of immunostained cells as percent of total epidermal cells from ten microscopic fields of immunostained tissues per animal. Western Blot Assay Frozen dorsal skin tissues from UVB-induced erythema model were randomly selected (6 per group), weighed and homogenized in ice-cold buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 8 mM MgCl2, 5 mM ethylene glycol bis (2- aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid, 0.5 mM EDTA, 0.01 mg/mL leupeptin, 0.01 mg/mL pepstatin, 0.01 mg/mL aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and 250 mM NaCl). The homogenates were centrifuged (12,000 g, 15 min, 4ºC), and the supernatants were collected and stored at -80ºC. To determinate the protein concentration of the homogenates was used the Bradford colorimetric method (Bradford, 1976). Samples of the supernatants with equal amounts of protein (25 μg) were separated on 10 % acrylamide gel by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Then, the proteins were electrophoretically transferred onto a nitrocellulose membrane and incubated with specific primary antibodies: rabbit anti-iNOS (1:1000; Stressgen-Enzo Life Sciences, Farmingdale, USA); rabbit anti-COX-2 (1:3000; Cayman Chemical, Michigan, USA); rabbit anti-Nrf2, rabbit anti-HO-1 (1:1000Cell Signaling, Danvers, MA, USA) overnight at 4ºC. After rising, the membranes were incubated with the horseradish peroxidase-linked (HRP) secondary antibody anti-rabbit (Cayman Chemical®, Ann Arbor, MI, USA) (1:1000) or anti-mouse (Dako®, Atlanta, GA, USA) (1:1000) containing blocking solution for 1 h at room temperature. To prove equal loading, the blots were analyzed for β-actin expression using an anti-β-actin antibody (Sigma Aldrich®, MO, USA). Immunodetection was performed using an enhanced chemiluminescence light-detecting kit (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, IL, USA). Then, the immunosignals were monitorized by using LAS-3000 Imaging System (Fujifilm Image Reader, 127 USA) and densitometric data were studied after normalization to the control (housekeeping gene). The signals were analyzed and quantified with a Scientific Imaging Systems (Biophotonics ImageJ Analysis Software, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA) and expressed as percentage respect to sham control group. Statistical Analysis All values in the figures and text are expressed as arithmetic means ± SEM. Data were evaluated with GraphPad Prism version 5.00 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). In all cases, the Shapiro-Wilk test was used to verify the normality of the data. The Mann-Whitney U-test was chosen for non-parametric values. The parametric values groups were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni’s Multiple Comparison Test. P values < 0.05 were considered statistically significant. RESULTS Effects of FX on TNF-α production in LPS-stimulated THP-1 macrophages and IL-6 and IL-8 production in TNF-α-stimulated HaCaT human keratinocytes. The anti-inflammatory effect of FX was assayed in both THP-1 macrophages and human keratinocytes. As shown in figure 1, all concentrations tested significantly reduced the production of inflammatory cytokines in both cell models. Interestingly, the pretreatment with the carotenoid at 50 µM showed a significant reduction of the TNF-α production in LPS-stimulated THP-1 macrophages, reaching values similar to Dex (P < 0.001) (Fig. 3a). In relation to IL-6 and IL- 8 production in HaCaT keratinocytes, similar results were exhibited in cells pretreated with the highest dose of FX (P < 0.001) (Fig. 3b-c). Figure 3. Effects of Fucoxanthin (FX) from I. galbana on pro-inflammatory cytokines production in THP-1 macrophages and HaCaT keratinocytes. (a) Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in LPS-stimulated THP-1 macrophages. (b)